JP6992809B2 - 免疫疾患の治療のための高効能幹細胞の選別方法 - Google Patents

免疫疾患の治療のための高効能幹細胞の選別方法 Download PDF

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Description

本発明は、間葉系幹細胞でＩＦＮ－γで前処理刺激した後に免疫抑制バイオマーカーのレベルを測定するステップを含む免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞の選別方法、その方法によって選別された高効能間葉系幹細胞及びその高効能間葉系幹細胞を用いた免疫疾患の治療方法に関する。
従来、悪性及び非悪性の血液疾患、自己免疫疾患及び免疫欠乏の治療のために同種異系造血母幹細胞を移植する方法が広く利用されて来た。しかし、ヒト白血球抗原一致同胞（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｉｂｌｉｎｇ）を移植した後にも免疫疾患中の一つである移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）の発病及びこれによる死亡は解決課題として残っている。
移植片対宿主病は、宿主の抗原提示細胞によって活性化された供与者のＴ－細胞により誘発され、前記細胞は、ターゲット組織（皮膚、腸及び肝）に移動して標的機関の機能異常を誘発する。移植片対宿主病の１次的標準治療は、高い濃度のステロイドを処方することである。しかし、前記患者の５０％は前記１次治療法に反応せず、一旦ステロイド抵抗性が誘発されると、死亡率が増加することが知られているにもかかわらず、ステロイド抵抗性移植片対宿主病に対する２次的治療法がなく、追加的な治療代案が必要な実情である。
一方、成長因子、細胞間相互作用及び基質タンパク質を提供する骨髓間質細胞（Ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）は、骨髓の微細環境に存在する共通的前駆細胞に由来し、間葉系幹細胞としても知られている。間葉系幹細胞は、分化できる能力を有し、骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨前駆細胞を含む制限された細胞に分化できる潜在力を有する前駆細胞を生産することができる。間葉系幹細胞は、化学療法又は放射線療法により損傷された骨髓の微細環境で宿主細胞を代替することができ、遺伝子の治療のための手段に用いられ得る。
多くの研究によると、間葉系幹細胞が傷部位に移動して損傷された組織の復旧に寄与するだけでなく、免疫調節機能を有していることが報告された。間葉系幹細胞は、Ｔ－細胞、Ｂ－細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ ｃｅｌｌｓ）及び抗原提示細胞を含む免疫細胞の活性化、増殖及び機能を抑制する。間葉系幹細胞により媒介される免疫抑制は、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＴＧＦ－β、一酸化窒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のような可溶性因子からなり得る。
活性化されたＴ－細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及び大食細胞のような多様な類型の細胞から生成される強力な炎症誘発サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、自然免疫及び獲得免疫の反応において重要で且つ複雑な役目を実行し、急性移植片対宿主病において病原性因子として知られている。ＩＦＮ－γは、細胞分裂を抑制して細胞死滅を促進することで、同種反応性Ｔ－細胞を陰性的に調節し、授与者の実質細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ）と直接的な相互作用を通じて組織損傷を抑制する。
このように、以前のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を通じて活性化された間葉系幹細胞でＩＦＮ－γの役目が知られているが、間葉系幹細胞の移植を通じたｉｎ ｖｉｖｏ移植片対宿主病の治療機序に対しては知られていない実情である。
さて、本発明者らは、マイクロアレイ分析を通じて間葉系幹細胞の免疫調節機能と関連したバイオマーカーの発現プロファイルに対してＩＦＮ－γが及ぼす影響を分析し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｆｌｉｃｔｓの調節と関連した間葉系幹細胞の作用機序を確認しただけでなく、ＩＦＮ－γにより刺激された脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ；ＡＴ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ；ＣＢ）、ホウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ'ｓ ｊｅｌｌｙ；ＷＪ）及び骨髓に由来する間葉系幹細胞が移植片対宿主病のモデルで生存率を増加させることを確認することで、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は、ＩＦＮ－γを前処理刺激した後に特定の免疫抑制バイオマーカー（ＩＤＯ／ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１、ＴＲＡＩＬ）のレベルを測定するステップを含む免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞の選別方法及びそれによって選別された高効能間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及しなかったまた他の課題は、下の記載から当業者に明確に理解されるべきである。
本発明は、間葉系幹細胞でＩＦＮ－γを前処理刺激した後に免疫抑制バイオマーカーのレベルを測定するステップを含む免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞の選別方法を提供する。
本発明の一具現例によると、前記方法は、下記のステップを含むことを特徴とする。
（ａ）間葉系幹細胞を培養した後にＩＦＮ－γを処理するステップ；
（ｂ）間葉系幹細胞で免疫抑制バイオマーカーの発現レベルを測定するステップ；及び
（ｃ）前記発現レベルがＩＦＮ－γの未処理対照群と比較して増加する場合、免疫疾患の治療のための高効能幹細胞であると判定するステップ。
本発明の他の具現例によると、前記免疫抑制バイオマーカーは、ＩＤＯ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記免疫抑制バイオマーカーは、ＣＸＣＬ９（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ ９）、ＣＸＣＬ１０（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ １１）、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）、ＩＣＡＭ２（Ｉｎｔｅｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２）、Ｂ７－Ｈ１（Ｂ７－ｈｏｍｏｌｏｇ １）、ＰＴＧＤＳ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ２ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＶＣＡＭ１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）及びＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）からなる群より選択される一つ以上をさらに含むことを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記高効能は、免疫抑制能であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、ホウォートンゼリー、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜及び胎盤からなる群より選択されるものに由来することを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記免疫疾患は、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒絶反応、体液性拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、第１型糖尿、ルプス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性硬皮症、喘息又は潰瘍性大腸炎であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記ＩＤＯの発現は、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞でＪＡＫ／ＳＴＡＴ１の信号経路を通じて増加されることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記ステップ（ａ）のＩＦＮ－γは、培地内に１－１００ＩＵ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記ステップ（ｂ）のバイオマーカーの発現レベルは、ウエスタンブロッティング、抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、ＲＴ－ＰＣＲ、競合的ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング又はＤＮＡチップを用いて測定することを特徴とする。
