CN104394882B - 成纤维细胞生长因子21蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药理学有效的和稳定的人成纤维细胞生长因子21(FGF21)的蛋白质,含有FGF21蛋白的药物组合物,以及使用这类蛋白质治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的方法。
Description
本发明涉及成纤维细胞生长因子21(FGF21)蛋白质,含有FGF21蛋白的药物组合物,以及用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的方法。
FGF21是一种激素,其作为葡萄糖和脂质内稳态的重要代谢调节物发挥作用。通过上调GLUT1表达,FGF21促进脂肪细胞中的葡萄糖摄取,其机制不同于胰岛素。在糖尿病啮齿动物和猴子中,人FGF21降低葡萄糖空腹血清浓度,并降低甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素的空腹血清浓度。此外,在饮食诱导的肥胖啮齿类动物模型中,施用FGF21导致累计体重呈剂量依赖性丧失。因此,FGF21具有用于治疗糖尿病、肥胖、异常脂血症、代谢综合征的潜在效用。
在WO2010/042747、WO2010/285131和WO2009/149171中已经描述了FGF21蛋白。
与人野生型FGF21和已知的FGF21蛋白相关的问题是分子的短的体内半寿期、低的效力和/或药物不稳定性。因此,仍然需要一种长期作用的、有效和/或稳定的替代性FGF21蛋白。
本发明提供了替代性的FGF21蛋白。本发明的某些FGF21蛋白具有人野生型FGF21和本领域公开的已知的FGF21蛋白没有的优点。这些优点包括具有延长的半寿期、改善的效力和/或改善的药物稳定性。除改善的效力外,本发明的某些FGF21蛋白具有一种或多种有利的稳定性特征,这些特征对作为治疗性蛋白质的有效制备和/或配制是有用的,包括在体内降低的蛋白质水解降解、降低的对氧化的易感性、减少的在高浓度聚集的倾向、降低的在哺乳动物细胞系统中生产期间的翻译后修饰和蛋白水解水平、和/或改善的化学稳定性。另外,本发明的FGF21蛋白对2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的治疗具有潜在的作用。
本发明提供了FGF21蛋白,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含IgG4Fc部分,其中Fc部分由抗体的铰链区、CH2和CH3恒定区结构域组成,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
此外,本发明提供了这样的FGF21蛋白,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
本发明还提供了这样的FGF21蛋白,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的接头与第二多肽的N-末端融合。
本发明提供了这样的FGF21蛋白,其中氨基酸序列是
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDD AQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDG ALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPA RFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDNO:5).
上述SEQIDNO:5的FGF21蛋白包括SEQIDNO:14的IgG4Fc部分,表示为粗体的SEQIDNO:11的接头序列,下划线的SEQIDNO:1的FGF21蛋白。
此外,本发明提供了这样的FGF21蛋白,其中氨基酸序列是
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREX1LX2EDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLX3SPSFX4X5(SEQIDNO:15)
其中X1是L或D,X2是L或K,X3是R或L,X4是L或E,且X5是G或空缺。本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白,其中X1是D,X2是L或K,X3是L,X4是L,且X5是G。此外,本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白,其中X1是L或D,X2是L或K,X3是R,X4是E,且X5空缺。
本发明提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。此外,本发明提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。最优选的FGF21蛋白是SEQIDNO:5。
本发明还提供了药物组合物,其包含本发明的FGF21蛋白、和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了治疗患者2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的方法,包括向所述患者施用本发明的FGF21蛋白。
本发明还提供了治疗患者2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的方法,包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
进一步地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白用于治疗。优选地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征。
进一步地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白在制备用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的药物中的用途。
本发明还涉及编码上述本发明的FGF21蛋白的多核苷酸。
进一步地,本发明提供了编码本发明的FGF21蛋白的多核苷酸,其中FGF21蛋白的氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含IgG4Fc部分,其中Fc部分由抗体的铰链区、CH2和CH3恒定区结构域组成,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
本发明还提供了编码本发明的FGF21蛋白的多核苷酸,其中FGF21蛋白的氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
此外,本发明还提供了编码本发明的FGF21蛋白的多核苷酸,其中FGF21蛋白的氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的接头与第二多肽的N-末端融合。
进一步地,本发明提供了编码本发明的FGF21蛋白的多核苷酸,其中FGF21蛋白的氨基酸序列是
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYL YTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ RPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDNO:5).
