NO165644B - Fremgangsmaate for dannelse av et ekspresjonsplasmid for ekspresjon av et heterologt gen. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for dannelse av et ekspresjonsplasmid for ekspresjon av et heterologt gen.

Ved innføringen av rekombinant DNA-teknologi har den regulerte bakterielle produksjon av en enorm variasjon av nyttige polypeptider blitt mulig. Det finnes allerede bakterier som er modifisert ved denne teknologi som tillater produksjon av slike polypeptidprodukter somatostatin (K. Itakura et al., Science 198. 1056 [1977]), (komponent) A- og B-kjedene i human insulin (D.V. Goeddel et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA, 76, 106 [1979]), og human veksthormon (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544 [1979]). I den senere tid har rekombinante DNA-teknikker blitt benyttet for å bevirke bakteriell produksjon av thymosin-a-1, en immunfrembringende substans produsert av thymus (kfr. Wetzel et al., "Biochemistry" 19: 6097 [1980]). Denne teknologi er nå så godt utviklet at praktisk talt et hvilket som helst nyttig polypeptid kan produseres bakterielt, og man settes i stand til å oppnå kontrollert fremstilling av hormoner, enzymer, antistoffer og vaksiner mot en rekke forskjellige sykdommer.

Arbeidsinstrumentet ved rekombinant DNA-teknologi er plasmidet, en ekstra-kromosomal sløyfe av dobbeltkjedet DNA som finnes i bakterier, ofte i flere kopier pr. bakterie-celle. I den informasjon som er innkodet i nevnte plasmid-DNA er innbefattet den som skal til for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replikon") og vanligvis en eller flere seleksjonsmarkører slik som resistens overfor antibiotika, hvilket muliggjør at kloner av vertscellen inneholdende det plasmid som er av interesse kan gjenkjennes og dyrkes selektivt i selektive media. Nyttevirkningen av bakterie-plasmider ligger i det faktum at de kan spaltes spesifikt av en eller annen restriksjonsendonuklease eller "restrik-sjon s enzym " , som hver gjenkjenner et forskjellig sete på nevnte plasmid-DNA. Deretter kan heterologe gener eller genfragmenter innsettes i plasmidet ved endesammenføyning ved spaltningssetet eller ved rekonstruerte ender tilstøtende spaltnlngssetet. Som benyttet heri refererer betegnelsen "heterolog" til et gen som ikke vanligvis finnes i, eller en polypeptidsekvens som vanligvis ikke produseres av, E. coli, mens betegnelsen "homolog" refererer til et gen eller polypeptid som produseres i E. coli av villtypen. DNA-rekombinasjon foregår utenfor bakterien, men det resulterende "rekombinante" plasmid kan innføres i bakterier ved en prosess som er kjent som transformasjon og store mengder av det rekombinante plasmid inneholdende heterogent gen kan oppnås ved dyrking av transformanten. Når genet er riktig innsatt med hensyn til deler av plasmidet som styrer transkripsjonen og translasjonen av det kodede DNA-budskapet, så kan dessuten den resulterende ekspresjonsvektoren anvendes for faktisk å fremstille polypeptidsekvensen for hvilken det innsatte gen koder, en prosess som er betegnet ekspresjon.

Ekspresjon initieres i et område kjent som promoteren som gjenkjennes av og bindes av RNA-polymerase. I noen tilfeller som i trp-operonet omtalt nedenfor, overlappes promoter-områder av "operator"-områder til dannelse av en kombinert promoter-operator. Operatorer er DNA-sekvenser som gjenkjennes av såkalte repressorproteiner som tjener til å regulere frekvensen av transkripsjonsinitiering ved en spesiell promoter. Polymerasen vandrer langs DNA'et og transkriberer dermed informasjonen som inneholdes i den kodende kjeden fra dens 5'- til 3'-ende til mRNA som igjen translateres til et polypeptid som har aminosyresekvensen for hvilken nevnte DNA koder. Hver aminosyre kodes av en unik nukleotidtriplett eller "kodon" innen det som for foreliggende formål kan betegnes det "strukturelle genet", dvs. den del som koder aminosyresekvensen i det uttrykte produktet. Etter binding til promoteren så transkriberer RNA-polymerasen først nukleotider som koder et ribosom-bindings-sete, deretter et translasjonsinitierings- eller "start"-signal (vanligvis ATG, som i den resulterende mRNA glir AUG), deretter nukleotidkodonene innen selve det strukturelle genet. Såkalte stopp-kodoner transkriberes ved enden av det strukturelle genet hvoretter polymerasen kan danne en ytterligere sekvens av mRNA som, på grunn av tilstedeværelsen av stoppsignalet, vil forbli utranslatert av ribosomene. Ribosomer bindes til bindingssetet som er tilveiebragt på nevnte mRNA, i bakterier vanligvis samtidig som nevnte mRNA dannes, og produserer selv det kodede polypeptidet, ved å begynne ved translasjonsstartsignalet og slutte ved det tidligere nevnte stoppsignalet. Det ønskede produktet produseres dersom sekvensene som koder ribosombindingssetet er posisjonert på riktig måte i forhold til AUG-initiator-kodonet og dersom alle gjenværende kodoner følger initiator-kodonet i fase. Det resulterende produktet kan oppnås ved lysering av vertscellen og utvinne produktet ved hensikts-messig rensing fra annet bakterieprotein.

