KR20200140878A

KR20200140878A - 성장 분화 인자 15 융합 단백질

Info

Publication number: KR20200140878A
Application number: KR1020207032157A
Authority: KR
Inventors: 유메이 시옹; 케네스 윌리엄 워커; 엘리슨 무리엘르 마리 베니안트
Original assignee: 암젠 인크
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2020-12-16
Also published as: WO2019199685A1; MX2020010659A; SG11202009884YA; TW202003586A; AR114476A1; US20220017584A1; JP2022095856A; EP3773656A1; JP2020533271A; CN111954537A; US11161889B2; CA3096097A1; BR112020020823A2; UY38177A; US20210147500A1; IL277842A; MA52205A; CR20200510A; JP7058670B2; EA202092419A1

Abstract

본 명세서에서는 GDF15 분자가 제공된다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 GDF15 영역이 Fc 영역에 융합된 GDF15-Fc 융합체이다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 링커를 통해 Fc 영역에 융합된다. 또한 본 명세서에서는 GDF15 분자의 제조 및 이용 방법이 제공된다.

Description

성장 분화 인자 15 융합 단백질

관련 출원

본 출원은 2018년 4월 9일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/655,108호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

서열목록

본 출원은 전자적 형식의 서열 목록과 함께 출원 중이다. 서열 목록은 파일명 "A-2239-WO-PCT_SeqList_ST25.txt"로서 제공되며, 2019년 3월 15일자로 생성되었고, 용량은 109 kb이다. 전자적 형식의 서열 목록에서의 정보는 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 GDF15 분자, 예컨대, GDF15 융합 단백질, 이의 조성물, 및 이러한 단백질의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.

대식세포 저해 사이토카인 1(MIC1)(Bootcov MR, 1997, Proc Natl Acad Sci 94:11514-9), 태반 골 형태형성 인자(PLAB)(Hromas R 1997, Biochim Biophys Acta. 1354:40-4), 태반 형질전환 성장인자 베타(PTGFB)(Lawton LN 1997, Gene. 203:17-26), 전립선 유래 인자(PDF)(Paralkar VM 1998, J Biol Chem. 273:13760-7) 및 비스테로이드성 항염증 약물-활성화 유전자(NAG-1)(Baek SJ 2001, J Biol Chem. 276: 33384-92)로도 지칭되는 성장 분화 인자 15(GDF15)는 대략 25 kDa의 동형이량체로서 혈장에서 순환하는 분비된 단백질이다. GDF15는 고친화도로 GDNF 패밀리 수용체 α유사(GFRAL)에 결합한다. GDF15-유도 세포 신호전달은 GFRAL과 공수용체 RET의 상호작용을 필요로 하는 것으로 여겨진다.

GDF15는 다중 생물학적 활성과 연관되었다. 상승된 GDF15는 체중감소와 상호 연관되는 것으로 나타났고, GDF15의 투여는 식품 섭취 및 체중을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 치료제로서 투여될 수 있는 효능있는 GDF15 분자에 대한 필요가 있다. 본 개시내용은 이런 필요를 충족시키며 관련된 이점을 제공하는 GDF15 분자를 제공한다.

본 명세서에서 GDF15 분자, 분자의 제조 방법 및 분자의 이용 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 GDF15-Fc 융합 단백질이다. 융합 단백질은 Fc 영역에 결합된 GDF15 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 링커를 통해 Fc에 결합된다.

일부 실시형태에서, GDF15 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열 및 적어도 하나의 돌연변이, 예컨대, 3번 위치에서의 아스파라긴의 돌연변이(N3), 5번 위치에서의 아스파르테이트의 돌연변이(D5), 또는 3번 위치에서의 아스파라긴 및 5번 위치에서의 아스파르테이트의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 5번 위치에서의 아스파르테이트의 글루탐산으로의 돌연변이(D5E)를 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은, 예를 들어, 아미노산 서열 서열번호 14를 갖는 3번 위치에서의 아스파라긴의 글루타민으로의 돌연변이(N3Q)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, GDF15 영역은 N3Q와 D5E 돌연변이를 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질은 G4S(서열번호 19) 또는 G4Q(서열번호 24) 링커, 예컨대, (G4S)n 또는 (G4Q)n 링커인 링커를 갖되, n은 0 초과이다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 G4A(서열번호 58) 링커, 예컨대, (G4A)n 링커인 링커를 갖되, n은 0 초과이다. 일부 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, n은 2 초과, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 실시형태에서, 링커는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 58의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질은 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 가진다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 절단된 힌지 영역을 가진다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 표 3으로부터 선택된다.

또한 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 포함하는 이량체 및 사량체가 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 이량체는 서열번호 39 내지 57 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는, 예컨대, 표 6에 나타낸 서열번호 32, 33, 34, 35, 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인과 이량체화한다. 일부 실시형태에서, 이량체는 사량체를 형성한다. 본 명세서에 개시된 GDF15 분자를 생산하고 이용하는 방법이 또한 제공된다.

도 1은 6주 동안 매주 비히클, 3 ㎎/㎏의 양성 대조군 FGF21-Fc, 1.5 ㎎/㎏의 scFc-GDF15, 또는 1.5 ㎎/㎏의 이량체 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K)를 투약한 후에, 5주 약효세척한 사이노몰거스 원숭이의 체중에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 6주 동안 매주 비히클, 3 ㎎/㎏의 양성 대조군 FGF21-Fc, 1.5 ㎎/㎏의 scFc-GDF15, 또는 1.5 ㎎/㎏의 이량체 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K)를 투약한 후에, 5주 약효세척한 사이노몰거스 원숭이의 트리글리세리드 수준에 대한 효과를 나타내는 플롯이다.
도 3은 양이온 교환 후 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15의 프로파일을 나타낸다.
도 4는 FcΔ10(+)-(G4)-GDF15의 펩티드 맵이다.
도 5는 이량체 FcΔ10(-)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K)(서열번호 41 및 32); FcΔ10(-)-GDF15(N3D):FcΔ10(+,K)(서열번호 42 및 32); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K,CC)(서열번호 43 및 34); FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D):FcΔ10(+,K,CC)(서열번호 44 및 34)) 및 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K)(서열번호 39 및 32)의 용량의 함수로서 마우스에서의 식품 섭취에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 마우스에서 시간의 함수로서 FcΔ10(-)-GDF15(Δ3)(서열번호 41); FcΔ10(-)-GDF15(N3D)(서열번호 42); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3)(서열번호 43); 및 FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D)(서열번호 44))의 혈청 농도 그래프이다.
도 7은 4주마다 매주 비히클, 3 ㎎/㎏의 양성 대조군 FGF21-Fc, 0.5 ㎎/㎏ 또는 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E):FcΔ16(+,K,CC)(서열번호 45 및 35), 0.5 ㎎/㎏ 또는 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K,CC))(서열번호 46 및 35) 또는 0.5 ㎎/㎏ 또는 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K)(서열번호 47 및 36)을 투약하고, 4주 약효세척한 사이노몰거스 원숭이의 체중에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 2주 동안 매주 비히클, 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K)(서열번호 39 및 32), 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q):FcΔ16(+,K)(서열번호 49 및 36); 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K)(서열번호 50 및 36), 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K)(서열번호 54 및 36), 또는 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ10(+,K,L234A/L235A)(서열번호 57 및 37)을 투약한 사이노몰거스 원숭이의 체중에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K)(서열번호 50 및 36)를 투여한 ob/ob 마우스에서 용량의 함수로서 식품 섭취의 그래프이다.
도 10은 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ10(+,K,L234A/L235A)(서열번호 57 및 37)을 투여한 ob/ob 마우스에서 용량의 함수로서 식품 섭취 그래프이다.

일부 실시형태에서, GDF15 영역은 야생형 GDF15를 포함한다. 인간과 뮤린 GDF15는 둘 다 신호 펩티드 및 프로도메인을 가진다. 전장 인간 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

전장 인간 GDF15에 대한 아미노산 서열(308 아미노산)은 하기와 같다:

신호 서열이 없는 인간 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

29개의 아미노산 신호 서열이 없는 인간 GDF15에 대한 아미노산 서열(279 아미노산)은 하기와 같다:

신호 펩티드 또는 프로도메인이 없는 인간 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

신호 펩티드 또는 프로-도메인(112개 아미노산의 GDF15의 활성 도메인)이 없는 인간 GDF15에 대한 아미노산 서열은 하기와 같다:

전장 뮤린 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

전장 뮤린 GDF15에 대한 아미노산 서열(303개의 아미노산)은 하기와 같다:

신호 서열이 없는 뮤린 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

32개의 아미노산 신호 서열이 없는 뮤린 GDF15에 대한 아미노산 서열(271 아미노산)은 하기와 같다:

신호 서열 또는 프로 도메인이 없는 뮤린 GDF15에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

신호 펩티드 또는 프로도메인(115개의 아미노산의 활성 도메인)이 없는 뮤린 GDF15에 대한 아미노산 서열은 하기와 같다:

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 GDF15, 예를 들어, 신호 펩티드 또는 프로-도메인이 없는 GDF15의 활성 도메인을 포함하는 GDF15 영역을 포함한다. 일부 양태에서, GDF15 영역은 서열번호 6 또는 12의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, GDF15의 활성 도메인에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 GDF15 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 GDF15의 활성을 감소시키거나 제거하지 않는다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 인간 GDF15의 활성 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 처음 3개의 아미노산이 제거된 인간 GDF15의 활성 도메인인 "GDF15(Δ3)"과 같은 활성 도메인의 처음 3개의 아미노산의 결실이다(즉, 서열번호 13).

