TW202003586A - 生長分化因子15融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供了GDF15分子。在一些實施方式中，該GDF15分子是GDF15-Fc融合蛋白，其中GDF15區融合至Fc區。在一些實施方式中，該GDF15區藉由接頭融合至該Fc區。本文還提供了用於製備和使用GDF15分子之方法。
Description
本申請要求2018年4月9日提交的美國臨時申請案號62/655,108之權益，將其藉由引用以其全部內容併入本文。
本申請連同電子格式的序列表一起提交。序列表被提供為標題為A-2239-WO-PCT_SeqList_ST25.txt的文件，創建於2019年3月15日，大小是109kb。將電子格式的序列表的資訊藉由引用以其全文結合在此。
本揭露涉及GDF15分子，例如GDF15融合蛋白、其組成物和用於製備和使用此類蛋白之方法。
生長分化因子15(GDF15)(也稱為巨噬細胞抑制因子1(MIC1)(Bootcov MR,1997,Proc Natl Acad Sci[美國科學院院刊]94：11514-9)、胎盤骨形態發生因子(PLAB)(Hromas R 1997,Biochim Biophys Acta.[生物化學與生物物理學學報]1354：40-4)、胎盤轉化生長因 子β(PTGFB)(Lawton LN 1997,Gene.[基因]203：17-26)、前列腺衍生因子(PDF)(Paralkar VM 1998,J Biol Chem.[生物化學雜誌]273：13760-7)、和非甾類抗炎藥活化基因(NAG-1)(Baek SJ 2001,J Biol Chem.[生物化學雜誌]276：33384-92))是作為約25kDa同源二聚體在血漿中循環的分泌蛋白。GDF15以高親和力結合至GDNF家族受體α樣蛋白(GFRAL)。據信，GDF15誘導的細胞傳訊需要GFRAL與輔助受體RET的相互作用。
GDF15與多種生物活動相關。升高的GDF15已示出與體重減輕相關，並且投與GDF15已示出使食物攝入減少並使體重減輕。因此，需要可以作為治療劑投與的有效的GDF15分子。本揭露提供了滿足這一需要並且提供了相關優點的GDF15分子。
本文提供了GDF15分子、製備這些分子的方法和使用這些分子的方法。在一些實施方式中，該GDF15分子是GDF15-Fc融合蛋白。該融合蛋白可包含連接至Fc區的GDF15區。在一些實施方式中，該GDF15區藉由接頭連接至該Fc。
在一些實施方式中，該GDF15區包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列和至少一個突變，例如，在位置3處的天冬醯胺(N3)的突變，例如在位置5處的天冬胺酸(D5)的突變、或在位置3處的天冬醯胺的突變和在位置5處的天冬胺酸的突變。在一些實施方式中，該GDF15區包含在位置5處的天冬胺酸成為麩胺酸的突變(D5E)。在一些實施方式中，該GDF15區包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些實施方式中，該GDF15區包含在位置3處的天冬醯胺成為麩醯胺的突變(N3Q)，例如，具有胺基酸序列 SEQ ID NO：14。在又其他實施方式中，該GDF15區包含N3Q和D5E突變。在一些實施方式中，該GDF15區包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該融合蛋白具有接頭，該接頭是G4S(SEQ ID NO：19)或G4Q(SEQ ID NO：24)接頭，例如(G4S)n或(G4Q)n接頭，其中n大於0。在一些實施方式中，該融合蛋白具有接頭，該接頭是G4A(SEQ ID NO：58)接頭，例如(G4A)n接頭，其中n大於0。在一些實施方式中，n是1或2。在一些實施方式中，n大於2，例如3、4、5、6、7、或8。在一些實施方式中，該接頭包含SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25或58的胺基酸序列。
在一些實施方式中，該融合蛋白具有包含帶電荷的成對突變的Fc區。在一些實施方式中，該Fc區具有截短的鉸鏈區。在一些實施方式中，該Fc區選自表3。
本文還提供了包含本文所揭露的該融合蛋白的二聚體和四聚體。在一個實施方式中，該二聚體包含GDF15-Fc融合蛋白，該GDF15-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：39-57中任一個所述的胺基酸序列。在一些實施方式中，包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：32、33、34、35、36或37的胺基酸序列的Fc結構域二聚化，例如表6中所示。在一些實施方式中，這些二聚體形成了四聚體。還提供了生產和使用本文揭露的這些GDF15分子的方法。
[圖1]是示出如下資訊之圖：每週給藥媒介物、3mg/kg的陽性對照FGF21-Fc、1.5mg/kg的scFc-GDF15、或1.5mg/kg的二聚體Fc△10(-)- (G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)，持續六週，隨後進行五週的洗脫對食蟹猴體重的影響。
[圖2]是示出如下資訊之曲線圖：每週給藥媒介物、3mg/kg的陽性對照FGF21-Fc、1.5mg/kg的scFc-GDF15或1.5mg/kg的二聚體Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)，持續六週，隨後進行五週的洗脫對食蟹猴甘油三酯水平的影響。
[圖3]示出了在陽離子交換後的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15曲線圖。
[圖4]是Fc△10(+)-(G4)-GDF15的肽圖。
[圖5]是示出如下資訊之圖：對小鼠食物攝入的影響隨二聚體Fc△10(-)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：41和32)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：42和32)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K,CC)(SEQ ID NO：43和34)；Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)：Fc△10(+,K,CC)(SEQ ID NO：44和34)和Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：39和32)的劑量而變化。
[圖6]是小鼠中隨時間變化的Fc△10(-)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：41)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：42)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：43)；和Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：44)血清濃度的圖。
[圖7]是示出如下資訊之圖：每週給藥媒介物、3mg/kg的陽性對照FGF21-Fc、0.5mg/kg或3.0mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)：Fc△16(+,K,CC)(SEQ ID NO：45和35)、0.5mg/kg或3.0mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K,CC)(SEQ ID NO：46和35)或0.5mg/kg或3.0mg/kg的Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K) (SEQ ID NO：47和36)，持續四週，隨後進行四週的洗脫對食蟹猴體重的影響。
[圖8]是示出如下資訊之圖：每週給藥媒介物、1.5mg/kg的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：39和32)、1.5mg/kg的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)：Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：49和36)：1.5mg/kg的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：50和36)、1.5mg/kg的Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：54和36)、或1.5mg/kg的Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)(SEQ ID NO：57和37)，持續兩週對食蟹猴體重的影響。
[圖9]是投與Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：50和36)的ob/ob小鼠中食物攝入隨劑量變化之圖。
[圖10]是投與Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)(SEQ ID NO：57和37)的ob/ob小鼠中食物攝入隨劑量變化之圖。
本文提供了GDF15分子、製備這些分子的方法和使用這些分子之方法。在一些實施方式中，該GDF15分子是GDF15-Fc融合蛋白。該融合蛋白可包含連接至Fc區的GDF15區。在一些實施方式中，該GDF15區藉由接頭連接至該Fc。
在一些實施方式中，該GDF15區包含野生型GDF15。人和鼠GDF15均具有訊息肽和原結構域。全長人GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：1)。
全長人GDF15的胺基酸序列(308個胺基酸)是： 
(SEQ ID NO：2)。
不具有其訊息序列的人GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：3)。
不具有其29個胺基酸的訊息序列的人GDF15的胺基酸序列(279個胺基酸)是： 
(SEQ ID NO：4)。
不具有其訊息肽或原結構域的人GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：5)。
不具有其訊息肽或原結構域的人GDF15的胺基酸序列(112個胺基酸的GDF15的活性結構域)是： 
(SEQ ID NO：6)。
全長鼠GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：7)。
全長鼠GDF15的胺基酸序列(303個胺基酸)是： 
(SEQ ID NO：8)。
不具有其訊息序列的鼠GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：9)。
