PT92079B - Processo de preparacao de proteina 60 de choque termico de levedura e de reuniao de sub-unidades de proteina nao funcional - Google Patents

Description

KEMÕRIA DESCRITIVA

Esta invenção foi realizada com o apoio do Governo dos Estados Unidos da América e o Governo dos Estados Unidos da Amé. rica tem certos direitos nesta invenção.

Campo Técnico:

A presente invenção refere-se ao processo de preparação da proteína 60 de choque térmico de levedura (hsp 60) e dos seus análogos que são úteis na reunião de proteínas biologicamente activas.

Antecedentes da Invenção:

A translocação de proteínas através das membranas biológicas é um fenómeno de fundamental importância facilitando a compartimentação das células eucariôticas. Estudos recentes da translocação de proteínas têm focado a determinação da estrutura terciária das proteínas que são translocadas e a identificação dos componentes mediadores. Particular atenção tem sido dirigida às mitocondrias devido ao facto de a maior parte das pro. teínas que residem no interior deste organito serem inicialmente sintetizadas no exterior, no citosol, e depois translocadas para o interior do compartimento da matriz.

Vários estudos indicaram que as proteínas precursoras mi. tocondriais recentemente sintetizadas têm de assumir uma confor mação não dobrada afim de serem translocadas e uma análise recente sugere que esta conformação competente para a translocação pode ser dirigida por uma família de proteínas hsp70 no cito, sol. Após passagem, através das membranas mitocondriais nos pontos de contacto entre as membranas exterior e interior e após a remoção proteolítica subsequente dos peptídos de sinal NH₂-termi. nais, as sub-unidades mitocondriais dobram-se ou reunem-se adqui. rindo as suas conformações biologicamente activas. Este passo pode não ocorrer espontaneamente mas em vez disso pode ser um passo activo requerendo a acção de um ou mais produtos de gene. Se estes produtos existem, os produtos de gene podem ser necessários para produzir conformações funcionais das moléculas biolo

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gicamente activas que são sintetizadas quimicamente ou produzidas por recombinação na célula hospedeira deficiente nesse produto de gene.

IEHíINGSEN et al. fNature 338:330-334 (1988)J7 descreve uma família de proteínas, que designs molecular chaperones (acompanhantes moleculares), os quais estão associados à reunião, ρόε-traduçSo das proteínas. 0 papel proposto desses acompanhantes moleculares é o de assegurar que a dobragem de certos polipéptidos e sua reunião em estruturas oligoméricas ocorre correctamente, presumivelmente, evitando a formação de estruturas inadequadas resultantes da exposição das superfícies hidrofóbicas ou carregadas quer dentro, quer entre as cadeias polip£ ptídicas. Os autores referem que as três classes reconhecidas dentro da família dos acompanhantes moleculares são (1) o nuclec) plasma (2) a classe de proteínas de ligação de cadeia pesada hsp70-imunoglobulina e (3) a classe cloroplasto-mitocondria-bactéria. Os autores propõem o termo CHAPERONINS para referir a terceira classe.

Hemmingsen et al. sugerem que os biotecnologistas que en contram problemas na produção de proteínas estranhas em células bacterianas podem estar a falhar na necessidade de ter um chaperonin bacteriano que é capaz de mediar a dobragem/reunião normalmente realizadas por um chaperonin de cloroplasto ou de mitocôndria.

Determinando essas proteínas necessárias para a dobragem/ /reunião adequada de proteínas estranhas na célula hospedeira, facilitaria a produção de proteínas activas biologicamente úteis Breve Sumário da Invenção

A presente invenção tem diversas facetas. Essas facetas giram em torno da levedura (S. cerevisiae) cujas proteínas trata das por choque térmico deseapenham um papel importante na reunião e/ou na activação da proteína, particularmente para proteínas de mitocondria.

Num seu aspecto, a invenção contempla uma proteína purifi^ cada biológicamente activa com um M de cerca de 55.000 a cerca

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a

de 65.000 daltons, em electroforese de gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio. Essa proteína exibe pelo menos uma identidade de resíduos aminoácido de cerca de 60 por cento em relação à proteína mitocondrial de levedura tratada por choque térmico, sendo a sequência de resíduos aminoácido a que se mo£ tra na Eig. 1 desde o resíduo de aminoácido na posição 23 até à posição 572. Essa proteína de levedura é aqui designada por hsp60 ou um seu análogo.

Esta invenção contempla ainda o segmento de ADN, consis. tindo essencialmente de um segmento isolado de ADN não cromossómico contendo ADN suficiente para codificar a hsp60 ou um seu análogo. 0 segmento de ADN, contem tipicamente cerca de 1600 a cerca de 2300 pares de bases, e, preferencialmente, codifica a sequência de resíduos aminoácido que se mostra na Pig. 1 desde o nucleótido da posição 67 até ao nucleótido na posição 1716.

Outra concretização da invenção contempla um vector capaz de replicação autónoma na célula. 0 vector contem um segmeri to de sequência de polinucleótidos, operativamente ligado, que codifica a hsp60 ou um seu análogo. 0 vector é preferencialmente um vector de ADN que dirige a expressão da hsp60 ou de um seu análogo.

Ainda outro aspecto contempla uma célula hospedeira tran formada que contem o vector acima descrito. Esta célula hospede ra pode ser uma célula eucariótica ou procariótica.

Ainda num seu outro aspecto a invenção refere-se aos processos de preparação.

Num primeiro processo forma-se um complexo de proteína oligomérica funcional. Aqui as sub-unidades de proteína não funcionais são misturadas in vitro com uma quantidade eficaz funcio. nalizante de uma preparação aquosa da matriz de nitocondria de levedura, biologicamente operativa, para formar uma mistura aquo. sa. Essa preparação de matriz contem pelo menos, o dobro da quan tidade de hsp60 ou de um seu análogo, em relação à quantidade de hsp60 presente após o choque térmico, até cerca de 10% da protei. na total na preparação da matriz. A mistura é mantida sob condi0i| -H|

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-5ções de cultura biológica por um período de tempo suficiente pa ra que as sub-unidades de proteína não funcionais se liguem à bsp60 ou ao seu análogo, sejam processadas, dobradas e dissocia das para formar um complexo de proteína oligomérica funcional.

Num segundo processo uma forma inactiva de moléculas de proteínas monoméricas ou moléculas de sub-unidades de proteína,

3S é convertida numa forma activa. Neste processo/moléculas de pro. teína monomérica inactiva ou as moléculas de subunidades de pro. teína são misturadas in vitro com uma quantidade eficaz activadora de uma preparação aquosa de matriz de mitoncondria de lev£ dura, biologicamente operativa, tal como antes se discutiu,de modo a formar uma mistura aquosa. A mistura é mantida em cultura sob condições biológicas, por um período de tempo suficiente para que as moléculas de.proteína monomérica inactivas ou as subunidades de proteína/se liguem à hsp60 ou ao seu análogo, sendo processadas, dobradas e dissociadas, de modo a obter-se uma forma activa das moléculas de proteína monomérica ou das moléculas de subunidades de proteína.

Os terceiro e quarto processos são substancialmente idên ticos aos primeiro e segundo processos respectivamente, com a excepção de a preparação da matriz de mitocondria ser usada tal e qual e não incluir a adição de hsp60 ou de uma molécula de proteína análoga.

Em cada um dos processos acima referidos as subunidades de proteína não funcionais ou as moléculas de proteína monoméri. ca inactivas ou as moléculas de subunidades de proteína inactivas, estão tipicamente presentes numa proporção em peso, em relação ao total de proteína da preparação da matriz, de cerca de 1 a cerca de 20 partes em relação a cerca de 200 a cerca de 2000 partes, respectivamente. A concentração total de proteína de uma mistura aquosa é de cerca de 10 a cerca de 70 mg/ml.

Breve Descrição das Figuras

Nas figuras/constituem parte da descrição:

A Fig. 1 está dividida em duas partes (Figura IA e IB) e mostra a cadeia simples de codificação de ácido nucleico e a tra

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-6dução das sequências de resíduos aminoácido da hsp60. Ambas as sequências são apresentadas da esquerda para a direita na dire£ ção 5'-3', e do terminal amino para o terminal carboxilo, respe. ctivamente.

A posição -410 é o ponto de clivagem da endonuclease de restrição Bell no terminal 5' com locais de restrição adicionais PstI, Sall e Bell, indicados na sequência de ADN. A posição +1 indica o resíduo Met inicial do péptido líder que está fundido com a sequência de proteína. A principal fonte de ADN para análise de sequência foi o fragmento de 5,3 Kb (aproximadamente 5 Kb), EcoRI-EcoRI, que se mostra na Eigura 9· Segmentos deste fragmento foram subclonados nos vectores pUCllô ou pUC119 //Vieira et al., Meth. Enzy., 153:3-11 (1987)/7 θ sequen. ciados pelo método de terminação da cadeia. Os subfragmentos para análise da sequência foram gerados por digestão exonucleolitica com Bal3l e de novo clonados nos vectores pUC. Determinaram-se as sequências de ambas as cadeias de ADN, e assinalaram-se todos os sítios de restrição usados para a subclonação.

A Fig. 2 ilustra uma representação do esquema para isola mento dos mutantes de levedura S. cerevisiae deficientes na reu nião das proteínas mitocondriais,A estirpe de leveduras, RP11 //Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:4063-4067 (1987)/7 deficiente em ornitinatranscarbamilase citosólica (OTC) endógena, foi transformada com um plasmídeo contendo a sequência de codificação da OTC humana ligada a um promotor Gall (GalOTC) //Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:4063-4067 (1987)/7- Quando induzida com 8/ de galactose, esta estir pe transformada (GalOTC/RPll) exibe uma actividade enzimática de OTC na matriz mitocondrial onde a OTC humana, normalmente se localiza. //Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:4063-4067 (1987)/70 GalOTC/RPll foi sujeito a mutação com metanossulfonato de etilo (MSE) e seleccionaram-se os mutantes que eram sensíveis à temperatura em crescimento em ambos os meios YPEG (1% de extracto de levedura, 2/ de bactopeptona, 2/ de etanol e 3?ζ de gli. cerol) e YPD (1$ extracto de levedura, 2/ de bactopeptona e 2^o

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-7glucose). Os mutantes individuais cultivados em 1 ml de YPSG a 23⁵C são mudados para uma temperatura não permitida (37⁹C) e simultaneamente transferidos para um meio contendo 2% de galactose para induzir expressão da OTC.

Após 2 horas, prepararam-se esferoplastos usando Sorbitol 1,2 M, fosfato de potássio 20 mM (Epi), pH 7,4, 0,17% de mercaptoetanol e 0,05 mg/ml de Zymolase 100T (Miles). Os esferc) plastos foram então retirados por centrifugação a 2000 rpm durante 5 minutos usando uma centrífuga clínica, e resuspenderam-se em 100^1 de tampão de lise (Hepes 20mM, pH 7,4 e 0,1% de Triton-100). Analisaram-se 50 microlitros (pl) de lisados celulares para determinar a actividade da OTC, e os mutantes sensíveis à temperatura (TS) não exibindo actividade de OTC foram analisados por imuno-mancha. Extrairam-se 50 microlitros de lisado celular com tampão de Laemmli, e depois sujeitaram-se a electroforese num gel de poliacrilamida-SDS a 8%, transferiram-se para papel de nitrocelulose e realizou-se a análise de imuno-mancha com anticorpos anti-OTC ou anticorpos anti-Fl-beta-ATPase /_ Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:4063-4067 (1987 )J7·

Os mutantes ts produzindo predominantemente subunidades OTC maduras embora sem actividade OTC foram candidatos a análise em coluna PALO. /~delta-N-(fosfo-acetil)-L-0rnitina_Z7· Trans feriram-se cinco unidades de densidade óptica (DO) de células para uma temperatura não permitida,, induziram-se com galactose e transformaram-se em esferoplastos como anteriormente se descreveu. Os esferoplastos foram lisados em Hepes 20 mM, pH 7,4, 30/Zg/ml de Lubrol, e depois aplicados a colunas PALO. As colunas foram então lavadas com KOI 40 mM e eluídas com fosfato de carbamilo 10 mM. Cada fracção eluída foi imunoprecipitada com o anti-soro anti-OTC, sujeita posteriormente a electroforese, a análise de imunomancha com anti-soro anti-OTC e visualizada com proteína A de 5. aureus radiomarcada.

Mutantes cujas subunidades OTC maduras não se ligaram à coluna PALO foram seleccionados para análise genética. Esses mu tantes foram cruzados com a estirpe progenitora RP11 do tipo

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-8selvagem para segregar o fenótipo ts da OTC humana inserido.

As estirpes que comportam uma mutação ts, simples, foram trans formadas com um novo plasmídeo GalOTC e com o resultante do cruzamento com o tipo selvagem GalOTC/RPll para estudar a cons£ gregação do fenótipo ts e o defeito na reunião ts (coluna PALO).

A Pigura 3 contem esses três painéis, A, B e C que ilustram os estudos com o mutante alfa-143 (ou tsl43) obtido, usando o esquema da Figura 2.

Painel A é uma fotografia de uma análise SDS-PAGE das fracções da coluna PALO, do tipo selvagem (Wt) e dos extractos celulares do ts 143. Aqui o tipo-selvagem GalOTC/RPll e o mutan. te ts 143 foram cultivados no meio YPEG até à fase semi-logarítmica (D.0.=l). Cinco unidades de Ό.Ο.^θθ das células foram sedimentadas e colocadas de novo em 1 ml de meio fresco YPEG e mu dou-se a cultura para 37^SC. Após 30 minutos, a expressão OTC foi induzida com galactose por 3 horas e os esferoplastos foram preparados como se descreve na Fig. 2. Os esferoplastos foram recolhidos por centrifugação a 2.000 rpm durante 5 minutos e ressuspendidos em 1 ml de tampão (Hepes 20 min, pH 7,4 e Luhrol 300/Jg/ml). Os extractos celulares foram aplicados na coluna PALO, lavados em KOI 40 ml',1 e depois eluídos com fosfato de carbamilo 10 mM. 0 extracto celular total (CE), a fracção atravessante (breakthrough) (BK), as fracções de lavagem com solução salina (SW), e as fracções eluídas com fosfato de carbamilo, foram imunoprecipitadas com anti-soro anti-OTC. Os precipitados foram fraccionados em SDS-PAGE e o gel foi analisado por imunomancha com o anti-soro anti-OTC.

Painel B é a fotografia da análise autoradiográfica por SDS-PAGE das extracções por clorofórmio (CHClj) e água da Fl-beta-ATPase dos extractos celulares do tipo selvagem (Wt) e da ts 143. Aqui, o tipo selvagem (Wt) GalOTC/RPll, e o mutante ts 143 foram cultivados em meio mínimo de galactose com os aminoácidos requeridos (0,67% base de azoto de levedura sem aminoácidos, 2% galactose, 20 /Jg/ml de histidina, 20>ug/ml de leucina e 20jltl/ml de arginina) até uma D.Ο.^θθ=Ο,5. Ressuspenderam-se quatro unidades de D.O. de células em 2 ml de meio mínimo de ga

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400y>Ci de S-metionina e a cada cultura e incubaram-se duran. te 30 minutos. A reacção foi parada por adição de NaN^ até 10 mM. Adicionaram-se então 25 unidades D.O. de células não ligadas como transportador para fraccionamento celular grosseiro.

As células foram transformadas em esferoplastos em 5 ml de solução zimoliase como na Figura 2 durante 30 minutos, foram recolhidas, lavadas uma vez com sorbitol 1,4 M arrefecido em ge lo e com fosfato de potássio 20 mM (Kpi), pH 7,4 e NaN^ 10 mM, e ressuspenderam-se em 5 ml de solução, arrefecida em gelo, co£ tendo sorbitol 0,6 I'<1, Hepes 20 mE, pH 7,4, NaN-j 4,10 mM, e PMSF 1 mlví (fluoreto de fenilmetilsulf onilo). As suspensões de esferoplastos foram homogeneizadas num equipamento Dounce e centrifugadas num rotor SS-34 a lOOOxg, durante 5 minutos, a 4²C para remover os núcleos e os restos das células. Recolheram-se os sobrenadantes e centrifugaram-se no rotor SS-34 a 10 OOOxg durante 10 minutos a 4²C. Recolheram-se os sedimentos e ressuspenderam-se em tampão sorbitol 0,6 M obtendo-se uma fracção de mitocondria em bruto. Ajustaram-se as fracções de mitocôndria de 5xl0^cpm total do tipo selvagem e lOxlO^cpm total da tsl43, até 100jul com tampão sorbitol 0,6 M e extractaram-se com 50/xl de clorofórmio por agitação de vórtice durante 1 minuto.

