CN108440668A

CN108440668A - Fgf21与igf-1的融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN108440668A
Application number: CN201710085047.6A
Authority: CN
Inventors: 吴燕燕; 崔文俊; 郭树华; 张佳春
Original assignee: Rui Yang (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Rui Yang (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-02-16
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2018-08-24

Abstract

本发明提供了一种FGF21与IGF‑1的融合蛋白。本发明的融合蛋白通过适当的接头肽段以最佳的融合形式进行融合，产生的融合蛋白成功地保留了各自的生物活性。本发明的融合蛋白特别的是从N端到C端依次含有人成纤维细胞21号生长因子21(hFGF21)、柔性肽接头(L)、人免疫球蛋白Fc片段、柔性肽接头(L)和类胰岛素一号增长因子(IGF‑1)。该融合蛋白在糖脂代谢等方面展示出比单独使用时更高的调控作用，增强了对代谢紊乱类疾病、心血管疾病、肝脏脂肪病变等类型疾病的治疗效果。同时又克服了单独使用时容易造成的副作用(如：骨质疏松、致癌风险等)。

Description

FGF21与IGF-1的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种FGF21与IGF-1的融合蛋白及其应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)，是一类由FGF基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，它们是在发展及成熟组织中均有表达的多肽，目前已发现至少22个的成员，其中心区域都含有同源性为30～70％的一段氨基酸序列，根据其序列同源性分析，目前FGF家族成员可分为7个亚族。FGF不止在纤维原细胞的生长中起作，也在形态发生、血管生成、肿瘤发生、创伤愈合、神经元存活、代谢调节及细胞分化等方面有重要作用。

FGF21是FGF家族的一个重要成员，与FGF19及FGF23构成的FGF的一个亚族。与其它亚族同源性较低，该家族作为内分泌因子参与多种生理过程，如：能量和胆酸代谢平衡，葡萄糖及脂肪代谢及磷酸和维他命D代谢平衡等。

FGF21是非典型的FGF，人的FGF21由209个氨基酸组成，包含了一段28个氨基酸的前导序列，与老鼠的FGF21的氨基酸序列具有大约75％同源性，与人类的FGF19及FGF23的氨基酸序列的同源性分别为35％和24％。FGF21是分泌型多肽，不依赖于肝素，作为一种调节糖、脂肪及能量代谢的激素，在肝脏、胰腺及白色脂肪组织中高表达，也是FGF家族中唯一主要在肝脏中表达的，能降低血糖，甘油三酯，胰高血糖素和果糖胺的浓度，改善胰岛β细胞的功能等，有望被广泛应用于人类II型糖尿病、肥胖、血脂异常、脂肪肝、肝癌、心血管疾病以及其它代谢紊乱疾病。

Inagaki等人用高脂低碳的食物喂养FGF21缺乏的转基因小鼠及对照正常小鼠的实验显示，30天连续喂养后，正常小鼠肝脏FGF21表达明显升高，转基因小鼠则急剧变胖，肝脏内出现脂肪堆积。恢复正常饮食后，正常小鼠的FGF21表达水平出现回落。结果显示高脂肪低碳水化合物条件导致机体代谢模式调整成消耗体内储存脂肪，将脂肪转运到肝脏中进行分解代谢。FGF21在此过程中扮演了重要的调节作用。Coskun和Xu连续两周将FGF21注射入高脂饮食导致的肥胖小鼠后，小鼠体重减低了20％，体内脂肪含量也出现下调，且与FGF21呈浓度依赖关系。在此过程中，能量摄取并未减少，但是能量消耗增加、脂肪利用及脂质代谢加快，肝脏脂肪含量降低，高血糖症状也有明显改善。Kharitonenkov及其研究组成员将FGF21注射到糖尿病恒河猴体内后发现，不仅空腹血糖和胰岛素水平明显下降，同时高密度脂蛋白胆固醇(HDL)提高了约30％，低密度脂蛋白胆固醇(LDL)则减少约10％，甘油三酯水平也减少了50％左右。该实验表明，FGF21可减少体重及全身脂肪，降低血脂水平并逆转肝脏脂肪变性。综上所述，FGF21对脂肪代谢和体重控制非常重要，表现出来有效治疗肥胖及脂肪肝的所必须的治疗学特征，提供了代谢调节因子效用方面新的思路。

Kharitonenkov等也发现，FGF21可刺激鼠3T3-L1脂肪细胞及人脂肪细胞，提高其葡萄糖吸收能力。与胰岛素刺激产生的快速作用不同，FGF21需要持续作用4小时以上才能到达相似效果。同样结果也在动物实验上得到体现。同时研究显示，任何剂量的FGF21均未导致健康鼠、糖尿病鼠及过表达FGF21的转基因鼠体重增加或低血糖症出现，提示FGF21通过不依赖胰岛素的途径来调节血糖。除了直接调节血糖水平外，FGF21还可通过改善胰岛β细胞的功能，保护其存活来实现血糖调节，治疗II型糖尿病。Wente等的研究显示，在大鼠胰岛和INS-1E细胞中，FGF21激活细胞外信号调节激酶ERK1/2和Akt信号通路，提高健康大鼠胰岛素mRNA及蛋白水平但并未增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌。FGF21能部分保护胰岛及INS-1E细胞免于糖脂毒性及细胞因子介导的凋亡作用。FGF21处理糖尿病啮齿类的胰岛及INS-1E细胞则增加了胰岛素浓度及葡萄糖诱导的胰岛素分泌。用FGF21处理正常或者db/db小鼠可降低血浆胰岛素浓度并改善葡萄糖清除速率；连续8周用FGF21处理的db/db小鼠则能使血糖水平恢复正常，增加血浆胰岛素浓度。对此小鼠的免疫组化实验显示，胰岛数量及胰岛分泌细胞数量均有显著增加。Kharitonenkov在肥胖恒河猴体内的实验则显示，注射外源FGF21能降低血糖浓度并且呈现浓度依赖性。同时对糖尿病恒河猴的实验则显示，FGF21能降低血浆白介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)、纤溶酶原激活剂抑制因子(PAI)-1水平而升高脂联素(adiponectin)水平。此外，研究表明FGF21刺激脂肪细胞摄取葡萄糖，对其它类型细胞则无此种作用，这种作用实际上相当于增强了胰岛素活性。肥胖小鼠注射FGF21后，脂肪组织葡萄糖转运蛋白1显著增加。在饮食诱导肥胖、低血糖和高甘油三酯水平情况下，FGF21对糖尿病鼠具有保护作用。在FGF21过表达的转基因小鼠中，出现了生长速度慢，低血糖及低甘油三酯，与年龄相关的II型糖尿病及胰岛增生及肥胖也没有出现。综上所述，FGF21能够维持血糖水平保持正常，降低甘油三酯及胆固醇水平，提高葡萄糖耐受量及胰岛素敏感性、提高胰高血糖素分泌、保护胰岛β细胞、促进胰岛素合成及调节血液循环中脂肪细胞因子等作用。FGF21起效作用慢，但持续时间长，不会引发低血糖。