不具有其32個胺基酸的訊息序列的鼠GDF15的胺基酸序列(271個胺基酸)是： 
(SEQ ID NO：10)。
不具有其訊息序列或原結構域的鼠GDF15的核苷酸序列是： 
(SEQ ID NO：11)。
不具有其訊息肽或原結構域的鼠GDF15的胺基酸序列(115個胺基酸的活性結構域)是： 
(SEQ ID NO：12)。
在一些實施方式中，該GDF15分子包含GDF15區，該GDF15區包含GDF15(例如，不具有其訊息肽或原結構域的GDF15)的活性結構域。在一些實施方式中，該GDF15區包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12的胺基酸序列。在一些實施方式中，該GDF15區包含具有一個或多個突變(例如在GDF15的活性結構域中的至少一個突變)的GDF15序列。在具體的實施方式中，該一個或多個突變不減少或消除GDF15的活性。在一些實施方式中，該GDF15區包含在人GDF15的活性結構域中的突變。在一個實施方式中，該突變是活性結構域的前三個胺基酸的缺失，例如“GDF15(△3)”，其是缺失前三個胺基酸的人GDF15的活性結構域(即，SEQ ID NO：13)。
在一些實施方式中，該GDF15區包含在人GDF15(SEQ ID NO：6)的活性結構域的位置3處的天冬醯胺(N3)的突變。N3突變可以指GDF15胺基酸序列中的SEQ ID NO：6的位置3處的天冬醯胺殘基的突變或與GDF15胺基酸序列中的SEQ ID NO：6的位置3處的天冬醯胺相對應的天冬醯胺殘基的突變。在一些實施方式中，在位置3處的該天冬醯胺突變為麩醯胺(N3Q)或天冬胺酸(N3D)。因此，在一些實施方式中，該GDE15分子包含GDF15(N3Q)的GDF15區，其具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列。在其他的實施方式中，該GDF15分子包含GDF15(N3D)的GDF15區，其具有SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一些實施方式中，該 GDF15區包含在人GDF15(SEQ ID NO：6)的活性結構域的位置5處的天冬胺酸(D5)的突變。D5突變可以指在GDF15胺基酸序列的SEQ ID NO：6的位置5處的天冬胺酸殘基的突變或與GDF15胺基酸序列的SEQ ID NO：6的位置5處的天冬胺酸相對應的天冬胺酸殘基的突變。在一個實施方式中，在位置5處的該天冬胺酸突變為麩胺酸(D5E)。因此，在一些實施方式中，該GDF15分子包含GDF15(D5E)的GDF15區，其具有SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
在又其他實施方式中，該GDF15區包含突變的組合，例如△3和D5突變的組合，例如，GDF15(△3/D5E)(SEQ ID NO：17)或N3和D5突變的組合，例如，GDF15(N3D/D5E)或GDF15(N3Q/D5E)。在，該GDF15區包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
表1提供了可在GDF15分子中使用的GDF15區的實例。
在一些實施方式中，該GDF15分子直接融合至Fc。在其他的實施方式中，該Fc藉由接頭融合至該GDF15分子。在一些實施方式中，該接頭包含G4S(SEQ ID NO：19)接頭。在其他的實施方式中，該接頭包含G4Q(SEQ ID NO：24)接頭。在其他的實施方式中，該接頭包含G4A(SEQ ID NO：58)接頭。該接頭可以是(G4S)n或(G4Q)n接頭，其中n大於0。該接頭可以是(G4A)n接頭，其中n大於0。在一些實施方式中，n是1或2。在一些實施方式中，n大於或等於2，例如3、4、5、6、7、或8。在一些實施方式中，該接頭包含如表2所示的SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25或58的胺基酸序列。
[表2]-接頭 
在一些實施方式中，該GDF15分子包含Fc區。該Fc區可包含或衍生自抗體的重鏈的Fc結構域。在一些實施方式中，該Fc區可包含具有一個突變的Fc結構域，例如帶電荷的成對突變、在糖基化位點的突變或包含非天然胺基酸的突變。該Fc區可衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人IgG恒定結構域。在一些實施方式中，該Fc區包含IgA、IgD、IgE和IgM重鏈的恒定結構域。
在一些實施方式中，該Fc區包含具有帶電荷的成對突變的Fc結構域。藉由引入產生帶電荷的Fc區的突變，該GDF15分子可與帶有相反電荷的相應的Fc分子二聚化。例如，天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K，其中356是使用EU編號的位置，並且相對於如表3-5中所說明的這些位置)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K，其中399是使用EU編號的位置，並且相對於如表3-5中所說明的這些位置)可引入該Fc區，其視情況藉由接頭連接至GDF15區，產生GDF15分子的帶正電荷的Fc區。賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D；其中392和409是使用EU編號的位置並且相對於如表3-5中所說明的這些位置)可引入單獨的分子的Fc結構域中，產生帶負電荷的Fc分子。在帶負電荷的Fc分子中的天冬胺酸殘基可與GDF15分子的帶正電荷的Fc區的賴胺酸殘基藉由靜電力結合，促進Fc異源二聚體在 GDF15分子的Fc區和該Fc分子之間的形成，而減少或防止Fc同源二聚體在GDF15分子的Fc區之間或在Fc分子之間的形成。
在一些實施方式中，一個或多個賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D)引入至該Fc區，其視情況藉由接頭連接至GDF15區並且天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K)引入至另一分子的Fc結構域中。在GDF15分子的Fc區中的天冬胺酸殘基可與Fc分子的賴胺酸殘基藉由靜電力結合，促進Fc異源二聚體在GDF15分子的Fc區和該Fc分子之間的形成，並且減少或防止Fc同源二聚體在GDF15分子的Fc區之間或在Fc分子之間的形成。
在一些實施方式中，該GDF15分子包含Fc區，該Fc區包含具有突變的鉸鏈區的Fc結構域。在一些實施方式中，該Fc結構域包含在該鉸鏈區中的缺失。在一些實施方式中，來自鉸鏈區的十個胺基酸缺失，例如，Fc△10。在其他的實施方式中，來自鉸鏈區的十六個胺基酸缺失，例如，Fc△16。在一些實施方式中，該Fc結構域包含鉸鏈區缺失(例如，Fc△10或Fc△16)和帶電荷的成對突變，使得該Fc結構域帶正電荷或負電荷。例如，該Fc結構域可包含在鉸鏈區的十個胺基酸的缺失和賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D)，例如Fc△10(-)。在另一實施方式中，該Fc結構域可包含在鉸鏈區的十個胺基酸的缺失和天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K)，例如Fc△10(+)。在另一實施方式中，該Fc結構域可包含在鉸鏈區的十六個胺基酸的缺失和賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D)，例如Fc△16(-)。在另一實施方式中，該Fc結構域可包含在鉸鏈區的十六個胺基酸的缺失和天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K)，例如Fc△16(+)。
在一些實施方式中，包含鉸鏈區缺失和帶電荷的成對突變的Fc分子與此類的GDF15分子異源二聚化。例如，該Fc分子可具有鉸鏈區缺失和帶電荷的成對突變，該鉸鏈區缺失和帶電荷的成對突變補充GDF15分子的Fc區的鉸鏈區缺失和帶電荷的成對突變。例如，Fc分子可包含具有在鉸鏈區的十個胺基酸的缺失和賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D)的Fc結構域，例如Fc△10(-)，其可視情況包含C-末端賴胺酸(例如，Fc△10(-,K))。該Fc分子可與包含Fc△10(+)的GDF15分子異源二聚化。在另一實施方式中，該Fc分子可包含在鉸鏈區的十個胺基酸的缺失和天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K)，例如Fc△10(+)，其可視情況包含C-末端賴胺酸(例如，Fc△10(+,K))。該Fc分子可與包含Fc△10(-)的GDF15分子異源二聚化。在另一實施方式中，該Fc分子可包含在鉸鏈區的十六個胺基酸的缺失和賴胺酸-至-天冬胺酸突變(K392D、K409D)，例如Fc△16(-)，其可視情況包含C-末端賴胺酸(例如，Fc△16(-,K))。該Fc分子可與包含Fc△16(+)的GDF15分子異源二聚化。在另一實施方式中，該Fc分子可包含在鉸鏈區的十六個胺基酸的缺失和天冬胺酸-至-賴胺酸突變(E356K)和麩胺酸-至-賴胺酸突變(D399K)，例如Fc△16(+)，其可視情況包含C-末端賴胺酸(例如，Fc△16(-,K))。該Fc分子可與包含Fc△16(-)的GDF15分子異源二聚化。
在一些實施方式中，該Fc區或Fc分子包含具有L234A和/或L235A突變的Fc結構域，其中234和235是使用EU編號的位置並且相對於如表3-5中所說明的這些位置。該Fc結構域可包含L234A突變、L235A突變、帶電荷的成對突變、鉸鏈區缺失、或其任何組合。在一些實施方式中，該Fc結構域包含L234A突變和L235A突變。在一些實施方式中，該Fc結構域包含鉸鏈區缺失、L234A突變、L235A突變和帶電荷的成對突變，例如 Fc△10(+,L234A/L235A)、Fc△10(-,L234A/L235A)、Fc△16(+,L234A/L235A)或Fc△16(-,L234A/L235A)。在一些實施方式中，該Fc結構域包含視情況的C-末端賴胺酸，例如，Fc△10(+,K,L234A/L235A)、Fc△10(-,K,L234A/L235A)、Fc△16(+,K,L234A/L235A)或Fc△16(-,K,L234A/L235A)。
