PL162227B1 - Sposób wytwarzania z wysoka wydajnoscia produktu polipeptydowego PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania z wysoka wydajnoscia produktu polipeptydowego, który jest lub jest na drodze specyficznego rozszczepienia biologicznie aktywnym heterologicznym polipeptydem otrzymanym w wyniku ekspresji strukturalnego genu kodujacego polipeptyd w bakterii, znamienny tym, ze formuje sie transformowany zdolnym do replikacji plazmido­ wym nosnikiem ekspresji inokulant o sekwencji dwuniciowego DNA, zawierajacy w fazie od pierwszego konca 5’ do drugiego konca 3’ jego nici kodujacej nastepujace elementy: /a/ bakteryjny uklad trp promotor-operator, /b/ nukleotydy kodujace rybosomowe miejsce przy­ laczenia translacji elementu /d/, /c/ nukleotydy kodujace sygnal translakcji elementu /d/ i /d/ strukturalny gen kodujacy sekwencje aminokwasowa aktywnego biologicznie heterologicz­ nego polipeptydu, przy czym wspomniana sekwencja pozbawiona jest zdolnosci atenuowania trp i nukleotydów kodujacych rybosomowe miejsce przylaczenia trp, po czym transformo­ wane bakterie umieszcza sie w naczyniu fermentacyjnym i prowadzi sie ich hodowle na pozywce zawierajacej dodatek tryptofanu wystarczajacy do represji ukladu promotor-opera­ tor, po czym pozbawia sie bakterie tego dodatku tryptofanu, powodujac zniesienie represji ukladu promotor-operator i ekspresje sekwencji DNA elementu /d/ z wytworzeniem produktu polipeptydowego kodowanego przez wspomniany gen strukturalny i prowadzi sie wzrost komórek do gestosci optycznej inokulanta do 10 krotnego nadmiaru /przy 550 nM/, po czym oddziela sie heterologiczny polipeptyd w postaci aktywnej biologicznie. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania z wysoką wydajnością produktu polipeptydowego w drodze ekspresji strukturalnego genu kodującego polipeptyd w bakterii tranformowanej zdolnym do replikacji plazmidowym nośnikiem ekspresji o sekwencji dwuniciowego DNA, w fazie od pierwszego końca 5' do drugiego końca 3’ jego nici kodującej, z wykorzystaniem tryptofanowego układu promotor-operator.

Z chwilą odkrycia technologii rekombinowanego DNA możliwa stała się kontrolowana bakteryjna produkcja licznej i różnorodnej grupy użytecznych polipeptydów. Posiadane obecnie zmodyfikowane za pomocą tej technologii bakterie pozwalają na wytwarzanie takich polipeptydowych produktów jak somatostatyna/K.Itakura i współ., Science 198, 1056/1979//, /składowe/ łańcuchy A i B ludzkiej insuliny /D.V. Goeddel i współpr.. Proc.Nat’l Acad.Sci. USA 76 106/1979//, i ludzki hormon wzrostu/D.V. Goeddel i współpr., Naturę 281,544/1979//. Ostatnio technikę rekombinowanego DNA stosowano do bakteryjnego wytwarzania tymozyny alfa 1. substancji potęgującej odporność immunologiczną, wytwarzanej przez grasicę /Europejski opis patentowy nr 035 459/. Technologia tajest tak wszechstronna, że pozwala wytworzyć bakteryjnie właściwie każdy pożyteczny polipeptyd, umożliwiając kontrolowane wytwarzanie hormonów, enzymów, przeciwciał i szczepionek przeciwko wielu chorobom.

Podstawą technologii rekombinowanego DNA jest plazmid, niechromosomalna pętla dwuniciowego DNA, występujący w bakteriach, często w licznych kopiach w jednej komórce bakteryjnej. Wśród informacji zakodowanych w DNA plazmidu znajduje się informacja potrzebna do produkcji plazmidu w siostrzanych komórkach /tzw. replikon/ jak i zazwyczaj, jedna lub więcej informacja dotycząca wybiorczych cech charakterystycznych, takich jak oporność na antybiotyki, które to cechy pozwalają na rozpoznanie komórki gospodarza zawierającej interesujący plazmid i wyhodowanie go na selektywnym podłożu. Użyteczność plazmidów bakteryjnych polega na tym, że mogą one być w specyficzny sposób cięte przez tę czy inną endonukleazę restrykcyjną lub enzym restrykcyjny, z których każda rozpoznaje inne miejsce w cząsteczce DNA plazmidu. Następnie heterologiczne geny lub fragmenty genu można wcielić do plazmidu, łącząc je z końcami w miejscu cięcia lub ze zrekonstruowanymi końcami przyległymi do miejsca cięcia. Określenie heterologiczny odnosi się do genu nie występującego zazwyczaj w, E. coli lub do sekwencji polipeptydowej nie wytwarzanej przez E. coli, podczas gdy określenie homologiczny odnosi się do genu występującego lub polipeptydu wytwarzanego w dzikim E. coli.

Rekombinowanie dNa odbywa się na zewnątrz bakterii, ale powstały zrekombinowany plazmid może być wprowadzony do bakterii w procesie znanym jako transformacja i duże ilości zrekombinowanego plazmidu zawierającego heterologiczny gen otrzymano w drodze hodowli transformatu. Ponadto, kiedy nastąpi właściwe włączenie genu do części plazmidu zarządzających transkrypcją i translacją zakodowanej na DNA informacji, powstały nośnik ekspresji może być użyty do wytwarzania sekwencji polipeptydu, kodowanego przez wcielony gen, a proces wytwarzania produktu genu nazwano ekspresją.

Ekspresja zapoczątkowana jest w obszarze DNA zwanym promotorem, który jest rozpoznawany przez polimerazę RNA i od którego polimeraza RNA rozpoczyna syntezę RNA. W pewnych przypadkach, jak na przykład w trp operonie, obszary promotora w znacznej mierze pokrywają się z miejscem operatorowym, tworząc połączony układ promotor-operator. Operatorami są sekwencje DNA rozpoznawane przez tzw. represorowe proteiny służące do regulacji częstotliwości inicjowania transkrypcji w poszczególnym promotorze. Polimeraza wędruje wzdłuż cząsteczki DNA transkrybując informację, zawartą w nici kodującej od jej końca 5’ do końca 3’ na informacyjny RNA, który kolejno jest źródłem informacji służących syntezie polipeptydu o sekwencji aminokwasowej zakodowanej w DNA.

Każdy aminokwas jest zakodowany przez trójkę nukleotydów lub inaczej kodon który można nazwać strukturalnym genem tzn. tą częścią, która koduje sekwencję aminokwasową produktu wytwarzanego podczas ekspresji. Po przyłączeniu się do promotora, polimeraza RNA najpierw transkrybuje nukleotydy kodujące rybosomowe miejsce przyłączenia, a następnie sygnał inicjacji translacji lub startowy /zazwyczaj ATG, który w powstałym informacyjnym RNA staje się AUG/, i wreszcie kodony nukleotydowe w samym genie strukturalnym. Tak zwane kodony zakańczające syntezę polipeptydu są transkrybowane na końcu strukturalnego genu, dzięki czemu polimeraza może uformować dodatkową sekwencję informacyjnego RNA, która

162 227 z powodu obecności sygnału kończącego nie ulegnie transkrypcji rybosomowej. Rybosomy łączą sie w miejscu przyłączenia, w który zaopatrzony jest informacyjny RNA, w bakteriach zazwyczaj w trakcie tworzenia mRNA i wytwarzają zakodowany polipeptyd rozpoczynając od sygnału startu translacji, a kończąc na wspomnianym wyżej sygnale zakończenia. Pożądany produkt jest wytwarzany wtedy, kiedy sekwencje kodujące rybosomowe miejsce przyłączenia są właściwie usytuowane względem inicjującego kodonu AUG i jeżeli wszystkie pozostałe kodony następują kolejno w fazie po kodonie inicjującym. Powstały produkt można otrzymać w drodze lizy komórek gospodarza i wyodrębniania produktu poprzez oczyszczanie od innych protein bakteryjnych. Polipeptydy, powstałe w trakcie ekspresji uzyskanej dzięki stosowaniu technologii rekombinowanego DNA, mogą być całkowicie heterologiczne, co ma miejsce w przypadku bezpośredniej ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu, albo alternatywnie mogą zawierać heterologiczny polipeptyd i przyłączoną do niego co najmniej część sekwencji aminokwasowej homologicznego peptydu, jak to ma miejsce podczas wytwarzania półproduktów do produkcji somatostatyny i składników ludzkiej insuliny; w tym ostatnim przypadku na przykład przyłączony homologiczny polipeptyd, zawiera część sekwencji aminokwasowej beta-galaktozydazy. W tych przypadkach planowany aktywny biologicznie produkt jest zdezaktywowany biologicznie za pomocą złączonego z nim homologicznego polipeptydu, dopóki ten ostatni nie zostanie usunięty do środowiska pozakomórkowego. Połączone proteiny, takie jak wymienione wyżej, można zaplanować w ten sposób, aby umożliwić wysoko specyficzną reakcję odszczepienia proteiny-prekursora od zamierzonego produktu działaniem na przykład bromocyjanu na metioninę, lub alternatywnie przez rozszczepienie enzymatyczne. Patrz np. brytyjski opis patentowy nr 2 007 676 A/.

Jeżeli technologia rekombinowanego DNA miałaby w pełni spełniać swoją rolę, to musiałyby być zapewnione układy optymalizujące ekspresję wstawek genowych, tak aby planowane produkty polipeptydowe były osiągalne z wysoką wydajnością.

Stosowane w przeszłości układy promotor-operator beta laktamazy i laktozy chociaż użyteczne, to jednak nie wykorzystywały w pełni, pod względem wydajności, zdolności technologii. Stąd konieczność poszukiwania nośnika ekspresji bakteryjnej, zdolnego do kontrolowanej ekspresji pożądanych produktów polipeptydowych z wysoką wydajnością.

