WO2020130431A1 - 클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2020130431A1
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WO
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cell
versus
stem cells
host disease
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PCT/KR2019/017031
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송순욱
김시나
문정현
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에스씨엠생명과학 주식회사
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    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention is a composition for preventing, treating or improving graft-versus-host disease, including monoclonal mesenchymal stem cells (MSC) obtained through improved layer separation culture of stem cells, and graft-versus-host disease using the same It relates to a method of treatment.
  • MSC monoclonal mesenchymal stem cells
  • T lymphocytes the immune cells of others, introduced into the host through treatments such as bone marrow transplantation between allogeneic, peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation, and immunity deterioration, etc.
  • the immune function is deteriorated, it is not killed by the host's immune system but multiplies in the host's body and lymphocytes recognize the patient's cells as non-self and attack the host, depending on the severity of symptoms In severe cases, it can also lead to death.
  • Graft-versus-host disease is classified as acute and chronic, and is classified as acute if it occurs 100 days before the procedure and chronic when it occurs after 100 days. Graft-versus-host disease is most often acute, and T cells contained in the graft respond to specific antigens present in the host cell and cause various symptoms. Symptoms of infection include pneumonia due to infection and cytomegalovirus. , Hepatitis, gastroenteritis. Skin lesions cause a skin rash similar to measles, which usually occurs in the auricle, palm, and sole of the foot, and is different from other skin diseases. Along with skin diseases, liver disease accompanies jaundice and increases liver levels. If you have problems with the gastrointestinal tract, you may have nausea, vomiting, loss of appetite, abdominal pain, and diarrhea.
  • stem cells have the potential to grow into the tissues of all 210 organs of our body, can divide indefinitely, and can differentiate into desired organs through proper manipulation. Because of these characteristics of stem cells, stem cells are in the spotlight as a new treatment, and the possibility of treating incurable diseases using stem cells is very high, and it is expected to be able to treat numerous diseases such as leukemia, osteoporosis, hepatitis, Parkinson's disease, senile dementia, and burns. have.
  • stem cells there are still many limitations in that it is difficult to obtain them in large quantities. Although it can be said that the method for obtaining stem cells from a frozen embryonic cell is efficient, there are still many controversies in terms of ethics. In order to solve this problem, many studies have been conducted on a method for obtaining a stem cell using a somatic cell nuclear transfer method or an adult stem cell.
  • Adult stem cell research is more actively conducted than embryonic stem cell research.
  • Adult stem cells remain in various organs, such as the central nervous system or bone marrow, and are cells that participate in long-term development and regeneration when damaged. Because they exist in various organs, they can be obtained from various parts including bone marrow, spleen, fat cells, etc. The method of obtaining is most often practiced. However, among many different types of bone marrow cells, it is difficult to always obtain a uniform type of cell in separating and culturing mesenchymal stem cells, and research has been conducted to compensate for these problems.
  • the present inventor has invented a method for separating stem cells, which is called a novel layer separation culture method, and has applied for a patent and registered it through Korean patent application KR 10-2006-0075676.
  • the layer-separated culture method can be performed at a lower cost than other methods, and there is no contamination problem, and other stem cells in that clonal mesenchymal stem cells (cMSC) can be effectively obtained without fear of mixing with other stem cells. It has excellent superiority to the obtained method.
  • the layered culture method requires a sufficient amount of mesenchymal stems through a process of producing a working cell bank and obtaining the final product through mass production of mesenchymal stem cells for use as a final product. It was difficult to obtain a fast monoclonal mesenchymal stem cell population in that cells could be obtained and at least 10 passages were required.
  • a therapeutic agent for stem cells still has various technical limitations, and in particular, a method of manufacturing stem cells for effectively treating graft-versus-host disease and a method of treating graft-versus-host disease using the same are not known.
  • the present inventors while conducting research to induce rapid proliferation of stem cells through improvement of the layer separation culture method as described above, use an improved layer separation culture method in which the cultured cell density is controlled low and antioxidant is added to culture. Small passages can be used to induce an effective increase in cell proliferation, and the single clonal mesenchymal stem cells obtained through this are clonal mesenchymal stem cells obtained from a conventional layer separation culture method or graft-versus-host disease compared to conventional stem cells. It was confirmed that the therapeutic effect of the drug was increased and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is a composition for preventing, treating and improving graft-versus-host disease comprising a single clonal stem cell obtained through a layer-separated culture and proliferation method of a stem cell that has improved the conventional layer-separated culture method and a method for manufacturing the same Is to provide
  • the present invention comprises the steps of 1) culturing bone marrow separated from an individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating graft-versus-host disease, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4).
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant of step 3) as the supernatant of the first container of step 2); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a stem cell for preventing, improving or treating graft-versus-host disease obtained through.
  • the improved method of layer separation culture and proliferation of stem cells of the present invention it is possible to obtain large quantities of desired monoclonal mesenchymal stem cells in a short time through rapid proliferation of monoclonal mesenchymal stem cells. Since the monoclonal mesenchymal stem cells are stem cells having an enhanced therapeutic effect against graft-versus-host disease, they can be usefully used as a therapeutic agent for graft-versus-host disease.
  • FIG. 1 is a view showing a layer separation culture method for separating monoclonal mesenchymal stem cells from human bone marrow.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming the morphological changes of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through microscopic observation.
  • FIG. 3 shows changes in cell size and granularity of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through forward scatter (FSC) through flow cytometry (FACS) analysis.
  • FSC forward scatter
  • FACS flow cytometry
  • SSC side scatter
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of confirming whether cells are aged by staining the activity of beta galactosidase (beta gal) with monoclonal mesenchymal stem cells having different cell culture densities and cell passage cultures.
  • Figure 5 shows the results of aging-related genes p15, p16 and proliferation marker PCNA confirmed by RT-PCR after culturing the single-clonal mesenchymal stem cells of passage 15 (Passage 15; P15) at different cell culture densities. It is.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming the proliferation capacity of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through cell population doubling time (PDT) and population doubling level (PDL). (*P ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 7 is a view showing the results of confirming the differentiation ability of the monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 7A is a result of confirming the differentiation ability of monoclonal mesenchymal stem cells into adipocytes according to cell culture and cell passage culture through Oil red O histological staining
  • FIG. 7B quantifies the degree of histological staining of A It is the figure shown.
  • 7C is a result of confirming the differentiation ability of monoclonal mesenchymal stem cells into osteogenic cells according to cell culture and cell passage culture through Alizarin red S histological staining
  • FIG. 7D shows the degree of histological staining of C It is a figure shown by quantifying.
  • FIG. 8 shows the production of total reactive oxygen species (ROS) produced from monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture (A) and thus DNA damage through comet assay (B ) It is a diagram showing one result (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • ROS total reactive oxygen species
  • Figure 9 shows the concentration of 8-oxo-deoxyguanosine (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; 8-OHdG) in order to confirm the degree of DNA damage caused by free radicals produced according to cell culture density and cell passage culture. It is a diagram showing the measured result (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • FIG. 11 is a result of comparing the level of activated oxygen species produced after culturing monoclonal mesenchymal stem cells of passage 15 (P15) under high-density condition alone (HD) or high-density condition + addition of ascorbic acid (HD+AA). It is a diagram showing (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 12A is a diagram showing a comparison between a conventional layer separation culture method and an improved layer separation culture method experiment method.
  • 12B is a schematic diagram of an improved layer separation culture method, and is a schematic diagram showing a low density culture corresponding to passage 2 different from the conventional layer separation culture method.
  • FIG. 13 to 20 are inoculated with SCM01 to SCM08 monoclonal mesenchymal stem cells obtained through a layer separation culture method at a density of 1000 or 4000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) and LG- with or without antioxidant added.
  • FIG. 13 to 20 It is a diagram showing the results of confirming the proliferation rate of cells cultured using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, low glucose), ⁇ -MEM (Minimum Essential Medium ⁇ ) culture medium.
  • a of each figure shows the change in cell number according to passage 1 (P1) to passage 5 (P5) of each experimental group
  • B of each figure shows the cell group doubling time (PDT) and cell number proliferation level (PDL) results of each experimental group. It is.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in an experimental group using only LG-DMEM medium to which no antioxidant was added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 22 shows the results of confirming the cell group doubling time (PDT) and cell number proliferation level (PDL) in the experimental group using only LG-DMEM medium to which no antioxidant was added and varying the cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density. It is a diagram showing.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in the experimental group using only ⁇ -MEM medium to which antioxidants were added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of confirming PDT and PDL in an experimental group using only ⁇ -MEM medium to which an antioxidant was added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in the experimental group in which the cell density was fixed at a density of 1000 cells/cm 2 and the culture medium was changed to LG-DMEM or ⁇ -MEM.
  • 26 is a diagram showing the results of confirming PDT and PDL in an experimental group in which the cell density was fixed at a density of 1000 cells/cm 2 and the culture medium was changed to LG-DMEM or ⁇ -MEM.
  • 27 is a schematic diagram showing a method of manufacturing an animal model for graft-versus-host disease.
  • FIG. 29 is a diagram showing the results of confirming the MHC II phenotype of C57BL/6 recipient blood in a mouse induced graft-versus-host disease through flow cytometry.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of confirming the skin layer of the mouse on the 7th and 14th days of graft-versus-host disease induction through tissue staining.
  • 31 is a view showing the results of confirming the change in weight of the mouse for 4 weeks after induction of graft-versus-host disease.
  • 32 is a schematic diagram of an experiment for confirming the treatment effect of a graft versus host disease animal model and subsequent treatment.
  • 33 is a schematic diagram of an experiment for confirming the effect of treating graft-versus-host disease using cMSC1 of the improved layer separation culture method.
  • 34 is a diagram showing the results of confirming the survival rate of graft-versus-host disease mice according to the improved layer separation culture method cMSC1 administration.
  • 35 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving the clinical symptoms of graft-versus-host disease according to the administration of cMSC1 of the improved layer separation culture method.
  • 36 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving skin symptoms among clinical symptoms of graft-versus-host disease according to administration of cMSC1 in the improved layer separation culture method.
  • FIG. 37 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving the symptoms of fur texture among clinical symptoms of graft-versus-host disease according to the administration of cMSC1 of the improved layer separation culture method.
  • 38 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving the diarrhea symptoms of clinical symptoms of graft-versus-host disease according to the administration of cMSC1 of the improved layer separation culture method.
  • 39 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving the symptoms of ascites among clinical symptoms of graft-versus-host disease according to the administration of the cMSC1 of the improved layer separation culture method.
  • FIG. 40 is a diagram showing the results of confirming the posture improvement effect among clinical symptoms of graft-versus-host disease according to the administration of cMSC1 in the improved layer separation culture method.
  • 41 is a diagram showing the results of confirming the cell number and cell size of the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1 under a microscope.
  • FIG. 42 is a diagram showing the results of confirming the cell size of the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1 through a Nucleo Counter NC-250 instrument.
  • FIG. 43 is a diagram showing the results of confirming the cell size of the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1 through a flow cytometer.
  • 44 is a diagram showing the results of confirming the expression level of the immune-related marker of the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1 through qPCR.
  • Figure 45 compares the survival rates according to the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1(100) (100 cells/cm 2 culture), cMSC1(1000) (1000 cells/cm 2 culture) treatment in the GVHD animal model. It is a diagram showing the results.
  • Figure 46 shows the clinical symptoms improvement effect of the conventional layer separation culture method cMSC2 and the improved layer separation culture method cMSC1(100) (100 cell/cm 2 culture), cMSC1(1000) (1000 cell/cm 2 culture) treatment in the GVHD animal model. It is a diagram showing the result of comparing.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating graft-versus-host disease, including single clonal stem cells, obtained through improved layer separation culture and proliferation methods of mesenchymal stem cells. Administering to the individual in need; It relates to a graft-versus-host disease prevention or treatment method comprising a.
  • the present invention comprises the steps of obtaining a single clonal stem cells through an improved layer separation culture and proliferation method of mesenchymal stem cells; It relates to a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating graft-versus-host disease comprising a.
  • the active ingredient of the present invention provides rapid proliferation of monoclonal stem cells, preferably monoclonal mesenchymal stem cells.
  • WCB Working Cell Bank
  • the monoclonal stem cells obtained through the above method are stem cells having an increased therapeutic effect against graft-versus-host disease compared to stem cells obtained through a conventional layer separation culture method.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating graft-versus-host disease, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the culture of steps 2) and 3) is cultured at 30 to 40° C. for 4 hours or less, preferably 1 hour to 3 hours, more preferably 1 hour 30 minutes to 2 hours 30 minutes, and repeated culture is 30 to 40 4 hours or less at °C, preferably 1 hour to 3 hours, more preferably 1 hour 30 minutes to 2 hours and 30 minutes after incubation, 30 to 40 °C 12 to 36 hours, preferably 18 hours to 30 hours incubation It is repeated 2 to 3 times, and then incubated at 30 to 40°C for 24 to 72 hours, 36 to 60 hours, preferably 36 to 60 hours, and each time the supernatant is transferred to a new culture vessel. have.
  • the cultured cells form a monoclonal cell population. After separating the monoclonal cell populations, passage culture can be performed.
  • a single clonal stem cell obtained through a layer separation culture is rapidly obtained in large quantities, .
  • it is characterized by including the culture step of step 5).
