CS238612B2 - Production method of polypeptide product - Google Patents

Description

Nástup technologie využívající rckombinované kyseliny desoxyribonukleové (=DNA) umožnil kontrolovanou bakteriální produkci enormní řady užitečných polypeptidů. V současné době jsou již k dispozici bakterie modifikované touto technologií, které umožňují výrobu takových polypeptidických produktů, jako jsou somatostatin [viz K. Itakura a spolupracovníci, Science 198, 1056 (1977]], komponenty A a B řetězců lidského insulinu (viz D. V. Goeddei a spolupracovníci, Proč.

* Nať1. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979)] a lidský růstový hormon [viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544 (1979)]. Nověji bylo rekombinačních dNa technologií použito k bakteriální produkci thymosinu alfa 1, imunopotenďační substance produkované thymem (publikovaná přihláška evropského patentu č. 0 035 454).

Význam této· technologie je tak velký, že bakteriálně lze skutečně vyrábět každý potřebný polypeptid, přičemž je v dosahu kontrolovaná výroba hormonů, enzymů, protilátek a vakcín proti nejrůznějším onemocněním. Citované publikace, ve kterých jsou podrobněji popsány shora uvedené typické příklady bakteriální výroby polypeptidů, jsou na tomto místě uváděny, stejně tak jako další níže uvedené publikace, za účelem bližšího objasnění podstaty vynálezu.

Výkonným útvarem rekombinační DNA technologie je plasmid, chromosomů prostá smyčka dvouvláknové DNA nalezená v bakteriích, často v mnohonásobných kopiích v jed-e bakteriální buňce. V informaci zakódované v plasmidické DNA jest včleněna informace potřebná k reprodukci plasmidu do dceřinné buňky (tzv. „replikón“) a obvykle jedna nebo více selekčních charakteristik, jako je rezistence vůči antibiotikům, které umožňují, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu, mohou být rozpoznány, selektivně vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí.

Užitečnost bakteriálních plasmidů spočívá ve skutečnosti, že je lze specificky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleázou neboli „restrikčním enzymem“, přičemž každá z těchto endonukleáz rozpoznává na plasmidické DNA odlišné místo. Po rozštěpení lze vpravit do plasmidu heterologické geny nebo fragmenty genů buď přímým připojením v místě rozštěpení, nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Pod pojme „Lheterologický“ používaným v popisu vynálezu se rozumí gen, který se obvykle nenachází v bakteriích E. coli, nebo polypeptidická sekvence, která není těmito bakteriemi obvykle produková na, zatímco pojem „homologický“ se vztahuje na gen nebo polypaptid, který · je produkován divoce rostoucím typem bakterií · E. coli. Rekombinace DNA se provádí vně bakterií, ale vzniklý „rekombinovaný“ plasmid lze zavěsti do bakterií postupem známým jako transformace a kultivací získaného transformantu lze připravit velká množství rekombinovaného· plasmidu obsahujícího heterologický gon. Kromě toho, podle toho· kam se gen vhodně zavede vzhledem k částem plasmidu, které řídí transkripci („přepis“) a translaci („překlad) zakódovaných DNA · informací, lze získaný vylučovací prostředek použít k aktuální produkci polypeptické sekvence, pro· kterou je vestavěný gen kódován; tento postup se v popisu vynálezu označuje jako vylučovací (exprese).

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která se vyznačuje tím, že je místem připojení RNA-polymerázy. V některých případech, jako v níže diskutovaném případu tryptofanového (trp) operónu, jsou oblasti promotoru překryty oblastmi „operátoru“ a vytváří se kombinovaný promotor-operátor. Operátory jsou sekvence DNA, které lze rozpoznat přítomností tak zvaných represorových proteinů, které slouží k regulování frekvence iniciace transkripce u specifického promotoru. Polymeráza se · pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím vláknu DNA z jeho 5‘ místa na 3‘ konec informační kyseliny · ribonukleové (m-RNA) a tyto informace ihned překládá do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselin, které je v DNA zakódované. Každá aminokyselina je zakódována jediným tripletem nukleotidů, neboli „kodónem“, pro který je v popisu vynálezu používán termín „strukturální gen“ a označuje tu část DNA, ve které je zakódována sekvence aminokyselin vyloučeného peptidického produktu. Poté, co se RNA-polymeráza naváže na promotor, transkribuje nejprve nukleotidy kódováním na ribozómové vazebné místo, pak dojde k iniciaci translace neboli k signálu „start“ (obyčejně kodónem ATG, který se ve vzniklé informační RNA stane AUG) a poté k translaci nukleotidických kodónů do samotného · strukturálního genu. Na konec strukturálního genu se transkribují tak zvané stop-kodóny a polymeráza může poté vytvářet další sekvenci informační RNA, která vzhledem k přítomnosti stop-signálu zůstává nepřenesena do ribozómů.

Ribozómy se naváží na vazebné místo připravené na informační RNA, v bakteriích obvykle poté, co se mRNA vytvoří, a samy produkují polypeptidy podle zakódované sekvence, počínaje start signálem translace a konče zmíněným stop signálem. Žádaný produkt se tvoří jen tehdy, když jsou sekvence kódující vazebné místo· ribozómů umístěny správně vzhledem k AUG iniciačnímu kodónu a když všechny zbývající kodóny následují za inciačním kodónem ve fázi. Vzniklý produkt lze získat lýzou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bílkovin vhodnou čisticí metodou.

Polypeptidy získané expresí za použití rekombinační DNA technologie mohou být zcela heterologické, jako v případě přímého vylučování lidského růstového hormonu, nebo se alternativně mohou skládat z heterologického polypeptidu, na který je navázána [fúzována) alespoň část aminokyselinové sekvence homologického peptidu, jako v případě přípravy meziproduktů pro somatostatin a složek lidského insulinu. · V posléze uvedeném případu obsahuje například homologický peptid navázanou část aminokyselinové sekvence pro betagalaktosidázu. V takových případech je žádaný bioaktivní produkt bilogicky inaktivován navázaným homologickým polypeptidem do té doby, dokud, není posléze uvedený peptid odštěpen působením extracelulárních prostředků. Fúzované bílkoviny, jako ty, které byly zmíněny výše, lze pokládat za prekursory žádaných bílkovin, které se z nich dají získat vysoce specifickým štěpením, jako například působením bromkyanu, obsahují-li methionin, nebo alternativně enzymatickým štěpením; viz například britský patent č. 2 007 676 · A.

Má-li rekombinační DNA technologie splnit · očekávané naděje, · musí · se nalézti . systémy, které optimalizují expresi vložených genů a umožňují získávat žádané polypeptidické produkty ve vysokých výtěžcích. Beta-laktamázové a laktózové promotor-operátorové systémy, kterých se v minulosti nejběžněji používalo, poněvadž byly užitečné, nevyužívaly plně kapacitu technologie z hlediska výtěžků. Bylo třeba nalézti prostředek pro bakteriální vylučování peptidů, který by umožňoval · kontrolovatelnou expresi žádaných polypeptidických produktů ve vysokých výtěžcích.

Tryptofan je aminokyselina produkovaná bakteriemi a používaná jimi jako komponenta homologických polypeptidů. Biosyntéza probíhá následujícím způsobem: kyselina chorismová · kyselina antranilová -* kyselina fosforíbosylantranilová -* CDRP (enol-1-(o-karboxyfenylamino)-l-desoxy-D-ribulosa-5-fos-fát) -* indol-3-glycerolfosfát a posléze samotný tryptofan. Enzymatické reakce této biosyntézy jsou katalyzovány produkty tryptofanového operónu, což je polycistrónový úsek DNA, který je transkribován pod řízením trp-promotorového-operátorového systému. Vzniklá polycistrónová informační RNA kóduje tak zvané hlavní tryptofanové sekvence a pak, v níže uvedeném pořadí, polypeptidy označované zde jako trp E, trp D, trp C, trp B a trp A. Tyto polypeptidy v různé míře katalyzují a kontrolují individuální stupně biosyntézy tryptofanu z kyseliny chorismové.

V divokém typu bakterií E. coli je tryptofanový operón pod vlivem alespoň tří různých forem regulačních kontrol. V případě

6 represe promotoru-operátoru působí sám tryptofan jako korepresor, váže se na svůj aporepresor a vytváří aktivní represorový komplex, který se ihned poté váže na operátor a ukončuje biosyntézu v jejím celku. Za druhé, mechanismem inhibice zpětné vazby, se tryptofan váže na komplex trp E a trp D polypeptidů a zamezuje tím jejich účast na biosyntéze. Posléze se provádí regulace mechanismem, známým jako útlumový faktor, pod kontrolou „útlumové oblasti“ genu, oblasti, která je uvnitř hlavní trp-sekvence. Viz obecně G. F. Miozzari a spolupracovníci v časopise j. Bacteriology 133, 1457 (1978); monografie „The Operon“, str. 263 až 302, vydavatelé Miller a Reznikoff, Cold Spring Harbor Laboratory (1978); F. Lee a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, 4365 (1977); a. K. Bertrand a spolupracovníci, J. Mol. Biol. 103, 319 (1976). Zdá se, že stupeň útlumu je ovládán intracelulární koncentrací tryptofanu, a u divokého typu bakterií E. coli ukončuje útlumový článek expresi přibližně v devíti z desíti případů, pravděpodobně vytvářením sekundární struktury neboli „terminační smyčky“ v informační RNA, což má za následek, že se RNA-polymeráza předčasně vyprostí z připojení k DNA.

Jiní pracovníci použili trp-operón za účelem, aby získali nějaké měřítko pro expresi heterologických peptidů. Tento pracovní směr se pokouší řešit problémy represe a útlumu přidáváním kyseliny indolylakrylové, induktoru a analogu, který soutěží s tryptofanem a trp-represory v molekule, a směřují k vyvolání deprese pomocí kompetitivní inhlbice. Induktor zmenšuje současně útlum inhibicí enzymatické konverze indolu na tryptofan, a tak účinně zbavuje buňky tryptofanu. Výsledkem je, že více polymeráz úspěšně transkribuje přes útlumový článek. Tento přístup se však zdá problematický z hlediska důsledného dokončení translace a provedení ve vysokém výtěžku, neboť syntéza bílkovinové sekvence obsahující tryptofan se předčasně ukončí v důsledku nedostatku využitelného tryptofanu. Účinné snížení útlumu při tomto přístupu jest ovšem úplně závislé na silném tryptofanovém. hladovění.

