JPH0673469B2 - トリプトファン・プロモーター−オペレーターを用いる細菌によるポリペプチドの発現 - Google Patents

トリプトファン・プロモーター−オペレーターを用いる細菌によるポリペプチドの発現

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JPH0673469B2
JPH0673469B2 JP4274165A JP27416592A JPH0673469B2 JP H0673469 B2 JPH0673469 B2 JP H0673469B2 JP 4274165 A JP4274165 A JP 4274165A JP 27416592 A JP27416592 A JP 27416592A JP H0673469 B2 JPH0673469 B2 JP H0673469B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明の背景 組換えＤＮＡ技術の出現により、無数の種類の有用なポ
リペプチドの細菌による制御生産が可能になってきた。
すでにこの技術によって修飾された細菌にソマトスタチ
ン(Ｋ.Ｉtakura,et.al., Ｓcience１９８,１０５６〔１
９７７〕)、ヒトインシュリンの(成分)Ａ鎖とＢ鎖(Ｄ.
Ｖ.Ｇoeddel,et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.sci,ＵＳＡ７
６,１０６〔１９７９〕)、ヒト成長ホルモン(Ｄ.Ｖ.Ｇo
eddel etal., Ｎature２８１,５４４〔１９７９〕)のよ
うなポリペプチド生産物を生産させることが進行してい
る。ごく最近、組換えＤＮＡの技術は胸腺によって生産
される免疫賦活剤であるサイモシンα１の細菌による生
産の場合にも用いられている。そのように事実上いかな
る有用なポリペプチドも細菌によって生産することがで
きるという技術の力は、ホルモン、酵素、抗体及び広い
範囲の病気に対するワクチンの制御生産にまで達してい
る。上で引用した代表例をさらに詳細に記述している引
用文献は、本発明の背景を説明するために、他のこれ以
後に引用する出版物と同様、参考文献として本明細書中
に編入する。
【０００２】組換えＤＮＡの技術の働き手はプラスミド
で、これは細菌に見つかっている、染色体とは異なる２
本鎖ＤＮＡの輪であり、しばしば細菌の細胞当りに多く
のコピーが存在している。プラスミドＤＮＡに暗号化さ
れている情報に含まれているものには、娘細胞に於いて
このプラスミドを再生するのに必要なもの、すなわち
「レプリコン」、および通常はたとえば抗生物質耐性のよ
うな１つ又はそれ以上の選択特性があり、これは関心の
あるプラスミドを含む宿主細胞のクローンを認識し、優
先的に選択培地で生育させることを可能にする。細菌プ
ラスミドの有用性は、プラスミドのＤＮＡの異った部位
をそれぞれに認識する１つ又はいくつかの制限エンドヌ
クレアーゼ即ち「制限酵素」によってプラスミドを特異的
に切断することができるという事実に存在する。それに
よって、異種遺伝子または遺伝子断片は、切断個所又は
切断個所に隣接する再構成された末端に末端結合させる
ことによってプラスミドに挿入することができる。本明
細書で用いる「異種」という用語は、通常大腸菌に見られ
ない遺伝子、又は大腸菌によって通常生産されないポリ
ペプチド配列を示し、他方「同種」という用語は大腸菌野
性株で生産される遺伝子又はポリペプチドをさす。ＤＮ
Ａの組換えは細菌の細胞外で行なわれるが、しかし結果
として生ずる「組換え」プラスミドは細菌細胞内へ形質転
換として知られる方法で移入することが可能であり、多
量の、異種遺伝子を含んでいる組換えプラスミドが形質
転換株を増殖させることによって得られる。さらに遺伝
子が、暗号化されたＤＮＡメッセージの転写と翻訳を支
配するプラスミド上の適切な位置に挿入されれば、でき
あがった発現媒体は、発現として知られる過程で、移入
された遺伝子が暗号化しているポリペプチド配列を実際
生産させるのに使用することができる。
【０００３】発現は、ＲＮＡポリメラーゼが認識しそし
て結合する、プロモーターとして知られる領域で開始さ
れる。ある場合には、下記に論議するトリプトファンオ
ペロン(tpr operon)のようにプロモーター領域が「オペ
レーター(operator)」領域と重複していてプロモーター
−オペレーター結合型を形成している。オペレーター
は、ある特定のプロモーターにおける転写開始の頻度を
調節するのに役立つ、いわゆるリプレッサー(抑制)タン
パク質によって認識されるＤＮＡ配列である。ポリメラ
ーゼはＤＮＡに沿って移動し、その暗号鎖に含まれてい
る情報を５’から３’末端へとメッセンジャーＲＮＡに
転写し、今度はこのmＲＮＡが、このＤＮＡがコードし
ているアミノ酸配列を持ったポリペプチドに翻訳され
る。
【０００４】本明細書に於いて「構造遺伝子」と呼ぶもの
に含まれる独自のヌクレオチド３重連又は「コドン」によ
って各々のアミノ酸は暗号化されている。即ちこの「構
造遺伝子」は発現される生産物のアミノ酸配列を暗号化
している部分である。プロモーターに結合後、ＲＮＡポ
リメラーゼは最初にリボソーム結合個所を暗号化してい
るヌクレオチドを転写し、次に翻訳開始又は「スタート」
信号(通常はＡＴＧ、これはできあがったメッセンジャ
ーＲＮＡではＡＵＧになる)及び構造遺伝子それ自身の
中のヌクレオチド・コドンを転写する。いわゆる終止コ
ドンは、構造遺伝子の末端で転写され、それ以後もポリ
メラーゼは追加の配列を生成することがあるが、これ
は、終止シグナルの存在のためにリボソームによって翻
訳されない。リボソームは、細菌では普通メッセンジャ
ーＲＮＡ生成が行なわれているときに、メッセンジャー
ＲＮＡ上に用意された結合個所に結合し、それ自身によ
って翻訳を翻訳開始信号から始め、そして前述の終止信
号で終り、暗号化されていたポリペプチドを生産する。
もしリボソーム結合個所を暗号化している配列がＡＵＧ
の開始コドンに関して適切な位置にあれば、そして残り
の全てのコドンが開始コドンに(解読)相が一致して続い
ていれば、希望する生産物が生産される。できあがった
生産物は、宿主細胞を溶菌することにより、そしてバク
テリアの他の蛋白質からの適切な精製によって生産物を
回収することにより得られる。
【０００５】組換えＤＮＡの技術の利用によって発現さ
れたポリペプチドは、ヒト成長ホルモンの直接発現の場
合のように全く異種であるか、それでなければ、ソマト
スタチンの中間体やヒトインシュリンの成分の生産の場
合のように、異種ポリペプチドと同種ペプチドのアミノ
酸配列の少なくとも一部分とを融合させたものから成
る。例えば、後者の場合は、融合した同種ポリペプチド
はβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の一部分から成
る。それらの場合、目的とする生物活性のある生産物
は、融合した同種ポリペプチドによって、それを細胞外
の環境で切り離さない限り不活性化されている。今述べ
たような融合蛋白質は、メチオニン部位でのシアン化臭
素との反応、あるいは酵素的切断の様に、所望の生産物
から前駆体蛋白質を極めて特異的に切断し得る様に設計
することができる。例えば英国特許公告第２,００７,６
７６Ａ号参照。
【０００６】組換えＤＮＡ技術がその約束を充分に支持
するためには、システムは、目的のポリペプチド生産物
が多量に入手できうるために、移入された遺伝子の発現
が最適となるようなシステムを工夫しなければならな
い。β-ラクタマーゼ及びラクトースのプロモーター-オ
ペレーター系は過去において最もよく使用されたが、有
用とはいえ収率の観点からはこの組換え技術の能力を充
分に利用してはいない。従って、目的とするポリペプチ
ド生産物を高い収量で制御発現できる細菌の発現ベクタ
ーが要望されていた。トリプトファンは同種ポリペプチ
ドの構成成分として使用されるために、以下の生合成経
路によって細菌で生産されるアミノ酸である;コリスミ
ン酸→アントラニル酸→ホスホリボシルアントラニル酸
→ＣＤＲＰ〔エノール−１−(Ｏ−カルボキシフェニル
アミノ)−１−デスオキシ−Ｄ−リブロース−５−ホス
フェート〕→インドール−３−グリセロールリン酸→そ
して最後にトリプトファンそれ自体。
【０００７】この経路の酵素反応はトリプトファン・オ
ペロン、即ち“trp"オペロン−これはtrpプロモーター-
オペレーター系の支配下で転写される多シストロン性Ｄ
ＮＡ断片である−の生産物によって触媒される。できあ
がった多シストロン性メッセンジャーＲＮＡはいわゆる
trpのリーダー配列、それから順にtrpＥ、trpＤ、trp
Ｃ、trpＢそしてtrpＡと名づけられたポリペプチドを暗
号化している。これらのポリペプチドはコリスミン酸か
らトリプトファンへの経路の個々のステップをそれぞれ
に触媒し、調節している。
【０００８】大腸菌野性株ではトリプトファン・オペロ
ンは少なくとも３つの別個の調節型式の支配下にある。
プロモーター-オペレーター抑制の場合は、トリプトフ
ァンが抑制補体(コリプレッサー)として働き、主抑制体
(アポリプレッサー)に結合して活性ある抑制因子複合体
(リプレッサー)を形成し、次にこれがオペレーターに結
合してこの系を全体的に閉じる。２番目はフィードバッ
ク阻害の作用によってトリプトファンはtrpＥ及びtrpＤ
ポリペプチド複合体に結合し、その結果、その複合体が