  • Step 5) is a single clonal stem cells 1000 cells / cm 2 (cells / cm 2 ) It is a step of inoculating the medium with a cell density of less than, preferably, 50 to 1000 cells/cm 2 and culturing. According to the present invention, since it is possible to induce the proliferation of fast monoclonal stem cells, the final product can be rapidly obtained, and MCB (Master Cell Bank) can be manufactured through a small number of passage cultures.
  • MCB Master Cell Bank
  • layer separation culture refers to a method for separating stem cells according to specific gravity, first extracting human bone marrow and culturing it in a cell culture medium, and then obtaining only the supernatant to treat or not treat the coating agent. Refers to the process of repeating the same process several times after transferring to a culture vessel and culturing.
  • This layer-separated culture is characterized by repeating the process of culturing by repeatedly obtaining the supernatant without centrifugation, and finally, without contamination of other cells, monoclonal stem cells, preferably monoclonal mesenchymal stems. There is an advantage that cells can be obtained.
  • Steps 1) to 4) of steps 1) to 5) of the present invention may be performed in the same or equivalent manner to the layer separation culture method described in KR 10-2006-0075676 or KR10-2007-0053298, KR 10-2006-0075676 may be incorporated herein by reference in its entirety.
  • KR10-2007-0053298 a method of obtaining cells in connection with the treatment of graft-host disease 1) collecting bone marrow from an individual; 2) culturing the collected bone marrow; 3) only the supernatant of step 2) is transferred to a new container and cultured; 4) Disclosing only the supernatant of step 3) and repeating the culturing in a culture vessel treated with a coating agent or a culture vessel without a coating agent, wherein the method is directed to single clonal stem cells with only a difference in density without centrifugation.
  • KR 10-2006-0075676 uses the conventional layer separation culture method in that it is a method of obtaining.
  • the present invention relates to a "improved layer separation culture method" based on the fact that by controlling the cell density in the culture after passage 2, it is possible to effectively obtain stem cells excellent in preventing, treating and improving graft-versus-host disease.
  • Characterized in that the conventional layer separation culture method and the culturing step after the seed cell are different.
  • the single clonal stem cells of step 4) above are 50 to 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) And incubating the medium with a cell density of'.
  • the improved layer separation culture method can induce the proliferation of monoclonal stem cells faster than the conventional layer separation culture method, and thus the final product can be rapidly obtained.
  • a single clonal stem cell for use in the treatment of graft-versus-host disease can be obtained through passages of P2 to P13 passages, and a sufficient passage of graft-versus-host disease treatment effect is achieved even with a passage passage less than 10 such as P2 to P8.
  • freeze-type stem cells may be used, and the improved stem-separated culture method of the present invention may be used after freezing and thawing stem cells obtained through passage 8 or less.
  • stem cells in the case of chronic graft-versus-host disease that requires rapid treatment, fresh stem cells can be used for effective treatment, and in this case, the stem cells can be obtained by extending the passage to 13 passages to secure a larger amount of stem cells. .
  • the stem cells obtained as described above are monoclonal stem cells in which the expression of immune-related markers is increased, the differentiation ability is maintained, and aging is suppressed compared to the stem cells obtained by high-density culture, which is obtained through a conventional centrifugation method.
  • the stem cells and stem cells obtained by the conventional layer separation culture method may be stem cells having a significantly improved treatment effect against graft-versus-host disease.
  • the monoclonal stem cells of the present invention are cultured at a high density of 4000 cells/cm 2 as in the conventional process, the cell proliferation capacity is significantly reduced, the marker of mesenchymal stem cells is changed, and the differentiation capacity of the stem cells may be lost. have. Therefore, the monoclonal stem cells obtained through the improved layer separation culture method have low to medium density, 4000 cells/cm 2 Low cell density of less than (cells/cm 2 ), such as 3000 cells/cm 2 Or less, preferably 2000 cells/cm 2 or less, more preferably 50 to 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) It can mean cultured at a cell density.
  • the medium used in the present invention may include a medium not containing an antioxidant, a medium in which an antioxidant is added to the medium, or a medium containing an antioxidant.
  • DMEM medium may be used as a medium that does not contain an antioxidant, but is not limited thereto, and if necessary, culture may be performed by further adding an antioxidant to the medium. In addition, if necessary, the culture may be performed using an ⁇ -MEM medium containing an antioxidant.
  • Antioxidants of the invention may comprise an antioxidant that can be used in cell culture without limitation, and glutaric Leone (Glutathione), Cysteine (Cysteine), cysteamine (Cysteamine), ubiquinol (Ubiquinol), beta-Merced It may be at least one selected from the group consisting of cap-ethanol (b-mercaptoethanol) and ascorbic acid (Ascorbic acid; AA).
  • glutaric Leone Glutathione
  • Cysteine Cysteine
  • cysteamine cysteamine
  • Ubiquinol ubiquinol
  • beta-Merced It may be at least one selected from the group consisting of cap-ethanol (b-mercaptoethanol) and ascorbic acid (Ascorbic acid; AA).
  • the antioxidant may be added at a concentration of 10 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 25 ⁇ g/ml.
  • DMEM more preferably LG-DMEM medium is used as a medium containing no antioxidant
  • ⁇ -MEM medium is used as a medium containing ascorbic acid as an antioxidant.
  • gentamicin When using a medium containing an antioxidant as the culture medium of the present invention, gentamicin may be added as an antibiotic to the culture medium.
  • a process of manufacturing a working cell bank (WCB) using MCB may be omitted. This simplifies the process compared to the conventional layer separation culture method that involves the process of manufacturing WCB after MCB production.
  • the mesenchymal stem cells obtained through the method of the present invention may be stem cells obtained after passage 2 to passage 13, preferably after passage 2 to passage 12, more preferably passage 2 to passage 9.
  • mesenchymal stem cells having an excellent effect of treating graft-versus-host disease sufficient to be used as a therapeutic agent can be sufficiently obtained only by culturing less than passage 10, and as quickly as chronic graft-versus-host disease If more stem cells are required, the passage can be expanded up to 13, for example, 12 passages, and cultured to obtain more monoclonal stem cells with improved graft-versus-host disease treatment effect.
  • the single layer obtained by the improved layer separation cultivation method as described above, improved layer separation cultivation method of low density and antioxidant conditions of preferably 2000 cells/cm 2 or less, more preferably 1000 cells/cm 2 or less Clonal stem cells (hereinafter referred to as'cMSC1') can be formed to be smaller and more homogeneous in cell size compared to single clonal stem cells (hereinafter referred to as'cMSC2') obtained by a conventional layer separation culture method, It is characterized by stem cells that can increase the survival rate of chronic graft-versus-host disease as well as acute, increase the expression of immune-related markers, and effectively improve the clinical factors of various graft-versus-host diseases when administered to an individual.
  • implant graft versus host disease refers to a disease in which an immune response occurs by recognizing T lymphocytes in the peripheral blood or bone marrow of a donor injected during allograft as being in the body of a patient, and chronic or acute graft versus host disease. All inclusive.
  • Stem cells used in the treatment of graft-versus-host disease may be either fresh or frozen, and may be appropriately selected and used according to clinical judgment.
  • graft-versus-host disease may include, without limitation, both acute graft-versus-host disease or chronic graft-versus-host disease.
  • the monoclonal stem cells obtained by the improved layer separation culture method of the present invention may be characterized by an increased expression level of an immunological marker compared to the stem cells obtained by a conventional layer separation culture method or a centrifugal separation method, for example, IDO ( Indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand), TSG6 (Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein), CXCL9 (chemokine (CXC motif) ligand 9), CXCL10 (chemokine (CXC motif) ligand 10), and HO-1 (Heme oxygenase-1) may be increased in the expression level of one or more immune-related markers selected from the group consisting of.
  • IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase
  • ICOSL Induced T cell co-stimulator ligand
  • TSG6 Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein
  • CXCL9 chemokine (C
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier included in the pharmaceutical composition of the present invention is commonly used in formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but is not limited thereto It does not work.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be varied by the method of formulating the pharmaceutical composition, the method of administration, the administration time and/or route of administration, etc., and the type and degree of reaction to be achieved by administration of the pharmaceutical composition.
  • Factors including the type of subject to be administered, age, weight, general health status, severity or severity of the disease, sex, diet, excretion, components of drugs or other compositions used concurrently or in conjunction with the subject, and It can be varied according to similar factors well known in the pharmaceutical field, and those skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be, for example, 1 mg/kg to 1,000 mg/kg per day, but the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the route of administration and the mode of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent of each other, and are not particularly limited in the manner, and any route of administration and mode of administration as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site. You can follow.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral administration or parenteral administration.
  • the parenteral administration method includes, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, or subcutaneous administration, and a method of applying, spraying, or inhaling the pharmaceutical composition to a diseased site may also be used. However, it is not limited thereto.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4) (cells/cm 2 ) Obtaining a single clonal stem cell through the step of inoculating the medium with a cell density of culturing; And 6) administering the single clonal stem cells to the individual; It provides a method for preventing or treating graft-versus-host disease, including.
  • the'individual' includes an individual in need of prevention or treatment of graft-versus-host disease, and may be a mammal or a mammal other than a human.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4).
  • the culture of step 5) is 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) It can be characterized in that it is performed by inoculating the medium with a cell density of.
  • the medium of step 5 may be characterized in that the medium is added with antioxidants.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a stem cell for preventing, improving or treating graft-versus-host disease obtained through.
  • single clonal stem cells obtained by a conventional layer separation culture method compared to single clonal stem cells obtained by a conventional layer separation culture method, single clonal stem cells exhibiting excellent graft-versus-host disease prevention, improvement or treatment effects can be obtained quickly and easily without WCB production, and the Monoclonal stem cells can be included without limitation in pharmaceutical, food, quasi-drug, and cosmetic compositions.
  • the contents described in the above composition may be applied identically, and overlapping contents are omitted to avoid the complexity of the specification.
  • Improved mesenchymal stem cell layer separation culture method and proliferation method were used to prepare monoclonal mesenchymal stem cells that show better effect on graft-versus-host disease.
  • the improved mesenchymal stem cell layer separation culture method and proliferation method are characterized by changing the cell density and culture medium among the culture conditions of the layer separation culture method described in Korean Patent Application No. 10-2006-0075676.
  • the cell culture density of monoclonal mesenchymal stem cells (cMSC) obtained through the layer separation culture method is 50 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) (low density) and 1000 cells/cm 2, respectively. (Medium density), 4,000 cells / cm 2 (high density) was varied and the properties of the cells were analyzed accordingly.
  • mesenchymal stem cells of passage 5 (P5), passage 10 (P10), and passage 15 (P15) were used, and inoculated into LG-DMEM medium under conditions of low density, medium density, and high density, respectively. Thereafter, morphological changes of the cells were observed through a microscope to determine whether stem cells were aged, and the results are shown in FIG. 2.
  • passage 5 (P5) and passage 10 (P10) showed a difference in cell size and morphological pattern according to cell density, especially in the case of P15, in the high density culture condition, flat and enlarged mesenchymal lobes Stem cells were observed.
  • This form represents the aging of typical mesenchymal stem cells, and it was confirmed that the density control of cells in long-term culture can control the aging of mesenchymal stem cells.
  • the size of the cells did not show a significant difference in P5, but in the case of P10 and P15, it was confirmed that it shows a significant difference according to the cell density.
  • the cell size was significantly increased in the culture conditions of high cell density, and thus it was confirmed that cell aging was further promoted.
  • the particle size of cells also showed a significant increase as the density of cells increased at all passages. Therefore, in the long-term cultivation of mesenchymal stem cells, it was confirmed that cell density control can be a factor that regulates cell aging, and by lowering the cell culture density, it can be confirmed that the morphological changes occurring in later passages can be improved. .
  • Examples 1.1 and 1.2 are actually an aging-dependent phenomenon of mesenchymal stem cells
  • a staining analysis method using beta galactosidase capable of selectively staining senescent cells was performed, and the expressions of the aging-related genes p15, p16 and the proliferation marker PCNA gene were compared through RT-PCR. The results are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • passage 5 (P5) and passage 10 (P10) were not able to confirm the staining of aged cells at all cell densities, whereas passage 15 (P15) increased cell density as the cell density increased. It was confirmed that this increased significantly.
  • passage 15 (P15) as the cell culture density increased, the gene expression of the CDK inhibitors p15 and p16, which are aging-related genes, increased, and the proliferation marker PCNA decreased.
  • the proliferative capacity can be used as a criterion for confirming the aging of mesenchymal stem cells, and the proliferative capacity of mesenchymal stem cells according to the cell culture density during long-term cell culture was performed.
  • the proliferation capacity of each cell was confirmed by calculating the proliferation rate according to each passage through the number of cells initially inoculated and the number of cells obtained after the culture was over, and the results are shown in Table 1 and FIG. 6.
  • the differentiation capacity according to P5 to P15 culture was compared. Adipose cell differentiation ability and bone cell differentiation ability were confirmed by stem cell function, and normal and quantitative analysis was performed at each passage and density.
  • the adipocyte differentiation culture was NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10 -7 mol dexamethasone (Sigma), 0.5 mM IBMX (Sigma), 10 ⁇ g/ml insulin (insulin) (Sigma) in High Glusose DMEM culture.