Cerca de 7,5$ das contagens totais no tipo selvagem e

4,5$ na tsl43 estavam na fase aquosa onde se extrai a Fl-beta-ATPase. Levaram-se à ebulição 0,3xl0^cpm de fase aquosa dos extractos de clorofórmio do tipo selvagem e do tsl43, em 50/11 de SDS a 4$ durante 5 minutos, e adicionou-se 1 ml de TNTE (Tris qM , pH 7,8, NaCl 150 mM , 1$ de Triton-100 e EDTA 5 mM). A imunoprecipitação foi realizada com anti-soro anti-Fl-beta-ATPase, e os precipitados foram analisados por SDS-PAGE e por auto-radiografia. LINHA(-)= imunoprecipitação de lxl0^Dcpm de fracções de mitocôndria em bruto. LINHA(CHC1₇)= imunoprecipitag 3 ção de 0,3xl0°cpm da fase aquosa dos extractos de clorofórmio.

As marcas no lado esquerdo do painel indicam os pesos moleculares das formas percursora (p) e madura (m).

painel C é outra fotografia da análise auto-radiografi

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Jf

-10ca de SDS-PAGE, neste caso para o citocromo b^ nos extractos celulares do tipo selvagem (wt) é tsl43. As células do tipo sei. vagem (wt) e tsl43 foram cultivadas em meio mínimo de galactose com os aminoácidos requeridos acima descritos. Usam-se duas uni. dades D.O. de células para marcação in vivo com ^S-Ivíetionina (200 mCi/2 unidades O.D. celulares) como anteriormente. As célu las foram transformadas em esferoplastos, colhidas e extraídas com 50 jjl de SDS a 4$ . Os extractos foram ressuspendidos em 1 ml de ΤΝΤΞ e imunoprecipitados com o anti-soro anti-citocromo b2« A análise SDS-PAGE e a auto-radiografia foram como anterior mente se indicou. As marcas no lado esquerdo do painel indicam os pesos moleculares das formas precursora (pre), intermediária (i) e madura (m) da enzima.

A Figura 4 contem dois painéis A e B que são fotografias das análises PAGE obtidas em gradientes de sedimentação de saca rose dos extractos celulares das células tsl43 desenvolvidas a 252c (painel A) e das células submetidas a um choque térmico du. rante 25 minutos a 37-C (painel Β). A cultura das células tsl43 a 252c foi dividida ao meio. Uma metade permaneceu a 252c enquan to que a outra foi transferida para banho de água a 37⁹C. A tem peratura desta cultura foi seguida periodicamente levando cerca de 5 minutos a atingir os 37⁹C. Uma vez atingidos os 37⁹C as células transferidas foram mantidas a 37⁹C por um período adicional de 25 minutos. As células de ambos os frascos foram recolhidas, lavadas, abertas e tratadas com triton-DOC para lisar qualquer mitocôndria ainda existente. Estes extractos foram centrifu. gados a lOOOxg e o sobrenadante resultante foi novamente centrifugado a 15>000xg durante 15 minutos.

sedimento obtido a 15.000 xg foi dissolvido em tampão de Laemmli e 0 sobrenadante foi coberto com um gradiente de sacarose de 15 a 30% que foi centrifugado a 27.500 rpm durante 17 horas. As proteínas das fracçoes no gradiente de sacarose foram precipitadas, e o conteúdo foi subsequentemente dissolvido em tampão de Laemmli. As proteínas de cada fracção foram separadas em gel de acrilamida a 12,5%. Realizaram-se dois geles: um para coloração (painel A) que continha as fracçoes de gradiente e os

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-11rn.arcad.ores de peso molecular (MV/); o outro para imunomancha (pai. nel B) continha as fracções do gradiente e uma amostra do sedimento obtido a 15.000 xg (indicado por P), contendo os mesmos equivalentes celulares de cada fracção representada. As proteínas do segundo gel foram transferidas para nitrocelulose para uma análise Western usando anti-soro anti-Tetrahymena-hsp58. //McMullin et al., Mol. Cell. Biol·., 7.:4414-4423 (1987)77· Este anti-soro é também aqui designado por anti-hsp60 (T.t.). A seta indica a posição do complexo hsp60 da levedura corada. A direcção da sedimentação é da esquerda para a direita.

A Pigura 5 ilustra a separação do ARN(A) em gel de agarose, bem como 3 representações esquemáticas de mapas de restrição (B, C e D) para três plasmídeos (p8, pl e pl2) que são capazes de socorrer o mutante tsl43 após transformações desse mutante com cada um dos plasmídeos. Cada plasmídeo provem de uma biblioteca CEM /Rose et al., Gene, 60:237-243 (1987)./7 que continha fragmento de ADN genómico de levedura inseridos no plasmídeo YCp50. Apenas se mostra 0 ADN inserido de levedura de cada plas_ mídeo excepto para uma pequena porção do vector da linha ondula, da vertical para sítio Sall. Em cada representação:B = BamHI;

G = BglII; C = Ciai; Rl - EcoRI; H - HindIII; P = PstI; e S = Sall.

Mais especificamente, tal como na parte A,as células de levedura do tipo selvagem foram cultivadas em meio YPEG a 23⁹C

O até à fase semilogarítmica. Ressuspenderam-se 4x10 células em 70 ml desse meio. Metade desta cultura celular foi incubada a 2320, a outra metade a 422c, cada uma por um período de 30 minutos. Colheram-se 5xl0%élulas de cada cultura e usaram-se na pre. paração do ARN poli A⁺. 0 ARN total de levedura foi preparado de acordo com o método de Davis et al., A Manual For Genetic Engineering Advanced Bactéria! Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980). 0 ARN PoliA⁺ foi isolado usando celulose oligod (I) ianiatis et al., Molecular Cloning, A Daboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982)_7· 0 ARN resultante foi fraccionado em gel de agarose a l>o, e transferido para nitro, celulose, e combinado com um fragmento PstI de 0,9 Kb traduzido, derivado do plasmídeo p8 (que a seguir se refere) seguindo os pro.

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-12- * U cedimentos de Lerach et al., Biochemistry 16:4743-4751 (1977).

mapa de restrição do inserido no plasmídeo p8 é idênti. co ao inserido do fago lambda-gtll que é aqui depois discutido na Figura 8. Analisou-se ainda um fragmento EcoRI-EcoRI com aproximadamente 5 Kb (figura 1) derivado do plasmídeo p8 por digestão com a endonuclease PstI e as dimensões dos fragmentos foram comparadas com as dos obtidos a partir do fago lambda. Veri. ficou-se que a ordem do fragmento era a indicada para a sequência do fago lambda.

Um fragmento PstI de 900 pb do inserido do plasmídeo p8 foi sequenciado tal como indicado pela seta. Esta sequência ajus ta-se à sequência do fago lambda inserido. Mostram-se os codões de começo de tradução (ATG) e de paragem (TGA) e a direcção da tradução tal como determinada a partir do inserido de fago-lambda.

A Pigura 6 contém também dois painéis A e B que são fotografias da análise PAGE similar à da Pigura 4. 0 tratamento destas células foi o mesmo que o descrito anteriormente na Pigura 4 com a excepção de as células transferidas para 37²C terem sido mantidas aí durante 2 horas. Os extractos celulares foram prepa. rados tal como anteriormente se descreve, mas a análise foi feita como se segue. Após a ruptura inicial das células, tomou-se uma pequena amostra e adicionou-se 2 vezes igual volume de tampão Laemmli. 0 restante material foi centrifugado como anteriormente. Tomou-se uma pequena amostra do sobrenadante obtido a 15*000 xg e adicionou-se 2 vezes igual volume de tampão Laemmli. 0 sedimento foi redissolvido no mesmo volume de tampão de homogeneização inicial tal como o sobrenadante obtido a 15.000 xg, e removeu-se uma amostra e adicionou-se a 2 vezes igual volume de tampão Laemmli. Os volumes iguais (contendo iguais equivalen. tes celulares) de cada um dos extractos totais (TOT), dos sobrenadantes obtidos a 15.000 xg (SUP) ou dos sedimentos obtidos a 15.000 xg (PEL) das células a 25^0 ou das células a 37^QC por 2h, foram separados em geles de acrilamida a 12,5%. 0 painel A contém o gel corado. 0 painel B é uma análise de mancha Western dum gel sondado com o anti-soro anti-hsp5Ô. Note-se que a proteína

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-13adicional acumulada durante o choque térmico a 37-C é processa da dum modo prefeitamente normal. Estes resultados indicam que o velho complexo hsp64 é enfraquecido e que o novo material não se reune correctamente embora seja necessário fornecê-lo e processá-lo correctamente. Os números 25 e 37 no topo das linhas indicam o crescimento celular a 252c e 37²C, respectivamen. te .

A Figura 7, contém dois painéis A e B que ilustram a aná lise SDS-PAGE das células que contêm cópias simples ou múltiplas do HSP60. No painel A a estirpe haplóide aV/303 (amavelmen. te cedida por R. Rothstein, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, NY; linhas 1, 3) ou a mesma estirpe transformada com 0 vector plasmideo YEpHsp60 (discutido na Fig. 8) (linhas 2, 4) são cultivados até à fase semi-logarítmica, a 3O²C. Sessenta microgramas (>Ug) de extractos totais de proteínas //Hurd et al., Mol. Cell. Biol., 7:3673-3677 (1937)/7 (linhas 1, 2) ou de mitocôndrias purificadas Z/Faye, et al.,

J. líol. Biol., 88.:185-203 (1974)// (linhas 3, 4) foram analisados em duplicado em geles SDS-PAGE. As proteínas de um dos geles foram coradas com azul de Commassie (coloração CB) enquanto que as da segundo gel foram transferidas para papel de nitrocelulose e sondadas com anti-hsp60 (T.t.) como anteriormente des. crito por KcMullin et al., Mol. Cell. Biol. 7.:4414-4423 (1987). Aumentando 0 número de cópias de HSP60 incluindo o gene num pia mídeo de multicópias, aumenta-se o nível celular da proteína re ctiva anti-hsp60 (T.t.). Os pesos moleculares padrões incluídos no gel corado (não mostrado) mostram que 0 material imuno-reactivo temMr=60K.

painel 3 é uma fotografia duma auto-radiografia que ilustra os níveis em estado estácionario do ARNm da hsp60 em condições normais e sob condições de tensão devido a calor. A estirpe aV/303 (linhas 1, 3) ou a mesma estirpe transformada com YEpHspôO (linhas 2, 4) foram cultivadas até à fase semi-logarítmica a 25²C. As culturas foram então divididas e cultivadas du rante 2 horas adicionais quer a 25²C (linhas 1, 2) quer a 39-C (linhas 3, 4). Os ácidos nucleicos totais foram extraídos /~Lin_ dquist, Nature, 293:311-314 (1981)~7. desnaturados com glioxal

4?

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-14/7í'-cI'Iaster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:4835-4838 (1977 )_7 ^e separados por electroforese em gel de agarose. Os ácidos nucleicos foram transferidos para filtros de nitrocelulo. se e analisados por mancha Northern, usando o fragmento de 3,0 Kb que se mostra na Figura 8B como sonda radio-marcada. Esta sonda hibrida-se com uma banda de ARN simples de 1,9 Kb (não se mostram os padrões de peso molecular do ARN). A concentração deste ARNm é duas a três vezes mais elevado nas células de choque térmico do que no controlo não submetido a choque térmico. Aumentando o número de cópias do HSP60, aumenta-se o nível do estado estacionário do ARNm de 1,9 Kb a 252c e a indução por choque térmico é de novo observada. A banda de Kr elevado obser vada nas linhas 2 e 4 é devida à hibridação da sonda com o ADN.

A Figura 8 é um mapa de restrição esquemático com três partes (A, 3 e C) do HSP60 e de HSP60::H153. Na parte A a linha a tracejado indica a região do ADN genómico de levedura isolado a partir de um clone lambda-gtll reactivo anti-hsp60 (Tt).

sítio EcoRI designado E foi inserido como um linker durante a construção da biblioteca. A parte 3 mostra o mapa de restrição do fragmento de ADN do genoma contendo 0 fragmento representado na linha A. A barra preta indica a região de codificação da hsp60 tal como é determinado pela análise da sequência de núcleotidos, com a direcção da transcrição indicada pela seta. 0 plasmideo YEpHspóO compreende este fragmento EcoRI-EcoRI de 5,3 Kb clonado no vector de vaivém de base circular de 2 microns YSp352 Hill et al., Yeast, 2:163-167 (1986)_/7· A parte C ilustra o mapa de restrição do alelo nulo HSP6O::HIS3. As bar ras negras indicam as regiões de codificação do HSP60, e as linhas tracejadas indicam um fragmento contendo o HIS3 que interrompe o HSP60 por inserção do sítio PstI. As posições dos sítios de reconhecimento pelas enzimas de restrição são indicadas para EcoRI(E), Ball(C), Pstl(P), Sall(5) e BamHI(B).

Os plasmídeos e 0 ADN isolados foram construídos como se segue. Uma biblioteca de fragmentos de ADN genómico de levedura em lambda-gtll /^Young et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: :1194-1198 (1988)_7 foi analisada com anti-hsp60 (T.t.) /~McKul lin et al., Kol. Ce11, Biol.. 7:4414-4423 (1987)/7.

148 s/n 261,573

-15Dos cerca de 300.000 recombinantes de biblioteca analisados, isolou-se uma única placa positiva a qual, por repurifi cação, originou sómente clones positivos. Os recombinantes posi. tivos continham três fragmentos EcoRI, dentro dos braços lambda, um dos quais foi hibridado com um ARNm induzível por choque térmico. Este fragmento de 3,0 Kb é representado na linha da parte A da Figura.

A análise da sequência nucleótida dos terminais do fragmento de 3,0 Kb revelou uma cadeia de leitura aberta homóloga ao groED /jHendrix, J. Kol. Biol,, 129:375-392 (1979)3⁷ que con. tinua através do sítio marcado E na direcção 5'-3'. Deste modo, usou-se o fragmento de 3,0 Kb como sonda de hibridação para iso_ lar o fragmento de genoma sobreposto contendo o gene HSP60 inteiro. A análise da hibridação Southern mostrou que o fragmento de 3,0 Kb isolado do lambda-gtll era derivado do fragmento EcoRI genómico com aproximadamente 5,0 Kb. Preparou-se uma biblioteca com aproximadamente 5,0 Kb de tamanho fraccionada em fragmentos EcoRI no vector de meio-fago pUCH8 //fieira et al., Ee th.

Enz., 153:3:11 (1987)3⁷ θ analisou-se com o fragmento 3,0 Kb.

Os clones positivos continham o fragmento de 5,3 Kb EcoRI-EcoRI que se mostra na linha da parte B da Figura. A análise da sequência nucleótidica revelou a localização do HSP60.

Para construir ο H5P60::HIS3» o fragmento EcoRI-EcoRI de 3,0 Kb, que se mostra na linha da parte A, foi clonado no vector plasmideo YSp352E, um derivado do vector de vaivém YEP352 3^111 et al., Yeast, 3:163-167 (1986)3^ do qual o fragmento PvuII con tendo o operão parcial lac e múltiplos sítios de clonação foi re. movido e substituído por um ligador EcoRI. 0 plasmideo recombinante foi linearizado no único sítio PstI no HSP60 e ligado a um fragmento de 1,15 Kb de ADN de levedura que contem o gene HIS3 do tipo selvagem. Um dos sítios PstI que delimitam este fragmento está situado a juzante da região de codificação do HIS3, o ou tro sítio PstI é derivado do sítio de clonação múltipla do pUClS Este fragmento linear EcoRI, que se mostra na linha da parte C, foi cortado do YSp352E e usado para transformar o diplóide HI5^~ -HIS3~ a/alfa-W3O3 para independência de histidina, 3Ηΐ^πηβη al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75.: 1929-1933 (1973)3· A análi70 148 s/n 261,573

f) <

-16se por hibridação Southern do ADN cromossómico verificou que os transformantes His^/tinham integrado alelos quebrados nos sítios homólogos nun cromossoma, tinham a constituição genética HSP60/ /HSP60::HIS3.