Polypeptider som er uttrykt ved bruk av rekombinant DNA-teknologi kan være fullstendig heterologe, slik tilfellet er for den direkte ekspresjon av human veksthormon, eller kan alternativt omfatte et heterologt polypeptid og, sammensmeltet dermed, i det minste en del av aminosyresekvensen i et homologt polypeptid slik tilfellet er for produksjonen av mellomprodukter for somatostatin og komponentene i human insulin. I de sistnevnte tilfellene omfattet f.eks. det sammensmeltede homologe polypeptidet en del av aminosyresekvensen for e-galaktosidase. I de andre tilfellene blir det tilsiktede bioaktive produkt bioinaktivert av det sammensmeltede, homologe polypeptidet inntil sistnevnte er avspaltet i et ekstracellulært miljø. Fusjonsproteiner lik de som nettopp er nevnt kan konstrueres slik at det oppnås meget spesifikk spaltning av forløperproteiner fra det tilsiktede produkt, som ved innvirkningen av cyanogenbromid på metionin, eller alternativt ved enzymatisk spaltning, kfr. f.eks. GB-patent 2 007 676 A.

Dersom rekombinant DNA-teknologi fullt ut skal holde det den lover så må det tilveiebringes systemer som optimaliserer ekspresjon av geninnskudd slik de tilsiktede polypeptid-produktene kan gjøres tilgjengelige i høyt utbytte. De p—laktamase- og laktose-promoter-operatorsystemene som tidligere har vært mest benyttet, har, selv om de har vært nyttige, ikke fullt ut utnyttet kapasiteten ved teknologien sett fra et utbyttesynspunkt. Det har vært et behov for en bakterieekspresjonsvektor som kan gi regulert ekspresjon av ønskede polypeptidprodukter i høyere utbytte.

Tryptofan er en aminosyre som produseres av bakterier for bruk som en komponentdel i homologe polypeptider i en biosyntesevei som forløper på følgende måte: chorisminsyre -+ antranitril -» f osforibosylantranilsyre -+ CDRP [endol-l-(o-karboksyfenylamino)-l-desoksy-D-ribulose-5-fosfat] -» indol-3-glyserol-fosfat, og til slutt til selve tryptofan. De enzymatiske reaksjonene i denne synteseveien katalyseres av produktene av tryptofan- eller "trp"-operonet, et polycistro-nisk DNA-segment som transkriberes under styring av trp-promoter-operatorsystemet. Den resulterende polycistroniske mRNA koder den såkalte trp-ledersekvensen og deretter i rekkefølge polypeptidene som betegnes trp E, trp D, trp C, trp B og trp A. Disse polypeptidene katalyserer på forskjellig måte og regulerer individuelle trinn i synteseveien fra chorisminsyre til tryptofan.

I villtypen av E. coli er tryptofan-operonet under minst tre forskjellige former for kontroll. I tilfellet for promoter-operator-represjon virker tryptofan som en korepressor og bindes til dets aporepressor til dannelse av et aktivt repressorkompleks som igjen bindes til operatoren, og lukker dermed hele synteseveien. Ved den andre formen som er en prosess med tilbakeføringsinhibering, så bindes tryptofan til et kompleks av trp E- og trp D-polypeptidene og hindrer dermed deres medvirkning i synteseveien. Ved den tredje formen så bevirkes kontroll ved en prosess som er kjent som attenuering under kontroll av "attenuatorområdet" i genet, et område som befinner seg i trp-ledersekvensen; se generelt G.F. Miozzari et al, J. Bacteriology, 133. 1457 (1978); The Operon, 263-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller og Reznikoff, utgivere; F. Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 4365 (1977) og K. Bertrand et al., J. Mol. Biol., 103. 319 (1976). Graden av attenuering synes å styres av den intracellulære konsentrasjon av tryptofan og i villtypen av E. coli terminerer attenuatoren ekspresjon i omkring 9 av 10 tilfeller, muligens gjennom dannelsen av en sekundær struktur eller "termineringssløyfe", i mRNA hvilket bevirker at RNA-polymerasen frigjøres for tidlig fra den tilknyttede DNA.

