JPS6379594A - ポリペプチド鎖伸長因子−２毒素耐性変異体遺伝子とそのプロモ−タ−領域ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリペプチド鎖伸長因子−２（以下ＥＦ−２
と略称する）ゲノム遺伝子及びそのプロモーター・エン
ハンサー領域塩基配列並びにこれらの培養細胞への応用
に関する。

ポリペプチド鎖伸長因子−２は、真核細胞の蛋白合成時
にベプチヂル転移ＲＮＡをリボゾーム上のＡ部位からＰ
部位へ転移させる際に必須の酵素である。　この酵素は
、ジフテリア毒素または緑膿菌外毒素によりＮＡＤ由来
のＡ　Ｄ　Ｐ　ｒｉｂｏｓｅと共有結合して失活する。

これらの毒素で処理した細胞は、ＥＦ−２が失活するた
め蛋白合成が阻害され死滅することになる。

本発明者らは、既に、ＥＦ−２の１部のアミノ酸配列を
明らかにし、それをもとに作製した合成オリゴヌクレオ
チドをもとにハムスターＣ）−Ｔ　Ｏ細胞由来ＥＦ−２
ｃＤＮＡの全−次構造を明らかにした。　　（Ｋｏｈｎ
ｏ、に、、Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ、、０ｈｋｕｂｏ、）１．
、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ。

Ｓ、、　Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｔ、、　Ｆｕｋｕｉ、Ｔ
、、　０ｈｔｓｕｋａ、Ｅ、。

Ｉｋｅｈａｒａ、Ｍ、＆　Ｄｋａｄａ、Ｙ、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、Ａｃｕｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ８３４９
７８（１９８６））。

更に、ＥＦ−２の変異のためにジフテリア毒素及び緑膿
菌外毒素耐性となった変異チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯからジフテリア毒素及び緑膿菌外毒素耐性ＥＦ−
２のｃＤＮＡのクローニングをし、その−次構造を明ら
かにしている。

本発明者らは、更に鋭意研究の結果、この度、毒素耐性
ＥＦ−２のゲノム遺伝子を単離し、その構造を明らかに
し、更にそのプロモーター・エンハンサー領域塩基配列
を明らかにした。

このことにより、ＥＦ−２ゲノム遺伝子の一次構造が初
めて明らかになった。　更に、ＥＦ−２の変異の為に毒
素耐性になった細胞からクローニングされた変異ＥＦ−
２ゲノム遺伝子は選択マーカー等して利用価値の高いも
のであることが明らかになった。

この変異ＥＦ−２ゲノム遺伝子がベクターに組み込まれ
たプラスミドを培養細胞へ導入し、毒素で処理すると、
この遺伝子の導入された細胞は毒素耐性となり生き残る
。　更に、この様な選択マーカーを持たない任意の遺伝
子を任意の細胞内へ導入する際に極めて良い選択マーカ
ー遺伝子となる。　従来、この様な遺伝子としては、ｐ
ＳＶ２−ｇｐｔとかｐＳＶ−ｎｅｏなどがあり、上記の
様な目的に用いられているが、これらより用いる細胞の
幅も広く、また選択培養の日数は上記のものより短くて
充分である。

動物細胞を用いて有用物質を生産する場合に、本発明の
ＥＦ−２ゲノム遺伝子を利用することによりそのような
細胞を容易に得ることができる。

ＥＦ−２は、ハムスター細胞の全蛋白の数％を占めるこ
とから、ＥＦ−２ゲノム遺伝子のプロモーターは強力な
プロモーターであると考え、このようなＥＦ−２ゲノム
遺伝子の５゛上流領域をを他の遺伝子の上流につなぐこ
とにより、目的の遺伝子産物を動物細胞で大量に発現さ
せることが可能となる。　ＥＦ−２ゲノム遺伝子の５゛
上流領域、特にそのプロモーター・エンハンサーＨｂ５
　ＤＮＡは、有用物質を動物細胞で生産する場合にその
利用価値は大きい９ このように、本発明は、毒素耐性ＥＦ−２のゲノム遺伝
子、そのプロモーター・エンハンサー領域ＤＮＡ、並び
にこれらの動物細胞に於ける外来遺伝子発現による有用
物質の生産への応用方法を提供する。

