KR20240049337A - Gdf15 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GDF15 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 융합 단백질은 Fc 변이체 및 GDF15 활성 도메인을 포함하고, 이때 Fc 변이체는 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 356 및/또는 위치 439에 아미노산 치환을 갖고, 여전히 동종이량체를 형성하는 능력을 갖는다. 본 발명에서, Fc 변이체와 GDF15 활성 도메인을 융합함으로써, Fc-GDF15 융합 단백질은 유의하게 개선된 물리화학적 특성 및 재조합 발현 수준을 갖고, 천연 GDF15 분자와 동등하거나 더 양호한 시험관내 활성을 갖고, 생체내 순환 반감기가 유의하게 연장되어, 2주 1회 또는 1개월 1회의 투약 빈도를 지원할 수 있다.

Description

GDF15 융합 단백질 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2021년 8월 24일자로 중국 국가특허청에 출원된 중국 특허출원 202110977378.7(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)을 우선권 주장한다.
기술분야
본 발명은 생물의학의 기술 분야, 특히 GDF15 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
대식세포 억제 사이토카인-1(MIC-1)로도 공지된 성장 분화 인자 15(GDF15), 태반 전환 성장 인자-β(PTGF-β), 태반 뼈 형태형성 인자(PLAB), 전립선-유래 인자(PDF), 비스테로이드 항염증성 약물-활성화 유전자(NAG-1)는 형질전환 성장 인자(TGF-β) 상과의 먼 구성원이다. 성숙한 GDF15 폴리펩티드는 112개의 아미노산을 함유하는 반면, 생체내에서 순환하는 생물학적 활성 GDF15는 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 2개의 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체 단백질(24.5 kD)이다.
GDF15의 상승된 순환 수준은 진행성 암을 갖는 환자의 감소된 식품 섭취량 및 체중 감소와 관련이 있는 것으로 보고되었다(문헌[Johnen H et al, Nat Med, 2007]). 또한, GDF15의 높은 발현을 갖는 유전자이식 마우스와 재조합 GDF15가 투여된 마우스는 둘 다 감소된 체중과 식품 섭취량을 나타냈고, 개선된 내당능(glucose tolerance)을 가졌고(문헌[Xiong Y et al., Sci Transl Med, 2017]), 이는 GDF15가 비만, 제2형 당뇨병(T2D), 비알코올성 지방간염(NASH)과 같은 질병을 치료함 잠재력을 가짐을 나타낸다.
생체내 천연 GDF15 이량체의 순환 반감기(t1/2)는 단지 약 2 내지 3시간으로 짧고, 이는 임상 치료 적용을 크게 제한한다. 바이오의약품의 순환 반감기를 연장하기 위한 기존 방법은 활성 분자를 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 단편과 융합시키는 것을 포함한다. 그러나, GDF15 이량체와 Fc 단편 이량체 분자의 3-차원 구조의 특징으로 인해 GDF15와 Fc 단편의 직접적인 융합은 융합 분자의 전반적인 안정성과 재조합 발현의 수율에 큰 영향을 미칠 것이다.
따라서, 비만, T2D, NASH 등과 같은 대사-관련 질환의 치료를 위해 더 긴 반감기와 최적의 약물기량성(druggability)을 갖는 안정한 치료용 GDF15 분자를 개발하는 것이 매우 필요하다.
본 발명의 목적은 GDF15 융합 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다. GDF15 융합 단백질은 최적의 물리화학적 특성, 긴 생체내 반감기 및 효능의 지속시간, 간단한 제조 공정 등의 장점을 갖고, 비만, 제2형 당뇨병, NASH, 이상지질혈증 등과 같은 대사-관련 질환 치료에 사용될 수 있다.
이를 위해, 제1 양상에서, 본 발명은 GDF15 활성 도메인 및 Fc 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공하고; Fc 변이체의 C-말단은 GDF15 활성 도메인의 N-말단에 직접 연결되거나 펩티드 링커를 통해 연결되고;
Fc 변이체가 EU 넘버링(numbering)에 따른 IgG Fc의 위치 356 및/또는 위치 439에서의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 변이체는 동종이량체를 형성하는 능력을 유지한다.
일부 실시양태에서, IgG Fc는 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc 및 IgG4 Fc 중 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, IgG Fc는 인간 IgG1 Fc이다. 일부 실시양태에서, IgG Fc는 인간 IgG4 Fc이다.
또한, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 356에서 D, E 및 C 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, IgG Fc의 위치 356의 아미노산은 하기 군 중 하나에 의해 치환된다: G, S, A, T, V, N, L, I, Q, Y, F, H, P, M, K, R. 또한, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 439에서 R, H, K 및 C 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, IgG Fc의 위치 439의 아미노산은 하기 군 중 하나에 의해 치환된다: G, S, A, T, V, D, N, L, I, E, Q, Y, F, P, M.
일부 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이를 포함한다: E356G, E356S, E356A, E356T, E356V, E356N, E356L, E356I, E356Q, E356Y, E356F, E356H, E356P, E356M, E356K 및 E356R 중 하나, 및/또는 K439G, K439S, K439A, K439T, K439V, K439D, K439N, K439L, K439I, K439E, K439Q, K439Y, K439F, K439H, K439P 및 K439M 중 하나.
바람직한 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이를 포함한다: E356R, E356Q, E356A 및 E356N 중 하나, 및/또는 K439D, K439E, K439Q, K439A 및 K439N 중 하나.
일부 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이 중 하나를 포함한다: K439D, K439E, K439Q, K439A, K439N. 바람직한 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이 중 하나를 포함한다: K439D, K439E, K439Q.
일부 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이 중 하나를 포함한다: E356R, E356Q, E356A, E356N. 바람직한 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 돌연변이를 포함한다: E356R.
일부 실시양태에서, Fc 변이체는 하기 돌연변이를 추가로 포함한다: AA에 대한 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 234 및 위치 235에서의 아미노산 치환, 및/또는 위치 447에서의 아미노산 결실. 예를 들어, IgG1 Fc의 경우, 하기 돌연변이도 포함되고: L234A 및 L235A, 및/또는 위치 447에서의 아미노산 결실; IgG4 Fc의 경우 하기 돌연변이도 포함된다: F234A 및 L235A, 및/또는 위치 447에서의 아미노산 결실.
특정 실시양태에서, Fc 변이체는 EU 넘버링에 따라 IgG Fc에 하기 아미노산 치환 중 하나만을 갖는다:
EU 넘버링에 따른 위치 356에서의 아미노산 치환;
EU 넘버링에 따른 위치 439에서의 아미노산 치환;
EU 넘버링에 따른 위치 356 및 위치 439에서의 아미노산 치환;
EU 넘버링에 따른 위치 356, 위치 234 및 위치 235에서의 아미노산 치환;
EU 넘버링에 따른 위치 439, 위치 234 및 위치 235에서의 아미노산 치환;
EU 넘버링에 따른 위치 356, 위치 439, 위치 234 및 위치 235에서의 아미노산 치환
(각각의 위치에 기재된 아미노산 치환은 본 발명에 기재된 의미를 갖는다).
특정 실시양태에서, Fc 변이체의 아미노산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다: 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45.
[표 1]
Fc 변이체
주석: 표 1에서 아미노산 위치의 넘버링은 EU 넘버링 체계를 따른다.
다른 실시양태에서, Fc 변이체는 하기 서열 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 1 내지 22, 서열번호 27, 서열번호 29 내지 45.
추가로, GDF15 활성 도메인은 전장(full-length) 성숙한 GDF15 단백질, N-말단 절두된 GDF15 단백질, 또는 GDF15의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 변이체이다.
다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 군 중 하나로부터 선택되거나 하기 군 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
서열번호 46;
서열번호 46의 N-말단에서의 1 내지 14개의 아미노산 절두 및/또는 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환.
다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 군 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
서열번호 46;
서열번호 46의 N-말단에서의 1 내지 14개의 아미노산 절두 및/또는 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환.
또한, 서열번호 46의 N-말단의 아미노산 절두의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14이다.
또한, 서열번호 46에서의 아미노산 치환의 위치는 하기 군 중 1, 2 또는 3개로부터 선택된다: 위치 5, 위치 6, 위치 21, 위치 26, 위치 30, 위치 47, 위치 54, 위치 55, 위치 57, 위치 67, 위치 69, 위치 81, 위치 94, 위치 107.