  • indomethacin indomethacin
  • indomethacin 100 ⁇ M indomethacin (indomethacin) (Sigma) was added to the medium was made and tested, 7 days after the differentiation was confirmed by Oil red O histochemical staining. In addition, after the oil red O histochemical staining, it was eluted with isopropyl alcohol, measured at 500 nm and confirmed by quantitative analysis.
  • the bone cell differentiation culture medium was supplemented with ⁇ -MEM medium containing FBS (Gibco), 50 ⁇ g/ml ascorbic 2 phosphate (sigma), 10 -8 mol dexamethasone (Sigma), and 10 mM betaglycerophosphate ( ⁇ (sigma)). After the 21-day differentiation, it was confirmed by Alizarin red S histochemical staining.After Alizarin red S histochemical staining, it was eluted with 10% acetic acid, measured at 405 nm, and confirmed by quantitative analysis. 7 shows the results of adipocyte differentiation and bone cell differentiation.
  • the osteoblast differentiation ability decreased as the passage progressed, but the difference by density was not clearly observed, whereas in the case of the osteoblast differentiation ability, it was significantly decreased in the passage 15 (P15) culture group under high density condition. Was confirmed. Through these results, it was confirmed that the osteoblast differentiation ability of mesenchymal stem cells can be better maintained when cultured with a low cell density.
  • passage 15 when the cells were cultured at a high density, the expression amount of most positive markers was significantly reduced, and CD73 and CD105 showed negative expression. It was confirmed that it can be a very important factor.
  • ROS Reactive oxygen species
  • ROS total reactive oxygen species
  • the 8-OHdG analysis method is as follows. 50 ⁇ l of the DNA sample obtained from each cell was placed in a 8-OHdG conjugate coated plate, and then incubated at room temperature for 10 minutes. Thereafter, an anti-8-OHdG antibody was additionally added and cultured for 1 hour at room temperature. After washing 3 times, a secondary antibody enzyme conjugate was added to each well, and then 1 Incubated at room temperature for an hour. After washing again three times, a substrate solution was added and incubated at room temperature for 30 minutes. Finally, after adding a stop solution, the absorbance was measured at 450 nm to confirm, and the results are shown in FIG. 9.
  • the fold increased from P11 to P15 to 2.6, 1.9, and 1.6, respectively, and as the number of passages increased, aging began to decrease as the number of passages increased. It was confirmed that the proliferation capacity was maintained high by about 50%. Also, the growth fold increase in the antioxidant treatment group was 3.8 in P11 to P15, respectively. The proliferation capacity was maintained high even at P15 at 2.9 and 2.5.
  • MSC culture is preferably performed at a low cell density rather than a high density, and when the ROS production induced in the high-density cell culture is eliminated with an antioxidant, it is possible to increase the proliferation capacity of mesenchymal stem cells. That is, in the high-density condition, the proliferative capacity of mesenchymal stem cells is suppressed due to ROS, and as the cell density decreases, the ROS decreases, so that the mesenchymal stem cell proliferation capacity can be promoted.
  • the cell density in the culture conditions is 1000 cells/cm 2 It is important to control the density below, and when cultivated by adding antioxidants, it was confirmed that the mesenchymal stem cell proliferation can be effectively promoted by suppressing oxidative stress that may be caused in cell culture.
  • stem cells of passage 15 or higher have a density of 1000 cells/cm 2 or less, as compared to those of passage 5 or passage 10, the morphological changes of cells are prominent and the results such as promoting aging of stem cells and reducing differentiation are confirmed. It was confirmed that culturing with low passage number was the most effective.
  • Example 1 in the mesenchymal stem cell culture obtained by the layer separation culture method, since it was confirmed that cell density control, passage control, and addition of antioxidants could be important factors, domestic patent application 10-2006-
  • the single-clonal mesenchymal stem cells obtained by the conventional process of the layer separation culture method described in 0075676 have different cell culture densities, while the medium is changed with a medium to which an antioxidant ascorbic acid is added while proliferating ability of a single colony MSC and thus obtaining cells. Effects were compared.
  • KR 10-2007-0053298 discloses a treatment for graft-versus-host disease using mesenchymal bone marrow cells obtained through a layer-separated culture method, in which a single cell group obtained by a layer-separated culture method is 6-well culture corresponding to passage 1 It only discloses the fact that it moves to a cell number of 100 to 600 cells in a container, and it does not disclose the composition and effect accordingly for the repeated culture density control of individual cells other than colony 2 after passage 2.
  • at least 10 passages should be cultured in order to obtain a sufficient amount of monoclonal stem cells having an effect of preventing, treating, and improving graft-versus-host disease.
  • the improved layer separation cultivation method of the present invention it is possible to efficiently obtain large quantities of the desired single clonal stem cells through low passage density such as passage 2 to passage 13 and low cell density conditions.
  • the present improvement method after culturing the colonies of passage 1 (P1) obtained through the layer separation culture method, in passage culture after passage 2 (P2), cells are divided to a low density of 1000 cells/cm 2 or less, and Compared to the effect of 4000 cell/cm 2 cell culture.
  • the cell culture medium was different from the ⁇ -MEM medium containing the antioxidant and the LG-DMEM medium without the antioxidant, and the cell proliferation effect was compared accordingly.
  • the experimental group for confirming the effect of the improved layer separation culture method is shown in Table 3 below, and the process improvement part is schematically shown in FIGS. 12A and 12B.
  • the conventional layer separation culture method and the improved layer separation culture method proceed in the same way until the step of obtaining passage 1, but the improved layer separation culture method uses extended passage 1 cells as seed cells to culture.
  • the passage culture process is different from the conventional layer separation culture method.
  • Existing layer separation culture method performs a high density passage culture of 4000 cells/cm 2 or more for the purpose of obtaining many cells without being aware of the density conditions, but the improved layer separation culture method reduces the density of the passage culture to a low density of 1000 cells/cm. By adjusting to 2 or less, a sufficient amount of the final product can be obtained only by cultivation of passage 9 or less after passage 2, and expansion cultures up to 13 passages can be obtained to obtain more monoclonal stem cells.
  • the culture process after passage 2 is shown in detail in FIG. 12B.
  • the cell lines are cell lines separated by a layer separation culture method and are named SCM01 to SCM08, respectively.
  • the cells were cultured using the SCM01 to 08 cell lines, and the cell proliferation effect according to the passage was compared with cell number, cell population doubling time (PDT), and cell population proliferation level (PDL). , This is shown in FIGS. 13 to 20.
  • the culture medium was fixed with LG DMEM or ⁇ -MEM medium, respectively, and the cell proliferation effects according to the inoculation density of 1000 or 4000 cells per cm 2 were compared, and the results were compared. 21 to 24.
  • the proliferation rate at passage 2 (P2) to passage 5 (P5) of the SCM01 to SCM08 cell lines cultured in LG DMEM was inoculated with 1000 cell counts than 4000 cell count inoculation groups per cm 2 and cultured.
  • the proliferation rate of 1000 cell inoculation groups compared to 4000 cell inoculations per cm 2 confirmed in passage 5 (P5) was found to be a minimum of 3.08 to a maximum of 48.50 times.
  • cm PDT value of 1000 cells inoculated group per Fig. 2 showed a cm 2 4000 gae cell lines lower or similar than the inoculated sugar in all cell lines, PDL values is 4000 per cm 2 in all cell lines Higher values were observed compared to dog cell inoculation.
  • Example 2.2 Since it was confirmed through the previous Example 2.2 that 1000 cell/cm 2 culture can show superior proliferation effect compared to 4000 cell/cm 2 culture, the cell number is fixed to 1000, and the cell proliferation effect is compared while changing the medium to a variable. By doing so, the proliferation effect by culture medium conditions was additionally verified and the results are shown in FIGS. 25 and 26.
  • the layer separation culture process and proliferation culture of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells of the present invention were performed as follows.
  • bone marrow was collected by stabbing an injection needle into the hip bone.
  • 14 ml DMEM Dulbecco ⁇ s modified Eagle ⁇ s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin in a 100 mm culture vessel
  • human bone marrow The cells were cultured at 37° C. in a CO 2 cell incubator for 2 hours. After cultivation, only the upper culture medium of the culture vessel was transferred to a new container so as to prevent the cells attached to the bottom from falling off by tilting the culture vessel slightly to one side.
  • the obtained culture solution was transferred to a culture vessel (Becton Dickinson) coated with collagen on the bottom, and then cultured at 37°C for 2 hours.
  • the culture was transferred to a new collagen-coated container again, and after 24 hours, to a new container, and after 24 hours, to a new container.
  • the cells were transferred to a new container, and the remaining cells were attached to the bottom of the culture vessel and visually confirmed. It is possible to guess that the cells that can reach this stage through the previous multiple layer separation steps are significantly smaller cells than other cells.
  • the cells formed a single colony, which was separated by treatment with trypsin and then transferred to a 6-well culture vessel. After incubation for 4-5 days in a 37°C, 5% CO 2 cell incubator, when grown to about 80%, the cells were obtained by treatment with 0.05% trypsin/1mM EDTA (GIBCO-BRL), and then transferred to a T175 culture vessel to lower cells. The cells were cultured at a density.
  • ROS stress induced in cell culture of high density can be effectively improved by antioxidant treatment, and cell proliferation ability of mesenchymal stem cells can be restored.
  • it has a feature of significantly shortening the passage of cells and maintaining a characteristic of mesenchymal stem cells in which a single colony mesenchymal stem cell in a fresh state without progression can be rapidly and stably obtained.
  • low-density cell culture can obtain a large number of cells in a short time, which simplifies the manufacturing process as well as aging that maintains the characteristics of mesenchymal stem cells intact even in long-term culture. It was confirmed that it was possible to obtain cells in a non-state, thereby enabling production of high-quality stem cells.
  • stem cells obtained through the improved method constructed through the above example were used.
  • FIG. 27 shows a method of manufacturing an animal model for graft-versus-host disease.
  • BALB/c mice were irradiated with an amount of 8.5 Gy, and after 24 hours, bone marrow cells (5x10 6 /0.1 ml) and spleen cells (5x10 6 /0.1 ml) were extracted from female C57BL/6N, and radioactivity was investigated.
  • BALB/c mice were injected through a vein. To confirm that the mouse model of graft-versus-host disease was constructed, the skin, fur texture, ascites, dirrhea, and hunched back were observed in the manufactured mouse and the clinical study of graft-versus-host disease It was confirmed whether or not it exhibits red symptoms.
  • the prepared mouse is shown in FIG. 28.
  • mice prepared according to the manufacturing method of the present invention showed a phenomenon in which hairs are rough and cracked and fall off compared to the control group, and it was confirmed that the hairs had a yellowish color. Also, ascites showed cold, bloody stool symptoms, and curved back. In addition, it was confirmed that the exercise amount and the amount of meals also decreased compared to the control group.
  • graft-versus-host disease mice produced by the production method of the present invention exhibited an MHC II phenotype in C57BL/6 recipient blood compared to Naive mice.
  • graft-versus-host disease mice produced by the production method of the present invention had thicker dermal layers compared to Naive mice.
  • monocyte infiltration was observed in the hyperkeratinocytes and the periphery of blood vessels.
  • both the epidermal layer and the dermal layer developed thicker than the Naive mouse, and the fat layer under the dermal layer collapsed and there was damage to the hair follicles or sebaceous glands.
  • the graft-versus-host disease-induced mice had a reduced body weight compared to Naive mice, and it was confirmed that the largest weight change was observed on the 10th day after transplantation.
  • FIG. 32 It is shown in FIG. 32 by briefly simulating the method of manufacturing the animal model of graft-versus-host disease and the treatment method thereafter.
  • the cell culture density was 1000 cells/cm 2 or less, and monoclonal mesenchymal stem cells were obtained using a-MEM medium containing an antioxidant. Gentamicin was added as an antibiotic, and was performed with ⁇ -MEM culture (see Table 5).
  • cMSC1 stem cells obtained through an improved layer separation culture method with low density and antioxidant conditions of 1000 cells/cm 2 or less were designated as “cMSC1”.
  • GCM graft centrifugation method
  • GCM-MSC graft centrifugation method
  • mice receiving cMSC1 of the present invention had the lowest clinical score evaluated on days 7, 10, and 14 after induction of graft versus host disease.
  • mice administered cMSC1 of the present invention showed a significant clinical symptom improvement effect compared to the experimental group administered only with a cell stabilizer. In addition, compared to the group administered with GCM-MSC, it showed a remarkably excellent effect.
  • clonal stem cells obtained according to the method of culturing at a low concentration in a-MEM medium, an improved layer separation culture method have the effect of increasing the survival rate of graft-versus-host disease mice and improving various clinical symptoms. It was confirmed that it can be usefully used as a treatment for graft-versus-host disease.
  • cMSC1 is a mesenchymal stem cell obtained through an improved layer separation culture method having low density and antioxidant medium conditions, and as previously confirmed, the stem cell characteristics and proliferation ability are effectively maintained compared to the mesenchymal stem cell obtained according to the conventional layer separation culture method. And has superiority.
  • a comparative experiment was conducted to confirm whether cMSC1 has superiority as a therapeutic agent for graft-versus-host disease compared to stem cells separated by a conventional layer separation method.
  • antioxidants are not added, and based on the same layer separation method as stem cells (hereinafter referred to as “cMSC2”) separated by a conventional layer separation culture method with a culture cell count per area of 4000 cells/cm 2 or more, but an antioxidant is added.