在一些實施方式中，該Fc區或Fc分子包含具有“半胱胺酸夾鉗”的Fc結構域。半胱胺酸夾鉗突變涉及藉由突變將半胱胺酸引入該Fc結構域的特定位置，使得當用也藉由突變將半胱胺酸引入特定位置的另一Fc結構域孵育時，二硫鍵(半胱胺酸夾鉗)可在該兩個Fc結構域之間(例如，在具有“半胱胺酸夾鉗”突變的Fc△16(+)結構域和具有“半胱胺酸夾鉗”突變的Fc△16(-)結構域之間)形成。可以將半胱胺酸引入至Fc結構域的CH3結構域。在一些實施方式中，Fc結構域可含有一個或多個此類的半胱胺酸夾鉗突變。在一個實施方式中，藉由將絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C，其中354是使用EU編號的位置並且相對於如表3-5中所說明的位置)引入至第一Fc結構域並且將酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C，其中349是使用EU編號的位置並且相對於如表3-5中所說明的位置)引入至第二Fc結構域，提供半胱胺酸夾鉗。在一個實施方式中，GDF15分子包含含有Fc結構域的Fc區(該Fc結構域具有半胱胺酸夾鉗、帶負電荷的成對突變和十六個胺基酸的鉸鏈區缺失(例如，GDF15-Fc△16(-,CC)))和含有Fc結構域的Fc分子(該Fc結構域包含半胱胺酸夾鉗、帶正電荷的成對突變和十六個胺基酸的鉸鏈區缺失和視情況的C-末端賴胺酸(例如，Fc△16(+,K,CC)))。該半胱胺酸夾鉗可增加GDF-Fc分子與Fc分子的異源二聚化。
可在GDF15分子中使用的Fc區的實例示出於表3中。
Fc分子的實例示出於表4中，其中C-末端賴胺酸是視情況的。
這些Fc分子可用於與包含互補Fc結構域的分子二聚化。例如，Fc△10(+,K)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失 和帶負電荷的成對突變例如，Fc△10(-))的分子(例如，包含Fc△10(-)的Fc區的GDF15分子)二聚化。Fc△10(-,K)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失和帶負電荷的成對突變例如，Fc△10(+))的分子(例如，包含Fc△10(+)的Fc區的GDF15分子)二聚化。
Fc△10(+,K,CC)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失和帶負電荷的成對突變例如，Fc△10(-,CC))的分子(例如，包含Fc△10(-,CC)的Fc區的GDF15分子)二聚化。Fc△16(+,K,CC)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失和帶負電荷的成對突變例如，Fc△16(-,CC))的分子(例如，包含Fc△16(-,CC)的Fc區的GDF15分子)二聚化。Fc△16(+,K)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失和帶負電荷的成對突變例如，Fc△16(-))的分子(例如，包含Fc△16(+)的Fc區的GDF15分子)二聚化。Fc△10(+,K,L234A/L235A)的Fc分子可與包含Fc區(該Fc區包含十個胺基酸的鉸鏈區缺失和帶負電荷的成對突變例如，Fc△10(-,L234A/L235A))的分子(例如，包含Fc△10(-,L234A/L235A)的Fc區的GDF15分子)二聚化。
為GDF15-Fc融合蛋白的GDF15分子的實例示出於表5中。
在一些實施方式中，該融合蛋白是scFc-GDF15，其中該GDF15區連接至兩個Fc區。在一些實施方式中，該融合蛋白包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：38具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性。在一些實施方式中，該融合蛋白包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列。在計算百分比序列同一性時，將比較的序列以給出序列間最大匹配的方式進行比對。可用於確定百分比同一性的電腦程式是GCG套裝程式，該GCG套裝程式包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res.[核酸研究]12：387；Genetics Computer Group[遺傳學電腦集團]，威斯康辛大學，威斯康辛州麥迪森)。電腦演算法GAP可用於比對要確定百分比序列同一性的兩種多肽或多核苷酸。比對這些序列它們各自的胺基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，由演算法確定)。空位開放罰分(計算為對角線平均值的3倍，其中“對角線平均值”是所使用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是由特定的比較矩陣分配給每個完美胺基酸匹配的分數或數字)和空位延伸罰分(通常是空位開放罰分的1/10倍)、以及例如PAM 250或BLOSUM 62的比較矩陣與演算法結合使用。在某些實施方式中，演算法也使用標準比較矩陣(PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白質序列和結構圖集]5：345-352；BLOSUM 62比較矩陣參見Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國科學院院刊]9：10915-10919)。可用於使用GAP程式確定百分比同一性的參數為如下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]48：443-453；比較矩陣：來自Henikoff等人，1992，同上的BLOSUM 62；空位罰分：12(但是末端空位無罰分)空位長度罰分：4 相似性閾值：0用於比對兩個胺基酸序列的某些比對方案可產生僅兩個序列的短區域匹配，並且即使在兩個全長序列之間沒有顯著關係，該小的比對區域也可具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，可以調整所選擇的比對方法(例如，GAP程式)，以產生跨越靶多肽的至少50個連續胺基酸的比對。
在一些實施方式中，該GDF15分子是Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15、Fc△10(+)-(G4)-GDF15、Fc△10(-)-GDF15(△3)、Fc△10(-)-GDF15(N3D)、Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)、Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)、Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)、Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q)、Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)或Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)。
在一些實施方式中，該GDF15分子包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列。在一些實施方式中，該GDF15分子包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性。在一些實施方式中，該GDF15分子包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、或57具有至少85%序列同一性。在一些實施方式中，該GDF15分子包含胺基酸序列，該胺基酸序 列與SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、或57具有至少90%序列同一性。在一些實施方式中，該GDF15分子包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、或57具有至少95%序列同一性。在一些實施方式中，該GDF15分子包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、或57具有至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，該GDF15分子是Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15、Fc△10(+)-(G4)-GDF15、Fc△10(-)-GDF15(△3)、Fc△10(-)-GDF15(N3D)、Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)、Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)、Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)、Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q)、Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)或Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子。在一些實施方式中，該GDF15分子是Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15、Fc△10(+)-(G4)-GDF15、Fc△10(-)-GDF15(△3)、Fc△10(-)-GDF15(N3D)、Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)、Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)、Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)、Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4S)2- GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q)、Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)或Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子，該分子與其Fc區和/或GDF15區具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性。