Tryptofan, będący składnikiem homologicznych polipeptydów, jest aminokwasem produkowanym przez bakterie na szlaku biosyntetycznym o następującym przebiegu: kwas chorysmowy — kwas antranilowy — fosforybozyl kwasu antranilowego — CDRP /enol-l-/okarboksyfenylo;anino//l-dezoksy-D-rybulozylo-5-fosforran —> indolilo-3-glicerofosforan i na końcu tryptofan. Reakcje enzymatyczne przebiegające na tym szlaku są katalizowane produktami tryptofanu lub trp operonu, policistronowego segmentu DNA, który podlega transkrypcji pod kierunkiem układu trp promotor-operator. Powstały policistronowy informacyjny RNA koduje tak zwaną sekwencję trp lidera, po czym kolejno polipeptydy zwane trp E, trp D, trp C, trp R i trp A. Te polipeptydy w różny sposób katalizują i kontrolują poszczególne etapy szlaku biosyntetycznego biegnącego od kwasu chorysmowego do tryptofanu.

W dzikich komórkach E. coli operon tryptofanowy znajduje się pod wpływem co najmniej trzech odmiennych czynników kontrolujących. W przypadku represji promotor-operator, tryptofan działa w roli korepresora i wiąże się zjego aporepresorem do postaci aktywnego kompleksu represora, który przyłącza się do operatora, zamykając w całości szlak reakcji. Po drugie w wyniku procesu ujemnego sprzężenia zwrotnego, tryptofan wiąże się w kompleks z polipeptydami trp E i trp D uniemożliwiając im wzięcie udziału w szlaku biosyntetycznym. Wreszcie, do kontroli przyczynia się proces zwany atenuacją /osłabianiem/ przebiegający pod kontrolą obszaru osłabiającego genu, obszaru znajdującego się w obrębie sekwencji trp lidera. Problem ten poruszono w pracach G.F. Miozzari i współp., J. Bacteriology 133,1457 /1978/; The Operon 263-302, Golg Spring Harbor Laboratory/1978/, Miller i Reznikoff; F. Lee i współpr. Proc. Nad. Acad. Sci USA 74,4365 /1977/ i K. Bertrand i współpr., J. Mol. Biol. 103, 319 /1976/. Zasięg osłabiania jest zarządzany wewnątrz-komórkowym stężeniem kryptofanu, a w przypadku dzikiego E. coli atenuator kończy ekspresję w około 9 na 10 przypadków, prawdopodobnie dzięki formowaniu wtórnej struktury, lub kończącej pętli w RNA informacyjnym, co wywołuje przedwczesne oderwanie się RNA polimerazy od przyłączonego DNA.

162 227

Inni badacze zastosowali trp operon do określenia miary ekspresji heterologicznego polipeptydu. Praca ta, należy sądzić, ma na celu przybliżenie problemu represji i osłabiania za pomocą dodawania kwasu indoloakrylowego, induktora i analoga, którzy współzawodniczy z tryptofanem do cząsteczek trp represora. przyczyniając się do zmniejszenia represji w drodze współzawodniczej inhibicji. W tym samym czasie induktor zmniejsza tenuowanie poprzez hamowanie enzymatycznej konwersji indolu w tryptofan i w ten sposób komórka zostaje pozbawiona tryptofanu. W rezultacie uzyskuje się zwiększenie ilości polimeraz odczytywanych przez atenuator. Podejście to jednak jest problematyczne z powodu stałej i z wysoką wydajnością zachodzącej translacji, podczas gdy sekwencje proteinowe zawierające tryptofan są przedwcześnie zużywane do syntezy, ze względu na brak tryptofanu nadającego się do wykorzystania. Rzeczywiście, efekt uzyskany dzięki atenuacji jest w tym przypadku całkowicie zależny od wielkości głodu tryptofanowego.

Sposób wytwarzania produktu polipeptydowego według wynalazku polega na tym, że transformuje się bakterie zdolnym do replikacji nośnikiem ekspresji, zawierającym następujące elementy: /a/ bakteryjny układ trp promotor-operator, /b/ nukleotydy kodujące rybosomowe miejsce przyłączenia dla translacji elementu /d/, /c/nukleotydy kodujące sygnał startu translacji elementu /d/, i /d7 strukturalny gen kodujący sekwencję aminokwasową heterologicznych polipeptydów. przy czym wspomniana sekwencja pozbawiona jest zdolności atenuowania trp i nukleotydów kodujących rybosomowe miejsce przyłączenia trp E, po czym transformowane bakterie umieszcza się w naczyniu fermentacyjnym i prowadzi się ich hodowlę do wcześniej założonego poziomu wzrostu, który jest mniejszy od fazy wzrostu stacjonarnego w/na pożywce zawierającej dodatek tryptofanu wystarczający do represji układu promotor-operator i następnie pozbawia się bakterie tego dodatku tryptofanu, powodując zniesienie represji układu promotoroperator i ekspresję produktu kodowanego przez wspomniany gen strukturalny. Tak więc, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania w bakteriach heterologicznych produktów polipeptydowych przy użyciu nowych nośników plazmidowej ekspresji. Nośniki te posiadają sekwencję podwójnie skręconej spirali DNA zawierającej w fazie od pierwszego 5' do drugiego 3’ końca kodującej nici, trp promotor operator, nukleotydy kodujące rybosomowe miejsce przyłączenia dla trp lidera i nukleotydy kodujące inicjację translacji w celu ekspresji strukturalnego genu, który koduje sekwencję aminokwasową heterologicznego polipeptydu. Wspomniana sekwencja DNA nie posiada ani obszaru trp atenuatora ani nukleotydów kodujących trp E rybosomowe miejsce przyłączenia. Zamiast tego rybosomowe miejsce przyłączenia trp lidera jest stosowane do wywołania ekspresji informacji zakodowanej przez włączony gen.

Komórki transformuje się przez dodanie plazmidów zawierających trp promotor-operator i plazmidów pozbawionych atenuatora, i prowadzi się ich hodowlę w obecności dodatku tryptofanu. Zastosowanie podłoża bogatego w tryptofan powoduje, że następuje prawie całkowita represja układu trp promotor-operator przez wzajemne oddziaływanie trp/represor tak, że wzrost komórkowy może następować bez zahamowań z powodu przedwczesnej ekspresji dużych ilości heterologicznego polipeptydu kontrolowanego przez heterologiczną wstawkę, czyli inaczej pod kontrolą układu trp promotor-operator. Kiedy zrekombinowana kultura narośnie do poziomu dostatecznego dla rozpoczęcia wytwarzania polipeptydu na skalę przemysłową, usuwa sie zewnętrzne źródło tryptofanu, pozostawiając komórce oparcie tylko w tryptofanie, który może sama wyprodukować. Rezultatem jest łagodne ograniczenie tryptofanu, w związku z czym otwiera się znowu szlak biosyntetyczny i następuje wysoce wydajna ekspresja heterologicznej wstawki, nieskrępowanej przez atenuowanie ponieważ obszar atenuowania został usunięty z układu. W ten sposób komórki nie są nigdy w dużym stopniu pozbawione tryptofanu i wszystkie proteiny, niezależnie od tego czy zawierają one tryptofan czy nie, mogą być produkowane ze znaczną wydajnością.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na rysunku, na którym fig. 1 i 2 ilustrują korzystny schemat tworzenia plazmidów, zdolnych do ekspresji heterologicznych genów w postaci fuzji z częścią trp D polipeptydu, z której to postaci mogą być później uwolnione; fig. 3 przedstawia wynik segregacji przeprowadzonej na żelu poliakryloamidowym proteiny komórkowej, zawierającej proteiny powstałe w wyniku fuzji proteiny homologicznej /trp D’/ i heterologicznej /somatostatyna lub alfa 1 tymozyna/; fig 4, 5 i 6 ilustrują kolejno etapy korzystnego schematu wytwarzania plazmidu, zdolnego do bezpośredniej ekspresji heterologicznego genu/ ludzkiego

162 227 hormonu wzrostu/ pod kontrolą układu trp promotor-operator; fig. 7 przedstawia wynik segregacji na żelu poliakryloamidowym proteiny komórkowej zawierającej ludzki hormon wzrostu bezpośrednio wydzielony pod kontrolą układu trp promotor- operator; fig 8, 9/a-b/ i 10 ilustrują w kolejnych etapach korzystny schemat wytwarzania plazmidów, zdolnych do ekspresji heterologicznych genów/w ilustrowanym przypadku dotyczy to somatostatyny/ w postaci połączenia z częścią trp E polipeptydu, z którego to połączenia mogą one być później uwolnione; fig. 11 przedstawia wynik segregacji na żelu polikryloamidowym proteiny komórkowej powstałej w wyniku połączenia proteiny homologicznej /trp E/ z proteiną heterologiczną w celu wytworzenia, odpowiednio, somatostatyny, tymozyny alfa 1, ludzkiej proinsuliny i łańcuchów A i B ludzkiej insuliny; fig. 12 i 13 ilustrują w kolejnych etapach sposób w jaki manipuluje się plazmidem, wytworzonym zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunkach 8-10 włącznie w celu utworzenia układu, w którym inne geny heterologiczne mogą w sposób wymienialny ulec ekspresji w postaci połączenia z sekwencjami trp E polipeptydu.

Na rysunkach dla zachowania jasności obrazu przedstawiono tylko nić kodującą dwuniciowego plazmidu i liniowych DNA. Geny kodujące odporność na antybiotyki oznaczono ap^K /ampicylina/ i tc^R /tetracyklina/. Oznaczenie tc oznacza gen odpowiedzialny za odporność tetracyklinową, który nie jest pod kontrolą układu promotor-operator^ tak, że plazmidy zawierające ten gen nie będą nigdy wrażliwe na tetracyklinę. Określenie aps oznacza wrażliwość na ampicylinę, wynikającą z usunięcia części genu kodującego wrażliwość na ampicylinę. Plazmidowe promotory i operatory oznaczono jako p i o. Litery A, T, G i C oznaczają odpowiednio nukleotydy zawierające zasady adeninę, tyminę, guaninę i cytozynę. Znaczenie innych oznaczeń na rysunkach wynika z tekstu.

Do cięcia łańcuchów DNA stosuje się liczne ogólnie dostępne endonukleazy restrykcyjne wymienione niżej wraz z odpowiadającymi im sekwencjami i wzorcami cięcia/oznaczonymi za pomocą strzałki/.

