KR20230168036A

KR20230168036A - 뇌전증 관련 불안 장애에 대한 치료 표적 및 치료용 바이오 마커로서 il-17a의 용도

Info

Publication number: KR20230168036A
Application number: KR1020220068460A
Authority: KR
Inventors: 조경옥; 조미라
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2022-06-03
Filing date: 2022-06-03
Publication date: 2023-12-12

Abstract

본 발명은 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안장애)에 대한 치료 표적 및 치료용 바이오 마커로서 L-17A(Interleukin-17A)의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 IL-17A의 차단이 비정상적인 해마 신경발생 및 흥분독성 신경 세포사를 감소시킴으로써 뇌전증 관련 불안장애에 대한 예방 및/또는 치료 효과가 있음을 실험적으로 규명함으로써, 이에 따라 IL-17A는 치료 타겟 및 치료용 바이오 마커로서 중요한 인자임을 확인하였는 바, 상기 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 뇌전증 관련 불안장애 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대될 뿐만 아니라, 치료 유효성(치료 효과 여부 또는 효과의 크기 측정) 판정에 필요한 정보를 제공할 수 있기 때문에 상기 장애의 개인화된(personalized) 치료 요법 제공에 있어서 더욱 이점을 제공할 것으로 기대된다.

Description

뇌전증 관련 불안 장애에 대한 치료 표적 및 치료용 바이오 마커로서 IL-17A의 용도{Use of IL-17A as a therapeutic target and therapeutic biomarker for epilepsy-associated anxiety disorder}

본 발명은 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder)에 대한 치료 표적 및 치료용 바이오 마커로서 IL-17A(Interleukin-17A)의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 장애의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법, IL-17A의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 상기 장애 치료 요법의 효능 지표 마커 조성물, IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 상기 장애 치료 요법의 효능 평가용 조성물 및 키트, 및 상기 장애 치료 유효성의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정(비교)하는 방법에 관한 것이다.

해마(hippocampus)는 불안과 스트레스를 관리하는 데 중심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 성인 때 생성된 뉴런 또한 불안의 조절에 관여하는데, 그러나 해마 병변이 불안 장애의 발달에 기여하는지에 대해서는 논란이 많다. 게다가, 뇌전증을 포함한 많은 중추신경계 질환에서 손상(injury)에 의한 비정상적인 해마 신경 발생이 두드러지지만 뇌전증 관련 불안장애(뇌전증 동반이환 불안장애)에 있어서, 비정상적인 신경발생의 영향을 입증하는 연구는 거의 없다.

한편, 뇌전증(epilepsy, 간질)은 만성적인 신경 장애의 하나로, 뇌신경 세포의 불규칙한 흥분으로 뇌에 전기가 발생해 발작과 경련을 일으키는 질환이다. 뇌전증의 평균 유병률은 0.5 ~ 1%로, 만성 신경 질환 중에서 가장 유병률이 높은 질환 중의 하나이다. 뇌전증의 유병률은 연령에 따라 차이가 있는데, 소아와 고령층에서의 유병률이 높은 것이 특징이다. 아직까지 뇌전증의 근본적인 치료 방법은 없으며, 항뇌전증 약물의 투여가 주된 치료법인 것으로 알려져 있으나, 항뇌전증 약물의 복합요법(polytherapy)에도 뇌전증 발작이 조절되지 않는 약물 내성 뇌전증(pharmacoresistant epilepsy)으로 진행하는 환자가 상당수에 달한다. 1차적 병태로서 뇌전증(간질)의 발생 뿐만 아니라, 뇌전증의 동반이환 (comorbidity)의 치료 또한 뇌전증 환자에서 주요한 치료 전략 및 질병 관리 전략으로서 중요성이 강조되고 있다. 동반이환(comorbidity)이란 1차 병태(primary condition)와 공동발생하는 하나 이상의 추가 장애(질환)의 존재로 정의된다. 뇌전증과 관련된 다수의 동반 병태(comorbid condition)가 존재한다. 2007 NINDS 뇌전증 연구 기준(Epilepsy Research Benchmarks)은 동반이환을 기준 중 하나로 포함하였고(기준 영역 III: 뇌전증 및 이의 치료와 관련된 동반이환을 예방하고, 제한하며, 역행시킨다(Benchmarks Area III: Prevent, limit, and reverse the co-morbidities associated with epilepsy and its treatment)), 의학연구소 또한 뇌전증 동반이환을 뇌전증에 대한 IOM 보고서에서 식별하였다.

측두엽 뇌전증(temporal lobe epilepsy, TLE)은 성인에게서 가장 널리 발견되는 후천성 뇌전증(간질) 중 하나이다. TLE 환자는 우울증, 불안, 정신병적 장애(psychotic disorder) 등 다양한 정신의학적 동반이환(psychiatric comorbidity)에 시달리는 경우가 많다. 이러한 뇌전증 동반이환들은 뇌전증을 동반하지 않은 질환 상태와 그 병태적 특성이 상당히 다르다. 일례로 뇌전증 관련 우울증(뇌전증 동반이환 우울증)은 일반적인 형태의 우울증과 현상학적으로(phenomenologically) 다르며 치료 의사가 이러한 다양한 형태에 대해서도 평가하는 것이 중요한 것으로 알려졌다(비특허문헌 1). 또한 불안장애는 뇌전증과 관련된 가장 흔한 동반이환(comorbid condition)로 보고되고 있으며, 삶의 질을 심각하게 떨어뜨리고, 약물치료에 대한 반응성 측면에서 예후가 좋지 않다. 상기 뇌전증 관련 우울증처럼, 뇌전증 관련 불안장애(뇌전증 동반이환 불안장애)는, 뇌전증이 없는 일반적인 행태의 불안 장애 또는/및 정상인에서 나타나는 불안감 소양과는 다른 특이적인 병태적 특성을 지닌다. 이를 뒷받침하여, 뇌전증이 없는(뇌전증을 동반하지 않는) 일반적인 행태의 불안 장애의 치료에 있어서 처방되는 항-불안제(신경안정제)가 뇌전증 관련 불안장애에는 효과가 없었다는 보고들이 있는 실정이다. 일례로 일반적인 항불안제로 알려진 Benzodiazepine(BDZ)은 뇌전증의 발작 조절을 위해서 처방되기도 하는데, 실질적으로 뇌전증 동반이환 불안장애를 지니는 환자에서 BDZ를 사용하거나 사용하지 않는 환자 사이의 불안 수준에는 통계적으로 유의한 차이가 없다고 보고 된 바 있다(비특허문헌 2). 뇌전증으로 인한 동반이환(동반질환) 불안 장애의 높은 발생률에도 불구하고 전술한 바와 같이 효과적인 치료 방법에 대한 연구가 거의 전무한 실정이어서, 뇌전증 관련 불안장애의 효과적인 치료 또는/및 개선 방법에 대해서 활발한 연구가 필요한 실정이다.

R Seethalakshmi et al., Depression in epilepsy: phenomenology, diagnosis and management, Epileptic Disord, 2007 Mar;9(1):1-10. Angelica Dal Pizzol et al., Impact of the chronic use of benzodiazepines prescribed for seizure control on the anxiety levels of patients with epilepsy, Epilepsy Behav, 2012 Mar;23(3):373-376.

이에 본 발명자들은 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder)에 대한 새로운 치료 전략을 연구하던 중, IL-17A(Interleukin-17A)가 상기 장애(질환)에 대한 치료 표적 및 치료용 바이오 마커로서 기능함을 최초로 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은,

(a) 시험 물질을 IL-17A 유전자를 발현하는 분리된 세포에 접촉시키는 단계;

(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 대조군 세포와 비교하여 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, IL-17A의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 지표(효과 평가용) 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법으로,

뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법이 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료요법이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것인, 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 IL-17A 단백질 발현 억제제는 IL-17A mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 IL-17A 단백질 활성 억제제는 IL-17A 단백질에 특이적으로 결합하는(상보적으로 결합하는) 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증 관련 불안 장애의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증 관련 불안 장애의 예방, 개선 및/또는 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 뇌전증 관련 불안 장애의 예방, 개선 및/또는 치료 용도를 제공한다.