Vynález se věnuje problémům spojeným s represí a útlumem biosyntézy tryptofanu odlišným způsobem.

Předmětem vynálezu je

1) způsob získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro přímou expresi heterologických genů z trp-promotoru-operátoru,

2) způsoby získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro expresi, z tryptofanového operátoru-promotoru, specificky štěpitelných polypeptidů kódovaných fúzemi homologických a heterologických genů a

3) způsob výroby heterologických polypepťdů bakteriální expresí, vyznačující se tím, že ho lze provádět kontrolovatelně, účinně a ve vysokých výtěžcích, a způsob výroby potřebných prostředků.

Podle vynálezu se provádí způsob výroby polypeptidického produktu, zcela heterologického nebo fúzované bílkoviny obsahující heterologický polypeptid, bakteriálním vylučováním strukturálního genu kódující zmíněný polypeptid, přičemž se připraví bakteriální inokulant transformovaný replikace schopným plasmidickým vylučovacím prostředkem a transformovaný inokulant se přenese do fermentační nádoby a kultivuje se do dosažení předem určené hladiny.

Podstata způsobu podle vynálezu pak spočívá v tom, že se k transformaci bakteriálního inokulantu použije plasmidického vylučovacího dvojvláknového DNA a obsahujícího ve fázi od prvního 5‘ konce ke druhému 3‘ konci kódujícího. vlákna bakteriální tryptofanový promotorový-operátorový systém, nukleotidy kódující na ribozómové vazebné místo pro translaci strukturálního genu kódujícího aminokyselinovou sekvenci heterologického polypeptidů a nukleotidy kódující startovací translační signál pro zahájení translace strukturálního genu kódujícího aminokyselinovou sekvenci heterologickébo polypepUdu, přičemž uvedená sekvence neobsahuje ani oblast pro. trp útlumovou schopnost ani nukleotidy kódující na trp E .ribozómové vazebné místo, a po kultivaci inokulantu v živném prostředí obsahujícím přídatný tryptofan v množství dostatečném k potlačení shora uvedeného promotorového-operátcrového systému se získaná kultura . bakterií zbaví přídatného tryptofanu a vy-, loučí se polypeptidický produkt.

Buňky se transformují přidáním plasmidů připravených způsobem podle vynálezu a · obsahujících trp-promotor-operátor, kterým však chybí útlumový článek, a kultivují . se v přítomnosti záměrně přidaného tryptofanu. Použití živného prostředí bohatého na tryptofan umožňuje, aby dostatek tryptofanu v podstatě úplně potlačil interakce trp promotor-operátoru s trp-represorem, takže růst buňek může postupovat bez inhibice předčasným vylučováním velkých množství heterologických polypeptidů zakódovaných ve vloženém genu, jinak pod kontrolou trp promotorového-operátorového systému. Když se rekombinovaná kultura vypěstuje na úroveň vhodnou pro průmyslovou produkci polypeptidu, vnější zdroj tryptofanu se naopak odstraní a buňky se nechají odkázány pouze na tryptofan, který mohou samy produkovat. Výsledkem je slabé omezení tryptofanu, v důsledku toho je potlačena biosyntéza a dojde k vysoce účinnému vylučování vloženého heterologického genu, nebráněné útlumem, protože útlumová oblast je ze systému vypuštěna. Tímto způsobem nejsou buňky nik

Ί dy příliš zbaveny tryptofanu a všechny bílkoviny, ať obsahují tryptofan nebo ne, mohou být produkovány ve vysokých výtěžcích.

Vynález rovněž zahrnuje způsoby štěpení dvojvláknové DNA vhodnými prostředky v kterémkoliv žádaném místě, dokonce i v nepřítomnosti restrikčního enzymového místa; uvedená pracovní technika jest vhodná, mimo jiné, k sestrojení trp-operónů majících deletovaný útlumový článek, a to jiným způsobem než byly získávány dříve selekcí mutantů.

Posléze vynález umožňuje výrobu různých užitečných meziproduktů a konečných produktů, včetně specificky štěpitelných heterologicky-homologických fúzovaných bílkovin, které jsou stabilizovány vůči odbourávání za podmínek vylučování.

Způsob podle vynálezu, jeho podstata a výhody jsou blíže objasněny v následujícím podrobném popisu a na přiložených výkresech na obr. 1 až 13.

Obr. 1 a 2 ilustrují výhodné schéma přípravy plasmidů schopných exprese heterologických genů ve formě fúzí s částí trp D polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin je lze později specificky odštěpit.

Obr; 3 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické [trp D‘j a heterotogické (somatostatin nebo· thymosin a 1) fúzované bílkoviny, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 4, 5 a 6 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojení · plasmidu schopného přímého vylučování heterologického genu (lidského růstového hormonu-HGH-gen) za kontroly trp promotorového-operátorového systému.

Obr. 7 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny obsahující lidský růstový hormon (HGH) přímo vylučovaný za kontroly trp promotorového-operátorového systému, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 8, 9 (a až b) a 10 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojování plasmidů · schopných vylučování heterologických genů (ve znázorněném případě somatostattnu) ve formě fúzí s částí trp E polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin lze heterologícké peptidy později specificky odštěpit. Na obr. 9a (a) znamená 5‘ -* 3‘ digesci komplementárního vlákna LE‘ strukturálního genu lambda-exonukleázou, (bj znamená připojení oligonukleotidu 26, 32pCCTGTGCATGAT na vzdálenější konec LE‘ kódujícího vlákna a (c) znamená Klenowovu polymerázu I (5‘ -» 3‘ — polymeráza) + 4 dNTP (a 3‘ -> 5‘ exonukleáza).

Obr. 11 znázorňuje výsledky dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické (trp E) a heterologícké fúzované bílkoviny vhodné pro produkci například somatostatinu, thymosinu alfa 1, lidského prolnsulinu a A a B řetězců lidského insulinu, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 12 a 13 znázorňují postupné stupně způsobu, při kterém plasmid vytvořený postupem znázorněným na obr. 8 až 10 včetně je zpracován tak, aby vytvořil systém, ve kterém se mohou zaměnitelně vylučovat jiné heterologícké geny ve formě fúzí s polypeptldickými sekvencemi trp E peptidu.

Na uvedených obrázcích jsou z důvodu jasnosti ilustrace zobrazeny ve většině případů jen kódovací řetězce dvojvláknového plasmidů a lineárních DNA. Geny kódující resistenci vůči antibiotikům jsou označeny ap^R (resistence vůči ampicilinu) a tc^R · (resistence vůči tetracyklinu). Označení tc^s znamená gen pro tetracyklinovou resistenci, který není pod kontrolou promotorového-operátorového systému, takže plasmidy · obsahující tento gen nemohou být nikdy citlivé na tetracyklin. Legenda „ap^s“ značí ampicilinovou citlivost vzniklou vynecháním části genu kódující ampicilinovou citlivost. Plasmidické promotory a operátory jsou označeny „p“ a „o“. Písmena A, T, G a C označují nukleotidy obsahující báze ademin, thymin, guanín a popřípadě cytosin. Význam dalších legend uvedených v obrázcích bude vysvětlen v následujícím textu.

Výhodná provedení způsobu podle vynálezu popsaná níže zahrnují použití řady běžně dostupných restrikčních endonukleáz identifikovaných v dalším popisu; jejich odpovídající rozpoznávací sekvence a vzory štěpení (místa štěpení jsou označena šipkami ) jsou znázorněny níže:

238612
9	10
Označení endonukleázy	nukleotidové sekvence a místo štěpení	Označení endonukleázy	nukletidové sekvence a místo štěpení
Xbal	I	Taql
	TCTAGA		TCGA
	AGATCT		AGCT
EcoRI	Ť	HindlII	1 Ť.
	Gaattc		AAGCTT
	CTTAAG		TTCGAA
	Ť		ΐ
BglII	1	Hpal
	AGATCT		i
	TCTAGA		GTTAAC
PvuII	I Ť GAGCTG	Pstl	CAATTG t .
BamHI	GTCGAC J ΐ		ctgcaG
	GGATCC		gacgtc
	CCTAGG		1
	4

Když jsou body štěpení prostorově · umístěny odděleně na příslušných řetězcích, jsou, rozštěpené konce „l.spvé“ (záchytné), tj. schopné opětovné anotace (uzavření kruhu) nebo schopné připojení na jiné komplementární DNA zakončené lepivým koncem, podle Watsonova-Crickova principu párování bází [A s T a G s C) na. principu drážky a čepu. Některé restrikční enzymy, jako shora uvedený HpaJ. a PvulI štěpí řetězec DNA za vzniku „otupených“ konců.

Shora uvedené nukleotidové sekvence jsou znázorněny v souhlase s běžnými konvencemi: vrchní řetězec je řetězec kódující bílkoviny a při postupu z leva do prava po zmíněném řetězci jde o pohyb z jeho 5‘-konce na 3‘-konec, tj. ve směru transkripce od „bližšího“ ke „vzdálenějšímu“ bodu.