A Figura 9 tem duas partes (Figuras 9A e 93) e ilustra a sequência de alinhamento principal dos resíduos aminoácido da hsp60, de mitocôndria de levedura com a proteína Ξ. coli groEI (groEI) e com proteína ligante Rubisco (R3P) do cloroplasto de trigo. A sequência de resíduos aminoácido prevista,produto do gene do HSP60, foi alinhada com as sequências previstas das pro teínas do groSL e RBP //Hemmingson et al., Nature, 333:330-354 (1988)/7 usando o programa LiFALGO //Woodbury et al. , J. lie d ♦

Evol., 15.:129-148 (1980)//· Os resíduos partilhados entre a hsp60 e a groSL ou RBP estão assinalados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A. DEFINIÇÕES

ANINOACIDO: todos os resíduos aminoácido aqui identificados estão na configuração natural L. Para manter a nomenclatura dos polipéptidos convencional, J. Biol. Chem. 243:5557-59 (1969), as abreviaturas dos resíduos aminoácido são como se mostra na Tabela de correspondência seguinte:

Tabela de Correspondência

SI1.Í30L0	AIÍINO ACIDO
1-letra	5-	-letra
Y		Tyr	L-tirosina
G		Gly	Glicina
F		Phe	L-fenilalsnina
h		he t	L-metionina
A		Ala	L-alanina
3		Ser	L-serina
1		Ile	L-isoleucina

148 s/n 261,573

-17Tabela de Correspondência (Continuação)

	S ILIBO LO	AMINOÁCIDO
1-letra 3-letra
L	Leu	L-leucina
T	Thr	L-treonina
V	Vai	L-valina
P	Pro	L-prolina
K	Lys	L-lisina
H	His	L-histidina
Q	Gin	L-glutamina
E	Glu	ácido L-glutâmico
W	Trp	L-triptofano
R	Arg	L-arginina
D	Asp	L-ácido aspártico
N	Asn	L-asparagina
C	Cys	L-cisteína
E de	notar que todas as	proteínas ou sequê

duos aminoácido são representadas aqui por fórmulas cuja orienta ção da esquerda para a direita, é a direcção convencional, do grupo amino-terminal para o grupo carboxilo terminal. Além disso, será de notar que um tracejado no princípio ou no fim da sequência de resíduos aminoácido indica uma ligação a um radical tal como H e OH (hidrogénio e hidroxilo) nos terminais amino e carboxilo, respectivamente, ou uma sequência adicional de um ou mais resíduos aminoácido até um total de cerca de 50 resíduos na cadeia de polipéptido.

POLIPÉPTIDO e PÉPTIDO: Polipéptido e péptido são termos aqui usados intermutavelmente para designar séries lineares com não mais de cerca de 50 resíduos aminoácido ligados uns aos ou tros por ligações peptídicas entre os gru

U8 s/n 261,573

pos amino alfa e carboxilo de resíduos adjacentes.

PROTEÍNA: é um termo aqui usado para designar uma série linear com mais de 50 resíduos aminoácido ligados uns aos ou tros como num polipéptido.

NUCIEOTIDO: é uma unidade monomérica de ADN ou ARN consistindo dum grupo açúcar (pentose), de fosfato e de uma base heterocíclica azotada. A base está ligada ao gru po açúcar por um carbono glicosídico (carbono 1' da pentose) e essa combinação de base e açúcar é um nu cleósido. Quando o nucleósido contém um grupo fosfa to ligado à posição 3' ou 5' da pentose é designado por nucleótido. As sequências nucleotídicas sao tam bém lidas da esquerda para a direita da posição 5' para a posição 3'.

PAR de BASE (pb): E uma associação de adenina (A) com a timina(T), ou citosina (C) com a guanina (G) numa molécula de ADN de cadeia dupla.

3. A PROTEÍNA Hsp60

A presente invenção contempla,numa sua concretização, uma proteína de choque térmico de mitocôndria de levedura, biologicamente activa, purificada, com uma massa molecular relativa (H ), medida por electroforese em gel de poliacrilanida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), de cerca de 60.000 daltons (60 K) designada por hspóO. Os análogos biologicamente activos são também contemplados. Esta proteína e os seus análogos estão substan. cialmente isentos de outras proteínas de mitocôndria da levedura e são deste modo designados por proteínas purificadas. Na Pigura 1 mostra-se a sequência de resíduos aminoácido da hsp60 das mito, côndrias de levedura.

Um análogo da hsp60 possui um E de cerca de 55 a cerca de 65 K em análise SDS-PAGE e pelo menos cerca de 60%,de preferência, pelo menos 80% e, muito preferivelmente, pelo menos, 90%, da sua sequência de resíduos aminoácido é idêntica à sequência que se mostra na Pigura 1. Em face das diferenças no Er entre a hsp60 e um seu análogo, contemplam-se inserções e eliminações na

148 s/n 261,573

-19sequência bem como a inclusão de resíduos aminoácido substituí, dos não conservativamente. Assim, quando um análogo tem um Mr inferior a cerca de 60 K, pelo menos 60$ dos resíduos aminoáci. do presentes são idênticos aos que se mostram na Figura 1. Similarmente quando o análogo possui um iir superior a cerca de 60 K, um alinhamento da sequência de resíduos aminoácido do aná logo com a sequência da Figura 1, tal como se mostra na Figura 9 resulta pelo menos numa identidade de 60$ entre as sequências.

Pode portanto dizer-se que uma molécula de proteína hsp60 biologicamente activa, purificada, ou um seu análogo, uma proteí. na da invenção, tem um Mr de cerca de 55 K a cerca de 65 K, determinado como anteriormente se referiu. Pode também dizer-se que esta proteína exibe uma identidade de aminoácidos de pelo menos cerca de 60$ em relação à proteína de choque térmico de mitocôndria de levedura cuja sequência de resíduos aminoácido se mostra na Figura 1, desde o resíduo aminoácido na posição 23 até ao resíduo aminoácido na posição 572.

Um análogo da hsp60 reage também, imunologicamente de um modo cruzado com a hspôO de mitocôndria de levedura, isto é, os anticorpos monoclonais criados para uma₁imuno-reagem com a outra. Os anticorpos monoclonais podem partilhar esta propriedade de reacção cruzada mas não necessitam de depender do epítopo ao qual se ligam.

A actividade biológica da hsp60 ou de um seu análogo manifesta-se na capacidade da proteína para formar um complexo na cromolecular que sedimenta a cerca de 20-25 S num gradiente de sacarose. 0 complexo macromolecular exibe tipicamente uma forma aproximadamente circular com um eixo de simetria Ογ, quando examinado ao microscópio electrónico. 0 complexo tem também um diâmetro de cerca de 10 a cerca de 15 nanometros quando é assim examinado.

de notar que a Figura 1 é apresentada em termos das po. siçoes nucleotídicas começando com a A do ATG que codifica o re. síduo Met amino-terminal, +1 (ou nucleótido na posição 1) e de uma região 5' não traduzida estendendo-se até ao nucleótido na

148 s/n 261,573

posição 410. As posições dos resíduos aminoácido podem. ser obti dos facilmente a partir da Figura 1, por divisão da posição do nucleótido da base mais 3' do codão, por três tal como é bem co. nhecido.

A hspôO ou um seu análogo pode incluir a sequência líder ou a sequência líder pode estar ausente. A sequência líder inicia-se no resíduo 1 da Figura 1 e continua até ao resíduo 22 (Ser).

Não é necessária toda a sequência líder e esta está preferivelmente ausente de modo a que a proteína se inicie no resí.

duo aminoácido da posição 23. Contudo, a proteína pode começar entre com resíduos/l e 22, e pode continuar até ao fim da sequência da Figura 1, (resíduo 572). En concretizações preferidas uma proteína da invenção tem uma sequência de aminoácidos idêntica â da Figura 1 desde a posição 1 até à posição 572 ou desde a posição 23 até à posição 572. Assim, quando presente, a sequência de resíduos aminoácido desde a posição 1 até à posição 22, está ligada por uma ligação peptídica ao resíduo aminoácido da posição 23 e, deste modo, ao restante da sequência até à posição 572.

Uma proteína hspõO ou os seus análogos da invenção, podem ser isolados a partir de células de levedura, usando anticorpos anti-hsp60 ou um anticorpo que reaja de um modo cruzado com hsp60, tai como os anticorpos anti-hsp (T.t.) referidos em I.icLZullin et al., Mol. Cell.Bio., 7.:4414-4423 (1937). 0 método de detecção de hsp60 em células transformadas é descrito em detalhe nos exemplos e nas descrições das figuras. Pode usar-se um método similar para purificar a hsp60, ou um seu análogo, usando cro. matografia de imunoafinidade como é bem conhecido.

isolamento da sequência de ADN está também descrito nos exemplos e nas descrições das figuras. Estas sequências podem ser usadas para transformar as células hospedeiras para exprimirem a hsp60. 0 produto dessa expressão pode ser glicosilado ou não-glicosilado dependendo da célula hospedeira usada.

estudo do mutante de levedura letal condicional, tsl43 aqui descrito,demonstrou que a entrada das proteínas no espaço

148 s/n 261,573

-21da matriz mitocondrial do citosol requer uma proteína de matriz hsp60, de modo a assumirem as suas conformações biologicamente activas. De acordo com a sua função essencial a hsp60 é constitutivamente expressa. A sua classificação como proteína sob ten. são por calor reflecte oincremento da indução observado de 2 a 3 na resposta à incubação a 4290. Esta resposta pode representar um mecanismo celular para a manutenção da conformação funcional das proteínas mitocôndriais durante e após a tensão por calor.

mecanismo pelo qual a hsp60 actua para determinar a conformação biologicamente activa das proteínas que entram no espaço da matriz é indefenido, mas a presença da proteína num. complexo macromolecular cujas propriedades de sedimentação são afectadas por mutação, sugerem que esteja envolvida uma máquina, que inclui outras proteínas. Considerando a dupla estrutura circular sob a qual a hsp60 aparentemente reside, e a estrutura em andaime de 14 subunidades similar nos resíduos crescidos, a hsp60 pode desempenhar principalmente um papel estrutural actuando como uma bancada de trabalho no qual o dobramento é efectuado por outras proteínas com actividade catalítica. Os componentes catalíticos putativos podem residir, quer no comple_ xo, quer na matriz solúvel. Entre estes componentes incluem-se os produtos de tradução dos plasmídeos pl e pl2 que aqui se dis. cutem.

A proteína mitocondrica hsp60 é necessária para a função celular à temperatura normal e também parece estar envolvida na protecção contra a tensão por calor. A proteína hsp60 é necessá. ria para a reunião, dentro da mitocôndria, de múltiplos subunidades de proteína, algumas delas sintetizadas dentro do organito e outras no citoplasma, em enzimas oligoméricas funcionais.

A hsp60 é o segundo membro do regulão de choque térmico, que é requerido para a biogenese das enzimas mitocondriais. Eostrou-se recentemente que as proteínas hsp70 fornecem uma função de não dobragem para a translocação tanto para a mitocôndria co mo para o lúmen do retículo endoplasmático / Deshaies et al., Nature, 332:800-805 (1988) e Chirico et al., Nature, 332:80570 143 s/n 261,573

-810 (1988). Assim, as proteínas com a capacidade de influencia rem a estrutura de ordem mais elevada das várias proteínas mito, côndriais estão localizadas de ambos os lados da membrana do or ganito.

C. SEGMENTO NUCLEOTlPICO

Nos organismos vivos, a sequência de resíduos aminoácido de uma proteína ou de um polipéptido está directamente relacionada, através do código genético, com/sequência do ácido desoxirribonucleico (ADN) do gene estrutural que codifica a proteína. Assim, um gene estrutural pode ser definido em termos da sequên. cia de resíduos aminoácido, isto é, da proteína ou do polipépti. do que codifica.

Um aspecto importante e bem conhecido do código genético é a sua redundância. Isto é, para a maior parte dos resíduos aminoácido usados na síntese de proteínas mais que um tripleto nucleotídico de codificação (codão) pode codificar ou designar um resíduo aminoácido particular. Deste modo, um certo número de diferentes sequências de nucleotídos pode codificar uma sequência de resíduos aminoácido particular. Estas sequências de nucleotídos são consideradas funcionalnente equivalentes uma vez que podem resultar na produção da mesma sequência de resíduos aminoácido após a tradução num organismo. Ocasionalmente pode incorporar-se uma variante metilada da purina ou da pirimi. dina numa dada sequência de nucleótidos. Contudo estas metilações não afectam de modo nenhum a relação de codificação.

Um segmento de nucleotídos isolado, não cromosso^zmico, do presente invento, é caracterizado por incluir uma sequência de ADN que codifica a proteína 60 (hsp60), ou um seu análogo, de tensão por calor, como anteriormente se descreveu. Isto é, 0 se. gmento de ADN da presente invenção é caracterizado pela presença de um gene estrutural da hsp60 ou de um seu análogo, isto é, um gene capaz de codificar uma proteína hsp60 e de exprimir essa proteína num sistema de expressão apropriado tal como aqui depois se descreve. 0 gene que codifica a proteína hsp60 é deno. minado HSP60. Preferivelmente, 0 gene está presente na forma de uma série linear ininterrupta de codões, onde cada codão, codi70 148 s/n 261,573

-23fica um resíduo aminoácido encontrado na proteína, isto é, um gene livre de intrões.

A ocorrência natural do gene da hsp60 é genòmica, localizada num cromossoma de levedura. Um segmento de ADN do presente invento é mais pequeno do que o ADN cromossómico e é não cromossómico.

segmento de ADN da invenção é também uma molécula de ADN isolada que está isenta de cromossoma de levedura e, substancialmente, de todo o ADN de levedura. 0 isolamento de um s£ gmento de ADN da invenção é aqui descrito. Estes segmentos de ADN isolados são encontrados, tipicamente, num vector sintetizado artificialmente tal como é usado na tecnologia de ADN recombinante .

liais particularmente, o presente invento contempla um segmento de ADN contendo um número suficiente de pares de bases (pb) para codificar a hsp60 ou um seu análogo.

Esse número suficiente é de cerca de 1650 pb para a proteína madura e de cerca de 1716 oara a proteína mais a sequência líder. Na prática preferida-, o segmento de ADN contem de cerca de 1750 a cerca de 2200 pb. Para os análogos de peso molecular mais baixo são necessários cerca de 1600 pb enquanto que, para os análogos de peso molecular mais elevado, podem utilizar-se cerca de 2300 pb .

Numa concretização preferida, o segmento de ADN codifica uma sequência de aminoácido correspondente à sequência da Figura 1, usualmente incluindo a sequência líder. Liais preferivelmen. te, o segmento inclui uma sequência de ADN correspondente à sequência de nucleótidos da Figura 1 ou a uma sua porção, que codifica uma proteína da invenção. Isto é, o segmento pode incluir a sequência de codificação da sequência líder e pode também incluir as regiões não traduzidas 3' e 5'» embora a região 3' não codificante esteja preferivelmente, ausente.

Ainda que a região 3' não traduzida esteja, pref erivelmen. te, ausente a região 5' não traduzida, que inclui o promotor de choque térmico de levedura, está preferivelmente presente em alΊΟ 148 s/n 261,573

guinas concretizações do segmento de ADN. Esse promotor de choque térmico é capaz de controlar a expressão da hsp6O tanto em células de levedura como en células de E. coli.

promotor está localizado na sequência de ADN entre o sítio de reconhecimento EcoRI na extremidade 5' da inserção de ADN cromossómico de levedura do plasmídeo p8, cujo mapa de res trição se mostra na Figura 5B. Tal como se pode observar no ma pa da Figura 5B o promotor está localizado no fragmento EcoRI-PotI de 2,5 Kb da inserção e está a cerca de 0,8 a 1 Kb a montante do codão de início (ATG) do hsp60 que se mostra na Fi gura 5B. Este é o ATG localizado na posição de nucleótido +1 da sequência nucleotídica que se mostra na Figura 1. Assim, o promotor do choque térmico de levedura está localizado entre o sítio de reconhecimento 5'-EcoRI e o codão de início para a hsp60 e está no fragmento EcoRI-EcoRI com aproximadamente 5 kb do ADN cromossómico de levedura, cujo mapa de restrição se mos. tra na Figura 5B.

Nesta concretização, o segmento de ADN pode prolongar-se desde o sítio 5'-EcoRI a montante do codão de início da hsp60 até ao nucleótido da posição 1716 e também até ao nucleótido da posição 1783. Subentende-se que 0 promotor anteriormente descri to, quando presente num segmento da sequência de ADN de um análogo da hsp60,está operativamente ligado a um segmento de ADN que codifica o análogo da hsp6O. Quando assim ligada, a sequência de ADN promotora prolonga-se desde o sítio de reconhecimento 5¹-EcoRI até ao codão de início do ADN análogo com as sequê£ cias ligadas em fase, tal como também estão quando a hspôO está, ela própria, codificada.