또한 본 발명은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 뇌전증 관련 불안 장애의 예방, 개선 및/또는 치료용 제제를 제조(생산)하기 위한 용도를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(c) 대조군 세포와 비교하여 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계

를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 신경세포(neuron), 신경줄기세포(neural stem cell), 별아교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 IL-17A 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은 IL-17A mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 시험물질은 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 천연추출물 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 지표(효과 평가용) 마커 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는, IL-17A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 IL-17A 단백질에 특이적인 항체인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 후술하는 본 발명의 뇌전증 관련 불안 장애 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

뇌전증 관련 불안 장애 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법으로,

뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법이 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료 요법이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것인, 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 발현수준 변화는, 상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 피검체(환자)로부터 채취된 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, IL-17A의 발현수준은, IL-17A 단백질 또는 유전자 발현 수준인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 IL-17A 유전자 발현 수준은 IL-17A mRNA 발현 수준을 측정하는 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명자들은 IL-17A의 차단이 비정상적인 해마 신경발생 및 흥분독성 신경 세포사를 감소시킴으로써 뇌전증 관련 불안장애(뇌전증 동반이환 불안장애)에 대한 예방 및/또는 치료 효과가 있음을 실험적으로 규명함으로써, 이에 따라 IL-17A는 치료 타겟 및 치료용 바이오 마커로서 중요한 인자임을 확인하였는 바, 상기 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 뇌전증 관련 불안장애 예방 또는 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대될 뿐만 아니라, 치료 유효성(치료 효과 여부 또는 효과의 크기 측정) 판정에 필요한 정보를 제공할 수 있기 때문에 상기 장애의 개인화된(personalized) 치료 요법 제공에 있어서 더욱 이점을 제공할 것으로 기대된다.

도 1a는 필로카르핀 투여에 의해 뇌전증 마우스 모델 제작 후 수행한 개방 필드 테스트(OFT) 및 고가 십자 미로(EPM) 테스트 실험의 일정 설계를 간략히 보여주는 타임라인(timeline)이다.
도 1b는 개방 필드 테스트(OFT)에서 정의된 중앙 구역 및 주변 구역을 간략히 도식화하여 나타낸 것이다.
도 1c는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 개방 필드 테스트 상자 내에서 보인 자발적 움직임을 추적한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 1d는 상기 도 1c의 개방 필드 테스트에서 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 중앙 구역과 주변 구역에서 보낸 시간의 백분율과, 개방 필드에서 이동한 총 거리를 보여주는 그래프이다(n = 41 (WT) 및 n = 42 (KO), 구체적인 통계처리 정보는 다음과 같다; Central Zone: Mann-Whitney U test, p = 0.044, U = 640.500; peripheral zone: Mann-Whitney U test, p = 0.044, U = 640.500; total distance: Student's unpaired t-test, p = 0.481, t(81) = 0.707.).
도 1e는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 고가 십자 미로 내에서 보인 자발적 움직임을 추적한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 1f는 상기 도 1e의 고가 십자 미로 테스트에서 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 고가 미로의 열린 통로(open arms)에서 보낸 시간의 백분율을 보여주는 그래프이다(n = 14 (WT) 및 n = 17 (KO), Student's unpaired t-test, p = 0.019, t(29) = 2.492. 데이터는 평균 ± SEM 으로 나타내었다. *p < 0.05, NS, not significant).
도 1g는 개방 필드 테스트에서 뇌전증 IL-17A WT 마우스가 중앙 구역과 주변 구역에서 보낸 시간의 백분율을 각 성별에 따라 구분하여 관찰한 결과로, 각 성별간에는 유의한 차이가 없었다(n = 20 (male), n = 17 (female). Detailed statistics are as follows. Central zone: Mann-Whitney U test, p = 0.206, U = 128.000; Peripheral zone: Mann-Whitney U test, p = 0.206, U = 128.000).
도 1h는 개방 필드 테스트에서 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 중앙 구역과 주변 구역에서 보낸 시간의 백분율을 각 성별에 따라 구분하여 관찰한 결과로, 각 성별간에는 유의한 차이가 없었다(n = 10 (male), n = 20 (female). Detailed statistics are as follows. Central zone: Student’s unpaired t-test, p = 0.110, t(28) = 1.651; Peripheral zone: Mann-Whitney U test, p = 0.093, U = 61.500).
도 1i는 고가 십자 미로 테스트에서 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스가 고가 미로의 열린 통로(open arms)에서 보낸 시간의 백분율을 각 성별에 따라 구분하여 관찰한 결과로, 각 성별 간에는 유의한 차이가 없었다( IL-17A WT: n = 5 (male), n = 9 (female); IL-17A KO: n = 4 (male), n = 11 (female). Detailed statistics are as follows. IL-17A WT: Student’s unpaired t-test, p = 0.646, t(12) = 0.472; IL-17A KO: Student’s unpaired t-test, p = 0.371, t(13) = 0.928. Data are presented as mean ± SEM. *p < 0.05, NS, not significant).
도 2a는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스 제작 후 수행한 개방 필드 테스트(OFT) 및 고가 십자 미로(EPM) 테스트 실험의 일정 설계를 간략히 보여주는 타임라인(timeline)이다.
도 2b는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스가 개방 필드 테스트 상자 내에서 보인 자발적 움직임을 추적한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 2c는 상기 도 2b의 개방 필드 테스트에서 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스가 중앙 구역과 주변 구역에서 보낸 시간의 백분율과, 개방 필드에서 이동한 총 거리를 보여주는 그래프이다(n = 37 (WT) 및 n = 38 (KO), 구체적인 통계처리 정보는 다음과 같다; Central Zone: Mann-Whitney U test, p = 0.078, U = 536.500; peripheral zone: Mann-Whitney U test, p = 0.077, U = 536.000; total distance: Mann-Whitney U test, p = 0.895, U = 690.000.).
도 2d는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스가 고가 십자 미로 내에서 보인 자발적 움직임을 추적한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 2e는 상기 도 2d의 고가 십자 미로 테스트에서 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스가 고가 미로의 열린 통로(open arms)에서 보낸 시간의 백분율을 보여주는 그래프이다(n = 15 (WT) 및 n = 16 (KO), Student's unpaired t-test, p = 0.369, t(29) = 0.912. 데이터는 평균 ± SEM 으로 나타내었다. *p < 0.05, NS, not significant.)
도 3a는 필로카르핀 투여에 의해 뇌전증 마우스 모델 제작 후 뇌피질 전극 및 경막외 전극 2개를 이식하고 지속적인 비디오-EEG 모니터링을 실시한 실험의 일정 설계를 간략히 보여주는 타임라인(timeline)이다.
도 3b는 마우스 뇌에서 뇌피질 전극 및 경막외 전극이 이식되는 위치를 간략히 나타낸 이미지이다(Ref: reference; LPC: left parietal cortex).
도 3c는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스의 전신 발작을 EEG로 측정 및 기록한 결과를 나타낸다.
도 3d는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스에서, 하루에 자발적 재발성 발작(spontaneous recurrent seizures, SRS)의 발생 빈도 및 각 발작의 평균 지속시간을 나타낸 그래프이다(n = 4 (WT) 및 n = 6 (KO). 구체적인 통계처리 정보는 다음과 같다; SRS frequency: Student's unpaired t-test, p = 0.906, t(8)=0.122; SRS duration: Mann-Whitney U test, p = 0.257, U = 6.000. 데이터는 평균 ± SEM 으로 나타내었다. *p < 0.05, NS, not significant.). 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스 사이에 SRS 빈도나 지속 시간에는 차이가 없었다.
도 4a는 필로카르핀 투여에 의해 뇌전증 마우스 모델을 제작하고 3일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험의 일정 설계를 간략히 보여주는 타임라인(timeline)이다.
도 4b는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스에서, Fluoro-Jade B(FJB)로 염색된 퇴행성 뉴런을 보여주는 대표적인 현미경 이미지이다(전체적인 해마 이미지(위쪽)에서의 스케일바는 50μm을 나타내고, 각 hilus, CA1, 및 CA3의 세부구역 확대 이미지(아래쪽)에서의 스케일바는 200μm를 나타낸다).
도 4c는 뇌전증 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증 IL-17A KO 마우스에서, 해마의 hilus, CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)에서 FJB-양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다(n = 6 (WT) 및 n = 4 (KO), 구체적인 통계처리 정보는 다음과 같다; Hilus: Mann-Whitney U test, p = 0.971, U = 11.500; CA1: Mann-Whitney U test, p = 0.019, U = 1.000; CA3: Mann-Whitney U test, p = 0.038, U = 2.000. 데이터는 평균 ± SEM 으로 나타내었다. *p < 0.05, NS, not significant.). WT 그룹에 비해 IL-17A KO 마우스가 해마의 CA1 및 CA3 세부구역에서 퇴행성 뉴런이 더 적었다.
도 5a는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 3일차의 뇌 해마 조직에서 Ki67 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(과립 세포층(granule cell layer)의 내부 가장자리는 점선으로 표시하였다. 전체적인 해마 조직 이미지(왼쪽)에서의 스케일바는 100μm를 나타내고, 확대 이미지(오른쪽)에서의 스케일바는 20μm를 나타낸다).
도 5b는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 3일차의 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 영역에 대하여 Ki67 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다(n=5 (WT) 및 n = 6 (KO), Student's unpaired t-test, p = 0.149, t(9) = 1.576).
도 6a는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 42일차의 뇌 해마 조직에서 doublecortin(DCX) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(전체적인 해마 조직 이미지(왼쪽)에서의 스케일바는 100μm를 나타내고, 확대 이미지(오른쪽)에서의 스케일바는 20μm를 나타낸다).
도 6b는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 42일차의 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 및 치상문(hilus) 영역에 대하여 doublecortin(DCX) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다(n = 10 (WT) 및 n = 6 (KO), 구체적인 통계처리 정보는 다음과 같다; SGZ: Student's unpaired t-test, p = 0.323, t(14) = 1.025; hilus: Mann-Whitney U test, p = 0.141, U = 16.000).
도 6c는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 42일차의 뇌 해마 조직에서 prospero homeobox 1(Prox1) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(과립 세포층(granule cell layer)의 내부 가장자리는 점선으로 표시하였다. 전체적인 해마 조직 이미지에서의 스케일바는 100μm를 나타낸다).
도 6d는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 42일차의 뇌 해마 조직 중 치상문(hilus) 영역에 대하여 prospero homeobox 1(Prox1) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다(n = 6 (WT) 및 n = 5 (KO), Mann-Whitney U test, p = 0.017, U = 2.000. Data presented as mean ± SEM. *p < 0.05, NS, not significant).
도 7a는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후, 3일차의 뇌 해마 조직에서 Iba1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1)에 대한 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다. 점선으로 해마 DG(dentate gyrus), CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)을 구분하여 표시하였다. 전체적인 해마 이미지(위쪽)에서의 스케일바는 500μm을 나타내고, 각 DG, CA1, 및 CA3의 세부구역 확대 이미지(아래쪽)에서의 스케일바는 50μm를 나타낸다).
도 7b는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 3일 후, DG(dentate gyrus), CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)에서 Iba1 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다(n = 6 (WT) and n = 6 (KO). DG: Student’s unpaired t-test, p = 0.686, t(10) = 0.417; CA1: Student’s unpaired t-test, p = 0.693, t(10) = 0.406; CA3: Student’s unpaired t-test, p = 0.696, t(10) = 0.402).
도 8a는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후, 3일차의 뇌 해마 조직에서 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대한 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다. 점선으로 해마 DG(dentate gyrus), CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)을 구분하여 표시하였다. 전체적인 해마 이미지(위쪽)에서의 스케일바는 500μm을 나타내고, 각 DG, CA1, 및 CA3의 세부구역 확대 이미지(아래쪽)에서의 스케일바는 50μm를 나타낸다).
도 8b는 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 3일 후, DG(dentate gyrus), CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)에서 GFAP 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다(n = 6 (WT) and n = 6 (KO). DG: Student’s unpaired t-test, p = 0.184, t(10) = 1.429; CA1: Student’s unpaired t-test, p = 0.230, t(10) = 1.278; CA3: Student’s unpaired t-test, p = 0.008, t(10) = 3.311. Data are presented as mean ± SEM. *p < 0.05, NS, not significant).
도 9는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 3일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 해마의 hilus, CA1 및 CA3의 세부구역(subfield)에서 FJB-양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다. 각 그룹간에 유의성 있는 차이가 없었다(n = 6 (WT) and n = 8 (KO). Detailed statistics are as follows. Hilus: Student’s unpaired t-test, p = 0.756, t(12) = 0.318; CA1: Student’s unpaired t-test with Welch’s correction, p = 0.410, t(8.482) = 0.867; CA3: Mann-Whitney U test, p = 0.875, U = 22.500).
도 10a는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 3일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 영역에 대하여 Ki67 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(검정색 네모 부분을 확대한 것을 오른쪽 위 모서리 부분에 나타내었다. 과립 세포층(granule cell layer)의 내부 가장자리는 점선으로 표시하였다. 낮은 배율 이미지에서의 스케일바는 250μm를 나타내고, 확대 이미지에서의 스케일바는 50μm를 나타낸다).
도 10b는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 3일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 영역에 대하여 Ki67 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 각 그룹간에 유의성 있는 차이가 없었다(n = 6 (WT) and n = 8 (KO). Student’s unpaired t-test, p = 0.742, t(12) = 0.337).
도 11a는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 42일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 및 치상문(hilus) 영역에 대하여 doublecortin(DCX) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(검정색 네모 부분을 확대한 것을 오른쪽 위 모서리 부분에 나타내었다. 과립 세포층(granule cell layer)의 내부 가장자리는 점선으로 표시하였다. 낮은 배율 이미지에서의 스케일바는 200μm를 나타내고, 확대 이미지에서의 스케일바는 25μm를 나타낸다).
도 11b는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 42일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 SGZ(subgranular zone) 및 치상문(hilus) 영역에 대하여 doublecortin(DCX) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 각 그룹간에 유의성 있는 차이가 없었다(n = 7 (WT) and n = 6 (KO). Detailed statistics are as follows. SGZ: Student’s unpaired t-test, p = 0.119, t(11) = 1.690; hilus: Student’s unpaired t-test, p = 0.611, t(11) = 0.524).
도 12a는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 42일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 치상문(hilus) 영역에 대하여 prospero homeobox 1(Prox1) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 보여주는 대표적 현미경 이미지이다(검정색 네모 부분을 확대한 것을 오른쪽 위 모서리 부분에 나타내었다. 과립 세포층(granule cell layer)의 내부 가장자리는 점선으로 표시하였다. 낮은 배율 이미지에서의 스케일바는 200μm를 나타내고, 확대 이미지에서의 스케일바는 25μm를 나타낸다).
도 12b는 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스를 제작하고 42일 후에 마우스를 희생시켜 조직분석을 수행한 실험 결과로, 뇌 해마 조직 중 치상문(hilus) 영역에 대하여 prospero homeobox 1(Prox1) 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 각 그룹간에 유의성 있는 차이가 없었다(n = 6 (WT) and n = 6 (KO). Student’s unpaired t-test, p = 0.313, t(10) = 1.061. Data are presented as mean ± SEM. *p < 0.05, NS, not significant).
도 13a는 필로카르핀 주사 후 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서, 첫 번째 발작 시작 시간(min)을 각 성별에 따라 구분하여 관찰한 결과로, 각 성별간에는 유의한 차이가 없었다(IL-17A WT: n = 13 (male), n = 5 (female); IL-17A KO: n = 10 (male), n = 8 (female). Detailed statistics are as follows. IL-17A WT: Student’s unpaired t-test, p = 0.732, t(16) = 0.348; IL-17A KO: Mann-Whitney U test, p = 0.347, U = 29.500).
도 13b는 필로카르핀 주사 후 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서, 뇌전증 지속상태(SE, 간질중첩증) 시작 시간(min)을 각 성별에 따라 구분하여 관찰한 결과로, 각 성별간에는 유의한 차이가 없었다(IL-17A WT: n = 7 (male), n = 5 (female); IL-17A KO: n = 10 (male), n = 5 (female). Detailed statistics are as follows. IL-17A WT: Student’s unpaired t-test, p = 0.904, t(10) = 0.124; IL-17A KO: Student’s unpaired t-test, p = 0.532, t(13) = 0.642).