研究表明，FGF21与受体复合物(β-klotho(KLB)及三种不同的FGF受体(FGFR1c,FGFR2c及FGFR3c)中的一种形成的受体复合物)的相互作用所介导的信号通路是其活性必须的。其中，KLB/FGFR1c形成的复合物是FGF21主要的功能受体。FGFR1c/KLB与FGF21引起细胞质内信号并通过Ras/MAP上调GLUT1表达，它能够维持对葡糖糖及脂肪的控制，增加胰岛素敏感性及β细胞功能，并且没有明显的副作用。激活FGF21信号通路可用于人类多种疾病的治疗，如II型糖尿病，肥胖，血脂异常及其它代谢疾病。近期有实验显示，FGF21能够将实验小鼠的寿命延长40％左右。耶鲁大学医学院Vishwa Dixit领导的团队对FGF21浓度提高的转基因小鼠进行了研究。该研究结果发现，增加FGF21浓度能防止老年小鼠胸腺的脂肪变性，从而增加胸腺细胞产生新T细胞的能力；而FGF21不足会加速老年小鼠胸腺的萎缩。

FGF21作为药物进行治疗目前存在体内半衰期短，效价低且不稳定的缺点。有实验显示FGF21可能会导致骨质疏松。

IGF(insulin-like growth factors)，类胰岛素生长因子，其结构与胰岛素类似，也被称为“生长激素介质”(即SM，somatomedins)，现在已知的包括IGF-1和IGF-2两种。作为生长激素产生生理作用过程中必须的一种活性蛋白多肽物质，可以促进生长，且对于糖、脂、蛋白质代谢和无机盐代谢必不可少。

类胰岛素一号增长因子(insulin-like growth factor 1,IGF-1)由70个氨基酸分子组成，含有三个分子内部的二硫键的活性蛋白多肽物质，可通过内分泌、自分泌和旁分泌的三种途径产生。人体许多组织，如肾脏、脑、肺等都可以合成并分泌IGF-1，但在正常机体内主要由肝脏合成，主要存在于血液中。IGF-1在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义，是最基本的维持人体年轻的生长因子之一。IGF-1对人体有广泛的生物学效应，如：降血糖，降血脂，舒张血管，促进骨的合成代谢保持其正常结构功能，促生长，促细胞分化及创伤修复，增加肌肉量，有助于修复神经的损害，维持神经系统的正常功能，增加免疫功能等。IGF-1在体内的半衰期长达20h。

IGF-1作为药物开发存在表达难的缺点，且由于其具有促进细胞生长及抗凋亡的作用，推测其可能提高癌症的发生，目前有部分实验显示血液中游离IGF-1的上升与部分癌症相关。。

综上所述，FGF21蛋白与IGF-1蛋白在代谢紊乱类疾病中具有相同或类似的功能，如降血糖、降血脂等，利用两个蛋白的协同作用可加强对肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝及其它相关疾病的治疗。同时，利用IGF-1与FGF21在生长发育方面的不同作用及FGF21的相对严格的组织特异性，此两种蛋白的联用亦有可能减低单独使用时的致癌、骨质疏松、发育迟缓等副作用。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种疗效好、副作用小且半衰期长的FGF21蛋白或其突变体与衍生物和IGF-1蛋白或其突变体与衍生物的融合蛋白。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

根据本发明的第一方面，提供一种FGF21与IGF-1的融合蛋白，所述融合蛋白包含成纤维细胞21号生长因子(FGF21)肽段或其突变体与衍生物以及类胰岛素一号增长因子(IGF-1)肽段或其突变体与衍生物。

优选地，该融合蛋白包含FGF21肽段或其突变体与衍生物、IGF-1肽段或其突变体与衍生物以及用于连接的肽接头。该肽接头是柔性肽接头。

FGF21肽段包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其突变体与衍生物。IGF-1肽段包含由SEQ IN NO:2表示的氨基酸序列或其突变体与衍生物。人免疫球蛋白Fc片段包含由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。FGF21肽段或其突变体与衍生物、IGF-1肽段或其突变体与衍生物以及人免疫球蛋白Fc片段通过肽接头进行连接。

更优选地，融合蛋白从N端到C端依次包含FGF21肽段或其突变体与衍生物、肽接头(L)、人免疫球蛋白Fc片段、肽接头(L)和IGF-1肽段或其突变体与衍生物。

优选地，肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。

进一步优选地，肽接头的氨基酸组成的结构通式为((Gly)_a-Ser)_n，a和n都为大于等于0的整数，且a+n≥1。

具体地a为4，n为3，即肽接头的氨基酸的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。

根据本发明的第二方面，提供一种编码任一上述的融合蛋白的核酸分子。

根据本发明的第三方面，提供一种包含如上所述的核酸分子的表达载体。

根据本发明的第四方面，提供一种包含如上所述的表达载体的宿主细胞。

根据本发明的第五方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含任一上述的融合蛋白和药学可接受的载体。

优选地，该药物组合物用于治疗代谢紊乱疾病。

具体地，代谢紊乱疾病是肥胖、II型糖尿病、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、高胰岛素、高甘油三酯、高血压、血脂异常、肝脏脂肪病变、非酒精性脂肪肝、肝癌、心血管疾病、胰腺炎、神经病、胃轻瘫及其它代谢紊乱疾病。