일부 실시형태에서, GDF15 영역은 인간 GDF15의 활성 도메인의 3번 위치에 아스파라긴의 돌연변이(N3)를 포함한다(서열번호 6). N3 돌연변이는 GDF15 아미노산 서열에서 서열번호 6의 3번 위치에서의 아스파라긴 잔기의 돌연변이 또는 서열번호 6의 3번 위치에서의 아스파라긴에 대응하는 아스파라긴 잔기의 돌연변이를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3번 위치에서의 아스파라긴은 글루타민(N3Q) 또는 아스파르테이트(N3D)로 돌연변이된다. 따라서, 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 GDF15(N3Q)의 GDF15 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 GDF15(N3D)의 GDF15 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 영역은 인간 GDF15의 활성 도메인의 5번 위치에서의 아스파르테이트의 돌연변이(D5)를 포함한다(서열번호 6). D5 돌연변이는 GDF15 아미노산 서열에서 서열번호 6의 5번 위치에서의 아스파르테이트 잔기의 돌연변이 또는 서열번호 6의 5번 위치에서의 아스파르테이트에 대응하는 아스파르테이트 잔기의 돌연변이를 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 5번 위치에서의 아스파르테이트는 글루타메이트로 돌연변이된다(D5E). 따라서, 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 GDF15(D5E)의 GDF15 영역을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, GDF15 영역은 돌연변이의 조합, 예컨대, Δ3과 D5 돌연변이의 조합, 예를 들어, GDF15(Δ3/D5E)(서열번호 17) 또는 N3과 D5 돌연변이의 조합, 예를 들어, GDF15(N3D/D5E) 또는 GDF15(N3Q/D5E)를 포함한다. GDF15 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.

표 1은 GDF15 분자에서 사용될 수 있는 GDF15 영역의 예를 제공한다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 Fc에 직접 융합된다. 다른 실시형태에서, Fc는 링커를 통해 GDF15 분자에 융합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 G4S(서열번호 19) 링커를 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 G4Q(서열번호 24) 링커를 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 G4A(서열번호 58) 링커를 포함한다. 링커는 (G4S)n 또는 (G4Q)n 링커일 수 있되, n은 0 초과이다. 링커는 (G4A)n 링커일 수 있되, n은 0 초과이다. 일부 실시형태에서, n은 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, n은 2 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 실시형태에서, 링커는 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 58의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역은 항체 중쇄의 Fc 도메인을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 하전된 쌍 돌연변이, 글리코실화 부위에서의 돌연변이 또는 비천연 아미노산의 포함과 같은 돌연변이를 갖는 Fc 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 IgG 불변 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 IgA, IgD, IgE 및 IgM 중쇄의 불변 도메인을 포함한다.

일부 실시형태에서, Fc 영역은 하전된 쌍 돌연변이를 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 하전된 Fc 영역을 초래하는 돌연변이를 도입함으로써, GDF15 분자는 반대 전하를 갖는 대응하는 Fc 분자와 이량체화할 수 있다. 예를 들어, 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K, 356은 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급한 바와 같은 위치에 대응함) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K, 399는 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급된 바와 같은 위치에 대응함)는 선택적으로 링커를 통해 GDF15 영역에 결합된 Fc 영역에 도입되어, GDF15 분자에 대해 양으로 하전된 Fc 영역을 초래할 수 있다. 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D; 여기서 392 및 409는 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급한 바와 같은 위치에 대응함)는 별개 분자의 Fc 도메인에 도입되어, 음으로 하전된 Fc 분자를 초래할 수 있다. 음으로 하전된 Fc 분자에서 아스파르테이트 잔기는 정전기력을 통해 GDF15 분자의 양으로 하전된 Fc 영역의 리신 잔기와 결합되어, GDF15 분자의 Fc 영역과 Fc 분자 사이의 Fc 이형이량체 형성을 용이하게 하는 한편, GDF15 분자의 Fc 영역 사이 또는 Fc 분자 사이의 Fc 동형이량체 형성을 감소시키거나 방지할 수 있다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D)는 선택적으로 링커를 통해 GDF15 영역에 결합된 Fc 영역에 도입되고, 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K)는 다른 분자의 Fc 도메인에 도입된다. GDF15 분자의 Fc 영역 내 아스파르테이트 잔기는 정전기력을 통해 Fc 분자의 리신 잔기와 결합되어, GDF15 분자의 Fc 영역과 Fc 분자 사이의 Fc 이형이량체의 형성을 용이하게 하고, GDF15 분자의 Fc 영역 사이 또는 Fc 분자 사이의 Fc 동형이량체 형성을 감소시키거나 방지할 수 있다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 힌지 영역이 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 힌지 내 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지로부터 10개의 아미노산이 결실된다, 예를 들어, FcΔ10. 다른 실시형태에서, 힌지로부터 16개의 아미노산이 결실된다, 예를 들어, FcΔ16. 일부 실시형태에서, Fc 도메인이 양으로 또는 음으로 하전되도록, Fc 도메인은 힌지 결실(예를 들어, FcΔ10 또는 FcΔ16) 및 하전 쌍 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 힌지 내 10개의 아미노산 결실 및 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D), 예컨대, FcΔ10(-)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 힌지 내 10개 아미노산 결실 및 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K), 예컨대, FcΔ10(+)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 힌지 내 16개의 아미노산 결실 및 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D), 예컨대, FcΔ16(-)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 힌지 내 16개 아미노산 결실 및 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K), 예컨대, FcΔ16(+)을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 힌지 결실 및 하전 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 분자는 이러한 GDF15 분자와 이형이량체화한다. 예를 들어, Fc 분자는 힌지 결실 및 힌지 결실을 보완하는 하전 쌍 돌연변이 및 GDF15 분자의 Fc 영역의 하전 쌍 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어, Fc 분자는 힌지 내 10개 아미노산 결실 및 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D), 예컨대, C-말단의 리신을 선택적으로 포함할 수 있는 FcΔ10(-)(예를 들어, FcΔ10(-, K))을 갖는 Fc 도메인을 포함할 수 있다. Fc 분자는 FcΔ10(+)을 포함하는 GDF15 분자와 이형이량체화할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 분자는 힌지 내 10개 아미노산 결실 및 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K), 예컨대, 선택적으로 C-말단의 리신을 포함할 수 있는 FcΔ10(+)(예를 들어, FcΔ10(+, K))을 포함할 수 있다. Fc 분자는 FcΔ10(-)을 포함하는 GDF15 분자와 이형이량체화할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 분자는 힌지 내 16개의 아미노산 결실 및 리신의 아스파르테이트로의 돌연변이(K392D, K409D), 예컨대, 선택적으로 C-말단의 리신을 포함할 수 있는 FcΔ16(-)(예를 들어, FcΔ16(-, K))을 포함할 수 있다. Fc 분자는 FcΔ16(+)을 포함하는 GDF15 분자와 이형이량체화할 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 분자는 힌지 내 16개 아미노산 결실 및 아스파르테이트의 리신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루타메이트의 리신으로의 돌연변이(D399K), 예컨대, 선택적으로 C-말단의 리신을 포함할 수 있는 FcΔ16(+)(예를 들어, FcΔ16(-, K))을 포함할 수 있다. Fc 분자는 FcΔ16(-)을 포함하는 GDF15 분자와 이형이량체화할 수 있다.

일부 실시형태에서, Fc 영역 또는 Fc 분자는 L234A 및/또는 L235A 돌연변이를 갖는 Fc 도메인을 포함하되, 234 및 235는 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급한 바와 같은 위치에 대응한다. Fc 도메인은 L234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 하전 쌍 돌연변이, 힌지 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A 돌연변이와 L235A 돌연변이를 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 힌지 결실, L234A 돌연변이, L235A 돌연변이 및 하전 쌍 돌연변이, 예컨대, FcΔ10(+, L234A/L235A), FcΔ10(-, L234A/L235A), FcΔ16(+, L234A/L235A) 또는 FcΔ16(-, L234A/L235A)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 선택적인 C-말단의 리신, 예를 들어, FcΔ10(+,K,L234A/L235A), FcΔ10(-,K,L234A/L235A), FcΔ16(+,K,L234A/L235A) 또는 FcΔ16(-,K,L234A/L235A)을 포함한다.