1

Xbal:	TCTAGA	Taql:	TCGA
FcoRI:	AGATCT 1 T	Hindlll:	AGCT 1 T
	GAATTC		AAGCTT
BgHI:	CTTAAG 1 T	Hpal:	TTCGAA 1 T
	AGATCT		GTTAAC
PvuD:	TCTAGA i t	Pstl:	CAATTG t 4
	GAGCTG		CTGCAG
	GTCGAC 1 T		GACGTC T
BamHI:	GGATCC
	CCTAGG

T

W przypadku kiedy punkty cięcia na niciach są od siebie oddalone, to odcięte końce będą zwane lepkimi końcami, tzn. będą zdolne do przyłączenia lub odłączenia do innych uzupełniających lepko zakończonych cząsteczek DNA zgodnie z regułą Watsona-Gricka łączenia się zasad /A do T i G do C/ na mRNA. Czternasty aminokwas wiodącego trp polipeptydu jest zakodowany przez bp 27-71 postępujące za ATG nukleotydami, które kodują sygnał startowy translacji. Trp obszar atenuowania zawiera kolejno bogate w GC i bogate w AT sekwencje leżące pomiędzy bp 114 i 156 i atenuowanie zachodzi w widoczny sposób na nukleotydach mRNA, zakodowanych parami zasad bp -134-141 sekwencji wiodącej. Aby nastąpiła ekspresja heterologiczna polipeptydu pod wpływem trp wiodącego rybosomowego miejsca przyłączenia, przy jednoczesnym uniknięciu atenuowania, muszą być zaobserwowane następujące kryteria:

162 227

1. Pary zasad 134-141 lub nieco szerzej muszą być usunięte;

2. Kodon ATG wstawionego genu musi znajdować się w odpowiednim położeniu wobec miejsca przyłączenia rybosomu, co jest znane (patrz, np. J.A. Steitz Genetic signals and nukleotide sequences in messenger RNA w Biological Regulation and Contro! (ed. R. Golberger) Plenum Press, N. Y. (1978)).

3. W przypadku kiedy ma być wytworzona proteina powstała w wyniku fuzji składników homologiczno-heterologicznych, to sygnał wyjściowy translacji sekwencji homologicznego polipeptydu powinien pozostać dostępny i kodony homologicznej części proteiny powstałej w wyniku fuzji powinny być ustawione w fazę bez interwencyjnych sygnałów kończących translację.

Na przykład, usunięcie wszystkich par zasad w obrębie wiodącej sekwencji oddalonej od bp 70 usuwa obszar atenuowania, pozostawia sekwencję ATG kodującą sygnał wyjściowy translacji i eliminuje interwencyjne zatrzymanie translacji kodowane przez tCa (bp 69-71) na skutek eliminowania A kolejnych nukleotydów. Tego typu delecja powinna powodować ekspresje proteiny powstałej w wyniku fuzji, z wiodącym polipeptydem, kończącej się na polipeptydzie zakodowanym przez heterologicznąinsercję, i zawierającej dystalny obszar jedego z polipeptydów trp operonu określonych rozmiarem delecji w kierunku 3’. Ta właśnie delecja rozszerzająca się na gen E powinna prowadzić do ekspresji homologicznego prekursora, zawierającego sekwencję L i dystalny. obszar E (poza punktem końcowym delecji) złączony w sekwencję zakodowaną przez każdą z kolejnych insercji. itd.

Dwoma szczególnie użytecznymi plazmidami, z których obszar atenuowania został usunięty. są plazmidy pGMl i pGM3, G.F. Miozzari i współpr. J. Bacteriology 133, 1457 (1978). Te plazmidy, odpowiednio, niosą delecje, niosą delacje trpALE 1413 i trp Δ LE 1417 i pod kontrolą systemu trp promotor-operator wykazują ekspresję polipeptydu zawierającego w przybliżeniu sześć pierwszych aminokwasów obszarów trp wiodącego i dystalnego polipeptydu E. W najbardziej dogodnym przypadku, pGMl, wykazuje ekspresję jedynie około ostatniej trójki polipeptydu E i jest poddawana ekspresji podczas gdy pGM3 wykazuje ekspresję dystalnej połowy kodonów polipeptydów E. szczep K-12 E. coli odmiana W3110 tna 2' trp’ 102 zawierająca pGM 1 została złożona w depozycie w American Type Culture Collection (ATCC nr 31622). pGM 1 można w zwykły sposób usunąć z komórek szczepu w celu zastosowania w procesie opisanym poniżej.

Alternatywnie delecje można powodować sposobem będącym przedmiotem równolegle zgłoszonego wynalazku (P i dotyczącego specyficznego cięcia podwójnej nici DNA w dowolnie nie pożądanym miejscu. W części IV sekwencji doświadczalnej opisano jeden przykład takiej techniki cięcia. W ten sposób podwójną nić DNA przekształca się w jedniniciowy DNA w regionie otaczającym planowany punkt cięcia, na przykład w reakcji zlambda egzonukleazą. Po czym syntetyczny lub inny jednoniciowy primerDNA jest hybrydyzowany zjednoniciowym fragmentem wcześniej utworzonym, za pomocą metody parowania zasad Watsona-Crick’a, z tym że sekwencja primera zapewnia zetknięcie się jego końca 5’ z nukleotydem na pierwszej nici tuż przed miejscem planowanego cięcia. Primer jest następnie rozwijany w kierunku 3’ w reakcji z polimerazą DNA w ten sposób, że następuje odbudowa tej części oryginalnego dwuniciowego DNA, która istniała przed planowanym cięciem, a która została odłączona w pierwszym etapie. Jednocześnie lub kolejno część pierwszej nici, wystająca poza planowany punkt cięcia usuwa się przez wytrawienie. Dla podsumowania podano poniższy schemat, w którym V oznacza planowany punkt cięcia:

a) ....------------- planowany punkt cięcia v

b) ....------------ wytworzenie pojedynczej nici wokół punktu v γ

c) ................. hybrydyzacja primeru

162 227

d) ................ rozwijanie primeru

e) ............... trawienie pojedynczej nici

W większości korzystnych wykonań, etapy (d) i (e) przeprowadza się jednocześnie, z zastosowaniem polimerazy, która jednocześnie trawi wystający koniec pojedynczej nici w kierunku 3' —5’ i rozwija primer ( w obecności dATP. dGTP, dTTP i dCTP) w kierunku 5' —5’. Najbardziej korzystnym środkiem do tego celu wydaje soę polimeraza Klenowa I. tzn. fragment uzyskany w drodze proteolitycznego cięcia Polimerazy I DNA, który zawiera 5' —3’ aktywność polimeryzującą i 3’ —5’ aktywność egzonukleolityczną enzymu rodzicielskiego. tracąc jego 5’ — 3’ egzonukleolityczną aktywność. A. Kornberg DNA Synthesis, 98. W.H. Preeman and Co., SFO (1974).

Stosując powyżej opisany sposób postępowania można dokonać delecji atenuatora w dowolnie wybrany sposób w plazmidzie zawierającym trp operon, po pierwsze nadając jemu postać liniową, na przykład w drodze cięcia w miejscu restrykcji w dół od punktu, w którym cząsteczka powinna kończyć się tępo (punkt v powyżej). Powrotne zamknięcie obwodu następujące po usunięciu regionu atenuowanego może odbyć się na przykład w drodze ligacji tępego końca lub w inny sposób, który będzie znany fachowcom.

Jakkolwiek wynalazek dotyczy bezpośrednio ekspresji heterologicznego polipeptydu dokonanej pod kierunkiem systemu trp promotor-operator, to korzystny przypadek obejmuje ekspresję protein, które uległy fuzji, zawierających zarówno homologiczne jak i heterologiczne sekwencje, z których ostatnią odszczepia się w specyficzny sposób od pierwszej w pozakomórkowym środowisku. Szczególnie dogodne są fuzje w których homologiczna część zawiera jeden lub więcej aminokwasów trp polipeptydu wiodącego i około jedej trzeciej lub więcej trp E sekwencji aminokwasowej (koniec dystalny). W ten sposób otrzymane proteiny, które uległy fuzji wykazują godną uwagi stabilność wobec degradacji w warunkach ekspresji.

Bakterie E. coli K-12 szczep W3110 tna 2’trp’ Δ 102 (pGMl), ATCC nr 31622, można użyć w celu amplifikacji zasobów plazmidu pGMl stosowanego dogodnie do konstrukcji, zgodnie z wynalazkiem, systemów trp promotor-operator wykazujących brak atenuatora. Odmiana ta jest fenotypowo trp+ w obecności antranilanu i może wzrastać na podłożu minimalnym takim jak LB wzbogaconym 50 pg/ml antranilanu.

Wszystkie szczepy bakteryjne użyte do bezpośredniej ekspresji kierowanej przez trp promotor-operator zgodnie z wynalazkiem są trp represorami + (trp⁺R⁺) jak w przypadku dzikiego typu E. coli, w celu zapewnienia represji dopóki planowana ekspresja heterologiczna nie zachodzi.

Rekombinację DNA, w korzystnych warunkach, prowadzi się w E. coli, KI2 szczep 294 (koniec A, thi’, hsr’, hsm\), ATCC nr 314446, szczepie bakteryjnym, którego błonę charakteryzuje łatwość transformacji. Plazmidy, produkujące heterologiczne polipeptydy, wyrosłe w szczepie 294 są w zwykły sposób ekstrahowane i pozostawione w roztworze (np. 10 mM tris, 1 mM EDTA, pH8) w temperaturze od około -20°C do około 4°c. Z drugiej strony w celu uzyskania ekspresji w warunkach przemysłowych, preferujemy bardziej wytrzymały szczep E. coli K-12 λΈ RV 308 stf, gal 308’ ATCC nr 31608. RV 308 jest pod względem odżywczym szczepem dzikim i rośnie dobrze na minimalnym podłożu, syntetyzując wszystkie potrzebne makrocząsteczki z konwencjonalnych mieszanin soli amonowych, fosforanowych i magnezowych, śladowych metali i glikozy. Po transformacji hodowli RV 308 plazmidem otrzymanym ze szczepu 294, hodowlę szczepi się na płytkach z podłożem selektywnym dla cechy (takiej jak odporność na antybiotyki) przenoszonej plazmid i stransformowaną kolonię pobiera się i hoduje w kolbach. Próbki tej ostatniej w roztworze 10% roztworach w DMSO lub glicerynie ( w sterylnych fiolkach Wheatona) zamraża się na ścianach w kąpieli etanol-suchy lód i przechowuje się w temperaturze -80°C. W celu wyprodukowania zakodowanego heterologicznego polipeptydu próbki hodowli namnaża się w podłożu zawierającym tryptofan tak, aby nastąpiła represja trp promotora-operatora, po czym układ pozbawia się dodatkowych ilości tryptofanu w celu wywołania ekspresji.

