CN1162978A - 体重调控物，相应的核酸和蛋白质，及其诊断和治疗应用 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及动物体重的控制，包括哺乳动物和人类的体重的控制，更具体地说，涉及被鉴定为体重调控物的物质及其在诊断和治疗上的应用。广义来说，本发明涉及表现为参与哺乳动物体重调控的核苷酸序列及据推测由这些核苷酸表达的蛋白质或其简并变异体的说明和发现。所研究的核苷酸序列代表的基因对应于鼠类和人类OB基因，OB基因据推测在体重和肥胖症的调节中起关键作用。这里给出的初步数据提示所研究基因的多肽产物作为激素发挥作用。本发明进一步提供用作分子探针或聚合酶链式反应(PCR)扩增引物的核酸分子，即合成的或天然的寡聚核苷酸。另一方面，本发明提供一种含有本发明的核酸的克隆载体，以及含有经操作连接表达控制序列的本发明核酸分子的细菌、昆虫或哺乳动物表达载体。相应地，本发明进一步涉及用适当表达载体转染或转化的细菌或哺乳动物细胞以及相应的上述结构在制备本发明的调控物时的应用。本发明还提供OB多肽的抗体。另外提供了一种调控哺乳动物体重的方法。在特定的实施例中，提供了编码鼠类和人类OB多肽的两种异构体的基因。

Description

体重调控物，相应的核酸和蛋白质， 及其诊断和治疗应用
                   本发明的技术领域
本发明总体上涉及哺乳动物体重的控制，包括动物和人类的体重的控制，更具体地说，涉及在此被鉴定为体重调控物的物质及其在诊断和治疗上的应用。
                   发明背景
肥胖症，其定义为相对无脂肪身体物质来说体内脂肪过多，与重要的精神和医学疾患相联系，后者包括高血压、血脂升高和II型或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。美国有六百万到一千万人患有NIDDM，包括18％的65岁人口[Harris等人，国际肥胖杂志(Int.J.Obes.)11：275-283(1987)]。约45％男性和70％女性NIDDM患者肥胖，减轻体重会显著改善或消除他们的糖尿病[Harris，糖尿病护理，14(3)：639-648(1991)]。如下所述，肥胖症和NIDDM明显地遗传，尽管相关基因尚未被确定。这种代谢相关病症的分子遗传基础是一个重要但知之甚少的问题。
养料能量的吸收、贮藏和利用构成一个对后生动物生存起决定作用的复杂自稳态(homeostatic)系统。陆生动物在脂肪组织中贮存大量代谢燃料如甘油三酯，这对于在食物匮乏期存活至关重要。维持一定水平的能量储备但又不能持续改变生物体的大小和形状，这就需要在能量摄入和消耗之间达到平衡。然而，调节能量平衡的分子机制仍待阐明。分离出传导营养信息和调控能量平衡的分子对于理解健康与疾病条件下体重调节至关重要。
个体的肥胖水平在很大程度上由遗传决定。检查同卵或异卵双胞胎或受领养者与其亲生父母的体重与肥胖症的相关率[concordance rate]，表明肥胖症的遗传性(0.4-0.8)超过许多其它通常被认为具有实在的遗传成分的性状，如精神分裂症，酗酒和动脉硬化[stunkard等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)322：1483-1487(1990)]。能量消耗率的家系相似性也见于报道[Bogardus等人，糖尿病(Diabetes)35：1-5(1986)]。地理隔离人群的遗传分析显示可能是相对少数基因决定着身体组份差别的30-50％[Moll等人，美国人类遗传学杂志[Am.J.Hum.Genet.]49：1243-1255(1991)]。然而，尚未有在普通人群中作为肥胖症病因的基因被遗传定位于确定的染色体位置。
肥胖症的啮齿类模型包括七个明显的单基因突变。研究得最多的小鼠肥胖症突变是ob(肥胖)和db(糖尿病)基因。当处于相同的遗传品系背景时，ob和db的代谢和行为表型不可区分，表明这些基因可能通过相同生理途径起作用[Coleman等人，糖尿病学(Diabefologia)，14：141-148(1978)]。每一种突变的纯合小鼠都贪食并且代谢旺盛，出生一月后即导致可见的肥胖表型。这些动物的体重趋向稳定在60-70克(与对照小鼠的30-35克相比)。ob和db动物表现许多其他的激素和代谢变化，故难以鉴定造成突变的主要缺陷[Bray等人，美国临床营养杂志(Am.J.Clin.Nutr.]，50：891-902(1989)]。
每种啮齿类肥胖症模型均伴有糖代谢的变化，与人的II型糖尿病类似。在某些病例中，糖尿病严重程度部分依赖于背景小鼠系[Leifer，内分泌学[Endocrinology]124：912-922(1989)]。对于ob和db，同类系的C57BL/Ks小鼠患严重的糖尿病，最终β细胞坏死，胰岛萎缩，造成相对的胰岛素减少(insulinopenia)。相反，同类系的C57BL/6J ob和db小鼠患暂时性胰岛素抗性糖尿病，最终由β细胞肥大补偿，这类似于人类II型糖尿病。
除了患糖尿病，在其它方面ob和db小鼠的表型也类似于人类肥胖症-突变小鼠比瘦对照吃得多而且能量消耗少(正如胖人)。该表型与腹侧正中下丘脑损伤的动物的表型也很相似，表明两种突变可能扰乱中枢神经系统中正常整合并响应营养信息的能力。该假说的支持证据来自神经兴奋的暂时抑制(parabiosis)实验的结果[Coleman，糖尿病学，9：294-298(1973)]，该结果表明ob小鼠缺乏一种循环饱足因子而db小鼠对ob因子的作用有抗性(可能由于ob受体缺陷〕。由这些实验导出如下结论：这些突变小鼠的肥胖症可能是由于假设的控制身体组份的反馈机制的传入循环和/或整合中心的不同缺陷。
利用分子和经典遗传标记已将ob和db基因分别定位于近染色体6和中染色体4[Bahary等人，美国国家科学院刊[Proc.Nat.Acad.Sci.USA]，87：8642-8646(1990)；Friedman等人，Genomics，11：1054-1062(1991)]。两种情况下，突变均定位于小鼠基因组上与人类同模(syntenic with)的区域，表明若人类有ob和db同源物，它们可能分别定位于人类染色体7q和1q。db基因的缺陷可能导致其它哺乳动物种的肥胖症，在Zucker fa/fa大鼠和棕色挪威[Brown Norway]+/+大鼠的遗传杂交中，fa突变(大鼠染色体5)被在小鼠中包围db的相同座位包围[Truett等人，美国国家科学院院刊，88：7806-7809(1991)]。
由于许多因子似乎都影响体重，尚不可能预知体重主要取决于哪种因子，或更具体地说，哪种自稳定机制。因此，本发明的首要问题是提供体重调控因子，它能控制肥胖症和哺乳动物的脂肪含量。
                   发明概述
根据本发明，通过提供此处公开的肥胖症(OB)多肽和编码这些多肽的核酸分子，解决动物，特别是哺乳动物的肥胖症和脂肪含量的控制问题。本发明首次提供了用于调控，即控制和调节体重和肥胖症的分离到的多肽，以及编码这些多肽的核酸序列，这些核酸序列不仅能重组产生OB多肽，其本身也可用于体重调控。
本发明的肥胖症(OB)多肽有约145到约167个氨基酸，能调控动物，尤其是哺乳动物的体重，并包括等位变异体或类似物及其具有相同生物活性的片段。可用重组法或化学合成法制备这些多肽。此处优选的OB多肽包括具有SEQ ID NO：2、4、5或6的氨基酸序列的多肽或等位变异体或类似物，包括其片段。
本发明的OB多肽的免疫原性片段包括：Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQ ID NO：18)；Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala(SEQ ID NO：19)；Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO：20)；和Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys(SEQ ID NO：21)。
人类OB多肽类似物包括具有SEQ ID NO：4和6的人类氨基酸序列的多肽，其中氨基酸53，56，71，85，89，92，95，98，110，118，121，122，126，127，128，129，132，139，157，159，163和166(对应SEQ ID NO：4的编号)的一个或多个被其它氨基酸替换，例如SEQ ID NO：2给出的小鼠OB多肽的趋异(divergent)氨基酸，或丙氨酸。这种类似物还包括那些多肽，其中：(a)53位的丝氨酸残基被甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或苏氨酸替换；(b)98位的丝氨酸残基被甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或苏氨酸替换；(c)92位的精氨酸残基被天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸替换。本发明的OB多肽类似物优选地与SEQ ID NO：2、4、5或6给出的人类OB多肽氨基酸序列有不小于百分之八十三的氨基酸序列同源性。
本发明的另一些人类OB多肽类似物具有SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列并且：(a)一个或多个天冬氨酸残基被谷氨酸替换；(b)一个或多个异亮氨酸残基被亮氨酸替换；(c)一个或多个甘氨酸或缬氨酸残基被丙氨酸替换；(d)一个或多个精氨酸残基被组氨酸替换；(e)一个或多个酪氨酸或苯丙氨酸残基被色氨酸替换；(f)121到128残基的(对应SEQ ID NO：4的编号)一个或多个被甘氨酸或丙氨酸替换；以及(g)54到60位或118到166位(对应SEQ ID NO：4的编号的一个或多个残基被赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或脯氨酸替换。
