DE69938190T2 - Gene mit veränderter expression in metastatischen brust- oder dickdarm- krebszellen - Google Patents

Gene mit veränderter expression in metastatischen brust- oder dickdarm- krebszellen Download PDF

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Vorhersage des Verhaltens von Tumoren. Spezieller betrifft die Erfindung Verfahren, bei denen eine Tumorprobe auf die Expression einer spezifizierten Gensequenz untersucht wird, um dadurch eine Neigung für die metastatische Ausbreitung anzugeben.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Brustkrebs ist eine der am weitesten verbreiteten malignen Erkrankungen bei Frauen, wobei pro Jahr weltweit etwa 1.000.000 neue Fälle auftreten. Dickdarmkrebs bzw. Colonkrebs ist eine weitere der am weitesten verbreiteten Krebsarten. Trotz der Verwendung einer Anzahl von histochemischen, genetischen und immunologischen Markern, ist es für Kliniker immer noch schwierig, vorherzusagen, welche Tumore Metastasen in anderen Organen bilden werden. Einige Patienten benötigen eine adjuvante Therapie, um das Wiederauftreten und eine Metastase zu verhindern, und andere nicht. Jedoch ist die Unterscheidung zwischen diesen Subpopulationen von Patienten nicht einfach bzw. geradlinig, und der Behandlungsverlauf ist nicht einfach festzulegen. Es besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf an neuen Markern zum Unterscheiden zwischen Tumoren, die metastasieren werden oder metastasiert haben, und denen, bei denen ein Metastasieren weniger wahrscheinlich ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Marker zum Unterscheiden zwischen Tumoren, die metastasieren werden oder metastasiert haben, und denen, bei denen ein Metastasieren weniger wahrscheinlich ist, bereitzustellen. Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden durch eine oder mehrere der unten beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung stellt ein isoliertes und gereinigtes humanes Protein bereit, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu wenigstens 85% identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird, wobei das Protein das unterschiedliche Expressionsprofil des durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codierten Proteins teilt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Fusionsprotein bereit, das einen ersten Proteinabschnitt und einen zweiten Proteinabschnitt, miteinander mittels einer Peptidbindung fusioniert, umfasst. Der erste Proteinabschnitt besteht aus wenigstens sechs zusammenhängenden Aminosäuren, ausgewählt aus einer Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Zubereitung von Antikörpern bereit, die spezifisch an ein humanes Protein binden, das eine Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird, umfasst.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Polynucleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus:
    • (a) dem Polynukleotid von SEQ ID NO: 28;
    • (b) einem Polynukleotid, welches zu der Sequenz von SEQ ID NO: 28 komplementär ist und
    • (c) einem Polynukleotid, welches zu wenigstens 95% identisch zu der Sequenz von SEQ ID NO: 28 über seine gesamte Länge ist, wobei das Polynukleotid, das zu wenigstens 95% identisch ist, mit einem Polynukleotid hybridisiert, das das unterschiedliche Expressionsprofil der entsprechenden SEQ ID NO: 28 teilt.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von metastatischen bzw. metastasierenden Tumorzellen in einer Gewebeprobe bereit. Ein Expressionsprodukt eines Gens, welches die Sequenz von SEQ ID NO: 28 umfasst, wird in einer Gewebeprobe gemessen. Eine Gewebeprobe, die das Produkt nicht exprimiert, wird als metastatisch kategorisiert.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen des metastatischen Potentials in einer Gewebeprobe bereit. Ein Expressionsprodukt eines Gens, welches die Sequenz von SEQ ID NO: 28 umfasst, wird in einer Gewebeprobe gemessen. Eine Gewebeprobe, die das Produkt nicht exprimiert, wird als ein metastatisches Potential besitzend kategorisiert.
  • Hierin wird eine Anzahl von Genen und Proteinen, die als Marker der Metastase verwendet werden können, beschrieben. Diese sind für ein rationaleres Verordnen des Therapieablaufs für Brust- oder Dickdarmkrebs-Patienten nützlich.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass eine Anzahl von Genen zwischen metastatischen Krebszellen, insbesondere Krebszellen der Brust und des Dickdarms, und nicht-metastatischen Krebszellen differentiell bzw. unterschiedlich bzw. unterscheidend exprimiert wird. Diese Gene sind Metastasemarkergene. Diese Information kann eingesetzt werden, um diagnostische Reagentien, die für die Expressionsprodukte der unterschiedlich exprimierten Gene spezifisch sind, herzustellen. Sie kann auch in diagnostischen und prognostischen Verfahren verwendet werden, die Kliniker bei der Planung von geeigneten Behandlungsregimen für Krebs, insbesondere der Brust oder des Dickdarms, unterstützen.
  • Einige der hierin offenbarten Polynucleotide stellen neue Gene dar, die zwischen nicht-metastatischen Krebszellen und Krebszellen, die ein Potential zum Metastasieren besitzen, unterschiedlich exprimiert werden. Die SEQ ID NOS: 1–63 stellen neue Metastasemarkergene dar (Tabelle 1). Die SEQ ID NOS: 64–85 stellen bekannte Gene dar, bei denen in metastatischen Krebszellen eine unterschiedliche Expression relativ zu nicht-metastatischen Krebszellen festgestellt wurde (Tabelle 2). Einige der hierin offenbarten Metastasemarkergene werden, relativ zu nicht-metastatischen Zellen, in metastatischen Zellen, insbesondere in Brustkrebszellen, die Me tastasen im Knochen und in der Lunge bilden, exprimiert (SEQ ID NOS: 1, 5, 11, 18, 20, 22, 24, 30, 33, 35, 36, 38, 45, 52, 58, 65, 66, 70, 74, 76 und 80). Ein Metastasemarkergen (SEQ ID NO: 56) wird in nicht-metastatischen Brustkrebszellen und in Dickdarmkrebszellen mit geringem metastatischen Potential exprimiert. Andere Metastasemarkergene werden in metastatischen Krebszellen exprimiert, insbesondere Brustkrebszellen, die nur in der Lunge Metastasen bilden (SEQ ID NOS: 2, 4, 9, 13, 14, 19, 26, 29, 39–41, 48, 55, 57, 60, 63, 64, 72, 73, 82 und 83). Noch andere Metastasemarkergene (SEQ ID NOS: 3, 7, 8, 10, 12, 15–17, 21, 23, 28, 31, 34, 37, 42–44, 46, 47, 49, 61, 62, 67, 68, 75, 77–79, 81, 84 und 85) werden in Krebszellen exprimiert, die nicht typischerweise metastasieren, insbesondere in Brustkrebszellen. Die Identifizierung dieser Beziehungen und Marker erlaubt die Formulierung von Reagentien und Verfahren, wie sie untenstehend weiter beschrieben sind. Andere Metastasemarkergene, wie z. B. die, die eine Nucleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NOS: 6, 27, 32 und 54, umfassen, können verwendet werden, um kanzeröses Gewebe, insbesondere Brustkrebsgewebe, zu identifizieren.
  • Sequenzen von Metastasemarkergenen sind in den SEQ ID NOS: 1–85 offenbart. Metastasemarkerproteine können mittels Expression der offenbarten Polynucleotidmoleküle hergestellt werden. Aminosäuresequenzen, die durch die neuen Polynucleotide der Erfindung codiert werden, können vorhergesagt werden, indem ein Translationsprogramm für jeden der drei Leserahmen für eine offenbarte Sequenz und ihr Komplement laufen gelassen wird. Vollständige Polynucleotidsequenzen können durch Chromosomen-Walking bzw. abschnittsweises Durchsequenzieren von Chromosomen, Durchmusterung von Bibliotheken auf überlappende Klone, 5'-RACE oder andere Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, erhalten werden.
  • Eine Bezugnahme auf Metastasemarkernucleotid- oder -aminosäuresequenzen umfasst Varianten, die ähnliche Expressionsmuster in metastatischen Zellen, relativ zu nicht-metastatischen Zellen, aufweisen, wie unten beschrieben. Metastasemarkerpolypeptide können sich hinsichtlich der Länge von Volllängen-Metastasemarkerproteinen unterscheiden und können wenigstens 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180 oder 200 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren eines Metastasemarkerproteins enthalten.
  • Varianten von Markerproteinen und -polypeptiden können ebenfalls vorkommen. Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten können natürlich oder nicht-natürlich vorkommend sein. Natürlich vorkommende Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten werden in Menschen oder anderen Arten gefunden und umfassen Aminosäuresequenzen, die im Wesentlichen identisch sind zu den Proteinen, die von Genen, die den Nucleotidsequenzen, gezeigt in SEQ ID NOS: 1–85, oder deren Komplementen entsprechen, codiert werden. Nicht-natürlich vorkommende Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten, die im Wesentlichen die gleichen unterschiedlichen Expressionsmuster in metastatischen Krebszellen, relativ zu nicht-metastatischen Krebszellen, beibehalten, wie natürlich vorkommende Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten sind hier ebenso umfasst. Vorzugsweise besitzen natürlich oder nicht- natürlich vorkommende Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten Aminosäuresequenzen, die zu wenigstens 85%, 90% oder 95% identisch sind zu den Aminosäuresequenzen, die durch die Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt sind, codiert werden. Bevorzugter sind die Moleküle zu wenigstens 98% oder 99% identisch. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen einem Wildtypprotein oder -polypeptid und einer Variante wird durch Abgleich bzw. Alignment des Wildtypproteins oder -polypeptids mit der Variante, um die größte Zahl von Aminosäureübereinstimmungen zu erhalten, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, Zählen der Zahl von Aminosäureübereinstimmungen zwischen dem Wildtyp und der Variante, und Teilen der Gesamtzahl der Übereinstimmungen durch die Gesamtzahl der Aminosäurereste der Wildtypsequenz bestimmt.
  • Aminosäureänderungen im Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten sind vorzugsweise konservative Aminosäureänderungen, d. h., Substitutionen von bzw. durch ähnlich geladene oder ungeladene Aminosäuren. Ein konservativer Aminosäureaustausch umfasst die Substitution von einer aus einer Familie von Aminosäuren, die hinsichtlich ihrer Seitenketten verwandt sind. Natürlich vorkommende Aminosäuren werden allgemein in vier Familien unterteilt: saure (Aspartat, Glutamat), basische (Lysin, Arginin, Histidin), unpolare (Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) und ungeladene polare (Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin) Aminosäuren. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert.
  • Es kann vernünftigerweise erwartet werden, dass eine isolierte Ersetzung eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonins durch ein Serin oder eine ähnliche Ersetzung einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keine große Auswirkung auf die biologischen Eigenschaften der resultierenden Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvariante haben wird. Eigenschaften und Funktionen von Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvarianten sind vom gleichen Typ, wie bei einem Metastasemarkerprotein oder -polypeptid, das Aminosäuresequenzen, die durch die in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen codiert werden, umfasst, obgleich die Eigenschaften und Funktionen im Grad bzw. Ausmaß variieren können. Ob eine Aminosäureänderung in einer Metastasemarkerprotein- oder -polypeptidvariante mit dem geeigneten unterschiedlichen Expressionsmuster resultiert, kann leicht festgestellt werden. Beispielsweise können Nucleotidsonden aus den hierin offenbarten Markergensequenzen ausgewählt und zum Detektieren von Markergen-mRNA in Northern-Blots oder in Gewebeschnitten verwendet werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Alternativ können Antikörper, die spezifisch an Proteinprodukte von Metastasemarkergenen binden, verwendet werden, um eine Expression von Metastasemarkerproteinen zu detektieren.
  • Metastasemarkervarianten umfassen glycosylierte Formen, aggregative bzw. Aggregationskonjugate mit anderen Molekülen und kovalente Konjugate mit nicht-verwandten chemischen Gruppierungen. Metastasemarkervarianten umfassen auch allelische Varianten, artbeding te Varianten ("species variants") und Muteine. Trunkierungen oder Deletionen von Regionen, die die unterschiedliche Expression von Metastasemarkergenen nicht beeinflussen, sind ebenso Metastasemarkervarianten. Kovalente Varianten können durch Verknüpfung von Funktionalitäten mit Gruppen, die in der Aminosäureseitenkette oder am N- oder C-terminalen Rest gefunden werden, hergestellt werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Volllängen-Metastasemarkerproteine können unter Verwendung von biochemischen Standardverfahren aus Metastasemarkerprotein-produzierenden humanen Zellen, wie metastatischen Brust- oder Dickdarmkrebszellen, extrahiert werden. Ein isoliertes und gereinigtes Metastasemarkerprotein oder -polypeptid wird von anderen Verbindungen getrennt, die normalerweise in einer Zelle mit einem Metastasemarkerprotein oder -polypeptid assoziieren, z. B. bestimmte Proteine, Kohlenhydrate, Lipide oder subzelluläre Organellen. Eine Zubereitung von isolierten und gereinigten Metastasemarkerproteinen oder -polypeptiden ist zu wenigstens 80% rein; vorzugsweise sind die Zubereitungen zu 90%, 95% oder 99% rein.
  • Metastasemarkerproteine und -polypeptide können auch mittels DNA-Rekombinationsverfahren oder mittels chemischer Syntheseverfahren produziert werden. Zur Produktion von rekombinanten Metastasemarkerproteinen oder -polypeptiden können codierende Sequenzen, ausgewählt aus den in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen, oder Varianten dieser Sequenzen, die für Metastasemarkerproteine codieren, in bekannten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystemen exprimiert werden (siehe unten). Bakterielle, Hefe-, Insekten- oder Säuger(zell)-Expressionssysteme können verwendet werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
  • Alternativ können chemische Syntheseverfahren, wie z. B. Festphasen-Peptidsynthese, verwendet werden, um ein Metastasemarkerprotein oder -polypeptid zu synthetisieren. Allgemeine Mittel zur Produktion von Peptiden, Analoga oder Derivaten sind dargelegt in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS - A SURVEY OF RECENT DEVELOPMENTS, Weinstein, B., Hrsg., Marcell Dekker, Inc., Verlag, New York (1983). Darüber hinaus kann eine Substitution des normalen L-Stereoisomeren durch D-Aminosäuren durchgeführt werden, um die Halbwertszeit des Moleküls zu erhöhen. Metastasemarkervarianten können auf ähnliche Weise produziert werden.
  • Nicht-natürlich vorkommende Fusionsproteine, die wenigstens 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180 oder 200 oder mehr zusammenhängende Metastasemarker-Aminosäuren umfassen, können ebenfalls konstruiert werden. Humane Metastasemarkerfusionsproteine sind verwendbar zum Erzeugen von Antikörpern gegen Metastasemarker-Aminosäuresequenzen und für eine Verwendung in zahlreichen Assaysystemen. Beispielsweise können Metastasemarkerfusionsproteine verwendet werden, um Proteine, die mit Metastasemarkerproteinen Wechselwirken und deren Funktionen beeinflussen, zu identifizieren. Physikalische Verfahren, wie z. B. Proteinaffinitätschromatographie, oder Bibliotheks-basierte Assays für Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie die Hefe-zwei-Hybrid- ("yeast two-hybrid") oder Phagendisplaysysteme, können ebenso für diesen Zweck verwendet werden. Derartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können auch als Wirkstoffscreenings verwendet werden.
  • Ein Metastasemarkerfusionsprotein umfasst zwei Proteinabschnitte, die miteinander mittels einer Peptidbindung fusioniert sind. Der erste Proteinabschnitt umfasst wenigstens 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180 oder 200 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren eines Metastasemarkerproteins. Die Aminosäuren können ausgewählt werden aus den Aminosäuresequenzen, die durch die Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt sind, codiert werden, oder aus Varianten dieser Sequenzen, wie die, die oben beschrieben sind. Der erste Proteinabschnitt kann auch ein Volllängen-Metastasemarkerprotein umfassen.
  • Der zweite Proteinabschnitt kann ein Volllängenprotein oder ein Proteinfragment oder Polypeptid sein. Das Fusionsprotein kann mit einem detektierbaren Marker markiert sein, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, z. B. mit einem radioaktiven, fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder biotinylierten Marker. Der zweite Proteinabschnitt kann ein Enzym sein, das ein detektierbares Produkt erzeugen wird, z. B. β-Galactosidase. Der erste Proteinabschnitt kann, je nachdem, wie es zweckdienlich ist, N-terminal oder C-terminal sein.