本发明还提供了编码本发明的FGF21蛋白的多核苷酸,其中核苷酸序列是SEQIDNO:13。
编码上述蛋白质的多核苷酸可以是RNA的形式,或者DNA的形式,所述DNA包括cDNA和合成的DNA。DNA可以是双链或单链的。编码本发明的蛋白质的编码序列可以由于遗传密码的冗余或简并性的结果而不同。
编码本发明蛋白的多核苷酸可以包含如下:仅仅蛋白的编码序列,蛋白的编码序列和其他的编码序列,如引导序列或分泌序列或前蛋白序列;蛋白的编码序列和非编码序列,如内含子或蛋白的编码序列的5’和/或3’非编码序列。因此,术语“编码蛋白的多核苷酸”涵盖这样的多核苷酸,所述多核苷酸可不仅仅包括蛋白的编码序列,还包括包括其他的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸,如SEQIDNO:13。
序列被有效地连接至表达调控序列后,本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达。表达载体通常作为附加体或作为宿主染色体DNA的整体部分在宿主生物体中复制。一般地,表达载体含有选择标记物,例如,四环素、新霉素、和二氢叶酸还原酶,以允许检测被期望的DNA序列转化的那些细胞。
本发明的FGF21蛋白可以容易地在如下细胞中生产:在哺乳动物细胞中如CHO、NS0、HEK293或COS细胞;在细菌细胞中如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence);或在真菌或酵母细胞中。使用本领域已知的技术培养宿主细胞。优选的哺乳动物宿主细胞是含有谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统的CHOK1SV细胞系(参见US5,122,464)。
可以通过熟知的方法将含有目的多核苷酸序列(例如FGF21蛋白和表达调控序列)的载体转移至宿主细胞中,这样的方法取决于宿主细胞的类型而不同。例如,氯化钙转化通常用于原核细胞,而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他宿主细胞。
可采用多种蛋白质纯化的方法,这些方法是本领域公知的,例如,在Deutscher,MethodsinEnzymology182:83-89(1990)和Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,第3版,Springer,NY(1994)中描述的。
本发明还提供了用于生产同源二聚体的方法,其中所述同源二聚体的每条多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5,所述方法包括步骤:
i)在使得所述多核苷酸序列表达的条件下,培养包含多核苷酸的哺乳动物宿主细胞,所述多核苷酸编码具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽;和
ii)从所述宿主细胞回收同源二聚体,其中所述同源二聚体的每条多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5。
当在哺乳动物细胞中表达时,本发明的FGF21蛋白是同源二聚体。“同源二聚体”在本文中指具有相同氨基酸序列(例如SEQIDNO:5)的两条本发明的FGF21蛋白,其通过非共价相互作用和Fc部分中的分子间二硫键缔合。
本发明提供了FGF21蛋白的同源二聚体,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含IgG4Fc部分,其中Fc部分由抗体的铰链区、CH2和CH3恒定区结构域组成,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
进一步的,本发明提供了FGF21蛋白的同源二聚体,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
本发明还提供了FGF21蛋白的同源二聚体,其中氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的FGF21蛋白,且其中第一多肽的C-末端通过具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的接头与第二多肽的N-末端融合。
本发明提供了FGF21蛋白的同源二聚体,其中氨基酸序列是ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDD AQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDG ALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPA RFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDNO:5).
上述SEQIDNO:5的FGF21蛋白包括SEQIDNO:14的IgG4Fc部分,粗体显示的SEQIDNO:11的接头序列,和下划线的SEQIDNO:1的FGF21蛋白。
进一步的,本发明提供了FGF21蛋白的同源二聚体,其中氨基酸序列是
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREX1LX2EDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLX3SPSFX4X5(SEQIDNO:15)
其中X1是L或D,X2是L或K,X3是R或L,X4是L或E,且X5是G或空缺。本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白的同源二聚体,其中X1是D,X2是L或K,X3是L,X4是L,且X5是G。此外,本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白的同源二聚体,其中X1是L或D,X2是L或K,X3是R,X4是E,且X5空缺。
本发明提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白的同源二聚体,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。本发明还提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白的同源二聚体,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。此外,本发明提供了SEQIDNO:15的FGF21蛋白的同源二聚体,其中FGF21蛋白选自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。最优选的FGF21蛋白是SEQIDNO:5。
