KR20180042476A - 면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법 - Google Patents

면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 중간엽 줄기세포에서 IFN-γ 전처리 자극후 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 이 방법에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포, 및 이 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한 면역질환 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 이식편대숙주병, 자가면역질환을 포함하는 다양한 면역질환의 임상적 치료를 위한, 면역반응 조절능력을 가지는 기능적으로 우수한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 유용한 방법을 제공할 수 있는 바, 면역질환 치료요법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법{Methods for Selecting Improved Stem Cell for Treating Immune Disease}
본 발명은, 중간엽 줄기세포에서 IFN-γ 전처리 자극후 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 이 방법에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포, 및 이 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한 면역질환 치료방법에 관한 것이다.
종래, 악성 및 비-악성 혈액질환, 자가면역 질환 및 면역결핍의 치료를 위해 동종이계 조혈모줄기세포를 이식하는 방법이 널리 이용되어왔다. 그러나, 조직 적합성항원 동일 자매세포(human leucocyte antigen(HLA)-identical sibling)를 이식한 후에도, 면역질환 중의 하나인 이식편대숙주병(graft versus-host disease; GVHD)의 발병 및 이에 의한 사망은 해결 과제로 남아있다.
이식편대숙주병은 숙주의 항원 제시세포에 의해 활성화된 공여자의 T-세포에 의해 유발되며, 상기 세포는 타겟 조직(피부, 장, 및 간)으로 이동하여 표적 기관의 기능이상을 유발한다. 이식편대숙주병의 1차적 표준 치료는 높은 농도의 스테로이드를 처방하는 것이다. 그러나 상기 환자의 50%는 상기 1차 치료법에 반응하지 않으며, 일단 스테로이드 저항성이 유발되면 사망률이 증가한다고 알려져 있음에도, 스테로이드 저항성 이식편대숙주병에 대한 2차적 치료법이 없어 추가적인 치료대안이 필요한 실정이다.
한편, 성장인자, 세포간 상호작용 및 기질 단백질을 제공하는 골수 기질세포(Marrow stromal cell)는 골수 미세환경에 존재하는 공통적 전구세포에서 유래하며, 중간엽줄기세포라고도 알려져 있다. 중간엽줄기세포는 분화할 수 있는 능력을 가지며, 골아세포, 지방세포, 및 연골 전구세포를 포함하여 제한된 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지는 전구세포를 생산할 수 있다. 중간엽줄기세포는 화학요법 또는 방사선요법에 의해 손상된 골수 미세환경에서 숙주세포를 대체할 수 있고 유전자 치료를 위한 수단으로 이용될 수 있다.
많은 연구들에 의하면, 중간엽줄기세포가 상처부위로 이동하여 손상된 조직을 복구하는데 기여할 뿐만 아니라 면역조절 기능을 가지고 있음이 보고되었다. 중간엽줄기세포는 T-세포, B-세포, 자연살해세포(NK cells), 및 항원제시세포를 포함하는 면역세포들의 활성화, 증식, 및 기능을 억제한다. 중간엽줄기세포에 의해 매개되는 면역억제는 인터루킨-10(IL-10), TGF-β, 일산화질소, 프로스타글란딘 E2(PGE2)와 같은 가용성 인자들에 의해 이루어질 수 있다.
활성화된 T-세포, NK세포, NKT세포, 및 대식세포와 같은 다양한 유형의 세포들로부터 생성되는 강력한 염증 유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 인터페론-감마(IFN-γ)는 선천면역 및 적응면역 반응에서 중요하고 복잡한 역할을 수행하며, 급성 이식편대숙주병에서 병원성 인자로 알려져 있다. IFN-γ는 세포 분열을 억제하고 세포 사멸을 촉진시킴으로써 동종반응성 T-세포를 음성적으로 조절하며, 수여자의 실질세포(parenchymal cells)와 직접적인 상호작용을 통해 조직 손상을 억제한다.
이와 같이, 이전의 in vitro 연구를 통해 활성화된 중간엽줄기세포에서 IFN-γ의 역할이 알려진 바는 있으나, 중간엽줄기세포 이식을 통한 in vivo 이식편대숙주병의 치료 기작에 대해서는 알려진 바가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 마이크로어레이 분석을 통해 중간엽줄기세포의 면역조절 기능과 관련된 바이오마커들의 발현 프로파일에 대해 IFN-γ가 미치는 영향을 분석하고, in vitro 및 in vivo 에서 immune conflicts 조절과 관련된 중간엽줄기세포의 작용기전을 확인하였을 뿐만 아니라, IFN-γ에 의해 자극된 지방조직(adipose tissue; AT), 제대혈(umbilical cord blood; CB), 워튼연육(Wharton's jelly; WJ) 및 골수에서 유래된 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병 모델에서 생존율을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은, IFN-γ 전처리 자극후 특정 면역억제 바이오마커(IDO / CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1, TRAIL)의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법, 및 이에 의해 선별된 고효능 중간엽 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 중간엽 줄기세포에서 IFN-γ 전처리 자극후 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 중간엽 줄기세포 배양 후 IFN-γ를 처리하는 단계;
(b) 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 발현수준이 IFN-γ 미처리 대조군과 비교하여 증가하는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 면역억제 바이오마커는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 면역억제 바이오마커는 CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), B7-H1(B7 homolog 1), PTGDS(Prostaglandin D2 synthase), VCAM1(Vascular Cellular Adhesion Molecule 1) 및 TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 고효능은 면역 억제능인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 자가면역질환은 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 IDO의 발현은 IFN-γ로 자극된 중간엽 줄기세포에서 JAK/STAT1 신호경로를 통하여 증가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (a)의 IFN-γ은 배지내에 1-100 IU/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (b)의 바이오마커의 발현수준은 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정하는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 고효능은 면역억제능인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이계 유래인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 이식편대숙주질환 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이식편대숙주질환 등의 면역질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 이용한, 이식편대숙주질환 등의 면역질환 치료용도를 제공한다.