合成経路に参加するのを阻害する。最後はtrpのリーダ
ー配列内に存在する遺伝子のアテニュエーター領域の支
配下での、アテニュエーションとして知られる作用によ
るコントロールである。概説はＧ.Ｆ.Ｍiozzari et a
l., Ｊ.Ｂacteriology １３３,１４５７(１９７８); Ｔ
he Ｏperon ２６３−３０２, ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌ
aboratory(１９７８), Ｍiller及びＲeznikoff,eds.;
Ｆ.Ｌee et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７
４,４３６５(１９７７)並びにＫ.Ｂertrand et al.,
Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１０３,３１９(１９７６)参照。アテニ
ュエーションの程度は細胞内のトリプトファンの濃度に
よって支配されていると見られ、そして大腸菌の野性株
では、アテニュエーターはだいたい十中八、九まで、以
下の機構で発現を停止させる。それは恐らくＲＮＡポリ
メラーゼを、結合しているＤＮＡから未成熟のうちに遊
離してしまう二次構造、即ち「終止ループ(termination
loop)」がメッセンジャーＲＮＡ内に形成されることによ
る。
【０００９】他の研究者は異種ポリペプチドの発現のあ
る種の手段としてtrpオペロンを使ったことがある。こ
の研究は、インドールアクリル酸の添加により抑制とア
テニュエーションの問題を解決しようと試みたものと考
えられる。インドールアクリル酸は誘導因子であり、ト
リプトファンのアナログで、trp抑制因子に対し(トリプ
トファンと)競合し競合阻害によって脱抑制の方向へ向
けるものである。同時に、この誘導因子はインドールか
らトリプトファンへの酵素的転換を阻害し、そのために
細胞を効果的にトリプトファン欠乏させることによって
アテニュエーションを減少させる。結果として、より多
くのポリメラーゼがアテニュエーターを首尾よく読みぬ
ける。しかしながら、トリプトファンの欠乏のために、
トリプトファンを含む蛋白質の配列の合成が中途で停止
してしまうために、このアプローチは一貫した翻訳の完
成と高収率の観点から問題があることが分った。実際に
このアプローチによるアテニュエーションの効果的な軽
減は厳しいトリプトファン飢餓に完全に依存している。
【００１０】本発明は、トリプトファンの抑制及びアテ
ニュエーションに伴った問題を異った方法で処置し、そ
して(１)trpプロモーター−オペレーターによる異種遺
伝子の直接発現のためにデザインされた発現媒体(ベク
ター)を得るための方法;(２)トリプトファンのオペレー
ター−プロモーターから、異種−同種遺伝子融合体によ
って暗号化されている特異的に切断されうるポリペプチ
ドの発現のためにデザインされたベクターを得るための
方法;(３)異種のポリペプチドを効率的にそして高収率
に制御可能な方法で発現できる方法、並びにそれらに関
与する手段を提供するものである。
【００１１】本発明の概要 本発明は、細菌による異種ポリペプチド産物の生産のた
めの新規なプラスミド発現媒体を提供するものであり、
この媒体は、暗号鎖の最初の５’末端から第二の３’末
端までの相においてtrpプロモーター−オペレーター、t
rpリーダー内のリボソーム結合部位及び異種ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を暗号化している構造遺伝子の発現の
ための翻訳開始を暗号化しているヌクレオチドから成る
２本鎖ＤＮＡ配列を持っている。ここで言うＤＮＡ配列
はtrpアティニュエーター領域もtrpＥリボソーム結合部
位を暗号化しているヌクレオチドも含んでいない。その
代わりに、trpリーダー内のリボソーム結合部位が、挿
入された遺伝子に暗号化されている情報の発現を達成す
るために効果的に使用される。
【００１２】trpプロモーター−オペレーターを含む
が、アティニュエーターを欠く本発明のプラスミドを加
えることにより細胞を形質転換し、添加トリプトファン
の存在下で増殖させる。トリプトファンに富む培地を使
用することにより、trp／リプレッサーの相互作用によ
ってtrpプロモーター−オペレーターを実質的に完全に
抑制するのに充分なトリプトファンを供給することにな
り、その結果、そうでなければtrpプロモーター−オペ
レーター系の制御下にある挿入遺伝子によって暗号化さ
れている多量の異種ポリペプチドが中途半端に発現され
ることによる阻害をうけることなしに、細胞増殖が進行
する。組換え体の培養がだいたいポリペプチドの工業生
産のレベルまで増殖した時、外から供給したトリプトフ
ァンを除き、細胞をそれ自体で生産するトリプトファン
のみに頼らせるようにする。この結果は軽いトリプトフ
ァン制限になり、従って経路は脱抑制され、異種挿入物
の発現が、アティニュエーター領域がこの系から欠失し
ているのでアティニュエーションによって妨げられず、
高い頻度で生じる。この方法では細胞は決してトリプト
ファンが著しく欠乏した状態にはならず、全ての蛋白質
は、それがトリプトファンを含むと否とにかかわらず、
多量に生合成されうる。
【００１３】本発明はさらに制限酵素部位がなくても任
意の所望の個所で２本鎖ＤＮＡを切断する方法を提供す
るものであり、この技術はとりわけ、従来の変異株選択
によって取得されるもの以外の、アティニュエーター欠
失trpオペロンを創作する点で、特に役に立つものであ
る。最後に、本発明は発現条件下で、分解に対して安定
化されている、特異的に切断できる異種−同種融合蛋白
質を含む多様な有用中間体と最終産物を提供するもので
ある。どの様にすれば本発明の目的が達成され、その利
点が得られるかは、以下の記載及び添付図面からより明
確になるであろう。
【００１４】図において図解を明確にするために、ほと
んどの場合、二本鎖であるプラスミド及び線状ＤＮＡ
は、その暗号鎖のみを描いている。抗生物質耐性を暗号
化している遺伝子はapＲ(アンピシリン)とtcＲ(テトラ
サイクリン)で示す。図面の説明において、tcＳはプロ
モーター−オペレーター系の制御下にないテトラサイク
リン耐性遺伝子を意味し、従ってこの遺伝子を含むプラ
スミドは、この遺伝子があるにもかかわらずテトラサイ
クリン感受性になる。図の説明で“apＳ"はアンピシリ
ン耐性を暗号化している遺伝子が一部欠失した結果アン
ピシリン感受性となったことを意味する。プラスミドの
プロモーター及びオペレーターは“Ｐ"と“Ｏ"で表され
る。Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣの文字は各々アデニン、チミン、グ
アニンとシトシンを含むヌクレオチドを意味する。他の
図の凡例は本明細書から明らかである。後に述べる発明
の好適具体例は、以下に示す対応するいくつかの認識配
列と切断形式(矢印によって示される)を持つ一般に入手
可能な制限エンドヌクレアーゼを利用したものである。
【００１５】
【化１】
【００１６】切断点が各々の鎖で食い違う切断末端は
「粘着(sticky)」になる、すなわち、これは再アニーリング
することもできるし、又はほぞあな(mortise)とほぞさ
し(tenon)の様に、ワトソン-クリック(Ｗatson-Ｃrick)
塩基対(ＡとＴ及びＧとＣ)の法則により他の相補性「粘
着」末端ＤＮＡとアニーリングすることもできる。上述
のＨpaIやＰvuIIのようにいくつかの制限酵素は「平滑(b
lunt)」末端を残して切断される。上述のヌクレオチド配
列は広く使用されている慣習に従って表現されている:
上方の鎖は蛋白質を暗号化している鎖で、その鎖上を左
から右へ進むことは５’末端から３’末端へ移動するこ
とで、これはすなわち「基(近接)部(proximal)」点から
「末(遠位)部(distal)」点へ向かう転写の方向である。
【００１７】最後に、慣習によると“△"の記号は欠失
を意味する。それ故例えばプラスミドに“△ＥcoＲI−
ＸbaI"がついていれば、ＥcoＲIとＸbaIの制限酵素(作
用)部位の間のヌクレオチド配列がこれらの酵素の切断
によって除去されたプラスミドを表わしている。便宜
上、ある種の欠失は数字で示される。したがって、pＢ
Ｒ３２２親プラスミドのテトラサイクリン耐性遺伝子に
先行するＥcoＲI認識部位の第１塩基対(“bp")から数え
て“△１"はbp１−３０の塩基の欠失(つまり△ＥcoＲI
−ＨindIII)となり、結果としてテトラサイクリン・プ
ロモーター−オペレーター系の不能化を意味する。“△
２"はbp１−３７５の欠失(つまり△ＥcoＲI-BamＨI)
で、結果としてテトラサイクリン・プロモーター−オペ
レーターとテトラサイクリン耐性を暗号化している構造
遺伝子の両方の除去を意味する。そして“△３"はbp３
６１１−４３５９の欠失(つまり△ＰstI−ＥcoＲI)とア
ンピシリン耐性の欠如を意味する。“△４"はtrpオペロ
ンの断片５(図１)からbp〜９００−〜１５００の除去及
びその結果trpＤポリペプチドの構造遺伝子の欠如を意
味するのに用いられる。
【００１８】詳細な記述 trpのリーダー配列は、trpメッセンジャーＲＮＡの出発
点からはじまる塩基対(“bp")１−１６２から成る。１
４のアミノ酸からなる想定のtrpリーダーポリペプチド
は、翻訳開始信号を暗号化しているＡＴＧヌクレオチド