일부 실시형태에서, Fc 영역 또는 Fc 분자는 "시스테인 클램프(cysteine clamp)"를 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 시스테인 클램프 돌연변이는, 또한 돌연변이를 통해 특정 위치에 도입된 시스테인을 갖는 다른 Fc 도메인과 함께 인큐베이션될 때, 이황화 결합(시스테인 클램프)이 두 Fc 도메인 사이에(예를 들어, "시스테인 클램프" 돌연변이를 갖는 FcΔ16(+) 도메인과 "시스테인 클램프" 돌연변이를 갖는 FcΔ16(-) 도메인 사이에) 형성될 수 있도록, 돌연변이를 통해 특정 위치에서 Fc 도메인 내로 시스테인의 도입을 수반한다. 시스테인은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 하나 이상의 이러한 시스테인 클램프 돌연변이를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 시스테인 클램프는 세린의 시스테인으로의 돌연변이(S354C, 354는 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급한 바와 같은 위치에 대응함)를 제1 Fc 도메인에 도입함으로써 그리고 타이로신의 시스테인으로의 돌연변이(Y349C, 여기서 349는 EU 넘버링을 이용하는 위치이며, 표 3 내지 5에 언급한 바와 같은 위치에 대응함)를 제2 Fc 도메인 내로 도입함으로써 제공된다. 일 실시형태에서, GDF15 분자는 시스테인 클램프, 음으로 하전된 쌍 돌연변이 및 16-아미노산 힌지 결실을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역(예를 들어, GDF15- FcΔ16(-,CC)), 및 시스테인 클램프, 양으로 하전된 쌍 돌연변이 및 16-아미노산 힌지 결실, 및 선택적인 C-말단의 리신을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 Fc 분자(예를 들어, FcΔ16(+,K,CC))를 포함한다. 시스테인 클램프는 Fc 분자와 GDF-Fc 분자의 이형이량체화를 증가시킬 수 있다.

GDF15 분자에서 사용될 수 있는 Fc 영역의 예는 표 3에 나타낸다.

Fc 분자의 예는 표 4에 나타내며, 이때 C-말단의 리신은 선택적이다.

Fc 분자는 상보성 Fc 도메인을 포함하는 분자와 이량체화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, FcΔ10(+,K)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대, FcΔ10(-)(예를 들어, FcΔ10(-)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다. FcΔ10(-,K)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대 FcΔ10(+)(예를 들어, FcΔ10(+)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다.

FcΔ10(+,K,CC)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대, FcΔ10(-,CC)(예를 들어, FcΔ10(-, CC)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다. FcΔ16(+,K,CC)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대, FcΔ16(-, CC)(예를 들어, FcΔ16(-, CC)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다. FcΔ16(+,K)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대, FcΔ16(-)(예를 들어, FcΔ16(+)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다. FcΔ10(+,K,L234A/L235A)의 Fc 분자는 10-아미노산 힌지 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 분자, 예컨대, FcΔ10(-,L234A/L235A)(예를 들어, FcΔ10(-, L234A/L235A)의 Fc 영역을 포함하는 GDF15 분자)와 이량체화할 수 있다.

GDF15-Fc 융합 단백질인 GDF15 분자의 예는 표 5에 나타낸다.

일부 실시형태에서, 융합 단백질은 GDF15 영역이 2개의 Fc 영역에 결합되는 scFc-GDF15이다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 38에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 비교 중인 서열은 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 백분율을 결정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지인데, 이는 GAP을 포함한다(Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; 미국 위스콘신주 메디슨에 소재한 위스콘신 유니버시티의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 백분율이 결정되는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하기 위해 사용될 수 있다. 서열은 그들의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드에 대한 최적의 매칭(알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "매칭된 범위")을 위해 정렬된다. 갭 오프닝 페널티(3x 평균 대각선으로서 계산하되, "평균 대각선"은 사용 중인 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치로 부여된 스코어 또는 수임) 및 갭 익스텐션 페널티(보통 갭 오프닝 페널티의 1/10배)뿐만 아니라 비교 매트릭스, 예컨대 PAM 250 또는 BLOSUM 62가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 실시형태에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스에 대해 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대해 문헌[Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 9:10915-10919] 참조)는 또한 알고리즘에 의해 사용된다. GAP 프로그램을 이용하여 동일성 백분율을 결정하기 위해 사용될 수 있는 파라미터는 다음과 같다:

알고리즘: 문헌[Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];

비교 매트릭스: 문헌[Henikoff et al., 1992, 상기 참조]으로부터의 BLOSUM 62;

갭 페널티: 12(그러나 말단 갭에 대해 페널티 없음)

갭 길이 페널티: 4

유사성 역치: 0

두 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 두 서열의 짧은 영역만의 매칭을 초래할 수 있고, 이 작은 정렬 영역은 2개의 전장 서열 사이에 유의미한 관계가 없다고 해도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 표적 폴리펩티드의 적어도 50개의 인접한 아미노산에 걸쳐 있는 정렬을 초래하는 것이 요망된다면 선택된 정렬 방법(예를 들어, GAP 프로그램)은 조정될 수 있다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15, FcΔ10(+)-(G4)-GDF15, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-)-GDF15(N3D), FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D), FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E), FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15, FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q), FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q) 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)이다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99% 또는 95 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15, FcΔ10(+)-(G4)-GDF15, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-)-GDF15(N3D), FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D), FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E), FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15, FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q), FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q) 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자이다. 일부 실시형태에서, GDF15 분자는 Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99% 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15, FcΔ10(+)-(G4)-GDF15, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-)-GDF15(N3D), FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D), FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E), FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15, FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q), FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자이다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자는 Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15, FcΔ10(+)-(G4)-GDF15, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-)-GDF15(N3D), FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3), FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D), FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E), FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15, FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q), FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E), FcΔ16(-)-GDF15(N3Q), FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q), 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자이다. 예를 들어, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99% 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15 분자는 힌지 영역의 10-아미노산 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 갖고, 서열번호 26에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 6에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99% 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는, GDF15 분자를 포함한다. 예를 들어, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15 분자는 힌지 영역의 10-아미노산 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 갖고, 서열번호 26에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 6에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는 GDF15 분자를 포함한다.

다른 예에서, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자는 서열번호 30에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 힌지 영역의 16-아미노산 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 18에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는 GDF15 분자를 포함한다. 다른 예에서, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자는 서열번호 30에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 힌지 영역의 16-아미노산 결실 및 음으로 하전된 쌍 돌연변이를 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 18에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는 GDF15 분자를 포함한다.

또 다른 예에서, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자는 힌지 영역의 10-아미노산 결실, 음으로 하전된 쌍 돌연변이 및 234 및 235번 위치에서의 류신의 알라인으로의 돌연변이를 갖고 서열번호 31에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 18에 대해 80 내지 99%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99% 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는 GDF15 분자를 포함한다. 또 다른 예에서, Fc 영역 및/또는 GDF15 영역에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 분자는 힌지 영역의 10-아미노산 결실, 음으로 하전된 쌍 돌연변이 및 234 및 235번 위치에서의 류신의 알라닌으로의 돌연변이를 갖고 서열번호 31에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 및/또는 서열번호 18에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 GDF15 영역을 갖는, GDF15 분자를 포함한다.

또한 본 명세서에서 본 명세서에 제공된 GDF15 분자를 포함하는 이량체 및 사량체가 제공된다. 일 실시형태에서, 이량체는 서열번호 39 내지 57 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는, 예컨대, 표 6에 나타낸 서열번호 32, 33, 34, 35, 36 또는 37의 아미노산 서열(이때 C-말단의 리신은 선택적임)을 포함하는 Fc 도메인과 이량체화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이량체는 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15: FcΔ10(+,K)이다. 다른 실시형태에서, 이량체는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q): FcΔ10(+,K,L234A/L235A)이다. 또 다른 실시형태에서, 이량체는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q):FcΔ10(+,K,L234A/L235A)이다.

일 실시형태에서, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 32(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 33(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 32(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 32(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 34(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 34(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 34(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 35(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 35(C-말단의 리신은 선택적)를 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 36(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 37(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다. 다른 실시형태에서, 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15-Fc 융합체는 서열번호 37(C-말단의 리신은 선택적)을 포함하는 Fc 분자와 이량체화한다.

일부 실시형태에서, 이량체는 사량체를 형성한다. 예를 들어, 표 6에서 이량체는 사량체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사량체는 동일한 이량체로부터 형성된다. 일부 실시형태에서, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K); FcΔ10(+)-(G4)-GDF15:FcΔ10(-,K); FcΔ10(-)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K); FcΔ10(-)-GDF15(N3D):FcΔ10(+,K); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K,CC); FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D):FcΔ10(+,K,CC); FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E):FcΔ16(+,K,CC); FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K,CC); FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15:FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-G4S- GDF15(N3Q):FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E): FcΔ16(+,K); FcΔ16(-)-GDF15(N3Q): FcΔ16(+,K); FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q):FcΔ10(+,K,L234A/L235A); 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4- GDF15(N3Q/D5E):FcΔ10(+,K,L234A/L235A)의 두 이량체는, 예컨대, 두 GDF15 영역의 이량체화를 통해 사량체를 형성한다.

또한 본 명세서에서 본 명세서에 개시된 GDF15 및 Fc 분자를 생산하는 핵산 및 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 벡터 또는 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합되는데, 다른 실시형태에서 벡터 또는 핵산은 염색체 밖이다.