また、本発明は、前記方法によって選別された免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞を提供する。
本発明の一具現例によると、前記免疫疾患は、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒絶反応、体液性拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患であることを特徴とする。
本発明の他の具現例によると、前記高効能は、免疫抑制能であることを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、ホウォートンゼリー、神経、皮膚、羊膜又は胎盤に由来することを特徴とする。
本発明のまた他の具現例によると、前記間葉系幹細胞は、自家、他家又は同種異系来由であることを特徴とする。
また、本発明は、前記高効能間葉系幹細胞を含有する免疫疾患治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明は、前記高効能間葉系幹細胞を含有する移植片対宿主疾患治療用医薬製剤を提供する。
また、本発明は、前記高効能間葉系幹細胞を個体に投与するステップを含む移植片対宿主疾患などの免疫疾患の治療方法を提供する。
また、本発明は、前記高効能間葉系幹細胞を用いた移植片対宿主疾患などの免疫疾患の治療用途を提供する。
本発明によると、ＩＦＮ－γで刺激した後、特定のバイオマーカーの組合せ（ＩＤＯ／ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１、ＴＲＡＩＬ）が移植片対宿主病を含む免疫関連疾患において最も優れた免疫抑制能を有する間葉系幹細胞を選別するためのバイオマーカーとして用いられ得ることを提示する。
したがって、本発明は、移植片対宿主病、自己免疫疾患を含む多様な免疫疾患の臨床的治療のための免疫反応の調節能力を有する機能的に優れた間葉系幹細胞が得られる有用な方法を提供することで、免疫疾患の治療法で有用に用いられ得る。
また、本発明のＩＦＮ－γを通じて活性化された間葉系幹細胞を用いた移植片対宿主病の予防及び治療は、同種異系幹細胞の移植のより高い治療的可能性を示す。
多様な組織（骨髓ＢＭ、脂肪ＡＴ、臍帯血ＣＢ及びホウォートンゼリーＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の形態を示す結果である。 表面抗原タンパク質（図１の（ｂ））を示す結果である。 分化誘導後の性状（図１の（ｃ））を示す結果である。 図２は、多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の免疫抑制特性を確認するために、ＰＨＡで活性化させた末梢血液単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の増殖率を評価した結果である。 多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の免疫抑制特性が細胞間の接触によるか可溶性因子によるかを確認するために、直接接触培養法及びトランスウェル培養法により比較評価した結果である。 多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の免疫抑制特性が細胞間の接触によるか可溶性因子によるかを確認するために、直接接触培養法及びトランスウェル培養法により比較評価した結果である。 多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の免疫抑制特性が細胞間の接触によるか可溶性因子によるかを確認するために、直接接触培養法及びトランスウェル培養法により比較評価した結果である。 多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞の免疫抑制特性が細胞間の接触によるか可溶性因子によるかを確認するために、直接接触培養法及びトランスウェル培養法により比較評価した結果である。 ｉｎ ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の免疫抑制機能を確認するために、マウスにｈＰＢＭＣ及び多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞をともに１回又は２回注入した後のマウス生存率を示す結果である。 ｉｎ ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の免疫抑制機能を確認するために、マウスにｈＰＢＭＣ及び多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞をともに１回又は２回注入した後のマウス生存率を示す結果である。 ｉｎ ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の免疫抑制機能を確認するために、マウスにｈＰＢＭＣ及び多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞をともに１回又は２回注入した後のマウス生存率を示す結果である。 ｉｎ ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の免疫抑制機能を確認するために、マウスにｈＰＢＭＣ及び多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）に由来する間葉系幹細胞をともに１回又は２回注入した後のマウス生存率を示す結果である。 図５は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の動物モデルにｈＰＢＭＣとともに骨髓由来間葉系幹細胞を注入するとき血液内のＩＦＮ－γ（炎症性サイトカイン）のレベルが減少されることを示す結果である。 図６は、ｈＰＢＭＣを多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）由来の間葉系幹細胞とともに培養した後の生存率を評価したもので、このとき、間葉系幹細胞はＩＦＮ－γ非刺激群（ＭＳＣＰＢＳ）と刺激群（ＭＳＣＩＦＮ－γ）間の生存率を比較した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病を改善させるかを確認するために、Ｎｏ ＭＳＣ、ＭＳＣＰＢＳ、ＭＳＣＩＦＮ－γ、ＭＳＣＡＧ４９０＋ＩＦＮ－γ投与群間のマウス生存率を比較評価した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病を改善させるかを確認するために、Ｎｏ ＭＳＣ、ＭＳＣＰＢＳ、ＭＳＣＩＦＮ－γ、ＭＳＣＡＧ４９０＋ＩＦＮ－γ投与群間のマウス生存率を比較評価した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病を改善させるかを確認するために、Ｎｏ ＭＳＣ、ＭＳＣＰＢＳ、ＭＳＣＩＦＮ－γ、ＭＳＣＡＧ４９０＋ＩＦＮ－γ投与群間のマウス生存率を比較評価した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病を改善させるかを確認するために、Ｎｏ ＭＳＣ、ＭＳＣＰＢＳ、ＭＳＣＩＦＮ－γ、ＭＳＣＡＧ４９０＋ＩＦＮ－γ投与群間のマウス生存率を比較評価した結果である。 図８は、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病のマウスモデルでＴ細胞の増殖抑制を誘導するかを確認するため、Ｎｏ ＭＳＣ、ＭＳＣＰＢＳ、ＭＳＣＩＦＮ－γ、ＭＳＣＡＧ４９０＋ＩＦＮ－γ投与群間のＣＤ４５＋細胞及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の数を比較測定した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を移植片対宿主病のマウスモデルに移植した後に組織学的分析を通じて組織への免疫細胞浸透が減少することを確認した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を移植片対宿主病のマウスモデルに移植した後に組織学的分析を通じて組織への免疫細胞浸透が減少することを確認した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した前後の間葉系幹細胞の形態を比較した結果である。 