JP2022527117A - 免疫細胞の凍結保存のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

凍結する前に細胞をPTD-MYC融合タンパク質（例えば、HIV-TAT-MYC融合タンパク質）で前処理することによる、末梢血単核細胞 (PBMC) などの免疫細胞の凍結保存のための組成物および方法が、本明細書において提供される。本方法を実施するためのキットもまた、本明細書において提供される。TIFF2022527117000011.tif135140

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年4月8日に出願された米国仮特許出願第62/830,950号に対する優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。

技術分野
本技術は、凍結前にPTD-MYC融合タンパク質（例えば、HIV TAT-MYC融合ポリペプチド）で細胞を前処理することによる、末梢血単核細胞 (PBMC) などの免疫細胞の凍結保存のための組成物および方法に関する。本方法を実施する際に使用するためのキットもまた、本明細書において提供される。

背景
凍結保存は、細胞を低温まで冷却することによって保存する過程である。このような低温では、通常の条件下では細胞死を引き起こす生化学的反応を含む生物学的活性が、効果的に停止する。しかしながら、適切に制御されなければ、凍結保存によって細胞が損傷を受け、細胞生存率が低下し得る。さらに、凍結融解過程後、適切な回復を確実にするためには、通常、細胞を培養する必要がある。現在、凍結保存された細胞を融解した後の細胞の生存率および回収率を高める凍結保存方法のまだ満たされていない必要性が存在する。

概要
1つの局面において、本開示は、
(a) (i) タンパク質導入ドメイン、(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと；
(b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む凍結組成物であって、対象から単離された対照PBMC細胞と比較して、細胞生存率の上昇を示す凍結組成物を提供する。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質導入ドメイン配列である。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[48-57]である。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[57-48]である。いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1を含む。いくつかの態様において、1個または複数個の末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、組成物は細胞懸濁培地をさらに含む。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む。いくつかの態様において、組成物は、凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、融解した際に細胞回収率の増加を示す。いくつかの態様において、組成物は、凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、細胞活性化後のCD25の発現の増加を示す。いくつかの態様において、本開示は、凍結組成物を含む免疫細胞バンクを提供する。

1つの局面において、本開示は、末梢血単核細胞 (PBMC) を凍結保存する方法であって、
(a) ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階；および
(b) 組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
を含む方法を提供する。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質導入ドメイン配列である。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[48-57]である。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[57-48]である。いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1を含む。いくつかの態様において、1個または複数個の末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、本方法は、PBMCを細胞懸濁培地に懸濁する段階をさらに含む。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む。

いくつかの態様では、1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約500μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる。いくつかの態様では、1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約10μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる。いくつかの態様では、1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に24時間未満、MYC融合ポリペプチドと接触させる。いくつかの態様では、1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に約1時間、MYC融合ポリペプチドと接触させる。いくつかの態様では、PBMCを、段階 (a) の後かつ段階 (b) の前に洗浄する。

いくつかの態様では、速度制御された低温フリーザーを使用して、PBMCを冷却する。いくつかの態様では、1分当たり約-1℃の速度で、PBMCを冷却する。いくつかの態様において、組成物を凍結させるのに十分な温度は、約-80℃～約-190℃である。

いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、細胞活性化、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階を、本方法はさらに含む。

MYC融合ポリペプチドを用いて凍結保存された細胞を使用する方法もまた、本明細書において提供される。

本明細書に記載されるいずれかの態様の本技術のMYC融合ポリペプチド、MYC融合ポリペプチドで修飾された免疫細胞、および／または凍結組成物、ならびに使用説明書を含むキットもまた、本明細書において提供される。

1つの局面において、本開示は、
(a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと；
(b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む免疫細胞バンクを提供する。

PTD-MYC融合ポリペプチド (TBX-3400) または媒体対照 (PBMC) で前処理し、様々な条件下で凍結保存し、かつ融解した後の、免疫細胞（例えば、末梢血単核細胞 (PBMC)）の細胞生存率を示す。細胞を7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD) またはトリパンブルーで染色し、フローサイトメトリーまたは血球計数器により解析して、融解後の生細胞の程度を決定した。細胞は、表示の通りにCHB培地、CS5培地、またはCS10培地中で凍結し、VIA Freeze（商標）速度制御フリーザーのCoolCell（登録商標）容器中で凍結した。 PTD-MYC融合ポリペプチドで前処理し、様々な条件下で凍結保存し、かつ融解した後の、免疫細胞 (PBMC) の細胞回収率 (%) を示す。細胞は、表示の通りにCHB培地、CS5培地、またはCS10培地中で凍結し、CoolCell（登録商標）容器中で凍結した。 PTD-MYC融合ポリペプチドまたは媒体対照で前処理し、様々な条件下で凍結保存し、かつ融解した後に回収された、ドナー対象から単離された免疫細胞の細胞集団（T細胞、B細胞、単球、顆粒球、およびNK細胞）の相対量を示す。細胞は、表示の通りにCHB培地、CS5培地、またはCS10培地中で凍結し、VIA Freeze（商標）速度制御フリーザーのCoolCell（登録商標）容器中で凍結した。細胞集団は、フローサイトメトリーおよび様々な細胞集団の免疫表現型検査によって決定した。 PTD-MYC融合ポリペプチドまたは媒体対照で前処理し、様々な条件下で凍結保存し、かつ融解した後の、CD25発現の蛍光強度中央値（FI中央値）によって表された、対照細胞および免疫細胞の細胞活性化を示す。細胞は、表示の通りにCHB培地、CS5培地、またはCS10培地中で凍結し、VIA Freeze（商標）速度制御フリーザーのCoolCell（登録商標）容器中で凍結した。細胞は、単一刺激分子 (CD3) 単独、または単一刺激分子 (CD3) と共刺激分子 (CD28) との組み合わせのいずれかにより活性化した。 PTD-MYC融合ポリペプチドまたは媒体対照で前処理し、様々な条件下で凍結保存し、かつ融解した後の、CD25陽性細胞%として表された、対照細胞および免疫細胞の細胞活性化を示す。細胞は、表示の通りにCHB培地、CS5培地、またはCS10培地中で凍結し、VIA Freeze（商標）速度制御フリーザーのCoolCell（登録商標）容器中で凍結した。細胞は、単一刺激分子 (CD3) 単独、または単一刺激分子 (CD3) と共刺激分子 (CD28) との組み合わせのいずれかにより活性化した。

詳細な説明
本開示は、本出願において記載される特定の態様の点で限定されるべきではなく、それらは本開示の個々の局面の単なる例示として意図される。本開示の様々な態様がすべて、本明細書において記載されるわけではない。当業者に明白であるように、本開示の多くの改変物および変形物が、その精神および範囲から逸脱することなく作製され得る。本明細書において列挙されたものに加えて、本開示の範囲内にある機能的に等価な方法および装置が、前述の説明から当業者に明白になるであろう。そのような改変物および変形物は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。本開示は、そのような特許請求の範囲の権利が与えられる等価物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の条件によってのみ限定されるべきである。

本開示は、特定の使用、方法、試薬、化合物、組成物、または生物システムに限定されず、それらは当然、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様を説明する目的のために過ぎず、限定を意図していないこともまた理解されるべきである。

加えて、本開示の特徴または局面がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本開示がまたそれにより、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するであろう。

当業者によって理解されるように、ありとあらゆる目的のために、特に書面の説明を提供する観点から、本明細書において開示される範囲はすべて、それらのありとあらゆる可能な部分範囲および部分範囲の組み合わせもまた包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも半分、3分の1、4分の1、5分の1、10分の1、等に等分されることを十分に説明し、可能にすることが、容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書において論じられる各範囲は、下方の3分の1、中央の3分の1、および上方の3分の1、等に容易に分割され得る。同様に当業者によって理解されるように、「最大で～まで」、「少なくとも」、「～を超える」、「～未満」、および同様のものなどの言語はすべて、列挙される数字を含み、後に上記のような部分範囲に分割され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲には、個々の各メンバーが含まれる。従って、例えば、1～3個の細胞を有する群は、1個、2個、または3個の細胞を有する群を指す。同様に、1～5個の細胞を有する群は、1個、2個、3個、4個、または5個の細胞を有する群を指し、他も同様である。

特に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する

I. 定義
本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様を説明する目的のために過ぎず、本開示を限定することは意図されない。本明細書で用いられる場合、「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」という単数形は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数形も同様に含むことが意図される。

本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、値が、+/- 20%、+/- 15%、+/- 10%、または+/- 5%変動しても、本開示の範囲内にとどまり得ることを意味する。例えば、「約200 IU/mLの濃度」は、160 IU/mL～240 IU/mLの濃度を包含する。

本明細書で用いられる場合、作用物質の対象への「投与」という用語は、その意図された機能を果たすように、作用物質を対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下を含む任意の適切な経路によって実施され得る。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然にコードされるアミノ酸は、20種類の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ならびにピロリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合しているα炭素を有する作用物質、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。そのような類似体は、（ノルロイシンのように）修飾されたR基または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。いくつかの態様において、ポリペプチドを形成するアミノ酸はD型である。いくつかの態様において、ポリペプチドを形成するアミノ酸はL型である。いくつかの態様において、ポリペプチドを形成する第1の複数のアミノ酸はD型であり、第2の複数のアミノ酸はL型である。

アミノ酸は、本明細書において、一般に公知のその3文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会 (Biochemical Nomenclature Commission) により推奨される1文字記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられているその1文字コードによって言及される。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーにも、1個または複数個のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えばアミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

本明細書で用いられる場合、「対照」は、比較目的のために実験において用いられる代替試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であってよい。例えば、実験の目的が、特定の型の疾患のための処置について治療剤の有効性の相関を判定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を示すことが公知である組成物）および陰性対照（治療を受容しないかまたはプラセボを受容する対象または試料）が、典型的には用いられる。

本明細書で用いられる場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の治療効果を達成するために十分な作用物質の量を指す。治療的適用に関して、対象に投与される治療用ペプチドの量は、感染の型および重症度、ならびに全身健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐容能などの個体の特徴に依存し得る。それは、疾患の程度、重症度、および型にもまた依存し得る。当業者は、これらおよびその他の要因に応じて、適切な投薬量を決定することができるであろう。

本明細書で用いられる場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写される過程、および／または転写されたmRNAがその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞試料または組織試料中のmRNAまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。1つの局面においては、ある試料からの遺伝子の発現レベルを、対照試料または参照試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。別の局面においては、ある試料からの遺伝子の発現レベルを、本明細書において開示される組成物の投与後の同じ試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。「発現」という用語はまた、以下の事象のうちの1つまたは複数を指す：(1) 細胞内での（例えば、転写による）DNA配列からのRNA鋳型の生成；(2) 細胞内での（例えば、スプライシング、編集、5'キャップ形成、および／または3'末端形成による）RNA転写物のプロセシング；(3) 細胞内でのRNA配列のポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；(4) 細胞内でのポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾；(5) 細胞表面上でのポリペプチドまたはタンパク質の提示；ならびに (6) 細胞からのポリペプチドまたはタンパク質の分泌または提示または放出。

「リンカー」という用語は、2つの配列を接続または連結する、例えば2つのポリペプチドドメインを連結する合成配列（例えば、アミノ酸配列）を指す。いくつかの態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸配列を含む。

本明細書で用いられる場合、免疫細胞という用語は、免疫応答において役割を果たす任意の細胞を指す。免疫細胞は造血系起源のものであり、これには、B細胞およびT細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好中球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄系細胞が含まれる。

「リンパ球」という用語は、組織特異的な種類および特殊な種類を含む、すべての未熟型、成熟型、未分化型、および分化型の白色リンパ球集団を指す。それは、非限定的な例として、B細胞、T細胞、NKT細胞、およびNK細胞を包含する。いくつかの態様において、リンパ球には、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、形質B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、およびアネルギー性AN1/T3細胞集団を含むすべてのB細胞系列が含まれる。

本明細書で用いられる場合、T細胞という用語は、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギー性T細胞、寛容T細胞、キメラT細胞、抗原特異的T細胞、および制御性T細胞を含む。