Assim,o segmento de ADN que consiste essencialmente na sequência que se mostra na Figura 1 desde cerca da posição 1 no seu terminal 5' até cerca do nucleótido da posição 1716 no seu terminal 3' e que é capaz de exprimir a hspôO, constitui uma concretização do presente invento. Um segmento de ADN que consiste essencialmente na sequência que se mostra na Figura 1 des. de uma posição de nucleótido inicial de cerca de 67 até cerca da posição de nucleótido 1716, e que é capaz de exprimir a hspôO,

148 s/n 261,573

-25constitui outra concretização da invenção. Numa outra concreti_ zação, o segmento inclui os nucleótidos que se mostram na Figu. ra 1 desde cerca da posição de nucleótido 410 até cerca da posição do nucleótido 1783. Note-se que se não se usar nenhum si_ nal mais (+) ou (-) é antes do número da posição do nucleótido, este número é positivo.

Os segmentos de nucleótido que codificam uma proteína hsp60 podem conter uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência líder polipéptidica amino-terminal tal como os resíduos aminoácido de 1 a cerca de 22 tal como se mostra na Figura 1. Deste modo, um segmento nucleotídico que forma um gene estru tural que codifica a hspôO, consiste essencialmente da sequência mostrada na Figura 1 desde cerca da posição 67 do seu termi nal 5' até cerca da posição 1716 do seu terminal 3' e pode incluir as posições 1 a 66 do seu terminal 5' hem como as regiões não traduzidas do gene que se mostram na Figura.

As sequências análogas de ADN e ARN que codificam a proteína hsp60 anterior ou um seu análogo ,tal como anteriormente se definiu^são também contempladas. Uma sequência de ADN ou ARN análoga que codifica o análogo de hsp60 anteriormente descrito não necessita de partilhar as percentagens anteriormente referi das de identidade entre a hsp60 e um seu análogo devido às redundâncias do código genético e às diferenças entre a hspôO e seus análogos.

Os segmentos de ADN que codificam as proteínas hsp60 e as proteínas análogas podem ser sintetizados por técnicas quími cas, por exemplo, pelo método do fosfotriéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. , 103:3185 ( 1931).(As descrições da arte aqui citadas são aqui incorporadas para referência). 2 claro, que por síntese química da sequência de codificação, podem efectuar-se quaisquer modificações, simplesmente por substituição das bases apropriadas em vez das que codificam a sequência original de resíduos aminoácido. Contudo, as moléculas de ADN,incluindo sequências idênticas às que se mostram na Figura 1, são preferidas.

Além disso, os segmentos de ADN consistindo essencial70 148 s/n 261,573

-26mente de genes estruturais que codificam uma proteína hspôO po. dem ser obtidos a partir de moléculas de ADN contendo esses ge. nes, e que estão presentes em células eucariôticas. Por exemplo, o isolamento do gene que codifica a hsp60 da Sacchromyces cerevisiae é aqui descrito em detalhe. Uma vez que a sequência é agora conhecida, e está ilustrada na Pigura 1,podem usar-se son das correspondentes a una porção da sequência (ou a sua cadeia complementar) para isolar o gene de uma biblioteca ou para obter genes apropriados noutras células tal como aqui depois se fez.

Um segmento de ADN que inclui uma sequência de codificação da hsp60 pode ser preparado ligando operativamente (unindo) a sequência a um vector de replicação (clonação) usando métodos bem conhecidos. Esse vector é depois disso utilizado para trans. fectar células apropriadas tais como, as de Ξ. coli, de levedura ou de mamíferos, para replicar o ADN e preparar assim ADN em maior quantidade.

ADN replicado pode depois disso ser recolhido operativamente ligado a um vector de expressão e esse vector pode ser transfectado em células apropriadas, tal como anteriormente para exprimir a hsp60. 0 vector usado para a replicação pode também ser usado para expressão em alguns casos como é bem conheci, do, e como aqui se descreve com mais pormenor.

C. CONSTRUÇÕES DE ADN

As moléculas de ADN recombinantes do presente invento po. dem ser produzidas ligando operativamente um vector a um segmen. to de ADN do presente invento ou a uma sequência de ARN correspondente, usando técnicas bem conhecidas. Um vector útil conteõa assim a sua própria sequência polinucleotídica operativamente li gada a um segmento da sequência polinucleotídica que codifica a hsp60 ou um seu análogo,e esse vector é preferivelmente um vector de ADN. Em face desta última preferência os vectores são normalmente aqui designados por construções de ADN ou vectores de ADN.

Tal como é aqui usado o termo vector refere-se a uma molécula de ADN capaz de replicação autónoma numa célula e à

148 s/n 261,573

-27qual está operativamente ligado outro segmento de ADN por forma a possibilitar a replicação do segmento ligado. Os vectores capazes de dirigir a expressão da hsp60 ou os genes análogos são aqui designados por vectores de expressão. Deste modo, uma construção de ADN é uma molécula de ADN híbrida compreendendo pelo menos duas sequências nucleotídicas que não são normalmente encontradas juntas na natureza.

A escolha do vector ao qual o segmento de ADN do presen. te invento está operativamente ligado, depende directamente, tal como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, por exemplo da expressão de proteína, e da célula hospedeira /ser transformada, sendo estas limitações inerentes à arte da construção de moléculas de ADN recombinante. Contudo um vector contemplado pelo presente invento é pelo menos capaz de dirigir a replicação e, preferivelmente também a expressão da hsp60 ou de um gene estrutural análogo incluído em segmentos de ADN ao qual está operativamente ligado.

Em concretizações preferidas, um vector contemplado pelo presente invento inclui um replicão procariótico ou eucarió. tico, isto é, uma sequência de ADN com a capacidade de dirigir a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante, extracromossomicamente numa célula hospedeira procarió. tica ou eucariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana ou de levedura, com ele transformada. Estes replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente essas concretizações incluem também um gene cuja expressão confere um marcador selectivo tal como a resistência às drogas, a uma célula hospedeira com ele transformada. Os genes bacterianos de resistência às drogas, típicos, são aqueles que conferem resistência à ampicilina ou â tetraciclina.

Os vectores que incluem um replicão tal como um replicão procariótico podem também incluir um promotor apropriado tal como um promotor procariótico capaz de dirigir a expressão (trans. crição e tradução) dos genes numa célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli com ele transformada. Similarmente, quando se usa um replicão eucariótico, o vector contém também um promotor

148 s/n 261,573 c^:' leve eucariótico tal corno promotor Gal 1 para uso em células de dura. Tal como anteriormente se referiu, o promotor de choque térmico da levedura localizado a cerca de 0,8 a 1Kb a montante do codão de início da hspóO e dentro do inserido EcoRI-EcoRI, com aproximadamente 5 Kb, de ADN cromossómico de levedura que se mostra na figura 5B, é particularmente preferido.

Um promotor é um elemento de controlo de expressão formado por uma sequência de ADN que permite a ocorrência da ligação da ARN-polimerase, e a transcrição. As sequências promotoras compatíveis com os hospedeiros bacterianos exemplares são tipicamente fornecidas em vectores plasmídeos contendo sítios de restrição convenientes para a inserção de um segmento de ADN do presente invento.

Vectores plasmídeos procarióticos típicos incluem pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 disponíveis a partir dos Biorad Laboratories, (Richmond, CA) e o pPL e o pKK223 disponíveis a partir de Pharmacia, Piscataway, N.J. Descrevem-se aqui vectores adicionais .

Os vectores de expressão de células eucarióticas são tam bém bem conhecidas na arte e estão disponíveis a partir de diversas fontes comerciais. Vectores típicos incluem o pSVl e o pKSV-10 (Pharmacia), o pBPV-l/pML2d (international Biotechnologies, Inc.) e o pTDTl (ATCC, = 312555 ) e o YSp352 //Hill et al., Yeast, 2:163:167 (1986)~7. 0 YEp352 é um vector de vaivém que pode ser usado tanto em células procarióticas (E. coli) como em células eucarióticas (levedura).

Em concretizações preferidas, os vectores de expressão de células eucarióticas, usados para construir as moléculas de ADN recombinante do presente invento incluem um marcador seleccionável que é eficaz numa célula eucariótica. Marcadores sele£ cionáveis preferidos são os genes URA3 e HIS8 aqui utilizados.

Tem-se desenvolvido uma variedade de métodos para ligar operativamente ADN a vectores através dos seus terminais coesos complementares. Por exemplo, podem adicionar-se tractos de homopolímero complementar ao segmento de ADN e ser inserido no

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-29vector de ADN. 0 vector e o segmento de ADN são depois ligados por ligações de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas com plementares, para formar moléculas de ADN recombinante.

Os ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição constituem um método alternativo para ligar o segmen. to de ADN a vectores. 0 segmento de ADN gerado pela digestão com endonuclease de restrição como anteriormente se descreveu, é tratado com ADN polimerase de bacteriofago ou com ADN-polimerase I de E. coli, enzimas que removem, com a sua activida^ de 3'-5'-exonucleolítica os terminais 3' de cadeia simples, sa lientes e que preenchem os terminais 3' recolhidos com a sua actividade polimerizante.

A combinação dessas actividades gera, deste modo segmen. tos de ADN de terminais rombos. Os segmentos de terminais rombos são então incubados com um grande excesso molar de moléculas de ligados na presença de uma enzima que é capaz de catali. sar a ligação das moléculas de ADN de terminal rombo, tal como ADN ligase de bacteriofago T^. Assim, os produtos de reacção, são segmentos de ADN compreendendo sequências de ligadores poliméricos nos seus terminais. Esses segmentos de ADN são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de exoressão que também foi clivado com uma enzima cue dos produz terminais compatíveis com os/segnentos de ADN.

Os ligadores sintéticos contendo uma variedade de sítios de endonucleases de restrição estão comercialmente disponíveis a partir de um certo número de fontes incluindo a International Biotechnologies Inc., New Haven, CN.

D. CÉLULAS TRANSFORMADAS Ξ CULTURAS presente invento refere-se também a uma célula hospedeira transformada com uma construção de vector polinucleotídõ^ co do presente invento. A célula hospedeira pode ser quer procariótica quer eucariótica. As células bacterianas são células hospedeiras procarióticas preferidas e, tipicamente, são uma es. tirpe de E. coli tal como, por exemplo, as estirpes de E. coli,

DH5 disponível a partir de Bethesda Research Laboratories Inc,

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Bethesda, MD, e RR1 disponível no American Type Culture Gollec tion (ATCC) de Rockville, MD (N° ATCC 31343). As células hospe. deiras eucarióticas incluem células de mamíferos e de leveduras, de preferência células de vertebrados tais como células de rata zana, macaco ou a linhagem celular fibroblástica humana. Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem as células de ovário do hamster Chinês (CHO) disponíveis do ATCC como CCL61, células embrionárias de ratinho suíço NIH, NIH/3T3 disponíveis no ATCC como CRL1658, e a estirpe S ♦ cerevisiae RP11 que é difi ciente em ornitina transcarbamilase (OTC), citosólica endógena, que aqui se utiliza. Esta estirpe é descrita por Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 34:4063-4067 (1987).

A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma construção de ADN de presente invenção, é realizada por mé todos bem conhecidos que, tipicamente, dependem do tipo de vector usado. A transformação de células de levedura é aqui discutida de um modo específico. Em relação à transformação de células hospedeiras procarióticas, vêr, por exemplo, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2110 (1972); e Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). A transformação das célii las de levedura é aqui descrita e em Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1986). As transformações particulares em leveduras foram aqui realizadas, tipicamente, usando o método do lítio de Ito et al., J. Bacteriol., 153:163-168 (1983). 0 método de Beggs, Nature 275:104-109 (1973) é também, útil. Em relação à transformação de células de vertebrados com vectores retrovirais contendo ADNr, vêr, oor exemplo, Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4.:1730-37 (1984); Graham et al., Virol. , 52.:456 (1973); e V/igler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1373-76 (1979)·

As células transformadas com êxito, isto é, as células que contêm uma construção de ADN da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução duma construção de expressão da presente invenção, podem ser cultivadas para produzir a hsp60

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-31ou um seu análogo. As células podem ser colhidas, lisadas e o seu conteúdo de ADN pode ser examinado, para avaliar a presença do ADN da invenção, usando um método idêntico ao descrito por Southern et al., J. Mol. Biol. 98:503 (1975) ou Berent et al. Biotech., 3.:208 (1935 )· Alternativamente, a presença de hsp60, ou de um seu análogo, no sobrenadante, pode ser detectada usando anticorpos anti-hsp60 tal como aqui se descreve.

Para além do ensaio directo para avaliar a presença de ADNr, a transformação bem sucedida pode ser confirmada por métodos imunológicos bem conhecidos, quando o ADNr é capaz de di. rigir a expressão da hsp60 ou de uma seu análogo. Por exemplo, as células transformadas com êxito com um vector de expressão, produz em proteínas com antigenicidade da hsp60. As amostras de células suspeitas de terem sido transformadas são colhidas e analisadas para determinar a presença de proteínas hsp60 ou de seus análogos, usando anticorpos específicos para a hsp60.

Assim, para além das próprias células hospedeiras trans. formadas, o presente invento contempla também uma cultura destas células, preferivelmente uma cultura monoclonal (clonalmen. te homogénea), ou uma cultura derivada duma cultura monoclonal, num meio nutriente. De preferência, a cultura contem também a hsp60, ou um seu análogo, biologicamente activo.

Os meios nutrientes normalmente usados para cultivar as células hospedeiras transformadas, são bem conhecidos na arte, e podem ser obtidos a partir de várias fontes comerciais.

E. MÉTODOS

ADN e a construção de ADN anteriormente referidos úteis para a preparação da hsp60 ou de um seu análogo. A hsp60, ou um seu análogo, são utilizados numa composição aquosa in vitro para reunir subunidades proteicas não funcionais, para formar um complexo de proteína oligomérica, bem como para converter formas inactivas de proteínas monoméricas ou de subunidades de pro. teína, em formas activas dessas moléculas.

As subunidades de proteína não-funcionais e as formas inactivas de proteínas monómericas e de subunidades de proteína

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-32incluem moléculas que têm de ser processadas enzimaticamente,

p.e., por uma clivagem hidrolítica, antes de se tornarem funcio nais ou activas, bem como as formas desnaturadas destes materiais proteicos. As formas de proteína desnaturada incluem as formas que indevidamente dobradas, tal como ocorre com a ueia, e desnaturações similares, e exclui as formas desnaturadas quimicamente, tais como quando molécula de proteína está acilada, ou é reagida ou hidrolisada até um peso molecular para o qual não pode ser fun. cional ou activa.

A funcionalidade das subunidades reunidas, anteriormente não funcionais, pode ser avaliada por ensaios biológicos usuais para a proteína funcional. Um exemplo destas proteínas é a ornitinatranscarbamilase (OTG), uma enzima homotrimérica cuja funci£ nalidade, ou a falta desta, pode ser analisada usando um substrato para a enzima, tal como a ornitina.

Como é bem conhecido na arte, para a proteína ser activa é necessário que as moléculas de proteína possuam uma estrutura tridimensional adequadamente dobrada. Adicionalmente muitas proteínas são traduzidas na natureza ou por técnicas de recombinação, numa forma precursora inactiva tal como, p.e., as enzimas zimogénicas que são activadas após a tradução pela acção de uma ou mais enzimas ou por outras moléculas. A OTC é também um exemplo do tipo que, não só tem de ser reunida para ser activa, como também sofre reacções de clivagem após a tradução desde a forma precursora até à forma molecular madura , que é de menor massa molecular relativa que o precursor anterior à reunião. A subunidade beta da ATPase é outra molécula de proteína cujo precursor é clivado antes da reunião do complexo de enzima completo, o qual contém dois conjuntos de cinco subunidades cada. A proteína Pe/S Rieske é monomérica mas também sofre modificações após a tradução, antes de se tornar funcionalmente activa.

Sem querer ser demasiado teórico, crê-se que a molécula de hsp60 e os seus análogos, actuam como andaimes ou moldes mole, culares aos quais o material inactivo ou não funcional se liga e nos quais ocorrem a dobragem adequada e o processamento após a tradução das proteínas ou das subunidades de proteína, de modo a

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formar as formas activas destas proteínas após a dissociação da hsp60 ou a partir dos quais as subunidades de proteína adequadamente formadas ( e/ou processadas) se podem dissociar para formar os complexos de proteína oligomérica funcional. Este é especiaimente o caso das proteínas de mitocôndria.

Assim um outro aspecto do presente invento contempla um método de reunião de subunidades de proteína não funcionais, de sequências de um ou mais resíduos aminoácido num complexo de proteína oligomérico funcional. De acordo com este invento, as subunidades de proteína, não funcionais são misturadas in vitro, para formar uma mistura aquosa, com uma preparação aquosa de matriz de mitocôndria de levedura biologicamente operativa que con. tem a hsp60, ou um seu análogo, numa quantidade de pelo menos duas vezes a quantidade da hsp60 naturalmente presente, após o choque térmico, e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 50 microgramas (>>g), pelo menos, por miligrama (mg) de proteína total da matriz da mitocôndria até cerca de 10% em peso de hspôO ou de um seu análogo baseado no total da proteína da matriz mitocondrial presente. Esta mistura é mantida sob condições de cultura biológica por um período de tempo suficiente para que as subunidades se liguem à molécula de hspôO ou de um seu análogo para serem processadas e dobradas correctamente, e daí dissociadas para formarem um complexo de proteína oligomérica funcional. Este complexo funcional pode depois disso ser recupe. rado. A recuperação não é essencial e o complexo pode ser usado na solução onde foi preparado.