Andre forskere har benyttet trp-operonet for oppnåelse av en viss grad av heterolog polypeptidekspresjon. Det antas at dette arbeidet forsøkte å takle problemer med represjon og attenuering ved tilsetning av indolakrylsyre, et induk-sjonsmlddel og analog som konkurrerer med tryptofan for trp-represssormolekyler, som tenderer mot derepresjon ved konkurrerende inhibering. Samtidig så minsker induksjons-midlet attenuering ved inhibering av den enzymatiske omdannelse av indol til tryptofan og berøver cellen for tryptofan. Som et resultat av dette leser flere polymeraser på vellykket måte gjennom attenuatoren. Denne metoden synes imidlertid å være problematisk når det gjelder å fullføre translasjon på konsekvent måte og i høyt utbytte fordi de tryptofannoIdige proteinsekvensene blir for tidlig terminert i syntesen på grunn av mangel på utnyttbar tryptofan. Således er en effektiv opphevning av attenuering ved denne metode helt avhengig av sterk tryptofanutarming.

Foreliggende oppfinnelse berører problemer som er forbundet med tryptofan-represjon og ^attenuering på en forskjellig måte og tilveiebringer en fremgangsmåte for oppnåelse av en ekspresjonsvektor som er konstruert for direkte ekspresjon av heteorologe gener fra trp promoter-operatoren.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for dannelse av et ekspresjonsplasmid for ekspresjon av et heterologt gen, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man i fase frembringer en samtidig ligering av: (a) et første lineært, dobbeltkjedet DNA-fragment inneholdende et replikon og et gen som uttrykker en selek-sjonsmarkør når det plasseres under styring av en bakteriell promoter, idet nevnte fragment mangler slik promoter, og idet nevnte fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (b) eller (c); (b) et annet lineært, dobbeltkjedet DNA-fragment omfattende nevnte heterologe gen, idet nevnte andre fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (a) eller (c); og (c) et tredje dobbeltkjedet DNA-fragment som omfatter en bakteriell promoter, idet nevnte tredje fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (a) eller (b);

hvor de ligerbare endene til nevnte fragmenter har en slik konfigurasjon at de er i stand til ligering til dannelse av et replikerbart plasmid i hvilket både genet for seleksjons-markøren og det heterologe genet kommer under styring av promoteren med det heterologe gen liggende transkripsjonalt nedstrøms for promoteren og oppstrøms for seleksjonsmarkør-genet, idet det sistnevnte ikke er i stand til funksjonell ligering til promoterfragmentet annet enn via fragment (b) hvor det heterologe gen er funksjonelt bundet til promoteren, hvilket således tillater anvendelse av nevnte markør ved seleksjon av transformante bakteriekolonier som er i stand til å uttrykke det heterologe genet.

Seleksjonsmarkøren er fortrinnsvis antibiotikaresistent, f.eks. tetracyklinresistent. I en foretrukket utførelse er seleksjonsmarkøren tetracyklinresistent, og den bakterielle promotoren er trp-promotoren, idet ligering fortrinnsvis også rekonstituerer et operon for ekspresjon av ampicillinresistens.

Oppfinnelsen vil klargjøres ytterligere i det nedenstående og under henvisning til de medfølgende tegninger hvor: Fig 1 og fig. 2 illustrerer i suksessive trinn den måte på hvilken plasmidet manipuleres til dannelse av et system hvori andre heterologe gener på utskiftbar måte kan uttrykkes som fusjoner med trp E-polypeptidsekvenser. Fig. 3 er resultatet av polyakrylamidgel-segregering av celleprotein inneholdende homologe (trp E)-heterologe fusjonsproteiner for produksjon av henholdsvis somatostatin, thymosin-a-1, human proinsulin, og A- og B-kjedene i human insulin.

Polyakrylamingel-analyse som illustrert på fig. 3 sørger for separering av proteiner etter størrelse, og

tilveiebringelse av et bilde av deres relative konsentra-sjoner som gjenspeiles i densiteten av de individuelle bånd.

Som en kontroll ble det benyttet en rekke forskjellige proteiner, inkludert de spesielle proteinene som ble fremstilt ved bruk av ekspresjonsvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse, og analysebetingelsene for kontrollen og testforbindelsene var nøyaktig de samme. Feltene som er i den samme posisjonen representerer de samme proteinene, mens forskjellene i densitetene i disse feltene illustrerer konsentrsjonsforskjellene mellom testproduktet og den tilsvarende standard. Siden polyakrylamidgelanalyse som beskrevet viser konsentrasjons(utbytte)-forskjeller og ikke absolutte konsentrasjonsverdier så er konsentrasjonen av standarden uten betydning.

