KR20240029698A - TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6를 발현하는 고효능 줄기세포를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 그 선별 방법 - Google Patents

TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6를 발현하는 고효능 줄기세포를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 그 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6를 이용한, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법 및 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 특정 마커 조합이 신경계 질환에 있어 가장 우수한 치료(개선) 효능을 가지는 줄기세포를 선별하기 위한 바이오 마커로서 이용될 수 있음을 제시할 뿐만 아니라, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6 인자들의 발현 또는 활성이 증가된 줄기세포 또는 줄기세포에서 상기 인자들의 조절(특히, 상향 조절) 물질의 이용을 통해, 보다 고효능(고성능) 및 고효율로 신경계 질환의 치료 효과가 현저하다. 또한 본 발명은 동종이계 줄기세포 이식의 더 높은 치료적 가능성을 보여준다.

Description

TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6를 발현하는 고효능 줄기세포를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 그 선별 방법{Pharmaceutical composition for preventing or treating neurological diseases including improved stem cells expressing TIMP-1, MCP-1, GROα and IL-6, and Methods for selecting the improved stem cells}
본 발명은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6를 이용한, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법과, 상기 고효능 줄기세포를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경계 질환은 중추신경계 또는 말초신경계의 신경 손실로 인해 발생하게 되며 현재까지 특별한 치료법이 없는 질환으로 알려져 있다. 신경계 질환 중 대표적 일례인 뇌졸중은 뇌 조직으로 통하는 혈류의 장애로 정의된다. 이것은 뇌의 특정부위의 장애 발생 또는 심장에 의한 펌프질이 완전히 손상되었을 때 나타나며, 구체적으로 뇌로 통하는 혈관의 막힘이나 파열에 의해 뇌의 특정부위로의 혈류 흐름이 방해되었을 때 뇌졸중이 발생하게 된다. 구체적으로 색전증(embolism)이나 혈전(thrombus)의 형성을 통해 혈관이 막힘으로써 뇌로 혈액을 공급하는 동맥에서 발생하게 되고 이는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)으로 알려져 있다. 뇌졸중은 선진국에서 사망의 세 번째 주요원인이다. 미국에서, 뇌졸중 사망의 결과로 인한 치료비용과 생산성 손실은 약 40조 달러에 이른다고 추산되고 있다. 허혈성 뇌졸중이 발병하게 되면 뇌 조직의 괴사 및 뇌경색(cerebral infraction)이 일어나게 되며, 초기 발병 후 3~6시간 이내에 혈전용해술(thrombolysis)을 포함한 약물투여와 재활치료를 통해 뇌 기능의 보존 및 회복을 유도하는 치료법이 사용되고 있다. 하지만, 이러한 혈전용해술의 경우 뇌줄혈의 위험이 증가하기 될 뿐만 아니라 뇌경색이 일어난지 수 시간 내에 시행되어야 하기 때문에 시술 받지 못하는 환자가 많은 실정이다. 이러한 뇌졸중의 치료 방법은 응급 치료에 그치거나 병의 진행을 막는 것에 불과할 뿐 이미 손상된 뇌조직을 재생하는 등의 근본적인 치료 대책이 없는 상태이다.
이러한 현대의학의 한계점을 극복하기 위하여, 최근에는 신경계 재생 효과가 있는 줄기세포를 이용한 치료가 시도되고 있다. 줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 세포, 즉 미분화 세포로서, 적절한 조건 하에서 다양한 조직 세포로 분화할 수 있으므로 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 응용할 수 있다. 이러한 줄기세포치료제는 손상된 신경의 재생을 가능하게 할 것으로 기대되고 있으며, 직접적인 재생 이외에도 손상된 환경을 개선하는 다양한 물질을 분비하여 재생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 줄기세포 관련 기술의 비약적 발전으로 인해 신경계 질환 치료효과에 대한 기대감이 높은 반면, 임상적으로 가장 앞서 나아가고 있는 중간엽줄기세포를 이용한 뇌졸중이나 그 외 퇴행성 신경계 질환 치료의 임상결과에서 실제로는 큰 효과가 없는 것으로 보고되고 있다. 뿐만 아니라 다양한 질환 분야에서 줄기세포를 이용한 치료를 시도하고 있으나, 실질적으로 좋은 효능을 보이지 못해 고효능 줄기세포를 발굴하기 위한 많은 연구들이 진행되고 있는 실정이다(특허문헌 1). 또한 태아 유래 신경줄기세포를 이용하여 뇌졸중 및 척수 손상 환자 대상으로 임상연구가 진행 중이지만 윤리적인 문제뿐 아니라 불완전 분화로 인한 종양 발생 등의 심각한 기술적인 문제가 발생하고 있는 실정이다.
한국등록특허 10-1971323
이에 본 발명자들은, 줄기세포를 이용하는 신경계 질환 치료에 있어서 보다 고효능 및 고효율의 치료 전략을 찾고자 연구하던 중, 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성에 있어서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 핵심적 역할을 최초로 규명하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, TIMP-1(TIMP Metallopeptidase inhibitor 1), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), GROα(Growth-Regulated Oncogene alpha) 및 IL-6(Interleukin 6)의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성능을 생체 외에서 판별할 수 있는 방법으로, 상기 방법은 줄기세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 정도를 측정하여 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
(a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 분리된 줄기세포에 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 처리하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 복합제제를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1(TIMP Metallopeptidase inhibitor 1), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), GROα(Growth-Regulated Oncogene alpha) 및 IL-6(Interleukin 6)의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자는, 상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포에서 고발현 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경계 질환은 허혈성 뇌질환, 퇴행성 신경질환, 신경손상 질환, 말초신경장애, 및 외상성 뇌손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 뇌색전증, 뇌혈전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 뇌출혈, 신생아 뇌실내 출혈(IVH), 뇌동맥경화증, 저산소성 뇌손상 및 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy: OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨슨-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 및 픽병(Pick's disease)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경손상 질환은 뇌전증, 척수 손상 질환, 행동 장애, 발달장애, 정신 지체, 다운증후군 및 정신분열증에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법은 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(i) 줄기세포를 배양하는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계의 줄기세포 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 농도를 측정하는 단계; 및
(iii) 상기 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질이 고발현된 경우 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포인 것으로 판정 및 분류하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 상기 (iii)단계는,
상기 (ii) 단계에서 측정된 배양물 내
TIMP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
MCP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
GROα 단백질 농도가 500 pg/mL 이상, 및
IL-6 단백질 농도가 50 pg/mL 이상인 경우
상기 줄기세포가 고효능인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성능을 생체 외에서 판별할 수 있는 방법으로, 상기 방법은 줄기세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 정도를 측정하여 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 수준 측정은, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제에 의해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트는, 전술한 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
(a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(flow cytometry) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 용도를 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물의 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료용 제제를 제조(생산)하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양물은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 포함하는 조건배지(conditioned medium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 분리된 줄기세포에 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 처리하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은,
TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 1개 이상의 발현벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기세포의 활성은 자가 재생, 신경세포보호능, 신경세포사멸억제능, 혈관내피세포 이동, 혈관형성, 항염증 및 반응성 아교화 억제능으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합제제를 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 이를 필요로 하는 개체에 투여(특히, 복합 투여 또는 병용 투여)하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 용도를 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질의 신경계 질환의 예방, 개선 및/또는 치료용 제제(특히, 복합제제 또는 병용제제)를 제조(생산)하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질은,
TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 1개 이상의 발현벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양물은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 포함하는 조건배지(conditioned medium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 혈관형성 유도용 약학적 조성물은, 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌경색, 뇌허혈, 뇌졸중, 혈관성 치매, 뇌출혈, 지주막하 출혈 및 백질 이상증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법(혈관형성 유도 방법)을 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법(혈관형성 유도 방법)을 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 용도(혈관형성 유도 용도)를 제공한다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는 이의 배양물의 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료용 제제를 제조(생산)하기 위한 용도(혈관 형성 유도제를 제조하기 위한 용도)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 복합제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은,
TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 1개 이상의 발현벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 혈관형성 유도용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 복합제제는 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 이를 필요로 하는 개체에 투여(특히, 복합 투여 또는 병용 투여)하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법(혈관형성 유도 방법)을 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여(특히, 복합 투여 또는 병용 투여)하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 방법(혈관형성 유도 방법)을 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료 용도(혈관형성 유도 용도)를 제공한다.
또한 본 발명은,
분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질의 뇌혈관 질환의 예방, 개선 및/또는 치료용 제제(특히, 복합제제 또는 병용제제)를 제조(생산)하기 위한 용도(혈관 형성 유도제를 제조하기 위한 용도)를 제공한다.
본 발명에 의하면, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 특정 마커 조합이 신경계 질환에 있어 가장 우수한 치료(개선) 효능을 가지는 줄기세포를 선별하기 위한 바이오 마커로서 이용될 수 있음을 제시할 뿐만 아니라, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6 인자들의 발현 또는 활성 수준이 증가된 줄기세포 또는 줄기세포에서 상기 인자들의 조절(특히, 상향 조절) 물질의 이용을 통해, 보다 현저하게 고효능(고성능) 및 고효율의 신경계 치료 효과를 거둘 수 있음을 제시한다. 또한 본 발명은 동종이계 줄기세포 이식의 더 높은 치료적 가능성을 보여준다.
도 1은 성체 인간 뇌조직(국소겉질이상 IIIa형 기증자에서 병변이 없는 측두엽 조직)으로부터 분리 수득한 신경줄기세포의 조건 배지(conditioned media)를 이용하여, 신경줄기세포가 분비하는 물질의 조성을 cytokine 분석 및 LC-MS/MS을 통하여 분석한 과정을 보여주는 개략도이다.
도 2는 primary rat cortical neuron 세포에 OGD(Oxygen Glucose Deprivation, 산소-포도당 결핍)를 유도하여 제작한 in vitro 뇌졸중 모델에서, 성체 인간 뇌조직으로부터 분리 수득한 신경줄기세포 조건 배지(conditioned media)의 신경세포보호능을 확인한 결과를 나타낸다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC)
도 3a는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 MCP-1 또는 TIMP-1 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후, OGD(Oxygen Glucose Deprivation, 산소-포도당 결핍)를 유도하여 제작한 in vitro 뇌졸중 모델에 처리하여, 신경세포 보호능에 각 인자가 미치는 영향을 비교 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체의 처리에 의해 신경세포 보호능이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM; $ p <0.05, $$ p <0.01, $$$ p <0.001 vs CM + (각 항체 처리)).
도 3b는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 GROα 또는 IL-6 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후, OGD(Oxygen Glucose Deprivation, 산소-포도당 결핍)를 유도하여 제작한 in vitro 뇌졸중 모델에 처리하여, 신경세포 보호능에 각 인자가 미치는 영향을 비교 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체의 처리에 의해 신경세포 보호능이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM; $ p <0.05, $$ p <0.01, $$$ p <0.001 vs CM + (각 항체 처리)).
도 4는 primary rat spinal cord neuron 세포에 H2O2처리하여 제작한 in vitro 척수손상 모델에서, 신경줄기세포 조건 배지(conditioned media)의 신경세포보호능을 확인한 결과를 나타낸다. ROS(reactive oxygen species)에 의한 손상조건하에서 신경세포 조건 배지를 처리하였을 때, 신경세포의 생존율이 증가하였다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC)
도 5a는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 MCP-1 또는 TIMP-1 각각에 대한 중화항체, 또는 IgG를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후, 이를 H2O2처리로 ROS 생산을 유도하여 제작한 in vitro 척수손상 모델에 처리하여, 상기 신경줄기세포 조건 배지의 신경세포 보호능에 각 인자가 미치는 영향을 비교 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체의 처리에 의해 척수신경세포 보호능이 현저히 감소하였다 (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. IM; # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 vs. CM; $ P<0.05, $$ P<0.01, $$$ P<0.001 vs. CM + IgG(10ug/ml)).
도 5b는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 GROα 또는 IL-6 각각에 대한 중화항체, 또는 IgG를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후, 이를 H2O2처리로 ROS 생산을 유도하여 제작한 in vitro 척수손상 모델에 처리하여, 상기 신경줄기세포 조건 배지의 신경세포 보호능에 각 인자가 미치는 영향을 비교 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체의 처리에 의해 척수신경세포 보호능이 현저히 감소하였다 (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. IM; # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 vs. CM; $ P<0.05, $$ P<0.01, $$$ P<0.001 vs. CM + IgG(10ug/ml)).
도 6은 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관내피세포 이동 능력 변화를 확인하기 위해, HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 이용하여 Wound-healing assay 방법으로 이동능력 시험을 수행한 결과 이미지이다. 신경줄기세포 조건배지 처리에 의해 혈관내피세포 이동능력이 현저히 증가하였다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다).
도 7은 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관내피세포 이동 능력 변화를 확인하기 위해, HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 이용하여 Wound-healing assay 방법으로 이동능력 시험을 수행한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 신경줄기세포 조건배지 처리에 의해 혈관내피세포 이동능력이 현저히 증가하였다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC).
도 8a는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 MCP-1 또는 TIMP-1 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하여, 각 인자가 혈관내피세포 이동 능력에 미치는 영향을 Wound-healing assay 방법으로 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체 처리에 의해 혈관 내피세포 이동능력이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM).
도 8b는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 GROα 또는 IL-6 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하여, 각 인자가 혈관내피세포 이동 능력에 미치는 영향을 Wound-healing assay 방법으로 확인한 결과로서, 각 인자의 중화항체 처리에 의해 혈관 내피세포 이동능력이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM).
도 9a는 혈관내피세포(HUVEC)를 이용하여 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관형성능력을 확인한 실험에서, 관 형성 결과를 보여주는 이미지이다. 조건배지 처리에 의해 혈관내피세포의 관형성 능력이 증가하였다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다).