또한, 서열번호 46에서의 아미노산 치환은 상이한 위치 중 1개, 임의의 2개 또는 상이한 위치 중 임의의 3개로부터 선택된다: D5E, H6D, H6E, R21Q, R21H, D26E, A30S, A47D, A54S, A55E, M57T, R67Q, K69R, A81S, T94E, K107Q.
일부 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 서열번호 46에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 서열을 포함한다: 서열번호 46의 N-말단에서 1 내지 14개의 아미노산만큼 절두된 아미노산 서열.
또 다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 서열을 포함한다: 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열; 서열번호 46에서의 아미노산 치환은 본 발명에 기재된 의미를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 서열을 포함한다: 서열번호 46의 N-말단에서의 1 내지 14개의 아미노산 절두 및 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열; 서열번호 46에서의 아미노산 치환은 본 발명에 기재된 의미를 갖는다.
특정 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 서열 중 하나를 포함한다: 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66.
[표 2]
GDF15 활성 도메인 서열
주석: 표 2에서, 아미노산 위치를 나타내는 넘버링 방법은 다음과 같다: 서열번호 46의 N-말단에서의 제1 아미노산은 제1 위치이고, C-말단의 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 하기 군 중 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 46 내지 66; 바람직하게는, GDF15 활성 도메인은 하기 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 46 내지 66.
다른 실시양태에서, GDF15 활성 도메인은 하기 서열 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 46 내지 66.
일부 실시양태에서, Fc 변이체의 C-말단은 펩티드 링커를 통해 GDF15 활성 도메인의 N-말단에 연결되고; 펩티드 링커는 가요성 펩티드 링커(flexible peptide linker) 및 강성 펩티드 링커(rigid peptide linker) 중 하나, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 임의의 적합한 링커가 본 발명의 실시양태의 융합 단백질에 사용될 수 있다. 본원에서 용어 "링커"는 펩티드 링커를 함유하는 연결 모이어티(linking moiety)를 의미한다. 바람직하게는, 링커는 적절한 접힘(folding)을 보장하고 입체장애를 최소화하고 융합 단백질 내의 각각의 기능적 구성요소(component)의 구조를 유의하게 방해하지 않는 데 도움을 준다. 더욱 바람직하게는, 보다 높은 단백질 발현 수율을 수득하기 위해 강성 펩티드 링커와 강성/가요성 하이브리드 펩티드 링커가 본 발명에서 사용되었다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n, (X'P)m, (EAAAK)p 및 Gq 중 하나, 또는 2개 이상의 조합을 포함하고, 이때 각각의 n, m, p 및 q는 1 내지 10의 정수, 또는 11 내지 20의 정수로부터 독립적으로 선택된다. X는 세린(S) 또는 알라닌(A)이고, X'는 알라닌(A), 리신(K) 또는 글루탐산(E)이다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n 및 (X'P)m의 조합을 포함하고, 이때 n, m, X, X'는 본 발명에 기술된 의미를 갖는다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n1-(X'P)m-(G4X)n2를 포함하고, 이때 각각의 n1, m 및 n2는 1 내지 10의 정수 또는 11 내지 20의 정수로부터 독립적으로 선택된다. X는 S 또는 A이고, X'는 A, K 또는 E이다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n1-(X'P)m-(G4X)n2를 포함하고, 이때 n1은 2이고, m은 10이고, n2는 2이다.
다른 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gq와 (X'P)m의 조합을 포함하고, 이때 q, m, X'는 본원에 기술된 의미를 갖는다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gq1-(X'P)m-Gq2를 포함하고, 이때 q1, m 및 q2는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수, 또는 11 내지 20의 정수로부터 선택되고, X'는 A, K 또는 E이다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gq1-(X'P)m-Gq2를 포함하고, 이때 q1은 4이고, m은 10이고, q2는 4이다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n, (X'P)m 및 Gq의 조합을 포함하고, 이때 n, m, q, X, X'는 본 발명에 기술된 의미를 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n1-Gq1-(X'P)m-(G4X)n2-Gq2를 포함하고, 이때 n1, q1, m, n2, q2는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수 또는 11 내지 20의 정수로부터 선택된다. X는 S 또는 A이고, X'는 A, K 또는 E이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4X)n1-Gq1-(X'P)m-(G4X)n2-Gq2를 포함하고, 이때 n1은 1이고, q1은 4이고, m은 10이고, n2는 1이고, q2는 4이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)5(서열번호 123)를 포함하고; 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)8(서열번호 124)을 포함하고; 본 발명의 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 G4(AP)10G4(서열번호 125)를 포함하고; 본 발명의 다른 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)2(AP)10(G4S)2(서열번호 126)를 포함하고; 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)2(EP)10(G4S)2(서열번호 127)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 군 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118.
[표 3]
융합 단백질
주석: 표 3에서, Fc 변이체의 돌연변이의 주석에 있는 아미노산 위치의 넘버링은 EU 넘버링을 따르고; GDF15 활성 도메인의 아미노산 위치를 나타내는 넘버링 방법은 다음과 같다: 서열번호 46의 N-말단에서의 제1 아미노산은 제1 위치이고, C-말단의 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 서열 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102, 서열번호 105 내지 118. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 하기 군 중 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102, 서열번호 105 내지 118; 바람직하게는, 융합 단백질은 하기 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102 및 서열번호 105 내지 118.
제2 양상에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양상에서 기술된 융합 단백질을 포함하는 동종이량체(homodimeric) 융합 단백질을 제공한다.
제3 양상에서, 본 발명은 생물학적 물질을 제공하고, 이때 생물학적 물질은 하기 (i), (ii) 및 (iii) 중 어느 하나이다:
(i) 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
(ii) (i)의 핵산을 포함하는 벡터;
(iii) (i)의 핵산 및/또는 (ii)의 벡터를 함유하는 숙주 세포.
제4 양상에서, 본 발명은 본 발명의 동종이량체 융합 단백질을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 동종이량체 융합 단백질은 치료 효과량으로 약학 조성물에 존재한다.
추가로, 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
제5 양상에서, 본 발명은 대사 질환의 치료용 약제의 제조에서의 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 대사 질환은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환 등을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 치료 효과량의 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 대사 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 대사 질환은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환 등을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 대상에서 대사 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 대사 질환은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환 등을 포함한다.
제6 양상에서, 본 발명은 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 포도당 수치의 감소용 약제의 제조에서의 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 대상에게 치료 효과량의 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 포도당 수치를 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 글루코스 수치를 감소시키는 데 사용하기 위한 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물을 제공한다.
제7 양상에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질, 동종이량체 융합 단백질 또는 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대사 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 대사 질환은 본 발명에 기재된 의미를 갖는다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 다음과 같은 진보를 갖는다: 비돌연변이(unmutated) 또는 단량체 또는 이종이량체(heterodimeric) IgG Fc 및 GDF15 활성 도메인의 융합 단백질과 비교하여, 본 발명에 의해 제공된 Fc 변이체를 생물학적 활성을 유지하는 임의의 GDF15 도메인(성숙한 GDF15, 절두된 GDF15 또는 이의 변이체)과 융합함으로써, Fc-GDF15 융합 단백질은 유의하게 개선된 물리화학적 특성 및 재조합 발현 수준을 갖고, 천연 GDF15 분자와 동등하거나 더 양호한 시험관내 활성을 갖고, 유의하게 연장된 생체내 순환 반감기를 가져서, 2주 1회 또는 심지어 1개월 1회의 투여 빈도를 지원할 수 있다. 또한, 본 발명의 Fc-GDF15 융합 단백질은 종래 기술의 이종이량체에 의해 형성된 융합 단백질에 비해 제조 공정이 간단하고 생산 비용이 저렴하다.
다양한 다른 장점 및 이점은 바람직한 실시양태에 대한 하기 상세한 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 도면은 단지 바람직한 실시양태를 예시하기 위한 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 도면에서,
도 1은 Fc-GDF15 융합 단백질에 의해 형성된 동종이량체의 개략도를 도시한다.
도 2는 정상 마우스의 체중에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여 효과(14일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 3은 정상 마우스의 식품 섭취량에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 효과(14일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 4는 정상 마우스의 체중에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여 효과(30일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 5는 정상 마우스의 식품 섭취량에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 효과(30일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 6은 정상 마우스의 체중에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 효과(56일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 7은 정상 마우스의 식품 섭취량에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 효과(56일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 8은 식이-유발 비만 마우스의 체중에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 반복-용량 투여의 효과(42일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 9는 Fc-GDF15 융합 단백질의 반복-용량 투여 후 식이-유발 비만 마우스에서의 내당능(glucose tolerance) 시험의 결과를 도시한다.