본 발명에 의하면, IFN-γ 자극후, 특정의 바이오마커 조합(IDO / CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1, TRAIL)이 이식편대숙주병을 포함하는 면역 관련 질환에 있어서 가장 우수한 면역억제능을 가지는 중간엽 줄기세포를 선별하기 위한 바이오마커로써 이용될 수 있음을 제시한다.
따라서, 본 발명은 이식편대숙주병, 자가면역질환을 포함하는 다양한 면역질환의 임상적 치료를 위한, 면역반응 조절능력을 가지는 기능적으로 우수한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 유용한 방법을 제공할 수 있는 바, 면역질환 치료요법으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 IFN-γ를 통해 활성화된 중간엽줄기세포를 이용한 이식편대숙주병의 예방 및 치료는 동종이계 줄기세포 이식의 더 높은 치료적 가능성을 보여준다.
도 1은, 다양한 조직(골수 BM, 지방 AT, 제대혈 CB, 및 워튼연육 WJ)에서 유래한 중간엽줄기세포의 형태(A), 표면항원단백질(B), 분화유도후 성상(C)를 보여주는 결과이다.
도 2는, 다양한 조직(BM, AT, CB, WJ)에서 유래한 중간엽줄기세포의 면역억제 특성을 확인하기 위하여, PHA로 활성화시킨 말초혈액단구세포(hPBMC)의 증식율을 평가한 결과이다.
도 3은, 다양한 조직(BM, AT, CB, WJ)에서 유래한 중간엽줄기세포의 면역억제 특성이 세포간 접촉에 의한 것인지 가용성 인자에 의한 것인지 확인하기 위하여, 직접 접촉 배양법 및 트랜스웰 배양법으로 비교평가한 결과이다.
도 4는, in vivo에서 중간엽줄기세포의 면역억제 기능을 확인하기 위해, 마우스에 hPBMC 및 다양한 조직(BM, AT, CB, WJ) 유래 중간엽줄기세포를 함께 1회 또는 2회 주입한 후 마우스 생존율을 보여주는 결과이다.
도 5는, 이식편대숙주병(GVHD) 동물모델에 hPBMC와 함께 골수유래 중간엽줄기세포를 주입시 혈액내 IFN-γ(염증성 사이토카인)의 수준이 감소됨을 보여주는 결과이다.
도 6은, hPBMC를 다양한 조직(BM, AT, CB, WJ) 유래 중간엽줄기세포와 함께 배양후 생존율을 평가한 것으로, 이때 중간엽줄기세포는 IFN-γ 비자극군(MSCPBS)과 자극군(MSCIFN -γ) 간에 생존율을 비교한 결과이다.
도 7은, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병을 개선시키는지 확인하기 위해, No MSC, MSCPBS, MSCIFN-γ, MSCAG490 + IFN-γ 투여군 간에 마우스 생존율을 비교평가한 결과이다.
도 8은, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병 마우스 모델에서 T 세포 증식억제를 유도하는지 확인하기 위해, No MSC, MSCPBS, MSCIFN -γ, MSCAG490 + IFN -γ 투여군 간에 CD45+ 세포 및 CD45+CD3+ 세포의 수를 비교측정한 결과이다.
도 9는, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 이식편대숙주병 마우스 모델에 이식후 조직학적 분석을 통해, 조직으로의 면역세포 침투가 감소함을 확인한 결과이다.
도 10은, IFN-γ 자극 전후의 중간엽줄기세포의 형태(A) 및 유전자 발현 프로파일(B)을 비교한 결과이다.
도 11은, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포에서 CXCL9, CXCL10, CCL8 및 IDO 유전자의 mRNA 발현수준이 현저히 증가함을 확인한 결과이다.
도 12는, 다양한 조직(BM, AT, CB, WJ) 유래 중간엽줄기세포를 IFN-γ로 자극시 서로 유사하게 IDO 발현이 증가함을 확인한 결과이다.
도 13 및 14는, IFN-γ 매개의 IDO 발현이 JAK/STAT1 신호전달 경로를 통하여 유도됨을 확인한 결과이다.
도 15는, STAT1 표적 siRNA 처리시 IFN-γ의 하위 신호전달 경로가 억제되어 hPBMC 증식 억제효과가 차단됨을 보여주는 결과이다.
도 16은, 이식편대숙주병 마우스에 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 주입한 후, 중간엽줄기세포의 조직내 침투 및 IDO 발현 유도를 확인한 면역조직염색 결과이다.
도 17은, 중간엽줄기세포의 면역억제 특성과 관련된 IDO의 역할을 알아보기 위해, shRNA 처리로 IDO 발현 저해를 확인한 후(A, B), hPBMC 증식율 변화를 확인한 결과이다.
도 18은, IDO의 발현이 감소된 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 처리하거나 처리하지 않은 상태로 이식편대숙주병 마우스에 투여한 후 생존율을 비교평가한 결과이다.
도 19는, IDO의 발현이 감소된 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 처리하거나 처리하지 않은 상태로 이식편대숙주병 마우스에 투여한 후 소장 및 피부조직에서 IDO 다운조절된 중간엽줄기세포의 존재를 보여주는 면역조직염색 결과이다.
도 20은, IDO를 과발현하는 중간엽줄기세포의 면역억제능을 in vitro 에서 확인한 결과이다.
도 21은, IDO를 과발현하는 중간엽줄기세포의 면역억제능을 in vivo 에서 확인한 결과이다.
도 22는, IDO 과발현 중간엽줄기세포를 이식편대숙주병 마우스에 투여한 후 소장 및 피부조직에서 IDO 상향조절된 중간엽줄기세포의 존재를 보여주는 면역조직염색 결과이다.
도 23은, IFN-γ에 의해 자극된 중간엽줄기세포와 TLR3가 활성화된(poly I:C 자극) 중간엽줄기세포간의 면역억제 활성을 비교한 결과이다.
도 24는, IFN-γ 자극된 중간엽줄기세포에서, JAK/STAT1 경로를 통해 IDO 발현이 유도되는 반면, TLR3 활성화는 유도되지 않음을 보여주는 결과이다.
