KR102217254B1 - 대사 장애를 치료하기 위한 이중 기능 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 투여받는 대상체에서의 대사 프로파일을 개선시키는 것으로 공지된 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 및 다른 대사 조절제 (그의 변이체 포함)를 포함하는 신규한 단백질의 확인에 관한 것이다. 대사 상태를 비롯한 FGF21-연관 장애, GLP-1-연관 장애 및 엑센딘-4-연관 장애를 치료하는 방법을 또한 개시한다.

Description

대사 장애를 치료하기 위한 이중 기능 단백질{DUAL FUNCTION PROTEINS FOR TREATING METABOLIC DISORDERS}

본 발명은 투여받는 대상체에서의 대사 프로파일을 개선시키는 것으로 공지된 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 및 다른 대사 조절제를 포함하는 신규한 단백질에 관한 것이다.

섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리는 22개의 유전적으로 구별되는 상동 리간드를 특징으로 하고, 이들은 7개의 서브패밀리로 나누어진다. FGF-21은 FGF-19 및 FGF-23과 가장 밀접하게 관련되고, 이들과 함께 서브패밀리를 형성한다. 이 FGF 서브패밀리는 전형적 FGF에 대해 통상적이지 않은 다양한 생리학적 과정, 즉 에너지 및 담즙산 항상성, 글루코스 및 지질 대사, 및 포스페이트 뿐만 아니라 비타민 D 항상성을 조절한다. 또한, 다른 FGF와 달리, 이 서브패밀리는 내분비 방식으로 작용한다 (문헌 [(Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)(Beenken et al. (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8, 235)]).

FGF21은 28개 아미노산 리더 서열 (서열 132)을 함유하는 209개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 FGF21은 마우스 FGF21에 대해 약 79% 아미노산 동일성을, 래트 FGF21에 대해 약 80% 아미노산 동일성을 갖는다. 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)은 허혈성 혈관 질환, 상처 치유, 및 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손실과 연관된 질환을 위한 치료로서 기재된 바 있다 (문헌 [Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206]; 특허 공개공보 WO01/36640; 및 특허 공개공보 WO01/18172). FGF-21은 FGF 수용체, 및 FRS2a 및 ERK를 비롯한 하류 신호전달 분자를 활성화시키지만, FGFR과 FGF-21의 직접 상호작용은 검출되지 않았다. 연구는 FGF-21에 대한 세포 반응의 결정자 및 FGFR을 통한 FGF-21 신호전달을 매개하는 보조인자로서, 간, 지방세포 및 췌장에서 고도로 발현되는 β-클로토(β-klotho)를 확인한 바 있다 (문헌 [Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95]). FGF21은 FGFR1(IIIc), FGFR2(IIIc) 및 FGFR3(IIIc) β-클로토 신호전달 복합체의 강력한 효능제이다.

FGF-21은 인슐린-비의존성 글루코스 흡수를 유도하는 것으로 나타났다. FGF-21은 또한 다양한 당뇨병 설치류 모델에서 고혈당증을 개선하는 것으로 나타났다. 또한, FGF-21을 과다발현하는 트랜스제닉 마우스는 식이-유발 대사 이상에 저항성인 것으로 밝혀졌고, 감소된 체중 및 지방량, 인슐린 감수성의 증진이 입증되었다 (문헌 [Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37]). 당뇨병 비-인간 영장류에 대한 FGF-21의 투여는 공복 혈장 글루코스, 트리글리세리드, 인슐린 및 글루카곤 수준의 감소를 야기하였고, 거의 80%의 HDL 콜레스테롤 증가를 비롯하여 지단백질 프로파일의 유의한 개선을 유도하였다 (문헌 [Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81]). FGF21 작용의 분자 메카니즘을 조사한 최근 연구는 공복 상태에 대한 적응의 조절을 돕는 중요한 내분비 호르몬으로서의 FGF21을 확인한 바 있다 (문헌 [(Badman et al. (2009) Endocrinology 150, 4931)(Inagaki et al. (2007) Cell Metabolism 5, 415)]). 이것은, 에너지 항상성의 생물학을 조절하는데 있어 간이 신체의 나머지 부분과 소통하게 하는, PPARα 하류의 이전에 상실된 연결 고리를 제공한다 (문헌 [(Galman et al. (2008) Cell Metabolism 8, 169)(Lundasen et al. (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 360, 437)]).

FGF21은 PPARγ 발현을 억제하고 미토콘드리아 기능을 증가시키는 AMPK/SIRT1/PGC1α 경로의 활성화를 통해 지방세포 항상성을 조절한다 (문헌 [Chau et al. (2010) PNAS 107, 12553]). FGF21은 또한 배양된 인간 근관 및 단리된 마우스 조직에서 측정된 바와 같이 골격근에 의한 글루코스 흡수를 증가시킨다 (문헌 [Mashili et al. (2011) Diabetes Metab Res Rev 27, 286-97]). 설치류 도세포의 FGF21 처리는 ERK1/2 및 Akt 경로의 활성화를 통해 개선된 기능 및 생존을 유도한다 (문헌 [Wente et al. (2006) Diabetes 55, 2470]). FGF21 처리는 또한, 아마도 HNF4α 및 Foxa2 신호전달을 통해, 설치류 간에서의 지질생성 및 지방산 산화 효소에 대한 변경된 유전자 발현을 유발한다. 그러나, 최근 연구 (문헌 [Wei et al. (2012) PNAS 109, 3143-48])는 식이-유발 비만 마우스의 FGF21로의 처리가 (감소된 SUMO화를 통한) PPARγ의 감소된 불활성화에 기인하여, 골 손실을 유도하고; FGF21 처리 후 골에서의 증가된 PPARγ 활성의 존재 하에 골모세포에서 지방세포로의 중간엽 줄기 세포 분화의 변화가 나타남을 보여준다.

FGF-21을 생물치료제로서 직접 사용하는 것과 연관된 문제점은 그의 반감기가 매우 짧다는 것이다 (문헌 [Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635]). 마우스에서, 인간 FGF21의 반감기는 0.5 내지 1시간이고, 시노몰구스 원숭이에서, 반감기는 2 내지 3시간이다. FGF21은 다용도 멸균 제약 제제로서 이용될 수도 있다. 그러나, 보존제, 예를 들어 m-크레졸은 이들 조건 하에서 그의 안정성에 대해 부작용을 갖는 것으로 결정된 바 있다.

이미 임상에서 나타난 또 다른 강력한 대사 조절제는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1)이다 (문헌 [Knudsen et al. (2004) Journal of Medicinal Chemistry 47, 4128]). GLP-1은 알파 및 베타 세포 둘 다에 작용하여 글루코스-의존성 방식으로 인슐린 분비를 자극하고 글루카곤 방출을 억제하는, 포유동물 소화관의 L-세포에 의해 분비되는 36개 아미노산 인크레틴이다 (문헌 [Hare et al. (2010) Diabetes 59, 1765; Meier et al. (2005) Diabetes-Metabolism Research and Reviews 21, 91]). GLP-1은 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)의 클래스 II 패밀리의 7-막횡단 나선 단백질인 GLP-1 수용체 (GLP-1R)에 결합하여 이를 활성화시킨다 (문헌 [Mayo et al. (2003) Pharmacological Reviews 55:167]). GLP-1 수용체 효능제로서, GLP-1은 말초 조직에서의 글루코스 흡수를 증가시키기 위해 췌장으로부터의 인슐린 분비를 자극하고 글루카곤 분비를 억제하여, 감소된 간 글루코스 방출을 유발함으로써 식후 혈액 글루코스 수준을 감소시키는데 중요한 역할을 갖는다.

임상적으로 중요한 제2 GLP-1 수용체 효능제는 엑센딘-4이다. 엑센딘-4는 길라 몬스터(Gila Monster) 도마뱀의 타액선에서 생성된 39개 잔기 폴리펩티드이다 (문헌 [Goke et al. (1993) Diabetes 46:433-439; Fehmann et al. (1995) Endocrine Rev. 16:390-410]). 엑센딘-4는 독특한 비-포유동물 유전자의 생성물이고 타액선에서만 발현되는 것으로 여겨지지만, 이는 GLP-1과 52% 아미노산 서열 상동성을 공유하고, 포유동물에서 GLP-1 수용체와 상호작용한다 (문헌 [Goke, et al.; Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682]). 시험관내에서, 엑센딘-4는 인슐린 생성 세포에 의한 인슐린 분비를 촉진하는 것으로 나타났고, 등몰량으로 주어진 경우에, 인슐린 생성 세포로부터 인슐린 방출을 유도하는데 있어서 GLP-1보다 강력하다. 또한, 엑센딘-4는 설치류 및 인간 둘 다에서 인슐린 방출을 강력하게 자극하여 혈장 글루코스 수준을 감소시키고, GLP-1보다 오래 작용하지만; 엑센딘-4는 포유동물에서 자연적으로 발생하지 않기 때문에, 이는 GLP-1이 결핍된 포유동물에서 특정한 잠재적 항원 특성을 갖는다.

인간에서 글루코스 조절을 개선하는 GLP-1 및 엑센딘-4 유사체 (예를 들어, 리라글루티드(Liraglutide) 및 바이에타(Byetta))의 능력은 임상에서 확립된 바 있다 (문헌 [Idris (2010) Diabetes Obesity & Metabolism 12, 89; Monami et al (2009) European Journal of Endocrinology 160, 909]). GLP-1은 또한 유도된 증식 및 아폽토시스의 억제 둘 다를 통해 베타 세포 질량을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Egan, A et al (2003) Diabetes-Metabolism Research and Reviews 19, 115; Farilla, L. et al. (2003) Endocrinology 144, 5149; Xu, G. et al. (1999) Diabetes 48, 2270]). 이것은 또한 식욕을 감소시키는 포만감 신호를 제공하면서 위에서의 산 분비 및 위 배출을 억제하는 장 호르몬으로서 작용한다 (문헌 [Vilsboll et al. (2009) Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 23, 453]). 이들 효과는 제2형 당뇨병 환자에 대한 GLP-1 유사체의 투여에 의해 관찰된 유익한 체중 감소를 설명할 것으로 여겨진다. GLP-1은 또한 허혈후 설치류 심장에서 심장보호작용을 하는 것으로 나타났다 (문헌 [Ossum et al. (2009) Pharmacological Research 60, 411; Sonne, D.P. et al. (2008) Regulatory Peptides 146, 243; Nikolaidis, L. A. et al. (2004) Circulation 109, 962]).

추가로, GLP-1은 PPARγ의 발현을 감소시킴으로써 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 지방세포로의 분화를 감소시킬 수 있고, GLP-1은 hMSC의 세포 증식 및 세포보호작용을 촉진한다 (문헌 [Sanz et al. (2010) Am J Physiol Endocrinol Metab 298, E634-E643]).

제1형 및 제2형 당뇨병 및 다른 대사 상태의 치료에서 치료제로서 사용하기 위한 FGF21 단백질 (그의 변이체 또는 유사체 포함)의 개발 시에는, 반감기 및 안정성의 증가가 바람직할 것이다. 증진된 반감기 및 안정성을 갖는 FGF21 단백질은 환자에게 보다 적은 빈도의 단백질 투여를 허용할 것이다. 명백하게, 치료 단백질 FGF21을 위한 안정한 수성 단백질 제제를 개발할 필요성이 존재한다.

또한, 단백질 제약, 예컨대 대사 조절제 FGF21, GLP-1 “G 엑센딘-4의 개발에서의 유의한 문제는 그의 물리적 및 화학적 불안정성을 극복하는 것이다. 단백질의 조성 다양성 및 특징은 구체적 거동, 예컨대 폴딩, 입체형태적 안정성, 및 언폴딩/변성을 규정한다. 이러한 특징은 수성 단백질 용액을 이용하는 제약 제제 개발의 과정에서 단백질 안정화를 목표로 하는 경우에 다루어져야 한다 (문헌 [Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)]). 관심있는 치료 단백질, 예를 들어 본 발명의 단백질을 안정화시키는 것의 바람직한 효과는, 단백질분해 및 효소적 분해에 대한 저항성을 증가시킴으로써 단백질 안정성을 개선하고 단백질 응집을 감소시키는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 및 다른 대사 조절제, 예를 들어 GLP-1 및 엑센딘-4를 포함하고, 제약 제제 조건 하에 구성성분 작용제보다 개선된 제약 특성을 갖는, 예를 들어 더 안정하고, 투여받는 대상체에 대한 대사 파라미터를 개선시키는 능력을 보유하고, 단백질분해 및 효소적 분해에 덜 민감하고, 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적고, 면역원성일 가능성이 적은 신규한 단백질, 예를 들어 융합 단백질의 확인에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제 활성 둘 다를 보유하고; FGF21의 말단절단 및 변이를 포함하며, 예를 들어 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 엑센딘-4, 또는 다른 대사 조절제 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 추가로 포함한다.

FGF21-연관 및 GLP-1 연관 장애, 뿐만 아니라 다른 대사, 내분비 및 심혈관 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증 및 다른 대사 장애를 치료하는 방법, 및 중환자의 사망률 및 이환율을 감소시키는 방법이 또한 개시된다.

본 발명의 단백질은 단독으로 또는 경구 항당뇨병제와 조합하여 규칙적으로 (예를 들어 매일, 보다 바람직하게는 매주, 격주 또는 매월) 투여되는 주사가능한 형태로 사용될 수 있으며, 이는 제1형 및 제2형 당뇨병 환자의 혈당 조절, 체중 및 지질 프로파일을 개선시킬 것이다. 단백질은 또한 비만 또는 다른 FGF21- 또는 GLP-1-연관 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질, 예를 들어 본 발명의 GLP-1-FGF21 변이체 및 엑센딘-4-FGF21 변이체 융합 단백질은 제약 제제 조건 하에서 야생형 FGF21보다 더 안정하고, 단백질분해 및 효소적 분해에 덜 민감하고, 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적고, 면역원성일 가능성이 적기 때문에, 예를 들어 야생형 FGF21의 투여를 포함하는 단백질 치료제와 연관된 물리적 불안정성의 유의한 난관을 극복한다.

제1 측면에서, 본 발명은 표 1에 열거되고 본원에 추가로 기재된 서열 중 하나 이상을 포함하는 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 단백질, 예를 들어 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 단백질은 야생형, 말단절단된 버전 또는 돌연변이된 버전에 상관없이 GLP-1 및/또는 엑센딘-4 단백질, 또는 그의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 표 1에 열거된 FGF21 서열은 야생형 FGF21 서열, 예를 들어 NCBI 참조 번호 NP_061986.1을 갖고, 예를 들어 키론 코퍼레이션(Chiron Corporation)에 양도된 US 6,716,626B1과 같은 허여된 특허에서 찾을 수 있는 야생형 FGF21 서열의 변이체이다. 표 1에 열거된 GLP-1 및 엑센딘-4 서열은 야생형 GLP-1 및 엑센딘-4 서열, 예를 들어 각각 NCBI 참조 번호 NP_002045 및 AAB22006.1을 갖고, 예를 들어 각각 일라이 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Co.) 및 제너럴 호스피털 코퍼레이션(General Hospital Corp.)에 양도된 WO98/19698 및 WO87/06941A (GLP-1), 및 아밀린(Amylin)에 양도된 US 5,424,286 (엑센딘-4)과 같은 특허 공보에서 찾을 수 있는 서열의 변이체이다.

다른 실시양태는 본 발명의 이중 기능 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 보유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 단백질을 생성하는데 사용되는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 이러한 방법은, 예를 들어 야생형 FGF21 단백질 내 관심 위치에서의 아미노산의 부위-특이적 혼입을 통한 야생형 FGF21 단백질의 변형, 뿐만 아니라 다른 대사 조절제, 예컨대 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 엑센딘-4, 또는 GLP-1 및/또는 엑센딘-4로 변형된 중합체와의 접합체와 분자의 FGF21 부분 사이에서의 융합을 포함한다. 상기 변형 및 융합은 단백질의 야생형 버전 (예를 들어 FGF21, GLP-1 및 엑센딘-4)에 비해 본 발명의 단백질의 생물학적 특성을 증진시키고, 뿐만 아니라 일부 경우에는, 예를 들어 표지 및 단백질 반감기 연장제를 위한 부착지점으로서 작용하고, 고체 지지체의 표면에 상기 변이체를 부착하기 위해 작용한다. 본 발명의 관련 실시양태는 상기 본 발명의 단백질의 생산, 및 상기 변이체 및 융합체를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터의 생산이 가능한 세포의 생산 방법이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 길이가 8-12개 아미노산 잔기만큼 작은 단편을 비롯한 FGF21, 엑센딘-4 및/또는 GLP-1 서열의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩티드는 포유동물에서 혈액 글루코스를 저하시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은, 예를 들어 그의 야생형 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입, 부가 또는 치환을 갖는, FGF21, 엑센딘-4 및/또는 GLP-1 서열의 하나 이상의 변이체를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4에 비해 부위-특이적 아미노산 변형이 이루어진 위치에서든지 또는 이들 단백질의 야생형 버전과 공유하는 아미노산의 위치에서든지 하나 이상의 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리시알산에 공유적으로 연결될 수 있다. PEG 기는 본 발명의 융합 단백질, 예를 들어 GLP-1 단백질 변이체 또는 FGF21 단백질 변이체의 구성성분 부분의 생물학적 기능을 증진시키고/거나, 저해하지 않도록 부착된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의로 링커, 예컨대 GS, GGGGSGGGGSGGGGS (서열 8) 또는 SGGGGSGGG (서열 128)를 통해 이종 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 이종 아미노산 서열은 IgG 불변 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어 Fc 영역), 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 알부민-결합 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 개시된 이러한 융합 단백질은 또한 다량체를 형성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 이종 아미노산 서열 (예를 들어 HSA, Fc 등)은 본 발명의 단백질의 아미노-말단에 융합된다. 다른 실시양태에서, 융합 이종 아미노산 서열 (예를 들어 HSA, Fc 등)은 본 발명의 단백질의 카르복실-말단에 융합된다. 또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 이종 아미노산 서열 (예를 들어 HSA, Fc 등)은 본 발명의 이중 기능 단백질의 중간, 즉 GLP-1 또는 엑센딘-4 서열의 C-말단 잔기와 FGF21 서열의 N-말단 잔기 사이에 위치한다. 상기 바람직한 실시양태는, 예를 들어 최대 GLP-1 (엑센딘-4) 활성을 위해 유리 N-말단을, 최대 FGF21 활성을 위해 무손상 유리 C-말단을 남겨둔다.

일부 실시양태에서, GLP-1 수용체 효능제는 항체의 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 융합되고, FGF21은 동시에 동일한 항체의 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 융합된다 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 퓨조바디(fusobody)). 상기 바람직한 실시양태는 최대 GLP-1 (엑센딘-4) 활성을 위해 유리 N-말단을, 최대 FGF21 활성을 위해 무손상 유리 C-말단을 남겨둔다. 바람직한 실시양태는 PCT 공개공보 WO2011/076781에 기재된 항체 서열을 이용한다.

일부 실시양태에서, GLP-1 또는 엑센딘-4 펩티드는 FGF21에 화학적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 FGF21 아미노산 잔기 측쇄에 부착된다. 다른 실시양태에서, 상기 펩티드는 천연 화학적 라이게이션 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 통해 FGF21의 N-말단에 부착된다. 바람직한 실시양태는 최대 활성을 위해 GLP-1 (엑센딘-4)의 유리 N-말단을, 최대 활성을 위해 FGF21의 무손상 유리 C-말단을 남겨둔다.

일부 실시양태에서, GLP-1 또는 엑센딘-4 펩티드는 결국 FGF21 단백질 변이체에 부착되는 중합체 분자에 공유적으로 부착된다. 바람직한 실시양태에서, GLP-1 또는 엑센딘-4 펩티드는, 동시에 FGF21 단백질 변이체에 부착되는 PEG 중합체에 부착된다. 상기 바람직한 실시양태는 최대 GLP-1 (엑센딘-4) 활성을 위해 유리 N-말단을, 최대 FGF21 활성을 위해 무손상 유리 C-말단을 남겨둔다. 본 발명의 일부 실시양태에서, GLP-1 수용체 효능제 펩티드는, PEG 링커 또는 동시에 반감기 연장 뿐만 아니라 2개의 수용체 효능제에 대한 공유 연결을 제공하는 다른 중합체 링커를 통해 FGF21 변이체에 연결된다.

또 다른 실시양태는 하나 이상의 FGF21-연관 장애 또는 GLP-1-연관 장애, 예컨대 비만, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증 및 다른 대사 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 하나 이상의 본 발명의 단백질 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애를 나타내는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 본 발명의 이중 기능 단백질 및 제약상 허용되는 제제화 작용제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 대사 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 그를 필요로 하는 인간 환자에게 본 발명의 제약 조성물의 투여하는 것을 포함한다. 치료할 수 있는 대사 장애의 비제한적 예는 제1형 및 제2형 당뇨병 및 비만을 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 상세한 설명에서 설명될 것이다.

