WO2022092915A1 - Gdf15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Gdf15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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gdf15
cells
disease
immune
treatment
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조미라
박성환
최종영
이선영
전주연
박민정
나현식
이아람
이채림
이순규
최정원
엄인규
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and treating immune diseases containing GDF15 as an active ingredient.
  • the immune system can be largely divided into innate immunity and acquired immunity.
  • Acquired immunity is an immune system that exists only in vertebrates. Several cells are entangled like a network, and antigen-presenting cells, B cells, and T cells are involved. There are B cells and T cells as effector cells. B cells are involved in humoral immunity that secretes antibodies, and T cells are mainly responsible for cellular immunity and are cytotoxic T cells. It is classified into cytotoxic T cells and helper T cells. In the normal state, the immune system controls specific immune responses to autoantigens, and there are cases where it also suppresses immune responses to external antigens.
  • Tregs immune regulatory T cells
  • T cells are one of the cell groups that play a central role in the immune system as a biological defense system against various pathogens.
  • T cells are generated in the thymus of the human body and differentiate into T cells with unique characteristics through a series of differentiation processes. differentiated into helper cells (Th2).
  • Th2 cells helper cells
  • the main function of Th1 cells is involved in cell-mediated immunity
  • Th2 cells are involved in humoral immunity
  • these two cell populations maintain the balance of the immune system by checking each other so that they do not overactivate each other. Therefore, it can be seen that most of the immune diseases are due to the imbalance between these two immune cells. For example, if the activity of Th1 cells is abnormally increased, autoimmune diseases may occur, and the activity of Th2 cells is abnormally increased. It is known that immune diseases caused by hypersensitivity reactions occur.
  • Cytotoxic T cells protect the host by directly killing infected cells, and participate in host defense by moving and regulating various types of cells. It also acts on cells to defend the host.
  • TCR antigen-specific antigen receptor
  • TCR antigen-specific antigen receptor
  • dendritic cells which are antigen presenting cells, must find pathogens and migrate to lymph nodes to meet pathogens. When dendritic cells present antigens, undifferentiated naive T cells divide several times to become a sufficient number to respond to pathogens.
  • dendritic cells provide T cells with information about the appearance and location of pathogens through multiple mechanisms, whether pathogens are intracellular or extracellular, bacterial, viral, or eukaryotic. It allows us to know whether it is an organism, what tissue it is invading into, etc. Therefore, pathogen-specific T cells express their genes according to the life cycle of the pathogen to be eliminated, and determine which helper T cells to generate more and which cells to recruit according to the type of secreted cytokine. The most important signal for the differentiation of helper T cells is cytokines.
  • cytokines In T cell differentiation, cytokines induce or inhibit growth factors as well as transcription factors essential for differentiation into Th1 or Th2 cells, and are secreted from differentiated helper T cells themselves to cause growth and differentiation of other immune cells. It also serves as a medium. Representative cytokines secreted by Th1 cells are interferon- ⁇ (interferon- ⁇ ), and representative cytokines secreted by Th2 cells are IL-4, IL-5, and IL-13. IL-17 is a representative cytokine of Th17 cells, a type of recently discovered helper T cells. Cytokines secreted by each helper T cell promote the differentiation of the helper cell and inhibit the differentiation of another helper T cell.
  • interferon- ⁇ interferon- ⁇
  • IL-17 is a representative cytokine of Th17 cells, a type of recently discovered helper T cells. Cytokines secreted by each helper T cell promote the differentiation of the helper cell and inhibit the differentiation of another helper T cell.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • CD4+ CD25+ T cells which are natural Tregs, are given immunosuppressive functions when they are newly created in the thymus, and are among the peripheral CD4+ T lymphocytes of normal individuals. It is present at a frequency of 5 to 10%.
  • peripheral natural T cells can be differentiated into cells exhibiting an immunosuppressive effect when stimulated by autologous or foreign antigens under specific circumstances, which are called adaptive or inducible Tregs and secrete IL-10 These include Th2, which secretes TGF- ⁇ , and Th3 and CD8 Ts that secrete TGF- ⁇ .
  • Treg cells have the characteristic of controlling the inflammatory response by suppressing the function of abnormally activated immune cells, and many studies are being conducted to treat immune diseases by increasing the activity of Treg cells.
  • Th17 cells as another group created in the differentiation process of T cells. Th17 cells are known to be formed through a process similar to that of Treg cells in the differentiation process of undifferentiated T cells.
  • Treg cells and Th17 cells are differentiated in the presence of TGF- ⁇ in common, but Treg cells do not require IL-6, whereas in Th17 cells, IL-6 is present together with TGF- ⁇ . differentiate in a situation where In addition, differentiated Th17 cells are characterized in that they secrete IL-17. It has been found that Th17 cells, unlike Treg cells, are involved in the forefront of the inflammatory response seen in immune diseases and accelerate disease progression by maximizing the signal of the inflammatory response. Therefore, in the case of autoimmune diseases that are not controlled by Treg cells among autoimmune diseases, the development of therapeutic agents for autoimmune diseases targeting the inhibition of Th17 cell activity has been highlighted.
  • the main mediator of the transplant immune rejection is T cells, and the T cell receptor recognizes the major histocompatibility complex (MHC) expressed in the graft, thereby inducing an immune response.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Transplant rejection occurs.
  • the death rate due to the side effects of immunosuppressive drugs is high, and there is a demand for the development of effective and safe new immunosuppressants.
  • Immunosuppressants that block the signal transduction pathway in T cells are the most commonly used immunosuppressants currently used to treat immune diseases. These immunosuppressants are toxic, infection, lymphoma, diabetes, tremor, headache, diarrhea, hypertension, and nausea. , there is a problem that side effects such as renal dysfunction occur.
  • the inventors of the present invention found that GDF15 expression increases when TH17 cells are lowered, that GDF15 expression increases according to STAT3 inhibitor treatment in the blood of liver transplant patients, Treg cell induction is increased by GDF15 treatment, and hepatocyte fibrosis is suppressed. Found and completed the present invention.
  • GDF15 protein or a nucleic acid sequence encoding the same such as prevention or treatment of immune diseases, and monitoring of transplant-related diseases or immune diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating an immune disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of GDF15 protein or a nucleic acid sequence encoding the same.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the GDF15 protein or a nucleic acid sequence encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for diagnosing mitochondrial dysfunction, comprising the step of determining the expression level of GDF15.
  • the present invention provides a method for monitoring the amount of Th17 cells in the blood, comprising the step of checking the expression level of GDF15.
  • the present invention provides a method for predicting the prognosis of liver transplantation after liver transplantation, comprising the step of determining the expression level of GDF15.
  • the present invention provides a method of monitoring the prognosis of 1) rheumatoid arthritis or 2) post-transplantation, transplant-related disease treatment comprising the step of confirming the expression level of GDF15.
  • the present invention comprises the steps of treating a candidate material in the separated sample; And reducing the expression of IL-17 comprising the step of determining the expression level of GDF15 in the sample to reduce the amount of Th17 cells, and to increase the expression of IL-10 screening for compounds that increase the amount of Treg cells provides a way to
  • the present invention provides a composition for monitoring the prognosis of a transplant-related disease after 1) rheumatoid arthritis or 2) transplantation, and 1) rheumatoid arthritis or 2) transplantation comprising the composition, including an agent for measuring the expression level of GDF15.
  • a kit for monitoring the prognosis of a transplant-related disease is provided.
  • the present invention provides a method for treating an immune disease comprising the step of administering to an individual a pharmaceutically effective amount of the GDF15 protein or a nucleic acid sequence encoding the same.
  • GDF15 has an increased expression when TH17 cells are lowered, increased in the blood of liver transplant patients with STAT3 inhibitor treatment, increased Treg cell induction by GDF15 treatment, and suppressed hepatocyte fibrosis. Therefore, it can be usefully used as a pharmaceutical composition or immunosuppressant for preventing and treating immune diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, and transplant rejection diseases caused by abnormal regulation of the immune response.
  • 1 is a diagram confirming the correlation between GDF15 expression in normal blood, the expression level of TH17 cells, and mitochondrial function.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the correlation between GDF15 expression and TH17 and Treg induction according to STAT3 inhibitor treatment in the blood of liver transplant patients.
  • 3 is a diagram confirming the increase of IL-10 by GDF15 in normal human blood.
  • FIG. 4 is a diagram confirming the Treg cell induction effect by GDF15 in the blood of a liver transplant patient.
  • FIG. 5 is a diagram confirming the antifibrotic effect of GDF15 in hepatocytes.
  • FIG. 6 is a diagram confirming that Treg and IL-10 are induced in GDF15 treatment in immune cells of transplanted disease patients.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the disease treatment effect of GDF15 vector injection in the Sjogren preclinical model.
  • FIG. 8 is a diagram confirming that the expression of GDF15 is reduced when IL17 is increased in the serum of a transplant patient.
  • FIG. 9 is a diagram confirming that, when SD282 is treated in liver transplant patient immune cells, GDF15 expression is increased simultaneously with TH17 inhibitory Treg induction.
  • FIG. 10 is a diagram confirming that GDF15 expression is increased when SD282 is treated in a transplant rejection disease (GVHD) model.
  • GVHD transplant rejection disease
  • 11 is a diagram confirming the disease control effect, GDF15 expression induction, and IL-10 synergistic effect when SD282 is treated in an avatar animal model of a liver transplantation patient.
  • FIG. 12 is a diagram confirming the effect of treating transplant disease, inducing GDF15 expression and reducing the expression of IL-17 when SD282 is treated in a liver transplantation animal model.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating a vector map including human and mouse GDF15.
  • FIG. 14 is a diagram confirming the effect of treating an immune inflammatory disease and inducing GDF15 expression when SD282 is treated for rheumatoid arthritis.
  • FIG. 16 is a diagram confirming the arthritis index and induction rate according to the administration of the Echmensia mucinphilia strain in the rheumatoid arthritis-induced mouse of the present invention (A: change in the arthritis index, B: arthritis induction rate).
  • 17 is a rheumatoid arthritis-induced mouse of the present invention, according to the administration of Echmensia mucinphilia strain, hematoxylin and eosin (Hematoxylin and eosin, H&E) staining and safranin O (Safranin O)
  • This is a diagram confirmed by staining (A: staining result, B: staining result quantification).
  • FIG. 18 is a diagram illustrating the expression of IL-17 in the joint according to the administration of the Echmensia mucinphilia strain in the rheumatoid arthritis-induced mouse of the present invention by immunohistochemical staining (A: immunohistochemical staining result, B: IL-17 positive area quantification).