  • the monoclonal mesenchymal stem cells (cMSC1) obtained by culturing at a low density in ⁇ -MEM were used, which are summarized in Table 10.
  • FIG. 41 The cell number and cell size of cMSC2 and cMSC1 of the present invention were confirmed through a microscope, and the results are shown in FIG. 41. As shown in FIG. 41, it was confirmed that cMSC2 obtained by different production processes and cMSC1 of the present invention were different in size and number of cells.
  • the cell size was confirmed using a Nucleo Counter NC-250 instrument. More specifically, since mesenchymal stem cells have the characteristic of growing on the plastic, trypsin-EDTA is used to remove the cells from the plastic. Take a picture of the cells at this time and check if there is a difference in the state of the cells when they were circular And, the cell size was confirmed using a Nucleo Counter NC-250 instrument, and the results are shown in FIG. 42 and Table 11.
  • cMSC2 has a large cell size, so that the cells are widely distributed, whereas cMSC1 has a small cell size and is distributed within 200K of lateral scattered light (SSC).
  • SSC lateral scattered light
  • the expression level of the immune-related markers IDO, ICOSL, TSG6, CXCL9, CXCL10, HO-1
  • Example 5.1 Since it was confirmed through Example 5.1 that the stem cells obtained through the improved layer separation culture method show more suitable cell characteristics as a GVHD therapeutic agent compared to the stem cells obtained through the conventional layer separation culture method, an acute GVHD animal model was prepared. , cMSC1 and cMSC2 treatment effects were confirmed in animal models.
  • 7.0Gy radiation close to the lethal dose was irradiated to remove all of the immune cells of the receptor BALB/c, and bone marrow cells and spleen cells isolated from the recipient C57BL/6N after about 24 hours 5
  • 200 ⁇ l was injected into the irradiated BALB/c through the vein to cause disease.
  • the established GVHD animal model was administered with stem cells cMSC1 and cMSC2 obtained through an improved layer separation culture method.
  • stem cells obtained in the experimental group improved delamination culture method of culturing or less 1000cell / cm 2 was 100 cell / cm 2 Stem cells obtained by passage culture with (cMSC1(100)) and 1000cell/cm 2 (cMSC1(1000)) were used, and high-density culture cMSC2 corresponding to the conventional layer separation culture method was obtained by passage culture with 4000cell/cm 2 Stem cells were used.
  • cell viability was averaged at 99.53%, 99.66%, and 99.8%, respectively, and it was confirmed that the density-controlled culture did not show cytotoxicity.
  • the administered substances and total doses administered to the cell cGVHD animal model are shown in Table 12 below.
  • the severity of GVHD was confirmed by scoring the severity of each symptom such as burning, diarrhea and ascites, posture, movement, etc. of skin keratin and wounds, hair loss and roughness observed with the naked eye on the skin, and analyzed according to survival rate Did.
  • the cMSC injection group increased the point of survival drop more than 2 times when compared to the PBS alone injection group (PBS: 7 days, cMSC injection group: 16-18 days).
  • the survival rate began to decrease from the 18th day, and the survival rate decreased to 50% on the 27th day, and 40% of the total survived until the observation period (day 28). Did.
  • the cMSC1 (100) and cMSC1 (1000) obtained through the improved layer separation culture method showed that the survival rate decreased from day 18 in both administration groups, but the survival rate was maintained after that, and it was confirmed that 70% of the total survival was maintained even on day 28. This is a result showing that the stem cells obtained through the improved layer separation culture method with an increase in survival rate of about 1.5 times or more compared to the conventional layer separation culture method can exhibit excellent GVHD treatment effect compared to the stem cells obtained through the conventional layer separation culture method.
  • GVHD+PBS G3 group
  • GVHD+cMSC1 100
  • GVHD+cMSC1 1000
  • G6 high-density cultured cMSC2 administration group
  • cMSC1 obtained through an improved layer separation culture method increases the survival rate of graft-versus-host disease and effectively improves various clinical symptoms.
  • cMSC1 according to the present invention maintains excellent proliferation capacity and stem cell characteristics compared to the existing single-clonal mesenchymal stem cells, thereby effectively maintaining proliferation, as well as monoclonal mesenchymal stems produced for the manufacture of existing therapeutic agents.
  • WCB preparation compared to cells can be omitted and can be obtained at a small number of passages, so it is possible to treat graft-versus-host disease better than conventional monoclonal mesenchymal stem cells because it is a fresh, single-clone clone that has not undergone aging. Able to know.

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이를 이용한 이식편대숙주질환 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 이식편대숙주질환 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 이식편대숙주질환 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주질환 치료용 약학적 조성물
본 발명은 줄기세포의 개선된 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells; MSC)를 포함하는 이식편대숙주질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이를 이용한 이식편대숙주질환 치료 방법에 관한 것이다.
이식편대숙주 질환 (Graft Versus Host Disease)은 동종 간의 골수 이식이나 말초혈액 조혈모세포 이식, 면역력 저하 등의 이유로 진행한 수혈 등의 치료행위를 통하여 숙주 내로 유입된 타인의 면역세포인 T 림프구가 숙주가 면역 기능이 저하된 경우에는 숙주의 면역체계에 의하여 사멸되지 않고 숙주의 체내에서 증식하여 림프구가 환자의 세포를 비자기(non-self)로 인식하여 숙주를 공격하는 병으로, 증상의 정도에 따라 심한 경우 사망에 이르기도 하는 질환이다. 이식편대 숙주 질환의 원인은 크게 2가지로 나뉘는데, 숙주의 면역력 약화와 가족의 혈액 수혈이다. 이식편대숙주질환은 급성과 만성으로 구분하며, 시술 후 100일 이전에 발생하면 급성, 100일 이후에 발생하면 만성으로 분류된다. 이식편대숙주질환은 급성으로 오는 경우가 대부분이며 이식편에 포함된 T세포가 숙주세포에 존재하는 특이 항원에 대하여 반응을 나타내고 여러 가지 증상을 일으키는데, 발생되는 증상으로는 감염, 사이토메갈로바이러스로 인한 폐렴, 간염, 위장관염이 있다. 피부병변으로 홍역과 비슷한 피부의 발진이 생기는데 주로 귓바퀴, 손바닥, 발바닥에 발생하므로 다른 피부질환과 차이가 있다. 피부질환과 함께 간질환이 동반되어 황달이 발생하고 간수치가 증가한다. 위장관에 문제가 있는 경우 구역, 구토, 식욕부진, 복통 및 설사 증상이 있다.
현재까지 이식편대숙주질환의 근본적인 치료방법은 없으며 증상을 완화시킬 수 있는 치료만 가능하고, 스테로이드요법이 효과적인 치료로 사용되고 있다.
한편 최근 다양한 질환의 치료에 줄기세포를 이용하고자 하는 시도들이 진행되고 있다. 줄기세포는 우리 몸의 210여개 모든 기관의 조직으로 성장할 수 있는 잠재적 능력을 갖고 있고, 무한히 분열할 수 있으며 적절한 조작을 통해 원하는 장기로 분화할 수 있다.　이와 같은 줄기세포의 특성 때문에 줄기세포는 새로운 치료제로 각광받고 있으며, 줄기세포를 이용한 난치병의 치료가능성은 대단히 높아 백혈병, 골다공증, 간염, 파킨슨씨병, 노인성 치매, 화상 등 수많은 질병 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다.
그러나 줄기세포의 경우, 이를 대량으로 수득하기 어렵다는 점에서 여전히 많은 제약사항이 있다. 줄기세포를 수득하는 방법으로 냉동 배아세포에서 얻는 방법이 효율적이라고 할 수 있지만 윤리적인 면에서 아직도 많은 논란이 있다. 이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 체세포 핵 이식 방법이나 성체 줄기세포를 이용하여 줄기세포를 수득하는 방법 역시 많은 연구가 진행되었다. 배아줄기세포에 대한 연구보다 활발히 행해지는 분야는 성체줄기세포 연구이다.　성체줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포로 각종 장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으나 골수에서 얻는 방법이 가장 흔히 시행된다.　그러나 많은 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포들을 분리, 배양하는 데 있어 항상 균일한 형태의 세포를 얻는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 연구가 행해지고 있다.
본 발명자는 신규한 층분리 배양법이라고 명명된 줄기세포의 분리방법을 발명한 바 있으며, 대한민국 특허출원 KR 10-2006-0075676 호를 통해 특허 출원하고 이를 등록 받았다. 상기 층분리 배양법은 다른 방법에 비해 적은 비용으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 오염 문제가 없으며 타 줄기세포가 섞일 염려 없이 클로날 중간엽 줄기세포(cMSC)를 효과적으로 얻을 수 있다는 점에 있어서 다른 줄기세포 수득 방법에 비해 탁월한 우수성을 가지고 있다. 그러나 상기 방법의 우수성에도 불구하고, 층분리 배양법은 중간엽 줄기세포를 대량 생산하여 최종 산물로 사용하기 위해서는 워킹 셀 뱅크를 제조하고, 이를 통해 최종 산물을 수득하는 공정을 거쳐야 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있으며 최소 10 계대(Passage) 이상의 배양이 필요하다는 점에서 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포 집단 수득이 어려운 한계점이 있었다.
따라서, 줄기세포를 치료제 개발은 아직까지 다양한 기술적 한계점을 가지고 있으며, 특히 이식편대숙주질환을 효과적으로 치료하기 위한 줄기세포 제조법 및 이를 이용한 이식편대숙주질환의 치료 방법에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 층분리 배양법의 개선을 통해 줄기세포의 빠른 증식을 유도하기 위한 연구를 하던 중, 배양 세포 밀도를 낮게 조절하고 항산화제를 첨가하여 배양하는 개선된 층분리 배양법을 이용하는 경우, 적은 계대 배양만으로도 효과적인 세포 증식률 증가를 유도할 수 있고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포가 종래 층분리 배양 방법으로부터 수득되는 클로날 중간엽 줄기세포 또는 기존의 줄기세포 대비 이식편대숙주 질환의 치료 효과를 증대시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 기존의 층분리 배양법을 개선한 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방, 치료 및 개선용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 이식편대숙주질환 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 개선된 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포는 이식편대숙주 질환 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 이식편대숙주질환 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 사람 골수로부터의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 분리하는 층분리 배양법을 나타낸 도이다.
도 2는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 세포 크기 및 입도(granularity)의 변화를 유세포 분석기(Flow cytometry; FACS) 분석을 통해 전방산란(forward scatter; FSC) (A) 및 측방산란(side scatter; SSC) (B)광의 평균값으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 4는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양을 달리한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 베타 갈락토시다아제(베타 gal)의 활성도를 염색을 통해 세포의 노화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 계대 15(Passage 15; P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하여 배양한 후 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식능을 세포군 배가 시간(population doubling time; PDT) 및 세포수 증식 수준(population doubling level; PDL)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 7은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 분화능력을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005). 도 7의 A는 세포 배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 Oil red O 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며 도 7의 B는 A의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다. 도7의 C는 세포배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 골화 세포로의 분화능을 Alizarin red S 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며, 도 7의 D는 C의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 8은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 단일 클로날 중간엽 줄기세포에서 생산되는 총 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생산 (A) 및 이에 따른 DNA 손상을 comet assay를 통해 확인 (B) 한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 9는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 생산되는 활성산소종에 의한 DNA 손상 정도를 확인하기 위하여 8-옥소-데옥시구아노신(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; 8-OHdG) 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 10은 계대 11(P11) 내지 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산(항산화제의 일종) 추가(HD+AA)를 통해 배양한 후 세포 증식능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 계대 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산 추가(HD+AA)로 배양한 후, 생산되는 활성산소종 수준을 비교한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 12a 는 종래 층분리 배양법 및 개선된 층분리 배양법 실험 방법을 비교하여 나타낸 도이다.
도 12b 는 개선된 층분리 배양법의 모식도로, 종래 층분리 배양법과 상이한 계대 2 이후에 해당하는 저밀도 배양을 나타낸 모식도이다.
도 13 내지 도 20 은 층분리 배양법을 통해 수득된 SCM01 내지 SCM08 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 1000 또는 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 밀도로 접종하고 항산화제 첨가 유무를 달리한 LG-DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, low glucose), α-MEM(Minimum Essential Medium α) 배양 배지를 이용하여 배양한 세포의 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 각 도의 A는 각 실험군의 계대 1(P1) 내지 계대 5(P5)에 따른 세포 수의 변화를, 각 도의 B는 각 실험군의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL) 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL 을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM으로 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM으로 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL 을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 이식편대숙주질환 동물 모델의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 28은 제조된 이식편대숙주질환 동물 모델에서 임상적 증상의 발현을 확인한 도이다 (▲이식편대숙주 질환 유발 마우스).
도 29는 이식편대숙주질환을 유도한 마우스에서 C57BL/6 수여자 혈중의 MHC Ⅱ 표현형을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 이식편대숙주질환 유도 7일 및 14일째 마우스의 피부층을 조직염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 31은 이식편대숙주질환 유도 후 4주 동안 마우스의 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 이식편대숙주질환 동물 모델의 제조 및 이 후 치료 효과 확인 실험의 모식도이다.
도 33은 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 를 이용한 이식편대숙주질환 치료 효과 확인 실험의 모식도이다.
