CN1314808C - 绿脓毒素基因及其包装与导向蛋白复合物对癌的靶向基因治疗 - Google Patents

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本发明涉及突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，包含所述重组DNA的表达型重组体，以及由所述的表达型重组体与一种融合蛋白的复合物制备的针对恶性肿瘤特别是细胞表面表皮生长因子富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗药物。所述的融合蛋白由人组蛋白H1一部分和人表皮生长因子一部分组成，其也是本发明的一个方面。

Description

绿脓毒素基因及其包装与导向蛋白复合物 对癌的靶向基因治疗
本发明涉及突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA，包含所述重组DNA的表达型重组体，以及由所述的表达型重组体与一种融合蛋白的复合物制备的针对恶性肿瘤特别是细胞表面表皮生长因子(EGF)富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗药物。所述的融合蛋白由人组蛋白H1一部分和人表皮生长因子一部分组成，其也是本发明的一个方面。
绿脓杆菌毒素(PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素，具有三个结构域，结构域Ia(AA1-252)为细胞结合结构域，结构域II(AA253-364)为转运结构域，结构域III(AA405-613)为ADP糖基化区域，结构域II和结构域III又合称为PE40，而结构域Ib(AA365-404)无明显的生物学功能。PE是一种极毒的毒素，仅仅对小鼠一次静脉注射0.3微克即可使之在24小时内死亡。对于一个细胞来说，几个分子的毒素的导入即可使这个细胞死亡。由于PE这种独特的性能，使得其作为一种很有前途的毒素被应用到肿瘤基因治疗中去。
恶性肿瘤的传统治疗方法，如手术、放射治疗、化学治疗以及对于某些类型肿瘤的内分泌治疗，很多情况下疗效不好，从而基因治疗手段逐渐成为恶性肿瘤治疗方法中最有前景的一种。靶向性基因治疗，又称“生物导弹”技术，正越来越引起人们的关注。第一代生物导弹的设计思路是将单克隆抗体与药物、核素或毒素蛋白融合在一起用于临床治疗，其主要问题是靶向性差；第二代生物导弹的设计思路是将不同功能的基因区段拼接所构建的融合蛋白作为“分子导向”型导弹。如人工构建IL2-PEA0融合蛋白用于治疗某些自身免疫性疾病。其主要问题是人工构建的融合蛋白由于其中的PE40对人体而言是异源蛋白，在人体应用时会有较强的免疫原性，无法实际在临床上推广；第三代生物导弹主要设计思路是利用治疗基因(或基因片段)与多聚阳离子分子形成DNA-蛋白质复合体，利用此复合体中蛋白质上的特异性配体作为分子识别蛋白，将整个复合体特异性导向到靶细胞实现其靶向性设计。
关于特异性配体的选择，病理统计结果表明，在癌症患者中有40-50％的不同种类的肿瘤，即鳞状上皮癌的癌细胞表面表皮生长因子(EGF)受体过度表达，这一现象甚至成为所患癌症危害程度的指标之一。体内癌组织出现此现象的患者，经传统疗法治疗之后往往预后不良。也许正是与此有关，这一类型的癌症成为基因治疗的首选目标之一。富集于癌细胞表面的EGF受体虽然标志着更高的恶性程度，但在基因治疗的研究当中，却为癌细胞的选择性杀伤提供了足以利用的标靶。但是使用完整EGF分子作为配体会造成刺激DNA合成与细胞增殖的分子效应出现，从而促进恶性肿瘤在体内增殖。因此改造配体也成为制备这一类型基因治疗药物的关键，这也是本发明中所涉及的一个方面。
另外，经常用于结合DNA的多聚阳离子为多聚赖氨酸(polylysine)，但大部分的多聚赖氨酸都是人工合成的，在基因治疗临床应用中成本极高(在美国，固相合成的28aa，1克约为40～50万美元，在中国，约为150～160万人民币)，以致于即使临床试验成功，也几乎无法在临床推广应用。为了降低成本，并尽可能减少外源物质引起免疫原性的可能，需要有更廉价易得且无免疫原性的结合DNA的多聚阳离子物质。这一点也是本发明所考虑解决的问题之一。
因此，本发明的一个目的在于提供一种突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA及包含所述DNA的表达型重组体，该重组DNA编码的突变绿脓杆菌毒素毒性更强。
本发明的另一个目的在于提供一种恶性肿瘤靶向基因治疗药物，其包含所述的表达型重组体与一种融合蛋白的复合物。所述的融合蛋白由人组蛋白H1一部分和人表皮生长因子一部分组成。
本发明的再一目的在于提供一种融合基因，该融合基因编码用于生产本发明的靶向基因治疗药物中的融合蛋白，所述融合蛋白包括人组蛋白H1的106个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸，或者所述融合蛋白包括人组蛋白H1的221个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸。此类融合蛋白是用基因工程技术方法生产的，同固相合成比较，其造价约可降低2～3个数量级，以便于临床实验及可能的临床应用。
根据本发明的第一个方面，提供了突变改型的编码绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNA以及包含所述重组DNA的表达型重组体。所述的重组DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其是通过将绿脓杆菌毒素第III结构域C端的5个氨基酸残基REDLK的密码子突变为KDEL的密码子并引入终止密码子TAA而得到，以下称该重组DNA为PEIIImut。PEIIImut所编码的蛋白产物的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。PEIIImut可根据本领域公知的技术引入各种表达载体以用于构建表达型重组体，从而表达所述的毒素蛋白。这种表达型重组体的一个例子是pcDNA(3.1)-PEIIImut，以pcDNA(3.1)-PEIIImut转化的大肠杆菌DH5α/pcDNA(3.1)-PEIIImut于2000年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0478。
