KR102242285B1

KR102242285B1 - 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR102242285B1
Application number: KR1020190122191A
Authority: KR
Inventors: 김경숙; 한상배; 이태용; 김형숙
Original assignee: 코아스템(주); 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-04-20
Also published as: JP2022551054A; KR20210039678A; WO2021066526A1; US20220373545A1; EP4039828A4; EP4039828A1

Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

Description

중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물 {BIOMARKER COMPOSITION FOR PREDICTING THE THERAPEUTIC EFFICACY OF MESENCHYMAL STEM CELLS IN SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS}

본 발명은 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

루푸스라고 불리는 전신홍반루푸스(SLE)는 원형 전신 자가 면역 질환이다. 전신홍반루푸스는 DNA에 대한 항체, 핵 항원에 대한 항체 및 리보뉴클레오단백질에 대한 자가 항체를 포함한 일련의 항체의 존재를 특징으로 하는 자가면역질환이다. 전신홍반루푸스는 항시적 증상 및 징후, 근골격, 피부, 신장, 위장, 폐, 심장, 세망내피, 혈액 및 신경정신병학적 발현증상을 포함한다. 피부 발현증상은 전신홍반루푸스에서 가장 흔하다. 전신홍반루푸스의 진행은 면역 복합체의 침전에 의해 유발되는 조직 및 기관에 대한 손실 및 일반적 임상 증상과 관련이 있다. 기타 자가면역 증상과 유사하게, 전신홍반루푸스의 병인은 유전, 환경, 호르몬 및 면학적 인자를 수반하는 다인자적이다.

루푸스 신염은 전신홍반성루푸스와 관련된 사구체 신염으로 항-dsDNA 및 보체를 포함하는 면역 복합체의 침착은 병리 생리학적으로 중요한 역할을 하며, 단백뇨의 양은 말초 사구체 모세 혈관 고리의 크기를 반영하고 혈관 사이 증식 및 막성 신증(membraneous nephropathy)에 따라 증가되는 경향이 있다. 증식성 사구체 신염(Class Ⅲ 및 Ⅳ)은 루푸스 신염의 가장 심각한 형태이다.

중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)는 뼈, 연골 그리고 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화능을 갖는 높은 증식성의 부착성 세포로, 항염증 및 면역조절 능력이 있는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포는 T 세포와 B 세포의 증식 및 분화 억제, 수지상 세포(dendritic cell), 자연살해 (natural killer, NK) 세포 및 대식세포 (macrophage)와 같은 면역 세포들의 기능 억제 등 면역 억제 효과를 나타낸다. 최근, 중간엽 줄기세포를 조혈모 세포와 함께 이식하여 조혈모세포의 생착률을 증가시키는 연구가 보고되었으며, 이식편대 숙주 질환(graftversus-host disease, GVHD), 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA), 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE), 패혈증, 급성 췌장염(acute pancreatitis, AP), 대장염, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS) 및 류마티스 관절염 등의 질환에서 중간엽 줄기세포가 염증을 감소시키고 자가면역성 과다반응을 억제한다고 보고되고 있다. 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)에서도 중간엽 줄기세포가 염증을 감소시키며, 치료효과가 있다고 개시되어 있다.

기존에는 전신홍반루푸스 질환동물모델에서 중간엽줄기세포의 치료효과 확인하기 위해, 생존율, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨를 측정하였다. 그러나 기존의 치료효과 예측 바이오마커는 측정방법이 까다롭고, 병이 상당히 진행한 후에 측정될 수 있으며, 정확도가 낮다는 한계가 있어, 새로운 바이오마커에 대한 연구가 필요한 실정이다.

본 발명자들은 전신홍반루푸스 질환동물모델에서 중간엽줄기세포의 치료효과를 기존 바이오마커 (생존율, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨)를 이용하여 측정하였으며, 새로운 바이오마커 (케모카인, 싸이토카인, CHI3L1)도 측정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

더 자세하게는 MRL/lpr 마우스에서 전신홍반루푸스가 진행되면, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치가 증가하고, 궁극적으로 마우스가 사망함을 확인하였다. 이 마우스에 중간엽줄기세포를 투여하면 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치가 감소함을 확인하여, 이들 기존 바이오마커는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 확인할 수 있음을 확인하였다.