도 34는 개선된 층분리 배양법 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 마우스의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 중 피부 증상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 37은 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 중 모질 (fur texture) 증상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 38은 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 중 설사 증상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 39는 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 중 복수 (ascites) 증상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 40은 개선된 층분리 배양법의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 중 자세 (posture) 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 41은 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1의 세포수 및 세포 사이즈를 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 42는 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1의 세포 사이즈를 Nucleo Counter NC-250 기기를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 43은 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1의 세포 사이즈를 유세포 분석기를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 44는 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1의 면역 관련 마커의 발현량을 qPCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 45는 GVHD 동물 모델에서 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1(100)(100 cells/cm 2 배양), cMSC1(1000)(1000 cells/cm 2 배양) 처리에 따른 생존율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 46은 GVHD 동물 모델에서 기존 층분리 배양법 cMSC2 및 개선된 층분리 배양법 cMSC1(100)(100 cell/cm 2 배양), cMSC1(1000)(1000 cell/cm 2 배양) 처리에 따른 임상 증상 개선 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포(cMSC1)를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 단일 클로날 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유효성분인 단일 클로날 줄기세포는 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 빠른 증식을 통해 WCB (Working Cell Bank) 제조 단계 없이도 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있는 개선된 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포이다. 상기의 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 종래 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포와 비교하여 이식편대숙주 질환 치료 효과가 증대된 줄기세포이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 2) 및 3) 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양하고, 반복 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양 후, 30 내지 40℃에서 12 내지 36시간, 바람직하게는 18 시간 내지 30시간 배양을 2 내지 3회 반복하고, 이어서 30 내지 40℃에서 24 내지 72시간, 36시간 내지 60시간, 바람직하게는 36시간 내지 60시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 분리한 방법을 간단히 요약하면 다음과 같다.　
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배양한 세포들은 단일 클로날 세포군을 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 분리한 후 계대 배양을 수행할 수 있으며 본 발명은 층분리 배양을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포를 대량으로 신속하게 수득하고, 이식편대숙주질환 치료효과가 증대된 단일 클로날 줄기세포를 수득하기 위하여 5) 단계의 배양 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 5) 단계는 단일 클로날 줄기세포를 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 이하의 세포 밀도, 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm 2 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계이다. 본 발명에 따르면 빠른 단일 클로날 줄기세포의 증식을 유도할 수 있으므로, 최종 산물을 빠르게 수득할 수 있으며, 적은 수의 계대 배양을 통해 MCB(Master Cell Bank)를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어, "층분리 배양" 은 줄기세포를 비중에 따라 분리하는 방법을 의미하며, 먼저 사람 골수를 추출하여 세포 배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하는 공정을 말한다. 이와 같은 층분리 배양은 원심분리 과정 없이 상층액을 반복적으로 수득하여 배양하는 공정을 반복하는 것을 특징으로 하며, 최종적으로 다른 세포의 오염없이 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 1) 내지 5) 단계 중 1) 내지 4) 단계는 KR 10-2006-0075676호, 또는 KR10-2007-0053298호에 기재된 층분리 배양 방법과 동일 또는 동등하게 수행될 수 있고, KR 10-2006-0075676호는 본 발명에 전체로서 참고될 수 있다.
종래 KR10-2007-0053298호에서는 이식편숙주질환의 치료와 관련하여 세포를 얻는 방법으로 1) 개체로부터 골수를 채취하는 단계; 2) 채취한 골수를 배양하는 단계; 3) 단계 2)의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계; 4) 단계 3)의 상층액만을 분리하여 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양용기에서 반복 배양하는 단계를 개시하고 있으며, 상기 방법은 원심분리 없이 밀도차이만으로 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 방법이라는 점에서 KR 10-2006-0075676호의 종래 층분리 배양방법을 이용한다.
그러나, 상기 KR 10-2006-0075676호 및 KR10-2007-0053298호의 층분리 배양 방법은, 단일 클로날 줄기세포를 낮은 계대에서 효과적으로 수득하고, 이를 통해 이식편대숙주질환 치료 효과가 현저하게 개선된 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위한 방법을 개시하고 있지 않다.
종래 층분리 배양방법은 도 1에서 확인되는 바와 같이 단일 콜로니로부터 얻어진 모든 세포를 6웰로 이동시켜 80-90% 컨플루언시 (confluency) 로 증식시킨 후, 증식된 상태의 계대 1(P1) 세포들을 seed cell 로 하여 밀도 조절에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위하여 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 로 고밀도 배양을 수행한다.
반면 본 발명은 계대 2 이후의 배양에서 세포 밀도를 조절함으로써 이식편대숙주질환 예방, 치료, 개선 효과가 우수한 줄기세포를 효과적으로 수득할 수 있음을 기초로 한 “개선된 층분리 배양 방법” 에 관한 것이며, 종래 층분리 배양방법과 seed cell 이후 배양 단계를 달리하는 것을 특징으로 한다. 예컨대 구체적으로 '5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계'를 포함한다. 개선된 층분리 배양 방법은 종래 층분리 배양 방법 대비 빠른 단일 클로날 줄기세포의 증식을 유도할 수 있으므로, 최종 산물을 빠르게 수득할 수 있다. 이식편대숙주질환의 치료에 사용하기 위한 단일 클로날 줄기세포는 P2 내지 P13 계대 배양을 통해 수득될 수 있으며, P2 내지 P8 와 같은 계대 10 미만의 낮은 계대 배양만으로도 충분한 양의 이식편대숙주질환 치료 효과가 탁월한 줄기세포를 수득할 수 있다. 예컨대 급성 이식편대숙주질환의 경우 동결형의 줄기세포를 사용할 수 있으며, 본 발명의 개선된 층분리 배양법으로 계대 8 이하의 배양을 통해 수득된 줄기세포를 동결 및 해동시킨 후 이용할 수 있다. 또한 빠른 치료가 필요한 만성 이식편대숙주질환의 경우 효과적인 치료를 위하여 신선형 줄기세포를 이용할 수 있고, 이 경우 보다 많은 양의 줄기세포 확보를 위하여 13 계대까지 계대를 확장하여 줄기세포를 수득할 수 있다. 상기와 같이 수득되는 줄기세포는 고밀도 배양으로 수득되는 줄기세포 대비 모두 면역관련 마커의 발현이 증가되고, 분화능 유지, 노화가 억제된 단일 클로날 줄기세포인 바, 기존의 원심분리 방법을 통해 수득되는 줄기세포 및 기존 층분리 배양법에 의해 수득되는 줄기세포 대비 이식편대숙주질환 치료 효과가 매우 현저하게 개선된 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 단일 클로날 줄기세포는 기존의 공정과 같이 4000 세포/cm 2의 고밀도로 배양되는 경우 세포 증식능이 현저하게 감소하고 중간엽 줄기세포의 마커가 변화되고, 줄기세포의 분화능이 상실될 수 있다. 따라서 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포는 저밀도 내지 중간 정도의 밀도, 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 미만의 낮은 세포 밀도, 예컨대 3000 세포/cm 2 이하, 바람직하게는 2000 세포/cm 2 이하, 더욱 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 세포 밀도로 배양된 것을 의미할 수 있다.
1000 세포/cm 2(cells/cm 2) 이하의 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우, 세포의 증식능은 4000 세포/cm 2 같이 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 장기간의 배양기간 내내 현저히 높게 유지되므로, 많은 계대를 반복하지 않아도 원하는 양의 대량 단일 클로날 세포를 빠르게 수득할 수 있는 장점이 있다. 또한 상기 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우 해당 세포는 DNA 손상이 적으며, 노화가 억제되어 줄기세포의 분화능을 효과적으로 유지할 수 있는 장점이 있어 빠르고 신속하게 우수한 줄기세포 특성을 갖는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지는 항산화제를 포함하지 않는 배지, 상기 배지에 항산화제가 추가된 배지 또는 항산화제를 포함하는 배지를 모두 포함할 수 있다.
항산화제를 포함하지 않는 배지로는 이에 제한되는 것은 아니나 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지에 항산화제를 더 추가하여 배양을 수행할 수 있다. 또한 필요에 따라 항산화제가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 배양을 수행할 수 있다.
본 발명의 항산화제는 세포 배양에 사용될 수 있는 항산화제를 제한 없이 포함할 수 있으며, 글루타리온( Glutathione ), 시스테인(Cysteine), 시스테아민(Cysteamine), 유비퀴놀(Ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol) 및 아스코르브산(Ascorbic acid; AA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 항산화제가 배지에 추가되는 경우, 상기 항산화제는 10 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30, 더욱 바람직하게는 25μg/ml의 농도로 추가될 수 있다.
본 발명의 일 예에서는 항산화제를 포함하지 않는 배지로 DMEM, 더욱 바람직하게는 LG-DMEM 배지를 사용하며, 항산화제로 아스코르브산을 포함하는 배지로 α-MEM 배지를 사용한다.
본 발명의 배양 배지로 항산화제를 포함하는 배지를 이용하는 경우, 상기 배양 배지에는 항생제로 젠타마이신이 추가될 수 있다.
한편 본 발명의 방법에 따르면 단일 클로날 줄기세포를 매우 효과적으로 증식할 수 있으므로, MCB 를 이용하여 WCB (Working Cell Bank)를 제조하는 공정이 생략될 수 있다. 이는 기존의 층분리 배양법이 MCB 제조 후 WCB를 제조하는 공정을 수반해야 하는 것과 비교하여 공정을 단순화한 것이다.
본 발명의 방법을 통해 수득된 중간엽 줄기세포는 계대 2 내지 계대 13 이후, 바람직하게는 계대 2 내지 계대 12의 이후, 더욱 바람직하게는 계대 2 내지 계대 9 에 수득되는 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 개선된 층분리 배양법에 따르면 계대 10 미만의 배양만으로도 치료제로 사용되기 위한 충분한 우수한 이식편대숙주질환 치료 효과를 갖는 중간엽 줄기세포를 충분히 수득할 수 있으며, 만성 이식편대숙주질환과 같이 신속하게 더욱 많은 줄기세포가 필요한 경우, 계대를 최대 13, 예컨대 12 계대까지 확장하여 배양하여 이식편대숙주질환 치료 효과가 증진된 단일 클로날 줄기세포를 보다 많이 수득할 수 있다.
이는 최소 계대 10 이상의 배양이 필수적으로 요구되는 기존의 공정 대비 더 낮은 계대에서 수득되는 줄기세포이며, 세포 접종 밀도 조절을 통해 낮은 계대에서 빠르게 증식된 중간엽 줄기세포를 손쉽게 대량 수득할 수 있고, 동시에 이식편대숙주질환 치료 효과가 개선된 중간엽 줄기세포임을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기와 같은 개선된 층분리 배양법, 바람직하게는 2000 세포/cm 2 이하, 더욱 바람직하게는 1000 세포/cm 2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개선된 층분리 배양법 방법으로 수득된 단일 클로날 줄기세포 (이하, 'cMSC1' 으로 표기) 는 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포 (이하 'cMSC2' 로 표기)와 비교하여, 세포 크기가 더 작고 균질하게 형성될 수 있으며, 급성 뿐만 아니라 만성 이식편대숙주질환의 생존율을 높이고, 면역관련 마커들의 발현이 증가되며, 개체에 투여시 각종 이식편대 숙주질환의 임상적 인자들을 효과적으로 개선할 수 있는 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어 “이식편대숙주 질환” 이란 동종이식 때 주입되는 공여자의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말하며, 만성 또는 급성 이식편대숙주 질환을 모두 포함한다. 이식편대숙주 질환의 치료에 사용되는 줄기세포는 신선형 또는 동결형을 모두 사용할 수 있으며, 임상적 판단에 따라 적절하게 선택하여 사용될 수 있다.
따라서 본 발명에 있어 이식편대 숙주질환은 급성 이식편대 숙주질환 또는 만성 이식편대 숙주질환을 모두 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 개선된 층분리 배양방법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 종래 층분리 배양법 또는 원심 분리방법으로 수득되는 줄기세포 대비 면역학적 마커의 발현량이 증대된 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOSL(Induced T cell co-stimulator ligand), TSG6 (Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein), CXCL9 (chemokine (C-X-C motif) ligand 9), CXCL10 (chemokine (C-X-C motif) ligand 10), 및 HO-1 (Heme oxygenase-1) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 마커의 발현량이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이식에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 1일 1 mg/kg 내지 1,000 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함되며, 상기 약학적 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포 수득하는 단계; 및 6) 상기 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 이식편대숙주질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어, 상기 '개체'는 이식편대숙주질환 예방 또는 치료가 필요한 개체를 포함하며, 포유류 또는 인간을 제외한 포유류일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2 ) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 이식편대숙주질환 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 탁월한 이식편대숙주질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 단일 클로날 줄기세포를 WCB 제조없이 빠르고 손쉽게 수득할 수 있으며, 상기 단일 클로날 줄기세포는 약학, 식품, 의약외품, 및 화장료 조성물에 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 치료방법 및 제조방법에 있어, 상기에서 조성물에서 기술된 내용이 동일하게 적용될 수 있으며, 중복되는 내용은 명세서 기재의 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.