根据本发明的第六方面，提供任一上述的融合蛋白在制备用于治疗代谢紊乱疾病的药物组合物中的应用。

本发明根据这两种蛋白的性质，采用两种蛋白联用的方式进行相关疾病的治疗。本发明采用适当的接头肽段，设计最佳的融合方式进行融合，产生的融合蛋白成功地保留了各自的生物活性。本发明的融合蛋白特别的是从N端到C端依次含有人成纤维细胞21号生长因子(human fibroblast growth factor，hFGF21)、肽接头(L)、人免疫球蛋白Fc片段、肽接头(L)和类胰岛素1号增长因子(insulin-like growth factor 1,IGF-1)。该融合蛋白在糖脂代谢等方面展示出比单独使用时更高的调控作用，增强了对代谢紊乱类疾病、心血管疾病、肝脏脂肪病变等类型疾病的治疗效果。同时又克服了单独使用时容易造成的副作用(如：骨质疏松、致癌风险等)。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的融合蛋白展现出良好的疗效，比单独使用的FGF21或者IGF-1展现出更好的治疗效果，同时克服了蛋白单独使用时半衰期短等的缺陷，与此同时，FGF21及其受体复合物的组织分布特异性消除了IGF-1的相关副作用，而IGF-1对骨骼生长等方面的效应则减轻了FGF21药用时产生的骨质疏松等缺陷。

具体实施方式

下述将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器做出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

FGF21和IGF-1

FGF21由208个氨基酸编码，包含了27个氨基酸的信号肽。人的FGF21与小鼠的FGF21具有约79％的同源性，与大鼠的FGF21具有约80％的同源性。人FGF21蛋白或其突变体是本发明中首选的融合蛋白模板，但是也可采用哺乳动物的FGF21多肽进行融合。本发明的FGF21多肽序列来源于成熟天然的181个氨基酸的人FGF21(SEQ ID NO:1)。

成熟人IGF-1由70个氨基酸分子编码，人的IGF-1与小鼠的IGF-1具有约64％的同源性，与大鼠的IGF-1具有约65％的同源性。人IGF-1蛋白或其突变体是本发明中首选的融合蛋白模板，但是也可采用哺乳动物的IGF-1多肽进行融合。本发明的IGF-1多肽序列来源于成熟天然的70个氨基酸的人IGF-1(SEQ ID NO:2)。

本发明中的FGF21或者IGF-1优选的是天然或野生型蛋白及其突变体和衍生物，更优选的是相应的天然或野生型蛋白以保证其生物活性，如在葡萄糖吸收等实验中展现的功能等。

天然或野生型FGF21和IGF-1，分别指181个氨基酸的FGF21和70个氨基酸的IGF-1，也指蛋白相应的等位基因产物。

FGF21和IGF-1的突变体指成熟的FGF21蛋白或者IGF-1蛋白至少发生一个氨基酸突变。通常而言，突变体拥有相对于野生型蛋白而言经过修饰改造的功能、结构或者特性。例如：突变体在溶液中具有更好的稳定性，不易形成聚集沉淀，同时又维持了其生物活性；或者，突变体能与药物制剂成分更好地相容，利于后期制成各种药物制品，该制品在储存期间能够保持药物生理化学特性及本身的生物学活性；又或者是，突变体糖基化程度减少，在维持其功能活性的同时保证了大规模生产时批次之间的一致性。本发明中的突变体所包含的突变不限于以上述及的各种定义，本发明的突变体指相对于野生型蛋白而言，其性质功能等各方面具有一个以上方面的改变。

FGF21或IGF-1的衍生物包含FGF21或IGF-1的衍生物，该衍生物包括FGF21或IGF-1的氨基酸序列或者类似物，同时包含分子侧链、α-碳原子及N端或者C端上的一个或多个化学修饰。化学修饰包括但不限于增加或者减少化学基团，产生新的键等。

氨基酸

氨基酸指广义氨基酸，包含自然或者非自然产生的氨基酸，包含突变体及衍生物。广义氨基酸具体包括，诸如自然产生的L-氨基酸和D-氨基酸，化学修饰后的氨基酸如突变体及衍生物；自然产生的如非原基因氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等；化学合成的具有氨基酸性质的化合物。非自然产生的氨基酸如：α-甲基化氨基酸，D-氨基酸，类组氨酸氨基酸，侧链包含多余亚甲基的氨基酸，侧链的羧基被磺酸基取代的氨基酸等。本发明中的氨基酸除非特别说明，首选天然产生的氨基酸。

氨基酸侧链基团上的修饰包括，但不限于：赖氨酸ξ-氨基的酰基化，精氨酸、组氨酸及赖氨酸的N-烷化，精氨酸及谷氨酸羧基的烷基化，谷氨酰胺及天冬酰胺的脱酰基化。N末端氨基酸的修饰包括，但不限于：N-低级脂肪醇、N-乙酰化修饰等。C末端氨基酸修饰包括，但不限于：脱酰化，低烷基酰胺等。此外，末端或者侧链基团是具有保护作用的普通蛋白化学基团。氨基酸的α-碳可以是单、双甲基化。

本发明中的氨基酸取代是基于侧链氨基酸的相似性，如亲水性、疏水性、电荷及大小等。此外，取代还可根据二级结构的倾向，如螺旋结构的氨基酸可以用能够维持螺旋结构的氨基酸取代。经典的取代需要考虑前述的许多特性以维持保证该取代是沉默替换，取代氨基酸可从同属于该类型的氨基酸的其它氨基酸选择。氨基酸可被分为四组：1)酸性氨基酸；2)碱性氨基酸；3)中性极性氨基酸；4)中性非极性氨基酸。

异源融合蛋白

本发明的异源融合蛋白指FGF21蛋白或其突变体和衍生物、IGF-1蛋白或其突变体和衍生物融合到人免疫球蛋白的Fc(包括Fc区域部分、类似物或者片段)、人血清白蛋白(包括蛋白、类似物或者片段)或具有延长血清半衰期或增加稳定性的化合物(如：包含但不限于PEG等)中形成的蛋白。其中，FGF21或其突变体和衍生物、IGF-1或其突变体和衍生物及Fc片段等直接连接成融合蛋白，或者通过接头肽段进行融合。