「1個のB細胞」または「複数個のB細胞」という用語は、非限定的な例として、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、抗原特異的B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、およびアネルギー性AN1/T3細胞集団を指す。いくつかの態様において、B細胞という用語は、その細胞表面上に免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖を発現するB細胞を含む。いくつかの態様において、B細胞という用語は、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖を発現し分泌するB細胞を含む。いくつかの態様において、B細胞という用語は、その細胞表面上で抗原と結合する細胞を含む。本明細書において開示されるいくつかの態様では、B細胞またはAN1/T3細胞が、記載される過程において用いられる。ある特定の態様において、そのような細胞は、例えば、造血幹細胞、ナイーブB細胞、B細胞、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、形質B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、アネルギー性B細胞、またはアネルギー性AN1/T3細胞を含む、抗体を発現するのに適している、抗体を発現することができる（例えば、誘導性発現）、または抗体を発現するのに適した細胞に分化することができる任意の動物細胞と任意で置き換えられる。

本明細書で用いられる場合、「末梢血単核細胞」は、T細胞、B細胞、NK細胞などのリンパ球、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含む、円形の核を有する任意の末梢血細胞を指す。

本明細書で用いられる場合、「養子細胞治療用組成物」は、養子細胞移入に適した細胞を含む任意の組成物を指す。例示的な態様において、養子細胞治療用組成物は、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL)、TCR（すなわち、異種T細胞受容体）改変リンパ球、およびCAR（すなわち、キメラ抗原受容体）改変リンパ球からなる群より選択される細胞型を含む。別の態様において、養子細胞治療用組成物は、T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞、NK細胞、δγT細胞、制御性T細胞、および末梢血単核細胞(PBMC)からなる群より選択される細胞型を含む。別の態様においては、TIL、T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞、NK細胞、δγT細胞、制御性T細胞、または末梢血単核細胞が、養子細胞治療用組成物を形成する。1つの態様において、養子細胞治療用組成物はT細胞を含む。1つの態様において、養子細胞治療用組成物は、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチド
と接触した、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞および／またはPBMCを含む凍結組成物であってよい。

「MYC」および「MYC遺伝子」という用語は、同義語である。それらは、MYCポリペプチドをコードする核酸配列を指す。MYC遺伝子は、NCBIアクセッション番号NM-002467の配列と少なくとも60%～100%同一または相同、例えば、少なくとも60、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、または約70%～約100%からの任意の他のパーセントで同一である、少なくとも120ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、MYC遺伝子はがん原遺伝子である。ある特定場合において、MYC遺伝子は、8番染色体上の8q24.21に見出される。場合によっては、MYC遺伝子は、pterから128,816,862 bpで始まり、pterから128,822,856 bpで終わる。場合によっては、MYC遺伝子は約6 kbである。場合によっては、MYC遺伝子は、少なくとも8種類の別々のmRNA配列‐選択的スプライシングを受けた5種類の変種およびスプライシングを受けていない3種類の変種をコードする。

「MYCタンパク質」、「MYCポリペプチド」、および「MYC配列」という用語は、同義語であり、NCBIアクセッション番号UniProtKB/Swiss-Prot：P01106.1（MYCアイソフォーム1）またはNP_002458.2（UniProtKB/Swiss-Prot：P01106.2；MYCアイソフォーム2）に開示されたアミノ酸残基のポリマー、およびそれらの機能的相同体、類似体、または断片を指す。UniProtKB/Swiss-Prot：P01106.1の配列は、

である。
NP_002458.2 (UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2) の配列は、

である。

いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、完全なMYCポリペプチド配列である。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、部分的なMYCポリペプチド配列である。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、SEQ ID NO:2または11の少なくとも400個の連続アミノ酸を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、SEQ ID NO:2または11の少なくとも400個の連続アミノ酸を含み、かつ少なくとも1種類のMYC活性を保持する。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、SEQ ID NO:2または11の少なくとも400個、少なくとも410個、少なくとも420個、少なくとも430個、または少なくとも450個の連続アミノ酸を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、SEQ ID NO:2または11の少なくとも400個、少なくとも410個、少なくとも420個、少なくとも430個、または少なくとも450個の連続アミノ酸を含み、かつ少なくとも1種類のMYC活性を保持する。いくつかの態様において、MYCポリペプチドはc-MYCである。いくつかの態様において、MYCポリペプチド配列は、以下に示される配列：

を含む。

いくつかの態様において、MYCポリペプチド配列は、以下に示される配列：

を含む。

いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP002458.2またはUniProtKB/Swiss-Protアクセッション番号P01106.1の配列と少なくとも40%～100%同一、例えば、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または約40%～約100%からの任意の他のパーセントで同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、439アミノ酸のポリマー、いかなる翻訳後修飾も受けていないMYCポリペプチドを指す。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、翻訳後修飾を受けた439アミノ酸のポリマーを指す。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは48,804 kDaである。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスロイシンジッパー (bHLH/LZ) ドメインを含む。いくつかの態様において、bHLH/LZドメインは、

の配列を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは転写因子（例えば、転写因子64）である。いくつかの態様において、MYCポリペプチドはEボックスDNA結合ドメインを含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、CACGTGを含む配列に結合する。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、細胞の生存および／または増殖のうちの1つまたは複数を促進する。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、上記のもののうちの1つまたは複数を含み、かつ1つまたは複数の翻訳後修飾（例えば、アセチル化を含む）。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、ポリペプチドのN末端またはC末端に1個または複数個の付加的なアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの態様において、MYCポリペプチドは、ポリペプチドのN末端またはC末端において、1つまたは複数の付加的なペプチドに連結されている。

本明細書に記載される方法において使用するのに適したタンパク質には、本明細書に記載される任意のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、1～15個のアミノ酸変化、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するタンパク質を含む、機能的変種もまた含まれる。他の態様において、変更されたアミノ酸配列は、本明細書に記載される任意のタンパク質阻害剤のアミノ酸配列と少なくとも75%同一、例えば、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。そのような配列変種タンパク質は、変更されたアミノ酸配列が、本明細書に記載される組成物および方法において機能的であるために十分な生物学的活性を保持する限り、本明細書に記載される方法に適している。アミノ酸置換が行われる場合、置換は保存的アミノ酸置換であってよい。一般的な天然アミノ酸の中で、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群のそれぞれの中でのアミノ酸間の置換によって例示される：(1) グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3) セリンおよびスレオニン、(4) アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5) グルタミンおよびアスパラギン、ならびに (6) リジン、アルギニン、およびヒスチジン。BLOSUM62表は、500を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列である (Henikoff et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:10915- 10919)。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載または開示されるアミノ酸配列に導入される保存的アミノ酸置換を規定するために、BLOSUM62置換頻度が使用される。（上記のように）化学的特性のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という言語は、好ましくは、-1を上回るBLOSUM62値によって表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3というBLOSUM62値により特徴づけられる場合に保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1（例えば、1、2、または3）というBLOSUM62値により特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2（例えば、2または3）というBLOSUM62値により特徴づけられる。

「Eボックス配列」および「エンハンサーボックス配列」という語句は、本明細書において互換的に用いられ、Nが任意のヌクレオチドであるヌクレオチド配列CANNTGを意味する。場合によっては、Eボックス配列はCACGTGを含む。場合によっては、MYCによってコードされる転写因子の塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスドメインは、Eボックス配列に結合する。場合によっては、Eボックス配列は、遺伝子（例えば、p21、Bc1-2、またはオルニチンデカルボキシラーゼ）の上流に位置する。場合によっては、MYCポリペプチドはEボックスDNA結合ドメインを含む。場合によっては、EボックスDNA結合ドメインは、KRRTHNVLERQRRN (SEQ ID NO: 6) の配列を含む。場合によっては、MYCによってコードされる転写因子のEボックス配列への結合により、RNAポリメラーゼがEボックス配列の下流の遺伝子を転写することが可能になる。

「MYC活性」または「MYC生物学的活性」または「生物学的に活性のあるMYC」という用語は、細胞生存、細胞増殖、および／または抗体産生の増強または誘導のうちの1つまたは複数を含む。例としてかつ非限定的に、MYC活性には、抗CD3および抗CD28活性化T細胞の増大の増強、ならびに／または長期自己再生性造血幹細胞の増殖の増加が含まれる。MYC活性には、細胞の核への侵入、核酸配列への結合（例えば、Eボックス配列との結合）、および／またはMYC標的遺伝子の発現の誘導もまた含まれる。

「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、動物、典型的には哺乳動物を指す。1つの態様において、患者、対象、または個体は哺乳動物である。1つの態様において、患者、対象、または個体はヒトである。いくつかの態様において、患者、対象、または個体は、動物、例えば、これらに限定されないが、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、およびネコなどの飼育動物である。

「タンパク質導入ドメイン (PTD) 」または「輸送体ペプチド配列」という用語（細胞透過性タンパク質 (CPP) または膜移行配列 (MTS) としても公知である）は、本明細書において互換的に用いられ、古典的なエンドサイトーシスには依存せずに、はるかにより大きな分子を細胞内に輸送することができる小さいペプチドを指す。いくつかの態様において、分子の細胞核へのさらなる移行を媒介する核局在化シグナルが、タンパク質導入ドメイン内に見出され得る。

本明細書で用いられる場合の「処置すること」または「処置」という用語は、ヒトなどの対象における疾患の処置を包含し、(i) 疾患を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること；(ii) 疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと；(iii) 疾患の進行を遅らせること；および／または (iv) 疾患の1つもしくは複数の症状を阻害する、軽減する、もしくはその進行を遅らせることを含む。腫瘍に関して、「処置すること」または「処置」はまた、腫瘍の退縮、腫瘍成長を遅らせること、腫瘍の転移を阻害すること、再燃もしくは再発がんを阻害すること、および／または寛解を維持することを包含する。

記載される医学的な疾患および状態の処置または防止の様々な様式は、完全な処置または防止のみならず不完全な処置または防止も含み、いくらかの生物学的または医学的に関連する結果が達成される、「実質的」を意味することが意図されることもまた認識されるべきである。処置は、慢性疾患のための継続的な長期的処置、または急性状態の処置のための単回もしくは少数回の投与であってよい。

本明細書で用いられる場合の「治療的」という用語は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根治によって得られる。

II. 概要
1つの局面において、本開示は、一部には、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞（例えば、末梢血単核細胞 (PBMC)）を含む組成物の凍結保存に関し、この場合、1個または複数個の免疫細胞をPTD-MYC融合ポリペプチドの有効量とインビトロで接触させた後に、組成物を凍結させるのに十分な温度まで組成物を冷却する。

別の局面において、本開示は、一部には、ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC) を含む組成物の凍結保存に関し、この場合、1個または複数個のPBMCをPTD-MYC融合ポリペプチドの有効量とインビトロで接触させた後に、組成物を凍結させるのに十分な温度まで組成物を冷却する。

本開示は、少なくとも一部には、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞および／またはPBMCを、MYCポリペプチドおよびHIV TATタンパク質導入ドメインなどのタンパク質導入ドメイン (PTD) を含むMYC融合ポリペプチドと接触させ、処理された免疫細胞および／またはPBMCを、細胞を凍結させるのに十分な温度まで冷却することにより、MYC融合ポリペプチドで処理されていない対照免疫細胞および／またはPBMCと比較して、細胞生存率および／または細胞回収率が有意に上昇し、ならびに細胞活性化後のCD25の発現が有意に増加するという発見に基づく。本明細書において提供される実施例により、凍結保存の前にTAT-MYC融合タンパク質と接触させた、ドナー対象から単離された免疫細胞および／またはPBMCが、凍結融解サイクル後の対照PBMCと比較して、融解した際に、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、CD3およびCD28による細胞活性化の増加、または細胞活性化時のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すことが実証される。

いくつかの態様において、本開示は、免疫細胞を凍結保存する方法であって、
ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン (PTD)；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階、および
組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、末梢血単核細胞 (PBMC) を凍結保存する方法であって、
ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン (PTD)；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階、および
組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質導入ドメイン配列である。いくつかの態様において、MYCポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 2または11に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、骨髄系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の骨髄系細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好中球、マスト細胞、好塩基球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のB細胞は、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、抗原特異的B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、アネルギー性AN1/T3細胞集団、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のT細胞は、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギーT細胞、寛容T細胞、キメラT細胞、および抗原特異的T細胞、制御性T細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、1個または複数個の末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

