CN107385020A - 瘦素在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，以诱导分化的脂肪细胞为对象，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT‑PCR)检测FGF21处理后脂肪细胞的瘦素表达水平程度，进而确定人重组FGF21蛋白的活性。本发明发现瘦素表达水平与所用人重组FGF21蛋白浓度之间存在量效关系，从而确定脂肪细胞瘦素表达水平可成为FGF21活性检测的新指标，该方法操作的可靠性强，具有很好的实用价值。

Description

瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用
技术领域
本发明属于瘦素应用技术领域，具体涉及一种瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
背景技术
肥胖和2型糖尿病相关的药物研发一直是科研与开发领域的热点。在肥胖和2型糖尿病模型小鼠以及人类患者的研究发现，FGF21重组蛋白可减轻体重、降低血脂、降低血糖、显著减轻肥胖和2型糖尿病及其并发症。因此，在肥胖和2型糖尿病相关药物研发的众多候选分子中，成纤维细胞生长因子21(FGF21)是一个研发热点。
建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键。一个客观评价FGF21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测指标对于FGF21研发至关重要。目前，脂肪细胞的葡萄糖摄取量的测定是目前普遍采用的FGF21活性检测方法：该方法一般是测定葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖无法进入后续代谢步骤，因而会在细胞中聚集，可反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法检测过程中一般使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，这对于实验防护和环境保护要求较高；另外，检测过程中还可以使用荧光方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，该方法价格昂贵，不利于高通量筛选使用，同时葡萄糖摄取检测还受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。
因此，研发新的FGF21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足，而且能够获得给为简便可靠的检测方法，这对于客观评价人重组FGF21蛋白效果具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组FGF21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。
本发明所采用的技术方案是，瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
本发明的特点在于，
瘦素基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为：当人重组FGF21蛋白的添加浓度c≥10ng/ml时，瘦素基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而减少。
瘦素基因表达水平通过定量PCR方法检测。
定量PCR方法检测过程中，瘦素的引物序列为：
上游引物：5’-CTC CAA GGT TGT CCA GGG TT-3’；
下游引物：5’-AAA ACT CCC CAC AGA ATG GG-3’。
本发明所采用的另一个技术方案是，用于判断人重组FGF21蛋白活性的瘦素，瘦素基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度下调，且呈剂量依赖性下降。
本发明的特点还在于，
瘦素为脂肪细胞内的瘦素。
本发明的有益效果是：本发明通过人重组FGF21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂肪细胞的基因表达，从而确定脂肪细胞瘦素表达水平成为FGF21活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；
图2是本发明定量PCR方法中瘦素和beta-actin基因的扩增曲线图；
图3是本发明定量PCR方法中PCR产物的熔解曲线；
图4是本发明人重组FGF21蛋白处理细胞12h后对瘦素基因表达水平的影响柱状图；
图5是本发明人重组FGF21蛋白浓度对瘦素基因表达水平的量效关系图；
图6是本发明人重组FGF21受体抑制剂对人重组FGF21蛋白作用的抑制效应柱状图。
具体实施方式
本发明公开的瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一、细胞培养和处理
小鼠前体脂肪细胞种植于12孔培养板中，在温度为37℃的孵箱培养，所用培养液为普通培养液即DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液，诱导培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3IU/ml胰岛素、20μmol/L地塞米松和20μmol/L罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液，胰岛素培养液为DMEM培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3IU/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于FGF21处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。