本发明还涉及编码上述本发明的FGF21蛋白的同源二聚体的多核苷酸。
本发明还提供了药物组合物,其包含本发明的FGF21蛋白的同源二聚体、和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了治疗患者的2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的方法,包括向所述患者施用本发明的FGF21蛋白的同源二聚体。
进一步地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白的同源二聚体用于治疗。优选地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白的同源二聚体用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征。
进一步地,本发明提供了本发明的FGF21蛋白的同源二聚体在制备用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的药物中的用途。
本发明的FGF21蛋白可以在Fc部分中高保守的N-糖基化位点糖基化。进一步的,当在哺乳动物细胞中表达时,本发明的FGF21蛋白是同源二聚体。“同源二聚体”在本文中指具有相同氨基酸序列(例如SEQIDNO:5)的两条本发明的FGF21蛋白,其通过非共价相互作用和Fc部分中的分子间二硫键缔合。
全长人野生型FGF21是包含27个氨基酸信号肽的208个氨基酸的多肽。成熟人野生型FGF21包含不具有27个氨基酸信号肽的全长多肽,因而其为181个氨基酸的多肽(SEQIDNO:2)。
本发明FGF21蛋白中氨基酸位置的改变由不含IgG4Fc部分和接头的成熟人野生型FGF21(SEQIDNO:2)多肽中的氨基酸位置决定。例如,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的IgG4Fc部分包括氨基酸1至228,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的接头包括氨基酸229至244,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的FGF21蛋白包括氨基酸245至424。因此,文中描述的取代“A31C”指在成熟人野生型FGF21的位置31处由氨基酸Cys取代野生型氨基酸Ala。
需要注意的是在特定蛋白中一个氨基酸残基的取代可以影响蛋白作为整体的特征,其总体效果可能对药理学效力和/或药物稳定性有益或有害。例如,一个氨基酸取代,P115W,增加FGF21蛋白的效力,但是,也认为P115W导致引起聚集的自身缔合。因而,其总体效果对蛋白是有害的,所以,P115W取代不包含在本发明的FGF21蛋白中。另一个例子涉及氨基酸取代R175L,其增加FGF21蛋白的效力。但是,发现具有R175L取代的FGF21蛋白对蛋白水解易感,因而其总体效果是有害的。为了解决本发明的FGF21蛋白中观察到的C-末端蛋白水解,在180和181位的氨基酸(第180位是L,第181位是G)在第180位用氨基酸E取代,并且在第181位的氨基酸被删除。这些修饰实质性地减少了C-末端蛋白水解,但也降低了FGF21蛋白的药理学效力25倍,如在人293细胞-βKlotho-SREluc测定法中测量的。令人惊讶的是,通过将第175位的氨基酸残基(R175L)还原为野生型R,可以恢复效力。因此,该取代的总体效果对蛋白是有害的,所以,R175L取代不包含在本发明的优选的FGF21蛋白中。
某些本发明的FGF21蛋白是有效的、生物活性的蛋白质,如实施例2和3中所示的SEQIDNO:5。本发明优选的FGF21蛋白包含这样的氨基酸取代,所有这些取代在一起不仅仅改善效力,而且与其他氨基酸改变是相容的,这反过来提供了改善的稳定性性质,和增加的体内稳定性。在本发明的优选FGF21蛋白中改善效力的氨基酸取代包含D127K、S167R和G174L(参见,实施例2和3)。
人野生型FGF21的浓缩蛋白质溶液暴露于药物防腐剂、例如间甲酚时,增加蛋白质形成聚集体的倾向。通过引入额外的二硫键产生的结构稳定性改善了人野生型FGF21的防腐剂相容性和热稳定性。本发明的FGF21蛋白并入了氨基酸取代A31C和G43C,其极大地改善了热稳定性和防腐剂相容性,而不影响生物活性。之前也曾经描述过包含A31C/G43C取代的高效力FGF21蛋白。那些报道的蛋白与野生型FGF21相比,呈现显著改善的防腐剂相容性,但是其在存在防腐剂的条件下仍然倾向于聚集。此蛋白质聚集增加免疫原性风险,因而降低了蛋白质作为治疗性蛋白质的可接受性。
FGF21蛋白与Fc部分的融合也使自身缔合更显著。该行为可能由于Fc融合体的同源二聚体结构,所述结构导致亲合力,稳定化自身相互作用和凝聚。
本发明优选的蛋白质包含氨基酸取代L98D和L100K,其令人惊讶地导致高浓度下显著更低的高分子量聚集体形成。有利地,氨基酸取代L98D和L100K不降低蛋白质的效力,但使有害的凝聚问题最小化。
用于制备本发明FGF21蛋白的优选的商售表达系统是哺乳动物CHO-K1细胞系。然而,哺乳动物细胞系CHO-K1和HEK293可能通过位置179的酪氨酸侧链硫酸盐化作用引起成熟的人野生型FGF21翻译后修饰。在位置179和180(如果存在的话)的酪氨酸残基的硫酸盐化作用降低了效力,并且是不想要的产品异质性的来源。因此,当在位置179和/或180具有Tyr的FGF21蛋白质从CHO-K1或HEK293细胞系表达时,一定比例的表达蛋白质可能在位置179被硫酸盐化,另一些可能在位置180被硫酸盐化,而另一些可能在两个位置均被硫酸盐化,而另一些在任何位置均未被硫酸盐化。这导致了具有降低的效力的异质的且不可预知的蛋白质群体。
本发明的优选的FGF21蛋白包括解决了该有害的硫酸盐化作用的氨基酸取代。因此,蛋白质中并入了氨基酸取代Y179F。Y179F消除了在CHO-K1和HEK293细胞中生产导致的硫酸盐化作用。而且,氨基酸取代Y179F与本发明其他有利的氨基酸取代是相容的,且确认了其是关于效力的中性改变。
人野生型FGF21易感于体内的蛋白质水解降解。用野生型FGF21静脉内或皮下注射小鼠或食蟹猴后,从血清回收的主要蛋白质水解片段是中止于位置171的片段。在体外效力测定法中,确定了跨越残基1至171的FGF21片段效力低~100倍。因此,消除该蛋白质水解切割位点可通过增加对活性药物的暴露而改善了药效。已经表明氨基酸取代G170E在小鼠中显著减缓切割,且在食蟹猴中在24小时后测量时,实质上消除了在位置171处的蛋白质水解。G170E取代不影响效力,且与期望的物理化学稳定性谱相容。因此,氨基酸取代G170E并入本发明的FGF21蛋白中。