在一些實施方式中，該GDF15分子是Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15、Fc△10(+)-(G4)-GDF15、Fc△10(-)-GDF15(△3)、Fc△10(-)-GDF15(N3D)、Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)、Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)、Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)、Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q)、Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)、Fc△16(-)-GDF15(N3Q)、Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)或Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子，該分子與其Fc區和/或GDF15區具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性。例如，與其Fc區和/或GDF15區具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15分子包括具有Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十個胺基酸缺失和帶負電荷的成對突變，並且與SEQ ID NO：26具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：6具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性。例如，與其Fc區和/或GDF15區具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15分子包括具有Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十個胺基酸缺失和帶負電荷的成對突 變，並且與SEQ ID NO：26具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性。
在另一個實例中，與其Fc區和/或GDF15區具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子包括具有Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十六個胺基酸缺失和帶負電荷的成對突變，與SEQ ID NO：30具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：18具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性。在另一個實例中，與其Fc區和/或GDF15區具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子包括具有Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十六個胺基酸缺失和帶負電荷的成對突變，並且與SEQ ID NO：30具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：18具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性。
在又另一個實例中，與其Fc區和/或GDF15區具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性的Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子包括具有Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十個胺基酸缺失、帶負電荷的成對突變和在位置234和235處的亮胺酸至丙胺酸突變並且與SEQ ID NO：31具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：18具有80%-99%、85%-99%、90%-99%或95%-99%序列同一性。在又另一個實例中，與其Fc區和/或GDF15區具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的Fc△10(-,L234A/L235△)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)分子包括具有 Fc區和/或GDF15區的GDF15分子，該Fc區具有鉸鏈區的十個胺基酸缺失、帶負電荷的成對突變和在位置234和235處的亮胺酸至丙胺酸突變並且與SEQ ID NO：31具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性，該GDF15區與SEQ ID NO：18具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性。
本文還提供了包含本文所提供的GDF15分子的二聚體和四聚體。在一個實施方式中，該二聚體包含GDF15-Fc融合蛋白，該GDF15-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：39-57中任一個所述的胺基酸序列。在一些實施方式中，包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：32、33、34、35、36或37的胺基酸序列的Fc分子(其中C-末端賴胺酸是視情況的)二聚化，例如表6中所示。例如，在一些實施方式中，該二聚體是Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)。在另一實施方式中，該二聚體是Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)。在又另一個實施方式中，該二聚體是Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)。
在一個實施方式中，包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：32的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：33的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：32的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：32的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：34的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：34的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：34的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：35的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：35的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情 況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：36的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：37的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。在另一實施方式中，包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的GDF15-Fc融合蛋白與包含SEQ ID NO：37的Fc分子(C-末端賴胺酸視情況)二聚化。
在一些實施方式中，這些二聚體形成了四聚體。例如，在表6中的這些二聚體可形成四聚體。在一些實施方式中，這些四聚體從這些相同的二聚體形成。在一些實施方式中，Fc△10(-)-(G4S)4- GDF15：Fc△10(+,K)；Fc△10(+)-(G4)-GDF15：Fc△10(-,K)；Fc△10(-)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)：Fc△10(+,K)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K,CC)；Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)：Fc△10(+,K,CC)；Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)：Fc△16(+,K,CC)；Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K,CC)；Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-(G4S)2-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)；Fc△16(-)-GDF15(N3Q)：Fc△16(+,K)；Fc△10(-,L234△/L235△)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)；or Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)中的兩個二聚體形成四聚體，例如藉由兩個GDF15區的二聚化。
本文還提供了用於生產本文所揭露的GDF15和Fc分子的宿主細胞(包含核酸和載體)。在多個實施方式中，將該載體或核酸整合進宿主細胞基因組，在其他的實施方式中，該載體或核酸是染色體外的。
提供了包含此類核酸、載體或核酸或載體中的一者或兩者的組合的重組細胞(例如酵母、細菌(例如，大腸桿菌)和哺乳動物細胞(例如，永生化哺乳動物細胞))。在各種實施方式中，包含非整合型核酸(例如質粒、黏粒、噬菌粒或線性表現元件)的細胞，該非整合型核酸包含編碼GDF15分子和/或Fc分子的表現的序列。在一些實施方式中，該細 胞包含用於產生GDF15分子的核酸並且另一細胞包含用於產生Fc分子以與GDF15分子二聚化的核酸(例如，用於在一個細胞中編碼GDF15分子的載體和用於在第二個細胞中編碼Fc分子的第二載體)。在其他的實施方式中，宿主細胞包含用於產生GDF15分子和Fc分子的核酸(例如，編碼兩種分子的載體)。在另一實施方式中，宿主細胞包含用於產生GDF15分子的核酸和用於產生Fc分子的另一核酸(例如，在一個宿主細胞中的兩個不同的載體，一個編碼GDF15分子並且一個編碼Fc分子)。
包含編碼GDF15分子和/或Fc分子的核酸序列的載體可以藉由轉化或轉染，例如藉由本領域已知的方法，引入至宿主細胞中。