도 25는, 중간엽줄기세포에서 기능 유전자(CXCL9 , CXCL10 , IL-6, IL-8) 발현에 미치는 영향을, IFN-γ 자극시와 TLR3 활성화(poly I:C 자극)시 간에 비교평가한 RT-PCR 결과이다.
도 26은, 중간엽줄기세포에서 기능 유전자(IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1 및 TRAIL) 발현에 미치는 영향을, IFN-γ 자극, TNF-α 자극, 및 TLR3 활성화(poly I:C 자극)시 간에 비교평가한 RT-PCR 결과이다.
본 발명자들은 이전 연구를 통해 활성화된 T-세포가 정지성 T-세포보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 발현하며, 상기 IFN-γ 발현수준은 T-세포를 중간엽줄기세포와 공동배양하였을 때 현저히 감소한다는 것을 보고함으로써 IFN-γ의 자가분비-근거리분비 순환(autocrine-paracrine loop)을 제시한 바 있다. 따라서, 본 발명에서는 IFN-γ를 통한 중간엽줄기세포 자극이 세포의 면역억제 특성을 향상시키는 결과를 나타낼 것이라고 예상하고, IFN-γ로 자극된 중간엽줄기세포에서 다양한 유전자들의 발현수준이 면역 억제능과 관련 있는지 확인하기 위하여, 유전자 발현 프로파일을 분석하였다.
그 결과, IFN-γ로 자극된 중간엽줄기세포에서 다양한 면역반응을 일으키는 백혈구 모집에 중요한 역할을 하는 CXCL9, CXCL10 , CCL8 , 및 IDO를 포함하여 512개 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 이러한 케모카인들과 구별되게, IDO는 더욱 직접적으로 중간엽줄기세포의 면역억제능에 관여하는 경향을 보이며 이러한 활성과 면밀히 연관되어 있다. IDO는 IFN-γ로 자극된 중간엽줄기세포에서 발현이 매우 증가하였으며, IDO의 발현을 저해시키면 T-세포의 항원 매개 증식이 억제되었다.
또한, 본 발명에서는 IFN-γ가 인간 골수 이외에도, 제대혈, 지방조직, 및 워튼연육 등 다양한 조직 유래의 중간엽줄기세포에서도 IDO의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다. 특히, 이러한 IDO의 발현은 IFN-γ로 자극된 중간엽줄기세포에서 JAK/STAT1 신호전달 경로를 통해 증가하고, IDO를 발현하는 중간엽줄기세포는 면역억제능을 나타냄을 밝혔다. IDO의 면역억제 활성은 T-세포 증식에 필수적인 아미노산인 트립토판의 분해를 통해 매개되므로, IDO 및 트립토판의 결핍은 많은 면역 관련 질환에서 중요한 점으로 인식된다.
또한, 본 발명에서는 공초점 현미경 이미지를 통해 IFN-γ로 자극된 중간엽줄기세포를 주입한 이식편대숙주병 마우스모델에서 IDO가 발현되는 것을 관찰하였는 바, 중간엽줄기세포의 증진된 면역억제 활성은 IFN-γ 전처리와 매우 관련 있으며 이는 또한 IDO의 발현이 유도되었기 때문인 것을 예상된다.
또한, 본 발명에서는 이식편대숙주병 마우스모델에서 PBS(대조군) 처리 중간엽줄기세포를 주입한 군에 비해 IFN-γ 자극 중간엽줄기세포를 주입한 군이 더욱 향상된 생존율을 나타낸 것을 확인하였는 바, 이식편대숙주병의 세포치료요법으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명에서는 TLR 신호전달에 반응하여 IDO의 발현을 증가시키는데 관여하는 신호전달 경로를 확인한 결과, 인간 중간엽줄기세포에서 TLR3의 자극이 IFN-β 및/또는 IDO의 발현을 거의 유도하지 않았으며, 이는 TLR 신호전달이 인간 중간엽줄기세포의 면역억제 기능에 있어서 주요한 경로가 아니라는 것을 의미한다. 또한, IFN-γ 자극은 모든 중간엽줄기세포에서 IDO의 발현을 현저히 유도함이 관찰되었으므로, 직접적인 IFN-γ 자극이 면역 관련질환의 치료를 위한 중간엽줄기세포 기능을 개선하는데 중요한 수단임을 알 수 있다.
이에, 본 발명은, 중간엽 줄기세포에서 IFN-γ 전처리 자극후 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법을 제공한다.
본 발명의 선별방법은, (a) 중간엽 줄기세포 배양 후 IFN-γ를 처리하는 단계; (b) 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현수준이 IFN-γ 미처리 대조군과 비교하여 증가하는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 면역억제 바이오마커에 제한은 없으나, 예를 들면 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 IDO 마커에, CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), B7-H1(B7 homolog 1), PTGDS(Prostaglandin D2 synthase), VCAM1(Vascular Cellular Adhesion Molecule 1) 및 TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 '고효능'이란 중간엽 줄기세포의 면역 반응 억제능력이 우수하여 면역 관련 질환의 치료에 효과적인 효능을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 다양한 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에서 "면역질환"은 면역 조절 이상에 의해 발생하는 질환이면 제한이 없으나, 예를 들면 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환일 수 있다.
이때, 자가면역질환은 그 종류에 제한이 없으나, 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염일 수 있다.
이때, 알러지성 질환은 그 종류에 제한이 없으나, 과민성(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지 또는 약품 알러지일 수 있다.
본 발명에서 IFN-γ로 자극된 중간엽 줄기세포는 JAK/STAT1 신호경로를 통하여 IDO의 발현이 증가되는 데, 이때 JAK/STAT1 신호경로는 조혈계 또는 면역계에서 주요한 정보교환분자인 사이토카인의 주요한 정보교환경로이다. STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)는 JAK(Janus kinase/Just another kinase)에 의해 티로신 인산화된 후 이합체를 형성하여 핵으로 이동함으로서 유전자 발현을 조절하는 전사인자(TF)로 기능하므로, IDO는 STAT1의 타겟 유전자가 된다.