Posléze v souhlase s konvencemi, symbol „A“ značí dcleci [vynechání určité sekvence). Tak například označení plasmidu „AEcoRI-Xbaí“ popisuje plasmid, ze kterého byla odstraněna nukleotidická sekvence mezi místy působení restrikčuích enzymů EcoRI . a Xbal digescí těmito enzymy. Pro lepší názornost jsou některé delece označeny čísly. Tak například, počínaje prvním párem bází („bp“) rozpoznávacího místa enzymu EcoRI, který předchází genu pro tetracyklinovou resistenci v rodičovském plasmidu pBR322, značí „.Δ1“ vynechání párů bp 1 až 30 [tj. AEcoRI až HindlII) a z toho vyplývající eliminaci tetracyklinovébo promotorového-ope' rátorového systému; „A2“ značí deleci bp 1 až 375 (tj. AEcoRI až BamHI) a z toho vyplývající odstranění jak tetiaicykiinOvébo promotoru-opurátoru, tak strukturálního genu, který kóduje tetracyklinovou resistenci; a „A'-“ značí vynechání sledu bp 3 611 až 4 353 (tj. APstí .až EcoRI) a v důsledku toho eliminaci ampicilinové resistence. Symbolu ,,A4“ se používá k označení odstranění sek·,, vence bp —900 až —1 500 z trp operónového fragmentu 5 (viz · obr. 1) a v důsledku toho eliminaci strukturálního genu pro polypeptld trp D.

Hlavní trp sekvence je vytvářena páry bází (bp) 1 až 162, počínaje od výchozího bodu pro trp mRNA. Čtrnáct aminokyselin uvedeného hlavního trp polypeptldu je zakódováno páry bp . 27 až 71, následujících za ATG nukleotidy, které kódují startovní signál pro translaci. Oblast trp útlumového článku zahrnuje postupně GC-bohaté a AT-bohaté nukleotidové sekvence, ležící mezi bp 114 až 156, a útlum je zřejmě způsobován mRNA nukleotidy zakódovanými páry -134 až 141 hlavní sekvence. Aby došlo k expresi heterologického polypeptidu za. řízení trp hlavním ribozómovým vazebným místem a současně aby se zamezilo útlumu, musí být sledována následující kritéria:

1. páry bází 134 až 141 nebo ještě následující musí být vynechány;

2. ATG kodón vloženého genu musí být umístěn ve správné relaci vzhledem k ribozómovému vazebnému místu, jak je popsáno v literatuře [viz například kapitolu J. A. Steitze „Genetické signály a nukleotidické.· sekvence v informační RNA“ v monogra fii „Biological Regulation ' and Control“ (vydavatel R. Goldbergerj, Plenům Press, N. Y. (1978)];

3. mají-li být produkovány homologicko-heterologické fúzované bílkoviny, musí zůstat dostupný startovní signál pro translaci homologické polypeptidické sekvence, a kodóny pro homologickou část fúzované bílkoviny musí být včleněny ve fázi, aniž by zasahovaly do stop-signálu pro translaci.

Tak například vynecháním všech párů bází uvnitř hlavní sekvence, vzdálenějších od bp 70, se odstraní· oblast útlumu, ponechá se ATG kodón, který kóduje startovní signál pro translaci a eliminuje se mezi nimi ležící stop-signál pro translaci kódovaný sekvencí TCA (bp 69 až 71), eliminací nukleotidu A a následujících nukleotidů. Vynechání takové sekvence má za následek expresi fúzovaných bílkovin začínajících hlavním polypeptidem a končících proteinem zakódovaným příslušnou heterologickou vložkou, a včetně vzdálenější oblasti jednoho z polypeptidů za vedoucím trp-operónem, určeného rozsahem vynechání sekvence ve směru k 3‘-konci. Tak například vynechání zasahující do· E genu vede k expresi homologického prekursoru obsahujícího sekvenci L a vzdálenější oblast sekvence E [za konečným bodem vynechané sekvence), fúzovaných se sekvencí kódovanou následující vložkou, a tak dále.

Dva zvláště vhodné plasmidy, ze kterých byla odstraněna oblast útlumu, jsou plasmidy pGMl a pGM3; viz publikaci G. F. Mozzariho a spolupracovníků v časopise J. Bacteriology 133, 1 457 (1978). Tyto plasmidy mají popřípadě delece trp ALE 1 413 a trp ALe 1 417 a vylučují [za kontroly trp-promotoru-operátoru) polypeptidy obsahující přibližně prvních šest aminokyselin hlavní trp sekvence a a vzdálenější oblasti polypeptidů E.

V nejvýhodnějším případě, u plasmidu pGMl, je vylučována pouze asi poslední třetina polypeptidů E, zatímco plasmid pGM3 vylučuje téměř celou vzdálenější polovinu kodónů polypeptidů E. Bakterie E. coli K-12, kmen W 3 110 tna 2’trp 102 obsahující plasmid pGMl jsou uloženy v americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture CoHection) pod označením ATCC číslo 31 622. Plasmid pGMl se může z uvedeného kmene odstranit obvyklým způsobem a lze ho pak používat v níže popsaných postupech.

Alternativně lze delece některých sekvencí provádět způsoby podle vynálezu, které umožňují specifické štěpení dvo-jvláknového DNA na kterémkoliv žádaném místě. Jeden příklad této štěpící pracovní techniky je zřejmý z příkladu 4 uvedeného níže. Tak například se dvojvláknová DNA rozdělí na jednotlivá vlákna DNA v okolí oblasti zamýšleného místa štěpení, například reakcí s lambda-exonukleázou. K takto- předem vytvořené jednovláknové části DNA se pak hybridizuje syntetický nebo jiný jednovláknový DNA primér, pomocí Watsonova-Crickova principu párování bází, přičemž sekvence priméru musí být účelně taková, aby zaručovala, že jeho 5‘-konec bude koterminální s nukleotidem na prvním vláknu DNA právě před určeným bodem štěpení. Primér se pak prodlouží směrem k 3‘-konci reakcí s DNA polymerázou, a tak se znovu sestaví ta část původní dvouvláknové DNA, která je před určeným místem štěpení a která byla v prvním stupni ztracena. Současně nebo poté se část prvního vlákna DNA za určeným místem štěpení odstraní digescí vhodným enzymem. Postup je shrnut graficky v následujícím schématu, ve kterém „v“ označuje určené místo štěpení DNA:

a) .......

určené míso štěpení řetezceDN A „v“

b) ....... v vytvoření jednovláknové DNA v olkolí ,,v“

c) ....... v hybridkaice priméru

d) ....... v prodloužení priméru ————-——. . · · · · ·

e) ....... v digesce jednovláknové DNA za místem štěpení „v“.

Při výhodném způsobu provedení se stupně

d) ae) znázorněného postupu provádějí současně, za použití polymerázy, která současně digeruje vyčnívající jednovláknový konec DNA ve směru 3‘ -> 5‘ a prodlužuje primér ve směru 5‘ -> 3‘ (v přítomnosti dATP, dGTP, dTTP a dCTP). Vhodným materiálem pro uvedený účel je Klenowova polymeráza I, tj. fragment získaný proteolytickým štěpením DNA polymerázy I, který vykazuje 5‘ - 3^l polymerizační účinnost a 3‘ -> 5‘ exonukleolytickou aktivitu rodičovského enzymu, ale kterému chybí její 5‘ - 3‘ exonukleolytická účinnost; víz A. Kornberg v monografii „DNA Synthesis“, str. 98, W. H. Freeman and Co., SFO (1974).

Za použití právě popsaného postupu lze provádět delece útlumové oblasti z plasmidu obsahujícím trp-operón, po jeho předchozí linearizaci, např. štěpením v místě žádané restrikce, položeném níže od bodu, ve kterém má být molekula zakončena otupeným koncem (viz shora uvedené „v“). Opětovné uvedení plasmidu do kruhového tvaru následující po odstranění útlumové oblasti lze uskutečnit například navázáním „tupého“ konce molekuly nebo jinými způsoby, které jsou odborníkům známé.

Ačkoliv způsob podle vynálezu zahrnuje přímé vylučování heterologických polypeptidu za řízení trp-promotorem-operátcrem, týká se přednostní způsob jeho provedení vylučování fúzovaných bílkovin obsahujících jak homologické, tak heterologické sekvence, přičemž posléze uvedené polypeptidy se s výhodou dají odštěpit od prvých v extracelulárních prostředcích. Zvláště výhodnými jsou takové fúze bílkovin, ve kterých se homologická část skládá z jedné nebo více aminokyselin z trp hlavního polypeptidu a asi z jedné třetiny nebo více trp E aminokyselinové sekvence (ze vzdálenějšího konce). Takto získané fúzové bílkoviny se jeví podstatně stálejší vůči degradaci za podmínek exprese.

Bakterií E. co li K-12, kmene W 3 110 tna 2trp~ Δ102 (pGMl), ATCC číslo 31 622, lze používat к rozšiřování kmenů plasmidu pGMl, kterých se podle vynálezu s výhodou používá к sestrojování trp-promotorových-operátiorových systémů zbavených útlumové oblasti. Tento kmen je v přítomnosti anthranilátu fenotypicky trp ⁺ a lze ho pěstovat na minimální živné půdě, jako například na půdě LB doplněné 50 <ug/ml anthranilátu.

Všechny bakteriální kmeny používané při expresi řízené trp promotorem-operátorem podle vynálezu jsou trp represory⁺ („trp R⁺“) jako v případě divokého typu bakterií E. coli, čímž je zajištěna represe až do doby zamýšleného heterologického vylučování.

Při výhodném způsobu provedení se rekombinace DNA provádí v bakteriích E. coli K-12, kmenu 294 (zakončení A, thi, hsr, hsm_k ⁺), ATCC číslo 31 446, což je bakteriální kmen, jehož membránové charakteristiky usnadňují transformace. Plasmidy produkující heterologické polypeptidy, vypěstované v kultuře kmene 294, se běžným způsobem extrahují a uchovávají v prostředí vhodného roztoku [např. v roztoku 10 mmol tris(=tris/ /hydrcxymethyl/amlnomethan) a 1 mmol EDTD (= kyselina ethylendiamintetraoctová), pH 8] při teplotě v rozmezí asi od —20, do 4 °C.