可以經由病毒載體將編碼GDF15分子的核酸放置於和/或遞送至宿主細胞或宿主動物。病毒載體可包含單獨的或與一個或多個病毒蛋白組合的任何數量的病毒多核苷酸，病毒蛋白促進本發明的核酸在所希望的宿主細胞中的遞送、複製和/或表現。該病毒載體可以是多核苷酸，該多核苷酸包含病毒基因組的全部或部分、病毒蛋白/核酸綴合物、病毒樣顆粒(VLP)或包含病毒核酸和編碼包含GDF15區的多肽的核酸的完整的病毒顆粒。病毒顆粒病毒載體可包含野生型病毒顆粒或經修飾的病毒顆粒。該病毒載體是如下載體：該載體的複製和/或表現需要另一種載體或野生型病毒(例如腺病毒載體擴增子)的存在(例如，病毒載體可以是輔助依賴性病毒)。在此方面，合適的病毒載體顆粒包括例如，腺病毒載體顆粒(包括屬於或衍生自腺病毒科病毒的任何病毒)、腺相關病毒載體顆粒(AAV載體顆粒)或其他的細小病毒和細小病毒載體顆粒、乳頭狀瘤病毒載體顆粒、黃病毒載體、甲病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體、逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)。
GDF15分子可以使用標準蛋白純化方法分離。包含GDF15區的多肽可以從已經工程化以表現包含GDF15區的多肽的細胞(例如非天然地表現天然GDF15的細胞)中分離。可以使用本領域已知的蛋白純化方法以及相關的材料和試劑來分離GDF15分子。在本文的實例中也提供了純化GDF15分子的方法。可用於分離GDF15分子的另外的純化方法可在以下參考文獻中找到，例如，Bootcov MR,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國科學院院刊]94：11514-9,Fairlie WD,2000,Gene[基因]254：67-76。
還提供了包含GDF15分子(和視情況Fc分子，例如本文揭露的二聚體或四聚體)的藥物組成物。此類多肽藥物組成物可包含治療有效量的GDF15分子與為適合投與方式選擇的藥學上或生理上可接受的配製劑或載體混合。該藥學上或生理上可接受的配製劑可以是一種或多種配製劑，該一種或多種配製劑適合實現或提高GDF15分子向人或非人受試者體內的遞送。藥學上可接受的物質例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑(該物質提高GDF15分子的保質期或有效性)也可作為配製品載體，或形成配製品載體的組分。可接受的藥學上可接受的載體較佳地是在所使用的劑量和濃度下對接受者無毒性的。該藥物組成物可含有一種或多種配製劑用於改變、保持或保存組成物的以下方面：例如，pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或滲透性。
將在醫療上使用的包含GDF15分子的藥物組成物的有效量將取決於例如治療背景和目的。熟悉該項技術者將理解，治療的適當劑量水平因此將部分地根據遞送的分子、使用GDF15分子的適應症、投與途徑和受試者的尺寸(體重、體表或器官尺寸)和狀況(年齡和一般健康狀況)而變化。給藥頻率取決於所用配製品中GDF15分子的藥物動力學參數。
該藥物組成物的投與途徑可以是口服；藉由靜脈內途徑、腹膜內途徑、腦內途徑(腦實質內途徑)、腦室內途徑、肌內途徑、眼內途徑、動脈內途徑、門靜脈內途徑或病灶內途徑的注射；藉由緩釋系統(該途徑也可以注射)；或藉由植入設備。如果希望，這些組成物可以藉由快速濃注投與或藉由輸注或藉由植入設備連續投與。該組成物還可以藉由植入膜、海綿或其他適當的材料局部投與，所希望的分子已被吸收或包封在這些材料上。在使用植入設備的情況下，可以將設備植入任何合適的組織或器官中，並且可以藉由擴散、定時釋放快速濃注或連續投與來遞送所希望的分子。
GDF15分子可用於治療，診斷或改善代謝病症或障礙。在一個實施方式中，該代謝障礙是糖尿病，例如，2型糖尿病。在另一實施方式中，該代謝病症或障礙是肥胖症。在其他的實施方式中，該代謝病症或障礙是血脂紊亂、葡萄糖水平升高、胰島素水平升高或糖尿病腎病。例如，可以使用GDF15分子治療或改善的代謝病症或障礙包括其中人類受試者具有125mg/dL或更高，例如130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或大於200mg/dL的空腹血糖水平的情形。血糖水平可以在進食或禁食狀態下，或在隨意狀態下測定。該代謝病症或障礙還可包含如下情形：受試者患上代謝病症的風險增加。對於人類受試者，此類病症包括100mg/dL的空腹血糖水平。可以使用包含GDF15分子的藥物組成物治療的病症也可以發現於American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care 2011[美國糖尿病協會2011年糖尿病護理醫療標準]，American Diabetes Association,Diabetes Care[美國糖尿病協會：糖尿病護理]第34卷，增補版第1期，S11-S61,2010。
可以例如藉由靜脈內(IV)注射、腹膜內(IP)注射、皮下注射、肌內注射、或以片劑或液體組成物的形式口服進行投與。GDF15分子的治療有效劑量將取決於投與方案、投與的藥劑的單位劑量、GDF15分子是否與其他治療劑組合投與、免疫狀態和接受者的健康。治療有效劑量是GDF15分子的量，該GDF15分子的量將引起由研究人員、醫生或其他臨床醫師正在尋求的組織系統、動物或人的生物學或醫學應答，該生物學或醫學應答包括緩解或改善待治療的疾病或障礙的症狀，即，該GDF15分子的量支持可觀察到的水平的一個或多個所希望的生物學或醫學應答，例如，降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；減輕體重；改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性；或減少食物攝入。GDF15分子的治療有效劑量還可以隨著所希望的結果而變化。
本文還提供了一種方法，該方法包括測量受試者的一個或多個代謝相關化合物例如葡萄糖、胰島素、膽固醇、脂質的基線水平，投與受試者包含GDF15分子的藥物組成物，和在所希望的一段時間後，測量受試者的一個或多個代謝相關化合物(例如，血糖、胰島素、膽固醇、脂質)的水平。然後可以比較這兩個水平以確定受試者的代謝相關化合物的相對改變。根據比較的結果，可投與該藥物組成物的另一劑量以實現一個或多個代謝相關化合物的所希望的水平。
包含GDF15分子的藥物組成物可以與另一種化合物或治療劑共同投與。GDF15分子(和視情況，其相應的Fc分子)可以和另一種治療劑，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；減輕體重；減少食物攝入；改善葡萄糖耐量、能量消耗、或胰島素敏感性的藥劑；或其任何組合(例如，抗糖尿病劑、降血脂劑、抗肥胖症劑、抗高血壓劑、或過氧化物酶體增殖因子-活化劑受體的激動劑)組合投與。與GDF15分子共同投與的 化合物的特性和性質將取決於待治療或改善的病症的性質。與本文揭露的GDF15分子一起投與的藥劑可以是GLP-1R激動劑，例如GLP-1或其類似物；或激動肽、激動肽類似物或激動肽激動劑。可與該藥物組成物組合投與的化合物的實例的非限制性清單包括利拉魯肽、羅格列酮、匹格列酮、瑞格列奈、nateglitinide、二甲雙胍、艾塞那肽、西他列汀(stiagliptin)、普蘭林肽、格列吡嗪、格列美脲阿卡波糖(glimeprirideacarbose)、奧利司他、鹽酸氯卡色林、苯丁胺托吡酯(phenterminetopiramate)、納曲酮安非他酮(naltrexonebupropion)、塞美蘭肽(setmelanotide)、索馬魯肽、朗來納肽(efpeglenatide)、卡格列淨、LIK-066、SAR-425899、Tt-401、FGFR4Rx、HDV-生物素和米格列醇。
在一個實施方式中，包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列的GDF15分子與另一種化合物或治療劑(例如利拉魯肽)一起投與。
在另一實施方式中，GDF15分子和相應的Fc分子(分別地包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：39和32(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：40和33(C-末端賴胺酸視情況)、SEQ ID NO：41和32(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：42和32(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：43和34(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：44和34(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：45和35(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：46和35(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：47和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：48和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：49和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：50和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：51和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：52和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：53和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：54和36(C-末 端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：55和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：56和37(C-末端賴胺酸視情況)；或SEQ ID NO：57和37(C-末端賴胺酸視情況))與另一種化合物或治療劑(例如利拉魯肽)一起投與。
在另一實施方式中，分別地包含SEQ ID NO：50和36(C-末端賴胺酸視情況)的胺基酸序列的GDF15分子和相應的Fc分子與另一種化合物或治療劑(例如利拉魯肽)一起投與。在另一實施方式中，分別地包含SEQ ID NO：57和37(C-末端賴胺酸視情況)的胺基酸序列的GDF15分子和相應的Fc分子與另一種化合物或治療劑(例如利拉魯肽)一起投與。
與另一種治療劑一起投與GDF15分子可包括並行投與治療有效量的該GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)和治療有效量的另一種治療劑。與另一種治療劑一起投與的GDF15分子可包括相繼投與治療有效量的GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)和治療有效量的另一種治療劑，例如，投與治療有效量的GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)，隨後投與治療有效量的另一種治療劑或投與治療有效量的另一種治療劑，隨後投與治療有效量的GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)。可以在投與治療有效量的另一種治療劑後至少1、2、3、4、5、6或7天投與治療有效量的GDF15分子(和視情況，其相應的Fc分子)。在另一實施方式中，可以在投與治療有效量的GDF15分子(和視情況，其相應的Fc分子)後至少1、2、3、4、5、6或7天投與治療有效量的另一種治療劑。
