JPH08503852A

JPH08503852A - ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法

Info

Publication number: JPH08503852A
Application number: JP6513344A
Authority: JP
Inventors: アール．ビラー，ティモシー; ケイ．ニュッスラー，アンドレアス; エイ．ゲラー，デイヴィッド; エル．シモンズ，リチャード
Original assignee: ユニバーシティオブピッツバーグオブザコモンウェルスシステムオブハイヤーエデュケーション
Priority date: 1992-11-25
Filing date: 1993-11-23
Publication date: 1996-04-30
Also published as: CA2150125A1; EP0670902A1; WO1994012645A3; WO1994012645A2; US5882908A; US5468630A

Abstract

(57)【要約】ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを開示する。ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンの作製方法およびヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質の発現方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法発明の背景ここに記載する発明は、米国立保健研究所、一般医学からの公衆衛生局許可番号GM44100およびGM37753によって一部支援された研究の過程で行われたものである。下記の微生物は、米国15260ペンシルバニア州ピッツバーグに在る高等教育連盟のピッツバーグ大学（the University of Pittsburgh of the Commonwealth S ystem of Higher Education）を代表してDavid A. Gellerが１９９２年１１月１８日に米国202852-1776メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301 に在るアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託したものであって、ＡＴＣＣの永久コレクションから入手可能である。 ATCC 75358 pBluescript中のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡ（pHINOS） ATCC 69126 大腸菌SOLR株に形質転換された pBluescript中のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡ（プラスミドHINOS cDNA）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションは上記の寄託微生物のそれぞれに対して生存試験を実施し、１９９２年１１月２０日に各微生物が生存可能で、増殖能を有するという結論を出した。これらの寄託物はそれらを公開する譲受人、高等教育連盟のピッツバーグ大学、に特許が授与された際に一般の人々に利用可能となる。しかしながら、これらの寄託物の利用可能性は、政府の決定によって許可された特許権の適用制約のもとで本発明を実施するためのライセンスを構成するものでないことを理解すべきである。発明の分野本発明は、ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を発現することができるヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン、およびヒト誘導性一酸化窒素シンターゼのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニングするのに適した方法に関するものである。より詳細には、本発明は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン、およびヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素の供給源を提供するためのヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡのクローニングおよび発現方法に関するものである。本発明は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするアミノ酸配列を有するｃＤＮＡをクローニングする方法を提供する。図１Ａ−Ｇおよび配列表の配列番号１は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡのセンス鎖の４１４５ヌクレオチド塩基を示すもので、ヌクレオチド配列のコード部分についての塩基コードを３塩基連鎖（コドン）として記載してある。また、図１Ａ−Ｇおよび配列番号１は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素のアミノ酸１から１１５３をコードするヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列を示している。従来技術の簡単な説明一酸化窒素（ＮＯ）がアミノ酸のＬ−アルギニンから誘導される生物学的媒介物質であることは当技術分野で知られている。酵素の１ファミリーのうちの１つである一酸化窒素シンターゼ（nitric oxide synthase：ＮＯＳ）はＬ−アルギニンに作用して、グアニジノ窒素の１つをＮＯに酸化する。一方で、Ｌ−アルギニン分子の残部からはシトルリンが形成される。一酸化窒素は非常に短命の遊離基であって、一酸化窒素形成の安定した不活性最終産物として測定される亜硝酸（ＮＯ₂-）および硝酸（ＮＯ₃-）に速やかに酸化される。一酸化窒素シンターゼ酵素のイソフォームが数多く存在すること、そしてそれらは一般に２つのカテゴリー、すなわち１）構成酵素および２）誘導（性）酵素、に大別されることが当技術分野でよく知られている。これらのクラスのＮＯＳ酵素類はその大きさ、アミノ酸配列、活性および調節の点でかなり異なっている。例えば、ニューロンや血管内皮細胞のような細胞は構成ＮＯＳイソタイプを含むが、マクロファージや血管平滑筋細胞は誘導性ＮＯＳを発現する。一般的によく知られていることだが、構成ＮＯＳによって生成された少量のＮＯはメッセンジャー分子として作用して可溶性のグアニル酸シクラーゼを活性化し、その結果細胞内のサイクリックグアノシン３ ’，５’-一リン酸（ｃＧＭＰ）を増加させ、そして第２メッセンジャーとしてのｃＧＭＰに依存している生物学的反応を誘導するらしい。例えば、この作用機構を介して、内皮由来のＮＯは血管平滑筋の弛緩を引き起こし、内皮由来の弛緩因子（ＥＤＲＦ）として同定されている。Nature, Vol.327, pp.524-526（1987 ）およびProc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．84，pp．9265-9269（1987）を参照のこと。もう１つの例として、ニューロンの一酸化窒素を挙げることができ、これは中枢神経系および自律神経系において重要な機能を有するグアニル酸シクラーゼを活性化することにより神経伝達物質として働く。Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，Vol．86，pp．9030-9033（1989）およびScience，Vol．257，p．401（19 92）を参照のこと。誘導性一酸化窒素シンターゼによって生産された比較的多量の一酸化窒素が抗微生物作用および抗腫瘍作用を有することは当技術分野で公知である。J．Clin ．Invest.，Vol．81，pp．1129-1136（1989）およびScience，Vol．235，pp．47 3-476（1987）を参照のこと。また、血管平滑筋細胞を炎症性サイトカインでＮＯＳ酵素を発現するように剌激するとき、生産された過剰量の一酸化窒素が敗血症に見られる血管虚脱に寄与することも当技術分野で知られている。FEBS Lett. ，Vol．265，pp．133-136（1990）を参照のこと。従って、一酸化窒素は細胞内および細胞外の両方の生理学的調節機能をもっていることが理解されるであろう。しかし、一酸化窒素の過剰生産は有害である。例えば、血管内の誘導性一酸化窒素の合成をバクテリアのリポ多糖（ＬＰＳ）のような菌体内毒素および敗血症において上昇するサイトカインで剌激すると、敗血症性ショックの際に通常見られる血管の大拡張および持続性の低血圧が生じる。Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．87，pp．3629-32（1990）を参照のこと。免疫複合体によって剌激された肺での一酸化窒素の過剰生産は肺に直接損傷を与える。J．Immunol.，Vol．148，p ．3086（1992）を参照のこと。膵島における一酸化窒素シンターゼの誘導はインスリンの分泌を減少させ、若年型糖尿病の発症に関与する。J．Biol．Chem.，Vo l．266，p．21351（1991）を参照のこと。ヒトにおいて構成型のＮＯＳではなく誘導型のＮＯＳを集合的に阻害するための医学的共同体（メディカルコミュニティー）の大きな必要性が存在することが理解されるであろう。なんとなれば、これは血管運動の調子の生理学的調節または中枢神経系における神経伝達を妨げることなく、例えば敗血症に見られる低血圧性ショックを防止する手段を可能にすると思われるからである。我々は、最近、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン −γおよびバクテリアのリポ多糖（菌体内毒素）で刺激した後の単離ヒト肝細胞において一酸化窒素の生合成が誘導されることを実証した。FASEB JOURNAL，Vol ．6，No．5，p．A1834（1992年４月）およびJ．Exp．Med.，Vol．176，p．261（ 1992）を参照のこと。これまで、ヒト細胞型はどれも、サイトカインで処理したときに窒素酸化物の生産増加を示すことは知られていなかった。Res．Immunol. ，Vol．142，p．557（1991）を参照のこと。当技術分野では一般的に知られていることだが、齧歯類マクロファージ中に存在するものに代表される一酸化窒素シンターゼをヒトマクロファージおよび関連細胞において誘導する試みはことごとく失敗している。Res．Immunol.，V ol．142，p．562，589-90（1991)を参照のこと。この背景技術の資料にもかかわらず、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその分子クローニング法の極めて現実的かつ実質的な必要性が依然として存在している。図面の簡単な説明図１Ａ−Ｇは、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡセンス配列（各水平列の上のライン）およびアミノ酸１−１１５３のアミノ酸配列（各水平列の下のライン）、配列番号１を示す。図２は、ヒト肝細胞（ＨＣ）一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡと交差ハイブリダイズするマウスマクロファージＮＯＳｃＤＮＡのノーザンブロットを示す。図３は、マウスマクロファージｃＤＮＡを用いて３つの別個のヒト肝サンプルから単離された誘導一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。図４は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを単離するためのｃＤＮＡライブラリーを構築するために２つの別個のヒト肝サンプルから精製されたポリＡｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。図５は、サイトカインおよびＬＰＳ剌激後のヒト一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの誘導の時間経過を表す、ヒト肝細胞から単離されたｃＤＮＡによるノーザンブロットを示す。発明の概要本発明は上述した必要性を満たしている。本発明は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法を提供する。より詳細には、本発明は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法を提供する。この方法は、ヒト肝細胞において一酸化窒素シンターゼを誘導し、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのメッセンジャーＲＮＡを同定し、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのメッセンジャーＲＮＡを単離し、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのメッセンジャーＲＮＡを集め、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのメッセンジャーＲＮＡからヒト肝細胞ポリＡメッセンジャーＲＮＡを分離し、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡライブラリーを構築し、このｃＤＮＡライブラリーをヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンについてスクリーニングし、そしてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンを、ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする実質的に全長のｃＤＮＡクローンを得るためのプラスミドベクターに変換することを含むものである。この方法は、さらに、このｃＤＮＡの塩基配列を解析し、ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡタンパク質を発現系において発現させ、そしてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡタンパク質を精製することを含むものである。本発明の目的は、ヒト組織中の誘導性一酸化窒素シンターゼの分子クローニングおよび特性付けを提供することである。本発明の目的は、ヒト肝細胞中の誘導性一酸化窒素シンターゼの分子クローニングおよび特性付けを提供することである。本発明の目的は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを単離することである。本発明の目的は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを単離することである。