につづくbp２７−７１により暗号化されている。trpの
アティニュエーター領域はbp１１４−１５６間に存在す
る連続したＧＣ塩基の多い配列とＡＴ塩基の多い配列か
ら成り、アティニュエーションは明らかにリーダー配列
のbp〜１３４−１４１で暗号化されているメッセンジャ
ーＲＮＡのヌクレオチド上で起こる。trpのリーダーリ
ボソーム結合部位の支配下に異種ポリペプチドを発現さ
せ、同時にアティニュエーションを防ぐために次の基準
が守られなければならない:
【００１９】１．塩基対１３４−１４１又はそれ以上を
除去しなけらばならない。 ２．挿入された遺伝子のＡＴＧコドンは、周知の如く、
リボソームの結合部位に対して適切な関係に位置するこ
とが必要である〔例えば、Ｊ.Ａ.Ｓteitz “Ｇenetic s
ignals and nucleotide sequences in messengerＲＮ
Ａ" in Ｂiological Ｒegulation and Ｃontrol (ed,
Ｒ.Ｇoldberger) Ｐlenum Ｐress. Ｎ.Ｙ.(1980)を参
照〕。 ３．同種−異種融合蛋白を生産しようとする場合には同
種のポリペプチド配列の翻訳開始信号が使用可能なまま
残されるべきであり、そして融合蛋白質の同種部分のコ
ドンは、翻訳終止信号に割って入り込むことなく、相内
に挿入されなければならない。
【００２０】例えば、リーダー配列中、bp７０から遠位
末端へかけての全ての塩基対を除去すると、アティニュ
エーター領域が除去されるが、翻訳開始信号を暗号化し
ているＡＴＧ配列は残る。そしてＡとそれに続くヌクレ
オチドの除去によりＴＣＡ(bp６９−７１)によって暗号
化される介在翻訳終止が除去される。そのような除去に
より、リーダーポリペプチドで始まり、異種挿入物によ
って暗号化されたポリペプチドで終わる融合蛋白が発現
される。この蛋白は３’方向への欠失の程度によって決
まる、trpオペロンのリーダー後位の一つのポリペプチ
ドの遠位末端部を含む。かくて、Ｅ遺伝子中にまで延び
た欠失により、後に続く挿入体によってコードされた配
列と融合したＥの末端部(欠失の終点以降の)とＬ配列か
ら成る同種前駆体が発現される。
【００２１】アティニュエーター領域が欠失している、
２つの特に有用なプラスミドはpＧＭ１とpＧＭ３であ
る。Ｇ.Ｆ.Ｍiozzari et al., Ｊ.Ｂacteriology,１３
３,１４５７(１９７８)参照。これらは各々trp△ＬＥ１
４１３とtrp△ＬＥ１４１７の欠失を持っており、そし
て(trpのプロモーター・オペレーターの制御下で)trpの
リーダー部分の最初の６つのアミノ酸とＥ．ポリペプチ
ドの遠位末端部からなるポリペプチドを発現する。最も
好適な場合ではpＧＭ１はＥポリペプチドの最後の約３
分の１のみを発現し、一方pＧＭ３はＥポリペプチドコ
ドンの１／２の遠位末端部分のほとんどを発現する。p
ＧＭ１を含有する大腸菌Ｋ−１２株Ｗ３１１０tna２-tr
p-△１０２はアメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション(theＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)に
寄託されている(ＡＴＣＣ Ｎo.３１６２２)。pＧＭ１は
後述する方法で、使用するに際し菌株から常法により取
ることができる。
【００２２】あるいはまた、欠失は任意の所望の個所で
ＤＮＡ２本鎖を特異的に切断する本発明によって提供さ
れる方法によって成しとげられる。この切断技術の１つ
の例は後述の実験区分、第IV部にでてくる。即ち、λエ
クソヌクレアーゼとの反応によって目的とする切断点の
周辺領域のＤＮＡ２本鎖を１本鎖ＤＮＡに換える。合成
された又は他の方法による１本鎖ＤＮＡのプライマー
を、ワトソン-クリックの塩基対合によって、先に形成
した１本鎖にハイブリダイズさせる。プライマー配列は
その５’末端が、所望とする切断点の直前の第１鎖のヌ
クレオチドと一緒になって端末を形成する様な配列とな
っている。プライマーを次にＤＮＡポリメラーゼとの反
応によって３’方向へ伸長させ、最初の段階で失われ
た、目的とする切断点の前にある本来の２本鎖ＤＮＡの
部分を再合成する。同時に又はその後で、目的とする切
断点より以降の第１鎖の部分を消化し去る。要約する
と、以下の通りである(ここで“∨"印の個所は目的とす
る切断点を示す):
【００２３】
【化２】
【００２４】最も好適な具体例は、(d)と(e)の段階を同
時に行なうことであり、これはポリメラーゼを使い、突
き出た１本鎖を３’→５’の方向に消化し、同時に５’
→３’の方向へ(dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ
の存在下に)プライマーを伸長する。この目的に対して
好適な材料はＫlenowポリメラーゼIで、これはＤＮＡポ
リメラーゼIの蛋白分解的切断によって得られるフラグ
メントであり、親酵素の５’→３’への重合活性と３’
→５’へのエキソヌクレアーゼ的(exonucleolytic)活性
を持つが、５’→３’へのエキソヌクレアーゼ的活性は
欠如している。Ａ.Ｋornberg, ＤＮＡ Ｓynthesis,９
８, Ｗ Ｈ Ｆreeman and Ｃo, ＳＦＯ, (１９７４)参
照。
【００２５】trpオペロン含有プラスミド分子を、その
平滑末端にしたい点(上記の“∨")より下流の制限部位
で切断することにより線状化したプラスミドは、上に述
べた方法により、所望通りにアテニュエーターを欠失さ
せることができる。アティニュエーター領域欠失に続く
再環状化は、平滑末端の連結又はその他の当業者によく
知られている方法によってなしとげられる。本発明はtr
pプロモーター−オペレーターの支配下での異種ポリペ
プチドの直接発現を包含するが、好適な態様は同種及び
異種配列の両方からなる融合蛋白を発現し、好ましくは
異種配列を細胞外の環境で同種配列から特異的に切除す
るものである。特に好適なものは、trpリーダー・ポリ
ペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸とtrpＥのアミ
ノ酸配列の末端部の約３分の１又はそれ以上からなる同
種配列との融合物である。そのようにして得られた融合
蛋白質は発現条件下での分解に対して極めて安定であ
る。
【００２６】細菌、大腸菌Ｋ-１２ Ｗ３１１０株tna２-
trp -△１０２(pＧＭ１)(ＡＴＣＣＮo.３１６２２)を、
本発明のアティニュエーター欠損trpプロモーター＝オ
ペレーター系の構築に使用するのに好適なpＧＭ１プラ
スミドの増幅に用いることができる。この株の表現型は
アントラニル酸の存在下でtrp+ であり、５０μg／mlの
アントラニル酸を補足した、例えばＬＢのような最小培
地で生育できる。本発明によるtrpプロモーター-オペレ
ーター支配による発現に使われるすべての細菌菌株は、
大腸菌野性株の場合のように、異種配列を発現するまで
抑制を確実にするためにtrpリプレッサー+(“trpＲ+")
である。
【００２７】好適な具体例では、ＤＮＡ組換え(実験)
は、膜の性質が形質転換に向いている細菌株である大腸
菌Ｋ−１２ ２９４株(endＡ, thi-, hsr-, hsmk+)(ＡＴ
ＣＣＮo.３１４４６)を用いて行なう。２９４株中で増
殖させた、異種ポリペプチド産生プラスミドを常法によ
り抽出し、約−２０℃から約４℃までの温度で溶液(例
えば１０mＭトリス １mＭ ＥＤＴＡ pＨ８)中に保存す
る。一方、工業的条件下での発現のためにはもっと丈夫
な菌株である大腸菌Ｋ−１２ λ-Ｆ-ＲＶ３０８ strr,
gal３０８-(ＡＴＣＣ Ｎo.３１６０８)を選ぶ。ＲＶ３
０８は栄養的には野性株であり、最小培地で良好に生育
し、アンモニウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、微量
金属及びグルコースの常用の混合物から全ての必須な巨
大分子を合成する。２９４株由来のプラスミドによりＲ
Ｖ３０８培養菌を形質転換した後、この培養菌を、プラ
スミドの持っているマーカー(抗生物質耐性のような)に
ついて選択能力を有する培地にプレートし、形質転換体
コロニーを拾い、フラスコ培養で増殖させる。この培養
物の一部を１０％ＤＭＳＯ又はグリセロール溶液に入れ
(滅菌したＷheatonのバイアル中)、エタノール−ドライ
アイス浴槽につけて薄層状に凍らし−８０℃で凍結して
おく。暗号化されている異種ポリペプチドを生産するに
は、培養サンプルを、trpプロモーター-オペレーターの
抑制のため、トリプトファンを含む培地で増殖させ、次
いで添加したトリプトファンを系から除いて発現させ
る。
【００２８】生育の第１段階のために、例えばＬＢ培地
(Ｊ.Ｈ.Ｍiller, Ｅxperiments inＭolecular Ｇenetic
s, p４３３ Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory １９
７２)−水溶液１l中に１０gのバクト・トリプトン(Ｂac
to tryptone)、５gのバクト・イースト・エクストラク
ト(Ｂacto yeast extract)及び１０gのＮaＣlを含む−
を使用してもよい。好ましくは、接種した培養物は、定
常期より少ないけれども、５５０nＭにおける光学密度
(“o.d.")が１０又はそれ以上、さらに好ましくはo.d.