도 1a 및 1b는 다양한 N-말단 돌연변이를 갖는 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질, 및 엑센딘-4-FGF21-PEG 융합 단백질의 활성을 나타낸다. 도 1a는 DPP-4 프로테아제에 의한 프로세싱을 늦추기 위해 추가된 돌연변이를 나타낸다 (GLP-1 펩티드 (원형), 또는 야생형 (V231; 개방된 사각형), G0 (V251; 개방된 원형), A8G (V258; 개방된 삼각형), A8S (V232; 삼각형) 또는 E9P (V271; 사각형) GLP-1을 갖는 이중 기능 단백질). 도 1b는 엑센딘-4 융합체 (GLP-1 펩티드 (사각형), 또는 엑센딘-4 1-39 (V234; 삼각형), 1-30 (V267; 원형) 또는 1-30/E16G/E17Q (V268; 개방된 삼각형)을 갖는 이중 기능 단백질)를 나타낸다.
도 2는 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질의 약동학적 특성 (PK)을 나타낸다 (FGF21-PEG (V294; 개방된 사각형), GLP-1(A8S)-PEG (V253; 개방된 원형), 또는 야생형 GLP-1 (V237; 원형) 또는 GLP-1(A8S) (V235; 삼각형) GLP-1을 갖는 이중 기능 단백질). 0.25 mg/kg으로 주입된 야생형 비-PEG화 FGF21의 PK를 비교용으로 나타낸다 (사각형).
도 3a-3c는 경구 글루코스 내성 검사 (OGTT)를 이용하여 반감기 연장된 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질의 효능을 측정한 결과를 나타낸다. 8주령 C57BL/6J 마우스 (n=5)에 1 mg/kg 화합물 또는 비히클 (채워진 백색 막대; 삼각형)을 복강내 (i.p.) 주사에 의해 투여하였다. 혈액 글루코스를 투여 후 1시간 및 24시간 째에 측정하여 GLP-1의 급성 효과를 평가하였는데, 이는 1시간 째에는 야생형 GLP-1 (V239; 해시형 막대; 사각형) 및 GLP-1(A8S) 버전 (V232; 흑색 막대; 원형)에 대해 유사하였고, 24시간 째에는 GLP-1(A8S) 버전에서 약간 나은 정도로 유지되었다. 제3일 밤, 투여 후 72시간 째에 1.5 g/kg 경구 글루코스로 시험접종하기 전에 마우스를 공복상태로 만들었다. A8S 버전을 투여한 마우스는, 야생형 GLP-1 버전을 투여한 마우스에 비해 유의하게 개선된 혈액 글루코스의 조절을 나타냈으며, 이는 A8S 돌연변이가 활성 GLP-1의 장기간 수준을 증가시켰음을 시사한다.
도 4는 ob/ob 마우스에서의 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질의 효능을 나타낸다. 10주령 수컷 ob/ob 마우스 (n=8)에 제시된 화합물을 2주 동안 매주 2회 복강내 투여하였다. FGF21-PEG (V238; 사선 해시형 막대; 사각형) 및 GLP-1-FGF21(R154C)-PEG (V239; 수평선 해시형 막대; 개방된 사각형)의 동등한 투여는 비히클-처리 군 (원형)과 비교할 때 혈액 글루코스 수준, 체중 및 간 건강에서 매우 유사한 개선을 나타냈다 (혈청 ALT 수준 및 간 중량에 의해 측정 시). DPP-4-저항성 융합체, 0.2 mg/kg GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235; 수직선 해시형 막대; 개방된 삼각형)는 다른 화합물과 유사한 효능을 나타냈지만, 1 mg/kg GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235; 흑색 막대; 삼각형)의 동등 투여는 혈액 글루코스, 체중, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 간 중량의 추가 저하를 제공하였다.
도 5a-5g는 ob/ob 마우스에서의 FGF21(R154C)-PEG + GLP-1(A8S)-PEG의 공-투여 (수직선 해시형 막대; 개방된 원형), FGF21(R154C)-PEG의 단일 투여 (V238; 0.2 mg/kg (밝은색 사선 해시형 막대); 1 mg/kg (어두운색 사선 해시형 막대; 사각형)), 및 GLP-1(A8S)-PEG의 단일 투여 (V253; 0.2 mg/kg (밝은색 수평선 해시형 막대); 1 mg/kg (어두운색 수평선 해시형 막대; 개방된 사각형))에 대한 GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235; 흑색 막대; 개방된 삼각형) 융합 단백질의 비교를 나타낸다. 9주령 수컷 ob/ob 마우스 (n=8)에 제시된 화합물 또는 비히클 (채워진 백색 막대; 원형)을 4주 동안 매주 2회 복강내 투여하였다. 융합체는 FGF21(R154C)-PEG + GLP-1(A8S)-PEG의 공-투여와 비교하여 유의하게 개선된 효능을 나타냈다. FGF21(R154C)-PEG 및 GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG에 의해서는 단지 중간정도의 중량 감소가 관찰되었으나, 다른 군은 단지 부분적으로 식품 섭취의 차이에 기인하여 상당량의 중량이 증가하였다.
도 6a-6f는 FGF21(R154C)-PEG (V235; 어두운색 막대)를 FGF21(V76)-PEG (V272; 밝은색 막대)와 비교함으로써 ob/ob 마우스에서의 GLP-1(A8S)-FGF21-PEG 융합 단백질의 효능을 나타낸다. 9주령 ob/ob 마우스 (n=8)에 제시된 화합물 또는 비히클 (채워진 백색 막대)을 2주 동안 매주 2회 복강내 투여하였다. GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG 및 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG 융합체 둘 다는 0.05 내지 0.2 mg/kg (0.05 사선 해시형 막대; 0.1 수평선 해시형 막대; 0.2 수직선 해시형 막대)에서 글루코스 조절 및 체중에 대한 용량 반응을 나타냈다. 0.2 mg/kg에서, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG는 GLP-1(A8S)-FGF21FGF21(R154C)-PEG보다 특히 글루코스 수준, 체중, 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤을 저하시키는데 효과적이었다. 도 6a-6c는 각각 기초 글루코스 (AUC), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 혈청 총 콜레스테롤의 수준을 나타낸다. 도 6d-6f는 각각 D12 체중, 간 지질 및 혈청 트리글리세리드의 수준을 나타낸다.
도 7a-7b는 개별 작용제의 조합물과 비교하여, 췌장 기능을 개선시키고 섬 인슐린 함량을 증가시키는 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG 융합 단백질의 능력을 나타낸다. db/db 마우스에 4주 동안 1주 2회, 개별 GLP-1(A8S)-PEG + FGF21(V76)-PEG의 조합물 (V76+V253; 수직선 해시형 막대), 뿐만 아니라 본 발명의 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG 이중 기능 융합 단백질 (V272; 사선 해시형 막대; 밝은색은 0.5 mg/kg이고 어두운색은 1 mg/kg임) 또는 비히클 (백색 막대)을 투여하였다.
도 8a-8b는 개별 작용제의 조합물과 비교하여, 글루코스 저하 및 체중을 개선시키는 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질의 능력을 나타낸다. db/db 마우스에 2주 동안 1주 2회, 비히클 (백색 막대; 개방된 원형), 개별 GLP-1(A8S)-PEG의 조합물 (V253; 3 mg/kg (밝은색 수평선 해시형 막대; 개방된 다이아몬드형) 및 5 mg/kg (어두운색 수평선 막대; 다이아몬드형)) 및 FGF21(V76)-PEG (3 mg/kg (V76; 밝은색 사선 해시형 막대; 개방된 사각형) 및 5 mg/kg (어두운색 사선 해시형 막대; 사각형)), 뿐만 아니라 본 발명의 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG 이중 기능 융합 단백질 (V272; 0.2 mg/kg (작은 격자형 막대; 개방된 삼각형); 1 mg/kg (큰 격자형 막대; 삼각형))을 투여하였다. 도면으로 알 수 있는 바와 같이, 0.2 mg/kg의 GLP-1(7-35; A8S)-FGF21(V76)-PEG 이중 기능 융합 단백질 (V272)은 5 mg/kg의 FGF21(V76)-PEG만큼 효과적이다. 또한 도면으로 알 수 있는 바와 같이, 1.0 mg/kg의 GLP-1(7-35; A8S)-FGF21(V76)-PEG 이중 기능 융합 단백질 (V272)은 FGF21(V76)-PEG + GLP-1(7-35; A8S)-PEG (1 + 1 mg/kg (밝은색 수평선 해시형 막대; 엑스표) 및 3 + 3 mg/kg (어두운색 수평선 막대; 별표))의 최대로 효과적인 조합 용량보다 종점의 혈당 및 체중 둘 다에 대해 더 효과적이다.
도 9는 FGF21 활성에 대한 검정의 결과를 나타낸다. 제시된 화합물에 의한 HEK293-베타-클로토 세포의 처리 후에 ERK의 인산화를 측정한다. GLP-1(A8S)-V76-PEG (V272)의 활성은 등몰 엑세나티드의 존재 또는 부재 하의 동일한 FGF21 변이체 FGF21(V76)-PEG에 비해 신호의 크기에서 유의하게 더 높다.
도 10은 대응하는 단일 효능제 단백질 또는 펩티드와 비교한 융합 단백질 활성을 측정하는데 사용된 수용체 약리 검정의 결과를 나타낸다. GLP-1R 및 FGFR1c/베타-클로토 (10a 및 10b) 또는 GLP-1R 단독 (10c 및 10d)으로 형질감염시킨 HEK293 세포를 1시간 동안 화합물로 처리한 후에 GLP-1R로의 베타-아레스틴 동원에 대해 검정하였다. 검정에서 시험된 분자는 엑센딘-4 (사각형), GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272; 원형), GLP-1(A8S)-PEG (V253; 삼각형), V253+FGF21(V76)-PEG (개방된 다이아몬드형), 엑센딘-4(1-39)-Fc-FGF21(V103) (V211; 개방된 원형), 엑센딘-4(1-39)-Fc (V201; 개방된 삼각형) 및 V201+FGF21(V101) (다이아몬드형)이었다.

본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 바와 같은 전장 야생형 FGF21 폴리펩티드의 변형된 버전을 나타낸다. FGF21 야생형 서열은, 예를 들어 FGF21 야생형 서열과 단백질 변이체 간의 비교가 필요한 경우, 참조 서열 (서열 1)로서 작용할 것이다. FGF21 야생형 서열은 NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1을 갖고, 예를 들어 키론 코퍼레이션에 양도된 US 6,716,626B1과 같은 허여된 특허에서 찾을 수 있다 (서열 1).

전장 FGF21 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 mRNA 서열 (NCBI 참조 서열 번호 NM_019113.2)은 하기에 나타낸다 (서열 2).

성숙 FGF21 서열은 리더 서열이 결여되고, 또한 폴리펩티드의 다른 변형, 예컨대 (리더 서열이 있거나 없는) 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단의 단백질분해 프로세싱, 보다 큰 전구체로부터의 보다 작은 폴리펩티드 절단, N-연결된 및/또는 O-연결된 글리코실화, 및 당업자에게 이해되는 다른 번역후 변형을 포함할 수 있다. 성숙 FGF21 서열의 대표적인 예는 하기 서열 (서열 3, 전장 FGF21 단백질 서열 (NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1)의 아미노산 위치 29-209를 나타냄)을 갖는다.

성숙 FGF21 폴리펩티드 (서열 3)를 코딩하는 상응하는 cDNA 서열은 하기에 나타낸다 (서열 4).

본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 바와 같은 전장 야생형 GLP-1 폴리펩티드의 변형된 버전을 나타낸다. GLP-1 야생형 서열은, 예를 들어 GLP-1 야생형 서열과 단백질 변이체 간의 비교가 필요한 경우, 참조 서열 (서열 5)로서 작용할 것이다.

GLP-1 야생형 서열은 번역후 변형되고, 그렇지 않으면 프리프로글루카곤 야생형 서열로부터 유도된다. 프리프로글루카곤 서열 (서열 5)은 NCBI 참조 서열 번호 NP_002045를 갖고, 예를 들어 각각 일라이 릴리 앤드 컴퍼니 및 제너럴 호스피털 코퍼레이션에 양도된 WO98/19698 및 WO87/06941A와 같은 특허 공개공보에서 찾을 수 있다. 예를 들어 문헌 [Goke, et al. (1991) European Journal of Clinical Investigation 21, 135]에 기재된 바와 같이, GLP-1은 프리프로글루카곤으로부터 유도된 37량체이다 (GLP-1은 프리프로글루카곤의 잔기 92-138로 구성되고, 하기 서열 5에 밑줄 그어져 있음). GLP-1은 6개의 N-말단 잔기의 절단에 의해, 활성 31량체로 추가 프로세싱된다.

프로세싱된 야생형 GLP-1 서열의 예는 하기와 같다 (서열 129).

활성 GLP-1 서열의 예는 하기와 같다 (서열 30).

프리프로글루카곤 GLP-1 야생형 서열 (서열 5)을 코딩하는 상응하는 mRNA 서열은 하기에 나타낸다 (서열 6).

본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 바와 같은 전장 야생형 엑센딘-4 폴리펩티드의 변형된 버전을 나타낸다. 엑센딘-4 야생형 서열은, 예를 들어 엑센딘-4 야생형 서열과 단백질 변이체 간의 비교가 필요한 경우, 참조 서열 (서열 7)로서 작용할 것이다.

엑센딘-4 야생형 서열은 NCBI 참조 서열 번호 진뱅크(GenBank): AAB22006.1을 갖고, 예를 들어 아밀린 파마슈티칼즈, 인크. 및 일라이 릴리 앤드 컴퍼니에 양도된 US 5,424,286과 같은 허여된 특허에서 찾을 수 있다. 야생형 서열의 예는 하기와 같다 (서열 7).

본 발명의 단백질은 본원에 열거된 야생형 단백질의 단백질 변이체 또는 돌연변이체, 예를 들어 FGF21 변이체, GLP-1 변이체 및/또는 엑센딘-4 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 변이체", "인간 변이체", "폴리펩티드 또는 단백질 변이체", "변이체", "돌연변이체", 뿐만 아니라 그의 임의의 유사 용어 또는 특정 버전 (예를 들어 "FGF21 단백질 변이체", "인간 GLP-1 변이체", "엑센딘-4 폴리펩티드 또는 단백질 변이체", "변이체", "FGF21 돌연변이체" 등)은 자연 발생 (즉, 야생형) 단백질 또는 폴리펩티드 대응부 또는 상응하는 천연 서열의 변형, 말단절단, 다른 변이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 정의한다. "변이체 FGF21" 또는 "FGF21 돌연변이체"는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 야생형 (즉, 자연 발생) FGF21 단백질에 상대하여 기재된다.

본 발명의 대표적인 이중 기능 단백질 서열은 표 1에 열거된다. 상기 효능제의 기재는 개별 구성성분 효능제, 및 적용가능한 경우 링커를 포함한다. 변이체가 구성성분 효능제로서 사용되는 경우, 이루어진 변화 또는 치환은 그의 야생형 대응부분과 비교하여 번호가 매겨진다. 예로서, "이중 기능 1-단백질" (서열 9)은 본원에 기재된 바와 같은 야생형 GLP-1 서열의 잔기 7-35 (즉, GLP-1 수용체 효능제), 링커 서열, 및 본원에 기재된 바와 같은 FGF21 야생형 서열 (서열 1)에 대한 다수의 열거된 변화를 갖는 FGF21 변이체 (즉, FGF21 수용체 효능제)를 함유한다.

표 1. 본 발명의 이중 기능 단백질 및 뉴클레오티드
"긴 명칭" 열에 개시된 링커들은 하기와 같이 지정된다:
GSGGGGSGGG (서열 174), SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG 및 S(GGGGS)₃GGGG (서열 175), GGGGSGGG (서열 176), S(GGGGS)₃A (서열 138), (GGGGS)₃ (서열 8), SGGGGSGGG (서열 177), GSGGGGC (서열 178), GSGGGGCGGG (서열 179), GGS(GGGGS)₃ (서열 180), (GGGGS) (서열 173), (GGGGS)3GGGG (서열 181).

본 발명의 단백질에서 사용되는 변이체 또는 돌연변이체, 예를 들어 야생형 FGF21, GLP-1 및/또는 엑센딘-4의 변이체는 야생형 단백질에 비해 하나 이상의 치환된, 부가된 및/또는 제거된 아미노산을 특징으로 한다. 추가로, 변이체는 야생형 단백질에 비해 N- 및/또는 C-말단의 말단절단을 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 변이체는 야생형 단백질의 일부 변형된 구조적 또는 기능적 특성을 보유한다. 예를 들어 변이체는 농축 용액에서의 증진되거나 또는 개선된 물리적 안정성 (예를 들어 보다 적은 소수성 매개 응집), 혈장과 함께 인큐베이션하는 경우의 증진되거나 또는 개선된 혈장 안정성, 또는 면역원성에 대한 감소된 위험, 또는 유리한 생물활성 프로파일을 유지하면서 증진되거나 또는 개선된 생물활성을 가질 수 있다.

본 발명의 단백질의 부분과 그의 야생형 비교 단백질 사이의 차이를 구성하는 허용되는 아미노산 치환 및 변형은 피롤리신, 피롤린-카르복시-리신 (Pcl) 및 비-자연 발생 아미노산 유사체에 의한 치환을 비롯한 하나 이상의 아미노산 치환, 및 말단절단을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 단백질 (예를 들어 본 발명의 융합 단백질)은, 본원에 기재된 바와 같은 부위-지정 돌연변이체, 말단절단된 폴리펩티드, 단백질분해-저항성 돌연변이체, 응집-감소 돌연변이체, 조합 돌연변이체, 및 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

단백질 발현 분야의 당업자는 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현을 위해, 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 임의의 본 발명의 단백질의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려될 수 있음을 인식할 것이다.

단백질 발현 분야의 당업자는 임의의 숙주 세포에서의 발현을 위해, 발현 수준, 정제 또는 안정화 조절을 위한 추가의 태그 또는 융합 도메인이 상기 태그 또는 융합 도메인의 추후 제거를 위한 특정 프로테아제에 의한 소화를 표적화하는 추가의 펩티드와 함께 또는 이것 없이 임의의 본 발명의 단백질의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려될 수 있음을 인식할 것이다.

단백질 발현 분야의 당업자는 이. 콜라이 또는 다른 박테리아 숙주에서의 발현을 위해, 발현된 단백질을 주변세포질 또는 세포외 공간으로 표적화하는 리더 펩티드가 임의의 본 발명의 단백질의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려될 수 있음을 인식할 것이다.

단백질 발현 분야의 당업자는 진핵 숙주 세포에서의 발현을 위해, 발현된 단백질을 ER, 분비 소포 또는 세포외 공간으로 표적화하는 리더 펩티드가 임의의 본 발명의 단백질의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려될 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 단백질은 제약 보존제 (예를 들어 m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)와의 증가된 상용성을 보유할 수 있고, 따라서 저장 동안 단백질의 생리화학적 특성 및 생물학적 활성을 유지하는 보존된 제약 제제의 제조를 가능하게 한다. 따라서, 야생형에 비해 증진된 제약 안정성을 갖는 변이체는 생물학적 효력을 유지하면서, 생리학적 및 보존된 제약 제제 조건 둘 다 하에서 농축 용액에서의 개선된 물리적 안정성을 갖는다. 비제한적 예로서, 본 발명의 단백질은 그의 야생형 대응부 또는 상응하는 천연 서열보다 단백질분해 및 효소적 분해에 대해 저항성일 수 있고; 개선된 안정성을 가질 수 있고; 응집 가능성이 적을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 이들 용어는 상호 배타적이거나 제한적이지 않으며, 주어진 변이체가 야생형 단백질의 하나 이상의 변형된 특성을 갖는 것이 전적으로 가능하다.

본 발명은 또한, 예를 들어 서열 3의 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 FGF21 아미노산 서열을 포함하지만, FGF21 단백질 변이체에 바람직한 특성, 예를 들어 FGF21-수용체에 대한 개선된 효력, 단백질분해-저항성, 증가된 반감기 또는 응집-감소 특성 및 그의 조합을 부여하는 특정 잔기는 추가로 변형되지 않은 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 즉, 단백질분해-저항성, 응집-감소, 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열 내의 잔기를 제외하고, FGF21 돌연변이체 서열 내의 약 5% (대안적으로 4%, 대안적으로 3%, 대안적으로 2%, 대안적으로 1%)의 다른 모든 아미노산 잔기는 변형될 수 있다. 이러한 FGF21 돌연변이체는 하나 이상의 야생형 FGF21 폴리펩티드의 활성을 보유한다.

이와 유사하게, 본 발명은 또한, 아미노산 서열이 서열 30 및 7의 아미노산 서열 각각과 약 85% 이상 동일하고, 더 바람직하게는 약 90 내지 95% 이상 동일하지만, 이중 기능 단백질 변이체에 바람직한 특성, 예를 들어 단백질분해-저항성, 증가된 반감기 또는 응집-감소 특성 및 그의 조합을 부여하는 특정 잔기는 추가로 변형되지 않은 분자의 GLP-1 및 엑센딘-4 부분을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 또한, 서열 2, 서열 4, 서열 6의 뉴클레오티드 서열과 약 85% 이상 동일하고, 더 바람직하게는 약 90 내지 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 야생형 엑센딘-4를 코딩하지만, 코딩된 단백질의 단백질분해-저항성, 응집-감소 또는 다른 특성을 부여하는 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드는 추가로 변형되지 않은 cDNA 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 즉, 단백질 분해-저항성, 응집-감소 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 돌연변이체 서열 내의 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드를 제외하고, 돌연변이체 서열 내의 약 15%, 더 바람직하게는 약 10 내지 5％의 다른 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 하나 이상의 그의 야생형 대응부의 활성을 보유하는 단백질을 코딩한다.

본 발명의 단백질을 생성하는데 사용되는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 이러한 방법은 야생형 버전의 단백질 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 FGF21 야생형 단백질)의 부위-특이적 변형 및 비-부위-특이적 변형, 예를 들어 야생형 단백질의 말단절단, 및 야생형 단백질 내 관심 위치에서의 아미노산의 부위-특이적 혼입을 포함한다. 상기 변형은 야생형 단백질에 비해 본 발명의 단백질의 생물학적 특성을 증진시키고, 뿐만 아니라 일부 경우에는, 예를 들어 표지 및 단백질 반감기 연장제를 위한 부착 지점으로서 작용하고, 고체 지지체의 표면에 상기 변이체를 부착하기 위해 작용한다. 본 발명의 관련 실시양태는 상기 본 발명의 이중 기능 단백질의 생산, 및 상기 변이체를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터의 생산이 가능한 세포의 생산 방법이다.

특정 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은, 예를 들어 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 반감기를 연장하거나 또는 달리 생물학적 특성을 개선시키기 위해, 접합체, 예를 들어 PEG 기를 상기 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하는데 사용된다. 상기 기술은 본원에 추가로 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은 본 발명의 단백질의 반감기를 연장하는 다른 중합체, 소분자 및 재조합 단백질 서열을 부착하는데 사용된다. 한 이러한 실시양태는 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대한 지방산 또는 특정 알부민 결합 화합물의 부착을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변형은 특정한 아미노산 유형에서 이루어지고, 단백질 상 하나 이상의 부위에 부착될 수 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은 야생형 및/또는 변이 다량체, 예를 들어 이량체 (동종이량체 또는 이종이량체) 또는 삼량체 또는 사량체의 생성을 위한 부착 수단으로서 사용된다. 이들 다량체 단백질 분자는 아미노-말단에서 또는 카르복시-말단에서 다른 단백질, 예컨대 Fc, 인간 혈청 알부민 (HSA) 등에 부착되거나 융합된 PEG, 당 및/또는 PEG-콜레스테롤 접합체와 같은 기를 추가로 가질 수 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 부위-특이적으로 혼입된 피롤리신, 피롤린-카르복시-리신, 또는 피롤리신 유사체 또는 비-자연 발생 아미노산 (파라-아세틸-Phe, 파라-아지도-Phe)의 위치가 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 고체 지지체 표면 상에 대한 제어된 배향 및 부착을 허용하는 것인 상기 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 생산하는데 사용되거나 또는 PEG, 당 및/또는 PEG-콜레스테롤 접합체와 같은 기가 부착되도록 하는데 사용된다.

다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 부위-특이적으로 가교결합시켜 이종이량체 및 이종삼량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 헤테로-올리고머를 형성하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 부위-특이적으로 가교결합시켜 단백질-단백질 접합체, 단백질-폴리펩티드 접합체, 단백질-펩티드 접합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 접합체, 폴리펩티드-펩티드 접합체 또는 펩티드-펩티드 접합체를 형성하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 부위 특이적 변형은 하나 초과의 분자의 유형이 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 단일 부위에 부착되는 것을 허용하는 분지화 지점을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 열거된 변형은 비-부위-특이적 방식으로 이루어져, 본 발명의 단백질-단백질 접합체, 단백질-폴리펩티드 접합체, 단백질-펩티드 접합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 접합체, 폴리펩티드-펩티드 접합체 또는 펩티드-펩티드 접합체를 형성할 수 있다.

정의

다양한 정의가 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 대부분의 단어는 당업자에 의해 그 단어에 부여된 의미를 갖는다. 하기 또는 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의된 단어는 전체로서 본 발명의 문맥에서 제공되고 당업자에 의해 전형적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "FGF21"은 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 단백질 패밀리의 구성원을 의미한다. FGF21의 아미노산 서열 (진뱅크 등록 번호 NP_061986.1)은 서열 1로서 제시되고, 이의 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 2 (NCBI 참조 서열 번호 NM_019113.2)로서 제시된다. "FGF21 변이체", "FGF21 돌연변이체" 및 유사한 용어는, 예를 들어 결실되거나, 부가되거나, 변형되거나, 또는 치환된 구성성분 아미노산 잔기를 갖는, FGF21 단백질의 변형된 버전을 설명한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "FGF21 수용체"는 FGF21에 대한 수용체를 의미한다 (문헌 [Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,Het al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Yet al. (2007) PNAS 104:7432-7437]).

용어 "FGF21 폴리펩티드"는 인간에서 발현되는 자연 발생 폴리펩티드를 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "FGF21 폴리펩티드"는 임의의 전장 FGF21 폴리펩티드, 예를 들어 209개의 아미노산 잔기로 이루어지고 서열 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 1; 181개의 아미노산 잔기로 이루어지고 전장 FGF21 폴리펩티드의 아미노-말단 단부의 28개 아미노산 (즉, 신호 펩티드를 구성하는 것)은 제거된 임의의 성숙 형태의 폴리펩티드를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 76" 또는 "V76"은, Cys154를 통해 연결된 40 kDa 분지형 PEG 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이를 특징으로 하는, 예를 들어, P199G 돌연변이를 갖는 V76인 서열 185 또는 서열 186인, FGF21 단백질 변이체이다. 변이체의 합성은 본원에 더 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 101" 또는 "V101"은, 조작된 디술피드 가교 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이를 특징으로 하는, 예를 들어, 서열 187인, GS 링커를 갖는 인간 IgG1 Fc-도메인에 대한 융합체로서 발현되는, FGF21 단백질 변이체이다.　 변이체의 합성은 본원에 더 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 103" 또는 "V103"은, 조작된 디술피드 가교 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이를 특징으로 하는, 예를 들어, 서열 188인, GS 링커를 갖는 인간 IgG1 Fc-도메인에 대한 융합체로서 발현되는 FGF21 단백질 변이체이다.　 변이체의 합성은 본원에 더 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 188" 또는 "V188"은, 조작된 디술피드 가교 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이를 특징으로 하고, (SGGGG)₃ 링커 (서열 182)를 갖는 인간 IgG1 Fc-도메인에 대한 융합체로서 발현되는 FGF21 단백질 변이체이다.　 변이체의 합성은 본원에 더 상세하게 기재되어 있다.

"GLP-1-FGF21-PEG 이중 효능제", "이중 기능 단백질", "이중 기능 융합 단백질", "이중 활성 단백질", "융합 생성물", "이중 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제", "본 발명의 이중 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제 단백질", "GLP-1-FGF21 융합 단백질", "본 발명의 융합 단백질", "본 발명의 융합체", 및 유사한 용어는 적어도 GLP-1 또는 엑센딘-4와 같은 또 다른 대사 조절제에 융합되거나 연결된 FGF21 폴리펩티드 또는 단백질 변이체, 돌연변이체 또는 말단절단된 버전을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 융합체를 정의한다.　 이들은 그들 각각의 구성성분의 수용체에 대한 이중 활성 또는 이중 기능을 갖는 단일 분자를 포함하는데, 즉 이들은 FGF21 수용체 및 GLP-1 수용체에 대해 효능작용하는 능력을 나타낸다.　 상기 융합 단백질의 구성성분 서열은 자연 발생 (즉, 야생형) 단백질 또는 폴리펩티드 대응부의 변형, 말단절단, 다른 변이를 포함할 수 있고, 임의의 수의 다양한 다른 변형, 예를 들어 반감기 연장을 위한 PEG 기를 사용할 수 있다.