本发明优选的人类OB多肽截短类似物包括这样一些，其中(对应SEQ ID NO：4的编号)：(a)121位到128位的一个或多个残基缺失；(b)残基1-116缺失；(c)残基1-21和54到167缺失；(d)残基1-60和117到167缺失；(e)残基1-60缺失；(f)残基1-53缺失；以及(g)次部分(subpart)(a)的类似物，其中残基1-21缺失。缺少21个氨基酸的“信号”序列(例如SEQ ID NO：4的氨基酸1到21)的本发明的OB多肽和ob多肽类似物可以具有N末端氨基酸或氨基酸序列，诸如(1)蛋氨酸，(2)甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：38)，(3)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：98)，(4)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：26)，(5)谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：27)，(6)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸序列(SEQID NO：28)；(7)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID NO：99)和(8)甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列。
本发明的OB多肽衍生物有一个或多个连于其上的化学基元(moiety)，包括水溶性聚合物如聚乙二醇。聚乙二醇衍生得到的衍生物可以是单、双、三或四聚乙二醇化的，例如N末端单聚乙二醇化的。本发明的ob多肽的优选N末端单聚乙二醇化衍生物包括含有SEQID NO：4的氨基酸残基22到167或SEQ ID NO：6的残基22到166的OB多肽，可选地在21位有一个(聚乙二醇化)蛋氨酸。
如上述，本发明提供的分离的核酸分子编码OB多肽、等位变异体或类似物，包括片段。特别提供的是用于保证OB多肽表达的DNA分子，该OB多肽在哺乳动物中有调控体重的活性，所述DNA分子选自：(a)SEQ ID NO：1和3给出的DNA分子或其片段；(b)与(a)中定义的DNA分子杂交的DNA分子或其可杂交片段；和(c)编码能表达上述任一DNA分子编码的氨基酸序列的DNA分子。这种分子的示例是SEQ ID NO：22和24的人类基因组DNA分子。
本发明的优选DNA分子编码含有下列的氨基酸序列的多肽，(a)SEQ ID NO：2；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸22到167；(c)SEQ IDNO：4；(d)SEQ ID NO：4的氨基酸22到167；(e)SEQ ID NO：5；(f)SEQ ID NO：5的氨基酸22到166；和(g)SEQ ID NO：6；和(h)SEQ ID NO：6的氨基酸22到166，以及具有前述N末端氨基酸或氨基酸序列的多肽。作为说明，优选的DNA分子具有SEQ ID NO：3的蛋白质编码序列对应的序列，具体地说，具有编码氨基酸22到167的序列对应的序列。
本发明还提供了可与本发明的DNA分子杂交的检测标记的核酸分子，包括可与OB核酸非编码区杂交的核酸分子，该非编码区选自内含子、5′非编码区和3′非编码区。本发明还提供用于扩增编码ob多肽的人类基因组DNA的寡聚核苷酸引物，诸如SEQ ID NO：29到32给出的寡聚核苷酸。
本发明提供的载体包含本发明的上述DNA分子并优选地具有表达载体的形式，该表达载体含有经操作连接表达控制序列的DNA分子。本发明的单细胞宿主细胞用本发明的DNA分子或上述载体转化或转染。优选的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞及组织培养的人类细胞。作为说明，这种宿主细胞选自大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、DOS7、BSC1、BSC40、BMT10和Sf9细胞。此处优选的酵母宿主包括啤酒酵母、毕赤氏酵母、假丝酵母、汉逊氏酵母、球拟酵母。还提供了哺乳动物细胞，它含有ob多肽编码DNA序列，并经体外修饰，利用包括将表达调节序列插到ob多肽编码序列有功能的近处的同源重组事件使ob多肽更多地表达。表达调节序列可以是ob多肽表达，也可以不是，并能替代细胞中突变的ob多肽调节序列。
本发明提供的制备ob多肽的方法包括：(a)如上述在利于ob多肽表达的条件下培养细胞；和(b)回收表达的ob多肽。该操作方法也可伴有下述步骤：(c)在Ni螯合柱上层析多肽；和(d)凝胶过滤纯化多肽。在优选实施方案中，在(c)步之后(d)步之前，该方法包括在强阳离子交换柱上层析ob多肽。
本发明还提供对本发明的ob多肽有特异性的标记的及未标记的单克隆和多克隆抗体以及生产本发明的单克隆抗体的不死细胞系。本发明的抗体制备方法包括：(a)将ob多肽结合到载体蛋白上；(b)用(a)步的OB多肽片段-载体蛋白结合物与佐剂混合，免疫宿主动物；(c)由免疫的宿主动物获取抗体。
本发明提供用于测量样本中OB多肽存在的方法，包括：(a)在能够形成包含抗体和OB多肽的反应复合物的条件下将怀疑含有OB多肽的样本与特异性结合OB多肽的抗体(优选地结合在固体支持物上)接触；(b)检测样本中含有抗体和OB多肽的反应复合物的形成，其中检测到反应复合物的形成意味着样本中存在OB多肽。相应地提供用于评价生物样本中反应复合物形成的体外方法，包括：(a)用上述方法检测生物样本中反应复合物的形成；和(b)评价形成的反应复合物的量，该反应复合物的量对应于生物样本中OB多肽的水平。当检测或诊断与本发明的OB多肽水平升降相联系的疾病的存在时，做上述评价，将检测到的水平与正常受试者或受试者早些时候的OB多肽水平相比较。与正常或先前水平相比OB多肽水平升高显示与OB多肽水平上升相联系的疾病，而与正常水平相比OB多肽水平下降显示与OB多肽水平下降相联系的疾病。相应地提供了用于对与哺乳动物中的OB多肽水平上升或下降显示与OB多肽水平下降相联系的疾病的治疗的体外方法，包括如上述的评价从接受这种治疗的哺乳动物受试者在不同时间点取得的一系列生物样本中OB多肽水平。
本发明的药物组合物包括上述OB多肽及药用载体，可用于减轻动物体重的治疗中。本发明的另一些用于增加动物体重的治疗方法的药物组合物包括OB多肽的拮抗物，优选地选自结合并中和OB多肽活性的抗体，结合但不激活OB多肽受体的OB多肽片段以及OB多肽的小分子拮抗物。本发明还提供相应地用于增加或减轻个体体重的改善体形的美容组合物，这些组合物可用于改善个体体形的美容方法。这种美容组合物以适当剂量对个体给药，足以将个体的体重调控到需要的水平。
本发明还涉及本发明的核酸分子的应用，以及可与编码本发明的OB多肽的核酸杂交的反义核酸分子，以生产可改变动物体重(例如基因疗法)的药品。还提供了本发明的OB多肽或拮抗剂在生产用于改变动物体重的药品上的应用。该药品可用来改变哺乳动物的体重以治疗糖尿病、高血压和高胆固醇等病症以及作为与治疗该类疾病的药品的组合疗法的一部分。此类药品可用于如下治疗方法，包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻腔、口腔或肺部给药系统。
这里给出的数据表明本发明的OB多肽主要由哺乳动物脂肪细胞分泌并且该多肽起激素作用。
这里的实施例表明OB多肽，此处又称“瘠素(leptin)”，在大鼠、小鼠和人类血浆中循环。瘠素不存在于ob/ob小鼠的血浆，以十倍高的浓度存在于db/db小鼠，以二十倍高的浓度存在于fa/fa大鼠。最显著的是，每日注射重组瘠素能显著减轻ob/ob小鼠的身体重量，明显影响野生型小鼠的体重，对db/db小鼠无作用。
另一方面，一个物种的ob多肽在另一物种中具有生物活性。特别地，人的OB多肽在小鼠中有活性。
首先，本发明的调控物含有核酸分子，包括重组DNA分子(例如cDNA或包含cDNA的载体或分离的基因组DNA)或克隆的基因(即分离的基因组DNA)，或其简并变异体，它们编码本身作为此后定义的体重控制调控物的多肽，或保守的变异体或其片段，特别地这类片段缺少信号肽(此处又称成熟的OB多肽)，这些多肽具有图1A至E(SEQID NO：2)，图3(SEQ ID NO：4)，图5(SEQ ID NO：5)和图6(SEQID NO：6)给出的氨基酸序列。在特定的实施方案中，提供了鼠类和人类ob多肽的两个变异体的氨基酸序列。两种多肽均以谷酰胺49缺失形式存在，这可能是由于mRNA拼接异常。不同物种的OB多肽可能高度同源，如图4所示，鼠类和人类OB多肽的同源性超过80％。
这些核酸分子、重组DNA分子或克隆基因可能具有图1A至E(SEQ ID NO：1)和图2A和B(SEQ ID NO：3)给出的核苷酸序列或与它们给出的DNA编码序列互补。特别地，这种DNA分子可能是cDNA或分离自染色体的基因组DNA。本发明的核酸分子也可能对应DNA的5′和3′两侧序列和内含子DNA序列。相应地，本发明也涉及一种核酸的鉴定，该核酸具有选自图1A至E(SEQ ID NO：1)和此处的图2A和B(SEQ ID NO：3)，以及简并变异体、等位变异及相似同源分子的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以是DNA或RNA，包括其具有磷酸键或磷酸类似物键，例如硫代磷酸键的合成变异体。单链和双链序列均为本发明所需。
本发明进一步提供用作分子探针或聚合酶链式反应(PCR)扩增的引物的核酸分子，即合成的或天然的寡聚核苷酸，其序列对应于图1A至E(SEQ ID NO：1)，图2A和B(SEQ ID NO：3)和图20A至C(SEQ ID NO：22和24)给出的序列的一部分；或是编码序列的5′和3′两侧序列；或基因组DNA的内含子序列。特别地，本发明需要具有至少约10个核苷酸的核酸分子，其中该核酸分子的一段序列对应于图1A至E(SEQ ID NO：1)、图2A和B(SEQ ID NO：3)和图20A至C(SEQ ID NO：22)的核苷酸序列中有相同数目核苷酸的核苷酸序列，或是与之互补的序列。更优选地，该核酸序列有至少20个核苷酸。在本发明的一个实施方案中，该寡聚核苷酸是探针，并作了检测标记，例如用放射性核素(诸如32P)或酶标记。