ＩＦＮ－γで刺激した前後の遺伝子発現プロファイルを比較した結果である。 図１１は、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞でＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ８及びＩＤＯ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが顕著に増加することを確認した結果である。 図１２は、多様な組織（ＢＭ、ＡＴ、ＣＢ、ＷＪ）由来の間葉系幹細胞をＩＦＮ－γで刺激したとき互いに類似にＩＤＯ発現が増加することを確認した結果である。 ＩＦＮ－γを媒介としたＩＤＯ発現がＪＡＫ／ＳＴＡＴ１の信号伝逹経路を通じて誘導されることを確認した結果である。 ＩＦＮ－γを媒介としたＩＤＯ発現がＪＡＫ／ＳＴＡＴ１の信号伝逹経路を通じて誘導されることを確認した結果である。 図１５は、ＳＴＡＴ１標的のｓｉＲＮＡ処理時にＩＦＮ－γの下位の信号伝逹経路が抑制されてｈＰＢＭＣの増殖抑制効果が遮断されることを示す結果である。 移植片対宿主病のマウスにＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を注入した後、間葉系幹細胞の組織内浸透及びＩＤＯ発現誘導を確認した免疫組織染色の結果である。 移植片対宿主病のマウスにＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を注入した後、間葉系幹細胞の組織内浸透及びＩＤＯ発現誘導を確認した免疫組織染色の結果である。 移植片対宿主病のマウスにＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を注入した後、間葉系幹細胞の組織内浸透及びＩＤＯ発現誘導を確認した免疫組織染色の結果である。 移植片対宿主病のマウスにＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を注入した後、間葉系幹細胞の組織内浸透及びＩＤＯ発現誘導を確認した免疫組織染色の結果である。 図１７の（ａ）～図１７の（ｃ）は、間葉系幹細胞の免疫抑制特性と関連したＩＤＯの役目を調べるため、ｓｈＲＮＡ処理でＩＤＯ発現阻害を確認した後（図１７の（ａ）、図１７の（ｂ））、ｈＰＢＭＣの増殖率変化（図１７の（ｃ））を確認した結果である。 図１７の（ａ）～図１７の（ｃ）は、間葉系幹細胞の免疫抑制特性と関連したＩＤＯの役目を調べるため、ｓｈＲＮＡ処理でＩＤＯ発現阻害を確認した後（図１７の（ａ）、図１７の（ｂ））、ｈＰＢＭＣの増殖率変化（図１７の（ｃ））を確認した結果である。 図１７の（ａ）～図１７の（ｃ）は、間葉系幹細胞の免疫抑制特性と関連したＩＤＯの役目を調べるため、ｓｈＲＮＡ処理でＩＤＯ発現阻害を確認した後（図１７の（ａ）、図１７の（ｂ））、ｈＰＢＭＣの増殖率変化（図１７の（ｃ））を確認した結果である。 図１８は、ＩＤＯの発現が減少された間葉系幹細胞にＩＦＮ－γを処理するか処理しない状態で移植片対宿主病のマウスに投与した後の生存率を比較評価した結果である。 図１９は、ＩＤＯの発現が減少された間葉系幹細胞にＩＦＮ－γを処理するか処理しない状態で移植片対宿主病のマウスに投与した後、小腸及び皮膚組織でＩＤＯダウン調節された間葉系幹細胞の存在を示す免疫組織染色の結果である。 図２０は、ＩＤＯを過発現する間葉系幹細胞の免疫抑制能をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した結果である。 図２１は、ＩＤＯを過発現する間葉系幹細胞の免疫抑制能をｉｎ ｖｉｖｏで確認した結果である。 図２２は、ＩＤＯを過発現する間葉系幹細胞を移植片対宿主病のマウスに投与した後、小腸及び皮膚組織でＩＤＯが上向き調節された間葉系幹細胞の存在を示す免疫組織染色の結果である。 図２３は、ＩＦＮ－γにより刺激された間葉系幹細胞とＴＬＲ３が活性化された（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ刺激）間葉系幹細胞との免疫抑制の活性を比較した結果である。 図２４の（ａ）及び図２４の（ｂ）は、ＩＦＮ－γにより刺激された間葉系幹細胞において、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ１の経路を通じてＩＤＯ発現が誘導される一方、ＴＬＲ３活性化は誘導されないことを示す結果である。 図２４の（ａ）及び図２４の（ｂ）は、ＩＦＮ－γにより刺激された間葉系幹細胞において、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ１の経路を通じてＩＤＯ発現が誘導される一方、ＴＬＲ３活性化は誘導されないことを示す結果である。 図２５は、間葉系幹細胞で機能遺伝子（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、ＩＬ－８）の発現に及ぶ影響に対して、ＩＦＮ－γの刺激時とＴＬＲ３の活性化（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ刺激）時とを比較評価したＲＴ－ＰＣＲ結果である。 図２６は、間葉系幹細胞で機能遺伝子（ＩＤＯ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１及びＴＲＡＩＬ）の発現に及ぶ影響に対して、ＩＦＮ－γ刺激、ＴＮＦ－α刺激及びＴＬＲ３活性化（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ刺激）時を比較評価したＲＴ－ＰＣＲ結果である。
本発明者らは、以前の研究を通じて、活性化されたＴ－細胞が制御性Ｔ－細胞よりさらに高いレベルのＩＦＮ－γを発現し、前記ＩＦＮ－γの発現レベルは、Ｔ－細胞を間葉系幹細胞と共同培養したときに顕著に減少することを報告することで、ＩＦＮ－γの自家分泌－近距離分泌循環（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ－ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｌｏｏｐ）を提示したことがある。したがって、本発明では、ＩＦＮ－γを通じた間葉系幹細胞の刺激が細胞の免疫抑制特性を向上させる結果を示すと予想し、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞で多様な遺伝子の発現レベルが免疫抑制能と関連があるか確認するために、遺伝子発現プロファイルを分析した。
その結果、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞で多様な免疫反応を起こす白血球の募集に重要な役目をするＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ８及びＩＤＯを含む５１２個の遺伝子の発現が増加したことを確認した。このようなケモカインと区別され、ＩＤＯは、より直接的に間葉系幹細胞の免疫抑制能に関与する傾向を示し、このような活性と綿密に連関されている。ＩＤＯは、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞で発現が非常に増加し、ＩＤＯの発現を阻害させると、Ｔ－細胞の抗原媒介増殖が抑制された。
また、本発明では、ＩＦＮ－γがヒト骨髓以外にも臍帯血、脂肪組織及びホウォートンゼリーなど多様な組織由来の間葉系幹細胞でもＩＤＯの発現を誘導し得ることを確認した。特に、このようなＩＤＯの発現は、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞でＪＡＫ／ＳＴＡＴ１の信号伝逹経路を通じて増加し、ＩＤＯを発現する間葉系幹細胞は、免疫抑制能を示すことを明らかにした。ＩＤＯの免疫抑制活性は、Ｔ－細胞の増殖に必須なアミノ酸であるトリプトファンの分解を通じて媒介されるので、ＩＤＯ及びトリプトファンの欠乏は多くの免疫関連疾患において重要な点と認識される。
また、本発明では、共焦点顕微鏡イメージを通じてＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞を注入した移植片対宿主病のマウスモデルでＩＤＯが発現されることを観察した。間葉系幹細胞の増進された免疫抑制活性は、ＩＦＮ－γの前処理と非常に関連があり、これは、またＩＤＯの発現が誘導されたからであると予想される。
また、本発明では、移植片対宿主病のマウスモデルで、ＰＢＳ（対照群）を処理した間葉系幹細胞を注入した群に比べてＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を注入した群が一層向上された生存率を示すことを確認した。したがって、移植片対宿主病の細胞治療療法で有用に用いられると期待される。
また、本発明では、ＴＬＲ信号伝逹に反応してＩＤＯの発現を増加させるのに関与する信号伝逹経路を確認した結果、ヒト間葉系幹細胞でＴＬＲ３の刺激がＩＦＮ－β及び／又はＩＤＯの発現をほとんど誘導しなかった。これは、ＴＬＲ信号伝逹がヒト間葉系幹細胞の免疫抑制機能において主要な経路ではないことを意味する。
また、ＩＦＮ－γの刺激は、全ての間葉系幹細胞でＩＤＯの発現を顕著に誘導することが観察されたので、直接的なＩＦＮ－γの刺激が免疫関連疾患の治療のための間葉系幹細胞の機能を改善するのに重要な手段であることが分かる。