For at illustrasjonen skal være så klar som mulig så er bare den kodende kjeden i det dobbeltkjedede plasmid og lineære DNA'er vist på figurene i de fleste tilfellene. Gener som koder antibiotikaresistens er betegnet ap<R> (ampicillin) og tc<R> (tetracyklin). Symbolet "ap<s>" betegner ampicillinsensitivitet som resulterer fra deletering av en del av det genet som koder ampicillinsensitivitet. Plasmidiske promote-rer og operatorer er betegnet "p" og "o". Bokstavene A, T, G og C betegner henholdsvis nukleotidene som inneholder basene adenin, thymin, guanin og cytosin. Andre figurforklaringer fremgår fra teksten.

De foretrukne utførelser som er beskrevet i det nedenstående omfatter bruken av en rekke vanlig tilgjengelige restrik-sjonsendonukleaser som er identifisert i det følgende, med deres tilsvarende gjenkjennelsessekvenser og (angitt med pil) spaltningsmønstere.

Når spaltningspunktene ligger i avstand fra hverandre på de respektive kjedene, så vil de spaltede endene være "klebrige", dvs. i stand til gjensammensmelting eller sammen-smelting med annen komplementær DNA med "klebrig" ende ved Watson-Crick-basepardannelse (A til T og G til C) på en måte som kan kalles "hun"- og "han"-tapping. Noen restriksjons-enzymer, slik som Hpal og PvuII ovenfor, spaltes slik at det etterlates "butte" ender. Nukleotidsekvensene ovenfor er representert i overensstemmelse med den gjennomført benyttede konvensjon; øvre kjede er den proteinkodende kjeden, og ved å gå fra venstre mot høyre på denne kjeden så beveger man seg fra dens 5'- til 3'-ende, dvs. i transkripsjonsretningen fra et "proksimalt" mot et "distalt" punkt.

Sluttelig, med hensyn til konvensjoner så betegner symbolet "A" en delesjon. Således beskriver f.eks. henvisning til et plasmid fulgt av f.eks. "AEcoRI-Xbal" plasmidet fra hvilket nukleotidsekvensen mellom EcoRI og Xbal restriksjons-enzymseter har blitt fjernet ved nedbrytning med disse enzymene. For hensiktsmessighetens skyld er visse delesjoner betegnet med tall. Således ved å begynne fra det første baseparet ("bp") i EcoRI-gjenkjennelsessetet som går forut for genet for tetracyklinresistens i pBR322-stamplasmidet, så betegner "Al" delesjon av bpl-30 (dvs. AEcoRI-Hindlll) og følgelig en nøytralisering av tetracyklin-promoter-operatorsystemet; "a2" betegner delesjon av bpl-375 (dvs. AEcoRI-BamHI) og følgelig fjerning av både tetracyklin-promoter-operatoren og det strukturelle genet som koder tetracyklinresistens; og "A3" betegner delesjon av bp 3611-4359 (dvs. APstl-EcoRI) og eliminering av ampicillinresistens. "a4" anvendes for å betegne fjerning av bp ~900 - ~1500 fra trp-operonfragmentet 5., hvorved det strukturelle genet for trp D-polypeptidet elimineres.

trp-ledersekvensen består av basepar ("bp") 1-162, og starter fra startpunktet for trp mRNA. Et putativt trp-lederpoly-peptid av 14 aminosyrer kodes av bp 27-71 etter ATG-nukleo-

tidene som koder translasjonsstartsignalet. trp-attenuatorområdet omfatter suksessive GC-rike og AT-rike sekvenser som ligger mellom bp 114 og 156 og attenuering bevirkes tilsyne-latende på mRNA-nukleotider kodet av bp ~134-141 i ledersekvensen. For å uttrykke et heterologt polypeptid under styring av trp-lederribosombindingssetet og samtidig unngå attenuering, må følgende kriterier observeres: 1. Basepar 134-141 eller utenfor må fjernes; 2. ATG-kodonet i det innskutte gen må posisjoneres i korrekt forhold til et ribosombindingssete, som er kjent (se f.eks. J.A. Steitz, "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" i Biological Regulation and

Control (utg. R. Goldberger) Plenum Press, N.Y. [1978]). 3. Når et homologt-heterologt fusjonsprotein skal dannes, så bør translasjonsstartsignalet i en homolog polypeptidsekvens være tilgjengelig og kodonene for den homologe delen i fusjonsproteinet må innsettes i fase uten at translasjonsstoppsignaler kommer i mellom.