另一方面，本发明提供一种克隆载体，它含有编码ob多肽的本发明的核酸，和一种细菌、昆虫或哺乳动物表达载体，它含有编码ob多肽的本发明的核酸分子，其经操作连接表达控制序列。相应地，本发明进一步涉及一种宿主细胞，诸如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，其被适当表达载体转染或转化，并且相应地涉及上述结构在制备本发明的调控物中的应用。
在另一方面，本发明涉及结合ob多肽的抗体。此类抗体可以制得抗全长多肽或其抗原性片段。一方面，此类抗体抑制ob多肽的功能(即体重和脂肪结构的调控)活性。另一方面，抗体可用来决定血浆或血清中循环ob多肽的水平。在另一方面，区域特异性抗体，特别是单克隆抗体，可用作OB多肽结构的探针。
所有上述材料在此处均被试图用作体重和脂肪结构的调控物，并依此可用于不同情况。特别地，本发明涉及诊断和治疗应用，以及某些农业应用，所有这些均依赖于此处定义的调控物(包括核酸分子和肽类)的应用。而且，当肥胖症或相反的极度瘦弱代表的不良身体状况可用本发明的一种或几种调控物给药来治疗时，调控体重就具有特定的医疗应用和价值。
因此，提出一种调控哺乳动物体重的方法，包括控制核酸编码的蛋白质的，该核酸序列选自图1A至E(SEQ ID NO：1)和序列，图2A和B(SEQ ID NO：3)的序列和其简并及等位变异体。通过基因疗法将所研究的核苷酸引入患者或宿主的脂肪细胞来控制或降低肥胖症，可以影响这种控制。相反，当涉及过度体重减轻，如神经性厌食，癌症或爱滋病等情况存在并正在治疗时可试图并寻求制备该核苷酸的拮抗剂，如反义分子并给药。这些结构可用相似的方式引入核苷酸，直接导入脂肪细胞来造成这些变化。
相应地，图1A至E、3、5和6(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5和SEQ ID NO：6)定义的蛋白质、保守的变异体、其活性片段和同源小分子可配制成药物，用于为治疗用途的直接给药，以降低或控制过多的体内脂肪或体重增加。相应地，可制备所述蛋白质材料的抗体或其它拮抗物如其片段，并类似地给药以获得相反的效果。相应地，本发明更有利于制备一种药用组合物，它含有本发明的OB多肽，或可选地含有其拮抗物，并与药用载体或赋形剂相混合。
另外，本发明的OB多肽可因其美容效果而施用，例如，通过减少脂肪储备而改善体形。为了其美容效果，OB多肽可单独使用或与其它美容措施如手术联合使用。
本核苷酸及相应肽类的诊断应用扩展至用核酸来鉴定其等位变异体的进一步突变，以研制一整套用于诊断和治疗应用的活性核苷酸材料。特别地，可鉴定所研究的核苷酸的同源或异源突变，以更精确地将患者的状况定量化来确定个体患肥胖症的潜在危险。特别地，异源突变在此处被视作与轻微或中等肥胖症有关，而同源突变与更显著的或严重的肥胖状况有关。用上述已确定的材料作标准可进行相应的DNA检查，以协助对特定趋势的准确长期预诊，从而建议改变饮食或其它个人习惯或进行直接的医疗干预来避免这些情况。
本发明的诊断用途可扩展至测量细胞样本或取自受试者的生物提取物(或样本)中本发明的调控物的存在与范围，从而可证实这些受试样本中的核酸(基因组DNA或mRNA)和/或蛋白质水平。假定核苷酸活性增加及所得到的蛋白质的存在反映了受试者抑制肥胖症的能力，检查这些肥胖受试者的结果的医生即可确定与本发明的核酸的存在和活性失调不同的因素是肥胖现象的原因。相反，核酸和/或表达的蛋白质水平降低可能表明必须提高这些水平来治疗这种肥胖现象，然后可实施适当的疗法。
进一步，图1A至E和2A和B给出的所发现的核苷酸代表如上简述的用于测量相应RNA的cDNA。类似地，可制备对应于图1A至E和3的多肽的重组蛋白质材料并适当地标记用于例如放射性免疫检测来，例如，测量脂肪和/或OB蛋白的血浆水平，或者检测组织例如下丘脑上OB受体的存在与水平。
更进一步，本发明不仅试图鉴定此处给出的核苷酸和对应的蛋白质，还试图阐明这些物质的受体。在这种情况下，可制备图1A至E，3，5，和/或6的多肽并用来筛选适当的表达文库来分离活性受体。然后可以克隆受体，再单独用受体或与配体共用来筛选可能具备对此处的调控物有相似活性的小分子。
更进一步，本发明涉及药用组合物，它包括特定的调控物，优选的是具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6给出的序列的多肽，它们的抗体，相应的小分子激动剂或拮抗剂，或活性片段，它们被制成用于多种施用方式的适于治疗的制剂。该制剂可以包含药用载体或者所需要的其它佐剂，其有效剂量范围在不同情况下由医生或临床医师决定。
相应地，本发明的主要目的是提供在此定义的纯态体重调控物，它表现出与哺乳动物脂肪含量和肥胖症控制与变化相关的某些特征与活性。
本发明另一目的是提供检测和测量此处提出的体重调控物的方法，对于某些其中该调控物的水平的变化是或者可能是一种定性特征的病理情况，它可以作为一种有效诊断和监测的手段。
本发明的另一目的是提供一种方法以及相关的检测系统，用于筛选例如药物、试剂等物质，这些物质对于在哺乳动物中模仿或抑制本发明的调控物可能有效。
本发明的另一目的是提供一种方法，该方法可以控制哺乳动物的脂肪含量和体重，和/或治疗某些以异常体重降低或升高为特征的病理情况。
本发明的另一目的是制备遗传构建体以应用于基因疗法和/或相似疗法的药物组合物，其中含有基于一种或几种调控物、结合配体或可能控制其生产或模仿或拮抗其活性的试剂。
以下述说明性附图为参考并结合下面的描述，本领域技术人员可认识到其它研究目标及其优点。
                 附图简述
图1(A至E)显示得自鼠类OB cDNA的核酸序列(SEQ IDNO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。39个碱基对的5′导肽之后是预计的167个氨基酸的开放阅读框架和约3.7kb的3′未转录序列。(在前面提交的申请，序列号No.08/347,563，提交日期1994年11月30日和序列号08/438,431，提交日期1995年5月10日中，附加的58残基5′非编码序列后来被证明是克隆伪迹。该伪迹不能定位于编码区，图1所给出的39残基5′非编码区，或基因的3′非编码区。)显示了3′不转录序列的共约2500碱基对。观察以及用SigSeq计算机程序分析所预计的氨基酸序列，显示信号序列的存在(下划线)。注意到cDNA的微观不均匀性，约70％的cDNA的第49位密码子是谷酰胺密码子，而30％的不是(图5和6，见下)。该氨基酸是下划线的，C57BL/6Job/ob小鼠(1J小鼠)中突变的精氨酸密码子也是下划线的。
图2(A和B)显示来自人类OB cDNA的核酸序列(SEQ IDNO：3)。核苷酸编号从1到701，起始位点在核苷酸46，终止于核苷酸550。
图3显示由对应于图2A和B的核酸序列的人类OB基因推导出的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。氨基酸编号1从到167。信号序列切割位点位于氨基酸21(Ala)之后，故成熟蛋白质起自氨基酸22(Val)止于氨基酸167(Cys)。
图4显示推导出的鼠类(SEQ ID NO：2)和人类(SEQ ID NO：4)氨基酸序列的比较。推导的人类OB氨基酸序列与小鼠的高度同源。保守变化用虚线标出，非保守变化由星号标出。可变的谷酰胺密码子是下划线的，C57BL/6J ob/ob(1J)小鼠中无义突变位置也是下划线的。总而言之，在氨基酸水平上有83％的一致性，尽管22位密码子缬氨酸(紧接信号序列下游)和117位半胱氨酸之间仅发现8个替换。
图5显示来自图3给出的鼠类OB基因的全长氨基酸序列(SEQ IDNO：5)，但缺少49位的谷酰胺。氨基酸编号从1到166。信号序列切割位点位于氨基酸21(Ala)之后(因而在谷酰胺49缺失之前)，故而成熟蛋白起于氨基酸22(Val)止于氨基酸166(Cys)。
图6显示来自图4给出的人类OB基因的全长氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，但缺少49位的谷酰胺。氨基酸编号从1到166。信号序列切割位点位于氨基酸21(Ala)之后(因而在49缺失之前)，故而成熟蛋白起于氨基酸22(Val)止于氨基酸166(Cys)。
图7(A)ob在鼠类染色体上位置的物理图谱，和YAC与P1克隆图谱。“M和N”对应Mul I和Not I限制位点。编号对应于在计数的1606个减数分裂后代中ob区重组的个体动物数。Met，Pax4，D6Rck39，D6Rck13和Cpa指ob区上结合DNA探针的位置。用D6Rck13和Pax-4作探针分离出YAC，未端用小载体(vectorette)PCR和/或质粒末端补救(plasmid end rescue)回收进而用于分离新的YAC。(B)得到的YAC库(contig)，该库中一个YAC-Y902A09925-是嵌合体。每种用于确定重组动物的基因型的探针在括号中显示。(6)对应YAC107；(5)对应M16(+)(或M16(pLUS))；(4)对应adu(+)；(3)对应aad(pICL)；(2)对应53(pICL)；和(1)对应53(+)。(C)用选取的YAC末端探针分离到的噬菌体P1克隆的P1库。在用YAC YB6S2F12(末端(4))(此处又称adu(+))远端分离到的P1克隆中分离得ob基因。
图8显示用PCR扩增并表征的第四外显子捕获实验的192个独立分离物的溴乙锭染色照片。
图9显示怀疑携带ob的PCR扩增克隆的溴乙锭染色照片。不携带伪迹的7个克隆均用PCR再扩增，1％琼脂糖凝胶用TBE电泳，溴乙锭染色。分子量标记(最左边未编码的泳道)是可购置的“1KB阶梯”。泳道1-1D12克隆，含有“HIV序列”。泳道2-1F1克隆，ob区之外的新克隆。泳道3-1H3克隆。泳道4-2B2克隆，与1F1相同。泳道5-2G7克隆，含有ob外显子。泳道6-2G1克隆1，与1F1相同。泳道7-2H1克隆，不含插入序列。
图10显示2G7克隆(SEQ ID NO：7)的序列，它包含一个编码一部分OB基因的外显子。用来扩增该外显子的引物序列在图中被加框(SEQ ID NO：8和9)。