정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 용어 '뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder)'는 당업계에서 '뇌전증 동반이환 불안 장애(epilepsy comorbidity anxiety disorder)'로도 불리며 본 명세서에서 동일한 의미로 혼용되어 사용될 수 있고, 1차 병태인 뇌전증(간질)과 공동으로 발생한 불안 장애를 의미한다. 상기 뇌전증 관련 불안장애(뇌전증 동반이환 불안장애)는, 뇌전증이 없는 일반적인 행태의 불안 장애 또는/및 정상인에서 나타나는 불안감 소양과는 다른 특이적인 병태적 특성을 지니며, 본 발명에서 이들과 구분되는 의미이다.

상기 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안 장애)는, 선천적 또는 후천적 뇌전증 발생 환자에서 나타나는 질환일 수 있다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 뇌전증 관련 불안 장애는, 바람직하게 후천적 뇌전증 환자에서 나타나는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안 장애)는, 급성 또는 만성 뇌전증 환자에서 나타나는 질환일 수 있다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 뇌전증 관련 불안 장애는, 바람직하게 만성 뇌전증 환자에서 나타나는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안 장애)는, 여러가지 뇌전증 세부유형에서 보고된다. 특히, 뇌전증 관련 불안 장애는 측두엽 뇌전증(temporal lobe epilepsy, TLE)환자에서 매우 흔히 발생되는 것으로 알려졌다. 따라서, 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 뇌전증 관련 불안 장애는, 바람직하게 측두엽 뇌전증 환자에서 나타나는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안 장애)는, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 IL-17A-양성(positive) 뇌전증 환자에서 나타는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 발명에서 용어 '숙주세포(host cell)'는, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩티드(polypeptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 IL-17A(Interleukin-17A)는 IL-17 family에 속하는 사이토카인으로, 상기 IL-17 family는 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F의 6가지 서로 다른 멤버로 이루어진다. 당업계에 IL-17A를 생산하는 여러 유형의 세포들이 알려져 있으며, 이에 제한되지 않으나, 일례로 Th17, γδ T 세포, 호중구, 별아교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)와 같은 여러 유형의 세포들이 IL-17A를 생산할 수 있다.