本发明尝试各种接头肽段及蛋白融合顺序，如：包含但不限于FGF21-Fc-IGF-1，IGF-1-Fc-FGF21，IGF-1-FGF21-Fc，FGF21-IGF-1-Fc等。这些异源融合蛋白具有生物学活性，并且相对于野生型蛋白具有更长的半衰期及稳定性。

本发明的融合蛋白具有比天然蛋白相当或者更高的生物活性。或者即便有些融合蛋白的生物活性比天然蛋白低，但是具有更长的半衰期、稳定性及更少的副作用。

本发明的融合蛋白包含糖基化位点。糖基化是一种在蛋白特定位点产生的添加糖基的化学修饰。糖基化能够保证成熟蛋白正确的电荷量、构象及稳定性，并且能将蛋白定位到细胞表面并分泌。更重要的是，糖基化影响蛋白体内的清除速率。糖基化包括N-糖基化及O-糖基化。O-糖基化发生在丝氨酸或者苏氨酸羟基氧原子上，而N-糖基化发生在天冬酰胺的酰基N原子上。N-糖基化的保守位点是Asn X1 X2，其中X1是除脯氨酸外的氨基酸，X2是丝氨酸或者苏氨酸。

本发明中与任何蛋白或者其片段、类似物、衍生物融合的融合蛋白应具有生物活性，并且具有比单独的FGF21或者IGF-1蛋白更好或者相当的半衰期。

本发明的异源融合蛋白包含在FGF21蛋白、IGF-1蛋白中及Fc片段的保守替代。所谓保守替代指的是替代的氨基酸与被替代氨基酸具有相似的电荷、形状及大小。带有脂肪族侧链或者脂肪族取代基团侧链的氨基酸在总的碳原子上的差别应少于4个。当其侧链区别不多于1时，具有相似形状。侧链基团含有苯基或苯基取代基团时，其形状及大小类似。除非特别说明，本发明中的保守替代均用天然的氨基酸产物。

本发明的融合蛋白及其突变体、类似物、衍生物等可用于治疗、诊断、改善、防止疾病，疾病的人数或者条件。包括但不限于代谢紊乱。在一个实施方案中的代谢紊乱为糖尿病的代谢紊乱，在另一个实施方案中是肥胖的代谢紊乱。其它条件或实施例包括代谢紊乱如脂质代谢障碍、高血压；肝脂肪病变，如非酒精性脂肪肝、肝癌等；心血管疾病如动脉粥样硬化和老化等。

本发明的融合蛋白适合通过非消化道给药，也可通过口服、鼻腔给药及吸入方式给药。非消化道给药包括诸如：全身用药、肌肉注射、静脉注射、皮下注射、腹腔注射等。该融合蛋白可以与适合的药剂载体、稀释剂或者赋形剂一起用于治疗疾病。药剂成分中的该融合蛋白可以是溶液或者悬浮液。药剂载体的选择可参看《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA)。用于非消化道给药的药物载体包括，如：无菌水、生理盐水、抑菌盐水、磷酸缓冲液、汉克溶液、林格乳酸盐水等。合适的赋形剂包括：乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇及盐藻糖等。

本发明的融合蛋白有可能制成适合给药的制剂，以保证蛋白在血浆中更长时间内保持有效。

FGF21/IGF-1融合蛋白的有效治疗剂量指的是该剂量在给药到病人体内后在不引起副作用的情况下产生期望的治疗效果或者预防效果。预期的治疗效果包括以下所述一种以上情况：1)疾病相关症状的减轻；2)疾病相关症状发生的延迟；3)与未治疗的情况相比寿命延长；4)与未进行治疗相比生活质量提升。如治疗II型糖尿病的有效剂量指与未进行治疗相比，该剂量使血糖浓度得到控制，从而延缓了糖尿病综合症的爆发，如视网膜病、神经病、肾病等。防止糖尿病的有效剂量指与未进行治疗相比，该剂量延迟了需要用抗高血糖药物进行治疗的血糖升高。此外，FGF21/IGF-1融合蛋白的有效治疗剂量与疾病的类型及严重程度及病人本身的特性，如健康状况、性别、年龄、体重及耐药性等有关。

包含本发明中的FGF21/IGF-1融合蛋白的药物组合物的有效治疗剂量由个体病人在医学实践及手术中的特点决定。本发明中的剂量一般为从0.01mg/kg到1000mg/kg，优选的剂量为0.1mg/kg到100mg/kg，更优选的剂量是1mg/kg到10mg/kg，最优选的是1-5mg/kg。

异源Fc融合蛋白

FGF21蛋白或其突变体和衍生物和IGF-1蛋白或其突变体和衍生物可以直接或通过接头多肽间接地融合到免疫球蛋白的Fc区域。免疫球蛋白是用二硫键连接的多肽链，通常含两条轻链及两条重链，每条链中含有一个依赖于抗体分子特异性的可变区(V区)，其它区域在同一类型分子中相对比较保守。

本发明中Fc区域为一般的免疫学领域里的定义。更具体地，指的是去除了两个抗原结合区域(Fab区域)的免疫球蛋白区域。去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白。Fc部分包含了通过非共价键及二硫键形成的来源于两条重链的恒定区的片段。Fc区域包括铰链区及CH2、CH3到抗体分子C末端的部分。在《Antibody Engineering,APractical Guide,Borrebaeck,C.A.K.,ed.,W.H.Freeman and Co.,1992》中可以找到典型的人或小鼠的铰链区。Fc区域可包含一个或更多的糖基化位点。包含了铰链区及CH2、CH3区域及82位N-糖基化位点的一个典型的Fc序列见SEQ ID NO:3。