도 10은 식이-유발 비만 마우스의 체중에 대한 다양한 용량 수준의 M39 구축물의 반복-용량 투여의 효과(49일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 11은 상이한 용량의 M39 구축물의 반복-용량 투여 후(46일) 식이-유발 비만 마우스의 공복 혈당 수치(Fasting blood glucose level)를 도시한다.
도 12a는 상이한 용량 수준의 M39 구축물의 반복-용량 투여 후(46일) 식이-유발 비만 마우스에서의 내당능 시험의 결과를 도시하고, 도 12b는 내당능 시험 곡선하 면적의 통계(**-p<0.01, ***-p<0.001 대 비히클. 통계적 분석 방법: 일원(one-way) ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 13은 상이한 용량의 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 식이-유발 비만 마우스의 지방 지수(**-p<0.01, ***-p<0.001, #-p<0.05, ##-p<0.01, ###-p<0.001 대 비히클. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 14는 상이한 용량의 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 식이-유발 비만 마우스의 알라닌 트랜스아미나제 수치(***-p<0.001 대 비히클. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 15는 상이한 용량의 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 식이-유발 비만 마우스의 아스파르테이트 트랜스아미나제 수치(***-p<0.001 대 비히클. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 16은 ob/ob 비만 마우스의 체중에 대한 상이한 용량의 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여의 효과(52일 동안 모니터링됨)를 도시한다. 도 16a. 기준선 대비 체중 변화; 도 16b. 비히클 대조군 대비 체중 변화.
도 17은 상이한 용량에서 ob/ob 비만 마우스의 식품 섭취량에 대한 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여의 효과(52일 동안 모니터링됨)를 도시한다.
도 18은 상이한 용량의 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 ob/ob 비만 마우스의 간 지수(***-p<0.001 대 비히클, ###-p<0.001 대 세마글루타이드(Semaglutide). 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 19는 상이한 용량의 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 ob/ob 비만 마우스의 알라닌 트랜스아미나제 수치(***-p<0.001 대 비히클, ##-p<0.01 대 세마글루타이드. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 뒤이어 Dunnett's)를 도시한다.
도 20은 상이한 용량의 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 ob/ob 비만 마우스의 아스파르테이트 트랜스아미나제 수치(*-p<0.05, **-p<0.01, ***-p<0.001 대 비히클, #-p<0.05 대 세마글루타이드. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)를 도시한다.
도 21은 상이한 용량의 M6 및 M39 구축물의 반복-용량 투여 후 ob/ob 비만 마우스의 간 병리학의 개선(***-p<0.001 대 비히클, ###-p<0.001 대 세마글루타이드. 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's)을 도시한다.
실시예
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 개시내용의 예시적인 실시양태를 더욱 상세하게 설명한다. 도면에 본 개시내용의 실시양태가 도시되지만, 본 개시내용은 다양한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 실시양태에 의해 제한되지 않는다는 점을 이해해야 한다. 오히려, 이러한 실시양태는 본 개시내용이 당업자에게 더욱 완전하게 이해되고, 본 개시내용의 범주가 완전하게 전달될 수 있도록 제공된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당업자의 종래 기술의 숙지 및 본 발명의 설명에 따라, 실시양태에 사용된 특정 방법, 장치 및 재료 외에도, 본 발명의 실시양태에 설명된 방법, 장치 및 재료와 유사하거나 동등한 종래 기술의 임의의 방법, 장치 및 재료가 또한 본 발명을 구현하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "천연", "야생형" 또는 "WT"는 유전적으로 조작된 돌연변이를 함유하지 않고 자연적으로 발생하거나 환경으로부터 단리될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 아미노산 "치환" 또는 "대체"는 폴리펩티드 내의 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 치환은 제1 문자, 이어서 숫자, 이어서 제2 문자로 표시된다. 제1 문자는 야생형 단백질의 아미노산을 나타내고; 숫자는 치환된 아미노산 위치를 의미하고; 제2 문자는 야생형 아미노산을 대체하는 데 사용된 아미노산을 나타낸다.
본원에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단에서의 결실은 ΔN, 이어서 숫자로 표시되고, 이때 숫자는 아미노 말단에서 결실된 아미노산의 수를 나타낸다.
본원에 사용된 "IgG" 또는 "IgG 항체"는 자연 발생 면역글로불린 G 분자의 구조를 갖는 항체를 지칭한다. IgG 항체는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc 및 IgG4 Fc는 각각 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 또는 Fc 영역을 나타낸다. 본원에서 융합 단백질의 IgG Fc는 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 바람직하게는 IgG1 Fc, IgG4 Fc일 수 있다.
본원에 사용된 "펩티드 링커"는 2개의 단백질을 함께 연결하는 단일 아미노산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 펩티드 링커의 길이는, 예를 들어 반복되는 알라닌, 글리신 및 세린을 비롯한 약 1 내지 40개의 아미노산일 수 있다. 일반적인 펩티드 링커는 가요성 펩티드 링커, 예를 들어 펩티드 링커의 반복 단위의 수에 의해 연결된 단백질 사이의 거리를 조정할 수 있는 (GGGGS)n과 같은 글리신과 세린의 조합; Gn과 같은 글리신만으로 구성된 펩티드 링커(일반적인 것은 G6, G8 등을 포함함); (EAAAK)n 서열을 갖는 α-나선형 펩티드 링커와 같은 강성 펩티드 링커; 프롤린이 풍부한(XP)n을 갖는 펩티드 링커(이때, X는 임의의 아미노산을 특정할 수 있고, 일반적인 것은 알라닌, 리신 또는 글루탐산을 포함하고, (XP)n 서열은 나선형 구조가 없고, 펩티드 링커에 프롤린이 존재하면 골격 강성도(stiffness)를 높이고 도메인을 효과적으로 분리함)를 포함한다. 골격근 단백질의 N-말단에 있는 (AP)7의 구조와 같이 프롤린이 풍부한 서열을 갖는 구조가 신체에 널리 퍼져 있다. 펩티드 링커의 선택은 가요성 펩티드 링커만을 사용하는 것, 강성 펩티드 링커만을 사용하는 것, 가요성 펩티드 링커와 강성 펩티드 링커의 조합을 사용하는 것 등과 같은 일반적인 실험에 근거하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에서, "Fc" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 당업자는 Fc 영역이 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함하고, Fc 영역의 경계가 변할 수 있다는 것을 알고 있다. 이러한 맥락에서, Fc 영역의 C-말단은 항체의 중쇄의 C-말단이고; Fc 영역의 N-말단은 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역의 N-말단은, 예를 들어 위치 231(EU 넘버링), 위치 233(EU 넘버링), 위치 236(EU 넘버링) 또는 위치 237(EU 넘버링)로부터 출발할 수 있고; 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc 영역의 N-말단은 힌지 영역을 포함하지 않고; 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc 영역의 N-말단은 힌지 영역을 포함한다. 본원에서, Fc 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Edelman et al., The covalent structure of an entire γG immunoglobulin molecule. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1969]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 공지된 EU 넘버링 시스템에 따른다.
GDF15 폴리펩티드는 활성을 발휘하기 위해 이량체를 형성해야 한다. 본 발명의 연구 과정에서, IgG Fc가 자연적으로 이량체를 형성할 수 있음에도 불구하고, IgG Fc 이량체에서 두 단량체 Fc의 카복실 말단 사이의 공간적 거리가 GDF15 단량체의 아미노 말단의 거리와 유의하게 상이하고; 가요성 또는 강성 펩티드 링커를 사용하더라도, IgG Fc의 C-말단과 GDF15의 N-말단에 의해 형성된 융합 단백질이 여전히 어셈블리(assembly) 과정에서 불안정성과 낮은 발현 수율과 같은 문제를 갖고 있음이 밝혀졌다. 본 발명에 의해 제공되는 Fc 변이체는 위치 439 또는 356과 같은 특정 Fc 부위에 돌연변이를 도입함으로써 Fc-GDF15 분자의 안정성을 유의하게 개선하고, Fc-GDF15 융합 단백질의 효율적인 어셈블리를 실현하고, 발현 수율을 증가시킨다. 제조 공정은 간단하고, 융합 단백질은 동종이량체를 형성하는 능력을 유지한다. 또한, 본 발명의 Fc 변이체는 성숙한 GDF15 단백질이든, 이의 절두된 GDF15이든, 또는 이의 임의의 변이체이든, 본 발명의 Fc 변이체와 융합 단백질을 형성하고 역할을 수 있는 모든 GDF15 단백질 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 변이체에 적용될 수 있다.