이러한 핵산, 벡터 또는 이들 중 하나 또는 둘 다의 조합을 포함하는 재조합 세포, 예컨대 효모, 박테리아(예를 들어, 이콜라이(E. coli)), 및 포유류 세포(예를 들어, 불멸 포유류 세포)가 제공된다. 다양한 실시형태에서, GDF15 분자 및/또는 Fc 분자의 발현을 위한 서열 암호를 포함하는 비-통합 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 구성요소를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 GDF15 분자를 생산하기 위한 핵산을 포함하고, 다른 세포는 GDF15 분자와의 이량체화를 위해 Fc 분자를 생산하기 위한 핵산을 포함한다(예를 들어, 하나의 세포에서 GDF15 분자를 암호화하는 벡터 및 제2 세포에서 Fc 분자를 암호화하는 제2 벡터). 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 GDF15 분자 및 Fc 분자를 생산하기 위한 핵산을 포함한다(예를 들어, 분자를 둘 다 암호화하는 벡터). 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 GDF15 분자를 생산하기 위한 핵산 및 Fc 분자를 생산하기 위한 다른 핵산을 포함한다(예를 들어, 단일 숙주 세포에서 2개의 별개의 벡터, 즉, 하나는 GDF15 분자를 암호화하고, 하나는 Fc 분자를 암호화함).

GDF15 분자 및/또는 Fc 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는, 예컨대, 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환에 의해 또는 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

GDF15 분자를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물에 위치되고/되거나 전달될 수 있다. 바이러스 벡터는 단독으로 또는 요망되는 숙주 세포에서 본 발명의 핵산의 전달, 복제 및/또는 발현을 용이하게 하는 1종 이상의 바이러스 단백질과 조합하여, 다수의 바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 게놈, 바이러스 단백질/핵산 접합체, 바이러스-유사 입자(VLP), 또는 바이러스 핵산 및 GDF15 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 무손상(intact) 바이러스 입자의 모두 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 바이러스 입자 바이러스 벡터는 야생형 바이러스 입자 또는 변형된 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 및/또는 발현을 위한 다른 벡터 또는 야생형 바이러스의 존재를 필요로 하는 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터 앰플리콘일 수 있다(예를 들어, 바이러스 벡터는 헬퍼-의존적 바이러스일 수 있다). 이에 대해 적합한 바이러스 벡터 입자는, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 입자 (아데노바이러스과의 또는 이로부터 유래된 임의의 바이러스를 포함), 아데노-관련 바이러스 벡터 입자(AAV 벡터 입자) 또는 기타 파보바이러스 및 파보바이러스 벡터 입자, 유두종바이러스 벡터 입자, 플라비바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터를 포함)를 포함한다.

GDF15 분자는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 단리될 수 있다. GDF15 영역을 포함하는 폴리펩티드는 GDF15 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키도록 조작된 세포, 예를 들어, 천연 GDF15를 자연적으로 발현시키지 않는 세포로부터 단리될 수 있다. 당업계에 공지된 단백질 정제 방법은 GDF15 분자뿐만 아니라 결합된 물질 및 시약을 단리시키는 데 사용될 수 있다. GDF15 분자를 정제하는 방법이 또한 본 명세서의 실시예에 제공된다. GDF15 분자를 단리시키는 데 유용할 수 있는 추가적인 정제 방법은 문헌[Bootcov MR, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11514-9, Fairlie WD, 2000, Gene 254: 67-76]과 같은 참고문헌에서 찾을 수 있다.

GDF15 분자(및 선택적으로, Fc 분자, 예컨대, 본 명세세에 개시된 이량체 또는 사량체)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 이러한 폴리펩티드 약제학적 조성물은 투여 방식에 적합하게 선택된 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 제형화제 또는 담체와 혼합하여 치료적 유효량의 GDF15 분자를 포함할 수 있다. 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 제형화제는 인간 또는 비인간 대상체의 신체 내로 GDF15 분자의 전달을 달성하거나 향상시키는 데 적합한 1종 이상의 제형화제일 수 있다. GDF15 분자의 보관수명 또는 유효성을 향상시키는 약제학적으로 허용 가능한 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제는 또한 제형 담체로서 작용하거나 또는 제형 담체의 성분을 형성할 수 있다. 허용 가능한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 바람직하게는 비독성이다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투압, 점성도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형하거나, 유지하거나, 보존하기 위한 제형화제(들)를 함유할 수 있다.

치료적으로 사용될 GDF15 분자를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 치료 내용 및 목적에 따라 다를 것이다. 따라서 당업자는 치료를 위한 적절한 투약량 수준이, 부분적으로, 전달되는 분자, GDF15 분자가 사용되고 있는 적응증, 투여 경로, 및 대상체의 크기(체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 병태(연령 및 일반적 건강상태)에 따라 다를 것임을 인식할 것이다. 투약 빈도는 사용 중인 제형 내 GDF15 분자의 약물동태학적 파라미터에 따라 다를 것이다.

약제학적 조성물의 투여 경로는 경구; 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해; 지속 방출 시스템에 의하거나(또한 주사될 수 있음); 또는 이식 장치에 의할 수 있다. 원하는 경우, 조성물은 볼루스 주사에 의해 또는 연속적으로 주입에 의해 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 막, 스펀지, 또는 목적하는 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화되는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 이식될 수 있고, 목적하는 분자의 전달은 확산, 시간 방출 볼루스 또는 지속적 투여를 통할 수 있다.

GDF15 분자는 대사적 병태 또는 장애를 치료하거나, 진단하거나 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 대사 장애는 당뇨병, 예를 들어, 2형 당뇨병이다. 다른 실시형태에서, 대사 병태 또는 장애는 비만이다. 다른 실시형태에서, 대사 병태 또는 장애는 이상지질혈증, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준 또는 당뇨병성 신경병증이다. 예를 들어, GDF15 분자를 이용하여 치료되거나 또는 개선될 수 있는 대사적 병태 또는 장애는 인간 대상체가 125 ㎎/㎗ 이상, 예를 들어 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 200 ㎎/㎗ 초과의 공복 혈당 수준을 갖는 상태를 포함한다. 혈당 수준은 섭식 또는 공복 상태에서 또는 무작위에서 결정될 수 있다. 대사적 병태 또는 장애는 또한 대상체가 대사적 병태가 발생할 증가된 위험에 있는 병태를 포함할 수 있다. 인간 대상체에 대해, 이러한 병태는 100 ㎎/㎗의 공복 혈당 수준을 포함한다. GDF15 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 병태는 또한 문헌[American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care 2011, American Diabetes Association, Diabetes Care Vol. 34, No. Supplement 1, S11-S61, 2010]에서 찾을 수 있다.

투여는, 예컨대 정맥내(IV) 주사, 복강내(IP) 주사, 피하 주사, 근육내 주사에 의해 또는 정제 또는 액체 제형의 형태로 경구로 수행될 수 있다. GDF15 분자의 치료적 유효 용량은 투여 스케줄, 투여되는 제제의 단위 용량, GDF15 분자가 다른 치료제와 병용하여 투여되는지의 여부, 면역 상태 및 수용자의 건강 상태에 따라 다를 것이다. "치료적 유효 용량"은 치료 중인 질환 또는 장애 증상의 경감 또는 개선을 포함하는, 연구자, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는 조직계, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 GDF15 분자의 양, 즉, 하나 이상의 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응의 관찰 가능한 수준, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준의 저하; 체중 감소; 또는 내당능, 에너지 소비량 또는 인슐린 민감성의 개선을; 또는 섭식 감소를 뒷받침하는 GDF15 분자의 양이다. GDF15 분자의 치료적 유효 용량은 또한 목적하는 결과에 따라 다를 수 있다.

또한 본 명세서에서 대상체에서의 1종 이상의 대사적으로 적절한 화합물, 예컨대 글루코스, 인슐린, 콜레스테롤, 지질의 기준 수준을 측정하는 단계, GDF15 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계, 및 목적하는 기간의 시간 후에, 대상체에서의 1종 이상의 대사적으로-적절한 화합물(예를 들어, 혈당, 인슐린, 콜레스테롤, 지질) 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이어서, 두 수준은 대상체에서의 대사적으로 적절한 화합물의 상대적 변화를 결정하기 위해 비교될 수 있다. 해당 비교 결과에 따라서, 약제학적 조성물의 다른 용량은 하나 이상의 대사적으로 적절한 화합물의 목적으로 하는 수준을 달성하도록 투여될 수 있다.

GDF15 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 다른 화합물 또는 치료제와 공동 투여될 수 있다. GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)는 다른 치료제, 예컨대, 혈당, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 체중을 낮추거나; 식품 섭취를 감소시키거나; 당내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 민감성을 개선시키거나; 또는 이들의 임의의 조합인 제제(예를 들어, 항당뇨병제, 저지질혈증, 항비만제, 항고혈압제, 또는 퍼옥시좀 증식제-활성체 수용체의 작용제)와 병용하여 투여될 수 있다. GDF15 분자와 함께 공동투여되는 화합물의 정체 및 특성은 치료되거나 또는 개선될 병태의 특성에 따라 다를 것이다. 본 명세서에 개시된 GDF15 분자와 함께 투여되는 제제는 GLP-1R 작용제, 예컨대, GLP-1 또는 이의 유사체; 또는 엑센딘, 엑센딘 유사체 또는 엑센딘 작용제일 수 있다. 약제학적 조성물과 병용하여 투여될 수 있는 화합물 예의 비제한적 목록은 리라글루티드, 로시글리티존, 피오글리티존, 레파글리니드, 나테글리티니드, 메트포민, 엑세나티드, 스티아글립틴, 프람린티드, 글리피지드, 글리메피리드아카보스, 올리스타트, 로카세린, 펜터민토피라메이트, 날트렉손부프로피온, 세트멜라노티드, 세마글루티드, 에페글레나티드, 카나글리플로진, LIK-066, SAR-425899, Tt-401, FGFR4Rx, HDV-비오틴 및 미글리톨을 포함한다.