본 발명에서 IL-17A 단백질은, 당업계에 공지된 IL-17A 단백질 또는 폴리펩타이드로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명의 IL-17A는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_002181(서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어짐), AAH67505.1 등으로 공지된 것을 포함하고, 마우스(Mus musculus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_034682 등으로 공지된 것을 포함한다. 본 발명에서 상기 IL-17A는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란, 공지의 IL-17A 단백질을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 공지의 IL-17A 단백질(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서'실질적으로 동질의 생리활성'이란 뇌전증 관련 불안 장애를 조절(예방, 개선 또는/및 치료)하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 IL-17A의 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 IL-17A 의 기능적 동등물에는, IL-17A 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 IL-17A 의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 IL-17A 의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 IL-17A 의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1, 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 2)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, IL-17A 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에서 용어 '핵산','DNA 서열','RNA 서열' 또는 '폴리뉴클레오티드'는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 'IL-17A 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 IL-17A mRNA'는 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 NCBI(Genbank) Accession No. NM_002190(서열번호 2)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서 '아날로그(analog)'라 함은 표준물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.

본 발명에서 '상동체(homologues)'라 함은 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.

본 발명에서 '접촉(contacting)'이라 함은 이의 일반적인 의미(normal meaning)이며, 2개 이상의 제제(예: 2개의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.

본 발명에서 '시험물질' 또는 '시험 제제(test agent)'라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다. 본 발명의 제제는, 바람직하게 구체적으로 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드(표적물질(예를 들어 IL-17A)에 특이적인 결합도메인을 갖는 펩티드), 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 천연추출물 및 화합물(천연화합물 및 합성화합물)을 모두 포함한다.

보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 항체, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.

상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다.

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는, IL-17A 전장 단백질 또는 이의 단편(단편 폴리펩타이드)이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 IL-17A 에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. IL-17A의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. IL-17A 의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일례로 하기 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5, 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에서 "miRNA, siRNA 또는 shRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상, IL-17A의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 'microRNA(miRNA)'란 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA를 의미한다. 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 상보적인 염기 서열을 가진 표적(target) mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다.

본 발명에서 사용되는 용어 'siRNA(small interfering RNA)'란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA간섭(RNA interference; RNAi) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

본 발명에서 용어 'shRNA(small hairpin RNA)'란 단일 가닥으로 50-60개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 즉, shRNA는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열이다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 15-30개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다. shRNA는 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 유전자 발현억제가 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합한다. 이들 RISC는 mRNA에 결합하여 이를 절단한다. shRNA는 RNA 폴리머레이즈(polymerase)에 의해 전사된다.

본 발명에서 '안티센스 뉴클레오티드'는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙 mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다. 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포 흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

본 발명에서 '펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)'는 IL-17A 단백질의 결합도메인을 억제하여 IL-17A 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, '구조적으로 강제된(conformationally constrained)'펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 IL-17A 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.

본 발명에서 '앱타머(aptamer)'는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

본 발명에서 'IL-17A 항체' 또는 'IL-17A에 대한 항체'는 IL-17A 의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 IL-17A 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다.

상기한 바와 같은 IL-17A에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 IL-17A 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 바람직하게 상기 단편은 모(母)항체의 IL-17A 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 뇌전증 관련 불안장애(뇌전증 동반이환 불안장애)의 원인이 되는 새로운 치료 표적으로서, 인터류킨-17A(IL-17A)을 규명했다. 즉, 본 발명자들은 IL-17A 결실(deletion)이, 해마 신경 보호 및 발작-유발 비정상 신경 발생의 감소를 통해, 뇌전증 관련 불안 장애를 치료 및/또는 개선시킬 수 있음을 입증했다. 또한 상기 입증에 따라, IL-17A은 상기 장애의 치료용 마커로서 기능함을 알 수 있다. 즉 피검체(환자)에 임의의 치료 요법을 적용할 때 상기 피검체에서 IL-17A의 수준 변화(특히 감소)를 검출 또는 측정함을 통해 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가가 가능하여 마커로서 기능함이 뒷받침 된다.

본 발명의 일 실시예에서, 6주령 IL-17A 야생형(WT)과 IL-17A 넉아웃(KO) 마우스를 사용하여, 필로카르핀(pilocarpine) 주사를 통해 뇌전증성 발작(epileptic seizure)을 유발했다. 마우스가 중앙 영역이나 개방 공간에서 보내는 시간을 측정하여 불안 수준을 평가하기 위해 마우스들에 개방 필드 테스트(open field test) 및 고가 십자 미로 테스트(elevated plus maze test)를 수행하였으며, 이들이 중앙 영역(center zone) 이나 오픈 암(open arm) 영역에 머무르는 시간을 측정했다. 뇌전증성 IL-17A WT 마우스는 주촉성(thigmotaxis)을 보이고 오픈 암에서 머무르는 것을 꺼려한 반면, IL-17A KO 마우스는 중앙 영역 및 오픈 암에서 더 많은 시간을 보냈는데 이는 뇌전증에서의 불안이 완화되었음을 시사한다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 신경생물학적 메커니즘을 조사하기 위한 조직학적 평가에 따르면, IL-17A KO 마우스에서 Fluoro-Jade B 염색에 의해 평가된 해마 신경 세포사가 유의하게 감소하였다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 필로카르핀으로 유도된 뇌전증 지속상태(status epilepticus) 6주 후, IL-17A 결핍에 의해 해마 치상문의 이소성 과립세포들(hilar ectopic granule cells, EGCs)의 수가 현저히 감소하였고, 이때 치상회(dentate gyrus, 해마 내부에 위치)에서의 신경전구세포 증식이나 신생뉴런의 생성에는 차이가 없음을 확인하였다.

따라서 본 발명은, IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 IL-17A 단백질 발현 억제제는 IL-17A mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 IL-17A 단백질 활성 억제제는 IL-17A 단백질에 특이적으로 결합하는(상보적으로 결합하는) 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시 양태에서, IL-17A의 발현 또는 활성 억제제는, 바람직하게는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드, 펩타이드, 펩티드 미메틱스, 항체, 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 IL-17A 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 '예방'이란 본 발명의 대상 질환(본 발명에서, 뇌전증 관련 불안장애) 발병 전에 선제적으로 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 본 발명의 대상 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '치료'란 본 발명의 대상 질환(본 발명에서, 뇌전증 관련 불안장애) 발병 후에 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 본 발명의 대상 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 '개선'이란 본 발명에서 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, IL-17A의 발현을 억제시키는 경우 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 및 치료 효과를 가지므로, 본 발명은 구체적 일 양태로서, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 IL-17A의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 조성물(특히, 약학적 조성물)을 제공한다. 상기에서 IL-17A의 발현을 억제하는 구조 유전자는 IL-17A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA shRNA 또는 miRNA일 수 있다.

상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터, CaMV 35S 프로모터, Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

한편. 상기 발현벡터는 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포(숙주 세포) 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다. 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다.

또한 본 발명에 적용 가능한 방법으로서, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus), 렌티바이러스(Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다. 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 상기 IL-17A의 발현을 억제하는 구조 유전자(예를 들어 antisense RNA, siRNA shRNA 또는 miRNA)는 다른 방법, 예를 들면, 국소적으로, 경구(설하 적용 포함) 투여 및 비경구 투여로서 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 주사법 및 점적법을 포함한다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직을 치료하기 위한 유효량으로 뇌전증 관련 불안 장애의 병소 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식 기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 대한 투여 경로 유효성이 입증된 병소의 경우에는 본 발명의 구조유전자(또는 본 발명의 구조유전자를 포함하는 발현벡터)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 병소에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다. 이때, X-선, 소노그램(sonogram), 또는 광섬유 시스템(fiberoptic visualization system)과 같은 영상 장치가 표적조직의 위치확인과 바늘 또는 도관의 주입에 사용될 수 있다. 그 밖에, 직접적으로 도달할 수 없거나 분석학적으로 분리해낼 수 없는 병소의 경우에는 본 발명의 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 구체적 일 양태로서, IL-17A에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. IL-17A에 대한 항체는 전술한 바를 참조로 하여 이해된다.