도 9b는 혈관내피세포(HUVEC)를 이용하여 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관형성능력을 확인한 실험에서, 형성된 관의 길이를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 조건배지 처리에 의해 혈관내피세포의 관형성 능력이 증가하였다(반복 실험을 위해 동일한 방법으로 제작된 3 lot의 조건배지를 사용하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC).
도 10a는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 MCP-1 또는 TIMP-1 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하여, 각 인자가 혈관형성능력에 미치는 영향을 확인한 결과이다. TIMP-1에 대한 중화항체 처리에 의해 관형성능력이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM).
도 10b는 본 발명의 4개 효능인자 조합 중 GROα 또는 IL-6 각각에 대한 중화항체를 신경줄기세포 조건 배지에 pre-incubation 한 후 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하여, 각 인자가 혈관형성능력에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 각 인자의 중화항체 처리에 의해 관형성능력이 현저히 감소하였다(*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs NC; #p <0.05, ##p <0.01, ### p <0.001 vs CM).
도 11a는 in vivo 척수손상 동물모델에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 행동학적 장애 개선을 평가하기 위해 BBB 스코어 테스트(Basso, Beattie and Bresnahan score test)를 일주일 간격으로 수행한 결과를 나타낸 그래프이다(G1, Vehicle(DMEM F12-phenol free); G2, 3 x 106 cells/마리; G3, 1 x 106 cells/마리; *, G1(n=42) vs. G2(n=41); #, G1 vs. G3(n=42)).
도 11b는 in vivo 척수손상 동물모델에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 행동학적 장애 개선을 평가하기 위해 로타-로드 테스트(rota-rod test)를 일주일 간격으로 수행한 결과를 나타낸 그래프이다(*, G1(n=42) vs. G2(n=41); #, G1 vs. G3(n=42)).
도 11c는 in vivo 척수손상 동물모델에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 신경병증성 통증 개선을 평가하기 위해 본 프레이 테스트(von Frey test)를 일주일 간격으로 수행한 결과를 나타낸 그래프이다(*, G1(n=42) vs. G2(n=41); #, G1 vs. G3(n=42)).
도 12a는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)을 이용하여, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포의 치료효과를 확인하기 위한 일련의 실험들의 타임라인을 나타내는 개략도이다.
도 12b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 뇌경색 개선 효과를 평가하기 위해, 실험동물의 뇌에 대하여 TCC 염색을 수행한 결과 이미지이다.
도 12c는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 뇌경색 개선 효과를 평가하기 위해, 실험동물의 뇌에 대하여 TCC 염색을 수행하고 뇌경색 부위의 크기(부피)를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 손상을 주지 않은 대조군(control)과 뇌졸중 유도 후 손상대조군(HBSS) 및 신경줄기세포 이식 시험군(NSC, 5 x 105 cells/마리)으로 실험 동물군을 나누어 뇌경색 개선 효과 시험을 수행한 결과, 줄기세포를 뇌실 내로 투여 받은 동물(NSC)의 경우 줄기세포를 투여 받지 않은 동물(HBSS)에 비해 뇌경색이 현저히 감소했다(*, p<0.05; **, p<0.01).
도 13a는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 운동 장애 개선을 평가하기 위해 로타-로드 테스트(rota-rod test)를 일주일 간격으로 수행한 결과를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05 compared to Control; #, p<0.05 compared to HBSS; ##, p<0.01 compared to HBSS; ###, p<0.001 compared to HBSS).
도 13b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 인지 및 기억능력 개선을 평가하기 위해 수동회피실험을 일주일 간격으로 수행한 결과를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05 compared to Control; #, p<0.05 compared to HBSS; ##, p<0.01 compared to HBSS; ###, p<0.001 compared to HBSS).
도 13c는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 감각 및 운동능력 개선을 평가하기 위해 adhesive removal test를 일주일 간격으로 수행한 결과 중 removal time을 나타낸 그래프이다(*, p<0.05 compared to Control; #, p<0.05 compared to HBSS; ##, p<0.01 compared to HBSS; ###, p<0.001 compared to HBSS).
도 13d는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 감각 및 운동능력 개선을 평가하기 위해 adhesive removal test를 일주일 간격으로 수행한 결과 중 contact time을 나타낸 그래프이다(*, p<0.05 compared to Control; #, p<0.05 compared to HBSS; ##, p<0.01 compared to HBSS; ###, p<0.001 compared to HBSS).
도 14a는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식)에 의한 뇌졸중 치료효과를 관찰하기 위하여 선택된 각각의 조직부위를 나타낸다. 손상된 동측성(ipsilateral) 부위 및 비손상된 대측성(contralateral) 부위에서, 3개 부분을 평균적으로 관찰하였다. 본 출원 명세서 내용 및 도면에서 언급되는 동측성 부위 및 대측성 부위는 모두 도 14a에 표시한 곳을 지칭한다.
도 14b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 신경세포 개수를 비교하기 위해 NeuN 염색을 수행한 결과 이미지이다 (control, 대조군; HBSS, 손상 대조군; NSC, 신경줄기세포가 이식된 시험군).
도 14c는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 신경세포 개수를 비교하기 위해 NeuN 염색을 수행하고, 각 실험군에서의 신경세포 개수를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 투여에 의해 손상 뇌조직 내 신경 세포의 생존이 증가되어 있음을 확인하였다(control, 대조군; HBSS, 손상 대조군; NSC, 신경줄기세포가 이식된 시험군, *, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 15a는 in vivo. 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 반응성 아교화(reactive gliosis) 정도를 비교하기 위해 GFAP 항체로 면역조직화학염색을 수행한 결과 이미지이다.
도 15b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 반응성 아교화(reactive gliosis) 정도를 비교하기 위해 GFAP 항체로 면역조직화학염색을 수행하여, 각 실험군에서의 별아교세포를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 15c는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 반응성 미세아교세포(reactive microglia) 수준을 비교하기 위해 Iba1 항체로 면역조직화학염색을 수행한 결과 이미지이다.
도 15d는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 손상된 부위의 반응성 미세아교세포(reactive microglia) 수준을 비교하기 위해 Iba1 항체로 면역조직화학염색을 수행하여, 각 실험군에서의 미세아교세포를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 16a는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 세포 생존 및 사멸에 관련된 단백질인 BAX, Bcl2, cleaved caspase-3의 발현 정도를 확인하기 위해 뇌 조직을 이용해 웨스턴 블랏을 수행한 결과 이미지이다.
도 16b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 세포 생존 및 사멸에 관련된 단백질인 BAX, Bcl2, cleaved caspase-3의 발현 정도를 확인하기 위해 뇌 조직을 이용해 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다(*, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 17a는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 뇌혈관의 회복 정도를 확인하기 위해 대뇌피질부분에서 CD31 면역형광염색 (혈관염색)을 수행한 결과 이미지이다.
도 17b는 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(중대뇌동맥 폐쇄모델, MCAO)에서, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입(이식) 후, 뇌혈관의 회복 정도를 확인하기 위해 손상부위 대뇌피질부분에서 CD31 면역형광염색 (혈관염색)을 수행하여, 각 실험군에서의 혈관 형성(재생) 수준을 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 18은 신경줄기세포를 이용하는 본 발명에서 MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6의 4개 인자의 특이적 조합 및 이들 인자들을 기준으로 선별된 고효능 신경줄기세포의 신경계 질환 치료에 대한 우수한 효과를 여러 측면에서 요약하여 나타낸 개략도이다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어 '신경계 질환'은 신경계, 즉 뇌, 척수, 신경 등에 문제가 생겨 발생하는 질병으로서, 일부 정신병 또한 이에 포함될 수 있다. 상기 신경계 질환은 뇌 신경, 중추 신경계 또는 말초 신경계 질환을 모두 포함하는 의미 일 수 있다. 본 발명에서 상기 신경계 질환은, 신경(신경세포) 재생을 필요로 하는 질환이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 허혈성 뇌질환, 퇴행성 신경질환, 신경손상 질환, 말초신경장애 및 외상성 뇌손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 '허혈'은 혈액의 공급이 차단되어 부족한 상태로서, 해당 조직 부위에 괴사를 초래하는 상태를 의미한다. 상기 허혈성 뇌질환은, 당업계에 뇌 내 허혈에 이해 초래되는 병증으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 뇌색전증, 뇌혈전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 뇌출혈, 신생아 뇌실내 출혈(IVH), 뇌동맥경화증, 저산소성 뇌손상 및 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)은, 당업계에 퇴행성 신경질환으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy: OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨슨-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 및 픽병(Pick's disease)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 신경손상 질환은, 이에 제한되지 않으나, 일례로 뇌전증, 척수 손상 질환, 행동 장애, 발달장애, 정신 지체, 다운증후군 및 정신분열증에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '신경재생(Neuroregeneration)'은 신경이 다시 새롭게 생겨나는 것을 의미하는 것으로서, 본원 명세서에서 신경재생과 신경발생은 혼용될 수 있다. 본 발명에서 용어 '신경발생(Neurogenesis)'은 당업계에 공지된 바와 같이 일반적으로 새 뉴런이 생산되는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩티드(polypeptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 TIMP-1(TIMP Metallopeptidase inhibitor 1) 단백질은, 당업계에 TIMP-1 단백질 또는 폴리펩타이드로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 TIMP-1은 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_003245.1(서열번호 1), 또는 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q6FGX5 등으로 공지된 것을 포함한다. 본 발명에서 상기 TIMP-1은 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1) 단백질은, 당업계에 MCP-1 단백질 또는 폴리펩타이드로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 MCP-1은 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. AAB20651.1, NP_002973.1(서열번호 2), 또는 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P13500.1 등으로 공지된 것을 포함한다. 본 발명에서 상기 MCP-1은 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 GROα(Growth-Regulated Oncogene alpha; chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1)) 단백질은, 당업계에 GROα 단백질 또는 폴리펩타이드로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 GROα는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_001502.1(서열번호 3), 또는 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P09341 등으로 공지된 것을 포함한다. 본 발명에서 상기 GROα는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 IL-6(Interleukin 6) 단백질은, 당업계에 IL-6 단백질 또는 폴리펩타이드로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명에서 IL-6는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_000591.1(서열번호 4), 또는 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P05231 등으로 공지된 것을 포함한다. 본 발명에서 상기 IL-6는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 기능적 동등물이란, 공지의 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6 단백질을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 공지의 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서'실질적으로 동질의 생리활성'이란 신경계 질환의 예방, 개선 또는/및 치료를 위한 줄기세포의 활성을 조절하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6의 기능적 동등물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는, TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4; 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에서 용어 '핵산','DNA 서열','RNA 서열' 또는 '폴리뉴클레오티드'는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 발명에서 'TIMP-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 TIMP-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, TIMP-1 mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게는 NCBI(Genbank) Accession No. NM_003254.3(서열번호 5) 등으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 'MCP-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 MCP-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, MCP-1 mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게는 NCBI(Genbank) Accession No. NM_002982.3(서열번호 6) 등으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 'GROα를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 GROα를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, GROα mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게는 NCBI(Genbank) Accession No. NM_001511.4 (서열번호 7) 등으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 'IL-6를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'는 일례로 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다 즉, 상기 IL-6를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는, DNA, cDNA 및 RNA(일례로, IL-6 mRNA) 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게는 NCBI(Genbank) Accession No. NM_000600.5(서열번호 8) 등으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 목적 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 '아날로그(analog)'라 함은 표준물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.
본 발명에서 '상동체(homologues)'라 함은 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.
본 발명에서 '접촉(contacting)'이라 함은 이의 일반적인 의미(normal meaning)이며, 2개 이상의 제제(예: 2개의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.
본 발명에서 '시험물질' 또는 '시험 제제(test agent)'라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 항체, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질(합성 화합물)일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질(천연 화합물, 식물 추출물 등)일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 핵산일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다.
본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는, TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6 전장 단백질 또는 이의 단편(단편 폴리펩타이드)이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 상기 단백질에 결합 또는 상호작용할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. 상기 단백질의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 단백질 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일례로 하기 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5, 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 용어 '프라이머'는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 프라이머와 관련하여 사용되는 용어 "실질적으로 상보적인 (substantially complementary)"은 소정의 어닐링 조건하에서 프라이머가 주형 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 어닐링된 프라이머는 중합효소에 의해 연장되어 주형의 상보체를 생성한다. 따라서, 상기 용어는 용어 "완전히 상보적인 (perfectly complementary)" 또는 이와 관련된 용어와 다른 의미를 갖는다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적(실질적으로 상보적)이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 표적 핵산의 서열을 가지고, 상보적 염기쌍에 의해 이중 구조를 형성하는, 통상적으로 표지화된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 표적 서열의 지역에 해당하는, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 및 일부 경우에, 50개 이상 뉴클레오티드로 이루어진 "혼성화 지역"을 포함할 것이다. "상응하는"은 지정된 핵산과 동일하거나 상보적인 것을 의미한다. 프로브는, 바람직하게는, PCR을 준비하는데 사용된 서열(들)에 상보적인 서열을 함유하지 않을 수 있다. 일반적으로, 프로브의 3' 말단은 프라이머 신장 생성물 속으로 프로브의 일체화를 억제하도록 "차단될" 것이다. "차단"은 비-상보적 염기를 사용하거나 비오틴, 인산염기 또는 형광체와 같은 화학적 모이어티를 선택된 모이어티에 따라, 표지에 부착된 핵산의 후속 탐지 또는 포획을 위한 표지로서 작용함으로써 이중 목적을 만족시킬 수 있는 염기 뉴클레오티드의 3' 하이드록실에 첨가함으로써, 얻을 수 있다. 차단은 3'-OH를 제거하거나 다이데옥시뉴클레오티드와 같은 3'-OH가 없는 뉴클레오티드를 사용함으로써 성취될 수 있다.