본 발명의 GLP-1-FGF21-PEG 융합 단백질의 특히 바람직한 실시양태는 FGF21 변이체로서 V76 (본원에 정의된 바와 같음)을 혼입한다. 상기 바람직한 실시양태는 또한 본원에서 "GLP-1(A8S)-FGF21-PEG"로 지칭되고, 야생형 GLP-1 서열 (서열 5129)에 대한 위치 8에서의 알라닌에서 세린으로의 치환 및 야생형 FGF21 서열 (서열 1)에 대한 위치 154에서의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환을 특징으로 한다. GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG의 서열은 하기와 같다 (서열 9).

용어 "단리된 핵산 분자"는 (1) 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, (2) "단리된 핵산 분자"가 자연에서는 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 연결되지 않거나, (3) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (4) 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩티드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.

용어 "벡터"는 코딩 정보를 숙주 세포에 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 (예를 들어 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 의미하기 위해 사용된다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하고/거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 발현은 전사, 번역, 및 인트론이 존재할 경우의 RNA 스플라이싱과 같은 과정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 플랭킹 서열이 그의 통상적인 기능을 수행하도록 설정되거나 또는 조립된 것인 플랭킹 서열의 배열을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 융합 단백질의 요소들은 융합 단백질이 자연 발생의 내인성 단백질인 것처럼 기능하도록 하기 위해 및/또는 상승작용적 방식으로 상기 융합 단백질의 이질적인 요소들을 결합시키기 위해 서로 작동가능하게 연결될 수 있다.

뉴클레오티드 수준에서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 플링킹 서열은 코딩 서열의 복제, 전사 및/또는 번역에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열은 프로모터가 그 코딩 서열의 전사를 지시할 수 있을 때 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다. 플랭킹 서열은 정확하게 기능하는 한, 코딩 서열에 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들어 비번역되지만 전사되는 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있고 이어서 선택된 관심 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미하기 위해 사용된다. 상기 용어는 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손의 형태 또는 유전적 구성이 본래의 모세포와 동일한지의 여부와는 상관없이 모 세포의 자손을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체 (이들 모두는 그 구조가 D 및 L 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 이러한 입체이성질체 형태임)를 의미한다. 아미노산은 본원에서 그의 명칭, 그의 통상적으로 공지된 3문자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 지칭된다.

용어 "자연 발생"은 생물학적 물질, 예컨대 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 관련하여 사용되는 경우, 자연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않은 물질의 의미한다. 이와 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 "비-자연 발생"은 자연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 의미한다. 뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "자연 발생"은 염기 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T) 및 우라실 (U)을 의미한다. 아미노산과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "자연 발생"은 20개의 통상적인 아미노산 (즉, 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 리신 (K), 류신 (L), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 및 티로신 (Y)), 뿐만 아니라 셀레노시스테인, 피롤리신 (Pyl 또는 O), 및 피롤린-카르복시-리신 (Pcl 또는 Z)을 의미한다.

피롤리신 (Pyl)은 메타노사르시나(Methanosarcina) 과의 메탄생성 고세균의 메틸아민 메틸트랜스퍼라제 내에서 자연적으로 발견되는 아미노산이다. 피롤리신은 각각의 mRNA 내의 인-프레임 UAG 코돈에서 번역과 동시에 혼입되는 리신 유사체이고, 이는 22번째 천연 아미노산으로 간주된다.

적어도 PCT 특허 공개공보 WO2010/48582 (출원인 아이알엠, 엘엘씨(IRM, LLC))에 기재된 바와 같이, 이. 콜라이에서 피롤리신 (Pyl)을 생합성하기 위한 시도는 본원에서 피롤린-카르복시-리신 또는 Pcl로 지칭되는 "탈메틸화 피롤리신"의 형성을 유발하였다. 본원에 사용된 바와 같은 "Pcl"은 Pcl-A 또는 Pcl-B를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"은 동일하든 상이하든 임의의 유기체로부터의 비변형된 또는 변형된 유전자를 사용하여 임의의 유기체에서 생합성적으로 생성될 수 없는 아미노산 구조를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 (야생형) FGF21 단백질 서열 또는 본 발명의 서열에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 의미한다. 이들은 20개의 자연 발생 아미노산, 셀레노시스테인, 피롤리신 (Pyl), 또는 피롤린-카르복시-리신 (Pcl, 예를 들어 PCT 특허 공개공보 WO2010/48582에 기재된 바와 같은 것) 중 하나가 아닌 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 비-천연 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산의 치환에 의해, 및/또는 비-천연 아미노산의 자연 발생 (야생형) FGF21 단백질 서열 또는 본 발명의 서열 내로의 삽입에 의해 도입될 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산 잔기는 목적 관능기, 예를 들어 관능성 모이어티 (예를 들어 PEG)를 연결하는 능력을 FGF21 분자에 부여하도록 혼입될 수 있다. 아미노산과 관련하여 사용되는 경우, 기호 "U"는 본원에 사용된 바와 같은 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"을 의미할 것이다.

또한, 이러한 "비천연 아미노산"은 전형적으로 단백질로의 혼입을 위해 변형된 tRNA 및 변형된 tRNA 신테타제 (RS)를 요구하는 것으로 이해된다. 이들 "선택된" 직교 tRNA/RS 쌍은 슐츠(Schultz) 등에 의해 개발된 선택 방법 또는 무작위 또는 표적화 돌연변이에 의해 생성된다. 예로서, 피롤린-카르복시-리신은 한 유기체로부터 숙주 세포로 이동된 유전자에 의해 생합성적으로 생성된다는 점, 및 천연 tRNA 및 tRNA 신테타제 유전자를 사용하여 단백질에 혼입된다는 점에서 "천연 아미노산"인 반면, p-아미노페닐알라닌 (문헌 [Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9] 참조)은 생합성적으로 생성될지라도, "선택된" (즉, "자연 발생"되지 않는) 직교 tRNA/tRNA 신테타제 쌍에 의해 단백질에 혼입되기 때문에 "비천연 아미노산"이다.

변형된 코딩된 아미노산은 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린, 아제티딘카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노부티르산, 3-아미노부티르산, 2-아미노피멜산, tert-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로프리온산, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프트알라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 펜틸글리신, 피페콜산 및 티오프롤린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "아미노산"은 또한 특정 유기체 내에서의 대사물이지만 단백질 내로의 혼입을 위한 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 자연 발생 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산은 오르니틴, D-오르니틴 및 D-아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 일례로서 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물을 의미한다. 아미노산 유사체는, 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 차단되거나, 또는 그의 C-말단 카르복시기, 그의 N-말단 아미노기 및/또는 그의 측쇄 관능기가 화학적으로 변형된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 유사체는 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폰, S-(카르복시메틸)-시스테인, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폭시드, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폰, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르), N-에틸글리신, 알라닌 카르복스아미드, 호모세린, 노르류신, 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다.

용어 "생물학적 활성 변이체"는 폴리펩티드 변이체에 도입된 변형의 유형이나 수에 상관없이, 그의 야생형 (예를 들어 자연 발생) 단백질 또는 폴리펩티드 대응부의 활성, 예컨대 혈액 글루코스, HbA1c, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 조절하고; 췌장 기능을 증가시키고; 간 내 지질 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 보유하는, 본 발명의 이중 기능 단백질에서 예를 들어 융합체의 구성성분 단백질로서 사용되는 임의의 폴리펩티드 변이체를 의미한다. 그의 야생형 버전에 비해 다소 감소된 수준의 활성을 보유하는 폴리펩티드 변이체도 생물학적 활성 폴리펩티드 변이체로 간주될 수 있다. 본 발명의 생물학적 활성 폴리펩티드 변이체의 대표적인 비제한적 예는, 변형 후에 야생형 FGF21에 비해 유사하거나 증진된 생물학적 특성을 보유하는 FGF21 변이체이다.

용어 "유효량" 및 "치료 유효량"은 각각 야생형 폴리펩티드 또는 단백질 대응부의 하나 이상의 생물학적 활성, 예컨대 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키거나; 간 트리글리세리드 또는 지질 수준을 감소시키거나; 체중을 감소시키거나; 또는 글루코스 내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력의 관찰가능한 수준을 지지하기 위해 사용되는 본 발명의 융합 단백질의 양을 의미한다. 예를 들어 FGF21-연관 장애 또는 GLP-1-연관 장애 (예컨대 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만 또는 대사 증후군)를 나타내거나, 이를 앓고 있거나, 또는 앓기 쉬운 환자에게 투여되는 "치료 유효량"은 상기 언급된 장애와 연관된 병리학적 증상, 질환 진행, 생리학적 상태, 또는 상기 장애에 굴복하는 것에 대한 저항성에서의 개선을 유도하거나 향상시키거나 또는 달리 유발하는 양이다. 본 발명의 목적을 위해, "대상체" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이지만, 동물, 보다 구체적으로 반려 동물 (예를 들어 개, 고양이 등), 가축 (예를 들어 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물 (예를 들어 래트, 마우스, 기니 피그 등)일 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 담체" 또는 "생리학상 허용되는 담체"는 본 발명의 융합 단백질의 전달을 달성하거나 증진시키기에 적합한 하나 이상의 제제화 물질을 의미한다.

용어 "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있고, 추가로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.

용어 "천연 Fc"는 단량체 또는 다량체 형태에 상관없이 전체 항체의 소화로부터 또는 다른 수단에 의해 생성된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 의미하고, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 천연 Fc의 본래의 이뮤노글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원의 것이고, 임의의 이뮤노글로불린일 수 있지만, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 천연 Fc 분자는 공유 (즉, 디술피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 이루어진다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 부류 (예를 들어 IgG, IgA 및 IgE) 또는 하위부류 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4 범위이다. 천연 Fc의 하나의 예는 IgG의 파파인 소화로부터 생성되는 디술피드-결합 이량체이다 (문헌 [Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다.

용어 "Fc 변이체"는 천연 Fc로부터 변형되지만 여전히 샐비지(salvage) 수용체인 FcRn (신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 포함하는 분자 또는 서열을 의미한다. 국제 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 96/32478에 예시적인 Fc 변이체, 뿐만 아니라 샐비지 수용체와의 상호작용이 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 천연 Fc는 본 발명의 단백질의 융합 분자에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비상용성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시의 N-말단 불균일성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 주거나, 또는 관련된 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되거나, 또는 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함한다. Fc 변이체는 하기에 더 상세하게 기재되어 있다.

용어 "Fc 도메인"은 상기 정의된 바와 같은 천연 Fc 및 Fc 변이체 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자에서와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 소화된 것이든 다른 수단에 의해 생성된 것이든 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Fc 도메인은, 예를 들어 Fc 도메인과 FGF21 서열 사이의 공유 결합을 통해 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 (FGF21 또는 FGF21 돌연변이체의 말단절단된 형태 포함)에 융합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 Fc 도메인의 회합을 통해 다량체를 형성할 수 있고, 이들 융합 단백질 및 그의 다량체 둘 다 본 발명의 측면이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "퓨조바디"는 2개의 이종이량체를 포함하고, 각각의 이종이량체가, 예를 들어 하나 이상의 디술피드 결합(들)을 통해 안정적으로 함께 회합된 1개의 아미노산 중쇄 및 1개의 아미노산 경쇄로 이루어진 것인 항체-유사 가용성 단백질을 의미한다. 각각의 중쇄 또는 경쇄는 하기에서 각각 퓨조바디의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 지칭되는 항체의 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 적어도 항체의 C_H1 영역을 포함하고, 힌지 영역을 비롯하여 C_H2 및 C_H3 영역을 추가로 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 항체의 C_L 영역을 포함한다. 퓨조바디에서, 항체의 가변 영역은 이종 가용성 결합 도메인으로 대체된다. 비제한적 예로서, 본 발명의 퓨조바디는 본 발명의 이중 기능 융합 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 GLP-1 수용체 효능제는 항체의 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 융합되고 FGF21은 동시에 동일 항체의 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 융합된다.

용어 "이종"은 이들 도메인이 항체의 불변 영역과 연관되어 자연적으로 발견되지 않음을 의미한다. 특히, 이러한 이종 결합 도메인은 4개의 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 이들 사이의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어진 항체 가변 도메인의 전형적인 구조를 갖지 않는다. 따라서 퓨조바디의 각 아암은 항체의 불변 C_H1 중쇄 영역의 N-말단 부분에서 공유적으로 연결된 제1 결합 도메인을 포함하는 제1 단일 쇄 폴리펩티드, 및 항체의 불변 C_L 경쇄의 N-말단 부분에서 공유적으로 연결된 제2 결합 도메인을 포함하는 제2 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다. 공유 연결은, 예를 들어 펩티드성 결합을 통해 직접적일 수 있거나, 또는 링커, 예를 들어 펩티드성 링커를 통해 간접적일 수 있다. 퓨조바디의 2개의 이종이량체는, 항체 구조와 유사하게, 예를 들어 그의 힌지 영역에서의 1개 이상의 디술피드 가교에 의해 공유적으로 연결된다. 퓨조바디 구조를 갖는 분자의 예, 특히 이종이량체 수용체의 리간드 결합 영역을 포함하는 퓨조바디는 당업계에 기재된 바 있다 (예를 들어 국제 특허 공개공보 WO01/46261 및 WO11/076781 참조).

용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티를 사용한 유도체화가 존재하거나 존재하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 의미한다.

용어 "엑세나티드"는 엑센딘-4의 합성 버전을 나타내고, 바이에타(Byetta) 및 바이듀레온(Bydureon)으로 시판되는 엑세나티드는 제2형 당뇨병의 치료용으로 2005년 4월에 승인받은 글루카곤-유사 펩티드-1 효능제 (GLP-1 효능제) 의약이다. 이는 인크레틴 모방체의 군에 속하고, 아밀린 파마슈티칼스에 의해 제조된다.

엑센딘-4는 길라 몬스터 도마뱀의 타액선에서 생성된 39개 잔기 폴리펩티드이다 (문헌 [Goke et al. (1993) Diabetes 46:433-439; Fehmann et al. (1995) Endocrine Rev. 16:390-410]). 엑센딘-4는 독특한 비-포유동물 유전자의 생성물이고 타액선에서만 발현되는 것으로 여겨지지만, 이는 GLP-1과 52% 아미노산 서열 상동성을 공유하고, 포유동물에서 GLP-1 수용체와 상호작용한다 (문헌 [Goke, et al.; Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682]).

용어 "FGF21-연관 장애", "GLP-1-연관 장애", "엑센딘-4-연관 장애" 및 본원에서 유사하게 사용된 용어는 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증 및 다른 대사 장애를 포함한다.

용어 "인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애" 및 본원에서 유사하게 사용된 용어는 중증 인슐린 저항성을 유도하지만 종종 (그러나 항상은 아님) 제2형 당뇨병에서 흔한 비만을 보이지 않는 인슐린 수용체 (또는 그로부터 직접 하류인 가능한 단백질)에서의 돌연변이로 인해 고통받는 대상체에서의 상태를 설명한다. 여러 면에서, 이들 상태로 인해 고통받는 대상체는 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 하이브리드 증상을 나타낸다. 이로 인해 고통받는 대상체는 유형 A 인슐린 저항성, 유형 C 인슐린 저항성 (AKA HAIR-AN 증후군), 랩손 멘덴홀(Rabson-Mendenhall) 증후군 및 최종적으로 도노휴(Donohue) 증후군 또는 요정증을 포함하는 대략적인 중증도 증가의 몇몇 카테고리로 나뉜다. 이들 장애는 매우 높은 내인성 인슐린 수준과 연관되고, 매우 종종 고혈당증과 연관된다. 이로 인해 고통받는 대상체는 또한 피부의 접힌 부분에서 고안드로겐증, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 다모증 및 흑색 극세포증 (과도한 성장 및 색소침착)을 비롯한 "인슐린 독성"과 연관된 다양한 임상적 특징을 나타낸다.

"HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증"은 체지방의 선택적 감소를 특징으로 하는 지방 조직의 장애이다. 지방이영양증을 앓는 환자는 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 고혈당증, 고트리글리세리드혈증 및 지방간이 발병하는 경향이 있다. 유전성 (유전적) 또는 후천성 지방이영양증의 다수의 형태가 존재한다. 유전적 형태의 지방이영양증은 선천성 전신 지방이영양증 (베라르디넬리-세입(Berardinelli-Seip) 증후군) 및 몇몇 유형의 가족성 부분 지방이영양증 (두니건(Dunnigan) 유형, 코베를링(Kobberling) 유형, 만디불로마크랄(mandibuloacral) 이형성증 유형)을 포함한다. 후천성 형태의 지방이영양증은 후천성 전신 지방이영양증 (로렌스(Lawrence) 증후군), 후천성 부분 지방이영양증 (바라케-시몬스(Barraquer-Simons) 증후군), 및 HIV를 치료하는데 사용되는 프로테아제 억제제 및 뉴클레오시드 역전사효소 억제제에 의해 유도된 지방이영양증을 포함한다.

"제2형 당뇨병"은 인슐린의 이용가능성에도 불구하고 과량의 글루코스 생성을 특징으로 하는 상태이고, 부적절한 글루코스 클리어런스의 결과로서 순환 글루코스 수준이 과도하게 높게 유지된다.

"제1형 당뇨병"은 인슐린의 완전한 결여에 의해 야기되는 높은 혈액 글루코스 수준을 특징으로 하는 상태이다. 이것은 신체의 면역계가 췌장 내의 인슐린-생산 베타 세포를 공격하여 이를 파괴할 때 발생한다. 이에 따라, 췌장은 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 않게 된다.

"글루코스 불내성" 또는 글루코스 내성 장애 (IGT)는 심혈관 병리상태의 증가된 위험과 연관된 이상혈당증의 당뇨병 전증 상태이다. 당뇨병 전증 상태는 대상체에서 글루코스의 세포 내로의 효율적인 이동 및 효율적인 연료 공급원으로서의 이용을 막아, 혈액 내 글루코스 수준의 상승 및 어느 정도의 인슐린 저항성을 야기한다.

"고혈당증"은 혈액 내 과량의 당 (글루코스)으로서 정의된다.

저혈당으로도 불리는 "저혈당증"은 혈액 글루코스 수준이 신체의 활성에 충분한 에너지를 제공하기에는 너무 낮게 떨어졌을 때 발생한다.

"고인슐린혈증"은 정상보다 높은 수준의 혈액 내 인슐린으로서 정의된다.

"인슐린 저항성"은 정상적인 양의 인슐린이 정상 미만의 생물학적 반응을 생성하는 상태로서 정의된다.

"비만"은 인간 대상체에 대해, 주어진 집단의 이상적인 체중보다 20% 초과로 더 높은 체중으로서 정의될 수 있다 (문헌 [R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916]).

"당뇨병성 합병증"은 높은 혈액 글루코스 수준에 의해 야기되는, 다른 신체 기능, 예컨대 신장, 신경 (신경병증), 발 (족부 궤양 및 불량한 순환) 및 눈 (예를 들어 망막병증)의 문제이다. 또한, 당뇨병은 심장 질환 및 골 및 관절 장애의 위험을 증가시킨다. 당뇨병의 다른 장기간 합병증은 피부 문제, 소화 문제, 성 기능장애 및 치아 및 잇몸 문제를 포함한다.

"대사 증후군"은 하기 징후 중 3개 이상의 집합으로서 정의될 수 있다: 복부 지방 - 대부분의 남성에서 40-인치 이상의 허리; 고혈당 - 공복 후 110 밀리그램/데시리터 (mg/dl) 이상; 높은 트리글리세리드 - 혈류에서 150 mg/dL 이상; 낮은 HDL - 40 mg/dl 미만; 및 130/85 mmHg 이상의 혈압.

"췌장염"은 췌장의 염증이다.

"이상지혈증"은 지단백질 과다생산 또는 결핍을 포함하는 지단백질 대사의 장애이다. 이상지혈증은 혈액 내의 총 콜레스테롤, 저-밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도의 상승, 및 고-밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소에 의해 나타낼 수 있다.

"비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)"은 간세포의 지방 변화를 특징으로 하는, 알콜 소비와 연관되지 않은 간 질환이다.

"비알콜성 지방간염 (NASH)"은 간소엽내 염증 및 섬유증이 동반되는 간세포의 지방 변화를 특징으로 하는, 알콜 소비와 연관되지 않은 간 질환이다.

"고혈압" 또는 높은 혈압은 심혈관 손상 또는 다른 유해한 결과를 유도할 가능성이 있는 수준으로의 전신 동맥 혈압의 일시적인 또는 지속적인 상승이다. 고혈압은 140 mmHg 초과의 수축기 혈압 또는 90 mmHg 초과의 확장기 혈압으로서 임의로 정의된 바 있다.

"심혈관 질환"은 심장 또는 혈관에 관한 질환이다.

"급성 심근경색"은 심장의 일부에 대한 혈액 공급의 중단이 있을 때 발생한다. 생성된 허혈 및 산소 부족은, 충분한 기간 동안 치료하지 않고 방치할 경우 심근 조직 (심근)의 손상 또는 사망 (경색증)을 야기할 수 있다.

"말초 동맥 질환"은 플라크가 혈액을 두부, 기관 및 사지로 운반하는 동맥에 축적될 때 발생한다. 시간이 경과함에 따라, 플라크는 경화되어 동맥을 좁게 만들 수 있고, 이는 기관 및 신체의 다른 부분으로의 산소-풍부 혈액의 흐름을 제한한다.

"아테롬성동맥경화증"은 동맥 내강의 협소화를 야기하고 종국적으로 섬유증 및 석회화로 진행되는, 대동맥 및 중간 크기 동맥의 내막에 불규칙적으로 분포하는 지질 침착물을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 통상적으로 국소적이고, 서서히 및 간헐적으로 진행된다. 혈류 제한은 병변의 분포 및 중증도에 따라 상이한 대부분의 임상 징후를 설명한다.

"졸중"은 24시간보다 오래 지속되는 뇌 순환의 장애에 관한 임의의 급성 임상 사건이다. 졸중은 비가역적인 뇌 손상, 순환이 손상된 뇌 조직의 위치 및 범위에 따른 증상의 유형 및 중증도를 포함한다.

울혈성 심부전으로도 불리는 "심부전"은 심장이 충분한 혈액을 더 이상 신체의 나머지 부분으로 펌프질할 수 없는 상태이다.

관상동맥 질환으로도 불리는 "관상동맥 심장 질환"은 심장에 혈액 및 산소를 공급하는 소혈관의 협소화이다.

"신장 질환" 또는 신병증은 임의의 신장 질환이다. 당뇨병성 신병증은 제1형 또는 제2형 당뇨병을 앓는 사람의 이환 및 사망의 주요 원인이다.

"신경병증"은 뇌신경 또는 말초 또는 자율 신경계를 포함하는 임의의 질환이다.

"위마비"는 장의 지연 배출을 야기하는 위 연동운동의 약화이다.

"클릭 화학"은 수율이 높고, 범위가 넓고, 크로마토그래피 없이 제거될 수 있는 부산물만을 생성하고, 입체특이적이고, 수행이 간단하고, 용이하게 제거가능하거나 또는 온화한 용매에서 실행될 수 있는 반응을 설명하기 위해 케이. 비. 샤프리스(K. B. Sharpless)에 의해 2001년에 도입된 용어이다.

본 발명에 의해 포함되는 중환자는 일반적으로 불안정한 대사항진 상태를 경험한다. 이 불안정한 대사 상태는 일부 영양소의 상대적인 결핍을 야기할 수 있는 기질 대사의 변화에 기인한다. 일반적으로 지방 및 근육 둘 다의 증가된 산화가 존재한다.

또한, 중환자는 바람직하게는 전신 염증 반응 증후군 또는 호흡 곤란을 경험하는 환자이다. 이환율의 감소는 중환자에서 추가의 질병, 상태, 또는 증상이 발병할 가능성의 감소 또는 추가의 질병, 상태, 또는 증상의 중증도의 감소를 의미한다. 예를 들어 이환율의 감소는 균혈증 또는 패혈증 또는 다발성 기관 부전과 연관된 합병증의 발생률의 감소에 상응할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 내용상 명백하게 달리 표시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "항체"는 2개 이상의 이러한 항체의 혼합물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 값의 +/- 20%, 보다 바람직하게는 +/- 10%, 보다 더 바람직하게는 +/- 5%를 의미한다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 의미하고, 이는 코딩 및 비-코딩 아미노산, 자연 및 비-자연 발생 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 융합 단백질, 예컨대 비제한적으로 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 이종 및 상동 리더 서열을 갖고 N-말단 메티오닌 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 융합체; 면역학적으로 태그부착된 단백질 등을 포함한다.