さて、本発明は、間葉系幹細胞でＩＦＮ－γの前処理刺激後の免疫抑制バイオマーカーのレベルを測定するステップを含む免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞の選別方法を提供する。
本発明の選別方法は、（ａ）間葉系幹細胞を培養した後にＩＦＮ－γを処理するステップ；（ｂ）間葉系幹細胞で免疫抑制バイオマーカーの発現レベルを測定するステップ；及び（ｃ）前記発現レベルがＩＦＮ－γの未処理対照群と比較して増加する場合、免疫疾患の治療のための高効能幹細胞であると判定するステップを含むことができる。
本発明で、前記免疫抑制バイオマーカーに制限はないが、例えば、ＩＤＯ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）であることが好ましく、より好ましくは、前記ＩＯＤマーカーに、ＣＸＣＬ９（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ ９）、ＣＸＣＬ１０（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｌｉｇａｎｄ １１）、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）、ＩＣＡＭ２（Ｉｎｔｅｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２）、Ｂ７－Ｈ１（Ｂ７－ｈｏｍｏｌｏｇ １）、ＰＴＧＤＳ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ２ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＶＣＡＭ１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）及びＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）からなる群より選択される一つ以上をさらに含むことが好ましい。
本発明で「高効能」とは、間葉系幹細胞の免疫反応抑制能力に優れて免疫関連疾患の治療に効果的な効能を有することを意味する。
本発明で「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）」は、骨、軟骨、脂肪、筋肉細胞を含む多様な中胚葉細胞又は神経細胞のような外胚葉細胞にも分化する能力を有する多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である。前記間葉系幹細胞は、好ましくは、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜及び胎盤で構成された群から選択されるものに由来し得る。また、前記間葉系幹細胞は、ヒト、胎児又はヒトを除いた哺乳動物に由来し得る。前記ヒトを除いた哺乳動物は、より好ましくは、イヌ科動物、ネコ科動物、サル科動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラット、マウス又はギニアピッグなどであってもよく、その由来を制限しない。
本発明で「免疫疾患」は、免疫調節の異常により発生する疾患であれば、制限がないが、例えば、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒絶反応、体液性拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患であってもよい。
このとき、自己免疫疾患は、その種類に制限はないが、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、第１型糖尿、ルプス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性硬皮症、喘息又は潰瘍性大腸炎であってもよい。
このとき、アレルギー性疾患は、その種類に制限はないが、過敏症（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アレルギー性皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎、蕁麻疹、掻痒症、昆虫アレルギー、食品アレルギー又は薬品アレルギーであってもよい。
本発明で、ＩＦＮ－γで刺激された間葉系幹細胞は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１信号経路を通じてＩＤＯの発現が増加され、このとき、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１信号経路は、造血系又は免疫系で主要な情報交換分子であるサイトカインの主な情報交換経路である。ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）は、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ／Ｊｕｓｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｋｉｎａｓｅ）によってチロシンリン酸化された後、二量体を形成して核に移動することで、遺伝子の発現を調節する転写因子（ＴＦ）として機能するため、ＩＤＯはＳＴＡＴ１のターゲット遺伝子になる。
本発明の選別方法において、間葉系幹細胞の培養液に処理されるＩＦＮ－γの濃度に制限はないが、例えば、１－１００ＩＵ／ｍｌの濃度、好ましくは、１－１０ＩＵ／ｍｌの濃度、より好ましくは、１ＩＵ／ｍｌの濃度で含まれ得る。
本発明の選別方法において、バイオマーカーの発現レベルを測定する方法に制限はないが、例えば、タンパク質の発現に対しては、ウエスタンブロッティング、抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法を用いて測定し、ｍＲＮＡの発現に対しては、ＲＴ－ＰＣＲ、競合的ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング又はＤＮＡチップを用いて測定し得る。
また、本発明は、上記方法によって選別された免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞を提供し、前記間葉系幹細胞の由来に制限はないが、例えば、自家、他家又は同種異系由来であってもよい。
また、本発明は、前記高効能間葉系細胞を含有する免疫疾患の治療用薬学組成物／薬学製剤を提供する。
本発明で「医薬組成物」は、既存の治療活性成分、その他補助剤、薬剤学的に許容可能な担体などの成分をさらに含み得る。前記薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール及びエタノールなどを含む。
前記組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口剤型、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられてもよい。
本発明で「投与量」は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与回数、投与方法、排泄率及び疾患の程度などによってその範囲が多様に調節され得ることは当業者に明白である。
本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明で「薬学的有効量」は、投与される疾患の種類及び程度、患者の年齢及び性別、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定され、前記要素を全て考慮して副作用なしに最大効果が得られる量であって、当業者により容易に決定され得る。
本発明の組成物は、目的組織に到逹できる限り、「投与方法」には制限がない。例えば、経口投与、動脈注射、静脈注射、経皮注射、鼻腔内投与、経気管支投与又は筋肉内投与などが含まれる。一日投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回～数回に分けて投与することが好ましい。
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例よって本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１：実験方法
１－１．ヒト組織由来の間葉系幹細胞の分離及び培養
本実験は、サムスン医療院の研究審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ；ＩＲＢ）の承認（ＩＲＢ Ｎｏ．２０１１－１０－１３４）を受け、全てのサンプルは、事前同意を得て収集した。骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣｓ）、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＣＢ－ＭＳＣｓ）、脂肪組織由来の間葉系幹細胞（ＡＴ－ＭＳＣｓ）及びホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞（ＷＪ－ＭＳＣｓ）は、従来知られている方法で分離した。分離された細胞は、１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地を用いて２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でシーディングして、３７℃及び５％のＣＯ２条件下で培養した。