Note-se que as preparações normais de matriz de mitocôndria da levedura contêm hsp60. Contudo, a quantidade desta proteína naturalmente presente nestas preparações, mesmo após o choque térmico é, tipicamente, de cerca de 10 a cerca de 20 jug/mg. Uma preparação de matriz contemplada contém, pelo menos, cerca de duas vezes a quantidade de hspôO ou de um seu análogo está naturalmente presente, mesmo após o choque térmico.

As preparações da matriz de mitocôndria biologicamente operativa, são elas próprias bem conhecidas na arte. Exemplos destas preparações estão descritos em Cheng et al., Proc. Natl.

148 s/n 261,573 z^<:

-34Xi

Acad. Sei. USA, 84:4063-4067 (1987); e em NcLIullin et al., .Tol. Cell. 3iol. 8:571-580 (1988). Descreve-se aqui, depois, uma outra preparação ilustrativa de matriz de mitocôndrica. Pressupõe -se que a preparação da referida matriz está substancialmente isenta de células inteiras e de materiais nucleares, tais como o ADN, e também isenta, tipicamente, de proteínas da membrana celular e de líquidos.

A preparação da matriz de mitocôndria contém preferivelmente, apenas as proteínas da matriz. Contudo pode usar-se a mitocôndria inteira, bem como uma preparaçao na qual a membrana externa está ausente. Estas preparações estão isentas de membra na externa e de intermembrana fluída, e podem ser preparadas por tratamento da mitocôndria, por choque osmótico ou com uma enzima fosfolipase, seguido de centrifugação, p.e., num gradiente de den sidade, para obter partículas das membranas internas e da matriz. 0 tratamento das partículas recuperadas da membrana interior com detergente, liberta a matriz e solubiliza componentes da membrana interior,tais preparações são biologicamente operativas pois as proteínas da matriz não estão desnaturadas ou inactivadas por qualquer outra forma.

A mistura é mantida sob condições de cultura biológica, por exemplo, a uma temperatura de cerca de 12C a cerca de 4020 e num tampão apropriado e a um pn com um valor de cerca de 7,0 a 7,5. 0 tempo de manutenção, isto é, o tempo suficiente para formar um complexo de proteína oligomérica funcional pode variar bastante, dependendo das subunidades de proteína usadas e do com plexo de proteína desejado, bem como da temperatura. Os t Θ UJ pos habituais de manutenção são de cerca de 5 minutos a cerca de 25 horas. Tempos mais usuais são de cerca de 30 minutos a cerca de 10 horas.

0s complexos de proteína oligomérica funcionais podem ser recuperados da mistura reaccional de diversos modos bera conhecidos dos técnicos experimentados. 0 modo seleccionado é mu/ tas vezes determinado pelo próprio complexo de proteína. Procedimentos exemplares incluem a cromatografia de afinidade e a centrifugação num gradiente de densidade de sacarose. Â funcio70 148 s/n 261,573

-35nalidade do complexo de proteína recuperado é avaliada por técnicas convencionais.

O método de conversão de uma forma inactiva da proteína monomérica ou de uma subunidade de proteína, numa forma activa de cada molécula é também contemplado. Aqui o monómero inactivo ou subunidade é misturado in vitro com a preparação aquosa da matriz de nitocôndria, biologicamente activa, com hsp6O ou de um seu análogo tal como antes se referiu. Esta mistura é man. tida sob condições de cultura biológica por um período de tempo suficiente para que a forma inactiva se torne uma forma activa, isto é, liga-se à hsp6O ou a uma molécula análoga, é processada, dobrada adequadamente e dissociada, tal como antes se descreveu.

Cada um dos métodos anteriores podem ser melhorados pela presença de uma ou de ambas as proteínas expressas pelo vectores, pl e pl2 anteriormente referidos. Cada um destes produtos da expressão é também uma proteína de mitocôndria de levedura e está consequentemente presente na preparação de mitocôndria tal como a hsp6O de levedura. Contudo tal como a hsp6O ou uma molécula análoga, a quantidade de qualquer produto de transcrição presente na mistura reaccional está em excesso em relação à quantidade normalmente presente numa preparação da matriz. Aqui, a quantidade de produto traduzido do vector pl é também de cerca de 40 yjg/ml até cerca de 10$ do total da proteína da matriz de mitocôndria enquanto que para o produto traduzido do vector pl2, o total é de cerca de 40 g/mg até cerca de 10$ do total de pro. teína da matriz de mitocôndria.

Ainda em outros aspectos do método da invenção, utiliza-se uma preparação da matriz de mitocôndria isolada na ausência de hspóO ou de um seu análogo, ou dos produtos de tradução dos plasmideos pl e pl2, para reunir subunidades de proteína não fun cionais ou para converter uma forma inactiva duma proteína monomé rica ou de uma subunidade de proteína num complexo de proteína oligomérica funcional ou numa proteína activa. Os passos destes métodos são substancialmente os que anteriormente se descreveram com a excepção de as proteínas misturadas estarem presentes nas suas concentrações naturais.

Em cada um dos métodos anteriormente descritos, a prepa70 148 s/n 261,573

ração da ciatriz, com ou sem a adição da hspôO ou de um seu aná logo (ou dos produtos de tradução de pl ou pl2) (preparação da proteína total de matriz), está presente numa quantidade eficaz de modo a tornar funcional ou activar a mistura das subunidades de proteína ou as moléculas de proteína monomérica ou as moléculas de subunidades não funcionais respectivamente. Esta quantidade pode variar bastante, dependendo, inter alia, da temperatura utilizada,da quantidade de material não-funcional ou inactivo misturado e da velocidade à qual se pretende que a reacção se processe.

Tipicamente, as subunidades de proteína ou as moléculas de proteína monomérica ou as moléculas de subunidades de proteí_ na, estão presentes numa proporção de peso, em relação à proteí. na tope da preparação de matriz, incluindo a hspôO ou um seu análogo bem como os produtos de tradução dos vectores pl e pl2 quando presentes, de cerca de 1 a cerca de 20 partes do primeiro em relação a cerca de 200 a cerca de 2.000 partes do último relaçao à erypreparação de matriz total. Liais especificamente, a relação de peso é de cerca de 5 a cerca de 10 partes para cerca de 300 a cerca de 1.000 partes, na ordem mencionada.

A concentração de proteína total na composição aquosa utilizada no método in vitro anterior é de cerca de 10 a cerca de 70 miligramas por mililitro ( mg/ml ). Liais preferivelmente, essa concentração é de cerca de 30 a cerca de 50 mg/ml. Note-se que, uma vez que a preparação de matriz total constitui cerca de 90% ou mais em peso de proteína na mistura, pode-se basear a concentração de proteína até ao teor de proteína na preparação do total de matriz de mitocôndria de levedura.

EXEiiPLOS

Pretende-se que os seguintes exemplos sejam ilustrativos mas não limitativos do presente invento.

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-57EXENPLO 1: Isolamento de um mutante defeituoso na Dobragem/Reunião

Ilustra-se na Figura 2 uma estratégia para o isolamento de mutantes de levedura condicionais afectando o mecanismo de importação da mitocôndria. A estratégia foi baseada na presunção de que a obstrução da importação das enzimas metabólicas essenciais que residem dentro das mitocôndrias seria letal. Foi baseada também na observação de que, quando se exprimiu, em levedura, a subunidade precursora da enzima da matriz de mitocôndria humana, ornitinatranscarbamilase (OTC), o precursor seguiu o mesmo percurso de importação, usado pelos precursores endógenos de mitocôndria de levedura.

Os mutantes letais sensíveis à temperatura (ts) são derivados de uma estirpe de levedura de Saccharomyces cerevisiae que é defeituosa no local OTC de levedura (Argo) mas contei no seu local URA3 um segmento integrado contendo a sequência de co dificação da OTC humana, ligada com um promotor Gal Ide levedura indutível (estirpe GALOTO). Para identificar os mutantes de choque térmico (ts) afectados na importação da mitocôndria,a exoressão da OTC humana a uma temperatura não permitida foi inse duzida, e examinou-se/a actividade da enzima OTC podia ou não, ser produzida sob estas condições. Um grupo de mutantes que não demonstraram actividade foram recolhidos.

Estes mutantes foram ainda analisados por imunomancha dos extractos, com o antisoro anti-OTC. Distinguiram-se duas classes de mutantes. Numa das classes, estão os precursores de OTC humana e de proteínas endógenas de mitocôndria de levedura acumuladas a temperatura não permitida. Uma analise complementar desta classe revelou 3 grupos denominados mif 1, 2 e 3 (mutantes da função de importação de mitocôndria). kostrou-se que o mif 1 e 2 codificam as duas subunidades de protease de processamento da mitocôndria , a proteína melhoradora do processamento (PEP) e a peptidase de processamento da matriz (KPP), respectivamente .

Numa segunda classe de mutantes letais ts a subunidade OTC de tamanho maduro foi observada a uma temperatura não permi

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-33tida (K⁺) mas não se detectou actividade de enzima OTC (A^-).

Três diferentes defeitos moleculares podem explicar este fenótipo:

1) Um defeito na translocação, deixando as subunidades de OTC só um pouco translocadasatravés das membranas da mitocôn. dria, numa posição onde podem ser clivadss pela enzima de processamento da matriz até a um tamanho maduro mas não estão aptas a ser translocadas através das membranas para uma posição onde possam contactar mutuamente para se unirem para formar uma enzi. ma homotrimerica activa; 2) Um defeito na própria subunidade da OTC permitindo que as subunidades da OTC sejam completamente translocadas para o espaço da matriz mas que bloqueia a sua reu nião para formar um homotrímero enzimaticamente activo;3) Um defeito num componente da mitocôndria que normalmente desempenha um papel na reunião das subunidades que atingem o espaço da matriz. 0 segundo tipo de defeito não conduziria, por si próprio, a um fenótipo letal porque a actividade da OTC não é requerida para o crescimento das células, desde que a arginina esteja presente no meio de crescimento. Contudo o primeiro e terceiro tipo de defeito podem produzir um fenótipo letal, pois esses defeitos podem envolver componentes que provavelmente desempenham um papel importante na importação.

Para determinar se quaisquer dos mutantes exibiam defeitos de translocação ou de reunião, cada mutante foi excisado da sequência de OTC humana, transformado com um novo segmento Gal-OTC é testado a 37-C para determinar tanto o tamanho das subunidades OTC como a presença de actividade enzimática. Mais es pecificamente cada mutante foi em primeiro lugar coberto por uma estirpe arg3 e esporolado. Os tetrados são então examinados para determinar um comportamento, ts letal 2:2 para demonstrar que uma mutação letal simples estava presente na espécie mutante original. Os esporos foram também testados para determinar a ausência do Gene URA3, por forma a identificar os esporos ts nos quais a mutação ts se tinha segregado do segmento original Gal-0TC-URA3, integrado.

Os esporos ts-ura foram transformados com um novo segmen.

148 s/n 261,573 to Gal-0TC-DRA3. Os transformantes Ura ⁺ foram examinados quanto à acxividade OTC após indução com galactose a J7²C. Nove em dez mutantes exibiram níveis normais de actividade sugerindo que tinham originalmente sofrido duas mutações, uma mutação ts letal que não afecta directamente o percurso de importação e uma segunda mutação que afecta a sequência da OTC humana.

Contudo, um dos dez mutantes, o alfa-l^p, também designa, do por tsl+3 comportou-se diferentemente. Tal como nos outros mutantes, as subunidades da OTC de tamanho maduro foram detecta das após uma indução a J7²C. Todavia neste mutante não se detec tou nenhuma actividade da OTC. Quando examinado a uma temperatu. ra permitida, C.A-0, este mutante comportou-se como a estirpe do tipo selvagem. Detectou-se a presença de subunidades maduras e de actividade de OTC. 0 tsl43 contem assim uma única mutação ts letal que afecta a capacidade das subunidades da OTC humana, do tipo selvagem de tamanho maduro, em produzir activiaade enzimática .

Para determinar se as subunidades OTC nas células tsl+3 se tinham reunido para formar uma enzima homotrimerica, realizou-se um ensaio usando um análogo de substrato OTC, delta-N-fosfonoacet il-L-ornitina (PALO). Os extractos celulares totais foram preparados a partir de ambas as células, tsl+3 e do tipo selvagem, e cultivaram-se durante 2 horas a 37⁵C em meio de galactose. Os extratos foram aplicados a colunas contendo PALO ligado a Sepharose. Os produtos eLmídos da coluna foram re, colhidos e imunoprecipitados com antisoro anti-OTC. Os precipitados foram solubilizados, fraccionados em SDS-PAGE e o gel foi analisado por imunomancha com anti-soro anti-OTC.

Como se mostra na Figura 3A, quando os extractos do tipo selvagem (painel da esquerda) foram aplicados na coluna, não se observaram subunidades de tamanho maduro na fracção atravessante (CSe BK), o que é consistente com a capacidade do análogo do substrato em se ligar quantitativamente à enzima OTC reunida. Em contraste quando um extracto de células tsl+o foi aplicado (painel da direita) verificou-se que a fracção atravessante cori tinha tanto o precurso como as subunidades OTC de tamanho maduro, numa quantidade correspondente à aplicada.

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Ambas colunas do tipo selvagem e tsl43 foram seguidamente lavadas com tampão contendo KOI 40 mH (SU). Não foram eluídas subunidades OTC de qualquer das colunas o que indica ausên. cia de ligação não específica.

As colunas foram finalmente lavadas com o substrato da OTC que é o fosfato de carbamilo, (Cp). Uma quantidade de subunidades OTC de tamanho maduro correspondente, aproximadamente, à originalmente aplicada foi eluída da coluna do tipo selvagem. No caso da coluna de tsl43 não foram detectados nem o precursor OTC nem a subunidade OTC madura demonstrando a passagem quantitativa das subunidades através da coluna durante a aplicação inicial do extracto. Deste modo, as subunidades de OTC humanas, do tipo selvagem, de tamanho maduro, são produzidas nas células tsl43 a 37²C mas não se reúnem para formar uma enzima OTC homotrimerica cataliticamente activa.

EXELÈPLO 2:

A reunião de uma proteína endógena de mitocondria de levedura foi afectada nas células tsl43 a uma temperatura Não-Permitida

Realizou-se um ensaio para reunir a subunidade beta FlATPase de proteína de matriz, codificada, nuclear para formar o complexo ATPase. Este ensaio utilizou a observação prévia de que a extracção por clorofórmio (CHCl^) de uma suspensão de mitocôndria, deixou na fase aquosa o complexo PlATPase reunida, enquanto que as subunidades não reunidas de ATPase permaneceram na fase orgânica. As células tsl43 e do tipo selvagem foram cul.

tivadas a 23²G, sendo a temperatura depois mudada para 37³C e 35 marcadas com um impulso de S-Metionina. Após 2 horas as células foram colhidas e prepararam-se as mitocôndrias.

Uma metade de cada uma das preparações foi directamente solubilizada e depois imunoprecipitada com o antisoro anti-Plbeta (F1B). A metade restante de cada preparação foi extraí da com igual volume de clorofórmio e imunoprecipitou-se a fase aquosa. Os precipitados são analisados por SDS-PAGE por auto-ra diografia tal como se mostra na Figura 33. Este procedimento de

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extração com clorofórmio foi realizado, substancialmente, cono se descreve en Douglas et al., J Biol. Chem., 252:8333-8335 (1977), tal cono é aplicado ao presente sistema.

Após a extracção da mitocôndria do tipo selvagem (Y/t), com clorofórmio, a subunidade madura F13 foi recuperada quase quantitativamente para a fase aquosa reflectindo a reunião das subunidades maduras para formar o complexo ATPase. Em admirável contraste, após a extracção com clorofórmio da mitocôndria tsl43 não se detectou, na fase aquosa, a subunidade F13 não madura. Assim, a subunidade F13 madura produzida no mutante tsl43 a uma temperatura não permitida não conseguiu efectuar a reunião do complexo FlATPase.