나아가, 본 발명자들은 MRL/lpr 마우스에서 전신홍반루푸스가 진행되면, 다양한 케모카인, 싸이토카인, CHI3L1의 발현도가 변화(증가 또는 감소)하고, 중간엽줄기세포 투여에 의해 조절됨을 확인하였다. 대표적으로 중간엽줄기세포는 신장 내 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11의 발현을 감소시키고, CCL8의 발현도는 증가시켰으며, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-의 발현은 감소시키고, CHI3L1의 발현을 감소시킴을 확인하였다.

이를 통해, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 예측하기 위해, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치 등 기존의 바이오 마커와 더불어, CCL2, CCL5, CCL8, IL-1β, CHI3L1을 활용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF- 또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.

상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 서술한 조성물을 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 키트를 제공할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)일 수 있다.

본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다: (a) 시료로부터 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF- 또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계.

상기 시료는 중간엽줄기세포의 치료를 받은 전신홍반루푸스 환자로부터 수득된 것일 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용할 수 있다.

상기 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)을 이용할 수 있다.

상기 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-α또는 CHI3L1의 유전자의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 낮게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단할 수 있다.

상기 CCL8의 유전자 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 높게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 따르면, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치 등 기존의 바이오마커와 더불어, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF- 또는 CHI3L1을 활용하여 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스의 치료효과를 예측할 수 있다.

도 1은 중간엽줄기세포 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 치료효과 확인한 결과로서, MRL/lpr 마우스에 중간엽줄기세포를 12주령과 15주령에 투여하고 (a)는 생존율을 측정한 결과이고, (b)는 몸무게를 측정한 결과이고, (c)는 신장의 무게를 측정한 결과이고, (d)는 혈청에서 anti-dsDNA를 측정한 결과이고 (e)는 total IgG을 측정한 결과이고, (f)는 뇨에서 단백뇨를 측정한 결과이다.
도 2는 중간엽줄기세포 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 신장 내 케모카인 변화를 확인한 결과로서, MRL/lpr 마우스에 중간엽줄기세포를 2회 투여하고 16주령에 부검을 실시하여, (a)는 신장 조직에서 9주령 대조군의 CCL2의 발현 수준을 기준으로 하여 상대적 정량 값으로 계산한 결과이고, (b)는 9주령 대비 16주령 값 또는 16주령에서 대조군 대비 중간엽줄기세포 투여 군의 값의 변화를 계산한 결과이다.
도 3은 중간엽줄기세포 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 혈청 내 케모카인 변화를 확인한 결과로서, MRL/lpr 마우스에 중간엽줄기세포를 2회 투여하고 16주령에 부검을 실시하고, 혈청을 이용하여 각 케모카인을 측정한 결과이다.
도 4는 중간엽줄기세포 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 신장 내 사이토카인 변화 확인한 결과로서, MRL/lpr 마우스에 중간엽줄기세포를 2회 투여하고 16주령에 부검을 실하여, (a)는 신장 조직에서 9주령 대조군의 IFN-α의 발현 수준을 기준하여 상대적 정량 값으로 계산한 결과이고, (b)는 9주령 대비 16주령 값 또는 16주령에서 대조군 대비 중간엽줄기세포 투여군의 값의 변화를 계산한 결과이다.
도 5는 중간엽줄기세포 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 CHI3L1 변화를 확인한 결과로서, (a)는 MRL/lpr 마우스에 중간엽줄기세포를 2회 투여하고 16주령에 부검을 실시하여 신장 조직에서 CHI3L1의 발현 수준을 9주령 대조군에 기준하여 상대적 정량 값으로 계산한 결과이고, (b)는 혈청을 이용하여 CHI3L1을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.

MRL/lpr 마우스에서 전신홍반루푸스가 진행되면, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치가 증가하고, 궁극적으로 마우스가 사망함을 확인하였다. 이 마우스에 중간엽줄기세포를 투여하면 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치가 감소함을 확인하여, 이들 기존 바이오마커는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 확인할 수 있음을 확인하였다 (도 1).

나아가, 본 발명자들은 MRL/lpr 마우스에서 전신홍반루푸스가 진행되면, 다양한 케모카인, 싸이토카인, CHI3L1의 발현도가 변화(증가 또는 감소)하고, 중간엽줄기세포 투여에 의해 조절됨을 확인하였다 (도 2 내지 도 5). 대표적으로 중간엽줄기세포는 CCL2, CCL5의 발현을 감소시키고, CCL8의 발현도는 증가시켰으며, IL-1β의 발현은 감소시키고, CHI3L1의 발현을 감소시킴을 확인하였다.