本発明の目的は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素の発現および精製方法を提供することである。本発明の目的は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素の発現および精製方法を提供することである。本発明の目的は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素の遺伝子発現の調節を提供することである。本発明の目的は、他のヒトタンパク質を実質的に含まないヒト誘導性一酸化窒素シンターゼを含むタンパク質を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な説明、図面、配列表および添付の特許請求の範囲から、より十分に理解されるだろう。発明の詳細な説明本明細書中で用いる「患者」という用語は、ヒトを含むがヒトに限らない動物界のメンバーを含むものとする。一酸化窒素はアミノ酸のＬ−アルギニンから誘導される生物学的媒介物質である。一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）はＬ−アルギニンに作用してグアニジノ窒素の１つを一酸化窒素に酸化する。一方で、Ｌ−アルギニン分子の残部からはシトルリンが形成される。一酸化窒素は細胞内および細胞外の両方の正常な生理学的調節機能を有することが当技術分野で認められているが、一酸化窒素の過度の生産は有害となる。ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼの容易に利用できる供給源が他にないことも当業者には理解されよう。本発明はヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法を提供するものである。従って、本発明のヒト組織一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡのクローニングおよび発現は、一酸化窒素シンターゼの選択的阻害剤を開発するための該酵素の供給源を提供する。本発明のヒト組織一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡのクローニングおよび発現は、治療目的に適う十分に高濃度の該酵素の供給源を提供する。本発明の一態様において、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンの作製方法を提供する。この方法は、ヒト組織の一酸化窒素シンターゼをin vitroで誘導し、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるｃＤＮＡプローブを用いてヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを同定し、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを単離し、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを集め、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡからヒト組織ポリＡｍＲＮＡを分離し、ヒト組織ポリＡｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ鎖を合成しかつｃＤＮＡ鎖をファージベクターに挿入することによりヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡライブラリーを構築し、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのクローンについて該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするにあたって、該ｃＤＮＡを含むファージベクターをバクテリアとインキュベートしてヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを含む少なくとも１つの陽性プラークを形成させ、ヘルパーファージを用いて該ファージベクターからｃＤＮＡクローンを救済し、そして救済したｃＤＮＡクローンをヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする実質的に全長のｃＤＮＡクローンを得るためのプラスミドベクターに変換することを含むものである。本発明のもう１つの態様において、上記の方法は、さらに、プラスミドベクターからヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡ挿入物を切りだすことを包含する。この方法は、また、ジデオキシヌクレオチドＤＮＡ塩基配列決定法を用いてｃＤＮＡ挿入物を確認することも包含する。さらに、この方法はサザンブロットハイブリダイゼーションを用いてｃＤＮＡ挿入物を確認することも包含する。本発明の他の態様において、上記の方法は、例えばバクテリア発現系または哺乳動物発現系のような発現系でヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡタンパク質を発現させることを包含する。ここに記載した方法によって得られたクローン化ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡを組換え法により発現させるにあたって、当業者であれば、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節要素を含む発現ベクターへの分子クローニングを行い、原核または真核宿主細胞に移入して組換え型誘導性一酸化窒素シンターゼを産生させることができることを理解するであろう。こうした操作技法はManiatisらの下記文献に詳しく記載されており、当技術分野で公知である。発現ベクターは、本明細書においては、クローン化されたコピー数の遺伝子の転写ならびに適当な宿主内でのそれらｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列として定義される。かかるベクターはバクテリア、青緑色の藻、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞のようなさまざまな宿主において真核生物の遺伝子を発現させるために使用することができる。特別に設計されたベクターは、バクテリア−酵母またはバクテリア−動物細胞といった宿主間のＤＮＡの往復移動を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内で自律複製するための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力、そして活性プロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡとの結合およびＲＮＡ合成の開始を命じるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターはｍＲＮＡが高頻度で合成開始されるようにするものである。発現ベクターはクローニングベクター、修飾したクローニングベクター、特別に設計したプラスミドまたはウイルスを含むが、これらに限らない。哺乳動物細胞において組換え型の誘導性一酸化窒素シンターゼを発現させるために種々の哺乳動物発現ベクターを使用することができる。