いくつかの態様において、本方法は、1個または複数個のPBMCを含む1個または複数個の免疫細胞を細胞懸濁培地に懸濁する段階をさらに含む。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、哺乳動物細胞の凍結保存に適している。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、PBMCを含む免疫細胞の凍結保存に適している。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む。

いくつかの態様では、速度制御された低温フリーザーを使用して、免疫細胞を冷却する。いくつかの態様では、1分当たり約-1℃の速度で、免疫細胞を冷却する。いくつかの態様では、速度制御された低温フリーザーを使用して、PBMCを冷却する。いくつかの態様では、1分当たり約-1℃の速度で、PBMCを冷却する。

いくつかの態様において、組成物を凍結させるのに十分な温度は、約-80℃～約-190℃である。いくつかの態様において、組成物を凍結させるのに十分な温度は、約-80℃、約-82℃、約-84℃、約-86℃、約-88℃、約-90℃、約-92℃、約-94℃、約-96℃、約-98℃、約-100℃、約-105℃、約-110℃、約-115℃、約-120℃、約-125℃、約-130℃、約-135℃、約-140℃、約-145℃、約-150℃、約-155℃、約-160℃、約-165℃、約-170℃、約-175℃、約-180℃、約-185℃、約-190℃、またはそれらの間の任意の整数値である。

いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照細胞と比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階を、本方法はさらに含む。

別の局面において、本開示は、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと、
ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞と
を含む凍結組成物であって、対象から単離された対照免疫細胞と比較して、細胞生存率の上昇を示す凍結組成物を提供する。

別の関連する局面において、本開示は、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと、
ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む凍結組成物であって、対象から単離された対照PBMCと比較して、細胞生存率の上昇を示す凍結組成物を提供する。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質導入ドメイン配列である。いくつかの態様において、MYCポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 2または11に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、骨髄系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の骨髄系細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好中球、マスト細胞、好塩基球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のB細胞は、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、抗原特異的B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、アネルギー性AN1/T3細胞集団、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のT細胞は、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギーT細胞、寛容T細胞、キメラT細胞、および抗原特異的T細胞、制御性T細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、1個または複数個の末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

いくつかの態様において、組成物は細胞懸濁培地をさらに含む。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む。

いくつかの態様において、組成物は、凍結融解サイクル後の対照PBMCと比較して、融解した際に細胞回収率の増加を示す。

いくつかの態様において、組成物は、凍結融解サイクル後の対照PBMCと比較して、細胞活性化後のCD25の発現の増加を示す。

いくつかの態様において、本技術の組成物は、養子細胞移入 (ACT) における免疫細胞および／またはPBMCの利用を有利に高めることができる。養子細胞移入(ACT) は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞の患者への移入を伴う免疫療法の一形態である。ACTは典型的に、抗腫瘍活性を有するリンパ球をドナー対象から単離し、リンパ球をインビトロで培養して集団を増大させ、次いでそれを必要とする患者にリンパ球を注入することを伴う。いくつかの態様において、免疫細胞および／またはPBMCは、ドナーから単離された初代細胞である。

いくつかの態様において、免疫細胞および／またはPBMCは、単離後に改変される。例えば、いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の異種受容体または改変受容体（例えば、キメラ抗原受容体）を発現するように改変された免疫細胞（例えば、T細胞）である。いくつかの態様において、細胞は、操作されたキメラ抗原受容体 (CAR) T細胞である。いくつかの態様において、細胞は、操作されたキメラ抗原受容体 (CAR) Treg細胞である。

いくつかの態様において、本明細書において提供される方法に従って凍結保存された免疫細胞および改変免疫細胞を用いて、対象における免疫応答を高めることができる。これらの細胞の例示的な使用には、がん免疫療法、およびウイルス、細菌、または真菌感染症などの病原性感染症の処置が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、本明細書において提供される方法に従って凍結保存された免疫細胞および改変免疫細胞を用いて、対象における免疫応答を低下させることができる。これらの細胞（例えば、Tregおよび改変Treg細胞）の例示的な使用には、多発性硬化症 (MS)、エリテマトーデス、喘息、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、大腸炎、移植片対宿主病 (GvHD)、関節リウマチ、炎症性腸疾患、糖尿病、および臓器または組織の移植片拒絶などの自己免疫性およびアレルギー性の疾患および状態の処置が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、本技術の組成物は、インビトロまたはインビボの免疫学的研究に使用することができる。

いくつかの態様において、本技術の組成物は、免疫療法および養子細胞移入で使用するための免疫細胞バンクを作製する方法において使用することができる。

III. 凍結保存の前に免疫細胞および／またはPBMCを入手および調製する方法
本明細書において提供される方法において使用するための免疫細胞および／または末梢血単核細胞は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を用いて入手することができる。いくつかの態様において、免疫細胞は初代免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞およびB細胞などのリンパ球である。いくつかの態様において、免疫細胞は、ナチュラルキラー (NK) 細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、リンパ球とNK細胞の混合物である。いくつかの態様において、免疫細胞は末梢血単核細胞 (PBMC) である。いくつかの態様において、T細胞は、対象における腫瘍または転移性腫瘍の手術中に採取される。例えば、いくつかの態様において、T細胞は、生検による腫瘍組織の採取後に単離される。いくつかの態様において、末梢血単核細胞 (PBMC) は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

いくつかの態様において、免疫細胞は、血液、リンパ液、または組織生検試料などの、細胞の集団を含む試料から単離することができる。免疫細胞は、当技術分野において公知の任意の手段によって、細胞の集団から単離することができる。

いくつかの態様において、免疫細胞は、末梢血試料などの全血試料から単離することができる。いくつかの態様において、免疫細胞は、白血球アフェレーシスユニットから単離することができる。いくつかの態様において、末梢血単核細胞は、白血球アフェレーシスユニットから単離することができる。いくつかの態様において、末梢血単核細胞画分は、任意の適切な密度勾配媒体を用いた勾配分離を介して、全血試料から単離することができる。いくつかの態様において、例えば、末梢血単核細胞画分を単離するために使用される密度勾配媒体は、Ficoll-Paque（登録商標）PLUSまたはFicoll-Paque（登録商標）PREMIUMである。1つの態様において、PBMC画分は、Ficoll-Paque（登録商標）PLUS媒体による勾配分離を介して、全血試料から単離される。いくつかの態様においては、血液試料の凝固を防ぐために、血液抗凝固剤であるエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) が用いられる。したがって、いくつかの態様において、本方法は、EDTAでコーティングされた収集バイアルを用いる。EDTAは、凝固および凝血を担う血液試料中のCa²⁺イオンのキレート化を介して血液抗凝固剤として作用する。いくつかの態様においては、試料の赤血球を試料から枯渇させる。

1つの態様において、本方法は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって、腫瘍試料から免疫細胞のバルク集団を入手する段階を含む。例えば、免疫細胞のバルク集団は、腫瘍試料を細胞懸濁液に解離させることによって、腫瘍試料から入手することができ、そこから特定の細胞集団を選択することができる。免疫細胞のバルク集団を入手する適切な方法には、腫瘍の機械的解離（例えば、粉砕）、腫瘍の酵素的解離（例えば、消化）、および（例えば、針による）吸引のうちの任意の1つまたは複数が含まれ得るが、これらに限定されない。

試料から得られた免疫細胞の集団は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、骨髄系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の適切な型の免疫細胞を含み得る。いくつかの態様において、試料から得られた骨髄系細胞のバルク集団は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好中球、マスト細胞、好塩基球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

試料から得られたT細胞の集団は、任意の適切な型のT細胞を含み得る。いくつかの態様において、試料から得られたT細胞は、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギー性T細胞、寛容T細胞、キメラT細胞、および抗原特異的T細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

試料から得られたB細胞の集団は、任意の適切な型のB細胞を含み得る。いくつかの態様において、試料から得られたB細胞は、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、抗原特異的B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、アネルギー性AN1/T3細胞集団、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含み得る。

試料から得られた免疫細胞の集団は、末梢血単核細胞 (PBMC) を含み得る。いくつかの態様において、試料から得られたPBMCは、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

試料は、任意の哺乳動物から入手することができる。特に明記されない限り、本明細書で用いられる場合、「哺乳動物」という用語は、ウサギなどのウサギ目；ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目；ウシ亜科（ウシ）およびイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目；またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物を含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、例えば、霊長目、セボイド目 (Ceboid)、もしくはシモイド目 (Simoids)（サル）、または真猿亜目（ヒトおよび類人猿）の非ヒト霊長類であってよい。いくつかの態様において、哺乳動物は、マウスおよびハムスターなどの齧歯目の哺乳動物であってよい。好ましくは、哺乳動物は、非ヒト霊長類またはヒトである。例示的な哺乳動物はヒトである。

いくつかの態様において、免疫細胞は、ポシティブまたはネガティブ選択技法によってさらに単離することができる。ネガティブ選択による免疫細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって達成され得る。細胞は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した細胞の選別および／または選択によって濃縮され得る。例えば、ネガティブ選択によってCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは典型的に、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。

さらに、抗CD14によってコーティングされたビーズもしくはカラム、または除去を容易にするためのこれらの細胞の食作用活性の利用を含むがこれらに限定されない、多種多様な方法論によって、血液調製物から単球集団（すなわち、CD14+細胞）を枯渇させることができる。

ポジティブ選択またはネガティブ選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変動し得る。ある特定の態様においては、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を共に混合する体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、1つの態様においては、細胞20億個／mLの濃度が使用され得る。1つの態様においては、細胞10億個／mLの濃度が使用される。さらなる態様においては、細胞1億個／mL超が使用され得る。さらなる態様においては、細胞約1000万個／mL、細胞約1500万個／mL、細胞約2000万個／mL、細胞約2500万個／mL、細胞約3000万個／mL、細胞約3500万個／mL、細胞約4000万個／mL、細胞約4500万個／mL、または細胞約5000万個／mLの細胞の濃度が使用され得る。さらに別の態様においては、細胞約7500万個／mL、細胞約8000万個／mL、細胞約8500万個／mL、細胞約9000万個／mL、細胞約9500万個／mL、または細胞約1億個／mLからの細胞の濃度が使用され得る。さらなる態様においては、細胞約1億2500万個／mLまたは細胞約1億5000万個／mLの濃度が使用され得る。高濃度を使用することで、細胞収率、細胞活性化、および細胞増大の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度を使用することで、CD28陰性T細胞などの関心対象の標的抗原を弱く発現し得る細胞の、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織、等）からのより効率的な捕捉が可能になる。そのような細胞集団は、治療的価値を有し得、したがって入手することが望ましい。例えば、高濃度の細胞を使用することで、通常はCD28発現がより弱いCD8+ T細胞のより効率的な選択が可能になる。

関連する別の態様において、より低い細胞の濃度を使用することが望ましい場合がある。免疫細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これにより、粒子に結合すべき所望の抗原を多量に発現する細胞が選択される。例えば、CD4+ T細胞は、より高レベルのCD28を発現し、希釈濃度においてCD8+ T細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの態様において、使用される細胞の濃度は5×10⁶個/mLであってよい。いくつかの態様において、使用される濃度は、約1×10⁵個/mL～1×10⁶個/mL、またはそれらの間の任意の整数値であってよい。したがって、使用される濃度は、約1×10⁵個/mL、約1.1×10⁵個/mL、約1.2×10⁵個/mL、約1.3×10⁵個/mL、約1.4×10⁵個/mL、約1.5×10⁵個/mL、約1.6×10⁵個/mL、約1.7×10⁵個/mL、約1.8×10⁵個/mL、約1.9×10⁵個/mL、約2×10⁵個/mL、約2.2×10⁵個/mL、約2.4×10⁵個/mL、約2.6×10⁵個/mL、約2.8×10⁵個/mL、約3×10⁵個/mL、約3.2×10⁵個/mL、約3.4×10⁵個/mL、約3.6×10⁵個/mL、約3.8×10⁵個/mL、約4×10⁵個/mL、約4.2×10⁵個/mL、約4.4×10⁵個/mL、約4.6×10⁵個/mL、約4.8×10⁵個/mL、約5×10⁵個/mL、約5.5×10⁵個/mL、約6×10⁵個/mL、約6.5×10⁵個/mL、約7×10⁵個/mL、約7.5×10⁵個/mL、約8×10⁵個/mL、約8.5×10⁵個/mL、約9×10⁵個/mL、約9.5×10⁵個/mL、約1×10⁶個/mL、またはそれらの間の任意の整数値であってよい。