  • Techniken, um Fusionsproteine entweder rekombinant oder durch kovalentes Verknüpfen von zwei Proteinabschnitten herzustellen, sind ebenfalls gut bekannt. DNA-Rekombinationsverfahren können verwendet werden, um Metastasemarkerfusionsproteine herzustellen, z. B. indem ein DNA-Konstrukt, das codierende Sequenzen, ausgewählt aus den SEQ ID NOS: 1–85, im geeigneten Leserahmen mit Nucleotiden, die für den zweiten Proteinabschnitt codieren, umfasst, hergestellt wird und das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle, wie unten beschrieben, exprimiert wird.
  • Isolierte und gereinigte Metastasemarkerproteine, -polypeptide, -varianten oder -fusionsproteine können als Immunogene verwendet werden, um Zubereitungen von Antikörpern, die spezifisch an ein Metastasemarkerprotein binden, zu erhalten. Die Antikörper können, inter alia, verwendet werden, um Wildtyp-Metastasemarkerproteine in humanem Gewebe und Fraktionen davon zu detektieren. Die Antikörper können auch verwendet werden, um das Vorhandensein von Mutationen in Metastasemarkergenen, die in einer Unter- oder Überexpression eines Metastasemarkerproteins oder in einer Expression eines Metastasemarkerproteins mit einer veränderten Größe oder elektrophoretischen Mobilität resultieren, zu detektieren.
  • Zubereitungen von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern können unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Einzelkettige Antikörper können ebenso hergestellt werden. Einzelkettige Antikörper, die spezifisch an Metastasemarkerproteine, -polypeptide, -varianten oder -fusionsproteine binden, können z. B. aus Einzelketten-Immunglobulin-Display-Bibliotheken isoliert werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Die Bibliothek wird einem "Panning" gegen Metastasemarkerprotein-Aminosäuresequenzen unterworfen, und eine Anzahl von einzelkettigen Antikörpern, die mit hoher Affinität an verschiedene Epitope von Metastasemarkerproteinen binden, können isoliert werden. Hayashi et al., 1995, Gene 160: 129–30. Einzelkettige Antikörper können auch unter Verwendung eines DNA-Amplifikationsverfahrens, wie der Polymerasekettenreaktion (PCR), unter Verwendung von Hybridom-cDNA als Matrize konstruiert werden. Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5: 507–11.
  • Einzelkettige Antikörper können mono- oder bispezifisch sein und können bivalent oder tetravalent sein. Die Konstruktion von tetravalenten, bispezifischen, einzelkettigen Antikörpern wird in Coloma und Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 159–63, beschrieben. Die Konstruktion von bivalenten, bispezifischen einzelkettigen Antikörpern wird in Mallender und Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269: 199–206, beschrieben.
  • Eine Nucleotidsequenz, die für den einzelkettigen Antikörper codiert, kann unter Verwendung einer manuellen oder automatisierten Nucleotidsynthese konstruiert, unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren in DNA-Expressionskonstrukte kloniert und in Zellen, die die codierende Sequenz exprimieren, eingeführt werden, wie unten beschrieben. Alternativ können einzelkettige Antikörper z. B. unter Verwendung der Technologie mit filamentösen Phagen direkt produziert werden. Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61: 497–501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165: 81–91.
  • Metastasemarker-spezifische Antikörper binden spezifisch an Epitope, die in einem Volllängen-Metastasemarkerprotein, das eine Aminosäuresequenz, codiert durch eine Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt ist, aufweist, vorhanden sind, an Metastasemarkerproteine oder an Metastasemarkervarianten, und zwar entweder alleine oder als Teil eines Fusionsproteins. Vorzugsweise sind Metastasemarker-Epitope nicht in anderen humanen Proteinen vorhanden. Typischerweise sind wenigstens 6, 8, 10 oder 12 zusammenhängende Aminosäuren erforderlich, um ein Epitop zu bilden. Jedoch können Epitope, die nicht zusammenhängende Aminosäuren involvieren, mehr, z. B. wenigstens 15, 25 oder 50 Aminosäuren, erfordern.
  • Antikörper, die spezifisch an Metastasemarkerproteine, -polypeptide, -fusionsproteine oder -varianten binden, liefern ein Detektionssignal, das wenigstens 5, 10 oder 20 Mal höher ist als ein Detektionssignal, das sich bei Verwendung in Western-Blots oder anderen immunchemischen Assays mit anderen Proteinen ergibt. Vorzugsweise detektieren Antikörper, die spezifisch an Metastasemarker-Epitope binden, keine anderen Proteine in immunchemischen Assays und können ein Metastasemarkerprotein, -polypeptid, -fusionsprotein oder eine -variante aus der Lösung immunpräzipitieren.
  • Antikörper können mittels Verfahren gereinigt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Vorzugsweise werden die Antikörper affinitätsgereinigt, indem die Antikörper über eine Säule geführt werden, an die ein Metastasemarkerprotein, -polypeptid, eine -variante oder ein -fusionsprotein gebunden ist. Die gebundenen Antikörper können anschließend z. B. unter Verwendung eines Puffers mit einer hohen Salzkonzentration aus der Säule eluiert werden.
  • Subgenomische Polynucleotide können weniger als ein ganzes Chromosom enthalten. Vorzugsweise sind die Polynucleotide Intron-frei. Die Polynucleotidmoleküle können eine zusammenhängende Sequenz von 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 32, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 74, 80, 90, 100, 125, 150, 154, 175, 182, 200, 243 oder 268 Nucleotiden, ausgewählt aus den SEQ ID NOS: 1–85 oder den Komplementen davon, umfassen. Das Komplement einer Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt ist, ist eine zusammenhängende Nucleotidsequenz, die Watson-Crick-Basenpaare mit einer zusammenhängenden Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt ist, bildet. Das Komplement einer Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt ist, (der Gegensinn- bzw. Antisense-Strang) ist ebenfalls ein subgenomisches Polynucleotid und kann verwendet werden, um Markerprotein-Gegensinn-Oligonucleotide bereitzustellen. Doppelsträngige Polynucleotide, die eine der in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen umfassen, sind ebenfalls subgenomische Polynucleotide. Subgenomische Metastasemarkerproteinpolynucleotide umfassen auch Polynucleotide, die für Metastasemarkerprotein-spezifische einzelkettige Antikörper und Ribozyme oder für Fusionsproteine, die Metastasemarkerprotein-Aminosäuresequenzen umfassen, codieren.
  • Degenerierte Nucleotidsequenzen, die für Aminosäuresequenzen von Metastasemarkerprotein und/oder -varianten codieren, sowie homologe Nucleotidsequenzen, die zu wenigstens 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% identisch zu den in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen sind, sind ebenfalls subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide. Typischerweise können homologe subgenomische Metastasemarker-Polynucleotidsequenzen durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, bestätigt werden. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen Wildtypsequenzen und homologen varianten Sequenzen wird durch Alignment des Wildtyp-Polynucleotids mit der Variante, um die größte Anzahl von Nucleotidübereinstimmungen zu erhalten, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, Zählen der Anzahl der Nucleotidübereinstimmungen zwischen dem Wildtyp und der Variante und Teilen der Gesamtzahl der Übereinstimmungen durch die Gesamtzahl der Nucleotide der Wildtypsequenz bestimmt. Ein bevorzugter Algorithmus zum Berechnen der prozentualen Identität ist der Smith-Waterman-Algorithmus zur Homologierecherche, wie er im MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) implementiert ist, wobei affine Lückensuche mit den folgenden Suchparametern bzw. Rechercheparametern verwendet wird: "gap open penalty" von 10 und "gap extension penalty" von 1.
  • Subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide können unter Verwendung von Standardtechniken der Nucleinsäurereinigung frei von anderen Nucleotidsequenzen isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise können Restriktionsenzyme und Sonden verwendet werden, um Polynucleotidfragmente zu isolieren, die Nucleotidsequenzen, die für ein Metastasemarkerprotein codieren, umfassen. Isolierte und gereinigte subgenomische Polynucleotide sind in Zubereitungen bzw. Präparationen, die frei oder zu wenigstens 90% frei von anderen Molekülen sind.
  • Komplementäre DNA-Moleküle, die für Metastasemarkerproteine codieren, können unter Verwendung von reverser Transkriptase mit Metastasemarker-mRNA als Matrize hergestellt werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder andere Amplifikationstechniken können verwendet werden, um subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide zu erhalten, wobei entweder humane genomische DNA oder (humane) cDNA als Matrize verwendet wird, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Alternativ können Synthesechemietechniken verwendet werden, um subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide zu synthetisieren, die codierende Sequenzen für Regionen von Metastasemarkerproteinen, einzelkettigen Antikörpern oder Ribozymen umfassen oder die Gegensinn-Oligonucleotide umfassen. Die Degeneriertheit des genetischen Codes ermöglicht es, abgeänderte ("alternate") Nucleotidsequenzen zu synthetisieren, die für ein Metastasemarkerprotein, das Aminosäuresequenzen, die durch die in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen codiert werden, umfasst, codieren werden.
  • Gereinigte und isolierte subgenomische Metastasemarker-Polynucleotide können als Primer verwendet werden, um zusätzliche Kopien der Polynucleotide zu erhalten, oder als Sonden zum Identifizieren von Sequenzen, codierend für Wildtyp- und Mutanten-Metastasemarkerprotein. Subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide können verwendet werden, um Metastasemarker-mRNA, -Protein, -Polypeptide oder -fusionsproteine zu exprimieren und um Metastasemarker-Gegensinn-Oligonucleotide und -Ribozyme zu erzeugen.
  • Ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid, das Metastasemarkerprotein-codierende Sequenzen umfasst, kann in einem Expressionskonstrukt verwendet werden. Vorzugsweise wird das subgenomische Metastasemarkerpolynucleotid in ein Expressionsplasmid inseriert (z. B. das Ecdyson-System, pIND, In Vitro Gene). Subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide können in Vektoren und Zelllinien unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, propagiert werden. Subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide können auf linearen oder zirkulären Molekülen sein. Sie können auf autonom replizierenden Molekülen oder auf Molekülen ohne Replikationssequenzen sein. Sie können durch ihre eigenen oder durch andere Regulationssequenzen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, reguliert werden.
  • Eine Wirtszelle, die ein Metastasemarker-Expressionskonstrukt umfasst, kann anschließend verwendet werden, um ein gesamtes oder einen Teil eines Metastasemarkerprotein(s) zu exprimieren. Wirtszellen, die Metastasemarker-Expressionskonstrukte umfassen, können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Eine Vielfalt von Wirtszellen ist für die Verwendung in bakteriellen, Hefe-, Insekten- und humanen Expressionssystemen verfügbar und kann verwendet werden, um Metastasemarker-Expressionskonstrukte zu exprimieren oder zu propagieren (siehe unten). Expressionskonstrukte können unter Verwendung einer beliebigen Technik, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, in Wirtszellen eingeführt werden. Diese Techniken umfassen Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfer, Transfektion mit nackten oder eingekapselten Nucleinsäuren, Liposom-vermittelte Zellfusion, intrazellulären Transport von DNA-beschichteten Latexkügelchen, Protoplastenfusion, virale Infektion, Elektroporation und Calciumphosphatvermittelte Transfektion.
  • Ein Metastasemarker-Expressionskonstrukt umfasst einen Promotor, der in einer gewählten Wirtszelle funktionell ist. Der Fachmann kann einen geeigneten Promotor leicht aus der großen Anzahl von Zelltyp-spezifischen Promotoren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und dort verwendet werden, auswählen. Das Expressionskonstrukt kann auch einen Transkriptionsterminator, der in der Wirtszelle funktionell ist, enthalten. Das Expressionskonstrukt umfasst einen Polynucleotidabschnitt, der für das/die/den gesamte(n) Metastasemarkerprotein, -variante, -fusionsprotein, -antikörper oder -ribozym oder einen Teil davon codiert. Der Polynucleotidabschnitt ist stromabwärts des Promotors lokalisiert. Die Transkription des Polynucleotidabschnitts beginnt am Promotor. Das Expressionskonstrukt kann linear oder zirkulär sein und kann, sofern gewünscht, Sequenzen für die autonome Replikation enthalten.
  • Bakterielle Systeme zum Exprimieren von Metastasemarker-Expressionskonstrukten umfassen die, die beschrieben sind in Chang et al., Nature (1978) 275: 615, Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544, Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057, EP 36 776 , U.S. 4 551 433 , deBoer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1983) 80: 21–25, und Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269.
  • Expressionssysteme in Hefe umfassen die, die beschrieben sind in Hinnen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; U.S. 4 837 148 ; US 4 929 555 ; Beach und Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr Genet. (1985) 10: 49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284–289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205–221; Yelton et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470–1474; Kelly und Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479; EP 244 234 und WO 91/00357 .
  • Die Expression von Metastasemarker-Expressionskonstrukten in Insekten kann durchgeführt werden, wie beschrieben in U.S. 4 745 051 ; Friesen et al. (1986), "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" in: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (W. Doerfler, Hrsg.); EP 127 839 ; EP 155 476 und Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765–776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409; Maeda et al., Nature (1985) 315: 592–594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404; Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273, und Martin et al., DNA (1988) 7: 99. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten sind beschrieben in Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47–55; Miller et al., in GENETIC ENGINEERING (Setlow, J. K. et al., Hrsg.), Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279, und Maeda et al., Nature (1985) 315: 592–594.
  • Die Expression von Metastasemarker-Expressionskonstrukten in Säugern kann erreicht werden, wie in Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761; Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777; Boshart et al., Cell (1985) 41: 521, und U.S. 4 399 216 beschrieben. Andere Merkmale der Expression von Metastasemarker-Expressionskonstrukten in Säugern können unterstützt bzw. ermöglicht werden, wie in Ham und Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44; Barnes und Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255; U.S. 4 767 704 ; US 4 657 866 ; US 4 927 762 ; US 4 560 655 , WO 90/103430 , WO 87/00195 und U.S. RE 30 985 beschrieben.
  • Subgenomische Polynucleotide, wie sie hierin beschrieben sind, können auch in Gen-Abgabevehikeln zum Zwecke der Abgabe einer Metastasemarker-mRNA oder eines Metastasemarkeroligonucleotids (entweder mit der Sequenz der nativen Metastasemarker-mRNA oder der ihres Komplements), eines Volllängen-Metastasemarkerproteins, eines Metastasemarkerfusionsproteins, eines Metastasemarkerpolypeptids oder eines Metastasemarker-spezifischen Ribozyms oder einzelkettigen Antikörpers in eine Zelle, vorzugsweise eine eukaryotische Zelle, verwendet werden. Ein Gen-Abgabevehikel kann z. B. nackte Plasmid-DNA, ein viraler Expressionsvektor, der ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid umfasst, oder ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid in Verbindung mit einem Liposom oder einem Kondensationsmittel sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Gen-Abgabevehikel einen Promotor und ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid. Bevorzugte Promotoren sind Gewebe-spezifische Promotoren und Promotoren, die durch Zellproliferation aktiviert werden, z. B. die Thymidinkinase- und Thymidylatsynthase-Promotoren. Andere bevorzugte Promotoren umfassen Promotoren, die durch Infektion mit einem Virus aktivierbar sind, wie z. B. die α- und β-Interferon-Promotoren, und Promotoren, die durch ein Hormon, wie z. B. Östrogen, aktivierbar sind. Andere Promotoren, die verwendet werden können, umfassen das Moloney-Virus-LTR, den CMV-Promotor und den Mausalbumin-Promotor.
  • Ein Metastasemarkergen-Abgabevehikel kann virale Sequenzen umfassen, z. B. einen viralen Replikationsursprung oder ein virales Verpackungssignal. Diese viralen Sequenzen können aus Viren, wie z. B. Astrovirus, Coronavirus, Orthomyxovirus, Papovavirus, Paramyxovirus, Parvovirus, Picornavirus, Pockenvirus, Retrovirus, Togavirus oder Adenovirus, ausgewählt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Metastasemarkergen-Abgabevehikel ein rekombinanter retroviraler Vektor. Rekombinante Retroviren und verschiedene Verwendungen davon sind in zahlreichen Referenzen beschrieben worden, einschließlich beispielsweise Mann et al., Cell 33: 153, 1983; Cane und Mulligan, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 6349, 1984; Miller et al., Human Gene Therapy, 1: 5–14, 1990; den US-Patenten Nrn. 4 405 712 , 4 861 719 und 4 980 289 , und den PCT-Anmeldungen Nrn. WO 89/02 468 , WO 89/05 349 und WO 90/02 806 . Zahlreiche retrovirale Gen-Abgabevehikel können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich beispielsweise der, die beschrieben sind in EP 0 415 731 ; WO 90/07936 ; WO 94/03622 ; WO 93/25698 ; WO 93/25234 ; US-Patent Nr. 5 219 740 ; WO 9311230 ; WO 9310218 ; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 3860–3864, 1993; Vile und Hart, Cancer Res. 53: 962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53: 83–88, 1993; Takamiya et al., J. Neurosa. Res. 33: 493–503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729–735, 1993 ( US-Patent Nr. 4 777 127 , GB 2 200 651 , EP 0 345 242 und WO 91/02805 ).