<실시예 1> 개량된 층분리 배양법의 확립
보다 이식편대숙주질환에 우수한 효과를 나타내는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 제조하기 위하여 개량된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법을 이용하였다. 개량된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법은 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 배양 조건 중 세포 밀도 및 배양 배지를 변경한 것을 특징으로 한다. 이하 실험에서는 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 중간엽 줄기세포(cMSC)의 세포 배양 밀도를 각각 50 세포/cm 2(cells/cm 2) (저밀도), 1000 세포/cm 2 (중간 밀도), 4,000 세포/cm 2 (고밀도)로 달리하고 그에 따른 세포의 특성을 분석하였다.
1.1 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화 확인
먼저 장기간 배양에서 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 장기간 배양 조건을 주기 위하여 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)의 중간엽 줄기세포를 이용하였으며, 각각 저밀도, 중간밀도, 고밀도의 조건으로 LG-DMEM 배지에 접종하였다. 이 후 세포의 형태학적 변화를 현미경을 통해 관찰하여 줄기세포의 노화여부를 판단하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 세포 밀도에 따라 세포 크기와 형태학적 패턴에서 차이를 나타냈으며, 특히 P15의 경우 고밀도 배양 조건에서 편평하며 커진 형태의 중간엽 줄기세포가 관찰되었다. 이와 같은 형태는 전형적인 중간엽 줄기세포의 노화를 나타내는 것으로, 장기간 배양에서 세포의 밀도 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 확인하였다.
1.2 세포 밀도에 따른 MSC 세포 크기 및 입도 확인
세포 밀도에 따른 줄기세포의 변화를 추가적으로 확인하기 위하여, 노화된 세포에서 증가하는 것으로 알려져 있는 세포 크기 및 세포의 입도(granularity)를 유세포 분석기를 통해 정략 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포의 크기는 P5에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, P10 및 P15인 경우 세포 밀도에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 특히 P10 및 P15에서는 높은 세포 밀도의 배양 조건에서 세포의 크기가 유의적으로 증가하여 세포 노화가 더욱 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이와 동일하게 세포의 입도 역시 모든 계대(Passage)에서 세포의 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다. 따라서 중간엽 줄기세포의 장기간 배양에 있어 세포의 밀도 조절이 세포 노화를 조절하는 인자가 될 수 있음을 확인하였으며, 세포 배양 밀도를 낮춤으로써 후기 계대에서 나타나는 형태학적 변화를 개선할 수 있음을 확인하였다.
1.3 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 노화 확인
실시예 1.1 및 1.2에서 확인된 형태학적 변화가 실제로 중간엽 줄기세포의 노화 의존적 (age-dependent) 현상인지를 확인하기 위하여, 노화 세포를 선택적으로 염색할 수 있는 베타 갈락토시다아제를 이용한 염색분석법을 수행하고, 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 모든 세포 밀도에서 노화된 세포의 염색을 확인할 수 없었으나, 계대 15(P15)에서는 세포 밀도가 높아질수록 노화된 세포의 염색이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 계대 15(P15)에서는 세포의 배양 밀도가 증가할수록 노화관련 유전자인 CDK 억제제 p15 및 p16의 유전자 발현이 증가하였으며, 증식 마커인 PCNA는 감소하였다.
이러한 결과는 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화가 중간엽 줄기세포의 노화와 관련 있음을 나타내는 결과이며, 세포 배양 밀도의 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 나타내는 결과이다.
1.4 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 변화 확인
중간엽 줄기세포의 증식 능력은 계대가 진행되고, 세포의 노화가 진행됨에 따라 점차적으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증식능은 중간엽 줄기세포의 노화를 확인할 수 있는 기준으로 사용될 수 있으며, 장기간 세포 배양 시 세포 배양 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 비교를 수행하였다. 각 세포의 증식능은 초기 접종 세포 수와 배양이 끝난 후 얻어지는 세포의 수를 통해 각 계대에 따른 증식률을 계산하여 확인하였고, 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000002
표 1에 나타낸 바와 같이, 저밀도로 배양된 중간엽 줄기세포(MSC)의 경우 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)에서 증가 배수(fold increase)가 88.4, 34.3, 16.4 인 반면, 중간 밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 8.5, 4.9, 3.1, 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 3.0, 1.9, 1.1 인 것을 확인하였다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)도 증가 배수와 같은 패턴으로 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 장기간의 중간엽 줄기세포 배양에서 세포 밀도를 낮춤으로써 중간엽 줄기세포의 증식능을 유지시킬 수 있음을 보여주는 결과이며, 동일한 계대 배양을 수행하더라도, 중간엽 줄기세포의 노화를 억제시키고 수명을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.
1.5 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포(MSC)의 분화능 변화 확인
세포 배양 밀도가 줄기세포능에 영향을 주는지 확인하기 위하여, P5 내지 P15 배양에 따른 분화능을 비교하였다. 줄기세포능으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인하였으며, 각각의 계대 및 밀도에서 정상, 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로 지방세포 분화 배양액은 High Glusose DMEM 배양액에 NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10 -7mol 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma), 0.5mM IBMX(Sigma), 10μg/ml 인슐린(insulin)(Sigma), 100μM 인도메타신(indomethacin) (Sigma)을 첨가한 배지를 만들어 실험하였으며, 7일 분화 후에 Oil red O 조직화학 염색을 통하여 확인하였다. 또한 Oil red O 조직화학 염색 후, 이소프로필 알코올로 용출시켰으며, 500nm에서 측정 후 정량 분석하여 확인하였다.
골세포 분화 배양액은 α-MEM 배양액에 FBS(Gibco), 50 μg/ml ascorbic 2 phosphate (sigma), 10 -8mol 덱사메타손(Sigma), 10mM 베타글리세로포스페이트 (β(sigma)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 21일 분화 후에 Alizarin red S 조직화학염색을 통하여 확인하였다. 또한 Alizarin red S 조직화학 염색 후, 10% 아세트산으로 용출시켰으며, 405nm에서 측정하고 정량 분석하여 확인하였다. 상기와 같은 방법으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화능은 계대가 진행됨에 따라 전체적으로 감소하였으나, 밀도에 의한 차이가 뚜렷하게 나타나지 않은 반면, 골세포 분화능의 경우 고밀도 조건의 계대 15(P15) 배양군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 중간엽 줄기세포의 골세포 분화능은 낮은 세포 밀도로 배양하는 경우 더욱 잘 유지될 수 있음을 확인하였다.
1.6 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 항원 프로파일 분석
세포 배양 밀도가 줄기세포의 항원 발현에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 각 계대 및 배양 밀도에 따른 양성 및 음성 항원 발현의 변화를 유세포 분석기로 확인하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000003
표 2에 나타낸 바와 같이, 음성 마커 발현의 변화는 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 일부 양성 마커의 경우 같은 계대에서도 세포 배양 밀도에 따라 발현양의 변화가 나타남을 확인하였다.
특히 계대 15(P15)에서는 높은 밀도로 세포를 배양하는 경우 대부분의 양성 마커들의 발현 양이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, CD73, CD105는 음성 발현을 보여 세포 밀도를 낮게 유지하여 세포 배양을 수행하는 것이 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였다.
1.7 배양 세포 밀도에 따른 활성산소종 ( ROS ) 생산 및 DNA 손상 비교
중간엽 줄기세포의 기능의 감소와 DNA 손상은 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 활성산소종인 ROS에 의해 유도되는 DNA 손상은 중간엽 줄기세포(MSC)의 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 배양 밀도에 따라 총 활성산소종(ROS) 생산 및 이에 따른 DNA 손상이 상이하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 계대 및 세포 배양 밀도에 따른 총 세포성 활성산소종(ROS)양을 형광 강도 분석을 통해 비교하고, comet 분석을 통해 DNA 손상 정도를 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 총 ROS 생산은 모든 계대에서 세포 배양 밀도가 증가할수록 증가되는 경향을 확인하였고, 특히 계대 10(P10)과 계대 15(P15)에서는 유의적으로 ROS 생산이 증가됨을 확인하였다 (A). comet 분석에서는 DNA 손상이 가장 약한 CC1부터 손상이 가장 심한 CC5로 분류하여 데이터를 분석하였으며, 손상이 가장 심한 CC5의 경우 세포 배양 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면, CC1은 세포 밀도가 높아질수록 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다 (B).
추가적으로 DNA 손상이 ROS에 의해 유발된 것인지 확인하기 위하여, ROS에 의한 DNA 손상을 확인하는 8-OHdG의 농도를 확인하는 실험을 수행하였다. 8-OHdG 분석방법은 다음과 같다. 각각의 세포로부터 얻은 DNA 시료 50μl를 8-OHdG 가 결합된 플레이트(8-OHdG conjugate coated plate)에 넣어준 후, 상온에서 10분간 배양하였다. 그 후, 항-8-OHdG 항체(anti-8-OHdG antibody)를 추가로 넣어 상온에서 한 시간 배양하였으며, 3회 세척 후, secondary antibody enzyme conjugate를 각 웰(well)에 넣어 준 후, 다시 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이 후 다시 3회 세척 후, 기질 용액(substrate solution)을 넣어 상온에서 30분간 배양하였다. 마지막으로 정지 용액(Stop solution)을 넣어 준 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DNA 손상이 가장 심한 것으로 나타난 계대 15(P15) 군에서는 세포 배양 밀도가 높아질수록 8-OHdG의 농도가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해 DNA 손상이 증가하는 것이며, 이에 의해 중간엽 줄기세포의 노화가 촉진된다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 세포 배양 밀도를 낮게 조절하는 것이 중간엽 줄기세포의 ROS 생산 증가에 의한 DNA 손상으로부터 중간엽 줄기세포를 보호하는 역할을 할 수 있음을 보여주는 결과이다.
1.8 항산화제 처리에 따른 중간엽 줄기세포( MSC ) 증식 및 활성산소종 ( ROS ) 생산능 확인
중간엽 줄기세포의 증식이 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해서 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여, ROS 소거 실험을 수행하였다. 계대 11(P11) 내지 계대 15(P15)에서 고밀도 배양 조건 및 고밀도 배양 조건에 항산화제인 아스코르브산 25μg/ml을 배지에 첨가하여 배양한 후 두 그룹 간의 증식률의 증가 배수(Fold)를 비교하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 고밀도 배양 조건에서 증가 배수가 P11 내지 P15에서 각각 2.6, 1.9, 1.6으로, 계대수가 증가할수록 증식능이 감소하면서 노화가 나타나기 시작했으나, 항산화제를 처리한 경우 모든 계대에서 약 50% 정도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 항산화제 처리군에서 성장 증가 배수 (growth fold increase)는 P11 내지 P15에서 각각 3.8. 2.9, 2.5로 P15까지도 증식능이 높게 유지되었다.
마지막 시점(Endpoint)인 P15에서 고밀도 배양 조건 단독 및 고밀도 배양 조건+항산화제 처리 두 그룹 간의 ROS 수준을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항산화제인 아스코르브산을 처리하여 증식이 증가한 조건에서는 ROS 수준 역시 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서 MSC 배양은 고밀도가 아닌 낮은 세포 밀도에서 수행하는 것이 바람직하며, 고밀도 세포 배양에서 유도되는 ROS 생산을 항산화제로 소거하는 경우 중간엽 줄기세포의 증식능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉 고밀도 조건은 ROS으로 인해 중간엽 줄기세포의 증식능이 억제되며, 세포 밀도가 낮아질수록 ROS가 감소하여 중간엽 줄기세포 증식능이 촉진될 수 있다.
이러한 결과를 종합하면, 층분리 배양을 통해 얻어진 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식, 배양 및 줄기세포능을 유지하기 위해서는 배양 조건 중 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 이하의 밀도로 조절하는 것이 중요하며, 항산화제를 첨가하여 배양하는 경우 세포 배양에서 유발될 수 있는 산화 스트레스를 억제하여 중간엽 줄기세포 증식을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다. 또한 계대 15 이상인 줄기세포는 계대 5 또는 계대 10 의 줄기세포와 비교하였을 때 세포의 형태학적 변화가 두드러지고 줄기세포의 노화 촉진, 분화능 감소와 같은 결과가 확인되므로, 1000 세포/cm 2 이하의 밀도로 낮은 계대 수로 배양하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
< 실시예 2> 개량된 층분리 배양법의 검증
상기 실시예 1 을 통해, 층분리 배양법으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절, 계대 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정으로 수득한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하고, 항산화제인 아스코르브산이 첨가된 배지로 배지를 달리하면서 단일 콜로니 MSC 의 증식능 및 이에 따른 세포 수득 효과를 비교하였다.
이전 국내특허출원 10-2006-0075676 호에서는 단일성 세포군인 콜로니들을 웰당 100 내지 600의 세포수로 이동하였으며, 그 이후의 계대 배양에서는 cm 2 당 4000 개의 세포로 배양을 진행하였다.
또한 층분리 배양법을 통해 수득된 중간엽 골수세포를 이용한 이식편대숙주질환 치료제를 개시하고 있는 KR 10-2007-0053298 호에서는 층분리 배양법에 의해 수득된 단일성 세포군을 계대 1에 해당하는 6-웰 배양 용기에 100 내지 600 세포수로 이동한다는 사실만을 개시하고 있을 뿐, 계대 2 이후의 콜로니가 아닌 개별 세포들의 반복적인 배양 밀도 조절에 대한 구성 및 이에 따른 효과는 전혀 개시하고 있지 않다. 상기 출원에 기재된 종래 층분리 배양법에 따르면 충분한 양의 이식편대숙주질환 예방, 치료, 개선 효과가 있는 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위하여 최소 10 계대 이상의 배양을 수행해야 한다. 반면, 본 발명의 개선된 층분리 배양 방법에서는 계대 2 이후 낮은 세포 밀도 조건, 계대 2 내지 계대 13 과 같은 낮은 계대 배양을 통해 효과적으로 목적하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있다.