용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 인간을 의미한다. 다른 대상체는 소, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 환자로부터의 생물학적 물질을 의미한다. 본 발명에 의해 검정되는 샘플은 임의의 특정한 유형으로 제한되지 않는다. 샘플은 비제한적 예로서 단세포, 다세포, 조직, 종양, 생물학적 유체, 생물학적 분자, 또는 임의의 상기의 것의 상청액 또는 추출물을 포함한다. 예는 생검을 위해 제거된 조직, 절제 동안 제거된 조직, 혈액, 소변, 림프 조직, 림프액, 뇌척수액, 점액 및 대변 샘플을 포함한다. 사용되는 샘플은 검정 형식, 검출 방법 및 검정되는 종양, 조직, 세포 또는 추출물의 특성에 따라 상이할 것이다. 샘플의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이용되는 방법에 적합한 샘플을 얻기 위해 용이하게 변형될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 분자"는 폴리펩티드, 핵산 및 사카라이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절하는"은 유전자, 단백질, 또는 세포의 내부, 외부 또는 표면 상 임의의 분자의 질 또는 양의 변화를 나타낸다. 변화는 분자의 발현 또는 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 용어 "조절하다"는 또한 제한 없이 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키고; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하는 생물학적 기능/활성의 질 또는 양의 변화를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절제"는 FGF21-연관 장애, 예컨대 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 비만과 같은 대사 상태와 연관된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 사건을 조절하는 조성물을 의미한다. 상기 사건은 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키고; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"유전자 산물"은 유전자에 의해 발현되거나 생산된 생체중합체 생성물이다. 유전자 산물은, 예를 들어 비스플라이싱된 RNA, mRNA, 스플라이스 변이체 mRNA, 폴리펩티드, 번역후 변형된 폴리펩티드, 스플라이스 변이체 폴리펩티드 등일 수 있다. 또한, 상기 용어에는 RNA 유전자 산물을 주형으로서 사용하여 제조된 생체중합체 생성물 (즉, RNA의 cDNA)이 포함된다. 유전자 산물은 효소적으로, 재조합적으로, 화학적으로, 또는 유전자가 천연인 세포 내에서 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물이 단백질성이면, 이것은 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물이 핵산이면, 이것은 생물학적 활성을 나타내는 단백질성 유전자 산물로 번역될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "FGF21 활성의 조절", "GLP-1 활성의 조절" 및 "엑센딘-4 활성의 조절"은, 예를 들어 작용제의 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와의 상호작용, FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 전사 및/또는 번역의 억제 (예를 들어 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 유전자 또는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 전사체와의 안티센스 또는 siRNA 상호작용, FGF21, GLP-1, 또는 엑센딘-4 발현을 용이하게 하는 전사 인자의 조절을 통함) 등의 결과일 수 있는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 활성 각각의 증가 또는 감소를 의미한다. 예를 들어 생물학적 활성의 조절은 생물학적 활성의 증가 또는 감소를 의미한다. FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 활성은 제한 없이 대상체에서의 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준의 검정, FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 폴리펩티드 수준의 평가, 또는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 전사 수준의 평가를 포함하는 수단에 의해 평가될 수 있다.

FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 활성의 비교는, 예를 들어 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 하류 바이오마커의 수준 측정, 및 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 신호전달의 증가 측정에 의해서도 달성될 수 있다. FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 활성은 세포 신호전달; 키나제 활성; 지방세포 내로의 글루코스 흡수; 혈액 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준 변동; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준 변화; FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4와 수용체 사이의 상호작용; 또는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 수용체의 인산화 측정에 의해서도 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 수용체의 인산화는 티로신 인산화일 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 활성의 조절은 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4-관련 표현형의 조절을 야기할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 하류 바이오마커"는 유전자 또는 유전자 산물, 또는 유전자 또는 유전자 산물의 측정가능한 표시이다. 일부 실시양태에서, FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4의 하류 마커인 유전자 또는 활성은 변경된 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 하류 마커의 활성은 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 조절제의 존재 하에 변경된다. 일부 실시양태에서, 하류 마커는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 신호전달이 본 발명의 이중 기능 단백질에 의해 교란되는 경우 변경된 발현 수준을 나타낸다. 예를 들어, FGF21 하류 마커는 제한 없이 글루코스 또는 2-데옥시-글루코스 흡수, pERK 및 다른 인산화 또는 아세틸화 단백질 또는 NAD 수준을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상향-조절하다"는 활성 또는 양의 증가, 활성화 또는 자극을 의미한다. 예를 들어 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 조절제, 예컨대 본 발명의 이중 기능 단백질은 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 수용체의 활성을 증가시키거나 이에 효능작용할 수 있다. 한 실시양태에서, FGFR-1(IIIc), FGFR-2(IIIc) 또는 FGFR-3(IIIc) 및/또는 β-클로토 중 하나 이상은 본 발명의 이중 기능 단백질에 반응하여 상향-조절될 수 있다. 상향-조절은 또한, 예를 들어 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키거나; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키거나; 체중을 감소시키거나; 글루코스 내성, 에너지 소비량, 또는 인슐린 감수성을 개선시키거나; 또는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 수용체의 인산화를 야기하거나; 또는 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4 하류 마커를 증가시키는 능력과 같은 FGF21, GLP-1 또는 엑센딘-4-관련 활성을 의미한다. 예를 들어 FGFR21 수용체는 FGFR-1(IIIc), FGFR-2(IIIc) 또는 FGFR-3(IIIc) 및/또는 β-클로토 중 하나 이상일 수 있다. 상향-조절은 대조군에 비해 25% 내지 500% 사이의 어느 범위일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단"은 단백질의 적어도 첫 20개 아미노산을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단 도메인" 및 "N-말단 영역"은 상호교환적으로 사용되고, 단백질의 첫 아미노산에서 시작하여 단백질의 N-말단 절반 내의 임의의 아미노산에서 끝나는 단백질의 단편을 의미한다. 예를 들어, FGF21의 N-말단 도메인은 서열 1의 아미노산 1로부터 대략 서열 1의 아미노산 10과 105 사이의 임의의 아미노산까지이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "C-말단"은 단백질의 적어도 마지막 20개 아미노산을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "C-말단 도메인" 및 "C-말단 영역"은 상호교환적으로 사용되고, 단백질의 C-말단 절반 내의 임의의 아미노산에서 시작하여 단백질의 마지막 아미노산에서 끝나는 단백질의 단편을 의미한다. 예를 들어, FGF21의 C-말단 도메인은 서열 1의 아미노산 105로부터 대략 아미노산 200까지의 임의의 아미노산에서 시작하여 서열 1의 아미노산 209에서 끝난다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 생체분자의 공지된 또는 추정되는 기능에 기여하는 생체분자의 구조적 부분을 의미한다. 도메인은 영역 또는 그의 일부와 동시에 연장될 수 있고, 그 영역의 전부 또는 일부 이외에도 특정한 영역과 구별되는 생체분자의 일부를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 도메인" ("신호 서열" 또는 "신호 펩티드"로도 불림)은 전구체 단백질 (종종 막 결합 또는 분비 단백질)의 N-말단 영역에서 아미노산 서열의 연속 스트레치에 존재하는 펩티드 도메인을 의미하고, 번역후 단백질 수송에 관여한다. 다수의 경우에서, 신호 도메인은 분류 과정이 완료된 후, 특수 신호 펩티다제에 의해 전장 단백질로부터 제거된다. 각각의 신호 도메인은 전구체 단백질에 대해 세포 내의 특정 목적지를 지정한다. FGF21의 신호 도메인은 서열 1의 아미노산 1-28이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "수용체 결합 도메인"은 막 결합 수용체 단백질과 접촉하여 세포 반응, 예컨대 신호전달 사건을 유발하는 단백질의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드 결합 도메인"은 상응하는 천연 서열의 하나 이상의 정성적 결합 활성을 보유하는 본 발명의 융합 단백질의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다.

용어 "영역"은 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접하는 부분을 의미한다. 단백질의 경우에, 영역은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의된다. 일부 실시양태에서, "영역"은 생체분자의 기능과 연관된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단편"은 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접하는 부분을 의미한다. 단백질의 경우에, 상기 부분은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의되고, 적어도 3-5개의 아미노산, 적어도 8-10개의 아미노산, 적어도 11-15개의 아미노산, 적어도 17-24개의 아미노산, 적어도 25-30의 아미노산, 및 적어도 30-45개의 아미노산을 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 경우에, 상기 부분은 그 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의되고, 적어도 9-15개의 뉴클레오티드, 적어도 18-30개의 뉴클레오티드, 적어도 33-45개의 뉴클레오티드, 적어도 48-72개의 뉴클레오티드, 적어도 75-90개의 뉴클레오티드, 및 적어도 90-130개의 뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 생체분자의 부분은 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 문맥에서, FGF21 폴리펩티드 단편은 서열 1에 제시된 전체 FGF21 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연으로부터 유래되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 어구 "상동 뉴클레오티드 서열", 또는 "상동 아미노산 서열", 또는 그의 변형은 뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서 적어도 명시된 백분율의 상동성을 특징으로 하는 서열을 의미하고, "서열 동일성"과 상호교환적으로 사용된다. 상동 뉴클레오티드 서열은 단백질의 이소형을 코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 이소형은, 예를 들어 RNA의 선택적 스플라이싱의 결과로서 동일한 유기체의 상이한 조직에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 이소형은 상이한 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상동 뉴클레오티드 서열은 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 이외의 종의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동 뉴클레오티드 서열은 또한 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 자연 발생 대립유전자 변이 및 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상동 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환을 함유하고 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 적어도 60% 또는 그 초과, 99%까지의 동일성을 갖는 경우 상동이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 1개 이상, 60개까지의 뉴클레오티드/아미노산 치환, 부가 또는 결실을 공유하는 경우 상동이다. 일부 실시양태에서, 상동 아미노산 서열은 5개 이하 또는 3개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.

퍼센트 상동성 또는 동일성은, 예를 들어 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman) 알고리즘 (문헌 [Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489])을 이용하는, 디폴트 설정을 사용한 갭(Gap) 프로그램 (유닉스(UNIX)용 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브와 표적 사이의 상동성은 약 75% 내지 약 85%이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 2 또는 그의 일부에 적어도 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 약 100% 상동인 뉴클레오티드를 갖는다.

상동성은 또한 폴리펩티드 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 기능 단백질의 구성성분 폴리펩티드는 그의 전장 야생형 대응부 또는 상응하는 천연 서열, 또는 그의 일부에 적어도 95% 상동일 수 있다. 본 발명의 이중 기능 단백질 또는 그의 일부와, 상이한 아미노산 서열의 동일성 정도 또는 백분율은 "본 발명 서열" 또는 "외래 서열" 중 어느 것이든 가장 짧은 것의 길이에 의해 나눠진 2개의 서열의 정렬에서 정확한 일치의 수로 계산된다. 그 결과는 동일성 퍼센트로서 표현된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼합"은 하나 이상의 화합물, 세포, 분자 등을 함께 동일한 영역 내에서 배합하는 과정을 의미한다. 이것은, 예를 들어 시험 튜브, 페트리 디쉬, 또는 하나 이상의 화합물, 세포, 또는 분자의 혼합을 허용하는 임의의 용기에서 수행될 수 있다

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 정제된"은 그의 자연 환경으로부터 제거되고 자연적으로 그와 함께 회합되는 다른 성분이 60% 이상, 75% 이상, 및 90% 이상 존재하지 않는 화합물 (예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 항체)을 의미한다.

용어 "제약상 허용되는 담체"는 치료제, 예컨대 항체 또는 폴리펩티드, 유전자, 및 다른 치료제의 투여를 위한 담체를 의미한다. 상기 용어는 그 자체가 조성물을 투여받은 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 담체를 의미한다. 적합한 담체는 크고 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 이러한 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 치료 조성물 내의 제약상 허용되는 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 이러한 비히클에 존재할 수 있다.

시스테인 잔기에 의해 제공되는 바와 같은 자연 발생 디술피드 결합은 일반적으로 단백질의 열역학적 안정성을 증가시킨다. 용융 온도의 증가에서 측정된 바와 같은 증가된 열역학적 안정성의 성공적인 예는 효소 T4 리소자임 (문헌 [Matsumuraet al., PNAS 86:6562-6566 (1989)]) 및 바르나제 (문헌 [Johnson et al., J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)])의 다중 디술피드-결합 돌연변이체이다. 본 발명의 측면은 야생형 FGF21의 가요성을 제한하여 단백질의 소수성 코어에 대한 보존제의 접근을 제한하는 변이체 내의 디술피드 결합의 존재에 의해 달성되는, 보존제 존재 하의 FGF21의 물리적 안정성의 증진이다. 변이체 내의 디술피드 결합의 존재에 기인한, 본 발명의 단백질 내의 FGF21의 물리적 안정성의 증진은 보존제가 존재하든 존재하지 않든, pH 및 온도와 같은 환경적인 조건의 변동에 대한 보호를 포함하나 이에 제한되지는 않는 상기 단백질에 대한 추가의 보호를 부여할 수 있다.

야생형 단백질 비교체 및 그의 조합물에 대한 본 발명의 이중 기능 단백질의 개선

단백질 제약의 개발에서 유의한 문제는 단백질의 물리적 및 화학적 불안정성을 다루는 것임은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이것은 단백질 제약 제제가 유리한 생물활성 프로파일을 유지하면서 안정한 농축 및 보존 용액을 필요로 하는 다중 사용의 주사가능한 제제로 의도되는 경우 훨씬 더 분명해진다. 문헌에서 야생형 FGF21의 생물물리학적 특성화는 농축 단백질 용액 (5 mg/ml 초과)이 스트레스 조건, 예컨대 고온 또는 낮은 pH에 노출될 때 가속화된 회합 및 응집 (즉, 불량한 물리적 안정성 및 생물제약 특성)을 유도함을 확립하였다. FGF21의 농축 단백질 용액의 제약 보존제 (예를 들어 m-크레졸)에 대한 노출도 물리적 안정성에 대해 부정적인 영향을 가졌다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 생리학적 및 보존된 제제 조건 둘 다 하에서 화학적 안정성 및 생물학적 효력을 유지하면서 농축 용액의 물리적 안정성을 증진시키는 것이다. 주어진 단백질 농도에서는 온도 및 이온 강도가 물리적 안정성에 대해 상당한 영향을 갖기 때문에, 회합 및 응집은 소수성 상호작용에 의한 결과일 수 있다고 생각된다.

대부분의 경우에, 비-보존된, 추정된 표면 노출 아미노산 잔기가 표적화된다. 이들 잔기의 국부 환경을 분석하고, 구조적으로 중요한 것으로 생각되지 않는 잔기를 돌연변이유발을 위해 선택한다. 특정 변화를 개시하기 위한 한 방법은 글루탐산 잔기를 도입함으로써 단백질의 pI를 추가로 감소시키는 것이다 ("글루탐산 스캔"). 하전된 치환기의 도입은 전하-전하 반발을 통해 소수성-매개 응집을 억제하여, 잠재적으로 보존제 상용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 당업자는 충분한 돌연변이유발로, 음전하의 동시 감소를 수반하거나 수반하지 않는 양전하의 도입에 의해 전하-전하 반발을 허용함으로써 pI가 염기성 pH 범위로 이동할 수 있음을 또한 인식할 것이다.

생물치료제로서의 야생형 FGF21의 치료 용도와 연관된 추가의 문제점은, 예를 들어 그의 반감기가 생체내에서 매우 짧다는 것이다 (마우스 및 영장류에서 각각 약 0.5 및 2시간). 따라서 더 높은 효력 또는 더 긴 반감기를 통해 보다 효과적인 후속 화합물을 개발할 필요성이 존재한다. 이와 유사하게, 다양한 메카니즘이 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP4)에 의한 절단에 대해 저항성인 엑센딘-4 또는 다른 유사체의 사용 뿐만 아니라 화합물의 연장된 반감기 또는 서방성을 위한 추가의 변형 및 제제화를 통해 GLP-1에 대한 혈청 반감기 (내인성 프로테아제, 특히 DPP4에 의한 빠른 절단에 기인하여 1-2분)를 증진시키기 위해 사용되어 왔다.

본 발명의 단백질, 예를 들어 본 발명의 이중 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제 단백질은 보다 높은 효력 및 반감기-연장된 제제로 FGF21 및 GLP-1 치료의 바람직한 효과를 달성하기 위한 방식으로서 개발되었다. GLP-1 및 FGF21의 공-투여는, 비만 및 제2형 당뇨병의 치료에 대한 GLP-1 및 FGF21의 공-투여의 상가적이거나 또는 상승작용적인 효과를 시사하는 데이터와 함께 문헌에, 예를 들어 특허 공개공보 WO2010/068735 및 WO2009/020802에 기재된 바 있다. 그러나, 단일 분자, 예를 들어 본 발명의 단백질 형태로의 2개의 수용체 효능제의 공-국재화는 GLP-1 및 FGF21 둘 다의 조직 또는 세포에 대한 더 나은 접근을 제공하고, 분리된 물질로서의 단순한 공-투여보다 증가된 이익을 제공한다. 각각의 단순한 공-투여에 비한 2개 효능제의 단일 분자로의 조합의 이러한 이점은 GLP-1 및 FGF21 수용체 둘 다가 동일한 조직, 예컨대 지방, 췌장 β-세포, 간 및 시상하부 세포에서 발현되는 조직에 대해 특히 유리하다. 본 발명의 이중 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제 단백질 및 다른 단일 이중 활성 물질은 변경된 수용체 트래픽킹, 변경된 신호 전달 효과 및/또는 엔트로피 (결합력) 효과에 기인하여 개선된 생물학적 특성을 갖는다.

FGF21 및 GLP-1 (또는 엑센딘-4)은 상이한 메카니즘을 통해 작용하기 때문에, 예를 들어 동시에 본 발명의 이중 기능 단백질의 형태로 투여되는 경우에 이들은 상가적이거나 또는 상승작용적인 효과를 가질 것으로 예상된다. GLP-1 및 엑센딘-4는 주로 식품 섭취에 반응하여 인슐린 분비를 증가시키는 작용을 하는 반면, FGF21은 인슐린에 더 잘 반응하도록 신체를 감작시키는데, 이는 혈액 글루코스 수준을 관리하는데 있어서 제1형 및 제2형 당뇨병 둘 다를 위한 이익을 제공할 수 있다. 개선된 베타-세포 기능 및 인슐린 감수성과 조합된 베타-세포 보호 효과는 심지어 제1형 당뇨병에서도 이익을 제공할 잠재력을 갖는다.

또 다른 예는 체중 감소이다: GLP-1 또는 엑센딘-4에 의한 포만감 신호 및 늦춰진 위 배출은 식욕을 저하시키는 것으로 예상되는 반면, FGF21은 지방 조직 및 지방의 감소를 증가시킬 수 있는 다른 조직에서의 대사를 증가시킨다. 이러한 2가지 효과는 조합된 투여에 의해 상가적이거나 또는 심지어 상승작용적인 체중 감소를 유발할 수 있다. 대사적 활성 조직에서의 FGF21 및 GLP-1 둘 다에 대한 수용체의 발현은 이러한 조직으로의 FGF21 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제의 동시 전달이 대사 질환을 치료하는데 유익할 수 있다는 것을 시사한다. GLP-1 및 엑센딘-4의 심장보호 효과 및 FGF21에 의해 나타나는 개선된 지질 프로파일의 조합은 비만, 제2형 및 제1형 당뇨병과 연관된 심혈관 질환에 대해 추가적 이익을 또한 유발할 수 있다.

GLP-1 및 FGF21 이중 효능작용의 또 다른 가능성 있는 이익은 개선된, 즉 감소된 부작용 프로파일이다. 최근 연구 (문헌 [Wei et al. (2012) PNAS 109, 3143-48])는 식이-유발 비만 마우스의 FGF21로의 처리가 (감소된 SUMO화를 통한) PPARγ의 감소된 불활성화에 기인하여, 골 손실을 유도하고; FGF21 처리 후 골에서의 증가된 PPARγ 활성의 존재 하에 골모세포에서 지방세포로의 중간엽 줄기 세포 분화의 변화가 나타남을 보여준다. 그러나, GLP-1은 PPARγ의 발현을 감소시킴으로써 인간 중간엽 줄기 세포의 지방세포로의 분화를 감소시킬 수 있음이 또한 보고되었다 (문헌 [Sanz et al. (2010) Am J Physiol Endocrinol Metab 298, E634-E643]). 따라서, GLP-1은 골을 보호하는 잠재력을 갖고 있기 때문에, GLP-1-FGF21 융합 단백질은 FGF21-단독 치료에 비해 골 손실의 위험을 감소시킬 것으로 여겨진다.

본 발명의 실시양태는 생리학적 및 보존된 제약 제제 조건 둘 다 하에서의 물리적 및 화학적 안정성에 관한 것이지만, 예를 들어 야생형 FGF21과 비교할 때 본 발명의 단백질의 생물학적 효력을 유지하는 것 또한 중요한 고려 인자이다. 따라서, 본 발명의 단백질의 생물학적 효력은 본원의 실시예에 나타낸 바와 같은 글루코스 흡수 및/또는 혈장 글루코스 수준의 저하에 영향을 미치는 단백질의 능력에 의해 규정된다.

본 발명에 따라 투여되는 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성되고/거나 단리될 수 있다. 변이체를 생성하기 위한 가장 바람직한 방법은 재조합 DNA 방법론을 통한 것이고, 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)]에 기재되어 있다.

추가로, 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 변이체로부터 유도된 생물학적 활성 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 기재된 하나 이상의 치환을 함유할 것이고, 변이체는 생물학적 활성을 보유할 것이다. 펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 모든 수단에 의해 생산될 수 있고, 그 예는 효소적 소화, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 방법론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 섬유모세포 성장 인자의 펩티드 단편이 생물학적 활성을 갖는 것은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어 문헌 [Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988), 및 J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987)]을 참조한다. 따라서, 변이체의 단편 또는 펩티드의 선택은 당업계에 공지된 기준을 기초로 한다. 예를 들어 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV 또는 DPP-4)는 뉴로펩티드, 내분비 펩티드 및 시토카인의 불활성화와 관련된 세린형 프로테아제로 공지되어 있다 (문헌 [Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)]). FGF21의 N-말단 (HisProIlePro (서열 183))은, 잠재적으로 DPP-IV의 기질이고, 이에 따라 4개 아미노산이 N-말단에서 말단절단된 FGF21의 단편을 생성할 수 있는 2개의 디펩티드를 함유한다. 예상외로, 야생형 FGF21의 이 단편은 생물학적 활성을 보유하는 것으로 입증되었고, 따라서 4개 이하의 아미노산이 N-말단에서 말단절단된 본 발명의 단백질은 본 발명의 실시양태이다.

본 발명은 또한 RNA 형태 또는 DNA의 형태일 수 있는 상기 기재된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축중성의 결과로 달라질 수 있다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 변이체에 대한 코딩 서열 단독; 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 기능성 폴리펩티드, 또는 리더 또는 분비 서열 또는 프로-단백질 서열; 변이체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 변이체에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 인트론 또는 비-코딩 서열. 따라서, 용어 "변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 코딩 서열 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 추가로, 제시된 치환을 함유하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 인간 FGF21 서열의 자연 발생 대립유전자 변이체, 비-자연 발생 변이체, 또는 상기 기재된 말단절단된 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 변이체가 개시된 변이체의 단편, 유도체 또는 유사체를 코딩하는 것인 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체는 제1 또는 제2 실시양태의 제시된 아미노산 치환이 하나 이상 존재하는 한, 결실 변이체, 치환 변이체, 말단절단된 변이체, 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 (즉, 기능을 보장하도록 위치한) 후에 숙주에서 발현될 것이다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용하기 위해 선택 마커, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다. 이중 기능 단백질 또는 그의 단편은 적절한 프로모터의 제어 하에 포유동물 세포, 곤충, 효모, 박테리아 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 번역 시스템이 본 발명의 DNA 구축물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생산하는데 사용될 수도 있다.

이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하기에 특히 유용한 원핵 숙주이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스 섭틸루스(Bacillus subtilus), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 및 다양한 종의 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 포함하지만, 다른 것도 선택에 따라 사용될 수 있다. 이들 원핵 숙주 내에, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어 복제 기점)을 함유할 발현 벡터를 제조할 수도 있다. 또한, 임의의 많은 익히 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (Trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다 또는 T7로부터의 프로모터 시스템이 존재할 수 있다. 프로모터는 전형적으로, 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.

단백질 발현 분야의 당업자는 이. 콜라이에서의 발현을 위해, 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 성숙 서열 (서열 3)의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려됨을 인식할 것이다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 이. 콜라이에서 발현된 본 발명의 단백질은 N-말단에 도입된 메티오닌 서열을 갖는다.

다른 미생물, 예컨대 효모 또는 진균도 발현에 사용될 수 있다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피키아 안구스타(Pichia angusta)는 바람직한 효모 숙주의 예이고, 목적한 바와 같은 발현 제어 서열, 예컨대 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소를 포함하는 프로모터, 및 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 함유한다. 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei); 및 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune)이 진균 숙주의 예이지만, 다른 것도 선택에 따라 사용될 수 있다.

포유동물 조직 세포 배양 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생산하는데 사용될 수 있다. 진핵 세포가 실제로 바람직한데, 이는 무손상 변이체를 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있기 때문이고, 여기에는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NSO 세포, 시리안 햄스터(Syrian Hamster) 난소 세포주, HeLa 세포, 또는 인간 배아 신장 세포주 (즉, HEK293, HEK293EBNA)가 포함된다.