  • Besonders bevorzugte Retroviren sind abgeleitet aus Retroviren, die die Folgenden umfassen: das aviäre Leukosevirus (ATCC-Nrn. VR-535 und VR-247), das bovine Leukämievirus (VR-1315), das murine Leukämievirus (MLV), das Mink-cell-focus-inducing-Virus (Koch et al., J. Vir. 49: 828, 1984; und Oliff et al., J. Vir. 48: 542, 1983), das murine Sarkomvirus (ATCC-Nrn. VR-844, 45010 und 45016), das Reticuloendotheliosevirus (ATCC-Nrn. VR-994, VR-770 und 45011), das Rous-Sarkomvirus, das Mason-Pfizer-Affenvirus, das endogene Pavianvirus bzw. "baboon endogenous virus", das endogene feline Retrovirus (z. B. RD114) und Maus- oder Ratten-gL30-Sequenzen, die als retroviraler Vektor verwendet werden. Besonders bevorzugte MLV-Stämme, aus denen rekombinante Retroviren erzeugt werden können, umfassen 4070A und 1504A (Hartley und Rowe, J. Vir. 19: 19, 1976), Abelson (ATCC-Nr. VR-999), Friend (ATCC-Nr. VR-245), Graffi (Ru et al., J. Vir. 67: 4722, 1993; und Yantchev, Neoplasma 26: 397, 1979), Gross (ATCC-Nr. VR-590), Kirsten (Albino et al., J. Exp. Med. 164: 1710, 1986), das Harvey-Sarkomvirus (Manly et al., J. Vir. 62: 3540, 1988; und Albino et al., J. Exp. Med. 164: 1710, 1986) und Rauscher (ATCC-Nr. VR-998) und das Moloney-MLV (ATCC-Nr. VR-190). Ein besonders bevorzugtes Nicht-Maus-Retrovirus ist das Rous-Sarkomvirus. Bevorzugte Rous-Sarkomviren umfassen Viren der Typen Bratislava (Manly et al., J. Vir. 62: 3540, 1988; und Albino et al., J. Exp. Med. 164: 1710, 1986), Bryan high titer (z. B. ATCC-Nrn. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 und VR-728), Bryan Standard (ATCC-Nr. VR-140), Carr-Zilber (Adgighitov et al., Neoplasma 27: 159, 1980), Engelbreth-Holm (Laurent et al., Biochem Biophys Acta 908: 241, 1987), Harris, Prague (z. B. die ATCC-Nrn. VR-772 und 45033) und Schmidt-Ruppin (z. B. die ATCC-Nrn. VR-724, VR-725, VR-354).
  • Angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung und der Standard-Rekombinationstechniken (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, und Kunkle, PNAS 82: 488, 1985), die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können beliebige der oben genannten Retroviren leicht eingesetzt werden, um retrovirale Metastasemarkergen-Abgabevehikel zusammenzusetzen oder zu konstruieren. Teile von retroviralen Metastasemarker-Expressionsvektoren können aus verschiedenen Retroviren stammen bzw. abgeleitet sein. Z. B. können Retrovektor-LTRs aus einem murinen Sarkomvirus, einer tRNA-Bindungsstelle aus einem Rous-Sarkomvirus, einem Verpackungssignal aus einem murinen Leukämievirus und aus einem Ursprung der Zweitstrangsynthese aus einem aviären Leukosevirus stammen. Diese rekombinanten retroviralen Vektoren können verwendet werden, um Transduktions-kompetente retrovirale Vektorpartikel zu erzeugen, und zwar indem sie in geeig nete Verpackungszelllinien eingeführt werden (siehe Aktenzeichen 07/800 921, eingereicht am 29. November 1991). Es können rekombinante Retroviren produziert werden, die die ortsspezifische Integration des rekombinanten retroviralen Genoms in spezifische Regionen der Wirtszell-DNA steuern. Eine derartige ortsspezifische Integration kann durch eine chimäre Integrase, die in die retroviralen Partikel eingebaut ist, vermittelt werden (siehe Aktenzeichen 08/445 466, eingereicht am 22. Mai 1995). Es ist bevorzugt, dass das rekombinante virale Gen-Abgabevehikel ein replikationsdefizientes rekombinantes Virus ist.
  • Verpackungszelllinien, die zur Verwendung mit den oben beschriebenen retroviralen Gen-Abgabevehikeln geeignet sind, können leicht hergestellt (siehe Aktenzeichen 08/240 030, eingereicht am 9. Mai 1994; siehe auch WO 92/05266 ) und verwendet werden, um Produzentenzelllinien (auch als Vektorzelllinien oder "VCLs" bezeichnet) für die Produktion von rekombinanten viralen Partikeln herzustellen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Verpackungszelllinien, ausgehend von menschlichen (z. B. HT1080-Zellen) oder Nerz-Elternzelllinien hergestellt, wodurch die Produktion von rekombinanten retroviralen Gen-Abgabevehikeln ermöglicht wird, die dazu befähigt sind, eine Inaktivierung in humanem Serum zu überleben. Die Konstruktion von rekombinanten retroviralen Gen-Abgabevehikeln ist detailliert in der WO 91/02805 beschrieben. Diese rekombinanten retroviralen Gen-Abgabevehikel können verwendet werden, um Transduktions-kompetente retrovirale Partikel zu erzeugen, und zwar indem sie in geeignete Verpackungszelllinien eingeführt werden (siehe Aktenzeichen 07/800 921). In ähnlicher Weise können Adenovirus-Gen-Abgabevehikel ebenso angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung (siehe auch Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988, und Rosenfeld et al., Science 252: 431–434, 1991; WO 93/07283 , WO 93/06223 und WO 93/07282 ) eingesetzt werden.
  • Ein Metastasemarkergen-Abgabevehikel kann auch ein rekombinantes adenovirales Gen-Abgabevehikel sein. Derartige Vehikel können leicht angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung (siehe Berkner, Biotechniques 6: 616, 1988, und Rosenfeld et al., Science 252: 431, 1991; WO 93/07283 , WO 93/06223 und WO 93/07282 ) hergestellt und eingesetzt werden. Metastasemarkergen-Abgabevehikel, die auf dem Adeno-assoziierten Virus beruhen ("Adeno-associated viral metastatic marker gene delivery vehicles"), können ebenfalls konstruiert und verwendet werden, um Metastasemarker-Aminosäuren oder -Nucleotide abzugeben. Die Verwendung von Gen-Abgabevehikeln, basierend auf dem Adeno-assoziierten Virus, in vitro ist beschrieben in Chatterjee et al., Science 258: 1485–1488 (1992); Walsh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 89: 7257–7261 (1992); Walsh et al., J. Clin. Invest. 94: 1440–1448 (1994); Flotte et al., J. Biol. Chem. 268: 3781–3790 (1993); Ponnazhagan et al., J. Exp. Med. 179: 733–738 (1994); Miller et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 91: 10183–10187 (1994); Einerhand et al., Gene Ther. 2: 336–343 (1995); Luo et al., Exp. Hematol. 23: 1261–1267 (1995), und Zhou et al., Gene Therapy 3: 223–229 (1996). Die in vivo-Verwendung dieser Vehikel ist beschrieben in Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 90: 10613–10617 (1993), und Kaplitt et al., Nature Genet. 8: 148–153 (1994).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Metastasemarkergen-Abgabevehikel von einem Togavirus abgeleitet. Bevorzugte Togaviren umfassen Alpha-Viren, insbesondere die, die offenbart sind in der US (-Patentanmeldung) Aktzenzeichen 08/405 627, eingereicht am 15. März 1995, WO 95/07994 . Alpha-Viren, einschließlich Sindbis- und ELVS-Viren, können Gen-Abgabevehikel für Metastasemarkerpolynucleotide sein. Alpha-Viren sind beschrieben in WO 94/21792 , WO 92/10578 und WO 95/07994 . Mehrere unterschiedliche Alpha-Virus-Gen-Abgabevehikelsysteme können konstruiert und verwendet werden, um subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide an eine Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung abzugeben. Repräsentative Beispiele für derartige Systeme umfassen die, die in den US-Patenten 5 091 309 und 5 217 879 beschrieben sind. Besonders bevorzugte Alpha-Virus-Gen-Abgabevehikel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die, die in WO 95/07994 und U.S. Aktenzeichen 08/405 627 beschrieben sind.
  • Vorzugsweise ist das rekombinante virale Vehikel ein rekombinantes virales Alpha-Virus-Vehikel, basierend auf einem Sindbis-Virus. Sindbis-Konstrukte, sowie zahlreiche ähnliche Konstrukte, können leicht hergestellt werden, wie es im Wesentlichen in U.S. Aktenzeichen 08/198 450 beschrieben ist. Sindbis-Virus-Gen-Abgabevehikel umfassen typischerweise eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Sindbis-Virustranskription befähigt ist, eine Nucleotidsequenz, die für Sindbis-Nicht-Strukturproteine codiert, eine virale Verbindungsregion, die inaktiviert ist, so dass eine subgenomische Fragmenttranskription verhindert wird, und eine Sindbis-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. Gegebenenfalls kann die virale Verbindungsregion modifiziert sein, so dass eine subgenomische Polynucleotidtranskription verringert, erhöht oder aufrecht erhalten wird. Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass entsprechende Regionen aus anderen Alpha-Viren anstelle der oben Beschriebenen verwendet werden können.
  • Die virale Verbindungsregion eines von Alpha-Virus abgeleiteten Gen-Abgabevehikels kann eine erste virale Verbindungsregion, die inaktiviert worden ist, um die Transkription des subgenomischen Polynucleotids zu verhindern, und eine zweite virale Verbindungsregion, die so modifiziert worden ist, dass die subgenomische Polynucleotidtranskription verringert ist, umfassen. Ein von Alpha-Virus abgeleitetes Vehikel kann auch einen 5'-Promotor umfassen, der fähig ist, die Synthese von viraler RNA aus cDNA zu initiieren, und eine 3'-Sequenz, die die Transkriptionstermination kontrolliert.
  • Andere rekombinante togavirale Gen-Abgabevehikel, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen die, die abgeleitet sind aus: dem Semliki-Forest-Virus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), dem Middleberg-Virus (ATCC VR-370), dem Ross-River-Virus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), dem venezulanischen Pferdeencephalitisvirus (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532) und die, die in den US-Patenten 5 091 309 und 5 217 879 und in der WO 92/10578 beschrieben sind. Die oben beschriebenen Sindbis-Vehikel sowie zahlreiche ähnliche Konstrukte können leicht hergestellt werden, wie es im Wesentlichen in US Aktenzeichen 08/198 450 beschrieben ist.
  • Andere virale Gen-Abgabevehikel, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z. B. die, abgeleitet aus dem/den: Poliovirus (Evans et al., Nature 339: 385, 1989, und Sabin et al., J. Biol. Standardization 1: 115, 1973) (ATCC VR-58); Rhinovirus (Arnold et al., J. Cell. Biochem. L401, 1990) (ATCC VR-1110); Pockenviren, wie das Kanarienpockenvirus oder Vacciniavirus (Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17, 1990; U.S. 4 603 112 und U.S. 4 769 330 ; WO 89/01973 ) (ATCC VR-111; ATCC VR-2010); SV40(-Virus) (Mulligan et al., Nature 277: 108, 1979) (ATCC VR-305), (Madzak et al., J. Gen. Vir. 73: 1533, 1992); Influenzavirus (Luytjes et al., Cell 59: 1107, 1989; McMicheal et al., The New England Journal of Medicine 309: 13, 1983; und Yap et al., Nature 273: 238, 1978) (ATCC VR-797); Parvovirus, wie ein Adeno-assoziiertes Virus (Samulski et al., J. Vir. 63: 3822, 1989, und Mendelson et al., Virology 166: 154, 1988) (ATCC VR-645); Herpes simplex-Virus (Kit et al., Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219, 1989) (ATCC VR-977; ATCC VR-260); Nature 277: 108, 1979); humanen Immundefizienzvirus ( EPO 386 882 , Buchschacher et al., J. Vir. 66: 2731, 1992); Masernvirus ( EPO 440 219 ) (ATCC VR-24); A (ATCC VR-67; ATCC VR-1247); Aura (ATCC VR-368); Bebaru-Virus (ATCC VR-600; ATCC VR-1240); Cabassou (ATCC VR-922); Chikungunya-Virus (ATCC VR-64; ATCC VR-1241); Fort-Morgan(-Virus) (ATCC VR-924; Getah-Virus (ATCC VR-369; ATCC VR-1243); Kyzylagach(-Virus) (ATCC VR-927); Mayaro(-Virus) (ATCC VR-66); Mucambo-Virus (ATCC VR-580; ATCC VR-1244); Ndumu(-Virus) (ATCC VR-371); Pixuna-Virus (ATCC VR-372; ATCC VR-1245); Tonate(-Virus) (ATCC VR-925); Triniti(-Virus) (ATCC VR-469); Una(-Virus) (ATCC VR-374); Whataroa(-Virus) (ATCC VR-926), Y-62–33 (ATCC VR-375); O'Nyong-Virus; Eastern-Encephalitis-Virus (ATCC VR-65; ATCC VR-1242), Western-Encephalitis-Virus (ATCC VR-70; ATCC VR-1251; ATCC VR-622; ATCC VR-1252) und Coronavirus (Hamre et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 121: 190, 1966) (ATCC VR-740).
  • Ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid der Erfindung kann auch mit einem Kondensationsmittel kombiniert werden, um ein Gen-Abgabevehikel zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kondensationsmittel ein Polykation, wie Polylysin, Polyarginin, Polyornithin, Protamin, Spermin, Spermidin und Putrescin. Es sind viele geeignete Verfahren zur Herstellung von derartigen Verknüpfungen auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Aktenzeichen 08/366 787, eingereicht am 30. Dezember 1994).
  • In einer alternativen Ausführungsform ist ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid mit einem Liposom unter Bildung eines Gen-Abgabevehikels assoziiert. Liposome sind kleine Lipidvesikel, bestehend aus einem wässrigen Kompartiment, das von einer Lipid-Doppelschicht umschlossen bzw. eingeschlossen ist, typischerweise (sind es) sphärische oder geringfügig verlängerte Strukturen mit einem Durchmesser von mehreren hundert Angström. Unter geeigneten Bedingungen kann ein Liposom mit der Plasmamembran einer Zelle oder mit der Membran eines endocytischen Vesikels innerhalb einer Zelle, die das Liposom internalisiert hat, fusionieren, wodurch seine Inhalte in das Cytoplasma freigesetzt werden. Vor einer Wechselwirkung mit der Zelloberfläche wirkt die Liposomenmembran jedoch als eine relativ undurchlässige Barriere, die die Inhalte z. B. vor/von abbauenden Enzymen maskieren bzw. absondern und schützen würde. Da ein Liposom eine synthetische Struktur ist, können zusätzlich speziell konzipierte Liposome produziert werden, die wünschenswerte Merkmale enthalten. Siehe Stryer, Biochemistry, S. 236–240, 1975 (W. H. Freeman, San Francisco, CA); Szoka et al., Biochim. Biophys. Acta 600: 1, 1980; Bayer et al., Biochim. Biophys. Acta 550: 464, 1979; Rivnay et al., Meth. Enzymol. 149: 119, 1987; Wang et al., PNAS 84: 7851, 1987; Plant et al., Anal. Biochem. 176: 420, 1989, und U.S.-Patent 4 762 915 . Liposome können eine Vielfalt von Nucleinsäuremolekülen, einschließlich DNA, RNA, Plasmide und Expressionskonstrukte, umfassend subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide, wie die, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, einkapseln.