구체적으로 본 개선 방법에서는 층분리 배양 방법을 통해 수득된 계대 1(P1)의 콜로니를 배양한 후, 계대 2(P2) 이후 계대 배양에서는 낮은 밀도인 1000 세포/cm 2 이하로 세포를 분주하고 이를 4000 세포/cm 2 세포 배양의 효과와 비교하였다. 또한 세포 배양 배지를 항산화제가 포함된 α-MEM 배지와 항산화제가 미 포함된 LG-DMEM 배지로 달리하고 이에 따른 세포 증식 효과를 비교하였다.
개량된 층분리 배양법의 효과를 확인하기 위한 실험군을 하기 표 3에, 공정 개량 부분을 도 12a 및 도 12b에 모식화하여 나타내었다.
도 12a 에 나타낸 바와 같이, 계대 1을 수득하는 공정까지는 종래 층분리 배양법과 개선된 층분리 배양법이 공정을 동일하게 진행하나, 개선된 층분리 배양법은 확장된 계대 1 세포를 seed cell 로 이용하여 배양하는 단계 이후의 계대 배양 공정이 종래 층분리 배양법과 상이하다. 기존 층분리 배양법은 밀도 조건에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위한 목적으로 4000 세포/cm 2 이상의 고밀도 계대 배양을 수행하나, 개선된 층분리 배양법은 계대 배양의 밀도를 낮은 밀도인 1000 세포/cm 2 이하로 조절함으로써, 계대 2 이후 계대 9 이하의 배양만으로도 최종산물을 충분한 양으로 수득할 수 있고, 보다 많은 단일 클로날 줄기세포 수득을 위해서는 최대 13 계대까지 확장 배양할 수 있다. 계대 2 이후의 배양 공정을 도 12b에 상세하게 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000004
세포주들은 층분리 배양 방법에 의해 분리된 세포주이며 SCM01 내지 SCM08로 각각 명명하였다.
2.1 세포주 밀도 및 배지에 따른 증식 효과 확인
상기 SCM01 내지 08 세포주를 이용하여 배양을 수행하고, 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 세포 수, 세포군 배가 시간(PDT; Population Doubling Time), 세포수 증식 수준(PDL; Population Doubling Level) 로 각각 비교하였으며, 이를 도 13 내지 도 20에 나타내었다.
도 13 내지 도 20에서 확인한 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 밀도로 접종하여 배양된 모든 실험군에서 cm 2 당 4000개의 세포 밀도로 접종하여 배양한 실험군보다 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한, 동일한 1000개의 세포 밀도군이라도, 항산화제인 아스코르브산이 포함된 α-MEM 배지에서 배양된 1000alpha 실험군에서 더욱 현저한 세포 증식 효과를 확인하였다.
2.2 세포주 밀도에 따른 증식 효과 비교
배양 세포 수에 따른 증식률의 보다 정확한 비교를 위하여, 배양 배지를 각각 LG DMEM 또는 α-MEM 배지로 고정하고, cm 2 당 1000 또는 4000개의 세포 접종 밀도에 따른 세포 증식 효과를 비교하였으며, 그 결과를 도 21 내지 도 24에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, LG DMEM에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주의 계대2(P2) 내지 계대 5(P5)에서의 증식률이 cm 2 당 4000 개의 세포수 접종군보다 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때 현저하게 높은 것을 확인하였으며, 계대 5(P5) 에서 확인된 cm 2 당 4000 개의 세포 접종 대비 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 3.08 내지 최대 48.50 배인 것을 확인하였다. 또한 도 22에 나타낸 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포주 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL값은 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
또한 도 23에 나타낸 바와 같이, α-MEM에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주 모두 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때, DMEM 실험군과 같은 경향을 보였으며, 계대 5(P5)에서 확인된 cm 2 당 4000 개의 세포주 접종 대비 cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 6.32 내지 최대 85.63배인 것을 확인하였다. 또한 도 24에 나타낸 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL 값은 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
이러한 결과는 cm 2 당 4000개의 고밀도 세포 접종 배양에 비하여 cm 2 당 1000개 이하의 세포 접종을 통해 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식을 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.3 배양 배지에 따른 증식 효과 비교
앞서 실시예 2.2 를 통해 1000 세포/cm 2 배양이 4000 세포/cm 2 배양 대비 우수한 증식 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였으므로, 세포수를 1000개로 고정하고, 배지를 변수로 변화시키면서 세포 증식 효과를 비교함으로써, 배양 배지 조건에 의한 증식 효과를 추가적으로 검증하였고 그 결과를 도 25 및 도 26에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 배양 배지를 α-MEM 및 DMEM으로 달리하며 세포 증식률을 비교한 결과 LG-DMEM 대비 α-MEM 배지를 이용한 실험군에서 최소 1.77 배 내지 6.39 배의 높은 세포 증식률을 확인하였다. 또한 도 26에 나타낸 바와 같이, PDT가 모든 α-MEM 실험군에서 낮게 나타났으며, PDL 은 증가된 것을 확인하였다.
이와 같은 실험 결과는 세포 접종 밀도를 cm 2 당 1000개 이하의 세포로 조절하여 낮은 계대로 배양하는 것에 더하여 항산화제가 첨가된 배지를 이용하여 배양하는 경우 세포 증식 효율을 극대화할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 3> 개량 공정의 수립
상기 실시예들을 통해, 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676호 및 10-2007-0053298호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정에 더하여, 세포 배양 밀도 및 배지 조건을 달리하여 단일 콜로니의 중간엽 줄기세포를 낮은 계대에서 효과적으로 수득할 수 있는 개선된 공정을 확립하였으며, 이를 종합적으로 하기 표 4 (DMEM 배지를 이용한 배양 조건) 및 표 5 (α-MEM 배지를 이용한 배양 조건)에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000005
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000006
보다 구체적으로 본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 층분리 배양 공정 및 증식 배양을 다음과 같이 수행하였다.
골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 14 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 1 ml를 넣어 37℃, CO 2 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다.
동일한 과정을 한 번 더 반복한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다. 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다.　앞의 여러 층분리 단계들을 거쳐서 이 단계에까지 올 수 있는 세포들은 세포의 비중이 타 세포들보다 월등히 작은 세포들임을 짐작할 수 있다.　
약 10 내지 14일의 시간이 지나면 세포들이 단일 콜로니 (single colony)를 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 트립신을 처리하여 분리한 다음 6-웰 배양용기로 옮겼다. 37℃, 5% CO 2 세포배양기에서 4 내지 5일 배양한 후 약 80% 자랐을 때, 세포들을 0.05% trypsin/1mM EDTA(GIBCO-BRL)를 처리하여 수득한 후, T175 배양용기로 옮겨 낮은 세포 밀도로 계대 배양하였다.　
이와 같이 초기 계대에서의 세포 밀도를 1000세포/cm 2 수준으로 낮춰 배양하는 경우, 다른 공정은 모두 동일하게 조절하였음에도 중간엽 기세포의 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 동일한 계대에서도 증식이 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 특히 세포 밀도를 낮춰 배양하는 경우, 기존 공정에서 필요로 했던, 중간엽 줄기세포에서 WCB(Working Cell Bank) 를 제조하는 과정을 생략할 수 있어, 세포 제조 기간을 효과적으로 단축할 수 있다. 특히 계대를 적게 하면 노화가 비교적 덜 진행된 세포를 많은 양으로 수득할 수 있으며, 이와 같은 세포를 치료제로 이용하는 경우 치료 효능이 우수할 것으로 기대할 수 있다.
또한, 배양 배지로써 항산화제가 첨가된 α-MEM을 이용하는 경우, 높은 밀도의 세포 배양에서 유도되는 ROS 스트레스가 항산화제 처리에 의해 효과적으로 개선되고 중간엽 줄기세포의 세포 증식능이 회복될 수 있어, 기존의 공정 대비 세포의 계대를 현저히 단축하고, 중간엽 줄기세포의 특성을 유지하는 노화가 진행되지 않은 신선한 상태의 단일 콜로니 중간엽 줄기세포를 빠르고 안정적으로 수득할 수 있다는 특징이 있다.
상기와 같은 내용을 종합하면, 저밀도 세포 배양은, 단시간에 많은 세포를 얻을 수 있어 제조공정은 간소화시킬 뿐 아니라 장기간 배양(long-term culture)에서도, 중간엽 줄기세포의 특성을 온전히 유지하는 노화되지 않은 상태의 세포를 수득할 수 있으므로, 양질의 줄기세포 생산을 가능하게 함을 확인하였다.
이에 따라, 이하 이식편대숙주질환 치료를 위한 실험에서 상기 실시예를 통해 구축한 개량 방법을 통해 얻어지는 줄기세포를 이용하였다.
< 실시예 4> 개량 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 이식편대숙주질환 치료 효과 확인
4.1 이식편대숙주질환 동물 모델의 제조
이식편대숙주질환 동물 모델 제조방법을 도 27 에 나타내었다. 먼저 BALB/c 마우스에 8.5 Gy 양의 방사능을 조사하였고, 24시간 후에 암컷 C57BL/6N로부터 골수세포(5x10 6/0.1 ml)와 비장세포(5x10 6/0.1 ml)를 추출하여, 방사능이 조사된 BALB/c 마우스의 정맥을 통해 주입하였다. 이식편대숙주질환 마우스 모델이 구축되었는지 확인하기 위하여, 제조된 마우스에서 피부, 모질 (fur texture), 복수 (ascites), 설사(diarrhea), 굽은 등(hunched back)을 관찰하고 이식편대숙주질환의 임상적 증상을 나타내는지 여부를 확인하였다. 제조된 마우스를 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 마우스는 대조군에 비해 털이 거칠고 갈라지면서 빠지는 현상을 나타내었고, 털이 누런빛을 띄는 것을 확인하였다. 또한 복수가 차고 혈변 증상을 나타내었으며, 굽은 등을 나타내었다. 그 외 운동량 및 식사량 역시 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다.
추가적으로 이식편대숙주질환 동물 모델 구축을 검증하기 위하여 유세포 분석, 면역조직화학 분석을 수행하였다.
먼저 유세포 분석기를 이용하여 마우스의 표현형, 면역세포, 염증세포 관찰을 수행하였으며, 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법으로 제조된 이식편대숙주질환 마우스는 Naive 마우스와 비교하여 C57BL/6 수여자 혈중의 MHC II 표현형을 나타내었다.
조직 염색을 통한 면역 조직화학 분석을 이식편대숙주질환 유도 7일째 및 14일째 수행하였고, 그 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법으로 제조된 이식편대숙주질환 마우스는 Naive 마우스와 비교하여 진피층이 두껍게 발달되어 있는 것을 확인하였다. 또한 이상각화 세포, 혈관 주변부에 단핵구 침윤이 관찰되었다. 특히 이식편대숙주질환을 유도한 후 14일 째에는 Naive 마우스와 비교하여 표피층과 진피층이 모두 두껍게 발달되었으며, 진피층 아래의 지방층은 무너지고, 모낭 또는 피지선에 대한 손상이 있는 것을 확인하였다.
이식편대숙주질환이 유도된 마우스가 Naive 마우스와 비교하여 체중의 변화가 있는지 확인하기 위하여, 질환 유도 후 4주 동안 체중의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 이식편대숙주 질환이 유도된 마우스는 Naive 마우스와 비교하여 체중이 감소하였으며 이식 후 10일째에 가장 큰 체중 변화를 나타내는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 이식편대숙주 질환 마우스 구축이 효과적으로 달성되었음을 나타낸다.
본 발명의 이식편대숙주질환 동물 모델의 제조 및 이 후 치료 방법을 간략하게 모식화하여 도 32에 나타내었다.
4.2 GCM (gradient centrifugation method) 대비 이식편대숙주질환 치료 효과 확인
4.2.1 개량 층분리 배양법에 의한 줄기세포 제조 및 투여
실시예 3의 개량 층분리 배양법에 따라, 세포 배양 밀도를 1000 세포/cm 2 이하로 하고, 항산화제를 포함하는 a-MEM 배지를 이용하여 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득하였다. 항생제로는 젠타마이신이 추가되었으며, α-MEM 배양액으로 수행하였다(표 5 참조). 이하 1000 세포/cm 2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개량 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포를 "cMSC1"으로 명명하였다. 비교군으로 이식편대숙주질환이 유발된 마우스에 GCM(gradient centrifugation method) 방법으로 분리된 줄기세포를 투여한 군을 설정하였으며, "GCM-MSC" 로 명명하고 cMSC1과 동일하게 투여하였다.