組換え型の誘導性一酸化窒素シンターゼの発現に適している市販のバクテリア発現ベクターとして、ｐＫＣ３０（ATCC 37286）、ｐＰＬａ２３１１（ATCC 316 94）、ｐＢＲ３２２（ATCC 31344および37017）、ｐｔａｃ１２（ATCC 37138）、λｇｔ１１（ATCC 37194）、ｐＡＳ１（ATCC 39262）、ｐＬＣ２４、ｐＳＢ２２６、ＳＶ４０およびｐＫＫ２２３−３を挙げることができるが、これらに限らない。組換え型の誘導性一酸化窒素シンターゼの発現に適している市販の哺乳動物発現ベクターとして、ｐＢＣ１２Ｂ１（ATCC 67617）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratage ne）、ｐＸＴＩ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２− ｎｅｏ（ATCC 37593）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ATCC 37110）、ｐｄＢＰＶ− ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ATCC 37224）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ATCC 37199）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ATCC 37198）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ATCC 37146）、ｐＵＣＴａｇ（ATCC 37460）、およびλＺＤ３５（ATCC 37565）を挙げることができるが、これらに限らない。また、誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡは組換え宿主細胞において発現させるための発現ベクターにクローニングすることもできる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、バクテリア、酵母、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル、齧歯類由来のセルラインを含むが、これらに限らない）、および昆虫細胞（ショウジョウバエ由来のセルラインを含むが、これらに限らない）が含まれるが、これらに限らない。市販されている適当な哺乳動物種由来のセルラインとしては、ＣＶ−１（ATCC CCL70）、ＣＯＳ−１（ATCC CRL1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL1651）、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL61）、３Ｔ３（ATCC CCL92）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ATCC C RL1658）、ＨｅＬａ（ATCC CCL2）、Ｃ１２７１（ATCC CRL1616）、ＢＳ−Ｃ− １（ATCC CCL26）、およびＭＲＣ−５（ATCC CCL171）を挙げることができるが、これらに限らない。組換えタンパク質の発現に最も多く用いられているバクテリア細胞は大腸菌である。利用可能な各種の大腸菌株があり、当技術分野で公知である。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーションを含むがこれらに限らない多数の技法のいずれか１つにより宿主細胞内に導入することができる。本発明の好ましい態様において、上記の方法はバキュロウイルス発現系においてヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を発現させることを包含する。本発明の別の態様は、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質の精製を包含する上記の方法を提供する。本発明の好ましい態様において、上記の方法は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼを用いることを包含する。この方法は、さらに、ヒ卜組織の誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質としてヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を用いることを包含する。本発明の他の態様では、（1）少なくとも１種のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ− １）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）よりなる群から選ばれるサイトカイン、（2）少なくとも１種の菌体内毒素、例えばバクテリアのリポ多糖（ＬＰＳ）、および（3）これらの組合せ、のうちの少なくとも１つを用いてin vitr oでヒト組織を剌激することによりヒト組織一酸化窒素シンターゼをin vitroで誘導することを含む上記の方法を提供する。本発明のさらに好ましい態様は、ヒト組織のポリＡｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ鎖を合成し、少なくとも約１０００塩基対の長さを有するｃＤＮＡ鎖をファージベクターに挿入することにより、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡライブラリーを構築することを含む上記の方法を提供する。さらに別の好ましい態様では、ファージベクターとしてλＺａｐ IIを用いることを含む上記の方法を提供する。本発明の別の態様において、上記の方法は、ファージ溶菌を行うためにファージベクターをバクテリアとともに約３４〜４０℃の温度で約６〜２４時間インキュベートすることを含むｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを包含する。この方法は、さらに、例えばExAssistヘルパーフアージ（Stratagene，La Jolla， CA）のようなヘルパーファージを用いることによりファージベクターからｃＤＮＡクローンを救済することを包含する。本発明の好ましい態様では、救済したｃＤＮＡクローンを、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする実質的に全長のｃＤＮＡクローンを得るためのプラスミドベクターに変換することを含む上記の方法を提供し、その際プラスミドベクターにはpBluescript（Stratagene，La Jolla，CA）が含まれる。本発明の別の好ましい態様において、上記の方法は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼを用いることを包含する。本発明の他の態様は、適当な宿主においてヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列を発現することができる複製可能なＤＮＡ発現ベクターを用意し、該宿主を形質転換して組換え宿主を得、そしてＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下に組換え宿主を維持してヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼを得ることを含む、ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質の生産方法を提供する。