在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml人重组FGF21蛋白(美国Peprotech公司产品)，处理12小时后，脂肪细胞用于RNA提取。
二、脂肪细胞的RNA提取和反转录
将12孔板中的培养液去除干净，每孔加入350μL裂解液RL。用细胞研磨棒研磨裂解，再将所有溶液转移至过滤柱CS中12000rpm离心2min，收集滤液；向滤液中加入350μL70％乙醇，混匀并转入吸附柱CR3中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入80μL DNaseI工作液，室温放置15min；向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；重复向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CR3转入RNase-Free离心管中，加入50μLRnase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。
酶标仪检测RNA浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。在八连管中依次加入2μL 5x gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，1μg Total RNA，最后用RNase Free dH2O补足至10μL，混匀，室温反应5min。在各管中依次加入以下试剂，4μL 5x PrimeScriptBuffer2，4μL RNase Free dH2O，1μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1μL RT PrimerMix，总反应体系为20μL，混匀。反应条件为37℃15min，85℃5s。反应完成后将cDNA存于4℃备用，长期保存时转入-20℃。
三、瘦素基因表达水平的检测
瘦素基因表达水平采用定量PCR方法检测，以beta-actin基因的表达作为参考基因。在八连管中依次加入6μL dH2O，2μL模板cDNA，2μL瘦素引物，10μL SYBR Premix ExTaqII(2x)，总反应体系为20μL，混匀。
反应条件是：第一步是94℃、5min；第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，循环以上顺序40次；第三步是进行加温熔解扩增产物，获得熔解曲线。
瘦素引物序列是：
上游引物：5’-CTC CAA GGT TGT CCA GGG TT-3’；
下游引物：5’-AAA ACT CCC CAC AGA ATG GG-3’。
Beta-actin的引物序列是：
上游引物：5’-CGT TGG CAT CCA CGA AAC TA-3’
下游引物：5’-GGT GCT GGG AGG TAC AGG G-3’。
以beta-actin基因表达为参考，对实验结果进行表达水平分析。如图2所示，随着扩增次数的增加，瘦素和beta-actin基因的拷贝数在一定扩增次数后呈指数增加，最后到达平台期，如图3所示，熔解曲线表现单峰，说明扩增产物的特异性强。如图4所示，人重组FGF21(美国Peprotech公司产品，浓度100ng/ml)处理细胞12小时可显著降低脂肪细胞内瘦素的表达(**表示统计学分析P<0.01，N＝6)。如图5所示，瘦素表达随人重组FGF21蛋白浓度的增加而减少，表现为良好的量效关系。如图6所示，设置4组实验，一组为对照组即空白组，二组加入人重组FGF21蛋白，三组加入人重组FGF21蛋白抑制剂AZD4547，四组同时加入人重组FGF21蛋白和抑制剂AZD4547，结果表明，人重组FGF21受体抑制剂AZD4547(美国MCE公司产品，浓度10nmol/L)处理后显著抑制FGF21对瘦素表达的作用(**表示统计学分析P<0.01，N＝6)。
四、扩增特异性的鉴定
把定量PCR扩增产物进行DNA测序，瘦素的扩增序列如下：
“ctc caa ggt tgt cca ggg ttg atc tca caa tgc gtt tct taa gca ggt agacgt ttg cat gcc aat atg tgg ttc tca tct gat tgg ttc atc caa agt aga acc ctgtct ccc acc cat tct gtg ggg agt ttt”，扩增片段大小为135bp，与美国国家生物技术信息中心报道的瘦素mRNA(序号：NM_008493.3)的1649-1783碱基序列完全一致。
根据以上实验结果发现，瘦素基因表达水平被人重组FGF21的添加浓度下调，且呈剂量依赖性下降，脂肪细胞瘦素基因表达水平可成为FGF21活性检测的新指标。

Claims (6)

1.瘦素在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的瘦素基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为：当人重组FGF21蛋白的添加浓度c≥10ng/ml时，瘦素基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而减少。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的瘦素基因表达水平通过定量PCR方法检测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的定量PCR方法检测过程中，瘦素的引物序列为：
上游引物：5’-CTC CAA GGT TGT CCA GGG TT-3’；
下游引物：5’-AAA ACT CCC CAC AGA ATG GG-3’。
5.用于判断人重组FGF21蛋白活性的瘦素，其特征在于，所述的瘦素基因表达水平被人重组FGF21蛋白浓度下调，且呈剂量依赖性下降。
6.根据权利要求5所述的用于判断人重组FGF21蛋白活性的瘦素，其特征在于，所述的瘦素为脂肪细胞内的瘦素。
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