  • Liposomale Zubereitungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen kationische (positiv geladene), anionische (negativ geladene) und neutrale Zubereitungen. Es ist gezeigt worden, dass kationische Liposomen die intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413–7416, 1987), mRNA (Malone et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 6077–6081, 1989) und von gereinigten Transkriptionsfaktoren (Debs et al., J. Biol. Chem. 265: 10189–10192, 1990) in funktioneller Form vermitteln. Kationische Liposome sind leicht erhältlich. Z. B. sind N[1-2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)-Liposome unter der Marke Lipofectin von GIBCO BRL, Grand Island, NY, erhältlich. Siehe auch Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91: 5148–5152.87, 1994. Andere kommerziell erhältliche Liposome umfassen Transfectace (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer). Andere kationische Liposome können aus leicht erhältlichen Materialien unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Siehe z. B. Szoka et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 75: 4194–4198, 1978, und WO 90/11092 für Beschreibungen der Synthese von DOTAP (1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan)-Liposomen.
  • In ähnlicher Weise sind anionische und neutrale Liposome leicht erhältlich, wie z. B. von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) oder sie können leicht unter Verwendung leicht erhältlicher Materialien hergestellt werden. Derartige Materialien umfassen Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), unter anderen. Diese Materialien können auch mit den DOTMA- und DOTAP-Ausgangsmaterialien in geeigneten Verhältnissen gemischt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung dieser Materialien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Die Liposome können multilamellare Vesikel (MLVs), kleine unilamellare Vesikel (SUVs) oder große unilamellare Vesikel (LUVs) umfassen. Die verschiedenen Liposom-Nucleinsäure-Komplexe werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet be kannt sind, hergestellt. Siehe z. B. Straubinger et al., METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Bd. 101, S. 512–527; Szoka et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 3410–3414, 1990; Papahadjopoulos et al., Biochim Biophys. Acta 394: 483, 1975; Wilson et al., Cell 17: 77, 1979; Deamer und Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629, 1976; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836, 1977; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76: 3348, 1979; Enoch und Strittmatter, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76: 145, 1979; Fraley et al., J. Biol. Chem. 255: 10431, 1980; Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 75: 145, 1979, und Schaefer-Ridder et al., Science 215: 166, 1982.
  • Zusätzlich können Lipoproteine mit einem subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotid für die Abgabe an eine Zelle eingeschlossen werden. Beispiele für Lipoproteine umfassen Chylomikrone, HDL, IDL, LDL und VLDL. Mutanten, Fragmente oder Fusionen dieser Proteine können ebenso verwendet werden. Modifikationen von natürlich vorkommenden Lipoproteinen können auch verwendet werden, wie z. B. acetyliertes LDL. Diese Lipoproteine können die Abgabe von Polynucleotiden zu Zellen, die Lipoprotein-Rezeptoren exprimieren, targetieren. Falls Lipoproteine mit einem Polynucleotid eingeschlossen werden, ist vorzugsweise kein weiterer Targetierungsligand in die Zusammensetzung eingeschlossen.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden nackte subgenomische Metastasemarkerpolynucleotidmoleküle als Gen-Abgabevehikel verwendet, wie in der WO 90/11092 und dem US-Patent 5 580 859 beschrieben. Derartige Gen-Abgabevelkel können entweder Metastasemarker-DNA oder -RNA sein und sind, in bestimmten Ausführungsformen, mit einem abgetöteten Adenovirus verknüpft. Curiel et al., Hum. Gene. Ther. 3: 147–154, 1992. Andere geeignete Vehikel umfassen DNA-Ligand-(Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985–16987, 1989), Lipid-DNA-Kombinationen (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, 1989), Liposome (Wang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 84: 7851–7855, 1987) und Mikroprojektile (Williams et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 88: 2726–2730, 1991).
  • Man kann die Effizienz der Aufnahme von nacktem subgenomischem Metastasemarkerpolynucleotid in Zellen erhöhen, indem die Polynucleotide als Beschichtung auf biologisch abbaubare Latexkügelchen aufgebracht werden. Diese Herangehensweise macht sich die Beobachtung zunutze, dass Latexkügelchen, wenn sie mit Zellen in einer Kultur inkubiert werden, wirksam transportiert und in der perinukleären Region der Zellen konzentriert werden. Die Kügelchen werden bei Injektion in einen Muskel anschließend in Zellen transportiert werden. Mit subgenomischem Metastasemarkerpolynucleotid beschichtete Latexkügelchen werden, nachdem die Endozytose durch die Latexkügelchen initiiert wird, wirksam in Zellen transportiert werden und somit den Gentransfer und die Expressionseffizienz erhöhen. Dieses Verfahren kann weiter verbessert werden indem die Kügelchen so behandelt werden, dass ihre Hydrophobizität erhöht wird, wodurch das Aufbrechen bzw. die Zerstörung des Endosoms und die Freisetzung von subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotiden in das Cytoplasma erleichtert werden.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren einer Metastasemarkergen-Expression in einer biologischen Probe bereit. Die Detektion einer Metastasemarkergen-Expression ist z. B. nützlich zum Identifizieren von Metastasen oder zum Bestimmen des metastatischen Potentials in einer Gewebeprobe, vorzugsweise ein Tumor. Geeignete bzw. zweckdienliche Behandlungsregime können anschließend für Patienten konzipiert werden, die ein Risiko für die Entwicklung von Krebsmetastasen in anderen Organen des Körpers aufweisen.
  • Die Körperprobe kann z. B. ein festes Gewebe oder eine Flüssigkeitsprobe sein. Protein- oder Nucleinsäure-Expressionsprodukte können in der Körperprobe detektiert werden. In einer Ausführungsform wird die Körperprobe auf das Vorhandensein eines Metastasemarkerproteins getestet bzw. untersucht. Ein Metastasemarkerprotein umfasst eine Sequenz, die durch die in SEQ ID NO: 28 gezeigte Nucleotidsequenz codiert wird, und kann unter Verwendung der Markerprotein-spezifischen Antikörper der vorliegenden Erfindung detektiert werden. Die Antikörper können z. B. mit einer radioaktiven, fluoreszierenden, biotinylierten oder enzymatischen Markierung markiert und direkt detektiert sein/werden oder sie können unter Verwendung indirekter immunchemischer Verfahren, unter Verwendung eines markierten Sekundärantikörpers, detektiert werden. Das Vorhandensein der Metastasemarkerproteine kann z. B. in Gewebeschnitten mittels Immunzytochemie oder in Lysaten unter Verwendung von Western-Blotting getestet werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Körperprobe auf das Vorhandensein von Markerprotein-mRNA getestet. Eine Probe kann mit einer Nucleinsäure-Hybridisierungssonde, die dazu fähig ist, mit der mRNA, die dem ausgewählten Polypeptid entspricht, zu hybridisieren, in Kontakt gebracht werden. Weiterhin kann die Probe einer Northern-Blotting-Technik unterworfen werden, um mRNA, die auf die Expression des Polypeptids hinweist, zu detektieren. Für die Techniken, bei denen mRNA detektiert wird, kann die Probe einem Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren unterworfen werden, wodurch das mRNA-Molekül oder ein ausgwähter Teil davon unter Verwendung von geeigneten Nucleotidprimern amplifiziert wird. Andere RNA-Detektionstechniken können ebenso verwendet werden, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, in situ-Hybridisierung.
  • Markerprotein-spezifische Sonden können unter Verwendung der cDNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 28 offenbart ist, erzeugt werden. Die Sonden sind vorzugsweise wenigstens 15 bis 50 Nucleotide lang, obgleich sie wenigstens 8, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 75 oder 100 oder mehr Nucleotide lang sein können. Die Sonden können chemisch synthetisiert werden oder sie können aus längeren Polynucleotiden unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden. Die Sonden können z. B. mit einer radioaktiven, biotinylierten oder fluoreszierenden Markierung markiert werden.
  • Optional kann die Konzentration eines bestimmten Metastasemarker-Expressionsprodukts in einer Körperprobe quantifiziert werden. Die Quantifizierung kann z. B. durch Vergleichen der Konzentration des Expressionsprodukts, die in der Körperprobe detektiert wird, mit den Mengen an Produkt, die in einer Standardkurve vorliegen, bewerkstelligt werden. Ein Vergleich kann visuell durchgeführt werden oder unter Verwendung einer Technik, wie Densitometrie, und zwar mit oder ohne Computerunterstützung. Zur Verwendung als Kontrolle können Körperproben aus anderen Menschen, anderen nicht-kanzerösen Organen des Patienten, der getestet wird, oder nicht-metastatischem Brust- oder Dickdarmkrebs aus dem Patienten, der getestet wird, isoliert werden.
  • Polynucleotide, die für Metastasemarker-spezifische Reagentien der Erfindung codieren, wie Antikörper und Nucleotidsonden, können in einem Kit zum Detektieren von Markergen-Expressionsprodukten in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt werden. Das Kit kann auch Puffer oder Markierungskomponenten sowie Instruktionen zur Verwendung der Reagentien, um die Marker-Expressionsprodukte in der biologischen Probe zu detektieren, enthalten.
  • Falls die Expression eines Metastasemarkergens, das eine in den SEQ ID NOS: 2, 4, 9, 13, 14, 19, 26, 29, 39–41, 48, 55, 57, 60, 63, 64, 72, 73, 82 oder 83 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, detektiert wird, enthält die biologische Probe Krebszellen, die wahrscheinlich Metastasen in der Lunge bilden werden. Falls die Expression eines Metastasemarkergens, das eine in den SEQ ID NOS: 1, 5, 11, 18, 20, 22, 24, 30, 33, 35, 36, 38, 45, 52, 58, 65, 66, 70, 74, 76 oder 80 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, detektiert wird, enthält die biologische Probe Krebszellen, die wahrscheinlich Metastasen im Knochen und/oder der Lunge bilden werden. Falls andererseits die Expression eines Metastasemarkergens, das eine in den SEQ ID NOS: 3, 7, 8, 10, 12, 15–17, 21, 23, 25, 28, 31, 34, 37, 42–44, 46, 47, 49–51, 53, 59, 61, 62, 67, 68, 75, 77–79, 81, 84 oder 85 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, detektiert wird, enthält die biologische Probe Krebszellen, die wahrscheinlich nicht metastasieren werden. Die Detektion der Expression eines Metastasemarkergens, das die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 56 gezeigt ist, umfasst, weist auch darauf hin, dass die biologische Probe Krebszellen enthält, die wahrscheinlich metastasieren werden. Diese Information kann beispielsweise verwendet werden, um Behandlungsregime zu konzipieren. Behandlungsregime können die Änderung der Expression von einem oder mehreren Metastasemarkergenen umfassen, wie gewünscht. Die Metastasemarkergen-Expression kann für therapeutische Zwecke, wie unten beschrieben, verändert werden, oder sie kann verwendet werden, um therapeutische Mittel zu identifizieren.
  • Die Expression eines Metastasemarkergens, dessen Expression bei metastatischem bzw. metastasierendem Krebs hinaufreguliert ist, kann unter Verwendung eines Ribozyms, eines RNA-Moleküls mit katalytischer Aktivität, verringert werden. Siehe z. B. Cech, 1987, Science 236: 1532–1539; Cech, 1990, Ann. Rev. Biochem. 59: 543–568; Cech, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 605–609; Couture und Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510–515. Wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, können Ribozyme verwendet werden, um eine Genfunktion durch Spaltung einer RNA-Sequenz zu inhibieren (z. B. Haseloff et al., U.S. 5 641 673 ).
  • Codierende Sequenzen von Metastasemarkergenen können verwendet werden, um Ribozyme zu erzeugen, die spezifisch an mRNA, die ausgehend von einem Metastasemarkergen transkribiert wird, binden werden. Verfahren für das Design und die Konstruktion von Ribozymen, die andere RNA-Moleküle in trans auf eine Hochsequenz-spezifische Weise spalten können, sind entwickelt und im Stand der Technik beschrieben worden (siehe Haseloff, J. et al. (1988), Nature 334: 585–591). Die Spaltungsaktivität von Ribozymen kann beispielsweise auf spezifische RNAs targetiert werden, indem eine diskrete "Hybridisierungs"-Region in dem Ribozym konstruiert wird. Die Hybridisierungsregion enthält eine Sequenz, die zur Ziel-RNA komplementär ist und somit spezifisch mit dem Ziel hybridisiert (siehe z. B. Gerlach, W. L. et al., EP 321 201 ). Längere komplementäre Sequenzen können verwendet werden, um die Affinität der Hybridisierungssequenz für das Ziel zu erhöhen. Die Hybridisierungs- und Spaltungsregionen des Ribozyms können integral in Beziehung stehen bzw. verwandt sein; somit kann die katalytische Region des Ribozyms nach Hybridisierung mit der Ziel-RNA durch die komplementären Regionen das Ziel spalten.
  • Ribozyme können in Zellen als Teil eines DNA-Konstrukts eingeführt werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Das DNA-Konstrukt kann auch Transkriptionsregulationselemente, wie ein Promotorelement, einen Enhancer oder ein UAS-Element und ein Transkriptionsterminatorsignal umfassen, um die Transkription des Ribozyms in den Zellen zu kontrollieren.
  • Mechanische Verfahren, wie Mikroinjektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Elektroporation oder Calciumphosphat-Präzipitation, können verwendet werden, um ein Ribozym-enthaltendes DNA-Konstrukt in Zellen einzuführen, bei denen eine Verringerung der Teilung gewünscht wird, und zwar wie oben beschrieben. Falls gewünscht wird, dass ein DNA-Konstrukt von den Zellen stabil zurückgehalten wird, kann das DNA-Konstrukt alternativ auf einem Plasmid zugeführt und als ein separates Element oder in das Genom der Zellen integriert aufrecht erhalten werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Wie in Haseloff et al., U.S. 5 641 673 , beschrieben, können Ribozyme so konstruiert werden, dass ihre Expression in Reaktion auf Faktoren, die eine Expression von Metastasemarkergenen induzieren, auftreten wird. Ribozyme können auch so konstruiert werden, dass sie eine zusätzliche Ebene der Regulation bereitstellen, so dass eine Zerstörung von mRNA nur auftritt, wenn sowohl ein Ribozym als auch ein Metastasemarkergen in den Zellen exprimiert werden.
  • Die Expression eines Metastasemarkergens kann auch unter Verwendung einer Gegensinn-Oligonucleotidsequenz verändert werden. Die Gegensinn-Sequenz ist komplementär zu wenigstens einem Teil der codierenden Sequenz eines Metastasemarkergens, das eine in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist. Das Komplement einer Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID NOS: 1–85 gezeigt ist, ist eine zusammenhängende Sequenz von Nucleotiden, die Watson-Crick-Basenpaare mit einer zusammenhängenden Nucleotidsequenz, gezeigt in den SEQ ID NOS: 1–85, bilden.
  • Vorzugsweise ist die Gegensinn-Oligonucleotidsequenz wenigstens sechs Nucleotide lang, sie kann aber wenigstens etwa 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nucleotide lang sein. Längere Sequenzen können ebenfalls verwendet werden. Gegensinn-Oligonucleotidmoleküle können in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt und in Zellen, deren Teilung zu verringern ist, eingeführt werden, wie oben beschrieben.
  • Gegensinn-Oligonucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder eine Kombination von beiden umfassen. Oligonucleotide können manuell oder mittels eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert werden, indem das 5'-Ende von einem Nucleotid mit dem 3'-Ende eines weiteren Nucleotids mit Nicht-Phosphodiester-Internucleotidverknüpfungen, wie Alkylphosphonaten, Phosphorothioaten, Phosphorodithioaten, Alkylphosphonothioaten, Alkylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphatestern, Carbamaten, Acetamidat, Carboxymethylestern, Carbonaten und Phosphattriestern, kovalent verknüpft wird. Siehe Brown, 1994, Meth. Mol. Biol. 20: 1–8; Sonveaux, 1994, Meth. Mol. Biol. 26: 1–72; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90: 543–583.
  • Obgleich eine genaue Komplementarität nicht für die erfolgreiche Duplexbildung zwischen einem Gegensinnmolekül und der komplementären codierenden Sequenz eines Metastasemarkergens erforderlich ist, werden Gegensinn-Moleküle mit nicht mehr als einer Fehlpaarung bevorzugt. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann den berechneten Schmelzpunkt eines Metastasemarkergen-Gegensinn-Sinn-Paares leicht verwenden, um den Grad der Fehlpaarung zu bestimmen, der zwischen einem bestimmten Gegensinn-Oligonucleotid und einer bestimmten codierenden Sequenz des ausgewählten Gens toleriert werden wird.