１－２．Ｔ－細胞の増殖：ＢｒｄＵ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ
間葉系幹細胞を１０％のＦＢＳが添加されているｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地を用いて９６－ウェルプレートに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でシーディングした。２４時間後、前記細胞の増殖を抑制させるために１０μｇ／ｍｌのｍｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、追加的に３７℃で２時間の間さらに培養した後、培養培地で５回洗浄した。次に、密度勾配遠心分離を通じて１×１０５個のヒト末梢血液単球細胞（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ；ｈＰＢＭＣｓ）を分離し、各ウェルに添加した後、Ｔ－細胞の増殖を促進させるために１μｇ／ｍＬのＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理した。ＰＨＡ処理によって活性化されたヒト末梢血液単球細胞をＢｒｄＵ（５－ｂｒｏｍｏ－２－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を添加する前に３～４日間それぞれ異なる条件の間葉系幹細胞とともに培養した。Ｔ－細胞の増殖率は、ＢｒｄＵを処理し、１８時間後にＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。
１－３．移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の動物モデル
８～９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫欠乏マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に３００ｃＧｙの全身照射法を実施し、２４時間後にヒト末梢血液単球細胞を静脈投与した。より具体的に、各マウスに２×１０７個のヒト末梢血液単球細胞を１×１０６個の間葉系幹細胞とともに投与した。このとき、間葉系幹細胞は、ＩＦＮ－γで刺激させるか刺激させないものを用いた。その後、同じ個数の間葉系幹細胞を投与７日目に反復投与した。
１－４．ＪＡＫ及びＳＴＡＴ１の活性抑制
ＩＦＮ－γ受容体の細胞内ドメインに該当するＪＡＫ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ）の活性抑制は、１００ｎｇ／ｍＬの抗－ＩＦＮ－γ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は１μＭのＡＧ４９０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理して実施し、ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）の発現抑制は、ＳＴＡＴ１遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、ｓｉＲＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）複合体を３７℃で１２時間細胞に処理して実施した。
１－５．免疫ブロッティング
間葉系幹細胞を冷たいＰＢＳで洗い、３００μＬの冷たいＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）、１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及びａ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））で溶解させた。その後、細胞の溶解物を４℃、３，０００ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を集め、ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質の定量分析を行った。
次に、電気泳動のためにタンパク質（５０μｇ）をｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １４．４ｍＭ β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ ＳＤＳ及び０．１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）に溶かし、５分間沸かした後、４－１２％のＳＤＳ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｇｅｌにローディングしてタンパク質がサイズ別に分離されるようにした。前記分離されたタンパク質に対してｔｒａｎｓ－ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）を用いてトランスファー過程を行うことで、タンパク質がＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）に移されるようにした。以後、メンブレンブロットに５％のｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれたＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １５０ｍＭ ＮａＣｌ）を処理し、１時間の間室温で反応させてブロッキング過程を実行し、ＴＢＳで３回洗浄した後、３％のｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋが含まれたＴＢＳＴ（ＴＢＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に１次抗体を希釈して処理し、４℃で一晩中反応させた。翌日、メンブレンブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、３％のｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋが含まれたＴＢＳＴに希釈した２次抗体を処理した後、室温で１時間の間反応させた。その後、さらにＴＢＳＴでメンブレンブロットを洗浄した後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて観察しようとするタンパク質の発現量を分析した。
このとき、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＡＫ２（＃３７７１）、ＳＴＡＴ１（＃９１７２）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１（＃９１７１）、β－ａｃｔｉｎ（＃４９６７）に特異的な抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入し、ＩＤＯ（ｓｃ－２５８０８）、ＩＲＦ－１（ｓｃ－１３０４１）に特異的な抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
１－６．遺伝的変異が誘導された間葉系幹細胞の製作
ＩＤＯ発現を阻害するために、ｈｕｍａｎ ＩＤＯ ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）レンチウイルスパーティクル及びＩＤＯ発現誘導レンチウイルスパーティクルをそれぞれＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｓｃ－４５９３９－Ｖ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）及びＧｅｎＴａｒｇｅｔ Ｉｎｃ．（ＬＶＰ３０２）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。まず、骨髓由来幹細胞にＩＤＯ発現阻害用レンチウイルスパーティクルをトランスフェクションするために、前記細胞に１０％のＦＢＳが添加されているＬＧ－ＤＭＥＭを用いて製造した５μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を前処理した後、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１０でレンチウイルスベクターを処理した。