본 발명에서 'TIMP-1 항체' 또는 'TIMP-1 에 대한 항체'는 TIMP-1 의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 TIMP-1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에서'MCP-1 항체', 'GROα 항체' 또는 'IL-6 항체'가 언급 또는 지시될 때, 상기 'TIMP-1 항체'에 관한 설명에 준하여 그 의미가 당업자에게 자명히 이해된다.
상기한 바와 같은 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 바람직하게 상기 단편은 모(母)항체의 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 발명에서 용어 '숙주세포(host cell)'는, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 신경줄기세포의 기본적 기능으로 알려진 신경세포로의 분화 이외의 기능에 대하여 연구한 결과, 사람 뇌 조직으로부터 유래한 신경줄기세포들 중에서 이들이 실질적으로 신경계 질환 치료에 있어서 유의미한 효과를 가지기 위해서는 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL6가 핵심적인 역할을 하며 직접적으로 치료 활성에 관여함을 최초로 규명하였다.
이에 따라 본 발명자들은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 특정 마커 조합을 이용하여 신경계 질환에 있어 가장 우수한 치료(개선) 효능을 가지는 줄기세포를 선별 가능하였으며, 이렇게 선별된 줄기세포를 이용해 in vivo 신경계 질환 동물 모델에서 현저한 치료 효과를 확인한 바 있다.
또한 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6 인자들의 발현 또는 활성 수준이 증가된 줄기세포를 직접적으로 이용하거나, 또는 줄기세포에서 상기 인자들의 발현 또는 활성을 조절(특히, 상향 조절)하는 물질의 이용을 통해, 보다 현저하게 고효능(고성능) 및 고효율로 신경계 질환의 치료가 가능하다.
이에 본 발명은 TIMP-1(TIMP Metallopeptidase inhibitor 1), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), GROα(Growth-Regulated Oncogene alpha) 및 IL-6(Interleukin 6)의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법을 제공한다.
상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법에 있어서, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자는, 상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포에서 고발현 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 선별되기 전의 '줄기세포' 또는 '분리된 줄기세포'는 신경계 질환 치료를 위해 사용되는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 종류가 특별히 제한되지 않을 수 있으나, 바람직하게 신경세포로의 분화능을 보유하는 줄기세포를 의미하는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 본 발명에서 상기 줄기세포는 바람직하게 중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기, 본 발명에서 선별되기 전의 '줄기세포' 또는 '분리된 줄기세포'는 당업계에 공지된 방법에 따라 분리 및 수득될 수 있다. 이러한 공지의 방법으로는, 이에 제한되지 않으나, 일례로 밀도차를 이용한 분리법(density gradient fractionation, 특히 밀도차등 원심분리 등), 면역선택(immunoselection), 층분리배양법 및 감별 부착 분리법(differential adhesion separation), 형광 활성화 세포 분리법(Fluorescence-activated cell sorting, FACS) 등이 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 상기 줄기세포는(특히, 신경줄기세포)는 사람 뇌 또는 사람 신경(중추신경 또는 말초신경) 조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원 명세서 일 실시예에 기재한 바와 같이, 본원 발명자는 국소겉질이상 IIIa형 기증자로부터(국소겉질이상 IIIa형 기증자의 뇌수술 중 적출되는 병변이 없는 부위의 측두엽 조직으로부터) 분리한 신경줄기세포를 분리 배양함으로써, 배아줄기세포 이용의 윤리적인 문제를 해결함과 동시에 이식이 가능한 인간 성체 신경줄기세포를 용이하게 제공한 바 있다. 본 발명에서, 국소겉질이상 IIIa형 기증자의 뇌조직으로부터 분리된 인간 성체 신경줄기세포는 자가 이식 및 타가 이식이 가능하다.
본 발명에서 상기 신경줄기세포는 신경전구세포를 포함하는 의미일 수 있다.
본 발명에서 '줄기세포의 배양물'은 상기 줄기세포를 공지된 줄기세포 배양방법 등에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미하는 것으로, 고형 및 액상 등 그 구체적 형태가 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 배양물은 액상의 배양액 형태로 이용(사용)되는 것일 수 있다.
상기 배양물은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 포함하고 있다면, 상기 배양물의 조성물 구성이 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 배양물은, 배양물 내에 상기 줄기세포가 포함되는 조성물 구성 또는 배양물 내에 상기 줄기세포가 포함되지 않는 조성물 구성을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 배양물은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포를 포함하지 않는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에서 상기 배양물은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포를 배양한 조건 배지(conditioned medium)일 수 있다. 본원에서 상기 조건 배지(conditioned medium)는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포를 당업계에 공지된 통상의 기본 배지(바람직하게는 포유동물 세포 배양에 사용되는 배지, 더욱 바람직하게는 당업계에 공지된 통상의 줄기세포 배양 배지)에 배양하여 상기 줄기세포가 분비하는 세크리톰을 포함하는 것으로서, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포 자체는 제거되고 배지만을 수거한 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 '기본배지'는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 저농도 글루코오스 함유 DMEM, MEM (Minimal Essential Medium), MEM-alpha 배지, BME (Basal Medium Eagle), IMEM(Improved Minimum Essential Medium), K-SFM(Keratinocyte serum-free medium), EGM-2(Endothelial Cell Growth Medium 2), RPMI 1640, F-10, F-12, Ham's F-12 배지,α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), McCoy's 5A 배지, Eagle's basal 배지(BME, Basal Medium Eagle), CMRL 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow 최소 필수 배지(GMEM), Leibovitz's L-15 배지, KSB-3 basal 배지, KSB-3 Complete 배지 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 배양 배지는 영양혼합물 (Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 예를 들면, F12, M199, MCDB110, MCDB131, MCDB202, MCDB302 등이 있으며, 바람직하게는 F12 영양혼합물 (F12 Nutrient Mixture), M199, MCDB media 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 배지 종류는 당업계에 포유동물 세포 배양에 사용되는 배지로 공지된 것, 더욱 바람직하게는 당업계에 공지된 통상의 줄기세포 배양 배지 라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 DMEM 배지, M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB131 배지, IMEM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지 및 EGM-2 배지로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 조건 배지 수득 시에 사용되는 배지는, 상기 배지 이외에 추가의 혈청 성분을 비포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 저혈청 배지 상태 또는 무혈청 배지 상태(당업계에서 실질적으로 혈청이 없는 것으로 보는 상태)로 사용되는 것일 수 있다.
상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 일 실시 양태에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있다:
(I) 줄기세포를 배양하는 단계;
(II) 줄기세포에서 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(III) 상기 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6가 고발현된 경우 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포(후보)인 것으로 판정 및 분류하는 단계.
상기 (I) 단계는, 본 발명에 따라 선별되기 전 상태의 각각의 줄기세포 풀(pool)을 대상으로 이들을 배양하는 단계이다. 당업계에 통상적으로 수행되는 방법이라면, 사용되는 배지 종류(특히 전술한 기본 배지 및 배지에 관한 설명 참조), 배양 온도, 배양 시간 및 배양 조건에 대해서는 특별히 제한되지 않는다.
상기 (II) 단계에서 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 발현수준을 측정하는 것은, 구체적으로 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 의미한다.
상기 단백질 발현 수준 측정은, 당업계에 공지된 측정 방법이라면 본 발명에서 그 종류가 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(flow cytometry) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자 발현 수준 측정은, 당업계에 공지된 측정 방법이라면 본 발명에서 그 종류가 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적 일 실시 양태에서, 상기 유전자 발현 수준의 측정은, 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 일례로, 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (II) 단계에서, 상기 측정은, 상기 (I) 단계에서 배양된 줄기세포 배양물, 또는 (I) 단계의 배양 후 수득한 조건 배지, 또는 (I) 단계에서 배양된 줄기세포의 용해물(lysate) 등을 대상으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, '고효능'이란, 선별되지 않은 줄기세포와 비교하여, 줄기세포의 활성, 또는 신경계질환에 대한 치료 활성이 유의적으로 뛰어남을 모두 포함하는 의미이다. 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 신경세포 보호능, 반응성 아교화 억제능, 염증반응 억제능 또는 신경조직 내 혈관형성능이 유의적으로 뛰어난 것을 의미하는 것일 수 있다.
상기 (III) 단계는 상기 (II) 단계에서 측정된 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 발현수준을 기준(reference, 또는 참조) 집단과 비교하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기준 집단은 바람직하게, 선별되지 않은 줄기세포를 의미할 수 있다.
이에 본 발명의 구체적 일 실시 양태에서, 상기 (III) 단계는 상기 (II) 단계에서 측정된 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 발현수준을 기준(reference, 또는 참조) 집단과 비교하여, 상기 기준 집단에 비해 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 수준이 증가되어 있는 것을 '고발현'되어 있다고 판정하여 이를 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포(후보)인 것으로 판정 및 분류하는 것일 수 있다. 이때 상기 기준 집단과의 비교는, 기준 집단에서 TIMP1, MCP1, GRO-α 및 IL-6의 발현 수준에 대한 컷오프 값과 비교하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 통계 분석 방법에 따른 컷오프 값의 도출 방법은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 컷오프(cut-off)는, ROC 곡선 분석(receiver operating characteristic curve analysis), 선형 또는 비선형 회귀분석방법; 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법; 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 결정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태에 있어서, 상기 본 발명의 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(IV) 상기 (III) 단계에서 분류된 줄기세포에서
신경세포 분화 능력;
신경세포 보호 능력;
염증반응 억제 능력; 및
혈관 재생 능력으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 능력을 보유하는지 여부를 측정하는 단계.
상기 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태에 있어서, 상기 본 발명의 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(IV) 신경계 질환 동물(비-인간 동물) 모델에서 상기 (III) 단계에서 분류된 줄기세포의 상기 신경계 질환 예방 또는 치료 효과를 확인하는 단계.
상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 구체적 일 실시 양태에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있다:
(i) 줄기세포를 배양하는 단계;
(ii) 상기 단계 (i)의 줄기세포 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6 의 단백질 농도를 측정하는 단계; 및
(iii) 상기 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 단백질이 고발현된 경우 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포인 것으로 판정 및 분류하는 단계.
상기 (i) 단계는 전술한 (I) 단계에 관한 설명을 참조로 하여 이해된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 바람직하게 상기 (i) 단계에서 배양 대상이되는 줄기세포의 기준 개수는 cm2 당 8000 개 내지 10000 개 일 수 있으며(즉, 8000 cells/cm2 내지 10000 cells/cm2), 더욱 바람직하게는 cm2 당 8500 개 내지 9500 개 일 수 있다(즉, 8500 cells/cm2 내지 9500 cells/cm2).
본 발명의 일 실시양태에서, 바람직하게 상기 (i) 단계는 DMEM 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지 및 DMEM/F12 배지로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 것을 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 바람직하게 상기 (i) 단계는 35℃ 내지 39℃ 온도에서 배양이 수행되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 36℃ 내지 38℃ 온도에서 배양이 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 바람직하게 상기 (i) 단계는 20 시간 내지 30 시간으로 배양이 수행되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 24 시간 내지 26 시간으로 배양이 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 (ii) 단계는 전술한 (II) 단계에 관한 설명을 참조로 하여 이해된다. 상기 (ii) 단계에서, 측정의 대상이 되는 배양물은 바람직하게 상기 줄기세포를 비포함하는 배양물(더욱 바람직하게는 조건배지)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 (iii)단계는,
상기 (ii) 단계에서 측정된 배양물 내
TIMP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
MCP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
GROα 단백질 농도가 500 pg/mL 이상, 및
IL-6 단백질 농도가 50 pg/mL 이상인 경우
상기 줄기세포가 고효능인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 본 발명은 상기 농도들을 컷오프(cut-off)로 하는 것을 특징으로 한다. 당업자라면, 본원 발명의 상기 컷오프 특징을 참조로 하여, 구체적인 배양 조건을 바꾸었을 때 컷오프 값의 변경 범위를 도출해낼 수 있으므로, 이러한 변경 범위(변경 값) 또한 본원 발명의 범위에 포함됨은 당업자에게 자명하게 이해된다.
상기 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 또 다른 구체적 일 실시 양태에 있어서, 상기 본 발명의 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(iv) 상기 (iii) 단계에서 분류된 줄기세포에서
신경세포 분화 능력;
신경세포 보호 능력;
염증반응 억제 능력; 및
혈관 재생 능력으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 능력을 보유하는지 여부를 측정하는 단계.
상기 고효능 줄기세포 선별 방법에 관한 본 발명의 또 다른 구체적 일 실시 양태에 있어서, 상기 본 발명의 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(iv) 신경계 질환 동물(비-인간 동물) 모델에서 상기 (iii) 단계에서 분류된 줄기세포의 상기 신경계 질환 예방 또는 치료 효과를 확인하는 단계.
또한 본 발명은, 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성능을 생체 외에서 판별할 수 있는 방법으로, 상기 방법은 줄기세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 정도를 측정하여 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
상기 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성능을 생체 외에서 판별할 수 있는 방법에 있어서, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자는, 상기 신경계 질환 치료 활성능이 높은 줄기세포에서 고발현 되는 것을 특징으로 하며, 전술한 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법에 기재한 내용들에 준하여 당업자에게 그 구성이 자명하게 이해된다.
또한 본 발명은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 마커 조성물을 제공한다.
구체적 일 양태로서 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트를 제공한다. 본 발명의 구체적 일 실시양태에서, 본 발명은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 구체적 일 실시양태에서, 본 발명의 상기 키트는, 전술한 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물 또는 키트에서, 상기 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물 또는 키트에서, 상기 상기 유전자 발현 수준 측정은, 당업계에 공지된 수단 또는/및 방법에 이한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제에 의해 측정되는 것일 수 있다. 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 측정 제제들은 주어진 조건에서 이의 확인, 검출, 측정 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.