본원에서 사용된 "이량체"는 2개의 단백질 폴리펩티드로 구성되고 단백질의 4차 구조인 단백질 이량체를 의미한다. 이량체를 구성하는 2개의 단백질 폴리펩티드는 이량체의 단량체 분자 또는 단량체 단백질로 지칭될 수 있다. 이량체는 "동종이량체" 및 "이종이량체"를 모두 포함할 수 있고, 이때 동종이량체는 2개의 동일한 단량체 분자의 조합에 의해 형성되고; 이종이량체는 2개의 상이한 단량체 분자의 조합에 의해 형성된다. 일반적으로, 동종이량체는, 단지 1개의 펩티드가 인코딩되는 데 필요하므로, 이종이량체보다 제조하기가 더 간단한 것으로 여겨진다. 본 발명에서, 본 발명에 의해 제공되는 Fc 변이체는 동종이량체를 형성하는 능력을 갖고; 본 발명에 의해 제공되는 Fc 변이체와 GDF15 활성 도메인의 융합 단백질은 또한 동종이량체를 형성하는 능력을 갖는다. 도 1을 참조하면, 융합 단백질에 의해 형성된 동종이량체에서, 2개의 단량체 Fc 변이체 사이와 2개의 단량체 GDF15 활성 도메인 사이에 각각 동종이량체화가 존재한다.
본원에서, 일부 실시양태에서, "성장 분화 인자 15", "GDF15" 또는 "GDF15 활성 도메인"은 천연 성숙한 인간 GDF15 또는 이의 도메인이고, 다른 실시양태에서, GDF15의 돌연변이체 또는 이의 도메인을 지칭한다. 성숙한 GDF15는 총 308개의 아미노산(UniProt q99988) 중에서 시그널 펩티드(signal peptide)와 리더 펩티드(leader peptide)를 제외한 아미노산 197(a) 내지 308(I)(GDF15(197-308)(서열번호 46)), 또는 GDF15의 독특한 활성 및 구조를 유지하는 범위 내에서 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 및 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 구성된다. 돌연변이체는 절두 및/또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절두된 GDF15는 N-말단 결실 변이체, 예컨대 N-말단에서 절두된 1 내지 14개 아미노산의 서열, 또는 절두된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 및 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있고; 일부 실시양태에서, GDF15 변이체는 성숙한 GDF15 또는 절두된 GDF15와 비교되는 하나 이상의 아미노산 부위의 치환, 삽입 또는 결실을 의미한다. 식품 섭취량, 혈당 수치, 인슐린 내성 및 체중 등에 대한 효과와 같은 GDF15 단백질의 생물학적 활성 중 하나 이상을 유지하는 한, 이는 본 발명의 보호범위에 속한다.
GDF15 변이체는 또한, 보존적이거나 비보존적인 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하고 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산을 사용함으로써, 또는 GDF15 폴리펩티드의 특정 위치에서 특정 잔기 또는 이의 분절을 결실시킴으로써, 생성될 수 있다.
본원에서 용어 "보존적 아미노산 치환"은, 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대한 효과가 없거나 거의 없도록 천연 아미노산 잔기(즉, 야생형 GDF15 폴리펩티드 서열의 소정 위치에서 발견되는 잔기)를 비천연 잔기(즉, 야생형 GDF15 폴리펩티드 서열과 동일한 위치에서 발견되지 않는 잔기)로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 혼입되는 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 이들은 펩티드 모방체(peptidomimetics) 및 다른 역전된(reversed) 또는 반전된(inverted) 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다.
자연적으로 발생하는 아미노산 잔기는 일반적인 측쇄 특성을 기준으로 하기 클래스로 분류될 수 있다:
(1) 소수성 잔기: M, A, V, L, I;
(2) 중성 친수성 잔기: C, S, T, N, Q;
(3) 산 잔기: D, E;
(4) 알칼리성 잔기: H, K, R;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: G, P; 및
(6) 방향족 잔기: W, Y, F.
보존적 치환은 이러한 범주의 한 구성원이 동일한 범주의 다른 구성원으로 교환되는 것을 포함할 수 있다.
일부 보존적 아미노산 치환은 하기 표에 제시된다:
보전적 치환은 이러한 범주 중 하나의 구성원을 동일한 범주의 다른 구성원으로 교환하는 것이 포함할 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 범주 중 하나의 구성원을 다른 범주의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "동일성" 또는 "상동성"은 일반적으로 2개의 펩티드 또는 단백질 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. % "동일성" 또는 "상동성"은 비교되는 분자 내의 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하고, 비교되는 분자 중 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다.
본 발명의 Fc 변이체와 천연 성숙한 인간 GDF15 또는 이의 변이체에 의해 형성된 융합 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터"는 자가-복제(self-replicating) 핵산 구조인 벡터, 및 벡터가 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 벡터를 비롯한, 연결된 다른 핵산을 전파(propagating)할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있고, 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 외인성 핵산이 도입된 세포를 의미하고, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 처음에 형질전환된 세포와 이로부터 유래된 자손(계대 횟수에 관계없이)을 포함한다. 자손은 핵산의 함량이 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 예컨대 E. coli, 곤충 세포, 식물 세포 등과 같은 포유동물 배양 세포를 포함하고, 유전자이식 동물, 유전자이식 식물, 배양된 식물 또는 동물 조직에 함유된 세포도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하고, 약학 조성물이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분이 없는 형태의 제제를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과량"은, 예를 들어 질병의 부작용을 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 예방하는 것을 비롯한 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 독성이 없는, 약학 조성물의 활성 성분 이외의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 치료받는 개체의 질병의 자연 경과를 변경하려는 시도를 의미하고, 임상 병리학의 과정 동안 수행되는 예방 또는 임상적 개입을 위한 것일 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화하고, 질병의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과를 감소시키고, 질병 진행의 속도를 늦추고, 질병 상태를 개선하거나 제거하고, 예후를 퇴행시키거나 개선하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "개인" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 영장류(예를 들어, 인간, 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이) 또는 다른 포유동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 말, 토끼, 및 설치류, 예를 들어 마우스 및 래트)을 포함한다. 특히, 개체 또는 대상은 인간이다.
본원에서, 천연 아미노산에 대한 기존의 1-글자 또는 3-글자 코드가 사용된다.
실시예 1
Fc 변이체의 디자인
본 실시예에서, Fc의 구조적 특성에 대한 상이한 돌연변이의 도입 효과를 시험하였고, 일부 돌연변이체의 시험 결과는 표 4에 제시된다. 시험 단계는 다음을 포함한다:
Fc 핵산 서열을 포유동물 세포 발현 벡터에 삽입하기 위해 분자 클로닝 방법을 사용하였고, CHO-S 세포에서의 일시적 형질감염 및 발현을 위해 ExpiCHO FectamineTM CHO Transfection Kit(ThermoFisher Scientific)를 사용하였고; Protein A 컬럼으로 정제한 후, 표적 단백질을 수득하였고, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC)로 표적 단백질을 분석하였다.
SEC 분석의 주요 원리는 분석물(예컨대, 단백질)의 분자량과 3-차원 구조를 기반으로 한다. 일반적으로, 분자량이 더 큰 분석물은 크로마토그래피 컬럼을 더 빨리 통과하므로, 컬럼 체류 시간이 더 짧다. 반대로, 분자량이 더 작은 분석물은 체류 시간이 더 길다. 따라서, SEC는 단백질 분자의 응집(aggregation)/올리고머화(예컨대, 이량체화)를 분석하는 데 사용할 수 있다.
천연 면역글로불린 Fc 단편은 자연적으로 동종이량체 구조를 형성할 것이다. 융합 단백질의 안정성을 개선하기 위해서, Fc 분자가 돌연변이되어야 하고, 이는 Fc 동종이량체의 구조를 파괴할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 위치 439에서의 돌연변이의 도입 후에 Fc 분자(K439D 또는 K439E)가 SEC 분석에서 돌연변이가 없는 Fc 분자와 동일한 체류 시간을 가졌음을 발견하였고, 이는 도입된 돌연변이가 Fc 이량체의 형성을 방해하지 않았음을 나타낸다. 대조군으로서, 본 실시예는 또한 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 Fc 분자(F405Q/Y407E 돌연변이 포함)를 시험하였다. 이전 특허문헌 WO 2019/195091에 따르면, F405Q/Y407E 돌연변이는 Fc 이량체를 파괴하여 단량체 Fc 분자를 형성한다. 본 실험에서, 돌연변이가 유의하게 연장된 체류 시간을 가짐을 발견하였고, 이는 Fc 분자가 단량체 형태로 존재함을 나타낸다.