以後、細胞を３７℃、５％のＣＯ２の条件下で２４時間の間培養し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で２回洗浄した後さらに培地を添加した。レンチウイルスベクターが導入された間葉系幹細胞は、導入後、１日目に５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれている間葉系幹細胞の培地で７日間培養して選別し、ウエスタンブロッティングを通じて確認した。一方、骨髓由来の間葉系幹細胞にＩＤＯ発現誘導レンチウイルスパーティクルをトランスフェクションするために、細胞に１０％のＦＢＳが添加されたＬＧ－ＤＭＥＭを用いて前記レンチウイルスパーティクルをＭＯＩ １０で処理し、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で７２時間の間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄し、さらに培養培地を添加した。
次に、上記と同じ方法で、レンチウイルスベクターが導入された間葉系幹細胞に対して導入後１日目に５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれている間葉系幹細胞の培地で７日間培養して間葉系幹細胞を選別し、ＲＦＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた蛍光観察及びウエスタンブロッティングを通じて確認した。
１－７．免疫細胞化学染色法及び免疫組織化学染色法
間葉系幹細胞に固定溶液である４％のホルムアルデヒドを処理し、光を遮断させた状態の室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗った。細胞の内部に発現するタンパク質を検出するために、細胞に０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を処理し、光を遮断させた状態の室温で５分間反応させて細胞透過性を高めた。その後、さらに細胞を３回洗い、５％のＦＢＳブロッキング溶液を処理して室温で１時間反応させた後、さらに細胞を洗い、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入したＩＤＯ特異的抗体を処理（１：１００）した後、やはり室温で１時間反応させた。次に、細胞をさらに３回洗い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８が付着されているｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）２次抗体を処理して室温で１時間反応させ、以後、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞イメージを得た。
間葉系幹細胞をトリプシンで処理し、１μＭのＣＭ－ＤｉＩ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）を用いて３７℃で５分間培養した後、追加で４℃で１５分間培養した。次に、標識された間葉系幹細胞１×１０６個をＰＢＳで洗ってｈＰＢＭＣとともにマウスに静脈投与し、７日目にさらに同じ数の細胞を投与した。以後、マウスを犠牲にして小腸を分離し、ｆｒｏｚｅｎ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ技術を用いて切断した後、組織を２回洗い、５％のＦＢＳブロッキング溶液を添加して室温で１時間の間細胞と反応させた。もう一度、上記のような方法で組織を洗い、ＩＤＯ（１：１００）に対する１次抗体を処理し、室温で１時間の間細胞と反応させた後、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｙｓｔｅｍを用いて組織から蛍光イメージを得た。これを通じて、核（青色；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、ＩＤＯ（緑色）及びＣＭ－ＤｉＩ－ｌａｂｅｌｅｄ ＭＳＣｓ（赤色）を検出した。共焦点顕微鏡イメージは、ＬＳＭ ７００ Ｚｅｎソフトウェアを用いて分析した。
１－８．ＲＴ－ＰＣＲの分析
間葉系幹細胞を２００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ－γ及び／又は１００μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）が存在するか存在しない条件で２４時間の間培養した後、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、前記ＲＮＡに対して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて総ＲＴ－ＰＣＲ（ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実行してｃＤＮＡを合成した。
前記ＰＣＲで用いたプライマー配列は、下記に示した通りである。
ＩＤＯ ｆｏｒｗａｒｄ：５'－ＧＣＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＧＣＴＴＣ－３'
ＩＤＯ ｒｅｖｅｒｓｅ：５'－ＣＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡ－３'（２３４ ｂｐ）
ＩＦＮ－γ ｆｏｒｗａｒｄ：５'－ＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＣ－３'
ＩＦＮ－γ ｒｅｖｅｒｓｅ：５'－ＧＧＡＧＡＣＡＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴ－３'（２０１ ｂｐ）
ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ：５'－ＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧ－３'
ＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ：５'－ＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣ－３'（２３４ ｂｐ）
１－９．統計分析
全ての実験結果は、平均±標準偏差で示し、各実験条件間の差は、ｔ－ｔｅｓｔ又は分散分析を用いて分析した。Ｐ－ｖａｌｕｅが０．０５未満である場合に統計的有意性があると判断した。
２．実験結果
２－１．ヒト組織由来の間葉系幹細胞の特性分析
骨髓、臍帯血及びホウォートンゼリーから分離したヒト間葉系幹細胞を観察した結果、線維芽細胞の形態であることを確認した。一方、脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、小さくて紡錘模様であることを観察した（図１の（ａ））
また、細胞分析を通じて表面に発現している抗原タンパク質を確認した結果、前記細胞は、全てＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６を発現する一方、造血母細胞系統のマーカーであるＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲは発現しないことを確認した（図１の（ｂ））。
また、間葉系幹細胞を骨形成、脂肪細胞形成及び軟骨形成の誘導培地で１４～２１日間培養した結果、それぞれアルカリホスファターゼ活性、中性脂肪液胞の蓄積及び軟骨細胞基質の蓄積を観察し、全ての間葉系幹細胞は、前記各培地で培養して分化を誘導したとき、その起源に関係なく骨、脂肪及び軟骨細胞の類似形態を示すことを確認した（図１の（ｃ））。
２－２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルで間葉系幹細胞の免疫抑制特性の確認
混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）を通じてｎａｉｖｅ間葉系幹細胞の免疫調節特性を評価した。
まず、ＰＨＡを処理して活性化させた末梢血液単球細胞を骨髓、脂肪組織、臍帯血又はホウォートゼリー由来の間葉系幹細胞上で培養した結果、Ｔ－細胞の活性が顕著に減少した。このような結果から、共同培養時に間葉系幹細胞の数に依存的であることを確認した（図２）。また、他の組織に由来した間葉系幹細胞の免疫調節特性には、著しい差が現われなかった。このような結果は、脂肪組織、臍帯血及びホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞が骨髓誘導の間葉系幹細胞のようにＴ－細胞の増殖を抑制するのに効果的であることを意味する。
次に、間葉系幹細胞によるＴ－細胞の増殖抑制が前記間葉系幹細胞により直接的に媒介されるのか可溶性因子によるのかを確認するために、トランスウェルシステムを用いて末梢血液単球細胞をトランスウェル挿入体内の間葉系幹細胞と共同培養した。
その結果、図３に示したように、各組織に由来する間葉系幹細胞は、細胞の接触がない条件でもＰＨＡ刺激に反応するｈＣＤ３＋ＣＤ８＋ Ｔ－細胞の増殖を抑制した。これは、直接的な細胞間接触がある条件で現われた増殖抑制レベルよりは少し減少された程度であった。前記結果は、細胞間の直接的な接触だけではなく可溶性因子も間葉系幹細胞の免疫調節効果に寄与することを意味する。