본 발명에서 용어 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질 또는 조성물을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액 (Ringer' solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산 에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용 될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃), 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴,마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57) 와 같은 기제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한 본 발명은

상기 IL-17A 유전자를 발현하는 분리된 세포는 생체 외로 분리된 세포를 의미한다. 또한 상기 (a) 단계에서 시험물질을 분리된 세포에 접촉시킨다는 것은, 상기 세포를 포함하는 조직 또는 시료(일례로 생물학적 시료, 피검체로부터 분리된 생물학적 시료 등) 등의 임의의 조성물과 시험물질을 접촉시키는 것을 의미한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 세포는, IL-17A 유전자를 발현할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 일례로 천연 상태에서 IL-17A 유전자를 발현하는 것으로 알려진 세포 또는 IL-17A 유전자가 발현되도록 인공적으로 작제한 세포 일 수 있다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 스크리닝 방법에서의 세포는, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 신경세포(neuron), 신경줄기세포(neural stem cell), 별아교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 IL-17A 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 구체적 일 실시양태에서, 상기 IL-17A 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은, IL-17A mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 일례로, 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 (a), (b) 및 (c) 단계를 포함하는 스크리닝 방법은, 당업자에게 뇌전증 관련 불안 장애의 예방제 또는/및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법으로 이해될 수 있다.

따라서 본 발명의 일 실시 양태에서, 본 발명은

(c) 대조군 세포와 비교하여 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 시험 물질을 후보물질로 판별 또는/및 선별하는 단계를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 전술한 스크리닝 방법들은 상기 (c) 단계 이후에, 하기 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있다.

(d) 뇌전증 관련 불안 장애 동물(비-인간 동물) 모델에서 상기 (c) 단계에서 선별된 예방 또는 치료제 후보물질의 효과를 확인하는 단계.

본 발명은 IL-17A의 유전자 또는 단백질을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안장애) 치료 요법의 효능 지표(효과 평가용) 마커 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안장애) 치료 요법의 효능 지표 (효과 평가용) 마커 조성물을 제공한다.

구체적 일 양태로서 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용(치료 효과 평가용) 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애치료 요법의 효능 평가용(치료 효과 평가용) 키트를 제공한다. 본 발명의 구체적 일 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 구체적 일 실시양태에서, 본 발명의 상기 키트는, 후술하는 본 발명의 뇌전증 관련 불안 장애 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 본 발명의 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 조성물 또는 키트에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 IL-17A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.

또한 상기 본 발명의 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 조성물 또는 키트에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, 당업계에 공지된 수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 IL-17A 단백질에 특이적인 항체 일 수 있다.

상기 측정 제제들은 주어진 조건에서 이의 확인, 검출, 측정 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.

상기 측정 제제의 확인, 검출, 측정 및 정량은 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

또한 상기 본 발명의 뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법의 효능 평가용 키트는, IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제와 별도로 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 전술한 표지, 이의 검출에 사용되는 물질, 및 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은, 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법으로,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는(판정하는) 것인, 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 IL-17A의 발현수준 변화는, 상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는(판정하는) 것을 특징으로 한다.

환자마다 개인화된(personalized) 치료 요법을 선택 및 제공하는데 있어서 본 발명은 이점을 가진다.

본 발명에서 상기 '생물학적 시료(생물학적 샘플)는', 이에 제한되지 않으나, 상기 피검체(환자)로부터 채취된(분리된) 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 일례로 상기 세포는 신경세포(neuron), 신경줄기세포(neural stem cell), 별아교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것 일 수 있다. 상기 조직은 상기 세포들을 포함하는 조직 일 수 있다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 피검체로부터 채취된 유체(액체) 시료 일 수 있다. 일례로, 상기 유체 시료는 뇌척수액, 혈액, 토사물, 타액, 림프액, 낭포액, 뇨, 기관지 세정에 의해 회수된 유체, 복막 세정에 의해 회수된 유체(복막액) 및 부인과적 유체(질액, 자궁 또는 질 세정에 의해 회수된 유체 등)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 제1 생물학적 시료 및 제2 생물학적 시료는 동일한 종류인 것일 수 있다.

상기 본 발명에서, 상기 IL-17A의 발현수준은, 바람직하게 IL-17A 단백질 또는 유전자(ex. mRNA) 발현 수준을 의미하는 것이다. 이들의 수준을 측정하는 방법은 본 명세서의 다른 부분에서 기재한 바를 참조로 이해된다.

본 발명에서 상기 '치료 요법'은, 당업계에 뇌전증 치료, 불안장애 치료, 또는/및 뇌전증 관련 불안장애의 치료에 유효할 것으로 당업자가 예측한 임의의 물질, 수단 및 방법을 모두 포함하는 것으로, 일례로 수술, 방사선요법, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장 인자 또는 사이토킨을 이용한 치료법, 화학치료법, 동종 줄기 세포 치료법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료법일 수 있다. 또한 일례로, 상기 화학 치료법은 공지의 뇌전증 치료제 또는 불안장애 치료제(항-불안제, 또는 신경안정제)를 투여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명은 뇌전증 관련 불안 장애 치료 유효성의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 비교하는 방법으로,

뇌전증 관련 불안 장애 치료요법이 상기 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료요법이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 방법은 환자(피검체)에 적용된 임의의 치료 요법에 대하여, 해당 치료 요법에 대한 환자(피검체)의 순응도 모니터링 방법으로 이해될 수 있다.

따라서 상기 실시 양태에서 일 구현예로, 본 발명은

뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 순응도 모니터링 방법으로,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적이고 환자가 상기 치료 요법에 순응하고 있음을 지시(판정)하는 것인, 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 IL-17A의 발현수준 변화는, 상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적이고 환자가 상기 치료 요법에 순응하고 있음을 지시하는(판정하는) 것을 특징으로 한다.

상기 실시 양태에서 또 다른 일 구현예로, 본 발명은

뇌전증 관련 불안 장애 치료 순응도 모니터링을 위하여 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 비교하는 방법으로,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적이고 환자가 상기 치료 요법에 순응하고 있음을 지시하는(판정하는) 것인, 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 IL-17A의 발현수준 변화는, 상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적이고 환자가 상기 치료방법에 순응하고 있음을 지시하는(판정하는) 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 본 발명의 방법은 뇌전증 관련 불안 장애의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위한 방법으로 이해될 수 있다. 특히 환자마다 개인화된(personalized) 치료 약물을 선택 및 제공하는데 있어서 본 발명은 이점을 가진다.

따라서 상기 실시 양태에서 일 구현예로, 본 발명은

뇌전증 관련 불안 장애의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법으로,

뇌전증 관련 불안 장애 치료 약물이 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료 약물이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,

상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 약물이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는(판정하는) 것인, 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 IL-17A의 발현수준 변화는, 상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 약물이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는(판정하는) 것을 특징으로 한다.

상기 실시 양태에서 또 다른 일 구현예로, 본 발명은

뇌전증 관련 불안 장애의 치료용 약물 선택에 필요한 정보를 제공하기 위하여 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 비교하는 방법으로,

뇌전증 관련 불안 장애 치료 약물이 상기 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료 약물이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1) 실험동물

IL17A+/- 마우스를 교배시켜 IL17A+/+(WT) 및 IL17A -/-(KO) 마우스를 수득하였다. 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해, 각 마우스의 유전자형(genotype)을 분석했다. 모든 실험절차는 한국 가톨릭대학교 IACUC(Institutional Animal Use and Care Committee/ 승인번호: CUMS-2020-0342-01, 2020-0103-04)의 승인을 받아, 국립보건원(National Institutes of Health)의 지침에 따라 진행됐다. 모든 마우스는 12시간 광-12시간 암 주기 환경에서, 식이와 음수가 자유식이(ad libitum)로 공급되는 동물 시설에 수용했다.

primer	Sequence (5' - 3')
Forward primer for WT genotype (서열번호 3)	ACT CTT CAT CCA CCT CAC ACG A
Reverse primer for WT genotype (서열번호 4)	CAG CAT CAG AGA CTA GAA GGG A
Forward primer for KO genotype (서열번호 5)	GCC ATG ATA TAG ACG TTG TGG C
Reverse primer for KO genotype (서열번호 6)	CAG CAT CAG AGA CTA GAA GGG A

2) 필로카르핀-유도 뇌전증 마우스 모델(Pilocarpine-induced mouse model of epilepsy)