图11显示(A)用2G7引物和肌动蛋白引物对同一小鼠不同组织的mRNA的反转录-PCR(RT-PCR)分析。用寡聚dT作引物反转录的100ng总RNA来进行RT-PCR反应用于合成第一条cDNA链。PCR扩增反应进行35轮：94℃变性1分钟；55℃杂交1分钟；72℃扩展2分钟，每一轮还有1分钟的第二次自扩展。RT-PCR产物溶于2％低熔点琼脂糖凝胶用1×TBE缓冲液走胶。(B)用PCR标记的2G7作探针对小鼠不同器官的mRNA的Northern印迹。10μg的每种组织的总RNA在带有甲醛的琼脂糖凝胶上电泳。探针于65℃ Rapid Hybe(·Amersham)中杂交。曝光1小时后可见自显影信号。本实验给出的是24小时曝光的结果。
图12(A)从每种列出的小鼠品系的脂肪细胞(白脂肪组织)RNA的RT-PCR反应物的溴乙锭染色。用寡聚dT和逆转录酶反转录每种样本的总RNA(100ng)，得到的单链cDNA用2G7引物(下带)或肌动蛋白引物(上带)PCR扩增。2G7和肌动蛋白引物在同一PCR反应中。产物在1％琼脂糖TBE凝胶上走胶。(B)对应于(A)的Northem分析。每种所述品系的10μg脂肪细胞(白脂肪组织)RNA走胶，如上述图11B用PCR标记2G7探针探测。C57BL/6J ob/ob(1J)系与少脂肪同窝仔相比，白脂肪RNA中2G7 mRNA水平可见约20倍增长。在SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J)小鼠的2G7 RNA即使曝光两个星期后用RT-PCR和Northern实验也没有检测信号。给出的是24小时自显影曝光。同一滤膜用肌动蛋白探针杂交(图底部)
图13是另外的2J动物与对照动物的Northern分析，证实了2J动物中不存在ob mRNA。如图11和12进行Northem分析。此时对照RNA是ap2，一种脂肪特异性转录物。ap2带的密度并无意义。
图14比较了点突变区C57BL/6J(正常)和C57BL/6J ob/ob(1J)小鼠的DNA序列，该点突变可导致将早熟终止密码子(无义突变)引入突变cDNA。ob/ob小鼠有C→T突变，改变了105位的精氨酸残基。该碱基变化由自动DNA测序仪的输出给出。用来自5′和3′不翻译区的引物对两种品系(+/+和ob/ob)的白脂肪RNA进行RT-PCR。RT-PCR产物用凝胶纯化，再用沿编码序列的两条链的引物手工或用应用生物系统公司(Applied Biosystems.Ins.)373型自动测序仪直接测序。
图15(A)所列出的两种小鼠品系的基因组DNA的Southern印迹。用所示限制酶限制消化约5μg DNA(由肝、肾或脾制备的基因组DNA)。然后将DNA在1％琼脂糖TBE凝胶上电泳，再用PCR标记的2G7探测。用Bgl II的限制消化显示SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J)DNA中增加了约(至多)9KB Bgl II片段的大小。用其它任何限制酶均检测不到RFLP。基因组DNA的初步限制定位显示多形性Bgl II位点在转录起始位点上游约7KB。没有任何其它受试酶超过mRNA起始位点。(B)SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J系中Bgl II多形性的分离。同类系SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J)群体中同一代的6个肥胖和5个瘦的后代通过对(A)给出的Bgl II多形性评分测定基因型。所有表型肥胖的动物对多形性Bgl II片段的大等位基因均同源。“对照”泳道DNA制备自与SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J群体中分开喂养的不相关SM/Ckc-+Dac+/+小鼠。
图16是所述物种的EcoRI消化的基因组DNA的Southern印迹，用的是OB cDNA作探针(即，ZOO印迹)。即使在中度严谨杂交后每个哺乳动物样本中都可检测出杂交信号。本实验的猫DNA轻微降解。受限DNA在1％琼脂糖TBE凝胶上走胶，再转移到imobilon膜上探测。滤膜在65℃杂交，65℃用2×SSC/0.2％SDS漂洗两次共20分钟，用Kodak(柯达)(罗彻斯特，纽约州)X-OMAT胶片曝光3天。
图17显示载体pET-15b(Novagen)(SEQ ID NO：11和12)的表达克隆区。
图18显示对重组成熟鼠类ob与His-tag的融合(A)和成熟人类OB与His-tag的融合(B)的His结合树脂(Ni)柱洗脱物的分析。分别用载体pETM9和pETH14转化细菌。在最佳条件下引入1mMIPTG，转化细菌能生产100-300μg/ml OB融合蛋白，该蛋白主要在包涵体中。包涵体用6M盐酸胍或脲溶解后，融合蛋白(存在于裂解上清液)加到10ml1×结合缓冲液与脲中的His-结合树脂(Ni)柱上。逐步用5ml等份的20μM，60μM和300μM咪唑，最后用洗脱缓冲液(sturp buffer)洗柱。在15％丙烯酰胺凝胶上对等份样品分析OB多肽融合物是否存在。每条泳道含有相当于100μl细菌提取物的物质。
图19(A)OB RNA的体外翻译。人类OB cDNA亚克隆到pGEM载体中。将质粒线性化，用Sp6聚合酶合成正链RNA。当猫胰微粒体膜存在或不存在时翻译体外合成的RNA。体外翻译后见到约18KD的初级翻译产物。在反应物中加入微粒体膜后有比初级翻译产物小约2KD的另一翻译产物出现。缺少编码的信号序列的白介素-1αRNA翻译产物的大小当加入微粒体膜时不变。这些数据显示有功能的信号序列的存在。(B)当蛋白酶K存在与不存在时的体外翻译。蛋白酶处理使18KD的初级翻译产物完全蛋白水解，而16KD的经处理的形式不受影响。用0.1％TRITON-X100将微粒体可渗透化(permeabilization)使处理过的形式对蛋白酶敏感。这些结果表明产物翻译到微粒体的腔内。
图20(A至E)人类OB基因序列(SEQ ID NO：22和24)。(F)鼠类OB基因的示意图。(G)人类OB基因的示意图。(F)与(G)中起始与终止密码子下划线。并无证据显示人类基因中存在与小鼠第一内含子同源的第一内含子存在，但也不能排除其存在。
图21显示一种用来实现毕赤氏酵母中OB重组表达的克隆方案的示意图。(A)带有α-交配因子信号序列的OB表达载体。(B)重组融合蛋白的结构示意图，包括显示XhoI位点和推测的KEX-2和STE-13切割位点的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)和KEX-2切割后存在的N末端富余氨基酸(SEQ ID NO：27)。(C)生产成熟OB的另一种方案，涉及制备一种构建体、其氨基酸序列对应于紧靠成熟ob多肽序列(SEQ ID NO：28)的XhoI切割位点和KEX-2切割位点。
图22在毕赤氏酵母中另一表达方案。(A)带有His-tag的OB融合物表达载体，取自α-交配因子信号序列(SEQ ID NO：33)控制下的pET表达系统。(B)带有His-tag的重组OB融合蛋白的结构示意图，它包括α-交配因子信号序列、假设的KEX-2和STE-13切割位点，His-tag和凝血酶切割位点，它可产生带有3个富余N末端氨基酸残基的OB。
图23(A)转化毕赤氏酵母中鼠类OB(两种微异源性形式，即含有及缺失Gln49)表达的PAGE分析。预测的约16KD的带可见于转化酵母培养液(泳道2与泳道3)，而不见于未转化酵母的培养液(泳道1)。(B)在羧甲基纤维素(一种弱阳离子交换剂)上部分纯化的重组OB多肽的PAGE分析。约16KD的带明显见于柱的级分3和4，用250mM NaCl洗脱。泳道1-上样的样品，泳道2-流过(flowthrough)，泳道3-5-用250mM NaCl洗脱的级分。
图24显示在小鼠血浆中循环的OB蛋白。(A)小鼠血的免疫沉淀。0.5ml的小鼠血浆用未偶联的琼脂糖(Sepharose)预清理，再与偶联到琼脂糖4B小珠上的免疫纯化抗OB抗体温育过夜。免疫沉淀在15％SDS-PAGE凝胶上分开，转移并用抗OB抗体作Western印迹。该蛋白以约16KD分子量迁移到与酵母中表达的成熟小鼠ob蛋白相同的位置。该蛋白不见于C57BL/6J ob/ob小鼠，相对于野生型小鼠在C57BLB/Ks db/db小鼠血浆中增加10倍。有人提示db小鼠过量生产OB蛋白，仅次于(secondary to)其抵抗作用。(B)肥胖大鼠中OB水平增加。肥胖大鼠之所以肥胖是由于大鼠染色体5上的隐性突变。遗传数据表明db小鼠中突变的相同基因上有缺陷。肥胖大鼠与不肥胖的(或瘦的)同窝仔的血浆免疫沉淀后进行western印迹。在突变动物中见到OB循环水平上升20倍。(C)小鼠血浆中OB蛋白的定位。在ob小鼠100λ血浆中加入递增量的重组小鼠蛋白并免疫沉淀。western印迹的信号强度与野生型小鼠100λ血浆的相比，见到与重组蛋白量增加相伴的信号强度线性增加，表明免疫沉淀时抗体过量。在野生型血浆样品和带有2ng重组蛋白的样品中也见到相似信号，表明小鼠血浆中循环水平约20ng/ml。(D)脂肪组织提取物中的OB蛋白。从db和野生型小鼠制备小鼠脂肪组织的细胞质提取物。western印迹显示从db小鼠制备的提取物中16KD蛋白质水平升高。
图25显示在人体血浆中OB蛋白以不同水平循环。(A)人体血浆的western印迹。血浆样品取自6位不肥胖的志愿者。免疫沉淀与western印迹显示有免疫活性的16KD蛋白的存在，大小与酵母中表达的重组146氨基酸人蛋白相同。6个样品中可见到蛋白质水平的变化。(B)人类ob的ELISA(酶联免疫测试)。微滴定板用免疫纯化的抗人类OB抗体包被。在板上加已知量的重组蛋白，用免疫纯化的生物素化抗ob抗体检测。414nm吸收对已知浓度OB作图得标准曲线。得到的标准曲线显示该测试能够检测至少1ng/ml的人类OB蛋白。(C)人体血浆中OB蛋白的定量。用来自6名瘦志愿者的100λ血浆和B图版用过的标准作ELISA免疫测试。见到OB蛋白水平变化范围为HP1中的2ng/ml到HP6中的15ng/ml。这些数据与图版A中的western印迹数据相符。