상기 측정 제제의 확인, 검출, 측정 및 정량은 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.
또한 상기 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트는, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제와 별도로 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 전술한 표지, 이의 검출에 사용되는 물질, 및 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은
(a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계
를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적 일 실시양태에서, 상기 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, 각 유전자에 대한 mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 당업계에 공지된 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 일례로, 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 (a), (b) 및 (c) 단계를 포함하는 스크리닝 방법은, 당업자에게 신경계 질환의 예방제 또는/및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법으로 이해될 수 있다.
따라서 본 발명의 일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험 물질을 후보물질로 판별 또는/및 선별하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (a), (b) 및 (c) 단계를 포함하는 스크리닝 방법은, 당업자에게 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포 보조제(줄기세포 활성 보조제, 줄기세포 활성 촉진용 병용제, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포 활성 촉진제(활성화제))의 스크리닝 방법으로 이해될 수 있다.
따라서 본 발명의 일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계
를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포 보조제(줄기세포 활성 보조제, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포 활성 촉진제(활성화제))의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 전술한 스크리닝 방법들에서, (b) 단계에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준 측정은, 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포를 배양한 배양액 내에서 발현(분비) 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 전술한 스크리닝 방법들에서, 상기 (c) 단계의 '선별'은 전술한 본원 발명의 '신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법'의 각 단계 또는/및 선별 기준(일례로, 컷오프 값 등)을 참조로 하여, 시험물질이 선별되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 실시 양태에서, 바람직하게 상기 (c) 단계의 '선별'은 줄기세포 8000 cells/cm2 내지 10000 cells/cm2를 기준(더욱 바람직하게는 8500 cells/cm2 내지 9500 cells/cm2)으로, 상기 줄기세포에서 분비된 TIMP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상, MCP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상, GROα 단백질 농도가 500 pg/mL 이상, 및 IL-6 단백질 농도가 50 pg/mL 이상으로 증가된 시험물질을 선별하는 것일 수 있다. 본 발명은 상기 농도들을 컷오프(cut-off)로 하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 당업자라면, 본원 발명의 상기 컷오프 특징을 참조로 하여, 구체적인 배양 조건을 바꾸었을 때 컷오프 값의 변경 범위를 도출해낼 수 있으므로, 이러한 변경 범위(변경 값) 또한 본원 발명의 범위에 포함됨은 당업자에게 자명하게 이해된다.
본 발명의 전술한 스크리닝 방법들은 상기 (c) 단계 이후에, 하기 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있으며, 이를 통해 시험물질을 최종적으로 선택할 수 있다:
(d) 신경계 질환 동물(비-인간 동물) 모델에서 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질(예방 또는 치료제 후보물질)의 상기 신경계 질환 예방 또는 치료 효과를 확인하는 단계.
상기 (d) 단계에서 (후보)시험물질은 상기 (a) 단계에서의 줄기세포와 병용투여(복합투여)될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 분리된 줄기세포에 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진 방법을 제공한다.
상기 줄기세포의 활성은, 이에 제한되지 않으나 바람직하게 자가 재생(신경 재생), 신경세포보호능, 신경세포사멸억제능, 혈관내피세포 이동, 혈관형성, 항염증 및 반응성 아교화 억제능으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 '증가 물질'은 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어 증가제, 증진제, 상승제, 활성화제를 모두 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 '단백질 발현 또는 활성 증가'는 해당 단백질의 세포 외 분비 증가를 모두 포함하는 의미이다.
상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은, 이에 제한되지 않으나 바람직한 일례로
TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 1개 이상의 발현벡터(재조합 발현 벡터)일 수 있다.
본 발명의 구체적 일 실시 양태로서, 상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은,
프로모터; 및 이와 작동가능하게 연결된 하기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1개 이상의 발현벡터(재조합 발현 벡터)를 제공한다:
TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명에서 제공되는 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα, 또는 IL-6의 단백질을 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드들은, 모두 1개의 발현 벡터에 탑재(포함)되어 제공되는 것일 수도 있고, 또는 복수 개(일례로 2 내지 4개)의 발현 벡터에 개별적으로 또는 2 이상의 조합으로 탑재(포함)되어 제공되는 것일 수 있다.
상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터, CaMV 35S 프로모터, Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.
한편. 상기 발현벡터는 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포(숙주 세포) 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다. 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다.
또한 본 발명에 적용 가능한 방법으로서, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus), 렌티바이러스(Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다. 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.
또한 본 발명은, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포(줄기세포 치료제), 또는/및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포(줄기세포 치료제), 또는/및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 배양액은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 함유하는 조건배지(conditioned medium)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 '줄기세포치료제'는 당업계에 통상적으로 사용되는 의미로 사용되며, 바람직하게는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 줄기세포의 '투여'는 상기 세포의 '이식'을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서 상기 'TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질 과발현'은 전술한 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질 처리(또는 접촉)에 의해 달성되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 양태에서, 상기 과발현은, 각각 TIMP-1, MCP-1, GROα 또는 IL-6의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 유전자를 세포 내에서 인공적으로 발현시켜 전구체 숙주 세포 내에서 동일한 폴리펩타이드의 발현 수준을 넘어서는 암호화된 폴리펩타이드의 발현의 수준을 생성하도록 하는 과정을 지칭한다. 따라서, 상기 용어가 통상적으로 유전자와 함께 사용될 때, 용어 "과발현" 은, 이의 암호화하는 유전자의 과발현으로부터 생성되는 단백질의 증가된 수준을 지칭하는 단백질과 함께 또한 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 단백질을 암호화하는 유전자의 과발현은, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 카피의 수를 증가시킴으로써 달성된다. 다른 구현예에서, 단백질을 암호화하는 유전자의 과발현은 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 및/또는 번역을 증가시키는 방법으로 프로모터 구역 및/또는 리보솜 결합 부위의 결합력을 증가시킴으로써 달성된다. 다른 구현예에서, 과발현은 유전자의 카피 수를 증가시키고, 프로모터 구역 및/또는 리보솜 결합 부위의 결합력을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 단백질을 암호화하는 유전자의 과발현은, 숙주 세포의 게놈 내에 도입되는 복수의 카피 플라스미드에 존재하는 상응하는 암호화 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 카피의 발현으로부터 발생된다. 다른 구현예에서, 단백질을 암호화하는 유전자의 과발현은, 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 상응하는 암호화 폴리뉴클레오타이드의 2 이상의 카피의 발현으로부터 발생된다.
또한 본 발명은, 분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합제제를 제공한다.
또한 본 발명은, 분리된 줄기세포; 및
TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 혈관형성 유도용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 복합제제를 제공한다.
본 발명에서 용어 '혈관형성 유도용'은 그것이 지칭하는 용도가, 바람직하게 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용을 의미하는 것일 수 있다. 상기 뇌혈관 질환은 뇌의 정상적인 혈액공급 장애에 의해 발생하는 신경 질환(neurologic deficit)으로서, 당업계에 뇌혈관 질환으로 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 뇌경색, 뇌허혈, 뇌졸중, 혈관성 치매, 뇌출혈, 지주막하 출혈 및 백질 이상증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것 일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 분리된 줄기세포와, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질이, 단일 조성물(single composition)의 형태로 제제화되거나 또는 개별적인 조성물(separate composition)의 형태로 제제화될 수 있다. 이들을 제제화하는 방법은 당업계에서 범용되는 공지의 기술을 이용할 수 있다.
상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질은, 분리된 줄기세포와 동시에(simultaneous), 개별적으로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여되는 것일 수 있다.
본원 발명의 유효성분인, 분리된 줄기세포와, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질은, 하나의 의약 제제에 함께 포함되어 동시에 같은 투여부위를 통해 투여될 수 있고; 또는 개별적인 제제로서 제공되어 서로 같은 투여 부위를 통해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있으며; 또는 개별적인 제제로서 제공되어 서로 다른 투여 부위를 통해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
구체적으로 '동시에' 투여란 상기 두 유효성분을 함께 동일한 투여 경로를 통하여 투여하거나, 또는 실질적으로 동일한 시간(예를 들어 투여 시간 간격이 15분 또는 그 이하)에 각각 동일 또는 상이한 투여 경로를 통하여 투여하는 것을 의미하는 것이다. 상기 '개별적으로' 투여란 상기 두 유효 성분을 일정 시간 간격을 두고 동일 또는 상이한 투여 경로를 통하여 투여하는 것을 의미한다. 상기 '순차적으로' 투여란 환자의 질환 상태에 따라 상기 두 유효성분을 일정한 선후 규칙을 가지고 동일 또는 상이한 투여경로를 통하여 투여하는 것을 의미한다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 순서 즉, 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 다양한 경로로 투여될 수 있다. 당업자에게 있어서 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양의 상기 유효성분들만을 포함하거나, 추가적으로 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 유효한 양'이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 신경계 질환을 치료 또는 예방하는데 충분한 양을 의미하는 것이다.
본 발명의 유효성분들인, 분리된 줄기세포와, TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질 발현 또는 활성 증가 물질의 병용비율, 투여용량 및 투여시기는 환자의 통증정도, 약물에 대한 환자의 감수성, 부작용 등을 고려하여 본 발명의 상기 범위 내에서 통상의 기술자가 선택하여 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 유효성분들이 단일제제로 병용 투여가 될 경우에는 1일 투여량의 각 성분의 양을 이용해 배합 비율을 적절하게 선택한 조성물(제제)를 조제하여, 그 배합 제제를 1일에 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다. 일례로 인간 환자에게 투여되는 경우, 본 발명에 따른 조성물의 총 1일 사용량은 의학적 판단 범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 조성물의 분비율, 치료 기간을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액 (Ringer' solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산 에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용 될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴,마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57) 와 같은 기제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 상기"약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 복합 제제는 투여 방법과 투여 경로에 따라, 구성요소인 상기 유효성분들이 하나의 제형에 동시에 포함되도록 제형화될 수도 있고, 상기 각 구성요소가 개별적으로 제형화되어 일일 또는 일회 등의 투여 단위에 따라 하나의 포장에 포함될 수 있다. 개별적으로 제형화된 상기 유효성분들의 제형은 동일할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 약학적 복합 제제의 구체적인 종류와 제형화 방법 및 제형에 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기 약학적 조성물에서 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질 또는 조성물을 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 복합 제제의 구성요소로서 상기 유효성분들은 동시에 또는 개별적으로 또는 정해진 순서에 따라(순차적으로) 투여할 수 있다. 상기 복합 제제는 일일 투여량이 일회 투여량에 모두 포함되도록 제형화될 수 있지만, 하루에 2, 3, 4회 등으로 나누어 투여하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 복합 제제의 바람직한 투여량은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다. 약학적 유효성분의 생물학적 이용가능성(bioavailability)은 개인차가 있기 때문에 본 발명의 약학적 제제 투여 초기에는 당업계에 알려져 있는 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 등에 기반한 어세이로 각 약물의 혈중 농도를 확인하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '예방'이란 본 발명의 대상 질환(본 발명에서, 신경계 질환) 발병 전에 선제적으로 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 본 발명의 대상 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '치료'란 본 발명의 대상 질환(본 발명에서, 신경계 질환) 발병 후에 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 본 발명의 대상 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 '개선'이란 본 발명에서 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 '개체(대상체)'란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고(이에 제한되지 않으나, 본 발명에서는 일례로 바람직하게 뇌신경세포 손상 억제 및 뇌 내 혈관형성 유도를 필요로 하는 대상을 의미할 수 있다), 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 포유류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명에 따라 선별 분리된 신경줄기세포 조건배지 수득, 싸이토카인 분석 및 액체 크로마트 그래피 분석(cytokine array analysis and LC/MS/MS analysis)
1-1. 신경줄기세포 배양 및 조건배지(conditioned media) 확보
성체 인간 뇌조직(국소겉질이상 IIIa형 기증자의 병변이 없는 측두엽 조직)으로부터 신경줄기세포를 분리 배양하였다. 먼저, 수술 표본을 기계로 잘게 절삭한 다음, 이를 papain (10 unit/ml, Sigma), DNase I (0.1 mg/ml, Roche), 및 D,L-cysteine (4 mg/ml, Sigma)을 함유하고 있는 효소 혼합액으로 37℃에서 15~30분동안 처리하였다. 그 후 약하게 분쇄과정을 거친 후, cell strainer (40 μm, BD Biosciences)를 이용하여 여과하였다. Percoll 정제 후, poly-L-ornithine (PLO)-코팅된 디쉬에, 1% B27(Invitrogen), 1% penicillin/streptomycin cocktail (Invitrogen), EGF(50 ng/ml, R&D Systems), bFGF (50 ng/ml, R&D Systems) 및 0.5% FBS(Invitrogen)를 포함하는 DMEM/F12 배지를 이용하여 부착배양(adherent culture) 하였다. 그 후, accutase(PAA Laboratories, Austria)를 사용하여 confluence 80%로 계대 배양하였다. 상기와 같은 방법으로 다양한 신경줄기세포주 풀(pool)의 여러가지 human neural stem cell line(신경줄기세포주)를 수득하였다.