いくつかの態様において、細胞は、フローサイトメトリーによる単離とその後の細胞表現型の特徴決定のために、エピトープ特異的な試薬によって直接標識される。いくつかの態様において、免疫細胞は、免疫細胞特異的抗体を接触させることによって単離される。いくつかの態様において、PBMCは、PBMC特異的抗体を接触させることによって単離される。抗原特異的T細胞、または一般的に本技術の任意の細胞の選別は、MoFloソーター（DakoCytomation、Fort Collins, Colo.）、FACSAria（商標）、FACSArray（商標）、FACSVantage（商標）、BD（商標）LSR II、およびFACSCalibur（商標）（BD Biosciences、San Jose, Calif.）を含むがこれらに限定されない、多種多様な市販のセルソーターのいずれかを使用して実施することができる。

IV. MYC融合タンパク質
いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドは、タンパク質導入ドメイン (PTD)、細胞の生存または増殖のうちの1つまたは複数を促進するMYCポリペプチド、および任意に、タンパク質タグドメイン、例えば融合タンパク質の精製を容易にする1つまたは複数のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、MYCポリペプチドと接触した細胞は、（例えば、MYCと接触していない同じ型の同一もしくは類似の細胞と比較して）生存時間の延長、および／または（例えば、MYCと接触していない同じ型の同一もしくは類似の細胞と比較して）増殖の増加を示す。

いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、(a) タンパク質導入ドメイン；および (b) MYCポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、融合ペプチドは、式 (I)：
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列
のポリペプチドである。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) タンパク質導入ドメイン；(b) MYCポリペプチド配列；および (c) タンパク質導入ドメインとMYCポリペプチド配列を連結する1つまたは複数の分子を含む。いくつかの態様において、融合ペプチドは、式 (II) ：
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列
のポリペプチドであり、式中、‐X‐は、タンパク質導入ドメインとMYCポリペプチド配列を連結する分子である。いくつかの態様において、‐X‐は少なくとも1個のアミノ酸である。

いくつかの態様において、本明細において開示される融合ポリペプチドは、(a) タンパク質導入ドメイン；(b) MYCポリペプチド配列；(c) 少なくとも2つのタンパク質タグ；および任意に (d) リンカーを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、式（III～VI）：
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列‐X‐タンパク質タグ1‐X‐タンパク質タグ2（式 (III)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐X‐タンパク質タグ1‐X‐タンパク質タグ2（式 (IV)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐タンパク質タグ1‐X‐タンパク質タグ2（式 (V)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐タンパク質タグ1‐タンパク質タグ2（式 (VI)）
のポリペプチドであり、式中、‐X‐はリンカーである。いくつかの態様において、‐X‐は1個または複数個のアミノ酸である。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) タンパク質導入ドメイン；(b) MYCポリペプチド配列；(c) 6-ヒスチジンタグ；(d) V5エピトープタグ；および (e) 任意にリンカーを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、式（VII～XIV）：
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列‐X‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (VII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐X‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (VIII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (IX)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐6-ヒスチジンタグ‐V5エピトープタグ（式 (X)）、
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列‐X‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XI)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐X‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XIII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐V5エピトープタグ‐6-ヒスチジンタグ（式 (XIV)）
のポリペプチドであり、式中、‐X‐はリンカーである。いくつかの態様において、‐X‐は1個または複数個のアミノ酸である。

上記のように、いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は1つまたは複数のリンカー配列を含む。リンカー配列は、融合タンパク質のタンパク質導入ドメイン、MYCポリペプチド配列、V5エピトープタグ、および／または6-ヒスチジンタグを連結するために用いることができる。いくつかの態様において、リンカーは1個または複数個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーのアミノ酸配列はKGELNSKLEを含む。いくつかの態様において、リンカーはRTGのアミノ酸配列を含む。

タンパク質導入ドメイン (PTD)
いくつかの態様において、MYC融合タンパク質はタンパク質導入ドメインを含む。ペプチド輸送は、低分子、タンパク質、または核酸の、細胞の細胞内区画への細胞膜を介した送達のための代替法を提供する。1つの非限定的な例であって、十分に特徴決定されているタンパク質導入ドメイン (PTD) は、TAT由来ペプチドである。Frankelら（例えば、米国特許第5,804,604号、米国特許第5,747,641号、米国特許第5,674,980号、米国特許第5,670,617号、および米国特許第5,652,122号を参照されたい）は、TATのアミノ酸48～57を含むペプチドをカーゴタンパク質（βガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートすることによる、カーゴタンパク質の細胞内への輸送を実証した。いくつかの態様において、TATはMRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 7) のアミノ酸配列を含む。

PTDの別の非限定的な例は、ペネトラチンである。ペネトラチンは、細胞膜を介して親水性高分子を輸送することができる（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Derossi et al., Trends Cell Biol., 8:84-87 (1998)）。ペネトラチンは、培養中の細胞に内部移行するショウジョウバエ転写因子、アンテナペディアのホメオドメインのアミノ酸43～58に相当する16アミノ酸ペプチドである。

PTDのさらに別の非限定的な例は、VP22である。単純ヘルペスウイルス1型 (HSV-1) 由来の外被タンパク質であるVP22は、細胞膜を介してタンパク質および核酸を輸送する能力を有する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Elliot et al., Cell 88:223-233, 1997）。VP22の残基267～300は必要であるが、輸送のために十分とはなり得ない。輸送機能を担う領域が同定されていないため、細胞膜を介してカーゴタンパク質および核酸を輸送するために、VP22タンパク質全体が一般的に使用される (Schwarze et al., Trends Pharmacol Sci, 21:45-48, 2000）。

いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドはタンパク質導入ドメインを含む。例として、しかし非限定的に、いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、TAT、ペネトラチン、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16、およびアンテナペディアのうちの1つまたは複数のタンパク質導入ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、TAT、ペネトラチン、VP22、vpr、およびEPTDのうちの1つまたは複数のタンパク質導入ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、TAT、ペネトラチン、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16、およびアンテナペディアのうちの少なくとも1つのタンパク質導入ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、合成タンパク質導入ドメイン（例えば、ポリアルギニンまたはPTD-5）を含む。特定の態様において、タンパク質導入ドメインは、TATタンパク質導入ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、MYCポリペプチドに共有結合で連結されている。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、ペプチド結合を介してMYCポリペプチドに連結されている。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインは、リンカー配列を介してMYCポリペプチドに連結されている。いくつかの態様において、リンカーは短いアミノ酸配列を含む。例として、しかし非限定的に、いくつかの態様において、リンカー配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長である。

本技術のMYC融合タンパク質は、任意の所望の順序で配置することができる。例えば、いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、(a) MYCポリペプチドにインフレームで連結されたタンパク質導入ドメイン、(b) V5ドメインにインフレームで連結されたMYCポリペプチド、および c) 6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結されたV5ドメインの順序で配置することができる。いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、(a) タンパク質導入ドメインにインフレームで連結されたMYCポリペプチド、(b) V5ドメインにインフレームで連結されたタンパク質導入ドメイン、および c) 6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結されたV5ドメインという成分の順序を有する。いくつかの態様においては、1つまたは複数の付加的なアミノ酸配列またはリンカーが、配列のそれぞれの間に含まれ得る。いくつかの態様において、付加的なアミノ酸は、ポリペプチド配列の最初および／または最後に含まれ得る。

いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTATタンパク質導入ドメインである。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[48-57]である。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメインはTAT_[57-48]である。

タンパク質タグドメイン
いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、融合タンパク質の精製を容易にする1つまたは複数のアミノ酸配列を含むタンパク質タグドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、ポリヒスチジンタグおよびエピトープタグのうちの1つまたは複数を含む。例として、しかし非限定的に、例示的なタグには、V5、ヒスチジンタグ（例えば、6-ヒスチジンタグ）、HA（赤血球凝集素）タグ、FLAGタグ、CBP（カルモジュリン結合ペプチド）、CYD（共有結合性であるが解離可能なNorpDペプチド）、Strepll、またはHPC（プロテインCの重鎖）のうちの1つまたは複数が含まれる。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは約10～約20アミノ酸長を含む。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、2アミノ酸長～40アミノ酸長、例えば6～20アミノ酸長を含む。いくつかの態様において、いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、21アミノ酸、22アミノ酸、23アミノ酸、24アミノ酸、25アミノ酸、26アミノ酸、27アミノ酸、28アミノ酸、29アミノ酸、30アミノ酸、31アミノ酸、32アミノ酸、33アミノ酸、34アミノ酸、35アミノ酸、36アミノ酸、37アミノ酸、38アミノ酸、39アミノ酸、または40アミノ酸を含む。いくつかの態様においては、上記の列挙されたタグのうちの2つ（例えば、V5およびHISタグ）が、タンパク質タグドメインを形成するために共に使用される。

いくつかの態様において、ヒスチジンタグは6-ヒスチジンタグである。いくつかの態様において、ヒスチジンタグは配列HHHHHH (SEQ ID NO:8) を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ペプチドは、V5エピトープタグを含む。いくつかの態様において、V5タグはGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:9) のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、V5タグはIPNPLLGLD (SEQ ID NO:10) のアミノ酸配列を含む。

タンパク質タグは、任意の適切な方法によって、本明細書において開示される融合タンパク質に付加することができる。例として、しかし非限定的に、いくつかの態様において、TAT-MYCポリペプチド配列は、1つまたは複数のタンパク質タグ、例えばポリHisタグおよび／またはV5タグをコードする発現ベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、ポリヒスチジンタグおよび／またはV5タグは、PCRによって付加される（すなわち、PCRプライマーは、ポリヒスチジン配列および／またはV5配列を含む）。

PTD-MYC融合ポリペプチドの構築
本明細書において開示されるPTD-MYC融合ポリペプチド（例えば、TAT-MYC融合ポリペプチド）は、当技術分野において周知の方法によって構築することができる。例として、しかし非限定的に、TAT-MYC融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、PCRによって作製することができる。いくつかの態様において、ヒトMYC配列のフォワードプライマーは、TATタンパク質導入ドメインのインフレームのN末端9アミノ酸配列（例えば、RKKRRQRRR）を含む。いくつかの態様において、ヒトMYC配列のリバースプライマーは、終止コドンを除去するように設計される。いくつかの態様において、PCR産物は、任意の適切な発現ベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、発現ベクターはポリヒスチジンタグおよびV5タグを含む。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、 (a) TATおよび (b) c-MYCを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[48-57]および (b) c-MYCを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[57-48]および (b) c-MYCを含む。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[48-57]、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグを含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[57-48]、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグを含む。

いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1を含み；いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1である。

融合タンパク質は、1つまたは複数の官能基を含むように、合成中または合成後に修飾することができる。例として、しかし非限定的に、タンパク質は、アセチル基、リン酸基、酢酸基、アミド基、アルキル基、および／またはメチル基のうちの1つまたは複数を含むよう修飾することができる。このリストは網羅的であることは意図されず、例示的なものに過ぎない。いくつかの態様において、タンパク質は少なくとも1つのアセチル基を含む。

PTD-MYC融合ポリペプチドは、当技術分野において公知の適切な方法によって、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの細胞における組換えタンパク質発現によって作製することができる。いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドは、微生物発酵によって組換えにより生成される。いくつかの態様において、微生物発酵は、約1～約10,000リットルの発酵体積、例えば約10～約1000リットルの発酵体積で行われる。発酵は、任意の適切な微生物宿主細胞および培養液を用いることができる。例示的な態様においては、大腸菌 (E.coli) が微生物宿主細胞として用いられる。別の態様においては、他の微生物、例えば、S. セレビシエ (S. cerevisiae)、P. パストリス (P. pastoris)、ラクトバチルス、バチルス、およびアスペルギルスが使用され得る。例示的な態様において、微生物宿主細胞はBL-21 Star（商標）大腸菌株 (Invitrogen) である。例示的な態様において、微生物宿主細胞はBLR DE3大腸菌株である。

いくつかの態様において、宿主細胞は、宿主微生物細胞のコドンバイアスを克服して発現タンパク質の翻訳を改善するために用いられる、稀なコドンに対するtRNAを提供するように改変される。例示的な態様において、宿主細胞（例えば、大腸菌）は、AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGAコドンに対するtRNAを発現する、pRARE (CamR) などのプラスミドで形質転換される。特定のコドンに対するtRNAを提供するのに適した付加的なプラスミドまたは構築物は、当技術分野で公知であり、提供される方法において用いることができる。