與另一種治療劑並行投與GDF15分子可包括投與包含GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)和另一種治療劑的組成物，例如，治療有效量的GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)與治療有效量的另一種藥劑在投與之前組合。在另一實施方式中，並行投與GDF15分子(和視情況 其相應的Fc分子)和另一種治療劑可包括並行投與包含GDF15分子的第一種組成物和包含另一種治療劑的第二組成物。
在一些實施方式中，GDF15分子與另一種治療劑一起投與具有協同效應。在一個實施方式中，該效應大於單獨的GDF15分子(和視情況其相應的Fc分子)或另一種藥劑。在另一實施方式中，該效應大於兩種藥劑(GDF15分子和視情況其相應的Fc分子、加另一種藥劑)的累加效應。在一個實施方式中，組合療法(即，投與GDF15分子視情況和其相應的Fc分子、和另一種治療劑)比GDF15單一療法(投與GDF15分子和視情況其相應的Fc分子)具有大於1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30倍的效應。在另一實施方式中，組合療法(即，投與GDF15分子視情況和其相應的Fc分子、和另一種治療劑)比用另一種藥劑的單一療法具有大於1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30倍的效應。該效應可以是體重減輕的量(例如，總質量或身體變化百分比的降低)；血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的降低；葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性的改善；或食物攝入的減少。該協同效應可以是投與後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。
在一個實施方式中，GDF15分子和相應的Fc分子(分別地包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：39和32(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：40和33(C-末端賴胺酸視情況)、SEQ ID NO：41和32(C-末端賴胺酸視情 況)；SEQ ID NO：42和32(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：43和34(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：44和34(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：45和35(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：46和35(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：47和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：48和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：49和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：50和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：51和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：52和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：53和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：54和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：55和36(C-末端賴胺酸視情況)；SEQ ID NO：56和37(C-末端賴胺酸視情況)；或SEQ ID NO：57和37(C-末端賴胺酸視情況))與GLP-1R激動劑(例如，利拉魯肽或激動肽或其類似物或激動劑)一起投與比GDF15單一療法具有大於1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30倍的效應；比GLP-1R激動劑單一療法(即，投與單獨的GLP-1R激動劑)具有大於1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30倍的效應；或具有這兩種效應，這兩種效應是投與該一種或多種藥劑後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。
詳細描述和以下實例說明了本發明，並且不應解釋為將本發明限制於此。熟悉該項技術者可以基於本發明的描述進行各種改變和修改，並且這些改變和修改也包括在本發明中。
以下實例(包括進行的實驗和實現的結果)僅提供解釋說明目的，並且不應被解釋為限制本發明。
製備了scFc-GDF15(SEQ ID NO：38)和Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)的GDF15分子並且測試了這些分子的活性。
Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)在適應無血清懸浮培養的CHO-K1細胞系中穩定地表現。將其克隆至含有嘌呤黴素抗性的穩定表現載體中，而將用於與Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15、Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：32)形成異源二聚體的Fc鏈選殖至含潮黴素的表現載體(Selexis公司(Selexis,Inc.))中。這些質粒以1：1的比率使用lipofectamine LTX轉染並且在轉染後2天在含有10ug/mL嘌呤黴素和600ug/mL潮黴素的專用生長培養基中對細胞進行選擇。在選擇期間每週更換2次培養基。當細胞達到約90%活力時，將它們按比例擴大以進行分批式生產運行。將細胞以2 x 106/mL接種在生產培養基中。在第7天收穫細胞產生的條件培養基(CM)並且澄清。端點活力通常是高於90%。
將Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)(和任意成對的Fc)澄清。使用兩步層析法程序將條件培養基純化。將大約5L的CM直接應用至GE MabSelect SuRe柱上，該柱提前用杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，PBS)平衡。結合蛋白經歷三個 清洗步驟：首先，3個柱體積(CV)的PBS；其次，1CV的20mM Tris、100mM氯化鈉、pH 7.4；和最後，3CV的500mM L-精胺酸、pH 7.5。這些清洗步驟除去了未結合的或輕微結合的培養基組分和宿主細胞雜質。該柱然後用5CV的20mM Tris、100mM氯化鈉在pH 7.4重新平衡，這將UV吸光度調節回基線。所希望的蛋白用100mM乙酸在pH 3.6洗脫並且整批收集。使用1M Tris-HCl、pH 9.2將蛋白池快速滴定到pH範圍為5.0至5.5。然後將pH經調節的蛋白池載入到GE SP Sepharose® HP柱上，該柱提前用20mM 2-乙磺酸(MES)在pH 6.0平衡。然後將結合蛋白用5CV的平衡緩衝液清洗，並且最後經20CV、0至50%線性梯度(從0至400mM氯化鈉，在20mM MES中，pH 6.0)洗脫。在洗脫過程中收集級分，並藉由分析型尺寸排阻層析法(Superdex® 200)進行分析，以確定合適的級分以合併均質產物。SP HP層析法去除了與產物相關的雜質，例如游離Fc、剪除的種類(clipped species)和Fc-GDF15多聚體。然後藉由滲析將SP HP池緩衝交換到10mM乙酸鈉、5%脯胺酸、pH 5.2中。使用Sartorius Vivaspin® 20十千道爾頓分子量截留離心設備將其濃縮至大約15mg/ml。最後，將其無菌過濾，並將含有純化的Fc-GDF15分子的所得溶液在5℃儲存。使用質譜分析、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳和尺寸排阻高效液相層析法評估最終產物的特性和純度。
以相似的方式製備ScFc-GDF15(SEQ ID NO：38)。這一GDF15分子在CHO/CS9細胞系中穩定地表現。將這些分子選殖至穩定表現載體中。將這些質粒(線性化的)以1：1的比率使用電穿孔轉染並且在轉染後2天對細胞進行選擇。在選擇期間每週更換3次培養基。當細胞達到約90%活力時，將它們按比例擴大以進行分批補料式生產運行。將細胞以1 x 106/mL接種在生產培養基中並且當細胞數目達到4-5 x 106/ml時補料一 次。在第10天收穫細胞產生的條件培養基(CM)並且澄清。端點活力通常是高於90%。將ScFc-GDF15澄清並且將條件培養基使用兩步層析偶聯法程序純化。合併來自多次收穫的條件培養基並且將其藉由切向流過濾使用1sq ft Pellicon® 2 10kD再生纖維素膜(Millipore)藉由超濾濃縮近5倍。將大約5L的濃縮的CM直接應用至GE MabSelect SuRe柱上，該柱提前用杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡。藉由12CV PBS洗滌步驟除去非特異性結合的蛋白。將所希望的蛋白用0.5%乙酸(pH 3.5、150mM NaCl)以3CV洗脫並且在儲存回路中收集。將收集的蛋白池直接載入到GE HiLoad 26/60 Superdex 200製備等級分級柱上，該柱提前用30mM乙酸鹽(pH 5.0、150mM NaCl)平衡。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳分析在分級運行過程中收集的峰值級分，以確定合適的級分以合併均質產物。藉由添加10%冰乙酸，將最終分級池的pH調節至pH 4.5，並且然後藉由滲析將其緩衝交換到10mM乙酸鈉、9%(w/v)蔗糖、pH 4.5。使用十千道爾頓分子量截留離心設備將其濃縮至高於15mg/ml。藉由3個冷凍和解凍循環測試蛋白對冷凍的穩定性。最後，將最後一批進行無菌過濾，並將含有純化的GDF15分子的所得溶液在-80℃儲存。使用質譜分析、n-末端測序、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳和尺寸排阻高效液相層析法評估最終產物的特性和純度。