人野生型FGF21也对CHO-K1制备中产生的羧肽酶易感,并且氨基酸取代A180E和第181位的氨基酸删除减缓了该过程,因而降低了所表达的蛋白长度的异质性(即,在由细胞系表达的成熟蛋白中氨基酸残基数目的异质性)。尽管氨基酸取代A180E和第181位的氨基酸删除并不消除哺乳动物细胞表达中的C末端蛋白质水解,其非常有效地减缓蛋白质水解,同时维持本发明FGF21蛋白中存在其它所需氨基酸取代的条件下的效力。鉴于该有利的特征,氨基酸取代A180E和第181位的氨基酸删除并入本发明的优选的FGF21蛋白。
本发明的FGF21蛋白通过接头与免疫球蛋白的Fc部分融合。本发明的FGF21蛋白使用的Fc部分源自IgG4Fc部分。甚至更优选的是本发明的FGF21蛋白包含Fc部分,所述Fc部分源自人IgG4,但相比野生型人序列包含一个或多个取代。如本文中使用的,免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域术语的常规含义。具体而言,该术语指不含有来自抗体的2个抗原结合区(Fab片段)的抗体片段。Fc部分由抗体的铰链区、CH2和CH3恒定区结构域组成。
本领域普遍已知的是在哺乳动物中表达抗体导致糖基化。通常,糖基化发生在抗体的Fc部分中的高保守的N-糖基化位点上。N-聚糖通常附着于天冬酰胺。
因此,本发明的FGF21蛋白源自与本发明的FGF21蛋白融合的免疫球蛋白的人IgG4Fc部分。优选地,FGF21蛋白的Fc部分包括SEQIDNO:14的序列:
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本发明的FGF21蛋白的N-末端氨基酸通过富含甘氨酸(富含G-)的接头与Fc部分的每条重链的C-末端融合,所述接头被称为L,L前面紧挨的数字指分隔开FGF21蛋白与Fc部分的重复接头单元的数量。接头单元被定义为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser序列(SEQIDNO:10)。如果使用多个接头重复,则接头任选含有与末端Ser连接的Ala。
本发明的FGF21蛋白的Fc部分优选通过1、2或3个富含G的肽接头,-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQIDNO:10),被称为1L,融合在一起。本发明的其他的富含G的肽接头包含序列-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala(SEQIDNO:12),称为2L,和-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala(SEQIDNO:11),称为3L。本发明的最优选的富含甘氨酸的肽接头是接头3L,-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala(SEQIDNO:11)。
应理解,IgG4Fc由IgG4抗体的两条重链的恒定区构成。因此,本发明的FGF21蛋白由在每个IgG4Fc部分多肽的每个C-末端通过富含G的肽接头与具有相同氨基酸序列的两条FGF21蛋白融合的IgG4Fc部分构成。
可通过本领域已知的任何方法施用本发明的FGF21蛋白的药物组合物,实现通常预期的治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的目的。优选的给药途径是胃肠外途径。给药剂量取决于接收者的年龄、健康状态和体重,如果有,还取决于同时治疗的种类,治疗的频率,以及期望效果的性质。典型的剂量水平可使用标准临床技术优化,并取决于给药模式和患者状态,可由具有本领域常规技术的人员确定。
根据已知的方法配制本发明的FGF21蛋白,以制备可药用的组合物。期望的制剂是稳定的冻干产品,其与合适的高纯度稀释剂或水性溶液重建,所述高纯度稀释剂或水性溶液任选带有可药用的载体、防腐剂、赋形剂或稳定剂[Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,Gennaro,编辑,MackPublishingCo.,Easton,PA1995]。
本发明的FGF21蛋白可以与可药用的缓冲液配制,调节pH以提供可接受的稳定性,以及给药可接受的pH。另外,本发明的FGF21组合物可放置于容器内,如药瓶、药筒、笔递送装置、注射器、静脉内给药管或静脉内给药袋。
术语“异常脂血症”指脂蛋白质代谢病症,包括脂蛋白质过量产生或不足。异常脂血症可表现为血液中总胆固醇、低密度脂蛋白质(LDL)胆固醇和甘油三酯浓度的升高和/或高密度脂蛋白质(HDL)胆固醇浓度的降低。
术语“代谢综合征”的特征在于一个人中的一组代谢风险因子。它们包括:腹部肥胖-在大多数男人中,有40英寸或更大的腰围;高血糖-禁食后至少110毫克每分升(mg/dl);高甘油三酯-血流中至少150mg/dL;低HDL-少于40mg/dl;和/或血压130/85或更高。
术语“肥胖”定义为其中具有相对于瘦体重的比例过量的皮下脂肪的状态(Stedman’sMedicalDictionary第28版,2006,LippincottWilliams&Wilkins)。
“患者”是哺乳动物,优选人。
术语“治疗”指减缓、降低或逆转现有的症状、紊乱、状态或疾病的进展或严重性。
术语“治疗有效量”指本发明的蛋白质的量或剂量,其通过单次或多次剂量给药于患者提供期望的治疗。
术语“2型糖尿病”特征在于尽管有可利用的胰岛素,仍然产生过量的葡萄糖,且由于葡萄糖清除不足导致循环的葡萄糖水平持续过高。
可以参考下列实施例实施本发明。但是,这些实施例不应理解为限制本发明的范围。进一步的,实施例中描述和示例的本发明的FGF21蛋白是在哺乳动物细胞中表达的,因此是同源二聚体。
实施例1
CHOK1SV细胞中FGF21蛋白的表达
使用CHOK1SV细胞在哺乳动物细胞表达系统中产生本发明的FGF21蛋白。将编码本发明的FGF21蛋白的基因亚克隆至含有谷氨酰胺合成酶(GS)的表达质粒骨架中(基于pEE12.4的质粒)。编码本发明的FGF21蛋白的cDNA序列与优选信号肽序列的编码序列符合读框融合,以增加期望的产品分泌到组织培养基中。优选信号肽序列是如氨基酸序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的多肽。
由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动表达。使用电穿孔以及适当量的重组表达质粒稳定转染CHOK1SV细胞,转染的细胞以足够的细胞密度维持在悬浮培养中。通过在含有甲硫氨酸砜亚胺(methioninesulfoximine,MSX)、不含血清的培养基中生长完成转染细胞的选择,并将其孵育在35-37℃和5-7%CO2中。
使用流式细胞仪测量或确定克隆来源的细胞系。在哺乳动物细胞中表达的FGF21蛋白通常产生天然的N末端序列,ESKY,即,在N末端没有甲硫氨酸残基,如氨基酸序列SEQIDNO:5所示的FGF21蛋白。