[표 4]
Fc 변이체 이량체 형성의 특성
실시예 2
Fc-GDF15 구축물의 제조
발현 벡터의 구축: 표 3에 제시된 Fc-GDF15 분자를 포유동물 세포 벡터 pXC17.4의 다중클론 제한 부위에 각각 삽입하여 표 3에 제시된 Fc-GDF15를 발현하는 발현 벡터를 구축하였고; Fc-GDF15 발현 벡터는 세포 형질감염을 위해 내독소-고갈된 플라스미드 추출 키트(OMEGA)로 추출되었다.
세포 형질감염 및 배양: CHO-S 세포를 회수하여 계대배양(subculture)하고, 세포 형질감염을 위해 밀도가 약 6x106 세포/mL에 도달하였을 때 세포를 수집하였다. Fc-GDF15 발현 벡터의 최종 농도가 1 μg/mL인 ExpiCHO FectamineTM CHO Transfection Kit(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 약 20시간 후에, ExpiCHO Fectamine CHO Enhancer 및 ExpiCHO Feed를 첨가하여 형질감염된 세포의 성장을 유지하였다. 세포 생존율이 약 80%로 감소하였을 때 세포 배양 배지를 수확하였다.
단백질 정제: 세포 배양 배지를 원심분리한 후, 상청액을 수집하고, 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 배양 상청액을 수득하였다. 세포 배양 상청액을 2-단계 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피의 제1 단계: 세포 배양 상청액을 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 평형화된 AT Protein A Diamond 컬럼(BestChrom)에 적용하였다. 표적 단백질이 결합된 후, 평형 용액으로 3 CV(컬럼 부피) 초과로 세척하여 결합되지 않은 불순물을 제거하고, 100 mM 아세트산-나트륨아세테이트(pH 3.0) 완충액으로 용리하였다. 표적 단백질을 수집한 후, 1.0 M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 사용하여 수집된 샘플의 pH를 7.2 내지 7.6으로 빠르게 조정하였고, pH-조정된 샘플을 이의 전도도 값이 5 ms/cm 미만일 때까지 정제수로 희석하여 제1 샘플을 수득하였다. 크로마토그래피의 제2 단계: Protein A에 의해 수득된 제1 샘플을 20 mM Tris-HCl 완충액으로 평형화된 Bestarose Q HP 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 제1 샘플을 로딩하고, 완충 시스템을 교체하기 위해 3 CV 초과 동안 20 mM Tris-HCl 완충액, 및 3 CV 초과 동안 20 mM PB 완충액으로 세척하고, 마지막으로 PBS로 용리하였다. 용리 분획을 수집하여 표적 단백질 샘플을 수득하였다. 표적 단백질 샘플의 성질 및 순도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 질량 분광 분석법에 의해 평가되었다. 표적 단백질 샘플은 미세핵산(micro-nucleic acid) 단백질 분석기(NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer)를 사용하여 정량화되었다.
실시예 3
Fc-GDF15 융합 단백질의 발현 수율에 대한 Fc 변이체의 효과
표 3에 기재된 Fc-GDF15 융합 단백질을 실시예 2에 기재된 방법으로 발현시키고, Fc-GDF15 융합 단백질의 발현 수율에 대한 상이한 Fc 변이체의 효과를 비교하였다. 시험 결과는 표 5에 제시된다.
시험 결과에 따르면, Fc의 K439(EU 넘버링) 또는 E356(EU 넘버링)에서 돌연변이가 발생하지 않은 Fc-GDF15 융합 단백질, 예를 들어 M1(서열번호 119의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M14(서열번호 79의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)는 발현 수율이 더 낮은 반면, Fc의 K439 및/또는 E356에서 돌연변이가 발생한 Fc-GDF15 융합 단백질, 예를 들어 M2(서열번호 67의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M3(서열번호 68의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M4(서열번호 69의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M5(서열번호 70의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M6(서열번호 71의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M7(서열번호 71의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M8(서열번호 73의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M9(서열번호 74의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M10(서열번호 75의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M11(서열번호 76의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M15(서열번호 80의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M39(서열번호 105의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M50(서열번호 116의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)은 융합 단백질 발현 수율이 개선되었고, 이는 위치 356(EU 넘버링) 또는 439(EU 넘버링)의 아미노산의 돌연변이가 Fc-GDF15 융합 단백질의 어셈블링된 발현에 더 바람직함을 나타낸다.
[표 5]
상이한 Fc 변이체를 포함하는 Fc-GDF15 융합 단백질의 발현 수율
실시예 4
Fc-GDF15 융합 단백질의 물리화학적 특성
응집 및 분해 경향과 같은 단백질 분자의 물리화학적 특성은 분자의 약물기량성에 영향을 미치므로, 이상적인 약물 분자는 안정한 단일 성분을 가져야 한다(즉, 응집 및 분해가 덜 발생함).
Fc-GDF15 융합 단백질의 물리화학적 성질을 시험하기 위하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 Fc-GDF15 융합 단백질을 발현 및 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다. 구체적으로, SEC 분석에는 Waters Xbridge BEH 200A, 3.5 μm(7.8 x 300 mm) 크로마토그래피 컬럼을 사용하였고, 이동상은 150 mM 포스페이트 완충액/아세토니트릴(9:1, pH 6.5)이었고, 유량은 0.5 mL/분이었다. 시험 결과에서, 고분자량(HMW) 성분의 비율은 응집의 비율을 나타내고, 저분자량(LMW) 성분의 비율은 분해의 비율을 나타낸다. 시험 결과는 표 6에 제시된다.
[표 6]
상이한 Fc-GDF15 융합 단백질의 물리화학적 특성의 비교
표 6의 결과는, Fc의 K439(EU 넘버링) 또는 E356(EU 넘버링)에 돌연변이가 없는 Fc-GDF15 융합 단백질, 예컨대 M1 및 M14는 각각 50.2% 및 67.6%의 고분자량(HMW) 응집을 가진 반면에; Fc의 K439(EU 넘버링) 및/또는 E356(EU 넘버링)에서 돌연변이된 Fc-GDF15 융합 단백질은 모두 유의하게 감소된 중합체 응집 비를 가졌고, 대부분의 융합 단백질은 5% 미만의 중합체 응집을 가졌고, 이는 K439(EU 넘버링) 또는 E356(EU 넘버링)에서의 Fc의 돌연변이가 Fc-GDF15 융합 단백질의 더 양호한 약물기량성을 가져올 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
Fc-GDF15 융합 단백질의 시험관내 활성
생체내에서 GDF15의 기능이 특정 수용체 GFRAL 및 보조수용체(coreceptor) RET를 통한 신호 전달(signal transduction)을 요구함을 나타냈다. 세포 표면의 수용체와 결합하는 GDF15는 하류 신호전달 경로를 활성화할 수 있고, 그 중 하나는 ERK1/2 인산화이다. 따라서, GDF15의 시험관내 활성 및 효능은 세포에서 ERK1/2의 인산화 수준을 검출함으로써 평가될 수 있다.
인간 GFRAL(UniProtKB - Q6UXV0) 및 인간 RET(UniProtKB - P07949)의 유전자 서열을 IRES 요소로 연결하고 CMV 프로모터의 하류에 배치한 다음, HEK293T 세포(ATCC)에 형질감염시켰다. 두 수용체를 안정적으로 발현하는 양성 세포(간단히 수용체-발현 세포라고 함)를 선별하기 위해 Puromycin(Gibco)을 첨가하였고, 이를 시험관내 GDF15 활성 분석에 사용하였다. 세포에서 ERK1/2의 인산화 수준은 제조사의 지침에 따라 Advanced phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204) HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescent) 키트(Cisbio)를 사용하여 검출되었다.
간략하게, 수용체-발현 세포를 384-웰 플레이트에 16,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅(plating)하였다. 기아(starvation) 후, 세포를 Fc-GDF15 융합 단백질 또는 천연 GDF15(ACROBiosystems, GD5-H5149)로 자극하였다. 자극 후, 세포를 용해시키고, 표지된 항체(검정 키트와 함께 제공됨)와 함께 밤새 실온에서 항온처리하였다. 다기능 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax i3X, Molecular devices)를 사용하고 337 nm를 여기 파장으로 사용하여 665 nm 및 620 nm에서 형광 값을 검출하였다. 신호 강도는 665 nm와 620 nm에서의 형광 값의 비로 계산되고, 공식은 다음과 같다:
이때, A665는 665 nm 파장에서 검출된 형광 값이고, A620은 620 nm 파장에서 검출되는 형광 값이다. 반응 값의 강도는 세포에서의 ERK1/2의 인산화 강도에 상응한다.