本发明中，融合蛋白可包含适合的酸、碱或两者兼具的功能基团，可与一系列的非有机基碱、有机或者非有机酸形成盐。

免疫球蛋白的Fc区域

有5种具有不同功能及药动学性质的免疫球蛋白：IgG,IgA,IgM,IgD和IgE。IgG是血清中含量最丰富的免疫球蛋白，还是血清中半衰期最长的免疫球蛋白(半衰期为23天)。与其它免疫球蛋白不同，IgG可以通过与Fc受体结合进行再循环。IgG有四种亚型：G1,G2,G3和G4，分别具有不同的功能或者效应。这些不同的效应功能通常通过结合不同的Fc受体(Fcγ受体)、C1q或者固定补体实现。与FcγR结合产生抗体依赖的细胞毒性作用，与补体因子结合则引起补体依赖的细胞裂解作用。在设计仅仅利用Fc延长半衰期特点的融合蛋白时需要尽可能降低其效应功能。所有IgG亚型均能够结合Fc受体(CD16,CD32,CD64)，G1和G3的效应功能相对G2和G4更强。IgG的Fc受体结合区域位于铰链区及CH2的C端。

根据所需要的体内功能，本发明所采用的Fc区域包含上述的各种亚型，同时也包含对Fc区域的受体结合部位或者补体结合部位进行突变改造的Fc片段。因此，本发明的融合蛋白包括了融合到FGF21蛋白或其突变体和衍生物及IGF-1蛋白或其突变体和衍生物上的免疫球蛋白完整的Fc部分、Fc片段或者类似物。

本发明的融合蛋白包括一条肽链或者多条肽链。2个或者更多的Fc融合蛋白可以通过自然形成的二硫键相互作用而生成。多聚体可以是同源的或者异源的多聚物蛋白。

不论融合蛋白的最终结构，Fc或者类Fc区域用于延长融合FGF21蛋白或其突变体和衍生物及IGF-1蛋白或其突变体和衍生物的血浆半衰期。此外，融合的FGF21及IGF-1必须保持其生物活性。生物活性可用实施例中的体内或者体外实验验证。

本发明中异源融合蛋白的Fc片段首选人免疫球蛋白IgG1和IgG4的Fc区域。更优先的选择是采用人IgG4的Fc片段，该片段与天然Fc片段相比含1个或者更多的氨基酸取代。

优选人IgG4，主要是因为其相对于其它亚型与Fcγ受体及补体的结合能力较低。本发明一些实施例中与FGF21及IGF-1融合的人IgG4Fc片段的序列见SEQ ID NO:4。其中，第11位的Pro可以用Ser代替，第16位的Pro可以用Glu代替，第17位的Phe可以用Val或者Ala代替，第18位的Leu可以用Glu或者Ala代替，第80位的Asn可以用Ala代替，第230位的Lys可以缺失。

此外，本发明中的人IgG4Fc部分还包含以下一个或者多个氨基酸取代以消除效应功能：228位的脯氨酸或者丝氨酸取代；233位的脯氨酸或者谷氨酸取代；234位的丙氨酸、缬氨酸或者苯丙氨酸取代；235位的丙氨酸、亮氨酸及谷氨酸取代。(EU numbering,Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.U.S.Dept.of Health and Human Services,Bethesda,MD,NIH Publication no.91-3242)。对应于本发明序列SEQ ID NO:4的位点11、16、17和18。此外，通过297位(EUnumbering)的丙氨酸及天冬酰胺取代去除N-糖基化，对应于本发明序列SEQ ID NO:4的位点80。

本发明序列SEQ ID NO:4的位点230的赖氨酸可以被缺失。主要是由于有些宿主细胞中(NSO)，该位点有部分表达为赖氨酸，但是有部分会缺失。这是由于哺乳动物中的蛋白酶作用造成的，为了保持表达时的一致，会将改位点进行缺失突变。

融合

本发明中的蛋白融合方法首选FGF21-human IgG4Fc-IGF-1，蛋白不同肽段之间通过富含甘氨酸的接头肽段连接。异源融合蛋白的体内活性及稳定性可通过调节接头类型及长度调整。通过添加小肽段的接头可以去除不需要的结构域之间的相互作用，而富含甘氨酸的接头肽段可以提供融合蛋白更好的弹性，以保证融合蛋白与受体或者细胞的结合。但是，这些接头肽段会造成体内免疫原性。因此，该接头的选择应该保证其生物活性、稳定性，去除非必须的结构域结合。虽然多拷贝的接头肽段可以用于该融合蛋白，但是首选还是用单拷贝的接头蛋白减少长期及多次给药引起的免疫原性。

本发明融合蛋白中首选的接头肽段为：GGGGS GGGGS GGGGS

本发明中的融合蛋白可采用《分子克隆》(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY(1989))中的经典方法进行表达及分离。

本发明中的蛋白根据蛋白的生产步骤，可以采用《酶学方法》(Deutscher,Methodsin Enzymology 182:83-9(1990))和《蛋白质纯化：原理和实践》(Scopes,ProteinPurification:Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982))中的方法进行纯化。

本发明中的人IgG4蛋白可从多种途径获得。

编码融合蛋白的序列可通过将FGF21DNA序列及IGF-1DNA序列连接到阅读框中的人IgG4Fc片段产生。FGF21、IGF-1及Fc区域的突变可在连接前或连接成完整蛋白后进行。融合蛋白的FGF21、IGF-1及Fc区域可通过编码富含甘氨酸的接头肽段的序列相互连接。

实验对象及病症

实验对象指哺乳动物，首选人类。

葡萄糖耐受性指对葡萄糖的异常敏感性。

高血糖症指血液中存在过量葡萄糖。

低血糖症发生在血液中葡萄糖含量低于能够提供集体活动所需的水平。

高胰岛素症指血液中的胰岛素水平超出平常。

胰岛素对抗指胰岛素产生的生物效应低于通常情况下能产生的水平。

代谢紊乱综合症包含至少如下三个症状：腹部脂肪-大部分男性腰围大于等于40英寸；高血糖-节食之后110mg/dl；高甘油三酯-在血液循环中至少150mg/dL；低HDL-少于40mg/dl；血压130/85或更高。