본 발명의 선별방법에 있어서, 중간엽 줄기세포 배양액에 처리되는 IFN-γ 농도에 제한은 없으나, 예를 들면 1-100 IU/ml 농도, 바람직하게는 1-10 IU/ml 농도, 더욱 바람직하게는 1 IU/ml 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 선별방법에 있어서, 바이오마커의 발현수준을 측정하는 방법에 제한은 없으나, 예를 들면 단백질 발현에 대하여는 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법을, mRNA 발현에 대하여는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포를 제공하며, 상기 중간엽 줄기세포의 유래에 제한은 없으나, 예를 들면 자가, 타가 또는 동종이계 유래일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물/ 약학 제제를 제공한다.
본 발명에서 "약학 조성물"은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 "투여량"은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여횟수, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 "투여방법"에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 실험 방법
1-1. 인간 조직유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
본 실험은 삼성의료원의 연구 심사위원회(Institutional Review Board; IRB)의 승인(IRB No. 2011-10-134)을 받았으며, 모든 샘플은 사전 동의를 얻어 수집하였다. 골수유래 중간엽줄기세포(BM-MSCs), 제대혈유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs), 지방조직유래 중간엽줄기세포(AT-MSCs), 및 워튼연육 유래 중간엽줄기세포(WJ-MSCs)는 종래 알려진 방법으로 분리하였다. 분리된 세포들은, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen-Gibco) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen-Gibco)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) 배지를 이용해 2 × 103 cells/cm2의 밀도로 분주하여, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
1-2. T-세포 증식: BrdU incorporation assay
중간엽줄기세포를 10% FBS가 첨가되어 있는 high-glucose DMEM(Dulbecco’ modified Eagle’ medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) 배지를 이용해 96-웰 플레이트에 1.25 × 104 cells/㎖의 밀도로 분주하였다. 24시간 후, 상기 세포의 증식을 억제시키기 위해 10 ㎍/㎖의 mitomycin-C(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 첨가하고 추가적으로 37℃에서 2시간 동안 더 배양한 후 배양배지로 5회 헹구어주었다. 다음으로, 밀도구배 원심분리를 통해 1 × 105개의 인간 말초혈액단구세포(human peripheral blood-derived mononuclear cells; hPBMCs)를 분리하고, 각 웰에 첨가한 후 T-세포 증식을 촉진시키기 위해 1 μg/mL의 PHA(phytohemagglutinin, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. PHA 처리에 의해 활성화된 인간 말초혈액단구세포를 BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)를 첨가하기 전 3~4일 동안 각기 다른 조건의 중간엽줄기세포와 함께 배양하였다. T-세포 증식률은 BrdU를 처리하고 18시간 후 Roche Applied Science(Penzberg, Germany)을 이용해 평가하였다.
1-3. 이식편대숙주병 ( GVHD ) 동물모델
8-9주령의 NOD/SCID 면역결핍 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에 300 cGy의 전신조사법을 실시하고 24시간 후 인간 말초혈액단구세포를 정맥 투여하였다. 보다 구체적으로, 각 마우스에 2 × 107개의 인간 말초혈액단구세포를 1 × 106개의 중간엽줄기세포와 함께 투여하였다. 이때 중간엽줄기세포는 IFN-γ로 자극시키거나 자극시키지 않은 것을 이용하였다. 이후 동일한 개수의 중간엽줄기세포를 투여 7일 째에 반복투여 하였다.
1-4. JAK 및 STAT1 활성 억제
IFN-γ 수용체의 세포내 도메인에 해당하는 JAK(Janus kinase)의 활성 억제는, 100 ng/mL 항-IFN-γ 항체(BD Biosciences) 또는 1 μM AG490 (Calbiochem, San Diego, CA)로 처리하여 실시하였으며, STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)의 발현 억제는, STAT1 유전자를 타겟팅하는 siRNA(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였으며, siRNA-Lipofectamine 2000 (Invitrogen-Gibco) 복합체를 37℃에서 12시간 세포에 처리하여 실시하였다.
1-5. 면역블롯팅
중간엽줄기세포를 차가운 PBS로 헹구고 300 ㎕의 차가운 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, containing 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% sodium deoxycholate, 및 a protease inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL))로 용해시켰다. 이어서 세포 용해물을 4℃, 3,000 × g로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 모아 bicinchoninic acid protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용해 단백질 정량분석을 수행하였다.
다음으로, 전기영동을 위해 단백질(50 μg)을 sample buffer(60 mM Tris-HCl, pH 6.8, containing 14.4 mM β-mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS, 및 0.1% bromophenol blue)에 녹이고, 5분 동안 끓인 후 4-12% SDS reducing gel에 로딩하여 단백질이 크기별로 분리되도록 하였다. 상기 분리된 단백질에 대하여 trans-blot system(Invitrogen-Gibco)을 이용하여 트랜스퍼 과정을 수행함으로써 단백질이 PVDF(polyvinylidene difluoride) 맴브레인(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 옮겨지도록 하였다. 이후 맴브레인 블롯에 5% non-fat dry milk (BD Biosciences)가 포함된 TBS(Tris-buffered saline)(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, supplemented with 150 mM NaCl)를 처리하고 1시간 동안 실온에서 반응시켜 블로킹 과정을 수행하고, TBS로 3회 헹군 다음 3% non-fat dry milk가 포함된 TBST(TBS supplemented with 0.01% Tween 20)에 1차 항체를 희석하여 처리하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 맴브레인 블롯을 TBST로 3회 헹구고 3% non-fat dry milk가 포함된 TBST에 희석한 2차 항체를 처리한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 다시 TBST로 맴브레인 블롯을 헹군 다음 enhanced chemiluminescence detection system (GE Healthcare)을 이용하여 관찰하고자 하는 단백질의 발현량을 분석하였다.
이때, phospho-JAK 2 (#3771), STAT1 (#9172), phospho-STAT1 (#9171), β-actin (#4967)에 특이적인 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구입하였고, IDO (sc-25808), IRF-1 (sc-13041)에 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다.