이를 통해, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 예측하기 위해, 혈중 anti-dsDNA Ab, 혈중 total IgG, 단백뇨 수치 등 기존의 바이오마커와 더불어, CCL2, CCL5, CCL8, IL-1β, CHI3L1을 활용할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 "mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"는 전신홍반루푸스 환자에서 중간엽줄기세포 치료 후에 증가 또는 감소하는 마커인 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출 및/또는 정량에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 구체적으로, 상기 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 이때 상기 유전자들의 핵산 정보는 genebank 등에 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하고, 상세하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치한 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 명세서의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 키트를 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 키트는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측 마커인 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-α또는 CHI3L1의 단백질 발현 수준을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양을 측정함으로써, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 예측할 수 있다. 상기 키트에서 전신홍반루푸스 환자에서 중간엽줄기세포의 치료효과 예측 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제, 예를 들어, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제, 예를 들어, 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체의 면역결합단편을 포함할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역 전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 LISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 질량 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 상기 MRM(Multiple reaction monitoring) 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군, 또는 동일 개체의 단백질 발현 수준과 중간엽줄기세포의 치료를 받은 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 또한, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과를 예측할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다: 시료로부터 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-α또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계.

상기 정보를 제공하는 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-또는 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현양 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현양을 측정함으로써 알 수 있다. 개체의 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 것은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 예를 들어, 개체의 신장 조직을 단백질 추출용 버퍼 또는 핵산 추출용 버퍼로 균질화한 다음, 원심부리 후, 얻어진 상등액을 개체의 시료로 사용할 수 있다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용할 수 있다. 또한, 상기 단백질 발현 수준의 측정은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅(Wetern blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)을 이용할 수 있다.

상기 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL17, CCL19, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IFNs, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TGF-또는 CHI3L1의 유전자의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 낮게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단할 수 있다. 상기 대조군 시료는 중간엽줄기세포 치료를 받지 않은 전신홍반루푸스 환자이다.

상기 CCL8의 유전자 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 높게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단할 수 있다. 상기 대조군 시료는 중간엽줄기세포 치료를 받지 않은 전신홍반루푸스 환자이다.

이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 동물 실험의 설계

MRL/lpr 마우스는 12주령에 전신홍반루푸스가 발병하여 20주령에 50%이상 사망하는 전신홍반루푸스 질환동물모델이다. 9주령을 발병전이라 하고 16주령 이상을 발병 중·후기라 판단하고 시험 모델에 적용하였다. Female MRL/MpJ-Fas^lpr/J(이하 MRL/lpr 이라 명명함) 마우스는 The Jackson Laboratory에서 구입하였다. 마우스의 사육 환경은 온도 21 ~ 24℃, 습도 40 ~ 60%, 명암 주기는 12시간(점등: 08 시, 소등: 20 시)으로 SPF(specific pathogen-free) 상태를 유지하였다. 고형 사료와 식수는 멸균하여 자유 급이 하였고, 모든 실험동물은 1 주일간 동물실에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 인간 중간엽줄기세포 (Human mesenchymal stem cell)는 코아스템㈜에서 분양 받았다. 정상인 골수 유래 중간엽줄기세포를 CSBM-A06 배지를 이용하여 배양하였으며 p4의 세포를 실험에 사용하였다. MRL/lpr 마우스에 human 중간엽줄기세포를 4×10⁶ cells/mouse의 농도로 마우스 12주령과 15주령에 2회 꼬리 정맥 투여하였다. 이에 생존율과 몸무게를 매주 측정하였다. 생존율과 무게 변화에는 차이가 없었다 (도 1A 및 1 B). 부검 후 무게 대비한 신장무게는 중간엽줄기세포 투여군에서 대조군 대비 감소하였다 (도 1C). 16주령 또는 18주령에 부검을 실시하면서 뇨, 혈청, 신장을 분리하여 분석시험에 사용하였다.

<실시예 2> Anti-dsDNA 측정

실시예 1의 동물모델에서 분리한 혈청을 이용하여 anti-dsDNA 를 측정하며 Anti-dsDNA Ab ESLIA (Alpha diagnostic international)의 제공된 시험방법에 따라 진행하였다. 마우스의 혈청을 Working Sample Diluent(WSD)로 희석한 후, 희석된 샘플 100 μl를 anti-dsDNA가 코팅된 well에 처리하고 실온에서 60분 반응시켰다. 그 후 200 μl의 세척 액을 이용하여 4번 세척하고, Anti-Mouse IgG HRP를 각 well 당 100 μl 넣고 실온에서 반응시켰다. 30분 후 200 μl의 세척 액을 이용하여 4번 세척하였다. TMB 용액 100 μl를 각 well에 넣어준 후 색을 관찰한 후, 10분 뒤 stop solution 100 μl를 넣고 반응을 중지시켰다. 마지막으로 450 nm에서 OD 값을 측정하였다. MRL/lpr 마우스의 혈중 anti-dsDNA Ab의 농도는 12주령 이후부터 증가하였으며 중간엽줄기세포 투여 시 감소하였다 (도 1D).