实施例1：FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1融合蛋白的表达及纯化

FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1融合蛋白用哺乳动物细胞HEK 293F细胞进行表达。用商品化的真核表达载体pCDNA3.1构建FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1表达载体，在FGF21融合蛋白的N端加入IgGκ信号肽增强目标蛋白的分泌，在肽段FGF21的C端用与IgG4(Fc)肽段N端及IgG4(Fc)肽段C端与IGF-1肽段N端通过(GlyGlyGlyGlySer)₃接头进行连接。表达采用强启动子CMV进行，用PEI法时，用适量的DNA转染适当密度的HEK293F悬浮细胞进行表达。细胞在37℃，6％CO₂条件下在无血清培养基中培养。在转染后第6天左右进行收样。通常情况下，表达量应该在0.01～1000mg/L。哺乳动物细胞中的表达产生天然的FGF21肽段N端，HPIP，而不含Met。

将收集的FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1融合蛋白的表达上清用0.22μm的滤器过滤后，上样到用PBS(pH 7.4)预先平衡好的1ml的Protein A预装柱，用pH 3.3的柠檬酸盐缓冲液洗脱。收集到的目标蛋白用pH 9.0的1M Tris·HCl中和并透析到PBS(pH 7.4)的缓冲液中，最后用Millipore 10K超滤管离心浓缩并用0.22μm的滤器进行过滤除菌。蛋白浓度用A280方法进行测定并用SDS-PAGE鉴定纯度及大小。

MALDI及N端测序确认所得到的蛋白正确无误。

实施例2：FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1融合蛋白亲和力测定

将FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1蛋白通过氨基固定或者Fc片段捕获法固定在芯片上作为配体，将FGFR1c-beta-Klotho或者IGF1R作为分析物进行亲和力测定。测定采用HBS-EP+缓冲液，用30μl/min的流速进行实验。结合时间分别为300秒及600秒，FGFR1c-beta-Klotho浓度采用0,6.25,12.5,25,50,100,200nM进行，用10mM Glycine·HCl,pH 2.0再生。IGF1R浓度采用0,6.25,12.5,25,50,100,200nM进行，用10mM Glycine·HCl,pH 2.0再生。采用Biacore分析软件对数据进行分析，拟合模型采用“1:1结合(1:1Binding)”模型。

实施例3：FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1体外半衰期的测定

将融合蛋白与小鼠血浆混合，在相应的时间点取样放于4℃，待所有时间点的样品均取完后，用细胞培养基将样品稀释到一定浓度，并进行梯度稀释，用此稀释样品处理稳定转染beta-Klotho的HEK293细胞和稳定转染IGF-1R的HEK293细胞，并进行pERK ICW测定。

实施例4：FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1体内半衰期测定

将FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1融合蛋白通过腹腔注射小鼠体内，在不同时间点采血(2h,4h,8h,16h,24h,48h,72h,96h,120h,144h,168h)，样品放入预先用蛋白酶抑制剂处理过的EDTA管中，血浆在12000rpm下离心10分钟，用亲和层析(anti-human Fc)纯化融合蛋白。以完整的FGF21-IgG4(Fc)-IGF-1为对照，用LC-MS分析样品。

(ELISA方法：在不同取样时间点取样后，包被anti-IGF-1和anti-FGF21抗体，捕获融合蛋白，用anti-hFc抗体检测。样品浓度根据用含血清的稀释液所制定的标准曲线来计算。)

实施例5：FGF21-IgG4(Fc4)-IGF-1体外活性测定

5.1荧光素酶实验

用293T构建beta-Klotho与荧光素酶报道基因载体。用于测定的FGF受体是293T(人胚肾细胞)中表达的FGF受体的内源性水平。荧光素酶报道基因构建体包含编码GAL4-EK1的序列和含有5个串联拷贝的Gal4结合位点(5×UAS-Luc)的启动子驱使的荧光素酶报道基因。荧光素酶活性通过磷酸化Erk/ELK1来调节，并用于间接监控并用于定量FGF21活性。以PBS为阴性对照，野生型FGF21为阳性对照进行实验。

IGF-1活性测定则用HEK 293细胞系进行。以PBS为阴性对照，野生型IGF-1为阳性对照。用检测试剂盒测试。

5.2鼠3T3-L1脂肪细胞葡萄糖吸收实验

3T3-L1脂肪细(ATCC,Rockville,MD)用含10％的富含铁离子血清的DMEM生长培养基培养，细胞长满2天后，用含10％FBS,10μg/ml的胰岛素,1μM的类固醇,和0.5μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的分化培养基培养48小时，再用含10％FBS,10μg/ml胰岛素的分化后培养基培养14d。

用含0.2％BSA的预热到37℃的KRP缓冲液(136mM NaCl,4.7mM KCl,10mM NaPO4,0.9mM CaCl2,0.9mM MgSO4,pH 7.4)洗涤两次，用含0.2％BSA的Leibovitz’s L-15培养基在37℃空气中孵育2小时。用含0.2％BSA的预热到37℃的KRP缓冲液(136mM NaCl,4.7mMKCl,10mM NaPO4,0.9mM CaCl2,0.9mM MgSO4,pH 7.4)稀释融合蛋白、野生型FGF21、野生型IGF-1及PBS(一般采用100nM到30μM)，作用细胞24h。用含0.2％BSA的预热到37℃的KRP缓冲液洗涤两次，用含0.2％BSA的预热到37℃的KRP缓冲液(含渥曼青霉素(wortmannin)或者不含)在37℃空气中孵育30分钟。加入终浓度100nM的胰岛素孵育15分钟，最后4分钟时测定2-Deoxy-D-glucose的含量，非特异的吸收为用10μM细胞松弛素B处理的细胞的吸收值。测得值扣减掉非特异吸收后即为目标吸收值。蛋白浓度用Pierce的BCA法测定。

实施例6：FGF21-IgG4(Fc4)-IGF-1在小鼠体内活性测定

6.1融合蛋白对小鼠血糖水平的影响

融合蛋白通过腹腔注射到8周大的ob/ob小鼠中(Jackson Laboratory)，在单次注射后分别在0h、6h、24h、72h、120h、和168h取血，用一键式血糖仪(lifescan Inc,Milpitas,CA)测定血糖水平，将结果表达为相对于基线血糖水平(如在0小时)的血糖水平变化。以PBS为阴性对照，野生型FGF21及野生型IGF-1为阳性对照。