本発明のジフテリア毒素及び緑膿菌外毒素耐性変異ＥＦ
−２ゲノム遺伝子は、ハムスター培養細胞由来の毒素耐
性細胞から常法に従い高分子ＤＮＡを調整し、ラムダク
ローニングベクターを用いて、ハムスターゲノム遺伝子
ライブラリーを作成し、これを大腸菌にトランスフオー
ムした後、適当なフ゛ロープ、例えばハムスターのＥＦ
−２ｃＤＮＡのフラグメントを用い、コロニーハイブリ
ダイセージジョンを行うことにより目的とするＤＮＡを
含むクローンを得、これから目的のファージあるいはＤ
ＮＡを調整することにより作製することができる。

以下に本発明の実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明
する。本発明は、この実施例のみ躍定されるものではな
く、本発明の技術分野において通常行われる変更をする
ことができる。

実施例１ ジフテリア毒素耐性細胞由来遺伝子ライブラリーの作製 ハムスター培養細胞由来（ＣＨＯ−ＫＩ）のジフテリア
毒素耐性ＫＥＥ　Ｉ細胞１）から常法に従って高分子Ｄ
ＮＡを調製した２）。　すなわち、径１５ｃｍのペトリ
皿に単層培養させたＫＥＥ　Ｉ細胞をトリス緩衝液（Ｔ
　Ｂ　Ｓ　：　ＮａＣ１８ｇ、　ＫＣＩ　Ｏ，３８ｇ、
Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ　３．Ｏｇを８００ｍ　ｌの水で溶
かし、ＩＮ塩酸によりｐＨを７．４に合わせ、全量を水
で１１にしたもの）で２回洗ったのち、細胞をポリスマ
ンにより集めた。集めたベレットを氷冷したＴｒｉｓ−
ＥＤＴＡ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，１
ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）に１０８細胞／ｍｌになるよう
懸濁し、１０倍量の０．５　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ（ｐＨ
８）　、　０．５％５ａｒｃｏｓｙｌ、１００μｇ／ｍ
ｌ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｍｅｒｋ）溶液を加え
、５０℃で３時間インキュベートした。　フェノール抽
出をおだやかに３回行つたち、水層を透析チューブに移
し、４７！の５０　ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ８）
　、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液
で０Ｄ２７０が＜０．０５になるまで透析を行った。

更に、サンプルを１００　ｐ　ｇ／ｍｌのＲＮ　Ａ　ａ
ｓｅ　（ＤＮａｓｅｆ　ｒｅｅ）で３７℃、３時間処理
し、フェノール：クロロホルムでおだやかに２回抽出し
、水層を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐｔ（８１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ溶液で透析を行って高分子ＤＮＡとする。　
この時点でＤ　Ｎ　Ａ　ｔａ度は、おおよそ５０〜１０
０μｇ／ｍ　ｌであり、ＤＮＡは８０Ｋｂ以上のものが
取得できた。

（２）ラムダクローニングベクターＥｍｂｌｅ３の８゜
袈Ｅｍｂｌｅ３ベクター　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔ
ｅｃ）　　（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ。

Ａ、、　Ｌｅｈｒａｃｈ、Ｈ，、Ｐｏｕｓｔｋａ、Ａ、
、＆　Ｍｕｒｒａｒｙ、Ｎ、、　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１７０　８２７−８４２（１９８
３））　１０℃ｇをＢａｉ＋ＨＩ反応液２０μｊ！　（
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，７ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩｚ、１００　ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　２−メル
カプトエタノール、０゜０１７ウシ血清アルブミン）に
溶し、２０ＶのＢａｍＨＩ（宝酒造）で３７℃、２時間
反応させ完全に消化した後、ＥＤＴＡを１５ｍＭになる
ように加えた。

７０℃１０分間処理し、制限酵素を不活化したのちエタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収し２６μβのＴＥ（１（Ｌｎ
ＭＴｒｉｓ−ｔｌｃＩ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐｔ１
８）に溶した。　次ぎに、２００のＥｃｏＲＩ　（東洋
紡）を加え３７℃、２時間反応させ、完全消化させたの
ちＥＤＴＡを１５ｍＭになるように加え、フェノール抽
出を行った。４．５μＡ　３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、
２２μｌのイソプロパツールを加え１５分間氷冷した。