For eksempel, delesjon av alle basepar i ledersekvenser distalt fra bp. 70 fjerner attenuatorområdet, etterlater ATG-sekvensen som koder translasjonsstartsignalet og eliminerer mellomliggende translasjonsstopp kodet av TCA (bp. 69-71) ved eliminering av A og etterfølgende nukleotider. En slik delesjon ville resultere i ekspresjon av et fusjonsprotein som begynner med lederpolypeptidet og slutter med det som er kodet av et hvilket som helst heterologt innskudd, og innbefattende et distalt område av et av post-leder-trp-operonpolypeptidene bestemt av graden av delesjon i Beret-ningen. En delesjon som rager inn i E-genet ville således lede til ekspresjon av en homolog forløper omfattende L—sekvensen og det distale området av E (utenfor delesjons-endepunktet) sammensmeltet med sekvensen kodet av et hvilket som helst etterfølgende Innskudd, og så videre.

To spesielt nyttige plasmider hvorfra attenuatorområdet har blitt deletert er plasmidene pGMl og pGM3, G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology, 133, 1457 (1978). Disse bærer henholdsvis delesjonene trp ALE 1413 og trp ALE 1417 og uttrykker (under kontroll av trp-promoter-operatoren) et polypeptid omfattende omtrent de første seks aminosyrene i trp-leder- og distalområdene i E-polypeptidet. I det mest foretrukne tilfelle, pGMl, blir bare omtrent den siste tredjedelen av E—polypeptidet uttrykt, mens pGM3 uttrykker nesten den distale halvpart av E-polypeptidkodonet. E. coli K-12 stammen W3110 tna 2~trp~Al02 inneholdende pGMl har blitt deponert hos American Type Culture Collection (ATCC nr. 31622), pGMl kan fjernes på konvensjonell måte fra stammen for bruk i de nedenfor beskrevne fremgangsmåter.

Alternativt kan delesjoner bevirkes ved hjelp av midler tilveiebragt spesielt for spaltning av dobbeltkjedet DNA ved et hvilket som helst ønsket sete. Således blir dobbeltkjedet DNA omdannet til enkeltkjedet DNA i området som omgir det tilsiktede spaltningspunktet, som ved reaksjon med X-eksonuklease. En syntetisk eller annen enkeltkjedet DNA-primer hybridiseres deretter til den tidligere dannede enkeltkjedede lengden ved Watson-Crick-basepardannelse, idet den primære sekvensen er slik at man sikrer at 5<*->enden derav vil ha samme endepunkt som nukleotidet på den første kjeden like før det tilsiktede spaltningspunktet. Primeren forlenges deretter i 3'-retningen ved omsetning med DNA-polymerase hvilket gjenskaper den delen av den opprinnelige dobbeltkjedede DNA før den tilsiktede spaltning, som gikk tapt i det første trinnet. Samtidig eller deretter blir delen av den første kjeden som ligger utenfor det tilsiktede spaltningspunktet fjernet ved nedbrytning. Dette skal illustreres som følger, idet "v" markerer det tilsiktede spaltningspunktet:

I den mest foretrukne utførelse blir trinnene (d) og (e) utført samtidig ved anvendelse av en polymerase som samtidig nedbryter den fremstikkende, enkeltkjedede enden i a' -* 5'. retningen og forlenger primeren (i nærvær av dATP, dGTP, dTTP og dCTP) i 5' -» 3' retningen. Materialet som er foretrukket for dette formål er Klenow Polymerase I, dvs. det fragmentet som oppnås ved proteolytisk spaltning av DNA-polymerase I som inneholder den 5' -♦ 3' polymeriserende aktivitet og den 3' -* 5' eksonukleolytiske aktivitet til stamenzymet, men mangler dets 5' -» 3' eksonukleolytiske aktivitet. A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W.H. Freeman and Co., SFO (1974 ).

Ved anvendelse av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte så kan attenuatordelesjoner tilveiebringes på en hvilken som helst måte i et trp operonholdig plasmid som først er gjort lineært ved f.eks. spaltning ved et restriksjonssete nedstrøms fra det punkt ved hvilket molekylet skal gis en butt ende ("v" ovenfor). Resirkularisering etter delesjon av attenuatorområdet kan bevirkes f.eks. ved buttende-ligering eller på annen måte som vil være åpenbar for en fagmann på området.

Selv om oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for dannelse av et ekspresjonsplasmid for ekspresjon av et heterologt gen innbefattende direkte ekspresjon av heterologt polypeptid under styring av trp-promoter-operatoren, så innebærer det foretrukne tilfellet ekspresjon av sammensmeltede proteiner inneholdende både homologe og heterologe sekvenser, hvor den sistnevnte fortrinnsvis er spesifikt spaltbar fra førstnevnte i ekstracellulære omgivelser. Spesielt foretrukket er fusjoner hvorved den homologe delen omfatter en eller flere aminosyrer i trp-lederpolypeptidet og ca. en tredjedel eller mer av trp E-aminosyresekvensen (distal ende). Således oppnådde fusjonsproteiner viser seg å være betydelig stabilisert mot nedbrytning under ekspresjonsbetingelser.