1-6. 유전적 변이가 유도된 중간엽줄기세포의 제작
IDO 발현을 저해하기 위해 human IDO shRNA(short hairpin RNA) 렌티바이러스 파티클 및 IDO 발현 유도 렌티바이러스 파티클을 각각 Santa Cruz Biotechnology(sc-45939-V)(Santa Cruz, CA) 및 GenTarget Inc.(LVP302)(San Diego, CA)에서 구입하였다. 먼저, 골수유래 줄기세포에 IDO 발현 저해용 렌티바이러스 파티클을 트랜스펙션하기 위해, 상기 세포에 10% FBS가 첨가되어 있는 LG-DMEM을 이용해 제조한 5 μg/mL의 폴리브렌(polybrene, Santa Cruz Biotechnology)을 전처리한 후 MOI(multiplicity of infection) 10으로 렌티바이러스 벡터를 처리하였다.
이후 세포를 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 동안 배양하고 PBS(phosphate-buffered saline; Biowest, Nuaille, France)로 2회 헹군 후 다시 배지를 첨가하였다. 렌티바이러스 벡터가 도입된 중간엽줄기세포는 도입 후 1일째에 5 μg/mL의 퓨로마이신(puromycin , Sigma-Aldrich)이 포함되어 있는 중간엽줄기세포 배지에서 7일 동안 배양하여 선별하고 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 한편, 골수유래 중간엽줄기세포에 IDO 발현 유도 렌티바이러스 파티클을 트랜스펙션하기 위해, 세포에 10% FBS가 첨가된 LG-DMEM를 이용해 상기 렌티바이러스 파티클을 MOI 10으로 처리하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 72시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 헹구고 다시 배양배지를 첨가하였다.
다음으로 상기와 동일한 방법으로 렌티바이러스 벡터가 도입된 중간엽줄기세포에 대하여 도입 후 1일째에 5 μg/mL의 퓨로마이신(puromycin , Sigma-Aldrich)이 포함되어 있는 중간엽줄기세포 배지에서 7일 동안 배양하여 중간엽줄기세포를 선별하였으며, RFP(red fluorescent protein)를 통한 형광 관찰 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다.
1-7. 면역세포화학염색법 및 면역조직화학염색법
중간엽줄기세포에 고정용액인 4% 포름알데히드를 처리하고 빛을 차단시킨 상태의 실온에서 30분간 반응시킨후 PBS로 3회 씻어내었다. 세포 내부에 발현되는 단백질을 검출하기 위하여, 세포에 0.25% Triton X-100을 처리하고 빛을 차단시킨 상태의 실온에서 5분 동안 반응시켜 세포 투과성을 높였다. 이후 다시 세포를 3회 씻어내고, 5% FBS 블로킹 용액을 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 다시 세포를 씻어내고 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입한 IDO 특이적 항체를 처리(1:100)한 후 역시 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 세포를 다시 3회 씻어내고, Alexa Fluor®488이 부착되어 있는 goat anti-mouse IgG(Invitrogen-Gibco) 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 이후 Carl Zeiss LSM 700 confocal microscope system(Jena, Germany)을 이용해 세포 이미지를 얻었다.
중간엽줄기세포를 트립신 처리하고 1 μM CM-DiI CellTracker(Invitrogen-Gibco)를 이용해 37℃에서 5분 동안 배양한 후 추가로 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 다음으로, 표지된 중간엽줄기세포 1×106 개를 PBS로 씻어내고 hPBMC와 함께 마우스에 정맥 투여하고, 7일째 다시 같은수의 세포를 투여하였다. 이후 마우스를 희생시키고 소장을 분리하여 frozen sectioning 기술을 이용해 절단한 후 조직을 2번 씻어내고 5% FBS 블로킹 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 세포와 반응시켰다. 한 번 더 상기와 같은 방법으로 조직을 씻어내고, IDO(1:100)에 대한 1차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 세포와 반응시킨 후 Carl Zeiss LSM 700 confocal microscopy system을 이용해 조직으로부터 형광 이미지를 얻었다. 이를 통해, 핵(파랑; Vector Laboratories, Burlingame, CA), IDO (녹색), 및 CM-DiI-labeled MSCs(빨강)을 검출하였다. 공초점 현미경 이미지는 LSM 700 Zen 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
1-8. RT- PCR 분석
중간엽줄기세포를 200 IU/mL의 IFN-γ 및/또는 100 μg/mL의 poly I:C(Invitrogen-Gibco)가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 24시간 동안 배양한 후 QIAGEN RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 이용해 총 RNA를 추출하였고, 상기 RNA에 대하여 PrimeScript™1st strand cDNA synthesis kit(TaKaRa Shuzo, Shiga, Japan)를 이용해 RT-PCR(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)를 수행하여 cDNA를 합성하였다.
상기 PCR에서 이용한 프라이머 서열은 하기에 나타낸 바와 같다.
IDO forward: 5'-GCGCTGTTGGAAATAGCTTC-3'
IDO reverse: 5'-CAGGACGTCAAAGCACTGAA-3'(234 bp)
IFN-γ forward: 5'-TTGGCTTTTCAGCTCTGCATC-3'
IFN-γ reverse: 5'-GGAGACAATTTGGCTCTGCATT-3'(201 bp)
GAPDH forward: 5'-TCAACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'
GAPDH reverse: 5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'(234 bp)
1-9. 통계분석
모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 각 실험 조건간의 차이는 t-test 또는 분산분석을 이용해 분석하였다. P-value가 0.05 미만인 경우에 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
2. 실험결과
2-1. 인간 조직유래 중간엽줄기세포의 특성 분석
골수, 제대혈, 및 워튼연육으로부터 분리한 인간 중간엽줄기세포를 관찰한 결과 섬유아세포의 형태임을 확인하였고, 반면에 지방조직유래 중간엽줄기세포는 작고 방추모양임을 관찰하였다(도 1A).