　遠心後ペレットを５００μｌの０．３５Ｍ酢酸ナトリ
ウムＰ１１６．０　、エタノール混液（１：２．５）で
洗い、遠心後最終？農度１μｇ／μｌになるようにＴＥ
に？６解した。

１）Ｋｏｈｎｏ、に、、Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ、、Ｍｅｋａ
ｄａ、Ｅ、＆　０ｋａｄａ、Ｙ。

Ｓｏｍａｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、旦４２１
　（１９８５）２）Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｔ、、　Ｆｒ１
ｔｓｈ、Ｅ、Ｆ、、　＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　１ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎａｌ（Ｃｏｌｄ　　　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ
１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ） （３）インサートゲノムＤＮＡの調製 （１）で調製した高分子ＤＮＡｌ０μｇをＳａｕ　３Ａ
反応液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ　ｐＨ７，５，
７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１００ｍＭ　　ＮａＣ１）　１
００　、ｉＪ　ｌに？容かし、２０メｚ６１本、１０℃
ｌ８本の微量遠心チューブに分注した。　最初の２０ｔ
ｔｌのチューブに５ａｕ３Ａ　Ｉ　Ｕを加え、１０ｔ−
ｘｉを第２のチューブに移した。　同様の操作を行い、
５ａｕ３Ａ　２３度を倍々希釈したチューブを１０本作
り、３７℃で１時間インキュベートし、０．３％のアガ
ロースゲルに流し、高分子ＤＮＡを部分消化した。

泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、２０Ｋｂ前後
の長さに部分消化される条件を決めた。次に１００μｇ
の高分子ＤＮＡを１１の５ａｕ３Ａ反応液に溶かし、上
記の条件に必要なだけの５ａｕ３Ａを加え、３７℃１時
間反応させ、２０Ｋｂ前後にピークをもつ５ａｕ３Ａ部
分消化ＤＮＡを得た。これに等量のフェノール：クロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加
え、２回抽出を行い、水層を得た。最終濃度が０．１Ｍ
になるようにＮａＣ１を加え、倍量の水冷エタノールを
加え、ＤＮＡを沈澱させ回収した。

７０％エタノールで２回洗い、２００μｌのＴＥに溶か
し、６５℃１０分間処理した。

次に、ベックマン５Ｗ４１０−ター用ポリアロマ−チュ
ーブに１２ｍ１の５−２５％（Ｗ／い塩化ナトリウム密
度勾配溶液（３ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｐＨ８を含む）
を作り、上記のＤＮＡ溶液２００μｌを上層し、３７０
００回転４．５時間室温で遠心したのち、０　、２５ｍ
　ｌずつエノフェンドルフチューブに分画して集めた。

そのうち２５μｌをとり、０．３％アガロースゲル電気
泳動を行い、各画分に含まれるＤＮＡの長さを調べた。

１５Ｋｂ〜２２Ｋｂを含む画分に等量の純水を加え、１
ｍｌのエタノールを加え、−２０℃に放置し、Ｄ　Ｎ　
Ａを沈澱させ、目的のＤＮＡを回収した。沈澱したＤＮ
Ａは、７０％エタノールで２回洗ったのち、２０ｔｔｌ
のＴＥに溶解し、ＤＮＡの濃度をアガロースゲル上にス
ポットし、既知濃度のＤＮＡと比色することにより決定
した。

更に、上記ＤＮＡ　（３）１３℃ｇにＩＵのアルカリホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、分生腸由来
）を加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　ｐＨ９，５
，１ｍＭｓｐｅｒｍｉｃｈｉｎｅ、　　０．１ｍＭ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ反応液４Ｃｈｔｌ中で３７℃３０分処理し
た。

これに最終濃度１０ｍＭとなるようにニトリロ酢酸を加
え、７０℃１０分間処理したのち、エタノール沈澱を行
い、ＤＮＡを回収し、０．５μｇ／ｍ　１の濃度になる
ように１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，０，１
ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ溶液に溶解した。

（４）ライゲーション　びパッケージング（２）で調製
したベクター２μｇ、（３）で調製したインサートＤＮ
Ａ２　μｇをライゲーション反応液（６６＋ｎＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、　１ｍＭＡＴ
Ｐ）　２０，１７１に溶かし、Ｔ４ＤＮＡライゲース（
宝酒造）を２Ｕ加え、１２℃１２時間インキュベートし
た。