뇌전증성 발작(epileptic seizure, 간질 발작)은 이전 연구(Jeong et al., 2011;Cho et al., 2019;Choi et al., 2021)들에서 공지된 방법대로, 필로카르핀 주입에 의해 유도되었다. 본 방법에 의한 뇌전증 동물 모델은, 뇌전증 관련 불안(뇌전증 동반이환 불안장애)를 동반하게 된다. 간략하게 설명하면 다음과 같다. 필로카르핀의 말초 콜린성 부작용을 최소화하기 위해, 먼저 6주령의 IL-17A WT와 KO 마우스에 scopolamine methyl nitrate (i.p.; 2 mg/kg; Sigma-Aldrich S2250)와 terbutaline hemisulfate salt (i.p.; 2 mg/kg; Sigma-Aldrich T2528)를 0.9%의 식염수를 사용하여 혼합 후 주입했다. 30분 후, 생리식염수(normal saline)를 이용하여 준비된 필로카르핀(240 mg/kg for male, 260 mg/kg for female, Sigma-Aldrich P6503)용액을 복강내(i.p.) 주입하여 뇌전증 지속상태(status epilepticus, 간질중첩증)를 유도하였다. 필로카르핀 주입 후, 마우스를 31℃로 유지되는 인큐베이터에 넣었다. 발작 단계는 mRS(modified Racine Scale) 척도에 따라 평가하였다: stage 1, 안면 간대성 경련(facial clonus); stage 2, 머리 끄덕임 (head nodding); stage 3, 앞다리 간대성 경련(forelimb clonus); stage 4, 일어서기(rearing); stage 5, 일어서기 및 넘어짐(rearing and falling). 오직 일관되게 stage 3 내지 stage 5를 보이는 동물들만 뇌전증 지속상태로 정의하고, 본 연구에 사용하였다. 간질 중첩증 유도 3시간 후, 행동 발작을 진정시키기 위해 diazepam(i.p.; 10 mg/kg; Sigma-Aldrich D0899)을 주입하였고, 그 후 회복을 촉진하기 위해 5% dextrose(i.p.; 1ml)를 단일 용량으로 투여하였다. 모든 실험 동물을 인큐베이터(28~30 ℃)에서 성장시키며, 체중이 증가할 때까지 2일 동안 물에 불린 음식을 먹였다. sham 대조군의 경우, 필로카르핀 대신 식염수를 주사한 것 이외에는, 실험 동물에 상기한 것과 동일하게 scopolamine 및 terbutaline을 주사하여 준비하였다(도 2a 참조).

3) 개방 필드 테스트(Open field test, OFT)

필로카르핀 투여 6주 후, 마우스를 사각형의 흰색 상자(44cm x 44cm x 30cm)에 넣고 15분간 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 하였고, 이를 천장에 장착된 비디오 카메라로 녹화했다. 모든 실험은 오전 7시에서 오전 9시 사이에 희미한 빛(dim light, 60 lux) 아래에서 수행되었다. 불안-유사 행동을 평가하기 위해, SMART 소프트웨어(Panlab Harvard Device)를 사용하여, 총 시간(total time) 대비 중앙 구역(central zon, 20cm x 20cm)과 주변 구역(peripheral zone)에서 보낸 시간의 백분율을 계산하였다(Ryu et al., 2018). 또한 각 마우스에 대해, 15분 시험 동안 이동한 총 거리를 평가하여, 운동성(locomotor activity)을 평가하였다.

4) 고가 십자 미로 테스트(Elevated plus maze(EPM) test)

상기 OFT 수행 하루 후, 마우스를 두 개의 개방 통로(open arm)와 두 개의 폐쇄 통로(closed arm)가 있는 고가 십자 미로(elevated plus maze)의 중앙에 위치시켰다. 상기 고가 십자미로의 각 통로(arm)는 너비 5cm, 길이 35cm, 높이 75cm 였다. 폐쇄 통로(closed arm)는 20cm 높이의 외벽으로 덮여 있었다. 5분 동안 실험동물을 60룩스의 빛 강도 조건 하의 EPM에서 자유롭게 돌아다닐 수 있게 하였고, 실험이 끝난 후 케이지(cage)로 돌려보냈다. 불안 수준을 평가하기 위해, 총 시간 중 개방 통로(open arm)에 있었던 시간의 백분율을 SMART 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.

5) 비디오/EEG 모니터링 (Video/electroencephalogram monitoring)

비디오/EEG 녹화는 하기 문헌에서 이전에 공지된 방법에 따라 수행되었다 : Brulet et al., 2017; Kim and Cho, 2018. 뇌전증 지속상태 유발 5주 후, 경막외 전극(epidural electrode)을 브레그마(bregma)로부터 전후측(AP) + 0.1 mm, 내외측(ML) + 0.1 mm (reference)에, 뇌피질 전극(cortical electrode)을 브레그마(bregma)로부터 AP - 0.2 mm, ML + 0.22 mm에 정위로(stereotaxically) 이식하였다. 이러한 신경신호 기록을 위한 전극들(recording electrode)은 마우스 등의 피하에 위치시킨 무선 EEG transmitter(TA11ETAF10; Data Sciences International)에 연결되었다. 전극 이식 수술로부터 회복을 위한 1주일 경과 후, 자발적 재발성 뇌전증 발작(spontaneous recurrent seizure, SRS)이 14일 동안 24시간 모니터링되었으며, 이를 기반으로 SRS의 빈도 및 각 발작의 지속 정도를 분석하였다. 비디오 녹화로도 확인된 3초 이상 지속되는 반복적인 간질형 스파이크(≥3 Hz, epileptiform spiking)를 경련성 발작(convulsive seizure)으로 정의하였다.

6) 조직학적 평가 (Histologic assessments)

필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 3일 또는 42일차에, 마우스에 케타민(50 mg/ml)과 자일라진(23.3 mg/ml)의 혼합액(4:0.5)을 2.5 ml/kg(body weight) 용량으로 투여하여 깊게 마취시켰다. 마우스를 생리식염수(normal saline)로 경심 관류(perfused transcardially)하였다. 뇌를 적출한 후, 4% paraformaldehyde(in 0.1M PBS)로 3일간 고정하였고, 그 후 30% sucrose 용액(in 0.1M PBS)으로 동결보호(cryoprotection)시켰다. 그런 다음, 뇌를 이등분하고, 동결절편기(cryostat)를 사용하여 상기 등분된 뇌를 관상으로 절단(coronally cut, 두께 30μm)했다.

퇴행성 뉴런(degenerating neuron)을 평가하기 위해, SE(뇌전증 지속상태 또는 간질중첩증) 유발 후 3일째인 마우스 샘플을 이용하여, Fluoro-Jade B (FJB) 염색을 수행하였다. 뇌 해마 절편은 현미경 슬라이드에 마운팅(mounting)되었다. 그 후 슬라이드를 증류수에 1분간 넣은 후, 0.06% KMnO₄ 용액에 7분간 담가(soaking) 산화시켰다. 0.1% 아세트산에 희석한 0.001% FJB(Biosensis, TR-150-FJB) 용액으로 절편을 30분 동안 염색하였고, 1분씩 3회 증류수로 헹구고, 1시간 동안 건조시켰다. 자일렌으로 슬라이드를 탈수시키고, DPX mounting medium(dibutylphthalate polystyrene xylene mounting medium) 처리와 함께 커버를 덮었다. 그 후, Lionheart FX (Biotek)로 염색 이미지를 수득하였다.

면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)을 위하여, 기존에 공지된 것과 같은 방법으로 자유부유법(free-floating method)을 수행하였다(Jang et al., 2019;Cho et al., 2020). 간략하게 설명하면 다음과 같다. 절편을 0.01 M PBS 로 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 3.5% 과산화수소 용액에 두어 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase) 활성을 제거했다. 0.01 M PBS로 세척한 후, 3% normal goat serum 및 0.3% Triton X-100을 포함하는 blocking solution 에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 4 ℃에서 밤새 하기 1차 항체와 반응시켰다: rabbit anti-Ki67 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, sc-23900), guinea pig anti-doublecortin (DCX, 1:1000, Millipore, AB2253), rabbit anti-Prox1 (1:2000, Millipore, ABN278), rabbit anti-Iba1 (1:500, Wako, 019-19741). 및 mouse anti-GFAP (1:1000, Millipore, MAB360). 다음날, 0.01M PBS로 세척한 후, 절편을 과산화효소-접합된 2차 항체와 함께 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 절편을 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) 용액으로 발색시키고, DPX로 마운팅(mounting)하였다. 광학 현미경(BX51; Olympus) 하에서 이미지를 수득하였다.

7) 현미경 분석 및 정량화 (Microscopic analysis and quantification)

기존에 공지된 방법으로(Brulet et al., 2017), 면역반응성 세포 또는 FJB-양성(FJB-positive) 세포를 정량하였다. 과립세포층(granule cell layer, GCL)의 안쪽 가장자리로부터, 과립 세포 1개의 평균 직경 이내의 영역이, 과립하구역(subgranular zone: SGZ)으로 정의되었다. 치상회 문(hilus)은, SGZ를 제외하고 GCL의 상부 및 하부 블레이드(upper and lower blades of GCL)의 끝점을 연결하는 삼각형 영역으로 정의되었다.