根据本发明的第二方面，提供了恶性肿瘤的靶向基因治疗药物，其包含本发明第一方面所述的包含PEIIImut的表达型重组体与一种融合蛋白的复合物。所述融合蛋白包括人组蛋白H1(第115位-第221位)的106个氨基酸和人表皮生长因子C环的最后22个氨基酸，或者所述融合蛋白包括人组蛋白H1(第1位-第221位)的221个氨基酸和人表皮生长因子(EGF)C环的最后22个氨基酸。在本发明的这种靶向基因治疗药物的应用中，PEIIImut的表达型重组体与融合蛋白中的DNA结合组分人组蛋白H1紧密结合，融合蛋白中的定向组分人表皮生长因子C环通过与恶性肿瘤细胞表面的EGF受体结合而将复合物导入恶性肿瘤细胞，在肿瘤细胞中PEIIImut表达型重组体表达毒素蛋白，从而将肿瘤细胞杀死。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种融合基因，该融合基因编码用于本发明的靶向基因治疗药物中的融合蛋白，所述融合蛋白从5′到3′依次包括人组蛋白H1的106个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸(含42个赖氨酸和3个精氨酸，即45个带正电氨基酸)，或者所述融合蛋白从5′到3′依次包括人组蛋白H1的221个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸(含62个赖氨酸和6个精氨酸，即68个带正电氨基酸)。其中包括人组蛋白H1的106个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸的融合蛋白命名为H1.3-EGFc，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其编码序列如SEQ IDNO：3所示。包括人组蛋白H1的221个氨基酸和人表皮生长因子C环的22个氨基酸的融合蛋白命名为H1-EGFc，其氨基酸序列如SEQID NO：6所示，其编码序列如SEQ ID NO：5所示。用含有两个拷贝的H1.3-EGFc编码序列的质粒MFLII转化巴氏毕赤酵母KM71获得的转化子巴氏毕赤酵母/KM71/MFLII于2000年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0476。而用含有H1-EGFc编码序列的质粒pLY1-H1-EGFc转化大肠杆菌DH5α获得的转化子大肠杆菌DH5α/pLY1-H1-EGFc于2000年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0477。
具体地，由于本发明的设计是将毒素基因导入肿瘤细胞中表达，因此就不需要毒素的跨膜转运结构域。正是基于这种原因，本发明第一方面涉及的毒素基因中仅含有绿脓杆菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III结构域的编码序列。该编码序列在靶细胞中表达出的蛋白可作为杀死靶细胞的毒素。另外，本发明人用白喉毒素C端的4个氨基酸残基KDEL替换了PE毒素C端的5个氨基酸残基REDLK，由此大大增强了毒素的杀细胞能力。另外，由于毒素蛋白是在细胞内进行表达，这就彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。即使在靶细胞崩解后，其中的毒素蛋白也许可能被机体免疫识别系统捕获，从而产生抗体，但这些抗体既无法清除细胞内的毒素蛋白，也不会和作为毒素蛋白表达载体的质粒DNA发生反应。
关于本发明的基因治疗药物中的特异性配体EGF，现有技术已知使用完整EGF分子作为配体势必会造成刺激DNA合成与细胞增殖的分子效应出现，从而促进恶性肿瘤在体内增殖。而本发明中利用了表皮生长因子53个氨基酸中，最后的22个氨基酸不但不具有刺激DNA合成、细胞增殖的能力，反而具有抑制DNA合成的能力。与此同时，这22个氨基酸仍具备与EGF受体结合的能力，可以作为靶向蛋白与恶性肿瘤细胞表面富集的EGF受体结合。也即本发明的融合蛋白中使用的EGF分子片段具有安全和有效的特点。
本发明的融合蛋白中利用人体内正常存在的组蛋白H1作为DNA的结合分子。组蛋白H1含有足够数量的碱性氨基酸，特别是大量的赖氨酸，在一定pH条件下带有正电荷，能通过静电作用与带负电荷的DNA结合。其自然形态本身就在真核生物基因组DNA的折叠、浓聚方面有重要的作用，这样设计可以在保证DNA分子充分浓聚的基础上保证了低免疫原性。
以下将参照附图和实施例详细描述本发明。
图1为本发明的总体设计图。
图2为pcDNA(3.1)-PEIIImut的图谱。
图3示出含有融合基因H1-EGFc的重组质粒PET30a-H1-EGFc的构建过程。
图4示出含有融合基因H1-EGFc的重组表达质粒pLY1-H1-EGFc的构建过程。
图5示出含有融合基因H1.3-EGFc的重组表达质粒MFLII的构建过程。
图6示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理JK细胞(一种不含EGF受体的白血病细胞)的实验结果的统计图，其中组1为空白对照，组2为靶向蛋白H1-EGFc处理组，组3为质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut处理组，组4为H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1微克)处理组，组5为H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2微克)处理组，组6为H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)处理组。
图7示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理BT-325细胞(一种表面富集EGF受体的神经胶质瘤细胞)的实验结果的统计图，其中组别同图6。
图8示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理Hela细胞(一种表面富集EGF受体的宫颈癌细胞)的实验结果的统计图，其中组别同图6。
图9示出在EGF存在下用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理Hela细胞的实验结果的统计图，其中组1为空白对照，组2为H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)处理组，组3为H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)加EGF(3微克)处理组。
图10示出用H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理Hela细胞的实验结果的统计图，其中组1为空白对照，组2为质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut处理组，组3为靶向蛋白H1.3-EGFc处理组，组4为H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1微克)处理组，组5为H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIHmut(2微克)处理组，组6为H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)处理组。
图11示出用H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理JK细胞的实验结果的统计图，其中组别同图10。
图12示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物处理BT-325细胞的实验结果的统计图，其中组别图10。
实施例1PEIIImut的克隆及包含其的表达型重组体的构建
1、PEIIImut的扩增和克隆
以含有绿脓杆菌毒素PE40的质粒pZM3(本发明人构建)为模板，用序列如下的引物经PCR扩增出绿脓杆菌毒素第III结构域的编码序列。所用的引物序列中引入了EcoRV和EcoRI的识别序列并且引入了意在使PEIII编码序列3′端如上所述的5个氨基酸的密码子突变为4个氨基酸的密码子的序列，引物序列为：
上游引物(33bp)：5′-tc gatatcac catgctcggc gacggcggcg acg-3′
                      EcoRV Kozak序列