選択された宿主細胞にPTD-MYC融合ポリペプチドの発現カセットを導入する目的で、組込み型ベクターまたは自己複製型ベクターを使用することができる。発現カセットにおいて、PTD-MYC融合ポリペプチドのコード配列は、誘導性プロモーターなどのプロモーターに機能的に連結される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養素の有無または温度の変化に応答して、プロモーターの制御下にあるDNAからの転写を、増加したレベルで開始するプロモーターである。いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドをコードする核酸は、細菌発現のためにコドン最適化される。

多種多様な可能性のある宿主細胞によって認識される例示的なプロモーターは、周知である。これらのプロモーターは、存在する場合、制限酵素消化により供給源DNAからプロモーターを取り出し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、PTD-MYC融合ポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結することができる。微生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム（Chang et al. (1978) Nature, 275:617-624；Goeddel et al. (1979) Nature, 281:544）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン (trp) プロモーターシステム（Goeddel (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057；EP 36,776）、ならびにtacプロモーター (deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25) などのハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。選択された宿主細胞による発現に適した任意のプロモーターを使用することができる。適切なヌクレオチド配列は公開されており、それによって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、PTD-MYC融合ポリペプチドをコードするDNAにそれらを機能的に連結することが可能になる（例えば、Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269を参照されたい）。例示的な態様において、細菌系において使用するためのプロモーターは、コード配列に機能的に連結されたシャイン・ダルガーノ (S.D.) 配列を含み得る。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、当技術分野において周知のように、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) によって誘導されるlacZプロモーターである。プロモーターおよび発現カセットはまた、関心対象のDNA配列を合成するための周知の技法を使用して、新規に合成することもできる。例示的な態様において、本明細書におけるPTD-MYC融合ポリペプチドの発現のための発現ベクターは、pET101/D-Topo (Invitrogen) である。

PTD-MYC融合ポリペプチドの発現のためには、PTD-MYC融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む微生物宿主を、典型的には、発酵リアクター内で高密度まで増殖させる。いくつかの態様において、リアクターは、グルコースの制御された供給を有する。いくつかの態様においては、最初に、発酵槽接種材料を、抗生物質が補充された培地中で培養する（例えば、終夜培養）。次いで、この発酵槽接種材料を用いて、タンパク質の発現用の発酵槽培養液に接種する。発酵槽培養液の少なくとも約15、通常は少なくとも約20、少なくとも25、少なくとも約30、またはそれ以上のOD600の時点で、組換えタンパク質の発現を誘導する。例示的な態様においては、誘導性プロモーターがlacZプロモーターである場合、PTD-MYC融合ポリペプチドの発現を誘導するために、IPTGを発酵培地に添加する。一般に、IPTGは、対数増殖期を表すOD600の時点で、発酵槽培養液に添加する。

提供される方法のある特定の態様において、誘導されたタンパク質発現は、誘導後約2時間前後～約5時間前後維持し、かつ誘導後約2時間前後～約3時間前後であってもよい。より長い誘導期間は、組換えタンパク質の分解のため、望ましくない場合がある。誘導中の反応混合物の温度は、好ましくは約28℃～約37℃、通常は約30℃～約37℃である。特定の態様において、誘導は約37℃でなされる。

PTD-MYC融合ポリペプチドは、典型的には、微生物細胞においてサイトゾル封入体として発現される。封入体を回収するためには、細胞ペレットを、誘導後に発酵培養液を遠心分離することにより収集し、-70℃またはそれ以下で凍結し、融解し、かつ破壊緩衝液に再懸濁する。従来の方法、例えば、超音波処理、ホモジナイズ、等によって、細胞を溶解する。次いで、通常は、タンパク質を可溶化するのに有効な濃度、例えば、約5M、6M、7M、8M、9M前後、またはそれ以上の尿素の存在下で、溶解物を可溶化緩衝液に再懸濁する。再懸濁は、ペレットを機械的にばらばらにし、均一性を達成するために撹拌することを必要とし得る。いくつかの態様においては、細胞ペレットを尿素緩衝液に直接再懸濁し、均一になるまで混合する。いくつかの態様において、再懸濁／可溶化緩衝液は8M尿素、50 mMリン酸 pH7.5であり、懸濁物はホモジナイザーに通す。

いくつかの態様においては、均一化された懸濁液をスルホニル化する。例えば、いくつかの態様においては、均一化された懸濁液を、200 mM亜硫酸ナトリウムおよび10 mMテトラチオン酸ナトリウムを含むように調整する。次いで、その溶液を均一になるまで室温で混合する。次いで、混合された溶解液をさらなる期間（例えば、2～8℃で≧12時間）混合して、スルホニル化を完了させる。次いで、スルホニル化された溶解液を1時間遠心分離した。次いで、スルホニル化されたPTD-MYC融合ポリペプチドを含む上清を、遠心分離により収集し、細胞ペレットを廃棄する。次いで、上清をフィルター、例えば0.22μm膜フィルターに通して、溶解液を清澄化する。

次いで、可溶化されたタンパク質を精製する。精製方法には、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および同様のものが含まれ得る。いくつかの態様においては、アフィニティークロマトグラフィーが使用される。例えば、タンパク質には、簡便な精製のためにエピトープタグまたはヒスチジン6タグが提供される。本方法において、例示的なPTD-MYC融合ポリペプチドは、Ni樹脂を用いたNiアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製のために、ヒスチジン6タグを含む。

例示的な態様においては、Ni樹脂カラムを、尿素を含有する緩衝液で平衡化する。いくつかの態様において、平衡化緩衝液は、6M尿素、50 mMリン酸、500 mM NaCl、10%グリセロール溶液である。次いで、PTD-MYC融合ポリペプチドを含むスルホニル化され清澄化された上清を、Ni樹脂カラムに負荷する。次いで、カラムを、洗浄緩衝液、例えば、6M尿素、50mMリン酸、10%グリセロール、500 mM NaCl、pH7.5で洗浄する。次いで、カラムを、塩濃度が減少していく順次的な洗浄緩衝液で洗浄した。例えば、例示的なその後の洗浄には、6M尿素、50mMリン酸、10%グリセロール、および2M NaCl、pH7.5と、それに続く6M尿素、50mMリン酸、10%グリセロール、50mM NaCl、および30mMイミダゾール、pH7.5のさらなる洗浄が含まれ得る。

洗浄緩衝液の順次的な適用の後、溶出緩衝液、例えば、100～300 mMイミダゾールの勾配を有する6M尿素、50mMリン酸、10%グリセロール、および50mM NaCl、pH7.5を添加することにより、PTD-MYC融合ポリペプチドをカラムから溶出させ、画分を収集する。次いで、プールすべきタンパク質含有画分を、0.22μm膜を通して濾過する。タンパク質収率の評価は、任意の適切な方法、例えばUV波長280での分光光度法を使用して測定することができる。

いくつかの態様においては、1つまたは複数の付加的な精製方法を用いて、単離されたPTD-MYC融合ポリペプチドをさらに精製することができる。例示的な態様では、Ni-Sepharoseクロマトグラフィー段階からプールされた画分を、Q-Sepharose樹脂を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。いくつかの態様では、試料を第2の洗浄緩衝液（例えば、6M尿素、50mMリン酸、10%グリセロール、2M NaCl、pH7.5）でQ Sepharose緩衝液の伝導率（17.52 +/- 1mS/cm）まで希釈することにより、Ni Sepharoseクロマトグラフィー段階からのプールを、Q-Sepharoseカラムへの負荷のために調製する。次いで、希釈されたプールをQ-Sepharoseカラムに負荷し、続いてチェイス (chase) 緩衝液（例えば、6M尿素、50mMリン酸、300mM NaCl、および10%グリセロール）を用いる2回のチェイス段階を行い、UV追跡がベースラインに到達し、タンパク質がカラムから溶出されたことが示されるまで、チェイス緩衝液をさらに順次的に適用する。

V. 凍結保存の方法
先に提供されたように、本開示は、免疫細胞の凍結保存のための方法であって、
(a) ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞を含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階、および
組成物を凍結させるのに十分な温度まで免疫細胞を冷却する段階
を含む方法を対象とする。例示的なMYC融合ポリペプチドは、本明細書において提供される。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質伝達ドメイン配列である。いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1を含む。

いくつかの態様において、免疫細胞は末梢血単核細胞 (PBMC) である。したがって、本開示はまた、PBMCの凍結保存のための方法であって、
(a) ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階、および
組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
を含む方法を対象とする。いくつかの態様において、タンパク質導入ドメイン配列はTATタンパク質伝達ドメイン配列である。いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドはSEQ ID NO: 1を含む。

本方法の例示的な態様において、約30 mL～約470 mLの全血試料がドナー対象から単離される。したがって、約30 mL、約32 mL、約34 mL、約36 mL、約38 mL、約40 mL、約42 mL、約44 mL、約46 mL、約48 mL、約50 mL、約55 mL、約60 mL、約65 mL、約70 mL、約75 mL、約80 mL、約85 mL、約90 mL、約95 mL、約100 mL、約110 mL、約120 mL、約130 mL、約140 mL、約150 mL、約160 mL、約170 mL、約180 mL、約190 mL、約200 mL、約220 mL、約240 mL、約260 mL、約280 mL、約300 mL、約320 mL、約340 mL、約360 mL、約380 mL、約400 mL、約420 mL、約440 mL、約460 mL、約470 mL、またはそれらの間の任意の整数値の全血試料を、ドナー対象から単離することができる。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された全血試料は次いで、EDTA（約1.5% w/v）などの抗凝固剤で直ちに処理する。いくつかの態様では、単離された全血試料を次いで、約20℃で一定期間（例えば、約1～24時間）インキュベートして、試料を免疫細胞および／またはPBMCと全血試料の他の成分（すなわち、赤血球、血小板、血漿、等）に分離させる。いくつかの態様において、分離は密度勾配溶液 (DGS) を用いて行われる。いくつかの態様では、SEPAX-100細胞処理システム（Biosafe America Inc.、Houston、TX）が用いられる。分離された細胞は、残存する血液成分を除去するために、細胞分離工程中に1回または複数回洗浄することができる。いくつかの態様では、生理食塩水中の2.5% (w/v) HSA（ヒト血清アルブミン）溶液を用いて細胞を洗浄し、次いで同じ洗浄溶液に再懸濁して細胞懸濁液を提供する。

いくつかの態様において、PTD-MYC融合ポリペプチドで処理する前に、細胞懸濁液の試料を採取することができる（陰性対照）。いくつかの態様において、次いで、懸濁液中の残りの細胞を、例えば約0.5μg/mL～約500μg/mLの濃度のPTD-MYC融合ポリペプチドで処理することができる。いくつかの態様において、次いで、処理した試料および処理していない（陰性対照）試料を適切な時間、例えば約1時間、室温でインキュベートすることができる。

いくつかの態様においては、免疫細胞（例えば、PBMC）を、凍結前に、細胞に取り込まれるのに十分な期間、PTD-MYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる。いくつかの態様においては、免疫細胞をPTD-MYCの有効量と、約24時間未満、約23時間未満、約22時間未満、約21時間未満、約20時間未満、約19時間未満、約18時間未満、約17時間未満、約16時間未満、約15時間未満、約14時間未満、約13時間未満、約12時間未満、約11時間未満、約10時間未満、約9時間未満、約8時間未満、約7時間未満、約6時間未満、約5時間未満、約4時間未満、約3時間未満、約2時間未満、約1時間未満、約45分未満、約30分未満、約15分未満、または約10分未満接触させる。いくつかの態様においては、免疫細胞（例えば、PBMC）をPTD-MYCの有効量と約1時間接触させる。