  • FIG. 19 is a view confirming the expression of regulatory T cells (Regulatory T cells, Treg) according to the administration of the strain Echmensia mucinphilia in the rheumatoid arthritis-induced mouse of the present invention by flow cytometry analysis.
  • regulatory T cells Regulatory T cells, Treg
  • FIG. 20 is a diagram confirming the expression of GDF15 according to the administration of the Echmensia mucinphilia strain in the rheumatoid arthritis-induced mouse of the present invention by immunohistochemical staining (A: immunohistochemical staining result, B: GDF positive area quantification).
  • 21 is a diagram confirming that weight loss due to lupus is suppressed when SD217 is treated in an animal model of lupus.
  • Figure 22 is a diagram confirming the expression of CD4- (percp cy5.5), CD8- (PE) T cells (double negative, DNT) in blood cells by flow cytometry analysis when SD217 is treated in an animal model of lupus (A: Flow cytometry results, B: quantification of DNT expression).
  • the SD282 compound increased the expression level of GDF15 when the expression level of GDF15 was checked after treatment with the immune cells of liver transplant patients with the SD282 compound, which is known to maintain the homeostasis of the existing Th17 and Treg cells ( Fig. 9).
  • the SD282 compound was treated in the transplant rejection disease (GVHD) animal model, the correlation between the therapeutic effect of the transplant rejection disease and the expression level of GDF15 was confirmed ( FIG. 10 ).
  • the relationship between the IL-10 expression level, IL-17 expression level, and GDF15 expression level of the therapeutic effect of SD282 in the liver transplantation animal model was confirmed, and it was confirmed that the GDF15 expression level significantly increased, and the expression of IL-10 was It was confirmed that the increase, but it was confirmed that the expression of IL-17 is reduced (Figs. 11 and 12).
  • a method for screening a candidate for a treatment for transplantation rejection disease or a drug that reduces Th17 and increases Treg cells a method for monitoring the immune status in immune patients It was confirmed that it can be used as a kit ( FIGS. 9 to 12 ).
  • IL-10 an increase in IL-10 was confirmed upon treatment with GDF15 in normal blood, and IL-10 and Treg induction were also confirmed in liver transplant patient blood ( FIGS. 3 and 4 ).
  • GDF15 was shown to decrease the mRNA levels of TGF- ⁇ and ⁇ -SMA, confirming that GDF15 had an effect of inhibiting fibrosis (FIG. 5).
  • GDF15 was treated in immune cells of liver transplant disease patients, IL-10 secretion and Treg induction effects were confirmed, confirming that GDF15 could be used for diseases such as transplant rejection disease ( FIG. 6 ).
  • GDF15 of the present invention is a growth differentiation factor 15 (Growth differentiation factor 15), which is involved in cellular stress and disease, and is a factor known as a member of the TGF ⁇ superfamily. GDF15 was first discovered through subtraction cloning in 1997, and its secretion increased in response to pro-inflammatory cytokines, and it was confirmed that it limits the further activation of late macrophages. -1) was also called.
  • GDF15 is known as a predictive biomarker related to cardiovascular disease, and is known to increase in serum during heart or muscle damage. This increase in expression is known to be involved in tissue or cell regeneration.
  • GDF15 has a function of protecting the heart from hypertrophy and hemorrhagic reperfusion injury, and differentiation of M2 with anti-inflammatory function of macrophages. is known to promote
  • GDF15 can restore mitochondrial function and regulate cell metabolism, especially in animal models with mitochondrial dysfunction. Therefore, increasing the expression of GDF15 means that the anti-inflammatory function of the cell can be improved and the metabolism of the cell can be controlled (recovery of mitochondrial function).
  • SD282 compound of the present invention may be a compound (N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide) represented by the following Chemical Formula 1, which is a compound disclosed in Korean Patent Application No. 10-2014-0155182.
  • SD217 compound of the present invention may be a compound (1-(2,4-difluorophenyl)biguanide) represented by the following Chemical Formula 2, which is a compound disclosed in Korean Patent Application No. 10-2014-0110919.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising a growth/differentiation factor 15 (GDF15) protein or a nucleic acid sequence encoding the same as an active ingredient.
  • GDF15 growth/differentiation factor 15
  • the immune disease is an immune disease in which IL-10 is decreased and the expression of IL-17 is increased, the number of Tregs is decreased, and the number of Th17 cells is increased, for example, autoimmune diseases, inflammatory diseases and It may be any one or more selected from the group consisting of a cell, tissue, or organ transplantation rejection disease.
  • the tissue or organ may be liver tissue or liver.
  • the immune disease may include a transplant rejection disease, a transplant disease, fibrosis, and the like.
  • the immune disease may include, for example, liver fibrosis, fibrosis after liver transplantation, liver transplantation disease, transplant rejection disease, Sjogren's syndrome, graft-versus-host disease (GVHD), and the like.
  • the transplantation may be a transplantation of liver cells or tissue.
  • T cells The main mediator of the transplant immune rejection response is T cells, and the T cell receptor recognizes the major histocompatibility complex (MHC) expressed in the graft, thereby inducing an immune response to reject the transplant. reaction will occur.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the nucleic acid sequence encoding the GDF15 protein may include a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the GDF15 protein may include any one of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the nucleic acid sequence encoding the GDF15 protein may reduce or inhibit differentiation of undifferentiated T cells into Th17 cells.
  • the nucleic acid sequence encoding the GDF15 protein can increase the secretion of IL-10 and induce regulatory T cells (Tregs), and specifically promote or increase the activity or amplification of Tregs.
  • Tregs regulatory T cells
  • Foxp3 is mainly present in immunoregulatory T cells derived from the thymus and is a transcriptional factor present in cells with CD4+ CD25+ marker antigen, and its function is to express Foxp3 T cells.
  • Generation of IL-2 against T cells that can potentially induce autoimmunity among CD4+ CD25- T cells that have low reactivity to antigens and do not express Foxp3 differentiated from the thymus upon antigen recognition It has a role as a suppressor T cell that suppresses hypermitosis.
  • Foxp3 contains not only IL-2, but also IL-4, which is affected by the transcription factor NFAT, for regulatory T cells expressing Foxp3 and CD25-T cells through cell-cell contact with them.
  • Foxp3-expressing T cells which have the above-mentioned actions, they are applied to treat immune diseases by inhibiting or regulating the immune response, and also, Foxp3-expressing CD4 T cells present in humans.
  • a cell therapy method by increasing the number of self-antigen specific T cell clones through treatment with high concentrations of IL-2 cytokines and combination treatment with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies
  • confirmation of the expression of Foxp3 is an index capable of measuring the activity or amplification of Treg cells.
  • the term "activation" refers to all mechanisms of regulatory T cells (Tregs) in vivo, that is, Treg cells including both natural Treg and adaptive Treg cells. It refers to promoting or enhancing, and refers to promoting or enhancing an immunomodulatory action, such as an immunosuppressive reaction, to maintain a normal state of an immune response in a living body.
  • the "expansion” refers to the differentiation and proliferation of undifferentiated T cells into regulatory T cells
  • 'differentiation' refers to a phenomenon in which cells divide and proliferate and specialize in structure or function. In other words, it refers to the change in form or function of cells, tissues, etc. of living things to perform a given task
  • 'proliferation' is the proliferation of homogeneous cells due to cell division. said to be increasing.
  • the nucleic acid sequence encoding the GDF15 protein can inhibit fibrosis, for example, organ fibrosis by reducing the mRNA expression level of TGF- ⁇ and ⁇ -SMA.
  • the organ may be, for example, a liver.
  • GDF15 or a fragment thereof may be included in the composition at 0.2 to 200 ng/ml.
  • the "immune disease” refers to a disease in which components of the mammalian immune system cause, mediate, or otherwise contribute to the mammalian pathology.
  • all diseases in which stimulation or interruption of an immune response has a compensatory effect on the progression of the disease may be included, and the present invention may include diseases caused by an overactive immune response.
  • immune diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases; inflammatory diseases; and transplantation rejection disease of cells, tissues or organs.
  • inflammatory disease means TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ), IL-1 ( Interleukin-1), IL-6, prostaglandin, luecotriene, or nitric oxide (NO) is a disease caused by inflammatory substances (inflammatory cytokines).
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of the extent of the disease, stabilization of the disease state (i.e., not worsening), delay or reduction in the rate of disease progression, disease state improvement or temporary alleviation and alleviation (partial or total), detectable or undetectable.
  • Treatment can also mean to increase survival as compared to the expected survival rate in the absence of treatment. “Treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic methods. Such treatments include the treatment required for the disorder being prevented as well as the disorder that has already occurred. “Palliating” a disease means that the extent and/or undesirable clinical signs of the disease state are reduced and/or the time course of progression is delayed or prolonged, compared to no treatment. means to lose
  • treatment unless otherwise stated, is meant reversing, ameliorating, inhibiting the progression of, or preventing the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition;
  • treatment as used herein refers to the act of treating when treating is defined as above. Accordingly, treatment or therapy for immune disorders in mammals may include one or more of the following:
  • a composition is indicated to be "pharmaceutically or physiologically acceptable” if the recipient animal can tolerate administration of the composition, or if administration of the composition to that animal is suitable.
  • the agent can be said to have been administered in a "therapeutically effective amount”.
  • An agent is physiologically meaningful if the presence of the agent results in a physiologically detectable change in the recipient patient.
  • an “effective amount” is an amount appropriate to effect beneficial or desirable clinical or biochemical results.
  • An effective amount may be administered one or more times.
  • an effective amount of a promoter is an amount suitable to temporarily alleviate, ameliorate, stabilize, reverse, slow down or delay the progression of the associated disease state.
  • the present invention relates to a composition for preventing and treating immune diseases comprising a vector comprising a polynucleotide encoding GDF15 or a fragment thereof or a cell comprising the vector as an active ingredient.
  • the vector may be manufactured like the vector map shown in FIG. 13 , but is not limited thereto.
  • vector refers to any nucleic acid comprising a competent nucleotide sequence that is inserted into a host cell and recombined with and inserted into the host cell genome, or that replicates spontaneously as an episome.
  • vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors, and the like.