が２０又はそれ以上、そして一層好ましくはo.d.が３０
又はそれ以上になるまで生育させる。
【００２９】次いで、脱抑制および発現のため、接種し
た培養物を、添加トリプトファンを細胞からとり去る条
件下で生育させる。このような生育に適している培地の
１つにＭ９(Ｊ.Ｈ.Ｍiller 前述 p４３１)があり、次の
ように調製される(１l当たり)： ＫＨ2ＰＯ4 ３g Ｎa2ＨＰＯ4 ６g ＮaＣl ０.５g ＮＨ4Ｃl １g
【００３０】オートクレーブした後、次の成分を添加す
る： １０ml ０.０１Ｍ ＣaＣl2 １ml １Ｍ ＭgＳＯ4 １０ml ２０％ グルコース ビタミンＢ１ １μg／ml Ｈumko hycase amino 又はＤＩＦＣＯ cas.アミノ酸 ４０μg／ml。
【００３１】この補足アミノ酸はトリプトファンを欠い
たカゼインの酸加水分解物である。異種ポリペプチドの
発現を始めるため、トリプトファンの豊富な培地で生育
させた接種培養物を、例えばトリプトファンが添加され
ていない多量の培地で希釈し(例えば２〜１０倍希釈)、
目的とするレベルまで生育させ(できれば定常生長期に
入らないところまで)、そして目的生産物を常法により
溶菌、遠心そして精製することによって得る。トリプト
ファンを除去した生育段階においては、好ましくはodが
１０以上になるまで、さらに好ましくはod２０を越える
まで、最も好ましくはod３０またはそれ以上(すべて５
５０nＭにおいて)になるまで細胞を生育させた後、生産
物を回収する。
【００３２】以下に続く実験の部において記述するすべ
てのＤＮＡ組換え実験は、Ｎ.Ｉ.Ｈ.の組換えＤＮＡの
研究に対するガイドラインに沿ってジェネンテェク社
(Ｇenentech Ｉnc.)で行なわれたものである。 １．Ｄ−ポリペプチド融合蛋白の発現 所望のポリペプチド及びそれと融合したtrpＤポリペプ
チドのアミノ酸配列の一部−これは、ＣＮＢr切断に対
して特異的な感受性を有するアミノ酸であるメチオニン
により生体外で分離することができる−から成る融合蛋
白の発現の好ましい方法図３を参照しながら記述する。
【００３３】Ａ．pＢＲＨtrpの構築 プラスミドpＧＭ１(図１の１)は△ＬＥ１４１３の欠失
を含む大腸菌トリプトファン・オペロンを持っており
〔ＧＦＭiozzari et al. (１９７８),Ｊ.Ｂacteriolog
y, １３３, １４５７−１４６６〕、従ってtrpプロモー
ター−オペレーター系の支配下にある、trpＤポリペプ
チドの全部、ならびにtrpリーダーの最初の６つのアミ
ノ酸およびtrpＥポリペプチドの終りの約３分の１の部
分(これ以後は両者を合せてＬＥ’と呼ぶ)から成る融合
蛋白を発現する。このプラスミド２０μgを、このプラ
スミドを５個所で切断する制限酵素ＰvｕIIにより消化
する。次いで、この遺伝子断片２をＥcoＲＩリンカー(p
ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧの配列の自己相補的オリゴヌ
クレオチド３から成る)と結合させ、後にＥcoＲI部位を
含有するプラスミド(２０)中にクローニングするための
ＥcoＲI切断部位を得る。pＧＭ１から得られた２０μg
のＤＮＡ断片２を、５’−リン酸化された合成オリゴヌ
クレオチドpＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ(３)の２００ピ
コモルの存在下、２０μlのＴ4ＤＮＡリガーゼ緩衝液
(２０mＭトリス、pＨ７.６、０.５mＭ ＡＴＰ、１０mＭ
ＭgＣl2、５mＭ ジチオスレイトール)中、４℃で一
晩、１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼで処理する。次い
で、連結を停止させるため、溶液を７０℃で１０分間加
熱する。リンカーをＥcoＲＩ消化によって切断し、そし
てＥcoＲＩ末端を持つ様になった断片を５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(以後“ＰＡＧＥ"という)により
分離し、大きい３つの断片を、まずエチジウムブロマイ
ドで染色し、紫外線によって断片の位置を決め、そして
所望の部分をゲルから切り出すことにより、ゲルから単
離する。各々のゲル断片を３００μlの０.１×ＴＢＥと
ともに透析袋に入れて、そして０.１×ＴＢＥ緩衝液で
１時間１００Ｖで電気泳動する(ＴＢＥ緩衝液:１０.８g
mトリス塩基、５.５gmホウ酸、０.０９gmＮa2ＥＤＴＡ
を１lのＨ2Ｏに含む)。水溶液を透析袋から集め、フェ
ノール抽出し、クロロホルム抽出し、そして０.２Ｍ Ｎ
aＣlとし、エタノール沈澱後ＤＮＡを水に回収する。
[以降に記述するすべてのＤＮＡ断片の単離は、上に述
べたＰＡＧＥとそれに続く電気溶出法により行なっ
た]。ＥcoＲＩ粘着末端を持つtrpプロモーター−オペレ
ーターを含んでいる遺伝子５は次に記述する方法、すな
わちテトラサイクリン感受性プラスミド６へ断片を挿入
することによって同定した(このプラスミドはプロモー
ター−オペレーターが挿入されることによってテトラサ
イクリン耐性となる)。
【００３４】Ｂ．trpプロモーター−オペレーターの制
御下でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドpＢ
ＲＨtrpの創製並びに上記(Ａ)で単離されたtrpプロモー
ター−オペレーター含有ＤＮＡフラグメント５の同定及
び増幅。プラスミドpＢＲＨ１(６)[Ｒ.Ｉ.Ｒodriguez
et al:Ｎucleic acids Ｒesearch ６ p３２６７−３２
８７(１９７９)]はアンピシリン耐性を発現し、そして
テトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでいるが、これに
結合しているプロモーターがないのでその耐性を発現し
ない。従って、このプラスミドはテトラサイクリン感受
性である。ＥcoＲＩ部位にプロモーター−オペレーター
系を導入することにより、このプラスミドをテトラサイ
クリン耐性にすることができる。
【００３５】pＢＲＨ１をＥcoＲＩにより消化し、酵素
をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽出によって取
り除き、そして水溶液中、エタノール沈澱して回収す
る。得られたＤＮＡ分子７を上記Ａ−で得られた３つの
ＤＮＡ断片の各々と、別々の反応混合物中で混合し、前
述したようにしてＴ4ＤＮＡリガーゼでつなぐ。反応混
合物中に存在するＤＮＡを使って形質転換能を持つ(コ
ンピテント)大腸菌Ｋ−１２ ２９４株[Ｋ.Ｂackman et
al, Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ ７３, ４１７４−
４１９８(１９７６)](ＡＴＣＣ no.３１４４８)を標準
的な技術[Ｖ.Ｈershfield et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.
Ｓci.ＵＳＡ ７１, ３４５５−３４５９(１９７４)]に
よって形質転換し、その細菌を２０μg／mlのアンピシ
リンと５μg／mlのテトラサイクリンを含むＬＢプレー
ト上に蒔いた。いくつかのテトラサイクリン耐性コロニ
ーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、所望の断片の
存在を制限酵素解析によって確認した。得られたプラス
ミド８はpＢＲＨtrpと称され、β−ラクタマーゼを発現
し、アンピシリン耐性を与える。さらにこのプラスミド
は、trpプロモーター−オペレーターを含み、trpリーダ
ーの最初の６つのアミノ酸とtrpＥポリペプチドの終わ
りの約３分の１の融合からなる第１の蛋白(このポリペ
プチドをＬＥ’と称する)、trpＤポリペプチドの最初の
約半分に相当する第２の蛋白(このポリペプチドはＤ’
と称される)およびテトラサイクリン耐性遺伝子によっ
てコードされた第３の蛋白とを暗号化しているＤＮＡ断
片を含んでいる。
【００３６】Ｃ．種々の最終生産物ポリペプチドのため
の遺伝子のクローニング並びに最終生産物と特異的に切
除できるtrpＤポリペプチド前駆体から成る融合蛋白と
してのこれらの発現(図２)。trpプロモーター−オペレ
ーター並びにＬＥ’及びＤ’ポリペプチドのコドンから
成るＤＮＡ断片をプラスミドpＢＲＨtrpから得、これを
種々の所望ポリペプチドの構造遺伝子を含むプラスミド
に挿入した。次にソマトスタチンの場合を例として挙げ
る(図２)。
【００３７】pＢＲＨtrpをＥcoＲＩ制限酵素によって消
化し、得られた断片５をＰＡＧＥと電気溶出により単離
した。ＥcoＲＩで消化したプラスミドpＳom１１[Ｋ.Ｉt
akura et al., Ｓcience １９８ p１０５６(１９７７
年);英国特許公告第２００７６７６Ａ号]を断片５と混
合した。この混合物を前述のようにしてＴ4ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、そして得られたＤＮＡによって大腸菌Ｋ
−１２ ２９４株を前述のように形質転換した。形質転
換された細菌をアンピシリンを含むプレートで選択し
た。得られたアンピシリン耐性コロニーを、pＢＲＨtrp
から単離しＰ32で放射能ラベルしたtrpプロモーター−
オペレーター含有断片５をプローブとして用いるコロニ
ー・ハイブリダイゼーション(colony hybridization)に