按照标准的层析技术,通过蛋白A亲和层析以及随后的制备性尺寸排阻层析,纯化由CHO细胞分泌到培养基中的FGF21蛋白。简而言之,用PBSpH7.4运行缓冲液将来自收获的培养基中的FGF21蛋白捕获到MabSelectProteinA(GE,Piscataway,NJ)上;用运行缓冲液简单洗涤以去除非特异性结合的材料;并用10mM柠檬酸pH3.0洗脱。混合含有FGF21蛋白的级分,通过添加1/10体积的1MTrispH8.0中和pH。浓缩所中和的混合物,将其上样到Superdex200尺寸排阻层析柱(GE,Piscataway,NJ)上,移动相为PBSpH7.4。混合、浓缩并储藏含有单体FGF21蛋白(共价连接的同源二聚体)的级分。
可选地,可以将含有FGF21蛋白的无细胞培养基加热至50-60℃,维持至多2小时,冷却,用洗涤剂(TritonX-100)处理失活病毒,并将其加载至MabSelectProteinA(GEHealthcare)柱上,用有或无氯化钠的pH7Tris缓冲的溶液连续洗涤以去除非特异性结合的材料。使用20mM柠檬酸pH3从柱上洗脱FGF21蛋白,并在pH3.4至3.7下保持至多2小时使病毒失活。通过加入Tris缓冲液和氯化钠,调节溶液pH4.8到5.2之间,并混合至少15分钟。通过深度过滤(Millipore)去除沉淀物。使用树脂,例如PorosHS50(LifeTechnologies)或SPSepharoseHP(GEHealthcare)通过阳离子交换层析进一步纯化FGF21蛋白。用pH5的醋酸钠缓冲溶液中的氯化钠洗脱该阳离子交换柱。通过使用Tris缓冲液将pH从7调节至8,添加硫酸钠并应用于柱,再用逆浓度梯度的硫酸钠洗脱,通过在苯基琼脂糖HP(GEHealthcare)上的疏水性相互作用层析进一步纯化FGF蛋白。使纯化的FGF21蛋白通过病毒滞留过滤器,如Planova20N(AsahiKaseiMedical),而后在再生纤维素膜(Millipore)上通过切向流超滤浓缩/渗滤至pH为7的10mM柠檬酸、150mMNaCl中。
实施例2
3T3-L1-βKlotho成纤维细胞的葡萄糖摄取测定
3T3-L1-βKlotho成纤维细胞由3T3-L1成纤维细胞通过CMV驱动的哺乳动物表达载体的逆转录病毒转导产生,所述CMV驱动的哺乳动物表达载体含有野生型小鼠βKlotho和杀稻瘟菌素抗性标记物的编码序列。在15μM杀稻瘟菌素存在下,生长14天后选择杀稻瘟菌素抗性细胞,应用抗βKlotho抗体通过免疫印迹证实βKlotho变体表达。在含有10%小牛血清和15μM杀稻瘟菌素的Dulbecco'sModifiedEagle培养基(DMEM)中维持3T3-L1-βKlotho成纤维细胞,直至铺板用于实验用途。
对于葡萄糖摄取,3T3-L1-βKlotho成纤维细胞以20,000个细胞/孔铺板于96孔平板,在含有10%小牛血清的DMEM中孵育48小时。在含有或不含有目的FGF21蛋白、含有0.1%牛血清白蛋白质(BSA)的DMEM中孵育细胞3小时,而后在含有或不含有FGF21蛋白、含有100μM2-脱氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer磷酸盐(KRP)缓冲液(15mMHepes,pH7.4,118mMNaCl,4.8mMKCl,1.2mMMgSO4,1.3mMCaCl2,1.2mMKH2PO4,0.1%BSA)中孵育1小时。通过在含有1mM2-脱氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer重碳酸盐/Hepes(KRBH)缓冲液中孵育选择的孔确定非特异结合。通过向细胞加入20μM细胞松弛素B中止反应,使用液体闪烁计数器测量葡萄糖摄取。
基本遵循如上所述的操作程序,在3T3-L1-βKlotho成纤维细胞的葡萄糖摄取测定法中,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的体外效力(EC50)测定为0.070nM。
实施例3
人293细胞βKlotho-SREluc测定法
293-βKlotho-SREluc报告细胞的构建:
HEK293细胞(人胚肾细胞)培养在37℃,5%CO2下、含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco'smodifiedEagle's的生长培养基(GM)中。用含有CMV启动子驱动的人βKlotho表达盒的质粒和含有血清反应元件(SRE)驱动的荧光素酶表达盒的质粒共同转染细胞。βKlotho表达质粒还含有SV40启动子驱动的新霉素磷酸转移酶表达盒,以赋予对氨基糖苷类抗生素G418的抗性。用600μg/mLG418选择转染的HEK-293细胞,以选择其中转染的质粒被整合至基因组的细胞。选择的细胞被稀释克隆,并在添加FGF2124小时后测试荧光素酶产量的增加。选择具有最大FGF21依赖的荧光素酶增加的克隆作为用于测量相对FGF21蛋白活性的细胞系。
293-βKlotho-SRElucFGF21活性测定法:
漂洗293-βKlotho-SREluc细胞,将其置于CD293悬浮培养基中(Invitrogen)。在37℃,6%CO2,125rpm下、细胞在悬浮液中过夜生长。计数细胞、通过离心沉淀、并重悬于含有0.1%BSA的CD293培养基中。以每孔25,000个细胞将细胞放置于白色96孔平板。在CD293/0.1%BSA中制备各FGF21蛋白的四倍系列稀释液,以生成终浓度从100nM至0.006nM的8个稀释液。一式三份将稀释液加入细胞中,在37℃,5%CO2下孵育16-20小时。通过加入等体积OneGloTM荧光素酶底物(Promega)并测量相对发光测定荧光素酶水平。使用四参数logistic模型(XLfit版本5.1)分析数据,以拟合曲线并确定EC50。
基本遵循如上所述的操作程序,在人293细胞βKlotho-SREluc测定法中,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的体外效力(EC50)测定为0.51nM。
实施例4
物理稳定性
R175和E180的表达异质性
生产均质的蛋白产物是理想的由于这更好地保证一致的和良好表征的产物。为了评估产物异质性,10μL样品的等分试样与90μLDPBS混合。使用以下条件通过液体层析质谱法(LC-MS)分析样品:流动相A为0.05%TFA,流动相B为0.04%TFA的乙腈溶液,柱是PLRPS2.1X50mm柱,注射体积是15μL。
表1:液体层析分离的梯度条件
时间(min) | 0 | 1 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
%B | 5 | 35 | 40 | 90 | 90 | 5 | 5 |
流量(μL/min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