각각의 구축물에 대한 EC50은, GraphPad Prism에서 4개의 파라미터 로지스틱 회귀(parameter logistic regression)에 의한 가변 기울기 S자형 용량-반응 곡선을 사용하여 결정한다. 상대 활성 비(천연 GDF15 EC50 : Fc-GDF15 구축물 EC50)를 계산하였다. 결과는 표 7에 제시된다.
[표 7]
Fc-GDF15 융합 단백질의 시험관내 활성
결과는, 시험관내 활성이 유의하게 감소된 M35를 제외하고, 나머지 Fc-GDF15 융합 단백질이 모두 천연 GDF15에 필적하거나 그보다 나은 시험관내 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 6
Fc-GDF15 융합 단백질의 열적 안정성
본 실시예에서, 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 상이한 Fc-GDF15 융합 단백질의 열적 안정성을 시험하였다. DSC 스펙트럼의 흡열 전이 곡선은 단백질 분자의 변성(denaturation) 및 풀림(unfolding) 과정을 나타내고, 단백질의 열적 안정성은 열 전이 중간점(Tm) 값으로 특징지을 수 있다. 구체적으로, 샘플을 30℃로부터 110℃까지 120℃/시간의 가열 속도로 가열하고, 상이한 Fc-GDF15 융합 단백질의 Tm 값을 측정하였다. 결과는 표 8에 제시된다. 실험 결과는 Fc-GDF15 융합 단백질이 양호한 열적 안정성을 갖고 약물 개발에 적합함을 나타낸다.
[표 8]
Fc-GDF15 융합 단백질의 Tm 값
실시예 7
정상 마우스에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 생체내 효능
GDF15는 식품 섭취를 억제하고, 체중을 줄이고, 비만 및 다른 관련 대사 질환을 치료할 가능성이 있다. 그러나, 천연 GDF15 분자는 혈청 반감기가 약 3시간에 불과해 직접적인 치료 적용을 크게 제한한다. 본 발명에 의해 제공되는 Fc-GDF15 융합 단백질은 약물 분자의 반감기를 연장시킬 수 있다. 본 실시예에서, 정상 마우스의 식품 섭취량 및 체중에 대한 상이한 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일-용량 투여의 효과를 시험하여 상이한 Fc-GDF15 융합 단백질의 생체내 효능 및 작용 지속시간을 평가하였다.
구체적으로, 8 내지 9주령 C57BL/6 마우스(Hunan SJA Laboratory Animal)의 체중을 0일에 칭량하고, 시험할 Fc-GDF15 융합 단백질 또는 비히클(PBS)의 단일 피하 용량을 투여하고, 식품 섭취량과 체중을 투여 후 지속적으로 모니터링하였다. 중량 변화 백분율의 계산 방법은 중량 변화(%) = (측정된 중량 - 초기 중량)/초기 중량 x 100%이다.
14일 동안 단일 용량으로 처리된 정상 마우스의 식품 섭취량 및 체중의 결과는 표 9, 도 2 및 도 3에 제시된다.
[표 9]
정상 마우스의 체중 및 식품 섭취량에 대한 단일-용량 치료의 효과(14일 동안 모니터링됨)
주석: 모든 데이터는 군 당 7마리 동물의 평균 ± SEM으로 제시된다. ***-p<0.001, 대 비히클; #-p<0.05, 대 MonoFc-GDF15; ##-p<0.01, 대 MonoFc-GDF15, 통계적 분석 방법: T-검정.
결과는, 정상 마우스에서 3 nmol/kg의 용량의 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일 투여가 제8일 및 제14일에 비히클에 비해 식품 섭취를 억제하였고 체중을 유의하게 감소시킴을 나타낸다. 특히, 단량체 Fc(특허 WO 2019/195091에 개시된 "화합물 2", 단량체는 서열번호 104의 서열을 갖고, Fc는 서열번호 18의 서열을 갖고, 이때 F405Q, Y407E)를 함유하는 GDF15 융합 단백질 monoFc-GDF15는 제8일에 최적의 효능에 도달하였고; 놀랍게도, Fc의 K439에서 돌연변이된 Fc-GDF15 융합 단백질, 예를 들어 M3(서열번호 68의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체) 및 M15(서열번호 80의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체); 및 GDF15의 상이한 아미노산 부위에 돌연변이를 추가로 포함하는 Fc-GDF15 융합 단백질, 예컨대 M20(서열번호 85의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M23(서열번호 88의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M24(서열번호 89의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체) 및 M35(서열번호 100의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)는 투여 후 제14일에 마우스에서 여전히 감소하는 경향을 나타냈고, monoFc-GDF15 융합 단백질의 효과보다 체중 감량이 유의하게 컸다.
30일 동안 단일 용량으로 처리된 정상 마우스의 식품 섭취량 및 체중의 결과는 표 10, 도 4 및 도 5에 제시된다.
[표 10]
정상 마우스의 체중 및 식품 섭취량에 대한 단일-용량 처리의 효과(30일 동안 모니터링됨)
주석: 모든 데이터는 군 당 7 내지 8마리 동물의 평균 ± SEM으로 제시된다. **-p<0.01, ***-p<0.001, 대 비히클; ##-p<0.01, ###-p<0.001, 대 MonoFc-GDF15, 통계적 분석 방법: T-검정.
결과는 정상 마우스에서 1 nmol/kg의 용량의 Fc-GDF15 융합 단백질의 단일 투여가 마우스의 체중을 유의하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 특히, 단량체 Fc를 함유하는 GDF15 융합 단백질 MonoFc-GDF15는 더욱 약한 체중-감소 효과를 갖고, 마우스는 제14일에 초기 체중으로 회복되었다. 그러나, 놀랍게도, 위치 K439에 Fc의 상이한 아미노산 돌연변이를 함유하는 Fc-GDF15 구축물, 예를 들어 M3(서열번호 68의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M6(서열번호 71의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M7(서열번호 72의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M16(서열번호 81의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체) 및 M51(서열번호 117의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)은 유의하게 더 강한 체중-감소 효과를 갖고, 최대 28일까지 마우스의 체중을 지속적으로 감소시킬 수 있고, 이는 유의하게 연장된 약물 효과 유지 시간을 시사한다.
56일 동안 단일 용량에 의해 처리된 정상 마우스의 식품 섭취량 및 체중의 결과를 표 11, 도 6 및 도 7에 제시된다.
[표 11]
정상 마우스의 체중 및 식품 섭취량에 대한 단일-용량 처리의 효과(56일 동안 모니터링됨)
주석: 모든 데이터는 군 당 8마리 동물의 평균 ± SEM으로 제시된다. ***-p<0.001, 대 비히클; 통계적 분석 방법: T-검정.
결과는, 1 nmol/kg의 M9(서열번호 74의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M18(서열번호 83의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M22(서열번호 87의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체) 또는 M35(서열번호 100의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)의 단일-용량 처리가 정상 마우스에서 식품 섭취를 억제하고 체중을 상당히 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 마우스의 체중은 반등 전 약 21일까지 계속 감소하고, 약 56일에 기준선으로 돌아왔고, 이는 Fc K439 또는 E356에서 돌연변이된 Fc-GDF15 융합 단백질, 예컨대 M9 및 M18, 및 GDF15의 상이한 아미노산 부위에 돌연변이를 추가로 함유하는 융합 단백질, 예컨대 M22 및 M35가 모두 효능의 매우 긴 지속시간을 가짐을 나타낸다. 단일-용량의 투여 후 약 1개월 동안 체중 저하 효능이 유지될 수 있다. 동시에, 본 발명자들은 놀랍게도, 구축물 M35가 시험관내 활성을 유의하게 감소시켰음에도 불구하고, 다른 구축물과 유사한 생체내 효능을 여전히 유지함을 발견하였다.