  • the term "host cell” refers to a eukaryotic or prokaryotic cell into which one or more DNA or vectors are introduced, and should be understood to refer not only to a particular subject cell, but also to its progeny or potential progeny. In fact, the progeny are not identical to the parent cell as certain modifications may occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, but are still included within the scope of the term as used herein.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the occurrence, spread, and recurrence of an immune disease by administration of the protein or fragment thereof according to the present invention, or a composition comprising the same.
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may vary depending on several factors, for example, the administration method, the target site, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in the human body, the dosage should be determined as an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from the effective amount determined through animal experiments. These considerations in determining effective amounts are found, for example, in Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; and E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, and the effective dose level is determined by the patient's Health status, disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including drugs used in combination or concurrently, and other factors well known in the medical field can be determined according to
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a carrier, diluent, excipient, or a combination of two or more commonly used in biological agents.
  • pharmaceutically acceptable refers to exhibiting properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is suitable for in vivo delivery of the composition, and for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • saline Compounds described in , saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components can be mixed and used, and if necessary, other antioxidants, buffers, bacteriostats, etc. Conventional additives may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable dosage form such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • the pharmaceutical composition may be one or more formulations selected from the group comprising oral formulations, external preparations, suppositories, sterile injection solutions and sprays.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited as long as it is suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds described in , saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components can be mixed and used, and if necessary, other antioxidants, buffers, bacteriostats, etc. Conventional additives may be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable dosage form such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • injectable dosage form such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, Lactose, mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, stearic acid Calcium, sucrose, dextrose, sorbitol and talc and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally according to a desired method, and the dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, The range varies depending on the diet, administration time, administration method, excretion rate, and the severity of the disease.
  • the daily dose of the composition according to the present invention is 0.0001 to 10 mg/ml, preferably 0.0001 to 5 mg/ml, and it is more preferable to divide and administer once to several times a day.
  • Liquid formulations for oral administration of the composition of the present invention include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients, such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. and the like may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • the present invention relates to a method for diagnosing mitochondrial dysfunction and predicting the amount of Th17 cells in blood, comprising the step of determining the expression level of GDF15.
  • mitochondrial function when the expression level of GDF15 is decreased, mitochondrial function may be impaired and the amount of Th17 cells in the blood may be increased.
  • the present invention relates to a method for monitoring the prognosis of liver transplantation after liver transplantation, comprising the step of determining the expression level of GDF15.
  • the expression level of GDF15 when the expression level of GDF15 is decreased, symptoms such as fibrosis and transplantation immune rejection after liver transplantation are highly likely to appear, and thus it can be determined that the prognosis is poor.
  • the present invention relates to a method of monitoring the prognosis of 1) rheumatoid arthritis or 2) post-transplant treatment, comprising the step of determining the expression level of GDF15.
  • Immunosuppressants have been used to reduce transplant rejection, and the common purpose of these immunosuppressants is to suppress the T cell-mediated immune response to the graft.
  • the prognosis may be considered good, but the present invention is not limited thereto.
  • the expression level of GDF15 increases after administration of a therapeutic agent or a treatment candidate for the treatment of rheumatoid arthritis or a transplant-related disease, it may be determined that the prognosis is good, but is not limited thereto.
  • the therapeutic agent or treatment candidate material may be a compound represented by the following formula (1) or a STAT3 inhibitor, but is not limited thereto.
  • the therapeutic agent or treatment candidate material may be a compound represented by the following formula (2), but is not limited thereto.
  • the therapeutic agent or treatment candidate material may be a strain of Akkermansia muciniphilia or a culture thereof, but is not limited thereto.
  • the term "culture solution” is obtained after culturing a target microorganism in a medium containing elements suitable for the growth of microorganisms, and is a concept including microorganisms and a medium.
  • the present invention comprises the steps of treating a candidate material in the separated sample; Screening for compounds that decrease the amount of Th17 cells by reducing the expression of IL-17, comprising the step of checking the expression level of GDF15 in the sample, and increase the expression of IL-10 to increase the amount of Treg cells it's about how
  • the present invention relates to a composition for monitoring the prognosis of a transplant-related disease after 1) rheumatoid arthritis or 2) transplantation, comprising an agent for measuring the expression level of GDF15.
  • the agent for measuring the expression level of GDF15 can be used without limitation as long as it is a formulation for measuring the expression level of GDF15 at the mRNA or protein level, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of GDF15 at the mRNA level is a primer that specifically recognizes a nucleic acid sequence of a marker, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, the nucleic acid sequence and a fragment of the complementary sequence Pairs, probes, or primer pairs and probes may be included, and the measurement thereof is a polymerase chain reaction, real-time RT-PCR (RT-PCR), reverse transcription polymerase chain reaction, competitive polymerase chain reaction (Competitive RT). -PCR), nuclease protection assay (RNase, S1 nuclease assay), in situ hybridization, nucleic acid microarray, Northern blot, or a method selected from the group consisting of a DNA chip.
  • the agent for measuring the expression level of GDF15 at the protein level is an antibody, antibody fragment, aptamer, or avidity multimer that specifically recognizes the full-length protein of the marker or a fragment thereof.
  • it may include peptidomimetics, and the measurement thereof is western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunity. It may be performed by a method selected from the group consisting of staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, mass spectrometry, or protein microarray.
  • the term “detection” or “measurement” refers to quantifying the concentration of a detected or measured target.
  • primer is a nucleic acid sequence having a short free 3 hydroxyl group, which can form a complementary template and base pair, and serves as a starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions.
  • the primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerate or reverse transcriptase) and the four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several hundred bases as short as possible to achieve specific binding to mRNA, and is labeled to determine the presence or absence of a specific mRNA.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
  • hybridization is performed using a probe complementary to the AFP, HMMR, NXPH4, PITX1, THBS4 and/or UBE2T genes, and the level of gene expression can be diagnosed based on whether hybridization occurs.
  • the selection of suitable probes and hybridization conditions may be modified based on those known in the art, and therefore, the present invention is not particularly limited thereto.
  • the primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences may also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution with one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phossotriesters, phosphoro amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
  • suitable conditions for hybridizing a probe with a cDNA molecule can be determined in a series of processes by an optimization procedure. These procedures are carried out as a series of procedures by those skilled in the art to establish protocols for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing times, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999).
  • high stringency among the stringent conditions is 0.5 M NaHPO4, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA at 65° C., and 0.1 ⁇ SSC (standard saline citrate)/0.1% SDS at 68° C. It means washing under conditions.
  • high stringency conditions mean washing at 48° C. in 6 ⁇ SSC/0.05% sodium pyrophosphate.
  • Low stringency conditions mean, for example, washing at 42° C. in 0.2 ⁇ SSC/0.1% SDS.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as a term known in the art.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a protein expressed in AFP, HMMR, NXPH4, PITX1, THBS4 and/or UBE2T genes, which are markers of the present invention, and the method for preparing the antibody is widely It can be prepared using a known method. This also includes partial peptides that can be made from the protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a part thereof is also included in the antibody of the present invention as long as it has a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or antigen-binding property, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention includes a special antibody such as a humanized antibody.
  • the present invention relates to a kit for monitoring the prognosis of 1) rheumatoid arthritis or 2) a transplant-related disease after transplantation, comprising the composition for monitoring of the invention.
  • the present invention relates to a kit for diagnosing an immune disease, comprising the composition for diagnosing an immune disease of the present invention.
  • the kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a subject or patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample. there is.
  • it may include PCR primers for amplifying a relevant region of genomic DNA.
  • the kit may include probes of genetic factors useful for pharmacogenomic profiling.
  • the labeled oligonucleotide can be easily identified during analysis.
  • the kit may further contain a labeling material such as a DNA polymerase and dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), a fluorescent material, and the like.
  • a labeling material such as a DNA polymerase and dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), a fluorescent material, and the like.
  • the term “immune disease diagnosis kit” refers to a kit containing the composition for diagnosing an immune disease of the present invention. Therefore, the expression “immune disease diagnosis kit” can be used interchangeably or mixed with the "composition for diagnosing immune disease”.
  • diagnosis refers to determining a subject's susceptibility to a specific disease or disorder, determining whether a subject currently has a specific disease or disorder, or having a specific disease or disorder. Determining the prognosis of a subject (eg, identification of an immune disease state, staging an immune disease, or determining the responsiveness of an immune disease to treatment), or therametrics (eg, information about the efficacy of treatment) monitoring the state of the object to provide
  • the present invention relates to a method of providing information for diagnosis or prognosis of an immune disease, comprising confirming the expression of GDF15 or a fragment thereof.
  • the present invention relates to the use of GDF15 or a fragment thereof for activating mitochondrial function.
  • GDF15 or a fragment thereof for activating mitochondrial function.
  • mitochondrial activity is not regulated, more severe inflammation occurs, and it is known that an adverse mitochondrial reaction is very important in the development of immune-inflammatory diseases.
  • mitochondrial activity is reduced, the control system of the pathogenic cell becomes unstable, which causes excessive cell activity or proliferation.
  • the expression of GDF15 of the present invention is positively correlated with mitochondrial function, it can be used as a marker for mitochondrial function activation or mitochondrial function confirmation.
  • the present invention relates to a method for reducing or inhibiting differentiation of undifferentiated T cells into Th17 cells in vitro, comprising the step of treating GDF15 or a fragment thereof.
  • the present invention relates to a method for activating regulatory T cells, comprising the step of treating regulatory T cells (Tregs) with GDF15 or a fragment thereof.
  • the activated regulatory T cells may have increased expression of Foxp3.
  • the present invention provides a method for treating an immune disease comprising the step of administering to an individual a pharmaceutically effective amount of the GDF15 protein or a nucleic acid sequence encoding the same.
  • the treatment method of the present invention comprises administering the active ingredient to the subject in a therapeutically effective amount.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular subject will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the age, weight, general health, sex and diet of the subject, the time of administration; It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, the duration of treatment, the drug used together with or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the daily dosage is 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.01 to 100 mg/kg, based on the amount of the pharmaceutical composition of the present invention, and may be administered 1 to 6 times a day.
  • each active ingredient should be such that the side effects do not occur by including the content of each active ingredient too high. Therefore, it is preferable to determine the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention in consideration of the foregoing.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • TH17 cells In blood obtained from normal individuals, the expression level of TH17 cells was confirmed by the number of IL-17-positive cells, and the mitochondrial function was confirmed by JC-1, which confirms the change in mitochondrial membrane potential, and the correlation between these and GDF15 expression levels was confirmed.