이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 라우스(Raus) 육종 바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 바람직한 폴리아데닐화 부위는 SV40 및 소 성장 호르몬으로부터 유래된 서열을 포함한다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본 발명의 단백질 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 상이한 익히 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 이용되고, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다

다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)는, 예를 들어 본 발명의 단백질에 이용되는 생산 방법의 특성에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드, 예를 들어 본 발명의 이중 활성 융합 단백질은 환자의 임상 상태, 단백질 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 고려하여 우수한 의료 행위에 일치하는 방식으로 제제화되고 투여되어야 한다. 따라서, 본원의 목적을 위한 본 발명의 단백질의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 결정된다.

본 발명의 단백질의 제약 조성물은 제1형 및 제2형 당뇨병, 비만, 대사 증후군 또는 중환자를 치료하기 위한 일반적으로 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 투여의 비제한적 허용 수단은, 예를 들어 흡입 또는 좌약에 의해 또는 점막 조직에, 예컨대 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직에 대한 세척에 의해, 경구로, 비강으로, 국소로, 비강내로, 복강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 흉골내로, 관절내 주사에 의해, 림프내로, 간질로, 동맥내로, 피하로, 활막내, 경상피, 및 경피로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 세척에 의해, 경구로, 또는 동맥내로 투여된다. 다른 적합한 도입 방법에는 재충전성 또는 생분해성 장치 및 저속 또는 지속 방출 중합체성 장치가 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 다른 공지된 대사 작용제와의 조합 요법의 일부로서 투여될 수 있다.

투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재할 경우 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 특성에 좌우될 것이다. 본 발명의 범위 내의 조성물은 FGF21 변이체가 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만 또는 대사 증후군의 치료를 위해 목적하는 의학적 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 환자별로 개별 필요량은 달라질 수 있지만, 모든 성분의 유효량에 대해 최적인 범위를 결정하는 것은 통상의 기술을 가진 임상의의 능력 내에 있다.

본 발명의 단백질은 공지된 제약상 유용한 조성물의 제조 방법에 따라 제제화될 수 있다. 목적 제제는 적절한 희석제로 재구성되는 안정한 동결건조 생성물 또는 임의적인 제약상 허용되는 담체, 보존제, 부형제 또는 안정화제를 함유하는 고순도의 수용액인 제제일 것이다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]). 본 발명의 단백질은 제약상 허용되는 완충제, 및 허용되는 안정성을 제공하기 위해 조정된 pH, 및 투여에 허용되는 pH와 조합될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 일반적으로 목적 순도의 하나 이상의 단백질을 제약상 허용되는 담체, 즉 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이고 제제의 다른 성분과 상용성인 것과 주사가능한 단위 투여 형태 (용액, 현탁액 또는 에멀젼)로 혼합함으로써 제제화된다. 바람직하게는, 하나 이상의 제약상 허용되는 항-미생물제가 첨가될 수 있다. 페놀, m-크레졸 및 벤질 알콜이 바람직한 제약상 허용되는 항-미생물제이다.

임의로, 하나 이상의 제약상 허용되는 염이 이온 강도 또는 장성을 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 하나 이상의 부형제가 제제의 등장성을 추가로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 글리세린, 염화나트륨 및 만니톨이 등장성 조정 부형제의 예이다.

당업자는 우수한 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정된 바와 같이, 본 발명의 단백질을 포함하는 치료 조성물에 대한 제약상 유효 투여량 및 투여 요법을 용이하게 최적화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 전형적 용량 범위는 성인의 경우 약 0.01 mg/일 내지 약 1000 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 0.05 mg/주 내지 약 5000 mg/주)일 것이다. 바람직하게는, 투여량 범위는 약 0.1 mg/일 내지 약 100 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 0.5 mg/주 내지 약 500 mg/주), 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/일 내지 약 10 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 5 mg/주 내지 약 50 mg/주)이다. 가장 바람직하게는, 투여량은 약 1-5 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 5 mg/주 내지 약 25 mg/주)이다. 투여되는 FGF21 변이체의 적절한 용량은 보다 빠르고 보다 효율적인 글루코스 이용에 의해 혈액 글루코스 수준의 저하 및 에너지 소비량의 증가를 유발할 것이고, 따라서 제1형 및 제2형 당뇨병, 비만 및 대사 증후군을 치료하는데 유용하다.

또한, 고혈당증 및 인슐린 저항성은 영양 지원이 주어진 중환자에서 통상적이기 때문에, 일부 중환자실 (ICU)에서는 식후 중환자의 과도한 고혈당증을 치료하기 위해 인슐린을 투여한다. 실제로, 최근의 연구는 혈액 글루코스를 110 mg/dl 이하의 수준으로 유지하기 위한 외인성 인슐린의 사용이 당뇨병 병력의 존재 여부와 무관하게 외과 중환자실의 중환자의 이환율 및 사망률을 감소시켰음을 기록하고 있다 (문헌 [Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)]). 따라서, 본 발명의 단백질은 대사 불안정 중환자에서 대사 안정성의 회복을 돕는데 특유하게 적합하다. FGF21의 변이체를 함유하는 것과 같은 본 발명의 단백질은 그것이 글루코스 흡수를 자극하고, 인슐린 감수성을 증진시키지만, 저혈당증은 유도하지 않다는 점에서 특유하다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 상태, HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증 및 다른 대사 장애의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 단백질이 고려된다.

지금까지 본 발명을 상세하게 기재하였고, 이는 설명의 목적으로만 본원에 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 더욱 명확하게 이해될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); 및 Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]을 참조한다.

부위-특이적 FGF21 돌연변이체

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 (DPP-4 저항성의 전달, PEG화, 또는 다른 목적을 위한) GLP-1 또는 엑센딘-4의 추가의 돌연변이체, GLP-1/글루카곤 하이브리드 펩티드, 비천연 아미노산을 갖는 GLP-1 유사체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 FGF21의 하기 추가의 변형 중 하나 이상을 갖는 FGF21 효능제를 포함한다:

(i) 이량체화, 예컨대 R154C에서의 디술피드의 형성 또는 또 다른 부위에서의 시스테인의 도입, 또는 융합된 Fc 도메인을 통한 이량체화, 또는 이관능성 PEG와 같은 가교제를 통한 이량체 형성을 촉진하기 위한 추가의 디술피드, 비천연 아미노산, 또는 변형;

(ii) FGF21의 단편;

(iii) FGF21 활성 (베타-클로토에 대한 결합 및 FGFR의 결합 및 활성화)을 갖도록 선택된 단백질; 및

(iv) FGF21 모방 항체 (다양한 형식, 예컨대 Fab, 유니바디, svFc 등).

일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 활성 단백질은 하기 링커 중 하나 이상을 포함한다: 단순 아미드 결합, 짧은 펩티드 (특히 Ser/Gly 반복부), FGF21 번역된 서열로부터의 추가 잔기, 또는 전체 단백질에 이르는 보다 큰 링커 (예컨대 Fc 도메인, HSA-결합 나선 다발, HSA 등). 2개의 모이어티는 또한 다른 화학적 수단에 의해, 예컨대 비천연 아미노산 또는 표준 화학 링커 (말레이미드-Cys, NHS-Lys, "클릭 화학" 등)를 통해 연결될 수 있다. FGF21 모방 항체 접근을 위한 "링커"는 이미 열거된 것 및 또한 GLP-1 N-말단을 방출하기 위한 후속 절단을 수반하는 루프 내 삽입물을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 1개, 2개, 또는 그 초과의 특정 부위에서 발생하는 PEG화를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, PEG화는 FGF21 분자 또는 링커 내에서 발생한다. 일부 실시양태에서, PEG화는 이중 기능 단백질의 N-말단의 ~10개 아미노산 내에 있지 않고, 바람직하게는 FGF21의 개시점의 ~10개 아미노산 내에 있지 않다. PEG화 부착 화학은 NHS-Lys, 말레이미드-Cys, 비천연 아미노산 (알데히드, "클릭 화학", Pcl 등)을 포함할 수 있고, 반응의 화학량론을 조절하기에 적합한 단백질 변이체와 조합될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 PEG 기는 임의의 크기 (예를 들어 1, 2, 3.4, 5, 10, 20, 24, 29, 30, 40 kDa)일 수 있고, 선형, 분지형 또는 빗살형 구조일 수 있으며, 40 kDa 이상의 전체 PEG화가 바람직하다. 최적의 PEG화는 매주 1회의 투여로 충분한 반감기 연장을 달성한다. 단백질 이량체, 삼량체, 사량체 등의 PEG화는 더 짧은 PEG 중합체를 사용하여 적절한 혈청 반감기 연장을 유발할 수 있다. 분지형 및 빗살형 PEG 구조는 더 낮은 점도의 관점에서 유익할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질에 바람직한 반감기 연장 방법론은 IgG Fc 도메인 또는 HSA의 링커로의 통합을 포함하고, PEG화를 필요로 하지 않을 수 있다. 추가로, Fc 도메인 융합체의 사용은 이량체화를 유발할 것이고 반감기 연장 이외에도 효력의 증진을 유발할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 반감기 연장을 위한 하기 부착을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 융합체의 단량체 또는 이량체 버전에 대한 HSA-결합 지질 또는 소분자 또는 미셀.

본 발명의 특정 실시양태에서, 반감기 연장 및 다른 개선된 생물학적 특성을 달성하기 위해 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대해 다른 부착이 이루어질 수 있다. 이들은 PEG-콜레스테롤 접합체 (미셀 및 리포솜 포함)를 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하고/거나, 당 (글리코실레이트)을 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 스타치 (HES), 알부민-결합 리간드, 또는 탄수화물 차폐의 접합체를 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드에 부가하기 위해 유사한 기술이 사용된다.

HES화 기술은, 예를 들어 환원성 알킬화를 통해 분지형 히드록시에틸스타치 (HES) 쇄 (60 kDa 또는 100 kDa, 옥수수 전분으로부터의 고분지형 아밀로펙틴 단편)를 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 커플링시킨다. 폴리시알화는 PEG화와 유사한 방식으로 관심 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 폴리시알산 (PSA) 중합체와 접합시킨다. PSA 중합체는 신체에서 자연적으로 발생하는 음으로 하전된 비-면역원성 중합체이고, 10-50kD의 분자량으로 이용가능하다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 반감기 연장 및 다른 개선된 생물학적 특성을 달성하기 위해 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대해 다른 부착 또는 변형이 이루어질 수 있다. 이들은 재조합 PEG (rPEG) 기의 생성, 및 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대한 그의 부착을 포함한다. 회사 아뮤닉스 인크.(Amunix, Inc.)에 의해 개발된 바와 같은 rPEG 기술은 생물제약에 유전적으로 융합된 PEG-유사 특성을 갖는 단백질 서열을 기반으로 하여, 추가의 화학적 접합 단계를 회피한다. rPEG는 친수성 아미노산의 긴 비구조화 꼬리를 함유하는 연장된 반감기 엑세나티드 구축물이고, 이는 단백질 또는 펩티드의 혈청 반감기 증가 및 그의 흡수 속도 저하 둘 다를 가능하게 하여 최고효과-최저효과 비를 유의하게 감소시킬 수 있다. rPEG는 증가된 유체역학 반경을 갖고, 그의 실제 분자량의 약 15배인 겉보기 분자량을 나타내며, PEG화 방식을 모방하여 긴 혈청 반감기를 달성한다. 유사한 재조합 폴리펩티드 서열이 또한 단백질의 "PAS화"를 위해 엑스엘-프로틴 게엠베하(XL-protein GmbH)에 의해 개발되었다.

화학적으로 변형된 이중 기능 단백질 돌연변이체

예를 들어 본원에 기재된 이중 기능 융합 단백질의 말단절단 및 변이체 형태를 비롯하여 본원에 기재된 융합 단백질의 화학적으로 변형된 형태는 본원에 기재된 개시내용을 고려하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 이중 기능 단백질은, 화학적으로 변형된 돌연변이체가 돌연변이체에 자연적으로 부착된 분자의 유형 또는 위치에 있어서 비변형된 돌연변이체와 상이하도록 변경된다. 화학적으로 변형된 돌연변이체는 하나 이상의 자연적으로 부착된 화학적 기의 결실에 의해 형성된 분자를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 하나 이상의 중합체의 공유 부착에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 선택된 중합체는 전형적으로, 그것이 부착되는 단백질이 수용성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전되지 않도록 수용성이다. 적합한 중합체의 범위 내에는 중합체의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것일 것이다. 본 발명의 단백질에 접합된 비-수용성 중합체 또한 본 발명의 측면을 형성한다.

예시적인 중합체는 각각 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 중합체는 각각 전형적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 갖는다 (용어 "약"은 수용성 중합체의 제제 내에서, 일부의 분자는 언급된 분자량보다 크고 일부는 작을 것임을 나타냄). 각각의 중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 보다 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 40 kDa, 가장 바람직하게는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa이다.

적합한 수용성 중합체 또는 그의 혼합물은 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물, 당, 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (모노-(C1-C10), 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리 에틸렌 글리콜을 비롯하여 단백질의 유도체화에 사용된 PEG 형태 포함), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 (예컨대 저분자량, 예를 들어 약 6 kD의 덱스트란), 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물 기재 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 및 폴리비닐 알콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 공유적으로 부착된 이중 기능 단백질 변이체 다량체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 이관능성 가교결합 분자가 본 발명에 포함된다. 또한, 폴리시알산에 공유적으로 부착된 이중 기능 단백질 변이체가 본 발명에 포함된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 기능 단백질 변이체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 수용성 중합체를 포함하도록 공유적으로 또는 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 및 4,179,337을 참조한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 기능 단백질은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또 다른 탄수화물-기재 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 또는 이러한 중합체의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 중합체를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 기능 단백질은 PEG 서브유닛으로 공유적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 이중 기능 단백질 돌연변이체의 하나 이상의 특정 위치에서 (예를 들어 N-말단에서) 결합된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 이중 기능 단백질 돌연변이체의 하나 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG는 이중 기능 단백질 돌연변이체의 치료 능력을 개선시키는데 사용된다. 특정한 상기 방법은, 예를 들어 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,133,426에 논의되어 있다.

중합체가 PEG인 본 발명의 실시양태에서, PEG 기는 임의의 편리한 분자량의 것일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다. PEG 기의 평균 분자량은 바람직하게는 약 2 kD 내지 약 100 kDa 범위, 보다 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 예를 들어 10, 20, 30, 40 또는 50 kDa일 것이다. PEG 기는 일반적으로 이중 기능 단백질 돌연변이체 상의 반응성 기 (예를 들어 알데히드, 아미노 또는 에스테르 기)에 대한 PEG 모이어티 상의 반응성 기 (예를 들어 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스테르 기)를 통한 아실화 또는 환원성 알킬화에 의해 이중 기능 단백질 돌연변이체에 부착될 것이다.

"Y-자형" PEG 유도체로도 공지된 분지형 PEG 유도체는 중앙 코어에 부착된 2개의 선형 메톡시 PEG 쇄를 함유한다. 이들 "Y-자형" PEG 유도체의 입체적으로 부피가 큰 구조는 변형된 분자의 단일 지점 부착을 용이하게 할 것이다. 예로서, 3가지 종류의 "Y-자형" PEG 유도체는 Y-NHS-40K (아민 PEG화에 유용함); Y-MAL-40K (티올 PEG화에 유용함); 및 Y-ALD-40K (예를 들어 Y-AALD-40K 및 Y-PALD-40K) (N-말단 PEG화에 유용함)이다. 아민 PEG화를 위해, "Y-자형" NHS 에스테르는 생물학적 활성 분자 내의 리신(들)의 아미노기 또는 N-말단 아민과 반응하여 안정한 아미드 연결(들)을 생성할 것이다. 이 NHS 에스테르는 pH 7-8.5에서 표적화 분자와 커플링될 것이다. 티올 PEG화를 위해, "Y-자형" 말레이미드는 생물학적 활성 분자 내의 티올기와 반응하여 안정한 3-티오숙신이미딜 에테르 연결을 생성할 것이다. 이 말레이미드는 다른 관능기의 존재 하에 대략 pH 7.4에서 표적화 분자와 커플링될 것이다. N-말단 PEG화를 위해, "Y-자형" 알데히드는 바람직하게는 생물학적 활성 분자 내의 N-말단 아민과 반응하여 환원 시약, 예컨대 쇼듐 시아노보로히드리드의 존재 하에 안정한 아민 연결을 생성할 것이다. 이 알데히드는 pH 5-8에서 표적화 분자의 N-말단 아민과 커플링될 것이다. 분지형 PEG화 수행을 위한 시약은, 예를 들어 젠켐 테크놀로지(JenKem Technology)를 통해 입수가능하다.

본 발명의 단백질을 비롯한 폴리펩티드의 PEG화는 특히 당업계에 공지된 임의의 PEG화 반응을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 반응은, 예를 들어 하기 참조문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10]; 유럽 특허 번호 0 154 316 및 0 401 384; 및 미국 특허 번호 4,179,337. 예를 들어 PEG화는 본원에 기재된 바와 같은 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행할 수 있다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체는 단일 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 환원성 알킬화를 위해, 선택된 중합체는 단일 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 반응성 알데히드는, 예를 들어 물 안정성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,252,714 참조).

본 발명의 일부 실시양태에서, PEG 기를 폴리펩티드에 부착하기에 유용한 전략은 서로에 대해 상호 반응성인 특수 관능기를 각각 보유하는 펩티드 및 PEG 모이어티를 용액 내에서 접합체 연결의 형성을 통해 결합하는 것을 포함한다. 펩티드는 통상적인 고체 상 합성으로 용이하게 제조할 수 있다. 펩티드는 특정 부위에서 적합한 관능기로 "예비활성화"된다. 전구체를 정제하고, 충분히 특성화한 후, PEG 모이어티와 반응시킨다. 펩티드와 PEG의 라이게이션은 통상적으로 수성 상에서 발생시키고, 역상 분석용 HPLC에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. PEG화 펩티드는 정제용 HPLC에 의해 용이하게 정제할 수 있고, 분석용 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광측정법에 의해 특성화할 수 있다.

폴리사카라이드 중합체는 단백질 변형을 위해 사용할 수 있는 또 다른 유형의 수용성 중합체이다. 따라서, 폴리사카라이드 중합체에 융합된 본 발명의 단백질은 본 발명의 실시양태를 형성한다. 덱스트란은 우세하게 알파 1-6 연결에 의해 연결된 글루코스의 개별 서브유닛으로 구성된 폴리사카라이드 중합체이다. 덱스트란 자체는 넓은 분자량 범위에서 이용가능하고, 약 1 kD 내지 약 70 kD의 분자량에서 용이하게 이용가능하다. 덱스트란은 단독으로 또는 또 다른 비히클 (예를 들어 Fc)과 조합하여 비히클로서 사용하기에 적합한 수용성 중합체이다. 예를 들어 국제 공개 번호 WO 96/11953을 참조한다. 치료 또는 진단 이뮤노글로불린에 접합된 덱스트란의 사용이 보고된 바 있다. 예를 들어 본원에 참조로 포함된 유럽 특허 공보 번호 0 315 456을 참조한다. 본 발명은 또한 약 1 kD 내지 약 20 kD의 덱스트란의 사용을 포함한다.

일반적으로, 화학적 변형은 단백질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키기 위해 사용되는 임의의 적합한 조건 하에 수행할 수 있다. 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) FGF21 단백질 변이체가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되는 조건 하에 폴리펩티드를 활성화된 중합체 분자 (예컨대 중합체 분자의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 최적의 반응 조건은 공지의 파라미터 및 목적하는 결과를 기준으로 결정될 것이다. 예를 들어 중합체 분자 대 단백질의 비가 클수록, 부착된 중합체 분자의 백분율이 커진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 아미노-말단에 단일 중합체 분자 모이어티를 가질 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,234,784 참조).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단백질을 비오틴에 화학적으로 커플링시킬 수 있다. 이어서, 본 발명의 비오티닐화 단백질을 아비딘에 결합시켜, 4가의 아비딘/비오틴/본 발명의 단백질을 생성한다. 또한 본 발명의 단백질을 디니트로페놀 (DNP) 또는 트리니트로페놀 (TNP)에 공유적으로 커플링시키고, 생성된 접합체를 항-DNP 또는 항-TNP-IgM으로 침전시켜 10가의 십량체 접합체를 형성할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 화학적으로 변형된 이중 기능 단백질 돌연변이체의 투여에 의해 완화되거나 조정될 수 있는 상태는 본 발명의 단백질에 대해 본원에 기재된 것을 포함한다. 그러나, 본원에 개시된 화학적으로 변형된 이중 기능 단백질 돌연변이체는 비변형된 이중 기능 단백질 돌연변이체에 비해 추가의 활성, 증진 또는 감소된 생물학적 활성, 또는 다른 특징, 예컨대 증가 또는 감소된 반감기를 가질 수 있다.

이중 기능 단백질의 치료 조성물 및 그의 투여

본 발명의 이중 기능 단백질을 포함하는 치료 조성물은 본 발명의 범위 내에 있고, 예를 들어 증진된 특성을 나타내는 몇몇 돌연변이체 이중 기능 단백질 서열의 확인을 감안하여 구체적으로 고려된다. 이러한 이중 기능 단백질 돌연변이체 제약 조성물은 치료 유효량의 이중 기능 단백질 변이체를 투여 방식에 적합하도록 선택된 제약상 또는 생리학상 허용되는 제제화 작용제와 혼합하여 포함할 수 있다.

허용되는 제제화 물질은 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.

제약 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착, 또는 투과를 변형하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제제화 물질은 아미노산 (예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항미생물제, 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 완충제 (예컨대 보레이트, 비카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 벌킹제 (예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제 (예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)), 착화제 (예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체 (예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 반대이온 (예컨대 나트륨), 보존제 (예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매 (예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜 (예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제, 계면활성제 또는 습윤제 (예컨대 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증진제 (예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 증진제 (예컨대 알칼리 금속 할라이드; 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨; 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 그의 후속판 참조).

최적 제약 조성물은, 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 형식, 및 목적 투여량에 따라 당업자가 결정할 것이다 (예를 들어 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조). 이러한 조성물은 본 발명의 융합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 클리어런스 속도에 영향을 줄 수 있다.

제약 조성물 내의 1차 비히클 또는 담체는 특성상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여를 위한 조성물에 통상적인 다른 물질로 보충된 물, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 제약 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 트리스 완충제, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 완충제를 포함하고, 이는 소르비톨 또는 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이중 기능 제약 조성물은 목적 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의의 제제화 작용제 (상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences])와 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다. 추가로, 이중 기능 단백질 생성물은 적절한 부형제, 예컨대 수크로스를 사용하여 동결건조물로서 제제화될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질을 함유하는 제약 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관, 예컨대 경구를 통한 전달을 위해 선택될 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술 내에 있다.

제제 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 예를 들어 완충제를 사용하여 조성물을 생리학적 pH로 또는 약간 더 낮은 pH로, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지한다.

비경구 투여가 고려될 때, 본 발명에서 사용하기 위한 치료 조성물은 제약상 허용되는 비히클 내에 목적하는 이중 기능 단백질을 포함하는, 발열원 무함유의 비경구로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은, 그 안에 이중 기능 단백질이 적절하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제제화된 멸균 증류수이다. 또 다른 제제는 추후 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공하는 작용제, 예컨대 주사가능한 마이크로구체, 생분해성 입자, 중합체 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜에 의한 목적 분자의 제제화를 포함할 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 이는 순환에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 목적 분자를 도입하기에 적합한 다른 수단은 이식가능한 약물 전달 장치를 포함한다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 흡입용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 이중 기능 단백질은 흡입을 위한 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 이중 기능 단백질 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위한 추진제에 의해 제제화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기재하는 국제 공개 번호 WO 94/20069에 추가로 기재되어 있다.

특정 제제는 경구로 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이 방식으로 투여되는 본 발명의 이중 기능 단백질은 고체 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐의 조제에 통상적으로 사용되는 담체를 사용하거나 사용하지 않고 제제화될 수 있다. 예를 들어 캡슐은 생체이용률이 최대이고 사전-전신 분해가 최소일 때 위장관 내의 지점에서 제제의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 본 발명의 이중 기능 단백질의 흡수를 촉진하기 위한 추가의 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.

또 다른 제약 조성물은 유효량의 본 발명의 단백질을 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와 혼합하여 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 또 다른 적절한 비히클 내에 용해시킴으로써, 용액을 단위-투여 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 이중 기능 단백질을 포함하는 추가의 제약 조성물, 예컨대 지속- 또는 제어-전달 제제 내에 본 발명의 이중 기능 단백질을 포함하는 제제는 당업자에게 자명할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예컨대 리포솜 담체, 생분해성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제를 제제화하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 제약 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어 방출을 기재하는 국제 공개 번호 WO 93/15722, 및 마이크로구체/마이크로입자 제조 및 용도를 논의하고 있는 문헌 [Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327 및 Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18] 참조).

지속-방출 제제의 추가의 예는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919 및 유럽 특허 번호 0 058 481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56]), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (문헌 [Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (상기 문헌 [Langer et al.]) 또는 폴리-D-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 번호 0 133 988)을 포함할 수 있다. 지속-방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조할 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92]; 및 유럽 특허 번호 0 036 676, 0 088 046 및 0 143 949를 참조한다.

생체내 투여를 위해 사용될 수 있는 본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 멸균상태여야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물이 동결건조될 경우, 이 방법을 이용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액으로 저장할 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 구비된 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 넣는다.