또한, 세포 분석을 통해 표면에 발현하고 있는 항원 단백질을 확인한 결과, 상기 세포들은 모두 CD73, CD90, CD105, 및 CD166을 발현하는 반면, 조혈모세포 계통의 마커인 CD14, CD34, CD45, 및 HLA-DR는 발현하지 않는 것을 확인하였다(도 1B).
또한, 중간엽줄기세포를 골형성, 지방세포 형성, 및 연골형성 유도배지에서 14~21일 동안 배양한 결과 각각 알칼라인 포스파타아제 활성, 중성지방 액포의 축적, 및 연골세포 기질 축적을 관찰하였으며, 모든 중간엽줄기세포는 상기 각 배지에서 배양하여 분화를 유도하였을 때 그 기원에 관계없이 골, 지방, 및 연골세포 유사 형태를 보이는 것을 확인하였다(도 1C).
2-2. in vitro 및 in vivo 모델에서 중간엽줄기세포의 면역억제 특성 확인
혼합 림프구반응(mixed lymphocyte reaction; MLR)을 통해 naive 중간엽줄기세포의 면역조절 특성을 평가하고자 하였다.
우선, PHA를 처리하여 활성화시킨 말초혈액단구세포를 골수, 지방조직, 제대혈, 또는 워튼연육 유래 중간엽줄기세포 위에서 배양한 결과, T-세포 활성이 현저히 감소하였고, 이러한 결과는 공동배양 시 중간엽줄기세포의 수에 의존적인 것을 확인하였다(도 2). 또한, 다른 조직에서 유래한 중간엽줄기세포의 면역조절 특성에는 현저한 차이가 나타나지 않았는데, 이러한 결과는 지방조직, 제대혈, 및 워튼연육 유래 중간엽줄기세포가 골수유래 중간엽줄기세포 처럼 T-세포 증식을 억제하는데 효과적임을 의미한다.
다음으로, 중간엽줄기세포에 의한 T-세포 증식 억제가 상기 중간엽줄기세포에 의해 직접적으로 매개되는 것인지 가용성 인자에 의한 것인지를 알아보기 위해, 트랜스웰 시스템을 이용하여 말초혈액단구세포를 트랜스웰 삽입체 내의 중간엽줄기세포와 공동배양하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 조직에서 유래한 중간엽줄기세포는 세포 접촉이 없는 조건에서도 PHA 자극에 반응하는 hCD3+CD8+ T-세포의 증식을 억제하였고, 이는 직접적인 세포간 접촉이 있는 조건에서 나타난 증식 억제수준보다는 조금 감소된 정도였다. 상기 결과들은 세포 간 집적적인 접촉뿐만 아니라 가용성 인자 역시 중간엽줄기세포의 면역조절 효과에 기여하는 것을 의미한다.
또한, in vivo에서 중간엽줄기세포의 면역억제 기능을 확인하기 위해, 각 마우스에 말초혈액단구세포 및 각 조직유래 중간엽줄기세포를 함께 주입한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 주입 후 8주째에 인간 말초혈액단구세포를 단독으로 주입하거나 상기 세포와 중간엽줄기세포를 함께 1회 주입한 마우스들은 죽은 반면, 중간엽줄기세포를 2회 주입한 마우스의 경우에는 20% 정도가 생존하였다.
또한, 면역억제에 대한 가용성 인자의 역할을 알아보기 위해, 중간엽줄기세포가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양한 mitogen-activated T-세포 배양 상층액을 분석하였다. 그 결과, 말초혈액단구세포가 활성화 되었을 때, 다양한 사이토카인, 케모카인, 및 성장인자들의 분비가 증가하였다. 반면에 중간엽줄기세포가 존재하는 경우에는 그 기원에 관계없이 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 양이 감소하였다.
또한, 상기 in vitro 결과와 유사하게, 이식편대숙주병 동물모델에 말초혈액단구세포를 골수유래 중간엽줄기세포와 함께 주입한 경우에도, 혈액내 IFN-γ의 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 5).
2-3. IFN -γ 자극에 의한 중간엽줄기세포의 면역억제 특성 향상 확인
말초혈액단구세포는 중간엽줄기세포와 함께 배양하였을 때 증식이 억제되었으며, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포와 공동배양한 경우에는 증식이 더욱 억제된 것을 확인하였다(도 6).
따라서, 이러한 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병을 개선시킬 수 있는지 알아보기 위해, 인간 말초혈액단구세포를 주입한 마우스에 7일 간격으로 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 2회 주입하였다. 이후 말초혈액단구세포만 단독으로 주입한 그룹, 말초혈액단구세포와 중간엽줄기세포를 함께 주입한 그룹, 말초혈액단구세포와 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 함께 주입한 그룹, 또는 JAK 억제제인 AG490을 전처리하고 말초혈액단구세포와 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 함께 주입한 그룹에서 마우스 생존율을 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단구세포를 단독으로 주입한 마우스에 비해 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 함께 주입한 마우스의 생존율이 개선된 것을 확인하였다. 또한, 이러한 생존율 향상 결과는 말초혈액단구세포와 IFN-γ를 처리하지 않은 중간엽줄기세포를 함께 주입한 경우에 비해 더욱 높게 나타났다. 반면, JAK 억제제를 전처리한 경우에는 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포에 의한 이식편대숙주병 마우스의 생존율 향상을 감소시키는 것을 확인하였다.
또한, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병 마우스 모델에서 T 세포 증식억제를 유도하는지 확인하기 위해, 상기 각 마우스 그룹의 혈액을 유세포 분석법을 통해 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단구세포와 중간엽줄기세포를 함께 주입한 경우에는 CD45+ 및 CD45+CD3+ 세포의 수가 감소하였으나, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 함께 주입한 경우에는 감소 정도가 훨씬 높게 나타났다.
또한, 조직학적 분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포를 함께 주입하였을 때 이식편대숙주병 마우스의 임상적 증상 및 피부 및 소장에서 면역세포 침투가 효과적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 IFN-γ 자극이 중간엽줄기세포의 면역억제 특성을 향상시키는 것을 의미하는 것이다.