  • peripheral mononuclear cells PBMCs
  • Th17 cell analysis after PBMC isolation the reaction was performed for 4 hours after treatment with PMA, Ionomycin and Golgi stop. Then, after anti-human CD4 PE-Cy7 treatment, reaction was carried out for 30 minutes, and Cytofix/Cytoperm was permeabilized (eabilization). Then, it was stained with anti-human IL-17 FITC.
  • JC-1 staining a kit (JC-1 dye, Thermo Fisher) was used. The stained cells were analyzed by flow cytometry, and the number of CD4+ IL-17+ cells and JC-1+ cells was analyzed using the Flow jo program.
  • ELISA was performed to confirm GDF15 in the serum of a normal person. After coating on a 96-well plate for 2 hours at room temperature using the primary Capture ab (anti-mouse GDF15), a non-specific reaction was blocked using a blocking buffer. After blocking, the standard and the sample were placed on the plate and washed with a wash buffer after two hours of reaction.
  • Standard recombinant: anti-human GDF15
  • serum stock solution was added, and after 2 hours of reaction, washing was performed using a wash buffer. After washing, detection ab (anti-human GDF15) was added and reacted for 2 hours, followed by washing and color development.
  • Treg induction Foxp3 positive
  • GDF15 expression by STAT3 inhibitor (metformin) treatment in liver transplant patients
  • the expression level of TH17 cells in blood obtained from liver transplantation patients was compared to CD4+IL-
  • the number of 17+ positive cells the expression level of Treg cells was confirmed as the number of CD4 + CD25 high Foxp3 + positive cells, and the correlation between these and the GDF15 expression level was confirmed.
  • FACS analysis was performed by isolating peripheral mononuclear cells from the patient's blood. After PBMC isolation, for Th17 cell analysis, PMA, Ionomycin and Golgi stop were treated and then reacted for 4 hours.
  • TH17 cells decreased, Treg induction increased, and GDF15 expression increased after administration of the STAT3 inhibitor compared to before administration ( FIG. 2 ).
  • the expression of GDF15 is increased by the STAT3 inhibitor, the differentiation of TH17 is suppressed, and Treg induction is increased.
  • the correlation with the secretion amount of IL-10 by GDF15 in blood obtained from a normal person was confirmed. Specifically, the human peripheral blood mononuclear cells were treated with 1ng/ml of GDF at the same time as the anti-CD3 stimulation alone condition, and then cultured for 3 days to obtain sup (supernatant). ELISA was performed on the obtained sup for IL-10.
  • Treg expression in cells after 3 days of incubation was investigated.
  • anti-human CD4 PE-Cy7 and anti-human CD25 APC were treated and then reacted for 30 minutes and permeabilized with Cytofix/Cytoperm. After that, anti-human Foxp3 PE was stained. Cells positive for the antibody were analyzed using the Flow jo program.
  • Hepg2 hepatocytes
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • Treg expression in cells after 3 days of incubation was investigated.
  • anti-human CD4 PE-Cy7 and anti-human CD25 APC were treated and then reacted for 30 minutes and permeabilized with Cytofix/Cytoperm. After that, anti-human Foxp3 PE was stained. Cells positive for the antibody were analyzed using the Flow jo program.
  • the GDF15 vector had the configuration shown in FIG. 13 and was prepared as follows. First, for the mGDF15 in pUC57-Amp vector, a synthesized gene was obtained by inserting a BglII sequence at the 5' end into the optimized Mus musculus GDF15 CDS shown in SEQ ID NO: 2, removing a stop codon at the 3' end, and inserting a SalI sequence. For mGDF15 in pFLAG-CMV5a, mGDF15 in pUC57-Amp was cut with BglII and SalI, and only the mGDF15 fragment was extracted through gel extraction. The DNA fragment was ligated to the pFLAG-CMV5a overexpression vector to obtain colonies.
  • GDF15 desired insert DNA
  • BglII and SalI desired insert DNA
  • the selected clones were sequenced and the DNA sequence confirmed.
  • proteins were extracted from the cells, and Western blotting was performed on the proteins to select clones in which protein overexpression was confirmed.
  • the prepared GDF15 vector was injected into the Sjogren preclinical animal model by muscle electroporation at intervals of 100 ug/100ul once a week.
  • ELISA was performed to confirm GDF15 and IL-17 in serum or plasma obtained from liver transplantation patients.
  • Each of the primary Capture ab (anti-human GDF15, IL-17) was used to coat each 96-well plate at room temperature for 2 hours, and then a blocking buffer was used to block non-specific reactions. After blocking, the standard and the sample were placed on the plate and washed with a wash buffer after two hours of reaction.
  • Each standard (recombinant: GDF15, IL-17) and serum stock solution were added, and after 2 hours of reaction, washing was performed using a wash buffer. After washing, each detected ab (anti-human GDF15, IL-17) was added and reacted for 2 hours, followed by washing and color development.
  • splenocytes and bone marrow cells of c57BL6 MICE were isolated, respectively, and each cell was irradiated with 5x10 6 690 cGY.
  • Balb/c mice were injected with cells into the tail vein.
  • SD282 compound (STAIM1), FK506 or a combination of SD282 compound and FK506 (STAIM2) was orally administered. The drug was administered until the end of the experiment.
  • the expression level of GDF15 was confirmed in the small intestine cells stained with IHC in the small intestine tissue obtained at the end of the experiment.
  • a combination of FK506 or SD282 compound and FK506 was administered to the liver transplantation animal model. Then, the liver tissue of the animal model was IHC-stained to confirm the expression level of GDF15 and the expression level of IL-10.
  • FK506 or a combination of SD282 compound and FK506 was administered. Then, the liver tissue of the animal model was IHC-stained to confirm the expression level of GDF15 and the expression level of IL-10.
  • the disease control effect of the SD282 compound (HL237) was confirmed in rheumatoid arthritis disease, and the degree of destruction (H&E, saflaninO) and GDF15 in the joint tissue of the sacrificed rheumatoid arthritis mouse joint tissue 6 weeks after the SD282 compound (HL237) administration Protein expressing cells were analyzed. Specifically, the ratio of GDF15-expressing cells in the total cells in the synobium tissue was analyzed.
  • GDF15 The expression of GDF15 in the supernatant was confirmed by ELISA analysis after SD282 treatment and culturing for 72 hours in the condition where the peripheral mononuclear cells were stimulated with antiCD3 0.5ug/ml, which is a T cell activation condition.
  • the present inventors in order to confirm the effect on the GDF expression increase and rheumatoid arthritis of the microbiome strain Akkermansia muciniphilia , which is known to have a therapeutic effect on metabolic diseases, a rheumatoid animal model was produced. Specifically, 100 ug of type II collagen was injected into the tail dermal in normal DBA/1 mice, and 100 ug of type II collagen was injected 2 weeks later to induce arthritis. The group showing signs of rheumatoid arthritis at 3 weeks after induction of rheumatoid arthritis (arthritis index of 1 or more) was selected. The signs of rheumatoid arthritis were evaluated by the arthritis index, and the rheumatoid arthritis index was evaluated by the method of Table 1 below. As a normal control, wild-type mice (WT) were used.
  • WT wild-type mice
  • mice of the selected group it was attempted to confirm the GDF increase and rheumatoid arthritis improvement effect of Echmensia mucinphilia of the present invention.
  • Echmensia mucinphilia In order to confirm that the microbiome strain of the present invention, Echmensia mucinphilia, is effective for rheumatoid arthritis, Echmensia mucinphilia (1x10 10 /mice) was orally administered daily to the animal model prepared in Example 1 (Akkermansia group, A. Muciniphilia), the arthritis index and induction rate were observed based on Table 1 above. In the case of induced rate evaluation, when edema occurred in one foot, the sum of the four legs was calculated as 25%, and the sum of the legs was evaluated as 100%. As a control group, the vehicle group in which physiological saline was administered to the animal model of Example 1 was used.
  • Echmensia mucinphilia inhibits joint destruction. Specifically, by sacrificing the mouse of Example 2 humanely, joint synovium tissue was obtained, and the obtained tissue was stained with hematoxylin and eosin (H&E) and safranin O (Safranin O). The degree of tissue damage was observed.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • Safranin O safranin O
  • IL-17 is an interleukin that induces inflammation, and is expressed when the differentiation of IL-17-positive cells is promoted to induce inflammation. Therefore, in order to inhibit the expression of IL-17 in Accomensia muciniphili, the microbiome of the present invention, in rheumatoid arthritis, the joint tissue of the mouse of Example 2 was stained with immunohistochemical staining for IL-17. was confirmed.
  • the spleens extracted from the mice of Example 2 of the present invention were subjected to flow cytometry, respectively. Specifically, the excised spleen was treated with anti-human CD4 PE-Cy7 and anti-human CD25 APC for Treg cell analysis, followed by reaction for 30 minutes, and permeabilized with Cytofix/Cytoperm. Then, it was stained with anti-human Foxp3 PE.
  • Treg was increased in the group administered with Echmensia mucinphilia of the present invention.
  • the spleen extracted from the mouse of Example 2 was subjected to immunochemical tissue staining to confirm the expression of GDF.
  • Example 21 Lupus animal model and SD217 treatment
  • an animal model of lupus was used. Specifically, MRL/lpr, a 10-week-old naturally occurring lupus mouse, was used, and SD217 was orally administered to the MRL/lpr mouse at a concentration of 50 mg/kg daily. Body weights were measured every 2 weeks after the start of drug administration. Mice were humanely sacrificed at the 16th week of drug administration. As a control group, a vehicle group administered with physiological saline was used.