（４）のＤＮＡ溶液を５μｌを市販のλファージパッケ
ージングキソト（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社）０．５ｍｌのファージ希釈液（５，８ｇ　Ｎａ
Ｃ１，２ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０　５０ｍ１　ＬＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，５ｍｌ　　２％ゼラチ
ンに水を加え１１としたもの）を加え、その後２０μｌ
のクロロホルムを加えた。

（５）ラムダファージによるライフ゛ラリ−の言周製大
腸菌ＮＭ５３９株を一夜ＬＢ培地（バクトドリプトン１
０ｇ１酵母抽出液５ｇ、　ＮａＣ１５ｇ　、？ルトース
４ｇを純水に溶し１１としｐＨを７．５に調整したもの
）で培養し遠心で集菌したのち２００μｌの１０　ｍＭ
ＭｇＳ０４に懸濁した。　この液１００μｌと（４）で
調製したパッケージング液１００μｌを加え、室温で２
０分間放置し、ファージを細胞に吸着させた。

４５℃に冷えた２、５　ｍｌの寒天培地（ＬＢ培地に０
．６５Ｚの寒天１０　ｍＭのＭｇＳＯ４を加えたもの）
にファージと菌を加えＬＢ寒天培地（ＬＢ培地に１．５
ｚの寒天を加え径９ｃｍのプラスチックプレートに流し
込み一夜乾燥したもの）にまき３７℃−夜培養した。　
プレート５０枚で約２　ｘ　１０’個のプラークが形成
された。

このプレートをマスタープレートとし、この上に滅菌し
たニトロセルロースフィルター（径８２ｍｍ、ミリボア
ＨＡＴＦ）をのせ１分間放置し、２枚のレプリカフィル
ターを作製した。

実施例２　ハムスターＥＦ−２遺伝子を完全に含むクロ
ーンの選択 （１）プラークハイブリダイゼーションによるクローニ
ング １）ＤＮＡの固定 上記のフィルターを■０，５Ｎ　ＮａＯＨ，０１Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，０３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌ
ｃｌ　ｐＨ７，５＋　１．５Ｍ　ＮａＣ１の順に５分処
理、３分乾燥の操作を繰り返し、その後１時間自然乾燥
させたのち、７５℃２時間処理し、ＤＮＡをフィルター
に固定した。

ｉｉ）プリハイブリダイゼーション フィルターを３ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：０．３ＭＮａＣｌ。

０．０３Ｍクエン酸３ナトリウム）＋　０．１％ＳＤＳ
溶液で６０℃１５分間洗い、次に３ｘＳＳＣ，ＩＯＸデ
ンハート？ｇ？ｆ１．　（５０ｘデンハ一ト溶液＝１％
フィコール、１％ポリビニルピロリドン、１％牛血清ア
ルブミン）５０Ｍｇ／＋ｎｌ変性ニシン精子Ｄ　Ｎ　Ａ
溶液に浸し、６０℃で３時間以上処理した。

ｉｉｉ　）ニックトランスレーションによるプローブの
ハ ハムスターＥＦ−２ｃＤＮＡ　（Ｋｏｈｎｏ、に、。

Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ、、　０ｈｋｕｂｏ、Ｈ，、Ｎａｋａ
ｎｉｓｈｉ、Ｔ、、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ。

Ｔ、、　Ｆｕｋｕｉ、Ｔ、、　０ｈｔｓｕｋａ、Ｅ、、
　Ｉｋｅｈａｒａ、Ｍ、、　＆　０ｋａｄａ、Ｙ、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８
３４９７８）のＢｇｌ　ＩＩ　−５ｍａ　Ｉ断片５２０
ｂｐ　（プローブＡ）（第３図参照）をニックトランス
レーション（Ｒｉｇｂｙ、ＰＪ。

Ｊ、、Ｄｉｅｃｍａｎｎ、Ｍ、、　Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ，
、＆　Ｂｅｒｇ、ｐ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１
１３２３７（１９７７））により標識し、プローブとし
た（比活性＞１０”ｃｐｍ／μｇ　　ＤＮＡ）。