然後分析scFc-GDF15和Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15的活性以用於體內活性。每週投與食蟹猴(n=10每組)媒介物、3mg/kg的陽性對照FGF21-Fc、1.5mg/kg的scFc-GDF15或1.5mg/kg的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15：Fc△10(+,K)，持續六週，隨後進行五週的洗脫。測定了體重和甘油三酯水平。對雄性天生自發肥胖的食蟹猴針對健康且具有體重指數>41進行預篩選。在治療前，使這些猴適應獨立的住所、實驗程序和處理，持續 6週。將這些猴分成4組，每週接受一次SC注射，持續6週(第0、7、14、21、28和35天)，每組有相似的基線。在治療期，在給藥前第-24、-17和-10天和第6、13、20、27、34、和41天(在每週給藥後6天)，收集過夜空腹血液樣品。在洗脫期期間，在第48、55、62、69和76天收集血液樣品。每週測量一次體重並在整個研究中每天監控每隻猴的食物攝入。每隻猴在早晨和晚上餵食時在有限的時間(1小時)內接受無限制的餵食，間隔大約8小時。在兩餐之間提供150g蘋果零食，持續有限的時間(1小時)。取出剩餘的食物或蘋果並在每餐或零食後稱重以計算食物攝入。
GDF15-Fc融合蛋白使體重(圖1)和甘油三酯水平(圖2)降低，這與FGF21-Fc相似。
分析如實例1所描述的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)分子和Fc△10(+)-(G4)-GDF15(SEQ ID NO：40)的可能影響其穩定性和可製造性(例如，用於商業製造)的屬性。測定了GDF15分子(例如，Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15和Fc△10(+)-(G4)-GDF15)是高度異質的(例如，Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15的離子交換柱級分分析示出該分子是高度異質的，圖3)，這是對分子可製造性來說不希望的特徵。為了確定產生高度異質群體的GDF15分子的屬性，藉由尺寸排阻層析法、SDS PAGE凝膠和質譜分析進行了分子分析。藉由尺寸排阻層析法在保留時間方面缺乏差異表明聚集或總降解不太可能是異質性的原因。在SDS PAGE凝膠上也存在差異，這表明二硫鍵錯配(disulfide mispairing)或總降解也不太可能是異質性的原因。
也進行了MS分析以評估Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)的異質性。使用mono S、1ml柱純化GDF15分子並且收集級分數25 (P1)、級分數28(P2)和級分數31(P3)(圖3)並進行MS分析。將約50μg的這些級分乾燥，重新懸浮在25μL的150mM Tris、pH 7.5/8M尿素/40mM羥胺/10mM DTT中，並且然後在37℃孵育1小時。將樣品在室溫在黑暗中用20mM碘乙醯胺(IAM)烷基化30分鐘。然後用水和2μg的胰蛋白酶(1：25)將樣品稀釋至100μL，並在37℃消化過夜。將消化液酸化，隨後注入沃特斯公司(Waters)(麻塞諸塞州米爾福德)NanoAcquity UPLC系統。先將樣品以15μL/min載入到180μm X 20mmSymmetry C18捕獲柱上，隨後在安捷倫公司(Agilent)(加利福尼亞州聖克拉拉)Zorbax 0.5mm X 250mm 300SB-C18柱上進行肽分離。緩衝液A是0.1%甲酸/水，而緩衝液B是0.1%甲酸/99.9%乙腈。梯度由以下組成：在1% B的初始條件，隨後在85分鐘內增加至45% B，在1分鐘內增加至97% B，在97% B等度進行6分鐘，在3分鐘內增加至1% B，和然後在1% B等度進行20分鐘。使用標準加熱的電灑電離II(HESI II)電離源將UPLC柱流出物噴霧到賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)(加利福尼亞州聖約瑟)Orbitrap Velos Pro質譜儀中。質譜儀方法由以下組成：以30K解析度m/z[300-2000]的全MS掃描，隨後是前10個最豐富的前體離子的MS/MS(CID活化)。以下儀器參數用於分析：電源電壓=3.5kV；毛細管溫度=275℃；S-透鏡RF水平=50%；活化時間=10msec；標準化碰撞能量=35；分離寬度=2.0Da；和閾值=1.0E4。Thermo Xcalibur 2.1軟體的Xtract組件用於高解析度MS數據的反卷積。使用1.2的S/N閾值和以m/z 400的100,000解析度對來自[300-2000]的平均數據進行反卷積。反卷積的肽質量(糖基化的和非糖基化的)顯示為單一同位素[M+H]+。藉由聚糖亞基的逐步喪失和非糖基化前體離子作為CID活化後最強烈的片段的存在證實了各種糖基化種類。
MS結果示出，不同程度的脫醯胺種類(例如，P1的70%，P2的47%和P3的24%)和接頭上的糖基化分佈(主要是單糖和三糖)有助於GDF15分子的高度異質性，如其CEX譜中所示(圖3)。確定了(G4S)4接頭(例如，存在於Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15中)是高度糖基化和磷酸化的，具有不同程度和類型的糖基化和/或磷酸化，並且野生型人GDF15的活性片段的N-末端對脫醯胺和異構化高度敏感(參見例如圖4，這示出從完整質譜數據中提取的某些質量，其對應於在位置3處含有天冬醯胺的肽的未修飾的、脫醯胺的和異構化的種類。提取的质量是來自肽的雙電荷形式的m/z[590.25-590.75])。在位置3處的天冬醯胺(參考SEQ ID NO：6，編碼hGDF15的活性片段的胺基酸序列)對脫醯胺和異構化高度敏感並且在位置5處的天冬胺酸(參考SEQ ID NO：6，編碼hGDF15的活性片段的胺基酸序列)對異構化高度敏感。
基於這些屬性，製造GDF15-Fc融合蛋白(該融合蛋白具有野生型人GDF15的活性片段和連接Fc區的接頭)的普遍同質的群體(例如，用於商業製造)將是具有挑戰性的。
為解決實例2中描述的異質性問題，1)消除GDF15區和該Fc區之間的接頭和2)消除或替換了野生型人GDF15(例如，GDF15(△3)的活性片段(SEQ ID NO：13)的N-末端殘基(其中野生型人GDF15的活性片段的前三個胺基酸缺失)的新GDF15-Fc融合蛋白；或GDF15(N3D)(SEQ ID NO：16)(其中野生型人GDF15的活性片段上在位置3處的天冬醯胺突變為天冬胺酸))。
除了GDF15-Fc融合蛋白的Fc區的帶電荷的成對突變和用於Fc分子與GDF15-Fc融合蛋白的Fc區的非共價結合以形成異源二聚體的Fc分 子，設計了使這些新分子的一些還包括在CH3區內的鏈間二硫鍵或“半胱胺酸夾鉗”(其名稱中包括“CC”的分子)以增加GDF-Fc分子與Fc分子的異源二聚化。
產生了四個新GDF15-Fc融合蛋白，其中1)GDF15區和Fc區之間的接頭缺失和2)GDF15的N-末端殘基被消除或替換。在這四個分子的兩者中，還將鏈間二硫鍵引入至GDF15-Fc融合蛋白的Fc區的CH3結構域(以及其相應的Fc分子用於異源二聚化)。在小鼠中對這些分子(Fc△10(-)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：41)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：42)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：43)；Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：44))的效力和藥物動力學(PK)特性與前一代Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)進行了比較。
為了確定這些分子的效力，測定了食物攝入。將7至8週齡的單獨圈養的雄性ob/ob小鼠分成不同的治療組，每組具有相當的治療前體重和食物攝入水平。這些動物用0.32ug/kg、1.6ug/kg、8ug/kg、40ug/kg、0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg的GDF15-Fc融合蛋白(二聚體：Fc△10(-)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：41和32)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)：Fc△10(+,K)(SEQ ID NO：42和32)；或Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)：Fc△10(+,K,CC)(SEQ ID NO：39和32))藉由皮下注射治療，並且測量過夜食物攝入。呈現的數據是2-4個獨立研究的平均數(圖5)。這四個新分子Fc△10(-)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：41)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：42)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：43)；和Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：44)與前一代GDF15-Fc融合蛋白Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)具有相當的效力。
為了確定分子的藥物動力學，18週齡的雄性飲食誘導的肥胖型C57Bl/6小鼠皮下給藥1mg/kg蛋白，並且在給藥後1、4、8、24、72、168、240和336小時進行連續取樣。這四個新分子Fc△10(-)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：41)；Fc△10(-)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：42)；Fc△10(-,CC)-GDF15(△3)(SEQ ID NO：43)；和Fc△10(-,CC)-GDF15(N3D)(SEQ ID NO：44)與前一代GDF15-Fc融合蛋白Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(SEQ ID NO：39)具有相當的藥物動力學特性(圖6)。
由於新設計的具有改善的可製造性和穩定性屬性的分子與前一代分子具有相似的效力和PK特性，因此進一步工程化這些分子以減少可能的異質性並降低Fc效應子功能並增加效力。