Na druhé straně, pro expresi peptidů za průmyslových podmínek, se podle vynálezu dává přednost odolnějšímu kmenu, tj. kmenu E.coli K-12 /VF“ RV str¹’, gal 308“, označenému ATCC číslem 31 608. Kmen RV 308 jest nutričně divokým typem, roste dobře na minimální půdě a syntetizuje všechny nezbytné makromolekuly z běžných směsí amonných, fosforečnanových a horečnatých solí, stop kovů a glukózy. Po transformaci kultury RV 308 plasmidem odvozeným z kmene 294 se kultura pěstuje na agarových deskách v prostředí selektivním pro znak nesený plasmidem (jako je například resistence vůči antibiotikům) a kolonie transformantů se vyberou a kultivují v baňkách. Alikvotní díly posléze uvedené bankové kultury v 10% roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo glycerolu (ve sterilních lékovkách) se rychle zmrazí v lázni z ethanolu a suchého ledu a uchovávají se při —80 °C. Za účelem produkce zakódovaného heterologického polypeptidu sc vzorky takto uložené kultury pěstují v prostředí obsahujícím tryptiofan, čím зэ potlačí trp-promotor-operátor, pak se systém zbaví přídatného tryptofanu a tím dojde к vylučování peptidu.

Pro první stupeň kultivace se dá použít například LB živného prostředí (viz J. H. Miller v monografii „Experiments in Molecular Genetics“, str. 433, Gold Spring Harbor Laboratory 1972), které obsahuje na každý litr roztoku 10 g tryptonu, 5 g kvasnlčného extraktu a 10 g chloridu sodného. Inokulant se s výhodou kultivuje do optické hustoty (dále označované zkratkou „o. d.“) o hodnotě 10 nebo více (při 550 nm), výhodněji do o. d. 20 a nejvýhodněji do o. d. 30 nebo více, nicméně na o. d. menší, než má stacionární fáze.

Za. účelem dere prese a (exprese polypeptidxkých produktů se inokulant potě kultivuje za podmínek, které zbavují buňky přidaného tryptofanu. Jedno z vhodných živných prostředí pro tento druh kultivace je půda M9 (viz J. H. Miller, shora uvedená monografie, str. 431), připravená následujícím způsobem (uvedeno množství substancí na jeden litr roztoku):

dihydrogenfosforečnan draselný 3g hydrogenfosforečnan sodný 6g chlorid sodný0,5 g chlorid amonný 1g

Roztok se autoklávuje a pak se přidá:

ml 0,01 M roztoku bezvodého chloridu vápenatého ml 1 M roztoku bezvodého síranu horečnatého ml 20% roztoku glukózy ^g/ml vitaminu Bi <ug/ml kaseinového aminokyselinového hydrolyzátu.

Posléze uvedený aminokyselinový dodatek živné půdy je hydrolyzát kaseinu prostý tryptofanu.

Aby se dosáhlo vylučování iheterologického polypeptidu, zředí se inokulant vypěstovaný na živné půdě bohaté na tryptofan, například větším objemem prostředí neobsahujícím další tryptofan (například 2- až lOnásobné zředění), a pěstuje se až do dosažení žádané hladiny (výhodně krátce po stacionární fázi růstu); žádaný produkt se získá běžným způsobem lýzou, centrifugací a dalším čištěním. Ve fázi kultivace, při které se buňky zbavují tryptofanu, se buňky pěstují s výhodou do stupně o. d. vyšší než 10, ještě výhodněji do o. d. vyšší než 20 a nejvýhodněji do o. d. 30, nebo vyšší (měřeno při 550 nm) a pak se izoluje žádaný produkt.

Všechny rekombinace DNA popsané v následujících příkladech byly provedeny v souhlase se směrnicemi Národních zdravotnických ústavů pro výzkum rekombinovaných DNA.

Příklad 1

Exprese bílkoviny fúzované s trp D polypeptidem

Výhodný způsob vylučování fúzovaných bílkovin obsahujících žádané polypeptidy a na né navázanou část aminokyselinové sekvence trp D polypeptidu, kterou lze oddělit in vitro prostřednictvím aminokyseliny methioninu, specificky citlivé na štěpení bromkyancm, je popsán ve vztahu к obr. 1 až 3.

A. Konstrukce plasmidu pBRHtrp

Plasmid pGMl (1 na obr. 1) nese tryptofanový operón E. coli, mající vynechanou oblast ALE1413 [viz G. F. Miozzari a spolupracovníci, časopis J. Bacteriology (1978), 1 457 až 1 466] a proto vylučuje fúzovanou bílkovinu obsahující prvních 6 aminokyselin hlavní trp sekvence a přibližně poslední třetinu trp E polypeptidu (dále označovanou jako LE‘) a rovněž trp D polypeptid ve svém celku, vše pod kontrolou promotorového-operátorového systému. Plasmid (20 ^g) se digeruje restrikčním enzymem PvuII, který štěpí plasmid na pěti místech. Fragmenty 2 genu se poté kombinují s EcoRI články (obsahujícími vlastní komplementární oligo nukleotid 3 o sekvenci pCATGAATTCATG), čímž se umožní zapojit EcoRI místo štěpení posléze uvedeného fragmentu a vytvořit plasmid obsahující oblast EcoRI (20). Na 20 DNA-fragmentů 2 získaných z pGMl shora uvedeným způsobem se nechá působit 10 jednotek T4 DNA-ligázy v přítomnosti 200 prnol syntetického 5‘-fosforylovaného oligonukleotidu pCATGAATTCATG (3) a 20 μΐ T4 DNA ligázového pufru (20 mmol tris o pH 7,6, 0,5 mmol ATP, 10 mmol bezvodého chloridu horečnatého a 5 mmol dithiothreitolu] při tepplotě 4 °C přes noc. Roztok se pak 10 minut zahřívá na 70 °C, aby se přerušilo spojování. Získané konjugáty se poté rozštěpí digescí s restrikčním enzymem EcoRI a fragmenty, obsahující nyní EcoRI konce, se izolují za použití elektroforézy na 5% polyakrylamidovém gelu (tento postup je v dalším popisu označován jako „PAGE-elektroforéza“). Tři největší fragmenty se z gelu izolují, po předchozím obarvení ethidiumbromidem a určení jejich polohy v ultrafialovém světle, vyříznutím příslušných částí gelové vrstvy obsahujících žádané produkty. Každý vyříznutý fragment gelové vrstvy se umístí spolu s 300 μΐ Ο,ΙΧΤΒΕ pufru do dialyzační komory a podrobí se elektroloréze při 100 V po dobu 1 hodiny v Ο,ΙΧΤΒΕ pufru (TBE pufr obsahuje 10,8 g tris-báze, 5,5 g kyseliny borité, 0,09 gramu Na2EDTA v 1 litru vody). Vodný roztok z dialyzační komory se spojí, extrahuje se fenolem a chloroformem, pak se upraví chloridem sodným na 0,2 M roztok a žádaný fragment DNA se získá po vysrážení ethanolem ve vodném roztoku. (Všechny izolace DNA fragmentů popsané dále byly pomocí PAGE-elektroforézy a následující elektroelucí právě uvedeným způsobem). Získaný gen obsahující trp-promotor-operátor a EcoRI ,,lepivé“ konce 5 byl identifikován dále popsaným postupem, který spočívá v zavedení zmíněných fragmentů do plas-_t midu 6 citlivého na tetracyklin, který se po uvedeném včlenění promotoru-operátoru stane rezistentním vůči tetracyklinu.

B. Sestrojení plasmidu pBRHtrp vylučujícího rezistenci vůči tetracyklinu za kontroly trp-promotoru-operátoru a identifikace a rozmnožení DNA fragmentu obsahujícího trp-promotor-operátor, který byl izolován shora popsaným způsobem (A).

Plasmid pBRHl 6 [viz R. I. Rodriguez a spolupracovníci v časopise Nucleic Acids Research 6, 3 267 až 3 287 (1978)] vylučuje rezistenci vůči ampicilinu a obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, který však, poněvadž není připojen na promotor, nevylučuje posléze zmíněnou rezistenci. Plasmid je proto citlivý vůči tetracyklinu. Zavedením promotorového-operátorového systému pří238612

18 lomného v EcoRI oblasti se plasmid může stát rezistentním vůči tetracyklinu.

Plasmid pBRHl se digeruje restrikčním enzymem EcoRI, enzym se odstraní fenolovou extrakcí a následující extrakcí chloroformem a po vysrážení ethanolem se DNA získá ve vodném prostředí. Vzniklá molekula DNA 7 se pomocí T4 DNA ligázy váže shora popsaným způsobem, v oddělených reakčních směsích, s každým ze tří jednotlivých DNA fragmentů, získaných postupem uvedeným výše v části A. Rekombinovaná DNA, přítomná v reakční směsi, se použije k transformaci příslušných bakterií E. coli K-12, kmene 294, popsaných K. Backmanem a spolupracovníky v časopisu Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 73, 4 174 až 4 198 (1976) a označených ATCC číslem 31 448, standardní pracovní technikou; bakterie se naočkují na misky s agarem s minimální LB půdou obsahující 20 μυ/ml ampicilinu a 5 ^g/ml tetracyklinu. Vyrostlé tetracyklin-rezistentní kolonie se vyberou, plasmidická DNA se vyizoluje a přítomnost žádaného fragmentu se potvrdí restrikční enzymatickou analýzou.

Získaný plasmid 8, označený pBRHtrp, vylučuje (Maktamázu, která mu uděluje rezistenci vůči ampicilinu, a obsahuje fragment DNA zahrnující trp-promotor-operátor a. kódující první bílkovinu složenou z prvních, šesti aminokyselin hlavní trp sekvence fúzovaných, s přibližně poslední třetinou trp E polypeptidu (tato část polypepťdu, je označena LE‘), a druhou bílkovinu odpovídající přibližně první polovině trp D polypeptidu (tato část polypeptidu je označena D‘), a třetí bílkovinu kódovanou pro tetracyklinovou rezistenci genu.

C. Začlenění genů pro různé konečné polypeptidické produkty a vylučování posléze uvedených produktů ve formě fúzovaných bílkovin složených z konečného polypeptidu a specificky odštěpitelného trp D polypeptidmkého prekurzoru (obr. 2).