일 실시형태에서, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 분자는 다른 화합물 또는 치료제, 예컨대, 리라글루티드와 함께 투여된다.

다른 실시형태에서, 각각 서열번호 39 및 32(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 40 및 33(C-말단의 리신은 선택적), 각각 서열번호 41 및 32(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 42 및 32(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 43 및 34(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 44 및 34(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 45 및 35(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 46 및 35(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 47 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 48 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 49 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 50 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 51 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 52 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 53 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 54 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 55 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 56 및 37(C-말단의 리신은 선택적); 또는 각각 서열번호 57 및 37(C-말단의 리신은 선택적)의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 분자 및 대응하는 Fc 분자는 다른 화합물 또는 치료제, 예컨대, 리라글루티드와 함께 투여된다.

다른 실시형태에서, 각각 서열번호 50 및 36(C-말단의 리신은 선택적)의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 분자 및 대응하는 Fc 분자는 다른 화합물 또는 치료제, 예컨대, 리라글루티드와 함께 투여된다. 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 57 및 37(C-말단의 리신은 선택적)의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 분자 및 대응하는 Fc 분자는 다른 화합물 또는 치료제, 예컨대, 리라글루티드와 함께 투여된다.

다른 치료제와 함께 투여되는 GDF15 분자는 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)와 치료적 유효량의 다른 치료제의 동시 투여를 포함할 수 있다. 다른 치료제와 함께 투여되는 GDF15 분자는 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)와 치료적 유효량의 다른 치료제의 후속적 투여, 예를 들어, 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자) 다음에 치료적 유효량의 다른 치료제의 투여 또는 치료적 유효량의 다른 치료제의 투여 다음에 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)의 투여를 포함할 수 있다. 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)의 투여는 치료적 유효량의 다른 치료제의 투여 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일일 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 다른 치료제의 투여는 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로, 이의 대응하는 Fc 분자)의 투여 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일일 수 있다.

다른 치료제와 동시에 투여되는 GDF15 분자는 GDF15 분자(및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자)와 다른 치료제를 둘 다 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있고, 예를 들어, 치료적 유효량의 GDF15 분자(및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자)는 투여 전에 치료적 유효량의 다른 제제와 조합된다. 다른 실시형태에서, GDF15 분자(및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자)와 다른 치료제의 동시 투여는 GDF15 분자를 포함하는 제1 조성물과 다른 치료제를 포함하는 제2 조성물의 동시 투여를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, GDF15 분자와 다른 치료제의 투여는 상승적 효과를 가진다. 일 실시형태에서, 효과는 GDF15 분자 (및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자) 단독 또는 다른 제제보다 더 크다. 다른 실시형태에서, 효과는 제제 둘 다(GDF15 분자, 및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자 + 다른 제제)의 상가적 효과보다 더 크다. 일 실시형태에서, 병용 요법(즉, GDF15 분자를, 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자와, 다른 치료제와 함께 투여)은 GDF15 단일요법(GDF15 분자 및 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자의 투여)보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29 또는 30배로 효과가 더 크다. 다른 실시형태에서, 병용 요법(즉, GDF15 분자를, 선택적으로 이의 대응하는 Fc 분자와, 다른 치료제와 함께 투여)은 다른 제제에 의한 단일요법보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 효과가 더 크다. 효과는 체중 감소(예를 들어, 총 질량 또는 신체 변화 백분율의 감소); 혈당, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준의 감소; 당내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 민감성의 개선; 또는 식품 섭취의 감소의 양일 수 있다. 상승 효과는 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 또는 70일일 수 있다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제(예를 들어, 리라글루티드 또는 엑센딘, 또는 이의 유사체 또는 작용제)와 함께 투여되는, 각각 서열번호 39 및 32(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 40 및 33(C-말단의 리신은 선택적), 각각 서열번호 41 및 32(C-말단의 리신은 선택적) ; 각각 서열번호 42 및 32(C-말단의 리신은 선택적) ; 각각 서열번호 43 및 34(C-말단의 리신은 선택적) ; 각각 서열번호 44 및 34(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 45 및 35(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 46 및 35(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 47 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 48 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 49 및 36(C-말단의 리신은 선택적) ; 각각 서열번호 50 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 51 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 52 및36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 53 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 54 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 55 및 36(C-말단의 리신은 선택적); 각각 서열번호 56 및 37(C-말단의 리신은 선택적); 또는 각각 서열번호 57 및 37(C-말단의 리신은 선택적)의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 분자 및 대응하는 Fc 분자는 제제(들)의 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 또는 70일에 GDF15 단일요법보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29 또는 30배로 효과가 더 크거나; GLP-1R 작용제 단일요법(즉, GLP-1R 작용제 단독의 투여)보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29 또는 30배로 효과가 더 크거나; 또는 둘 다이다.

상세한 설명 및 다음의 실시예는 본 발명을 예시하며, 이에 대해 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 설명에 기반하여 당업자에 의해 다양한 변화와 변형이 만들어질 수 있으며, 이러한 변화와 변형이 또한 본 발명에 포함된다.

실시예

수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예 1: GDF15(WT)-링커-Fc 분자

scFc-GDF15(서열번호 38) 및 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)의 GDF15 분자를 생성하고, 화합물의 활성을 시험하였다.

FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)를 무혈청, 현탁액 적합 CHO-K1 세포주에서 안정하게 발현시켰다. 이를 퓨로마이신 내성을 함유하는 안정한 발현 벡터 내로 클로닝시킨 한편, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15, FcΔ10(+,K)(서열번호 32)와 이형이량체를 형성하기 위한 Fc 쇄를 하이그로마이신 함유 발현 벡터(셀렉시스 인코포레이티드(Selexis, Inc.)) 내로 클로닝시켰다. 리포펙타민 LTX를 이용하여 플라스미드를 1:1 비로 형질감염시켰고, 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신 및 600 ㎍/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 등록상표 성장 배지에서 형질감염 후 2일에 세포를 선택하였다. 선택 동안 주당 2회로 배지를 교환하였다. 세포가 약 90% 생존도에 도달될 때, 배취 생산 실행 동안 이들을 스케일 업(scaled up)하였다. 생산 배지에서 세포를 2Х10⁶/㎖로 파종시켰다. 세포에 의해 생산한 조정 배지(conditioned medium: CM)를 제7일에 채취하고, 정화시켰다. 종말점 생존도는 전형적으로 90% 초과였다.

FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)(및 임의의 짝지어진 Fc)를 정화하였다. 2단계 크로마토그래피 절차를 이용하여 조정 배지를 정제하였다. 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS)를 이용하여 미리 평형상태로 만든 GE MabSelect SuRe 칼럼에 대략 5 L의 CM을 직접 적용하였다. 결합 단백질은 3회의 세척을 겪었다: 처음에, 3개의 칼럼 용적(CV)의 PBS; 다음에, 1 CV의 20 mM Tris, 100 mM 염화나트륨, pH 7.4; 및 최종적으로, 3 CV의 500 mM L-알기닌, pH 7.5. 이들 세척 단계는 비결합 또는 약하게 결합된 배지 성분 및 숙주 세포 불순물을 제거한다. 이어서, 칼럼은 pH 7.4에서 5 CV의 20 mM Tris, 100 mM 염화나트륨을 이용하여 재평형상태로 만들었는데, 이는 UV 흡광도를 다시 기준으로 되돌린다. pH 3.6에서 100 mM 아세트산을 이용하여 목적하는 단백질을 용리시키고, 다량으로 수집하였다. 1 M Tris-HCl, pH 9.2를 이용하여 pH 범위 5.0 내지 5.5 내에서 단백질 풀을 빠르게 적정하였다. pH 조절된 단백질 풀을 다음에 pH 6.0에서 20 mM 2-에탄설폰산(MES)을 이용하여 미리 평형상태로 만든 GE SP 세파로스(Sepharose)® HP 칼럼에 장입시켰다. 이어서, 결합된 단백질을 5 CV의 평형 완충제로 세척하고, 최종적으로 pH 6.0에서 20 mM MES 중의 0 내지 400 mM 염화나트륨의 0 내지 50% 선형 구배로 20 CV에 대해 용리시켰다. 분획을 용리 동안 수집하였고, 균질한 생성물에 대한 풀에 적절한 분획을 결정하기 위해 분석 크기-배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex)® 200)에 의해 분석하였다. SP HP 크로마토그래피는 생성물-관련 불순물, 예컨대 유리 Fc, 클립 종(clipped species), 및 Fc-GDF15 다량체를 제거한다. 이어서, SP HP 풀을 투석에 의해 10 mM 아세트산나트륨, 5% 프롤린, pH 5.2로 완충제 교환하였다. 사르토리우스 비바스핀(Sartorius Vivaspin)® 20, 10 킬로달톤 분자량 컷오프 원심분리 장치를 이용하여 대략 15 ㎎/㎖로 농축시켰다. 최종적으로, 이를 멸균 여과시키고, 정제된 Fc-GDF15 분자를 함유하는 얻어진 용액을 5℃에서 저장하였다. 최종 생성물은 질량 스펙트럼 분석, 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 전기영동법 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 동일성 및 순도에 대해 평가하였다.