  • Gegensinn-Oligonucleotide können modifiziert werden, ohne ihre Fähigkeit, mit einer für ein Metastasemarkerprotein codierenden Sequenz zu hybridisieren, zu beeinträchtigen. Diese Modifikationen können intern oder an einem oder an beiden Enden des Gegensinn-Moleküls sein. Z. B. können Internucleosidphosphatbindungen modifiziert werden, indem Cholesteryl- oder Diamingruppierungen mit variierenden Zahlen von Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und der terminalen Ribose hinzugefügt werden. Modifizierte Basen und/oder Zucker, wie Arabinose anstelle von Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonucleotid, in dem die 3'-Hydroxylgruppe oder die 5'-Phosphatgruppe substituiert sind, können ebenso in einem modifizierten Gegensinn-Oligonucleotid eingesetzt werden. Diese modifizierten Oligonucleotide können mittels Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Agrawal et al., 1992, Trends Biotechnol. 10: 152–158; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90: 543–584; Uhlmann et al., 1987, Tetrahedron Lett. 215: 3539–3542.
  • Antikörper der Erfindung, die spezifisch an ein Metastasemarkerprotein binden, können ebenfalls verwendet werden, um die Metastasemarkergen-Expression zu verändern. Mit Antikörper sind Antikörper und Teile oder Derivate davon, wie einzelkettige Antikörper, die eine spezifische Bindung für das Protein beibehalten, gemeint. Spezifische Antikörper binden an Metastasemarkerproteine und hindern die Proteine daran, in der Zelle zu funktionieren. Polynucleotide, die für spezifische Antikörper der Erfindung codieren, können, wie oben beschrieben, in Zellen eingeführt werden.
  • Markerproteine der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um auf Wirkstoffe, die eine therapeutische antimetastatische Wirkung besitzen, zu durchmustern. Die Wirkung einer Testverbindung auf die Markerproteinsynthese kann auch verwendet werden, um Testverbindungen, die die Metastase bzw. Metastasenbildung modulieren, zu identifizieren. Testverbindungen, die durchmustert werden können, umfassen beliebige Substanzen, ob natürliche Produkte oder synthetische, die dem Subjekt verabreicht werden können. Bibliotheken oder Gemische von Verbindungen können getestet werden. Die Verbindungen oder Substanzen können die sein, für die eine pharmazeutische Wirkung bereits bekannt ist oder bei denen sie unbekannt ist.
  • Eine Zelle wird mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht. Die Zelle kann eine beliebige Zelle, wie z. B. eine Dickdarmkrebszelle, sein, die das Metastasemarkerprotein, das gemessen wird, gewöhnlicherweise synthetisiert. Die Tabellen 1 und 2 geben beispielsweise geeignete Zelltypen an, die für Screening-Assays verwendet werden können.
  • Die Synthese von Metastasemarkerproteinen kann durch beliebige Mittel zur Messung von Proteinsynthese, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gemessen werden, wie z. B. den Einbau von markierten Aminosäuren in Proteine und die Detektion von markierten Metastasemarkerproteinen in einem Polyacrylamidgel. Die Menge an Metastasemarkerproteinen kann z. B. unter Verwendung von Metastasemarkerprotein-spezifischen Antikörpern der Erfindung im Western-Blot detektiert werden. Die Menge der Metastasemarkerproteine, synthetisiert in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung, kann durch beliebige Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden, wie z. B. ein Vergleich der Menge an synthetisiertem Metastasenmarkerprotein mit der Menge der Metastasemarkerproteine, die in einer Standardkurve vorliegt.
  • Die Wirkung einer Testverbindung auf die Metastasemarkerprotein-Synthese kann auch mittels einer Northern-Blot-Analyse gemessen werden, indem die Menge der Metastasemarkerprotein-mRNA-Expression in Reaktion auf die Testverbindung unter Verwendung von Metastasemarkerprotein-spezifischen Nucleotidsonden der Erfindung gemessen wird, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
  • Typischerweise wird eine biologische Probe mit einer Reihe bzw. einem Bereich von Konzentrationen der Testverbindung, wie z. B. 1,0 nM, 5,0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 10 mM, 50 mM und 100 mM, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise erhöht oder verringert die Testverbindung die Expression eines Metastasemarkerproteins um 60%, 75% oder 80%. Stärker bevorzugt wird eine Erhöhung oder Verringerung von 85%, 90%, 95% oder 98% erzielt.
  • Zusammensetzungen zum Erhöhen oder Verringern der Expression von Metastasemarkerprotein können bereitgestellt werden. Therapeutische Zusammensetzungen zum Erhöhen der Metastasemarkergen-Expression sind wünschenswert für Marker, die in metastatischen Zellen herunterreguliert sind. Diese Zusammensetzungen umfassen Polynucleotide, die für ein gesamtes Metastasemarkerproteingen-Expressionsprodukt oder wenigstens einen Teil davon codieren. Vorzugsweise enthält die therapeutische Zusammensetzung ein Expressionskonstrukt, das einen Promotor und einen Polynucleotidabschnitt, der für wenigstens einen Teil des Metastasemarkerproteins codiert, umfasst, das zum Erhöhen oder Verringern des metastatischen Potentials wirksam ist. Teile von Metastasemarkergenen oder -proteinen, die beim Senken des metastatischen Potentials einer Zelle wirksam sind, können z. B. bestimmt werden, indem verschiedene Teile von Metastasemarkergenen oder -polypeptiden in metastatische Zelllinien, wie z. B. MDA-MB-231, MDA-MB-435, Km12C oder Km12L4, eingeführt und die Teilungsrate der Zellen oder die Fähigkeit der Zellen, bei Implantation in vivo Metastasen zu bilden, bestimmt wird, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Nicht-metastatische Zelllinien, wie MCF-7, können verwendet werden, um die Fähigkeit eines Teils eines Metastasemarkerproteins, die Expression eines Metastasemarkergens zu erhöhen, zu testen.
  • Innerhalb des Expressionskonstrukts ist der Polynucleotidabschnitt stromabwärts des Promotors lokalisiert, und die Transkription des Polynucleotidabschnitts beginnt am Promotor. Eine vollständigere Beschreibung von Gentransfervektoren, insbesondere retroviralen Vektoren, ist enthalten in U.S. Aktenzeichen 08/869 309 , die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Eine verringerte Metastasemarkergen-Expression wird gewünscht bei Zuständen, in denen das Markergen bei metastasierendem Krebs hinaufreguliert ist. Therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung dieser Störungen umfassen ein Polynucleotid, codierend für ein Reagens, das spezifisch an ein Metastasemarkerprotein-Expressionsprodukt bindet, wie hierin offenbart.
  • Therapeutische Metastasemarkerzusammensetzungen ("metastatic marker therapeutic compositions") können einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Derartige Träger umfassen, ohne Beschränkung darauf, große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und inaktive Viruspartikel. Pharmazeutisch verträgliche Salze können ebenfalls in der Zusammensetzung verwendet werden, z. B. Mineralsalze, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate oder Sulfate, sowie die Salze von organischen Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate oder Benzoate.
  • Therapeutische Zusammensetzungen können auch Flüssigkeiten, wie Wasser, Salzlösung, Glycerin und Ethanol, sowie Substanzen, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren oder pH-puffernde Mittel, enthalten. Liposome, wie die, die in U.S. 5 422 120 , WO 95/13796 , WO 91/14445 oder EP 524 968 B1 beschrieben sind, können auch als Träger für die therapeutische Zusammensetzung verwendet werden.
  • Typischerweise wird eine therapeutische Metastasemarkerzusammensetzung als ein injizierbares (Produkt), entweder als eine flüssige Lösung oder Suspension, hergestellt; jedoch können auch feste Formen zur Lösung in oder zur Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion hergestellt werden. Eine Metastasemarkerzusammensetzung kann auch als eine Magensaft resistente bzw. enterisch beschichtete Tablette oder als Gelkapsel gemäß auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie die, die in U.S. 4 853 230 , EP 225 189 , AU 9 224 296 und AU 9 230 801 beschrieben sind, formuliert werden.
  • Die Verabreichung von Metastasemarker-Therapeutika ("metastatic marker therapeutic agents") kann eine lokale oder systemische Verabreichung, einschließlich Injektion, orale Verabreichung, Partikelkanone oder Verabreichung über einen Katheter, und topische Verabreichung umfassen. Zahlreiche Verfahren können verwendet werden, um eine therapeutische Metastasemarkerzusammensetzung direkt an einer spezifischen Stelle im Körper zu verabreichen.
  • Für die Behandlung von Tumoren, einschließlich metastatischer Läsionen, kann z. B. eine therapeutische Metastasemarkerzusammensetzung mehrmals an mehreren unterschiedlichen Stellen in den Tumorkörper injiziert werden. Alternativ können Arterien, die einen Tumor versorgen, identifiziert werden, und eine therapeutische Zusammensetzung wird in eine solche Arterie injiziert, um die Zusammensetzung direkt in den Tumor abzugeben.
  • Ein Tumor, der ein nekrotisches Zentrum aufweist, kann aspiriert bzw. punktiert werden, und die Zusammensetzung kann direkt in das nun leere Zentrum des Tumors injiziert werden. Eine therapeutische Metastasemarkerzusammensetzung kann direkt an der Oberfläche bzw. direkt an die Oberfläche eines Tumors verabreicht werden, z. B. mittels topischer Anwendung der Zusammensetzung. Eine Röntgenbildgebung kann als Unterstützung bei bestimmten der obigen Abgabeverfahren verwendet werden. Kombinationstherapeutika, die ein Metastasemarkerprotein(e) oder -polypeptid oder ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid und andere Therapeutika umfassen, können simultan oder sequenziell verabreicht werden.
  • Eine Rezeptor-vermittelte targetierte Abgabe kann verwendet werden, um therapeutische Zusammensetzungen, die subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide, Metastasemarkerproteine oder -reagentien, wie Antikörper, Ribozyme oder Gegensinn-Oligonucleotide enthalten, an spezifische Gewebe abzugeben. Rezeptor-vermittelte Abgabetechniken sind z. B. beschrieben in Findeis et al. (1993), Trends in Biotechnol. 11, 202–05; Chiou et al. (1994), GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolff, Hrsg.); Wu & Wu (1988), J. Biol. Chem. 263, 621–24; Wu et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 542–46; Zenke et al. (1990), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655–59; Wu et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 338–42.
  • Alternativ kann eine therapeutische Metastasemarkerzusammensetzung ex vivo in menschliche Zellen eingeführt und die Zellen können anschließend wieder in den Menschen eingesetzt werden. Zellen können aus einer Vielfalt von Stellen entnommen werden, einschließlich beispielsweise aus einem ausgewählten Tumor oder aus einem befallenen Organ. Zusätzlich kann eine therapeutische Zusammensetzung in nicht-befallene (Zellen), z. B. dermale Fibroblasten oder Leukozyten des peripheren Bluts, eingeführt bzw. inseriert werden. Sofern gewünscht, können spezielle Zellfraktionen, wie eine T-Zell-Untergruppe oder Stammzellen, auch spezifisch aus dem Blut entfernt werden (siehe z. B. PCT WO 91/16116 ). Die entfernten Zellen können anschließend mit einer therapeutischen Metastasemarkerzusammensetzung in Kontakt gebracht werden, wobei eine beliebige der oben beschriebenen Techniken eingesetzt wird, gefolgt vom Zurückführen der Zellen in den Menschen, vorzugsweise an einen Tumor oder eine andere zu behandelnde Stelle oder in deren Nähe. Die oben beschriebenen Verfahren können zusätzlich die Stufen des Abreicherns ("depleting") von Fibroblasten oder anderen nicht-kontaminierenden Tumorzellen nach dem Entfernen von Tumorzellen aus einem Menschen und/oder die Stufe des Inaktivierens der Zellen, z. B. mittels Bestrahlung, umfassen.
  • Sowohl die Dosis einer Metastasemarkerzusammensetzung als auch die Mittel der Verabreichung können auf der Grundlage der spezifischen Qualitäten der therapeutischen Zusammensetzung, des Zustandes, Alters und Gewichts des Patienten, des Fortschreitens der Erkrankung und anderer relevanter Faktoren bestimmt werden. Vorzugsweise erhöht oder verringert eine therapeutische Zusammensetzung der Erfindung die Expression der Metastasemarkergene um 50%, 60%, 70% oder 80%. Am stärksten bevorzugt wird die Expression der Metastasemarkergene um 90%, 95%, 99% oder 100% erhöht oder verringert. Die Wirksamkeit des zum Verändern der Expression der Metastasemarkergene gewählten Mechanismus kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie Hybridisierung von Nucleotidsonden mit mRNA der Metastasemarkergene, quantitative RT-PCR oder Detektion von einem der Metastasemarkerproteine unter Verwendung spezifischer Antikörper der Erfindung, beurteilt werden.
  • Falls die Zusammensetzung die/das/den Metastasemarkerproteine, -polypeptid oder -antikörper enthält, liegen wirksame Dosierungen der Zusammensetzung im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht des Patienten, etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Körpergewicht des Patienten und etwa 200 bis etwa 250 μg/kg.
  • Therapeutische Zusammensetzungen, die subgenomische Metastasemarkerpolynucleotide enthalten, können in einem Bereich von etwa 100 ng bis etwa 200 mg DNA für die lokale Verabreichung verabreicht werden. Konzentrationsbereiche von etwa 500 ng bis etwa 50 mg, etwa 1 μg bis etwa 2 mg, etwa 5 μg bis etwa 500 μg und etwa 20 μg bis etwa 100 μg DNA können ebenfalls während eines Gentherapieprotokolls verwendet werden. Faktoren, wie die Methode bzw. Weise der Wirkung und die Effizienz der Transformation und Expression sind Gesichtspunkte, die die für eine schlussendliche Wirksamkeit der subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotide erforderliche Dosierung beeinflussen werden. Wenn eine höhere Expression auf einen bzw. über einen größeren Gewebebereich gewünscht wird, werden größere Mengen an subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotiden oder die gleichen Mengen erneut in einem sukzessiven Protokoll von Verabreichungen verabreicht oder es können mehrere Verabreichungen an unterschiedliche benachbarte oder nahe beieinander liegende Gewebeteile, z. B. die Stelle eines Tumors, erforderlich sein, um ein positives Therapieergebnis zu bewirken. In allen Fällen werden Routineexperimente in klinischen Versuchen spezifische Bereiche für eine optimale therapeutische Wirkung bestimmen.
  • Die Expression eines endogenen Metastasemarkergens in einer Zelle kann auch durch Einführen, und zwar im Leseraster mit dem endogenen Metastasemarkergen, eines DNA-Konstrukts, das eine Metastasemarkerprotein-targetierende Sequenz, eine Regulationssequenz, ein Exon und eine ungepaarte Spleiß-Donorstelle umfasst, durch homologe Rekombination geändert werden, so dass eine homolog rekombinante Zelle, die das DNA-Konstrukt umfasst, gebildet wird. Die neue Transkriptionseinheit kann verwendet werden, um das Metastasemarkergen nach Wunsch an- oder abzuschalten. Dieses Verfahren der Beeinflussung von endogener Genexpression wird im U.S.-Patent Nr. 5 641 670 beschrieben.
  • Die Targetierungssequenz ist ein Abschnitt von wenigstens 10, 12, 15, 20 oder 50 zusammenhängenden Nucleotiden, ausgewählt aus den in SEQ ID NOS: 1–85 gezeigten Nucleotidsequenzen oder den Komplementen davon. Die Transkriptionseinheit ist stromaufwärts einer codierenden Sequenz des endogenen Metastasemarkerproteingens lokalisiert. Die exogene Regulationssequenz steuert die Transkription der codierenden Sequenz der Metastasemarkergene.
  • Ein subgenomisches Metastasemarkerpolynucleotid kann auch zum Zwecke der Durchmusterung von Testverbindungen auf jene, die zum Verstärken des Transfers von subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotiden an die Zelle oder zum Verstärken anschließender biologischer Wirkungen der subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotide innerhalb der Zelle geeignet sind, an Subjekte verabreicht werden. Derartige biologische Wirkungen umfassen die Hybridisierung mit komplementärer Metastasemarker-mRNA und die Inhibierung von deren Translation, die Expression eines subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotids unter Bildung von Metastasemarker-mRNA und/oder Metastasemarkerprotein und die Replikation bzw. Vervielfältigung und Integration eines subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotids. Das Subjekt kann eine Zellkultur oder ein Tier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch, sein.