Z plasmidu pBRHtrp se získá fragment DNA obsahující trp-promotor-operátor a kodóny pro LE‘ a D1 polypeptidy, který se vloží do plasmidu obsahujícího strukturální geny pro tvorbu různých žádaných polypeptidů, jak je dále ukázáno na příkladu somatostatinu (viz obr. 2).

Plasmid pBRHtrp se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a získaný fragment 5 se izoluje za použiti PAGE-elektroforézy a elektroeluce. Produkt 10, získaný EcoRI digescí plasmidu pSom 11 9 [viz K. Itakura a spolupracovníci v časopisu Science 198, 1 056 (1977)]; britský patent č. 2 007 676 A), se kombinuje s fragmentem 5. Na směs se působí Ta DNA ligázou, jak bylo popsáno výše, a získanou DNA se transformuíí shora uvedeným způsobem bakterie E. coli K-12, kmene 294. Selekce transformovaných bakterií se provede na agarových deskách obsahujících ampicilin. Získané, vůči ampicilinu rezistentní kolonie se hybridizují sloupcovou technikou [viz M. Gruenstein a spolupracovníci v časopise Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 72, 3 951 až 3 965 (1975) ], za použití vzorku fragmentu 5 obsahujícího trp-promotor-operátor, izolované z pBRHtrp, který byl radioaktivně značen fosforem P32. Provede se selekce kolonií, které jsou pozitivní při sloupcové hybridizaci, plasmidická DNA se izoluje a umístění vložených fragmentů se stanoví restrikční analýzou za použití restrikčních enzymů , BglII a BamHl při dvojité digesci. Bacterie E. coli 294 obsahující plasmid označený pSOM7A2 11, který obsahuje trp-promotoro. vý-operátorový fragment v žádané orientaci, se kultivují v živné půdě LB obsahující 10 jíg/ml ampicilinu. Buňky se pěstují do dosažení hustoty o. d. 1 (při 550 nm), pak se odcentrifugují a .suspendují se znovu v desetinásobném zředění do, živné půdy M9. Buňky se kultivují 2 až 3 hodiny, opět do optické hustoty 1, pak se lyžují a celková buněčná bílkovina se analyzuje za použití elektroforézy na PAGE obsahujícím 15 % SDS-močoviny (SDS= dodecylsulfát sodný) [viz J. V. Maizel ,a spolupravovníci v časopisu , Meth. Viral 5, 180 až 246 (1971)).

Na obr. 3 je znázorněna gelová analýza bílkovin, při které byla celková bílkovina získaná z různých , kultur, rozdělena na jednotlivé složky. Hustota jednotlivých pásů , je měřítkem množství, ve kterém jsou jednotlivá bílkoviny přítomny. Na uvedeném obrázku představují dráhy 1 a 7 kontrolní vzorky zahrnující různé bílkoviny s předem stanovenou polohou, které slouží jako body pro srovnávání. Dráhy 2 a 3 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z kolonií E. coli 294 transformovaných plasmidem pSom7A2, kultivovaných jednak na živné půdě LB (dráha 2), jednak na půdě M9 (dráha 3). Dráhy 4 a 5 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z analogických buněk E. Coli 294 transformovaných plasmidem pTha7A2, tj. plasmidem vylučujícím thymosin; uvedený plasmid se získá v podstatě stejnými postupy, Jak již bylo, popsáno výše, počínaje plasmidem pThal (viz publikovaná přihláška evropského patentu č. 0 035 454). Dráha 4 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/pTha7A2 kultivovaných na živné LB půdě, a dráha 5 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané ze stejného transformanta kultivovaného na půdě M9. Dráha 6 jest další kontrola a znázorňuje rozdělení rodičovské bílkoviny z bakterií E. coli 294/pBR322, pěstované na LB půdě.

Ze srovnání s kontrolami vyplývá, že nejhořejší ze dvou největších párů v každé z drah 3 a 5 patří předpokládaným polohám bílkovm vylučovaných ve formě fúzovaného proteinu skládajícího se z D‘polypeptidu a somatosta.tinu, popřípadě thymosinu (další hlavní pásy představují LE^<poIypeptid vznikající vynecháním útlumové oblasti). Ob. 3 potvrzuje, že exprese je v živné půdě bohaté na tryptofan potlačena, ale naopak uvolněna za podmínek s nedostatkem tryptofanu v půdě.

D. Štěpení bílkovin bromkyanem a radioimunostanovení hormonálního produktu

V obou případech, jak u bílkoviny obsahující thymosin, tak u bílkoviny obsahující somatostatin, byla celková buněčná bílkovina rozštěpena bromkyanem, rozštěpený produkt izolován a po vysušení suspendován v pufru a analyzován radioimunometodou; bylo potvrzeno, že získané produkty jsou imunologicky identické se somastatinem, popřípadě thymosinem. Štěpení bromkyanem je popsáno D. V. Goeddelem a spolupracovníky v časopise Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 76 str. 106 až 110 (1979).

Příklad 2

Konstrukce plasmidů pro přímé vylučování heterologických genů za kontroly trp-promotorového-operátorového systému

Pro strategii přímého vylučování je nezbytné sestavit plasmid obsahující jediné restrikční místo vzdálené od všech kontrolních prvků trp-opcrónu, do kterého mohou být začleněny heterologické geny místo hlavní trp-sekvence a ve vhodné prostorové relaci к ribozómovému vazebnému místu pro hlavní trp polypeptid. Přístup к dosažení přímého vylučování heterologických peptidů jest v dalším popsán na příkladu vylučování lidského růstového hormonu.

Plasmid pSom7 Δ2 (10 μ£) se rozštěpí restrikčním enzymem EcoRI a DNA fragment 5, obsahující tryptofanové genetické prvky,, se izoluje pomocí PAGE-elektroforézy a elekt.roeluce. Získaný fragment (2 ^g) se digeruje 10 minut při 37 °C dvěma jednotkami restrikčními endonukleázy Taq I tak, aby se v každé molekule rozštěpilo v průměru pouze jedno z přibližně pěti Taq I restrikčních míst. Získaná směs rozštěpených fragmentů se rozdělí PAGE-elektroforézou a fragment 12 (viz obr. 4), který obsahuje přibližně 300 párů bází, jeden EcoR I konec a jeden Taq I konec, se izoluje elektroelucí. Příslušné Taq I restrikční místo jest umístěno mezi místy pro start transkripce a pro start translace a je o 5 nukleotidů vzdálené od ATG kodónu hlavního trp peptidu. DNA sekvence okolo tohoto místa je znázorněna na obr. 4. Uvedeným postupem lze izolovat fragment obsahující všechny kontrolní prvky trp-operčmu, tj. promotorový-operátorový systém, signál pro iniciaci transkripce a trp-hlavní ribozómové vazebné místo.

Zbytek Taq I na konci 3‘ získaného fragmentu, sousedící se signálem pro start translace pro hlavní trp-sekvenci, se poté převede do Xba I místa plasmidů pHSs2 s vynechanou sekvencí EcoR I — Xba I, způsobem znázor-.

něným na obr. 5. Tato operace se provede navázáním fragmentu 12, získaného shora uvedeným postupem, na plasmid obsahující jediné (to znamená jen jedno) EcoRI a jediné Xba I restrikční místo. Pro tento účel lze používat v podstatě jakéhokoliv plasmidů obsahujícího, v následujícím poradí, replikón, selektivní znak, jako rezistenci vůči antibiotikům, a EcoRI, Xbal a BamHI restrikční místa. Tak například lze Xbal restrikční místo zavést mezi EcoRI a BamHI místa plasmidu pBR322 [viz F. Bolivar se spolupracovníky v časopisu Gene 2, 95 až 119 (1977)], například rozštěpením plasmidů v jeho jediném Hind III restrikčním místě pomocí enzymu Hind III, následující digescí vzniklých „lepivých“ konců specifickou jednovláknovou nukleázou a navázáním „tupých“ konců samoanelujícího dvouvláknového syntetického nukleotidu obsahujícího žádané rozpoznávací místo, jako sekvenci CCTCTAGAGG. Alternativně lze použít DNA fragmentů získaných z přirozených plasmidů, jak je tomu v dále popsaném případě, které obsahují jediné Xbal restrikční místo mezi EcoRI a BamHI štěpnými zbytky. Tak např. digescí virového genómu hepatitidy В enzymy EcoRI a BamHI se obvyklým způsobem získá produkt, který se začlení do EcoRI a BamHI restrikčních míst plasmidů pGH6 [viz D. V. Goeddel a spolupracovníci v časopisu Nátuře 281, 544 (1979)] za vzniku plasmidů pHS32. Získaný plasmid pHS32 se rozštěpí enzymem Xbal, směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Na rozštěpený plasmid se působí 1 μΙ E. coli polymerázy I, Klenowovým fragmentem v prostředí 30 μΐ polymerázového pufru (tj. 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 7 mmol chloridu horečnatého bezv. a 1 mmol β-merkaptoethanolu) obsahujícího 0,1 mmol dTTP a 0,1 mmol dCTP, po dobu 30 minut při 0 °C a pak 2 hodin při 37 °C. Při této reakci se doplní dva ze 4 nukleotidů, komplementárních к 5‘ vyčnívajícímu konci Xbal štěpícímu místu:

5‘ CTAGA-- 5‘ CTAGA-3‘ T-- ' 3‘ TCT--Inkorporují se dva nukleotidy, dC a dT, a vznikne konec se dvěma 5‘ vyčnívajícími nukleotidy. Tento lineární zbytek plasmidů pHS32 (izolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem ve vodném prostředí) se štěpí restrikčním enzymem EcoRI.