ScFc-GDF15(서열번호 38)를 유사한 방식으로 생산하였다. 이 GDF15 분자를 CHO/CS9 세포주에서 안정하게 발현시켰다. 분자를 안정한 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 전기천공법을 이용하여 플라스미드(선형화)를 1:1 비로 형질감염시켰고, 형질감염 후 2일에 세포를 선택하였다. 선택 동안 주당 3회로 배지를 교환하였다. 세포가 약 90% 생존도에 도달될 때, 유가 배양 생산 실행 동안 이들을 스케일 업하였다. 세포를 생산 배지에서 1Х10⁶/㎖로 파종하였고, 세포 수가 4 내지 5Х10⁶/㎖에 도달되었을 때 1회 공급하였다. 세포에 의해 생산된 조정 배지(CM)를 제10일에 채취하고, 정화시켰다. 종말점 생존도는 전형적으로 90% 초과였다. ScFc-GDF15를 정화하고, 2단계 결합된 크로마토그래피 절차를 이용하여 조정 배지를 정제하였다. 다양한 채취물로부터의 조정 배지를 풀링하고, 접선 유동 여과에 의해 1 sq ft 펠리컨(Pellicon)® 2 10kD 제생 셀룰로스 막(밀리포어(Millipore))를 이용하는 한외여과에 의해 거의 5배로 농축시켰다. 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS)를 이용하여 미리 평형상태로 만든 GE MabSelect SuRe 칼럼에 대략 5 L의 농축된 CM을 직접 적용하였다. 비특이적으로 결합된 단백질을 12CV PBS 세척 단계에 의해 제거하였다. 목적하는 단백질을 3 CV에서 pH 3.5, 150 mM NaCl에서 0.5% 아세트산으로 용리시키고, 저장 루프에 수집하였다. 수집한 단백질 풀을 pH 5.0, 150 mM NaCl에서 30 mM 아세테이트로 미리 평형상태로 만든 GE HiLoad 26/60 Superdex 200 분취 등급 사이징 칼럼 상에 직접 장입시켰다. 균질한 생성물에 대한 풀에 대한 적절한 분획을 결정하기 위해 사이징 실행 동안 수집한 피크 분획은 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에 의해 분석하였다. 최종 사이징-풀의 pH를 10% 빙초산의 첨가에 의해 pH 4.5로 조절하고, 이어서, 투석에 의해 10 mM 아세트산나트륨, 9%(w/v) 수크로스, pH 4.5로 완충제 교환하였다. 10 킬로달톤 분자량 컷오프 원심분리 장치를 이용하여 이를 15 ㎎/㎖ 초과로 농축시켰다. 3주기의 냉동 및 해동에 의해 냉동에 대한 단백질 안정성을 시험하였다. 최종적으로, 최종 로트를 멸균 여과시키고, 정제된 GDF15 분자를 함유하는 얻어진 용액을 -80℃에서 저장하였다. 최종 생성물은 질량 스펙트럼 분석, n-말단의 서열분석, 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 전기영동법 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 동일성 및 순도에 대해 평가하였다.

이어서, 생체내 활성에 대해 scFc-GDF15 및 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15의 활성을 분석하였다. 사이노몰거스 원숭이(그룹 당 n = 10)에 6주 동안 매주 비히클, 3 ㎎/㎏의 양성 대조군 FGF21-Fc, 1.5 ㎎/㎏의 scFc-GDF15 또는 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15:FcΔ10(+,K)를 투여하고 5주 약효세척하였다. 체중 및 트리글리세리드 수준을 결정하였다. 미경험(

) 수컷 자발적 비만 사이노몰거스 원숭이를 건강상태에 대해 사전선별하였고, 체질량지수는 41 초과였다. 원숭이는 처리 전 6주 동안 단일 하우징, 실험 절차 및 조작에 순응시켰다. 원숭이를 유사한 기준을 갖는 각각의 그룹에 대해 6주 동안(제0일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제35일) SC 주사를 1주 1회로 받는 4개의 그룹으로 분류하였다. 밤새 공복 혈액 샘플을 투약 전 -제24일, -제17일 및 -제10일에, 그리고 치료 단계 동안에 제6일, 제13일, 제20일, 제27일, 제34일 및 제41일(각각의 매주 투약 후 6일)에 수집하였다. 약효세척 단계 동안, 제48일, 제55일, 제62일, 제69일 및 제76일에 혈액 샘플을 수집하였다. 체중을 1주 1회 측정하고, 연구 내내 식품 섭취를 각각의 원숭이에 대해 매일 모니터링하였다. 각각의 원숭이는 대략 8시간 간격으로 아침과 저녁에 제한된 양의 시간(1시간) 동안 제한되지 않은 먹이를 받았다. 제한된 양의 시간(1시간) 동안 식사 사이에 150 g의 사과 스낵을 제공하였다. 남아있는 식품 또는 사과를 제거하고 나서, 각각의 음식 또는 스낵 후에 중량을 재어 식품 섭취를 계산하였다.

GDF15-Fc 융합 단백질은 FGF21-Fc과 유사하게 체중(도 1) 및 트리글리세리드 수준(도 2)을 감소시켰다.

실시예 2: GDF15(WT)-링커-Fc 분자 속성

실시예 1에 기재한 바와 같은 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39) 분자 및 FcΔ10(+)-(G4)-GDF15(서열번호 40)는 (예를 들어, 상업적 제조를 위한) 안정성 및 제조능력에 영향을 미칠 수 있는 속성에 대해 분석하였다. GDF15 분자(예를 들어, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15 및 FcΔ10(+)-(G4)-GDF15)는 분자의 제조능력을 위한 바람직하지 않은 특징인 매우 이질성인 것으로 결정되었다(예를 들어, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15의 이온 교환 칼럼 분획의 분석은 분자가 매우 이질성임을 나타냄, 도 3). 매우 이질적인 집단을 초래하는 GDF15 분자의 속성을 결정하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피, SDS PAGE 겔 및 질량 분석법에 의한 분자의 분석을 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 체류 시간의 차이 결여는 응집 또는 총 분해가 균질성을 초래할 가능성이 없다는 것을 나타내었다. 또한 SDS PAGE 겔 상에서 차이의 결여가 있었는데, 이는 이황화물 잘못짝지음(mispairing) 또는 총 분해가 또한 이질성을 초래할 가능성이 낮다는 것을 나타내었다.

또한 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)의 이질성을 평가하기 위해 MS 분석을 수행하였다. GDF15 분자는 모노 S, 1 ㎖ 칼럼을 이용하여 정제하였고, 분획 수 25(P1), 분획 수 28(P2), 및 분획 수 31(P3)(도 3)을 수집하고, MS 분석을 위해 제출하였다. 약 50 ㎍의 분획을 건조시키고, 25 ㎕의 150 mM Tris, pH 7.5/8M 유레아/40 mM 하이드록실아민/10 mM DTT에서 재현탁시키고, 이어서, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 암실에서 30분 동안 실온에서 20 mM 요오도아세트아미드(IAM)로 알킬화시켰다. 이어서, 샘플을 물 및 2 ㎍의 트립신(1:25)을 이용하여 100 ㎕로 희석시켰고, 37℃에서 밤새 분해시켰다. 분해물을 산성화시킨 후에, 워터스(Waters)(매사추세츠주 밀퍼드에 소재) 나노액퀴티(NanoAcquity) UPLC 시스템 상에 주사하였다. 샘플을 15㎕/분으로 180 ㎛ Х 20 ㎜ 시메트리(Sy㎜etry) C18 트래핑 칼럼 상에 처음 장입시킨 후에, 애질런트(Agilent)(캘리포니아주 산타 클라라에 소재) 조박스(Zorbax) 0.5 ㎜ Х 250 ㎜ 300SB-C18 칼럼 상에서 펩티드 분해시켰다. 완충제 A는 0.1% 포름산/물인 반면, 완충제 B는 0.1% 포름산/99.9% 아세토니트릴이었다. 구배는 1%의 B에서의 초기 조건, 다음에 85분에 걸쳐 45%의 B까지, 1분에 걸쳐 97%의 B까지, 6분 동안 97% B에서 등용매 용리, 3분에 걸쳐 1% B까지 증가, 이어서, 1% B에서 20분 동안 등용매 용리로 이루어졌다. UPLC 칼럼 용출액을 표준 가열 전기분무 이온화 II(HESI II) 이온화 공급원을 이용하여 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)(캘리포니아주 산호세에 소재) 오비트랩 벨로스 프로(Orbitrap Velos Pro) 질량분석기에 분무하였다. 질량 분석기 방법은 30K 분해능에서 m/z [300-2000]의 전체 MS 스캔, 다음에 상위 10개의 가장 흔한 전구체 이온의 MS/MS(CID 활성화)로 이루어졌다. 분석을 위해 다음의 기기 파라미터를 사용하였다: 공급원 전압 = 3.5 kV; 모세관 온도 = 275℃ S-렌즈 RF 수준 = 50%; 활성화 시간 = 10 msec; 정규화된 충돌 에너지 = 35; 절연 폭 = 2.0 Da; 및 역치 = 1.0E4. 고분해능 MS 데이터의 데콘볼루션을 위해 Thermo Xcalibur 2.1 소프트웨어의 Xtract 성분을 사용하였다. 1.2의 S/N 역치 및 m/z 400에서 100,000의 분해능을 이용하여 [300-2000]으로부터의 평균 데이터를 디콘볼루션하였다. 디콘볼루션된 펩티드 질량(글리코실화 및 비글리코실화)을 단일동위원소 [M+H]⁺로서 나타내었다. 글리칸 서브유닛의 단계적 상실 및 CID 활성화 후 가장 강한 단편으로서 비글리코실화된 전구체 이온의 존재에 의해 다양한 글리코실화된 종을 확인하였다.