  • Testverbindungen, die durchmustert werden können, umfassen beliebige Substanzen, ob natürliche Produkte oder synthetisch, die dem Subjekt verabreicht werden können. Bibliotheken oder Gemische von Verbindungen können getestet werden. Die Verbindungen oder Substanzen können die sein, für die eine pharmazeutische Wirkung bereits bekannt oder unbekannt ist. Die Verbindungen oder Substanzen können vor, nach oder gleichzeitig mit einem subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotid abgegeben werden. Sie können separat oder im Gemisch mit einem subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotid verabreicht werden.
  • Die Integration eines abgegebenen subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotids kann durch beliebige Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, überwacht werden. Z. B. kann ein Southern-Blotting hinsichtlich des abgegebenen subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotids durchgeführt werden. Eine Veränderung der Größe der Fragmente eines abgegebenen Polynucleotids weist auf eine Integration hin. Die Replikation eines abgegebenen Polynucleotids kann inter alia überwacht werden, indem der Einbau von markierten Polynucleotiden, kombiniert mit der Hybridisierung mit einer Metastasemarkersonde, detektiert wird. Die Expression von subgenomischem Metastasemarkerpolynucleotid kann überwacht werden, indem die Produktion von Metastasemarker-mRNA, die mit dem abgegebenen Polynucleotid hybridisiert, detektiert wird oder indem Metastasemarkerprotein detektiert wird. Metastasemarkerprotein kann immunologisch detektiert werden. Somit stellt die Abgabe von subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung ein exzellentes System zur Durchmusterung von Testverbindungen hinsichtlich deren Fähigkeit, den Transfer von subgenomischen Metastasemarkerpolynucleotiden an eine Zelle zu verstärken, durch Verstärkung der Abgabe, der Integration, der Hybridisierung, der Expression, der Replikation oder der Integration in eine(r) Zelle in vitro oder in einem Tier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch, bereit.
  • Die obenstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, die hierin lediglich zu Zwecken der Erläuterung bereitgestellt werden und die den Rahmen der Erfindung nicht einschränken sollen, erlangt werden.
  • BEISPIEL 1
  • UNTERSCHIEDLICH EXPRIMIERTE GENE
  • Dieses Beispiel veranschaulicht Polynucleotide, die in humanen Brust- oder Dickdarmkrebszelllinien unterschiedlich bzw. unterscheidend exprimiert werden.
  • Humane Zelllinien, die zum Identifizieren unterschiedlich exprimierter Polynucleotide verwendet werden, sind die humanen Brustkrebszelllinien MCF-7 (nicht-metastatisch), MDA-MB-231 (Metastasen in Knochen und/oder Lunge bildend) und MDA-MB-435 (Metastase in der Lunge bildend) (Brinkley und Cailleau, 1980, Cancer Res. 40: 3118) und die Dickdarmkrebszelllinien Km12C (gering metastatisch) und Km12L4A (hochmetastatisch) (Morikawa et al., 1988, Cancer Res. 48: 1943–1948).
  • RNA wurde aus jeder Zelllinie präpariert und unter Bildung von cDNA revers transkribiert. Die cDNA wurde unter Verwendung von Zufallsprimern amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden auf einem Sequenzierungsgel visualisiert bzw. sichtbar gemacht, und cDNA, die mRNA, die in den Zelllinien unterschiedlich exprimiert wurde, entsprach, wurde identifiziert.
  • Expressionsmuster und Sequenzkennzahlen von neuen Metastasemarkerpolynucleotiden sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Expressionsmuster und Sequenzkennzahlen von Metastasemarkerpolynucleotiden, die bekannten Genen entsprechen, sind in Tabelle 2 gezeigt, und die entsprechenden Proteine sind untenstehend beschrieben.
  • Osteopontin (SEQ ID NO: 64) (OPN oder Spp1 für "secreted phosphoprotein 1") ist ein sezerniertes bzw. sekretiertes extrazelluläres Matrixprotein, das häufig während der Wundheilung exprimiert wird und bei der Osteoklustendifferenzierung und -aktivierung involviert ist, wie in Heymann et al., 1998, Cytokine 10: 155–168, beschrieben. Osteopontin wird im Knochen/in Knochen- und anderen Epithelzellen gefunden, und es ist gezeigt worden, dass es die Proliferation einer ruhenden Subpopulation von Prostataepithelzellen stimuliert (siehe Elgavish et al., 1998, Prostate 35: 83–94).
  • Osteopontin ist während der Entwicklung von diabetischer Nephropathie (Fischer et al., 1998, Diabetes 47: 1512–1518), des Vorgangs der Knorpel-zu-Knochen-Umwandlung während der Heilung steifer Knochen nach Knochenbruch (Nakase et al., 1998, Acta Histochem 100: 287–295); der Wundheilung durch eine Wechselwirkung mit dem Rezeptor Integrin alpha(v)beta 3 nach fokalem Schlaganfall (Ellison et al., 1998, Stroke 29: 1698–1706); Integrin-Rezeptor-Bindung und -Signalisierung während der Zellanheftung und mechanischen Stimulation von Osteoblasten (Carvalho et al., 1998, J. Cell Biochem 70: 376–390); der Nieren-Morphogenese (Denda et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9: 1425–1435); und als ein interstitielles Chemoattraktans bei einer Nierenentzündung (Rovin und Phan, 1998, Am. J. Kidney Dis. 31: 1065–1084) beteiligt. Mäuse, denen das Osteopontingen fehlt, zeigten eine Modulation der Osteoklastentdifferenzierung gegenüber Wildtyp-Mäusen (siehe Rittling et al., 1998, J. Bone Miner Res. 13: 1101–1111).
  • Osteopontin wird durch Monozyten und Makrophagen in bzw. innerhalb von Verletzungsstellen synthetisiert und kann die Leukozytenadhäsion durch das alpha 4betal-Integrin fördern, wie in Bayless et al., 1998, J. Cell Sci. 111: 1165–2274, beschrieben. Osteopontin wird transkriptional durch Retinsäure reguliert (siehe Manji et al., 1998, J. Cell Physiol. 176: 1–9); bevorzugt in hochgradig metastatischen Gehirntumoren, verglichen mit geringgradigen Gehirntumoren, exprimiert und ist durch den Gewebeplasminogenaktivator (tPA) in Gliomzelllinien induzierbar (siehe Tucker et al., 1998, Anticancer Res. 18: 807–812). Osteopontin wird in etwa 73% der primären Magenkarzinomgewebe exprimiert und korreliert mit dem Fortschreiten von humanem Magenkarzinom und lymphogener Metastase (siehe Ue et al., 1998, Int. J. Cancer 79: 127–132).
  • Nip (SEQ ID NO: 65) ist in Boyd et al., 1994, Cell 79: 341–351, beschrieben. Das "Adenovirus E1B 19 kDa"-Protein schützt gegen Zelltod, induziert durch Virusinfektion und externe Reize und kann funktionell durch das Bcl-2-Protoonkogen ersetzt werden. Mit E1B 19 kDa wechselwirkende Proteine ("E1B 19 kDa interacting proteins") (Nip1, Nip2 und Nip3) wurden in Hefe-zwei-Hybrid-Studien entdeckt, die durchgeführt wurden, um Proteine, die mit dem 19 kDa-Protein Wechselwirken, zu unterscheiden, wie von Boyd et al., supra, beschrieben. Nip 1, 2 und 3 Wechselwirken mit diskreten Domänen von E1B 19 kDa und Wechselwirken gleichermaßen auch mit Bcl-2, wobei sie in beiden Fällen das Überleben von Zellen fördern.
  • Ca-abhängige Protease (SEQ ID NO: 66) ist die Ca+2-abhängige Protease (auch Calpain genannt), deren Aktivität in jeder Wirbeltierzelle, die untersucht wurde, vorhanden ist. Die Aktivität der Ca+2-abhängigen Protease ist assoziiert mit Spaltungen, die die Regulation von zahlreichen Enzymaktivitäten verändern, mit der Remodellierung oder der Zerlegung des Zellcytoskeletts und mit Spaltungen von Hormonrezeptoren (siehe Goll et al., 1992, Bioessays 14(8): 549–556). Die Aktivität der Ca+2-abhängigen Protease wird durch die Bindung von Ca+2 an spezifischen Stellen des Calpain-Moleküls reguliert, wobei die Bindung an jede Stelle eine spe zifische Reaktion, die mit einer spezifischen Aktivität (z. B. proteolytische Aktivität, Calpastatin-Bindung usw.) korreliert ist, erzeugt, wie in Goll et al. beschrieben. Eine übermäßige Aktivierung der Ca+2-abhängigen Protease Calpain kann eine Rolle in der Pathologie von Erkrankungen, einschließlich cerebraler Ischämie, Katarakt, Myokardischämie, Muskeldystrophie und Thrombozytenaggregation, spielen. Therapeutische Anwendungen umfassen eine selektive Inhibierung der Ca+2-abhängigen Protease, wie in Wang und Yuen, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15(11): 412–419, beschrieben.
  • IGF-R (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Rezeptor) (SEQ ID NO: 67) ist eine Transmembran-Tyrosinkinase, verknüpft mit der ras-raf-MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)-Kaskade und ist erforderlich für das Durchlaufen des Zellzyklus durch die Zelle (Werner und Roith, 1997, Crit. Rev. Oncog 8(1): 71–92). IGF-R vermittelt Mitogenese, Wachstumshormonwirkung, Zellüberleben und Transformation zum und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyp(s). IGF-R ist ein Mitglied der Superfamilie der Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosinkinasen, liegt als kovalent verknüpfte Dimere vor, wobei jedes Monomere aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist, und ist mittels eines Liganden in der extrazellulären Domäne gebunden (Mc-Innes und Sykes, 1997, Biopolymers 43(5): 339–366).
  • Die Domänen des IGF-R sind in Sepp-Lorenzino, 1998, Breast Cancer Res Treat 47(3): 235–253, beschrieben, und umfassen Domänen, die für Mitogenese, Transformation und Schutz vor Apoptose verantwortlich sind. Die IGF-R-Expression ist in Brustkrebszellen, die aus Tumorgewebe und Zelllinien stammen bzw. abgeleitet sind, erhöht, wie in Surmacz et al., 1998, Breast Cancer Res Treat 47(3): 255–267, beschrieben, und erhöhter IGF-R kann die Tumormasse erhöhen und/oder das Wiederauftreten von Tumoren durch Förderung von Proliferation, Zellüberleben und Zell-Zell-Wechselwirkungen unterstützen. Krebsarten der humanen Bauchspeicheldrüse überexprimieren IGF-R und seinen Liganden (Korc, 1998, Surg Oncol Clin N Am 7(1): 25–41), und es wurde festgestellt, dass die Expression von IGF-I und IGF-R ein prognostischer Faktor (die Wechselwirkung zwischen neoplastischen Zellen und ihrer Mikroumgebung widerspiegelnd) für die Lymphozyteninfiltration in Schilddrüsenkarzinome ist (Fonseca et al., 1997, Verh Dtsch Ges Pathol 81: 82–96).
  • ILGF-BP5 (SEQ ID NO: 68) ist das "insulin-like growth factor binding protein 5" bzw. Bindungsprotein 5 für den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor, beschrieben in Allander et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 10891–10898. Das Gen und der Promotor für IGF-BP5 werden charakterisiert von Allander et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 10891–10898, und einige allgemeine Wirkungen von IGF-BPs sind beschrieben in Chan und Spencer, 1997, Endocrine 7: 95–97. Die potentielle Auswirkung von IGF-BPs auf das Wachstum von Krebszellen ist beschriebe in Oh, 1997, Endocrine 7: 111–113, und Oh, 1998, Breast Cancer Res Treat 47: 283–293. IGF-BP5 wird während der Gehirnentwicklung exprimiert: mRNAs von IGF-BP5 und IGF-1 werden synchron in Hauptneuronen von sensorischen Schaltsystemen, einschließlich des Riechkolbens, der medialen und dorsalen lateralen Kniehöcker, der Nuclei-ventrales-Reihe ("ventral tier nuclei"), des Nuclei cochleares, des Nuclei lemnisci und des Nuclei vestibulares, und werden transient coexprimiert in Hauptneuronen des Nucleus anterodorsalis, wie in Bondy und Lee, 1993, J. Neurosci 13(12): 5092–5104, beschrieben. IGF-BP5 wird von luminalen oder Cumulusgranulosa-Zellen in beinahe allen Follikeln exprimiert und ist in höchstem Maße überreich vorhanden in stromalen interstitiellen Zellen des reifen Eierstocks (siehe Zhou und Bondy, 1993, Biol. Reprod 48: 467–482). Die IGF-BP5-Induktion wird stark stimuliert während der Differenzierung von Skelettmyoblasten und ist mit der IGF-R-Aktivierung korreliert, wie in Rousse et al., 1998, Endocrinology 139: 1487–1493, beschrieben. IGF-BP5 und andere Komponenten des IGF-Systems sind bei der postnatalen Gehirnentwicklung kritisch (siehe Lee et al., 1996, J. Cereb Blood Flow Metab 16: 227–236).
  • IGF-BP5 stimuliert die Knochenzellproliferation mittels eines von IGF unabhängigen Mechanismus, wobei IGF-BP5-spezifische Zelloberflächen-Bindungsstellen involviert sind, wie in Mohan et al., 1995, J. Biol Chem 270: 20424–20431, beschrieben. In Bindegewebszelltypen besitzt IGF-BP5 eine verringerte Bindungsaktivität gegenüber der extrazellulären Matrix, was eine bessere Gleichgewichtseinstellung von IGF-1 mit den Rezeptoren ermöglicht, wodurch wiederum die IGF-1-Wirkung auf Fibroblasten und glatte Muskelzellen potenziert wird (Clemmons, Mol Cell Endocrinology 140: 19–24).
  • Lactatdehydrogenase (SEQ ID NO: 69) ist ein Mitglied der LDH-Gruppe von tetrameren Enzymen mit fünf Isoformen, zusammengesetzt aus Kombinationen von zwei Untereinheiten, LDH-A und LDH-B. Shim et al., 1997, Proc. Nat'l Acad. Sci 94: 6658-6663, beschrieben die Beziehung zwischen LDH-A und Neoplasie. Insbesondere kann eine Überexpression von LDH-A zu einem veränderten Metabolismus beitragen, der einen neoplastischen Wachstumsvorteil bereitstellt. Das Expressionsmuster von LDH in der vorliegenden Erfindung ist dahingehend konsistent, dass die LDH-Expression in zwei metastatischen Brustkrebszelllinien höher ist als in einer nicht-metastatischen Brustkrebszelllinie (Tabelle 2). Hohe oder ansteigende Lactatdehydrogenase (LDH)-Konzentrationen in Tumorgewebe und -zellen stehen in Zusammenhang mit einer geringen Überlebensrate beim kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC), wie in Ray et al., 1998, Cancer Detect Prev 22: 293–304, beschrieben, was es als prognostischen Indikator für SCLC, wie in Stokkel et al., 1998, J. Cancer Res Clin Oncol 124: 215–219, diskutiert, nützlich macht.
  • Ufo TKR (SEQ ID NO: 70) ist beschrieben in Schulz et al., 1993, Oncogene 8: 509–513. Dieses Protein ist als ein Marker in Tumoren beschrieben worden, ist jedoch vorher nicht bei Brustkrebs beschrieben worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Expression in der MDA-MB-231-Brustkrebszelllinie, nicht jedoch in den Zelllinien MSF-7 oder MDA-MB-435 gefunden. Dieses Gen und dieses Protein stellen neue Marker zum Unterscheiden von Brustkrebsgewebe von verschiedenen Typen metastatischen Potentials bereit.
  • Anfänglich aus primären humanen myeloiden Leukämiezellen isoliert, ist das ufo-Onkogen (auch als Axl oder Ark bezeichnet) eine Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK). Ihre genomi sche Struktur ist in Schulz et al., supra, beschrieben, und ihre unterschiedliche Expression ist in Challier et al., 1996, Leukemia 10: 781–787, beschrieben. Das ufo-Protein ist ein Mitglied einer Klasse von RTKs mit zwei Fibronectin-Domänen vom Typ III und zwei Immunglobulin-ähnlichen Domänen, die im extrazellulären Teil vorhanden sind, und es wird vorzugsweise in Monozyten, Stromazellen und einigen CD34-positiven Vorläuferzellen exprimiert (Neubauer et al., 1997, Leuk Lymphoma 25: 91–96). Ufo besitzt eine extrazelluläre Struktur, die zu neuralen Zelladhäsionsmolekülen ähnlich ist, und weist direkte oder indirekte Bindungsstellen für PLCgamma, GRB2, c-src und lck auf (Braunger et al., 1997, Oncogene 14: 2619–2631).