162 227

W celu przeprowadzenia pierwszego etapu wzrostu można zastosować, na przykład, podłoże LB (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) zawierające w litrze wodnego roztworu 10 g tryptonu (Bacto), 5g ekstraktu drożdzowego (Bacto) i lOg NaCl. Korzystnie inokulum rośnie do osiągnięcia optycznej gęstości (o.d) rzędu 10 lub więcej, (przy 550 nM), korzystnie do o.d. 20 lub więcej (a, najkorzystniej do o.d. 30 lub więcej), aczkolwiek mniejszej niż występująca w fazie stacjonarnej.

W celu osiągnięcia derepresji i ekspresji inokulum hoduje się następnie w warunkach zapewniających pozbawienie komórki dodatkowego tryptofanu. Dogodnym podłożem dla takiego wzrostu jest m.in. podłoże M9 (J.H. Miller, cyt powyżej 431) przygotowane w następujący sposób:

(ilości przypadające na litr)
KH2PO4 3g Na2HPO4 6g NaCl 0,5g NH4CI lg Po wprowadzeniu do autoklawu dodaje się: 10 ml 0,01 M	CaCk
1 ml 1M	MgSO4
10 ml 20%	glikozy
Witamina BI	1 gg/ml
Humko hycase amino lub DIFCO aminokwasy kazeiny	40 gg/ml

Dodatkiem aminokwasowym jest kwaśny hydrolizat kazeiny pozbawiony tryptofanu.

W celu zapoczątkowania ekspresji heterologicznego polipeptydu, inokulum, które rosło na bogatym w tryptofan podłożu można na przykład rozcieńczyć do większej objętości podłoża nie zawierającego dodatkowego tryptofanu (np. 2-10 krotne rozcieńczenie), hodować do pożądanego poziomu (korzystnie do osiągnięcia fazy bliskiej stałego wzrostu) i wyodrębnić planowany produkt w konwencjonalny sposób w drodze lizy, odwirowania i oczyszczania. W etapie wzrostu przy braku tryptofanu korzystne jest, aby komórki przed rozpoczęciem wyodrębniania produktu urosły do od większego od 10, lepiej do od 30 lub powyżej (zawsze w 550 nM).

Wszystkie doświadczenia nad rekombinacją DNA opisane w części doświadczalnej załączonej poniżej zostały przeprowadzone w Genentech INC. zgodnie z National Institutes of Health Guidelines for Recombinat DNA research.

Przykład I. Ekspresja proteiny D-polipeptydowej, powstałej w wyniku fuzji.

Korzystną metodą ekspresji protein powstałych w wyniku fuzji, zawierających pożądane polipeptydy i przyłączoną do nich część aminokwasowej sekwencji trp D polipeptydu, którą oddziela się in vitro dzięki metioninie - aminokwasowi specyficznie wrażliwemu na rozszczepienie pod wpływem CN-Br, opisano poniżej w odniesieniu do rysunków fig. 1-3.

A. Konstruowanie pBRHtrp

Plazmid pGMl (1, fig. 1), posiada tryptofanowy operon E. coli zawierający delecję ALE1413 (G.F. Miozzari, i współp., (1978) J. Bacteriology 1457-1466) i w następstwie czego możliwa jest ekspresja proteiny powstałej w wyniku fuzji i zawierającej pierwszych 6 aminokwasów trp lidera i ostatnią trójkę trp E polipeptydu (dalej zwanych LE’) jak również w całości trp D polipeptydu, wszystko to pod kontrolą systemu trp promotor-operator. Plazmid, 20 gg, trawiono enzymem restrykcyjnym PvuII, który tnie plazmid w 5 miejscach. Fragmenty genu 2 były następnie kombinowane z łącznikami EcoRI (składającymi się z komplementarnego oligonukletydu 3 o sekwencji: pCATGAATTCATG) tworząc miejsce cięcia EcoRI dla późniejszego klonowania do plazmidu zawierającego miejsce (20) EcoRI. Na 20 gg fragmentów DNA 2 otrzymanych z plazmidu pGMI działano 10 jednostkami ligazy T4DNA w obecności 200 pikomoli syntetycznego 5’-fosforylo-oligonukleotydu pCATGAATTCATG (3) i buforu T4 DNA ligazy (20mM tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgClą, 5 mM 1,4-dwumerkapto-2.3dwuhydroksy-butanu w 20 μΐ (mikro) w temperaturze 4°C w ciągu nocy. Roztwór ogrzewano następnie 10 minut w temperaturze 70°C w celu zahamowania ligacji. Łączniki odszczepiono w drodze trawienia EcoRI i fragmenty obecnie z końcami RcoRI oddzielono stosując elektroferezę na 5 procentowym żelu poliakryloamidowym (dalej nazywaną PAGE) i trzy największe frag10

162 227 menty wyizolowano z żelu najpierw przez nasycenie bromkiem 3,8-dwuamino-5-etylo-6fenylofenatrydyniowym, umiejscowienie fragmentów w świetle UV i wycięciu z żelu interesujących części. Każdy fragment żelu, wraz z 300 mikrolitrami 0,1 x TBE, umieszczono w dializatorze i poddawano elektroforezie stosując 100 V w ciągu jednej godziny w 0,1 x TBE buforze (bufor TBE zawiera: 10,8g zasady tris, 5,5g kwasu bornego, 0,09g Na2EDTA w 1 litrze wody). Zbierane wodne roztwory z dializatora ekstrahowano kolejno fenolem, chloroformem i rozpuszczono w 0,2 M roztworze chlorku sodowego a DNA wyodrębniano z wody po wytrąceniu etanolem. Wszystkie poniżej opisane izolacje fragmentu DNA przeprowadzono z użyciem PAGE z następną elektroelucją opisaną wyżej. Gen z lepkimi końcami 5 EcoRI. zawierający system trp promotor-operator identyfikowano w procesie opisanym poniżej za pomocą wprowadzenia fragmentów do wrażliwego na tetracyklinę plazmidu 6, który po wprowadzeniu promotora-operatora staje się odporny na działanie tetracykliny.

B. Tworzenie plazmidu pBRHtrp wykazującego odporność na tetracyklinę pod kontrolą systemu trp promotor-operator i identyfikacja oraz amplifikacja fragmentu DNA 5, zawierającego system trp promotor-operator, wyizolowanego sposobem opisanym w części A.

Plazmid (6) pBRHl (R.I. Rodrigues i współ., Nucleie Acids Research 6. 3267-3287 (1979)) wykazuje odporność na ampicylinę i zawiera gen odporności na tetracyklinę, ale ponieważ nie jest obecny promotor, dlatego nie wykazuje tej odporności. Plazmid jest wobec tego wrażliwy na działanie tetracykliny. Przez wprowadzenie układu promotor-operator w miejscu EolR, plazmid może stać się odporny na działanie tetracykliny.

pBRHl trawiono EcoRI i enzym usunięto stosując ekstrakcję fenolem z kolejną ekstrakcją chloroformem i wyodrębnienie z wody po wytrąceniu etanolem. Otrzymaną w wyniku cząsteczkę DNA 7, w oddzielnych reakcyjnych mieszaninach, łączono z każdym z trzech fragmentów DNA otrzymanych w części A i poddano działaniu ligazy T4DNA, w sposób już wcześniej opisany. DNA obecny w mieszaninie reakcyjnej został użyty w celu transformacji właściwego E. coli K-12 szczepu 294, K. Backman i współpr., Proc. Nat’l Acad, Sci. USA 73, 4174 - 4198 (1976)(ATCC nr 31448). za pomocą standardowych technik (V. Hershfield i współ., Proc. Nat’I Acad. Sci. USA 71, 3455-3459 (1974)) i bakterie hodowane na płytkach LB zawierających 20 gg/ml ampicyliny i 5 pg/ml tetracykliny. Wyselekcjonowano kolonie odporne na tetracyklinę i ampicylinę, wyizolowano plazmid DNA i potwierdzono obecność potrzebnego fragmentu na podstawie analizy enzymu restrykcyjnego. Powstały plazmid 8, oznaczony pBRHtrp, wykazuje ekspresję β-laktamazy, wywołującej odporność na ampicylinę i zawiera fragment DNA wraz z systemem trp promotor-operator i kodujący pierwszą proteinę powstałą w wyniku fuzji pierwszych sześciu aminokwasów trp lidera i ostatnich trzech aminokwasów trp E polipeptydu (ten polipeptyd oznaczono LE’) i drugą proteinę odpowiadającą w przybliżeniu pierwszej połowie trp D polipeptydu (ten polipeptyd oznaczono D’), i trzecią proteinę zakodowaną przez gen odpowiadający odporności na tetracyklinę.

C. Geny klonowania, dla różnych końcowych produktów polipeptydowych i ich ekspresji w postaci protein zfuzjowanych, zawierających produkt końcowy i dający się odszczepić w specyficzny sposób prekursor trp D polipeptydu (fig. 2).

Fragment DNA, zawierający trp promotor-operator i kodony LE’ i D’ polipeptydów otrzymano z plazmidu pBRHtrp i włączono do plazmidów zawierających strukturalne geny różnych pożądanych polipeptydów i zilustrowano przykładem somatostatyny (fig. 2).

pBRHtrp trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI i powstały fragment 5 izolowano za pomocą PAGE i elektroelucji. Wytrawiony EcoRI plazmid pSOM 11 (K. Itakura i współ.. Science 198, 1056 (1977); Publikacja patentowa Wielkiej Brytanii nr 2007676 A połączono z fragmentem 5. Mieszaninę poddano działaniu ligazy T4DNA w sposób opisany powyżej i powstały DNA transformowano w E. coli K-12 szczep 294, sposobem opisanym powyżej. Transformowane bakterie selekcjonowano na płytkach zawierających ampicylinę. Powstałe kolonie odporne na działanie ampicyliny poddano selekcji przez hybrydyzację kolonii (M. Gruenstein i współ., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 72,3951-3965 (1975) stosując w roli próbnika fragment 5, zawierający trp promotor-operator, wyizolowany z pBPHtrp, który oznakowano ra^dioaktywn^ym P³². Te kolonie^{, k}tóre wy^kazafy ^pozytywną reakcję zostafy wyse^le^kcJonowane^, wyizolowano plazmidowy DNA i oznaczono uporządkowanie wstawionych fragmentów za pomocą analizy restrykcyjnej z zastosowaniem enzymów Bgffl i BamHI w podwójnym trawie162 227 niu. Komórki E. coli 294 zawierające plazmid oznaczony jako pSOM 7 Δ 2, 11 posiadający fragment trp promotor-operator w pożądanym uporządkowaniu hodowano na podłożu LB zawierającym 10 gg ampicyliny. Komórki hodowano do optycznej gęstości 1 (przy 550 nM). odwirowywano i ponownie zawieszano na podłożu M9 w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu. Komórkom pozwolono rosnąć w ciągu 2-3 godzin do osiągnięcia optycznej gęstości 1, następnie poddawano lizie i komórkową proteinę w całości analizowano za pomocą elektroforezy SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu) - mocznik (15 procent) na poliakryloamidowym żelu (J.V. Maizel Jr. i współ., Meth Viral 5. 180-246 (1971).