<실시예 3> 총 IgG의 측정

실시예 1의 동물모델에서 분리한 혈청을 이용하여 총 IgG를 측정하며 Total IgG ELISA (Thermo Fisher Scientific)의 제공된 시험방법에 따라 진행하였다. ELISA 용 96 well에 capture antibody와 coating buffer를 1:250 비율로 희석하여 4℃에서 18시간 코팅하였다. 200 μl의 세척 액을 이용하여 2번 세척하고 blocking buffer 250 μl를 well에 넣은 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후 200 μl의 세척 액을 이용하여 2번 세척하고, 마우스 혈청을 assay buffer A(1x)에 희석하여 샘플을 준비하였다. 각 well에 assay Buffer A(1x) 90 l, detection-antibody 50 μl 및 standard 또는 sample 10 μl을 넣고 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 세척 액을 이용하여 세척하였다. Substrate solution 100 μl을 각 well에 넣은 후 5분 반응시키고 stop solution 100 μl을 넣어 반응을 중지시켰다. 마지막으로 450 nm 내지 570 nm로 값을 측정하였다. MRL/lpr 마우스의 혈중 총 IgG의 농도도 12주령부터 증가하였고 중간엽줄기세포 투여 시 감소하였다 (도 1E).

<실시예 4> Proteinuria 측정

분리한 뇨를 이용하여 proteinuria를 측정하며 Pierce 660nm Protein Assay (Thermo Fisher Scientific)의 제공된 시험방법에 따라 진행하였다. 마우스의 뇨를 PBS로 희석한 후, 희석된 샘플 10 μl를 protein assay reagent 150 μl와 실온에서 반응시키고 10분 후에 660 nm에서 OD 값을 측정하였다. 뇨를 이용한 proteinuria도 대조군 대비 중간엽줄기세포 투여 군에서 감소하였다(도 1F). MRL/lpr 마우스에는 중간엽줄기세포는 전신홍반루푸스 발병을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

<실시예 5> Quantitative real-time PCR (qPCR)

케모카인 네트워크를 확인하기 위해 MRL/lpr 마우스의 신장을 이용하여 케모카인의 유전자 발현을 측정하였다. TRIZOL Reagent(Invitrogen)를 이용하여 신장 조직에서 total RNA를 분리하였다. Total RNA 1 μg의 농도를 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 50ng의 농도로 SYBR green의 probe를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 측정한 케모카인은 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7. CCL8, CCL11, CCL17, CCL19, CCL20, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL16, 및 CX3CL1이며 대부분은 염증과 관련된 케모카인으로 알려져 있다. 시험 결과, MRL/lpr 마우스는 9주령 대비 16주령에서 케모카인 발현이 증가하였으며 이는 전신홍반루푸스 발병에 따른 현상으로 판단되었다. 중간엽줄기세포를 투여한 군에서는 케모카인 발현이 감소함을 확인하였다 (도 2A). 염증과 관련된 CCL2, 3, 4, 5 및 CXCL9, 10은 중간엽줄기세포 투여 시 감소하였으나, 특이하게 CCL8의 경우 마우스 주령에 따라 증가하고 또한 중간엽줄기세포 투여 시 더 증가하는 것을 확인하였다. 9주령과 16주령의 변화 값에서도 9주령 대비 16주령에서 CX3CL1을 제외하고 모든 케모카인이 증가하였다. 16주령에서 대조군과 중간엽줄기세포 투여군의 변화 값을 분석한 결과에서는 대부분의 케모카인이 감소하였으나 CCL8과 CXCL16의 케모카인만 중간엽줄기세포 투여 시 증가하였다 (도 2B).