Velký plasmidický fragment 13 se oddělí od menšího EcoRI — Xbal fragmentu PAGE-elektroforézou a izoluje se elektroelucí. Tento DNA-fragment plasmidů pHS32 (0,2 ₍ug] se naváže, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše, na shora uvedeným způsobem získaný EcoRI — Taql fragment tryptofanového operónu 12 (-0,01 ), jak je znázorněno na obr. 5. Při tomto po238612 stupu so Taql vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec, i když jeho báze nejsou kompletně spárovány podle Wa'sonova a Críckova principu:

CTAGA-TCT---T --AGC

Částí takto získané reakční směsi ligantů se transformují buňky bakterií E. coli 294 stejným způsobem, jak bylo popsáno výše v příkladu T, pak se na kulturu působí teplem a preočkuje se na agarové desky s LB půdou obsahující ampicilin. Selekcí se získá 24 kolonií rez^;stenčních vůči ampicilinu, které se kultivují ve 3 ml LB půdy a plasmid se izoluje. Šest z těchto plasmidů má Xbal místo regenerované cestou baktriemi E. Coli katalyzovaným přepárováním a replikací DNA:

--TCTAGA-- --TCTAGA----AGCTCT-- *--AGATCT--Bylo rovněž nalezeno, že se tyto plasniidy štěpí jak restrikčnim enzymem EcoRI, tak Hpal, a poskytují očekávané štěpné fragmenty. Jednoho z těchto plasmidů 14, označeného pTrp T4, lze použít pro vylučování heterologíckých pelypeptidů, jak je popsáno dále.

Plasmid pHgH 107 18 na obr. 6; [viz publikaci D. V. Goeddela a spolupracovníků v časopisu Nátuře 281, 544 (1979) ] obsahuje gen pro lidský růstový hormon, složený z 23 aminokyselinových kodónů produkovaných ze syntetických DNA fragmentů, a ze T63 aminokyselinových kodónů získaných z komplementární DNA vytvořené cestou reverzní transkripce informační _ RNA pro lidský růstový hormon. Tento gen 21, i když mu schází kodóny předcházející sekvence („pre“-sekvence) lidského· růstového hormonu, obsahuje ATG kodón pro iniciaci translace. Gen se izoluje z 10 μg plasmidů pHOH T07 nejprve působením řestřikčního enzymu EcoRI a poté připojením dTTP a dATP na získaný fragment působením Klenowovy E. coli polymerázy I, jak bylo· již popsáno výše (viz obr. 6j. Vzniklý plasmid se extrahuje fenolem, pak chloroformem a soli se vysráží ethanolem a poté se · rozštěpí enzymem BamHI (viz obr.

6). Vzniklý fragment 21, obsahující gen pro

-----TCTAGA--*--AGCTCT-lidský růstový hormon („HGH“) se izoluje PAGE-elektroforézou a následující elektroelucí. Výsledný DNA-fragment obsahuje rovněž prvních 350 nukleotidů strukturálního genu pro rezistenci vůči tetracyklinu, ale chybí mu tetracyklinový promotorový-operátorový systém, takže, když se v následujícím postupu začlení do plasmidů, který je schopný exprese, lze plasmidy obsahující tuto vložku určit podle obnovení tetracyklin-ové rezistence. Protože EcoRI zakončení fragmentu 21 je doplněno postupem za použití Klenowovy polymerázy I, má zmíněný fragment jeden „tupý“ a jeden „lepivý- konec, což mu zajišťuje správnou orientaci, když je později včleněn do plasmidů schopného exprese; viz obr. 6.

V dalším se upraví plasmid pTrp T4 schopný exprese tak, aby mohl přijmout shora uvedeným způsobem připravený fragment 21 obsahující HGH-gen. Plasmid pTrp 14 se za tím účelem digeruje enzymem Xbal a získané „lepivé“ konce fragmentu doplní za použití postupu s Klenowovou polymerázou I a trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP. Po extrakci reakční směsi fenolem, extrakci chloroforme a vysrážení ethanolem se na získanou DNA 16 působí enzymem BamHI a vzniklý velký fragment plasmidů 17 se izoluje PAGE-elektroforézou a elektroelucí. Uvedený fragment 17 odvozený od pTrp 14 má jeden „tupý“ a jeden „lepivý“ konec, které mu zajišťují správnou orientaci při rekombinaci s fragmentem 21 obsahujícím HGH-gen a popsaným výše.

Fragment 21 obsahující HGH-gen a fragment 17 pTrpl4 AXba-BamHI se zkombinují a navzájem naváží za podmínek podobných těm, které byly popsány výše. Doplněné Xbal a EcoRI konce se naváží spolu s tupými konci za obnovení obou Xbal a EcoRI štěpících míst:

--TCTAG

--AGATC

Xbal doplněný konec

AATTCTATG--

TTAAGATAC—

EcoRI doplněný konec

TJCTAGIAAT TC TATT — a^ŤČIttmIgatac —

Xbal EcoRI iniciace

HGH-genu ,

Touto konstrukcí se rovněž obnoví rezistence genu vůči tetracyklinu. Jelikož plasmid pHGH 107 vylučuje tetracyklinovou rezistenci z promotoru ležícího dále od HGH-genu (lac promotor], umožňuje výsledná konstrukce plasmidu 22, označená jako pHGH 207, vylučování genu pro· tetracyklinovou rezistenci za kontroly tryptofanového promotoru-operátoru. Směsí ligantů, produktů rekombinace, se transformují bakterie E. coli 294 a provede se selekce rezistentních kolonií na agarových deskách s LB půdou obsahující 5 ^g/ml tetracyklinu.

Aby se potvrdilo přímé vylučování lidského růstového hormonu plasmidem pHGH 207, byla celková buněčná bílkovina, která byla získána z bakterií E. coli 294/pHGH 207, které byly kultivovány do optické hustoty 1 na LB půdě obsahující 10 ^g/ml ampicilinu, zředěny 1 : 10 do M9 půdy a kultivovány opět do o. d. 1, podrobena SDS-gelové elektroforéze jako ve shora uvedeném příkladu 1, a získaná data srovnána s analogickými výsledky elektroforézy lidského růstového hormonu, získaného již dříve expresí postupem podle jiných autorů [D. V. Goeddel se spolupracovníky, časopis Nátuře 281, 544 (19719)]. Na obr. 7 je uvedena fotografie získané, obarvené gelové vrstvy po PAGE-elektroforéze: Dráhy 1 a 7 absahují standardy bílkovin o různých známých polohách na elektrogramu. Dráha 2 je kontrola a znázorňuje rozdělení celkové buněčné bílkoviny z bakterií E. coli, kmene 294 pBR322; dráha 3 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/ /pHGH 107, kultivovaných na LB půdě; dráha 4 ukazuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 107 kultivovaných na M9 půdě; dráha 5 znázorňuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 pěstovaných na LB půdě; a dráha 6 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 kultivovaných na M9 půdě. Hustý pás v dráze 6 je lidský růstový hormon, jak je zřejmé ze srovnání s podobnými pásy v dráhách 2 až 4. Jak je podle vynálezu předpokládáno, produkují mikroorganismy E. coli 294/pHGH 207 při kultivaci na LB půdě bohaté na tryptofan méně lidského¹ růstového· hormonu z důvodu interakcí tryptofanového represoru s trp-operátorem, a při kultivaci na M9 půdě produkují podstatně více zmíněného HGH než bakterie E. coli 294/pHGH 107 vzhledem k indukci silnějšího tryptofanového-promotorového-operátorového systému vůči lac-promotorového-operátorového· systému v pHGH 107.

Příklad 3

Sestavení plasmidu s obecnou expresí pro přímé vylučování heterologických genů pod kontrolou tryptofanového promotoru-operátoru

Plasmid pHGH 207 sestrojený v předcházejícím příkladu 2 se v dalším použije k získání fragmentu DNA obsahujícího kontrolní prvky tryptofanového operónu (s vynechanou útlumovou oblastí] a k sestrojení plasmidického „vylučovacího· vektoru“ vhodného pro přímou expresi genových vložek o různé struktuře. Strategie pro sestavení plasmidu s obecnou expresí zahrnuje odstranění tryptofanové kontrolní oblasti z plasmidu pHGH 207 digescí restrikčním enzymem EcoRI a vsunutí získaného fragmentu do enzymem EcoRI dlgerovaného plasmidu pBRHl, používaného výše v příkladu 1. Plasmid pBRHl je, jak již bylo uvedeno, plasmidem rezistentním vůči ampicilinu a obsahujícím gen pro tetracyklinovou rezistenci, ale je vůči tetracyklinu citlivý, neboť není přítomen vhodný promotorový-operátorový systém. Výsledný plasmid pHKY 1, jehož zkonstruování je podrobněji popsáno níže a znázorněno na obr. 8, je rezistentní jak vůči ampicilinu, tak vůči tetracyklinu, obsahuje tryptofanový promotorový-operátorový systém, chybí mu tryptofanový útlumový článek a obsahuje jediné Xbal restrikční místo vzdálené od tryptofanového promotoru-operátoru. Tryptofanový promotor-operátor a jediné Xbal místo jsou vázány mezi dvěma EcoRI štěpícími místy, takže uvedený fragment obsahující trp-promotor-operátor-Xbal místo lze odstranit a vsunout do plasmidů obsahujících jiné strukturální geny.

Alternativně lze do tohoto plasmidu vsunout další heterologické strukturální geny, buď do Xbal štěpícího místa, nebo (pa parciální digesci enzymem EcoRI) do EcoRI restrikčního· místa vzdálenějšího od tryptofanové kontrolní oblasti, v každém případě tak, aby přišel pod kontrolu tryptofanového promotorového-operátorového systému.

Plasmid pHGH 207 se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a získaný trp promotorový fragment 23 obsahující EcoRI štěpící místo, se izoluje za použití PAGE-elektroforézy a následující elektroelucí.