Rysunek fig. 3 ilustruje wynik analizy protein na żelu, w której proteiny z różnych hodowli są rozdzielone według wielkości. Gęstość poszczególnych prążków odpowiada ilości w jakiej występuje odpowiednia proteina. Na rysunku fig. 3 pasma 1 i 7 są pasmami kontrolnymi i zawierają różne proteiny o wcześniej określonej wielkości służące jako punkty odniesienia. W paśmie 2 i 3 segregowane są proteiny komórkowe z hodowli E. coli 294 transformowanej plazmidem pSOm 7Δ2 i rosnącej na podłożu LB (pasmo 2) i M9 (pasmo3). Pasma 4 i 5 rozdzielają proteiny komórkowe uzyskane z podobnych komórek transformowanych plazmidem ekspresji tymozyny ρΤ1ια7Δ2 otrzymanym w identyczny z tutaj opisanym sposobem, wychodząc z plazmidu pThcal (patrz zgłoszenie patentowe w Stanach Zjednoczonych Ameryki przez Roberto Crea i Ronald B. Wetzel złożone 28 lutego 1980 roku, a dotyczące wytwarzania tymozyny alfa 1, który podano tu jako odnośnik. Pasmo 4 przedstawia rozdział proteiny komórkowej z E. coli 294/pThia7A2 hodowanej na podłożu LB, podczas gdy pasmo 5 przedstawia rozdział proteiny komórkowej z tego samego transformanta hodowanej na podłożu M9. Pasmo 6 stanowi inny wzorzec protein hodowli E. coli 294/pBR322 na podłożu LB.

Porównanie z wzorcami wskazuje na występowanie dwóch bardzo wyraźnych pasm w pasmach 3 i 5, o wielkości oczekiwanej w przypadku ekspresji proteiny powstałej w wyniku fuzji i zawierającej polipeptyd-D’ i odpowiednio, somatostatynę i tymozynę (inne plamy występujące w przewodzie oznaczają polipeptyd LE’, wytworzony w wyniku delecji atenuatora). Rysunek fig. 3 potwierdza to, że w podłożu bogatym w trytofan ekspresja jest zahamowana, ale pojawia się znowu w warunkach deficytu tryptofanu.

D. za pomocą bromccyjutu oraz radioimmunologiczna próba prodidttu hormonalnego.

W przypadku tymozyny jak i somatostatyny całość komórkowych protein rozszczepiono za pomocą bromocyjanu, a produkty wyodrębniono i po suszeniu zawieszono w buforze i zanalizowano stosując radioimmunologiczną próbę, potwierdzającą ekspresję produktu identycznego immunologicznie z odpowiednio, somatostatyną i tymozyną. Rozszczepienie bromocyjanem przeprowadzono w sposób opisany w D.V. Goeddel i współpr. w Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 76, 106-110(1979).

II. Konstrukcja plazmidów służących do bezpośredniej ekspresji heterologicznych genów pod kontrolą trp systemu promotor- operator.

Strategia bezpośredniej ekspresji obejmuje tworzenie plazmidu zawierającego unikalne miejsce restrykcji w położeniu dystalnym w stosunku do wszystkich kontrolnych elementów trp operonu, do którego heterologiczny gen może być doczepiony i zwiększa relację do sekwencji trp lidera polipeptydowego rybosomowego miejsca przyłączenia. Próbę bezpośredniej ekspresji zilustrowano na przykładzie ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu.

gg plazmidu pSOM 7Δ2, pocięto za pomocą EcoRI i wyodrębniono fragment 5 DNA, zawierający genetyczne elementy tryptofanu i wyodrębniono stosując PAGE i elektroelucję.

gg tego fragmentu trawiono 2 jednostkami restrykcyjnej endonukleazy Taq I w ciągu 10 minut i w temperaturze 37°C, w ten sposób, że średnio tylko jedno z pięciu miejsc Taq I w każdej cząsteczce zostało przecięte. Tę częściowo wytrawioną mieszaninę fragmentów rozdzielono za pomocą PAGE i około 300 par zasad (rysunek fig. 4) fragmentów 12 posiadających jeden koniec BcoRI i jeden koniec Taq I wyodrębniono za pomocą elektroelucji. Odpowiadające cięciu miejsce Taq I mieści się pomiędzy miejscem startu transkrypcji i miejscem startu translacji i oddalone jest o 5 nukleotydów licząc w górę od kodonu ATG trp przewodniego peptydu. Sekwencję DNA wokół tego miejsca pokazano na rysunku fig. 4. Postępując jak opisano wyżej można wyodrębnić fragment zawierający wszystkie kontrolne elementy trp operonu tzn. system promotor-operator, sygnał rozpoczęcia transkrypcji i trp rybosomowe miejsce przyłączenia.

162 227

Pozostałość Taq I przy końcu 3' wytworzonego fragmentu przyległego do sygnału rozpoczęcia translacji trp przewodniej sekwencji przeprowadzono następnie w miejsce Xbal, co pokazano na rysunku fig. 5. Dokonano tego za pomocą ligacji fragmentu 12, otrzymanego sposobem opisanym powyżej z plazmidem zawierającym unikalne (tylko jedno miejsce) EcoRJ i unikalne miejsce Xbal. W tym celu można zastosować w zasadzie każdy plazmid, zawierający kolejno replikon. cechę umożliwiającą wyselekcjonowanie, taką jak odporność na antybiotyki, i miejsca EcoRI, Xbal i BamHI. Tak więc, na przykład, miejsce Xbal można wprowadzić pomiędzy miejsce EcoRI i BamHI plazmidu pBR322 (F. Bolivar i współpr., Gene 2, 95-119 (1977)). na przykład w drodze cięcia za pomocą Hind HI w unikalnym miejscu Hind ΠΙ plazmidu z kolejnym trawieniem nukleazą specyficznej nici powstałych lepkich końców i ligazą tępego końca dwuniciowego syntetycznego nukJeotydu, zawierającego miejsce rozpoznania takie jak CCTCTAGAGG. Z drugiej strony można zastosować fragmenty DNA pochodzenia naturalnego, co zrobiono w niniejszym przypadku, zawierające pojedyncze miejsce Xbal pomiędzy produktami cięcia EcoRI i BamHI. Produkt trawienia EcoRI i BamHI wirusowego genomu (hepatitis B) zapalenia wątroby B otrzymano w zwyczajny sposób i wszczepiono do miejsc EcoRI o BamHI plazmidu pGH6 (B.V. Goeddel i współpr.. Naturę 281,544 (1979) wcelu utworzenia plazmidu pHS32. Plazmid pHS32 rozszczepiono za pomocą Xbał, wyekstrahowano fenolem, chloroformem i wytrącono etanolem. Po czym działano na niego 1 μΐ polimerazy I E. coli, fragmentem Klenow’a (Boehringer-Mannheim) w 30 μΐ buforu polimerazy (50 mM fosforanu potasowego pH 7.4, 7 mM MgCh, 1 mM β-merkaptoetanolu) zawierającym 0,1 mM dl i 'Pi 0,1 mM dCTP w ciągu 30 minut w temperaturze 0°C, następnie dwie godziny w temperaturze 37°C. W wyniku tego działania powstały 2 z 4 nukleotydów komplementarnych wobec wystającego końca 5’

miejsca cięcia Xbał:
5’	CTAGA ...........	5’	CTAGA
3'	T .....	3’	TCT

Wprowadzono dwa nukleotydy dC i dT otrzymując koniec z dwoma wystającymi 5’ nukleotydami. Tą liniową pozostałość plazmidu pHS32 (po ekstrakcji fenolem i chloroformem i wyodrębnieniu z wody po wytrąceniu etanolem) rozszczepiono EcoRł. Duży plazmidowy fragment 13 oddzielono od mniejszego fragmentu EcoRI-XbaI w drodze PAGE i wyodrębniono po elektroelucji.

Ten fragment DNA z pHS32 (0,2 pg) poddano ligacji w warunkach podobnych do opisanych powyżej, w celu otrzymania fragmentu EcoRI-Taq I tryptofanowego operonu (-0,01 pg), jak pokazano na rysunku fig. 5. W tym procesie wystający koniec Taq I poddaje się ligacji do Xbal, pozostającego wystającego końca, chociaż nie jest on całkowicie sparowany zasadowo wg Watsona-Cricka:

................... T CTAGA ------------- ------------- TCTAGA ------------------------------------- AGC TCT------------ ------------ AGCTCT-------------------Część tej mieszaniny reakcyjnej powstałej w wyniku ligacji transformuje się do komórek

E. coli 294, jak to opisano w części I zamieszczonej powyżej, ogrzewa i hoduje na płytkach LB zawierających ampicylinę. Wyselekcjonowane 24 kolonie, hodowane w 3 ml pożywki LB i wyodrębniono plazmid. Odkryto, że 6 z nich posiadało miejsce Xbal zregenerowane poprzez DNA E. coli katalizujący, reperację i replikację:

............................. TCTAGA -------------- ----------- TCTAGA ---------------........................... AGCTCT -------------- -........... AGATCT----------------Stwierdzono, że plazmidy te poddają się cięciu zarówno przez EcoRI jak i Hpal, dając w wyniku spodziewane fragmenty. Jeden plazmid 14, oznaczony jako pTRpl4, zastosowano do ekspresji heterologicznego polipeptydu, jak przedstawiono niżej.

Plazmid pHGH 107 (oznaczony 18 na rysunku fig. 6, D.V.Goeddel i współpr., Naturę, 281, 544, 1979) zawiera gen ludzkiego hormonu wzrostu, zbudowany z 23 aminokwasowych

162 227 kodonów wytworzonych z fragmentów syntetycznego DNA i 163 aminokwasowych kodonów otrzymanych z komplementarnego DNA produkowanego w drodze odwróconej transkrypcji informacyjnego RnA ludzkiego hormonu wzrostu. Ten gen 21, chociaż traci kodony sekwencji pre ludzkiego hormonu wzrostu, zawiera kodon ATG inicjacji translacji.