ｉｖ）ハイブリダイゼーション ５０組１００枚のフィルターをプリハイプルダイゼーシ
ョンと同様の溶液４０ｍ１に浸し、９５°Ｃ５分処理し
た後、急冷し熱変性させたプローブＡを１０’ｃｐｍ加
え、６５℃３０時間反応させた。反応後３ＸＳＳＣ＋０
．１％ＳＤＳ溶液でフィルターをよく洗い乾燥させたの
ち、オートラジオグラフィーを行って陽性を示すプラー
クをマスタープレートから拾った。

以上の操作により合計２００万個にプラークから１７個
の陽性クローンを得ることができた。

選抜 上記の様にして得た１７クローンをＬｍｌの鮒培地（Ｎ
ａＣ１５，８ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ　・７ＨｚＯ２ｇ　ＳＬ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５５０ｍ１．２Ｚゼ
ラチン５ｍｌに純水を加え１１としたもの）にそれぞれ
加え一滴クロロホルムを加え４℃に４−６時間放置した
。このうち、Ｆｒｉ　ｔｓｃｈＥ、Ｆ、の方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙｍａｎｕａｌ、　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、
Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏ。

ｋ　ｐ、３７１−３７２　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に
従ってλファージで調製した。　このＤＮＡをＢａｍＨ
ＩまたはＰｓｔ　Ｉで完全消化したのち１％のアガロー
スゲルに流し、ニトロセルロースフィルター上へのサザ
ンブロッテイングを行った。

またＥＦ−２ｃＤＮＡの■５′末端プローブＢ（Ｐｓｔ
　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉ［に断片約４５ｏｂｐ）■プローブ
Ａ■３′末端プローブＣ（Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌｌ
断片約２３０ｂｐ）　（第３図）をそれぞれニックトラ
ンスレーションによりラヘルし、サザンブロッティング
のプローブとして用いた。その結果、完全長ＥＦ−２遺
伝子を含むと考えられる、即、上記の３プローブとすべ
てハイブリダイズするクローン４種類を得た（λ６゜λ
７．λ９．　λ１６）。

実施例３ ジフテリア毒素耐性ＥＦ−２遺伝子のマウスＬ細胞での
発現 マウスＬ細胞を８Ｘ１０’細胞ずつ３５ｍｍ径プラスチ
ック培養用ペトリ皿にまき、３７℃１日、ＣＯ□インキ
ューベーターで培養後、先のλ６．　λ７．λ９゜λ１
６のファージＤＮＡを最終濃度１μｇ／ｍｌの濃度とな
るようにリン酸カルシウム共沈澱法（Ｓｐａｎｄｉｄｏ
ｓ、Ｄ、Ａ、、＆　Ｗｉｌｋｉｅ、Ｎ、Ｍ、”Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”
ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｌｔｄ、ｂｙ　　ｌｌａｍｅ
ｓ、Ｂ、Ｄ、＆　　ｆｉｔｇｉｎｓ、Ｓ、Ｊ、、１−４
８　（１９８４）　）に従い作成した。１７０μ２ずつ
を細胞上に滴下し、２４時間細胞に取り込ませたのち、
培養液で細胞をよく洗い新しい細胎増殖用培地（αＭＥ
Ｎ　＋　８％　分生胎児血清）に交換した。さらに、２
４時間培養後、ジフテリア毒素（ＤＴ）と同じ毒作用を
示す緑膿菌外毒素Ａ　（ＰＡ）を０゜０５μｇ／ｍｌに
なるように培地に加え培養を続けた。

３日後に２μｌ／ｍｌの〔３Ｈ〕−ロイシンを含むＦ１
２培地で２時間培養し、蛋白合成を調べた。その結果λ
７とλ９のファージＤＮＡを用いた場合にのみ毒素存在
下での蛋白合成能が認められたので、これらのクローン
中には、毒素耐性型ＥＦ−２遺伝子が機能ある形で含ま
れていることが判明した。

実施例４ ジフテリア毒素耐性型ＥＦ−２遺伝子のサブクローニン
グ 上記クローンλ７およびλ９をＢａｍＨＩで完全消化し
たのち、サザンプロットを行うとＥＦ−２ｃＤＮＡの３
つのプローブＡ−Ｃは、すべてに１つのＢａｍＨＩ断片
すなわちλ７クローンでは８．５Ｋｂ、λ９クローンで
は１４Ｋｂの断片とハイブリダイズすることが明らかと
なったのでλ９由来の８．５ＫｂＢａｍＨＩ断片のサブ
クローニングを行った。