下游引物(40bp)：5′-g gaattctta cagttcgtcc ttcggcggtt tgccgggctg-3′
                      EcoRI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性40秒，56℃退火40秒，70℃延伸40秒。经35个循环后，70℃延伸10分钟。以琼脂糖凝胶电泳玻璃纤维法回收PCR产物中660bp的目的DNA片段。所得扩增片段经EcoRV和EcoRI双酶切，再以琼脂糖凝胶电泳玻璃纤维法回收酶切产物中的目的DNA片段。
2、表达型重组体的构建
将上述回收的目的DNA片段与同样经EcoRV和EcoRI处理的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisA(本实验室保藏)的DNA片段相连接，并转化大肠杆菌菌株JM109。筛选出阳性克隆，从中制备质粒，用EcoRV和EcoRI酶切鉴定所得质粒。由此鉴定出约含有650bp插入片段的阳性重组质粒，命名为pcDNA(3.1)-PEIIImut(图谱见图2)。经测序显示所得PEIIImut片段的序列与所设计的序列相吻合。PEIIImut的大小为642bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，其中黑体字示出了突变为KDEL的氨基酸密码子的序列。
3、pcDNA(3.1)-PEIIImut对细胞的毒性试验
用Hela细胞(得自中国医学科学院肿瘤研究所)测试pcDNA(3.1)-PEIIImut对细胞的毒性。
将在液氮中保存的Hela细胞解冻，然后将细胞转移至内装5ml含10％FBS的1640细胞培养基(Promega公司)的培养瓶中。置37℃、5％CO2的恒温细胞培养箱中，进行培养并传代。将长势旺盛的Hela细胞，用胰酶消化悬浮。以新鲜的细胞培养基(含10％FBS)稀释至1×105细胞/ml。以0.5ml/孔接种24孔细胞培养皿中的15个孔，此15孔分3排，每排接种5孔。置37℃、5％CO2的恒温细胞培养箱中，培养12小时；等细胞贴壁后，用于转染。按Promega公司的Lipofectin试剂的说明书进行操作。以空载pcDNA(3.1)作对照试验。
具体地，将100μl的Lipofectin试剂溶于900μl的无血清的1640细胞培养基中；分别将15μg的pcDNA(3.1)-PEIIImut质粒和空载pcDNA(3.1)溶于1ml的无血清的1640细胞培养基中。将这些溶液分别经针头滤器(0.22μm)过滤除菌。各取0.5ml的Lipofectin溶液，分别与两种质粒的溶液混匀。置室温放置15分钟，使Lipofectin与质粒进行结合。将上述准备的Hela细胞3排中的2排培养基吸除，以无血清1640细胞培养基(每孔1ml)洗细胞一次。分别加入0.5ml的无血清1640细胞培养基，然后分别加入0.3ml的上述两种Lipofectin与质粒DNA结合的溶液(每种溶液加一排5孔)。然后将细胞置37℃、5％CO2下培养12小时。再将15孔中的培养基全部吸出，用Hanks液将经转染的细胞洗两遍后，往每孔中加入1ml含10％FBS的1640培养基，置37℃、5％CO2下。48小时后，将24孔细胞培养皿中的15孔细胞按前述方法进行消化悬浮。充分混匀后加入1％的台盼蓝，进行细胞计数。实验结果为，质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut经Lipofectin介导转染Hela细胞，与空载的pcDNA(3.1)经Lipofectin介导转染Hela细胞相比，活细胞数减少19.67％。详见下表1。
表1.Lipofectin介导的毒素基因转染Hela细胞的试验结果
  转染复合物组分                             活细胞数(105)
  1   2   3   4   5   平均值±SD
  空白(对照)   5.000   4.525   4.425   4.850   4.750   4.710±0.235
  pcDNA(3.1)-PEIIImut   1.150   1.275   1.050   1.225   1.325   1.205±0.108
  pcDNA(3.1)   1.775   1.450   1.550   1.375   1.500   1.500±0.151
注：pcDNA(3.1)-PEHI组与pcDNA(3.1)组之间差异极显著
实施例2H1-EGFc融合基因的构建
1、组蛋白H1基因片段的扩增
用人类胎盘DNA(本实验室自行制备)为模板，以如下引物经PCR扩增人组蛋白H1基因，所用引物如下：
上游引物：5′-TA CATATGTCGGAGACTGCTCCAC-3′
                 NdeI
下游引物：5′-C GAATTCTTTTTCTTCGGAGCTGCCTTC-3′
                EcoRI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性35秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。以1％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的DNA片段，得到0.7kb左右的DNA片段。
2、EGFc基因片段的扩增
用含EGF基因的pUC19重组质粒(中国医学科学院基础医学研究所黄秉仁惠赠)为模板，以如下引物经PCR扩增人EGF C环区段的编码序列，所用引物如下：
上游引物：5′-GC GAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTAC-3′
                 EcoRI
下游引物：5′-C GGATCCTCATTATTCCCACCACTT-3′
                BamHI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性35秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳回收PCR产物中的目的DNA片段，得到80bp左右的DNA片段。
3、H1-EGFc融合基因的构建
将上述1和2步骤中回收的H1和EGFc基因片段用EcoRI酶切，在此酶切体系中加入T4DNA连接酶，连接过夜，之后用琼脂糖凝胶电泳的玻璃纤维法回收连接产物中的0.7-0.9kbDNA片段。将此回收的DNA片段经PCR扩增，扩增用引物为
H1上游引物5′-TA CATATGTCGGAGACTGCTCCAC-3′
                  NdeI
EGFc下游引物：5′-C GGATCCTCATTATTCCCACCACTT-3′
                    BamHI
PCR反应条件为：94℃变性5分钟后开始循环：94℃变性35秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。用玻璃纤维法回收此反应体系中目的DNA片段，获得0.7-0.8kb的DNA片段。
4、融合基因的克隆和测序
用Promega公司的pGEM T-vector试剂盒按厂商指导将上述步骤3中回收的0.7-0.8kb DNA片段克隆进pGEM T载体中，得到质粒pGEM-H1-EGFc，用该质粒转化大肠杆菌。按分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社)的碱裂解法小量制备质粒DNA，限制性分析证实质粒插入物大小与融合基因相符。经测序表明H1-EGFc融合基因的编码序列如SEQ ID NO：5所示。