6.2融合蛋白对小鼠体重的影响

融合蛋白通过腹腔注射到8周大的ob/ob小鼠中(Jackson Laboratory)，在单次注射后分别在0h、6h、24h、72h、120h、和168h对体重进行监测。以PBS为阴性对照，野生型FGF21及野生型IGF-1为阳性对照。

实施例7：融合蛋白对小鼠肝脏影响

实验采用6周大雄性ob/+control小鼠和ob/ob C57BL/6J Lep(-/-)小鼠。小鼠在22℃，12h光/暗循环中用一般的饲料饲养。小鼠分成10只每组，包括(ob/+对照组，vehicle处理组(ob/ob-Vehicle)，IGF-1处理组(ob/ob-IGF-1)，FGF21处理组(ob/ob-FGF21)和融合蛋白处理组(ob/ob-IGF-1/FGF21))。ob/ob小鼠腹腔给药3周，每5天记录一次体重。纤维化实验中，6周大的ob/ob小鼠进行蛋氨酸和胆碱缺乏的饲料(#A02082002B；ResearchDiets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)，以普通饲料为对照，喂养4周。蛋氨酸及胆碱缺乏饲料喂养的小鼠同时进行四周的给药实验(vehicle，IGF-1，FGF21及融合蛋白)。在实验开始及结束后测量小鼠体重。小鼠肝脏切成小块并用液氮快速冷冻。组织切片用中性甲醛固定。

7.1葡萄糖及胰岛素耐受实验

小鼠节食16小时后按2g/kg或1g/kg腹腔注射葡萄糖。在0min,15min,30min,60min,90min and 120min用血糖仪(ACCUCHEK,Roche Diagnostics Corporation,IN)测试小鼠的血糖水平。

胰岛素耐受测试在小鼠节食6小时后进行，腹腔注射胰岛素(0.75U/kg；Humalog)后测定葡萄糖水平。

7.2间接热量测定

喂食普通饲料及进行给药测试的小鼠单独关进小室并可自由获得食物及水，用物理笼式系统(Physical cage system(Oxylet,Panlab,Cornella,Spain))测量O₂消耗、CO₂产生及能量消耗，用METABOLISM软件(2.2版本)分析数据，计算光/暗循环中的平均数据。用T检验计算p值。

7.3脂肪代谢及肝脏代谢功能分析

将小鼠麻醉并从心脏取血，血样在10,000rpm离心5min取上清。天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯及总胆固醇含量用Hitachi 7180自动分析仪和Wako试剂(Wako Pure Chemical Industries,Osaka,Japan)进行测定。血清及肝脏中TNF-α水平用ELISA测试(R&D Systems,Minneapolis,MN)确定。

7.4纤维素化分析

肝脏用10％中性甲醛固定并用石蜡包埋检测脂肪变性及炎症状况。切片用苏木素-伊红法(hematoxylin-eosin(H&E))和马松三色法(Masson’s trichrome)进行染色。10μm的冷冻切片用0.5％(v/v)油红O染色法(Oil Red O)在室温染色60min再用苏木素进行复染。石蜡切片用anti-8-OHdG抗体(#ab62623,Abcam)鉴定氧化损伤。免疫组化用anti-F4/80抗体(#ab6640,Abcam)作为一抗，二抗采用相应抗体，最后用DAB法显色。计算染色面积百分比。

7.5脂类过氧化反应

用TBARS测试试剂盒(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI,USA)测量硫代巴比妥酸反应水平检测脂类过氧化反应。肝脏组织用RIPA缓冲液重悬超声，4℃下2,000×g离心10min收集上清，加入SDS及显色试剂进行混合，煮30min。TBARS水平用分光光度计读数并用蛋白浓度进行归一计算。

7.6氧气消耗率测试

用Seahorse XF24分析仪(Seahorse Bioscience Inc.,North Billerica,MA,USA)测试24孔板中的细胞氧气消耗率。测试前18小时在每个孔中接种20,000-50,000细胞，OCR测定前一天，芯片用校准缓冲液在37℃无CO₂培养箱中校正。测量前，细胞用无碳酸氢钠的培养基在37℃冲洗并孵育。加入线粒体抑制剂(寡霉素(Oligomycin)(2μg/ml)，羰基氰化物间氯苯腙(carbonylcyanidem-chlorophenyl hydrazine,CCCP)(5μM)和鱼藤酮(rotenone)(2μM))后，进行读数。

7.7炎症反应

用胶原酶(0.8mg/ml)灌注法分离8周大的雄性C57BL/6小鼠肝细胞。分离的细胞用Percoll分层液进行密度梯度离心纯化并在Medium 199(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)中贴壁培养3h-6h后取出未贴壁细胞。用MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)来检测支原体污染。用anti-phospho-NF-κB p65(#3039)、anti-phospho-JNK1/2(#9255)、anti-phosphop38MAPK T180/Y182(#9211)、anti-p38MAPK(#9212)和anti-GAPDH(#2118)抗体作为一抗，羊抗小鼠(goat anti-mouse)和羊抗兔(goatanti-rabbit)(Cell signaling Techonology)作为二抗进行免疫荧光试验，用ODYSSEY扫描并用Image Studio数字软件(LI-COR Biosciences,NE)进行定量。

实施例8：FGF21-IgG4(Fc4)-IGF1融合蛋白在恒河猴体内活性测定

融合蛋白通过腹腔注射给药法处理雄性健康恒河猴(BMI>35)。每组10只恒河猴，WT FGF21、WT IGF-1及vehicle control作为对照组。

在试验前，先将恒河猴饲养42天进行驯化后，分成10只一组。采用双盲实验，多次注射融合蛋白、WT FGF21、WT IGF-1及vehicle control进行实验。其中WT FGF21每天注射一次，其余每星期注射一次。融合蛋白、WT FGF21、WT IGF-1每两个星期提高剂量(图1)。体重及摄食量在整个实验期间均进行监测。

在给药前进行两次口服葡萄糖耐受测试(OGTT)。一次测试用于根据曲线下面积及体重来平均分组，第二次耐受实验则用来确认第一次的分组。如果实验恒河猴在两次耐受实验中出现差异，此恒河猴不能用于动物实验。在每次给药期间的最后一天，各进行一次OGTT。