いくつかの態様においては、免疫細胞（例えば、PBMC）を、約0.5μg/mL～約500μg/mLの濃度のPTD-MYC融合ポリペプチドと接触させる。前述の態様のいずれかと組み合わせることができるいくつかの態様では、細胞を、少なくとも0.5μg/mL、少なくとも0.6μg/mL、少なくとも0.7μg/mL、少なくとも0.8μg/mL、少なくとも0.9μg/mL、少なくとも1μg/mL、少なくとも2μg/mL、少なくとも3μg/mL、少なくとも4μg/mL、少なくとも5μg/mL、少なくとも6μg/mL、少なくとも7μg/mL、少なくとも8μg/mL、少なくとも9μg/mL、少なくとも10μg/mL、少なくとも15μg/mL、少なくとも20μg/mL、少なくとも25μg/mL、少なくとも30μg/mL、少なくとも35μg/mL、少なくとも40μg/mL、少なくとも45μg/mL、少なくとも50μg/mL、少なくとも55μg/mL、少なくとも60μg/mL、少なくとも65μg/mL、少なくとも70μg/mL、少なくとも75μg/mL、少なくとも80μg/mL、少なくとも85μg/mL、少なくとも90μg/mL、少なくとも95μg/mL、少なくとも100μg/mL、少なくとも110μg/mL、少なくとも120μg/mL、少なくとも130μg/mL、少なくとも140μg/mL、少なくとも150μg/mL、少なくとも160μg/mL、少なくとも170μg/mL、少なくとも180μg/mL、少なくとも190μg/mL、少なくとも200μg/mL、少なくとも220μg/mL、少なくとも240μg/mL、少なくとも260μg/mL、少なくとも280μg/mL、少なくとも300μg/mL、少なくとも320μg/mL、少なくとも340μg/mL、少なくとも360μg/mL、少なくとも380μg/mL、少なくとも400μg/mL、少なくとも420μg/mL、少なくとも440μg/mL、少なくとも460μg/mL、少なくとも480μg/mL、少なくとも500μg/mL、またはそれらの間の任意の整数値の濃度のPTD-MYC融合ポリペプチドと接触させる。

TAT-MYCポリペプチドとのインキュベーションの後、次いで、処理された免疫細胞および／または処理されたPBMC（TBX-3400）を1回または複数回再洗浄して（例えば、SEPAX-100上で）、洗浄溶液（例えば、2.5% (w/v) HSA溶液）で細胞から過剰なPTD-MYCを除去することができる。最後の洗浄段階の後、処理された細胞を、例えば細胞約0.5×10⁶個／mL～細胞約1×10⁸個／mLの濃度で再懸濁することができる。いくつかの態様では、処理された細胞を、細胞約0.5×10⁶個／mL、細胞約0.6×10⁶個／mL、細胞約0.7×10⁶個／mL、細胞約0.8×10⁶個／mL、細胞約0.9×10⁶個／mL、細胞約1×10⁶個／mL、細胞約1.1×10⁶個／mL、細胞約1.2×10⁶個／mL、細胞約1.3×10⁶個／mL、細胞約1.4×10⁶個／mL、細胞約1.5×10⁶個／mL、細胞約1.6×10⁶個／mL、細胞約1.7×10⁶個／mL、細胞約1.8×10⁶個／mL、細胞約1.9×10⁶個／mL、細胞約2×10⁶個／mL、細胞約2.2×10⁶個／mL、細胞約2.4×10⁶個／mL、細胞約2.6×10⁶個／mL、細胞約2.8×10⁶個／mL、細胞約3×10⁶個／mL、細胞約3.2×10⁶個／mL、細胞約3.4×10⁶個／mL、細胞約3.6×10⁶個／mL、細胞約3.8×10⁶個／mL、細胞約4×10⁶個／mL、細胞約4.2×10⁶個／mL、細胞約4.4×10⁶個／mL、細胞約4.6×10⁶個／mL、細胞約4.8×10⁶個／mL、細胞約5×10⁶個／mL、細胞約5.5×10⁶個／mL、細胞約6×10⁶個／mL、細胞約6.5×10⁶個／mL、細胞約7×10⁶個／mL、細胞約7.5×10⁶個／mL、細胞約8×10⁶個／mL、細胞約8.5×10⁶個／mL、細胞約9×10⁶個／mL、細胞約9.5×10⁶個／mL、細胞約1×10⁷個／mL、細胞約1.1×10⁷個／mL、細胞約1.2×10⁷個／mL、細胞約1.3×10⁷個／mL、細胞約1.4×10⁷個／mL、細胞約1.5×10⁷個／mL、細胞約1.6×10⁷個／mL、細胞約1.7×10⁷個／mL、細胞約1.8×10⁷個／mL、細胞約1.9×10⁷個／mL、細胞約2×10⁷個／mL、細胞約2.2×10⁷個／mL、細胞約2.4×10⁷個／mL、細胞約2.6×10⁷個／mL、細胞約2.8×10⁷個／mL、細胞約3×10⁷個／mL、細胞約3.2×10⁷個／mL、細胞約3.4×10⁷個／mL、細胞約3.6×10⁷個／mL、細胞約3.8×10⁷個／mL、細胞約4×10⁷個／mL、細胞約4.2×10⁷個／mL、細胞約4.4×10⁷個／mL、細胞約4.6×10⁷個／mL、細胞約4.8×10⁷個／mL、細胞約5×10⁷個／mL、細胞約5.5×10⁷個／mL、細胞約6×10⁷個／mL、細胞約6.5×10⁷個／mL、細胞約7×10⁷個／mL、細胞約7.5×10⁷個／mL、細胞約8×10⁷個／mL、細胞約8.5×10⁷個／mL、細胞約9×10⁷個／mL、細胞約9.5×10⁷個／mL、細胞約1×10⁸個／mL、またはそれらの間の任意の整数値の濃度で再懸濁することができる。

PTD-MYCによる細胞処理の後、処理された細胞を遠心分離し、所定の濃度（細胞／mL）で再懸濁することができる。いくつかの態様において、細胞は適切な凍結培地に再懸濁される。いくつかの態様において、細胞懸濁培地は、CHB培地、CS10培地、またはCS5培地の中から選択される。CHB培地は、50% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、40% (v/v) RPMI細胞培養液、および10% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む細胞懸濁培地である。CS10培地（BioLife Solutions, Inc.、Bothell, WA）は、10% (v/v) DMSOを含む細胞培養液であり、動物成分または血清を本質的に含まない。CS5 (BioLife Solutions, Inc.) 培地は、5% (v/v) DMSOを含む細胞培養液であり、動物成分または血清を本質的に含まない。

次いで、再懸濁されたPTD-MYC処理細胞をバイアルに入れ、低温凍結することができる。PTD-MYC処理細胞を含む組成物は、当技術分野で公知の任意の方法によって、低温凍結することができる。例えば、PTD-MYC処理細胞を含む組成物は、所望の温度までの制御された冷却を提供する方法によって、低温凍結することができる。いくつかの態様において、PTD-MYC処理された免疫細胞（例えば、PBMC）を含む組成物は、速度制御された低温フリーザーを使用して冷却する。いくつかの態様において、PTD-MYC処理された免疫細胞（例えば、PBMC）を含む組成物は、1分当たり約-1℃の速度で冷却する。

いくつかの態様において、組成物を凍結させるのに十分な温度は、約-80℃～約-190℃である。いくつかの態様において、組成物を凍結させるのに十分な温度は、約-80℃、約-82℃、約-84℃、約-86℃、約-88℃、約-90℃、約-92℃、約-94℃、約-96℃、約-98℃、約-100℃、約-105℃、約-110℃、約-115℃、約-120℃、約-125℃、約-130℃、約-135℃、約-140℃、約-145℃、約-150℃、約-155℃、約-160℃、約-165℃、約-170℃、約-175℃、約-180℃、約-185℃、約-190℃、またはそれらの間の任意の整数値である。

いくつかの態様において、PTD-MYC処理細胞は、CoolCell（登録商標）細胞凍結容器 (BioCision) に装填した後、-80℃でインキュベートすることにより、低温凍結する。CoolCell（登録商標）は、1分当たり約-1℃の冷却速度を提供する。いくつかの態様において、TBX-3400および対照細胞は、温度が-80℃に到達するまで1分当たり-1℃の冷却速度を有するVIA Freeze（商標）システム（GE Healthcare Life Sciences、Pittsburgh, PA）に装填することにより、低温凍結する。細胞試料の凍結保存の後、試料を-190℃の液体窒素フリーザーに移すことができ、そこで試料を液体窒素の気相中で保存することができる。

本明細書において提供される方法のいくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞（例えば、PBMC）は、単離後に抗凝固剤で直ちに処理することができる。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞（例えば、PBMC）は、単離後にPTD-MYC融合ポリペプチドで直ちに処理することができる。他の態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞は、PTD-MYC融合ポリペプチドで処理する前に、適切な緩衝液中で保存することができる。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞は、単離後にPTD-MYC融合ポリペプチドで直ちに処理することができ、処理された細胞は、凍結前に適切な緩衝液中で保存される。

いくつかの態様において、抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、ヘパリン、ワルファリン、リバーロキサバン、ダビガトラン、アピキサバン、エドキサバン、エノキサパリン、フォンダパリヌクス、酸性クエン酸デキストロース (ACD-A)、クエン酸ナトリウム、シュウ酸塩、クエン酸リン酸2デキストロース (CP2D)、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたは複数であってよい。

いくつかの態様において、1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC) は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の免疫細胞は、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、骨髄系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個の骨髄系細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好中球、マスト細胞、好塩基球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のB細胞は、プレB細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大型プレB細胞、小型プレB細胞、未熟B細胞、成熟B細胞、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、抗原特異的B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞、アネルギー性AN1/T3細胞集団、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、ドナー対象から単離された1個または複数個のT細胞は、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギーT細胞、寛容T細胞、キメラT細胞、および抗原特異的T細胞、制御性T細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階を、本方法はさらに含む。

いくつかの態様において、凍結保存された細胞を融解した後、免疫細胞を、生存率およびまたは活性化される能力について評価することができる。例えば、リンパ球を、免疫細胞の活性化を誘導する単一の作用物質による刺激または活性化により、活性化について評価することができる。別の態様において、凍結保存された細胞を融解した後、免疫細胞を、2つの作用物質、一次シグナルを誘導する第1のものおよび共刺激シグナルである第2のもので刺激または活性化することができる。単一のシグナルを刺激するか、または一次シグナル、および二次シグナルを刺激するアクセサリー分子を刺激するのに有用なリガンドは、可溶型で使用することができる。リガンドは、細胞の表面に、設計された多価シグナル伝達プラットフォーム (EMSP) に付着させるか、または表面上に固定化することができる。1つの態様では、一次および二次作用物質の両方が、表面、例えばビーズまたは細胞上に同時に固定化される。いくつかの態様において、単一作用物質によって活性化シグナルを提供する分子は、CD3リガンドであってよい。いくつかの態様において、一次活性化シグナルを提供する分子はCD3リガンドであってよく、共刺激分子はCD28リガンドであってよい。

いくつかの態様において、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、細胞活性化、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階を、本方法はさらに含む。

VI. 免疫細胞のバンク化
いくつかの態様において、本開示は、免疫細胞バンクを確立するための方法を対象とする。実施例6（表2および3）によって実証されるように、本技術のMYC融合ポリペプチドに接触させたPBMCは、生存率を失うことなく凍結保存に成功した。これにより、保存してその後に使用することができる免疫細胞の細胞バンクの確立が容易になり、それによって免疫療法のためのロジスティック上の利点が提供され、養子細胞移入のために免疫細胞を容易に利用することが可能になる。

VII. キット
本態様によるキットは、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、シリンジ、またはバッグなどの1個または複数個の容器をその中に密封している、箱、カートン、チューブなどの運搬手段を含み得る。キットはまた、本技術のMYC融合ポリペプチド、MYC融合ポリペプチドで修飾された免疫細胞、および／または凍結組成物を使用するための関連する説明書を含み得る。いくつかの態様において、キットは、MYC融合ポリペプチドで修飾された免疫細胞などの、養子細胞療法の有効量を含む。いくつかの態様において、キットは、投与されたMYC融合ポリペプチドおよび／またはMYC融合ポリペプチドで修飾された免疫細胞を検出するための1つまたは複数の試薬を含む。

本技術を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は決して限定として解釈されるべきではない。本明細書における実施例は、本技術の利点を説明するために、および当業者が本技術の組成物およびシステムを調製または使用することをさらに支援するために提供される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本技術の範囲を限定するものとして、決して解釈されるべきではない。実施例は、上記の本技術の変化形、局面、または態様のいずれかを含むか、または組み込むことができる。上記の変化形、局面、または態様はまた、さらにそれぞれが、本技術のありとあらゆるその他の変化形、局面、または態様の変化形を含むか、または組み込むことができる。