MS 결과는 링커 상에서 다양한 정도의 탈아미드화된 종(예를 들어, 70%의 P1, 47%의 P2 및 24%의 P3) 및 글리코실화 분포(대부분 단당류 및 삼당류)는 CEX 프로파일에 나타낸 바와 같은 GDF15 분자의 고도로 이질적인 특성에 기여하였다는 것을 나타내었다(도 3). (G4S)4 링커(예를 들어, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15에 존재함)는 다양한 정도 및 유형의 글리코실화 및/또는 인산화로 고도로 글리코실화 및 인산화되었고, 야생형 인간 GDF15의 활성 단편의 N-말단이 탈아미드화 및 이성질체화에 매우 민감하다는 것을 결정하였다(예를 들어, 3번 위치에 아스파라긴을 함유하는 펩티드의 비변형, 탈아미드화 및 이성질체화 종에 대응하는 전체 질량 분석법 데이터로부터 추출한 특정 질량을 나타내는 도 4 참조. 추출한 질량은 펩티드의 2배로 하전된 형태로부터의 m/z [590.25-590.75]였다). 3번 위치에서의 아스파라긴(서열번호 6에 대해, hGDF15의 활성 단편을 암호화하는 아미노산 서열)은 탈아미드화 및 이성질체화에 고도로 민감하였고, 5번 위치에서의 아스파르테이트(서열번호 6에 대해, hGDF15의 활성 단편을 암호화하는 아미노산 서열)는 이성질체화에 고도로 민감하였다.

이들 속성에 기반하여, (예를 들어, 상업적 제조를 위해) Fc 영역에 링커를 갖는 야생형 인간 GDF15의 활성 단편을 갖는 GDF15-Fc 융합 단백질의 일반적으로 균질한 집단을 제조하는 것은 어렵다.

실시예 3: 링커가 없는 GDF15-Fc 융합 단백질의 활성

실시예 2에 기재한 이질성 문제를 처리하기 위해, 새로운 GDF15-Fc 융합 단백질은 1) GDF15 영역과 Fc 영역 사이의 링커를 제거하고 2) 야생형 인간 GDF15의 활성 단편(예를 들어, 야생형 인간 GDF15의 활성 단편의 처음 3개의 아미노산이 결실된 GDF15(Δ3)(서열번호 13), 또는 야생형 인간 GDF15의 활성 단편의 3번 위치에서의 아스파라긴이 아스파르테이트로 돌연변이된 GDF15(N3D)(서열번호 16))의 N-말단의 잔기를 제거하거나 치환하였다.

이형이량체를 형성하기 위해 GDF15-Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 Fc 분자의 비공유 결합을 위한 GDF15-Fc 융합 단백질의 Fc 영역 및 Fc 분자 내 하전 쌍 돌연변이에 추가로, 일부 새로운 분자는 Fc 분자와 GDF-Fc 분자의 이형이량체화를 증가시키기 위해 CH3 영역 내 이황화 결합, 또는 "시스테인 클램프"(표기에 "CC"를 포함하는 분자)를 또한 포함하도록 설계하였다.

1) GDF15 영역과 Fc 영역 사이의 링커가 결실되고 2) GDF15의 N-말단의 잔기가 제거되거나 치환된 4개의 새로운 GDF15-Fc 융합 단백질이 생성되었다. 4개의 분자 중 둘에서, 쇄간 이황화 결합은 GDF15-Fc 융합 단백질의 Fc 영역(뿐만 아니라 이형이량체화를 위한 이의 대응하는 Fc 분자)의 CH3 도메인 내로 도입하였다. 마우스에서 이들 분자(FcΔ10(-)-GDF15(Δ3)(서열번호 41); FcΔ10(-)-GDF15(N3D)(서열번호 42); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3)(서열번호 43); FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D)(서열번호 44))의 효능 및 약물동태학적(PK) 특성을 초기 세대 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)와 비교하였다.

분자의 효능을 결정하기 위해, 식품 섭취를 결정하였다. 7 내지 8주령의 단일-수용 수컷 ob/ob 마우스를 상이한 처리군으로 분류하였고, 각각의 그룹은 비슷한 전처리 체중 및 식품 섭취 수준을 가졌다. 동물은 피하 주사를 통해 0.32 ㎍/㎏, 1.6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏, 40 ㎍/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 GDF15-Fc 융합 단백질(FcΔ10(-)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K)(서열번호 41 및 32); FcΔ10(-)-GDF15(N3D):FcΔ10(+,K)(서열번호 42 및 32); 또는 FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3):FcΔ10(+,K,CC)(서열번호 39 및 32)의 이량체)로 처리하였고, 밤새 식품 섭취를 측정하였다. 제시한 데이터는 2 내지 4회의 독립적 연구의 평균이다(도 5). 4가지 새로운 분자, 즉, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3)(서열번호 41); FcΔ10(-)-GDF15(N3D)(서열번호 42); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3)(서열번호 43); 및 FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D)(서열번호 44)는 초기 세대 GDF15-Fc 융합 단백질, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)와 비슷한 효능을 가진다.

분자의 약물동태학을 결정하기 위해, 18주령의 수컷 식이요법 유도 비만 C57Bl/6 마우스에 피하로 1 ㎎/㎏의 단백질을 투약하였고, 투약 후 1, 4, 8, 24, 72, 168, 240 및 336시간에 연속 샘플링을 수행하였다. 4가지 새로운 분자, 즉, FcΔ10(-)-GDF15(Δ3)(서열번호 41); FcΔ10(-)-GDF15(N3D)(서열번호 42); FcΔ10(-,CC)-GDF15(Δ3)(서열번호 43); 및 FcΔ10(-,CC)-GDF15(N3D)(서열번호 44)는 초기 세대 GDF15-Fc 융합 단백질, FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(서열번호 39)와 비슷한 약물동태학적 특성을 가진다(도 6).

실시예 4: 링커가 없는 GDF15-Fc 융합 단백질의 추가적인 조작

개선된 제조능력 및 안정성 속성을 갖는 새로 설계한 분자는 초기 세대 분자와 유사한 효능 및 PK 특성을 갖기 때문에, 분자는 가능한 이질성을 감소시키고 Fc 효과기 기능을 감소시키고 효능을 증가시키도록 조작하였다.

GDF15 영역의 이질성을 추가로 감소시키기 위해, 3번 위치에서의 아스파라긴을 아스파르테이트로 치환하는 대신에, 아스파라긴을 글루타민으로 치환하였다. 게다가, 분자는 GDF15, 예를 들어, GDF15(Δ3/D5E)(서열번호 17), GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 18)의 N-말단에서 2가지 변화를 갖도록 조작하여 천연 GDF15 단백질의 고비율의 탈아미드화 및 이성질체화를 제거하였다. Fc 효과기 기능을 감소시키고 효능을 개선시키기 위해, 분자는 또한 FcγR에 대한 결합을 감소시키기 위해 Fc 힌지 영역(예를 들어, FcΔ10 대신에 FcΔ16)으로부터 결실된 추가 6개의 아미노산을 가짐으로써 추가로 결실된 Fc 영역의 힌지 영역을 갖도록 조작하였다. GDF15-Fc 융합 단백질과 이형이량체화하는 대응하는 Fc 분자에 대해 힌지 영역의 동일한 조작을 수행하였다.