实施例3含有融合基因H1-EGFc的重组表达载体pLY1-H1-EGFc的构建
1、含有融合基因H1-EGFc的重组表达载体PET-30a-H1-EGFc的构建
将实施例2中步骤4得到的质粒pGEM-H1-EGFc用NdeI和NcoI双酶切，回收含融合基因H1-EGFc的约0.7kb-0.8kb的DNA片段。同时用NdeI和NcoI双酶切PET30a(本实验室保存)回收大片段。用T4DNA连接酶将两个回收片段连接过夜。连接混合物转化大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆，分离抗性克隆的质粒DNA，用NdeI和NcoI双酶切证实重组质粒，所得质粒称为PET30a-H1-EGFc。这一构建过程见图3所示。
2、含有融合基因H1-EGFc的重组表达载体pLY1-H1-EGFc的构建
将上述质粒PET30a-H1-EGFc用NdeI和BamHI双酶切，回收含融合基因H1-EGFc的约0.7kb-0.8kb的DNA片段。同时用NdeI和BamHI双酶切pLY1(本实验室早先构建)回收5kb左右片段。用T4 DNA连接酶将两个回收片段连接过夜。连接混合物转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选抗性克隆，分离抗性克隆的质粒DNA，用NdeI和BamHI双酶切证实重组质粒，所得质粒称为pLY1-H1-EGFc。这一构建过程见图4所示。
另外，以同样的方式将从质粒PET30a-H1-EGFc用NdeI和BamHI双酶切回收的含融合基因H1-EGFc的约0.7kb-0.8kb的DNA片段克隆进PET15b(本实验室保存)，构建成PET15b-H1-EGFc。
实施例4融合蛋白H1-EGFc的表达
将实施例3获得的质粒pLY1-H1-EGFc转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上筛选转化子。将转化子按2％的比例接种装有700毫升补加氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基的2000毫升培养瓶，32℃、250rpm培养3.5小时，再42℃、250rpm温度诱导3.5小时。离心收获菌体，经SDS-PAGE电泳分离纯化融合蛋白产物。
实施例5H1.3-EGFc融合基因的构建
用如下引物从实施例3构建的质粒PET15b-H1-EGFc扩增出融合基因H1-EGFc的片段，同时引入KEX2-XhoI和NotI识别序列。所用引物为
正向引物(35bp)：
               XhoI
反向引物(26bp)：
Figure C0013711600162
                NotI
PCR反应条件为：94℃变性40秒，55～60℃退火40秒，75℃延伸40秒～1分钟。经35个循环后，75℃延伸10分钟。得到对应大小(416bp)的扩增片段。经XhoI和NotI双酶切后与经同样双酶切的pPIC9*质粒连接，构建了pPIC9*-target质粒。使用BamH1及BglII双酶切证实所得质粒的正确。将此质粒测序，其中所含的融合基因命名为H1.3-EGFc，其编码序列如SEQ ID NO：3所示。
上述所用的质粒pPIC9*是考虑到在一个质粒上实现多拷贝表达盒的需要，对质粒pPIC9上原有的BamHI位点利用Klenow酶大片段进行填平操作而构建的。而质粒pPIC9是Invitrogen公司产品，其为一种E.coli-巴氏毕赤酵母穿梭质粒，能实现外源基因整合于Pichia pastoris基因组并分泌表达的载体。含colE1复制子和氨苄青霉素抗性筛选标记；在巴氏毕赤酵母中可整合于巴氏毕赤酵母基因组的HIS4或AOX1位点，筛选标记为组氨酸营养筛选。启动子P5’AOX1可被甲醇强烈诱导，其下游与酿酒酵母Saccharomcyces cerevisiae的α-因子分泌信号肽序列相融合，转录终止序列TT来自3′AOX1基因。在酵母一大肠杆菌穿梭质粒中，从AOX基因启动子及其下游分泌信号肽序列，编码基因直至转录终止序列TT的整体合称为一个“表达盒”。
为了使构建的质粒能够在巴氏毕赤酵母中表达，选择pPIC9*穿梭载体为工具载体。在这个表达载体中，XhoI酶切位点为外源基因多克隆位点之一，它位于α-因子信号序列切割位点(Glu-Lys-Arg*Glu)的上游11bp处。当XhoI位点被用于克隆时，重组质粒必须恢复决定XhoI位点的6个碱基及紧随其后的6个碱基，以保证信号序列的正确切割和目的蛋白的分泌。为此，在PCR的上游引物中加入了XhoI特异切割序列CTCGAG和编码Lys-Arg的6个碱基，在其后紧接着H1-EGFc编码基因序列。由于H1-EGFc的第一个氨基酸为Glu，符合α-因子信号切割序列对切割位点下游第一个氨基酸的要求，所以构建的表达载体在实际表达时，氨基端不带有多余氨基酸，最大程度上保持了编码蛋白的自然序列。下游引物的设计中加入了NotI位点，这样可以使编码基因定向克隆入pPIC9*穿梭质粒中。
实施例6含有多拷贝融合基因H1.3-EGFc表达盒的质粒的构建
为了实现一个质粒上多表达盒重复拷贝，需要在表达盒的起始端引入BglII位点，在其末端引入BamHI位点。由于BglII和BamHI分别切割后的末端连接后不能被两个酶中任何一个所切开，利用这一点可以实现多个表达盒在一个质粒上重复拷贝。
已经构建的pPIC9*载体上的表达盒起始端已经具有BglII位点，在末端引入BamHI位点的设计上，传统方法是使用PCR来实现：在PCR上游引物设计上保留BglII位点而在下游引物上设计BamHI位点。而这样设计就不可避免的遇到长片段PCR出现碱基错配的问题。为了避免这个问题，寻找与BglII和BamHI切割位点相关的酶，找到BstYI/MflI/XhoII三种同裂酶，其识别位点为RGATCY，在表达盒下游353bp处具有此三种酶酶切位点而表达盒内部无此酶的识别位点。这三种酶可以识别BamHI及BglII识别位点以及二者酶切后再连接的融合位点。考虑到MflI对甲基化宿主敏感，需要更换dam-宿主(如大肠杆菌JM110菌株)而XhoII价格昂贵，故选用BstYI来实现下游BamHI位点的引入。切割后的pPIC9*-target产生12个片段(2351bp，2302bp，1053bp，1029bp，768bp，456bp，188bp，114bp，86bp，17bp，12bp，11bp)，其中2302bp片段含有目的基因，为了使其与临近的2351bp在琼脂糖凝胶上区分开来，将酶切片段用SalI酶切，即将2351bp片段切为1391bp及960bp片段。至此取2302bp DNA片段和预先用BamHI切割的pAO815连接，得到的质粒命名为MFLI，将MFLI质粒用BamHI酶切，以上述目的基因片段连接，得到的质粒命名为MFLII，MFLI和MFLII质粒分别含有I和II拷贝表达盒。酶切鉴定证实该质粒的正确。这一构建过程如图5所示。
实施例7融合蛋白H1.3-EGFc在甲醇营养型酵母中的表达
1.表达载体的线性化及酵母的转化
所用表达载体为实施例6制备的MFLII，酵母为巴氏毕赤酵母KM71。KM71(黄秉仁教授赠送)是aox1-缺陷巴氏毕赤酵母株，其AOX1基因被野生型ARG4基因插入破坏，基因型为ARG4 HIS4(缺陷型)AOX1∷ARG，所有转化子均为Muts。