Bakterier E. coli K-12 stamme W3110 tna 2"trp"Al02 (pGMl), ATCC nr. 31622 kan anvendes for å amplifisere forråd av pGMl-plasmidet som fortrinnsvis benyttes ved konstruksjon av de aktuelle attenuatormanglende trp promoter-operatorsystemene. Denne stammen er fenotypisk trp<+> i nærvær av antranilat og kan dyrkes i minimale media slik som LB supplert med 50 jjg/ml antranilat.

Alle bakteriestammer som er benyttet i trp promoter-operator-styrt ekspresjon ifølge oppfinnelsen er trp repressor<+> ("trp R<+>") som i tilfellet for villtypen av E. coli, for derved å sikre represjon inntil heterolog ekspresjon er ønsket.

DNA-rekombinasjon blir i den foretrukne utførelsen foretatt i E. coli, K-12 stamme 294 (ende A, thi~, hsr~, hsm£), ATCC nr. 31446, en bakteriestamme hvis membranegenskaper letter transformasjoner. Heterologe polypeptidproduserende plasmider dyrket i stamme 294 blir konvensjonelt ekstrahert og holdt i oppløsning (f.eks. 10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8) ved fra ca.

—20°C til ca. 4°C. For ekspresjon under industrielle betingelser foretrekkes på den annen side en mer hardfør stamme, dvs. E. coli, K-12 X~F~ RV 308 str<r>, gal 308" ATCC nr. 31608. RV 308 er næringsmessig en villtype og vokser godt i minimale media og syntetiserer alle nødvendige makromole-kyler fra konvensjonelle blandinger av ammonium-, fosfat- og magnesiumsalter, spormetaller og glukose. Etter transformasjon av RV 308-kultur med plasmid avledet fra stamme 294 spres kulturen på media som er selektive for en markør (slik

som antibiotikaresistens) som bæres av plasmidet, og en transformant koloni plukkes ut og dyrkes i kolbekultur. Aliquoter av sistnevnte i 10% DMSO eller glyseroloppløsning (i sterile Wheaton-ampuller) skallfryses i et bad av etanol og tørris og fryses ved —80°C. For fremstilling av det kodede heterologe polypeptidet dyrkes kulturprøvene i media inneholdende tryptofan for derved å undertrykke trp promoter-operatoren og systemet berøves deretter for ytterligere tryptofan for å bevirke ekspresjon.

For det første vekstrinhet kan det f.eks. benyttes LB-medium (J.E. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) som pr. liter vandig oppløsning inneholder 10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gjær-ekstrakt og 10 g NaCl. Kulturen dyrkes fortrinnsvis til en optisk densitet ("O.D.") på 10 eller mer (ved 550 nM), mer foretrukket til O.D. på 20 eller mer, og mest foretrukket ti O.D. 30 eller mer, skjønt til mindre enn stasjonær fase.

For depresjon og ekspresjon blir kulturen deretter dyrket under betingelser som berøver cellen for tilsatt tryptofan. Et passende medium for slik vekst er M9 (J.H. Miller, supra ved 431) fremstilt som følger (pr. liter):

Dette medium autoklaveres og deretter tilsettes:

10 ml 0.01M CaCl2

1 ml IM MgS04

10 ml 20$ glukose

Vitamin Bj 1 pg/ml

Humko-hycase amino

eller Difco cas. aminosyrer 40 pg/ml.

Aminosyresupplementet er et tryptofanmanglende syrehydrolysat av kasein.

For å begynne ekspresjon av det heterologe polypeptidet kan inokuleringsmidlet som er dyrket i tryptofanrike media f.eks. fortynnes til et større mediumvolum som ikke inneholder noe additivt tryptofan (f.eks. 2-10 gangers fortynning) dyrket opp til et hvilket som helst ønsket nivå (fortrinnsvis like under stasjonær vekstfase) og deretter oppnås det tilsiktede produkt på konvensjonell måte ved lysering, sentrifugering og rensing. I det tryptofan-berøvede veksttrinnet blir cellene fortrinnsvis dyrket til en O.D.-verdi på over 10, mer foretrukket over 20 og mest foretrukket til eller utover en O.D.-verdi 30 (alle verdier målt ved 550 nM) før produkt-utvinning.

DNA-rekombinasjonsforsøk som er beskrevet i den nedenfor angitte eksperimentelle del ble utført ved Genentech Inc. i overensstemmelse med retningslinjene til National Institutes of Health for rekombinant DNA-forskning.

Dannelse av et ekspresjonssystem for trp LE'- polypeptid-fusjoner hvorved tetracyklinreslstens anbringes under kontroll av tryptofan- promoter- operatoren.