추가적인 조작된 GDF15-Fc 융합 단백질, FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E)(서열번호 45), FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 46) 및 FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 47)의 활성을 사이노몰거스 원숭이에서 시험하였다. 미경험 수컷 자발적 비만 사이노몰거스 원숭이를 치료 개시 전 10주 동안 절차적 조작(예를 들어, 혈액 수집, 피하 주사, 체중 측정, 섭식 스케줄)에 순응시키고/훈련시켰다. 팔십(80) 마리의 원숭이를 순응/훈련 단계 동안 수집한 데이터(혈액 화학 및 체중)에 각각 기반하여 n=10마리 원숭이의 8개 처리군으로 분류하였다. 각각의 처리군에 비히클, 3 ㎎/㎏의 양성 대조군 FGF21-Fc, 0.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K,CC)(서열번호 35)과 함께), 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(Δ3/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K,CC)(서열번호 35)과 함께), 0.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K,CC)과 함께), 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K,CC)과 함께), 0.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K)(서열번호 36)과 함께), 또는 3.0 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K)(서열번호 36)과 함께)을 투여하였다. 각각의 피하 주사를 치료 단계 동안, 이어서, 4주 약효세척 단계 동안 4주 동안 1주 1회로 제공하고; 혈액 수집 및 체중 모니터링은 매주 일어나고, 식품 섭취는 치료 및 약효세척 단계 동안 매일 일어났다. 그래프는 n=5 내지 6/그룹을 나타내고, 데이터는 그룹 평균 + SEM으로서 나타낸다. ANCOVA에 의해 통계학적 분석을 수행하였고, 비히클에 대해 통계학적 유의도를 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001로서 나타낸다. 빠른 약물 클리어런스를 갖는 원숭이는 항-약물 항체(anti-drug antibody: ADA)가 의심되며, 분석으로부터 제외하였다.

예상치 못하게, 새로 조작한 GDF15-Fc 융합 단백질은 거의 모든 효능을 상실하였다(도 7). 새로 조작한 GDF15-Fc 융합 단백질 중 어느 것도 앞서 생성된 GDF15-Fc 융합 단백질과 대조적으로, 체중을 FGF21-Fc와 유사한 정도로 감소시키지 않았다(실시예 1, 도 1 참조).

실시예 5: 사이노몰거스 원숭이에서 GDF15-Fc 융합 단백질 활성의 회복

실시예 1의 GDF15-Fc 융합 단백질과 비교하여 실시예 4의 GDF15-Fc 융합 단백질은 표 7에 나타낸 바와 같이 다음의 차이를 가졌다:

효능을 회복시키기 위해, 원숭이에서 효능이 있었던 분자의 상이한 양태를 새로운 GDF15-Fc 융합 단백질에 재도입하였다. 시스테인 클램프(CH3 쇄간 이황화 결합)를 제거하고, 링커를 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)(서열번호 49); FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 50) 및 FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 54)에 대해 재도입하였다. 그러나, 본 실시예에서 사용한 링커는 글리코실화될 수 없거나(예를 들어, G4Q) 또는 더 짧아서((G4S)4 대신에 G4S), 글리코실화를 감소시켰다. 또한, FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)에 대해, 5번 위치에서의 돌연변이를 제거하였다. 마지막으로, 분자 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(서열번호 57)의 새로운 분자에 대해, Fc 영역의 힌지 영역의 더 작은 결실에, 그러나 FcγR 결합을 제거하여야 하는 Fc 영역 내 L234A/L235A 돌연변이를 재도입하였다.

이들 새로운 분자를 실시예 1의 사이노몰거스 원숭이에서 효능있는 것으로 나타난 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15와 비교하였다. 미경험 수컷 자발적 비만 사이노몰거스 원숭이를 치료 개시 전 2주 동안 절차적 조작(예를 들어, 혈액 수집, 피하 주사, 체중 측정, 섭식 스케줄)에 순응시키고/훈련시켰다. 마흔두(42) 마리의 원숭이를 순응/훈련 단계 동안 수집한 데이터(혈액 화학 및 체중)에 각각 기반하여 n=7 마리 원숭이의 6개 처리군으로 분류하였다. 각각의 처리군에 비히클, 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ10(-)-(G4S)4-GDF15(이형이량체화 상대인 FcΔ10(+,K)와 함께), 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K)와 함께), 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K)와 함께), 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ16(+,K)와 함께), 또는 1.5 ㎎/㎏의 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(이형이량체화 상대인 FcΔ10(+,K,L234A/L235A와 함께)(서열번호 37)을 투여하였다. 피하 주사를 치료 단계 동안 2주 동안 1주에 1회로 제공하고; 혈액 수집 및 체중 모니터링은 매주 일어나고, 식품 섭취는 치료 단계 동안 매일 모니터링하였다. 그래프는 n=7/그룹을 나타내고, 데이터는 그룹 평균 + SEM으로서 나타낸다. ANCOVA에 의해 통계학적 분석을 수행하였고, 비히클에 대해 통계학적 유의도를 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001로서 나타낸다. 새로운 분자는 효능을 회복하였다(도 8).

이들 결과에 기반하여, N3Q 돌연변이는 원숭이에서 GDF15 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 결정되었고, GDF15에서의 이중 돌연변이(N3Q/D5E)는 또한 원숭이에서 GDF15 활성에 영향을 미치지 않았다. 16-아미노산 Fc 힌지 결실(Δ16)은 또한 원숭이에서 10-아미노산 Fc 힌지 결실(Δ10)과 유사한 효과를 갖는 것으로 나타났다. 마지막으로, 링커는 원숭이에서의 활성에 대한 중요한 성분이 되는 것으로 나타났다. 링커가 G4S인지 또는 G4Q인지의 여부는 활성에 영향을 미치지 않지만, 링커의 길이는 활성에 중요하다. 보다 긴 링커(예를 들어, 도 8에서 (G4S)4 및 (G4Q)4)는 보다 짧은 링커(예를 들어, G4S)에 비해 더 강력하다.

실시예 6: FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E) 및 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)에 대한 ob/ob 마우스에서의 식품 섭취 분석

두 상이한 GDF15-Fc 융합 단백질의 효능을 평가하기 위해 식품 섭취 분석을 사용하였다. 7 내지 8주령의 단일-수용 수컷 ob/ob 마우스를 상이한 처리군(그룹당 n=5)으로 분류하였고, 각각의 그룹은 비슷한 전처리 체중 및 식품 섭취 수준을 가졌다. 동물은 피하 주사를 통해 0.32 ㎍/㎏, 1.6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏, 40 ㎍/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 이형이량체 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ16(+,K) 또는 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E):FcΔ10(+,K,L234A/L235A)로 처리하였고, 밤새 식품 섭취를 측정하였다. 각각의 GDF15-Fc 융합 단백질에 대한 대표적인 실험 결과는 FcΔ16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(도 9) 및 FcΔ10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(도 10)에 대한 용량 반응 곡선에 나타낸다. 결과는 GDF15-Fc 융합 단백질이 둘 다 급성 ob/ob 마우스에서 식품 섭취를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이 분석에서의 ED50을 표 8에 나타낸다.

본 발명은 다양한 실시형태에 관해 기재하였지만, 당업자에 의해 변화와 변형이 일어날 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 첨부하는 청구범위는 청구하는 바와 같은 본 발명의 범주 내인 모든 이러한 동등한 변형을 아우르는 것으로 의도된다. 게다가, 본 명세서에서 사용되는 부문 표제는 단지 체계화 목적을 위한 것이고 기재한 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 출원에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에서 임의의 목적을 위해 참고로 분명하게 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. 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Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln 130 135 140 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala 165 170 175 Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 245 250 255 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 260 265 270 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 275 280 285 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 290 295 300 Cys His Cys Ile 305 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgtctctgg ccgaggcgag ccgcgcaagt ttcccgggac cctcagagtt gcactccgaa 60 gactccagat 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Leu His Thr Val 245 250 255 Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro 260 265 270 Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe 275 280 285 Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu 290 295 300 Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn 305 310 315 320 Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr 325 330 335 Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 340 345 <210> 57 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein <400> 57 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 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Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn 305 310 315 320 Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr 325 330 335 Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 340 345 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5

Claims

링커를 통해 Fc 영역에 결합된 GDF15 영역을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열 및 적어도 하나의 돌연변이를 포함하되, 상기 돌연변이 중 적어도 하나는 5번 위치에 아스파르테이트를 갖는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 5번 위치에서의 상기 아스파르테이트는 글루타메이트로 돌연변이된, 융합 단백질.
제2항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 3번 위치에 아스파라긴의 돌연변이를 더 포함하는, 융합 단백질.
제3항에 있어서, 3번 위치에서의 상기 아스파라긴은 글루타민으로 돌연변이된, 융합 단백질.
제5항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 (G4S)n 또는 (G4Q)n 링커이되, n은 0 초과인, 융합 단백질.
제7항에 있어서, n은 1 또는 2인, 융합 단백질.
링커를 통해 Fc 영역에 결합된 GDF15 영역을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열 및 적어도 하나의 돌연변이를 포함하되, 상기 돌연변이 중 적어도 하나는 3번 위치에 아스파라긴 또는 5번 위치에 아스파르테이트를 갖고, 상기 링커는 (G₄Q)_n 링커이며, n은 2 초과인, 융합 단백질.
제7항 또는 제9항에 있어서, n은 3 또는 4인, 융합 단백질.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 5번 위치에서의 아스파르테이트의 글루타메이트로의 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
제11항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 3번 위치에서의 상기 아스파라긴의 글루타민으로의 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
제13항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 절단된 힌지 영역을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 표 3으로부터 선택된, 융합 단백질.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 대사적 병태 또는 장애의 치료 방법.