CN109837594A - 一种提高表达文库阳性率的建库方法 - Google Patents

Abstract

一种能够提高表达文库阳性率的文库构建方案。它通过在mRNA反转录5’引物序列中添加不同数量的A实现一个mRNA具有三种读码框，保证其中一种可进行正确翻译的反转录方案。此方案获得的cDNA无论后续进行酵母文库构建还是连接到蛋白表达载体上，均可提高mRNA正确表达蛋白的阳性率，更真实的反应样本的实际状态。

Description

一种提高表达文库阳性率的建库方法

技术领域

本发明涉及一种新的表达文库构建方法，该方法尤其可以提高此类文库的阳性率，更真实的反应样本的状态。

背景技术

目前，常用的文库构建方式是先将mRNA利用反转录引物通过反转录酶的作用将RNA反转录生成cDNA一链和RNA的杂合产物，同时由于反转录酶的作用会在mRNA的5’末端加上一段引物用于后续的扩增或者酶切，再通过二链合成得到一条cDNA双链。将得到的两端都有特异引物的cDNA双链产物通过TA克隆连接到T载体上，大肠杆菌转化并过夜培养后随机挑取部分单菌落利用一代测序对连入T载体的cDNA进行测序确认cDNA符合实验要求，再将最初得到的cDNA双链与特定的质粒共转酵母菌并涂板培养，得到酵母文库；也可以将cDNA连入其它表达载体，得到其它种类的表达文库。虽然该方法是广泛应用的建库方案，但是此种文库存在一种缺陷：由于在反转录时只使用一种5’端引物，而常用的载体读码框也只有一种，因此导致每一条mRNA 也只有一种读码框。由于从mRNA到蛋白质的翻译过程中，三个碱基编码一个氨基酸，从起始密码子开始，到终止密码子结束，任何非3的倍数的碱基的丢失或插入都会导致移码突变，同样，如果连接进去的cDNA序列与载体读码框不一致，在蛋白表达过程中也会导致移码突变，使cDNA不能正确表达，从而降低了表达文库的阳性率，使所得到的实验结果不能反应样本的真实情况。

发明内容

为了降低现有文库制备方案对实验结果的影响，使文库能更真实的反应样本的实际情况，本发明提供一种新的建库方案，此方案改变了cDNA合成时的5’端引物序列，增加了cDNA 反转录时5’引物的种类，从原来的一种增加到三种，从而使后续建成的表达文库的读码框存在三种可能，无论cDNA从哪个碱基开始被翻译，都能保证其存在一种正确的读码框。可使结果能更真实的反应样本的实际情况。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：在总RNA进行反转录时使用3种5’端引物，对同一条RNA而言，每一种5’端引物代表一种读码方式。所使用的5’引物序列分别是：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAAGGG-3’。

采用该方案进行实验时所需起始RNA的量是原来用量的3倍，例如原实验方案只需1份总 RNA，那么在本实验方案中则需要反转录3份相同量的cDNA，每份样本作为一个样本分别使用’不同的反转录引物独立进行cDNA的一链和二链合成，得到cDNA双链之后，把3份双链cDNA等量混合后采用T克隆进行文库的测序实验。测序结果如果符合预期，则此三份cDNA的混合样本可以用于后续的文库构建实验。此种方案得到的cDNA能保证每一个mRNA来源的cDNA都具有三种读码框，连接到载体上之后，读码框正确的一种能够被表达。

本发明的有益效果是，可以提高表达文库的阳性率，有效避免了文库数据的损失，更接近真实的反应样本的实际状况。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是反转录时所使用的5’端引物序列：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAAGGG-3’

图2是3份cDNA混样后克隆到T载体上5’末端的测序结果：

Claims (1)

1.一种文库构建方案，以三种5’端反转录引物为基本序列，其序列在引物3’端最后3个连续的G之前不含A、添加1个A和2个A为必须要素。其特征是：通过添加不同数量的A形成三种读码框，以此三种序列为5’端引物形成的cDNA可以提高所构建表达文库的阳性比率。