본 발명의 cMSC1 주입에 따른 이식편대숙주질환 치료 효과를 확인하기 위하여, 이식편대숙주질환이 유발된 실시예 4.1 의 BALB/c 마우스에 1×10 6 cMSC1를 1, 3 및 5일째에 투여하여 치료효능을 관찰하였으며, 이의 구체적인 치료 프로토콜을 도 33에 나타내었다. 이식편대숙주질환 치료를 위하여 사용한 실험군 G1 내지 G5 및 각 실험군에 속하는 개체 수는 다음 표 6과 같고, 1, 3, 5일째에 투여한 용량(1일째 투여=1 st, 3일째 투여=2 nd, 5일째 투여=3 rd) 은 표 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000007
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000008
4.2.2 cMSC1 투여에 의한 치료 효과 확인
이식편대숙주질환 마우스의 생존율 측정
이식편대숙주질환 유발 후 대조군, 실험군을 포함한 G1 내지 G5 의 생존율을 약 20일 동안 확인하였고, 그 결과를 표 8 및 도 34에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000009
도 34 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 이식편대숙주질환 마우스에 세포안정화제만을 투여한 G3 실험군에서는 10일째에 마우스가 모두 폐사한 반면, GCM-MSC를 투여한 G4 실험군에서는 10일째에 50%가 생존하였고 15일째에 모두 폐사하였다. cMSC1를 투여한 G5 실험군에서는 10일째, 15일째에 각각 90% 및 70%가 생존하여 개량 층분리 배양인 a-MEM 배지에서 저농도로 배양된 클로날 줄기세포를 해당 질환에 적용했을 경우, 생존율을 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하였다.
이식편대숙주질환 마우스의 임상증상 개선 효과 확인
본 발명의 cMSC1 투여에 따른 이식편대숙주질환 임상 증상 개선효과를 확인하였다. 하기 표 9의 기준에 따라 실험 동물의 임상증상을 각 항목별로 0 내지 2 점으로 수치화 하여 총 10점으로 계산하여 나타냈으며, 그 결과를 도 35 내지 도 40 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000010
도 35에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 cMSC1를 투여한 마우스가 이식편대 숙주질환 유발 후 7, 10, 14일차에 평가한 임상점수가 가장 낮은 것을 확인하였다.
도 36 내지 도 40은 항목별 임상적 증상에 대한 점수를 나타낸 도이며, 각각 피부, 모질, 설사, 복수, 마우스의 자세(등 굽기)에 관한 결과를 나타낸다. 도 36 내지 도 40에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 임상적 증상에 있어, 본 발명의 cMSC1 를 투여한 마우스가 세포 안정화제만 투여한 실험군 대비 현저한 임상 증상 개선 효과를 나타내었다. 또한 GCM-MSC를 투여한 군과 비교했을 때 현저히 우수한 효과를 나타내었다.
상기와 같은 결과를 통해 개량 층분리 배양법인 a-MEM 배지에서 저농도로 배양하는 방법에 따라 수득한 클로날 줄기세포가 이식편대숙주질환 마우스의 생존율을 높이고, 다양한 임상적 증상을 개선하는 효과를 가지고 있어, 이식편대숙주질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 5> 개량 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 치료 효과 비교
5.1. 개량 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포와 기존 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 세포 특성 비교
cMSC1는 저밀도 및 항산화 배지 조건을 갖는 개량된 층분리 배양법을 통해 수득한 중간엽 줄기세포로 앞서 확인한 바와 같이, 종래 층분리 배양법에 따라 수득한 중간엽 줄기세포 대비 줄기세포 특성 및 증식능이 효과적으로 유지되는 등의 우수성을 갖는다. cMSC1가 종래의 층분리 방법으로 분리된 줄기세포와 비교하여 이식편대숙주질환의 치료제로서 더 우수성을 갖는지 여부를 확인하기 위한 비교실험을 수행하였다. 비교군으로는 항산화제가 추가되지 않고, 면적당 배양 세포수가 4000cells/cm 2 이상인 종래 층분리 배양방법으로 분리된 줄기세포(이하 “cMSC2” 로 기재)와 동일한 층분리 방법을 기본으로 하되, 항산화제가 추가된 α-MEM에서 저밀도로 배양하여 수득된 단일 클로날 중간엽 줄기세포(cMSC1)를 이용하였고, 이를 정리하여 표 10에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000011
cMSC2 와 본 발명의 cMSC1의 세포 수, 세포 사이즈를 현미경을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 41에 나타내었다. 도 41에 나타낸 바와 같이, 생산 공정을 달리하며 수득한 cMSC2 와 본 발명의 cMSC1은 세포의 사이즈와 수가 달라짐을 확인하였다.
두 세포간 사이즈 차이를 검증하기 위하여, Nucleo Counter NC-250 기기를 이용하여 세포 크기를 확인하였다. 보다 구체적으로 중간엽 줄기세포는 플라스틱에 붙어서 자라는 특징이 있기 때문에 Trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 플라스틱에서 떼어내는 작업을 수행하는데 이 때의 세포 사진을 찍어 원형이었을 때의 세포 상태에서 차이가 있는지 확인하고, Nucleo Counter NC-250 기기를 이용하여 세포 크기를 확인하였으며, 그 결과를 도 42 및 표 11에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000012
도 42에 나타낸 바와 같이, 원형 상태에서도 두 세포 간의 크기 차이를 확인할 수 있었고, 기기를 통해 세포 지름을 확인하였을 때 cMSC2는 10.2 ~ 32.6μm로 세포 크기가 다양하게 분포함을 알 수 있었다. 이에 반해 cMSC1은 10.2 ~ 18.3μm로 cMSC2 보다 세포 크기가 작고 균질함을 확인하였다.
추가적으로 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 전방산란/측방산란광(FSC/SSC) 값을 동일하게 지정하였을 때, 유세포 분석에서도 세포의 크기가 차이가 나는지 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 43에 나타내었다.
도 43에 나타낸 바와 같이, cMSC2는 세포 크기가 커서 세포가 전반적으로 넓게 분포되어 있는 반면, cMSC1은 세포 크기가 작아서 측방산란광(SSC) 200K내에 분포됨을 확인하였다.
상기와 같이, cMSC1가 세포 크기가 더 작고, 균질하게 형성됨에 따라 중간엽 줄기세포가 배양되면서 분비되는 사이토카인 양이 변화되어 cMSC1의 이식편대숙주질환 치료 효과가 더 강화될 것으로 예상하였는 바, 이식편대숙주질환에 대한 치료 효능의 증대를 확인하기 위한 in vitro 실험을 수행하였다. 활성화된 T 세포의 억제율을 혼합 림프구 반응(Mixed lymphocyte reaction; MLR) 조건에서 확인하였고, 아무 자극을 주지 않은 세포 상태에서 면역 관련 마커 (IDO, ICOSL, TSG6, CXCL9, CXCL10, HO-1)의 발현량을 qPCR법으로 두 세포를 비교하였으며, 그 결과를 도 44에 나타내었다.
도 44에 나타낸 바와 같이, 활성화된 T 세포의 억제율을 혼합 림프구 반응 조건에서 확인한 결과 두 세포 모두 T cell : MSC = 1 : 4 조건에서 95%의 높은 억제율을 보였으나, 아무런 자극을 주지 않은 상태의 면역 관련 마커 (IDO, ICOSL, TSG6, CXCL9, CXCL10, HO-1)의 발현량과 비교한 결과, cMSC1의 면역 관련 마커의 발현량이 높은 것을 확인하였고, 이는 cMSC1가 이식편대숙주질환의 치료제로 사용시 기존의 방법을 통해 얻어진 세포보다 더 좋은 치료 효능을 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.
5.2. 개량 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포와 기존 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 GVHD 치료 효과 비교
실시예 5.1을 통해 개량 층분리 배양 방법을 통해 수득된 줄기세포가 기존 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포와 비교하여 GVHD 치료제로 더 적합한 세포 특성을 나타냄을 확인하였으므로, 급성 GVHD 동물 모델을 제조하고, cMSC1 및 cMSC2 의 치료 효과를 동물 모델에서 확인하였다.
급성 GVHD 모델 확립을 위해 수용체인 BALB/c의 면역세포를 모두 제거하기 위해 치사량에 가까운 7.0Gy의 방사선을 조사하고, 약 24시간 후에 수여자인 C57BL/6N으로부터 분리한 골수세포와 비장세포 각각 5×10 6/100μl씩 PBS에 혼합하여 방사선이 조사된 BALB/c에 미정맥을 통해 200μl 주입하여 질환을 유발하였다. 이 후, 확립된 GVHD 동물 모델에 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포 cMSC1 및 cMSC2 를 투여하였다. 1000cell/cm 2 이하로 배양하는 개선된 층분리 배양법으로 수득된 줄기세포 실험군으로는 100 cell/cm 2 (cMSC1(100)) 및 1000cell/cm 2 (cMSC1(1000)) 로 계대 배양하여 수득되는 줄기세포를 이용하였고, 기존 층분리 배양법에 대응되는 고밀도 배양 cMSC2 는 4000cell/cm 2 로 계대 배양하여 수득되는 줄기세포를 이용하였다. cMSC1(100), cMSC1(1000), cMSC2 실험군 모두에서 세포 생존율은 각각 평균 99.53%, 99.66%, 99.8% 로 나타나 밀도 조절 배양이 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 세포 cGVHD 동물모델에 투여되는 투여물질 및 총 투여량을 하기 표 12에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000013
GVHD의 심각도 정도는 피부에 육안상으로 관찰되는 피부 각질과 상처, 털빠짐 및 거친 정도와, 등 굽기, 설사와 복수, 자세, 움직임 등 각 증상의 심각도를 각각 점수화하여 확인하였으며, 생존율에 따라 분석하였다.
각 실험군 투여에 따른 생존율을 확인한 결과를 도 45 및 표 13 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019017031-appb-img-000014
표 13 및 도 45에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군 (Naive, G1) 과 골수세포만 이식한 군(BM, G2) 에서는 28 일 관찰 기간 동안 모든 개체가 생존하였으나, GVHD 를 유도하고 PBS 만을 투여한 실험군 (GVHD+PBS, G3) 에서는 7일차부터 생존율이 80% 이하로 떨어지고, 11일 차에는 50%, 15일 차에는 1마리를 제외하고 모든 개체가 사망함을 확인하였다.
반면 배양 조건과 무관하게 PBS 단독 주입 그룹과 비교했을 때 cMSC 주입군 모두 생존율이 떨어지는 시점을 2배 이상 증대시켰음을 확인하였다 (PBS: 7일, cMSC주입군: 16~18일). 구체적으로 종래 층분리 배양법으로 수득된 줄기세포 (cMSC2, G6) 투여군은 18일차부터 생존율이 감소하기 시작하여 27일차에 생존율이 50%까지 감소하고 관찰기간 (28일차)까지는 전체의 40%가 생존하였다. 개선된 층분리 배양법을 통해 수득한 cMSC1 (100), cMSC1(1000) 은 두 투여군 모두 18일차부터 생존률이 감소하였으나 이후에는 생존율이 유지되어 28일차까지도 전체 70% 가 생존하는 것을 확인하였다. 이는 종래 층분리 배양법 대비 약 1.5 배 이상의 생존률 증가로 개선된 층분리 배양방법을 통해 수득된 줄기세포가 종래 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포 대비 탁월한 GVHD 치료 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.
실험군에 따른 GVHD 동물 모델의 임상 증상을 평가한 결과를 도 46에 나타내었다.
도 46 에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 이식 28일 후 피부의 각질 및 혈흔, 털의 상태, 복수, 설사여부, 등굽기 등을 종합적으로 평가한 임상증상을 관찰한 결과, GVHD+PBS (G3) 군 대비 배양 조건과 무관하게 cMSC 주입군에서는 임상 증상이 개선되는 것을 확인하였다. 특히 GVHD+cMSC1 (100) (G4) 및 GVHD+cMSC1 (1000) (G5) 에서는 종래 층분리 배양법으로 수득된 고밀도 배양 cMSC2 투여군 (G6) 와 비교하여 더욱 효과적인 임상 증상 개선이 확인되고 이러한 차이는 15일 차 이후부터 뚜렷하게 나타났다. 28일차 실험 동물의 상태에 따르면 GVHD+cMSC1 (100) (G4) 및 GVHD+cMSC1 (1000) (G5) 실험군이 PBS 및 cMSC2 투여군 대비 임상증상이 호전되었음을 육안으로도 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 개량된 층분리 배양법을 통해 수득한 cMSC1를 이용하면 이식편대숙주질환의 생존율을 높이고, 각종 임상증상을 효과적으로 개선시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 cMSC1은 기존의 단일 클로날 중간엽 줄기세포와 비교하여 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 증식이 효과적으로 유지될 뿐만 아니라, 기존 치료제 제조를 위해 생산되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포 대비 WCB 제조 과정을 생략할 수 있고 적은 계대수에서 수득이 가능하여 노화가 진행되지 않은 신선한 상태의 단일 클론이므로, 기존의 단일 클로날 중간엽 줄기세포대비 더욱 우수한 이식편대숙주질환 치료가 가능함을 알 수 있다.

Claims (12)

1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 2 내지 계대 13 배양하는 것인, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 이식편대숙주질환은 급성 이식편대숙주질환 또는 만성 이식편대숙주질환인, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOSL(Induced T cell co-stimulator ligand), TSG6 (Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein), CXCL9 (chemokine (C-X-C motif) ligand 9), CXCL10 (chemokine (C-X-C motif) ligand 10), 및 HO-1 (Heme oxygenase-1) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 마커의 발현량이 증가된 것인, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 2 내지 계대 13 배양인, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 하는, 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 이식편대숙주질환 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계;
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포 수득하는 단계; 및
6) 상기 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 이식편대숙주질환 예방 또는 치료 방법.
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