일단 제약 조성물을 제제화하였으면, 이를 멸균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 저장할 수 있다. 이러한 제제는 즉시 사용 가능 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태 (예를 들어 동결건조된 형태)로 저장할 수 있다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 건조된 단백질이 담긴 제1 용기 및 수성 제제가 담긴 제2 용기 둘 다를 각각 포함할 수 있다. 단일 및 다중-챔버의 사전-충전된 시린지 (예컨대 액체 시린지 및 리오시린지)를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

이중 기능 단백질의 투여량 및 그의 투여

치료적으로 사용되는 본 발명의 제약 조성물의 유효량은, 예를 들어 치료 상황 및 목표에 따라 달라질 것이다. 따라서, 당업자라면 치료에 적절한 투여량 수준이 전달되는 분자, 융합 단백질 변이체가 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체구 (체중, 체표면 또는 기관 크기) 및 상태 (연령 및 전반적 건강)에 따라 부분적으로 달라질 것임을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 수 있다.

투여 빈도는 사용되는 제제 내의 이중 기능 단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량 (동일한 양의 목적 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인할 수 있다.

제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따른, 예를 들어 경구; 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통한; 지속 방출 시스템 (이는 또한 주사될 수 있음)에 의한; 또는 이식 장치에 의한 투여이다. 원하는 경우, 조성물은 볼루스 주사, 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 조성물은 목적 분자가 그 위에 흡수되거나 캡슐화된 막, 스폰지, 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 이식될 수 있고, 목적 분자의 전달은 확산, 지연-방출형 볼루스, 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.

이중 기능 단백질의 치료 용도

본 발명의 단백질은 대사 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 질환, 장애 또는 상태의 치료, 진단, 개선 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료되는 대사 장애는 당뇨병, 예를 들어 제2형 당뇨병이다. 또 다른 실시양태에서, 대사 장애는 비만이다. 다른 실시양태는 제1형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 급성 심근경색, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, HIV-연관 지방이영양증을 비롯한 지방이영양증, 위마비 및 다른 대사 장애와 같은 대사 상태 또는 장애를 포함한다.

적용 시, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 비만과 같은 장애 또는 상태는 본원에 기재된 바와 같은 이중 기능 단백질 변이체를 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효 용량의 양으로 투여함으로써 치료될 수 있다. 투여는 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 IV 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 또는 정제 또는 액체 형성 형태로 경구로 수행할 수 있다. 대부분의 상황에서, 목적 투여량은 본원에 기재된 바와 같이 임상의가 결정할 수 있고, 이중 기능 단백질 폴리펩티드의 치료 유효 용량을 나타낼 수 있다. 이중 기능 단백질 폴리펩티드의 치료 유효 용량이 특히 투여 계획, 투여되는 항원의 단위 용량, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 다른 치료제와 조합되어 투여되는지의 여부, 수용자의 면역 상태 및 건강에 따라 달라질 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효 용량"은 연구원, 의사, 또는 다른 임상의가 조사하는 조직계, 동물 또는 인간에서 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 포함하는 생물학적 또는 의약 반응을 유도하는 이중 기능 단백질 폴리펩티드의 양을 의미한다.

제약 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 이중 기능 단백질 또는 본원에 기재된 돌연변이체 중 하나 이상 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되고; 주사 전 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 리포솜은 제약상 허용되는 담체의 정의 내에 포함된다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 또한 제약 조성물 내에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제에 대한 자세한 논의는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins]에서 이용가능하다.

융합 단백질 및 펩티드성 화합물

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 본 발명의 아미노산 서열의 이중 기능 단백질로부터 유래된 융합 단백질 또는 펩티드성 화합물로 제조될 수 있다. 이러한 융합 단백질 및 펩티드성 화합물은 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 펩티드성 화합물은 표준 펩티드 합성 기술을 이용하는 화학적 합성에 의해 제조된 후, 펩티드를 세포 내로 도입하기 위한 당업계에 공지된 다양한 수단 (예를 들어 리포솜 등)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질 또는 펩티드성 화합물의 생체 내 반감기는 펩티드 변형, 예컨대 본 발명의 이중 기능 단백질 내로의 N-연결된 글리코실화 부위의 부가, 또는 예를 들어 리신-모노PEG화 또는 시스테인-모노PEG화를 통한 본 발명의 이중 기능 단백질의 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG; PEG화)에 대한 접합을 형성함으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 기술은 치료 단백질 약물의 반감기를 연장하는데 유익한 것으로 입증된 바 있다. 본 발명의 단백질의 PEG화는 유사한 제약상 이점을 유발할 수 있을 것으로 예상된다.

또한, PEG화는 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 부분에서 비-천연 아미노산의 도입에 의해 달성할 수 있다. 특정 비-천연 아미노산은 문헌 [Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004] 또는 미국 특허 번호 7,083,970에 기재된 기술에 의해 도입할 수 있다. 간단히 설명하면, 이들 발현 시스템의 일부는 넌센스 코돈, 예컨대 앰버 TAG를 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 내로 도입하기 위한 부위-지정 돌연변이유발을 포함한다. 이어서, 도입된 넌센스 코돈에 특이적이며 선택된 비-천연 아미노산이 충전된 tRNA를 이용할 수 있는 숙주 내로 이러한 발현 벡터를 도입한다. 본 발명의 폴리펩티드에 모이어티를 접합하는 목적에 유익한 특정 비-천연 아미노산은 아세틸렌 및 아지도 측쇄를 갖는 것을 포함한다. 이어서, 이들 새로운 아미노산을 함유하는 본 발명의 단백질을 단백질 내의 이들 선택된 부위에서 PEG화할 수 있다.

이와 유사하게, PEG화는 본 발명의 단백질의 임의의 부분에서 문헌 [Ou et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42. Epub 2011 Jun 13)]에 기재된 바와 같은 피롤리신 또는 피롤린-카르복시-리신의 도입에 의해 달성할 수 있다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 GLP-1/단백질의 설계

GLP-1 및 FGF21의 효능을 함께 시험하기 위해, 융합 분자를 설계하였다. 수용체 결합 및 활성화를 위해 GLP-1은 유리 N-말단을 필요로 하고 FGF21은 유리 C-말단을 필요로 하기 때문에, 이 둘을 N-GLP-1-링커-FGF21-C의 순서로 클로닝하였다. 초기 구축물은 GLP-1 잔기 7-35로 제조하였고, DPP-4 보호를 위한 N-말단에 대한 몇몇 변형 (하기 논의됨)은 포함하거나 포함하지 않았다. GLP-1의 추가의 변형 (점 돌연변이체 또는 결실)은 시험관내 효력에 의해 시험하고 점수매겼다.

3, 8, 10 또는 20개 아미노산의 링커를 클로닝하였다. FGF21에 대해서는, 야생형 인간 단백질의 잔기 33-209를 사용하였다. PEG화 부위를 갖거나 갖지 않는 구축물을 생성시켰다. PEG화는 도입된 Cys에 반응성인 말레이미드-PEG 시약 (40 kDa 선형 및 분지형 PEG)을 이용하여 달성하였다. Cys는 FGF21의 위치 R154 및 GLP-1 또는 엑센딘-4 및 링커 내의 몇몇 부위에 위치시켰다. 또한 구축물을 FGF21의 위치 R154 또는 GLP-1의 K34에서의 TAG (앰버) 코돈의 도입에 의한 Pcl, Pyl, Pyl 유사체 또는 반응성 비-자연 발생 아미노산의 혼입을 통한 변형에 대해 설계하였다. 추가의 구축물을 R154 또는 K34에서의 Cys의 포함 및 다른 부위에서의 Pcl, Pyl, Pyl 유사체 또는 반응성 비-자연 발생 아미노산의 혼입을 위한 TAG 코돈에 의한 2개의 상이한 변형에 대해 설계하였다. 구축물을 GLP-1 및 FGF21을 인간 항체의 Fc 도메인에 융합시켜 제조하였다. FGF21의 변이체 76 (V76) 서열을 융합 형태에 도입하였다.

융합체의 발현 및 정제: 특정 이중 기능 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 몇몇 제거가능한 도메인 (예를 들어, His6 태그 (서열 184로서 개시된 "His 6"), 또는 TEV-프로테아제 인식 펩티드를 갖는 His6 태그 (서열 184로서 개시된 "His 6"), 또는 His6-유비퀴틴 (서열 184로서 개시된 "His 6"), 또는 His6-Smt3 (서열 184로서 개시된 "His 6")을 갖거나 갖지 않는 NPro 또는 NPro 변이체) 중 하나에 대한 코딩 서열을 함유하는 벡터 내로 클로닝함으로써 융합 단백질을 이. 콜라이 내에서 전형적으로 발현시켰다. 벡터는 단백질 발현을 위한 mRNA 번역을 개시하는 유도성 프로모터, 예컨대 lac, T7 또는 아라비노스 프로모터를 추가로 포함하였다. 간단히 설명하면, 벡터를 DH10b-유래 이. 콜라이 세포 또는 BL21(DE3)-유래 세포로 형질전환하고, 표준 조건 하에 성장시키고, 배양 배지에 첨가한 0.2% 아라비노스 또는 IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 유도 후 3-4시간 째에 세포를 수확하고, 회전시키고, 동결시켰다. 펠릿을 음파처리에 의한 용해를 위해 해동하여 재현탁시키고, 원심분리에 의해 불용성 단백질을 단리하였다. 이어서 펠릿을 6M 구아니딘에 가용화시키고, 용해되고 정화된 단백질을 Ni-NTA 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 변성 완충제에 이어서 비-변성 완충제로 세척하고, 표준 관행에 따라 비-변성 완충제 중에 용리시켰다. 용출액을 완충제 교환하여 이미다졸을 제거하고, 태그의 제거를 위한 특이적 프로테아제 (예를 들어 TEV 프로테아제, 유비퀴티나제 Usp2, 또는 smt3의 특이적 제거를 위한 Usp1)에 의해 소화시키고, Ni-NTA에 의해 정제하였다. 융합 단백질-함유 분획을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한 후 PEG화 (전형적으로 NOF 선브라이트(Sunbright) GL2-400MA 40kDa 분지형 PEG 말레이미드에 의함)하였다. PEG화 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리하고, PBS에 넣고, 농축시키거나 또는 다양한 검정을 위해 저장하였다.

N-말단의 돌연변이에 의한 GLP-1의 보호: DPP-4에 의한 GLP-1의 N-말단의 프로세싱은 그의 주요 수용체에 대해 펩티드를 불활성화는 것으로 공지되어 있기 때문에, 문헌에 보고되어 있는 몇몇 돌연변이를 이 과정을 늦추기 위해 연구하였다. N-말단에 대한 여분의 글리신의 부가, Glu9의 Pro로의 돌연변이, 또는 Ala8의 Gly 또는 Ser로의 돌연변이를 갖는 구축물 모두를 GLP-1 활성의 세포-기반 검정에서 시험하였다. FGF21에 부착된 40kDa PEG를 갖는 FGF21에 대한 융합의 맥락에서, Ala8에서의 돌연변이는 다른 N-말단 변형보다 우수한 활성을 보유하여 (도 1a), A8S 돌연변이를 후속 설계에서 사용하였다. 또한, DPP-4-저항성 유사체, 엑센딘-4를 연장된 생체내 반감기를 갖는 대안적 모이어티로서 융합체에서 또한 시험하였다 (도 1b). 예를 들어 문헌 [J. Y. Ohet al. (2009) Bulletin of the Korean Chemical Society 30, 2471-2474; K. Adelhorst, (1994) JBC 269, 6275; B. D. Green et al. (2003) Biological Chemistry 384, 1543; J. C. Parkeret al. (1998) Journal of Peptide Research 52, 398; C. F. Deaconet al. (1998) Diabetologia 41, 271; R. Burcelinet al. (1999) Metabolism-Clinical and Experimental 48, 252; U. Ritzelet al. (1998) Journal of Endocrinology 159, 93]을 참조한다.

A8S 돌연변이를 또한 생체내 약동학적 특성에 대해 야생형 GLP-1과 비교하였다. 야생형 GLP-1 (V329)을 갖는 융합 단백질 및 GLP-1(A8S) 돌연변이 (V232)를 갖는 것을 래트에 1 mg/kg으로 정맥내 주입하였고, 혈청 수준을 투여 용액에 의해 생성된 표준 곡선에 대해 측정하였다. 인간 FGF21-반응성 ELISA 키트로 측정하였을 때, 분자들은 서로 및 동일한 크기 (40 kDa)의 PEG가 부착된 FGF21 단독과 유사하게 작용하는 것으로 나타났다 (도 2). GLP-1 활성의 반감기 연장을 측정하기 위해, C57BL/6J 마우스에 야생형 GLP-1 또는 GLP-1(A8S)을 갖는 동일한 2개의 이중 기능 단백질 변이체를 주입하였다. 둘 다 투여 후 식후 글루코스 수준을 급격히 저하시켰지만, GLP-1(A8S) 변이체는 투여 후 3일차에 경구 글루코스 내성 검사 (OGTT) 측정에서 더 높은 활성을 유지하였다 (도 3). 이들 데이터는 A8S 돌연변이는 융합체의 GLP-1 모이어티의 유효 반감기를 증가시키는 반면, FGF21 모이어티의 PK는 GLP-1의 부가에 의해 많은 영향을 받지 않음을 입증하였다.

GLP-1과 FGF21 사이의 펩티드 링커의 설계: 3, 8, 10 또는 20개 아미노산의 링커를 시험하였다. 상이한 링커를 갖는 변이체에 대해 활성에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았지만, 일부 융합체 맥락에서는 발현 수율에 차이가 존재하였다. 추가로, 구축물을 다양한 길이의 GLP-1 (8 내지 31개 잔기) 또는 엑센딘-4 (30개 이상의 잔기)로 시험하였고, GLP-1R 세포-기반 검정에서 시험관내 활성에 대해 시험하였다.

실시예 2: ob/ob 및 db/db 당뇨병 마우스 모델에서의 융합체의 시험.

FGF21은 제2형 당뇨병의 ob/ob 마우스 모델에서 혈액 글루코스 수준, 간 지질 수준 및 체중을 개선시키는 것으로 나타나있다 (T2D; 예를 들어 문헌 [A. Kharitonenkovet al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115, 1627; T. Coskun et al. (2008) Endocrinology 149, 6018; 및 E. D. Berglund et al. (2009) Endocrinology 150, 4084] 참조). 이와 마찬가지로, GLP-1 유사체는 이 유전적 마우스 당뇨병 모델에서 글루코스 조절, 베타 세포 기능 및 간 건강을 개선시키는 것으로 나타나있다 (문헌 [Gallwitz B., Glucagon-like peptide-1 as a treatment option for type 2 diabetes and its role in restoring beta-cell mass. Diabetes Technol Ther. 2005, 7:651-7]).

FGF21에 대한 GLP-1의 융합이 추가의 효능을 유발할지의 여부를 결정하기 위해, WT GLP-1 및 GLP-1(A8S) 버전을 동일한 40 kDa 분지형 PEG가 부착된 동등한 FGF21 분자 각각에 대해 시험하였다. 매주 2회 투여하는 2주 연구에서, FGF21(R154C)-PEG (V238) 및 GLP-1-FGF21(R154C)-PEG (V239)는 혈액 글루코스, 체중 및 간 건강 (알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 혈청 수준, 중량 및 외관에 의해 평가함)에 대해 유사한 효과를 나타냈다 (도 4). 글루코스 측정값은 제1 용량 후에 FGF21 단독보다 융합체에 대해서 더 빠른 개선을 나타냈다. 이 둘은 투여 후 1일 초과의 시점에 수렴하였으며, 이는 GLP-1에 기인한 추가의 이익이 FGF21 효능보다 짧게 유지됨을 시사한다.

GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235) 융합체는 또한 다른 화합물에 대해 사용된 1 mg/kg 대신에 0.2 mg/kg에서 유사한 효과를 나타냈다. 이 화합물은 일반적으로 투여 사이에서 보다 일관된 결과를 제공하였으며, 이는 GLP-1-FGF21(R154C)-PEG (V239)의 기복이 있는 작용에 비해 DPP-4-저항성이 효능의 전체적인 개선에 중요함을 시사한다. 또한, 1 mg/kg의 GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235)는 글루코스, 체중, ALT/AST 및 간 중량의 추가의 저하를 나타내는 것으로 관찰되었다.

개선된 효능이 개별 FGF21 및 GLP-1 화합물의 공-투여에 의해서도 반복될 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 추가의 연구를 수행하였다. 그룹 사이에 유사한 단백질의 투여를 이루기 위해, FGF21 C-말단으로부터 14개 아미노산이 제거된 도구 화합물을 제조하였다. 이 분자 (V253)는 FGF21 수용체 검정에서 적어도 1000x 덜 강력하였지만, GLP-1R 검정에서는 다른 융합체와 비교했을 때 동등한 효력을 보유하였고, 야생형 FGF21 활성을 억제할 수 없었다. 이 화합물은 FGF21 수준에 의해 평가할 때, 래트에서 다른 융합체와 유사한 약동학을 가졌다 (도 2).

ob/ob 마우스를 FGF21(V76)-PEG, GLP-1(A8S)-PEG (V253), 둘 다 함께, 또는 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG 융합체 (V272)로 처리한 4주 연구의 결과를 도 5에 나타냈다. 융합체는 식후 글루코스 AUC, OGTT 글루코스 AUC, 연구의 끝에서의 체중, 간 지질 함량 및 ALT 측정값 (모두에 대해 p-값 < 0.05)에 대해 개별 FGF21(V76)-PEG 및 GLP-1(A8S)-PEG 분자의 공-처리보다 유의하게 효과적이었다 .

인간 FGF21 및 GLP-1의 혈청 노출을 말단 혈청 샘플 내에서 검사하여 다양한 군에서의 노출을 확인하였다. 인간 FGF21은 모든 처리 군에서 검출되었고, 활성 GLP-1에서의 유의한 증가는 GLP-1 (A8S)-PEG (V253) 또는 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)로 처리한 모든 군에서 측정되었다. GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272) 군은 0.2 mg/kg FGF21(V76)-PEG 기와 유사한 수준의 인간 FGF21을 나타냈으며, 이는 개선된 효능이 동물에서 더 높은 융합체의 전신 축적에 기인하지 않음을 시사한다. GLP-1(A8S)-PEG (V253) 분자는 시험관내에서 완전 활성이었다 (표 8). 이들 데이터는 융합체의 효능은 단일 분자에 있는 모이어티 둘 다에 의존하였고, 예를 들어 세포 수준에서의 상승작용으로부터 이익을 얻었음을 입증한다.

GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272) 대 공-투여를 추가로 시험하기 위해, db/db 마우스에서 3개의 연구를 수행하였다. 각 연구에서, 수컷 db/db 마우스 (8-11주령)에 매주 2회 복강내 투여하였다. 초기 3주 연구에서, 이중 기능 단백질 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 동등 용량에서의 공-투여의 글루코스 저하와 대등하였고, 단일 물질 투여의 효능을 능가하였다. 이중 기능 단백질은 또한 우수한 체중 감소를 나타냈다.

제2의 2주 연구에서, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 25배 더 낮은 용량에서 FGF21(V76)-PEG와, 5배 더 낮은 용량에서 GLP-1(A8S)-PEG (V253)과 비교하여 유사한 글루코스 저하를 나타냈다. 또한, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 단독-요법 또는 공-투여 군의 최대로 효과적인 용량보다 더 유의하게 HbA1c를 저하시켰고, 더 유의하게 체중을 저하시켰다 (도 8, 표 2). 예상외로, 공-처리의 투여 비를 1:1보다 높게 변경하는 것은 관찰된 효능을 개선시키지 않았다 (표 2). 이는 동등한 수의 GLP-1 모이어티 및 FGF21 모이어티를 포함하는 이중 기능 단백질이 생체내 처리 동안 최적의 효능을 달성할 수 있음을 시사한다.

표 2. 치료 투여량

¹ p-값 대 비히클 < 0.05. ² p-값 대 공-처리 군 < 0.05

표 2는 2주의 투여를 포함하는 db/db 마우스 연구에서 이중 기능 단백질과 비교한 다양한 용량에서의 단독-요법 및 공-처리의 효능을 나타낸다. 보고된 값은 표준 편차를 갖는 8마리의 동물에서 이루어진 측정의 평균이다. 4주 연구에서, 수컷 db/db 마우스 (n=8)에 4주 동안 매주 2회 단독-요법, 공-처리 또는 이중 기능 융합 단백질을 투여하였다. 27일차에, 마우스를 공복상태로 만들었고, 모든 동물에 대해 혈액 인슐린 수준을 측정하였다. 연구의 끝에, 췌장 인슐린 내용물을 추출하여 측정하였다 (n=3). GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 10배 초과로 더 낮은 용량에서 글루코스 수준, HbA1c 및 체중에 대해 FGF21(V76)-PEG 또는 GLP-1(A8S)-PEG (V253) 단독과 동등하거나 또는 더 나은 효능, 및 공-투여의 최대로 효과적인 용량보다 개선된 효능을 갖는 0.1-1 mg/kg의 견실한 투여 반응을 나타냈다. GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 또한 GLP-1(A8S)-PEG (V253) 및 FGF21(V76)-PEG의 단일 또는 조합 처리보다 큰 정도로 혈청에서의 공복 인슐린 수준을 저하시키면서 췌장의 인슐린 함량을 증가시켰다 (도 7). GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)-처리 동물은 식후 글루코스, HbA1c 및 체중 숫자에서 마른 대조군 마우스에 근접하였다.

대사율 및 기질 이용을 추정하기 위해, 본 발명자들은 옥시맥스(Oxymax) 간접 열량측정법 시스템 (미국 오하이오주 콜럼버스 소재의 콜럼버스 인스트루먼츠(Columbus Instruments))을 사용하여 산소 소모 및 이산화탄소 생성을 측정하였다. 22-24℃의 주위 온도에서 12-시간 명/12-시간 암 주기를 갖는 챔버에 마우스를 수용하였다. VO₂ 및 VCO₂ 속도를 옥시맥스 시스템 설정 및 프로토콜 하에서 결정하였다. 시스템을 표준 기체 혼합물에 대해 보정하여 소모된 O₂ (VO₂, ml/kg/h) 및 생성된 CO₂ (VCO₂, ml/kg/h)를 측정하였다. 대사율 (VO₂) 및 호흡 교환 비 (RER) (VCO₂/VO₂의 비)를 72-시간 주기에 걸쳐 평가하였다. 계산된 RER 값은 비히클 또는 조합물 처리 군과 비교할 때, 융합 단백질로 처리한 동물이 특히 제2 용량 후 24-72시간 동안 지질 기질에 더 의존함을 나타냈다 (RER 값이 0.75-0.85에 근접함). 이 기간 동안, 비히클 및 조합물 처리 군은 0.9에 근접한 RER 값을 나타냈으며, 이는 에너지를 위한 더 많은 탄수화물 기질 이용 및 에너지 소비를 위한 더 적은 정도의 지질 기질 이용을 시사한다. 데이터는 융합 단백질 처리가 db/db 마우스에서 그의 체중 감소에 기여할 수 있는 지방산 산화의 증가를 야기하였음을 시사한다.

이중 기능 융합 단백질은, 조합물과 비교할 때, 생체내에서 개선된 베타-세포 기능을 나타냈다. 이중 기능 단백질 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272) 또는 GLP-1(A8S)-PEG (V253) + FGF21(V76)-PEG의 4회 투여 후, db/db 마우스에 글루코스 및 아르기닌을 경구로 투여하였다. 이중 기능 단백질-처리 군 (비히클보다 72% 더 낮음)의 글루코스 변동은 조합물-처리 군 (비히클보다 56% 더 낮음)보다 유의하게 더 낮았다. 실험 동안, 분비되는 인슐린의 양은 또한 조합물-처리 군 (비히클보다 122% 더 높음)보다 이중 기능 단백질-처리 군 (비히클보다 279% 더 높음)에 대해 더 높았다.

전반적으로, 도면 및 표, 뿐만 아니라 본원에 나타내지 않은 데이터는, 개별 GLP-1 및 FGF21의 조합물 (예를 들어 FGF21(V76)-PEG 및 GLP-1(A8S)-PEG (V253))과 비교할 때, 본 발명의 이중 기능 융합 단백질, 예를 들어 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)의 시험관내 및 생체내 당뇨병의 설치류 모델에 대한 대사 파라미터를 개선시키는 능력을 입증한다. 상기 개선된 파라미터 (본원에 사용된 바와 같은 "대사 파라미터")는 식후 글루코스 (AUC), 체중, 간 트리글리세리드, 혈장 HbA1c, 혈청 트리글리세리드 수준, 총 콜레스테롤 수준, 경구 글루코스 내성 검사 혈청 글루코스 측정값 (AUC), 공복 혈청 인슐린, 췌장 인슐린 함량 및 체지방률을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

실시예 3: FGF21 변이체로부터의 본 발명의 GLP-1/단백질의 설계.