Gen wyizolowano z 10 gg pHGH 107 po działaniu EcoRI i kolejno fragmentu polimerazy Klenowa E. coli i dTTP i dATP, w sposób opisany powyżej. Po ekstrakcji fenolem i chloroformem i wytrąceniu etanolem, na plazmid podziałano BamHI. Patrz rysunek fig. 6. Fragment 21 zawierający ludzki hormon wzrostu (HGH) wyizolowano za pomocą PAGE i elektroelucji. Wytworzony fragment DNA również zawiera pierwsze 350 nukleotydów strukturalnego genu odpowiadającego za odporność na tetracyklinę, ale nie posiada tetracyklinowego systemu promotor-operator tak, że po późniejszym klonowaniu w plazmid ekspresji, plazmidy zawierające insercję mogły być zlokalizowane dzięki przywróceniu oporności wobec tetracykliny. Ponieważ koniec EcoRl fragmentu 21 został zapełniony za pomocą działania polimerazą 1 Klenowa. fragment ten posiada jeden koniec tępy i jeden koniec lepki, zapewniający lepszą orientację w przypadku insercji tego ostatniego do plazmidu ekspresji. Patrz rysunek fig. 6.

Przygotowano następnie plazmid ekspresji pTrpl4 w celu otrzymania fragmentu zawierającego gen HGH wytworzony jak wyżej. Dlatego pTrpl4 trawiono Xbal i powstałe lepkie końce poddano działaniu polimerazy I Klenowa z zastosowaniem dATP, dTT P, dGTP i dCTP. Po ekstrakcji fenolem i chloroformem i wytrąceniu etanolem otrzymany DNA 16 poddano działaniu BamHI i wytworzony duży fragment plazmidu 17 wyodrębniono stosując PAGE i elektroelucję. Fragment 17 otrzymany z plazmidu pTrp 14 posiadał jeden koniec tępy i jeden koniec lepki, pozwalając na rekombinację właściwie zorientowaną z fragmentem 21 zawierającym gen HGH, poprzednio opisanym.

Fragmenty 21 zawierające gen HGH i fragment 17 pTrpl4AXba-BamHI połączono i związano razem w warunkach podobnych do opisanych powyżej. Zapełnione końce Xbal i EcoRI związano razem w drodze łączenia tępych końców w celu odtworzenia miejsca Xbal i EcoRI:

Xbal zapełnione EcoRI zapełnione Inicjacja genu HGH

........... TCTAG AATTCTATG .................. T CTAG AATTCTATG...........

+ -------->

............ AGATC TTAAGATAC -—............. AGATC TTAA GATAC...........

X bal EcoRI

Konstrukcja taka odbudowuje również gen odporności na tetracyklinę. Ponieważ plazmid pHGH 107 wykazuje odporność na tetracyklinę z promotora leżącego w górę, odliczając od genu HGH (lac promotor) to ta konstrukcja 22, oznaczona jako pHGH 207, pozwala na ekspresję genu odporności tetracyklinowej pod kontrolą tryptofanowego systemu promotor-operator. Dlatego mieszaninę powstałą w wyniku ligacji transformowano do E. coli 294 i kolonie selekcjonowano na płytkach LB zawierających 5 gg/ml tetracylkiny. W celu uzyskania bezpośredniej ekspresji ludzkiego hormonu wzrostu z plazmidu pHGH 207, całkowitą ilość komórkowej proteiny otrzymanej z hodowli E. coli 294/pHGH 207, którą hodowano do optycznej gęstości równej 1 na podłożu LB zawierającym 10 gg/ml ampicyliny, rozcieńczono dziesięciokrotnie na podłożu M9, i hodowano ponownie do uzyskania optycznej gęstości 1, poddano elektroforezie SDS na żelu, jak w przypadku opisanym w części I zamieszczonej powyżej, i porównano z danymi z podobnej elektroforezy uzyskanymi dla ludzkiego hormonu wzrostu otrzymanego przez innych badaczy (D. V. Goeddel i współpr., Naturę, 281,544 (1979)). Rysunek fig. 7 przedstawia fotografię otrzymanego zabarwionego żelu, gdzie: Pasmo 1 i 7 zawierają proteinowe znaczniki o różnej znanej wielkości; Pasmo 2 jest pasmem kontrolnym rozdzielającym całą ilość komórkowej proteiny z hodowli E. coli 294/pBR322; Pasmo 3 przedstawia rozdział protein z hodowli E. coli 294/pHGH 107 prowadzonej na podłożu lB; Pasmo 4 przedstawia rozdział protein z hodowli E. coli 294/pHGH 107 prowadzonej na podłożu M9; Pasmo 5 przedstawia rozdział protein z hodowli E. coli 294/pHGH 207 prowadzonej na podłożu LB; Pasmo 6 przedstawia rozdział proteiny z hodowli E. coli 294/pHGH 207 prowadzonej na podłożu M9. Gęsty prążek w paśmie 6 odpowiada ludzkiemu hormonowi wzrostu, co wynika z porównania z podobnymi prążkami w Pasmach 2-4. Jak już wspomniano w opisie, organizm E.

162 227 coli 294/pHGH 207 wzrastając na podłożu LB bogatym w tryptofan produkuje mniejszą ilość ludzkiego hormonu wzrostu, w wyniku interakcji tryptofanowego układu represor-operator, a w przypadku wzrostu na podłożu M9 produkuje o wiele więcej HGH niż E. coli 294/pHGH 107 dzięki wprowadzeniu silniejszego systemu VS tryptofanowego promotor-operator w porównaniu z systemem lac- promotor-operator w pHGH 107.

ΙΠ. Tworzenie plazmidu o szerokiej ekspresji w celu bezpośredniej ekspresji genów heterologicznych zachodzącej pod kontrolą systemu tryptofanowego promotor-operator.

Plazmid pHGH 207 wytworzony w poprzednim rozdziale, został użyty do wytworzenia fragmentu DNA, zawierającego kontrolne elementy tryptofanowego operonu (z usuniętym atenuatorem) i stworzenia plazmidowego wektora ekspresji odpowiedniego do bezpośredniej ekspresji różnych strukturalnych insercji genu. Strategia wytworzenia plazmidu o szerokiej ekspresji polega na usunięciu tryptofanowego obszaru kontroli z pHGH 207 w drodze trawienia EcoRI i insercji do plazmidu pBRH 1 wytrawionego EcoRI użytego w części I powyżej. pBRH 1 jak już wcześniej wspomniano, jest plazmidem odpornym na działanie ampicyliny, zawierającym gen odporności wobec tetracykliny, który jest jednak wrażliwy na tetracyklinę z powodu nieobecności odpowiedniego systemu operator- promotor. Powstały plazmid pHKY 1, którego konstrukcję bardziej szczegółowo opisano poniżej i pokazano na rysunku fig. 8, jest odporny zarówno na ampicylinę jak i na tetracyklinę, zawiera tryptofanowy system promotor-operator, brak mu jednak tryptofanowego ate.nuatora, i zawiera unikalne miejsce Xbal dystalne w stosunku do tryptofanowego systemu promotor-operator. Tryptofanowy operator-promotor i unikalne miejsce Xbal są ograniczone miejscami EcoRI, tak, że fragment zawierający promotor-operator Xbal można usunąć w celu insercji do innych strukturalnie plazmidów zawierających gen. Z drugiej strony strukturalne heterologiczne geny można wprowadzić, albo w miejsce Xbal lub (po częściowym trawieniu EcoRI) do miejsca EcoRI, dystalnego w stosunku do obszaru tryptofanowej kontroli, w każdym przypadku tak, aby dostać się pod kontrolę systemu tryptofanowego operator-promotor.

Plazmid pHGH 207 poddano trawieniu z EcoRI i wyodrębniono EcoRI fragment 23, zawierający trp promotor, stosując PAGE z kolejno następującą elektroelucją.

Plazmid pBRHI trawiono EcoRI i na odciete końce działano bakteryjną alkaliczną fosfatazą (BAP) (lpg, w 50 mM tris pH 8 i 10 mM MgCb, 30 minut, temperatura 65°C) w celu usunięcia grup fosforanowych na wystających końcach EcoRI. Nadmiar bakteryjnej alkalicznej fosfatazy usunięto stosując ekstrakcję fenolem, chloroformem i wytrącanie etanolem. Powstały liniowy DNA 7a, z powodu braku grup fosforanowych na jego wystających końcach w trakcie procesu ligacji będzie akceptował jedynie msercje, których komplementarne lepkie końce są fosforylowane, ale nie będzie ulegał sam recyrkulacji, pozwalając na łatwiejsze wykrycie plazmidów, zawierających insercje. Fragment EcoRI otrzymany z pHGH 207 i liniowego DNA otrzymanego z pBRHI połączono w obecności ligazy T4 w sposób poprzednio opisany i związano. Część powstałej mieszaniny transformowano do E. coli szczep 294, jak powyżej opisano i hodowano na płytkach na podłożu LB zawierającym 5 μg/ml tetracykliny, i wyselekcjonowano 12 kolonii odpornych na działanie tetracykliny. Wyizolowano plazmid z każdej kolonii i zbadano na obecność insercji DNA za pomocą analizy restrykcyjnej endonukleazy z zastosowaniem EcoRI i Xbal. Jeden plazmid zawierający wstawkę nazwano pHKYl.

IV. Tworzenie plazmidu zawierającego tryptofanowy operon i zdolnego do ekspresji podatnej na specyficzne rozszczepienie proteiny powstałej w wyniku fuzji i składającej się z 6 aminokwasów peptydu trp lidera i ostatniej trójki trp E polipeptydu (oznaczonego LE’) i z produktu heterologicznego strukturalnego genu.

Tworzenie plazmidu zdolnego do ekspresji LE’ proteiny powstałej w wyniku fuzji przebiega w następujących etapach:

a. Przyjęcie fragmentu genu, zawierającego kodony do dystalnego obszaru LE’ polipeptydu, posiadającego lepkie końce Bgl Π i EcoRI odpowiednio przy końcu 5’ i końcu 3’ kodującej nici.

b. Wyeliminowanie z plazmidu SOM 7Δ2 kodonów dystalnego obszaru fragmentu genu LE’ i fragmentu trp D genu i insercja fragmentu utworzonego w etapie 1, odbudowanie sekwencji LE’ kodonu tuż obok heterologicznego genu odpowiadającego za somatostatynę.