また、ｉｎ ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の免疫抑制機能を確認するために、各マウスに末梢血液単球細胞及び各組織由来の間葉系幹細胞を一緒に注入した結果、図４に示したように、細胞を注入した後８週目に、ヒト末梢血液単球細胞を単独で注入するか前記細胞と間葉系幹細胞を一緒に１回注入したマウスは死んだ一方、間葉系幹細胞を２回注入したマウスの場合には、２０％程度が生存した。
また、免疫抑制に対する可溶性因子の役目を確認するために、間葉系幹細胞が存在するか存在しない条件で培養したｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ－細胞の培養上澄み液を分析した。その結果、末梢血液単球細胞が活性化されたとき、多様なサイトカイン、ケモカイン及び成長因子の分泌が増加した。一方で、間葉系幹細胞が存在する場合には、その起源に関係なくＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのような炎症性サイトカインの量が減少した。
また、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果と類似に、移植片対宿主病の動物モデルに末梢血液単球細胞を骨髓由来の間葉系幹細胞とともに注入した場合にも、血液内のＩＦＮ－γのレベルが顕著に減少することを確認した（図５）。
２－３．ＩＦＮ－γ刺激による間葉系幹細胞の免疫抑制特性向上の確認
末梢血液単球細胞は、間葉系幹細胞とともに培養したとき増殖が抑制され、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞と共同培養した場合には、増殖が一層抑制されたことを確認した（図６）。
したがって、このようなＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病を改善させ得るかを確認するために、ヒト末梢血液単球細胞を注入したマウスに７日間隔でＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を２回注入した。その後、末梢血液単球細胞のみを単独で注入したグループ、末梢血液単球細胞と間葉系幹細胞を一緒に注入したグループ、末梢血液単球細胞とＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を一緒に注入したグループ又はＪＡＫ抑制剤であるＡＧ４９０を前処理して末梢血液単球細胞とＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を一緒に注入したグループにおけるマウス生存率を比較した。
その結果、図７に示したように、末梢血液単球細胞を単独で注入したマウスに比べてＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を一緒に注入したマウスの生存率が改善されたことを確認した。また、このような生存率の向上結果は、末梢血液単球細胞とＩＦＮ－γを処理しない間葉系幹細胞を一緒に注入した場合に比べて一層高く現われた。一方、ＪＡＫ抑制剤を前処理した場合には、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞による移植片対宿主病マウスの生存率向上を減少させることを確認した。
また、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞が移植片対宿主病のマウスモデルでＴ細胞の増殖抑制を誘導するかを確認するために、前記各マウスグループの血液をフローサイトメトリー法を通じて確認した結果、図８に示したように、末梢血液単球細胞と間葉系幹細胞を一緒に注入した場合には、ＣＤ４５＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の数が減少したが、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を一緒に注入した場合には、減少程度が一層高く現われた。
また、組織学的分析結果、図９に示したように、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞を一緒に注入したとき、移植片対宿主病マウスの臨床的症状及び皮膚及び小腸で免疫細胞の浸透が効果的に減少したことを確認した。このような結果は、ＩＦＮ－γ刺激が間葉系幹細胞の免疫抑制特性を向上させることを意味する。
次に、間葉系幹細胞の遺伝子発現にＩＦＮ－γが及ぼす影響を確認するために、ＩＦＮ－γの刺激前後の間葉系幹細胞の遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、骨髓由来の間葉系幹細胞は、ＩＦＮ－γで刺激したとき、形態変化には著しい差がなかったが、（図１０の（ａ））、遺伝子発現プロファイルには多くの差があることを確認した（図１０の（ｂ））。
実際に、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞で５１２個の遺伝子の発現が増加し、下記表１に示したように、前記遺伝子のうち４個の遺伝子は間葉系幹細胞の免疫抑制機能に関連していることが分かった。
Figure 0006992809000001
また、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した結果、図１１に示したように、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞でＣＸＣＬ９（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ）、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ８（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ）及びＩＤＯ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが顕著に増加することを確認した。
２－４．ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１信号伝逹経路を通じたＩＦＮ－γ媒介ＩＤＯ発現誘導の確認
前記結果を通じて骨髓由来の間葉系幹細胞をＩＦＮ－γで刺激したとき、ＩＤＯ発現が増加することを確認した。このような結果は、他の組織由来の間葉系幹細胞でも同一に現われることを確認した（図１２）。
ＩＦＮ－γ信号伝逹は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１経路を通じて起き、ＳＴＡＴ１は、リン酸化されて核に移動して転写を媒介する。したがって、免疫ブロッティング分析結果、図１３に示したように、ＩＦＮ－γで刺激しない間葉系幹細胞と比較してＩＦＮ－γで刺激した細胞でＳＴＡＴ１の活性化（ＳＴＡＴ１リン酸化）を確認した。
また、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１経路とＩＤＯ発現間の相関関係を確認するために、ＪＡＫ抑制剤（ＡＧ４９０）を処理するかＳＴＡＴ１を標的するｓｉＲＮＡを処理した後、免疫ブロッティングを実施した結果、図１４に示したように、ＪＡＫ抑制剤又はＳＴＡＴ１標的ｓｉＲＮＡを処理した場合、ＩＤＯが少量発現するか発現しないことを確認した。これは、ＩＦＮ－γによるＩＤＯの発現増加がＪＡＫ／ＳＴＡＴ１経路を通じて起きることを意味する。
ＭＬＲ結果は、間葉系幹細胞が末梢血液単球細胞の増殖を抑制することを示したが、このような効果は、抗ＩＦＮ－γの抗体処理によって現われないことを確認した。これはＴ－細胞を含む活性化された免疫細胞により分泌されるＩＦＮ－γがＩＤＯ発現を通じて間葉系幹細胞の免疫調節特性において非常に重要な役目をすることを示す。また、このような結果は、ＳＴＡＴ１標的ｓｉＲＮＡ処理を通じてＩＦＮ－γの下位信号伝逹経路が抑制されることを通じて確認できる（図１５）。
結論的に、間葉系幹細胞でＩＦＮ－γ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１経路を通じたＩＤＯの発現誘導は、間葉系幹細胞の免疫抑制機能に非常に重要であることが分かる。
また、ＩＤＯ ｍＲＮＡの発現は、間葉系幹細胞にＩＦＮ－γを少なくとも４時間の間処理したときに増加した。１ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ－γを２４時間の間処理した場合には、ＩＤＯ ｍＲＮＡの発現が少なくとも１日間維持され、ＩＤＯタンパク質レベルは、少なくとも７日間維持されることを確認した。また、同一の間葉系幹細胞に１ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ－γを再処理したとき、ＩＤＯ ｍＲＮＡがさらに発現され、そのタンパク質レベルは一層増加することを確認した。
２－５．ヒト間葉系幹細胞の免疫抑制特性でＩＤＯの役目糾明
移植片対宿主病のマウスに注入された間葉系幹細胞が前記マウスの組織に存在するかを評価するために、ＣＭ－ＤｉＩ染色された間葉系幹細胞を注入し、共焦点顕微鏡で観察した。
その結果、図１６に示したように、前記間葉系幹細胞が組織内に浸透することを観察し、ＩＦＮ－γが処理された間葉系幹細胞を注入したとき、間葉系幹細胞でＩＤＯの発現が誘導されることを確認した。一方、前記間葉系幹細胞を注入する前にＪＡＫ抑制剤であるＡＧ４９０を処理したときには、組織で間葉系幹細胞の浸透が減少し、ＩＤＯの発現も減少した。