图26显示OB蛋白形成分子内或分子间二硫键。(A)还原条件与非还原条件下的western印迹。通过在样品缓冲液中添加或不添加还原剂来重复鼠类和人类血浆的western印迹。当样品缓冲液中不含β-巯基乙醇时，db血浆的免疫沉淀明显以16KD和32KD的分子质量迁移。在缓冲液中加入β-巯基乙醇，32KD部分消失(见图24)。小鼠蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达时也得到该结果。这种情况下，小鼠OB蛋白迁移到二聚体的位置。还原条件下，纯化的重组小鼠蛋白明显以16KD分子量迁移、表明32KD分子形式是一个或两个分子间二硫键的结果。还原与非还原条件下(数据未给出)体内表达与巴斯德毕赤氏酵母中表达的人蛋白均以16KD分子量迁移。(B)酵母中表达的人蛋白含有一个分子内的二硫键。分泌的蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达系统中表达时通常能形成正确构象。146氨基酸的成熟人类蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达，用包括IMAC和凝胶过滤的两步纯化步骤从酵母培养基中纯化出来。在用溴化氰切割前后对纯化的重组蛋白进行质谱分析。溴化氰在蛋氨酸残基羧基端切割。重组酵母蛋白的分子质量为16,024±3Da(计算的分子质量＝16,024Da)。溴化氰在蛋白质序列上氨基酸75，89和157的蛋氨酸后切割。测得质量为8435.6Da的溴化氰片段对应于Cys-117和Cys-167之间二硫键连接的氨基酸90-157和158-167(计算的分子质量＝8434.5Da)N.D.＝未检测到(note detected)。
图27显示了有生物活性的重组蛋白的制备。对应于145氨基酸的成熟小鼠OB的核苷酸序列克隆到pET 15b表达载体中。该pET载体在克隆的序列上游插入多聚组氨酸(His-tag)，故能有效地用固定化金属亲和层析(IMAC)纯化。细菌裂解后，重组细菌蛋白先分配在不溶性膜级分中。膜级分用盐酸胍溶解后装入IMAC柱。按所示用浓度递增的咪唑逐步洗脱蛋白。洗脱的蛋白重折叠后用凝血酶处理去除His-tag，描述如下。可溶蛋白的终产率是45ng每ml细菌培养物。
图28显示OB蛋白的生物效应。食物摄入的时间进程(图版A-C)和体重(图版D-F)。一组10个动物接受了或者每日腹腔内注射OB蛋白，剂量为5mg/kg/天(实心方块)，每日注射PBS(实心圆)或无处理(实心三角)。治疗组包括C57Bl/6J ob/ob小鼠(图版A和D)，C57Bl/Ks db/db小鼠(图版B和E)以及CBAJ+/+小鼠(图版C和F)。每日测量小鼠的食物摄入量，如所示每三到四天间隔记录体重。(以克为单位的体重比例对野生型小鼠和ob以及db小鼠不同)。接受蛋白的ob小鼠第一次注射后食物摄入量下降，过4天后稳定在假注射水平的约40％(p＜0.001)。这些动物的体重平均减少1.3克/天，三星期后稳定于起始体重的约60％的水平(p＜0.0001)。db小鼠中未表现蛋白的效果。CBA/J小鼠中在早先两个时间点(P＜0.02)中观察到对体重小而显著的影响。每次测量的标准差由一条形描绘，这些结果的统计置信度见于表1。
图29显示成对饲养ob小鼠的结果。(A)一组4个C57Bl/6J ob/ob小鼠饲喂与接受重组蛋白的那组ob小鼠消费量相同量的食物，过5，8和12天后计算两组的体重减少。食物限量的小鼠(斜线条)比接受蛋白的ob小鼠(实心条)减轻的体重要少(P＜0.02)。该结果显示OB蛋白的体重减轻效果是由于食物摄入和能量消耗。(B)一个接受处理的ob小鼠的照片。给出的是两只C57Bl/6J ob/ob小鼠。左边的小鼠接受PBS，体重65克，即起始体重。右边的小鼠每日接受重组OB蛋白注射。该动物的起始体重也是65克，蛋白注射3星期后体重为38克。(C)受处理与未受处理的ob小鼠的肝。给出的是受处理的与未受处理的C57Bl/6J ob/ob小鼠。接受PBS的小鼠的肝看来就胖，重5.04克。接受重组蛋白的小鼠的肝外观正常，重2.23克。
图30显示ob与脂肪组织的原位杂交。用Sp6和T7聚合酶与毛地黄毒苷(Digoxigenin)体外标记有义和反义ob RNA。将八周大C57Bl/Ks小鼠(标记为野生型)和C57Bl/Ks db/db小鼠(标记为db)附睾脂肪垫的脂肪组织石蜡包埋切片，与用标记的RNA杂交。图中脂滴为细胞内未染色的囊泡。细胞质为细胞边缘的一圈薄缘，与细胞膜不可分。只有用反义探针在野生型切片中才能检测到视场(field)中所有脂肪细胞的杂交，并且db/db动物组织切片中见到(杂交)水平大大增加。
图31显示OB RNA体内和体外在脂肪细胞中表达。八种不同来源的总RNA(10微克)走电泳作印迹并与ob探针杂交。首先，利用胶原酶消化后细胞浮力的不同来纯化脂肪细胞。OB RNA只存在于脂肪细胞成分。泳道S显示基管成分，泳道A显示脂肪细胞成分。另外，OB RNA在泳道U未分化的3T3-442前脂肪细胞中不表达。从这些细胞系分化的脂肪细胞清楚地显示可检测水平的OB mRNA(泳道D)。
图32显示OB RNA在所有脂肪组织沉积物中表达。所有检验过的脂肪组织沉积物均表达ob RNA。腹股沟脂肪垫RNA水平有些低，尽管不同实验中信号水平有变化。(图31A)泳道(1)附睾(2)腹股沟(3)小腹(4)子宫周围脂肪垫。褐色脂肪也表达低水平的OBRNA。(图31B)动物圈养于4℃一周，褐色脂肪中的OB表达水平不变，但是受冷诱导的褐色脂肪特异性OCP UNA的丰度却增加了5倍。
图33描绘了db/db与硫代葡糖金处理过的小鼠中OB RNA的表达。db/db与硫代葡糖金(GTG)处理过的小鼠的子宫周围脂肪垫的总RNA经电泳与Northern印迹。已知单独剂量给药的GTG能诱导特定的下丘脑损伤而导致肥胖。(A)一月大CBA雌性小鼠用GTG(0.2mg/g)处理，结果受处理小鼠比对照小鼠(＜5g)增加了＞20g。(B)OB探针与db/db和GTG处理的小鼠的RNA杂交显示ob RNA相对于对照RNA(肌动蛋白或GAPDH)丰度上增加20倍。
图34显示人类RNA的Northern印迹分析。如图所示含有10mg人类脂肪组织(FAT，图版A)的总RNA和2mg其它人类组织(图版B)的polyA+RNA的Northern印迹与人类ob或人类β-肌动蛋白探针杂交。对脂肪组织含RNA见到约4.5kb的强信号。与polyA+RNA的杂交在心(HE)和胎盘(PL)显示可检测信号，而在脑(BR)，胸(LU)，肝(LI)，骨胳肌(SM)，、肾(KI)和胰(PA)中未检测到OBRNA。每种情况下均给出放射自显影曝光长度。值得注意的是，胎盘RNA中见到的低分子量带的产生原因(例如选择拼接，RNA降解)未知。
图35显示含有人类OB基因和8个微型卫星标记(microsatellitemarker的YAC结构区(contig)。描绘了由SEGMAP/3.29版[Green等人，PCR方法应用(PCR Methods Applic)1：77-90(1991)]导出的含有人类OB基因的染色体7区域基于YAC的STS-含量图。19个单一性排列的STS(见表3)列于上部。8个微型卫星特异性STS用星号标出(见表4)。还给出对应于Pax4和OB基因的STS以及相对于该结构区(contig)的着丝粒(CEN)和7q端粒(TEL)上预计的位置。43个YAC克隆每一个均由水平条形描绘，左边给出名称，估计的YAC大小(以kb为单位，用脉冲电场凝胶电泳测量)给在括号里。STS在YAC中的存在用描黑的圈在适当位置标出。当STS对应YAC插入序列末端时，则在其来源的YAC的首端(靠近STS名称)和末端用方块围住对应的圈。对于七个底部的YAC(在水平虚线下)，未能检测到一个或多个预计会存在(基于建立的STS顺序)的STS(通过用相应STS特异性PCR检测至少两次检测每个YAC证实而得)，这用适当位置的空心圆表示。大多数YAC从人-仓鼠杂种细胞得到的文库[Green等人，基因组学，25：170-183(1995)]中分离得到，并给出其库名。其余的YAC从总人类基因组文库中分离得，表3给出其原来的文库位置。三个通过FISH分析找到的YAC(yWSS 691，yWSS 999，yWSS 2935)的名字加框以与7q31.3对应(map)。该结构区以“未经计算”的形式给出，其中YAC大小没有用来估计克隆重叠或STS间隔，因而所有STS以等距形式给出。在“计算过的”形式中，YAC大小用来估计隔开每对相邻STS的相对距离以及克隆重叠程度，全部YAC结构区看上去仅跨约2Mb。
                      发明详述
本发明涉及一种在此被称为ob多肽或瘠素的蛋白的说明及发现，编码该蛋白的核酸，包括其简并变异体，例如加入了用于在某个特定表达系统中表达的最适密码子，该蛋白表现控制哺乳动物体重的能力。所研究的核酸代表对应于小鼠和人类OB多肽的编码序列，推想可能在调节体重与肥胖中起关键作用。此处的列出的数据显示本发明的核酸的多肽产物被表达它的细胞分泌，该多肽作为激素起作用。其他的实验数据显示OB多肽在治疗携带ob基因突变的小鼠的肥胖症中十分有效。另外，OB多肽的高单次剂量或中等连续剂量影响正常(野生型)小鼠的体重减少。
另外，此处的实施例表明OB多肽，又称“瘠素”，在大鼠，小鼠和人血浆中循环。瘠素不见于ob/ob小鼠的血浆，在db/db小鼠血浆中以10倍浓度存在，在fa/fa大鼠中以20倍浓度存在。最明显的是每日注射重组瘠素显著降低ob/ob小鼠的体重，明显影响野生型小鼠的体重，对db/db小鼠无作用。
另一方面，一个物种的OB多肽在另一物种中有生物活性。具体地说人类OB多肽在小鼠中有活性。
在首要方面，本发明意图鉴别起哺乳动物体重调控物作用的物质。具体地说，本发明涉及如何分离、纯化和测序小鼠与人体中某些对应于OB基因的核酸或其编码区，以及这些核酸表达的相应多肽，本发明因而包括对具有图1A至E(SEQ ID NO：1)和图2A和B(SEQ ID NO：3)给出的核苷酸顺序的核酸及其简并变异体，等位基因及片段的发现，它们均有调控体重和肥胖的活性。该核酸跟OB基因的对应预示它在诸如肥胖症以及其它以体重失常作为一种贡献因素的病症和功能失调等情况会有显著作用。本发明包括由本发明的核酸表达的蛋白质，特别是由图1A至E(SEQ ID NO：2)，图3(SEQ ID NO：4)，图5(SEQ ID NO：5)和图6(SEQ ID NO：6)给出的蛋白质，以及保守变异体，活性片段和同源小分子。