CA1 및 CA3 추체상 세포층(pyramidal cell layer, PCL)은 PCL 두께 및 세포체 크기(soma size)에 의해 결정되었으며, CA1 PCL가 더 얇고, CA3 뉴런들이 상대적으로 더 큰 세포체(soma)를 가졌다. 해마 전체에 걸쳐 모든 12번째 관상 절편(every 12th coronal section) 내에서 각 마커-양성 세포들을 카운팅(counting)하였고, 상기 카운팅된 결과 모두를 더하고 24를 곱하여 각 실험동물의 총 세포수를 추정하였다.

8) 통계적 분석(Statistical analysis)

데이터는 '평균±SEM(standard error of the mean)'으로 나타내었고, 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9 software (GraphPad Software Inc.)를 사용하여 평가되었다. 실험 그룹은 무작위로 지정되었으며, 정확한 샘플 크기는 도면의 설명(figure legend)에 기재하였다. 실험적 편향(experimental bias)를 줄이기 위해, 유전자형을 모르는 연구자가 행동 테스트를 수행했다. 통계적 차이는 등분산 데이터(data with equal variance)에 대한 two-tailed Student's unpaired t-test를 통해 확인하였다. 정규 분포(normal distribution)를 가정하지 않은 경우에는, Mann-Whitney U test를 수행했다. p < 0.05 는 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1. IL-17A의 결실에 따른 뇌전증 관련 불안장애(Epilepsy-associated Anxiety)의 개선 효과

만성 뇌전증-관련 불안장애에서 IL-17A의 역할을 조사하기 위해, 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태, 간질중첩증) 유발 후 6주째에, IL-17A WT 및 IL-17A KO 마우스에 대하여 개방 필드 테스트(open field test) 및 고가 십자 미로 테스트(elevated plus maze test)를 수행하였다(도 1a).

개방 필드 시험장(open field arena)의 중앙 구역 및 주변 구역을 정의한 후(도 1b), 각각 중앙 구역 및 주변 구역에서 보낸 시간의 백분율을 산정했다. 개방 필드 시험 결과를 도 1c 및 도 1d에서 보여준다. 뇌전증 IL-17A KO 마우스는, 뇌전증 IL-17A WT 마우스에 비해 중앙 구역에서 더 많은 시간을 보내고 개방 필드 시험장의 주변 구역을 피했으며(도 1c 및 도 1d), 각 마우스 그룹 내에서 마우스 성별 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다(도 1g 및 도 1h). 그러나, 개방 필드(open field)에서 움직인 총 이동 거리는 상기 뇌전증성 IL-17A WT 및 KO 마우스들에서 비슷하였으며(도 1d 참조), 이는 두 마우스 군에서 운동성(locomotor activity)의 차이가 없음을 나타낸다.

만성 뇌전증에서 IL-17A 결핍(deficiency)에 의한 항-불안 효과를 확인하기 위해, 불안 상태를 테스트하기 위해 널리 사용되는 또 다른 행동 분석인 고가 십자 미로 테스트(elevated plus maze test)를 수행했고, 그 결과를 도 1e 및 도 1f에서 보여준다. 개방 필드 테스트와 일치하게, 뇌전증성 IL-17A KO 마우스는 뇌전증성 WT 마우스 그룹에 비해 개방 통로들(open arms)에서 현저하게 긴 탐색 시간을 보내는 것으로 나타났으며(도 1e 및 도 1f), 각 마우스 그룹 내에서 마우스 성별 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다(도 1i).

그러나, 대조군 sham IL-17A WT 및 sham KO 마우스들 간의 불안-유사 행동(anxiety-like behaviors)과 비교하였을 때, 이들이 개방 필드 시험장의 중앙 구역 및 고가 십자 미로의 개방 통로들(open arms)에서 보낸 시간에는 유의한 차이가 없었고(도 2b, 도 2c, 도 2d 및 도 2e 참조), 이는 IL-17A의 감소에 의해서는 기본 불안 수준(basal anxiety level)이 변하지 않음을 입증하는 것이다. 종합하면, 이러한 결과는, IL-17A를 차단하는 것이 만성 뇌전증에서 높아진 불안감을 완화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 2. IL-17A의 결실이 자발적 재발성 뇌전증 발작(Spontaneous Recurrent Seizures, SRS)의 발생 여부에 영향을 주지 않음을 확인

뇌전증 발생(epileptogenesis)에 대한 IL-17A 결실의 기능적 역할을 평가했다. 이를 위해 뇌전증성 IL-17A WT 마우스 및 뇌전증성 KO 마우스에 대하여, 지속적인 비디오-EEG 모니터링을 실시했다. 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 5주차에, 무선 EEG 기록을 위해 마우스에 뇌피질 전극 및 경막외 전극 2개를 이식했고, 이때 하나는 해마(left parietal cortex; LPC) 위에, 다른 하나는 후각 망울(olfactory bulb/ reference; Ref) 위에 위치시켰다(도 3a 및 도 3b 참조). 일주일 후, 자유롭게 움직이는 마우스들에 대하여 2주 동안 비디오-EEG 기록을 시행했다(도 3a).

실험 결과 도 3c 및 도 3d에 나타낸 바와 같이, IL-17A의 결실은 SRS 빈도나 각 발작 사건의 총 지속 시간에 크게 영향을 미치지 않았다. 이는 IL-17A 결실이 뇌전증 발생에 유의한 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.

또한 도 13a 및 도 13b에 나타낸 바와 같이, 필로카르핀 주사 후 IL-17A WT 마우스 및 IL-17A KO 마우스에서, 첫 번째 발작 시작 시간(min) 및 뇌전증 지속상태(SE, 간질중첩증) 시작 시간(min)은, 각 마우스 그룹 내의 마우스 성별 간에 유의한 차이가 없었다.

실시예 3. IL-17A의 결실에 따른 필로카르핀-유도 해마 신경의 세포사(Hippocampal Neuronal Death) 예방 효과

필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 3일 후 IL-17A 결핍으로 인한 조직학적 변화를 조사했다. 퇴행성 뉴런을 특이적으로 표지할 수 있는 FJB 염색에 의해, 필로카르핀 유도 SE 유발 후 3일차에 죽어가는 해마 세포를 명확하게 확인할 수 있었다(도 4a 및 도 4b 참조).

뇌전증 IL-17A WT 그룹과 비교했을 때, 해마의 CA1 및 CA3 세부영역에서 FJB-양성 뉴런의 수는 뇌전증 IL-17A KO 마우스에서 현저하게 감소했으며, 이때 해마 치상문 뉴런의 세포사(hilar neuronal death)에는 차이가 없었다(도 4b 및 도 4c 참조). sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스에서는 각 그룹간에, 어느 세부구역에서도 FJB-양성 뉴런의 수의 유의적 차이가 없었다(도 9).

이러한 데이터는, 필로카르핀-유도 SE 유발 후 IL-17A를 차단하면, 흥분독성 해마 신경 세포사(excitotoxic hippocampal neuronal death)를 예방할 수 있음을 나타낸다.

보충적으로, 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 3일 후 IL-17A 결핍으로 인한 신경염증에 대한 영향을 조사했다. 실험 결과, 반응성 미세아교세포증(reactive microgliosis)은 두 그룹 간에 유사했고(도 7a 및 도 7b), 반응성 별아교세포증(reactive astrocytosis) 또한 두 그룹간에 유사했으나(도 8a 및 도 8b) CA3 구역에서는 IL-17A KO 마우스에서 유의하게 별아교세포의 활성이 증가하였다.

실시예 4. IL-17A의 결실에 의한, 해마 치상문 이소성 과립 뉴런들(hilar ectopic granule neurons, hilar EGCs)의 생성 감소 효과

성인의 신경발생(neurogenesis)은 불안의 조절에 관계되기 때문에, IL-17A의 결핍이 발작으로 인한 해마 신경발생을 조절할 수 있는지 여부를 평가했다.

Ki67에 대한 면역조직화학(Immunohistochemistry) 분석 결과, 뇌전증 IL-17A WT와 뇌전증 IL-17A KO 그룹 간에 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 필로카르핀-유도 SE(뇌전증 지속상태) 유발 후 3일차에 신경 전구세포(neural progenitor)들이 유사한 증식 활성을 보여주었다(도 5a 및 도 5b 참조). sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스에서는 각 그룹간에 Ki67-양성 뉴런의 수의 유의적 차이가 없었다(도 10a 및 도 10b).