為了進一步降低GDF15區的異質性，不是用天冬胺酸取代在位置3處的天冬醯胺，而是用麩醯胺取代天冬醯胺。此外，這些分子被工程化以在GDF15的N-末端引入兩個變化，例如，GDF15(△3/D5E)(SEQ ID NO：17)、GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：18)以消除天然GDF15蛋白中高比率的脫醯胺和異構化。為了降低Fc效應子功能和改善效力，還進一步藉由從Fc鉸鏈區缺失額外的6個胺基酸來工程化這些分子以使Fc區的鉸鏈區缺失(例如，Fc△16而不是Fc△10)以減少結合至FcγR。對GDF15-Fc融合蛋白與其異源二聚化的相應Fc分子進行相同的鉸鏈區工程化。
在食蟹猴中測試了該進一步工程化的GDF15-Fc融合蛋白Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)(SEQ ID NO：45)、Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：46)和Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：47)的活性。在治療開始前，持續10週，使雄性天生自發肥胖的食蟹猴適應程序性操控或將它們訓練以習慣程序性操控(例如，血液採 集、皮下注射、體重測量、餵養方案)。根據在適應/訓練期的期間收集的數據(血液化學和體重)，將八十(80)隻猴分成8個n=10隻猴的治療組。每個治療組投與媒介物、3mg/kg的陽性對照FGF21-Fc、0.5mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K,CC)(SEQ ID NO：35))、3.0mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(△3/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K,CC)(SEQ ID NO：35))、0.5mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K,CC))、3.0mg/kg的Fc△16(-,CC)-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K,CC))、0.5mg/kg的Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：36))或3.0mg/kg的Fc△16(-)-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K)(SEQ ID NO：36))。在治療期間每組每週給予皮下注射一次，持續4週，隨後進行4週的洗脫期；每週進行血液收集和體重監測，並且在治療和洗脫期每天進行食物攝入。該圖表示n=5-6隻/組並且數據表示為組平均值±SEM。藉由ANCOVA進行統計學分析並且統計學顯著性表示為相對於媒介物*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。具有快速藥物清除率的猴懷疑具有抗藥物抗體(ADA)並被排除在分析之外。出乎意料的是，新工程化的GDF15-Fc融合蛋白幾乎喪失了所有效力(圖7)。與先前產生的GDF15-Fc融合蛋白相比，新工程化的GDF15-Fc融合蛋白均未將體重降低至與FGF21-Fc相似的程度(參見實例1，圖1)。
與實例1中的GDF15-Fc融合蛋白相比，實例4中的GDF15-Fc融合蛋白具有如表7中所示的以下差異：[表7]：實例1和4中的GDF15-Fc融合蛋白的差異 
為了恢復效力，將在猴中有效的分子的不同方面重新引入新的GDF15-Fc融合蛋白中。將半胱胺酸夾鉗(CH3鏈間二硫鍵)消除並且將接頭重新引入Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)(SEQ ID NO：49)；Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：50)和Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：54)。然而，該實例中使用的接頭不能被糖基化(例如，G4Q)或更短(G4S而不是(G4S)4)以減少糖基化。而且對於Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)，消除了在位置5處的突變。最後，對於新分子Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(SEQ ID NO：57)，重新引入Fc區的鉸鏈區的更小的缺失，但是伴有在Fc區中的L234A/L235A突變，其應該消除了FcγR結合。
將這些新分子與Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15進行比較，其在實例1中示出對食蟹猴有效。在治療開始前，持續2週，使雄性天生自發肥胖的食蟹猴適應程序性操控或將它們訓練以習慣程序性操控(例如，血液採集、皮下注射、體重測量、餵養方案)。根據在適應/訓練期的期間收集的數據(血液化學和體重)，將四十二(42)隻猴分成6個n=7隻猴的治療組。每個治療組給予媒介物、1.5mg/kg的Fc△10(-)-(G4S)4-GDF15(以及其異源二聚化伴侶Fc△10(+,K))、1.5mg/kg的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K))、1.5mg/kg的Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△16(+,K))、1.5mg/kg的Fc△16(-)-G4S-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源 二聚化伴侶Fc△16(+,K))或1.5mg/kg的Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(以及其異源二聚化伴侶Fc△10(+,K,L234A/L235A)(SEQ ID NO：37)。在治療期間每週給予皮下注射一次，持續2週；每週進行血液採集和體重監測並在治療期間每天監測食物攝入。該圖表示n=7隻/組並且數據表示為組平均值±SEM。藉由ANCOVA進行統計學分析並且統計學顯著性表示為相對於媒介物*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。這些新分子恢復了效力(圖8)。
基於這些結果，確定N3Q突變不影響猴中的GDF15活性，並且GDF15中的雙突變(N3Q/D5E)也不影響猴中的GDF15活性。還顯示出16個胺基酸的Fc鉸鏈區缺失(△16)與猴中10個胺基酸的Fc鉸鏈區缺失(△10)具有類似的作用。最後，示出接頭是猴中活性的關鍵組件。雖然接頭是G4S還是G4Q不影響活性，但接頭的長度對活性是重要的。與較短的接頭(例如，G4S)相比，較長的接頭(例如，圖8中的(G4S)4和(G4Q)4)更有效力。
食物攝入測定用於評估兩種不同GDF15-Fc融合蛋白的功效。將7至8週齡的單獨圈養的雄性ob/ob小鼠分成不同的治療組(n=5隻每組)，每組具有相當的治療前體重和食物攝入水平。將這些動物用0.32ug/kg、1.6ug/kg、8ug/kg、40ug/kg、0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg的異源二聚體Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△16(+,K)或Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)：Fc△10(+,K,L234A/L235A)藉由皮下注射治療，並且測量過夜食物攝入。每種GDF15-Fc融合蛋白的代表性實驗的結果以劑量應答 曲線示出：Fc△16(-)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(圖9)和Fc△10(-,L234A/L235A)-(G4Q)4-GDF15(N3Q/D5E)(圖10)。結果示出GDF15-Fc融合蛋白均減少急性ob/ob小鼠的食物攝入。本測定中的ED50示出於表8中。
雖然已經根據各種實施方式描述了本發明，但是應該理解，熟悉該項技術者將會想到許多變化和修改。因此，所附申請專利範圍旨在覆蓋落入所要求保護的本發明範圍內的所有此類的等效變化。另外，本文使用的章節標題只是出於組織的目的，並且不應被解釋為限制所描述的主題。
本申請中引用的所有參考文獻出於任何目的藉由引用明確併入本文。
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Claims (18)
- 一種融合蛋白，該融合蛋白包含藉由接頭連接至Fc區的GDF15區，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列和至少一個突變，其中這些突變中的至少一個是在位置5處的天冬胺酸的突變。
- 如請求項1之融合蛋白，其中在位置5處的天冬胺酸突變為麩胺酸。
- 如請求項2之融合蛋白，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
- 如請求項1或2之融合蛋白，其中該GDF15區進一步包含在位置3處的天冬醯胺的突變。
- 如請求項3之融合蛋白，其中在位置3處的天冬醯胺突變為麩醯胺。
- 如請求項5之融合蛋白，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該接頭是(G4S)n或(G4Q)n接頭，其中n大於0。
- 如請求項7之融合蛋白，其中n是1或2。
- 一種融合蛋白，該融合蛋白包含藉由接頭連接至Fc區的GDF15區，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列和至少一個突變，其中這些突變中的至少一個是在位置3處的天冬醯胺的突變或在位置5處的天冬胺酸的突變，並且其中該接頭是(G 4Q) n接頭並且n大於2。
- 如請求項7或9之融合蛋白，其中n是3或4。
- 如請求項9或10之融合蛋白，其中該GDF15區包含在位置5處的天冬胺酸成為麩胺酸的突變。
- 如請求項11之融合蛋白，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。
- 如請求項9至11中任一項之融合蛋白，其中該GDF15區包含在位置3處的天冬醯胺成為麩醯胺的突變。
- 如請求項13之融合蛋白，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
- 如請求項1至14中任一項之融合蛋白，其中該Fc區包含帶電荷的成對突變。
- 如請求項1至14中任一項之融合蛋白，其中該Fc區包含截短的鉸鏈區。
- 如請求項1至10中任一項之融合蛋白，其中該Fc區選自表3。
- 一種治療代謝病症或障礙之方法，其包括投與如請求項1至17中任一項之融合蛋白。
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