WatersMicromassLCTPremierTM质谱仪设置为质量范围400到1990amu之间、极性ES+、毛细管3000、采样锥40V、孔径1为25V、源温度为105℃、锥气流50L/小时、去溶剂化气温度为150℃、以及去溶剂化气流量是600L/小时。
表2:FGF21蛋白的LC/MS特征
表2报道了如通过LC/MS方法测定的各个FGF21蛋白所获得的异质性。产物1-425代表全长FGF21蛋白,其含有IgG4Fc部分、接头、SEQIDNO:8的FGF21蛋白和SEQIDNO:9的FGF21蛋白。SEQIDNO:8的FGF21蛋白和SEQIDNO:9的FGF21蛋白的区别仅在于第100位,SEQIDNO:8的FGF21蛋白含有野生型残基亮氨酸,而SEQIDNO:9的FGF21蛋白含有氨基酸残基赖氨酸(L100K),两个蛋白质都具有相同的C-末端。两个蛋白质都对C-末端截短易感,尤其是对第181位的氨基酸残基甘氨酸去除易感。如表2所示,少于50%的SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体和SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体的纯化产物是预期的全长1-425;1-424片段构成了纯化的产物的最多的部分。此外,还检测到微量的产物1-422、1-411和1-379。
SEQIDNO:5的FGF21蛋白的遗传构建体中删除了第181位的氨基酸残基,且第180位氨基酸残基被谷氨酸(E)取代。这些改变保护了C-末端在CHO表达过程中免受降解,获得100%均质的纯化的1-424产物。
实施例5
物理稳定性
高浓度下的自缔合
由于可能潜在地加剧不利作用,如引发免疫应答,蛋白质聚集和自缔合是不理想的。因此,优选将蛋白质维持在单体状态(共价连接的同源二聚体)。为了测试FGF21蛋白质自缔合的倾向,用表3列举的缓冲液透析蛋白质,并通过使用尺寸排阻层析(SEC)分析以确定1.0mg/mL溶液的%高分子量(%HMW)。%HMW是蛋白质聚集和自缔合的指标。
在尺寸为30cmx0.78cm的TosohBioscience3000SWXL,5微米柱上实施SEC分离方法。移动相为0.05M磷酸钠,175mMNaCl,pH7,流速为0.5mL/分钟。以10mcL注射应用1.0mg/mL样品并在214nm吸收波长处监控,而以1mcL注射应用75mg/mL样品并在280nm处监控。
表3自缔合
表3示例了在1.0mg/mL的所有缓冲液组成中,SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体为4-5%HMW,SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体和SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体为<1%HMW。然后,将样品浓缩至75mg/mL,模拟高浓度制剂,并再次通过SEC分析以确定%HMW。在75mg/mL,SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体变体含有13.7-21.9%HMW,而SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体仅含2.2-3.5%。由于SEQIDNO:8的FGF21蛋白与SEQIDNO:9的FGF21蛋白的唯一区别就是第100位的取代(L100L对比L100K),该数据证实了L100K降低了HMW形成。
除其他改变外,SEQIDNO:5的FGF21蛋白也含有L100K,在该同源二聚体蛋白质中也观察到了较低的%HMW。
实施例6
物理稳定性
L100K取代和%高分子量
如下确定FGF21对比的物理稳定性。透析蛋白质,并在pH7的10mM柠檬酸盐,150mMNaCl中制备成1-2mg/mL,并通过SEC分析确定%HMW(表3:“初始”)。
在尺寸为30cmx0.78cm的TosohBioscience3000SWXL,5微米柱上实施SEC分离方法。移动相为0.05M磷酸钠,175mMNaCl,pH7,流速为0.5mL/分钟。初始的低浓度样品以10mcL注射应用,并在214nm的吸收波长处监控,而以1mcL注射应用50mg/mL样品并在280nm处监控。
之后,将蛋白质浓缩为50mg/mL,并再次分析(t=0)。在浓缩后,SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从4.5%增加至9.3%。在浓缩后,SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从0.9%增加至1.4%。在浓缩后,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从0.4%增加至1.4%。因此,SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体和SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体都具有比SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体更低的初始%HMW,和在配制50mg/mL蛋白质时更低的%HMW。这些数据证实了存在于SEQIDNO:9的FGF21蛋白和SEQIDNO:5的FGF21蛋白中、而不存在于SEQIDNO:8的FGF21蛋白中的L100K突变的重要性。
将50mg/mL制剂在4℃、25℃和40℃下孵育4周,评估其在胁迫条件下的长期稳定性。如表4所示,在4周时间(t=4周)时再次测定%HMW。在40℃下,SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从9.3%增加至16.0%。在40℃下,SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从1.4%增加至5.5%。在40℃下,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW从0.4%增加至5.4%。在25℃下4周后,SEQIDNO:9的FGF21蛋白的同源二聚体和SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW水平仅为3.3%,而SEQIDNO:8的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW水平为13.8%。这些数据证实了包括在SEQIDNO:9的FGF21蛋白和SEQIDNO:5的FGF21蛋白中存在的L100K突变的有益影响。
表4:%高分子量
实施例7
物理稳定性
自缔合