EXEMPLO 3:

As Proteínas monomericas de mitocôndria não conseguiram assumir uma conformação activa nas células ts!43

Após a observação que duas proteínas diferentes de mitocôndria codificadas nuclearmente, no mutante tsl43 atingiam o tamanho maduro mas que não conseguiram a reunião para formar as enzimas oligomericas correspondentes, estudou-se se as proteínas de mitocôndria que assumem uma forma monomérica na matriz mitocôndrial podiam também ser afectadas. Duas destas proteínas são examinadas.

Em primeiro lugar, estudou-se a proteína BIESKE Pe/s. Este polipéptido codificado nuclearmente é normalmente traduzido no citosol como um precursor e importado para o espaço da ma triz. Após clivagem de uma porção amino-terminai do seu péptido de sinal pela protease de processamento da matriz, a proteína Pe/s liga-se a um átomo de Perro, é clivada por uma segunda pro. tease localizada na matriz e sai através da membrana interior da mitocôndria para atingir o seu destino final no espaço inter membranas.

destino da proteína Fe/s em ambas células do tipo selvagem e tsl43, foi examinado por imunoprecipitação dos extractos das células, radio-narcadas, a 37²C. Quando as células tipo, -selvagem foram examinadas, virtualmente toda a proteína Fe/s

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-42imunoprecepitável foi observada na forma madura. Em contraste, nas células tsl43 apenas a espécie de tamanho intermédio foi detectada. Esta anormalidade pode resultar de: 1) translocação defeituosa das moléculas da proteína Fe/s através das membranas mitocondriais; as moléculas podem atingir apenas uma posição in. termédia, onde a porção de sinal atinge o espaço da matriz e é clivada pela protease de processamento da matriz, mas o restante da proteína fica para trás numa topologia envolvente da membrana, incapaz de continuar os passos subsequentes da biogénese; 2) defeito na complexação, das moléculas localizadas na matriz, com o Ferro; se a complexação com o ferro dirige normalmente a proteína de tamanho intermédio para a conformação requerida, pa ra reconhecimento pela segunda enzima de processamento, então um defeito de complexação, que pode ele próprio requerer uma al teração conformacional, bloqueia o segundo passo da clivagem pro. teolítica; 3) defeito no processamento proteolítico das moléculas complexadas, isto pode resultar da deficiência das proteínas complexadas em assumirem uma conformação que possa ser reco, nhecida pela enzima de processamento ou de um defeito no proces. sarnento da própria enzima.

Para definir o passo envolvido analisou-se uma segunda proteína citocromo b^, que prossegue um percurso de biogénese divergente do da proteína de RIESKE Fe/s analisada. Tal como a proteína de Rieske, o citocromo b^ é traduzido no citosol como um precursor, é importado para o espaço da matriz e a porção grupo amino-terminal do seu péptido de sinal é clivado pela pro. tease de processamento da matriz. Contudo este polipéptido é de. pois obrigado a voltar para trás, directamente através da membrana interna para o espaço intermembranas. Aí, o restante do péptido líder é clivado por uma protease distinta das que se lo. calizam no espaço da matriz. A proteína fixa-se então na membra na interna devido ao grupo carboxílico terminal hidrofóbico. Tal como se mostra na Figura OC quando as células tsl43 foram radioligadas a 37²C e os extractos celulares imunoprecipitados com o anti-soro anti-b^, apenas se observou a forma de tamanho intermédio (i) não se observando nenhuma proteína de tamanho maduro

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—43— (a) nem. o precursor (pre) tal como no caso das células do tipo selvagem (Wt).

A anormalidade neste caso pode resultar: da translocação defeituosa das moléculas para a matriz; ou de uma falha das moléculas b>2 de tamanho intermédio, totalmente translocadas, em serem redireccionadas através da membrana interna. 0 segundo fenotipo pode resultar quer duma deficiência da alteração conformacional que se presume ser necessária para a translocação de retorno através da membrana interna,quer de um defeito no próprio dispositivo de translocação.

último defeito não pode explicar também, por si só, os resultados com a proteína Fe/s pois essa proteína nunca atinge o passo de translocação através da membrana interna. Isto é, a obstrução da biogenese da Fe/s ocorre antes de um segundo passo do processamento que precede a translocação através da membrana interna. Assim,para que o defeito na tsl^b afecte similarmente tanto as proteínas Fe/s como o citocromo b^ o passo afectado en volve quer a translocação para o espaço da matriz quer a altera ção conformacional mediada dentro do compartimento da matriz.

Para distinguir o defeito no tsl4b, sintetizaram-se as mesmas subunidades de mitocóndria de levedura que tinham sido examinadas em células intactas, como precursores e incubaram-se com a mitocóndria isolada a partir de culturas do tsl43 cul tivado quer a uma temperatura permitida quer a uma temperatura não permitida. Os métodos usados nestes estudos foram substancialmente os referidos em Hartl et al·., Ce 11. 51:1027-1037 (1937) e em Hartl et al., Oell. 47:9o9~951 (1936), nos quais se descrevem os estudos in vitro de importação para a mitocóndria da Neurospora Crassa, do citocromo b^ e da proteína RIESKE Fe/s respectivamente .

Quando o precursor beta-Fl foi incubado com a mitocóndria tipo selvagem (V.'t) preparado a partir de células a 37^eC, a subunidade foi convertida no seu tamanho maduro. Quando se adicionou proteinase K à mistura após a incubação, esta não conseguiu digerir a subunidade madura indicando a localização dentro dos

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-44organitos. Quando as mesmas incubações foram realizadas usando a mitocôndria preparada a partir da cultura de tsl45 a 37²C, observou-se que a subunidade madura e uma pequena quantidade do cela precursor estavam protegidos da digestão/protease adicionada. Isto exclui um defeito de translocação, o qual deixaria a subu. nidade madura susceptível de sofrer proteólise.

Para determinar o estado de reunião das subunidades Fl-beta maduras importadas, os organitos foram extraídos com clorofórmio. Solubilizaram-se o sobrenadante e as fases orgânicas e analisaram-se por imuno-mancha com anti-soro anti-beta-Fl.

Ouando se extraiu a amostra do tipo selvagem, mais do que 50% para do total de subunidades Fl-beta maduras passaram / fase aquosa indicando a reunião da subunidade importada para formar o complexo ATPase. Quando a amostra de tsl43 foi extraída não se detectou, virtualmente a subunidade de tamanho maduro na fase aquo. sa, estando substancialmente todas as subunidades existentes na fase de clorofórmio, indicando que a subunidade importada falhou em reunir-se.

Em seguida, examinou-se o comportamento dos precursores da proteína Fe/s e do citocromo b^. Aqui, quando a proteína Fe/ /s foi incubada com a mitocôndria do mutante (tsl43) esta atinge apenas o tamanho intermédio, o que corresponde aos resultados obtidos com as células intactas.

No caso do citocromo b^ os efeitos são menos marcantes do que com as células intactas. A observação repetida foi de que uma quantidade mais pequena de subunidade madura foi produzida pela mitocôndria mutante, quando comparada com a do tipo selvagem.

as

Para ambas/proteínas as espécies de tamanho intermédio observadas com a mitocôndria mutante, estavam protegidas da digestão pela tripsina adicionada indicando que as subunidades destas duas proteínas, tal como a beta-Fl, tinham sido completa, mente translocadas para o compartimento da matriz. Deste modo o defeito no tsl43 afectou o mecanismo pelo qual as proteínas assumem conformações apropriadas após a sua entrada no espaço da

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ff |H |3

.....'. ·

-45matriz. Estas conformações são necessárias para as subunidad.es componentes se reunirem, para formar as suas proteínas oligomé_ ricas respectivas e assumirem actividade biológica.

EXELPIO 4:

Caracterização da Mutação no Gene da hsp60

Para caracterizar adicionalmente a mutação no tsl45,esta estirpe foi submetida a cruzamentos genéticos.

Em primeiro lugar esta estirpe foi cruzada a 23^QC com uma estirpe do tipo selvagem,do tipo do cruzamento oposto e os diplóides foram mudados para 37^SC. Observou-se um crescimento normal à temperatura elevada e a quantidaae de actividade da enzima OTC detectada a seguir á indução pela galactose,foi idê tica à detectada na estirpe original GA10TC. Esta falta de efe to mutacional no diplóide heterozigótico indica que a mutação no tsl43 é recessiva.

A estirpe tsl43 foi de seguida cruzada com cada um dos três outros mutantes letais recessivos afectando os caminhos de importação para a mitocôndria mif 1, z e 3. Os primeiros dois destes mutantes afectam as subunidades da protease da matriz, en quanto o terceiro afecta um factor citosólico putativo. As células diplóides destes três cruzamentos cresceram normalmente a 37²C, indicando que o tsl43 pertence a um grupo de complementação distinto designado de mif 4 (tsl43). A observação do compor tamento genetico distinto do tsl43, es-_ua de acordo com o fenótipo distinto deste mutante.

Para isolar uma cópia do tipo selvagem do gene afectado no tsl45, a espécie haplóide foi transformada com uma biblioteca CEN substancialmente idêntica à do Depósito ATCC N² 37 415, preparada usando/vector de vaivém YCp50 (ATCC 37 419) //Rose et al., Gene, 60:237-443 (1987)_7 contendo fragmentos do ADN genomico de levedura inseridos num plasmídeo que contem tanto uma sequência de centromero como um marcador URA3. A biblioteca par ticular usada era uma biblioteca guardada, obtida directamente do Dr. Peter Novick, um co-autor do artigo acima citado de Rose et al. Essa biblioteca era por isso substancialmente a mesma da

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..y

-46ATCC No. 07 415.

Numa das estratégias de recuperação genética, os transformantes URA⁺ foram seleccionados a 23²C, e as réplicas foram colocadas em placa num meio enriquecido (YPD) e posto a 37²C. Numa segunda estratégia as células de levedura foram directanente colocadas em placas de meio YPD a 37²C seguindo-se a trans. formação.

Em ambos os casos, o ADN foi preparado a partir de trans formantes de colónias, purificados, e usou-se para transformar a Ξ. coli para resistência à ampicilina. Os ADNs plasmídeo foram então isolados e caracterizados por análise de restrição. Os plasmídeos da estratégia, envolvendo selecção URA inicial a 2320,seguida da colocação da réplica em placa a 372c, tinham todos em comum vários fragmentos de restrição que continham ADN da genomico de levedura inserido. Os plasmídeos/estratégia, envolvendo a colocação directa em placa a 37⁹C,exibiram não só este padrão em vários isolados mas também outros padrões de restrição distintos, cada um deles isolado independentemente mais do que uma vez.

.se

Seguidamente, estudou-se/qualquer um destes plasmídeos de recuperação podiam codificar uma proteína de choque térmico. As inserções de ADN de levedura dos plasmídeos são cortadas e traduzidas e usadas para pesquisar manchas contendo ARN prepara, do a partir da levedura do tipo selvagem cultivada a 23^SC e oan tida,quer a esta temperatura quer exposta, primeiramente, a uma incubação a 4290 por uma hora. Os resultados deste estudo, com o inserido de um plasmídeo designado por p3 relativos ao único grupo de plasmídeos obtidos por ambas as estratégias de recuperação, indicaram um incremento na quantidade de ARN analisada nas células incubadas à temperatura mais elevada em relação às incubadas à temperatura mais baixa. 0 plasmídeo p3 contém assim o plasmídeo YCp50 mais o gene da proteína de recuperação.

pS inserido identifica um ARNm de poli A⁺ com aproxima damente 1800 nucleótidos. A quantidade desta espécie presente na preparação de ARN total foi incrementada em 2 a 3 vezes por

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-47incubação a 4290. Tanto o tamanho como indução por calor desta mensagem indicam que ela pode codificar uma proteína com aproximadamente 64 Kilodalton (K), obtida por choque térmico, recen temente identificada na mitocôndria da levedura por llcEullin et al., líol, Cell. Biol., 3(1):371-330 51983).

Para determinar se era este o caso,o mapa de restrição do p8, mostrado esquematicamente na Figura 5B, foi comparado com o mapa do lambda-hsp60, um plasmídeo de levedura isolado, tal como aqui depois se descreve a partir de uma biblioteca lambda-gtll, usando um anti-soro dirigido contra a proteína de 5âK homóloga, obtida após choque térmico, da Ϊ. Thermophila //an. ti-hsp60 (T.t.)_27. Os mapas dos dois segmentos de levedura clonados são exactamente sobrepostos.

Para confirmar a identidade das duas sequências sujeitou-se uma região de p8, estendendo-se desde um sítio PstI (ver seta na Figura 5B), a uma análise da sequência do ADN. A sequência p3 foi comparada com a da região correspondente no lambda-hsp60, que se situa na região de codificação da proteína. As duas sequências eram idênticas.

Para estabelecer se o HSP60 é o gene afectado pela mutação, nas células tsl43, e deste modo excluir a hipótese de que a transferência de uma cópia adicional de H5P6O pode recuperar uma mutação que ocorre num local diferente, realisou-se um estudo de recombinação homóloga. 0 plasmídeo p8 foi resseccionado com as enzimas de restrição Smal e BglII para remover a sequência do centrómero. 0 plasmídeo derivado recircularizado foi linearizado num sítio único BamHI com a sequência de codificação HSP60 e transformado no tsl43. Os transformantes URA ⁺ foram seleccionados e analisados por hibridação de mancha de ADN usando um segmento da sequência de codificação HSP60 como sonda, para confirmar a inserção da sequência HSP60 clonada no homólogo cro. mossómico.

Cruzaram-se dois transformantes contendo estas inserções homólogas, independentemente, com a espécie ura^- do tipo selvagem, os diplóides foram esporulados a 239Q θ os segregantes foram examinados para avaliar a sua capacidade em crescerem a 37²C.

4?

f/

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-48Se o sítio da mutação do tsl43 fosse no HSP60, então a recomtã nação homologa deveria permitir que todos os esporos crescessem a 37²O. Se a mutação estivesse localizada algures no genoma da levedura, então a recomòinação homóloga para o HSP60 não deveria recuperar o fenotipo mutante. Em vez disso o fenotipo mutan. te deveria simplesmente segregar 2:2. Rigorosamente uma fracção significativa dos esporos que contêm a inserção homóloga, e são deste modo ura⁺, deveriam contudo exibir o fenotipo mutan. te .

Examinaram-se dezassete tetradas de um diplóide e oito de outro. Os resultados foram inequívocos. Todos os esporos cre.s ceram normalmente a J7²C, incluindo os 50% que eram ura⁺. Deste modo a mutação na espécie tsl43, responsável pelo defeito obser vado na reunião/dobragem, envolve a hspóO.

Dois plasmídeos adicionais obtidos do trabalho atrás des. crito foram também capazes de recuperar as células tsl43. Estes dois plasmídeos são designados por pl e pl2, e contêm cerca de 14 e 13 kilobases respectivamente, (Figuras 50 e 5D respectivamente). Cada um destes plasmídeos contem um gene que é diferente do gene da hsp60 e também diferente do gene da proteína hsp70 referida em Ecmullin et al., mol. Cell. 3iol, 8:571-bSO (1938). EXEMPLO 5:

A Ivlutação Afecta o Complexo Contendo a hsp60

Nos exemplos anteriores mostrou-se que o gene H5P60 é e_s sencial ao crescimento de levedura. Os genes codificam una pro. teína precursora com aproximadamente 66 K que é dirigida para a matriz mitocondrial por um péptido de sinal clivável/amino-termi nal. A proteína madura de aproximadamente 64 K tem uma notável semelhança com o produto de 65K do gene C-roEL da E. coli, produto necessário para a reunião da cabeça de bacterio^zfago e essencial para a viabilidade celular. Esta relação estrutural e possivel relação endossimbiótica evolutiva da hspóO, uma proteí. na bacteriana que aparece participar na reunião molecular, supor ta adicionalemente as conclusões das análises bioquímicas do tsl43 de que a hspóO participa na reunião/dobragem das proteí70 143 s/n 261,573

nas na matriz mitocondrial. Tal como o GroEL, mostrou-se que a hspÓ4 reside num complexo macromolecular: após extracção no seu estado nativo, sedimenta en gradientes de sacarose até un tamanho superior ao do monómero, em gradientes de densidade de sacarose de cerca de 20-25 S; e em análise por microscopia electrónica das fracçoes da matriz que contêm a proteína,observam-se dois toros circulares com uma simetria C7 situados um no topo do outro .

Se o complexo macromolecular contendo a hsp60, é o media dor activo da reunião, então a alteração do componente hsp60 por mutação pode afectar a integridade do complexo. Para estudar esta possibilidade, prepararam-se extractos totais a partir das culturas de tsl43 que tinham sido cultivadas a 23⁵C e manti dos quer a essa temperatura quer a 3720 durante meia hora. Após uma centrifugação a baixa rotação, os extractos foram preclassifiçados por centrifugação a 15 000 xg e os sobrenadantes foram fra£ cionados em gradiente de sacarose de 15-30%.