냉동보관하고 있던 신경줄기세포를 해동한 후, cm2당 6,000개의 세포를, 20 mL의 증식배지(FBS(0.1 ml) B-27TM supplement[Xenofree; Gibco (A14867-01)](0.4 ml), N-2 supplement[Gibco (17502-048)](0.2 ml), hEGF(1 μl), hbFGF2(1 μl) 및 Gentamicin(10 μl)을 함유하는 DMEM/F12 [Gibco (11330-032)] 배지)가 담긴 T75 Flask에 접종하였다. T75 Flask에서 상기 신경줄기세포를 Confluence 80% - 90% 도달 시까지 배양한 다음, PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 그 후 트립신/EDTA를 이용하여 세포를 부유하고, 세포 숫자를 측정한 다음, cm2당 9,000개의 세포를 증식배지가 담긴 T175 Flask에 분주하여 계대 배양을 수행하였다(CO2 incubator [Thermofisher(HERACELL VIOS 160i)], 37.0 ℃, 5% CO2). 세포 계대 배양으로부터 48시간 후, 수득된 배양액을 Gentamicin을 포함하는 기본배지 DMEM/F12[Gibco (11330-032)]로 교체한 후 24시간 동안 배양기에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 배양액을 전량 수집하여 50 ml 튜브로 옮기고 300 RCF로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 따서 새로운 튜브로 옮겨준 후, 이를 조건배지(conditioned media)로 사용하였다.
1-2. 사이토카인 분석 및 액체 크로마토그래피 분석
조건배지 내의 분비단백질을 확인(즉, 단백질 발현을 확인)하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 수득한 줄기세포 조건배지를 이용하여 사이토카인 분석을 실시하였다. R&D Proteome Profiler Human XL cytokine array KIT와 Raybio사의 human cytokine array kit를 이용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다.
또한 조건배지 내 효력 인자를 교차 검증하기 위해 단백질 정량을 기본으로한 액체 크로마토그래피 분석을 이바이오젠 회사(ebiogen Inc., korea)에 위탁하여 분석을 수행하였다. 분석과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. 먼저 조건배지 시료의 프로테오믹스 분석을 위해, UPLC-Exactive 장비를 이용하여 3개의 시료를 이용하여 총 3 번 run의 분석을 진행하였다. 데이터 분석을 위해 각 시료 별 LC-MS/MS 데이터를 Proteome Discoverer를 이용하여 분석하였고, 데이터베이스는 Uniprot의 human database를 사용하였다. Modification은 Oxidation(M), Carbamyl(N-term), Carbamidomethyl(C) 추가 분석하였으며 동정된 단백질 중 Con(Contaminants), Rev(Reverse) sequences는 필터링을 통해 분석을 수행하였다.
도 1에 간략히 나타낸 바와 같이, 사이토카인 분석을 통해 상기 조건 배지 내에 120여 개의 사이토카인들의 발현 정도를 확인하였고, LC-MS/MS 분석을 통해 약 496여 개의 단백질들이 존재하는 것으로 확인되었다. 무수한 시행착오 끝에, 본 발명자들은 조건배지 내 공통적으로 분포하는 여러가지 수많은 물질들 중에서도 MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6의 효력 인자를 최종적으로 선별하는데 성공하였다.
이하의 실시예를 통해, 신경줄기세포를 이용하는 본 발명에서 상기 MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6의 4개 인자의 특이적 조합 및 이들 인자들을 기준으로 선별된 신경줄기세포의 특이적인 우수한 치료 효과(신경계 질환의 예방 또는 치료 효과)를 구체적으로 개시한다.
1-3. 본 발명에 따른 신경계 질환 치료용 고효능 신경줄기세포 선별
본 발명에 따라, 실시예 1-1에서 수득한 다양한 신경줄기세포주 풀(pool)의 여러가지 human neural stem cell line(신경줄기세포주)으로부터 수득한 줄기세포 조건배지에서, TIMP-1(서열번호 1), MCP-1(서열번호 2), GROα(서열번호 3) 및 IL-6(서열번호 4) 단백질 농도를 측정하여, 상기 4가지 인자들이 고농도로 함유되어 있는 신경줄기세포를 선별하였다.
구체적인 방법은 다음과 같다. 먼저, cm2당 9,000개(즉, 9,000 cells/cm2)의 신경줄기세포(다양한 신경줄기세포주 풀(pool)의 여러가지 human neural stem cell line)를, 0.05 % Gentamicin을 포함하는 DMEM/F12[Gibco (11330-032)] 기본배지 35 ml이 들어 있는 T175 Flask에 분주(seeding)하고, 24시간 동안 배양기에서 배양하였다(CO2 incubator [Thermofisher(HERACELL VIOS 160i)], 37.0 ℃, 5% CO2). 24시간 배양 후, 배양액을 전량 수집하여 50ml 튜브로 옮기고 300 RCF로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 따서 새로운 튜브로 옮겨준 후, 이를 조건배지(conditioned media)로 사용하였다.
상기 조건 배지에서, TIMP-1(서열번호 1), MCP-1(서열번호 2), GROα(서열번호 3) 및 IL-6(서열번호 4) 단백질의 농도(단백질량)를 효소결합면역흡착검사(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, 이하 ELISA) 방법으로 정량적으로 측정하였다. ELISA는, 단백질량을 측정하기 위해, 항체나 항원에 효소를 마커로서 표지하여 효소의 활성을 측정함으로써 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법이다. 상기 ELISA시험은 각각 Human MCP-1 Quantikine ELISA (R&D 社, Cat no. DCP00), Human TIMP-1 Quantikine ELISA (R&D 社 , Cat no. DTM100), Human CXCL1/GROα DuoSet ELISA (R&D 社, Cat no. DY275-05), Human IL-6 DuoSet ELISA (R&D 社, Cat no. DY970-05) 키트를 이용하여, 각 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
상기 조건 배지에서 측정된 4가지 단백질 농도가, TIMP-1 농도가 6,000 pg/mL 이상이고, MCP-1 농도가 6,000 pg/mL 이상이며, GROα 농도가 500 pg/mL 이상이고, IL-6 농도가 50 pg/mL 이상인 것을 동시에 만족하는 경우에, 해당 조건 배지를 수득한 줄기세포(즉, 상기 4개 인자 단백질을 발현하는 줄기세포)를 고효능 신경줄기세포로 규명 및 선별하였다.
상기 방법으로 NSC #1, NSC #2 및 NSC #3 cell line을 고효능 신경줄기세포로 선별해내었다. 각각 NSC #1, NSC #2 또는 NSC #3의 신경줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 조건배지를 3 lot을 만들었다. 이들을 이하의 실험에서 사용하였다.
실시예 2. In vitro 뇌졸중 모델의 제작
2-1. Rat으로부터 1차 피질신경세포(primary cortical neuron cell)의 분리 및 배양
Pregnant rat(E18, 오리엔트바이오)을 CO2 가스를 이용하여 안락사 시킨 후, 수술용 가위를 이용해 제왕절개를 통해 배아(embryo)를 꺼냈다. 태반낭(placenta sacs)에서 배아(embryo)를 꺼낸 후, 배아 두개골(embryo skull)을 포셉을 이용해 제거하고, 뇌줄기(brainstem)와 소뇌(cerebella) 조직을 현미경 하에서 제거하였다. 각각의 뇌 반구를 덮고 있는 뇌척수막을 제거한 후, 해마(hippocampus)를 제거하여 대뇌피질조직(cortical tissue)만을 수득한 다음, 1X HBSS 10 ml을 넣고, 10 ml Serological pipette을 이용하여 파이펫팅(Pipetting)하여 조직을 잘게 부수었다(chopping). 원심분리기를 이용해 조직을 침전시킨 후, 상층액을 제거하였다. 여기에 1X HBSS 3 ml을 넣고 파이펫팅(pipetting)한 후, Tripsin-EDTA를 넣어 다시 파이펫팅한 다음, 37℃의 water bath에 2분동안 넣어두었다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, DMEM(FBS10%, P/S 1%)으로 현탁(suspension)한 후, 50 ml conical tube에 여과기(strainer)를 장착하고 단일세포(single cell)로 분리하였다. 분리한 세포수를 계수(counting)한 후, 1 X 105 cells/well 세포를 DMEM(FBS 10%, P/S 1%)을 넣어 놓은 PDL-coating plate에 분주하였다. 4시간 뒤에 complete cortical neuron culture media(B27 Supplement (50X)[Serum Free, Gibco　(17504-044)](2 %), L-Glutamine, Penicillin/Streptomycin(P/S, 1 %)이 포함된 Neurobasal Media[Gibco (21103-049)]))로 half media change를 해준다음, 다시 12시간 뒤에 Complete Cortical Neuron Culture Media로 Half Media Change 해주는 과정을 거친 후, 3일동안 하루에 한번 전체 배지 교환을 진행하면서 세포를 배양하였다.
2-2. In vitro 뇌졸중 모델 제작(OGD 손상 조건)
상기 실시예 2-1에서 분리한 뇌신경세포를 96-well plate에 분주(seeding)한 후, 증식 배지를 이용하여 7일간 배양을 통해 신경세포로 성장시켰다. 그 후, glucose가 첨가되지 않은 배지를 넣어 준 다음 1 % 저산소조건(oxygne, glucose deprivation; OGD) 하에서 1시간 동안 노출시킴으로써, 뇌졸중의 in vitro 모델을 구축하였다.
실시예 3. In vitro 뇌졸중 모델에서, 신경줄기세포 조건배지 처리에 따른 신경세포 보호능 분석
본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 조건배지 처리에 따른 in vitro 신경세포 사멸억제 효과를 분석하였다. 구제척으로, 상기 실시예 2-2에서 구축한 뇌졸중의 in vitro 모델에, 상기 실시예 1-3에서 수득한 신경줄기세포 조건배지를 처리한 후, MTT 분석을 통하여 신경세포 생존율을 측정하였다. 대조군으로서, OGD처리를 하지 않은 증식배지(GM, Growth media, 100 μl)를 양성 대조군으로 사용하였고 실시예 1-1에 기재한 것과 동일한 기본배지(IM, Incomplete media, 100 μl), 상기 실시예 1-3에서 선별된 3 lot의 신경줄기세포로부터 수득한 조건배지(CM, conditioned media, 각 100 μl)를 이용하여 분석을 수행하였다.
먼저, 실시예 2-2에서 구축한 뇌졸중의 in vitro 모델(OGD 유도한 세포)의 Plate에, 각 대조군 및 실험군별로 대상 시험물질을 처리한 후, MTT Solution(Sigma (M5655))을 0.5 mg/ml로 처리하였다. 1시간 동안 Incubator에 배양하면서 Formazan이 형성되는 것을 현미경으로 확인하였다. Media를 제거하고, DMSO 100 μl를 각 Well에 처리 후, 30분동안 Formazan을 37℃, 5% CO2 Incubator에서 녹였다. Microplate Spectrometer(X-MARK Microplate Absorbance Spectrophotometer [Bio-rad (168-1150)])에 Plate를 넣고 570nm 파장으로 O.D 값을 측정하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 신경세포(PC, positive control)에 비하여 뇌졸중 in vitro 모델에서는(NC, negative control) OGD 유발로 인하여 신경세포의 사멸이 유의하게 증가하였다. 반면에 OGD 손상 조건 하에 각각 3 lot의 신경줄기세포 조건배지를 처리한 군에서는 신경세포 사멸이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
이를 통해 신경줄기세포에서 분비되는 단백질에 의해 신경세포 보호 효과가 우수하게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 4. In vitro 뇌졸중 모델에서, 신경줄기세포 조건배지 내 효력인자 중화항체 처리에 다른 신경세포 보호능 변화 분석
상기 실시예 3에서 확인된, 뇌졸중의 in vitro 모델(OGD 유도한 조건)에서 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 조건배지에 의한 신경세포 보호효과가, 본 발명의 4개 조합 효력인자에 의해 조절되는지를 확인하기 위하여, 뇌졸중의 in vitro 모델인 OGD 손상 유도 1h 후에, 대조군 및 실험군별로 IM(기본배지, 100 μl), CM(조건배지, 100 μl), CM + 각 인자의 중화항체(10 μg/mL, 100 μl)를 각각 처리하여 24시간 동안 Incubation을 진행한 후에, MTT분석(실시예 3과 같은 방법)을 이용하여 신경세포 보호능을 분석하였다.
본 실험에서 사용된 각 인자에 대한 중화항체 정보는 다음과 같다: MCP-1 Ab[Santa cruz (sc-32771)], TIMP1-1 Ab [Santa cruz (sc-21734)], GROα Ab [Santa cruz (sc-514065)], IL-6 Ab [Santa cruz (sc-57315)].
실험 결과, 정상세포(control)와 비교하여, 음성 대조군인 OGD에 의해 유도된 in vitro 뇌졸중 모델에서(OGD+IM) 세포사멸이 증가하였고, 조건배지(OGD+CM)처리 군에서 세포사멸이 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 조건배지에 MCP-1, TIMP-1, GROα 또는 IL-6에 대한 각각의 중화항체 10 μg/well을 pre-incubation 한 후, 신경세포에 처리하였을 때, 조건배지에 의한 신경세포 사멸 억제 효과(즉, 신경세포 보호능)가 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).
특히, MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6 중에서 어느 한가지 인자만 중화항체로 억제시키더라도, 음성 대조군(OGD+IM) 보다 세포사멸 정도가 크거나 음성대조군과 유사한 수준으로 세포사멸이 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 3a 및 도 3b). 즉, 상기 4가지 인자 중 하나라도 없으면 신경세포 보호능(신경세포 사멸 억제 효과)이 실질적으로 상실되었다. 이를 통해 본 발명의 4가지 인자 조합(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)이 반드시 동시에 있어야만 함을 검증하였다.
실시예 5. In vitro 척수손상 모델에서, 신경줄기세포 조건배지 처리에 따른 신경세포 사멸억제 효과(신경세포 보호능) 분석
상기 실시예 3에서 in vitro 뇌졸중 모델에 신경줄기세포 조건배지를 처리한 결과와 비교하여, 척수손상의 2차적 손상 요인으로 알려진 ROS(reactive oxygen species)에 의한 세포사멸에 대하여 조건배지 처리를 통한 척수신경세포의 생존 효과를 다음과 같이 확인하였다.