在10mM柠檬酸盐,50mMNaCl,pH6缓冲液中透析纯化的SEQIDNO:7的FGF21蛋白(是具有D98L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白)和纯化的SEQIDNO:6的FGF21蛋白(是具有K100L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白),并确定浓度分别为12.9mg/mL、1.0mg/mL和0.6mg/mL。通过SEC分析从透析回收的各个样品以测定%HMW(表5)。所有的回收的透析液的%HMW都<1%。之后,使用10,000分子量截断值,4mLMillipore离心浓缩仪将样品浓缩至65-87mg/mL。表5中显示了各个样品的浓度。在浓缩后,使用浓缩的蛋白质通过SEC再次确定%HMW。
如表5所示,SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的%HMW增加至2.3%,提示了在较高浓度下发生了低水平的自缔合。相反,SEQIDNO:7的FGF21蛋白(是具有D98L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白)的同源二聚体和SEQIDNO:6的FGF21蛋白(是具有K100L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白)的同源二聚体的%HMW分别增加至8.0%和14.2%的水平。这些数据证实了当序列中包括野生型L98或L100时,不理想的自缔合的较大倾向。因此,L98D和L100K替换都对减少SEQIDNO:5的FGF21蛋白的自缔合作出贡献。进一步的,可以得出在缺少L98D的条件下存在L100K(即,SEQIDNO:7的FGF21蛋白)不足以使自缔合完全最小化的结论。相应的,可以得出在缺少L100K的条件下存在L98D(即,SEQIDNO:6的FGF21蛋白)不足以使自缔合完全最小化的结论。因此,降低自缔合的最大效果同时需要L98D和L100K。
在将浓缩的蛋白质稀释至1mg/mL后,%HMW的减少证实了自缔合是可逆的。将SEQIDNO:6的FGF21蛋白(是具有K100L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白)的同源二聚体稀释至1mg/mL,导致%HMW从14.2%减少至2.0%。将SEQIDNO:7的FGF21蛋白(是具有D98L的SEQIDNO:5的FGF21蛋白)的同源二聚体稀释至1mg/mL,导致%HMW从8.0%减少至1.3%。当SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体中同时存在L98D和L100K时,在稀释至1mg/mL后,%HMW减少至0.88%,再次证实了组合L98D和L100K时更有益的行为。
表5:自缔合
实施例8
Ob/ob小鼠模型中葡萄糖的降低
雄性ob/ob小鼠和年龄相匹配的ob/m(瘦型)对照在收到时是7周龄,在初始处理时是8-9周龄。在收到时,所有小鼠每只一笼,并在开始处理前使其适应环境1-2周。小鼠用PurinaRodentChow5015饲育,并可从自动给水装置在笼中自由饮水。小鼠饲养在12小时的亮/暗循环中,环境温度设置为75°F。在开始处理前一至两天,通过尾巴放血收集血液样品。用Accu-CheckAvivia血液葡萄糖测量仪(Roche)测量血液葡萄糖水平,使用MesoScale小鼠/大鼠胰岛素测定法试剂盒收集用于胰岛素测定法的血清样品。在处理初始那天(第0天),根据处理前的体重、血葡萄糖、和血清胰岛素将小鼠分组(BRAT分类软件)。在第0天和第3天,用0.1-30nmol/kg的SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体SQ给药小鼠,体积为10ml/kg。给药载体是含有0.03%小鼠血清球蛋白(MSA;SigmaA3139)的无菌PBS(HyCloneDPBS/Modified–Calcium–Magnesium)。每天测量血糖为时7天,并确定AUC。葡萄糖降低的ED50计算基于AUC。在处死时收集肝脏匀浆,在HitachiModularP临床分析仪上测量肝脏甘油三酯。
在第7天,载体处理的小鼠血糖过高,测得的平均血液葡萄糖水平是387±63.0mg/dl(平均值±SEM),而ob/m瘦型对照小鼠血液葡萄糖水平是162±9.0mg/dl(平均值±SEM)。SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体将血液葡萄糖降低至与ob/m瘦型对照可比较的水平。SEQIDNO:5的FGF21蛋白的同源二聚体的ED50是2.796nmol/kg(95%置信区间=1.1-7.0)。
序列
SEQIDNO:1-FGF21蛋白
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE
SEQIDNO:2-野生型FGF21(智人)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
SEQIDNO:3-人转铁蛋白(hTrf)信号肽
MRLAVGALLVCAVLGLCLA
SEQIDNO:4-人成纤维细胞生长因子结合蛋白-1(hFGFP-1)信号肽
MKICSLTLLSFLLLAAQVLLVEG
SEQIDNO:5-FGF21蛋白
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE
SEQIDNO:6-FGF21蛋白
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE
SEQIDNO:7-FGF21蛋白
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE
SEQIDNO:8-FGF21蛋白
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SEQIDNO:9-FGF21蛋白
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLLSPSFLG
SEQIDNO:10-接头(L)
GGGGS
SEQIDNO:11-接头(3L)
GGGGSGGGGSGGGGSA
SEQIDNO:12-接头(2L)
GGGGSGGGGSA
SEQIDNO:13-FGF21蛋白的(DNA)