λ７ＤＮＡ１μｇをＢａｍＨＩ　３　Ｕで３７℃２時間
反応し、完全消化したのち１％の抵触点アガロースゲル
（マリンコロイド社）に流し、８．５Ｋｂ　ＢａｍＨＩ
　Ｗｒ片を切出し、５倍量の抽出液（５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　ｐｌ（７，９，１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、
０．５ＨＮａＣ１）を加え６５℃１５分間加温してゲル
を溶解した。こののちフェノール抽出を行い、水層をエ
タノール沈澱し、８．５Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を得た（
５０ｍｇ＃７ｇ＃ｊ　Ｉ！ｉｎ　　Ｔ　Ｅ溶液）。

ｐＵｃｌ　８ＤＮＡ　（宝酒造）　　（Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ。

、Ｖｔｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｔｎｙ、Ｊ、Ｇ
ｅｎｅ、３３１０３（１９８５））１、ｃｚｇを４Ｕの
ＢａｍＨＩで３７℃２時間処理し、完全に消化したのち
フェノール抽出、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し
た。さらに２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，２
９μｉに？容かし、アルカリホスファターゼ０、５　ｔ
Ｊ　（宝酒造）を加え、５０℃で４５分間処理し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱を行い２０μｌのＴＥに溶
かした。このＢａｍＨＩ消化ｐＵｃ１８２００ｍｇに先
程調製した８、５Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片１１００ｎを加
えライゲージシン反応液１０μｒに溶かしく６６ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、
　１０ｍＭ　　ＤＴＴ　１ｍＭ　　ＡＴＰ）Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０．５　Ｕ　（宝酒造）を加え、１０゛Ｃで一
晩反応させた。この液５μｌを用い１００ｉｔ　ｌ　（
７）１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、４０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ形質
転換溶液を作り、これとＣａＣ１ｚを用いて調製したコ
ンピテント細胞（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１株）１０
０μｌを混ぜ、０℃２０分、室温１０分放置したのち１
ｍｌのＬＢ培地を加え３７℃１時間培養後、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌ加えたＬ　Ｂ寒天培地上に播種した。

−晩培養後、単ｌコロニーをとり実施例２　（２）と同
様少量培養し、ＢａｍＨＩ　Ｂ、５Ｋｂ断片を１つ組み
込んだプラスミドｐｇＨＥＤ７（第１図）を単離した。

実施例５ ｐｇＨＥＤ７を用いたマウスＬ細胞での毒素耐性形質の
一過的発現 ｐｇＨＥＤ７プラスミドにＥＦ−２遺伝子が機能ある形
ではいっているか否かを確かめる為に、このプラスミド
をマウスＬ細胞に導入し、ＰＡ存在下で蛋白合成を行な
えるのかどうかを実施例３の手順で同様に行った。その
結果、毒素耐性形質の発現が確認された為ＢａｍＨＩ　
Ｂ、６Ｋｂ断片にハムスターＥＦ−２遺伝子が存在する
ことが明らかとなつた。

実施例６ ハムスターＥＦ−２遺伝子の構造解析 （１）　　ＥＦ−２遺伝子の制限酵素１図の作製各種制
限酵素（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏ　Ｉ　、Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｐ
ｖｕ　ＩＩ　、Ｓａｃ　Ｉ　。

Ｈｉｎｄ　ｍ、Ｓｍａ　Ｉ　、Ｂｇｌ　Ｕ　、Ｓａｌ　
Ｉ　、ＥｃｏＲＩ　、Ｋｐｎ　ｒ　、Ｃ１ａＩ等）を用
いｐｇＨＥＤ７を１種または２種の制限酵素により切断
することによりｐｇＨＤＥ７の制限酵素地図（第１図）
を作成した。

ｐｇＨＥＤ７を適当な制限酵素を用い１００塩基対から
５００塩基対程度の断片にし、ポリアクリルアビドゲル
により各断片を調製し、Ｍ１３ファージ由来のｎ＋ｐ１
８．ｍｐ１９のマルチクローニングサイト（（Ｙａｎｉ
ｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃｍ　、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、、＆
　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｇｅｎｅ□１０３　（１９８５
））にリクローニングすべき断片を挿入し、大腸菌ＪＭ
１０５株にトランスフェクトした。目的の断片が挿入さ
れたか否かはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−叶チオガラ
クトピラノシド）存在下でＸ−Ｇａ　ｌ　（５−ブロモ
−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトサイド）
が代謝されたかどうか、すなわち白色のプラークを形成
するか否かにより選択した。このプラークから目的の断
片を含むファージを培養し、上清から１本鎖のファージ
Ｄ　Ｎ　Ａを調製、ジデオキシ法　（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ
、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１４１２０５　（１９８１）の鋳型
として使用した。