5-1. Rat으로부터 1차 척수신경세포(primary spinal cord neuron, motor neuron)의 분리 및 배양
Pregnant rat(E15, 오리엔트바이오)를 CO2 가스를 이용하여 안락사 시킨 후, 수술용 가위를 이용해 제왕절개를 통해 배아(embryo)를 꺼냈다. 태반낭(placenta sacs)에서 배아(embryo)를 꺼낸 후, 포셉으로 배아(embryo)의 몸을 고정시키고, 트위저(tweezers)로 척수(spinal cord) 부분의 외피를 제거하였다. 외피가 제거된 Rat 몸체로부터, 척수를 조심스럽게 분리한 다음, 척수를 감싸고 있는 뇌척수막(meninges)과 등쪽뿌리신경절(dorsal root ganglia)를 제거하여, 순수한 척수만을 15 ml 1X HBS가 담긴 코니칼 튜브(conical tube)로 옮겼다. 원심분리기를 이용해 조직을 침전시킨 후, 상층액을 제거하였다. 여기에 10 ml 1X HBSS을 넣고 파이펫팅(pipetting)한 후 원심분리를 수행하였다. 상층액을 제거한 후, 다시 3 ml 1X HBSS를 넣고 파이펫팅 한 후, Tripsin-EDTA를 넣어 파이펫팅 한 다음, 37℃의 water bath에 2분동안 넣어두었다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, DMEM(FBS 10%, P/S 1%)으로 현탁(suspension)해준 후, 70 μm 여과기(strainer)가 장착된 50 mL Conical Tube를 이용하여 단일세포(single cell)로 분리하였다. 분리한 세포를 계수(counting)한 후 plate에 세포를 분주(seeding)하고, 최소 2시간 경과 후 세포가 plate에 부착되었음을 확인하였다. 이후 Complete Motor Neuron Culture Media로 Half Media Change를 해주고 3일 동안 하루에 한번 Half Media Change를 진행하였다. 이후 3일에 한번 Whole Media Change를 진행하였다.
5-2. H 2 O 2 에 의해 유도된 in vitro 척수손상 모델의 제작, 및 신경줄기세포 조건배지 처리에 따른 척수신경세포 사멸억제효과(척수신경세포 보호능) 분석
상기 실시예 5-1에서 분리한 척수신경세포에, 척수손상의 2차 인자인 ROS(H2O2, Hydrogen peroxide 0.1 mM 처리)를 1 시간 처리하여, in vitro 척수손상 모델을 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5-1에서 분리한 척수신경세포를 GM(증식배지)에서 증식시킨 후, H2O2(Hydrogen peroxide) 0.1 mM을 포함하는 IM(기본배지)로 교체하여 1시간 동안 처리하여, in vitro 척수손상 모델을 제작하였다.
여기에 대조군으로서 새로운 Media인 IM(기본배지) 또는 실험군인CM (실시예 1-3에서 수득한 신경줄기세포 조건배지)을 처리하고 6시간 후에, MTT 방법을 통해서 척수신경세포 사멸억제효과(척수신경세포 보호능)를 분석하였다. MTT 분석은 상기 실시예 3에 기재한 것과 동일한 방식으로 수행되었다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상 신경세포(PC, positive control)에 비하여 H2O2처리에 의한 척수손상 조건(NC, negative control)에서 신경세포의 사멸이 유의하게 증가하는 반면, H2O2처리에 의한 척수손상 조건 하에 본 발명에 따른 신경줄기세포 조건배지를 처리한 군에서는 신경세포 사멸이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
이를 통해 신경줄기세포에서 분비되는 단백질에 의해 뇌 신경세포뿐 아니라 척수 신경세포 보호 효과에도 우수하다는 것을 확인하였다.
실시예 6. In vitro 척수손상 모델에서, 신경줄기세포 조건배지 내 효력인자 중화항체 처리에 따른 신경세포 보호능 변화 분석
상기 실시예 5-2에서 확인된 조건배지에 의한 척수신경세포 보호효과가 본 발명의 4개 조합 후보 효력인자에 의해 조절되는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 각 인자의 중화항체를 조건배지에 처리하여, 실시예 5-2와 같은 방법으로 척수 신경세포의 세포사멸 효과 변화를 관찰하였다.
이때 일반적인 IgG 처리(10 μg/ml, IgG [Santa cruz (sc-2025)]) 결과와도 비교하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, H2O2에 의해 유도된 ROS척수손상 in vitro 모델에서(IM + H2O2)에서 정상세포군(PC)에 비해 척수신경세포 사멸이 증가하는 반면, 본 발명에 따른 신경줄기세포 조건배지 처리군(CM, 4개 인자가 모두 포함되어 있음)에서는 세포사멸이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 조건배지에 MCP-1, TIMP-1, GROα 또는 IL-6에 대한 각각의 중화항체를 pre-incubation 한 후 척수 신경세포에 처리하였을 때, 조건배지에 의한 척수 신경세포 사멸 억제 효과가 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 5a 및 도 5b). 특히, MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6 중에서 어느 한가지 인자만 중화항체로 억제시키더라도, 음성 대조군(IM)과 유사한 정도의 세포사멸 현상을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b). 이를 통해 본 발명의 4가지 인자 조합(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)이 조건배지에서 척수신경세포 사멸을 억제하는데 중요한 역할을 함을 확인 검증하였다.
실시예 7. 혈관내피세포에 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관세포 이동능력 효과
혈관신생(angiogenesis)에 있어서, 내피세포의 이동은 혈관을 형성하는 진행단계에 필수적인 과정으로, 혈관을 둘러싸고 있는 세포외기질 성분의 분해와 함께 일어나게 된다. HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 이용하여, Wound-healing assay 방법으로, 상기 실시예 1-3에서 수득한 신경줄기세포 조건배지에 의한 혈관내피세포의 이동능력 변화를 분석하였다. Growth Medium 2 Supplement Mix [PromoCell (C-39216), 2.5 %] 및 Penicilin-Streptomycin (P/S, 1 %)이 포함된 Endothelial Cell Growth Medium 2[PromoCell (C-22211)] 증식배지를 이용하여, HUVEC을 12-well plate에 분주(seeding)하고, 5 % CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 16시간 동안 배양하였다. Confluence 90 %로 증식시킨 후, suction system을 이용하여 상층액을 제거한 뒤, 2 ml의 IM(Incomplete Media, Penicilin-Streptomycin (P/S, 1 %)이 포함된 Endothelial Cell Growth Medium 2[PromoCell (C-22211)])를 넣어 7시간 동안 세포를 굶주린 상태(cell starvation, 세포 영양결핍 상태)로 만들었다. 200p tip을 이용하여 well 당 십자 모양(cross shape)으로 스크래치를 내준 다음, suction system을 이용하여 상층액을 제거하고, well 당 1.5 mL의 CM(조건배지)으로 교체한 후, 십자 모양(cross shape)의 가운데를 중심으로 상하좌우로 현미경으로 사진을 찍어주었다. 17시간 뒤에 최초에 찍은 위치와 같은 부분에 대하여 사진을 찍은 후, 스크래치 경계선 간의 거리를 계산해 주고, 0시간과 17시간의 거리의 차이를 퍼센트로 환산하여 그래프로 정리하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에서 나타낸 바와 같이, IM(NC)과 비교하여 신경줄기세포 조건배지를 처리한 군(3 lot 반복 실험)에서 혈관내피세포의 이동이 유의적으로 현저히 증가함을 확인 검증하였다.
실시예 8. 혈관내피세포에 신경줄기세포 조건배지 내 효력인자 중화항체 처리에 따른, 혈관세포 이동 억제 능력 변화 분석
상기 실시예 7에서 확인된 조건배지에 의한 혈관내피세포(HUVEC) 이동 증가 효과가, 본 발명의 4개 조합 효력인자에 의해 조절되는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 각 인자의 중화항체를 조건배지에 처리하여, 실시예 7 같은 방법으로 혈관내피세포의 이동능력 변화를 분석하였다.
그 결과 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, MCP-1, TIMP-1, GROα 또는 IL-6에 대한 각각의 중화항체를 조건배지에 처리하자, 혈관내피세포의 이동능이 조건배지를 처리한 군(CM)과 비교하여 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 즉, 상기 4가지 인자 중 하나라도 없으면 혈관내피세포의 이동능력이 실질적으로 상실되었다. 이를 통해 본 발명의 4가지 인자 조합(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)이 반드시 동시에 있어야만 함을 검증하였다.
실시예 9. 혈관내피세포에 신경줄기세포 조건배지 처리에 의한 혈관세포 관형성 능력 평가
넓은 의미의 혈관신생(angiogenesis)은 혈관이 새로 생성되는 일련의 과정을 말하며, 기존의 혈관을 구성하는 세포가 증식 및 이동하여 새로운 관을 만듦으로써 영양분과 혈액을 공급하는 중요한 역할을 수행하게 된다. 이는 손상된 조직의 재생에도 밀접한 관계가 있어 전체적으로 치료효능을 평가하는데 중요한 지표로서의 적용이 가능하다. 이에 신경줄기세포에서 분비되는 단백질에 의한 혈관세포의 관형성능을 확인하기 위해, 신경줄기세포 조건배지를 혈관내피세포에 처리하여 관형성이 증가될 수 있는지 확인하였다.
신경줄기세포 조건배지에 의한 혈관내피세포 관형성능력을 평가하기 위해, 메트리겔(Matrigel)을 이용하였다. 메트리겔을 코팅한 96-well plate에 1x104 개HUVEC 세포를 배양배지에 혼합한 후 분주하였다. 10분 뒤 세포 부착유무를 확인하고, 배양배지를 IM(Incomplete Media)으로 교체하여 2시간동안 세포를 굶주린 상태로 만들었다. CM(조건배지)으로 교체한 후, 현미경 사진을 찍었다(0h). 20시간 뒤에 각각 현미경 사진을 찍은 후, 이미지 제이(image J)프로그램을 이용하여, 형성된 관의 전체 길이를 확인하여 평균 및 표준편차를 구한 뒤 그래프로 정리하였다.
그 결과 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신경줄기세포 조건배지를 처리하였을 때 혈관내피세포의 관형성 능력이 현저히 증진되었음을 확인하였다.
실시예 10. 혈관내피세포에서, 신경줄기세포 조건배지 내 효력인자 중화항체 처리에 따른 혈관세포 관 형성 능력 변화 분석
상기 실시예 9에서 확인된 조건배지에 의한 혈관내피세포 관형성 증가 효과가, 본 발명의 4개 조합 효력인자에 의해 조절될 수 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 4와 동일한 방법으로 각 인자의 중화항체를 조건배지에 처리하여, 실시예 9와 동일한 방법으로 혈관내피세포의 관형성 능력의 변화를 관찰하였다.
그 결과 도 10a및 도 10b에 나타낸 바와 같이, 조건배지를 처리한 군(CM)과 비교하여, 특히 TIMP-1, GROα, IL-6 중화항체를 조건배지에 처리한 군에서 혈관내피세포의 관형성능력이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.
종합하여, 본 발명의 4가지 인자 조합(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)이 혈관내피세포의 이동능력을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하고, 이들은 혈관내피세포의 관형성 능력을 증진시킬 수 있음을 확인 및 검증하였다(특히 TIMP-1, GROα 및 IL-6). 즉, 상기 4가지 인자 중 하나라도 없으면 혈관내피세포의 이동능력이 현저히 저하되므로, 이를 통해 본 발명의 4가지 인자 조합(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)이 반드시 동시에 있어야만 함을 검증하였다. 이러한 결과들은 손상된 신경조직의 재생과 보호에 중요한 역할을 수행하는 효력인자로써의 효과를 확인한 결과이다.
실시예 11. In vivo 척수손상 동물모델에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 행동개선 평가
In vivo 척수손상 동물모델에서 신경줄기세포 주입에 따른 행동학적 평가를 위해, 다음과 같은 방법으로 척수손상 모델을 제작하여 시험을 수행하였다. 약 50 ml Isoflurane과 산소(O2)를 혼합하여 10주령 랫드(Rat)를 호흡마취 시킨 후, 흉추(thoracic vertebra) 8~10 번의 척추를 노출시킨 뒤, 척추에 붙은 근육을 분리하고, 9번의 척추궁을 제거하기 위해 후 후궁 절제술(laminectomy)을 실시하였다. 그 다음 임팩터(impactor)를 이용하여 척수(spinal cord)의 등측 경막(dorsal dura mater)에 하중을 가하여 척수손상 모델을 제작하였다. 7일 후, 척수손상 모델에 부형제 대조군(G1) 또는 1 x 106(G3), 3 x 106(G2) 개의 신경줄기세포(본 발명에 따라 선별한 고효능 신경줄기세포)를 척수강을 통해 이식해 주었다. 신경줄기세포 주입 후, 일주마다 신경학적 행동평가 및 신경병증성 통증평가를 진행하였다. 신경학적 행동평가를 위하여, BBB 스코어 테스트(Basso, Beattie and Bresnahan score test) 및 로타-로드 테스트(rota-rod test)를 수행하였고, 신경병증성 통증평가를 위하여 폰 프레이 테스트(von Frey test)를 수행하였다.
구체적으로 BBB 스코어 테스트는 시험물질 투여개시 전 및 그 이후에는 1회/주 간격으로 총 7회 BBB test를 실시하였고, 시험에 대한 판독은 DM Basso 등이 평가한 방법을 토대로 점수화 하였다(J Neurotrauma. 1995 Feb;12(1):1- 21).