Strategien for dannelse av en ekspresjonsvektor som kan motta en rekke forskjellige heterologe polypeptidgener for ekspresjon som trp LE'-fusjonsproteiner under kontroll av tryptofanoperonet medfølger konstruksjon av et plasmid som har følgende egenskaper: 1. Tetracyklinreslstens som ville gå tapt dersom promoter-operatorsystemet som kontrollerer genene som spesifiserer slik resistens ble fjernet. 2. Fjerning av promoter-operatorsystemet som kontrollerer tetracyklinreslstens, og resirkularisering ved ligering til et heterologt gen og et tryptofan-promoter-operatorsystem i riktig lesefase med referanse dertil, hvilket gir gjenopprettelse av tetracyklinreslstens og følgelig tillater identifika-sjon av plasmider inneholdende det heterologe geninnskuddet.

I korthet og i overensstemmelse med beskaffenheten av de tilsiktede innskudd, så var formålet å skape et lineært stykke DNA som har en Pst-rest ved dens 3'-ende og en Bgl II-rest ved dens 5'-ende, begrensende et gen som kan spesifisere tetracyklinreslstens når det bringes under kontroll av et promoter-operatorsystem.

Således, under henvisning til fig. 1, ble plasmid pBR322 Hind III-nedbrutt og de utstikkende Hind III-endene ble igjen nedbrutt med Sl-nuklease. Sl-nukleasenedbrytning innebar behandling av 10 pg Hind III-spaltet pBR322 i 30 pl Sl-buffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl2t 25 mM natriumacetat, pH 4,5) med 300 enheter Sl-nuklease i 30 minutter ved 15'C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 pl 30 x Sl-nuklease-stoppoppløs-ning (0,8M tris-base, 50 mM EDTA). Blandingen ble fenol-ekstrahert, kloroformekstrahert og etanolutfelt, deretter EcoRI-nedbrutt som beskrevet ovenfor og det store fragmentet 46 ble oppnådd ved PAGE-metoden fulgt av elektroeluering. Det oppnådde fragment hadde en første EcoRI klebrig ende og en annen butt ende hvis kodende kjede begynner med nukleotidet thymidin. Slik det vil bli vist i det nedenstående, kan den Sl-nedbrutte Hind III-resten som begynner med thymidin sammenføyes med en Klenow-polymerase I-behandlet Bgl II-rest for derved å rekonstituere Bgl II-restriksjonssetet ved ligering.

Plasmid pSom7 A2, som fremstilt i EP 154133A, ble Bgl II-nedbrutt og de Bgl II klebrige endene som resulterte ble gjort dobbeltkjedet ved hjelp av Klenow-polymerase I-metoden ved bruk av alle fire deoksynukleotid-trifosfåter. EcoRI-spaltning av det resulterende produktet fulgt av PAGE og elektroeluering av det lille fragmentet 42 ga et lineært stykke DNA inneholdende tryptofan-promoter-operatoren og kodoner av LE' "proksimal"-sekvensen oppstrøms fra Bgl II-setet ("LE<*>(p)"). Produktet hadde en EcoRI-ende og en butt ende resulterende fra ifylling av Bglll-setet. Bglll-setet blir imidlertid rekonstituert ved ligering av den butte enden på fragment 42 til den butte enden på fragment 46. De to fragmentene ble således ligert i nærvær av T4 DNA-ligase til dannelse av det resirkulariserte plasmidet pHKY 10 (se fig. 1) som ble propagert ved transformasjon inn i kompetente E. coli-stamme 294 celler. Tetracyklinresistente celler inneholdende det rekombinante plasmid pHKY 10 ble dyrket, plasmid DNA ekstrahert og igjen nedbrutt med Bgl II og Pst fulgt av isolering ved PAGE-metoden og ved elektroeluering av det store fragmentet, av et lineært stykke DNA med Pst og Bgl II klebrige ender. Dette DNA-fragmentet 49. inneholder replikeringsopprinnelsen og viste seg senere å være nyttig som en første komponent i konstruksjonen av plasmider hvor både genene som koder for trp LE'-polypeptidfusjonsproteiner og tet-resistensgenet kontrolleres av trp-promoter/operatoren.

Plasmid pSom7 A2A4, som fremstilt i EP 154133A, kunne manipuleres for tilveiebringelse av en annen komponent for et system som kan motta en rekke forskjellige heterologe, strukturelle gener. Under henvisning til fig. 2 så ble plasmidet underkastet delvis EcoRI-nedbrytning (se del IV) fulgt av Pst-nedbrytning og fragment 51 inneholdende trp-promoter/operatoren ble isolert ved PAGE-metoden fulgt av elektroeluering. Delvis EcoRI-nedbrytning var nødvendig for å oppnå et fragment som ble spaltet tilstøtende til 5'-enden til somatostatingenet, men som ikke ble spaltet ved EcoRI-setet som befinner seg mellom ampicillinresistensgenet og trp-promoter-operatoren. Ampicillinresistens som var gått tapt på grunn av Pst I-kuttet i ap<R->genet kunne gjenopprettes ved ligering med fragment 51.