质粒转化酵母细胞前需经线性化处理。线性化表达载体进入巴氏毕赤酵母后，外源基因表达单元可以分别在基因组的his4位点或5′AOX1位点通过单交换插入酵母染色体产生Mut+(MethanolUtilization Plus)酵母株，也可在AOX1位点通过双交换插入酵母染色体产生Muts酵母株。整合后，表达质粒上的his4替换了酵母宿主细胞基因组上原有的缺陷型his4基因，使酵母株表型转变为HIS+，能在组氨酸(HIS)缺陷的MD培养基上生长。染色体中没有外源基因整合的酵母细胞则不能在HIS缺陷的培养基中生长。因此，转化产物首先需涂布于MD培养基上，以筛选有外源基因整合的转化子。
具体地，酵母细胞的转化方法如下：
转化质粒的准备
取5～10μg大量制备并纯化的质粒DNA，用SalI或BglII进行单酶切。取少量酶切反应产物行琼脂糖凝胶电泳，确证酶切完全。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇脱盐后于超净台无菌条件下晾干备用。
酵母表达载体线性化常用酶：
BglII：于AOX1位点取代(SMD1168，Muts)
SalI：于HIS4位点插入基因组。(SMD1168，Mut+或KM71，Muts)
电转法
a.取冷冻的毕赤酵母菌种划线于YPD板，30℃培养2～3天。挑取单菌落接种于5ml YPD，30℃剧烈振荡(大于200r/min)培养过夜。以1/1000～1/1500转接量接种于50ml YPD，再一次培养过夜，至OD600＝1.3～1.5。
b.4℃1500g离心5分钟收集细胞。用40ml冰冷的无菌去离子水洗涤沉淀。同样条件离心5分钟收集细胞。
c.20ml冰冷的无菌去离子重复上述操作一次。
d.重悬细胞于20ml冰冷的1mol/L山梨醇溶液中。离心收集细胞沉淀。
e.细胞沉淀重悬于400μl冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上备用。
f.取1.5mlEppendorf管，每管加入40μl制备好的细胞。分别加入5～10μg线性化质粒DNA。混匀后转入冰冷的电转杯中，冰浴5分钟以上。
g.设置电穿孔仪以产生7500V/cm，4-5ms的电脉冲。使用Bio-Rad产品时的具体设置为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。电击后立即在电转杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇，混匀。
h.细胞悬液涂布于MD培养基上，每个9cm直径平板涂300μl，15cm平板涂600μl。30℃培养至转化子出现。
2.分泌表达目的蛋白的阳性转化子的筛选
挑取在MD培养基上生长的His+转化子于50ml离心管中进行小量培养诱导，以筛选分泌表达目的蛋白的阳性酵母株。诱导3-4天后，离心收集培养上清行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的表达情况。
挑取20个KM71/MFLII的His+转化株进行筛选，得到三个有H1.3-EGFc分泌表达的转化株，其培养上清经SDS-PAGE分析显示，在约17KD处有蛋白带出现，比理论氨基酸序列推算分子量大，考虑有糖基化修饰所致。杂蛋白大多在43KD以上，目的蛋白附近并没有明显杂蛋白条带。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占培养基总蛋白的50％，粗略计算表达量为0.3g/L。
实施例8靶向基因药物H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut的制备及其对不同细胞的杀伤作用的检测
(一)蛋白H1-EGFc与质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut结合产物的制备
1.质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut和蛋白H1EGFc电荷数及质量比质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut(见实施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根据美国PE公司的DNA分子量计算公式：
MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61
该质粒的分子量为3780557。其所含负电荷数为：2×6142＝12284。
其质量电荷比为：307.76
蛋白H1-EGF c来自大肠系统，其分子量为25050，净正电荷数为58，其质量电荷比为：431.89
根据电荷数相等结合的原则，蛋白H1-EGFc和质粒pcDNA(3.1)-PEIII的质量比应为1.4033∶1，但考虑到蛋白的纯度，将此比例定为1.5∶1。
2.蛋白H1-EGFc与质粒pcDNA(3.1)-PEIII的结合
将0.1克的质粒pcDNA(3.1)-PEIII和0.15克的蛋白H1-EGFc溶于2ml 2M NaCl中，在室温下放置1小时，让它们结合。然后将此溶液于200ml的0.15M的NaCl中透析48小时。将此蛋白和DNA结合产物，用0.8％的琼脂糖电泳进行检测(同时用牛血清白蛋白代替融合蛋白H1-EGFc，作对照试验)。
此蛋白和DNA结合产物，就是本发明所设计的、针对EGFR过度表达的肿瘤的靶向基因药物。
(二)靶向基因药物对JK细胞的毒性作用
JK细胞株(中国医学科学院基础医学研究所保存)系悬浮培养的细胞，在24孔细胞培养皿的18个孔中，每孔加入1ml含1.5×105JK细胞的培养基。试验分为6组，每组3个平行试验。6组分别为：a.空白对照组，不加任何试剂；b.质粒pcDNA(3.1)-PEIII对照组，加入3μg质粒pcDNA(3.1)-PEIII；c.蛋白H1-EGFc对照组，加入4.5μg蛋白H1-EGFc；d.含1μg DNA的基因药物组，e.含2μg DNA的基因药物组，f含3μg DNA的基因药物组。
在加药48小时后，将各孔细胞分别吹散、混匀，进行计数。
(三)靶向基因药物对BT-325细胞的毒性作用
BT-325细胞株(中国医学科学院基础医学研究所保存)为贴壁培养的细胞。每孔接种5×104细胞，培养12小时开始加药，培养基加至1ml。试验也按上述同样的6组进行，每组3个平行试验。加药48小时后，消化悬浮细胞进行计数。
(四)靶向基因药物对Hela细胞的毒性作用
1.靶向基因药物对正常培养基中的Hela细胞的毒性作用
试验按上述BT-235细胞同样的设计和方法进行，细胞接种量为每孔5×104。
2.靶向基因药物对含过量EGF的培养基中Hela细胞的毒性作用
细胞的准备同上，试验分3组，每组5个平行试验。第一组是空白对照组，不加任何试剂；第二组，每孔加入含3μg DNA的靶向基因药物；第三组，每孔加入3μg的EGF和含3μg DNA的靶向基因药物。
实验结果
(一)目的蛋白H1-EGFc与质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的结合情况
蛋白H1-EGFc和DNA结合产物，经0.8％的琼脂糖电泳检测结果如图，其DNA迁移速度极其缓慢。而在以牛血清白蛋白替代蛋白H1-EGFc所进行的结合试验中，DNA的迁移速度与未进行蛋白结合的相同。
(二)JK细胞的计数结果
与对照组相比，在细胞培养基中加入融合蛋白H1EGFc、质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut以及此融合蛋白和质粒结合产物的各组，细胞数无显著差异。此结果表明，这三种处理对JK细胞的生长，没有明显的影响。详细的数据见下表2。