よってスクリーニングした[Ｍ.Ｇruenstein et al., Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７２,３９５１−３９６
５(１９７５)]。コロニー・ハイブリダイゼーションで
陽性を示す幾つかのコロニーを選択し、プラスミドＤＮ
Ａを単離し、挿入された断片の方向を、制限酵素ＢglII
とＢamＨＩの２重消化による制限酵素解析により決定し
た。trpプロモーター−オペレーター断片が所望の方向
で入っているpＳＯＭ７△２(１１)と称されるプラスミ
ドを含んでいるＥ.coli２９４を、１０μg／mlアンピシ
リンを含むＬＢ培地で増殖させた。光学密度が１(５５
０nmで)になるまでこの細胞を増殖し、遠心によって集
め、１０倍希釈のＭ９培地に再懸濁した。細胞を２−３
時間増殖させ、再び光学密度１になったら溶菌させ、全
細胞蛋白をＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)尿素(１５
パーセント)ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解
析した[Ｊ.Ｖ.Ｍaizel Ｊr. et al.,Ｍeth.Ｖiral.５,
１８０−２４６(１９７１)]。
【００３８】図３は、いろいろな培養物からの全蛋白を
大きさによって分別分離する、蛋白のゲル解析結果を示
したものである。個々のバンドの濃淡は各々の蛋白が存
在する量を反映している。図３に関して、レーン１と７
は対照であり、既に大きさが決定されているいろいろな
蛋白を含んでおり、比較対照点として役立つ。レーン２
及び３は、プラスミドpＳom７△２によって形質転換さ
れ、ＬＢ培地(レーン２)とＭ９培地(レーン３)でそれぞ
れ増殖した大腸菌２９４株のコロニーからの細胞蛋白を
分別分離したものである。レーン４及び５は、プラスミ
ドpＴhα１（Ｍozesら著：Ｃellular Ｒesponse to Ｍo
lecular Ｍodulators，１９８１，Ａcademic Ｐress参
照）から出発して、既述のものと本質的に同一の手順に
よって得られたサイモシン発現プラスミドであるpＴhα
７△２によって形質転換した同様の細胞から得られた細
胞蛋白を分別分離したものである。レーン４はＬＢ培地
で増殖した大腸菌２９４株／pＴhα７△２からの細胞蛋
白を分別分離したものであり、一方レーン５はＭ９培地
で増殖した同じ形質転換株からの細胞蛋白を分別分離し
たものである。レーン６は別の対照であり、ＬＢ培地で
増殖させた大腸菌２９４株／pＢＲ３２２の蛋白パター
ンである。
【００３９】対照と比較すると、レーン３及び５の各々
の２つの最も顕著なバンドで最大のものは、Ｄ’ポリペ
プチドとソマトスタチンあるいはサイモシンから成る融
合蛋白が発現された場合に予想される大きさの蛋白であ
ることを示している(他の顕著なバンドはアティニュエ
ーターの欠失によって生じたＬＥ’ポリペプチドを表わ
す)。図３は、トリプトファンの豊富な培地では発現が
抑制されるが、トリプトファン不足条件下では脱抑制さ
れることを示している。
【００４０】Ｄ．シアン化臭素切断とホルモン生産物の
放射線免疫分析 サイモシンとソマトスタチンの両方の場合について、全
細胞蛋白をシアン化臭素で切断し、切断された生産物を
回収して乾燥した後、緩衝液に懸濁して放射線免疫分析
により解析を行ない、それぞれソマトスタチンおよびサ
イモシンと免疫学的に同一の生産物が発現されているこ
とを確認した。シアン化臭素切断はＤ.Ｖ.Ｇoeddel et
al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７６, １０６−
１１０(１９７９)に記述されている。
【００４１】II．trpプロモーター−オペレーター系の
制御下での異種遺伝子の直接発現のためのプラスミドの
構築 直接発現のための戦略は、trpオペロンのすべての制御
因子の末端部に唯一の制限部位を含むプラスミドを創作
することであり、その制限部位には、trpリーダーポリ
ペプチドのリボソーム結合部位に対して適切な位置関係
で、trpリーダー配列の代りに異種遺伝子をクローンす
ることができる。この直接発現のアプローチを、ヒト成
長ホルモンの発現の場合を例にとって説明する。
【００４２】プラスミドpＳom７△２ １０μgをＥcoＲ
Ｉで切断し、トリプトファン遺伝的因子を含むＤＮＡ断
片５をＰＡＧＥと電気溶出により単離した。この断片２
μgを制限酵素ＴaqＩ ２ユニットを用いて１０分間３７
℃で消化し、平均して各々の分子上の約５つのＴaqＩ部
位の１つのみが切断されるようにする。断片のこの部分
的消化混合物をＰＡＧＥによって分別し、１つのＥcoＲ
Ｉ末端と１つのＴaqＩ末端を含む約３００塩基対の断片
１２(図４)を電気溶出により単離した。この相当するＴ
aqＩ部位は転写開始と翻訳開始部位の間に位置し、そし
てtrpリーダー・ペプチドのＡＴＧコドンから５ヌクレ
オチド上流にある。この部位のまわりのＤＮＡ配列を図
４に示す。前述のように処置することによって、trpオ
ペロンのすべてのコントロール因子、即ちプロモーター
・オペレーター系、転写開始信号及びtrpリーダーリボ
ソーム結合部位を含む断片を単離できた。
【００４３】trpリーダー配列のための翻訳開始信号に
隣接し、得られた断片の３’末端に位置するＴaqＩ部位
を、次に図５に示すようにしてＸbaＩ部位へ転換した。
これは、特異な(即ちただ１つの)ＥcoＲＩ部位と特異な
ＸbaＩ部位を含むプラスミドに、上で得られた断片１２
をつなぐことによって行なった。この目的のためには、
レプリコン、抗生物質耐性のような選択マーカー及びＥ
coＲＩ、ＸbaＩ、ＢamＨＩ部位を順に含むならば本質的
にどんなプラスミドでも採用することができる。かく
て、たとえばpＢＲ３２２のＥcoＲＩとＢamＨＩの間に
ＸbaＩ部位を導入することができる[Ｆ.Ｂolivar et a
l., Ｇene ２, ９５−１１９(１９７７)参照]。これは
例えばプラスミドの特異なＨindIII部位をＨindIIIで切
断し、続いて１本鎖に特異的なヌクレアーゼにより、生
成した粘着末端を消化し、そしてＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧ
のような認識部位を含む自己アニーリング性の２本鎖合
成ヌクレオチドと平滑末端結合することによって行な
う。あるいはその代わりに、ＥcoＲＩとＢamＨＩ切断残
基の間に１つのＸbaＩ部位を含んでいる天然由来のＤＮ
Ａ断片を、ここで行なった場合のように、使用すること
もできる。即ち、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム(genome)の
ＥcoＲＩ及びＢamＨＩ消化産物を常法によって得、そし
てプラスミドpＧＨ６[Ｄ.Ｖ.Ｇoeddel et al.,Ｎature
２８１ ５４４(１９７９)]のＥcoＲＩ及びＢamＨＩ部位
にクローンしてプラスミドpＨＳ３２を形成した。プラ
スミドpＨＳ３２をＸbaＩで切断し、フェノール抽出
し、クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させ
た。次いで、０.１mＭ dＴＴＰと０.１mＭ dＣＴＰを含
む３０μlのポリメラーゼ緩衝液(５０mＭ リン酸カリウ
ム、pＨ７.４、７mＭ ＭgＣl2、１mＭ β−メルカプト
エタノール)中、０℃で３０分間、次いで３７℃で２時
間、１μlの大腸菌ポリメラーゼＩ、Ｋlenowフラグメン
ト(Ｂoehringer−Ｍannheim)で処理する。この処理によ
って、ＸbaＩ切断部位の５’突出末端に相補的な４ヌク
レオチドのうちの２つが下記のように満たされる。
【００４４】
【化３】
【００４５】２つのヌクレオチドdＣ及びdＴを挿入し、
２つの５’突出ヌクレオチドを持った末端を得た。この
プラスミドpＨＳ３２の線状残余物をフェノール及びク
ロロホルム抽出し、水溶液中でエタノール沈澱して回収
した後ＥcoＲＩで切断した。大きなプラスミドの断片１
３をＰＡＧＥによってそれより小さいＥcoＲＩ−ＸbaＩ
断片から分離し、電気溶出して単離した。pＨＳ３２か
らのこのＤＮＡ断片(０.２μg)を前述と同様の条件下
で、図５に示したようにトリプトファン・オペロンのＥ
coＲＩ−ＴaqＩ断片(〜０.０１μg)と結合した。この様
にして、完全なワトソン−クリック塩基対ではないが、
ＴaqＩ突出末端はＸbaＩの残っている突出末端と結合す
る。
【００４６】
【化４】
【００４７】この結合反応混合物の一部で、上記Ｉのよ
うにして、大腸菌２９４株細胞を形質転換し、熱処理
し、アンピシリンを含むＬＢプレートに蒔いた。２４の
コロニーを選択し、３mlのＬＢ培地中で生育させ、そし
てプラスミドを単離した。このうち６つは、大腸菌によ
って触媒されるＤＮＡ修復及び複製により、再生された
ＸbaＩ部位を持っていることが見出された。
【００４８】
【化５】
【００４９】これらのプラスミドはＥcoＲＩとＸpaＩの
両方によって開裂しそして期待される制限断片を生じる
ことがわかった。一つのプラスミド１４はpＴrp１４と
称し、次に論議するように、異種ポリペプチドの発現に
使用される。プラスミドpＨＧＨ１０７[図６の１８,
Ｄ.Ｖ.Ｇoeddel et al., Ｎature, ２８１, ５４４(１
９７９)]は、合成ＤＮＡ断片から得られた２３個のアミ