I en første demonstrasjon ble den tredje komponenten, et strukturelt gen for thymosin-a-l, oppnådd ved EcoRI- og BamHI-nedbrytning av plasmid pThcxl (se Ep 154133A). Fragmentet, 52, ble renset ved PAGE og elektroeluering.

De tre genfragmentene 49, .51 og 52 kunne nå ligeres sammen i riktig orientering, som vist på fig. 2, til dannelse av plasmidet pTha7 AlA4 som kunne selekteres på grunn av gjenopprettelsen av ampicillin- og tetracyklinreslstens. Ved transformasjon inn i E. coli-stamme 294 og oppdyrking så uttrykte plasmidet et trp LE' polypeptidfusjonsprotein hvorfra thymosin-a-l kunne spaltes spesifikt ved cyanogen-bromidbehandling. Da andre heterologe, strukturelle gener med EcoRI- og BamHI-termini ble ligert på lignende måte med de pHKYlO-avledede og pS0M7 A2A4-avledede komponentene, ble trp LE'-polypeptidfusjonsproteinene inneholdende polypeptidene for hvilke disse heterologe gener koder, likeledes oppnådd på effektiv måte. Fig. 3 illustrerer en SDS-polyakrylamid-gelelektroforeseseparering av totalt cellulært protein fra E. coli stamme 294-transformanter, hvor det mørkeste båndet i hvert tilfelle representerer fusjonsproteinproduktet produsert under kontroll av tryptofan-promoter-operatorsystemet. På fig. 3 er felt 1 en kontroll som segregerer totalt cellulært protein fra E. coli 294/pBR322. Felt 2 inneholder somatostatin-fusjonsproduktet fra plasmid pSom7 A2A4. Felt 3 er det somatostatinholdige ekspresjonsproduktet av pSom7 A2A4. Felt 4 inneholder ekspresjonsproduktet av pThot7 AlA4, mens felt 5 inneholder produktet uttrykt fra et plasmid oppnådd de pEKY-10-avledede og pSom7 A2A4-avledede fragmentene omtalt ovenfor ble ligert med et EcoRI/BamHI-terminert strukturelt gen som koder human proinsulin. Felt 6 og 7 inneholder henholdsvis, som det mørkeste båndet, et trp LE'-polypeptidfusjonsprotein hvorfra B- og A-kjeden i human insulin kan spaltes. De insulin B og A strukturelle genene ble oppnådd ved EcoRI- og BamHI-nedbrytning av plasmider pIBl og pIAll respektivt, hvis konstruksjon er beskrevet i D.V. Goeddel et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA, 76, 106 [1979]. Felt 8 inneholder som tidligere størrelsesmarkører.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for dannelse av et ekspresjonsplasmid for ekspresjon av et heterologt gen, karakterisert ved at man i fase frembringer en samtidig ligering av: (a) et første lineært, dobbeltkjedet DNA-fragment inneholdende et replikon og et gen som uttrykker en selek-sjonsmarkør når det plasseres under styring av en bakteriell promoter, idet nevnte fragment mangler slik promoter, og idet nevnte fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (b) eller (c); (b) et annet lineært, dobbeltkjedet DNA-fragment omfattende nevnte heterologe gen, idet nevnte andre fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (a) eller (c); og (c) et tredje dobbeltkjedet DNA-fragment som omfatter en bakteriell promoter, idet nevnte tredje fragment har ligerbare ender som kan ligere til seg selv eller til fragment (a) eller (b); hvor de ligerbare endene til nevnte fragmenter har en slik konfigurasjon at de er i stand til ligering til dannelse av et replikerbart plasmid i hvilket både genet for seleksjons-markøren og det heterologe genet kommer under styring av promoteren med det heterologe gen liggende transkripsjonalt nedstrøms for promoteren og oppstrøms for seleksjonsmarkør-genet, idet det sistnevnte ikke er i stand til funksjonell ligering til promoterfragmentet annet enn via fragment (b) hvor det heterologe gen er funksjonelt bundet til promoteren, hvilket således tillater anvendelse av nevnte markør ved seleksjon av transformante bakteriekolonier som er i stand til å uttrykke det heterologe genet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at seleksjonsmarkøren er antibiotikaresistent.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at seleksjonsmarkøren er tetracyklinresistent, og at den bakterielle promoteren er trp-promoteren.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at ligering i tillegg rekonstituerer et operon for ekspresjon av ampicillinresistens.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at ligerings-produktet transformeres i en bakteriell vert, og at den bakterielle vert dyrkes i et selektivt medium.