本発明の別の態様は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを提供する。本発明の好ましい態様は、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを提供する。本発明のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンは、図１Ａ−Ｇに示されるアミノ酸配列（配列番号１および２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）を有する。図１Ａ−Ｇは、本発明のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡセンス配列（各水平列の上のライン）およびアミノ酸１−１１５３の推定アミノ酸配列（各水平列の下のライン）を示す。図１Ａ−Ｇは、本発明のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡ配列が４１４５ヌクレオチド塩基の長さで、塩基番号２０７で始まる開始コドンおよび塩基番号３６６８で終わる停止コドンを含むことを示している。このｃＤＮＡの二本鎖配列は、当技術分野でよく知られているサンガー（Sanger）のジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法を用いて Genesis 2000シークエンシングシステム（USB，Cleveland，Ohio）で決定した。 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．74，p．5463（1977）を参照のこと。本発明の別の態様は、ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンから発現させたヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質を提供する。好ましい態様では、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンから発現させたヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質を提供する。本発明の別の態様は、他のヒトタンパク質を実質的に含まないヒト誘導性一酸化窒素シンターゼを含むタンパク質を提供する。本発明の別の態様は、本質的にヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列からなるオープン・リーディング・フレームの上流にあってそれに隣接している開始コドンを本質的に含むヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。本発明の更なる態様は、本質的にヒト誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなるオープン・リーディング・フレームの上流にあってそれに隣接している開始コドンを本質的に含むヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質は開始コドンで始まり、停止コドンで終わる。本発明のさらに別の態様では、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて受託番号ATCC 75358を有する組換えプラスミドｐＨＩＮＯＳを含む組換えプラスミドを提供する。本発明の更なる態様は組換えプラスミドｐＨＩＮＯＳにより形質転換されたバクテリアを提供する。本発明の別の態様では、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて受託番号ATCC 69126を有する、大腸菌ＳＯＬＲに形質転換されたＨＩＮＯＳｃＤＮＡプラスミドを含む微生物を提供する。実施例１ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼの誘導ｍＲＮＡは、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ− １）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のようなサイトカインシグナルで剌激した後に弱く誘導される。サイトカインシグナルはｍＲＮＡレベルおよび一酸化窒素シンターゼ活性をさらにアップレギュレートするように共働的に作用する。最大誘導がＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γおよびバクテリアのリポ多糖（ＬＰＳ）の組合せにより達成された。FASEB Journal，Vol．6（前掲）およびJ． Exp．Med.，Vol．176（前掲）を参照のこと。実施例２ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡの同定および単離ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡを同定および単離するにあたって、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡとハイブリダイズ可能なｃＤＮＡプローブを使用した。その後、サイトカインおよびＬＰＳ〔以後、サイトカイン混合物（ＣＭ）という〕で剌激した後の最大ｍＲＮＡレベルの時点を決定した。培養したヒト肝細胞のＣＭ剌激の約２〜４８時間後に、ChomczynskiおよびSac chi，Anal．Biochem.，Vol．162，pp．156-159（1987）に記載されるRNAzol B変法を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＮｏｔＩ制限酵素により得られた切除断片に相当するマウスマクロファージｃＤＮＡプローブ〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA， Vol．89，pp．6711-6715（1992），GenBank受託番号M92649〕および交差種ハイブリダイゼーションを用いて、全ＲＮＡの２０マイクログラム（μｇ）アリコートに対してノーザンブロット分析を行った。ヒト肝細胞の一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡは約４．５ｋｂ（キロベース）に単一のバンドとして同定され、最大ｍＲＮＡレベルは刺激の約８時間後に見られた。図２はヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼの４．５ｋｂメッセージの存在を示す。単離したばかりのヒト肝細胞（ＨＣ）を細胞培養下に置き、そしてヒト組換え腫瘍壊死因子（５００単位／ｍｌ）、ヒト組換えインターロイキン−１（５単位／ｍｌ）、ヒト組換えインターフェロン−γ（１００単位／ｍｌ）およびリポ多糖（１０μｇ／ｍｌ）の組合せに暴露した。図２は、示した時点（２時間、４時間、６時間および８時間）で全ＲＮＡを単離し、サンプルにつき２０μ ｇをノーザンブロット分析にかけたことを示す。マウスマクロファージの誘導性一酸化窒素シンターゼに対するｃＤＮＡの２．７ｋｂ断片を用いて、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。