실시예 8
식이-유발 비만(DIO) 마우스에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 반복-용량 투여의 생체내 효능
본 실시예는 DIO 마우스에서 식욕 억제, 체중 감소 및 다양한 대사 지표의 개선에 대한 Fc-GDF15 융합 단백질의 반복-용량 투여의 효과를 시험한다. 고지방 식이로 4개월 동안 유도한 후, C57BL/6 마우스를 체중에 따라 무작위로 분류한 후, 비히클(PBS, 2주 1회), 상이한 Fc-GDF15 융합 단백질(1 nmol/kg, 2주 1회) 또는 세마글루타이드(3 nmol/kg, 1일 1회)를 49일 동안 피하 투여한다. 실험 동안 마우스의 체중과 식품 섭취량의 변화를 연속적으로 모니터링하였다. 초기 투여 후 제45일에 복강내 내당능 시험(IPGTT)을 수행하였고, 제49일에 마우스를 희생시켜 지방 함량 및 다양한 혈청 생화학적 파라미터를 분석하였다.
마우스의 체중 변화 및 식품 섭취량의 결과는 표 12에 제시되고, 체중 변화 곡선은 도 8에 제시되고; IPGTT 데이터는 도 9에 제시되고; 내당능 곡선하 면적, 지방 지수, 혈청 총 콜레스테롤(TC), 트라이글리세라이드(TG), 알라닌 트랜스아미나제(ALT), 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 및 저밀도 지단백질(LDL)의 파라미터는 표 13에 제시된다.
[표 12]
DIO 마우스의 체중 및 식품 섭취량에 대한 Fc-GDF15 구축물의 반복 투여의 효과(42일)
주석: 모든 데이터는 각각의 군에서 9마리 동물의 평균 ± SEM으로 표시된다.
[표 13]
DIO 마우스에서 내당능, 지방 지수, 혈청 TC, TG, ALT, AST 및 LDL에 대한 Fc-GDF15 구축물의 반복 투여의 효과
주석: 모든 데이터는 군 당 7 내지 9마리 동물의 평균 ± SEM으로 표시되고; *-p<0.05, **-p<0.01, ***-p<0.001, ns-비히클과 비교하여 유의한 차이 없음; 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's.
결과는, 2주마다 1 nmol/kg의 용량의 Fc-GDF15 융합 단백질 M4(서열번호 69의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M5(서열번호 70의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체) 또는 M9(서열번호 74의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)의 투여가 마우스의 체중을 정상 수준에 도달시킬 수 있는 3 nmol/kg 세마글루타이드 매일 투여에 필적하는 효능으로 DIO 마우스의 식품 섭취를 억제하고 체중을 유의하게 감소시킬 수 있고; M4 및 M5가 또한 DIO 마우스의 내당능 수치를 유의하게 개선할 수 있고; M4, M5 및 M9가 총 콜레스테롤, 트라이글리세라이드 및 저밀도 지단백질을 비롯한 지방 함량과 혈중 지질을 유의하게 감소시킬 수 있고; M4, M5 및 M9가 또한 ALT 및 AST 수준을 유의하게 감소시키는 것과 같이 간 기능을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 Fc-GDF15 구축물이 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 지방간/지방간염의 치료에 적용될 수 있음이 제시된다.
다른 실험에서, DIO 마우스에서 식욕 억제, 체중 감소 및 다양한 대사 파라미터 개선에 대한 상이한 용량의 구축물 M39의 반복-용량 투여 효과를 시험하였다. DIO 마우스를 무작위로 군(군 당 10 내지 12마리 마우스)으로 나누고, 비히클(PBS, 주 1회), 상이한 용량의 M39(0.03 nmol/kg, 0.1 nmol/kg 및 1 nmol/kg, 2주 1회) 또는 세마글루타이드(3 nmol/kg, 매일 1회)를 피하 투여하였다. 마우스의 체중과 식품 섭취량의 변화를 연속적으로 모니터링하였다. 초기 투여 후 제46일에 공복 혈당 및 내당능을 측정하였고, 제49일에 마우스를 희생시키고, 지방 함량 및 다양한 혈청 생화학적 지표를 분석하였다.
처리 종료 시 마우스의 체중 변화는 표 14에 제시되고, 체중 변화 곡선, 공복 혈당 수치, IPGTT(제46일) 및 곡선하 면적, 지방 지수 및 트랜스아미나제 수치는 각각 도 10 내지 15에 도시된다.
[표 14]
DIO 마우스의 체중 감량에 대한 상이한 용량의 M39의 반복 투여의 효과(48일)
주석: 모든 데이터는 군 당 10 내지 12마리 동물의 평균 ± SEM으로 제시되고; ***-p<0.001 대 비히클, #-p<0.05 대 세마글루타이드; 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's.
상기 결과는, 주 1회 또는 2주 1회의 M39의 피하 주사가 DIO 마우스의 체중을 용량-의존적 방식으로 감소시킬 수 있고, 주 1회 1 nmol/kg의 체중 감량 효과가 3 nmol/kg 세마글루타이드 매일 투여보다 유의하게 더 강함을 나타낸다. 동시에, M39는 또는 마우스의 지방 함량을 유의하게 감소시키고, 마우스의 공복 혈당 수치, 내당능 및 간 기능 바이오마커를 개선할 수 있다.
실시예 9
ob/ob 비만 마우스 모델에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 생체내 효능
본 실시예는 ob/ob 비만 마우스 모델에서 식욕 억제, 체중 감소 및 다양한 대사 지표 개선에 대한 구축물 M6 및 M39의 효과를 시험한다. 순응(acclimation) 후, 6 내지 7주령의 ob/ob 마우스(GemPharmatech)를 체중에 따라 군으로 무작위로 나누고, 비히클(PBS), 상이한 용량의 M6 또는 M39(0.1 nmol/kg, 제0일 및 제24일에 투약; 1 nmol/kg, 10 nmol/kg, 제0일 및 제36일에 투약) 또는 세마글루타이드(3 nmol/kg, 1일 1회)를 피하 투여하였다. 마우스의 체중과 식품 섭취량의 변화를 연속적으로 모니터링하였다. 제52일에 마우스를 희생시키고, 다양한 혈청 생화학적 지표 및 간 병리학을 분석하였다.
처리 종료 시 마우스의 체중 변화는 표 15에 제시되고, 체중 변화 곡선, 누적 식품 섭취량, 간 지수, 트랜스아미나제 수치 및 간 병리학 결과는 각각 도 16 내지 21에 도시된다.
[표 15]
ob/ob 마우스의 체중 개선에 대한 M6 및 M39의 상이한 용량의 효과(52일)
주석: 모든 데이터는 군 당 8마리 동물의 평균 ± SEM으로 제시되고; ***-p<0.001 대 비히클, ###-p<0.001 대 세마글루타이드; 통계적 분석 방법: 일원 ANOVA, 이어서 Dunnett's.
상기 결과는 본 발명에 의해 고안된 Fc-GDF15 구축물이 약물 효능의 매우 긴 지속시간을 가짐을 나타낸다. 저용량으로 제0일 및 제24일에 1회, 및 중간 및 고용량으로 제0일 및 제36일에 1회 투여된 M6 및 M39는 ob/ob 마우스의 식품 섭취량을 유의하게 감소시킬 수 있다. 체중의 개선은 매일 투여된 세마글루타이드에 비해 유의하게 더 강하였고, 또한 ob/ob 마우스에서 간 기능 및 간 지방증을 유의하게 개선할 수 있고, 효과도 세마글루타이드보다 유의하게 양호하였다.
실시예 10
마우스에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 약동학
본 실시예는 마우스에서 구축물 M38(서열번호 103의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M3(서열번호 68의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체), M15(서열번호 80의 서열을 갖는 단량체에 의한 동종이량체)의 약동학적 성능을 시험하였다. 상기 융합 단백질을 10 mM PBS로 0.05 mg/mL로 희석한 후, C57BL/6 마우스에 0.25 mg/kg의 용량으로 투여군 당 3마리씩 피하 주사하였다. 각각 투여 전, 및 투여 후 2시간, 7시간, 24시간, 48시간, 96시간, 168시간, 356시간, 504시간 및 672시간에 각각의 동물로부터 혈액을 수집하고, 혈장 Fc-GDF15 농도를 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 구체적으로, 마우스 항-인간 GDF15 단일클론 항체(Sino Biological Inc.)를 사용하여 플레이트를 코팅하고, 마우스 항-인간 IgG4 Fc-HRP를 사용하여 표적 단백질을 검출한 후, 약동학 데이터를 계산하였다. 결과는 표 16에 제시된다.
[표 16]
마우스에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 약동학 파라미터
주석: AUCINF_obs는 투여 시점부터 이론적 외삽 무한대까지의 곡선하 면적을 나타내고; Cmax는 검출된 최고 혈장 농도를 나타내고; T1/2는 반감기를 나타내고; Tmax는 최고 혈장 농도에 도달하는 시간을 나타낸다.