162 227

1. Jak przedstawiono na rysunku fig. 9a, plazmid pSOM 7Δ2 trawiono w obecności Hind III z kolejnym trawieniem za pomocą lambda egzonukleazy (egzonukleazy 5' do 3') w warunkach dobranych tak. aby nastąpiło trawienie poza miejscem restrykcji Bgl II w obrębie obszaru kodującego LE'. 20 μg pSOM 7Δ2 wytrawionego Hind Π1 rozpuszczono w buforze (20 mM bufor glicynowy, pH 9,6 1 mM MgCb. 1 mM β -merkaptoetanolu). Na powstałą mieszaninę działano 5 jednostkami lambda egzonukleazy w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem, ekstrahowano chloroformem i wytrącono etanolem.

W celu ostatecznego utworzenia reszty EcoRI przy dystalnym końcu fragmentu genu LE' zs^yntet^yzowanoprimerAp^CCTGTG^CATGAT stosując depszon^ą metodę trójestru ^fos^forowe^go (R Creai współpr.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 75 5765 (1978)) i hybrydyzowano z pojedynczo zakończonym końcem fragmentu genu LE’ otrzymanego w wyniku trawienia w obecności lambda egzonukleazy. Hybrydyzację przeprowadzono w opisany poniżej sposób.

pg produktu trawienia Hind ΙΠ plazmidu pSOM 7Δ2 na który działano lambda egzonukleazą, rozpuszczono w 20 μΐ wody i połączono z 6 μΐ roztworu zawierającego około 80 pikomoli opisanego powyżej 5-fosforylooligonukleotydu. Zsyntetyzowany fragment zhybrydyzowano z końcem 3’ sekwencji kodującej LE’ i pozostałą część wolnej nici zapełniono stosując procedurę Klenow polimerazy I opisaną powyżej, z zastosowaniem dATP, dlTP, dGTP i dCTP.

Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 50°, a następnie schłodzono wolno do 10°C. po czym dodano 4 μΐ enzymu Klenowa. Mieszaninę reakcyjną inkubowano 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie 30 minut w temperaturze 37°C, po czym reakcję zatrzymano dodajac 5 μΐ 0,25 molamego roztworu EDTA. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem, chloroformem, a następnie wytrącono etanolem. DNA poddano następnie ozszczepieniu w obecności enzymu restrykcyjnego Bgl Π. Fragmenty rozdzielono za pomocą PAGE. Autoradiogram żelu wykazuje obecność fragmentu znaczonego ³²P o spodziewanej długości około 470 bp. który wyodrębniono za pomocą elektroelucji. Jak już wcześniej zauważano ten fragment LE’ (d) posiada koniec Bgl Π i tępy koniec pokrywające się z początkiem primeru.

Plazmid pTtal 1 opisany w części I (C) nosi w sobie strukturalny 'gen tymozyny alfa 1 zaczepiony przy jego 5’ końcu nici kodującej w miejscu EcoRl przy 3’ końcu w miejscu BamHI. Jak widać z rysunku fig. 9, gen tymozyny zawiera również miejsce Bgl Π. Plazmid pThal zawiera również gen specyficznej odporności na ampicylinę. W celu utworzenia plazmidu zdolnego do przyjęcia fragmentu LE’ (d) sporządzonego zgodnie z podanym powyżej opisem, pThal poddano trawieniu z EcoRl z kolejnym etapem reakcji polimerazy Klenowa z dTTP i dATP w celu uzyskania tępych zakończeń EcoRI.

W wyniku trawienia Bgl Π otrzymanego produktu powstaje liniowy fragment DNA 33, zawierający gen odpowiedzialny za odporność wobec ampicyliny i na przeciwległych końcach, lepką pozostałość Bgl Π i tępy koniec. Powstały produkt może ulec recyrkularyzacji w reakcji z fragmentem LE’(d) zawierającym lepki koniec Bgl Π i tępy koniec, w obecności T4 ligazy, tworząc plazmid pTrp24 (rysunek fig. 9b). W taki sposób uwalnia się miejsce Eco RI w położeniu, w którym następuje ligacja tępego końca.

Jak przedstawiono na rysynku fig. 10, kolejne trawienie pTrp 24 za pomocą Bgl Π i EcoRl. połączone z PAGE i elektroelucją daje w wyniku fragment, posiadający kodony polipeptydu LE’ (d) z końcem lepkim Bgl II i z końcem lepkim EcoRI przylegającym do jego 3’ kodującego końca. Fragment LE’ (d) 38 może być klonowany do miejsca Bgl Π plazmidu pSOM 7Δ2 w celu utworzenia proteiny powstałej z fuzji polipeptydu LE’ i somatostatyny pod kontrolą tryptofanowego systemu promotor-operator, jak to pokazano na rysunku fig. 10. W celu dokonania tego pożądane jest (1) częściowe trawienie EcoRl pSOM 7Δ2 w celu cięcia miejsca EcoRl dystalnego w stosunku do tryptofanowego systemu promotor- operator, jak pokazano na rysunku fig. 10, i (2) dalszy wybór sekwencji primera (rysunek fig. 9) w celu pozostawienia systemu odczytywania kodonu i odbudowania miejsce cięcia EcoRl.

W tym celu, 16 pg plazmidu pSOM 7Δ2 rozpuszczono w 200 μΐ buforu zawierającego 20 mM Tris, pH 7,5,5 mM MgCb, detergentu 0,02 NP40 100 mM NaCl, i podziała 0,5 jednostkami EcoRl. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie estrahowano fenolem, ekstrahowano chloroformem i wytrącono etanolem, a następnie trawiono

162 227

Bgl II. Powstały większy fragment 36 wyodrębniono za pomocą PAGE, a następnie elektroelucji. Fragment ten zawiera kodony LE’(p) położonego bliżej końca LE’ polipeptydu, tzn. w górę licząc od miejsca Bgl II. Fragment 36 poddano następnie wiązaniu z fragmentem 38 w obecności T+DNA ligazy w celu utworzenia plazmidu pSOM 7Δ2Δ4, który w wyniku transformacji do E. coli 294 tak jak opisano wyżej wydajnie produkuje proteinę powstałą w wyniku fuzji w pełni zrekonstruowanego polipeptydu LE’ i somatostatyny pod kontrolą tryptofanowego systemu promotor-operator. Proteinę powstałą w wyniku fuzji, z której można oderwać w specyficzny sposób somatostatynę, dzięki obecności metioniny na końcu 5' sekwencji somatostatyny, rozdzielono za pomocą SDS elektroforezy na żelu poliakryloamidowym w sposób opisany powyżej. Produkt w postaci tej proteiny tworzy najbardziej wyraźny prążek w Paśmie 6 przedstawionym na rysunku fig. 11.

V. Tworzenie systemu ekspresji dla fuzji trp LE' polipeptydu w którym wprowadza się odporność na tetracyklinę pod kontrolą tryptofanowego promotora-operatora.

Strategia tworzenia nośnika ekspresji zdolnego do otrzymywania szerokiego wachlarza heterologicznych polipeptydowych genów dla ekspresji w postaci trp LE’ powstałych w wyniku fuzji protein pod kontrolą tryptofanowego operonu pociąga za sobą konstrukcję plazmidu o następujących właściwościach:

1. Odporność na tetracyklinę, która zanikałaby w przypadku gdyby system promotor-operator kontrolujący geny warunkujące tę oporność został usunięty.

2. Usuwanie systemu promotor-operator kontrolującego odporność na tetracyklinę i recyrkularyzowanie przez ligację do heterologicznego genu i systemu tryptofanowego promotora-operatora we właściwej fazie odczytywania, co przywraca się odporność na tetracyklinę, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja plazmidów, zawierających włączony heterologiczny gen. W związku z charakterem planowanych insercji, obiekt powinien tworzyć liniowe części DNA, posiadające Pst pozostałość przy jego końcu 3' i Bgl Π pozostałość przy jego 5’ końcu, przyłączając gen zdolny do specyficznej odporności na tetracyklinę w przypadku poddania kontroli systemu promotor-operator.

Jak przedstawiono na rysunku fig. 12, plazmid pBR322 poddano trawieniu z Hind HI i wystające Hind ΠΙ końce kolejno trawiono SI nukleazą. Trawienie SI nukleazą polega na działaniu na 10 pg pBR322 rozszczepionego Hind ΙΠ w 30 pl SI buforu (0,3 M NaCl. 1 mM ZnCh, 25 mM octanu sodu, pH 4,5) 300 jednostkami SI nukleazy w ciągu 30 minut w temperaturze 15°C. Reakcję przerwano dodając 1 pl roztworu hamującego działanie 30 X SI nukleazy (0,8 M zasady Tris, 50 mM EDTA). Mieszaninę ekstrahowano fenolem, chloroformem i wytrącono proteinę etanolem, a następnie trawiono EcoRI jak opisano wyżej i otrzymano duży fragment 46 stosując PAGE i elektroelucję. Otrzymany fragment posiada pierwszy EcoRI lepki koniec i drugi tępy koniec, którego nić kodująca zaczyna się od nukleotydu tymidyny. Niżej przedstawia się jak wytrawiona pozostałość SI trawiona Hind HI, zaczynająca się od tymidyny może być przyłączona do pozostałości Bgl Π, na którą działano polimerazą Klenowa w celu rekonstrukcji restrykcyjnego miejsca Bgl Π.