図２は、４．５ｋｂメッセージが剌激の約８時間後に最大に達したことを示す。また、図２は、対照（非剌激）肝細胞においてｍＲＮＡのシグナルが全く検出されなかったことを示す。図３は、異なる３人の患者〔患者１、２および３〕から単離した肝細胞についての、ＣＭ剌激の約８時間後のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼの４．５ｋｂｍＲＮＡの発現を示す。図３は、対照（非剌激）肝細胞においてｍＲＮＡのシグナルが全く検出されなかったことを示す。刺激後８時間の時点が最大ｍＲＮＡレベルをもたらしたので、in vitroでＣＭ剌激の約８時間後に２つのヒト肝臓からＲＮＡのサンプルを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを構築するのに十分な量を確保するためにプールした。ｃＤＮＡの合成には、全ＲＮＡではなく、ポリＡｍＲＮＡが約１０〜２０マイクログラム必要となる。精製されたポリＡｍＲＮＡを得るために、オリゴ−ｄＴセルロースカラムにかけて全ＲＮＡからポリＡｍＲＮＡを分離した。ｍＲＮＡの純度は反復ノーザンブロット分析により評価したが、この分析は、２つのヒト肝臓のそれぞれから得られた０．５マイクログラムのポリＡｍＲＮＡを、マウスマクロファージの誘導性一酸化窒素シンターゼからの２．７ｋｂのｃＤＮＡを用いるノーザンブロット分析にかけることを包含する。図４は異なる２人の患者からの一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの強いバンドを示しており、ポリＡｍＲＮＡが分解した形跡はない。図４は、マウスマクロファージの誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡがヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのポリＡｍＲＮＡと交差ハイブリダイズし、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡを効果的に同定できることを示している。これらのポリＡｍＲＮＡサンプルを用いて、ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを単離するためにｃＤＮＡライブラリーを構築した。実施例３ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡライブラリーの構築ＣＭ剌激によって肝細胞の一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを富化させた約２０マイクログラムのポリＡｍＲＮＡを用いて、Stratagene（La Jolla，CA）によりｃＤＮＡライブラリーを構築した。ランダムおよびオリゴ−ｄＴプライマーとともに逆転写酵素を用いて、ヒト肝細胞のポリＡｍＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。最小約１０００ヌクレオチドの塩基対長のサイズ排除後、ｃＤＮＡをλ ＺａｐIIファージベクター（Stratagene，La Jolla，CA）に挿入した。実施例４ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンについてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするにあたって、１×１０⁶ファージをバクテリア（大腸菌Sure株）とともに約３４〜４０℃で約１５〜３０分間インキュベートした。この混合物を溶融アガロースに加え、２０×２０ｃｍ寒天プレートに約２×１０⁵プラーク／プレートの密度で注入した（Maniatisら，Molecul ar Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982）。プレ一卜を約３４〜４０℃で一夜インキュベートし、ファージによる溶菌を行わせた。次いでプラークをナイロンフィルターに移し、³²Ｐで標識したマウスマクロファージ一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡプローブとのフィルターハイブリダイゼーションにより陽性クローンを同定した。オートラジオグラフ整合化による位置確認後に寒天プレートから陽性クローンを取り出した。個々のクローンが単離されるまで、この手順を約３回繰り返した。陽性クローンはヘルパーファージExAssist（Stratagene，La Jolla ，CA）を用いてλＺａｐ IIファージベクターから救済し、その後プラスミドベクターpBluescript（Stratagene，La Jolla，CA）に変換した。ヒト肝細胞の誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡ挿人物をBluescriptプラスミドのクローニング部位からＥｃｏＲＩ酵素を用いる制限分析により切り出し、ゲル電気泳動でサイズ分画化した。ｃＤＮＡ挿入物の同一性はＤＮＡシークエンシングおよびマウスマクロファージｃＤＮＡクローンを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。さらに、プローブとして本発明のヒト一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンを用いて、培養下のサイトカイン剌激ヒト肝細胞に対して反復ノーザンブロット分析を実施した。図５はヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡ発現の時間経過を示す。このＲＮＡは図２および３に示した患者とは異なる患者に由来するものである。図５に示した患者の細胞も図２に関して記載したものと同じ作用物質に暴露した。図５はヒト一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡがマクロファージプローブと同じｍＲＮＡシグナルを同定することを示しており、かくして、その同一性をさらに確認できた。本発明のヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする単離ｃＤＮＡクローンがｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために使われ、その結果、ヒ卜肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのｍＲＮＡを同定する本発明のｃＤＮＡクローンの能力を確認できた点に注目することが重要である。実施例５ｃＤＮＡの塩基配列決定プラスミドベクターpBluescriptは万能プライマー領域を含んでおり、これらの領域が二本鎖ＤＮＡの塩基配列決定を容易にするために使用された。Sanger（前掲）のジデオキシヌクレオチド技法を用いてGenesis 2000 シークエンシングシステム（USB，Cleveland，Ohio）で陽性クローンの塩基配列を決定した。塩基配列の分析は、ピッツバーグ・スーパーコンピューティング・センター（Billia r TR.，Pittsburgh Supercomputing Center，Pittsburgh，PA）から入手できるG enbank DNAシークエンシングソフトウェアプログラムを使って行った。実施例６ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼの発現全長ｃＤＮＡの同一性の証明は、組換えヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を発現させることにより行った。ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼのクローンを、ＣＭＶプロモーターを利用するｐＣＩＳ発現ベクター（Ge nentech，CA）に連結した。次に、この発現ベクターをヒト胚腎２９３細胞（ATCC，Maryland）にトランスフェクトした。一酸化窒素シンターゼ活性は［³H］アルギニンの［³H］シトルリンへの変換を測定することにより評価した。当業者には十分認識されていることだが、この発現系はクローン化されたラット脳の構成型一酸化窒素シンターゼの発現に使用して成功し、また、非剌激２９３腎細胞ではごくわずかな一酸化窒素シンターゼ活性しか存在しなかった〔Bredtら，Nature，Vol．351，p． 714（1991）〕。本発明のヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼクローンの同一性を上記のように証明した後で、大規模酵素生産を可能にするバキュロウイルス発現系（Invitrogen，San Diego，CA）でｃＤＮＡを発現させた。Texas Agric ulture Experiment Station Bulletin，No．1555（1988）を参照のこと。より詳細には、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡをバキュロウイルス運搬ベクターに挿入し、Ｓｆ９昆虫細胞（ATCC，Maryland）に野生型ウイルスＤＮＡとともに同時トランスフェクトした。タンパク質の過剰発現を可能にする組換えウイルスプラークを単離した。実施例７ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質の精製得られたヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質は２段階法を用いて精製した。最初に、タンパク質をＤＥＡＥセルロースのアニオン交換カラムにかけた。これに続いて、2'，5'-ADPセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーにかけた。Evansら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．89，pp． 5361-5365（1992）を参照のこと。純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた。各段階の後に、Ｌ−アルギニンからＮＯ₂-およびＮＯ₃-を生成する酵素の能力を測定することにより活性を定量化した。ＮＯ₂-およびＮＯ₃-はGr eiss反応に基づく自動比色定量反応を用いて測定した〔Greenら，Anal．Biochem .，Vol．126，p．131（1982）〕。以上、本発明の特定の実施態様を例示として記載してきたが、当業者であれば、本発明の細部の多くの変更が特許請求の範囲に規定した本発明から逸脱することなく行われ得ることが明らかだろう。配列表配列番号：１配列の長さ：4145 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼcDNAクローンハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源組織の種類：誘導されたヒト肝細胞RNA 直接の起源ライブラリー名：λ Zap II cDNA クローン名：pHINOS ゲノム内での位置染色体／セグメント名：不明染色体上の位置：不明単位：不明配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：207..3668 特徴を決定した方法：実験による配列配列番号：２配列の長さ：1153 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/06 Ｂ 9359−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者ニュッスラー，アンドレアスケイ. ドイツ連邦共和国 89231 ノイ―ウルムハートヴェーク４番地 (72)発明者ゲラー，デイヴィッドエイ. アメリカ合衆国 15235 ペンシルバニア州ピッツバーグ，ハリウッドドライブ 2329番地 (72)発明者シモンズ，リチャードエル. アメリカ合衆国 15208 ペンシルバニア州ピッツバーグ，サウスマートランドアヴェニュー 123番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト組織の誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンの作製方法であって、ヒト組織一酸化窒素シンターゼをin vitroで誘導し、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡとハイブリダイズ可能なｃＤＮＡプローブを用いてヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを同定し、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを単離し、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを集め、ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡからヒト組織ポリＡｍＲＮＡを分離し、逆転写酵素を用いてヒト組織ポリＡｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しかつ該ｃＤＮＡ鎖をファージベクターに挿入することによりヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡライブラリーを構築し、ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼクローンについて該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、該ｃＤＮＡを含むファージベクターをバクテリアとともにインキュベートしてヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを含む少なくとも１つの陽性プラークを形成させ、ヘルパーファージを用いて該ファージベクターからｃＤＮＡクローンを救済し、そしてｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターに変換してヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする実質的に全長のｃＤＮＡクローンを得る、ことを含む方法。２．前記のプラスミドベクターからヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡ挿入物を切り出すことを含む、請求項１に記載の方法。３．ジデオキシヌクレオチドＤＮＡ塩基配列決定法を用いて前記のｃＤＮＡ挿入物を確認することを含む、請求項２に記載の方法。４．サザンブロットハイブリダイゼーションを用いて前記のｃＤＮＡ挿入物を確認することを含む、請求項２に記載の方法。５．