  • eIF-2 (SEQ ID NO: 71) ist ein Translationsinitiationsfaktor und wirkt als ein heterotrimeres GTP-bindendes Protein, das in die Rekrutierung von Methionyl-tRNA zur ribosomalen 40 S-Untereinheit involviert ist (Gasper et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 3415–3422). Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine höhere Expression in zwei metastatischen Brustkrebszelllinien und nicht in der Zelllinie MCF-7 gefunden.
  • eIF-2 ist involviert in die Einführung der Initiator-tRNA in den Translationsmechanismus und die Durchführung der ersten Stufe des Peptidkettenverlängerungszyklus. eIF-2 ist mit einem Molekül von 5 Untereinheiten ("5 subunit molecule") mit GTP-Rezyklierungsfunktion, das als eIF-2B bezeichnet wird, assoziiert (Kyrpides und Woese, 1998, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 3726–3730, und Kimball et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 12841–12845).
  • eIF-2 besitzt die Untereinheiten alpha und beta. eIF-2alpha ist an Ser 51 phosphoryliert und moduliert dann die Wechselwirkung von eIF-2 und eIF-2B, wie in Kimball et al., 1998, Protein Expr. Purif 12: 415–419, Kimball et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 3039–3044, und Pavitt, 1998, Genes Dev. 12: 514–526, beschrieben. Es wird berichtet, dass durch das Regulieren der Translationsinitiation die Kontrolle von Zellwachstum und -teilung in eukaryotischen Zellen erreicht wird: beispielsweise reichert Clotrimazol, ein hochwirksames bzw. potentes antiproliferatives Mittel in vitro und in vivo intrazelluläre Ca+2-Vorräte ab, was PKR aktiviert, wodurch eine Phosphorylierung von eIF-2alpha und die letztendliche bzw. endgültige Inhibierung der Proteinsynthese und die Blockierung des Zellzyklus in der G1-Phase resultieren (Aktas et al., 1998, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 8280–8285). Zusätzlich zeigen Kim et al., 1998, Mol. Med. 4: 179–190, dass Stickoxid (NO) die Proteinsynthese in Zelltypen, einschließlich humanen Eierstocktumorzellen, supprimiert, indem die Phosphorylierung von eIF-2alpha stimuliert wird.
  • Glutaminylcyclase (SEQ ID NO: 72) wird von Song et al., 1994, J. Mol. Endocrinol. 13: 77–86, beschrieben und ist am höchsten in der am stärksten metastatischen Zelllinie MDA-MB-435 exprimiert, verglichen mit der weniger metastatischen Linie MDA-MB-231 und der nicht-metastatischen Linie MCF-7. Glutaminylcyclase (auch als Glutamincyclotransferase bezeichnet) wandelt Glutaminylpeptide (wie z. B. das Gonadotropin-freisetzende Hormon und das Thyrotropin-freisetzende Hormon) in Pyroglutamylpeptide um, wie beschrieben in Busby et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 8532–8536, Fischer und Spiess, 1987, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 3628–3632, und Pohl et al., 1991, Proc. Nat'l Acad. Sci. 88: 10059–10063. Die Klonierung und Sequenzanalyse von Glutaminylcyclase, stammend aus einer cDNA-Bibliothek der humanen Hypophyse, ist in Song et al., 1994, J. Mol. Endocrinol. 13: 77–86, beschrieben. Studien des Katalysewegs von Glutaminylcyclase und hinsichtlich ihrer Substratspezifität sind beschrieben in Gololobov et al., 1996, Biol. Chem. Hoppe Seyler 377: 395–398. Assays hinsichtlich des Vorhandenseins von Glutaminylcyclase-Aktivität sind beschrieben in Koger et al., 1989, Method Enzymol. 168: 358–365, und Houseknecht et al., 1998, Biotechniques 24: 346.
  • gp130 (SEQ ID NO: 73) ist das Transmembranprotein Glycoprotein 130. gp130 ist ein Signal, das die gemeinsame Komponente der Rezeptorkomplexe für die Cytokine von Interleukin-6 (IL-6)-Typ transduziert (Hirano et al., 1997, Cytokine Growth Factor Rev. 8: 241–252), einschließlich IL-6, IL-11, "leukemia inhibitor factor" (LIF), Oncostatin M (OSM), ziliärer neurotropher Faktor und Cardiotrophin-1. Der N-Terminus von gp130 ist ein extrazellulärer Immunglobulin-ähnlicher Teil des Proteins (Hammacher et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 22701–22707). Die Signaltransduktion, die gp130 einschließt, erfolgt über den gp130/Jak/STAT-Weg 1 (Heinrich 1998, Biochem. J. 334: 297–314). Die Cytokine, die durch den (Signal-)Weg, der gp130 einschließt, wirken (auch als gp130-Cytokine bezeichnet), weisen pleitrophe biologische Aktivitäten, einschließlich Immun-, hämatopoetischer und neuraler Wirkungen, auf (Nakashima und Taga, 1998, Semin Hematol. 35: 210–221, Thompson et al., 1998, Neuroscience 84: 1247–1255, Hirano, 1998, Int. Rev. Immunol. 16: 249–284, Marz et al., 1997, Eur. J. Neurosci. 9: 2765–2773, und Betz und Muller, 1998, Int Immunol 10: 1175–1184).
  • Es wird beschrieben, dass gp130-Cytokine das Überleben und die Proliferation von Myelomzelllinien und primären Myelomzellen kontrollieren (Klein, 1998, Curr. Opin. Hematol. 5: 186–191). gp130 wird in der Mehrzahl von Nierenzellkarzinomen exprimiert und besitzt eine wichtige Rolle bei der Proliferation einiger Nierenzellkarzinom-Zelllinien (Costes et al., 1997, J. Clin. Pathol. 50: 835–840).
  • E-Cadherin (SEQ ID NO: 75) ist ein Mitglied einer Familie von Glycoproteinen, die für die Calcium-abhängige Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich sind, und ist an der Aufrechterhaltung der Cytoskelettintegrität beteiligt. Das von epithelialem Cadherin (E-Cadherin) vermittelte Zelladhäsionssystem in Krebszellen wird durch mehrere Mechanismen, die den pathologischen Merkmalen des speziellen Tumortyps entsprechen, inaktiviert (Hirohashi, 1998, Am J Pathol 153: 333–339). Im Allgemeinen vermittelt das Cadherin-System eine Ca+2-abhängige homophile Zell-Zell-Adhäsion. Eine transkriptionelle Inaktivierung der Expression von E-Cadherin erfolgt häufig in der Tumorentwicklung und somit spielt eine Inaktivierung oder Herabregulation von E-Cadherin eine bedeutende Rolle bei der mehrstufigen Karzinogenese (Hirohashi, 1998, Am J Pathol 153: 333–339).
  • E-Cadherin ist charakterisiert als ein Tumorsuppressor des metastatischen Phänotyps, wie in MacGrogan und Bookstein, 1997, Semin Cancer Biol 8: 11–19, beschrieben, und Cadherine sind wichtige Determinanten der Gewebemorphologie, einschließlich invasiver Karzinome, wie in van der Linden, 1996, Early Pregnancy 2: 5–14, und Yap, 1998, Cancer Invest. 16: 252–261, beschrieben.
  • Die Mechanismen der Wirkung von Cadherinen werden diskutiert in Daniel und Reynolds, 1997, Bioessays 19: 883–891. Die Struktur und Funktion von Zelladhäsionsmolekülen, einschließlich E-Cadherin, werden beschrieben in Joseph-Silverstein und Silverstein, 1998, Cancer Invest. 16: 176–182, Yap et al., 1997, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 119–146, und Uemura, 1998, Cell 93: 1095–1098. Zelladhäsionsmoleküle, einschließlich E-Cadherin, sind potentielle Ziele für Antikrebswirkstoffe und Therapeutika zum Behandeln einer akuten oder chronischen entzündlichen Erkrankung, wie in Buckley und Simmons, 1997, Mol Med Today 3: 449–456, Moll und Moll, 1998, Virchows Arch 432: 487–504, beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird E-Cadherin in der nicht-metastatischen Brustkrebszelllinie MCF-7 exprimiert und nicht in MDA-MB-231 und MDA-MB-435. Die Expressionsprodukte sind diagnostische Marker, die auf das metastatische Potential von Burstkrebs-Gewebeproben hinweisen.
  • Serpin (SEQ ID NO: 76), Serinprotease-Inhibitoren, sind eine Familie von Protease-Inhibitoren, die Chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen inhibieren (Whisstock et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23: 63–67) und die die einzigartige Fähigkeit besitzen, ihre Aktivität durch Änderung der Konformation ihrer Schleife des reaktiven Zentrums ("reactive-center loop") zu regulieren; Studien an Serpinvarianten liefern eine Definition für die funktionellen Domänen von Serpinen, die die Faltung kontrollieren, und verbinden Serpinmutationen mit Erkrankungen (siehe Stein und Carrell, 1995, Nat. Struct. Biol. 2: 96–113). Eine Serinproteasespaltung von Proteinen ist für eine große Vielfalt von biologischen Vorgängen essentiell, und die Spaltung wird hauptsächlich durch die Spaltungsinhibitoren reguliert, wie in Wright, 1996, Bioessays 18: 453–464, beschrieben. Mitglieder der Serpin-Familie umfassen alpha-1-Antitrypsin (AAT) (Carrell et al., 1996, Chest 110: 243S–247S), alpha2-Antiplasmin (PAI-1 und PAI-2) (Andreasen et al., 1997, Int. J. Cancer 72: 1–22), Thrombin, Urokinase-Plasminogenaktivator und Kallikrein (Turgeon und Houenou, 1997, Brain Res Brain Res Rev 25: 85–95). Einige Serpine besitzen auch andere Aktivitäten, einschließlich Aktivitäten in der Differenzierung und im Überleben von Neuronen (Becerra, 1997, Adv. Exp. Med. Biol. 425: 332–237) und in der Tumorsuppression (Sager et al., 1997, Adv. Exp. Med. Biol. 425: 77–88). PAI-1 und PAI-2 sind mit der Krebsmetastase verknüpft, wie in Andreasen et al., 1997, Int. J. Cancer 72.1–22, beschrieben.
  • pS2 (SEQ ID NO: 77) wurde aus humanen Brustkrebszellen vom Typ MCF7 isoliert, wie in Takahashi et al., 1990, FEBS Letters 261: 283–286, beschrieben. pS2 ist Östrogen-reguliert. Speiser et al., 1997, Anticancer Research 17: 679–684, beschrieben, dass der pS2-Status von gut zu schlecht bzw. gering differenziertem Eierstockkrebs abnahm. Die pS2-Expression ist auch mit einer guten Prognose bei Brustkrebspatienten assoziiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird pS2 in MCF-7-Zellen exprimiert, nicht aber in zwei metastatischen Brustkrebszelllinien.
  • pS2 (Präsenilin-2 oder Trefoil-Faktor 1 (TFF 1)) ist ein Trefoil-Polypeptid, das normalerweise in der Mucosa des Gastrointestinaltrakts exprimiert und ektopisch bei gastrointestinalen entzündlichen Erkrankungen und verschiedenen Karzinomen gefunden wird (May und Westley, 1997, J. Pathol. 183: 4–7). pS2 wird in Brustkrebsarten exprimiert (Poulsom et al., 1997, J. Pathol. 183: 30–38). pS2 ist ein pleitroper Faktor, der in die Mucinpolymerisierung, die Zellmotilität bzw. -beweglichkeit (Modlin und Poulsom, 1997, J. Clin. Gastroenterol 25(1): S94–S100), die Zellproliferation und/oder -differenzierung und möglicherweise in das Nervensystem involviert ist (siehe Ribieras et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. 1378: F61–F77).
  • LIV-1 (SEQ ID NO: 78) ist ein Östrogen-reguliertes Protein, das für die MCF-7-Zelllinie beschrieben wird (Green et al., GeneBank-Einreichung, Eingangs-Nr. U41060). Gemäß der vorliegenden Erfindung wird LIV-1 in MCF-7-Zellen exprimiert, nicht aber in zwei metastatischen Brustkrebszelllinien.
  • Leucin-Isoleucin-Valin-1 (LIV-1) und andere Mitglieder der LIV-Familie (LIV-2, 3 und 4) sind Bindungsproteine, die für ein Transportsystem für verzweigtkettige Aminosäuren in E. coli stehen, wie in Yamamoto et al., 1979, J. Bacteriol. 138: 24–32, und Yamamoto und Anraku, 1980, J. Bacteriol. 144: 36–44, beschrieben. Ein humanes Homologes zu LIV-1 ist in der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 sowohl Östrogen- als auch Wachstumsfaktor-induzierbar (El-Tanani und Green, 1997, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol 60: 269–276; El-Tanani und Green, 1996, Mol Cell Endocrinol 124: 71–77; und El-Tanani und Green, 1996, Mol Cell Endocrinol 121: 29–35).
  • Das GTP-bindende Protein bzw. GTP-Bindungsprotein (SEQ ID NO: 79) ist ein Mitglied der Familie der Guaninnucleotid-bindenden regulatorischen Proteine, der G-Proteine. Das Protein wird in MCF-7-Zellen exprimiert, nicht aber in zwei metastatischen Brustkrebszelllinien.
  • Die G-Proteine liefern Signalisierungsmechanismen für die Serpentin-Familie von Rezeptoren, wie in Dhanasekaran und Prasad, 1998, Biol. Signals Recept 7: 109–117, beschrieben. Studien weisen darauf hin, dass die alpha- wie auch die beta-gamma-Untereinheiten der GTP-bindenden Proteine in der Regulation von mehreren zellulären Reaktionen involviert sind, wobei einige der Reaktionen für die Regulation von Zellwachstum und -differenzierung kritisch sind (Dhanasekaran und Prasad, 1998, Biol. Signals Recept 7: 109–117). G-Protein-gekoppelte Rezeptoren regulieren den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Weg, wie in Russell und Hoeffler, 1996, J. Invest. Dermatol Symp Proc 1: 119–122, beschrieben, und spielen somit eine Rolle bei der Kontrolle des Zellwachstums. GTP-bindende Proteine sind auch an der Regulation des intrazellulären Transports beteiligt, wie in Ktistakis, 1998, Bioessays 20: 495–504, beschrieben.
  • Chemokine induzieren zahlreiche intrazelluläre Signalisierungswege bei natürlichen Killerzellen, indem sie Mitglieder der GTP-bindenden Proteine aktivieren, wie in Maghazachi und Al-Autokaty, 1998, FASEB J. 12: 913-924, beschrieben. Heterotrimere GTP-bindende Proteine regulieren unterschiedliche Signalisierungswege, wobei einige von diesen wiederum die Aktivi tät von Na+/H+-Austauschproteinen regulieren, wie in Voyno-Yasenetskaya, 1998, Biol Signals Recept 7: 118–124, beschrieben.
  • Desmoplakin (SEQ ID NO: 84) ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die als Zelloberflächenanheftungsstellen für cytoplasmatische Intermediärfilamente ("cytophasmic intermediate filaments") dienen.
  • Vimentin (SEQ ID NO: 80) ist ein Mitglied der Intermediärfilament-Genfamilie (Evans, 1998, Bioessays 20: 79–86). Intermediärfilamente sind eine Hauptkomponente des Cytoskeletts von höheren Eukaryonten. Vimentingen-Knockout-Mäuse zeigen eine Degeneration der Purkinje-Zellen des Cerebellums (Galou et al., 1997, Biol Cell 89: 85–97). Vimentin ist positiv (färbend) in immunhistochemischen Reaktionen von Sarkomen und damit verwandten Läsionen (Gaudin et al., 1998, Am J Surg Pathol 22: 148–162) und von desmoplastischen kleinrundzelligen Tumoren und ihren Varianten (Gerald et al., 1998, J. Clin. Oncol. 16: 3028–3036). Vimentin wird auch in Neoplasmen, die eine Differenzierung von follikulären dendritischen Zellen zeigen, exprimiert, wie in Perez-Ordonez und Rosai, 1998, Semin. Diagn. Pathol. 15: 144–154, beschrieben, und in biphasischen karzinomatösen-sarkomatösen malignen gemischten Müller-Tumoren, wie in Guarino et al., 1998, Tumori 84: 391–397, beschrieben.