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Abstract

본 발명은 GDF15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 GDF15는 TH17 세포 저하시 발현이 증가하며, 간이식 환자의 혈액에서 STAT3 처리에 따라 발현이 증가하고, GDF15 처리에 의해 Treg 세포 유도가 증가되며, 간세포의 섬유화가 억제되는 효과가 있으므로, 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

GDF15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 GDF15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역체계는 크게 선천성 면역(innate immunity)과 후천성 면역(acquired immunity)으로 나눌 수 있다. 후천성 면역은 척추동물에만 존재하는 면역체계로 여러 세포들이 네트워크처럼 얽혀 있으며, 항원제시세포, B세포, T세포 등이 관여한다. 효과기 세포(Effector cell)로는 B세포, T세포가 있는데, B세포는 항체를 분비하는 체액성면역(humoral immunity)에 관여하고, T세포는 주로 세포성면역(cellular immunity)을 담당하여 세포독성 T세포(cytotoxic T cell)와 조력 T세포(helper T cell)로 분류된다. 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다. 따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
세포독성 T세포는 감염된 세포를 직접 죽임으로써 숙주를 보호하고, 여러 종류의 세포들을 움직이게 하고 조절하여 숙주 방어에 참여하고, 조력 T세포는 다른 임파구, 선천성 면역에 관여하는 세포 및 비면역세포인 상피세포에도 작용하여 숙주를 방어한다. 후천성 면역의 중요한 개념 중의 하나가 다양성이다. 각각의 T세포는 항원에 특이한 항원수용체 (T cell receptor, TCR)를 가지고 있어 다양한 병원균에 특이적으로 반응한다. 조력 T세포가 분화하기 위해서는 항원제공세포인 수지상 세포(dendritic cell)가 병원균을 찾아 임파선으로 이동하여 병원균을 만나야 한다. 수지상 세포가 항원을 제시하면 분화되지 않은 조력 T세포(naive T cell)는 수차례 분할하여 병원체에 대응할 정도의 충분한 수가 된다. 병원균 자체도 다양한 생활 방식과 면역 회피 기전을 가지고 있기 때문에 수지상 세포는 여러 기전으로 T세포에게 병원균의 양상과 위치에 관하여 정보를 제공하여, 병원체가 세포 내에 있는지 세포 외에 있는지 또는 박테리아인지 바이러스인지 아니면 진핵생물인지, 어떤 조직에 침범하고 있는지 등에 관해 알 수 있게 한다. 따라서 병원체에 특이한 T세포는 제거하고자 하는 병원균의 생활 주기에 맞추어 유전자의 발현을 하며 분비되는 사이토카인의 종류에 따라 어떤 조력 T세포를 더 많이 생성할지 또 어떤 세포들을 동원(recruitment)할지 결정한다. 조력 T세포의 분화에 가장 중요한 신호(signal)는 사이토카인이다. T 세포 분화에서 사이토카인은 Th1 또는 Th2 세포로의 분화에 필수적인 전사인자뿐만 아니라 성장인자(growth factor)를 유도 또는 억제하며, 분화된 조력 T세포 자체에서도 분비되어 다른 면역세포의 성장 및 분화를 일으키는 매개체 역할도 한다. Th1 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인이 인터페론-γ(interferon-γ)이고, Th2 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-13이다. IL-17은 최근에 발견된 조력 T세포의 일종인 Th17세포의 대표적 사이토카인이다. 각각의 조력 T세포에 의해 분비되는 사이토카인은 해당 조력세포의 분화를 촉진하며 또 다른 조력 T세포의 분화를 억제한다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, 최근 그 존재가 밝혀진 Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg), 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Th2, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다. Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다. 또한, Treg 세포 이외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다. Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
한편, 이식면역 거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식 거부반응이 발생하게 된다. 이와 같은 면역거부반응과 면역억제제의 부작용에 의한 사망률이 높아 효과적이고 안전한 새로운 면역억제제의 개발이 요구되고 있다. 현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 시급하다.
본 발명의 발명자들은 TH17 세포 저하시 GDF15 발현이 증가하며, 간이식 환자의 혈액에서 STAT3 억제제 처리에 따라 GDF15 발현이 증가하고, GDF15 처리에 의해 Treg 세포 유도가 증가되며, 간세포의 섬유화가 억제되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열의 면역질환의 예방 또는 치료, 이식 관련 질환 또는 면역질환의 모니터링과 같은 다양한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 미트콘드리아 기능손상을 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 혈액내 Th17 세포의 양을 모니터링하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 간이식 후 간이식 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15의 발현양을 확인하는 단계를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식 관련 질환 치료의 예후를 모니터링하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, IL-17의 발현을 감소시켜 Th17 세포의 양을 감소시키며, IL-10의 발현을 증가시켜 Treg 세포의 양을 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링하기 위한 조성물 및 이 조성물을 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 GDF15는 TH17 세포 저하 시 발현이 증가하며, 간이식 환자의 혈액에서 STAT3 억제제 처리에 따라 발현이 증가하고, GDF15 처리에 의해 Treg 세포 유도가 증가되며, 간세포의 섬유화가 억제되는 효과가 있으므로, 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, TH17 세포 및 IL17과 GDF15의 발현과의 상관관계를 확인하여 이를 이용한 면역질환의 진단 방법 및 이식 후 이식관련 질환의 치료 예후를 예측할 수 있는 방법을 확립할 수 있다.
도 1은 정상인 혈액에서의 GDF15 발현과 TH17 세포의 발현량 및 미토콘드리아 기능의 상관성을 확인한 도이다.
도 2는 간이식 환자의 혈액에서 STAT3 억제제 처리에 따른 GDF15 발현과 TH17 및 Treg 유도의 상관성을 확인한 도이다.
도 3은 정상인의 혈액에서 GDF15에 의한 IL-10의 증가를 확인한 도이다.
도 4는 간이식 환자의 혈액에서 GDF15에 의한 Treg 세포 유도 효과를 확인한 도이다.
도 5는 간세포에서 GDF15에 의한 항섬유화 효과를 확인한 도이다.
도 6은 이식 질환 환자 면역세포에서 GDF15 처리시 Treg 및 IL-10가 유도됨을 확인한 도이다.
도 7은 쇼그렌 전임상 모델에서 GDF15 벡터 주입에 의한 질환 치료 효과를 확인한 도이다.
도 8은 이식환자 혈청에서 IL17 증가시, GDF15 발현이 저하됨을 확인한 도이다.
도 9는 간이식환자 면역세포에 SD282를 처리했을 때, TH17 억제 Treg 유도와 동시에 GDF15 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 10은 이식거부질환(GVHD) 모델에 SD282를 처리했을 때, GDF15 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 11은 간이식 환자 아바타 동물모델에 SD282를 처리했을 때, 질환 제어 효과와 GDF15 발현 유도 및 IL-10 상승 효과를 확인한 도이다.
도 12는 간이식동물모델에 SD282를 처리했을 때, 이식질환 치료 효과와 GDF15 발현 유도 및 IL-17의 발현 저하 효과를 확인한 도이다.
도 13은 인간 및 마우스 GDF15를 포함하는 벡터 맵을 도시한 도이다.
도 14는 류마티스관절염 질환에 SD282를 처리했을 때, 면역 염증질환 치료 효과와 GDF15 발현 유도 효과를 확인한 도이다.
도 15는 인간 말초단핵구 세포에 SD282를 처리했을 때, GDF15 발현 유도 효과를 확인한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서, 에크멘시아 뮤신필리아 균주의 투여에 따른, 관절염 지수 및 유발률을 확인한 도이다(A: 관절염 지수 변화 확인, B: 관절염 유발률).
도 17은 본 발명의 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서, 에크멘시아 뮤신필리아 균주의 투여에 따른, 관절 손상을 헤마토실린 및 에오신(Hematoxylin and eosin, H&E) 염색과 사프라닌 O(Safranin O) 염색으로 확인한 도이다(A: 염색 결과, B: 염색 결과 정량화).
도 18은 본 발명의 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서, 에크멘시아 뮤신필리아 균주의 투여에 따른, 관절 내 IL-17의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다(A: 면역조직화학 염색 결과, B: IL-17 양성 면적 정량화).
도 19는 본 발명의 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서, 에크멘시아 뮤신필리아 균주의 투여에 따른 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)의 발현을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 류마티스 관절염이 유도된 마우스에서, 에크멘시아 뮤신필리아 균주의 투여에 따른 GDF15의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다(A: 면역조직화학 염색 결과, B: GDF 양성 면적 정량화).
도 21은 루푸스 동물모델에 SD217을 처리했을 때, 루푸스로인한 체중 감소가 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 22는 루푸스 동물모델에 SD217을 처리했을 때, 혈액세포에서 CD4-(percp cy5.5), CD8-(PE) T 세포(double negative, DNT)의 발현을 유세포분석으로 확인한 도이다(A: 유세포 분석 결과, B: DNT 발현 정량화).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명에서는 정상환자의 혈액에서 GDF15와 Th17 세포의 발현 수와 역관계를 갖는다는 점을 명확히 확인하였고(도 1), GDF15와 미토콘드리아와 기능이상과 양의 상관관계를 확인하였다.
또한, 간이식 환자의 혈액에서 STAT3 억제제가 처리되는 경우, Th17 세포가 감소하고, Treg가 유도되며, GDF15의 발현양이 증가됨을 확인하여, GDF15의 발현양을 확인함으로써, 간이식 거부질환의 후보 치료제의 치료효과 예측시, Th17세포와 Treg의 항상상 유지여부를 평가할 수 있는 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다(도 2).
또한, 간이식 환자에서 IL-17 발현과 GDF15의 발현과 상관관계를 확인하여 음의 상관관계가 있음을 확인하여, GDF15를 간이식 환자의 상태를 모니터링할 수 있는 마커로 이용가능할 수 있음을 확인하였다(도 8).
또한, 기존 Th17과 Treg 세포의 항상성을 유지시킬 수 있다고 알려진 SD282 화합물을 간이식 환자의 면역세포에 처리 후, GDF15의 발현양을 확인한 경우, SD282 화합물이 GDF15의 발현양을 증가시킴을 확인하였다(도 9). 또한, 이식거부질환(GVHD) 동물 모델에 SD282 화합물을 처리하는 경우, 이식거부질환의 치료효과와 GDF15의 발현량과의 상관관계를 확인하였다(도 10). 또한, 간이식 동물 모델에서 SD282의 치료효과의 IL-10 발현량, IL-17의 발현량 및 GDF15 발현량과의 관계를 확인하였고, GDF15 발현량이 현저히 증가함을 확인하였고, IL-10의 발현이 증가함을 확인하였으나, IL-17의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 11, 12). 상기 실험 결과를 근거로, GDF15의 발현양을 확인하여, 이식거부질환 치료제 또는 Th17를 감소시키고, Treg 세포를 증가시키는 후보물질을 스크리닝할 수 있는 방법, 면역환자에 있어서 면역상태를 모니터링할 수 있는 키트로 이용가능할 수 있음을 확인하였다(도 9 내지 12).
또한, 류마티스 관절염에서 SD282 화합물을 처리하는 경우, 관절손상 및 염증세포 침윤이 현저하게 감소됨과 더불어, GDF15 발현 세포가 증가됨을 확인하였다. 이를 근거로 상기 GDF15의 경우, 류마티스 관절염 환자의 치료효과를 모니터링할 수 있는 키트로 이용가능할 수 있음을 확인하였다(도 14).