As análises tanto em gel corado como por imuno-mancha in. dicaram que os extractos de hsp60 desenvolvidos a 23⁹C migraram para a parte intermédia do gradiente. Este resultado corresponde ao que foi observado com os extractos da levedura do tipo sei vagem. Quando se examinou o extracto a 372C, na posição intermédia do gradiente, observou-se uma porção mais pequena da proteína hsp60 total. Em vez disso a maior parte do produto foi observado no sedimento obtido no passo da preclarificação a 15 OOOxg.

Uma análise idêntica foi também realizada 2 horas após a mudança de 25 para d7⁹0 da cultura do tsl43. Como se mostra na Figura 6 para esta mudança de temperatura após o período de tempo de 2 horas todo o produto da hsp60 da estirpe tsl43 foi detec. tado na fracção sedimentada (25 e 37). Num estudo de controlo da mudança com a levedura tipo selvagem não se observou este resultado. Toda a hsp60 migra para a posição intermédia do gradiente /Tkchullin et al., hol. Cell. Biol., 8:j71-j8O (1938)_/.

comportamento da hsp60 que conduz, a 37^SC, à sua sedimentação a 15 OOOxg não é compreendido. 0 comphxo contendo a pro. teína pode tornar-se insolúvel e por isso precipita. Alternati70 148 s/n 261,573

vamente o complexo pode de algum modo associar-se a membranas. Isto é notado quando se examinaram as subunidades OTC e beta-Fl nas células tsl43 a 37-C, estas sedimentam também a 15.000xg sugerindo que também elas se tornaram insolúveis,independentemente da alteração exacta,as propriedades físicas, do complexo proteico que contém a hspôO são afectadas pela mutação da hspóO presente na espécie tsl43.

3XEI.TL0 6:

Isolamento do Gene da hsp60

Usou-se o anti-soro policlonal criado contra a hsp60 purificada da Tetrahymena Thermophila //anti-HSPoO (T.t.) kckullin et al., kol. Ce 11. Biol., 7.:4414-4443 (1987)// P^ara isolar um segmento do gene HSP60 de levedura, analisando uma biblioteca dos fragmentos de ADN genomico ligados ao fago lambda, vector lambda-gtll (tal como 0 ATCC 37194) //Young et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:1194-1198 (1983)/7 para a expressão das sequências de proteína relacionadas com a hsp60. A análise da sequência de nucleótidos de um fragmento de ADN da levedura de 3,0 Kilobases (Kb) presente num clone reactivo anti-hsp60 (T.t.) revelou uma cadeia de leitura aberta codificando uma pro. teína homóloga para ambas as proteínas ligantes Rubisco (R3P) e groEL. Este fragmento/^DN foi usado como sonda de hibridação pa ra isolar um segmento sobreposto do genoma da levedura que continha toda a sequência de codificação do HSP60 (Figura 1).

A sequência de uma região de 1,3 Kb que contém 0 HSP60 é apresentada na Figura 1 conjuntamente com a sequência de aminoácidos derivada. A cadeia de leitura aberta codifica um polipáptido de 572 aminoácidos (kr 6O3oO daltons) com uma homologia forte em relação à família conservada das proteínas relacionadas com a groEL (Figura 9)· Esta cadeia de leitura aberta foi definida como o gene A5PÓ0 da levedura.

A análise de hibridação Northern mostou que o HSP60 foi trancrito para um ARNm com aproximadamente 1,9 Kb, um tamanho proporcional ao kr observado de 60 K da hsp60 (Figura 73). Este ARNm é induzido duas a três vezes acima dos níveis de base

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-51quando as células são submetidas a uma tensão térmica a 39²C por 2 horas, o que está de acordo com a indutibilidade por cho que térmico da hsp6O /~McMullin et al., Mol. Ce 11. Biol., 7.: :4414-4423 (1987) e McMullin et al., Mol. Cell. Biol·., £3:371-380 (1938)/7- In crementando o número de cópias do HSP60 por transformação com o plasmídeo de multicópia YEphs6O (Figura 83), resulta uma maior concentração de material reactivo anti-hsp60 (T.t.) na mitocôndria, o que constitui evidência adicional da identidade deste gene.

A comparação dos produtos do HSP60 e do groBL (Figura 9) revela 53$ de identidade dos resíduos aminoácidos no comprimento da proteína bacteriana, verificando-se cinco pequenas inserções/eliminações no alinhamento. A comparação da hsp60 com a R3P de cloroplasto do trigo revelou 42$ de igualdade no comprimento da proteína do trigo, incluindo quatro inserções/eliminações. Aproximadamente um terço dos resíduos são conservados em todas as proteínas e existem numerosas substituições conservativas. As regiões de homologia estão distribuidas equitativamen. te ao longo das cadeias das proteínas. Uma excepção ocorre no grupo carboxilo terminal, onde motivo repetido Gly-Gly-Met é conservado tanto na hsp6O como no groEL mas não no R3P. 0 produ. to do gene KSP60 contém uma extensão amino terminal de aproxima damente 22 aminoácidos que não está representada nos outros dois membros desta família de genes. Esta sequência é caracteristica da maior parte dos péptidos dirigidos às mitocôndrias /Hurt et al. Trends Biochem. Sei., 11.:204-207 (1986)/7 Ρθΐο facto de con.

ter cinco resíduos básicos e nenhum ácido, e por conter qm total sequencia de seis resíduos serina ou treonina. A presença desta/dirigida é consistente com a localização mitocondrial da hsp60 /~TlcMullin et al., Mol, Cell. Biol. , 7.:4^14-4423 (1987) e McMullin et al., Mol. Cell. Biol., 8:371-330 (1933)/7Usou-se a quebra do gene a um passo //Rothstein, R. J. Meth. Enzym., 101:202-210 (I98o)~7 para construir um alelo do

HSP60 que é inactivo devido à inserção do gene HIS3 (Figura 80). A estirpe diplóide a/alfa-W3Oo-Vhsp6O foi construída com um ale. lo HSP60 tipo selvagem e com um alelo nulo designado HSP6O::HIS3

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Esta estirpe é his3^_ homozigótica, e deste modo os alelos do tipo selvagem e os alelos nulos do HSP6Q podem ser contados por auxotrofia e prototrofia de histidina, respectivamente.

A a/alfa-V3O3-V-Hsp6O foi induzida a esporular. Os produtos em número de quatro foram separados por micromanipulação. Nestes casos, apenas dois dos quatro produtos meióticos da tetrada sim pies formaram colónias em meio não selectivo. A cultura em placa das réplicas mostrou que todos os descendentes sobreviventes requereram histidina e tendo deste modo recebido o alelo HSP60. Uma vez que nenhumas células haplóides contendo o HSP60::HIS3 formaram colónias, o HSP60 é essencial para a viabilidade celular na levedura. Uma vez que as células foram cultivadas a 302 C os requesitos para o HSP6Q não estão limitadas às condições de tensão por calor.

fenótipo do tsl43 que impede a reunião na mitocôndria sem afectar nem o transporte para dentro do organito nem a clivagem dos péptidos dirigidos pode ser previsto para uma mutação no HSP60. Estudou-se pois se o tsl43 e o HSP60::HIS3 eram ou não alélicos. A evidência preliminar de que as duas mutações eram alélicas, reside no facto de a transformação de uma estir pe tsl43 com YEpHsp60 restaurar a capacidade de crescimento a uma temperatura não permitida. Para excluir a supressão do tsl43 pelo incremento do número de cópias do HSP6Q, a complementação das duas mutações foi testada directamente nos diplóides. 0 diplóide ura3 /ura3 a/alfa-W3O3-VHSP6O foi transformado com YEpHSPôO. Sm subsequentes manipulações a presença extracromossomal do HSP60 é marcado pelo gene ura3 do plasmídeo. A dissecação da tetrada resultou em haplóides contendo quer ο ΗΞΡ60 funcional quer o alelo nulo HSP60::HIS conjuntamente com YEpHspóO extracromossómico. Cada haplóide foi cruzada com uma estirpe con tendo tsl43 e os diplóides foram seleccionados por complementação de auxotrofias. Tal como era esperado, o diplóide HSP60/ /tsl4i perdeu frequentemente a YEpHspoO durante o crescimento, mitótico e estes segregantes requerendo uracilo foram viáveis a uma temperatura não permitida.

Em contraste, 100$ dos segregantes mitóticos de um diplói

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-53de HSP60::HIS3/tsl43 cultivados a uma temperatura não permitida eram uracil-prototro'f icos e por isso continham cópias extra cromossómicas de HSP60. Assim, o HSP6O::HISj e tsl43 não se com plementam um ao outro. Consequentemente, estas duas mutações es tão localizadas no mesmo elemento genético. Tal como foi descri to em exemplos anteriores, uma diferente aproximação genética mostrou também que o tsl43 é um alelo do HSP6O.

EXEMPLO 7:

Reunião da Ornitina Transcarbamilase Desnaturada, não funcional

A ornitinatranscarbamilase (OTC) desnaturada com ureia que era não funcional como enzima foi transformada em OTC funcional tal como a seguir se descreve.

A OTC foi purificada por passagem através duma coluna de afinidade preparada a partir da Sepharose epóxida, reagida com delta-N-fosfonoacetil-l-ornitina (PALO) tal como foi discutido no Exemplo 1. A OTC purificada (25jsg) foi desnaturada por dispersão em tampão aquoso contendo 0,5 ml de Ureia SM, Hepes 20 mM e ditiotreitol 10 mM (DTT); a mistura resultante foi colocada em gelo por um período de tempo de 30 minutos.

A preparação da matriz de mitocôndria utilizada foi pre_ parada como se segue. As células de levedura do tipo selvagem foram cultivadas em J litros de meio YPEG até à fase semilogarítmica, ϋ.Ο.^θθ cerca de 1,0. As células são então colhidas usando uma centrífuga G-53, lavadas uma vez com água e então tratadas por 10 minutos com uma solução tampão aquosa, contendo Tris-SO^ 0,1 M a pH 8,9, e DTT 10 mM para produzir uma concentração de cerca 0,5 gramas de células por mililitro de tampão (g/células/ml). As células foram então lavadas com uma solu_ ção tampão contendo sorbitol 1,2 M e Xpi 20 mM a pH 7,4, realizou-se a formação de esferoplastos com 0,15 g de células/ml em solução de zimoliase (Sorbitol 1,2 M, Kpi 20 mM a pH 7,4, e 1 mg zimoliase/g de células) a 30^0 durante 45 minutos. Os esferoplastos foram então retirados por centrifugação com uma centrífuga SS-34 a 3000 r.p.m. durante 5 minutos a 4⁹C. As células

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centrifugadas foram lavadas uma vez com um tampão contendo sor bitol 1,2 l.i e Kpi 20 mlví, pH 7,4, ressuspendidas num tampão con tendo sorbitol 0,6 rã Hepes 20 mil, pH 7,4, e P1ISF 1 mil com 0,15 g de células/ml, e depois disto submetidas a homogeneização de

Dounce durante 30 ciclos.

-540 homogeneizado celular resultante foi centrifugado con uma centrífuga SS-34 a 3.000 rpm durante 5 minutos para remover os restos celulares e nucleicos. 0 sobrenadante turvo foi então sedimentado numa centrífuga SS-34 a 9-000 rpm durante 10 minutos. 0 sedimento resultante que era uma fracção mitocôndrial das células originais, foi ressuspendido numa quantidade mínima de tampão contendo hepes 20 mil pH 7,4, PtISF 1 mil e DTT 1 ml.I e homogeneizado adicionalmente com pérolas de vidro. 0 homogeneizado resultante foi transferido para tubos Eppindorf e centrifugado a baixa rotação durante 10 minutos. 0 sobrenadante re_ sultante constituiu a preparação de matriz mitocondrial usada posteriormente.

A OTC desnaturada (5 g) em 200 1 de solução de ureia il foi diluída cerca de cem vezes usando um tampão aquoso contendo Hepes 20 mil pH 7,4, DTT 1 mil e PI.ÍSF 1 mil e que também con. tinha quer a) cerca de 400^g de albumina de soro bovino (BSA, controlo) ou b) cerca de 400 yjg de proteína total da preparação de matriz de mitocôndria, da preparação anterior. Qualquer das soluções anteriores (a) e (b) foram concentradas separadamente num concentrador centrífugo Centricon 30, até um volume de cerca de 100 JFL e após isto retornam ao seu volume original. Este procedimento através do ensaio que a seguir se descreve que foi realizado imediatamente após a solução voltar ao seu volume original demorou cerca de 3-4 horas.

Num outro estudo, a solução de OTC-ureia, anteriormente descrita foi diluída em cerca de 4 volumes com o tampão anterior contendo cerca de 400 yUg de (C) BSA ou (d) preparação da matriz mitocondrica. Cada uma dessas soluções foi dialisada contra um litro de solução tampão por um período de tempo de cerca de 18 horas com uma troca do tampão de diálise. A diálise e os pro. cedimentos/cENTRICON 30 removem a ureia.

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-55- ’

Cada una das soluções resultantes (a), (b), (c) e (d) foram, separadamente analisadas para determinar a actividade da OTC funcional usando o método de ensaio de Kalousek et al.,

J. Biol. Chem., 259:8392-5395 (1984). As soluções (b) e (d) que continham a preparação da matriz mitocondricã exibiram actividade de OTC, enquanto que as soluções (a) e (b) que continham BSA não exibiram actividade. A actividade exibida pelas soluções (b) e (d) era relativamente mínima, o método da diálise promovendo maior actividade funcional .

A descrição anterior, incluindo as concretizações específicas e os exemplos, pretende ilustrar a presente invenção e não é para ser considerada como limitativa. Numerosas outras variações e modificações podem ser efectuadas sem sair do verda deiro espírito e campo da presente invenção.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1&. - Processo de preparação de uma proteína purificada, biologicamente activa possuindo um l·’ de cerca de 55 000 a cer ca de 65 000 dalton em electroforese de dodecilsulfato de sódio - gel de poliacrilamida, e exibindo, pelo menos, uma identidade de 60 por cento dos resíduos aminoácidos com a proteína de choque térmico mitocóndrica de levedura cuja sequência de resíduos aminoácidos é a seguinte

   Bell

   -410 5' - TGATCAAGTA

   -400 GAACGCCAAGACTAGTTGTGCAAAGAAGTACAGTTGAAATTCCAGCCAGTTATGTCTCATCCCTATTCCAC TGTTTTTGTAGGTATACAATGGTGTTACG

   -300 AGCATTGAAGCTGTTTATTGCCTGGTATTACCTCTGGAAACTTACTTTATAGCCGCCCATCTGTATATGTC ATCATATACGGACCTTGTGGAATTTTCCA

   -200 GAAAACCAAATGGGGAGGGTGACTTTAATTTTGCTTCGTTTTGTCCGGAGCAGAATCCAGACGGACATTCA TGTATATATATTGAAGGAGACTAAGTTTT

   -10 0 ACATTCATTATGTAAGGTCGTGGTTGCGTCTTCATGCACTTCCTTGAATAATATAAGAAAATTCCCACGAG AAAACATCATAAGCAAAAAAGTTTTCAAA

   + 1 ATG Met CGT Arg TTG Leu GCT Ala AGA TCA TCC GTT Vai CAT His GTT Vai AAA Lys CGT Arg AGT CGC GCT ACT TTA AGG CCT Pro TTA Leu TTG Leu CGT Arg Arg Ser Ser TCT Ser Ser Arg Ala Thr Leu Arg TAC Tyr TCC Ser + 76 GAA TTG AAA TTC GGT GTA GAA GGA AGA GCC TCC CTT CTT AAG GGT GTC GAA ACT Glu Leu Lys Phe Gly Vai Glu Gly Arg Ala Ser Leu Leu Lys Gly Vai Glu Thr TTA GCT GAA GCG GTT GCT GCT Leu Ala Glu Ala Vai Ala Ala + 151 ACT TTG GGT CCA AAG GGT AGA AAC GTT TTA ATC GAA CAG CCT TTC GGT CCT CCA Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Vai Leu Ile Glu Gin Pro Phe Gly Pro Pro AAG ATT ACT AAG GAT GGT GTT Lys Ile Thr Lys Asp Gly Vai +226 ACA GTT GCC AAA TCT ATT GTG TTG AAG GAC AAG TTT GAA AAT ATG GGT GCC AAG Thr Vai Ala Lys Ser Ile Vai Leu Lys Asp Lys Phe Glu Asn Met Gly Ala Lys TTA CTA CAA GAA GTT GCC TCC Leu Leu Gin Glu Vai Ala Ser + 301 AAA ACC AAT GAG GCT GCT GGT GAC GGT ACT ACT TCT GCT ACT GTT TTA GGT AGA Lys Thr Asn Glu Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Ser Ala Thr Vai Leu Gly Arg GCC ATC TTC ACA GAA TCC GTC Ala Ile Phe Thr Glu Ser Vai + 376 AAA AAT GTC GCC GCT GGT TGT AAC CCT ATG GAT TTG AGA AGG GGT TCT CAA GTT Lys Asn Vai Ala Ala Gly Cys Asn Pro Met Asp Leu Arg Arg Gly Ser Gin Vai GCA GTT GAA AAA GTG ATT GAA Ala Vai Glu Lys Vai Ile Glu + 451 TTT TTG AGC GCC AAC AAG AAA GAA ATT ACC ACA TCT GAG GAA ATT GCT CAA GTA Phe Leu Ser Ala Asn Lys Lys Glu Ile Thr Thr Ser Glu Glu Ile Ala Gin Vai