  • Die Cytochrom-C-Oxidase (CcO) (SEQ ID NO: 81) ist das terminale Enzym der Atmungskette von Mitochondrien und aeroben Bakterien: es katalysiert den Elektronentransfer von Cytochrom C aus molekularem Sauerstoff, wodurch der Sauerstoff zu Wasser reduziert wird (Michel et al., 1998, Annu Rev Biophys Biomol Struct 27: 329–356). Die Cytochrom-C-Oxidase ist ein Mitglied der Superfamilie der Chinol- und Cytochrom-C-Oxidase-Komplexe, die über eine homologe Untereinheit, enthaltend sechs in der Position konservierte Histidinreste, die eine Low-spin-Häm-(Gruppe) und ein Häm-Kupfer-Disauerstoff-Aktivierungs- und -Reduktionszentrum verknüpfen, verwandt sind, wie in Musser und Chan, 1998, J. Mol. Evol. 46: 508–520, beschrieben. Cytochrom C- und Ubichinoloxidasen sind Membran-gebundene Redox(potential)getriebene Protonenpumpen, die einen Elektronenstrom mit einem Protronenstrom durch bzw. über die Membran hinweg kuppeln (siehe Karpefors et al., 1998, Biochim Biophys Acta 1365: 159–169). Die Analyse von mutanten Formen der Cytochrom-C-Oxidase ist in Mills und Ferguson-Miller, 1998, Biochim Biophys Acta 365: 46–52, beschrieben. Stickoxid inhibiert die Atmung an der Cytochrom-C-Oxidase, wie in Torres et al., 1998, J. Bioenerg Biomembr 30: 63–69, beschrieben.
  • Das Hitzeschockprotein 90 bzw. Heat shock-Protein 90 (hsp90) (SEQ ID NO: 82) wirkt als ein Chaperonmolekül in Assoziation mit den nukleären Glucocorticoid- und Progesteron-Rezeptoren und besitzt A-, B- und Z-Regionen zur Erleichterung dieser Wechselwirkungen (Dao-Phan et al., 1997, Mol Endocrinol 11.962–972). Es wird beschrieben, dass die Spiegel von hsp90 bei aktivem systemischem Lupus erythematodes erhöht sind (Stephanou et al., 1997, Biochem. J 321: 103–106). Eine erhöhte hsp90-Expression ist an der Regulation von Formen der Zellschädigung, die zu programmiertem Zelltod führen, beteiligt, wie in Galea-Lauri et al., 1996, J. Immunol. 157: 4109–4118, beschrieben. Hsp90 ist hochreguliert in sich regenerierenden Fasern und erkrankten Fasern der Duchenne-Muskeldystrophie (Bornman et al., 1996, Muscle Nerve 19: 574–580) und ist ein Kandidatensubstrat für die Proteolyse während der durch ionisierende Strahlung induzierten Apoptose von einigen Brustkrebszellen (Prasad et al., 1998, Int. J. Oncol 13: 757–764). Hsp90 ist in die Verschiebung bzw. Verdrängung der mutanten Insulinrezeptoren aus dem endoplasmatischen Reticulum in das Cytosol involviert, wie in Imamura et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 11183–11188, beschrieben, und assoziiert mit und aktiviert endotheliale(r) Stickoxidsynthase, wie in Garcia-Cardena et al., 1998, Nature 392: 821–824, beschrieben.
  • Integrin apha 6 (SEQ ID NO: 83) gehört zur Familie der Integrine, heterodimere, Kationen-abhängige Zellmembranadhäsionsmoleküle, die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen vermitteln. Integrin alpha 6 ist eine Komponente des Hemidesmosom-Komplexes (Jones et al., 1998, Bioessays 20: 488–494). Integrine erhalten die Gewebeintegrität aufrecht und regulieren die Zellproliferation, das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Zellmigration. (Siehe Thomas et al., 1997, Oral Oncol 33: 381–388). Bei oralen Plattenepithelzellkarzinomen gibt es eine variable Einbuße an oder verringerte Expression von Integrin apha 6, wie in Thomas et al., 1997, Oral Oncol. 33: 381–388, beschrieben. Alpha 6-Integrin spielt auch eine aktive Rolle bei der Invasion von Zellen vom intestinalen und diffusen Typ bei repräsentativen Magenkarzinomzelllinien, wie in Koike et al., 1997, J Cancer. Res. Clin. Oncol. 123L: 310–316, beschrieben.
  • Das osteogene Protein-1 (OP-1) (auch als BMP-7 bezeichnet) (SEQ ID NO: 85) ist ein morphogenetischer Faktor (und ein Mitglied der Knochen-morphogenetisches Protein (BMP)-Familie von Wachstumsfaktoren) und wird in hohem Maße in der Niere exprimiert und ist involviert in die Gewebereparatur und -entwicklung (siehe Almanzar et al., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9: 1456–1463). OP-1 wird auch im sich entwickelnden Nervensystem exprimiert und kann das Dendritenwachstum in sympathischen Neuronen induzieren, wie in Guo et al., 1998, Neurosci. Lett 245: 131–134, beschrieben. OP-1 stimuliert die Knorpelbildung, wie in Klein-Nulend et al., 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40: 614–620, beschrieben.
  • OP-1 induziert die Herabregulation von Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsproteinen (insbesondere IGFBP-5), wodurch IGF-1 im Kontext der Knochenzelldifferenzierung und Bildung von mineralisierten Knochenknoten ("mineralized bone nodule formation") beeinflusst wird, wie in Yeh et al., 1997, Endocrinology 138: 4181–4190, beschrieben. OP-1 kann als Knochentransplantatersatz verwendet werden, um die Wirbelsäulenfusion zu fördern und um den Einbau bzw. das Einwachsen von Metallimplantaten zu unterstützen (Cook und Rueger, 1996, Clin. Orthop. 324: 29–38). Die dreidimensionale Struktur von OP-1 wird in Griffith et al., 1996, Proc Nat'l Acad Sci 93: 878-883, beschrieben.
  • Das durch SEQ ID NO: 56 codierte Protein ist ein putatives sekretiertes bzw. sezerniertes Protein und wird in Fettgewebe in hohem Maße exprimiert. Tabelle 1. Neue unterschiedlich bzw. unterscheidend exprimierte Metastasemarkerpolynucleotide
    TRANSKRIPTNUMMER SEQ ID NO: Nicht-metastatisch, Brust, MCF-7 Brustkrebs, Metastasen in Knochen und/oder Lunge bildend, MDA-MB-231 Brustkrebs, Metastasen in der Lunge bildend, MDA-MB-435 Gering metastatisch, aus dem Dickdarm, KM12C Hochmetastatisch, aus dem Dickdarm, KM12L4A
    901 1 – + –
    907 2 – – +
    9102b 3 + – –
    9114 4 – – +
    9121a 5 – + –
    9129 6 + – +
    9139a 7 + – –
    9143b 8 + – –
    9157b 9 – – +
    9166 10 + – –
    9170b 11 – + –
    9190a 12 + – –
    9191 13 – – +
    9216 14 – – +
    9224c 15 + – –
    9230b 16 + – –
    924 17 + – –
    9242a 18 – + –
    9259a 19 – – +
    9261 20 – + –
    9272 21 + – –
    9293b 22 – + –
    9304b 23 + – –
    9307a 24 – + –
    931 25 + – –
    9313 26 – – +
    9316 27 + + –
    9318b 28 + – –
    9320a 29 – – +
    9330b 30 + –
    9335 31 + – –
    9337 32 + – +
    9342b 33 – + –
    9343c 34 + – –
    9350e 35 – + –
    9351b 36 – + –
    9361 37 + – –
    9368 38 – + –
    9373b 39 – – +
    9385a 40 – – +
    9386c 41 – – +
    9388d 42 + – –
    9390 43 + – –
    9393 44 + – –
    9396 45 – + –
    944b 46 + – –
    951 47 + – –
    953 48 – – +
    954a 49 + – –
    968 50 + – –
    971 51 + – –
    983c 52 – + –
    985 53 + – –
    990 54 + – +
    998 55 – – +
    316 56 + – – + –
    126c 57 – – +
    207-4 58 – + –
    265-3 59 + – –
    29B 60 – – +
    305B-25 61 + – –
    326B-39 62 + – –
    34B-11 63 – – +
    • +
    gibt eine unterschiedliche bzw. unterscheidende Expression, wie im Differential Display identifiziert, an
    –
    gibt das Fehlen im Differential Display an
  • Für das Transkript mit der Nummer 316 wurde zum Detektieren der Expression in den Brustkrebszelllinien PCR mit reverser Transkription (RT-PCR) verwendet. Tabelle 2. Unterschiedlich bzw. unterscheidend exprimierte Metastasemarkerpolynucleotide
    TRANSKRIPTNUMMER Protein SEQ ID NO: Nicht-metastatisch, Brust, MCF-7 Brustkrebs, Metastasen in Knochen und/oder Lunge bildend, MDA-MB-231 Brustkrebs, Metastasen in der Lunge bildend, MDA-MB-435
    902 Osteopontin 64 – – +
    9112 Nip 65 – + –
    9132 Ca-abhängige Protease 66 – + –
    9158 IGF-R 67 + – –
    9174 ILGF-BP5 68 + – –
    9177 Lactatdehydrogenase 69 – + +
    9202 ufo TKR 70 – + –
    9210 e1F2 71 – + +
    9212 Glutaminylcyclase 72 – – +
    9213 gp130 73 – – +
    9222 TGFb-II 74 – + –
    9232 E-Cadherin 75 + – –
    9239 Serpin 76 – + –
    9250 sezerniertes pS2 77 + – –
    9260 LIV-1 78 + – –
    9315 GTP-bindendes Protein 79 + – –
    9317 Vimentin 80 – + –
    938 Cytochrom-C-Oxidase 81 + – –
    9382 Hsp 90 82 – – +
    9394 Integrin a6 83 – – +
    956 Desmoplakin 84 + – –
    970 osteogenes Protein 85 + – –
    • +
    gibt eine unterschiedliche bzw. unterscheidende Expression, wie im Differential Display identifiziert, an
    –
    gibt das Fehlen im Differential Display an
  • Varianten der oben beschriebenen Proteine können bereitgestellt werden. Eine Variante ist ein Protein, das durch ein Polynucleotid codiert wird, wobei die globale Sequenzidentität der DNA im Vergleich zur entsprechenden SEQ ID NO hierin wenigstens 65% beträgt, und zwar bei Bestimmung mit dem Smith-Waterman-Algorithmus zur Homologierecherche, wie er im MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) implementiert ist, unter Verwendung einer affinen Lückensuche bzw. "ahne gap search" mit den folgenden Suchparametern: "gap open penalty" von 12 und "gap extension penalty" von 1. Das Protein, das durch die DNA, die die oben beschriebene Sequenzidentität aufweist, codiert wird, wird die im vorstehenden Absatz beschriebene prozentuale Aktivität aufweisen.
  • Fusionsproteine können bereitgestellt werden, wobei sie die Proteine und Varianten, die hierin offenbart sind, umfassen. Proteine, die bei der Konstruktion eines Fusionsproteins bevorzugt verwendet werden, umfassen beta-Galactosidase, beta-Glucoronidase, grün fluoreszierendes Protein bzw. "green fluorescent protein" (GFP), autofluoreszierende Proteine, einschließlich "blue fluorescent protein" (BFP), Glutathion-S-Transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). Zusätzlich werden in Fusionsproteinkonstruktionen Epitop-Tags bzw. Epitop-Markierungen verwendet, und zwar einschließlich Histidin (HIS)-Tags, FLAG-Tags, Influenza-Hämagglutinin (HA)-Tags, Myc-Tags, VSV-G-Tags und Thioredoxin (Trx)-Tags. Andere Fusionskonstruktionen können Maltosebindungsprotein (MBP), S-Tag, Lex A-DNA-Bidnungsdomäne (DBD)-Fusionen, GAL4-DNA-Bindungsdomäne-Fusionen und Herpes simplex-Virus (HSV)-BP16-Proteinfusionen umfassen.
  • Diese Fusionen können mittels Standardverfahrensweisen auf dem Fachgebiet der Molekularbiologie hergestellt werden, und viele sind als Kits erhältlich, beispielsweise von Promega-Corporation (Madison, WI); Stratagene (La Jolla, CA); Clontech (Mountainview, CA); Santa Cruz Biotechnolgy (Santa Cruz, CA); MBL International Corporation (MIC, Watertown, MA); und Quantum Biotechnologies (Montreal, Kanada).
  • Die Proteine der Erfindung und Varianten, wie sie hierin beschrieben sind, können auch verwendet werden, um Proteinwechselwirkungen in vivo zu detektieren, wobei das Hefe-zwei-Hybridsystem verwendet wird, wie z. B. im U.S.-Patent Nr. 5 674 739 beschrieben.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Ribozym- und Gegensinn-Konstrukten, können die Polynucleotide der Erfindung zum Inhibieren der Transkription über eine Dreifachhelixbildung, wie im U.S.-Patent Nr. 5 674 739 offenbart, verwendet werden.
  • Fachleute auf dem Gebiet werden viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die hierin beschrieben sind, erkennen oder fähig sein, diese zu ermitteln, wobei nicht mehr als Routineversuche nötig sind. Solche spezifischen Ausführungsformen und Äquivalente sollen von den folgenden Ansprüchen umfasst sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
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  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
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  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
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  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
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  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001

Claims (18)

  1. Verfahren zum Detektieren metastatischer Tumorzellen in einer Gewebeprobe, umfassend die Stufe: Messen eines Expressionsprodukts eines Gens, welches die Sequenz von SEQ ID NO: 28 umfasst, in der Gewebeprobe, wobei eine Gewebeprobe, die das Produkt nicht exprimiert, als metastatisch kategorisiert wird.
  2. Verfahren zum Bestimmen des metastatischen Potentials in einer Gewebeprobe, umfassend die Stufe: Messen eines Expressionsprodukts eines Gens, welches die Sequenz von SEQ ID NO: 28 umfasst, in einer Gewebeprobe, wobei eine Gewebeprobe, die das Produkt nicht exprimiert, als metastatisches Potential aufweisend kategorisiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Expressionsprodukt Protein ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an das Protein bindet, gemessen wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Expressionsprodukt mRNA ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die mRNA unter Verwendung einer Nukleotidsonde, die spezifisch mit der mRNA hybridisiert, gemessen wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die mRNA unter Verwendung einer Technik, ausgewählt aus quantitativer RT-PCR, Northern-Blotting und in situ-Hybridisierung, gemessen wird.
  8. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, ausgewählt aus: (a) dem Polynukleotid von SEQ ID NO: 28; (b) einem Polynukleotid, welches zu der Sequenz von SEQ ID NO: 28 komplementär ist und (c) einem Polynukleotid, welches zu wenigstens 95% identisch zu der Sequenz von SEQ ID NO: 28 über seine gesamte Länge ist, wobei das Polynukleotid, das zu wenigstens 95% identisch ist, mit einem Polynukleotid hybridisiert, das das differentielle Expressionsprofil der entsprechenden SEQ ID NO: 28 teilt.
  9. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei das Polynukleotid zu wenigstens 95% identisch mit dem in SEQ ID NO: 28 gezeigten Polynukleotid ist, und wobei das Polynukleotid von nicht-metastatischen Brustkrebszellen mit höherem Level exprimiert wird als von metastatischen Brustkrebszellen.
  10. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder 9, das DNA ist.
  11. Rekombinanter Vektor, umfassend ein Polynukleotid, wie in einem der Ansprüche 8 bis 10 definiert.
  12. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend das Einführen des rekombinanten Vektors nach Anspruch 11 in eine Wirtszelle.
  13. Rekombinante Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 11.
  14. Isoliertes und gereinigtes humanes Protein, umfassend eine Aminsäuresequenz, die zu wenigstens 85% identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird, wobei das Protein das differentielle Expressionsprofil des durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codierten Proteins teilt.
  15. Isoliertes und gereinigtes humanes Protein nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz zu wenigstens 95% identisch ist.
  16. Isoliertes und gereinigtes humanes Protein nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Aminosäuresequenz durch die Sequenz von SEQ ID NO: 28 codiert ist.
  17. Fusionsprotein, das einen ersten Proteinabschnitt und einen zweiten Proteinabschnitt, miteinander mittels einer Peptidbindung fusioniert, umfasst, wobei der erste Proteinabschnitt aus wenigstens sechs zusammenhängenden Aminosäuren besteht, ausgewählt aus einer Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird.
  18. Zubereitung von Antikörpern, die spezifisch an ein humanes Protein binden, das eine Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 codiert wird, umfasst.
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