実施例1：材料および方法
末梢血単核細胞 (PBMC) の活性化。 24ウェルプレートを、滅菌DPBS中の抗CD3e抗体（500μL、5μg/mL；BD Biosciences）の溶液でコーティングした。対照ウェルについては、500μLのDPBSのみを添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートした後、溶液を除去した。次いで、各ウェルを2 mLの滅菌DPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を細胞2×10⁶個／mLの濃度で完全RPMI培地 (cRPMI) に再懸濁し、続いて1 mLのDPBSで洗浄した。次に、プレートのレイアウトに従って、1.0 mLの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。次に、抗CD28抗体の溶液（100μL、200μg/mL；BD Biosciences）をcRPMIで調製し、10倍に段階希釈して、cRPMI中のCD28抗体の2つの保存溶液（20μg/mLおよび2μg/mL）を作製した。次に、10μLの適切なCD28抗体溶液またはDPBS（対照もしくは単一活性化細胞）を、指定のウェルに添加した。次いで、アッセイプレートを37℃、5% CO₂で48時間または72時間インキュベートし、その後、適切な抗体（抗ヒトCD25-PE、BD Biosciences）で染色し、FACS解析により活性化を可視化した。

実施例2：TAT-MYCによる処理後の免疫細胞および／またはPBMCの凍結保存の改善
本実施例では、全血試料（450～470 mL）をヒトドナー対象から単離し、血液抗凝固剤であるエチレンジアミン四酢酸（EDTA、約1.5% w/v）と混合した。細胞を約20℃で少なくとも24時間インキュベートした後、次いで、SEPAX-100細胞処理システム（Biosafe America Inc.、Houston, TX）上で密度勾配溶液 (DGS) を用いて、全血試料を末梢血単核細胞 (PBMC) と廃棄物（すなわち、赤血球、血小板、血漿、等）に分離する。PBMCを、細胞分離工程中に、生理食塩水中の2.5% (w/v) HSA（ヒト血清アルブミン）溶液で2回洗浄した。洗浄段階の後、PBMCを細胞13.6×10⁶個／mLの濃度で2.5% (w/v) HSA溶液に再懸濁して、細胞懸濁液を提供した。

細胞分離工程の後、処理前に細胞懸濁液からPBMCの試料を採取し（陰性対照）、細胞懸濁液中の残りの細胞をTAT-MYC融合タンパク質（25μg/mL）で処理し、室温で1時間インキュベートした。次いで、処理されたPBMC（TBX-3400と称される）をSEPAX-100上で再洗浄し、過剰なTAT-MYCを2.5% (w/v) HSA溶液で細胞から洗い流す。最後の洗浄段階の後、TBX-3400を細胞2.7×10⁶個／mLの濃度で2.5% (w/v) HSA溶液に再懸濁した。

TAT-MYCによる細胞処理の後、対照PBMCおよびTBX-3400を遠心分離し、3種類の細胞懸濁培地：CHB培地、CS10培地、またはCS5培地のうちの1つに所定の濃度（細胞／mL）で再懸濁した。CHB培地は、50% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、40% (v/v) RPMI細胞培養液、および10% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む細胞懸濁培地である。CS10培地 (BioLife Solutions, Inc.) は、10% (v/v) DMSOを含む細胞培養液であり、動物成分または血清を本質的に含まない。CS5培地 (BioLife Solutions, Inc.) は、5% (v/v) DMSOを含む細胞培養液であり、動物成分または血清を本質的に含まない。

次いで、再懸濁されたTBX-3400および対照PBMCをバイアルに入れ、2つの方法のうちの1つで低温凍結した。第1の方法では、低温バイアル（対照PBMCまたはTBX-3400を含む）をCoolCell（登録商標）細胞凍結容器 (BioCision) に装填した後、-80℃でインキュベートした。試料を、CoolCell（登録商標）細胞凍結用容器（-1℃／分の冷却速度を提供する）中で、-80℃で24時間インキュベートした。凍結後、次いで、試料を-190℃の液体窒素フリーザーの気相中で保存した。第2の方法では、温度が-80℃に到達するまで-1℃／分の冷却速度を有するVIA Freeze（商標）システム（GE Healthcare Life Sciences、Pittsburgh, PA）に、低温バイアル（対照PBMCまたはTBX-3400を含む）を装填した。凍結後、次いで、試料を-190℃の液体窒素フリーザーの気相中で保存した。

対照PBMC試料は、3種類の培地（CHB培地、CS10培地、および／またはCS5培地）のそれぞれに懸濁し、次いで別々の試料に分割して、CoolCell（登録商標）細胞凍結容器またはVIA Freeze（商標）システムを用いて凍結した。TBX-3400試料は、3種類の培地（CHB培地、CS10培地、および／またはCS5培地）のそれぞれに懸濁し、次いでCoolCell（登録商標）細胞凍結用容器を用いて凍結した。

実施例3：TAT-MYCで処理して凍結保存されたPBMCの融解後の細胞生存率および細胞回収率の改善
本実施例では、対照PBMCおよびTBX-3400の細胞の生存率および回収率をフローサイトメトリーにより決定した。簡潔に説明すると、凍結保存前および凍結保存細胞の融解後に、細胞計数を行った。簡潔に説明すると、凍結および／または凍結保存細胞を、水浴（37℃）またはVia Thawシステム (GE Healthcare Life Sciences) 中で迅速に融解した。次いで、融解された細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移し、細胞懸濁液をcRPMIで一滴ずつ希釈し（浸透圧平衡のため）、次いでcRPMIで最大で約10 mL～約30 mLまでゆっくりと希釈した。次いで、細胞懸濁液を160～400 RCFで10分間、20℃で遠心分離し、10 mLのcRPMIに再懸濁した。次いで、細胞を37℃、5% CO₂で一晩インキュベートした。

細胞生存率を決定するために、細胞1×10⁶個／mLを含む細胞懸濁液の試料をマイクロ遠心チューブに移し、2,000 rpmで5分間ペレット化した。次いで、細胞ペレットをDPBSに再懸濁し、5μLの7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD) を添加した。室温で暗下にて10分間インキュベートした後、試料をフローサイトメトリーにより解析して、凍結保存後の細胞生存率を決定した。図1により、TBX-3400が、PTD-MYC融合ポリペプチドで処理した後、凍結保存後の細胞生存率の有意な上昇を示すことが実証される。

細胞回収率を決定するために、血球計数器を用いて細胞計数を行った。簡潔に説明すると、細胞1×10⁶個／mLを含む細胞懸濁液の試料を、RBC溶解緩衝液で溶解し、室温でインキュベートした。次いで、細胞懸濁液をトリパンブルー染色液と混合し (1:1)、血球計数器を用いて細胞を計数した。図2により、CS5細胞懸濁培地中で凍結保存され、かつCoolCell（登録商標）細胞凍結容器を用いて凍結されたTBX-3400は、生細胞の約95%の回収率を示したのに対して、CHBまたはCS5細胞懸濁培地中で凍結保存されたTBX-3400は、それぞれ約45%および40%の回収率を示したことが示される。

したがって、これらの結果から、本明細書において開示される組成物および方法が、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞生存率の上昇および／または細胞回収率の増加を示すことが実証される。

実施例4：TAT-MYCによる処理後の単離されたPBMCの細胞集団の決定
本実施例では、単離された末梢血単核細胞 (PBMC) の集団を、フローサイトメトリーにより決定した。簡潔に説明すると、少なくとも細胞3×10⁶個／mLを含む細胞懸濁液を、1,600 rpmで5分間遠心分離して、細胞をペレット化した。次いで、細胞をDPBSで1回洗浄し、細胞1×10⁶個／mLの濃度で再懸濁した。次に、新たに調製した1μl/mLのLIVE/DEAD固定可能近赤外死細胞色素を細胞懸濁液に添加した。この色素は、1バイアルのLIVE/DEAD固定可能近赤外死細胞色素（ThermoFisher Scientific、Waltham, MA）に50μLのDMSOを添加することによって調製した。次いで、細胞を室温で暗下にて約30分間インキュベートした。DPBSで1回洗浄した後、細胞を1% BSAまたはDPBSで細胞1×10⁶個／mLの最終濃度に再懸濁した。

さらに、細胞懸濁液を3本の染色チューブに移し、表1に示される適切な抗体で染色した。次いで、染色チューブを室温で暗下にて20分間インキュベートした。インキュベーション後、0.1 mLのOptilyse B (Beckman Coulter) 染色溶液を各チューブに添加した。インキュベーション後、試料をフローサイトメトリーにより解析して、PBMCの集団を決定した（図3）。

（表１）抗体による染色

実施例5：TAT-MYCで処理して凍結保存された免疫細胞および／またはPBMCの融解後の細胞活性化の改善
本実施例では、対照PBMCおよびTBX-3400の細胞活性化を、1つの活性化作用物質または2つの同時活性化作用物質のいずれかを用いて、フローサイトメトリーにより決定した。簡潔に説明すると、凍結保存された対照PBMCまたはTBX-3400細胞を融解した後、細胞を細胞2×10⁶個／mLの濃度でcRPMIに懸濁し、1 mLの細胞懸濁液を、抗CD3抗体でコーティングされた24ウェルプレートに添加した。さらに、cRPMI中のCD28抗体（20μg/mL）10μLを指定のウェルに添加し、その後37℃、5% CO₂で72時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を十分に混合し、CD25-FITC抗体で染色した。インキュベーション後、試料をFACSチューブに移し、フローサイトメトリーにより解析して、CD3単独またはCD3とCD28との組み合わせによる細胞の活性化を決定した（図4）。

さらに、対照PBMCおよびTBX-3400の細胞活性化後のCD25陽性細胞の割合を、1つの活性化作用物質または2つの同時活性化作用物質のいずれかを用いて、フローサイトメトリーにより決定した。CD3および／またはCD28による細胞活性化の後、試料を十分に混合し、CD25-FITC (Beckman Coulter) で染色した。図5は、以前に低温凍結され、その後に融解された対照PBMCおよびTBX-3400の、細胞活性化後の、フローサイトメトリーにより決定されたCD25陽性細胞の割合を示す。

したがって、これらの結果から、本明細書において開示される組成物および方法が、MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞活性化の増加および／または細胞活性化後のCD25の発現の増加を示すことが実証される。

実施例6：TAT-MYCで処理されたPBMCの安定性
本実施例では、TBX-3400の安定性をフローサイトメトリーにより決定した。全有核細胞 (TNC) 数および生存率を、24時間 (24h) から42日 (42d) までの保存時間にわたって≦-70℃または≦-150℃のいずれかで保存した5つの異なるPBMCバッチについて、凍結前／凍結保存前および融解後に測定した。簡潔に説明すると、凍結および／または凍結保存細胞を、水浴（37℃）またはVia Thawシステム (GE Healthcare Life Sciences) 中で迅速に融解した。次いで、融解された細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移し、細胞懸濁液をcRPMIで一滴ずつ希釈し（浸透圧平衡のため）、次いでcRPMIで最大で約10 mL～約30 mLまでゆっくりと希釈した。次いで、細胞懸濁液を160～400 RCFで10分間、20℃で遠心分離し、10 mLのcRPMIに再懸濁した。次いで、細胞を37℃、5% CO₂で一晩インキュベートした。

細胞生存率を決定するために、細胞1×10⁶個／mLを含む細胞懸濁液の試料をマイクロ遠心チューブに移し、2,000 rpmで5分間ペレット化した。次いで、細胞ペレットをDPBSに再懸濁し、5μLの7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD) を添加した。室温で暗下にて10分間インキュベートした後、試料をフローサイトメトリーにより解析して、凍結保存後の細胞生存率を決定した。

細胞計数は、血球計数器を用いて行った。簡潔に説明すると、細胞1×10⁶個／mLを含む細胞懸濁液の試料を、RBC溶解緩衝液で溶解し、室温でインキュベートした。次いで、細胞懸濁液をトリパンブルー染色液と混合し (1:1)、血球計数器を用いて細胞を計数した。

表2に示されるように、本技術のMYC融合ポリペプチドは、PBMCの長期保存のための凍結保護物質として有効であり、また表3に示されるように、MYC融合ポリペプチドは、周囲温度でのPBMCの融解後の安定性を維持する上で有効である。保存期間は、TNCの回収またはTNC生存率に影響を及ぼさなかった（表2）。