   GCA ACC ATT TCT GCC AAT GGG Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly

   70 148 s/n 261,573

   + 526 GAC Asp GGT Gly TCT Ser GTC Vai CAT GTT GGT AAG Lys AGA Arg TTA CTA GCT TCA GCT Ser Ala ATG GAA Met Glu AAG Lys GTT Vai GGA Gly AAA Lys GAA Glu His ATC Ile Vai ACT Thr Gly ATC Ile Leu GAA Glu Leu Ala + 601 GGT AGA ACA TTG GAA GAT GAA CTT GAG GTT ACT GAA GGT ATG AGG TTT GAT CGT Gly Arg Thr Leu Glu Asp Glu Leu Glu Vai Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Arg GGT TTT ATT TCT CCA TAC TTC Gly Phe Ile Ser Pro Tyr Phe + 676 ATC ACT GAT CCA AAG TCG AGC AAG GTG GAA TTT GAA AAG CCA TTG CTA TTG TTG Ile Thr Asp Pro Lys Ser Ser Lys Vai Glu Phe Glu Lys Pro Leu Leu Leu Leu AGT GAA AAG AAA ATT TCT TCC Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser

   BcII

   + 751 ATT Ile TTG Leu CAA Gin ATC Ile GAT ATC TTG CCA GCT TTG GAA Glu ATT Ile TCC Ser AAT Asn CAA Gin AGC Ser AGA Arg AGA Arg CCT Pro TTG Leu Asp ATT Ile Ile GCT Ala Leu GAA Glu Pro GAT Asp Ala GTT Vai Leu + 826 GAC GGT GAA GCT CTT GCG GCC TGT ATT TTG AAC AAG TTA AGG GGT CAA GTT AAG Asp Gly Glu Ala Leu Ala Ala Cys Ile Leu Asn Lys Leu Arg Gly Gin Vai Lys GTT TGT GCT GTG AAG GCG CCT Vai Cys Ala Vai Lys Ala Pro + 901 GGT TTC GGT GAT AAT AGA AAG AAT ACA ATT GGT GAT ATT GCA GTC TTG ACG GGC Gly Phe Gly Asp Asn Arg Lys Asn Thr Ile Gly Asp Ile Ala Vai Leu Thr Gly GGT ACT GTT TTT ACT GAG GAG Gly Thr Vai Phe Thr Glu Glu + 976 TTG GAT TTG AAA CCA GAA CAA TGT ACC ATA GAA AAC TTG GGT TCT TGT GAC TCT Leu Asp Leu Lys Pro GlU Gin Cys Thr Ile Glu Asn Leu Gly Ser Cys Asp Ser ATT ACC GTT ACT AAG GAA GAC Ile Thr Vai Thr Lys GlU Asp + 1051 ACC GTT ATC CTG AAC GGT AGT GGT CCA AAG GAA GCT ATT CAA GAG AGA ATT GAA Thr Vai Ile Leu Asn Gly Ser Gly Pro Lys Glu Ala Ile Gin Glu Arg Ile Glu CAA ATC AAG GGC TCC ATC GAC Gin Ile Lys Gly Ser Ile Asp + 1126 ATT ACC ACC ACA AAT TCA TAT GAG AAG GAG AAA CTG CAA GAG CGT TTG GCC AAA Ile Thr Thr Thr Asn Ser Tyr Glu Lys Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala Lys TTG TCC GGG GGT GTT GCT FTC Leu Ser Gly Gly Vai Ala Vai + 1201 ATC AGG GTC GGT GGT GCA TCT GAA GTT GAA GTT GGT GAA AAG AAG GAC CGT TAC Ile Arg Vai Gly Gly Ala Ser Glu Vai Glu Vai Gly Glu Lys Lys Asp Arg Tyr GAT GAT GCT TTG AAC GCT ACC Asp Asp Ala Leu Asn Ala Thr

   PstI

   +1276 AGA GCT GCA GTT GAG GAA GGT ATC TTG CCA GGT GGT GGT ACT GCC TTA GTG AAG Arg Ala Ala Vai Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Vai Lys

   GCA TCT AGA GTT TTG GAT GAA Ala Ser Arg Vai Leu Asp Glu

   70 143 s/n 261,573

   -58Sall

   + 1351 GTT Vai ATT Ile GTT GTC GAC AAT TTC GAT CAA AAA TTG GGT Gly GTC GAT ATC ATA AGA AAG Lys GCC Ala Vai ACA Thr Vai AGA Arg Asp CCA Pro Asn GCC Ala Phe AAG Lys Asp CAG Gin Gin Lys Leu Vai Asp Ile Ile Arg + 1426 ATC ATT GAA AAC GCT GGT GAA GAA GGT TCA GTT ATC ATC GGC AAA TTG ATT GAT Ile Ile Glu Asn Ala Gly Glu Glu Gly Ser Vai Ile Ile Gly Lys Leu Ile Asp GAA TAT GGT GAT GAT TTT GCC Glu Tyr Gly Asp Asp Phe Ala + 1501 AAG GGT TAC GAT GCC TCT AAG TCA GAA TAC ACC GAC ATG TTA GCC ACT GGT ATC Lys Gly Tyr Asp Ala Ser Lys Ser Glu Tyr Thr Asp Met Leu Ala Thr Gly Ile ATC GAT CCA TTT AAA GTG GTT Ile Asp Pro Phe Lys Vai Vai + 157o AGA TCC GGT TTA GTT GAT GCT TCT GGT GTT GCC TCA CTA TTA GCT ACT ACC GAA Arg Ser Gly Leu Vai Asp Ala Ser Gly Vai Ala Ser Leu Leu Ala Thr Thr Glu GTT GCT ATT GTT GAT GCC CCA Vai Ala Ile Vai Asp Ala Pro + 1651 GAA CCA CCA GCA GCT GCT GGC GCT GGT GGT ATG CCA GGT GGT ATG CCA GGA ATG Glu Pro Pro Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Gly Met

   CCA GGT ATG ATG TAA CGACCGC Pro Gly Met Met >» + 17 2 7 CTTAATTCAAAATTTATCTTTCTTTAAATATGGTAATAATTTTATTATCTTGTAAAT - 3' desde o resíduo aminoácido na posição 23 até ao resíduo aminoácido na posição 572, caracterizado por compreender:

   (a) a cultura de células hospedeiras transformadas que contêm um vector com um segmento de ADN que codifica a referida proteína de choque térmico, e na qual o vector é capaz de exprimir a referida proteína nas referidas células hospedeiras;

   (b) o isolamento e a recuperação da referida proteína das referidas células hospedeiras cultivadas.

   25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterí. zado por a referida proteína incluir adicionalmente a sequência de resíduos aminoácidos desde o resíduo aminoácido na posição 1 até ao resíduo aminoácido na posição 22, e na qual o resíduo aminoácido na posição 22 está ligado por uma ligação peptídica ao resíduo aminoácido na posição 23.

   35. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterí. zado por a sequência de resíduos aminoácidos da referida proteí. na ser idêntica à que se mostra na reivindicação 1, desde o re70 148 s/n 261,573

   -59síduo aminoácido na posição 23 até ao resíduo aminoácido na posição 572.

   42. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida proteína incluir adicionalmente a sequência de resíduos aminoácidos de acordo com a da reivindicação 1, desde o resíduo aminoácido na posição 1 até ao resíduo aminoácido na posição 22, e na qual o resíduo aminoácido na posição 22 está ligado por uma ligação peptídica ao resíduo aminoácido na posição 23.

   5?. - Processo de isolamento de um segmento de ADN consistindo essencialmente de um segmento de ADN não cronossómico con tendo ADN suficiente para codificar a Hsp60 ou um seu análogo, caracterizado por compreender:

   (a) o contacto de ADN de levedura com uma sonda de hibridação compreendendo um fragmento de ADN capaz de exprimir uma sequência de proteína relacionada com a Hsp60; e (b) o isolamento de um fragmento sobreposto do referido ADN de levedura que se híbrida com a referida sonda.

   62. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido segmento de ADN conter de cerca de 1600 a cerca de 2300 pares de bases.

   72. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido segmento de ADN conter de cerca de 1650 a cerca de 2200 pares de bases.

   8^. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido segmento de ADN incluir adicionalmente a sequência de ADN promotora de choque térmico de um fragmento EcoRI-ScoRI de ADN cromossómico de levedura com aproximadamente 5 kb cujo mapa de restrição ScoRl e PstI é o seguinte

   ATG

   TGA ^P 4 ^p,

   P Rl
2. 2.5

   ΡΘ

   70 148 s/n 261,573

   -60a referida sequência promotora extendendo-se desde o sítio EcoRI -5' até ao codão de início do referido segmento da sequência de ADN da Hsp60 ou do seu análogo, e estando ligada operativamente ao referido segmento.

   9?. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido segmento de ADN conter cerca de 2200 pares de bases e por codificar a sequência de resíduos aminoácidos de acordo com a da reivindicação 1, desde o nucleótido na posição 67 até ao nucleótido na posição 1716.

   10?. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido segmento de ADN codificar a sequência de resíduos aminoácidos de acordo com a da reivindicação 1, desde o nucleótido na posição 1 até ao nucleótido na posição 1716.

   ll². - Processo de preparação de um vector capaz de replicaçâo autónoma numa célula, o referido vector contendo um segmento da sequência de polinucleótido operativamente ligado, que codifica a Hsp60 ou um seu análogo, caracterizado por compreender ligação operativa do referido segmento de sequência de poli nucleótidos a terminais coesivos no ADN de um vector de expressão , , necomblnante em células, formando-se uma molécula de ADN/que e capaz de replicar o referido segmento da sequência de polinucleótidos.

   12?. - Processo de acordo' com a reivindicação 11, caracterizado por o referido vector ser um vector de ADN que dirige a expressão da referida Hsp60 ou de um seu análogo.

   13?. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido vector conter cerca de 1600 a cerca de 2300 pares de bases de ADN que codificam a Hsp60 ou um seu análogo .

   14?. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido vector ser um vector de vaivém e por se poder replicar em células eucarióticas e procarióticas.

   15?. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido segmento de ADN codificar a sequência de resíduos aminoácidos de acordo com a da reivindicação 1, desde o nucleótido na posição 67 até ao nucleótido na posição 1716.

   70 148 s/n 261,573

   -6116^. - Processo de preparação de uma célula hospedeira transformada, contendo um vector que se replica autonomamente na referida célula hospedeira, o referido vector contendo um segmento da sequência de polinucleotidos ligado operativamente, que codifica a Hsp60 ou um seu análogo, caracterizado por compreender a cultura de células hospedeiras com o referido vector por um período de tempo suficiente para se produzir a transformação de uma célula hospedeira apropriada, o isolamento e a cul tura da referida célula hospedeira.

   17^. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caractede ADN rizado por o referido vector ser um vector/que dirige a expressão da referida Hsp60 ou de um seu análogo na referida célula hospedeira .

   18^. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido vector codificar a sequência de resíduos aminoácidos, de acordo com a da reivindicação 1, desde o nucleótido na posição 67 até ao nucleótido na posição 1716.

   19^?. - Processo de reunião de sub-unidades de proteína não funcional num complexo de proteína oligomérica funcional, carac terizado por compreender os passos de:

   a) misturar sub-unidades de proteína não funcional, in vitro , com uma quantidade eficaz, funcionalizante, de uma preparação aquosa de matriz mitocôndrica de levedura, que contêm de, pelo menos, cerca de duas vezes a quantidade de Hsp60 ou de um seu análogo, relativamente à quantidade de Hsp60 presente nessa preparação após o choque térmico, até uma quantidade de Hsp60 ou de um seu análogo que é 10 por cento do peso da proteína total na referida preparação de matriz, para formar uma mistura aquosa; e

   b) manter a referida mistura sob condições de cultura bio lógica durante um período de tempo suficierte para que as referidas sub-unidades de proteína não funcional se liguem à referida Hsp60 ou análogo, sejam processadas e dobradas e para se dissociarem daí e formarem um complexo de proteína oligomérica funcional.

   70 148 s/n 261,573

   -6220^. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender o passo adicional de recuperação do referido complexo de proteína oligomérica funcional.

   21^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a referida Hsp60 ou análogo estar presente numa quan tidade de pelo menos cerca de 50 micrograma por miligrama de proteína de matriz mitocondricã.

   22^?. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por as referidas sub-unidades de proteína não funcionais estarem presentes, numa proporção em peso em relação à proteína total da referida preparação de matriz, de cerca de 1 a cerca de 20 partes para cerca de 200 a cerca de 2000 partes, respectivamente, e por a concentração de proteína total na referida mistura aquosa ser de cerca de 10 a cerca de 70 mg/ml.

   23?. - Processo para conversão de uma forma inactiva de uma molécula de proteína monomérica ou de moléculas de sub-unidades de proteína numa forma activa dessa molécula caracterizado por compreender os passos de :

   a) misturar as moléculas de proteína monomérica ou as moléculas de sub-unidades de proteína inactivas in vitro com uma quantidade eficaz, activante, de uma preparação aquosa de matriz mitocondricã de levedura, biologicamente operativa, que contém de, pelo menos cerca de duas vezes a quantidade de Hsp60 ou de um seu análogo, relativamente a quantidade de Hsp60 presente nessa preparação após choque térmico, até uma quantidade de Hsp6C ou de um seu análogo que é 10 por cento do peso de proteí na total na referida preparação de matriz, para formar uma mistura aquosa; e

   b) manter a referida mistura sob condições de cultura bio lógica durante um período de tempo suficiente para/as referidas moléculas de proteína monomérica inactiva ou moléculas de sub-unidades de proteína inactiva se liguem à referida Hsp60 ou análogo, sejam processadas e dobradas e para se dissociarem daí e formarem uma forma activa das referidas moléculas de proteína monomérica ou moléculas de sub-unidades de proteína.

   70 148 s/n 261,573

   -63242. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender o passo adicional de recuperação da referida forma activa das referidas moléculas de proteína monomérica ou moléculas de sub-unidades de proteína.

   25&. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida Hsp60 ou análogo estar presente numa quan tidade de pelo menos cerca de 50 microgramas por miligrama de proteína de matriz mitocôndrica total.

   269. _ Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as referidas moléculas de proteína monomérica inacti. vas ou as moléculas de sub-unidades de proteína inactiva estarem presentes, numa proporção em peso, em relação a referida preparação de matriz, de cerca de 1 a cerca de 20 partes para cerca de 200 a cerca de 2000 partes, respectivamente, e por a concentração de proteína total na referida mistura aquo sa ser de cerca de 10 a cerca de 70 mg/ml.

   279 . - Processo de reunião de sub-unidades de proteína não funcional num complexo de proteína oligomérica funcional, carac terizado por compreender os passos de:

   a) misturar sub-unidades de proteína não funcional in vitro com uma quantidade eficaz funcionalizante de uma preparação aquosa de matriz mitocôndrica de levedura, biologicamente operativa, a referida preparação contendo Hsp60, para formar uma mistura aquosa; e

   b) manter a referida mistura sob condições de cultura bi£ lógica, por um período de tempo suficiente para que as referidas sub-unidades de proteína não funcional se liguem à referida Hsp60, sejam processadas e dobradas, e para se dissociarem daí e formarem um complexo de proteína oligomérica funcional.

   289. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender o passo adicional de recuperação do referido complexo de proteína oligomérica funcional.

   299. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por as referidas sub-unidades de proteína não funcional serem sub-unidades da ornitinatranscarbamilase.

   70 148 s/n 261,573

   -64305. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por as referidas sub-unidades de proteína não funcional estarem presentes, numa proporção em peso, em relação à referida preparação de matriz, de cerca de 1 a cerca de 20 partes para cerca de 200 a cerca de 2000 partes, respectivamente, e por a concentração de proteína total na referida mistura aquo sa ser de cerca de 10 a cerca de 70 mg/ml.