Plazmid pSOM 7Δ2 przygotowany w sposób podany w części I poddano trawieniu Bgl Π i wytworzono Bgl Π lepkie końce przemieniono w dwuniciowe za pomocą procedury z zastosowaniem polimerazy Klenowa I, stosując wszystkie 4 dezoksynukleotydowe trójfosforany. Rozszczepienie EcoRI powstałego produktu z kolejnym stosowaniem PAGE i elektroelucji małego fragmentu 42 daje liniową część DNA zawierającego tryptofanowy, system promotoroperator i kodony o LE’ sekwencji położonej w górę w stosunku do miejsca Bgl U (LE’ (p)). Produkt posiadał koniec EcoRI i tępy koniec, powstały w wyniku wypełnienia w miejscu Bgl II. Miejsce Bgl Π rekonstruuje się w wyniku połączenia tępego końca fragmentu 42 z tępym końcem fragmentu 46. W ten sposób dwa fragmenty uległy ligacji w obecności T 4 DNA ligazy, tworząc zamknięty plazmid pHKY 10 (patrz rysunek fig. 12), który namnożył się w wyniku transformacji do komórek E. coli szczepu 294. Komórki odporne na działanie tetracykliny noszące zrekombinowany plazmid pHKY 10 rozmnożono, plazmidowy DNA wyestrahowano, i trawiono kolejno Bgl Π i Pst, a następnie wyodrębniono za pomocą PAGE i elektroelucji wielki fragment, liniową część DNA posiadającą lepkie końce Pst i Bgl Π. Ten fragment DNA 49 zawiera początek replikacji i kolejno próbowany znajduje zastosowanie w roli pierwszego składnika w konstrukcji plazmidów, w których zarówno geny kodujące trp LE' polipeptydy

162 227 protein powstałych w wyniku fuzji, jak i gen odporności tetracyklinowej są pod kontrolą systemu tryptofanowego promotor-operator.

Plazmid pSOM 7Δ2Δ4, otrzymany sposobem opisanym wcześniej w części IV, można poddać przemianom w celu uzyskania drugiego składnika systemu umożliwiającego otrzymywanie szerokiego wachlarza heterologicznych genów strukturalnych. Jak pokazano na rysunku fig. 13, plazmid poddano częściowemu trawieniu EcoRI (patrz część IV) z kolejnym trawieniem Pst i wyodrębniono fragment 51 zawierający trp system promotor-operator, stosując PAGE i elektroelucję. Częściowe trawienie EcoRJ było konieczne dla otrzymania fragmentu, który został odszczepiony w sąsiedztwie końca 5' genu somatostatyny, ale nie został odszczepiony w miejscu EcoRJ występującym pomiędzy genem odpowiadającym za odporność ampicylinow^ i trp systemu operator-promotor. Odporność ampicylinowa stracona w wyniku cięcia Pst I w ap^K genie mogłaby być zachowana w wyniku ligacji z fragmentem 51.

Trzeci składnik, strukturalny gen tymozyny alfa 1, otrzymano w wyniku trawienia EcoRJ i BamHI plazmidu pTHal. Fragment 52 oczyszczono za pomocą PAGE i elektroelucji.

Trzy fragmenty genowe 49, 51 i 52 można teraz poddać ligacji w odpowiednim układzie, jak pokazano na rysunku fig. 13, w celu sformowania plazmidu ρΊΤα7Δ1Δ4, który będzie można wyselekcjonować dzięki zachowaniu odporności na tetracyklinę i ampicylinę. Plazmid po transformacji do E. coli szczepu 294 hodowli w warunkach opisanych w części I. wykazuje ekspresję trp LE’ polipeptydowej. proteiny, która powstała w wyniku fuzji, z której można specyficznie odszczepić tymozynę alfa 1, działaniem bromocyjanu. W przypadku, kiedy inne strukturalne heterologiczne geny posiadające końce EcoRI i BamHI podda się podobnej ligacji ze składnikami pochodzącymi z pHKY 10 i pSOM 7Δ2Δ4, to również w wydajny sposób będzie można otrzymać trp LE’ polipeptydowe proteiny powstałe w wyniku fuzji. Rysunek fig. 11 ilustruje rozdział za pomocą elektroforezy SDS na poliakrylowym żelu całości komórkowych protein z transformantów E. coli szczepu 294, najciemniejsze prążki w każdym przypadku oznaczają proteiny powstałe w wyniku fuzji, wytworzone pod kontrolą systemu tryptofanowego promotor-operator. Na rysunku fig. 11, pasmo 1 jest pasmem kontrolnym, które segreguje całą ilość proteiny komórkowej z E. coli 294/pBR322. Pasmo 2 zawiera somatostatynowy produkt powstały w wyniku fuzji, z plazmidu pSOM 7Δ2Δ4 otrzymanego sposobem z części IV. Pasmo 3 przedstawia produkt ekspresji pSOM 7Δ1Δ4 zawierający somatostatynę. Pasmo 4 zawiera produkt ekspresji ρΊΉα7Δ1Δ4, podczas gdy pasmo 5 zawiera produkt ekspresji plazmidu otrzymanego podczas reakcji ligacji fragmentów otrzymanych z pHKY-10 i pSOM 7Δ2Δ4 z genem strukturalnym ograniczonym EcoRJ/BamHI kodującym ludzką proinsulinę i przygotowanym przez nas. Pasmo 6 i 7 odpowiednio zawierają w postaci najciemniejszego prążka, trp LE’ polipeptydową proteinę powstałą w wyniku fuzji, z której można odszczepić łańcuch B i A ludzkiej insuliny. Strukturalne geny insuliny B i A otrzymano w drodze trawienia EcoRI i BamHI odpowiednio plazmidów pEBI i pIAl 1, których konstrukcję opisano w D.V. Goeddel i współpr., Proc. Nat’l Acd. Sci. USA 76,106 (1979).

Pasmo 8 zawiera znaczniki wielkości.

Jakkolwiek w niniejszym opisie wynalazku posłużono się E. coli, to w roli komórek gospodarza można zastosować inne Enterobacteriacae w celu ekspresji i jako źródło trp operonów, spośród których można wymienić jako przykładowe Salmonella typhimurium i Serratia marcesans. Wynalazek nie ogranicza się do tych korzystnych opisanych przykładów i w pełni zawarty jest w treści załączonych zastrzeżeń patentowych.

162 227

i Hin dm

1S, jednoniciowa nuklsaia 45

FIG.13

PSOM₇a2a4 I Eco R1 | czeóciowe trawienie

FIG.12

162 227

Air. //.

FIG.10

162 227

la) Trawieni Λ eg2onukleoza 5 'do 3 dopełniacie?) mci dla. uzyskania le' strukturalnego genu (blAneeal oliqonutleotvd«, ^JJpttTGT6CATGAT (26), do dyjtahego końca mci kodującej LE' (CKlenow Pol I ^'doTpolirnerozagAdNTP'⁵ (i egzanukieaza 3 do5 ')

BglD koniec —^l- '^d) - Te^py koniec GATCT-ATCATGCACAGG

A-TAGTACGT6TCCp^J1

FlG.9a

162 227

FIG.8

3 4 3 6 7

Z/<?,7

162 227

FIG.6

Eco RI A*rrc

G

TAGI-Xbal

UP P o

ECORI

xt>al pTrp 14

FIG. 5

162 227 toq 1 trp mRNA Taq I < -- ,_= i

LAATCAGCTGTTGACAATrAATCATCeAAtCAenAACTACTACSCAAGnCACSTAlAAAAGtiGTlATCGACAATG L-- ....................1 rqbAJ^Am^Auł . tEAodoe '·, l Trp operator miejsce miqAC|i

Trp promotor przytqzzenla_,.tronslocii

EcoRl5 ' LE' trp po ACC^-i T-rTaq I Tag I Toqi _D' —j-ę- E coR I

Togi Targi

FIG.4

Eco RI

Tagi częściowe trawienie, PACE trp po

TTq I _ _ T

ACC

3 4 5 6

162 227

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania z wysoką wydajnością produktu polipeptydowego, który jest lub jest na drodze specyficznego rozszczepienia biologicznie aktywnym heterologicznym polipeptydem otrzymanym w wyniku ekspresji strukturalnego genu kodującego polipeptyd w bakterii, znamienny tym, że formuje się transformowany zdolnym do replikacji plazmidowym nośnikiem ekspresji inokulant o sekwencji dwuniciowego DNA, zawierający w fazie od pierwszego końca 5' do drugiego końca 3’ jego nici kodującej następujące elementy: /a/ bakteryjny układ trp promotor-operator, IZ>I nukleotydy kodujące rybosomowe miejsce przyłączenia translacji elementu /d/, /c/ nukleotydy kodujące sygnał translakcji elementu /d/ i /d/ strukturalny gen kodujący sekwencję aminokwasową aktywnego biologicznie heterologicznego polipeptydu, przy czym wspomniana sekwencja pozbawiona jest zdolności atenuowania trp i nukleotydów kodujących rybosomowe miejsce przyłączenia trp, po czym transformowane bakterie umieszcza się w naczyniu fermentacyjnym i prowadzi się ich hodowlę na pożywce zawierającej dodatek tryptofanu wystarczający do represji układu promotor-operator, po czym pozbawia się bakterie tego dodatku tryptofanu, powodując zniesienie represji układu promotor-operator i ekspresję sekwencji DNA elementu /d/ z wytworzeniem produktu polipeptydowego kodowanego przez wspomniany gen strukturalny i prowadzi się wzrost komórek do gęstości optycznej inokulanta do 10 krotnego nadmiaru /przy 550 nM/, po czym oddziela się heterologiczny polipeptyd w postaci aktywnej biologicznie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się ekspresji dwuniciowy DNA, zawierający nukleotydy kodujące część homologicznego polipeptydu i gen strukturalny kodujący heterologiczny polipeptyd.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że poddaje się ekspresji DNA, w którym nukleotydy kodujące homologiczny polipeptyd kodują sekwencję aminokwasów enzymu biorącego udział w szlaku biosyntezy od kwasu choryzmowego do tryptofanu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że poddaje się ekspresji DNA, w którym nukletydy kodujące homologiczny polipeptyd kodują specyficznie rozszczepialny biologicznie nieaktywny polipeptyd, a strukturalny gen kodujący heterologiczny polipeptyd koduje biologicznie aktywny polipeptyd.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że poddaje się ekspresji DNA w którym nukleotydy kodujące homologiczny polipeptyd kodują trp E polipeptyd i rybosomowe miejsce przyłączenia dla wiodącego trp D polipeptydu.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że poddaje się ekspresji DNA, w którym nukleotydy kodujące homologiczny polipeptyd kodują trp D polipeptyd.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że poddaje się ekspresji DNA, w którym nukleotydy kodujące homologiczny polipeptyd kodują fuzję około sześciu pierwszych aminokwasów trp wiodącego polipeptydu i sekwencję aminokwasów dystalnej trójki genu trp E polipeptydu, a gen strukturalny koduje heterologiczny polipeptyd.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pozbawienie podłoża tryptofanu realizuje się na drodze przerwania jego dodawania i rozcieńczania fermentacyjnego podłoża, na którym to podłożu prowadzi się wzrost inokulum w pierwszej fazie.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako bakterię-gospodarza stosuje się E. coli.

   162 227