発現系においてヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼの前記ｃＤＮＡ挿入物を使用することによりヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を発現させることを含む、請求項２に記載の方法。６．発現系としてバキュロウイルス発現系を用いることを含む、請求項５に記載の方法。７．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を精製することを含む、請求項５に記載の方法。８．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼを用いることを含む、請求項１に記載の方法。９．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼを用いることを含む、請求項２に記載の方法。 10．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質としてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を用いることを含む、請求項５に記載の方法。 11．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質としてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質を用いることを含む、請求項７に記載の方法。 12．次の物質：（1）少なくとも１種のサイトカイン、（2）少なくとも１種の菌体内毒素、および（3）これらの組合せ、のうちの少なくとも１つを用いてin vi troでヒト組織を剌激することにより、ヒト組織一酸化窒素シンターゼをin vitr oで誘導することを含む、請求項１に記載の方法。 13．次の物質：（1）腫瘍壊死因子、インターロイキン−１およびインターフェロン−γより成る群から選ばれる少なくとも１種のサイトカイン、（2）バクテリアのリポ多糖を含む少なくとも１種の菌体内毒素、および（3）これらの組合せ、のうちの少なくとも１つを用いてin vitroでヒト組織を剌激することにより、ヒト組織一酸化窒素シンターゼをin vitroで誘導することを含む、請求項12に記載の方法。 14．ヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡとハイブリダイズ可能なｃＤＮＡプローブを用いてヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを同定することを含む、請求項12に記載の方法。 15．少なくとも約１０００塩基対の長さを有するｃＤＮＡ鎖をファージベクターに挿入することを含む、請求項14に記載の方法。 16．ファージベクターとしてλＺａｐ IIを用いることを含む、請求項15に記載の方法。 17．前記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするにあたって、ファージベクターをバクテリアとともに約３４〜４０℃の温度で約６〜２４時間インキュベートすることによりファージ溶菌を達成させることを含む、請求項15に記載の方法。 18．ヘルパーファージを用いて前記のファージベクターからｃＤＮＡクローンを救済することを含む、請求項17に記載の方法。 19．前記のヘルパーファージとしてExAssistヘルパーファージを用いることを含む、請求項18に記載の方法。 20．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする実質的に全長のｃＤＮＡクローンを得るために、救済されたｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターに変換し、そして前記のプラスミドベクターとしてpBluescriptを用いることを含む、請求項18に記載の方法。 21．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼを用いることを含む、請求項20に記載の方法。 22．次のアミノ酸配列（配列番号２）をコードするｃＤＮＡを含むヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン。 23．次のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含むヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼクローン。 24．ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質の産生方法であって、適当な宿主内でヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列を発現することができる複製可能なＤＮＡ発現ベクターを用意し、該宿主を形質転換して組換え宿主を作り、そして該組換え宿主を該ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下に維持してヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼを産生させる、ことを含む方法。 25．ヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンから発現されるヒト組織誘導性一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質を含む組換えタンパク質。 26．ヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンから発現されるヒト肝細胞誘導性一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質を含む組換えタンパク質。 27．他のヒトタンパク質を実質的に含まないヒト誘導性一酸化窒素シンターゼからなるタンパク質。 28．ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列から実質的に成るオープン・リーディング・フレームの上流に隣接して位置する開始コドンを実質的に含む、ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードしている単離されたＤＮＡ配列。 29．ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列から実質的に成るオープン・リーディング・フレームの上流に隣接して位置する開始コドンを実質的に含み、該ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼタンパク質が該開始コドンで始まって停止コドンで終わる、ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼをコードしている単離されたＤＮＡ配列。 30．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて受託番号ATCC 75358を有する組換えプラスミドｐＨＩＮＯＳからなる組換えプラスミド。 31．請求項30の組換えプラスミドｐＨＩＮＯＳにより形質転換されたバクテリア。 32．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて受託番号ATCC 69126を有する大腸菌（E.coli）SOLR株中に形質転換されたＨＩＮＯＳｃＤＮＡプラスミド。