로타-로드 테스트는 시험물질 투여개시 전 및 그 이후에는 1 회/주 간격으로 총 7 회, Rotarod latency test를 실시하였다. 동물을 Rotarod-treadmill (JD-A-07RA5, B.S Technolab Inc., Korea)에 조심스럽게 동물을 위치하게 한 후, 회전 속도를 4 rpm 부터 시작하여 300 초간 40 rpm까지 일정한 간격으로 증가시키도록 설정한 뒤, 동물이 균형을 잃고 바닥에 떨어질 때까지의 시간을 초(second) 단위로 측정하였다. 동물이 바닥에 떨어질 경우, Rotarod-treadmill 바닥에 위치한 감지기를 이용하여 자동적으로 시간을 측정할 수 있도록 하였다. 모든 동물에 대하여 1 회를 측정한 뒤, 다시 1 회씩 측정을 진행하여, 총 3 회 측정한 뒤, 평균값을 시험에 사용하였다
폰 프레이 테스트는 시험물질 투여개시 전 및 그 이후에는 1 회/주 간격으로 총 7 회, von Frey test를 실시하였다. 바닥에 가는 철망이 깔린 플라스틱 상자에 넣어 환경에 적응할 수 있도록 안정시킨 후, von Frey filament를 이용한 기계적 자극에 의한 회피 반응을 이용하여 통증 수준을 평가하였다. 철사상자 바닥의 구멍을 통하여 동물의 발바닥에 von Frey filament를 이용한 기계적 자극을 가하여 발을 날카롭게 회피하거나, 털거나, 필라멘트 자극에 대하여 움찔할(flinching) 때를 양성 반응으로 한정하고 그 때의 filament 강도를 측정하였다. 정확한 측정을 위하여 von Frey filament가 구부러지는 순간까지 약 3-5초 이내에 압력을 가하였다. filament는 0.6 g부터 시작하여 1, 1.4, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 26, 60, 100, 180, 300 g 순서로 filament 강도를 증가시키며 양성 반응을 보일때까지 실시하였다. 모든 동물에 대하여 1 회를 측정한 뒤, 다시 1 회씩 측정을 진행하여, 총 3 회 측정한 뒤 평균값을 시험에 사용하였다.
도 11a및 도 11b에 나타낸 바와 같이, BBB 행동스코어 테스트와 운동능력을 평가하는 rota-rod테스트 결과, 부형제 대조군(G1)과 비교하여 본 발명에 의해 선별된 고효능 신경줄기세포를 주입한 G2, G3 군에서 행동이 현저히 개선됨을 확인하였으며, 신경줄기세포를 이식하고 5주 이후에는 이러한 효과 차이가 더욱 극명하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한 도 11c에 나타낸 바와 같이, 신경병증성 통증평가(von Frey test) 에서는 본 발명에 의해 선별된 고효능 신경줄기세포를 이식한 G2, G3 군에서 이식 일주일 후부터 유의적인 결과를 보이며, 통증 개선에 현저한 효과를 나타냈다.
결과적으로 본 발명에 의해 선별된 신경줄기세포가 척수손상으로 인한 행동학적 장애를 개선시킬 수 있음을 확인 및 검증하였다. 하지만 신경줄기세포의 주입(이식) 개수 증가에 따른 G2와 G3 그룹간의 유의성은 보이지 않았다.
실시예 12. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 뇌조직 수축(손상) 정도 감소 효과 확인
본 발명에 의해 선별된 신경줄기세포를 in vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델에 주입하였을 때, 상기 질환의 치료 효과 및 뇌손상 조직의 개선 정도를 평가하기 위해 다음과 같이 시험을 수행하였다.
12-1. MCAO 허혈성 뇌졸중 동물모델 구축
8주령 랫드(Sprague-Dawely (SD) Rat)를 아이소프로란(isoflurane)과 산소를 혼합하여 호흡마취를 시킨 후, 목 안쪽의 피부가 드러나도록 면도를 해주었다. 알콜거즈를 이용하여 소독 후, 목 중간선(neck midline)의 피부를 수술용 가위(operating scissors)를 이용하여 3 cm 절개하였다. 침샘을 기관(trachea) 방향으로 고정시킨 후 CCA(common carotid artery, 총경동맥), ECA(external carotid artery, 외경동맥) 및 ICA(internal carotid artery, 내경동맥)가 드러나도록 크라일 포셉(Curved Crile forceps)를 이용하여 근육조직을 잡았다. 아이리스 포셉(Curved Iris forceps)을 이용하여 CCA를 드러낸 후 여기에 실크 봉합사(silk suture)로 고리를 걸어주었다. 동일한 방법으로 ECA와 ICA를 드러낸 후 수처로 고리를 걸고, ICA를 제외한 CCA와 ECA의 고리를 묶어 고정시켰다. 주사기를 이용하여 CCA와 ECA, ICA가 만나는 분기점 중앙에 구멍을 뚫은 다음, 실리콘이 코팅되어 있는 MCAO 수처를 CCA분기점으로부터 ICA 방향으로 넣은 후 MCAO 수처와 함께 ICA를 묶어주었다. 침샘을 제자리에 위치시키고 절개된 피부를 봉합하였다. 이러한 방법으로 폐색 처리 1시간이 지난 후, 전술한 바와 동일한 방법으로 호흡마취 후 CCA, ECA 및 ICA를 드러낸 다음, 고정되어 있던 고리를 풀어주고, 삽입되어 있던 MCAO 수처를 제거하여 재관류하였다. 지혈을 한 후, 피부를 봉합하였다. 재관류 하루 뒤에, 신경학적 증상을 확인하여 뇌경색 여부를 확인하였다.
12-2. 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입 후, MCAO 허혈성 뇌졸중 질환 치료 효과 확인 실험 방법
상기 실시예 12-1과 같이 MCAO 허혈성 뇌졸중 동물모델 제작 7일 후에, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 5 x 105 개를 뇌실 내에 이식해 주었다. 상기 동물모델에 대하여 신경학적 행동평가, 및 조직분석을 수행한 실험 프로토콜의 간략한 타임라인(time line)을 도 12a에 나타냈었다. Control(Wild type 정상 랫드), MCAO+HBSS(Hanks balanced salt solution, 20 μL 1 x HBSS), MCAO+NSC(본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포, 5 x 105 volumes suspended in 20 μL 1 x HBSS) 세 그룹에 대하여, MCAO 수술 일주일 전, HBSS 또는 NSC 이식 일주일 전, 이식 1주, 2주, 3주 및4주 후에 신경학적 행동 평가를 진행하였다. 이식 후 1일, 14일, 28일차에 세 그룹을 부검하고 조직 샘플 제작 후, 면역조직화학염색, 면역형광염색(IF)을 수행하였고, 28일차에는 TTC(Triphenyltetrazolium chloride) 염색까지 진행하였다. 구체적인 방법은 각각의 실시예에서 상세히 설명한다.
12-3. 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입 후, MCAO 허혈성 뇌졸중 질환에서 뇌손상 치료 효과 확인
대조군 및 실험군 랫드로부터 적출한 뇌조직을, Brain matrix를 이용하여 frontal pole(이마극)부터 두정면을 따라 2 mm 간격으로 절삭하여 조직 절편을 제작하였다. 2% 2,3,5-TTC solution(in Phosphate-buffered saline(PBS))을 이용하여, 상기 뇌 조직 절편들을 37 ℃에서 한시간 동안 반응시켜 염색하였다. 4 % paraformaldehyde solution(in PBS)에 염색된 절편들을 넣은 후, 4 ℃에서 하루 동안 고정시켰다. 그 후 뇌조직을 순서대로 OHP 필름 위에 올린 후 사진 촬영하였고, 뇌조직 절편의 뇌경색 면적(infarct volume, 하기 백분율(%) 계산식 참조)을 계산하였다. 뇌경색의 면적(infarct volume)은 image J(National Institutes of Health, USA) 프로그램을 이용하여 측정되었다.
뇌경색의 면적(% of Infarct volume)={(volume of contralateral hemisphere - volume of non-ischemic ipsilateral hemisphere) / volume of contralateral hemisphere} X 100
본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포를 주입하고 28일 후에, TTC 염색을 수행한 결과, HBSS 투여 그룹의 조직손상 부위와 비교하여, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 주입 그룹에서는 뇌경색의 면적이 유의적으로 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 12b 및 도 12c). 결과적으로 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포 이식에 따라 허혈성 뇌졸중의 면적이 감소된다는 것을 확인 검증하였다.
실시예 13. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 행동 개선 평가
상기 실시예 12-2의 프로토콜로 수행된 동물실험에서, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입 후 일주간격으로 신경학적 행동평가를 진행하여 상기 신경줄기세포에 의한 뇌손상 개선효과를 평가하였다.
로타 로드 테스트(Rota-rod test)는 실험동물의 균형 및 운동능력을 평가할 수 있는 척도이다. 실험동물들을 MCAO 수술 3일 전부터 매일 3회 반복 연습시키고, 이 중 학습이 잘된 동물들을 선별하여 MCAO 모델을 제작하고 상기 실시예 12-2의 프로토콜로 동물시험이 수행되었다. 그 후, 실험동물을 4~40 rpm으로 가속화되는 rota-rod 트래드밀에 올린 후 낙하할 때까지의 시간을 측정하였다. 한번 실험할 때의 최장 관찰시간을 3분으로하였다. 다음과 같은 경우 측정을 종료한다: 1) 실험동물이 트래드밀에서 완전히 떨어지면 측정을 종료, 2) 실험동물이 트래드밀을 붙잡은 상태로 연속 세 바퀴 이상 회전할 경우 측정을 종료. 다음과 같은 경우 재측정 한다: 1) 실험동물이 역주행 할 경우 재측정. 2) 실험동물이 트래드밀 밖으로 점프하거나 정신이 산만하여 제대로 걷지 않을 때, 재측정. 다시 측정했을 때 동일한 결과가 도출되면 군에서 제외.
수동회피실험(Passive Avoidance Test)은 실험동물의 단기/장기 기억을 평가할 수 있는 척도이다. 수동회피실험은 학습시험(training trial)을 실시하고 다음날 기억실험 (test trial)을 실시하는 방식으로 수행되었다. 상기 학습시험 (Training Trial)으로서, 실험동물을 조명을 켜지 않은 chamber에 30초간 적응시킨 후 다시 조명을 켰다. 15초동안 적응시킨 후, 실험동물이 어두운 chamber로 이동할 수 있는 문을 300초동안 열어주었다. 실험동물이 어두운 chamber로 이동하면 문을 닫고, 15초동안 적응시간을 준 뒤, 0.3mA의 전기충격을 15초동안 가하였다. 만약 실험동물이 이동하지 않는다면 실험동물이 이동할 때까지 기다렸다. 다음날 기억과 인지를 평가하기 위해 기억실험을 진행하였고 시험을 진행하면서 실험동물이 스트레스를 받지 않게 전기충격을 가하지 않는 조건으로 안정화시키고, 학습시험과 동일한 방법으로 기억 시험을 진행하였다. 학습시험에서는 조명을 켠 후, 어두운 chamber로 이동할 때까지의 시간을 측정하였다.
부착물 제거 테스트 (Adhesive Removal Test)는 실험동물의 촉각반응 및 비대칭성을 평가할 수 있는 척도이다. 실험동물의 앞발 바닥에 paper dot 스티커 (지름 9mm)를 붙이고 이를 인지하여 제거하는 시간을 측정하였다. 오른쪽과 왼쪽 앞발 각각 따로 측정하며, 실험할 때의 최장 시간을 1분으로 하고 3회 시행하여 평균을 집계하였다(이때 Raw 데이터의 median ± 50%를 벗어나는 값은 제외한다).
도 13a에 나타낸 바와 같이 운동능력을 평가하는 rota-rod test를 실시한 결과, HBSS 주입 그룹과 비교하여 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 주입 그룹에서는 현저한 운동능력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
도 13b에 나타낸 바와 같이 인지 및 기억능력을 평가하는 수동회피실험 결과, HBSS를 주입한 그룹에 비해 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포를 주입한 그룹에서 인지 기억능력이 증가하는 것을 확인하였다.
도 13c 및 도 13d에 나타낸 바와 같이 감각 및 운동능력을 평가하는 adhesive removal test를 수행한 결과, 손상된 앞발의 감각과 운동능력이 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 이식그룹에서 크게 개선됨을 확인할 수 있었고 특히 2주차에 유의미하게 개선되었다. 즉, 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 이식그룹에서 신경행동 결손이 현저히 완화된 것을 확인하였다.
실시예 14. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 조직학적 개선 효과 분석(신경세포 발현)
상기 실시예 12-2의 프로토콜로 수행된 동물실험에서 뇌조직을 채취하여, 통상적인 방법으로4% PFA를 이용하여 고정한 후 파라핀 블록을 제작하였다. 여러가지 면역형광염색을 수행하기 위해, 5 μm 두께로 조직 절편을 만든 후, 슬라이드 글라스에 올리고 탈파라핀(deparaffin) 과정을 거친 후 NeuN 염색을 실시하여 신경세포의 증감을 평가하였다.