다음으로, 중간엽줄기세포의 유전자 발현에 IFN-γ이 미치는 영향을 알아보기 위해, IFN-γ 자극 전후 중간엽줄기세포의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 그 결과, 골수유래 중간엽줄기세포는 IFN-γ로 자극시켰을 때 형태 변화에는 현저한 차이가 나타나지 않았으나(도 10A), 유전자 발현 프로파일에는 많은 차이가 나타난 것을 확인하였다(도 10B).
실제로, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포에서 512개의 유전자 발현이 증가하였고, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자들 중 4개의 유전자는 중간엽줄기세포의 면역억제 기능에 관련되어 있는 것을 알 수 있었다.
[표 1]
Figure pat00001
또한, qRT-PCR을 실시한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포에서 CXCL9 (C-X-C motif), CXCL10, CCL8 (C-C motif), 및 IDO 유전자의 mRNA 발현수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
2-4. JAK / STAT1 신호전달 경로를 통한 IFN -γ 매개 IDO 발현 유도 확인
상기 결과를 통해 골수유래 중간엽줄기세포를 IFN-γ로 자극시켰을 때 IDO 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 다른 조직유래 중간엽줄기세포에서도 동일하게 나타나는 것을 확인하였다(도 12).
IFN-γ 신호전달은 JAK/STAT1 경로를 통해 일어나며, STAT1은 인산화되어 핵으로 이동하고 전사를 매개한다. 따라서 면역블롯팅 분석 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, IFN-γ로 자극시키지 않은 중간엽줄기세포와 비교하여 IFN-γ로 자극시킨 세포에서 STAT1의 활성화(STAT1 인산화)를 확인하였다.
또한, JAK/STAT1 경로와 IDO 발현간의 상관관계를 알아보기 위해 JAK 억제제(AG490)를 처리하거나 STAT1을 표적하는 siRNA를 처리한 후 면역블롯팅을 수행한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, JAK 억제제 또는 STAT1 표적 siRNA를 처리한 경우 IDO가 소량 발현되거나 발현되지 않는 것을 확인하였다. 이는 IFN-γ에 의한 IDO의 발현 증가가 JAK/STAT1 경로를 통해 일어난다는 것을 의미한다.
MLR 결과는 중간엽줄기세포가 말초혈액단구세포의 증식을 억제한다는 것을 보여주었으나, 이러한 효과는 항 IFN-γ 항체 처리에 의해 나타나지 않는 것을 확인하였는바, 이는 T-세포를 포함하는 활성화된 면역세포들에 의해 분비되는 IFN-γ가 IDO 발현을 통해 중간엽줄기세포의 면역조절 특성에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 STAT1 표적 siRNA 처리를 통해 IFN-γ의 하위 신호전달 경로가 억제되는 것을 통해 확인할 수 있다(도 15).
결론적으로, 중간엽줄기세포에서 IFN-γ/JAK/STAT1 경로를 통한 IDO의 발현유도는 중간엽줄기세포의 면역억제 기능에 매우 중요함을 알 수 있다.
또한, IDO mRNA의 발현은 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 적어도 4시간 동안 처리하였을 때 증가하였다. 1 IU/mL의 IFN-γ을 24시간 동안 처리한 경우에는 IDO mRNA 발현이 적어도 1일 동안 유지되었고, IDO 단백질 수준은 적어도 7일 동안 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 동일한 중간엽줄기세포에 1 IU/mL의 IFN-γ을 재처리하였을 때 IDO mRNA가 다시 발현되었으며, 이의 단백질 수준은 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
2-5. 인간 중간엽줄기세포의 면역억제 특성에서 IDO의 역할 규명
이식편대숙주병 마우스에 주입된 중간엽줄기세포가 상기 마우스의 조직에 존재하는지 평가하기 위해 CM-DiI 염색된 중간엽줄기세포를 주입하고 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 상기 중간엽줄기세포가 조직 내로 침투하는 것을 관찰하였고, IFN-γ가 처리된 중간엽줄기세포를 주입하였을 때 중간엽줄기세포에서 IDO의 발현이 유도되는 것을 확인하였다. 반면, 상기 중간엽줄기세포를 주입하기 전에 JAK 억제제인 AG490을 처리하였을 때에는 조직에서 중간엽줄기세포의 침투가 감소하며, IDO의 발현 또한 감소하였다.
상기 결과를 바탕으로 중간엽줄기세포의 면역억제 특성에 있어서 IDO의 역할을 알아보기 위해 IDO 발현을 저해하는 shRNA를 처리하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, IDO를 표적하는 shRNA에 의해 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포에서 IDO의 발현수준이 현저히 억제된 것을 확인하였으며(도 17A, B), 또한 말초혈액단구세포를 PBS 또는 IFN-γ를 처리한 중간엽줄기세포와 함께 공동배양하였을 때 PHA에 의해 유도되는 말초혈액단구세포의 증식이 현저히 복구되었으며, 이때 ID 표적 shRNA에 의해 IDO의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 17C).
이에 더하여, IDO의 발현이 감소된 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 처리하거나 처리하지 않은 상태로, 이식편대숙주병 마우스에 7일 간격으로 2회 정맥투여한 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단구세포만을 단독으로 주입한 그룹과, 말초혈액단구세포를 IDO의 발현이 감소된 중간엽줄기세포와 함께 주입한 그룹에서 유의한 생존률의 차이가 나타나지 않았다.
이러한 생존결과와 상응하게, 면역형광 이미지 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 이식편대숙주병 마우스로부터 얻은 소장 및 피부조직에서는, IDO 다운조절된 중간엽줄기세포 내에 IDO가 거의 발견되지 않았다.
다음으로, IDO 및 RFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 도입하여 IDO를 안정하게 발현하는 중간엽줄기세포를 제작한 후, 이들 IDO를 과발현하는 중간엽줄기세포의 면역억제능을 in vitro 및 in vivo 모델에서 확인하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단구세포를 IDO 과발현 중간엽줄기세포와 공동배양하였을 때 PHA에 의해 유도된 말초혈액단구세포의 증식이 현저히 억제되었고, 이러한 결과는 IFN-γ로 자극시킨 중간엽줄기세포와 공동배양한 경우의 결과와 유사하게 나타났다.