如前所述，体重调控物肽类或其结合物或其它配体或模拟或拮抗它们或控制其生产的试剂，可制备成药物组合物，连同适当载体用多种方式以有效的强度施用给病人，用于治疗体重的不正常波动和肥胖，它们本身或作为诸如癌症或爱滋病等不良病况的一部分。可采用许多给药手段，包括口服，鼻腔或其它形式透过粘膜给药，肠胃给药技术如皮下、静脉、腹腔注射，导管插入等等。识别因子或其亚单位的平均量可以变化，具体的量要基于有资格的医生或兽医的推荐和处方。
与上述相应，可以制备一个用于筛选能有效模仿或拮抗体重调控物活性的潜在药物的检验系统。可将体重调控物引入试验系统，也可将待测药物引入得到的细胞培养物中，然后观察培养物，来研究仅由于加入待试药物或由于加入一定量的已知体重调控物的作用导致的细胞活性改变。
如前述，这里描述的OB基因的分子克隆导致鉴定了一系列在分子水平上调控哺乳动物体重的物质。发现了本发明的调控物对于诊断和治疗肥胖症、与癌症相关的体重降低等营养失调以及治疗与肥胖症有关的病症如高血压，心脏病、II型糖尿病等有重要的意义。另外，若要调控家养动物的体重，基因产物也有潜在的农业用途。最后，若本发明的一种或几种调控物是分泌型分子，则可用它们来在生化上用表达克隆技术分离其受体。下面的具体参考OB基因的讨论也可一般地应用到构成本发明的一部分的一系列调控物，因而这些讨论具有广泛的深度与广度。
如上述，可用转基因手段评价OB多肽的功能活性。为此可采用转基因小鼠模型。用分离到的ob基因构建转基因载体，包括对应于野生型候选者基因的病毒载体或粘粒克隆(或噬菌体克隆)。可用公开的方法将粘粒引入转基因小鼠[Jaenisch，科学(Science)，240：1468-1474(1988)]。将该构建体被引入由C57BL/6J ob/ob的F1后代与DBA互交得到的受精卵。这些互交要用C57BL/6J ob/ob卵巢移植体来产生F1动物。用DBA/2J小鼠作反品系(counterstrain)，是由于它们有非刺鼠皮颜色，这在使用卵巢移植体时有用。为确定粘粒转基因动物中ob位点的基因型，可用紧密连锁RFLP或包围突变而在后代株中有多形性的微型卫星测定动物类型。当某个特定构建体使基因型肥胖的F2动物(用RFLP分析评分(score))变瘦并且不患糖尿病则表现出了互补。这种情况下，最终确定互补将需要把携带转基因的ob/ob或db/db动物与ob/ob或db/db卵巢转植体交配。在该杂交中，所有不携带转基因的N2动物均肥胖并表现胰岛素抗性/糖尿病，而不携带转基因的N2动物将是瘦的并且在血浆中含有正常葡萄糖与胰岛素浓度。在遗传意义上，转基因是阻遏突变。
另外，当OB基因以反义方向在野生型动物中表达时可通过检查其表型效应来检验它。该方法中，野生型等位基因的表述受阻遏，导致突变型表型。形成RNA·RNA双螺旋(反义-有义)使mRNA不能得到正常处理，导致部分或全部失去野生型基因作用。该技术可用在组织培养物中抑制TK合成，在果蝇中产生Kruppel突变的表型，在小鼠中产生Shivever突变的表型，Izant等人，细胞(Cell)36：1007-1015(1984)；Green等人，生化年鉴(Annu Rev.Biochem，)，53：569-597(1988)；Katsuki等人，科学，241：593-595(1989)。该方法有一重要优点，即仅需一小部分基因表达即可有效抑制全部同源mRNA的表达。该反义转基因将受控于本身的启动子或在正确细胞类型中表达且置于SV40多聚A位点上游的另一启动子。该转基因可用来得到转基因小鼠。转基因小鼠也可与卵巢转植体交配来检验ob杂合体是否对反义结构的作用更敏感。
长远看来，阐明OB基因产物(OB多肽或蛋白质)的生化功能对于鉴定影响其活性的激动剂和抑制剂小分子是有用的。
本专利说明书中通篇使用的各种术语的定义举例如下。
术语“体重调控物”，“调控物”，“调控物(复数)”和其它任何没有专门列出的变化在此均可通用，在本申请书和权利要求书中通篇用来指核苷酸和蛋白物质，后者包括单个或多个蛋白。更特别地，前述术语的范围也包括含有此处讨论及图1A至E(SEQ ID NO：1)和图2A和B(SEQ ID NO：3)给出的序列的核苷酸和DNA。相似地，具有本处讨论以及图1A至E(SEQ ID NO：2)和图3(SEQ ID NO：4)给出的氨基酸序列数据的蛋白质也是本发明所需，还有相关于此处以及权利要求中的材料提出的各种活性。相应地，也试图表现基本等价或改变活性的核苷酸，包括基本同源的类似物和等位变异体。同样也试图表现基本等价或改变活性的蛋白质，包括例如用定点诱变或生产调控物的宿主中偶发突变得到的特意修饰的蛋白质。
若组合物中按蛋白质、DNA、载体(依据A、B所属的种类)计算至少75％是“A”则说含“A”(A是单个蛋白质、DNA分子、载体、重组宿主细胞等)的组合物中基本不含“B”(“B”包含一种或多种污染物蛋白、DNA分子、载体等，但不包含A的消旋异构体形式)。优选地，组合物中按A+B的重量算“A”占至少90％，最优选地占至少99％的重量。也优选基本不含污染物的组合物，基仅含分子量单一的物质，并具有感兴趣的物质的活性或特征。
                     OB多肽
术语“蛋白质”指天然存在的多肽，“多肽”在这里可对于ob基因产物及其变异体交替使用。术语“成熟蛋白质”或“成熟多肽”专门指信号序列(或融合基因伙伴)被去除的OB基因产物。
如上述，在特定的实施方案中，本发明的ob多肽含有例如SEQ IDNO：2，4，5和6等给出的氨基酸序列，包括用保守氨基酸替换修饰的蛋白及其有生物活性的片段，类似物和衍生物。术语“生物活性”此处指多肽的一种特定作用，包括但不限于专一性结合物如受体，抗体或其它识别分子；在分子水平上激活信号转导途径；和/或在体内诱导由天然ob多肽介导的生理作用(或用拮抗剂抑制它)。OB多肽，包括片段类似物，衍生物，可通过人工合成制备，例如用熟知的固相或溶液相多肽合成技术。优选地采用固相合成技术。此外，可用熟知的基因工程技术制备本发明的OB多肽，描述见下。另一实施方案中，可以从生物流体例如血浆、血清、尿等，优选地从过度表达该多肽的受试者，如患有OB受体突变或与“肥胖”相关突变的肥胖病症的胖人，取人的血浆，血清或尿等，用免疫亲和纯化方法纯化OB多肽。
                    OB多肽片段
在具体实施方案中，本发明注意到天然存在的OB多肽片段可能有重要性。肽序列含有许多位点，例如精氨酸残基通常是蛋白水解切割的目标。全长多肽有可能在一个或多个这样的位点被切割，形成生物活性片段。这些有生物活性的片段可能激活或抑制OB多肽减轻体重的功能活性。
                    OB多肽的类似物
本发明特别地试图制备OB肽的类似物，其特征为具有OB多肽的一种生物活性，例如结合ob肽的特定结合物如OB受体。在一个实施方案中，该类似物激动OB活性，即其功能与ob肽相似。优选地，OB激动物比天然蛋白更有效。例如，OB激动物类似物与OB受体结合的亲合力更高或体内半衰期更长或二者兼有。然而，没有天然蛋白质有效的OB肽激动剂类似物也为本发明涉及。在另一实施方案中，类似物拮抗OB活性。例如，与OB受体结合但不诱导信号传导的OB类似物能竞争性抑制天然OB结合受体，因而降低体内OB活性。这种OB拮抗物也可能表现与ob肽不同的性质，例如体内半衰期更长(或更短)，与OB受体结合的亲合性更大(或更小)或二者兼有。
在一个实施方案中，OB肽的类似物是通过将多肽上对结构或功能并非必需的位置上的氨基酸替换掉而被修饰的OB肽。例如，既然人类OB肽在小鼠中有生物活性，将人与鼠氨基酸序列相比得到的趋异氨基酸残基替换会很可能得到有用的OB肽类似物。例如，人的53位或98位或二者的丝氨酸残基(见图4描绘的未处理的肽序列)被替换成例如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或苏氨酸。相似地，92位的精氨酸残基(图4)可替换为例如天冬酰胺，赖氨酸，组氨酸，谷酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸或半胱氨酸。仍参考图4，人类OB肽上能被替换的其它氨基酸有118位的组氨酸，121位的色氨酸，122位的丙氨酸，126位的谷氨酸，127位的苏氨酸，128位的亮氨酸，132位的甘氨酸，139位的甘氨酸，159位的色氨酸，和166位的甘氨酸。在另一实施方案中，可能将121至128位(见图4)的一个或多个残基替换成例如甘氨酸或丙氨酸或将除123位的丝氨酸或125位的亮氨酸之外的某些残基替换掉。
另一实施方案中，OB多肽类似物，优选地是人类OB肽类似物，是多肽的截短形式。例如已表明49位谷酰胺残基并非必需，可从中去掉。相似地，也可能将121-128位的某些或全部趋异氨基酸残基去除。另外，本发明试图提供一种对生物活性必需的氨基酸序列最短的OB类似物，例如用结合OB特异性抗体能力，抑制天然OB多肽活性能力或激活天然OB肽活性的能力来检验OB片段活性即可确定这一点。在一种实施方案中，本发明提供一种截短OB多肽，包含有117和167位(见图4)半胱氨酸残基形成的二硫键形成的环结构。另一实施方案中，截短类似物对应以22残基(它跟在假定的信号肽切割位点之后)到53残基(该氨基酸残基紧靠一柔性环区之前，该环区由OB多肽的限制性蛋白水解及质谱分析检测到。见Cohen等人，蛋白质科学(ProteinScience)，4：1088(1995)]的氨基酸。另一实施方案中，截短类似物对应从61残基(该残基紧跟在OB多肽限制性蛋白水解/质谱分析检测到的柔性环区之后]到116残基(该残基紧靠第一个半胱氨酸残基之前)的氨基酸。在另一实施方案中，截短类似物对应从61残基到167残基的氨基酸。
此外，从54到60残基的假定柔性环的一个或多个残基也被替换。例如，一个或多个残基可替换成甘氨酸，谷氨酸或与例如聚合物交联的半胱氨酸(优选的是赖氨酸)，因为柔性环结构是蛋白质衍生化的优选位点。备选地，柔性环位置的残基可以替换成更不易蛋白水解但仍保留柔性结构的氨基酸残基，例如一个或多个脯氨酸。在另一实施方案中试图替换成可进一步衍生的氨基酸残基使其更不易降解。
本领域的普通技术人员即可理解前述片段大小均是近似值，前述截短类似物的一端或两端，或该多肽或其片段的内部可以含有或缺失1到大约5个氨基酸，不同的是二硫键环类似物中半胱氨酸残基必须保留。