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACCGAGTGCCACCTGGAAATCCGGGAGGACGGCACCGTGGGCTGTGCCGCCGACCAGTCCCCTGAGTCCCTGCTGCAGCTGAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAAACCTCCCGGTTCCTGTGCCAGAGGCCTGATGGCGCCCTGTACGGCTCCCTGCACTTCGACCCTGAGGCCTGCTCCTTCCGGGAGGACCTGAAGGAAGATGGCTACAACGTGTACCAGTCCGAGGCTCACGGCCTGCCTCTGCATCTGCCTGGCGACAAGTCCCCCCACCGGAAGCCTGCTCCTAGGGGCCCTGCCAGATTCCTGCCACTGCCTGGCCTGCCTCCAGCTCTGCCTGAGCCTCCTGGCATCCTGGCCCCTCAGCCTCCAGACGTGGGCTCCTCCGACCCTCTGCGGCTGGTCGAGCCTTCCCAGCTGCGGAGCCCTAGCTTCGAG
SEQIDNO:14-Fc部分
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQIDNO:15-共有FGF21蛋白
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREX1LX2EDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLX3SPSFX4X5
X1是L或D
X2是L或K
X3是R或L
X4是L或E
X5是G或空缺。
Claims (12)
1.成纤维细胞生长因子21(FGF21)蛋白的同源二聚体,其中FGF21蛋白氨基酸序列由与第二多肽融合的第一多肽组成,其中第一多肽包含IgG4Fc部分,第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质,且其中第一多肽的C-末端通过接头与第二多肽的N-末端融合。
2.权利要求1的同源二聚体,其中IgG4Fc部分的氨基酸序列是SEQIDNO:14。
3.权利要求1或2的同源二聚体,其中接头的氨基酸序列是SEQIDNO:11。
4.权利要求1至3中任一项的同源二聚体,其中氨基酸序列是
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDNO:5).
5.权利要求1至4中任一项的同源二聚体,其中蛋白质的IgG4Fc部分是糖基化的。
6.编码多肽的DNA分子,其中多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5。
7.用权利要求6的DNA分子转化的哺乳动物宿主细胞,所述细胞能够表达同源二聚体,其中所述同源二聚体的每条多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5。
8.用于生产同源二聚体的方法,其中所述同源二聚体的每条多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5,所述方法包括步骤:
i)在使得所述多肽序列表达的条件下,培养包含多核苷酸的哺乳动物宿主细胞,所述多核苷酸编码具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多肽;和
ii)从所述宿主细胞回收同源二聚体,其中每条多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:5。
9.由权利要求8的方法生产的同源二聚体。
10.包含权利要求1至5或权利要求9中任一项的同源二聚体和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
11.权利要求1至5或权利要求9中任一项的同源二聚体,所述同源二聚体用于治疗。
12.权利要求1至5或权利要求9中任一项的同源二聚体,所述同源二聚体用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征。
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WO2022032187A1 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis |
KR20220021207A (ko) | 2020-08-13 | 2022-02-22 | 주식회사 나이벡 | 이소골 형성 부작용 경감으로 치료효과가 증진된 골형성 단백질-9, 10의 변이체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
KR102495299B1 (ko) * | 2020-11-03 | 2023-02-06 | 토드제약 주식회사 | Fgf21의 열탄력성을 이용한 fgf21 생산 방법 |
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KR102631925B1 (ko) * | 2021-06-10 | 2024-02-01 | 토드제약 주식회사 | 신규 fgf21 변이체 개발 및 이의 생산기법과 용도 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102143758A (zh) * | 2008-06-04 | 2011-08-03 | 安姆根有限公司 | Fgf21突变体及其用途 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
US7459540B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
US20040259780A1 (en) | 2001-07-30 | 2004-12-23 | Glasebrook Andrew Lawrence | Method for treating diabetes and obesity |
JP4477013B2 (ja) | 2003-12-10 | 2010-06-09 | イーライ リリー アンド カンパニー | 線維芽細胞成長因子21の突然変異タンパク質 |
DE602005016917D1 (de) * | 2004-05-13 | 2009-11-12 | Lilly Co Eli | Fgf-21-fusionsproteine |
KR20140012199A (ko) * | 2007-03-30 | 2014-01-29 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그 용도 |
CH699521A2 (de) | 2008-09-09 | 2010-03-15 | Rotorcraft Ag | Streckwerk für eine Strickmaschine. |
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