（表２）凍結保存されたTBX-3400の安定性

（表３）凍結保存されたTBX-3400の安定性‐周囲温度での融解後の安定性

したがって、これらの結果から、本明細書において開示される組成物が、免疫細胞の長期保存のための方法、および免疫細胞バンク化のための方法において有用であることが実証される。

1つの局面において、本開示は、
(a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと；
(b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む免疫細胞バンクを提供する。
[本発明1001]
(a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと；
(b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む凍結組成物であって、
対象から単離された対照PBMC細胞と比較して、細胞生存率の上昇を示す、前記凍結組成物。
[本発明1002]
タンパク質導入ドメイン配列がTATタンパク質導入ドメイン配列である、本発明1001の凍結組成物。
[本発明1003]
MYC融合ポリペプチドがSEQ ID NO: 1を含む、本発明1001または本発明1002の凍結組成物。
[本発明1004]
1個または複数個の末梢血単核細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1001～1003のいずれかの凍結組成物。
[本発明1005]
細胞懸濁培地をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの凍結組成物。
[本発明1006]
細胞懸濁培地が、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む、本発明1005の凍結組成物。
[本発明1007]
凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、融解した際に細胞回収率の増加を示す、本発明1001～1006のいずれかの凍結組成物。
[本発明1008]
凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、細胞活性化後のCD25の発現の増加を示す、本発明1001～1007のいずれかの凍結組成物。
[本発明1009]
末梢血単核細胞 (PBMC) を凍結保存する方法であって、
(a) ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
(i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階；および
(b) 組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
を含む、前記方法。
[本発明1010]
タンパク質導入ドメイン配列がTATタンパク質導入ドメイン配列である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
MYC融合ポリペプチドがSEQ ID NO: 1を含む、本発明1009または本発明1010の方法。
[本発明1012]
1個または複数個の末梢血単核細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1009～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
PBMCを細胞懸濁培地に懸濁する段階をさらに含む、本発明1009～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
細胞懸濁培地が、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約500μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる、本発明1009～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約10μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる、本発明1009～1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に24時間未満、MYC融合ポリペプチドと接触させる、本発明1009～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に約1時間、MYC融合ポリペプチドと接触させる、本発明1009～1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
PBMCを、段階 (a) の後かつ段階 (b) の前に洗浄する、本発明1009～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
速度制御された低温フリーザーを使用して、PBMCを冷却する、本発明1009～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
1分当たり約-1℃の速度でPBMCを冷却する、本発明1009～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
組成物を凍結させるのに十分な温度が、約-80℃～約-190℃である、本発明1009～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、細胞活性化、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階をさらに含む、本発明1009～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
(a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
を含むMYC融合ポリペプチドと；
(b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
を含む免疫細胞バンク。
[本発明1025]
本発明1001～1008のいずれかの凍結組成物を含む免疫細胞バンク。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) タンパク質導入ドメイン；(b) MYCポリペプチド配列；(c) 6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) ；(d) V5エピトープタグ；および (e) 任意にリンカーを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、式（VII～XIV）：
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列‐X‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (VII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐X‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (VIII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐6-ヒスチジンタグ‐X‐V5エピトープタグ（式 (IX)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐6-ヒスチジンタグ‐V5エピトープタグ（式 (X)）、
タンパク質導入ドメイン‐X‐MYCポリペプチド配列‐X‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XI)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐X‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐V5エピトープタグ‐X‐6-ヒスチジンタグ（式 (XIII)）、または
タンパク質導入ドメイン‐MYCポリペプチド配列‐V5エピトープタグ‐6-ヒスチジンタグ（式 (XIV)）
のポリペプチドであり、式中、‐X‐はリンカーである。いくつかの態様において、‐X‐は1個または複数個のアミノ酸である。

上記のように、いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は1つまたは複数のリンカー配列を含む。リンカー配列は、融合タンパク質のタンパク質導入ドメイン、MYCポリペプチド配列、V5エピトープタグ、および／または6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) を連結するために用いることができる。いくつかの態様において、リンカーは1個または複数個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーのアミノ酸配列はKGELNSKLE (SEQ ID NO:12) を含む。いくつかの態様において、リンカーはRTGのアミノ酸配列を含む。

本技術のMYC融合タンパク質は、任意の所望の順序で配置することができる。例えば、いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、(a) MYCポリペプチドにインフレームで連結されたタンパク質導入ドメイン、(b) V5ドメインにインフレームで連結されたMYCポリペプチド、および c) 6ヒスチジンエピトープタグ (SEQ ID NO:8) にインフレームで連結されたV5ドメインの順序で配置することができる。いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、(a) タンパク質導入ドメインにインフレームで連結されたMYCポリペプチド、(b) V5ドメインにインフレームで連結されたタンパク質導入ドメイン、および c) 6ヒスチジンエピトープタグ (SEQ ID NO:8) にインフレームで連結されたV5ドメインという成分の順序を有する。いくつかの態様においては、1つまたは複数の付加的なアミノ酸配列またはリンカーが、配列のそれぞれの間に含まれ得る。いくつかの態様において、付加的なアミノ酸は、ポリペプチド配列の最初および／または最後に含まれ得る。

タンパク質タグドメイン
いくつかの態様において、MYC融合タンパク質は、融合タンパク質の精製を容易にする1つまたは複数のアミノ酸配列を含むタンパク質タグドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、ポリヒスチジンタグおよびエピトープタグのうちの1つまたは複数を含む。例として、しかし非限定的に、例示的なタグには、V5、ヒスチジンタグ（例えば、6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) ）、HA（赤血球凝集素）タグ、FLAGタグ、CBP（カルモジュリン結合ペプチド）、CYD（共有結合性であるが解離可能なNorpDペプチド）、Strepll、またはHPC（プロテインCの重鎖）のうちの1つまたは複数が含まれる。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは約10～約20アミノ酸長を含む。いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、2アミノ酸長～40アミノ酸長、例えば6～20アミノ酸長を含む。いくつかの態様において、いくつかの態様において、タンパク質タグドメインは、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、21アミノ酸、22アミノ酸、23アミノ酸、24アミノ酸、25アミノ酸、26アミノ酸、27アミノ酸、28アミノ酸、29アミノ酸、30アミノ酸、31アミノ酸、32アミノ酸、33アミノ酸、34アミノ酸、35アミノ酸、36アミノ酸、37アミノ酸、38アミノ酸、39アミノ酸、または40アミノ酸を含む。いくつかの態様においては、上記の列挙されたタグのうちの2つ（例えば、V5およびHISタグ）が、タンパク質タグドメインを形成するために共に使用される。

いくつかの態様において、ヒスチジンタグは6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) である。いくつかの態様において、ヒスチジンタグは配列HHHHHH (SEQ ID NO:8) を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ペプチドは、V5エピトープタグを含む。いくつかの態様において、V5タグはGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:9) のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、V5タグはIPNPLLGLD (SEQ ID NO:10) のアミノ酸配列を含む。

PTD-MYC融合ポリペプチドの構築
本明細書において開示されるPTD-MYC融合ポリペプチド（例えば、TAT-MYC融合ポリペプチド）は、当技術分野において周知の方法によって構築することができる。例として、しかし非限定的に、TAT-MYC融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、PCRによって作製することができる。いくつかの態様において、ヒトMYC配列のフォワードプライマーは、TATタンパク質導入ドメインのインフレームのN末端9アミノ酸配列（例えば、RKKRRQRRR (SEQ ID NO:13) ）を含む。いくつかの態様において、ヒトMYC配列のリバースプライマーは、終止コドンを除去するように設計される。いくつかの態様において、PCR産物は、任意の適切な発現ベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、発現ベクターはポリヒスチジンタグおよびV5タグを含む。

いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[48-57]、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、(a) TAT_[57-48]、(b) c-MYC、(c) リンカー、(d) V5タグ、および (e) 6-ヒスチジンタグ (SEQ ID NO:8) を含む。

次いで、可溶化されたタンパク質を精製する。精製方法には、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および同様のものが含まれ得る。いくつかの態様においては、アフィニティークロマトグラフィーが使用される。例えば、タンパク質には、簡便な精製のためにエピトープタグまたはヒスチジン6タグ (SEQ ID NO:8) が提供される。本方法において、例示的なPTD-MYC融合ポリペプチドは、Ni樹脂を用いたNiアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製のために、ヒスチジン6タグ (SEQ ID NO:8) を含む。

Claims (25)

1. (a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
   を含むMYC融合ポリペプチドと；
   (b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
   を含む凍結組成物であって、
   対象から単離された対照PBMC細胞と比較して、細胞生存率の上昇を示す、前記凍結組成物。
2. タンパク質導入ドメイン配列がTATタンパク質導入ドメイン配列である、請求項1に記載の凍結組成物。
3. MYC融合ポリペプチドがSEQ ID NO: 1を含む、請求項1または請求項2に記載の凍結組成物。
4. 1個または複数個の末梢血単核細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の凍結組成物。
5. 細胞懸濁培地をさらに含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の凍結組成物。
6. 細胞懸濁培地が、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む、請求項5に記載の凍結組成物。
7. 凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、融解した際に細胞回収率の増加を示す、請求項1～6のいずれか一項に記載の凍結組成物。
8. 凍結融解サイクル後のMYC融合ポリペプチドの非存在下での対照PBMCと比較して、細胞活性化後のCD25の発現の増加を示す、請求項1～7のいずれか一項に記載の凍結組成物。
9. 末梢血単核細胞 (PBMC) を凍結保存する方法であって、
   (a) ドナー対象から単離された1個または複数個のPBMCを含む組成物を、
   (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
   を含むMYC融合ポリペプチドの有効量と接触させる段階；および
   (b) 組成物を凍結させるのに十分な温度までPBMCを冷却する段階
   を含む、前記方法。
10. タンパク質導入ドメイン配列がTATタンパク質導入ドメイン配列である、請求項9に記載の方法。
11. MYC融合ポリペプチドがSEQ ID NO: 1を含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
12. 1個または複数個の末梢血単核細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、顆粒球、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項9～11のいずれか一項に記載の方法。
13. PBMCを細胞懸濁培地に懸濁する段階をさらに含む、請求項9～12のいずれか一項に記載の方法。
14. 細胞懸濁培地が、CHB培地、CS5培地、またはCS10培地を含む、請求項13に記載の方法。
15. 1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約500μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる、請求項9～14のいずれか一項に記載の方法。
16. 1個または複数個のPBMCを含む組成物を、約0.5μg/mL～約10μg/mLの濃度のMYC融合ポリペプチドと接触させる、請求項9～14のいずれか一項に記載の方法。
17. 1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に24時間未満、MYC融合ポリペプチドと接触させる、請求項9～16のいずれか一項に記載の方法。
18. 1個または複数個のPBMCを含む組成物を、段階 (b) の前に約1時間、MYC融合ポリペプチドと接触させる、請求項9～16のいずれか一項に記載の方法。
19. PBMCを、段階 (a) の後かつ段階 (b) の前に洗浄する、請求項9～18のいずれか一項に記載の方法。
20. 速度制御された低温フリーザーを使用して、PBMCを冷却する、請求項9～19のいずれか一項に記載の方法。
21. 1分当たり約-1℃の速度でPBMCを冷却する、請求項9～20のいずれか一項に記載の方法。
22. 組成物を凍結させるのに十分な温度が、約-80℃～約-190℃である、請求項9～21のいずれか一項に記載の方法。
23. MYC融合ポリペプチドの有効量と接触していない対照PBMCと比較して、細胞が、細胞生存率の上昇、細胞回収率の増加、細胞活性化、または細胞活性化後のCD25の発現の増加のうちの1つまたは複数を示すように、凍結保存された細胞を融解する段階をさらに含む、請求項9～22のいずれか一項に記載の方法。
24. (a) (i) タンパク質導入ドメイン；(ii) MYCポリペプチド配列
    を含むMYC融合ポリペプチドと；
    (b) ドナー対象から単離された1個または複数個の末梢血単核細胞 (PBMC)と
    を含む免疫細胞バンク。
25. 請求項1～8のいずれか一項に記載の凍結組成物を含む免疫細胞バンク。

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