더욱이, 이식편대숙주병 마우스에서 IDO 과발현 중간엽줄기세포 그룹의 생존율 또한 IFN-γ가 처리된 중간엽줄기세포와 공동배양한 그룹의 마우스 생존율만큼 향상된 것을 확인하였다(도 21).
이러한 생존율 결과와 상응하게, 면역형광 이미지 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 이식편대숙주병 마우스의 소장 및 피부 조직에서 IDO 과발현 중간엽줄기세포 내에 IDO가 발현되는 것을 확인하였다.
결론적으로, 상기 결과들은 IFN-γ를 처리한 중간엽줄기세포가 이식편대숙주병이 유도된 조직으로 귀소할 수 있고, IDO 발현 유도를 통해 면역억제 기능을 나타낼 수 있음을 보여주는 것이다.
2-6. IFN -γ 자극에 의한 IDO 발현 유도 및 TLR3 활성화 비유도
종래, 중간엽줄기세포에서 이들의 면역억제능을 위해 TLR3(Toll-like receptor 3)가 IDO의 발현을 유도한다고 보고된 바 있기 때문에, 본 실시예에서는 IFN-γ에 의해 자극된 중간엽줄기세포와 TLR3가 활성화된 중간엽줄기세포간의 면역억제 활성을 비교하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단구세포를 poly I:C를 처리하여 TLR3를 활성화시킨 중간엽줄기세포와 공동배양하였을 때 상기 말초혈액단구세포의 증식은 거의 억제되지 않은 반면, IFN-γ로 자극시킨 골수, 지방조직, 제대혈, 및 워튼연육유래 중간엽줄기세포와 공동배양한 경우에는 상기 말초혈액단구세포의 증식이 현저히 억제되는 것을 확인하였다.
이때, 인간 중간엽줄기세포에서 IFN-γ 자극 또는 TLR3 활성화에 의한 IFN-γ 발현 유도는 관찰되지 않았으며, 이는 ex vivo IFN-γ 자극이 인간 중간엽줄기세포의 면역억제 특성을 증진시키기 위한 적절한 수단임을 의미한다.
또한, 골수유래 중간엽줄기세포를 IFN-γ로 자극시켰을때 IDO 발현이 유도된 반면, poly I:C를 처리하여 TLR3를 활성화시킨 중간엽줄기세포의 경우에는 IDO 발현이 약간 증가하였는데, 이러한 결과는 지방조직, 제대혈, 및 워튼연육과 같은 다양한 조직에서 유래한 중간엽줄기세포에서도 동일하게 나타났다 (도 24).
또한, 도 25에 나타낸 바와 같이, TLR3를 활성화시킨 모든 골수유래 중간엽줄기세포에서 다른 기능과 관련된 CXCL10, IL-6, 및 IL-8과 같은 유전자들은 높게 발현되는 반면, STAT1의 활성화(STAT1 인산화)는 관찰되지 않았다.
상기 결과들에 의하면, IFN-γ 자극이 JAK/STAT1 경로를 통해 중간엽줄기세포에서 (면역억제능을 위해) IDO의 발현을 유도하는 반면, TLR3의 활성화는 IDO의 발현을 유도하지 않음을 알 수 있다.
2-7. IDO 바이오마커 이외의 나머지 후보 마커 ( CXCL9 , CXCL10 , ICAM2 , B7-H1, PTGDS , CXCL11 , VCAM1, ICAM1 , TRAIL)
지방조직 유래의 중간엽줄기세포(AT-MSC)에서 기능 유전자(IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1 및 TRAIL) 발현에 미치는 영향을, IFN-γ 자극, TNF-α 자극, 및 TLR3 활성화(poly I:C 자극)시 간에 비교평가하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 자극 특이적으로 IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1 및 TRAIL의 발현이 유도됨을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 중간엽 줄기세포에 IFN-γ 전처리 자극후 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포를 선별하는데 있어서, IDO, CXCL9, CXCL10, CXCL11, ICAM1, ICAM2, B7-H1, PTGDS, VCAM1 및 TRAIL가 면역억제 바이오마커로서 유효함을 의미하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (18)

  1. 중간엽 줄기세포에서 IFN-γ 전처리 자극후 면역억제 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포 선별방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법:
    (a) 중간엽 줄기세포 배양 후 IFN-γ를 처리하는 단계;
    (b) 중간엽 줄기세포에서 면역억제 바이오마커의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현수준이 IFN-γ 미처리 대조군과 비교하여 증가하는 경우 면역질환 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포인 것으로 판정하는 단계.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 면역억제 바이오마커는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 면역억제 바이오마커는 CXCL9(C-X-C motif ligand 9), CXCL10(C-X-C motif ligand 10), CXCL11(C-X-C motif ligand 11), ICAM1(Inter Cellular Adhesion Molecule 1), ICAM2(Inter Cellular Adhesion Molecule 2), B7-H1(B7 homolog 1), PTGDS(Prostaglandin D2 synthase), VCAM1(Vascular Cellular Adhesion Molecule 1) 및 TRAIL(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 고효능은 면역 억제능인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 크론병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 IDO의 발현은 IFN-γ로 자극된 중간엽 줄기세포에서 JAK/STAT1 신호경로를 통하여 증가되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 IFN-γ은 배지내에 1-100 IU/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이오마커의 발현수준은 웨스턴 블랏팅, 항체면역침강법, ELISA, 질량분석법, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정하는 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  12. 제 1 항의 방법에 의해 선별된, 면역질환의 치료를 위한 고효능 중간엽 줄기세포.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 장기이식시 거부반응, 체액성 거부반응, 자가면역질환 또는 알러지성 질환인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 고효능은 면역억제능인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 워튼연육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이계 유래인 것을 특징으로 하는, 고효능 중간엽 줄기세포.
  17. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 면역질환 치료용 약학 조성물.
  18. 제 12 항의 고효능 중간엽 줄기세포를 함유하는, 이식편대숙주질환 치료용 약학 제제.
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