또한, 정상인의 혈액에서 GDF15의 처리시 IL-10의 증가를 확인하였고, 간이식 환자 혈액에서도 IL-10 및 Treg 유도를 확인하였다(도 3, 4).
또한, GDF15가 TGF-β 및 α-SMA의 mRNA 수준이 감소하는 것으로 나타나, GDF15가 섬유증을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 5)
또한, 간 이식질환 환자의 면역세포에서 GDF15를 처리하는 경우, IL-10 분비 및 Treg 유도효과를 확인하여, GDF15가 이식거부질환등의 질환에 이용가능할 수 있음을 확인하였다(도 6).
또한, 쇼그렌 전임상 모델에서, GDF15를 유전자 치료제 형태로 투여하는 경우, 동물 모델의 체중이 증가하고, 질병의 스코어가 감소됨을 확인하여, GDF15를 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다(도 7).
본 발명의 “GDF15”는 성장 분화 인자 15(Growth differentiation factor 15)로서, 세포 스트레스 및 질병에 관여하며, TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원으로서 공지되어 있는 인자이다. GDF15는 1997년 subtraction cloning을 통해 처음 발견되었으며, 전염증성 사이토카인에 반응하여 분비가 증가하여, 후기 대식세포의 추가 활성화를 제한하는 것이 확인되면서, 대식세포 억제 사이토카인(macrophage inhibitory cytokine-1, MIC-1)으로 명명되기도 하였다.
한편, 이러한 GDF15는 심혈관질환과 관련된 예측 바이오마커로 알려져 있고, 심장이나 근육 손상 시에 혈청 내에서 증가하는 것으로 알려져 있다. 이러한 발현의 증가는 조직이나 세포의 재생에 관여하는 것으로 파악되고 있으며, 심혈관 쥐 모델에서 GDF15는 심장의 비대와 혀혈성 재관류 손상을 보호하는 기능이 있고, 대식세포의 항염증 기능을 가지는 M2의 분화를 촉진함이 알려져있다. 또한 일부 암 질환에서 암세포의 사멸을 유도함이 알려져 있으며, 특히 미토콘드리아 기능 이상을 가진 동물 모델에서 GDF15는 미토콘드리아의 기능을 회복하고 세포 대사를 조절 할 수 있음이 알려져 있다. 따라서 GDF15의 발현은 증가시키는 것은, 세포의 항염기능을 향상 시키고, 세포의 대사 조절 (미토콘드리아 기능회복)을 할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 용어 "SD282 화합물"은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물(N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide)일 수 있으며, 하기 화학식은 한국 특허출원 10-2014-0155182에서 개시된 화합물이다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2021015476-appb-img-000001
본 발명의 용어 "SD217 화합물"은 하기 화학식 2로 표현되는 화합물(1-(2,4-difluorophenyl)biguanide)일 수 있으며, 하기 화학식은 한국 특허출원 10-2014-0110919에서 개시된 화합물이다.
<화학식 2>
Figure PCTKR2021015476-appb-img-000002
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 GDF15 (growth/differentiation factor 15) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 면역질환은 IL-10 감소되고 및 IL-17의 발현이 증가되어, Treg의 수가 감소되었고, Th17 세포의 수가 증가된 면역질환으로, 예를 들어, 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조직 또는 기관은 간 조직 또는 간일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 면역질환은 이식 거부질환, 이식질환, 섬유증 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역질환은 예를 들어, 간섬유증, 간이식 후 섬유증, 간이식 질환, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군, 이식편대숙주질환(GVHD) 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이식은 간 세포 또는 조직의 이식일 수 있다.
성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다.
일 구현예에서, 상기 GDF15 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 GDF15 단백질은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 GDF15 단백질을 코딩하는 핵산서열은 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 GDF15 단백질을 코딩하는 핵산서열은 IL-10의 분비를 증가시키고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 유도할 수 있으며, 구체적으로 Treg의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.
본 발명에서 상기 "활성(activation)"이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.
또한, 상기 "증폭(expansion)"이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.
일 구현예에서, GDF15 단백질을 코딩하는 핵산서열은 TGF-β 및 α-SMA의 mRNA 발현수준을 감소시켜 섬유화, 예를 들어, 장기의 섬유화를 억제할 수 있다. 상기 장기는 예를 들어 간일 수 있다.
일 구현예에서, GDF15 또는 이의 단편이 조성물에 0.2 내지 200 ng/ml로 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.
또한, "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다.
또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역질환을 경감시킴.
(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating).
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 촉진제의 유효량은 관련 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효 성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 벡터는 도 13에 도시된 벡터 맵과 같이 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 면역질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 미트콘드리아 기능손상을 진단하는 방법 및 혈액내 Th17 세포의 양을 예측하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 GDF15의 발현량이 감소할 경우, 미토콘드리아의 기능이 손상되고, 혈액내 Th17 세포량이 증가한 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 간이식 후 간이식 예후를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 GDF15의 발현량이 감소할 경우, 간이식 후 섬유증, 이식면역거부반응 등의 증상이 나타날 가능성이 높아 예후가 좋지 않은 것으로 판단할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15의 발현양을 확인하는 단계를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식 관련 질환 치료의 예후를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이다.
이러한 면역억제제의 투여 후 GDF15의 발현량이 증가할 경우 예후가 좋은 것으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 류마티스 관절염 또는 이식 관련 질환의 치료를 위한 치료제 또는 치료후보 물질의 투여 후 GDF15의 발현량이 증가할 경우 예후가 좋은 것으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 치료제 또는 치료후보 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 STAT3 억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2021015476-appb-img-000003
상기 치료제 또는 치료후보 물질은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
<화학식 2>
Figure PCTKR2021015476-appb-img-000004
상기 치료제 또는 치료후보 물질은 에크멘시아 뮤신필리아(Akkermansia muciniphilia) 균주 또는 이의 배양액일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “배양액”은 미생물이 증식하기에 적합한 요소가 포함된 배지에, 목적 미생물을 종균하여, 일정시간 배양한 후 수득되는 것으로서, 미생물 및 배지를 포함하는 개념이다.
일 측면에서, 본 발명은 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 시료에서 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, IL-17의 발현을 감소시켜 Th17 세포의 양을 감소시키며, IL-10의 발현을 증가시켜 Treg 세포의 양을 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15의 발현양을 측정하는 제제를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링 하기 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 GDF15의 발현양을 측정하는 제제는 GDF15의 발현양을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 GDF15의 발현양을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는, 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 GDF15의 발현양을 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 AFP, HMMR, NXPH4, PITX1, THBS4 및/또는 UBE2T 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 AFP, HMMR, NXPH4, PITX1, THBS4 및/또는 UBE2T 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 모니터링하기 위한 조성물을 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링 하기 위한 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역질환 진단용 조성물을 포함하는, 면역질환 진단 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "면역질환 진단 키트"는 본 발명의 면역질환 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "면역질환 진단 키트"는 "면역질환 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다. 본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 면역질환 상태의 동정, 면역질환의 단계 결정 또는 치료에 대한 면역질환의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편의 발현을 확인하는 것을 포함하는 면역질환의 진단 또는 예후 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편의 미토콘드리아의 기능 활성화 용도에 관한 것이다. 미토콘드리아 활성이 조절되지 못하는 상황에서는 더 심한 염증이 생기며 이로 인하여 면역염증 질환의 발생에 미토콘드리아의 이상 반응이 매우 중요하다고 알려져 있다. 미토콘드리아의 활성이 저하될 경우에는 병인 세포의 제어 시스템이 불안하게 되고 이로 인하여 과도한 세포의 활성이나 증식을 유발하게 된다. 이와 관련하여, 본 발명의 GDF15의 발현은 미토콘드리아의 기능과 양의 상관관계에 있으므로, 이를 미토콘드리아 기능 활성화 또는 미토콘드리아 기능 확인을 위한 마커로서 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가될 수 있다.
또한, 본 발명은 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 유효성분을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 일일 투여량은 본 발명의 약학조성물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 다만, 각 유효성분의 복용량 또는 투여량이 각 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 정상 혈액에서의 TH17 세포 발현과 GDF15 발현량 연관성 확인
정상인으로부터 수득한 혈액에서 TH17 세포 발현량을 IL-17 양성 세포의 수로, 미토콘드리아 기능을 미토콘드리아 막전위 변화를 확인하는 JC-1으로 확인하고, 이들과 GDF15 발현량의 연관성을 확인하였다. 구체적으로, 정상인의 혈액에서 말초단핵구 세포 (PBMC)를 분리하여 FACS 분석을 수행하였다. PBMC 분리 후 Th17 세포 분석을 위해서 PMA, Ionomycin 및 Golgi stop 처리후 4시간 동안 반응하였다. 그 후 항-인간 CD4 PE-Cy7 처리 후 30분 동안 반응하고, Cytofix/Cytoperm을 투과화(eabilization)시켰다. 이 후 항-인간 IL-17 FITC로 염색하였다. 또한, JC-1 염색을 위해서는 키트 (JC-1 dye, Thermo Fisher)를 이용하여 수행하였다. 염색된 세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)로 분석하여, CD4+ IL-17+ 세포, JC-1+ 세포를 세포의 수를 Flow jo program을 이용하여 분석하였다. 또한, 정상인의 혈청에서 GDF15 확인을 위해 ELISA를 실시하였다. 1차 Capture ab (항-마우스 GDF15)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 96-웰 플레이트에 코팅한 후, 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 비특이적인 반응을 차단시켰다. 블로킹 후에 스탠다드(Standard)와 샘플을 플레이트에 넣고 두 시간 반응 후에 워시 버퍼(wash buffer)를 이용하여 세척하였다. 스탠다드 (재조합:항-인간 GDF15)와 혈청 원액을 넣어주고 2시간 반응 후 워시 버퍼를 이용하여 세척하였다. 세척 후 검출 ab (항-인간 GDF15)를 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 세척하고 발색을 진행하였다.