본 발명자들이 본원에서 "변이체 76" 또는 "V76"으로 지칭한 하기 FGF21 변이체 서열로 융합체를 제조하였다:

FGF21(V76)-PEG는 Cys154를 통해 연결된 40 kDa 분지형 PEG 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이 (Q56E, D74H, Q82E, R105K, K150R, R154C, R159Q, S195A, 모두 전장 FGF21 단백질 서열 (NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1)에 대해 만들어진 것)를 특징으로 한다. 이 분자에 대한 임상 면역원성의 위험은 인간 T-세포 반응의 에피스크린(EpiScreen) 시간 경과 검정을 기초로 낮은 것으로 간주된다. 분자는 마우스 및 래트에서 30시간 초과의 혈청 반감기를 갖고, 1 mg/kg의 매주-2회 주입에 의해 ob/ob 마우스에서 글루코스 AUC를 유의하게 저하시킨다.

GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272) 분자를 3가지 용량 (0.05, 0.1 및 0.2 mg/kg)으로 GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG (V235) 융합체에 대해 시험하였다. 융합체 둘 다는 글루코스 AUC, 체중, 식품 섭취 및 ALT 저하에서 용량 반응을 나타냈다 (도 6). GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 일반적으로 동등하거나 더 나았고, 0.2 mg/kg 용량에서는 모든 파라미터에 대해 더 높은 효능을 나타냈다. GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 또한 0.1 및 0.2 mg/kg 둘 다에서 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤의 저하를 나타냈다. 이들 데이터를 기초로, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272) 분자는 초기 융합체와 유사하거나 또는 개선된 특성을 나타내고, 이는 추가의 연구 및 개발에 적합하다.

Ex4(1-30)-L20-FGF21(V76)-PEG (V277) 또한 글루코스 조절, 체중 및 지질 수준에 대한 ob/ob 2주 연구에서 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)와 유사한 효능을 나타냈다.

반감기 연장을 위한 PEG화 부위의 선택. 예를 들어 도 2에서 확인되는 바와 같이, PEG화를 사용하여 래트에서 측정된 바와 같은 분자의 반감기를 GLP-1에 대해 몇 분 또는 FGF21에 대해 1시간 미만에서 30시간보다 더 길게 연장하였다. 융합체의 2개의 모이어티를 PEG의 치환에 의해 조정할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해, FGF21 서열이 아닌 GLP-1 또는 링커의 서열에 여분의 시스테인을 갖는 일련의 구축물을 제조하였다. 이들 구축물을 GLP-1 및 FGF21 둘 다의 활성에 대해 세포-기반 검정에서 시험하였다. 실험은 PEG화가 어느 하나의 활성에도 크게 영향을 미치지 않는 융합 단백질 서열 내 위치의 스트레치를 밝혀냈다. 이 스트레치의 N-말단에서의 조심스러운 PEG 치환은 녹-다운 GLP-1 활성을 갖는 분자를 제조하는데 사용할 수 있는 반면, 링커 내의 치환은 녹-다운 FGF21 활성에 사용할 수 있다. 이러한 분자는 융합체의 효능을 조절하는데 있어서 (예를 들어 보다 낮은 효능 FGF21이 효과적인 수준으로 투여될 때 GLP-1 또는 엑센딘-4의 높은 효능이 불량한 치료 범위를 유발하는 경우) 유용할 수 있다.

이들 데이터를 기초로, GLP-1 (V273)의 K34C 또는 엑센딘-4 (V274)의 K27C에서의 PEG화를 갖는 융합체를 그의 서열이 하기와 같은 FGF21(V76-C154R)에 의해 제조하였다.

ob/ob 마우스에서의 2주 연구는, 새로운 융합체 (V273 및 V274)가 래트에서 이전의 융합체와 유사한 시험관내 효력 및 유사한 약동학을 나타냈지만, 생체내에서는 그만큼 효과적이지 않았음을 입증한다. 0.2 mg/kg에서, GLP-1 융합 변이체는 글루코스 또는 체중에 대한 유의한 효능을 나타내지 않았다. 엑센딘-4 융합 변이체는 비히클에 비해 ALT 및 체중의 유의한 저하 및 AST를 저하시키는 경향을 나타냈지만, 혈액 글루코스에 대해서는 유의한 효과를 나타내지 않았다. 이들 융합체가 보다 높은 용량에서는 효능을 나타낼 수도 있지만, FGF21 내 R154C에서 PEG화를 갖는 본래의 형태를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 이 예상치못한 차이가 대안적 위치에서의 PEG화에 의해 차단되는 융합체의 GLP-1(A8S)-FGF21(V76-154R)-PEG 버전의 특수한 특성을 나타내는 것인지, 또는 시험관내 검정을 위해 사용된 형질감염된 세포 상에서보다 천연 수용체 수준을 갖는 천연 세포 상에서 PEG가 GLP-1R 상호작용을 더 차단한다는 것과 같은 또 다른 설명이 존재하는지는 명확하지 않다.

실시예 4: 본 발명의 GLP-1/FGF21 단백질의 추가적 특성화.

본 발명의 GLP-1-FGF21-PEG 이중 활성 단백질을 추가로 최적화하여 순서를 정하고, 공-투여 모델보다 개선된 그의 효능에 대한 보다 완전한 인식을 얻기 위해, 융합체를 효능에 대해 ob/ob 모델에서 시험하였다. 이들은 더 길거나 또는 더 짧은 링커를 갖는 분자, 추가의 본 발명의 단백질 (이는 변이체 76 또는 개발 중인 추가의 변이체, 예컨대 추가의 또는 상이한 점 돌연변이, 삽입 또는 결실, 이량체화 분자, 대안적 PEG화 전략, 추가의 디술피드 가교를 갖는 분자, 상이한 발현 시스템으로 생성된 분자를 기초로 한 돌연변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않을 수 있음), 및 혈청 안정성 또는 활성을 개선시키기 위한 엑센딘-4 또는 GLP-1의 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 후보를 또한 인실리코(in silico) 면역원성 예측, 발현 수준, 및 최종 생성물의 질 (용해도, 응집 및 안정성과 관련됨)에 의해 필터링하였다.

당뇨병 및 비만의 치료에 대한 FGF21 및 GLP-1의 상승작용을 추가로 특성화하기 위해, 2개 분자의 상호작용 역학을 맵핑하고, 융합 단백질을 개별 모 분자의 최대로 효과적인 공-투여와 비교하였다. 이들 실험은 비만 및 체중 감소에 초점을 맞춘 모델 (래트 또는 마우스에서의 식이 유발 비만) 및 당뇨병의 측면에서 더 나은 모델, 예컨대 고혈당증, 이상지혈증 및 베타 세포 기능 장애인 것 (ob/ob 또는 db/db 마우스)에서 수행하였다. 본 발명의 이중 활성 단백질에 의해 달성되는 상승작용의 정도는 각각의 개별 분자, 둘의 상이한 비의 조합물, 및 융합체의 효능을 맵핑함으로써 추가로 결정할 수 있다.

1차 또는 불멸화 래트 도세포 및 1차 인간 도세포를 사용한 세포-기반 검정에서 세포 증식, 아폽토시스로부터의 보호, 및 예를 들어 제1형 당뇨병의 허용된 모델에서 본 발명의 이중 활성 단백질을 입증하는 기능에 대한 융합체의 효능을 평가하기 위해 시험을 수행하였다 (추가로 문헌 [Van Belle, T.L. et al. Drug Discovery today: disease models. 209 pp. 41-45] 참조). 바람직한 생체내 모델은 스트렙토조토신 (STZ)에 의한 췌장 절제; 독시시클린을 함유하는 식이의 보충에 의해 베타-세포를 파괴하여 디프테리아 독소의 표적화 발현을 유도시킨, 유전적으로 변형된 유도성 마우스 균주 (RIP-DTA)에서의 표적화 베타-세포 절제를 특징으로 하는 것; 또는 자가면역 메카니즘을 갖는 제1형 당뇨병의 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스 모델이다. 이들 모델에서, 베타-세포 보호를 평가하기 위한 예방적 투여 (특히 NOD에서) 뿐만 아니라 베타-세포 자극 및 증식을 평가하기 위한 시험접종-후 투여 (특히 STZ 및 RIP-DTA에서) 둘 다로 시험하는 것이 가능하다.

공-투여 요법과 비교한 본 발명의 이중 활성 단백질에 의해 달성되는 효능 상승작용의 메카니즘을 보다 완전하게 실현하기 위해 하기 실험을 수행하였다: 둘 다의 수용체 (GLP-1R; FGFR1(IIIc), 2(IIIc), 3(IIIc) 또는 4; 및 베타-클로토)로 세포 공-형질전환시킨 세포를 사용하여 수용체가 세포 표면에서 반대 신호를 강력하게 할 수 있는지를 결정할 수 있었다. 하류 신호 사이의 혼선은 둘 다의 수용체를 자연적으로 발현하는 세포 (예를 들어 베타 세포)에서 검출할 수 있다. 동물에서, 식품 섭취의 기여 (대응표본-식후 코호트에 의해 조사), 증가된 대사율 (클램프 및 대사 챔버 실험에서 조사), 및 다른 메카니즘을 보다 철저하게 조사하여 두 신호의 상승작용 효과에 대한 작용 방식을 명료하게 할 수 있었다. 주요 조직 (간, 췌장, 지방, 장, 심장, 대동맥, 뇌 등)의 유전자 발현 프로파일링을 또한 수행하여 융합 단백질의 특유한 신호전달을 명료하게 할 수 있었고, 이는 잠재적으로 그의 개선된 효능을 설명할 수 있다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)의 분화를 조절하거나 변형하는 본 발명의 이중 기능 단백질의 활성을 이해하기 위해 하기 실험을 수행하였다: MSC를 본 발명의 단백질 단독으로 또는 골형성을 유도하는 것으로 공지된 화합물 또는 화합물의 혼합물, 또는 지방생성을 유도하는 것으로 공지된 화합물 또는 화합물의 혼합물로 처리할 수 있고, 결과적인 골모세포-유사 세포 또는 지방세포-유사 세포로의 분화율을 측정할 수 있다.

실시예 5: Fc-융합 FGF21 변이체로부터의 본 발명의 GLP-1 및 엑센딘-4-함유 단백질의 설계.

구축물을 대안적 링커 (예를 들어 SGGGGSGGGGSGGGGSA (서열 138), GGGGS (서열 173), GG, 및 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 174)), FGF21 변이체, 및 GLP-1-관련 펩티드로 제조하였다. 전형적으로 Fc 도메인을 함유하는 이중 기능 단백질은 HEK293 세포에서 발현시켰다. 이들 융합체의 DNA 코딩 서열을, 분비를 위해 단백질을 지시하는 리더 펩티드를 코딩하는 서열을 함유하고, 추가로 목적 생성물의 mRNA 합성 및 단백질 발현을 촉진하는데 필요한 서열을 함유하는 벡터 내로 클로닝하였다. HEK293 세포를 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 이들 세포 배양물로부터의 배지를 수집하고, 여과하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용출액을 중성 pH로 맞추고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 이어서 생성물을 농축시키고, 다양한 검정을 위해 저장하였다. 변이체를 시험관내 활성에 대해 4개의 검정에서 시험하였다: GLP-1R을 통한 활성을 측정하기 위한, GLP-1R로 형질감염시킨 HEK293에서의 CRE-루시페라제 발현 유도 (표 3) 및 INS1E 세포에서의 글루코스 자극 인슐린 분비 (표 6); FGF21 활성을 측정하기 위한, 베타-클로토로 형질감염시킨 HEK293에서의 ERK 인산화 유도 (표 4) 및 3T3L1 세포에 의한 2-데옥시글루코스 흡수 (표 5). GLP-1(A8S) 및 15개 아미노산 링커를 갖는 변이체는 GLP-1 및 더 짧은 링커를 갖는 변이체보다 활성이었다. 시험된 모든 링커를 갖는 엑센딘-4 (1-39) 변이체는 활성이었다. 엑센딘-4 (1-30)-함유 변이체는 엑센딘-4 (1-39)-함유 구축물과 유사한 시험관내 효력을 가졌다. 엑센딘-4(1-39)의 탠덤 반복부를 갖는 변이체는 GLP-1-관련 펩티드의 단일 카피를 갖는 변이체만큼 강력하지는 않았다.

표 3. HEK293-GLP-1R-CRE-루시페라제 리포터 세포에서의 GLP-1R 활성화.

표 4. HEK293-KLB 세포에서의 FGF21 활성의 ERK 인산화 검정에서 측정된 활성.

표 5. 3T3L1 마우스 지방세포에서의 2-데옥시글루코스 흡수에서 측정된 활성.

표 6. INS1E 래트 인슐린종 세포에서 글루코스-자극 인슐린 분비 (GSIS)에 의해 측정된 활성.

8마리 ob/ob 마우스에 2주 동안 0.5 mg/kg으로 1주 2회 변이체를 투여하였다. 연구 동안 혈액 글루코스 및 체중을 측정하였고, 연구의 끝에 간 지질을 측정하였다. 하기 표 (표 7)에서 확인되는 바와 같이, 처리된 동물은 연령이 대응되는 비히클 처리된 동물과 비교할 때, 연구 전반에 걸쳐 감소된 글루코스, 더 낮은 체중, 및 더 낮은 간 지질을 가졌다.

표 7. 2주 동안 0.5 mg/kg으로 1주 2회 처리한 ob/ob 마우스의 결과 개요.

^* p-값 대 비히클 < 0.05

실시예 6: 수용체 약리 검정에서의 본 발명의 단백질의 추가적 특성화.

예를 들어 도 9에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 이중 효능제 단백질을 베타-클로토로 형질감염시킨 HEK293에서 ERK 인산화를 유도하는 그의 능력에 대해 다양한 형태의 FGF21 및 엑세나티드와 비교하였다. 10분 째에, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)로 처리한 세포는 FGF21(V76)-PEG + 엑세나티드로 처리한 세포와 비교할 때 더 높은 효력 및 총 ERK에 대한 포스포-ERK의 더 높은 최대 비율을 나타냈다. 더 높은 최대 포스포-ERK 신호는, 이중 기능 단백질 V272가 FGF21(V76)-PEG 분자와 비교할 때, 아마도 수용체와의 더 나은 상호작용 (예를 들어 N-말단 연장은 이중 기능 단백질이 수용체 결합 또는 활성에 대해 더 유리한 구조를 보유하도록 함)에 기인하여, FGFR1c/베타-클로토를 통한 신호전달에 대해 더 우수한 효능제임을 나타낸다.

선택 이중 기능 단백질을 인간 지방세포에서 포스포-ERK 신호전달을 유도하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 단일 기능 FGF21 분자 (V101)와 비교할 때, 이중 기능 단백질 V208, V209, V211, V14 및 V272는 ERK의 인산화 자극에 대해 더 강력했다. 이는 인간 세포이기 때문에, 현재까지 설치류에서의 활성에 대해 입증되어 온 것과 유사하게, 다른 FGF21 모방체를 포함하는 처리와 비교할 때 본 발명의 이중 기능 단백질이 인간 질환의 치료에서 고도로 활성일 것임을 또한 시사할 수 있다.

예를 들어 표 8 및 도 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 이중 효능제 단백질을 GLP-1R로 형질감염시킨 HEK293 세포 또는 GLP-1R, 베타-클로토 및 FGFR1c로 공-형질전환시킨 세포에서 GLP-1R을 통해 신호전달하는 그의 능력에 대해 엑세나티드, GLP-1 펩티드, 엑센딘-4(1-39)-L5-Fc (V201) 및 GLP-1(A8S)-PEG (V253)과 비교하였다. 세포를 30분 동안 화합물로 처리하고, cAMP 수준을 측정하였다. 표 8은 GLP-1R 및 FGF21 수용체 복합체 둘 다를 갖는 세포에서, 이중 효능제 단백질 (V272 및 V211)이 단일 효능제 (V253 및 V101) 단독 또는 엑센딘-4와의 조합물에서보다 높은 효력을 나타냈음을 보여준다. GLP-1R만 갖는 세포에서는, 단일 효능제 단독 또는 엑센딘-4와의 조합물에서의 효력이 이중 효능제 단백질의 효력과 동등하였다. FGF21 변이체 단독은 검정에서 불활성이었다.

표 8. 본 발명의 이중 기능 단백질로 처리한 세포에서의 cAMP 유도의 검정.

2개의 추가의 HEK293 세포주를 GLP-1R의 C-말단 및 베타-아레스틴에 대한 베타-갈락토시다제 단편의 상보성을 이용하는 디스커버엑스 패쓰헌더(Discoverx's PathHunder) 검정 형식에서 제조하여, 수용체 활성화 시의 아레스틴 동원을 측정하였다. 도 10a-10d는 단백질 또는 펩티드, GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272), 엑센딘-4(1-39)-L5-Fc-L15-FGF21(V103) (V211), GLP-1(A8S)-PEG (V253) 및 엑센딘-4(1-39)-L5-Fc (V201)을 갖는 1시간 인큐베이션한 세포는 베타-아레스틴의 동원에 대해 엑세나티드보다 덜 강력했고, 세포가 GLP-1R/FGFR1c/베타-클로토 또는 GLP-1R 단독을 함유했는지의 여부에 대해 작용에서는 차이가 없었음을 나타낸다.

본원에 제시된 수용체 약리학 연구는 본 발명의 이중 기능 단백질이 통상의 FGF21 및 GLP-1/엑세나티드 분자의 조합물 또는 공-처리와 비교할 때 활성 및 효능에서 우수할 것임을 시사한다. PEG화 이중 기능 단백질 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)는 FGF21(V76)-PEG 분자와 비교할 때 예상외로 포스포-ERK 유도에 대한 더 높은 효력 및 최대 신호를 나타냈다. 이들 데이터는 이중 기능 단백질이 다른 FGF21 변이체와 비교할 때 FGF21 신호전달에 대해 동등하거나 우수함을 나타낸다. 이와 마찬가지로, 이중 기능 단백질은 세포가 GLP-1 및 FGF21 수용체 둘 다를 발현할 때 GLP-1R의 cAMP 신호전달 하류에 대해 더 높은 효력을 나타냈다. 이들 특성은 수용체 간의 직접 상호작용 또는 간접 효과, 예컨대 2개의 수용체에 대한 결합력을 통한 국부 농도의 상승을 반영할 수 있다. 이들 관찰은 본 발명의 다른 실시예에서 제시된 바와 같이, 개별 GLP-1 및 FGF21 변이체의 공-처리가 이중 기능 단백질의 생체내 효능에 대등하기에 충분하지 않았던 이유를 설명할 수 있는 이중 기능 단백질의 개선된 활성에 대한 메카니즘을 시사한다.

실시예 7: 제1형 당뇨병 (T1D) 모델에서의 본 발명의 단백질의 특성화

RIP-DTA 트랜스제닉 마우스 (9-10주령)를 3일 동안 독시시클린으로 처리하여 제어된 베타-세포 절제를 유도하였다 (문헌 [Thorel et al., Nature 2010(464)1149-1154]와 유사함). 이어서, 마우스를 FGF21(V76)-PEG, FGF21(V76)-PEG + GLP-1(A8S)-PEG (V253) 또는 GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG (V272)로 1주 2회 3주 동안 처리하였다. 3개의 모든 군에서 처리된 동물은 연구 동안 더 낮은 기초 식후 수준을 나타냈다. 이중 기능 단백질 처리는 조합물 처리 (비히클로부터 55% 감소)에 비해 유의하게 더 낮은 글루코스 AUC (비히클로부터 64% 감소)를 유발하였다. 공복상태로 만든 후에, 마우스에 글루코스 볼루스를 주었고, 글루코스 변동을 측정하였다. 3개의 모든 처리는 비히클-처리 동물에 비해 혈액 글루코스 수준을 저하시켜, 조합물 처리에 대한 66%에 비해 이중 기능 단백질 처리는 76% 감소를 유발하였다. 모든 처리 군은 비히클에 비해 증가된 췌장 인슐린 함량을 가져, 이중 기능 단백질 처리는 조합 처리보다 76% 더 높은 인슐린 함량을 유발하였다.

NOD 마우스를 GLP-1(A8S)-FGF21(154C)-PEG (V235) 또는 GLP-1(A8S)-PEG (V253) + FGF21(154C)-PEG (V238)로 3주 동안 1주 2회 처리하였다. 2주 후에, 마우스를 공복상태로 만들고 OGTT를 위해 글루코스 볼루스를 주었다. 이중 기능 단백질-처리 마우스는 시험접종 동안 비히클에 비해 유의하게 더 낮은 공복 글루코스 (비히클의 ~60%) 및 글루코스 변동 (~45%)을 나타낸 반면, 조합물-처리 동물은 시험접종 동안 비히클-처리 동물에 비해 비히클과 유의하게 상이하지 않은 공복 글루코스 수준 (~70%) 및 유사한 글루코스 변동을 가졌다. 연구의 끝에, 이중 기능 단백질-처리 동물은 비히클보다 유의하게 더 낮은 기초 글루카곤 수준 (~50%)을 가진 반면, 조합물-처리 동물은 비히클과 유사한 수준을 가졌다.

실시예 8. 면역원성 예측 결과 - MHC-연관 펩티드 단백질체학 (MAPP) 및 T-세포 검정 결과.

mAb 및 다른 치료 단백질에 대한 항-약물 항체 (ADA)의 형성은 중증 면역 독성학적 반응, 예컨대 IgE-매개 아나필락시스성 반응 (문헌 [Chung et al. (2008) N Eng J Med, 358, 1109-17]) 또는 면역 복합체 질환, 예를 들어 혈관염, 사구체신염 (문헌 [Descotes and Gouraud (2008) Expert Opin Drug Metab Toxicol 4, 1537-49]) 뿐만 아니라 임상적 노출 및 효능의 감소를 잠재적으로 유발할 수 있다. 치료 단백질 PEG화 거핵구 성장 및 발육 인자 (PEG-MGDF) 및 에리트로포이에틴 (EPO; 에프렉스)으로 치료한 일부 환자에서는, 그들 각각의 내인성 대응부에 교차-반응성인 중화 ADA가 발생하여, PEG-MGDF에 의해서는 갖는 중증 혈소판감소증이, 에프렉스에 의해서는 순수 적혈구 무형성증이 유발되었다 (문헌 [Li et al. (2007) Blood 98, 3241-8; Casadevall et al. (2002) N Engl J Med 346, 469-75]). 따라서, 인간 시험 이전에 면역원성 위험을 평가하는 것이 중요하다. 면역원성 위험의 평가 및 임상 개발 단계를 위한 확실한 면역원성 위험 완화 계획의 마련은 변형된 비-인간 서열, 예컨대 본 발명의 대상인 FGF21 변이체를 함유하는 치료 단백질에 특히 중요할 것이다.

ADA의 형성은 2가지 이상의 상이한 방식으로 유도할 수 있다. T 세포-의존성 및 -비의존성 경로가 B 세포 활성화에 대해 기재되어 있다. 강력하고 높은 친화도의 IgG 반응은 T 세포-의존성이고, CD4+ T 헬퍼 세포 (TH 세포)의 관여를 필요로 한다. 면역 반응은 외래 항원에 대한 반응과 유사하다: 천연 TH 세포는 전문 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포 (DC)에 의해 특이적으로 활성화되고, 이는 다시 약물-특이적 B 세포의 활성화를 유도한다.

MHC-연관 펩티드 단백질체학 (MAPP) 검정은 전문 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포에 의해 프로세싱되는 HLA 클래스 II 연관 펩티드의 시험관내 확인을 포함한다. 항원 흡수, 프로세싱 및 제시 과정을 고려한다. 이 접근법에서는, 다양한 건강한 혈액 공여자의 미성숙 인간 단핵구-유래 DC를 활성화 자극물의 존재 하에 다양한 생물치료 약물 후보와 함께 의해 인큐베이션하였다. 생물치료 단백질로부터 유래한, 자연적으로 프로세싱되는 HLA 클래스 II-연관 펩티드를 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법에 의해 확인하였다 (문헌 [Kropshofer and Spindeldreher (2005) in Antigen Presenting Cells: From Mechanisms to Drug Development, eds. Kropshofer and Vogt, Wiley-VCH, Weinheim, 159-98]).

T 세포 검정은 전체 단백질 치료제의 면역원성에 대한 잠재적 위험을 평가할 수 있는 형식을 제공한다. T 세포 검정은 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 치료 단백질의 능력을 평가한다. HLA 클래스 II 반수체형의 광범위한 패널을 포함하는 건강한 혈액 공여자의 코호트를 사용하여, 정제한 치료 단백질을 시험관내 T 세포 증식 및/또는 시토카인 분비에 대해 시험하였다. 이 기술은 생체내 면역 반응을 유도하는 잠재력에 대해 단백질 변이체를 비교하는데 성공적으로 사용되어 왔고 (문헌 [Jones et al. (2004) J Interferon Cytokine Res. 24, 560-72.; Jones et al. (2005) J Thromb Haemost. 3, 991-1000]), 현재 승인된 모노클로날 항체의 상기 평가는 시험관내 관찰된 T 세포의 활성과 임상에서의 면역원성 사이의 어느 정도의 상관관계를 보여주었다 (문헌 [Perry et al. (2008) Drugs R D 9, 385-96]). 본 발명의 맥락에서는, 세계 인구를 대표하는 50명의 건강한 공여자 (HLA 동종이형 기준)의 코호트로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 FGF21 변이체와 함께 인큐베이션하고, 증식 검정 ([³H]-티미딘 흡수) 및 IL-2 시토카인 분비 (ELISpot)를 이용하여 T 세포 반응을 측정하였다. 후속적으로, CD4⁺ T 세포 반응의 빈도 및 규모의 분석을 수행하여 임상 면역원성의 위험을 평가하였다.