ノ酸のコドンと、ヒト成長ホルモンのメッセンジャーＲ
ＮＡの逆転写によって作製された相補性ＤＮＡから得ら
れた１６３個のアミノ酸のコドンから成り立っているヒ
ト成長ホルモンの遺伝子を含んでいる。この遺伝子２１
は、ヒト成長ホルモンの“pre"配列のコドンを欠失して
いるけれども、ＡＴＧ翻訳開始コドンを含んでいる。こ
の遺伝子は、上記のように、１０μgのpＨＧＨ１０７を
ＥcoＲＩで処理し、次いで大腸菌ポリメラーゼＩ Ｋlen
owフラグメントとdＴＴＰ及びdＡＴＰで処理することに
よって単離した。続いてフェノール及びクロロホルムで
抽出し、エタノール沈澱した後プラスミドをＢamＨＩで
処理した。図６参照。
【００５０】ヒト成長ホルモン(“ＨＧＨ")遺伝子を含
む断片２１をＰＡＧＥとそれに続く電気溶出によって単
離した。生じたＤＮＡ断片はテトラサイクリン耐性構造
遺伝子の最初の３５０個のヌクレオチドを含んではいる
が、テトラサイクリン・プロモーター−オペレーター系
を欠失している。従って、次いでこれを発現のためのプ
ラスミドにクローン化すると、この挿入物を含むプラス
ミドはテトラサイクリン耐性を回復し、それによって所
在がわかる様になる。断片２１のＥcoＲＩ末端がＫleno
wのポリメラーゼＩ法によって満たされているので、こ
の断片は１つの平滑末端と１つの粘着末端を持つことに
なり、発現のためのプラスミドへ後に挿入されたときに
適切な方向性が確保される。図６参照。
【００５１】次に、発現プラスミドpＴrp１４を、上で
調製したＨＧＨ遺伝子を含む断片を受容し得る様に調製
した。即ち、pＴrp１４をＸbaＩで消化し、生じた粘着
末端をdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰおよびdＣＴＰを用い
るＫlenowポリメラーゼＩ法により満たした。フェノー
ル及びクロロホルム抽出そしてエタノール沈澱の後、得
られたＤＮＡ１６をＢamＨＩで処理し、その結果生じた
大きなプラスミド断片１７をＰＡＧＥ及び電気溶出によ
って単離した。このpＴrp１４由来の断片１７は１つの
平滑末端と１つの粘着末端を持ち、前に述べたＨＧＨ遺
伝子含有断片２１との適切な方向での組換えが可能であ
った。ＨＧＨ遺伝子断片２１とpＴrp１４△Ｘba−Ｂam
Ｈ１断片１７を混合し、前記と同様の条件下で結合し
た。(突出部分を対応する塩基で)充填したＸbaＩとＥco
ＲＩ末端を平滑末端結合することにより、ＸbaＩ及びＥ
coＲＩ部位の両方を再生した。
【００５２】
【化６】
【００５３】この構築により、テトラサイクリン耐性遺
伝子も再生される。プラスミドpＨＧＨ１０７はＨＧＨ
遺伝子の上流に存在するプロモーター(lacプロモータ
ー)からテトラサイクリン耐性を発現するので、pＨＧＨ
２０７と命名したこの構成物２２は、トリプトファン・
プロモーター−オペレーターの制御下でテトラサイクリ
ン耐性遺伝子の発現を可能にする。かくて、この連結混
合物で大腸菌２９４株を形質転換し、テトラサイクリン
５μg／mlを含むＬＢプレートでコロニーを選択した。
【００５４】プラスミドpＨＧＨ２０７からのヒト成長
ホルモンの直接発現を確かめるために、アンピシリン１
０μg／mlを含むＬＢ培地で光学密度が１に達するまで
増殖させ、Ｍ９培地で１０倍に希釈し、再び光学密度が
１に達するまで増殖させた大腸菌２９４株／pＨＧＨ２
０７からの全細胞蛋白を、前述の第１部の場合のように
ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、すでに他の者が発表してい
るヒト成長ホルモンで得られた同様の電気泳動のデータ
と比較した[Ｄ.Ｖ.Ｇoeddel et al., Ｎature,２８１
５４４(１９７９)]。図７は得られた染色ゲルの写真で
ある:レーン１と７は種々の既知の大きさの蛋白マーカ
ーを含んでいる;レーン２は大腸菌２９４株／pＢＲ３２
２の全細胞蛋白を分離した対照;レーン３はＬＢ培地で
増殖させた大腸菌２９４株／pＨＧＨ１０７からの蛋白
を分離したもの;レーン４はＭ９培地で増殖させた大腸
菌２９４株／pＨＧＨ１０７からの蛋白を分離したもの;
レーン５はＬＢ培地で増殖させた大腸菌２９４株／pＨ
ＧＨ２０７からの蛋白を分離したもの;レーン６はＭ９
培地で増殖させた大腸菌２９４株／pＨＧＨ２０７から
の蛋白を分離したもの。レーン６の濃いバンドは、レー
ン２−４の類似のバンドと比較して示されているヒト成
長ホルモンである。本発明によって予想されるように、
トリプトファンの豊富なＬＢ培地で増殖させた場合、こ
の微生物大腸菌２９４株／pＨＧＨ２０７によって生産
されるヒト成長ホルモンはトリプトファンの抑制因子／
オペレーターの相互作用によって少なくなる。しかし、
Ｍ９培地で増殖させた場合、pＨＧＨ１０７のlacプロモ
ーター−オペレーター系と比較したときのトリプトファ
ン・プロモーター−オペレーター系のより強力な誘導の
ために大腸菌２９４株／pＨＧＨ１０７よりかなり多量
にＨＧＨが生産される。
【００５５】III．トリプトファン・プロモーター−オ
ペレーターの制御下にある異種遺伝子の直接発現のため
の一般的発現プラスミドの創製 前の節で創製したプラスミドpＨＧＨ２０７を用い、次
にトリプトファンオペロン(アティニュエーターを欠失
している)の制御因子を含むＤＮＡ断片を得、そして各
種構造遺伝子の挿入物の直接発現に適したプラスミド
「発現ベクター」を創製した。この一般的発現プラスミド
の創製の戦略は、ＥcoＲＩ消化によるpＨＧＨ２０７か
らのトリプトファン制御領域の除去と前述の第Ｉ部で使
われたプラスミドpＢＲＨ１のＥcoＲＩ消化物への挿入
であった。前述したように、pＢＲＨ１はテトラサイク
リン耐性遺伝子を含むアンピシリン耐性プラスミドであ
るが、しかし適切なプロモーター−オペレーター系の欠
失のためにテトラサイクリン感受性である。得られたプ
ラスミドpＨＫＹ１の組立て法については、図８を参照
しながら後に詳述するが、このプラスミドは、アンピシ
リン及びテトラサイクリンの両者に耐性であり、トリプ
トファン・アティニュエーターを欠失し、トリプトファ
ン・プロモーター−オペレーター系を含み、さらにトリ
プトファン・プロモーター−オペレーターの遠位に唯一
のＸbaＩ部位を含んでいる。トリプトファンプロモータ
ー−オペレーターと唯一のＸbaＩ部位は(２つの)ＥcoＲ
Ｉ部位によって囲まれており、その結果このプロモータ
ー−オペレーター−ＸbaＩを含む断片を切り取り、他の
構造遺伝子を含むプラスミドへ挿入することができる。
逆に異種構造遺伝子を、ＸbaＩ部位か又は(部分的Ｅco
ＲＩ消化後)トリプトファン制御領域の遠位のＥcoＲＩ
へ挿入することができ、いずれの場合でもトリプトファ
ン・プロモーター−オペレーター系の制御下に置くこと
ができる。
【００５６】プラスミドpＨＧＨ２０７をＥcoＲＩで消
化し、trpプロモーター含有ＥcoＲＩ断片２３をＰＡＧ
Ｅとそれに続く電気溶出によって回収した。プラスミド
pＢＲＨ１をＥcoＲＩで消化し、突出したＥcoＲＩ末端
にあるホスフェート基の除去のために、細菌アルカリ・
ホスファターゼ(“ＢＡＰ")(５０mＭトリスpＨ８及び１
０mＭ ＭgＣl2中に１μg、３０分、６５℃)で切断末端
を処理した。過剰の細菌アルカリホスファターゼをフェ
ノール抽出、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱によ
って除去した。生じた線状ＤＮＡ７aは突出末端のリン
酸を欠失しているので、連結においてリン酸化された相
補的な粘着末端を持った挿入物しか受容できず、それ自
体の再環状化は起こらず、従って挿入物を含むプラスミ
ドのさらに容易な選別が可能になる。pＨＧＨ２０７由
来のＥcoＲＩ断片とpＢＲＨ１から得られた線状ＤＮＡ
を前述のようにＴ４リガーゼの存在下で混合し連結し
た。生じた混合物の一部分を使って、前述のように大腸
菌２９４株を形質転換し、テトラサイクリン５μg／ml
を含むＬＢ培地上にプレートし、そして１２のテトラサ
イクリン耐性コロニーを選択した。プラスミドを各々の
コロニーから単離し、そしてＥcoＲＩとＸbaＩを使用す
る制限エンドヌクレアーゼ分析によってＤＮＡ挿入物の
存在を調べた。挿入物を含んだ１つのプラスミドをpＨ
ＫＹ１と命名した。
【００５７】IV．trpのリーダーペプチドの６つのアミ
ノ酸とtrpＥポリペプチドの終わりの３分の１(ＬＥ’と
称す)と異種構造遺伝子産物から成る特異的に切断し得
る融合蛋白を発現することが可能な、トリプトファンオ
ペロンを含むプラスミドの創製 ＬＥ’融合蛋白の発現プラスミドの創製のための戦略を
実施するには次の工程が必要であった。 a．暗号化鎖の５’末端にＢglII、３’末端にＥcoＲＩ
粘着末端を持ったＬＥ’ポリペプリドの遠位領域のため
のコドンから成る遺伝子断片の準備。 b．ＬＥ’遺伝子断片の遠位領域からのそのコドンの除
去及びプラスミドＳＯＭ７△２からのtrpＤ遺伝子のコ
ドンの除去、および段階１で形成された断片を挿入し、
ソマトスタチンのための異種遺伝子のすぐ上流にＬＥ’
コドン配列を再構成すること。
【００５８】１．図９に示した様に、プラスミドpＳom
７△２をＨindIIIで消化し、続いてＬＥ’暗号化領域内
のＢglII制限部位を越えて消化する様に選択された条件
下で、λエキソヌクレアーゼ(５’から３’へのエキソヌ
クレアーゼ)により消化した。２０μgのＨindIII−消化
pＳom７△２を緩衝液(２０mＭ グリシン緩衝液 pＨ９.