Plasmid pBRHl se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a z konců rozštěpené molekuly se působením bakteriální alkalické fosfatázy („BAP“) (1 μ%, v prostředí 50 mmol tris-pufru o· pH 8 a 10 mmol bezvodého chloridu hořečnatého, po dobu 30 minut při 65 stupních Celsia] odstraní fosfátové skupiny na vyčnívající EcoRI koncích. Přebytek bakteriální alkalické fosfatázy se odstraní extrakcí fenolem a extrakcí chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Získá se lineární DNA 7, které chybí fosfátové skupiny na vyčnívajících koncích i a která přijímá a váže pouze vložky, jejichž komplementární „lepivé“ konce jsou fosforylovány, ale sama se neuzavírá do kruhového tvaru a dovoluje proto snadnější zkoušení plasmidů obsahujících různé vložené části. Fragment 23, získaný z plasmidu pHGH 207 a obsahující EcoRI, a lineární DNA získaná z plasmidu pBRHl 7a, se zkombinují a vzájemně naváží v přítomnosti T4 ligázy, způsobem popsaným vý

238812 še. Částí získané směsi se transformují bakterie E. coli kmene 294, analog^;cky jak je popsáno výše, a mikroorganismy se kultivují na agávových deskách s LB půdou obsahující 5 ^g/ml tetracyklinu a touto selekcí se získá 12 kolonií rezistentních na tetracyklin. Z každé kolonie se izoluje plasmid a hodnotí se na přítomnost vsunutého fragmentu DNA restrkcní endonukleázovou analýzou za použití štěp'cích enzymů EcoRI a Xbal. Jeden z takto z skaných plasmidů obsahujících žádanou vložku byl označen jako plasmid pHKYl.

P ř í к 1 a cl 4

Sestrojení plasmidu obsahujícího tryptofanový cpcrón, schopného exprese specificky štěpiteln.3 fúzované bílkoviny obsahující 6 aminokyselin hlavního trp-peptidu, poslední třetinu trp E polypeptidu (označenou LE‘) a heterologický strukturální gen

Strategie pro sestrojení plasmidu vylučujícího fúzovanou bílkovinu s LE‘ polypeptidem zahrnuje následující stupně:

a) Zajištění genového fragmentu obsahujícího koclóny pro vzdálenou oblast LE‘ polypeptidu a majícího Bgl II, popřípadě EcoRI záchytné konce na 5‘ a 3‘ koncích kódujícího vlákna;

e) Eliminace kodónů ze vzdálené oblasti LE‘ genového fragmentu a kodónů pro trp D gen z plasmidu SUM 7 Δ2, vsunutí fragmentu získaného ve stupni a) o obnovení LE‘ kodóuové sekvence bezprostředně za sekvencí heterologického genu pro somatostatin.

Jak je znázorněno na obr. 9a, plasmid pSom 7 Л2 se digeruje enzymem Hind Ш a pak se digeru je lambda -exonukleázou (5‘-3‘ exonukleáza) za podmínek zvolených tak, aby štěpení probíhalo za -Bgl II restrikčním místem s LE‘ kódující-oblastí; 20 plasmidu pSom 7 Δ2 digerovaného enzymem Hind III se rozpustí v pufru (20 mmol glycinového pufru o pH 9,6, 1 mmol bezvodého chloridu horečnatého a 1 mmol /j-merkaptoethanolu) a na směs se působí 60 minut při teplotě místnosti 5 jednotkami lambda-exonukleázy. Získaná reakční směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem.

Aby se posléze vytvořil EcoRI zbytek na vzdálenějším konci LE‘ genového fragmentu, syntetizuje se zlepšenou fósfortriesterovou metodou [viz R. Crea se spolupracovníky, časopis Proč. Naťl. Acad. Sci USA 75, 5 765 (1979)] primér o složení ³²pCCTGTGCATGAT a hybridizuje se s jednovláknovým koncem LE‘ genového fragmentu, získaným digescí lambda-exonukleázou. Hybridizace se provádí níže popsaným způsobům.

fragmentu, získaného působením lambda-exonukleázy na produkt digesce plasmidu pSom ?/ Δ2 enzymem Hind III, se rozpustí ve 20 vody а к roztoku se přidá 6 μΐ roztoku obsahujícího asi 80 pmol shora popsaného 5‘-fosforylovaného oligonukleotidu. Syntetický fragment se hybridizuje na 3* konec LE‘ kódující sekvence a zbývající jednovláknová část LE‘ fragmentu se doplní výše popsaným postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití trifosfátů dATp, dTTP, dGTP a dCTP.

Reakční směs se zahřeje na 50 ^CC a pak se nechá zvolna vychladnout na 10 °C; poté se přidá Klenowova polymeráza. Po 15 minutách inkubace při teplotě místnosti a následujících 30 minutách inkubace při 37 °C se reakce zastaví přidáním 5 μΐ 0,25 M EDTA. Reakční směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží se ethanolem. Získaná DNA 28 se poté štěpí restrikčním enzymem Bgl II a fragmenty se rozdělí PAGE-elektroforézou. Pomocí autoracPa gramu gelové vrstvy se zjistí poloha W-značeného' fragmentu o očekávané délce řetězce přibližně 470 bp, a tento fragment se izoluje elektroelucí. Jak již bylo nastíněno výše, tento fragment LE* (d) má Bgl II konec a druhý konec „tupý“, koincidující se začátkem priméru.

Plasmid pThal popsaný výše v přikladu 1, části C, nese strukturální gen pro thymosm alfa jedna, zakódovaný svým 5* koncem kódujícího vlákna do EcoRI místa a svým 3‘ koncem do BAMHI místa. Jak je znázorněno na obr. 9b, obsahuje thymosinový gen rovněž Bgl II štěpící místo. Plasmid pThal obsahuje též gen specifikující rezistenci vůči ampicilinu. Za účelem sestrojení plasmidu schopného přijmout shora uvedeným způsobem připravený fragment LE‘ (d) 29, se pThal digeruje restrikčním enzymem EcoRI a pak se provede reakce s trifosfáty dTTP a dATP v přítomnosti Klenowovy polymerázy, aby se „otupily“ EcoRI zbytky. Digescí získaného produktu enzymem Bgl II se získá lineární DNA fragment 33 obsahující gen pro ampicilinovou rezistenci a na opačném konci „lepivý“ Bgl II zbytek a na bližším konci „tupé“ zakončení. Vzniklý produkt se dá znovu uzavřít do kruhu reakcí s LE‘ (d) fragmentem 29 obsahujícím Bgl II záchytný konec a „tupý“ konec, v přítomnosti T4 DNA-ligázy, a získá se plasmid pTrp 24 (34 viz obr. 9b). Při tom se znovu vytvoří EcoRI štěpné místo v té poloze, kde dojde к vazbě s „tupým“ koncem.

Jak je znázorněno na obr. 10, postupná digesce plasmidu pTrp.24 restrikčními enzymy Bgl II a EcoRI a následující izolace produktu, za použití PAGE-elektroforézy a elektroeluce, poskytne fragment mající kodóny pro LE‘ (d) polypeppd s Bgl II .,lepivým koncem a EcoRI „lepivým“ koncem sousedícím s jeho 3‘ kódujícím zakončením. Získaný LE‘ (d) fragment 38 se dá začlenit do Bgl II místa plasmidu pSom 7 Δ2 za vytvoření fúzované bílkoviny složené z LE‘ polypeptidu a somatostatinu, která je vylučována za kontroly tryptofanového promotoru-operátoru, jak je znázorněno na obr. 10.

Aby se shora popsané začlenění fragmentu 38 dalo provést, je třeba 1) částečně, digerovat enzymem EcoRI plasmid pSom 7 Δ2 za účelem jeho rozštěpení v EcoRI místě vzdálenějším od tryptofanového promotoru-operátoru, jak je znázorněno na obr. 10, a 2) vhodně zvolit sekvenci priméru (viz obr. 9 a), za účelem udržení správné translační stavby kodónu, a znovu sestavit plasmid v EcoRI štěpném místě.

Tak například se 16 ^g plasmidů pSom 7 Δ2 zředí do 200 μΐ pufru obsahujícího 20 mmol tris o pH 7,5, 5 mmol bezvodého chloridu horečnatého, 0,02 mmol detergentu NP 40 a 100 mmol chloridu sodného, a působí se na něj 0,5 jednotkami restrikčního enzymu EcoRI. Po 15 minutách působení při 37 °C se reakční směs vyextrahuje fenolem, extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem a produkt se poté digeruje enzymem Bgl II.

Vzniklý větší fragment 36 se izoluje za použití PAGE-elektroforézy a elektroeluce. Tento* fragment obsahuje kodóny LE‘ {p) pro bližší konec LE‘ polypeptidu. tj. kodóny, které leží za Bgl II štěpícím místem. Fragment 36 se pak naváže na fragment 38 v přítomnosti Ti DNA ligázy za vzniku plasmidů pSom 7 Δ2Δ4, kterým se pak transformují bakterie

E. coli kmene 294 způsobem popsaným výše, a účinně se tak produkuje, pod kontrolou tryptofanového promotoru-operátoru, fúzovaná bílkovina skládající se z plně rekonstituovaného LE‘ polypeptidu a ze somatostatinu. Fúzovaná bílkovina, ze které může být somatostatin specificky odštěpen vzhledem к přítomnosti methioninu na 5‘ konci somatostatinové sekvence, se oddělí shora popsaným způsobem, za použití elektroforézy na sodiumdodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu. Na obr. 11 je fúzovaný protein patrný jako nejzřetelnější pás v dráze 6 (bližší podrobnosti к obr. 11 jsou uvedeny v níže uvedeném příkladu 5).

Příklad 5

Sestrojení systému pro vylučování trp LE‘ polypeptidických fúzí, ve kterých je umístěna rezistence vůči tetracyklinu, za kontroly tryptofanového promotoru-operátoru

Strategie pro sestrojení vylučovacího prostředku schopného přijímat rozličné heterologické polypeptidické geny pro expresi odpovídajících bílkovin ve formě fúzí s trp-LE‘ polypeptidem pod kontrolou tryptofanového operónu, zahrnuje zkonstruování plasmidů majícího následující charakteristiky:

1) Rezistenci vůči tetracyklinu, která se však může ztratit v případě, že se odstraní promotorový-operátorový systém kon trolující geny specifikující takovou rezistenci;

2) Odstranění promotorového-operátorového systému, který kontroluje rezistenci vůči tetracyklinu, a opětovné uzavření získaného lineárního fragmentu do kruhového tvaru navázáním zvoleného heterologického genu a tryptofanového promotorového-operátorového systému ve vhodné translačuí fázi vzhledem к němu, čímž se obnoví rezistence vůči tetracyklinu a v důsledku toho se umožní identifikace plasmidů obsahující vložený heterologický gen.