每周(包括给药前及药效清除阶段的三个星期)对节食的恒河猴进行取血，用于测定葡萄糖、胰岛素和甘油三酯以及残余药物水平。在给药前及给药后40min取脑脊液检测药物血脑穿透能力。

8.1体重测试

试验组WT IGF-1/WT FGF21/IGF-1-FGF21-IgG4(Fc)的三种给药剂量分别为0.1mg/0.1mg/0.3mg/kg、0.3mg/1mg/1mg/kg及1mg/1mg/5mg/kg。(理论上一般用等摩尔量的蛋白。)

在整个实验过程中进每周的体重测定，以给药前体重为基准，进行每周体重变化百分比的统计。

8.2胰岛素水平测试

节食的血浆胰岛素水平测试为每周采集一次血样，采集时间为过夜节食后或者是午餐后。此外，在最后一次给药后的21小时和5天各采集一次血样。

摄食的血浆胰岛素水平测试为最高给药量的第五、第六周。采集时间为融合蛋白给药后的第三天及WT FGF21和WT IGF-1最后一次给药后的2小时。

8.3口服葡萄糖耐受测试(葡萄糖及胰岛素)

给药后的三次OGTT按图1所示进行。第五次OGTT的胰岛素及葡萄糖水平测试在给药后第6个星期也即是最高浓度给药后第二个星期进行。此次血样采集时间为最后一次融合蛋白给药后7天及最后一次WT FGF21和WT IGF-1给药后21小时。血糖水平用血糖仪(ACCUCHEK,Roche Diagnostics Corporation,IN)测量。胰岛素耐受测试在节食6小时后，腹腔注射胰岛素(0.75U/kg；Humalog)后测定葡萄糖水平。

8.4甘油三酯水平测试

节食血浆甘油三酯水平每周进行一次。节食的血样采集时间为最后一次注射融合蛋白后5天及最后一次WT FGF21和WT IGF-1给药后21小时。摄食阶段的甘油三酯水平在每次融合蛋白给药后3天及WT FGF21和WT IGF-1给药后2小时进行。天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯及总胆固醇含量用Hitachi 7180自动分析仪和Wako试剂(WakoPure Chemical Industries,Osaka,Japan)进行测定。

8.5药物残余实验

取样时间点为融合蛋白给药前及最后一次给药后5天和WT FGF21或者WT IGF-1给药前及给药后5、12、19及26天。在最后一次给药后21小时也采集血样。采用静脉取血、利用Octet仪器进行融合蛋白参与量检测。将FGF21抗体固定至芯片表面，将血浆样品流经芯片后，再用IGF-1抗体检测被捕获的融合蛋白。用给药前的血浆样品稀释融合蛋白作标准曲线，根据标准曲线计算测试血浆中的药物残余量。

实施例9：骨质疏松效应

小鼠用高脂肪食物饲养4个月后，腹腔注射FGF21或融合蛋白((1mg·kg-1·d-1)或PBS对照)两周，最后一次注射之后将小鼠安乐死。用μCT、静态骨组织形态学法、动态骨组织形态学进行骨质分析。用Rat/Mouse PINP EIA试剂盒和RatLaps EIA试剂盒(Immunodiagnostic Systems)分别分析PINP和CTX-1骨髓MSC细胞在MSC培养基(MouseMesenCult Proliferation Kit,StemCell Technologies)中培养7天，然后在含10％胎牛血清(FBS)、5mMβ-甘油磷酸盐和100μg/mL抗坏血酸(矿化培养基)(GPAA mixture)的α-MEM培养基中进行分化培养9天。用固红紫色LB盐(fast red violet LB salt)鉴定成熟的成骨细胞。骨髓MSC细胞在含10％FBS、地塞米松(1μM)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,0.5mM)和胰岛素(5μg/mL)(DMI mixture)的α-MEM培养进行分化培养2天，再用含10％FBS和胰岛素(5μg/mL)的α-MEM培养基培养4天。用脂肪细胞ORO染色法鉴定成熟的脂肪细胞。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 瑞阳(苏州)生物科技有限公司

<120> FGF21与IGF-1的融合蛋白及其应用

<130> 171S010281

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 2

<211> 70

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

1 5 10 15

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

35 40 45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

50 55 60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala

65 70

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Glu Lys Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Lys Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 4

<211> 230

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Gly Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

Claims

1.一种FGF21与IGF-1的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含成纤维细胞21号生长因子(FGF21)肽段或其突变体和衍生物以及类胰岛素一号增长因子(IGF-1)肽段或其突变体和衍生物。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含FGF21肽段或其突变体和衍生物、IGF-1肽段或其突变体和衍生物以及用于连接的肽接头(L)。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端依次包含FGF21肽段、所述肽接头(L)、人免疫球蛋白Fc片段、所述肽接头(L)和IGF-1肽段,

和/或，

所述肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述肽接头的氨基酸组成的结构通式为((Gly)_a-Ser)_n，a和n都为大于等于0的整数，且a+n≥1。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述肽接头的氨基酸的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。

6.一种编码根据前述任一项权利要求所述的融合蛋白的核酸分子。

7.一种包含根据权利要求6中所述的核酸分子的表达载体。

8.一种包含根据权利要求7中所述的表达载体的宿主细胞。

9.一种用于治疗代谢紊乱疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-6中任一所述的融合蛋白和药学可接受的载体，所述代谢紊乱疾病是肥胖、II型糖尿病、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、高胰岛素、高甘油三酯、高血压、血脂异常、肝脏脂肪病变、非酒精性脂肪肝、肝癌、心血管疾病、胰腺炎、神经病、胃轻瘫及其它代谢紊乱疾病。

10.根据权利要求1-6中任一所述的FGF21或其突变体和衍生物与IGF-1或其突变体和衍生物的融合蛋白在制备用于治疗代谢紊乱疾病的药物组合物中的应用，所述代谢紊乱疾病是肥胖、II型糖尿病、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、高胰岛素、高甘油三酯、高血压、血脂异常、肝脏脂肪病变、非酒精性脂肪肝、肝癌、心血管疾病、胰腺炎、神经病、胃轻瘫及其它代谢紊乱疾病。