６、１mＭ ＭgＣl2、１mＭ β−メルカプトエタノール)
に溶解した。生じた混合物を、５単位のλエキソヌクレ
アーゼで６０分間室温にて処理した。得られた反応混合
物をフェノール抽出、クロロホルム抽出及びエタノール
沈澱にかけた。最終的にＬＥ’遺伝子断片の遠位末端に
ＥcoＲＩ残基をつくるため、改良ホスホトリエステル法
[Ｒ.Ｃrea et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７
５、５７６５(１９７８)]によってプライマー32ＰＣＣ
ＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴを合成し、そしてこれを、λエキ
ソヌクレアーゼ消化によって得られたＬＥ’遺伝子断片
の１本鎖末端へハイブリダイズした。このハイブリダイ
ゼーションは次に述べる方法で行なった。
【００５９】プラスミドpＳom７△２由来のλエキソヌ
クレアーゼ処理したＨindIII消化生産物２０μgを２０
μlの水に溶解し、そして上記の５’−リン酸化オリゴ
ヌクレオチド約８０ピコモルを含む溶液６μlと混合し
た。この合成された断片をＬＥ’暗号化配列の３’末端
にハイブリダイズし、残ったＬＥ’断片の１本鎖部分
を、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰそしてdＣＴＰを使用す
る前述のＫlenowポリメラーゼＩ法によって満たした。
反応混合物を５０℃まで熱し、ゆっくりと１０℃まで冷
やした後、Ｋlenow酵素４μlを加えた。１５分間室温で
インキュベートし、次に３０分間３７℃でインキュベー
トし、０.２５モルＥＤＴＡ ５μlの添加によって反応
を止めた。この反応混合物をフェノール抽出、クロロホ
ルム抽出そしてエタノール沈澱した。次にこのＤＮＡを
制限酵素ＢglIIで切断し、断片をＰＡＧＥで分けた。ゲ
ルから得られたオートラジオグラムは約４７０bpの予想
された長さの32Ｐでラベルされた断片の存在を示してお
り、これを電気溶出によって回収した。略述したよう
に、この断片ＬＥ’(d)はＢglIIとプライマーの開始部
に一致する平滑末端を持つ。
【００６０】前記第Ｉ部(Ｃ)に既述したプラスミドpＴh
α１は、暗号鎖の５’末端がＥcoＲＩ部位に、そしてそ
の３'末端がＢamＨＩ部位にクローンされたサイモシン
α１の構造遺伝子を持っている。図９および図１０に示
した様に、サイモシン遺伝子はＢglII部位をも含む。プ
ラスミドpＴhα１はまたアンピシリン耐性遺伝子を含ん
でいる。上で調製されたＬＥ’(d)断片の受容能力を持
つプラスミドを創製するためにpＴhα１をＥcoＲＩで消
化し、次にdＴＴＰとdＡＴＰを用いたＫlenowポリメラ
ーゼＩ反応でＥcoＲＩ残基を平滑にした。生じた生産物
のＢglII消化により、アンピシリン耐性遺伝子を含み、
そしてその両末端に粘着ＢglII残基と平滑末端を持った
線状ＤＮＡ断片３３を作成した。生じた生産物を、Ｔ４
リガーゼの存在下で、ＢglII粘着末端と平滑末端を持っ
たＬＥ’(d)断片と反応させることによって再環状化す
ることができ、この様にしてプラスミドpＴrp２４を作
成した(図１０)。このようにすることにより、平滑末端
連結が行なわれた位置でＥcoＲＩ部位が再生する。
【００６１】図１１に示した様に、ＢglIIとＥcoＲＩに
よるpＴrp２４の連続的消化、それに続くＰＡＧＥと電気
溶出によって、３’暗号化末端に隣接したＥcoＲＩ粘着
末端とＢglII粘着末端を持ったＬＥ’(d)ポリペプチド
のためのコドンを持つ断片が得られる。図１１に示した
様に、このＬＥ’(d)断片３８をプラスミドpＳom７△２
のＢglII部位にクローンすることができ、トリプトファ
ンプロモーター-オペレーターの制御下で発現させてＬ
Ｅ'ポリペプチド／ソマトスタチン融合蛋白を得ること
ができる。それを行なうために次の事が必要である。
(１)図１１に示されるように、トリプトファン・プロモ
ーター−オペレーターから遠位のＥcoＲＩ部位を切断す
るために、pＳom７△２を部分的にＥcoＲＩ消化するこ
と、及び(２)コドンの読み取り枠を適切に維持するた
め、及びＥcoＲＩ切断部位を再生するためにプライマー
配列(図９)を適切に選択すること。
【００６２】即ち、１６μgのプラスミドpＳom７△２を
２０mＭ トリス pＨ７.５、５mＭＭgＣl2、０.０２ＮＰ
４０清浄剤、１００mＭ ＮaＣlを含む緩衝液２００μl
で希釈し、０.５ユニットのＥcoＲＩで処理した。３７
℃で１５分後、反応混合物をフェノール抽出し、クロロ
ホルム抽出しそしてエタノール沈澱させ、そして続いて
ＢglIIで消化した。生じた大きな断片３６をＰＡＧＥ法
とそれに続く電気溶出によって単離した。この断片はＢ
glII部位から上流にあるＬＥ’ポリペプチドの近接部末
端に対するコドン“ＬＥ’(p)"を含んでいる。断片３６
を断片３８とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結してプ
ラスミドpＳom７△２△４を形成せしめ、これで前述の
ごとく大腸菌２９４株を形質転換すると、トリプトファ
ン・プロモーター−オペレーターの制御下で、完全に再
構築されたＬＥ'ポリペプチドとソマトスタチンから成
る融合蛋白が効率的に生産された。融合蛋白からソマト
スタチンは、ソマトスタチン配列の５’末端のメチオニ
ンの存在のために特異的に切断し得るが、この融合蛋白
を前述のようにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって分離した。融合蛋白生産物は図１２のレーン６
に明確なバンドとして観察される。これについては下記
第VI部でもっと詳細に論議する。
【００６３】Ｖ．テトラサイクリン耐性がトリプトファ
ン・プロモーター−オペレーターの制御下に置かれてい
るtrpＬＥ’ポリペプチド融合物発現系の創製 トリプトファン・オペロンの支配下にＬＥ’融合蛋白と
して発現させるための広範囲の異種ポリペプチド遺伝子
を受け入れ得る発現媒体創製のための戦略には次の性質
を持つプラスミドの構築が必要である。 １．テトラサイクリン耐性を指定している遺伝子を制御
するプロモーター−オペレーター系が切除された場合に
は、失われるであろうテトラサイクリン耐性。 ２．テトラサイクリン耐性を制御するプロモーター−オ
ペレーター系を除去し、異種遺伝子およびこれに対して
適切な解読相内にあるトリプトファン・プロモーター−
オペレーター系と連結することにより再環状化して、テ
トラサイクリン耐性を回復し、かくして異種遺伝子挿入
物を含むプラスミドの同定ができること。
【００６４】簡単に、そして意図する挿入物の性質に照
らして言うならば、ここでの目的は、その３’末端にＰ
st残基を持ち且つその５’末端にＢglII残基を持ち、か
つ、プロモーター−オペレーター系の制御下に置いた時
テトラサイクリン耐性を指定し得る遺伝子を囲んでい
る、線状ＤＮＡ片を創製することである。即ち、図１４
を参照しながら説明すると、プラスミドpＢＲ３２２を
ＨindIIIで消化しそして突出したＨindIII末端を、こん
どはＳ１ヌクレアーゼで消化した。Ｓ１ヌクレアーゼ消
化は、１０μgのＨindIII切断したpＢＲ３２２を３０μ
lのＳ１緩衝液(０.３Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＺnＣl2、２５m
Ｍ 酢酸ナトリウム pＨ４.５)に含まれる３００単位の
Ｓ１ヌクレアーゼで３０分間１５℃で処理することから
なる。３０×Ｓ１ヌクレアーゼ停止溶液(０.８Ｍ トリ
ス塩基、５０mＭ ＥＤＴＡ)１μlの添加によって反応を
停止させた。混合物をフェノール抽出し、クロロホルム
抽出しそしてエタノール沈澱させ、次に前に記述したよ
うにしてＥcoＲＩ消化し、そして大きな断片４６をＰＡ
ＧＥ法とそれに続く電気溶出によって単離した。得られ
た断片は第１のＥcoＲＩ粘着末端と第２の平滑末端を持
ち、後者の暗号化鎖はヌクレオチド、チミジンで始ま
る。後述するが、チミジンで始まるＳ１消化したＨindI
II残基は、ＫlenowポリメラーゼＩ処理したＢglII残基
と連結することができ、この連結によってＢglII制限部
位を再生させることができる。
【００６５】上記第１部で調製したプラスミドpＳom７
△２を、ＢglIIで消化し、そして生成したＢglII粘着末
端を、４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェートす
べてを使用して、ＫlenowポリメラーゼＩ法で２本鎖に
した。生成した生産物をＥcoＲＩ切断し、続いてＰＡＧ
Ｅ及び電気溶出によって得た小断片４２は、トリプトフ
ァンプロモーター−オペレーター及びＢglII部位から上
流にあるＬＥ’“基部"配列のコドン(“ＬＥ’(p)")を
含む線状ＤＮＡ断片である。この生産物はＥcoＲＩ末端
と、ＢglII部位を満たして生じた平滑末端を持つ。しか
しながらこのＢglII部位は断片４２の平滑末端と断片４
６の平滑末端との連結によって再生される。即ち、２つ
の断片をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結して再環状
化したプラスミドpＨＫＹ１０(図１４参照)を形成さ
せ、これをコンピテントな大腸菌２９４細胞へ形質転換
することによって増殖した。組み換えプラスミドpＨＫ
Ｙ１０を持つテトラサイクリン耐性細胞を増殖させ、プ
ラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＢglIIとＰstで順に消
化し、つづいてＰＡＧＥ法と電気溶出によってＰstとＢ
glII粘着末端を持つ大断片である線状ＤＮＡ片を単離し
た。このＤＮＡ断片４９は複製起源を含んでおり、これ
は、trpＬＥ’ポリペプチド融合蛋白暗号化遺伝子とテ
トラサイクリン耐性遺伝子の両者がtrpプロモーター／
オペレーターの制御下にあるプラスミドの構築における
第１の構成分として有用であることがわかった。
【００６６】すでに第IV部で調製したプラスミドpＳom
７△２△４は、多種多様の異種構造遺伝子を受容し得る
系のための第２の構成分となるよう操作することができ
た。図１３を参照しながら説明すると、このプラスミド
を部分的にＥcoＲＩ消化し(第IV部参照)、次にＰstで消
化し、trpプロモーター／オペレーターを含む断片５１
をＰＡＧＥとつづく電気溶出により単離した。部分的Ｅ
coＲＩ消化は、ソマトスタチン遺伝子の５’末端に隣接
したところは切断されているが、アンピシリン耐性遺伝
子とtrpプロモーター−オペレーターの間に存在するＥc
oＲＩ部位は切断されていない断片を得るために必要で
あった。アンピシリン耐性遺伝子内のＰstＩ切断によっ
て失われたアンピシリン耐性は、断片５１との連結によ
って回復することができた。
【００６７】第３構成分の最初の実例として、ＥcoＲＩ
とＢamＨ１によるプラスミドpＴhα１の消化によってサ
イモシンα１の構造遺伝子を得た。この断片５２はＰＡ
ＧＥと電気溶出によって精製した。３つの遺伝子断片４
９、５１及び５２を図１３に描写されている適切な方向
で連結し、プラスミドpＴhα７△１△４を形成すること
ができた。これはアンピシリンとテトラサイクリン耐性
の回復によって選択することができた。このプラスミド
を大腸菌２９４株へ形質転換し、第Ｉ部に記述したよう
な条件下で増殖させるとtrpＬＥ’ポリペプチド融合蛋
白を発現し、それからサイモシンα１をシアン化臭素処
理によって特異的に切り出すことができた。同様にし
て、ＥcoＲＩ及びＢamＨ１末端を持つ他の異種構造遺伝
子をpＨＫＹ−１０由来の、およびpＳＯＭ７△２△４由
来の構成成分と連結した場合も、それらの異種遺伝子が
暗号化しているポリペプチドを含むtrpＬＥ’ポリペプ
チド融合蛋白が効率良く得られた。図１２は大腸菌２９
４株の形質転換株からの全細胞蛋白のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による分離を示しており、各々の
場合の最も黒いバンドがトリプトファン・プロモーター
−オペレーター系の制御下で生産された融合蛋白生産物
を表わしている。
【００６８】図１２においてレーン１は大腸菌２９４／
pＢＲ３２２からの全細胞蛋白を分離した対照である。
レーン２は第IV部で調製されたプラスミドpＳom７△２
△４からのソマトスタチン融合生産物を含んでいる。レ
ーン３はpＳom７△１△４のソマトスタチンを含む発現
生産物である。レーン４はpＴhα７△１△４の発現生産
物を含み、一方レーン５はすでに論じたpＨＫＹ−１０
由来の断片およびpＳom７△２△４由来の断片を、本発
明者らのうちある者が一部調製したヒトプロインシュリ
ンを暗号化しているＥcoＲＩ／ＢamＨＩ末端の構造遺伝
子と連結して得たプラスミドから発現された生産物を含
んでいる。レーン６及び７は、ヒトインシュリンのＢ及
びＡ鎖を切り出すことができるtrpＬＥ’ポリペプチド
融合蛋白を、各々最も黒いバンドとして含んでいる。イ
ンシュリンのＢ及びＡ構造遺伝子は各々プラスミドpＩ
Ｂ１およびpＩＡ１１のＥcoＲＩとＢamＨ１の消化によ
って得られた。これらの構築は、Ｄ.Ｖ.ＧoeddelらのＰ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７６、１０６(１９７
９)に記載されている。レーン８は記述した如く、サイ
ズマーカーを含んでいる。
【００６９】以上、本発明の最も好適な具体例を、大腸
菌を例にとって記述したが、他の腸内細菌も同様に発現
のための宿主細胞として、およびtrpオペロン源として
使用することができる。これら細菌の例として、サルモ
ネラ・テフィムリウム(Ｓalmonella typhimurium)そし
てセラチア・マルセスセンス(Ｓerratia marcesens)が
挙げられる。それ故、本発明は記述した好適具体例にの
み限定されるものではなく、前述の特許請求の範囲によ
ってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 trpＤポリペプチドの一部と融合した異種遺
伝子(これらは後で切り離される)を発現する能力を持つ
プラスミドを形成するための好適な計画図である。図
中、trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、ＡpR＝
アンピシリン耐性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、Ｔ