Ve stručnosti, lze shrnout, že v souhlase s povahou uvažovaných vložených sekvencí je účelem sestrojit lineární část DNA mající Pst zbytek na svém 3' konci a Bgl II zbytek na svém 5‘ konci a vázající gen specificky schopný vytvářet rezistenci vůči tetracyklinu, když se uvede pod kontrolu promotorového-operátorového systému.

Tak například, jak je znázorněno na obr. 12, se plasmid pBR322 digeruje enzmem Hind III a vyčnívající Hind III konce se poté digerují Sl nukleázou. Posléze uvedená digesce spočívá v tom, že se na 10 μ% plasmidů pBR 322 rozštěpeného enzymem Hind III působí v prostředí 30 μΐ pufru S1 (0,3 mol chloridu sodného, 1 mmol bezvodého chloridu zinečnatého, 25 mmol octanu sodného, pH 4,5) 300 jednotkami nuklcázy Sl po dobu 30 muiut při 15 °C. Reakce se zastaví přidáním 1 ₍ul 30 X Sl přerušovacího roztoku pro Sl nukleázu (0,8 mol tris-báze a 50 mmol EDTA), směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem. Získaný produkt 45 se digeruje výše popsaným způsobem štěpícím enzymem EcoRI a ze vzniklé směsi štěpů se velký fragment 46 izoluje PAGE-elektroforézou a elektroelucí.

Takto získaný fragment má jeden EcoRI „lepivý“ konec a druhý „tupý“ konec, jehož kódovací vlákno začíná nukleotidem thymidinem. Jak bude ukázáno v dalším popisu, může se Sl digerovaný Hind III zbytek začínající thymidinem připojit na Bgl II zbytek vzniklý působením Klenowovy polymerázy I a po navázání rekonstituovat Bgl II restrikční místo.

Plasmid pSom 7 Δ2, připravený způsobem popsaným výše v příkladu 1, se digeruje enzymem Bgl II a získaný fragment s Bgl II záchytnými konci se převede postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití všech čtyř desoxynukleotidtrifosfátů, na dvouvláknový. Vzniklý produkt se rozštěpí enzymem EcoRI a následující izolací menšího fragmentu 42 pomocí PAGE-elektroforézy a elektroeluce se získá lineární část DNA obsahující tryptofanový promotor-operátor a kodóny nejblíže LE‘ sekvence za Bgl II štěpícím místem [,,LE‘ (p)“J. Tento lineární fragment má jednak EcoRI konec a jednak „tupý“ konec vzniklý doplněním v Bgl II místě. Bgl II místo se však rekonstituuje navázáním „tupého“ konce fragmentu 42 na „tupý“ konec fragmentu 46. Oba posléze zmíněné fragmety se uvedeným způsobem naváží v přítomnosti T4 DNA ligázy za vzniku znovu do kruhu uzavřeného plasmidu pHKY 10 (viz obr. 12), kterým se transformují buňky bakterií E. coli kmene 294. Vypěstované, vůči tetracyklinu rezistentní buňky nesoucí rekombinovaný plasmid pHKY 10 se vyizolují, plasmidická DNA se vyextrahuje a poté se postupně digeruje restrikčními enzymy Bgl II a Pst, velký fragment získaný štěpením se izoluje PAGE-elektrcforézou a elektroelucí. Získá se lineární část DNA mající Pst a Bgl II záchytné konce. Tento DNA fragment 49 obsahuje počáteční replikaci a je proto vhodný jako první komponenta pro konstrukci plasmidu, ve kterých oba geny, gen kódující bílkoviny fúzované s trp LE‘ polypeptidem a gen kódující rezistenci vůči tetracyklinu, jsou kontrolovány trp-promotorem-operátorem.

Plasmid pSom 7 Δ2Δ4, připravený způsobem popsaným v příkladu 4, lze zpracovat tak, aby poskytl druhou komponentu potřebnou pro sestrojení systému schopného přijímat rozličné heterologické strukturální geny. Jak je uvedeno na obr. 13, podrobí se zmíněný plasmid částečné digesci restrikčním enzymem EcoRI (viz příklad 4) a pak digesci enzymem Pst, a fragment 51 obsahující trp-promotor-operátor se izoluje PAGE-elektroforézou a následující elektroelucí. Parciální digesce enzymem EcoRI se musí provádět proto, aby se získal fragment rozštěpený v sousedství 5‘ konce somatostatinového genu, ale nerozštěpený v EcoRI místě přítomnému mezi genem pro ampicilinovou rezistencí a trp promotorem-operátorem. Ampicilinová rezistence ztracená štěpením enzymem Pst I v ap^l* genu se dá znovu obnovit po vazbě s fragmentem 51.

Jako první ukázka třetí komponenty potřebné pro konstrukci nového plasmidu je uveden strukturální gen pro thymosin alfa jedna. Připraví se tak, že se plasmid pTh«l podrobí digesci enzymem EcoRI a BamHI a získaný fragment 52 se čistí PAGE-elektroforézou a elektroelucí.

Uvedené tři genové fragmenty 49, 51 a 52 se navzájem naváží ve správné orientaci, jak je znázorněno na obr. 13, za vzniku plasmidu pTha 7 Δ1Δ4, který lze při kultivaci vybrat na základě jeho obnovené ampicilinové a tetracyklinové rezistence. Po transformaci bakterií E. coli kmene 294 a po kultivaci buněk za podmínek analogických těm, které byly popsány v příkladu 1, se získá plasmid vylučující fúzovanou bílkovinu s trp-polypeptidem LE^S, ze kterého lze specificky odštěpit thymosin alfa jedna působením bromkyanu.

Když se podobným způsobem naváží jiné strukturální heterologické geny mající EcoRI a BamHI zakončení s komponentami odvozenými z plasmidu pI-IKV 10 a pSom 7 Δ2-Δ4, získají se analogicky účinně fúzované bílkoviny s trp-LE‘ polypeptidem, obsahující polypeptidy, pro které jsou příslušné heterolo^ické geny kódovány.

Na obr. 11 jsou znázorněny výsledky dělení celkové buněčné bílkoviny získané z transformantů E. coli kmene 294, elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, přičemž nejintenzívnější pásy v každém z uvedených případů představují produkty fúzovaných bílkovin vzniklé pod kontrolou tryptoíanového promotorového-operátorového systému. Na dráze 1 obr. 11 je pro kontrolu znázorněno rozdělení celkové buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/ pBR 322. Dráha 2 znázorňuje rozdělení fúzovaného produktu obsahujícího somatostatin, získaného z plasmidu pSom 7 Δ2Δ4 připravenéhof způsobem popsaným v příkladu 4. Dráha 3 znázorňuje rozdělení produktu vylučování z plasmidu pSom 7 Δ1Δ4, obsahujícího somatostatin. Dráha 4 znázorňuje rozdělení produktu exprese z plasmidu pTha 7 Δ1Δ4, a dráha 5 znázorňuje rozdělení produktu vylučovaného z plasmidu získaného spojením shora popsaných fragmentů odvozených z plasmidů pHKY 10 a pSom 7 Δ2Δ4 se strukturálním genem kódujícím lidský proinsulin, zakončeným EcoRI a BamHI konci a připraveným částečně jedním z autorů tohoto vynálezu. Dráhy 6 a 7 znázorňují, jako nejintenzívnější pás, bílkovinu fúzovanou s trp-LE‘ polypeptidem, ze které lze specificky odštěpit В a A řetězce lidského insulinu. Strukturální geny pro insulin В a A se získají digesci plasmidů pIBl, popřípadě pIAll, restrikčními enzymy EcoRI a BamH I; konstrukci uvedených plasmidů popsali D. V. Goeddel se spolupracovníky v časopisu Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979). V dráze 8 je znázorněna poloha standardů.

Ačkoliv je způsob podle vynálezu popsán v jeho nejvýhodnějším provedení za použití bakterií E. coli, lze jako hostitelských buněk pro vylučování a jako zdrojů pro trp-operóny použít i jiných enterobakterií, ze kterých lze uvést například Salmonella typhimurium a Serratia marcesans. Způsob podle vynálezu není proto omezen na popsané výhodné provedení, ale jen na právní rozsah vyplývající z následujících bodů předmětu vynálezu.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob výroby polypeptidického produktu, zcela heterologického nebo fúzované bílkoviny obsahující heterologický polypeptid, bakteriální expresí strukturálního genu kódujícího zmíněný polypeptid, přičemž se připraví bakteriální inokulant transformovaný replikace schopným plasmidickým vylučovacím prostředkem a transformovaný inokulant se přenese do fermentační nádoby a kultivuje se do dosažení předem určené hladiny, vyznačující se tím, že se k transformaci bakteriálního inokulantu použije plasmidického vylučovacího prostředku se sekvencí dvojvláknové DNA a obsahujícího ve fázi od prvního 5‘ konce ke druhému 3‘ konci kódujícího vlákna bakteriální tryptofanový promotorový-operátorový systém, nukleotidy kódující na ribozómové vazebné místo pro translaci strukturálního genu kódujícího aminokyselinovou sekvenci heteroVYNÁLEZU logického polypeptidu a nukleotidy kódující startovací translační signál pro zahájení translace strukturálního genu kódujícího aminokyselinovou sekvenci heterologického polypeptidu, přičemž uvedená sekvence neobsahuje ani oblast pro trp útlumovou schopnost ani nukleotidy kódující na trp E ribozómové vazebné místo, a po kultivaci inokulantu v živném prostředí obsahujícím přídatný tryptofan v množství dostatečném k potlačení shora uvedeného promotorového-operátorového systému se získaná kultura bakterií zbaví přídatného· tryptofanu a vyloučí se polypeptidický produkt.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se živné prostředí zbaví tryptofanu přerušením jeho přidávání, přičemž se fermentační prostředí, ve kterém se inokulant poprvé kultivuje, zředí.