表2EGFR介导的质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut转染JK细胞的结果
  转染复合物                        存活细胞(105)   相当于空白对照百分比
  1   2   3   平均值±SD
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1μg/m1)   7.775   7.675   7.820   7.757±0.074   103.43％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2μg/ml)   7.700   7.050   7.375   7.375±0.375   98.33％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   7.525   7.350   7.625   7.500±0.139   97.40％
  H1-EGFc(4.5μg/ml)   7.725   7.750   7.600   7.692±0.803   102.57％
  pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   7.850   6.725   6.725   7.100±0.650   94.67％
  空白(对照)   7.775   7.675   7.650   7.700±0.066   100％
注1：各组间无显著差异。
(三)BT-325细胞的计数结果
与对照组相比，在细胞培养基中分别加入融合蛋白H1-EGFc或质粒pcDNA(3.1)-pEIIImut组，细胞数无显著差异。此结果表明，这两种处理对BT-325细胞的生长没有明显的影响。
在细胞培养基中加入融合蛋白H1-EGFc和质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的复合物的各组，与对照组相比细胞数有着极其显著的差异。其中，含1μg DNA组，细胞数减少35.59％；含2μg DNA组，细胞数减少40.61％；含3μg DNA组，细胞数减少46.03％。此结果表明，融合蛋白H1-EGFc和质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的复合物对BT-325细胞的生长有极其明显地抑制作用。具体结果见下表3。
表3EGFR介导的质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut转染BT-325细胞的试验结果
  转染复合物                        存活细胞(105)   相当于空白对照百分比
1 2 3 平均值±SD
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1μg/ml)   1.275   1.175   1.400   1.283±0.113   64.41％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2μg/ml)   1.125   1.325   1.100   1.183±0.123   59.39％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   1.000   1.025   1.200   1.075±0.109   53.97％
  H1-EGFc(4.5μg/ml) 1.725 1.650 2.025 1.800±0.198 90.36％
  pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   2.150   2.050   1.825   2.008±0.166   100.80％
  空白(对照)   2.125   1.750   2.100   1.992±0.210   100％
(四)Hela细胞的计数结果
1.正常培养基中的Hela细胞计数结果
在细胞培养基中分别加入融合蛋白H1-EGFc或质粒pcDNA(3.1)-pEIIImut组，与对照组相比细胞数无显著差异。此结果表明，这两种处理对Hela细胞的生长没有明显的影响。
在细胞培养基中加入融合蛋白H1-EGFc和质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的复合物的各组，与对照组相比细胞数有着极其显著的差异。其中，含1μg DNA组，细胞数减少39.59％；含2μg DNA组，细胞数减少44.15％；含3μg DNA组，细胞数减少48.12％。此结果表明，融合蛋白H1-EGFc和质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的复合物对Hela细胞的生长有极其明显地抑制作用。具体结果见下表4。
表4EGFR介导的质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut转染Hela细胞的试验结果
  转染复合物                        存活细胞(105)   相当于空白对照百分比
1 2 3 平均值±SD
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1μg/ml)   2.800   2.300   2.525   2.542±0.250   60.41％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2μg/ml)   2.200   2.600   2.250   2.350±0.218   55.85％
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   2.025   1.950   2.575   2.183±0.341   51.88％
  H1-EGFc(4.5μg/ml) 4.375 4.225 3.325 3.975±0.568 94.46％
  pcDNA(3.1)-PEIIImut(3μg/ml)   4.275   3.875   4.100   4.083±0.201   97.03％
  空白(对照)   3.750   4.725   4.150   4.208±0.490   100％
2.含过量EGF的培养基中Hela细胞的计数结果
在加入3μg EGF和含3μg DNA基因药物的培养基中，Hela细胞数目与对照组相比，上升10.66％。此结果表明，EGF可结合并封闭癌细胞表面的EGF受体，从而消除该基因药物对Hela细胞生长的抑制作用。这一结果说明，在本设计方案中，PEIIImut对癌细胞的靶向杀灭作用是通过EGFc介导的。具体结果见下表5。
表5EGF竞争结合的EGFR介导的毒素基因转染Hela细胞的试验结果
  转染复合物                              存活细胞(105)
  1   2   3   4   5   平均值±SD
  空白(对照)   3.975   4.550   4.125   3.850   4.475   4.195±0.307
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut   2.525   2.050   1.925   2.275   1.875   2.130±0.269