그 결과, 정상인의 혈액에서 TH17 세포의 발현이 증가하면 미토콘드리아의 기능이 손상되고 GDF15 발현이 감소하였으며, TH17 세포의 발현이 감소하면 미토콘드리아의 기능이 회복되고 GDF15 발현이 증가하는 것으로 나타나 (도 1), TH17과 GDF15 발현이 반비례의 상관관계를 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 2. 간이식 환자 혈액에서의 STAT3 억제제에 의한 GDF15 발현량과 TH17 세포 발현 및 Treg 연관성 확인
간이식 환자에서 STAT3 억제제 (메트포민) 처리에 의한 TH17 세포 발현, Treg 유도 (Foxp3 양성) 및 GDF15 발현량의 상관성을 확인하기 위해, 간이식 환자에서 수득한 혈액에서 TH17 세포 발현량을 CD4+IL-17+ 양성 세포의 수로, Treg 세포의 발현량을 CD4+CD25highFoxp3+ 양성 세포의 수로 확인하고, 이들과 GDF15 발현량의 연관성을 확인하였다. 구체적으로, 환자의 혈액에서 말초단핵구 세포를 분리하여 FACS 분석을 수행하였다. PBMC 분리 후 Th17 세포 분석을 위해서 PMA, Ionomycin 및 Golgi stop 처리후 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 항-인간 CD4 PE-Cy7 처리후 30분 반응시키고, Cytofix/Cytoperm을 투과화시켰다. 이후 항-인간 IL-17 FITC를 염색하였다. Treg 세포 분석을 위해서 항-인간 CD4 PE-Cy7 및 항-인간 CD25 APC를 처리한 후 30분 동안 반응시키고, Cytofix/Cytoperm을 투과화시켰다. 이 후 항-인간 Foxp3 PE로 염색하였다.
그 결과, STAT3 억제제 복용 전에 비해 복용 후에 TH17 세포가 감소하였으며, Treg 유도가 증가하였고, GDF15의 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 2). 이를 통해, GDF15의 발현이 STAT3 억제제에 의해 증가하고, TH17의 분화가 억제되며 Treg 유도가 증가하는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 정상 혈액에서의 GDF15에 의한 IL-10 분비 및 Treg 유도 영향 확인
정상인으로부터 수득한 혈액에서 GDF15에 의한 IL-10의 분비량과의 연관성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 인간의 말초혈액단핵구 세포에 anti-CD3 자극 단독 조건과 동시에 GDF 1ng/㎖를 처리한 후 3일간 배양 후에 sup(supernatant)을 수득하였다. 수득된 sup에 IL-10에 대해 ELISA를 진행하였다.
그 결과, GDF15에 의해 IL-10 분비가 증가하는 것으로 나타났다 (도 3).
실시예 4. 간이식 환자 혈액에서의 GDF15에 의한 IL-10 분비 및 Treg 유도 영향 확인
간이식 환자로부터 수득한 혈액에서 T 세포를 활성화 시키기 위해 Anti CD3 0.5ug/ml (plate coating 2h) 항체와 GDF15 0.25, 10 또는 20 ng/ml을 처리한 뒤, 3일간 배양 후 세포에서 Treg의 발현을 조사하였다. Treg 세포 분석을 위해서 항-인간 CD4 PE-Cy7 및 항-인간 CD25 APC를 처리한 후 30분 동안 반응시키고, Cytofix/Cytoperm을 투과화시켰다. 이 후 항-인간 Foxp3 PE를 염색하였다. Flow jo program을 이용하여 상기 항체에 대해 양성인 세포들을 분석하였다.
그 결과, GDF15에 의해 간이식 환자의 혈액 세포에서 Treg 세포 유도가 증가한 것으로 나타났다 (도 4).
실시예 5. 간세포에서의 GDF15에 의한 섬유화 영향 확인
GDF15 처리에 의해 간세포에서 섬유화가 감소되는지 확인하기 위해, 간세포 (Hepg2)에 TGF-β와 GDF15를 처리하고 GDF15에 의한 TGF-β의 단백질 수준 및 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 단백질 수준 (섬유화)을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, GDF15 처리에 의해 TGF-β 및 α-SMA의 mRNA 수준이 감소하는 것으로 나타나, GDF15가 섬유증을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다 (도 5).
실시예 6. 이식질환 환자 면역세포에서의 GDF15에 의한 IL-10 분비 및 Treg 유도 영향 확인
간 이식질환 환자로부터 수득한 면역세포에서 T 세포를 활성화시키기 위해 Anti CD3 0.5ug/ml (plate coating 2h) 항체와 GDF15 20 또는 100 ng/ml을 처리한 뒤, 3일간 배양 후 세포에서 Treg의 발현을 조사하였다. Treg 세포 분석을 위해서 항-인간 CD4 PE-Cy7 및 항-인간 CD25 APC를 처리한 후 30분 동안 반응시키고, Cytofix/Cytoperm을 투과화시켰다. 이 후 항-인간 Foxp3 PE를 염색하였다. Flow jo program을 이용하여 상기 항체에 대해 양성인 세포들을 분석하였다.
그 결과, GDF15에 의해 이식질환 환자의 면역세포에서 Treg 세포와 항염증 인자인 IL-10 유도가 증가한 것으로 나타났다 (도 6).
실시예 7. 쇼그렌 전임상 동물모델에서 GDF15에 의한 질환 치료 효과 확인
쇼그렌 전임상 동물모델(NOD/ShiLtJ)에서 GDF15 vector 주입 후 체중과 disease score를 확인하였다. 쇼그렌 전임상 모델 NOD/ShiLtJ에 GDF15 벡터를 처리한 후, 체중과 disease score를 확인하였다.
GDF15 벡터는 도 13과 같은 구성을 가지며, 하기와 같이 제조하였다. 우선, mGDF15 in pUC57-Amp 벡터는 서열번호 2에 표시되는 optimized Mus musculus GDF15 CDS에 5'말단 BglⅡ서열을 삽입하고 3'말단 stop codon을 제거하고 SalⅠ서열을 삽입하여 합성된 유전자를 확보하였다. mGDF15 in pFLAG-CMV5a 는 mGDF15 in pUC57-Amp을 BglⅡ와 SalⅠ으로 잘라서 Gel extraction을 통해 mGDF15 단편만 추출하였다. DNA 단편을 pFLAG-CMV5a 과발현 벡터에 ligation 하여 콜로니를 얻었다. 여러 콜로니를 랜덤선택하여 각각의 콜로니에서 plasmid DNA를 추출하고, BglⅡ와 SalⅠ을 처리하여 원하는 insert DNA (mGDF15)가 들어간 콜로니를 구분하여 얻었다. 선별된 클론을 시퀀싱하고 DNA 서열을 확인하였다. 선택된 클론을 HEK293세포에 형질도입한 뒤 3일 후 세포에서 단백질을 추출하고 이 단백질에서 Western Blotting을 진행하여 단백질 과발현이 확인된 clone을 선택하였다. 제조된 GDF15 벡터는 100 ug/100ul 씩 일주일에 한번 간격으로 muscle electroporation 방식으로 쇼그렌 전임상 동물모델에 주입하였다.
그 결과, GDF15 투여시 동물 모델의 체중이 증가하고, disease score가 감소함을 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 8. 이식질환 환자의 혈청에서 IL-17과 GDF15의 상관관계 확인
IL-17의 발현과 GDF15 발현량의 상관성을 확인하기 위해, 간이식 환자에서 수득한 혈청이나 혈장에서 GDF15와 IL-17의 확인을 위해 ELISA를 실시하였다. 각각의 1차 Capture ab (항-휴먼 GDF15, IL-17)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 각 96-웰 플레이트에 코팅한 후, 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 비특이적인 반응을 차단시켰다. 블로킹 후에 스탠다드(Standard)와 샘플을 플레이트에 넣고 두 시간 반응 후에 워시 버퍼(wash buffer)를 이용하여 세척하였다. 각각의 스탠다드 (재조합:GDF15, IL-17)와 혈청 원액을 넣어주고 2시간 반응 후 워시 버퍼를 이용하여 세척하였다. 세척 후 검출 각 ab (항-인간 GDF15, IL-17)를 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 세척하고 발색을 진행하였다.
그 결과, 이식환자 혈청에서 IL17이 증가시, GDF15 발현이 저하되는 네가티브 코릴레이션을 확인하였다(도 8 참조).
실시예 9. 간이식 환자 면역세포에서 SD282 화합물 처리 후 GDF15 발현량 확인
메트포민 유도체인 SD282 화합물(대한민국 등록특허 10-1705446호에 공지됨)을 간이식 환자로부터 수득한 면역세포에 처리한 후 GDF15의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 부형제 처리군에 비해 SD282 화합물 처리군(STAIM1)에서 GDF15 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다(도 9 참조).
실시예 10. 이식거부질환 동물 모델에서 SD282 화합물 처리 후 GDF15 발현량 확인
이식거부질환(GVHD) 동물 모델로 유도하기 위해서 c57BL6 MICE의 비장세포와 골수세포를 각각 분리하여 각각의 세포를 5x106을 690cGY 로 조사Balb/c 마우스에 꼬리 정맥에 세포를 주입하였다. GVHD 유도한 당일에 SD282 화합물(STAIM1), FK506 또는 SD282 화합물과 FK506의 조합(STAIM2)을 경구 투여하였다, 약물의 투여는 실험종료 시점까지 투여하였다. 실험종료 시점에 얻은 소장 조직에서 IHC로 염색한 소장 세포에서 GDF15의 발현량을 확인하였다.
그 결과, SD282 화합물과 FK506의 병용 처리군(STAIM2)에서 GDF15 발현량이 현저히 증가함을 확인하였으며, 이는 이식거부질환의 치료 효과가 우수할수록 GDF15의 발현량도 증가함을 보이는 것이다(도 10 참조).
실시예 11. 간이식 환자 아바타 동물 모델에서 SD282 화합물 처리 후 치료 효과 및 GDF15 발현량 확인
간이식 동물 모델에 FK506 또는 SD282 화합물과 FK506의 조합(STAIM2)을 투여하였다. 그런 다음, 동물 모델의 간조직을 IHC 염색하여 GDF15 발현량과 IL-10 발현량을 확인하였다.
그 결과, SD282 화합물 처리군(STAIM1) 및 SD282 화합물과 FK506의 병용 처리군(STAIM2)에서 GDF15 발현량과 IL-10의 발현량이 현저히 증가함을 확인하였으며, 이는 GDF15 발현과 IL-10의 발현이 서로 밀접한 관련이 있음을 입증하는 것이다(도 11 참조).
실시예 12. 간이식 동물 모델에서 SD282 화합물 처리 후 IL-17 및 GDF15 발현량 확인
FK506 또는 SD282 화합물과 FK506의 조합(STAIM2)을 투여하였다. 그런 다음, 동물 모델의 간조직을 IHC 염색하여 GDF15 발현량과 IL-10 발현량을 확인하였다.