구체적인 방법은 다음과 같다. 먼저, 래트 뇌 조직의 섹션 슬라이드가 동결되어 있는 샘플을 5분 동안 1X PBS로 세 번 세척하였다. 상기 조직 샘플을 실온에서 30분 동안 50% 에탄올과 함께 인큐베이션하고, 2.5% 정상 염소 혈청(VECTOR, S-1012)을 처리하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 일차 항체로서 NeuN Ab(희석배율 : 1:100, [abcam(ab177487)])를 샘플에 처리하여, 밤새 4℃ 냉장실에서 인큐베이션하였다. 이차 항체가 처리되기 전에, 샘플을 15분 동안 1% 정상 염소 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 2시간 동안 실온에서 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이차 항체로서 염소 항토끼 IgG(H+L) 알렉사 플루오르 594 항체를 1X PBS에서 1:500으로 희석하여 사용하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액(SIGMA, D9564)은 PBS 중 1:100,000으로 희석하여 사용하였고, 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로, 면역 형광 염색된 뇌 조직 슬라이드를 VECTASHIED 마운팅 용액으로(VECTOR 실험실, H-1400) 마운팅 시킨 후, 커버 슬립 (Deckglδser, 24Х32mm)으로 덮었다. 이어서, 400배율의 공초점 레이저 현미경(Leica)으로, 무작위로 선택된 피질 경색 영역의 동측성 부위 및 비측방 부위의 비경색 영역의 세 부분 각각을 관찰하였다. 손상된 동측성(ipsilateral) 부위 및 비손상된 대측성(contralateral) 부위에서, 각각 관찰한 조직 부위를 도 14a에 나타내었다.
실험결과 도 14b 및 도 14c에 나타낸 바와 같이, Control 그룹에 비해 HBSS를 주입한 그룹에서 신경세포의 수가 감소하는 결과를 확인하였다. HBSS 그룹에 비해 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서는 신경세포 마커의 발현이 유의미하게 증가하였으며, 특히 Control 그룹 수준으로 신경세포수가 증가되어 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 고효능 NSC를 이식한 경우 손상된 신경세포의 회복 개선 촉진효과가 매우 우수하다는 것을 확인 검증하였다.
실시예 15. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 반응성 아교화 개선 분석(별아교세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia))
상기 실시예 12-2의 프로토콜로 수행된 동물실험에서 뇌조직을 채취하여, 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 주입에 의한 반응성 아교화(reactive gliosis)의 변화를 평가하기 위해, GFAP항체와 Iba1항체를 이용하여 손상된 대뇌 피질 부분에 대해(도 14a 참조) 각각 면역조직화학염색을 수행하였다. 상기 면역조직화학염색을 통해, 별아교세포를 통한 반응성 아교화 증가는 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 증가 측정을 통해 평가되었으며(도 15a 및 도 15b), 미세아교세포를 통한 반응성 아교화 증가는 Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1) 증가 측정을 통해 평가되었다(도 15c 및 도 15d). 면역형광조직 염색은 일차 항체로서 각각 GFAP Ab([NSJ Bioreagents (V2129)], 희석배율 1:100), 또는 Iba1 Ab ([abcam(ab178846)], 희석배율 1:500)를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 16과 동일한 방법으로 수행되었다.
도 15a, 도 15b, 도 15c 및 도 15d에 나타낸 바와 같이, Control 그룹에 비해 HBSS 그룹에서 반응성 별아교세포의 수가 증가하였지만, HBSS 그룹에 비해 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서 반응성 별아교세포 마커 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 Control 그룹에 비해 HBSS 그룹에서 반응성 미세아교세포의 수가 증가하였지만, HBSS 그룹에 비해 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서 반응성 미세아교세포 마커 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포를 이식한 군에서 조직 내 반응성 아교화가 현저히 덜 발생하면서, 조직 손상을 현저하게 개선하는 효과가 있는 것을 확인 검증하였다.
실시예 16. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 세포사멸 개선 효과 분석
상기 실시예 12-2의 프로토콜로 수행된 동물실험에서 뇌조직을 채취하여, 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 주입에 의한 손상 조직 내 세포사멸 개선 정도를 확인하기 위해, 조직을 분쇄하여 생존 및 사멸에 관련된 단백질인 BAX, Bcl2, cleaved caspase-3의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 평가하였다.
뇌 조직을 RIPA 완충액(ChemCruz, sc-24948)에 용해시켰다. 샘플 중의 단백질의 양은 브래드포드 단백질 분석 염료(BIO-RAD, #5000006)로 정량화하였다. 동량의 단백질을 OneGel PAGE 키트 플러스(BIOSOLUTION)에 로딩한 다음, 1X 트리스-글리신-SDS 버퍼(DYNE BIO, CBT3141)를 이용하여 제조사의 프로토콜 대로 분리하였다. 분리된 단백질을 메탄올(DAEJUNG, 5558-4410)과 함께 1X 트리스-글리신 완충액(DYNE BIO, CBT3291)에서 니트로셀룰로스 막 상으로 옮겼다. 단백질의 분리 및 전달은 테트라수직 전기영동 및 블롯팅 시스템(BIORAD)을 사용하여 수행하였다. 멤브레인은 1시간 동안 실온에서 트윈-20(VWR LIFE SCIENCE, 0777-1L)과 함께 트리스 완충 식염수(DYNE BIO, CBT3051)에서 5% 탈지유(CellNest, CNS109-0500)로 차단하였다. 멤브레인을 4℃에서 밤새 5% 소 혈청 알부민(BSA) (SIGMA, A-2153) 중의 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 일차 항체 정보는 다음과 같다: Bax Ab([Santa Cruz (sc-7480)], 희석농도 1:1,000), Bcl-2 Ab ([Santa Cruz (sc-7382)], 희석농도 1:100), β-actin Ab ([Cell signaling (9664)], 희석농도 1:1,000), Cleaved-caspase3 Ab ([Santa Cruz (sc-47778)], 희석농도 1:1,000). 그 후, 멤브레인을 1시간 동안 실온에서 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 또는 토끼 IgG 이차 항체(1:10,000)와 함께 인큐베이션하였다. 검출 키트 용액(WESTSAVE up, LF-QC0101)을 멤브레인에 적용한 다음, x-레이 필름(AGFA) 또는 검출 시스템(JPI 헬스케어 주식회사, JP-33)에 의해 신호를 검출하였다. 밴드는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화되었고 β-액틴의 신호에 의해 정규화되었다.
웨스턴블랏 결과 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이, Control 그룹에 비해 HBSS 그룹에서 세포사멸 관련 단백질인 Bax와 Cleaved-caspase3의 발현이 증가하고, 생존 관련 단백질인 Bcl2의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 반면 HBSS 그룹에 비해, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서는 Bax와 Cleaved-caspase3의 발현이 감소하고, Bcl2의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서 Bax 및 Cleaved-caspase3의 발현 감소 수준, 그리고 Bcl2 발현 증가 수준은, Control군과 유사한 수준인 것으로 확인되었다.
따라서 상기 결과로부터, 허혈에 의해 발생되는 조직의 손상을 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포의 주입에 의해 조직 손상이 유의적으로 감소되는 효과가 매우 우수함을 확인 검증하였다.
실시예 17. In vivo 허혈성 뇌졸중 동물모델(Middle Cerebral Occlusion Rat model, MCAO)에, 본 발명에 따라 선별된 신경줄기세포 주입에 의한 뇌혈관 회복 효과 분석
상기 실시예 12-2의 프로토콜로 수행된 동물실험에서 뇌조직을 채취하여, 본 발명에 따른 고효능 신경줄기세포 주입에 의한 뇌혈관의 회복 정도를 확인하기 위해, 대뇌피질부분에서 CD31 면역형광염색(혈관염색)을 수행하였다. 면역형광염색은 일차 항체로서 CD31 Ab([abcam(ab28364)], 희석배율 1:50)를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 14와 동일한 방법으로 수행되었다.
CD31 면역조직화학 염색 결과 도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, Control 그룹에 비해 HBSS 그룹에서 뇌졸중 손상부위 조직 내 혈관 발현 정도가 매우 감소하였지만, HBSS 그룹에 비해 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포를 이식한 그룹에서 혈관발현 정도가 유의미하게 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어볼 때, 본 발명에 따라 선별된 고효능 신경줄기세포를 이식한 경우 혈관 형성을 유도하는 효과가 매우 우수함을 확인 검증하였다. 반면 뇌경색이 발생하지 않은 조직(대측성 조직)에서는 혈관의 발현 정도가 세 그룹간에 차이가 없었다.
종합하여(도 18 참조), 본 발명자들은 분리된 줄기세포를 본 발명의 상기 효력 인자(MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6)를 통해 선별하고, 이렇게 선별된 줄기세포를 이식함으로써, 대표적인 신경계 질환인 뇌졸중과 이로 인해 속발되어 발생할 수 있는 뇌 신경손상 예방 및 혈관 재생을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 그리고, 상기 뇌졸중으로 손상된 뇌의 조직학적, 생화학적 회복 효과뿐만 아니라, 행동학적인 감각 및 운동 능력 또한 유의하게 호전시키는 효과를 확인하였다. 즉, 또한 신경세포 및 혈관내피세포에서 각 효력 인자에 의한 특이적인 신경세포 보호능 및 혈관 재생 능력을 확인한 바 있다. 더불어 신경줄기세포는 면역거부반응을 일으킬 소지가 적으며 면역억제 능력이 높음을 확인하였다.
즉, 본 발명자들은, 본 발명에 의해 선별된 신경줄기세포의 이식을 통해 척수손상 및 뇌졸중을 포함한 신경계 질환 치료효과를 확인하였고, 손상조직에서의 신경세포 및 혈관 세포 생존의 증가; 및 반응성 아교화, 면역세포 및 세포사멸의 감소를 통해 신경손실로 야기되는 행동의 개선이 됨을 확인하였다. 따라서, 신경줄기세포 분리 배양 자체로서뿐 아니라, 분리 배양된 신경줄기세포에서 분비되는 특별한 효력 인자를 규명함으로써 보다 현저하게 고효능(고성능) 및 고효율로 신경계 질환의 치료가 가능한, 새로운 치료 전략을 제시하였다.
상기 결과들을 모두 종합하여(도 18 참조), 신경줄기세포를 이용하는 본 발명에서 상기 MCP-1, TIMP-1, GROα 및 IL-6의 4개 인자의 특이적 조합에 의하여 다양한 신경계 질환의 치료 및 증상 개선에 있어서 신경줄기세포의 치료 효능을 현저하게 높일 수 있음이 당업자에 자명하게 이해되는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (42)

  1. TIMP-1(TIMP Metallopeptidase inhibitor 1), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), GROα(Growth-Regulated Oncogene alpha) 및 IL-6(Interleukin 6)의 단백질 또는 이들의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자는,
    상기 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포에서 고발현 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는
    중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경계 질환은
    허혈성 뇌질환, 퇴행성 신경질환, 신경손상 질환, 말초신경장애 및 외상성 뇌손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은
    뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 뇌색전증, 뇌혈전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 뇌출혈, 신생아 뇌실내 출혈(IVH), 뇌동맥경화증, 저산소성 뇌손상 및 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은
    치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy: OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨슨-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 및 픽병(Pick's disease)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 신경손상 질환은
    뇌전증, 척수 손상 질환, 행동 장애, 발달장애, 정신 지체, 다운증후군 및 정신분열증에서 선택되는 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법:
    (i) 줄기세포를 배양하는 단계;
    (ii) 상기 (i) 단계의 줄기세포 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 농도를 측정하는 단계; 및
    (iii) 상기 배양물에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질이 고발현된 경우 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포인 것으로 판정 및 분류하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (iii)단계는,
    상기 (ii) 단계에서 측정된 배양물 내
    TIMP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
    MCP-1 단백질 농도가 6,000 pg/mL 이상,
    GROα 단백질 농도가 500 pg/mL 이상, 및
    IL-6 단백질 농도가 50 pg/mL 이상인 경우
    상기 줄기세포가 고효능인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 줄기세포의 신경계 질환 치료 활성능을 생체 외에서 판별할 수 있는 방법으로,
    상기 방법은 줄기세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 정도를 측정하여 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 마커 조성물.
  12. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준 측정은, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는
    상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별용 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 키트는
    제1항의 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  18. (a) 분리된 줄기세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험물질과 접촉한 줄기세포와 시험물질을 접촉하지 않은 대조군 줄기 세포에서 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 세포와 비교하여 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질 또는 이들의 유전자의 발현 또는 활성 수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계
    를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 줄기세포는,
    중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(flow cytometry) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는
    이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 배양물은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 포함하는 조건배지(conditioned medium)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 줄기세포는,
    중간엽 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, 조직유래줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것인 조성물.
  26. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진용 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질은,
    TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 1개 이상의 발현벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 줄기세포의 활성은 자가 재생, 신경세포보호능, 신경세포사멸억제능, 혈관내피세포 이동, 혈관형성, 항염증 및 반응성 아교화 억제능으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 분리된 줄기세포에 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 줄기세포의 활성 촉진 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은,
    TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 1개 이상의 발현벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 줄기세포의 활성은 자가 재생, 세포보호능, 세포사멸억제능, 혈관내피세포 이동, 혈관형성, 항염증 및 반응성 아교화 억제능으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 분리된 줄기세포; 및
    TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 단백질 발현 또는 활성 증가 물질은,
    TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 1개 이상의 발현벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제32항의 조성물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 복합제제.
  35. TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질을 과발현하는 줄기세포, 또는
    이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 배양물은, 상기 줄기세포가 분비하는 TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 단백질을 포함하는 조건배지(conditioned medium)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 상기 조성물은,
    뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은
    뇌경색, 뇌허혈, 뇌졸중, 혈관성 치매, 뇌출혈, 지주막하 출혈 및 백질 이상증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는, 조성물.
  39. 분리된 줄기세포; 및
    TIMP-1, MCP-1, GROα 및 IL-6의 유전자 또는 이들의 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질을 유효성분으로 포함하는, 혈관형성 유도용 약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 증가 물질은,
    TIMP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    MCP-1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    GROα 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    IL-6 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 1개 이상의 발현벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 조성물은,
    뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  42. 제39항의 조성물을 포함하는 혈관형성 유도용 약학적 복합제제.
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