  H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut和EGF   4.325   4.725   4.200   5.175   4.775   4.640±0.389
以上所述各项细胞实验的统计结果图见图6-图9。
实施例9靶向基因药物H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut的制备及其对不同细胞的毒性作用的检测(融合蛋白H1，3-EGFc来自酵母系统)
1、靶向基因药物即转染复合物的制备：
本实施例所用融合蛋白H1.3-EGFc(见实施例7)既作为靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白；所用质粒DNA为实施例1的毒素基因表达载体pcDNA(3.1)-PEIIImut。由于H1.3上富含带正电的赖氨酸，将与带负电性的DNA分子结合，从而使整个复合物分子整体电性趋近于中性，在琼脂糖电泳上表现出电泳迁移率滞后的现象。有文献表明，当此复合物达到完全滞留时，即在电场作用下一直滞留在上样孔中时，二者达到最佳结合。预先将靶向蛋白溶液在4℃放置过夜以充分复性，然后将DNA与靶向蛋白溶液按照不同比例混合，在20℃应30分钟使二者结合，在0.8％琼脂糖凝胶上观察电泳迁移率的变化。根据结果，初步确定DNA/蛋白质量比例为1/1.2。
取适量的蛋白质溶于DMEM培养基中，于4℃放置过夜复性后，以0.22μm滤膜过滤。然后将质粒DNA(pcDNA(3.1)-PEIIImut)的DMEM溶液以0.22μm滤膜过滤，并将两者混合。室温放置30分钟后用于转染，取出部分混合液在0.8％琼脂糖凝胶上观察电泳迁移率的变化。转染前在混合物中加入1％的胎牛血清
2、毒素基因的转染和表达
本试验采用3个剂量组。分别用1μg、2μg和3μg的质粒与相应量的蛋白质，并加适量DMEM将每孔培养液补至2ml，于24孔细胞培养板中分别转染1.5×105的Hela细胞、BT-325细胞和JK细胞。另外，以3.6μg蛋白(相当于3μg DNA对应蛋白)以及3μg质粒DNA作为空白对照，分别转染上述三种细胞，同时还有一组正常细胞不经任何转染处理，以用作正常生长对照。
转染48小时后，于显微镜下观察细胞生长情况，H1.3-EGFc/DNA复合物转染组的细胞生长状况明显劣于其它各组细胞，细胞数相对较少，出现许多死亡细胞。同时用血球计数器观察计数各孔的存活细胞数。所得各孔存活细胞数进行方差分析和T检验(T-test)分析，结果显示(表6)，空白对照组、正常生长对照组及单独融合蛋白、单独质粒DNA转染组各样品转染小组的存活细胞数没有显著性差异(p＞0.05)，说明H1.3-EGFc融合蛋白以及质粒DNA单独使用对JK细胞以及Hela、BT-325细胞的生长无影响。H1.3-EGFc/质粒DNA复合物转染的JK细胞存活数与对照无显著差异(p＞0.05)，说明这些物质对于JK细胞的生长无显著影响。H1.3-EGFc/质粒DNA复合物的1-3μg DNA剂量转染组的存活细胞相对于空白对照有明显的减少(p＜0.05或＜0.01)。但1-3μg剂量组之间细胞存活数在BT-325细胞之间无显著差异，而在Hela细胞之间有波动。
以正常生长组的存活细胞数作对照，计算出各转染复合物对Hela细胞以及BT-325细胞的杀伤率。所得数据显示，1-3μg DNA剂量的H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut对Hela细胞的杀伤率约为40.6％-53％，对BT-325细胞的杀伤率约为62％。细胞实验结果统计图见图10-图12。
表6：H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut复合物细胞实验结果
转染剂量：I：1μg DNA及相应蛋白；II：2μg DNA及相应蛋白；III：3μg DNA及相应蛋白。
统计检验：JK细胞各组之间无显著差异；BT-325细胞3μg DNA组与对照之间有极显著差异，其余剂量组和对照之间有显著差异；Hela细胞各剂量和对照之间有显著差异。
序列表
SEQ ID NO：1(PEIIImut核苷酸序列)：
ATGCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACG
GTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTC
GGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGC
GCGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCG
GCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGC
AACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGC
ACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGC
CATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGC
CTGGAGACCATTCTCGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCG
ATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGAC
AAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCG
AAGGACGAACTGTAA
SEQ ID NO：2(PEIIImut编码的氨基酸序列)：
MLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVR
ARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYR
TSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSA
IPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGDPPKDEL
SEQ ID NO：3(H1.3-EGFc编码序列)：
GAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCTGGG
GCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCCAAGAAAAGCATCAAA
AAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCC
AAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCT
AAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTT
ACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTAC
ATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATAATGA
SEQ ID NO：4(H1.3-EGFc氨基酸序列)：
EGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVA
KSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGY
IGERCQYRDLKWWE
SEQ ID NO：5(H1-EGFc编码序列)：
ATGTCGGAGACTGCTCCACTTGCTCCTACCATTCCTGCACCCGCAGAAAAAACACCT
GTGAAGAAAAAGGCGAAGAAGGCAGGCGCAACTGCTGGGAAACGCAAAGCTTCCGGA
CCCCCAGTATCTGAGCTTATCACCAAGGCAGTGGCAGCTTCTAAGGAGCGCAGCGGC
GTTTCTCTGGCCGCGCTTAAGAAAGCGCTTGCGGCTGCTGGCTACGATGTAGAAAAA
AACAACAGCCGTATCAAGCTTGGCCTCAAGAGCTTGGTGAGCAAAGGTACTCTGGTG
CAGACCAAAGGTACCGGTGCTTCTGGCTCCTTCAAACTCAACAAGAAAGCGGCTTCC
GGGGAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCT
GGGGCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATC
AAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTG
GCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCA
GCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAG
GTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGT
TACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGGAATAATGA
SEQ ID NO：6(H1-EGFc氨基酸序列)：
MSETAPLAPTIPAPAEKTPVKKKAKKAGATAGKRKASGPPVSELITKAVAASKERSG
VSLAALKKALAAAGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQTKGTGASGSFKLNKKAAS
GEGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKV
AKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVG
YIGERCQYRDLKWWE

Claims (6)

1、编码经突变改型的绿脓杆菌毒素第III结构域的重组DNAPEIIImut，其具有如下核苷酸序列：
ATGCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACG
GTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTC
GGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGC
GCGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCG
GCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGC
AACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGC
ACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGC
CATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGC
CTGGAGACCATTCTCGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCG
ATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGAC
AAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCG
AAGGACGAACTGTAA
2、由权利要求1的重组DNA PEIIImut编码的蛋白质，具有如下氨基酸序列：
MLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVR
ARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYR
TSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSA
IPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGDPPKDEL
3、含有权利要求1的重组DNA PEIIImut的真核表达型重组体。
4、权利要求3的真核表达型重组体，其为质粒pcDNA(3.1)-PEIIImut，所述质粒以包含于大肠杆菌中的形式保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.0478。
5、一种用于细胞表面EGF受体富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗的药物，其包括权利要求3或4的真核表达型重组体与一种融合蛋白的复合物，所述融合蛋白为人类组蛋白H1第115位-第221位的106个氨基酸和人类表皮生长因子C环的最后22个氨基酸的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示：
EGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVA
KSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGY
IGERCQYRDLKWWE。
6、一种用于细胞表面EGF受体富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗的药物，其包括权利要求3或4的重组表达型重组体与一种融合蛋白的复合物，所述融合蛋白为人类组蛋白H1第1位-第221位的221个氨基酸和人类表皮生长因子C环的最后22个氨基酸的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示：
MSETAPLAPTIPAPAEKTPVKKKAKKAGATAGKRKASGPPVSELITKAVAASKERSG
VSLAALKKALAAAGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQTKGTGASGSFKLNKKAAS
GEGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKV
AKSAKKVKTpQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVG
YIGERCQYRDLKWWE。
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