前記結果を土台に、間葉系幹細胞の免疫抑制特性においてＩＤＯの役目を確認するために、ＩＤＯ発現を阻害するｓｈＲＮＡを処理した。
その結果、図１７に示したように、ＩＤＯを標的するｓｈＲＮＡによりＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞でＩＤＯの発現レベルが顕著に抑制されたことを確認し（図１７の（ａ）、（ｂ））、また、末梢血液単球細胞をＰＢＳ又はＩＦＮ－γを処理した間葉系幹細胞とともに共同培養したとき、ＰＨＡにより誘導される末梢血液単球細胞の増殖が顕著に復旧され、このとき、ＩＤ標的ｓｈＲＮＡによりＩＤＯの発現が抑制されることを確認した（図１７の（ｃ））。
これに加えて、ＩＤＯの発現が減少された間葉系幹細胞にＩＦＮ－γを処理するか処理しない状態で、移植片対宿主病のマウスに７日間隔で２回静脈投与した結果、図１８に示したように、末梢血液単球細胞のみを単独で注入したグループと、末梢血液単球細胞をＩＤＯの発現が減少された間葉系幹細胞とともに注入したグループで有意な生存率の差はなかった。
このような生存結果に応じて、免疫蛍光イメージ結果、図１９に示したように、移植片対宿主病のマウスから得た小腸及び皮膚組織では、ＩＤＯダウン調節された間葉系幹細胞内にＩＤＯがほとんど発見されなかった。
次に、ＩＤＯ及びＲＦＰを発現するレンチウイルスベクターを導入してＩＤＯを安定的に発現する間葉系幹細胞を製作した後、これらＩＤＯを過発現する間葉系幹細胞の免疫抑制能をｉｎ ｖｉｔｒｏ及ｉｎ ｖｉｖｏモデルで確認した。
その結果、図２０に示したように、末梢血液単球細胞をＩＤＯ過発現の間葉系幹細胞と共同培養したとき、ＰＨＡにより誘導された末梢血液単球細胞の増殖が顕著に抑制された。このような結果は、ＩＦＮ－γで刺激した間葉系幹細胞と共同培養した場合の結果と類似していた。
さらに、移植片対宿主病のマウスでＩＤＯ過発現の間葉系幹細胞グループの生存率もＩＦＮ－γが処理された間葉系幹細胞と共同培養したグループのマウス生存率程度向上されたことを確認した（図２１）。
このような生存率結果に応じて、免疫蛍光イメージ結果、図２２に示したように、移植片対宿主病マウスの小腸及び皮膚組織でＩＤＯ過発現の間葉系幹細胞内にＩＤＯが発現されることを確認した。
結論的に、前記結果は、ＩＦＮ－γを処理した間葉系幹細胞が移植片対宿主病が誘導された組織に帰巣し得、ＩＤＯ発現誘導を通じて免疫抑制機能を示し得ることを示す。
２－６．ＩＦＮ－γ刺激によるＩＤＯ発現の誘導及びＴＬＲ３活性化の非誘導
従来、間葉系幹細胞でこれらの免疫抑制能のためにＴＬＲ３（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）がＩＤＯの発現を誘導すると報告されたことがあるので、本実施例では、ＩＦＮ－γにより刺激された間葉系幹細胞とＴＬＲ３が活性化された間葉系幹細胞との間の免疫抑制の活性を比較した。
その結果、図２３に示したように、末梢血液単球細胞をｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを処理してＴＬＲ３を活性化させた間葉系幹細胞と共同培養したとき、前記末梢血液単球細胞の増殖はほとんど抑制されない一方、ＩＦＮ－γで刺激した骨髓、脂肪組織、臍帯血及びホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞と共同培養した場合には、前記末梢血液単球細胞の増殖が顕著に抑制されることを確認した。
このとき、ヒト間葉系幹細胞でＩＦＮ－γ刺激又はＴＬＲ３活性化によるＩＦＮ－γ発現誘導は観察されなかった。これは、ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ－γ刺激がヒト間葉系幹細胞の免疫抑制特性を増進させるための適切な手段であることを意味する。
また、骨髓由来の間葉系幹細胞をＩＦＮ－γで刺激したとき、ＩＤＯ発現が誘導された一方、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを処理してＴＬＲ３を活性化させた間葉系幹細胞の場合には、ＩＤＯ発現が多少増加した。このような結果は、脂肪組織、臍帯血及びホウォートンゼリーのような多様な組織に由来する間葉系幹細胞でも同一に現われた（図２４）。
また、図２５に示したように、ＴＬＲ３を活性化させた全ての骨髓由来の間葉系幹細胞で他の機能と関連されたＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６及びＩＬ－８のような遺伝子は高く発現される一方、ＳＴＡＴ１の活性化（ＳＴＡＴ１ リン酸化）は観察されなかった。
前記結果によると、ＩＦＮ－γ刺激がＪＡＫ／ＳＴＡＴ１経路を通じて間葉系幹細胞で（免疫抑制能のために）ＩＤＯの発現を誘導する一方、ＴＬＲ３の活性化はＩＤＯの発現を誘導しないことが分かる。
２－７．ＩＤＯバイオマーカー以外の残りの候補マーカー（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＣＸＣＬ１１、ＶＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＴＲＡＩＬ）
脂肪組織来由の間葉系幹細胞（ＡＴ－ＭＳＣ）で機能遺伝子（ＩＤＯ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１及びＴＲＡＩＬ）発現に及ぼす影響を、ＩＦＮ－γ刺激、ＴＮＦ－α刺激及びＴＬＲ３活性化（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ刺激）によって比較評価するためにＲＴ－ＰＣＲを実施した。
その結果、図２６に示したように、ＩＦＮ－γ刺激特異的にＩＤＯ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１及びＴＲＡＩＬの発現が誘導されることが分かった。
このような結果は、間葉系幹細胞にＩＦＮ－γで前処理刺激した後に免疫疾患の治療のための高効能間葉系を選別するにおいて、ＩＤＯ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、Ｂ７－Ｈ１、ＰＴＧＤＳ、ＶＣＡＭ１及びＴＲＡＩＬが免疫抑制バイオマーカーとして有効であることを意味する。
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全て面で例示的なものであり、限定的ではないことで理解すべきである。
本発明は、移植片対宿主病、自己免疫疾患を含む多様な免疫疾患の臨床的治療のための免疫反応の調節能力を有する機能的に優れた間葉系幹細胞が得られる有用な方法を提供することで、免疫疾患の治療法で有用に用いられ得る。

Claims (5)

  1. 以下のステップを含む、免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞の選別方法：
    （ａ）間葉系幹細胞を培養し、ＩＦＮ－γで処理するステップ；
    （ｂ）間葉系幹細胞におけるＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）の発現レベルを測定するステップ；及び
    （ｃ）前記発現レベルがＩＦＮ－γの未処理対照群と比較して増加している場合に、免疫疾患の治療のための高効能間葉系幹細胞であると判定するステップ、
    ここで、前記高効能は免疫抑制能であり、前記ステップ（ａ）のＩＦＮ－γは、培地内に１～１００ＩＵ／ｍｌの濃度で含まれる。
  2. 前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、ホウォートンゼリー、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜及び胎盤からなる群より選択されるものに由来することを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
  3. 前記免疫疾患は、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒絶反応、体液性拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
  4. 前記自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、第１型糖尿、ルプス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性硬皮症、喘息又は潰瘍性大腸炎であることを特徴とする、請求項３に記載の選別方法。
  5. 前記ステップ（ｂ）のバイオマーカーの発現レベルは、ウエスタンブロッティング、抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、ＲＴ－ＰＣＲ、競合的ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング又はＤＮＡチップを用いて測定することを特徴とする、請求項１に記載の選別方法。
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