결과는 단량체 Fc를 함유하는 융합 단백질 M38이 마우스에서 58시간의 반감기를 가짐을 나타내고; 놀랍게도, 마우스에서 Fc 변이체를 갖는 Fc-GDF15 융합 단백질 M15 및 M3의 반감기는 마우스에서 통상적인 Fc 융합 단백질의 반감기보다 훨씬 더 긴 244시간 및 306시간에 도달한 것으로 밝혀졌다.
실시예 11
시노몰구스 원숭이에서 Fc-GDF15 융합 단백질의 약동학
본 실시예는 시노몰구스 원숭이에서 구축물 M39의 약동학 파라미터를 시험하였다. M39를 각각의 성별의 3마리 동물에 각각 1 mg/kg 및 2 mg/kg의 용량으로 시노몰구스 원숭이에게 피하 투여하였다. 투여 전, 및 투여 후 0.5시간, 2시간, 6시간, 48시간, 168시간, 356시간, 504시간 및 672시간에 각각의 동물로부터 혈액을 수집하고, 샌드위치 ELISA에 의해 혈장 Fc-GDF15 농도를 측정하였다. 구체적으로, 마우스 항-인간 GDF15 단일클론 항체(Sino Biological Inc.)를 사용하여 플레이트를 코팅하고, 마우스 항-인간 IgG4 Fc-HRP를 사용하여 표적 단백질을 검출한 후, 약동학 데이터를 계산하였다. 결과는 표 17에 제시된다.
[표 17]
시노몰구스 원숭이에서 구축물 M39의 약동학 파라미터
본 발명자들은 놀랍게도 구축물 M39가 또한, 시노몰구스 원숭이에서 약 100시간의 통상적인 비-항체 Fc 융합 단백질의 반감기보다 훨씬 더 긴, 시노몰구스 원숭이에서 200 내지 300시간에 달하는 매우 긴 반감기를 나타냄을 발견하였다.
상기 설명은 본 발명의 바람직한 실시양태에 불과하고, 본 발명의 보호범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 의해 개시된 기술적 범위 내에서 당업자가 용이하게 생각해낼 수 있는 모든 변경 또는 치환은 본 발명의 보호범위에 포함되어야 한다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 청구범위의 보호범위를 기준으로 하여야 한다.

Claims (22)

  1. GDF15 활성 도메인 및 Fc 변이체를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 Fc 변이체의 C-말단이 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 상기 GDF15 활성 도메인의 N-말단에 연결되고; 상기 Fc 변이체가 EU 넘버링(numbering)에 따른 IgG Fc의 위치 356 및/또는 위치 439에서 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    Fc 변이체가 동종이량체(homodimer)를 형성하는 능력을 갖는, 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Fc 변이체가 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 356에서 아스파르트산(D), 글루탐산(E) 및 시스테인(C) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하고/하거나; Fc 변이체가 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 439에서 아르기닌(R), 히스티딘(H), 리신(K) 및 시스테인(C) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하고;
    바람직하게는, Fc 변이체가 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 356에서 글리신(G), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 발린(V), 아스파라긴(N), 류신(L), 이소류신(I), 글루타민(Q), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 프롤린(P), 메티오닌(M), 리신(K) 및 아르기닌(R) 중 하나에 의한 아미노산 치환을 포함하고/하거나; Fc 변이체가 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 439에서 글리신(G), 세린(S), 알라닌(A), 트레오닌(T), 발린(V), 아스파르트산(D), 아스파라긴(N), 류신(L), 이소류신(I), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 프롤린(P) 및 메티오닌(M) 중 하나에 의한 아미노산 치환을 포함하고;
    더욱 바람직하게는, Fc 변이체가 E356R, E356Q, E356A 및 E356N 중 하나의 돌연변이 및/또는 K439D, K439E, K439Q, K439A 및 K439N 중 하나의 돌연변이를 포함하는,
    융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 변이체가 K439D, K439E, K439Q, K439A 및 K439N 중 하나의 돌연변이를 포함하고;
    바람직하게는, Fc 변이체가 K439D, K439E 및 K439Q 중 하나의 돌연변이를 포함하는,
    융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 변이체가 E356R, E356Q, E356A 및 E356N 중 하나의 돌연변이를 포함하고;
    바람직하게는, Fc 변이체가 E356R 돌연변이를 포함하는,
    융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 변이체가 EU 넘버링에 따른 IgG Fc의 위치 234 및 위치 235에서 알라닌(AA)에 의한 아미노산 치환 및/또는 IgG Fc의 위치 447에서의 아미노산 결실의 돌연변이를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 변이체가 서열번호 1 내지 22, 서열번호 27 및 서열번호 29 내지 45의 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    GDF15 활성 도메인이 전장(full-length) 성숙한 GDF15 단백질, N-말단 절두(truncation)된 GDF15 단백질, 또는 GDF15의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 변이체인, 융합 단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    GDF15 활성 도메인이,
    서열번호 46; 및
    서열번호 46의 N-말단에서의 1 내지 14개의 아미노산 절두 및/또는 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환
    의 군 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    GDF15 활성 도메인이,
    서열번호 46; 및
    서열번호 46의 N-말단에서의 1 내지 14개의 아미노산 절두 및/또는 서열번호 46에서의 1 내지 3개의 아미노산 치환
    의 군 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    서열번호 46에서의 아미노산 치환의 위치가 위치 5, 위치 6, 위치 21, 위치 26, 위치 30, 위치 47, 위치 54, 위치 55, 위치 57, 위치 67, 위치 69, 위치 81, 위치 94 및 위치 107의 군 중 1, 2 또는 3개로부터 선택되고;
    바람직하게는, 서열번호 46에서의 아미노산 치환이 D5E, H6D, H6E, R21Q, R21H, D26E, A30S, A47D, A54S, A55E, M57T, R67Q, K69R, A81S, T94E 및 K107Q의 상이한 위치 중 1개, 임의의 2개 또는 임의의 3개로부터 선택되는,
    융합 단백질.
  12. 제10항에 있어서,
    서열번호 46의 N-말단이 3, 4 또는 14개의 아미노산만큼 절두되는, 융합 단백질.
  13. 제10항에 있어서,
    GDF15 활성 도메인이 서열번호 46 내지 66의 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    GDF15 활성 도메인이 서열번호 46 내지 66의 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, GDF15 활성 도메인이 서열번호 46 내지 66의 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는,
    융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102 및 서열번호 105 내지 118의 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서,
    서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102 및 서열번호 105 내지 118의 군 중 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 군 중 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 서열번호 67 내지 78, 서열번호 80 내지 102 및 서열번호 105 내지 118의 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는
    융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 동종이량체 융합 단백질.
  18. (i) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    (ii) (i)의 핵산을 포함하는 벡터; 및
    (iii) (i)의 핵산 및/또는 (ii)의 벡터를 함유하는 숙주 세포
    중 어느 하나인 생물학적 물질.
  19. 제17항에 따른 동종이량체 융합 단백질을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 동종이량체 융합 단백질이 치료 효과량으로 약학 조성물에 존재하고;
    바람직하게는, 상기 약학 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는,
    약학 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제17항에 따른 동종이량체 융합 단백질, 또는 제19항에 따른 약학 조성물의,
    (iv) 대사 질환; 바람직하게는, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염 또는 비알코올성 지방간 질환을 포함하는 대사 질환의 치료용 약제의 제조; 및
    (v) 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 포도당 수치의 감소용 약제의 제조
    중 어느 하나에서의 용도.
  21. 치료 효과량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제17항에 따른 동종이량체 융합 단백질, 또는 제19항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는,
    (iv) 대사 질환; 바람직하게는, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염 또는 비알코올성 지방간 질환을 포함하는 대사 질환의 치료; 및
    (v) 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 포도당 수치의 감소
    중 어느 하나의 방법.
  22. 대상에서
    (iv) 대사 질환; 바람직하게는, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신장병, 비알코올성 지방간염 또는 비알코올성 지방간 질환을 포함하는 대사 질환의 치료; 및
    (v) 대상의 식품 섭취량, 체중, 인슐린 수치, 트라이글리세라이드 수치, 콜레스테롤 수치 또는 포도당 수치의 감소
    중 어느 하나에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제17항에 따른 동종이량체 융합 단백질, 또는 제19항에 따른 약학 조성물.
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