<실시예 6> 케모카인의 측정

신장 내 유전자 발현 분석에 근거하여 전신 면역반응을 확인하고자 혈청 내 케모카인의 변화를 확인하였다. 염증성 케모카인 CCL2 및 CCL5과 중간엽줄기세포 투여에 특이적으로 반응했던 CCL8을 대상으로 측정하였다. CCL2, CCL5 및 CCL8의 측정키트 (R&D SYSTEMS) 의 제공된 시험방법에 따라 진행하였다. ELISA 용 96 well에 capture antibody를 키트 내 농도에 맞춰 PBS에 희석하여 상온에서 18시간 코팅하였다. 200 μl의 wash solution을 이용하여 2번 세척하고 reagent diluent 300 μl를 well에 넣은 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 200 μl의 wash solution을 이용하여 2번 세척하고, 마우스 혈청을 reagent diluent(1x)에 희석하여 샘플을 준비하였다. 각 well에 standard 또는 sample 100 μl을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 wash solution을 이용하여 세척하였다. Detection antibody를 키트 내 농도에 맞춰 reagent diluent에 희석하여 2시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 wash solution을 이용하여 세척하였다. Streptavidin-HRP를 reagent diluent에 40배 희석하여 20분 반응시켰다. 반응이 끝나면 wash solution을 이용하여 세척하였다. Substrate solution 100 μl을 각 well에 넣은 후 20분 반응시키고 stop solution 50 μl을 넣어 반응을 중지시켰다. 마지막으로 450 nm - 540 nm로 값을 측정하였다. 유전자 발현과 같이 혈청 내 CCL2, CCL5, 및 CCL8은 전신홍반루푸스 발병에 따라 증가하였다 (도 3). 중간엽줄기세포 투여 시 CCL2와 CCL5는 감소하지만 CCL8은 더 증가하는 것을 혈청에서도 확인하였다. 전신홍반루푸스에서 CCL2, CCL5, 및 CCL8을 측정한다면 전신홍반루푸스 발병과 중간엽줄기세포 효과를 예측하는 바이오마커로 활용할 수 있는 것을 확인하였다.

<실시예 7> IFN의 발현 수준의 측정

MRL/lpr 마우스의 발병전인 9주령과 발병중기인 16주령의 마우스의 신장을 이용하여 사이토카인 유전자 발현을 측정하였다. TRIZOL Reagent(Invitrogen)를 이용하여 신장 조직에서 총 RNA를 분리하였다. Total RNA 1 μg의 농도를 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 50ng의 농도로 SYBR green의 probe를 이용하여 qPCR을 수행하였다. MRL/lpr 마우스는 주령이 증가함에 따라 모든 사이토카인이 증가하였고 중간엽줄기세포 투여 시 감소하는 것을 확인하였다 (도 4A). 주령과 16주령 변화 값 분석에서도 다른 사이토카인 보다 특히 IFN 계열의 유전자 발현율이 제일 높았으며, 9주령 대비 16주령에 3배 이상 크게 증가하였다 (도 4B). 따라서 IFN이 전신홍반루푸스 발병에 주요하게 작용하고 있음을 다시 한 번 확인하였다.

<실시예 8> CHI3L1 ELISA 측정

염증 및 세포의 증식유도와 관련된 CHI3L1이 전신홍반루푸스에도 반응하는지 확인하여 전신홍반루푸스 발병과 중간엽줄기세포에 의한 치료효과 예측을 위한 바이오마커로 적용 가능한지 검토하였다. 분리한 혈청을 이용하여 CHI3L1을 측정하며 Mouse Chitinase 3-like 1 (R&D SYSTEM)의 제공된 시험방법에 따라 진행하였다. 혈청을 assay diluent로 500배 희석하여 사용하였다. MRL/lpr 마우스에서 9주령 대비 16주령에서 신장 내 CHI3L1의 유전자 발현(도 5A)과 혈청 내 CHI3L1 생성(도 5B)이 증가하였다. 이에 중간엽줄기세포를 투여하면 신장 내 CHI3L1 유전자 발현과 혈청 내 CHI3L1 생성이 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다. 따라서 CHI3L1은 전신홍반루푸스의 발병 정도와 중간엽줄기세포에 의한 치료효과를 예측하는 잠재적인 바이오마커로 활용할 수 있다.

Claims

CCL5, CCL8 및 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체인, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 바이오마커 조성물.
제 1항의 조성물을 포함하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 키트.
제 4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)인, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측용 키트.
분리된 시료로부터 CCL5, CCL8 및 CHI3L1의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계;
를 포함하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법 .
제 6항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용하는 것인, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준의 측정은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)을 이용하는 것인, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 분리된 시료로부터 CCL5 및 CHI3L1의 유전자의 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 낮게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 분리된 시료로부터 CCL8의 유전자 발현 수준이 대조군 시료와 비교했을 때 높게 측정되면 치료효과가 있거나 우수한 것으로 판단하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료효과 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.