在接近生理条件下用圆二色检测重组肽发现鼠类OB肽含50％α-螺旋，人类OB多肽含约60％α-螺旋。相应地，另一实施方案中，氨基酸残基可被替换，形成的OB多肽，类似物形成或更倾向于形成更稳定的α-螺旋结构。例如，若将天然OB多肽的氨基酸残基替换成Glu，Ala，Leu，His，Trp则易形成α-螺旋结构。优选地采用保守的氨基酸替换。例如将29，30，44，61，76，100和/或106残基(见图4)的天冬氨酸替换成谷氨酸(Glu)；异亮氨酸替换成亮氨酸，甘氨酸或缬氨酸或任何趋异氨基酸替换成丙氨酸(例如人类OB多肽53位的丝氨酸替换成苯丙氨酸)，精氨酸或赖氨酸替换成组氨酸，以及酪氨酸和/或丙氨酸替换成色氨酸。提高α-螺旋结构的比例，或更重要地，提高α-螺旋结构的稳定性会使OB类似物有更高活性，更强的结合亲和性或更长的半衰期。在一特定实施方案中，OB肽对应氨基酸残基22到53的部分的螺旋形成能力增大了。另一实施方案中，氨基酸残基61-116的螺旋形成能力或稳定性增大。另一实施方案中，对应氨基酸117至167的二硫键环结构的螺旋形成能力增大。在不止一个上述结构域的α-螺旋潜力或稳定性增大的OB类似物也为本发明涉及。另一实施方案中，生成的截短OB多肽类似物加入了能形成结构(例如形成螺旋)的氨基酸残基以补偿多肽片段缺乏稳定结构的倾向。
可以通过例如胃蛋白酶消化体重调控物蛋白材料制得类似物的片段。其它类似物，例如突变蛋白，可通过将体重调控物肽编码序列进行标准诱变来制得。表现“体重调控物活性”的类似物，例如小分子，无论它起促进作用还是抑制作用，均可用已知体内和/或体外检验鉴定出来。
             OB多肽的小分子类似物和肽类似物
ob多肽(优选的是人类OB多肽)的结构可用本领域已知的多种方法分析。可用亲水性分析来确定蛋白质序列(例如Hopp等人，美国国家科学院院刊，78：3824(1981)。亲水性图谱可用来鉴定OB多肽的疏水区与亲水区、这样可以显示埋在折叠多肽内部的区域和多肽外部可接近的区域。另外，也可作二级结构分析[例如，Chou等人，生物化学(Biochem.)13：222(1974)]来鉴定OB多肽上可能的特定二级结构的区域。用本领域可得到的计算机软件程序可实现对预计或确定的结构的操作，包括二级结构预测。
通过提供来源丰富的重组OB多肽，本发明能定量确定多肽的结构。特别地，已有足够材料作核磁共振(NMR)、红外(IR)、拉曼、紫外(UV)尤其是圆二色(CD)谱分析。特别是NMR提供了对溶液中分子强有力的结构分析，溶液更接近分子的天然环境[Marion等人，生物化学与生物物理研究公报(Biochim.Biophys Res.Comm.)113：967-974(1983)；Bar等人，磁共振杂志(J.Magn.Reson.)65：355-360(1985)；Kimura等人，美国国家科学院院刊，77：1681-1685(1980)。也可用其它结构分析方法，包括但不限于X射线晶体学[Engstom，生化实验生物学(Biochem.Exp.Biol)，11：7-13(1974)]。
另一实施方案中，检验OB多肽类似物以确定它是否与对天然OB多肽或其特定片段有特异性的抗体发生交叉反应。交叉反应程度提供了有关蛋白结构同源性或相似性，或与用来产生片段特异性抗体的多肽部分相对应的区域可接近程度的资料。
                  筛选OB类似物
本领域已知多种筛选方法来筛选多肽类似物。可获得多种化学品文库。相应地，本发明试图筛选这些文库，例如经多年研究生成的合成复合物文库，天然复合物文库和组合文库，下文有详细描述，来寻找OB多肽类似物。在一个实施方案中，本发明试图筛选这些文库来寻找能结合抗OB多肽抗体尤其是抗人类OB多肽抗体的复合物。另一方面，一旦鉴定出OB受体(见下文)，任何本领域已知的筛选技术均可用来筛选OB抗体激动剂或拮抗物。本发明试图筛选小分子配体或配体类似物和模仿物，以及筛选结合并激动或拮抗体内激活OB受体的天然配体。
了解受体的一级序列以及该序列与已知功能的蛋白质的相似性，可提供关于该蛋白质的激动剂与拮抗物的初步线索。例如用X射线晶体学、中子散射、核磁共振光谱和其它确定结构的技术确定该蛋白质的结构特征可进一步帮助鉴定与筛选拮抗物。这些技术使激动剂与拮抗物的设计或鉴定更加合理。
另一方法用重组噬菌体产生大的文库。利用“噬菌体法”[Scott等人，科学，249：386-390(1990)；Cwirla等人，美国国家科学院院刊87：6378-6382(1990)；Devlin等人，科学，249：404-406(1990)]，可构建很大的文库(106-108化学实体)。再一种方法主要是化学方法，例子有Geysen法[Geysen等人，分子免疫学(Molecular Immunology)23：709-715(1986)；Geysen等人，免疫方法杂志(J.Immunologic Method)102：259-274(1987)]和最近的Fodor法，Fodor等人，科学，251：767-773(1991)。Furka，等人，14届国际生物化学大会，卷5，提要FR：013(1988)；Furka，国际肽蛋白研究杂志，37：487-493(1991)]；Houghton(美国专利4,631,211号，1986年12月出版)；和Rutter等人(美国专利5,010,175号，1991年4月23日出版)描述了生产经检验是激动剂或拮抗物的肽类的混合物的一些方法。
另一方面，一些合成文库(Needels等人，美国国家科学院院刊，90：10700-10704(1993))；Lan等人，国际发明出版物WO92/00252号，二者均在此引入作为参考]等可用来筛选本发明的OB受体的配体。对这些文库，不必真的克隆OB受体就能用表达受体的细胞检验受体拮抗物。
此外，可进行可溶性配体结合那些表达重组形式OB受体配体结合结构域的细胞的检验。可溶性配体可由现成的重组或合成OB多肽提供。
可对表达OB受体的重组细胞进行筛选，或备选地用例如上述重组生产纯化的受体蛋白。例如，标记的，可溶的或增溶的OB受体，包括分子的配体结合部分，结合配体的能力可用来筛选文库，描述见上述参考文献。
               OB多肽的衍生物
通常本蛋白(其中术语“蛋白质”包括“多肽”，除非有其它说明)可通过在蛋白质部分连上一个或多个化学部分来衍生。化学修饰的衍生物可进一步配制用于动脉内，腹腔内，肌肉内，皮下，静脉内，口服，鼻腔，直肠，口腔，舌下，肺部，局部，透皮(transdermal)或其它给药途径。已发现在某些情况下化学修饰有生物活性的蛋白质有附加的优点，例如提高了治疗用蛋白的稳定性和循环时间以及降低了免疫原性。见美国专利4,179,337号，Davis等人，1979年12月18日出版。综述见Abuchowski等人“可溶性聚合物-酶加合物”，酶的药物应用(Enzymes as Drugs)367-383页，Holcenberg与Roberts编，Wiley国科科学出版社，纽约，纽约州(1987)。描述蛋白修饰与融合蛋白的综述文章见Francis，生长因子研究(Focus on Grondh Factors)，3：4-10(1992)。
                    衍生用化学基元
适用于衍生化的化学基元可选自水溶性聚合物。所选聚合物应溶于水，以使结合上的蛋白质不会在含水环境如生理环境下沉淀。优选地，若制备终产物用于治疗，聚合物应是医药上可接受的。本领域专业人员选取所需聚合物时应注意以下几点：如聚合物/蛋白质结合物能否用于治疗，若能，所需剂量，循环时间，对蛋白水解的抗性等。对于本处蛋白质与肽，可用这里提供的检验来确证它们。
                     聚合物分子
水溶性聚合物可选自，例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖聚乙烯醇，聚乙烯比咯烷酮，聚1，3-二茂烷，聚1，3，6-三环氧乙烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙烯甘油同聚物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物，聚氧乙烯化聚醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛可能会因其在水中的稳定性而在生产中具有优势。
聚合物分子量可为任意值，可分支或不分支。对于聚乙二醇，优选的分子量在约2KDa到约100KDa之间(术语“约”表明在聚乙二醇制备过程中，有些分子分子量比上述分子量大，有些分子的分子量小)，处理与制造时方便。根据所需治疗条件(例如所需持续释药的时间，如果有的话，对生物活性的作用，处理时的方便性，抗原性的大小或有无以及聚乙二醇对治疗蛋白或类似物的其它已知作用)可以采用其它大小的分子。
                      聚合物/蛋白质比
这样连上的聚合物分子数会有变化，本领域专业人员可以弄清这对功能的影响。我们可以用相同或不同的化学基元单衍生或双衍生，三衍生，四衍生或提供一些衍生的组合。聚合物分子在反应混合物中的浓度可变，聚合物分子对蛋白质(或肽)分子的比例也可变。通常最佳比例(相对反应效率而言，反应不再存在过剩的未反应蛋白质或聚合物)的决定因素有例如所需的衍生程度(例如单，双，三衍生等)所选聚合物的分子量，聚合物是否分支，反应条件等。
                 化学基元与蛋白质的连接
聚乙二醇分子(或其它化学基元)连到蛋白上时要考虑到对蛋白质的功能结构或抗原结构域的影响。对本领域专业人员来说有许多连接方法，例如EP0401384引入此处作为参考(将PEG偶联到G-CSF上)。又见Malik等人，实验血液学(Exp.Hematol.)20：1028-1035(1992)(报道用tresyl氯化物进行的GM-CSF聚乙二醇化)。例如，聚乙二醇可通过反应基团如游离的氨基或羧基共价连到氨基酸残基上。反应基团即那些可连上激活的聚乙二醇分子的基团。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基，具有游离羧基的氨基酸残基包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸氨基酸残基。巯基也可用作连接聚乙二醇分子的反应基团。用于医疗目的优选的是连到氨基上，例如连到N末端或赖氨酸基团上。如果需要结合受体就应避免连接到结合受体重要的残基上。
             N末端化学修饰的蛋白