뇌전증 IL-17A WT와 뇌전증 IL-17A KO 두 그룹 간에 과립하구역(SGZ)과 치상문(hillus)에서 DCX-발현 신생 뉴런의 수도 비슷하였다(도 6a 및 도 6b 참조). sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스에서는 각 그룹간에 과립하구역(SGZ)과 치상문(hillus)에서 DCX-발현 신생 뉴런 수의 유의적 차이가 없었다(도 11a 및 도 11b).

그러나 IL-17A KO 마우스에서 해마 치상문 Prox1-면역반응 세포(hilar Prox1-immunoreactive cell)의 수가 유의미하게 감소하였고(도 6c 및 도 6d 참조), 이는 IL-17A 결핍에 의해 해마 치상문 이소성 과립 뉴런 세포(hilar ectopic granule neuron cell)들의 수가 감소되었음을 나타낸다. 그러나 sham IL-17A WT 마우스 및 sham IL-17A KO 마우스에서는 각 그룹간에 Prox1-양성 세포 수의 유의적 차이가 없어 IL-17A 결손만으로는 이소성 과립 뉴런 세포 생성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 12a 및 도 12b).

종합적으로, 이러한 결과들은, 필로카르핀-유도 SE 후 IL-17A의 감소가 발작-유발 이상 해마 신경발생(seizure-induced aberrant hippocampal neurogenesis), 특히 hilar EGC의 생성을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.

종합하여, 상기 실시예들은 IL-17A가 뇌전증 관련 불안 장애(뇌전증 동반이환 불안 장애)의 치료 타겟임을 입증한다. 뇌전증 관련 불안 장애의 치료를 위해서 IL-17A의 억제제가 필요하다는 것은, 다른 뇌신경(중추신경) 질환인 알츠하이머에서는 이의 관련(동반이환) 불안을 개선하기 위해서 IL-17A의 과발현이 필요하다는 기존 보고에 비추어 볼 때(Junling Yang et al., Intracranial IL-17A overexpression decreases cerebral amyloid angiopathy by upregulation of ABCA1 in an animal model of Alzheimer's disease, Brain Behav Immun. 2017 Oct;65:262-273.), 뇌전증 관련 불안 장애의 질환적 특이성을 나타내는 것이기도 하다.

또한 상기 실시예들은 IL-17A가 뇌전증 관련 불안 장애의 치료용 바이오 마커(therapeutic biomarker)임을, 즉 IL-17A가 뇌전증 관련 불안 장애의 치료 지표(치료 유효성 판별) 바이오 마커임을 입증한다. 따라서 피검체(환자)에 적용된 임의의 뇌전증 관련 불안 장애의 치료 요법(약물)에 대한 유효성(즉, 치료 효과가 있는지 여부, 및/또는 치료 효과를 나타내는 용량 등)을 측정, 판단 또는 판별하는데 있어서, 해당 치료 요법 적용 후에 해당 피검체(환자)에서 IL-17A의 수준 변화(특히, 감소) 여부 및 변화 크기 등을 통해, 상기 치료 요법(약물)의 효능 평가가 가능함이 당업자에게 자명하게 이해되는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Use of IL-17A as a therapeutic target and therapeutic biomarker for epilepsy-associated anxiety disorder <130> MP22-056 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of interleukin-17A (NCBI(Genbank) Accession No. NP_002181) <400> 1 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 2 <211> 1871 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic sequence of interleukin-17A <400> 2 gtccatctca tagcaggcac aaactcatcc atccccagtt gattggaaga aacaacgatg 60 actcctggga agacctcatt ggtgtcactg ctactgctgc tgagcctgga ggccatagtg 120 aaggcaggaa tcacaatccc acgaaatcca ggatgcccaa attctgagga caagaacttc 180 ccccggactg tgatggtcaa cctgaacatc cataaccgga ataccaatac caatcccaaa 240 aggtcctcag attactacaa ccgatccacc tcaccttgga atctccaccg caatgaggac 300 cctgagagat atccctctgt gatctgggag gcaaagtgcc gccacttggg ctgcatcaac 360 gctgatggga acgtggacta ccacatgaac tctgtcccca tccagcaaga gatcctggtc 420 ctgcgcaggg agcctccaca ctgccccaac tccttccggc tggagaagat actggtgtcc 480 gtgggctgca cctgtgtcac cccgattgtc caccatgtgg cctaagagct ctggggagcc 540 cacactcccc aaagcagtta gactatggag agccgaccca gcccctcagg aaccctcatc 600 cttcaaagac agcctcattt cggactaaac tcattagagt tcttaaggca gtttgtccaa 660 ttaaagcttc agaggtaaca cttggccaag atatgagatc tgaattacct ttccctcttt 720 ccaagaagga aggtttgact gagtaccaat ttgcttcttg tttacttttt taagggcttt 780 aagttattta tgtatttaat atgccctgag ataactttgg ggtataagat tccattttaa 840 tgaattacct actttatttt gtttgtcttt ttaaagaaga taagattctg ggcttgggaa 900 ttttattatt taaaaggtaa aacctgtatt tatttgagct atttaaggat ctatttatgt 960 ttaagtattt agaaaaaggt gaaaaagcac tattatcagt tctgcctagg taaatgtaag 1020 atagaattaa atggcagtgc aaaatttctg agtctttaca acatacggat atagtatttc 1080 ctcctctttg tttttaaaag ttataacatg gctgaaaaga aagattaaac ctactttcat 1140 atgtattaat ttaaattttg caatttgttg aggttttaca agagatacag caagtctaac 1200 tctctgttcc attaaaccct tataataaaa tccttctgta ataataaagt ttcaaaagaa 1260 aatgtttatt tgttctcatt aaatgtattt tagcaaactc agctcttccc tattgggaag 1320 agttatgcaa attctcctat aagcaaaaca aagcatgtct ttgagtaaca atgacctgga 1380 aatacccaaa attccaagtt ctcgatttca catgccttca agactgaaca ccgactaagg 1440 ttttcatact attagccaat gctgtagaca gaagcatttt gataggaata gagcaaataa 1500 gataatggcc ctgaggaatg gcatgtcatt attaaagatc atatggggaa aatgaaaccc 1560 tccccaaaat acaagaagtt ctgggaggag acattgtctt cagactacaa tgtccagttt 1620 ctcccctaga ctcaggcttc ctttggagat taaggcccct cagagatcaa cagaccaaca 1680 tttttctctt cctcaagcaa cactcctagg gcctggcttc tgtctgatca aggcaccaca 1740 caacccagaa aggagctgat ggggcagaac gaactttaag tatgagaaaa gttcagccca 1800 agtaaaataa aaactcaatc acattcaatt ccagagtagt ttcaagtttc acatcgtaac 1860 cattttcgcc c 1871 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for WT genotype <400> 3 actcttcatc cacctcacac ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for WT genotype <400> 4 cagcatcaga gactagaagg ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KO genotype <400> 5 gccatgatat agacgttgtg gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KO genotype <400> 6 cagcatcaga gactagaagg ga 22

Claims

IL-17A 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy- associated anxiety disorder)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IL-17A 단백질 발현 억제제는 IL-17A mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IL-17A 단백질 활성 억제제는 IL-17A 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(mimetics), 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 시험 물질을 IL-17A 유전자를 발현하는 분리된 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 IL-17A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계
를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애의 치료제 스크리닝 방법.
제4항에 있어서, 상기 세포는 신경세포(neuron), 신경줄기세포(neural stem cell), 별아교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 단백질 발현 또는 활성 수준 측정은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 IL-17A 유전자 발현 또는 활성 수준의 측정은 IL-17A mRNA 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 mRNA 발현 또는 활성 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 시험물질은 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 천연추출물 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
IL-17A의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 요법의 효능 지표 마커 조성물.
IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 요법의 효능 평가용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는
IL-17A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 IL-17A 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
IL-17A의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 요법의 효능 평가용 키트.
뇌전증 관련 불안 장애(epilepsy-associated anxiety disorder) 치료 유효성의 판정을 위한 정보 제공 방법으로,
뇌전증 관련 불안 장애 치료 요법이 뇌전증 관련 불안 장애를 앓고 있는 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준과 상기 치료 요법이 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 생물학적 시료에 존재하는 IL-17A의 발현수준을 측정하여 비교하는 단계를 포함하고,
상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준 변화가 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 발현수준 변화는
상기 제1 생물학적 시료와 비교하여 상기 제2 생물학적 시료에서의 IL-17A의 발현수준이 감소되었을 때 상기 요법이 상기 피검체의 뇌전증 관련 불안 장애를 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 상기 피검체로부터 채취된 세포, 조직 또는 유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 IL-17A의 발현수준은
IL-17A 단백질 또는 유전자 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 IL-17A 유전자 발현 수준은
IL-17A mRNA 발현 수준을 측정하는 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 키트는
제15항의 방법을 포함하는 내용이 교시된 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.