第２図にハムスターＥＦ−２遺伝子発現の為に必要な領
域（すなわちプロモーターとエンハンサ−を含む領域）
約３４０種類の配列と第１エキソンの配列を示した。Ｅ
Ｆ−２ｍＲＮＡは真核細胞のプロモータとして機能する
ＴＡＴＡＡＡＡの下流２５及び２８塩基下流から読み初
めていることが、ｍＲＮＡとのＳｒマフピング及びＥＦ
−２ｃＤＮＡとの塩基配列の比較から明らかとなった。

またＥＦ−２遺伝子とＥＦ−２ｃＤＮＡの塩基配列の比
較からＥＦ−２のエキソン、イントロン連結部が明らか
となった。　その結果ＥＦ−２ゲノム遺伝子は１３個の
エキソンおよび１２個のイントロンよりできていること
が明らかとなった。

その遺伝子地図を第１図に示した。

実施例　７ ｐｇＨＥＤ７のマウスＬ細胞での長期的発現マウスＬ細
胞を５Ｘ１０’細胞／１００＋ｎｍペトリ皿にまき、２
４時間培養後ｐｇＨＥＤ７　１μｇＤＮＡを実施例３と
同様にリン酸カルシウム共沈澱法でトランスフェクトし
、２４時間後、培養液を除き、良く細胞を洗ったのち、
新しい培地で２４時間培養を続けた。次にジフテリア毒
素と同じ毒作用を示す緑膿菌外毒素Ａ（ＰＡ）を０．０
５μｓ／ｍｌになるように培地に加え、１０日間培養を
続け、毒素存在下で形成されたコロニー数を算定した。

対照としてＣＨ０−ＫＩ細胞由来の高分子ＤＮＡＩμｇ
を同様にトランスフェクトした細胞では、コロニーは全
く検出されなかったが、ｐｇ）（ＥＤ７をトランスフェ
クトした細胞ではプレートあたり約５５０個のコロニー
が形成された。表１にその結果を示す。

表１　毒素存在下でのコロニー形成数

【図面の簡単な説明】 第１図は、ｐｇＨＥＤフィンサート：ハムスター細胞由
来のジフテリア毒素及び緑膿菌外毒素耐性ポリペプチド
鎖伸長因子−２のゲノム遺伝子の制限酵素地図である。 　図中、黒枠で示した部分はエクソンを表す。 第２図は、ハムスターＥＦ−２遺伝子のプロモーターと
エンハンサ−を含む領域、約３４０種類の配列と第１エ
キソンの配列を示す図である。 第３図は、ハムスターＥＦ−ｌｊ！伝子のｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＨＥＷ１の制限酵素地図を表す。　図中
、Ａ、、Ｂ、Ｃは、プローブとして用いた断片を表す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハムスター細胞由来のジフテリア毒素及び緑膿菌
   外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２のゲノム遺伝子
2. （２）ハムスター細胞由来のジフテリア毒素及び緑膿菌
   外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２のゲノム遺伝子
   を含むプラスミド
3. （３）ハムスター細胞由来のジフテリア毒素及び緑膿菌
   外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２のゲノム遺伝子
   を含むプラスミドを保持する微生物あるいは動物細胞
4. （４）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐｇＨＥＤ
   ７）株と命名された特許請求の範囲第３項記載の微生物
5. （５）ハムスター細胞由来のポリペプチド鎖伸長因子−
   ２のゲノム遺伝子のプロモーター・エンハンサー領域を
   コードするＤＮＡ
6. （６）ハムスター細胞由来のポリペプチド鎖伸長因子−
   ２のゲノム遺伝子のプロモーター・エンハンサー領域を
   コードするＤＮＡを含むプラスミド
7. （７）ハムスター細胞由来のジフテリア毒素及び緑膿菌
   外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２のゲノム遺伝子
   から成る選択マーカー