그 결과, SD282 화합물과 FK506의 병용 처리군(STAIM2)에서 GDF15 발현량이 증가함을 확인하였으며, IL-10의 발현량이 현저히 증가한 반면, IL-17의 발현량이 감소함을 확인하였다. 이는 GDF15 발현이 증가할 경우 IL-17의 발현이 감소됨을 보이는 것이다(도 12 참조).
실시예 13. 류마티스관절염 질환에서 SD282 화합물 처리 후 GDF15 발현량 확인
류마티스관절염 질환에서 SD282 화합물(HL237)에 의한 질환 제어 효력을 확인하였으며, SD282 화합물(HL237) 투여 후 6주에 희생된 류마티스관절염 마우스 관절 조직의 파괴 정도 (H&E, saflaninO)와 관절 조직 내에서의 GDF15 단백질 발현 세포를 분석하였다. 구체적으로는, 시노비움 조직 내의 전체 세포 내 GDF15 발현 세포 비율 분석하였다.
그 결과, 도 14에서 볼 수 있는 바와 같이 SD282 화합물(HL237)에 의해 관절 손상과 염증세포의 침윤이 현저하게 감소하였으며, 면역 바이오마커 GDF15 발현 세포가 현저하게 증가되었다. 따라서 GDF15는 염증 질환 치료 바이오마커로서 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 14. 인간 말초단핵구 세포에서 SD282 화합물 처리 후 GDF15 발현량 확인
말초단핵구 세포에 T 세포 활성 조건인 antiCD3 0.5ug/ml로 자극한 조건에 SD282 처리 후 72시간 배양 후 그 상청액에서 GDF15의 발현을 ELISA 분석을 통해서 확인하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이 SD282 화합물에 의해 GDF15 발현 세포가 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 15. 류마티스 관절염 동물모델 제작
본 발명자들은, 대사질환에 치료 효과가 있는 것으로 알려진, 마이크로바이옴 균주인 에크멘시아 뮤신필리아(Akkermansia muciniphilia)의 GDF 발현 증가 및 류마티스 관절염에 대한 효과를 확인하기 위하여, 류마티스 동물모델을 제작하였다. 구체적으로, 정상 DBA/1 마우스에 꼬리 dermal에 type II collagen 100 ug을 주입 하였으며, 2주 후 type II collagen 100ug을 주입하여 관절염을 유발하였다. 류마티스 관절염 유발 후 3주차에 류마티스 관절염 징후를 보이는 군(관절염 지수 1점 이상)을 선별하였다. 류마티스 관절염 징후는, 관절염 지수로 평가하였으며, 류마티스 관절염 지수는 하기 표 1의 방법으로 평가하였다. 정상 대조군으로는, 야생형 마우스(WT)를 이용하였다.
점수 평가기준
0점 부종이나 종창이 없다.
1점 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점 발목관절에서 족근골 (Metatarsal bone)에 걸친 경한 부종과 발적
3점 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
상기 선별된 군의 마우스를 이용하여, 본 발명의 에크멘시아 뮤신필리아의 GDF 증가 및 류마티스 관절염 개선효과를 확인하고자 하였다.
실시예 16. 관절염 지수 및 유병율 감소 확인
본 발명의 마이크로바이옴 균주인 에크멘시아 뮤신필리아가 류마티스 관절염에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 동물모델에, 에크멘시아 뮤신필리아(1x1010/mice)를 매일 경구투여(Akkermansia 군, A. Muciniphilia)하여, 상기 표 1의 기준으로 관절염 지수 및 유발률을 관찰하였다. 유발률 평가의 경우 하나의 발에서 부종이 발생될 시 25%로 네 다리의 합을 100%로 계산하여 평가하였다. 대조군으로는 상기 실시예 1의 동물모델에 생리식염수를 투여한 Vehicle 군을 이용하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 에크멘시아 뮤신필리아를 투여한 군에서는, 유의적으로 관절염 지수가 감소하는 것을 확인하였으며, 유발률 또한 Vehicle 군과 비교하여 감소한 것을 확인하였다.
실시예 17. 연골 보호 및 연골 손상 억제 확인
본 발명의 마이크로바이옴인 에크멘시아 뮤신필리아가 관절 파괴를 억제하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 상기 실시예 2의 마우스를 인도적으로 희생하여, 관절 synovium 조직을 수득하였으며, 수득된 조직을 헤마토실린 및 에오신(Hematoxylin and eosin, H&E) 염색과, 사프라닌 O(Safranin O) 염색으로 조직의 손상 정도를 관찰하였다.
그 결과, 야생형 대조군과 비교하여, Vehicle 군에서는 염증 지수, 관절 손상 및 연골 손상이 증가한 것을 확인하였으며, 본 발명의 에크멘시아 뮤신필리아를 투여한 군에서는 Vehicle 군과 비교하여, 염증 지수, 관절 손상 및 연골 손상이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 17).
실시예 18. IL-17 발현 억제 확인
IL-17은 염증을 유발하는 인터루킨으로서, IL-17 양성 세포의 분화가 촉진되면 발현되어, 염증을 유발하게 된다. 따라서, 본 발명의 마이크로바이옴인 아커멘시아 뮤시니필 리가, 류마티스 관절염에서 IL-17의 발현을 억제하기 위하여, 상기 실시예 2의 마우스의 관절 조직을 면역조직화학염색으로 염색하여 IL-17의 발현을 확인하였다.
그 결과, Vehicle 군과 비교하여, 에크멘시아 뮤신필리아를 투여한 군에서는, IL-17이 억제된 것을 확인하였으며, IL-17 양성으로 염색된 면적(IL-17 Positive area)이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 18).
실시예 19. 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg) 조절 확인
본원 발명의 상기 실시예 2의 마우스로부터 적출한 비장을, 각각 유세포 분석을 시행하였다. 구체적으로, 적출된 비장에서, Treg 세포 분석을 위해서 항-인간 CD4 PE-Cy7 및 항-인간 CD25 APC를 처리한 후 30분 동안 반응시키고, Cytofix/Cytoperm을 투과화시켰다. 이 후 항-인간 Foxp3 PE로 염색하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 본 발명의 에크멘시아 뮤신필리아를 투여한 군에서는, Treg가 증가한 것을 확인하였다.
실시예 20. GDF15 발현 증가 확인
본 발명의 에크멘시아 뮤신필리아가 GDF의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 마우스로부터 적출한 비장을, 면역화학조직 염색을 이용하여, GDF의 발현을 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, 본원 발명의 에크멘시아 뮤신필리아를 투여한 군의 비장 절편에서는 GDF15의 발현이 유의적으로 증가하여, GDF15 양성 면적(GDF15 Positive area)가 증가한 것을 확인하였다.
실시예 21. 루프스 동물모델 및 SD217 처리
본원 발명의 GDF15 발현을 유도하는 SD217이 루푸스에 대한 효과를 확인하고자, 루푸스 동물모델을 이용하였다. 구체적으로, 10주령의 루푸스 자연발생 마우스인 MRL/lpr를 이용하였으며, MRL/lpr 마우스에 SD217을 50 mg/kg의 농도로 매일 경구 투여 하였다. 약물 투여 시작 후 2주 간격으로 체중을 측정하였다. 약물투여 16주차에 마우스를 인도적으로 희생하였다. 대조군으로는, 생리식염수를 투여한 Vehicle군을 이용하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 루푸스 자연발생 마우스인 MRL/lpr 마우스는 루푸스 병증이 증가될수록, 체중 감소가 일어나는 반면, GDF15 발현을 유도하는 SD217을 투여한 군에서는 체중이 유지 및 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 SD217이 루푸스의 병증 진행을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 22. SD217 처리에 따른 면역세포 조절 확인
본원 발명의 신규한 화합물인 GDF15 발현을 유도하는 SD217이, 루푸스 동물모델에서, 면역 세포를 조절하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 상기 실시예 1의 희생된 마우스의 전혈을 채취하고, 혈액세포에서 CD4-(percp cy5.5), CD8-(PE) T 세포(double negative T cell, DNT)의 발현을 유세포분석으로 분석하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, GDF15 발현을 유도하는 SD217을 투여한 군에서는 Vehicle군과 비교하여, DNT의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

Claims (21)

  1. GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역질환은 IL-10 감소되고 및 IL-17의 발현이 증가되어, Treg의 수가 감소되었고, Th17 세포의 수가 증가된 면역질환인 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역질환은 이식 거부질환, 이식질환 및 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역질환은 간섬유증, 간이식 후 섬유증, 간이식 질환, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군 및 이식편대숙주질환(GVHD)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 GDF15 단백질은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 GDF15 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열은 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열은 IL-10의 분비를 증가시키고 Treg 세포를 유도하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열은 TGF-β 및 α-SMA의 mRNA 발현수준을 감소시켜 섬유화를 억제하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 미트콘드리아 기능손상을 진단하는 방법.
  11. GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 혈액내 Th17 세포의 양을 예측하는 방법.
  12. GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 간이식 후 간이식 예후를 모니터링하는 방법.
  13. GDF15의 발현양을 확인하는 단계;를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식 관련 질환 치료의 예후를 모니터링하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 방법은 치료제 또는 치료후보 물질의 투여 후 GDF15의 발현량이 증가할 경우 예후가 좋은 것으로 판단하는 것인 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환 치료의 예후를 모니터링하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 치료제 또는 치료후보 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 STAT3 억제제인 것인, 방법
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2021015476-appb-img-000005
    .
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 치료제 또는 치료후보 물질은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인, 방법
    <화학식 2>
    Figure PCTKR2021015476-appb-img-000006
    .
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 치료제 또는 치료후보 물질은 에크멘시아 뮤신필리아(Akkermansia muciniphilia) 균주 또는 이의 배양액인, 방법.
  18. 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 시료에서 GDF15의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, IL-17의 발현을 감소시켜 Th17 세포의 양을 감소시키며, IL-10의 발현을 증가시켜 Treg 세포의 양을 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 방법.
  19. GDF15의 발현양을 측정하는 제제를 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링 하기 위한 조성물.
  20. 제 19항에 따른 조성물을 포함하는 1)류마티스 관절염 또는 2)이식 후, 이식관련 질환의 예후를 모니터링 하기 위한 키트.
  21. GDF15 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역질환의 치료 방법.
PCT/KR2021/015476 2020-10-30 2021-10-29 Gdf15를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물 WO2022092915A1 (ko)

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