T 세포 및 MAPP 검정의 조합 사용은 인간 세포를 사용한 임상에서의 면역원성 위험 평가에 효과적인 방법을 제공한다. T-세포 검정에서 수지상 세포에 의해 제시되는 펩티드 수의 감소 및 반응 공여자 수의 감소를 유발하는 치료 단백질 후보에 대한 변형은 이들 단백질이 임상에서 더 낮은 면역원성 발생 위험을 부담하기 때문에 유리할 것이다. 면역원성을 감소시키는 것으로 기재된 단백질 변형의 예는 PEG화이다. 그러나, 감소된 면역원성이 PEG화에 의해 항상 발생하는 것은 아니다 (문헌 [Li et al. (2007) Blood 98, 3241-8]).

MAPP 검정에서, 시험된 모든 PEG화 GLP-1(A8S) 및 엑센딘-4 FGF21-융합 분자, 예컨대 V272 (PEG화) 및 V277 (PEG화), 및 Q55C, G148C 돌연변이를 함유하는 비-PEG화 Fc-FGF21 변이체 (V101, V103 및 V188)는 적은 수의 클러스터, 및 V76 (비-PEG화)과 비슷하고 야생형 FGF21 또는 V76 (비-PEG화)보다 짧은 펩티드 길이 변이체를 나타낸다. T 세포 검정에서, T-세포 반응의 빈도는 연구 코호트의 10% 미만이었고, 반응의 규모는 V272 (PEG화) 및 V277 (PEG화), 및 Q55C, G148C 돌연변이를 함유하는 비-PEG화 Fc-FGF21 변이체 (V101, V103 및 V188)에 대해 낮았다 (표 10). PEG 모이어티의 부재 또는 Q55C, G148C에서의 추가의 디술피드 결합의 부재는 야생형 FGF21 및 V76 (비-PEG화)에 의해 확인된 증가된 MAPP 및 T-세포 검정 반응에 기여할 수 있다 (표 9 및 표 10). MAPP 및 T-세포 검정으로부터의 결과를 기초로, 임상에서의 면역원성 발생 위험은 V76 (PEG화), V272 (PEG화), V277 (PEG화), 및 Q55C, G148C 돌연변이를 함유하는 비-PEG화 Fc-FGF21 변이체 (V101, V103, V188)에 대해 낮은 것으로 간주될 수 있다. 단백질에 대한 디술피드 결합의 부가가 그의 단백질분해 안정성을 증진시킬 수 있음은 공지되어 있고, Q55C, G148C 돌연변이를 함유하는 Fc-FGF21의 이 특성은 MAPP 검정에서 항원-로딩 성숙 수지상 세포에 의해 나타난 감소된 수의 펩티드에 기여할 수 있다.

또한, 비-PEG화 V76에 대한 검정에서의 증가된 MAPP 반응은 분자의 이량체화를 유발하여 항원 프로세싱 및 제시에 영향을 주는 유리 시스테인에 의해 설명될 수 있다. 이는 자유 시스테인이 도입된 야생형 FGF21이 동일한 이량체화 경향을 나타내고 펩티드의 증가된 제시를 유발한 관찰과 일치하였다. 추가의 PEG화 이중 기능 단백질, 및 Q55C, G148C 돌연변이를 함유하는 GLP-1(A8S)-Fc-FGF21 변이체 (V202, V203, V212, V213, V214, V215, V216, V218 등) 및 엑센딘-4-Fc-FGF21 변이체 (V196, V197, V198, V199, V206, V207, V208, V209, V210, V211 등) 또한 임상에서의 낮은 면역원성 발생 위험과 일치할 것인 MAPP 및 T 세포 검정 반응을 나타낼 것으로 여겨진다.

표 9. 야생형 FGF21, V76 (비-PEG화) 및 V76 (PEG화) 실험을 사용한 T-세포 검정 개요

표 10. V76 (PEG화), V272 (PEG화), V277 (PEG화), V101, V103 및 V188 실험을 사용한 T-세포 검정 개요

SEQUENCE LISTING <110> BOETTCHER, BRIAN R. CAPLAN, SHARI L. DANIELS, DOUGLAS S. HAMAMATSU, NORIO LICHT, STUART WELDON, STEPHEN CRAIG CELLITTI, SUSAN E. GEIERSTRANGER, BERNHARD HUBERT LOEW, ANDREAS <120> DUAL FUNCTION FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21 PROTEINS <130> PAT054621-US-NP <140> 13/626,207 <141> 2012-09-25 <150> 61/539,290 <151> 2011-09-26 <160> 188 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 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gattctgggc gtgaaaacca gccgttttct gtgccagcgt 360 ccggatggcg cgctgtatgg cagcctgcat tttgatccgg aagcgtgcag ctttcgtgaa 420 ctgctgctgg aagatggcta taacgtgtat cagagcgaag cgcatggcct gccgctgcat 480 ctgccgggca acaaaagccc gcatcgtgat ccggcaccgc gtggtccggc gcgttttctg 540 ccgctgccgg gtctgccgcc ggcactgccg gaaccgccgg gtattctggc cccgcagccg 600 ccggatgttg gtagcagcga tccgctgtct atggtgggtc cgagccaggg tcgtagcccg 660 agctatgcga gctaa 675 <210> 25 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp 35 40 45 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 50 55 60 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 85 90 95 Asp 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cagcctagag aacctcaagt gtatactctt ccgccctcac gcgaagagat gacgaaaaac 540 caagtgtcgc ttacgtgtct tgtcaaaggt ttctacccct cggacatcgc cgtagagtgg 600 gagtcgaacg gccagccgga gaacaactac aagaccacgc cccctgtctt ggatagcgac 660 ggatcgtttt tcctctactc gaaactcaca gtagataagt cccgatggca acagggtaat 720 gtctttagct gcagcgtgat gcacgaggcg cttcacaatc attacacaca aaaatcactg 780 tcgcttagcc cgggaaaggg ttcagattcg tcgcccctgt tgcagtttgg tggacaggtc 840 agacagcgct acctttacac ggatgacgcc tgccagacag aggcacacct cgaaatcaga 900 gaggacggta cggtcggggg tgcggccgat cagagccccg agtcgcttct ccagttgaag 960 gcccttaagc caggagtcat ccagattttg ggagtaaaga cctcacggtt tctctgtcag 1020 cgtccagatg ggacactgta cggctcattg catttcgatc ccgaagcgtg ctcgttccgg 1080 gagttgctgc ttgaggacgg atataacgtc tatcagagcg aagcgcatgg cctccccctt 1140 cacctcccgt gtaacaggtc gccgcatcgg gatccggcct cgaggggtcc cgcgagattt 1200 cttccgttgc ccgggttgcc tcccgcgctg cccgagcctc ccgggatcct cgcgccacag 1260 cctcctgatg tagggtcctc ggaccctttg gcgatggtag gtggatcaca agcacggtcc 1320 ccgagctatg catca 1335 <210> 34 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (161)..(161) <223> Any amino acid <400> 34 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 145 150 155 160 Xaa Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe 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agtttggcgg ccaggtgcgt 180 cagcgttatc tgtataccga tgatgcgcag cagaccgaag cgcatctgga aattcgtgaa 240 gatggcaccg tgggcggtgc ggcggatcag agcccggaaa gcctgctgca gctgaaagcg 300 ctgaaaccgg gcgtgattca gattctgggc gtgaaaacca gccgttttct gtgccagcgt 360 ccggatggcg cgctgtatgg cagcctgcat tttgatccgg aagcgtgcag ctttcgtgaa 420 ctgctgctgg aagatggcta taacgtgtat cagagcgaag cgcatggcct gccgctgcat 480 ctgccgggca acaaaagccc gcattgcgat ccggcaccgc gtggtccggc gcgttttctg 540 ccgctgccgg gtctgccgcc ggcactgccg gaaccgccgg gtattctggc cccgcagccg 600 ccggatgttg gtagcagcga tccgctgtct atggtgggtc cgagccaggg tcgtagcccg 660 agctatgcga gctaa 675 <210> 46 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 145 150 155 160 Cys Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln 195 200 205 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 210 215 <210> 47 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 catgcgccgg gcacttttac tagcgatgtt tctagctacc tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 tgcgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 48 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln 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acctggaagg ccaggctgcg 60 aaagaattca tcgcgtggct ggttaaaggc ggttctggtg gtggtggttc tggcggtggc 120 gactcgagcc cgctgctgca gtttggcggc caggtgcgtc agcgttatct gtataccgat 180 gatgcgcagc agaccgaagc gcatctggaa attcgtgaag atggcaccgt gggcggtgcg 240 gcggatcaga gcccggaaag cctgctgcag ctgaaagcgc tgaaaccggg cgtgattcag 300 attctgggcg tgaaaaccag ccgttttctg tgccagcgtc cggatggcgc gctgtatggc 360 agcctgcatt ttgatccgga agcgtgcagc tttcgtgaac tgctgctgga agatggctat 420 aacgtgtatc agagcgaagc gcatggcctg ccgctgcatc tgccgggcaa caaaagcccg 480 cattgcgatc cggcaccgcg tggtccggcg cgttttctgc cgctgccggg tctgccgccg 540 gcactgccgg aaccgccggg tattctggcc ccgcagccgc cggatgttgg tagcagcgat 600 ccgctgtcta tggtgggtcc gagccagggt cgtagcccga gctatgcgag ctaa 654 <210> 50 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 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<400> 51 cattctgaag gcacttttac tgctgatgct tctagctacc tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 tgcgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 52 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Ala Ala Ala Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cattctgaag gcacttttac tagcgatgct gctgcttacc tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 tgcgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 54 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 55 cattctgaag gcacttttac tagcgatgtt tctagctacg ctgaaggcgc tgctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 tgcgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 56 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 cacggagaag gcacctttac atcggacttg tcgaagcaga tggaggaaga agcggtgagg 60 ctcttcatcg agtggctcaa gaatggagga ccctcaagcg gagcgcctcc tccttccgac 120 aaaacccata catgtccgcc ttgtcccgca ccagaagcag cgggtgggcc ctcggtgttc 180 ctgttcccgc caaaaccgaa ggacacactt atgatttcac gcacaccgga agtgacttgc 240 gtcgtggtgg atgtatcgca cgaggacccc gaggtcaaat tcaactggta tgtcgatgga 300 gtggaggtgc acaatgcaaa gaccaagccg agggaagaac aatacaatag cacgtaccga 360 gtcgtgtccg tcttgacggt ccttcaccag gactggctga acggaaagga gtacaagtgc 420 aaagtgagca ataaggccct ccctgccccg attgagaaaa ccatttccaa ggccaaaggt 480 cagcctagag aacctcaagt gtatactctt ccgccctcac gcgaagagat gacgaaaaac 540 caagtgtcgc ttacgtgtct tgtcaaaggt ttctacccct cggacatcgc cgtagagtgg 600 gagtcgaacg gccagccgga gaacaactac aagaccacgc cccctgtctt ggatagcgac 660 ggatcgtttt tcctctactc gaaactcaca gtagataagt cccgatggca acagggtaat 720 gtctttagct gcagcgtgat gcacgaggcg cttcacaatc attacacaca aaaatcactg 780 tcgcttagcc cgggaaaggg ttcagattcg tcgcccctgt tgcagtttgg tggacaggtc 840 agacagcgct acctttacac ggatgacgcc tgccagacag aggcacacct cgaaatcaga 900 gaggacggta cggtcggggg tgcggccgat cagagccccg agtcgcttct ccagttgaag 960 gcccttaagc caggagtcat ccagattttg ggagtaaaga cctcacggtt tctctgtcag 1020 aaaccagatg gggcactgta cggctcattg catttcgatc ccgaagcgtg ctcgttccgg 1080 gagttgctgc ttgaggacgg atataacgtc tatcagagcg aagcgcatgg cctccccctt 1140 cacctcccgt gtaacaggtc gccgcatcgg gatccggcct cgaggggtcc cgcgagattt 1200 cttccgttgc ccgggttgcc tcccgcgctg cccgagcctc ccgggatcct cgcgccacag 1260 cctcctgatg tagggtcctc ggaccctttg gcgatggtag gtggatcaca agcacggtcc 1320 ccgagctatg catca 1335 <210> 57 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 cacggagaag gcacctttac atcggacttg tcgaagcaga tggaggaaga agcggtgagg 60 ctcttcatcg agtggctcaa gaatggagga ccctcaagcg gagcgcctcc tccttccgga 120 ggaggtgggt cgggcggtgg aggctccgga gggggaggga gcgacaaaac ccatacatgt 180 ccgccttgtc ccgcaccaga agcagcgggt gggccctcgg tgttcctgtt cccgccaaaa 240 ccgaaggaca cacttatgat ttcacgcaca ccggaagtga cttgcgtcgt ggtggatgta 300 tcgcacgagg accccgaggt caaattcaac tggtatgtcg atggagtgga ggtgcacaat 360 gcaaagacca agccgaggga agaacaatac aatagcacgt accgagtcgt gtccgtcttg 420 acggtccttc accaggactg gctgaacgga aaggagtaca agtgcaaagt gagcaataag 480 gccctccctg ccccgattga gaaaaccatt tccaaggcca aaggtcagcc tagagaacct 540 caagtgtata ctcttccgcc ctcacgcgaa gagatgacga aaaaccaagt gtcgcttacg 600 tgtcttgtca aaggtttcta cccctcggac atcgccgtag agtgggagtc gaacggccag 660 ccggagaaca actacaagac cacgccccct gtcttggata gcgacggatc gtttttcctc 720 tactcgaaac tcacagtaga taagtcccga tggcaacagg gtaatgtctt tagctgcagc 780 gtgatgcacg aggcgcttca caatcattac acacaaaaat cactgtcgct tagcccggga 840 aagggttcag attcgtcgcc cctgttgcag tttggtggac aggtcagaca gcgctacctt 900 tacacggatg acgcctgcca gacagaggca cacctcgaaa tcagagagga cggtacggtc 960 gggggtgcgg ccgatcagag ccccgagtcg cttctccagt tgaaggccct taagccagga 1020 gtcatccaga ttttgggagt aaagacctca cggtttctct gtcagaaacc agatggggca 1080 ctgtacggct cattgcattt cgatcccgaa gcgtgctcgt tccgggagtt gctgcttgag 1140 gacggatata acgtctatca gagcgaagcg catggcctcc cccttcacct cccgtgtaac 1200 aggtcgccgc atcgggatcc ggcctcgagg ggtcccgcga gatttcttcc gttgcccggg 1260 ttgcctcccg cgctgcccga gcctcccggg atcctcgcgc cacagcctcc tgatgtaggg 1320 tcctcggacc ctttggcgat ggtaggtgga tcacaagcac ggtccccgag ctatgcatca 1380 <210> 58 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe 1 5 10 15 Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln 20 25 30 Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln 65 70 75 80 Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala 85 90 95 Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln 100 105 110 Ser 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gagccagggt cgtagcccga gctatgcgag ctaa 594 <210> 62 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe 20 25 30 Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln 35 40 45 Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala 50 55 60 Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln 85 90 95 Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala 100 105 110 Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln 115 120 125 Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro 130 135 140 His Cys Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro 145 150 155 160 Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln 165 170 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 cactccgaag gaacattcac ttccgatgta agctcgtatt tggaagggca ggcggctaag 60 gagtttatcg catggttggt caaaggtggt ggaggtgggt cgggcggtgg aggctccgga 120 gggggaggga gcgacaaaac ccatacatgt ccgccttgtc ccgcaccaga agcagcgggt 180 gggccctcgg tgttcctgtt cccgccaaaa ccgaaggaca cacttatgat ttcacgcaca 240 ccggaagtga cttgcgtcgt ggtggatgta tcgcacgagg accccgaggt caaattcaac 300 tggtatgtcg atggagtgga ggtgcacaat gcaaagacca agccgaggga agaacaatac 360 aatagcacgt accgagtcgt gtccgtcttg acggtccttc accaggactg gctgaacgga 420 aaggagtaca agtgcaaagt gagcaataag gccctccctg ccccgattga gaaaaccatt 480 tccaaggcca aaggtcagcc tagagaacct caagtgtata ctcttccgcc ctcacgcgaa 540 gagatgacga aaaaccaagt gtcgcttacg tgtcttgtca aaggtttcta cccctcggac 600 atcgccgtag agtgggagtc gaacggccag ccggagaaca actacaagac cacgccccct 660 gtcttggata gcgacggatc gtttttcctc tactcgaaac tcacagtaga taagtcccga 720 tggcaacagg gtaatgtctt tagctgcagc gtgatgcacg 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tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt ttgtggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 80 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly 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81 cattctgaag gcacttttac tagcgatgtt tctagctacc tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttgtgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 82 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 catgcggaag gcacttttac tagcgatgtt tctagctacc tggaaggcca ggctgcgtgt 60 gaattcatcg cgtggctggt taaaggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcagcaga ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 gatcagagcc cggaaagcct gctgcagctg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 84 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr 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Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 145 150 155 160 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln 195 200 205 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 145 150 155 160 Cys Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 145 150 155 160 Cys Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 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gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 taggatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 96 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Any amino acid <400> 96 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 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cagcgtccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaacaa aagcccgcat 480 tgcgatccgg caccgcgtgg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctgtctatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 98 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 His Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg 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aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagaaaccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga tggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaaccg tagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcaggg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctggcgatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 100 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 100 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 His Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys 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cggtgcggcg 240 catcagagcc cggaaagcct gctggaactg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagaaaccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga aggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaaccg tagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcaggg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctggcgatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 102 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 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gcgcaggaaa ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 catcagagcc cggaaagcct gctggaactg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagaaaccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga aggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaaccg tagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcaggg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctggcgatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 104 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 104 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 His Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His 145 150 155 160 Arg Asp Pro Ala Pro Gln Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 210 215 <210> 105 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 cattctgaag gcacttttac tagcgatgtt tctagctacc tggaaggcca ggctgcgaaa 60 gaattcatcg cgtggctggt ttgtggcggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc 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atttcgatcc cgaagcgtgc 1080 tcgttccggg agttgctgct tgaggacgga tataacgtct atcagagcga agcgcatggc 1140 ctcccccttc acctcccgtg taacaggtcg ccgcatcggg atccggcctc gaggggtccc 1200 gcgagatttc ttccgttgcc cgggttgcct cccgcgctgc ccgagcctcc cgggatcctc 1260 gcgccacagc ctcctgatgt agggtcctcg gaccctttgg cgatggtagg tggatcacaa 1320 gcacggtccc cgagctatgc atca 1344 <210> 107 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 107 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 65 70 75 80 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 85 90 95 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 100 105 110 Val 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 109 catggtgagg gtacgtttac ttctgatctg tctaaacaga tggaagaaga agctgttcgc 60 ctgttcattg aatggctgaa aaatggtggt tctggtggtg gtggttctgg cggtggcgac 120 tcgagcccgc tgctgcagtt tggcggccag gtgcgtcagc gttatctgta taccgatgat 180 gcgcaggaaa ccgaagcgca tctggaaatt cgtgaagatg gcaccgtggg cggtgcggcg 240 catcagagcc cggaaagcct gctggaactg aaagcgctga aaccgggcgt gattcagatt 300 ctgggcgtga aaaccagccg ttttctgtgc cagaaaccgg atggcgcgct gtatggcagc 360 ctgcattttg atccggaagc gtgcagcttt cgtgaactgc tgctggaaga aggctataac 420 gtgtatcaga gcgaagcgca tggcctgccg ctgcatctgc cgggcaaccg tagcccgcat 480 cgtgatccgg caccgcaggg tccggcgcgt tttctgccgc tgccgggtct gccgccggca 540 ctgccggaac cgccgggtat tctggccccg cagccgccgg atgttggtag cagcgatccg 600 ctggcgatgg tgggtccgag ccagggtcgt agcccgagct atgcgagcta a 651 <210> 110 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 110 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 112 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Cys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 35 40 45 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr 50 55 60 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 65 70 75 80 His Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 85 90 95 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys 100 105 110 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 115 120 125 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Glu Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 130 135 140 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His 145 150 155 160 Arg Asp Pro Ala Pro Gln Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ala 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 130 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 20 25 30 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gln Ser Pro Glu Ser Leu 35 40 45 Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 50 55 60 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 100 105 110 His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gln Gly 115 120 125 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 130 135 140 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 145 150 155 160 Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 165 170 175 Ser <210> 131 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 174 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 175 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly 20 <210> 176 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 178 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 <210> 179 <211> 10 <212> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 188 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 20 25 30 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 50 55 60 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 100 105 110 His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly 115 120 125 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 130 135 140 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 145 150 155 160 Pro Leu Ala Met Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 165 170 175 Ser

Claims (27)

1. 서로 링커를 통해 부착되는, GLP-1 수용체 효능제, FGF21 수용체 효능제 및 Fc 도메인을 포함하고, N-말단-GLP-1 수용체 효능제-링커-Fc 도메인-링커-FGF21 수용체 효능제-C-말단의 배향을 갖는 이중 기능 융합 단백질로서,
   각 링커는 GS 링커이고, GLP-1 수용체 효능제는 엑센딘-4, GLP-1 변이체 및 엑센딘-4 유사체로부터 선택되며, FGF21 수용체 효능제는 하기 아미노산 서열 중 하나로부터 선택되는 것인 이중 기능 융합 단백질:
   서열 185 (V76), 서열 186 (V76 P199G), 서열 187 (V101) 및 서열 188 (V103).
2. 제1항에 있어서, GS 링커가 GS, SG, GGGGS (서열 173), (GGGGS)₃ (서열 8) 및 S(GGGGS)₃A (서열 138)로부터 선택되는 것인 이중 기능 융합 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GLP-1 수용체 효능제가
   - GLP-1 (서열 129) (7-35;A8S),
   - 엑센딘-4 (서열 7) (1-39), 및
   - 엑센딘-4 (서열 7) (1-30)
   로부터 선택되는 것인 이중 기능 융합 단백질.
4. 제1항에 있어서, 서열 36 (V209)의 아미노산 서열을 포함하는 이중 기능 융합 단백질.
5. 제1항에 있어서, 서열 134 (V211)의 아미노산 서열을 포함하는 이중 기능 융합 단백질.
6. 제1항에 있어서, 서열 135 (V214)의 아미노산 서열을 포함하는 이중 기능 융합 단백질.
7. 서로 링커를 통해 부착되는, GLP-1 수용체 효능제, FGF21 수용체 효능제 및 Fc 도메인을 포함하고, N-말단-GLP-1 수용체 효능제-링커-Fc 도메인-링커-FGF21 수용체 효능제-C-말단의 배향을 갖는 이중 기능 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애를 치료하기 위한 약제로서, 상기 대사 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성 또는 고혈당증이고,
   각 링커는 GS 링커이고, GLP-1 수용체 효능제는 엑센딘-4, GLP-1 변이체 및 엑센딘-4 유사체로부터 선택되며, FGF21 수용체 효능제는 하기 아미노산 서열 중 하나로부터 선택되는 것인 약제:
   서열 185 (V76), 서열 186 (V76 P199G), 서열 187 (V101), 및 서열 188 (V103).
8. 제7항에 있어서, GS 링커가 GS, SG, GGGGS (서열 173), (GGGGS)₃ (서열 8) 및 S(GGGGS)₃A (서열 138)로부터 선택되는 것인 약제.
9. 제7항 또는제8항에 있어서, GLP-1 수용체 효능제가
   - GLP-1 (서열 129) (7-35;A8S),
   - 엑센딘-4 (서열 7) (1-39), 및
   - 엑센딘-4 (서열 7) (1-30)
   로부터 선택되는 것인 약제.
10. 제7항에 있어서, 이중 기능 융합 단백질이 서열 36 (V209)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제.
11. 제7항에 있어서, 이중 기능 융합 단백질이 서열 134 (V211)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제.
12. 제7항에 있어서, 이중 기능 융합 단백질이 서열 135 (V214)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제.
13. 제7항에 있어서, 대사 장애가 비만인 약제.
14. 제7항에 있어서, 대사 장애가 제2형 당뇨병인 약제.
15. 제7항에 있어서, 대사 장애가 이상지혈증인 약제.
16. 제7항에 있어서, 대사 장애가 비알콜성 지방간 질환(NAFLD)인 약제.
17. 제7항에 있어서, 대사 장애가 비알콜성 지방간염(NASH)인 약제.
18. 제7항에 있어서, 대사 장애가 인슐린 저항성인 약제.
19. 제7항에 있어서, 대사 장애가 고인슐린혈증인 약제.
20. 제7항에 있어서, 대사 장애가 글루코스 불내성인 약제.
21. 제7항에 있어서, 대사 장애가 고혈당증인 약제.
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