cR＝テトラサイクリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺
伝子、lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター
−オペレーター、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝
子。
【図２】 trpＤポリペプチドの一部と融合した異種遺
伝子(これらは後で切り離される)を発現する能力を持つ
プラスミドを形成するための好適な計画図である。図
中、trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、ＡpR＝
アンピシリン耐性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、Ｔ
cR＝テトラサイクリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺
伝子、lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター
−オペレーター、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝
子。
【図３】 同種(trpＤ’)−異種(ソマトスタチン又はサ
イモシンα１)融合蛋白を含む細胞蛋白のポリアクリル
アミドゲル分離の結果を示す図である。
【図４】 trpプロモーター−オペレーター系の制御下
に異種遺伝子(ヒト成長ホルモン)を直接発現できるプラ
スミドの創製の好適な計画の逐次段階図である。図中、
trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、ＡpR＝アン
ピシリン耐性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝
テトラサイクリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝
子、lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター−
オペレーター、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図５】 trpプロモーター−オペレーター系の制御下
に異種遺伝子(ヒト成長ホルモン)を直接発現できるプラ
スミドの創製の好適な計画の逐次段階図である。図中、
trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、ＡpR＝アン
ピシリン耐性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝
テトラサイクリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝
子、lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター−
オペレーター、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図６】 trpプロモーター−オペレーター系の制御下
に異種遺伝子(ヒト成長ホルモン)を直接発現できるプラ
スミドの創製の好適な計画の逐次段階図である。図中、
trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、ＡpR＝アン
ピシリン耐性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝
テトラサイクリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝
子、lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター−
オペレーター、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図７】 trpプロモーター−オペレーター系の制御下
で直接発現されたヒト成長ホルモンを含む細胞蛋白のポ
リアクリルアミドゲルによる分離の結果を示す図であ
る。
【図８】 後刻、融合物から切除しうるtrpＥポリペプ
チド部分と融合した異種遺伝子(図の場合はソマトスタ
チン)を発現する能力を持つプラスミドの創製の好適な
計画の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trpプロモー
ター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐性、ＴcS＝
テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイクリン耐
性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.＝ラクト
ース・オペロンのプロモーター−オペレーター、ＨＧＨ
gene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図９】 後刻、融合物から切除しうるtrpＥポリペプ
チド部分と融合した異種遺伝子(図の場合はソマトスタ
チン)を発現する能力を持つプラスミドの創製の好適な
計画の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trpプロモー
ター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐性、ＴcS＝
テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイクリン耐
性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.＝ラクト
ース・オペロンのプロモーター−オペレーター、ＨＧＨ
gene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図１０】 後刻、融合物から切除しうるtrpＥポリペ
プチド部分と融合した異種遺伝子(図の場合はソマトス
タチン)を発現する能力を持つプラスミドの創製の好適
な計画の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trpプロモ
ーター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐性、ＴcS
＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイクリン耐
性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.＝ラクト
ース・オペロンのプロモーター−オペレーター、ＨＧＨ
gene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図１１】 後刻、融合物から切除しうるtrpＥポリペ
プチド部分と融合した異種遺伝子(図の場合はソマトス
タチン)を発現する能力を持つプラスミドの創製の好適
な計画の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trpプロモ
ーター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐性、ＴcS
＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイクリン耐
性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.＝ラクト
ース・オペロンのプロモーター−オペレーター、ＨＧＨ
gene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図１２】 それぞれソマトスタチン、サイモシンα
１、ヒトプロインシュリン並びにヒトインシュリンのＡ
およびＢ鎖の生産のための、同種(trpＥ)−異種融合蛋
白を含む細胞蛋白のポリアクリルアミドゲルによる分離
の結果を示す図である。
【図１３】 図８〜図１１までの計画によって創製した
プラスミドを操作して、他の異種遺伝子をtrpＥポリペ
プチド配列との融合物として、交換可能の型で発現する
系とする方法の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trp
プロモーター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐
性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイ
クリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.
＝ラクトース・オペロンのプロモーター−オペレータ
ー、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
【図１４】 図８〜図１１までの計画によって創製した
プラスミドを操作して、他の異種遺伝子をtrpＥポリペ
プチド配列との融合物として、交換可能の型で発現する
系とする方法の逐次段階図である。図中、trp p.o＝trp
プロモーター−オペレーター、ＡpR＝アンピシリン耐
性、ＴcS＝テトラサイクリン感受性、ＴcR＝テトラサイ
クリン耐性、ＳＯＭ＝ソマトスタチン遺伝子、lac p.o.
＝ラクトース・オペロンのプロモーター−オペレータ
ー、ＨＧＨgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/71 // Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ 9284−4Ｃ Ｈ 9284−4Ｃ 39/395 Ｂ 9284−4Ｃ (72)発明者 ハーバート・エル・ヘイネッカー アメリカ合衆国カリフォルニア州バーリン ガム・イーストンドライブ2621 (72)発明者 ギウセッペ・エフ・ミオザリ スイス国ツェーハー−4310ラインフェルダ ー・アウガルテン・イム フェーバーブッ シュ９

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリペプチドを暗号化している構造遺伝
    子を細菌内で発現させることによって該ポリペプチド生
    産物を製造するための方法であって、 (a)以下の要素： (i)細菌のtrpプロモーター−オペレーター系； (ii)要素(iv)の翻訳のためのリボソーム結合部位を暗号
    化しているヌクレオチド； (iii)要素(iv)の翻訳のための翻訳開始信号を暗号化し
    ているヌクレオチド；及び (iv)異種ポリペプチドのアミノ酸配列を暗号化している
    構造遺伝子；を暗号鎖の最初の５’末端から３’末端ま
    での相内に含有しているが、trpのアティニュエーショ
    ン能及びtrpＥのリボソーム結合部位を暗号化している
    ヌクレオチドを両者とも含有していない２本鎖ＤＮＡ配
    列を有する複製可能なプラスミド発現媒体で形質転換し
    た細菌接種物を調製し； (b)該形質転換接種物を発酵容器に移し、これを、該プ
    ロモーター−オペレーター系を抑制するのに充分な量の
    添加トリプトファンを含む適切な栄養培地で予定の水準
    となるまで増殖させ;そして (c)該細菌から該添加物を除去して、該系を脱抑制し、
    そして該構造遺伝子が暗号化している生産物を発現させ
    る；ことからなる方法。
  2. 【請求項２】 該構造遺伝子によって発現されるポリペ
    プチドが完全に異種のものである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 発現されるポリペプチドが異種ポリペプ
    チドと同種ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一
    部分から成る融合蛋白である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該一部分がコリスミン酸からトリプトフ
    ァンへの生合成経路に関与する酵素のアミノ酸配列の一
    部分である請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 異種ポリペプチドが生物活性なポリペプ
    チドであり、融合した同種ポリペプチドが特異的に切断
    し得る生物不活性なポリペプチドである請求項４記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 同種のポリペプチドがtrpＥポリペプチ
    ドであり、リボソーム結合部位がtrpリーダー・ポリペ
    プチドのためのリボソーム結合部位である請求項３記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 同種のポリペプチドがtrpＤポリペプチ
    ドである請求項３記載の方法。
  8. 【請求項８】 融合蛋白が異種ポリペプチドと同種ポリ
    ペプチドから成り、同種ポリペプチドそれ自体がtrpリ
    ーダー・ポリペプチドの最初の約６つのアミノ酸とtrp
    Ｅポリペプチド遺伝子の遠位の少なくとも約３分の１に
    よって暗号化されているアミノ酸配列との融合物を構成
    している請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 トリプトファンの除去を、該添加物の添
    加の停止と、該接種物を最初に増殖させる発酵培地の希
    釈によって行なう請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 宿主細菌が大腸菌である請求項９記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 異種ポリペプチドがヒト成長ホルモ
    ン、ヒトプロインシュリン、ソマトスタチン、サイモシ
    ンα1、ヒトインシュリンＡ鎖及びヒトインシュリンＢ
    鎖から成る群より選ばれる回収可能なポリペプチドから
    成る請求項１記載の方法。
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