人们可能特别需要N末端化学修饰的蛋白。用聚乙二醇作为本组合物的说明，可选用不同聚乙二醇分子(根据分子量，分支等)，反应混合物中聚乙二醇分子对蛋白质(或肽)分子的比例，要执行的聚乙二醇化反应的类型，以及得到所选N末端聚乙二醇化蛋白的方法。可以从大量聚乙二醇化蛋白分子中纯化N末端聚乙二醇化材料来获取N末端聚乙二醇化制备物(即若有必要将该部分与其它单聚乙二醇化部分分开)。可通过还原性烷基化利用对某一特定蛋白质可用来衍生化的不同类型一级氨基(赖氨酸与末端)的差别反应性实现选择性N末端化学修饰。适当反应条件下能实现蛋白质N末端与含羟基的聚合物基本上选择性的衍生。例如，在某一pH下反应，利用赖氨酸残基ε-氨基与蛋白质N末端残基α-氨基的pKa差别，选择性N末端聚乙二醇化蛋白质。通过这样的选择性衍生可以控制水溶性聚合物连到蛋白质上：与聚合物的偶联主要发生在蛋白质的N末端，其它反应基团例如赖氨酸侧链氨基没有发生显著修饰。利用还原性烷基化，水溶性聚合物可为上述类型并仅有一个与蛋白质偶合的反应性醛基。可用含有单个反应醛基的聚乙二醇丙醛。
               与OB多肽相关联的核酸
如下述，本发明涉及编码多肽的核酸及相关联的OB基因5′，3′和内含子的基因组非编码序列。因此，根据本发明可采用本领域的常规分子生物学，微生物学和重组DNA技术。文献中有这些技术的详述。见例如Sambrook等人，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)；Glover编，DNA克隆实用方法，卷I和II，MRL出版有限公司，牛津，联合王国(1985)；Gaif编，寡聚核苷酸合成，牛津大学出版社(1984)；Hames等人编，核酸杂交。斯普林格出版社(1985)；Hames等人编，转录与翻译，牛津大学出版社(1984)；Freshney编，动物细胞培养，牛津大学出版社(1986)；固定化细胞和酶，TRL出版社(1986)；Perbal，分子克隆实用指南，Wiley纽约(1984)。与本发明尤其相关的是基于熟知的聚合酶链式反应(PCR)技术的对基因或核酸的分离，克隆，测序，分析与定性。
“复制子”是任何在体内作为DNA复制的自主单位起作用的，即能受自身控制而复制的遗传元件(例如质粒，染色体，病毒)。
“载体”是一个复制子，例如质粒，噬菌体或粘粒，可连上另一段DNA使连上的片段得以复制。
“盒”指一段可在特点限制位点插入载体的DNA。DNA片段编码一段感兴趣的多肽，盒与限制位点被设计成使盒插进正确的阅读框架来转录与翻译。
“异源”DNA指不是天然存在于细胞中或细胞的染色体位点上的DNA。优选地，异源DNA包括对细胞来说是外来的基因。
若外源或异源DNA引入细胞，则该细胞被该DNA“转染”了。若转染DNA造成表型改变则该细胞被异源或外源DNA“转化”了。优选地，转化DNA整合(共价连接)进构成细胞基因组的染色体DNA中。
“克隆”是通过减数分裂来自单个细胞或共同祖先的一群细胞。
“核酸分子”指核糖核酸(腺苷，鸟苷，尿苷或胞苷，“RNA分子”)或脱氧核糖核酸(脱氧腺苷，脱氧鸟苷，脱氧胸腺苷或脱氧胞苷；“DNA分子”的磷酸酯聚合物形式，或是单链或是双链螺旋。也可能是双链DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，而不限制于任何特定的三级或四级形式。因此，该术语特别包括线状或环状DNA分子(例如限制片段)质粒和染色体中的双链DNA。讨论特定双链DNA分子的结构时，可根据常规在指述序列时仅给出沿RNA非转录链的5′到3′方向序列(即该链的序列与mRNA同源)。“重组DNA分子”是经过分子生物操作的DNA分子。
如果一个核酸分子单链形式在适当的温度和溶液离子强度条件(见Sambrook等人，1989，引文见上)下与另一核酸分子退火，则该核酸分子与另一核酸分子，如cDNA，基因组DNA或RNA，“可杂交”。温度和离子强度条件决定了杂交的“严谨性”。对于初步筛选同源核酸，可用对应于55℃ Tm的低严谨性杂交条件，例如，5×SSC，0.1％SDS0.25％牛奶，无甲酰胺；或30％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS。中等严谨性杂交条件对应高些的Tm，例如，40％甲酰胺，与5×或6×SCC。高严谨性杂交条件对应最高的Tm，例如50％甲酰胺，5×或6×SCC。杂交要求两个核酸含有互补序列，尽管依赖杂交的严谨性可能有残基之间的错配。核酸杂交的合适严谨性依赖核酸长度和互补程度，这些变量在本领域广为人知。两段核苷酸序列相似或同源程度越大，具有该序列的核酸杂交体的Tm值越高，核酸杂交的相对稳定性(对应于较高Tm)按下列顺序递降：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。长度超过100个核苷酸的杂交体已得到计算Tm的方式(见Sambrook等人，1989，引文见上9.50-9.51)。对于较短核酸即寡聚核苷酸的杂交，错配的位置就比较重要，并且寡聚核苷酸的长度决定其特异性(见Sambrook等人，1989，引文见上11.7-11.8)。优选地，杂交核酸的最小长度是至少约10个核苷酸；更优选地至少约15个核苷酸；最优选地至少约20个核苷酸。
“同源重组”指载体上外来DNA序列插入染色体中。优选地，同源重组对载体定向到特定染色体位点。对专一性同源重组，载体有足够长的区段与染色体序列同源，才能够互补结合并加入染色体中。同源区段越长，序列相似程度越大，越有可能提高同源重组的效率。
DNA“编码序列”是在适当调节序列的控制下体外或体内在细胞中转录并翻译的双链DNA序列。编码序列的边界由5′端(氨基端)的起始密码子和3′(羧基)端的转录终止密码子确定。编码序列可包括但不限于原核生物序列，真核mRNA得到的cDNA，真核(例如哺乳动物的)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成DNA序列。若编码序列要在真核细胞中表达，多聚腺苷化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′。
            OB编码和包围序列的分离
本发明涉及的核酸也包括编码诸如图1A至D(SEQ ID NO：2)，图3(SEQ ID NO：4)图5(SEQ ID NO：5)和图6(SEQ ID NO：6)给出的肽类的表达的核酸。相应地，一旦特异性DNA被分离出来并相对ob基因测序，任何动物细胞均可以作为核酸来源，用于编码本发明肽类的基因的分子克隆。可用本领域已知的标准方法从克隆的DNA(例如DNA“文库”)中，用化学合成，用cDNA克隆，或用基因组DNA克隆或用从所需细胞中纯化的片段克隆，得到DNA(见Sambrook等人，1989，引文见上；Glover，1985，引文见上)。基因组DNA得到的克隆可以除编码区之外还有调节DNA区和内含子DNA区；由cDNA得到的克隆不含内含子序列。无论来源如何，基因应当分子克隆到适当的载体中使基因增殖。
从基因组DNA分子克隆基因时，基因组DNA可用选自cDNA序列的引物来扩增。备选地，产生DNA片段，其中有些编码所需基因。可用多种限制性酶在特定位点切割DNA。也可用DNase连同镁将DNA切成片段，或例如用超声处理将DNA物理剪切。线型DNA片段然后可根据大小用标准技术分开，这些技术包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析。
一旦生成了DNA片段，可用许多方法鉴定含有所需ob或类ob基因的特异性DNA片段。例如，若拥有一定量的ob或类ob基因或其特异性RNA的一部分或其片段，并能纯化，标记，即可用核酸与标记的探针杂交对生成的DNA片段进行筛选[Benton等人，科学，196：180(1977)，Grunstein等人，美国国家科学院院刊，72：3961(1975)]。本发明提供了核酸探针，可以从此处公开的特异性序列方便地制取，例如杂交探针，其核苷酸序列对应于图1A至E(SEQ ID NO：1)或图2A和B(SEQ IDNO：3)描绘的序列的至少10个，优选地15个核苷酸的片段。优选地，选择对本发明的调控物肽高度专一的片段。与探针有相当多同源性的DNA片段将杂交。如上述，同源程度越大，就可用越严谨的杂交条件。在一个实施方案中，用低严谨性杂交条件来鉴定同源的调控物肽。然而，从优选地方面看，如此处实验显示，编码本发明的调控物肽的核酸会在与具有图1A至E(SEQ ID NO：1)或图2A和B(SEQ ID NO：3)描绘的核苷酸序列的核酸，或其可杂交片段在中等严谨性条件下杂交；更优选地，将在高度严谨性条件下杂交。
此外，可用基于基因表达产物的物理，化学或免疫的特性的检验方法来检测基因的存在。例如，可选择cDNA克隆或杂交选择正确mRNA的DNA克隆，它们产生的蛋白，例如具有与已知本调控物肽相似或相同的电泳迁移，等电聚焦行为，蛋白水解消化图谱，酪氨酸磷酸酶活性或抗原性质。例如，本发明的抗体可方便地用来从其它来源中筛选调控物肽的同源物。
编码本发明的调控物肽的基因亦可用mRNA选择来鉴定，即用核酸杂交然后体外翻译。该方法中，通过杂交用片段来分离互补mRNA。这样的DNA片段可能代表可获得的纯化调控物DNA。对分离到的mRNA产物的体外翻译产物作免疫沉淀分析或功能检验(例如酪氨酸磷酸酶活性)。鉴定具有所需序列的mRNA，因而也鉴定具有所需序列的互补DNA片段。另外，可通过将细胞中分离得的多核糖体吸附到专一性抗调控物肽的固定抗体上，选择特异性mRNA。
以所选择的mRNA(来自吸附的多核糖体)为模板可合成放射性标记的调控物肽cDNA。放射性标记的mRNA或cDNA，然后可用做探针，从基因组DNA片段中鉴定出同源的调控物肽DNA片段。
如上述，此处公开的编码体重调控物肽的DNA序列可以不由克隆而是合成地制备。该DNA序列可设计得带有对体重调控物肽氨基酸序列适当的密码子。一般地，若该序列用于表达则选择对预定宿主优选的密码子。从用标准方法制备的相互交叠的寡聚核苷酸组装完整序列进而组装完整的编码序列。见例如Edge，自然，292：756(1981)；Nambair等人，科学，223：1299(1984)；Jay等人，生物化学杂志(J.Biol.Chen.)259：6311(1984)。
合成DNA序列可方便地构建能表达上述体重调控物类似物的基因。此外，编码类似物的DNA可将天然OB基因或cDNA定点突变制得，该类似物可直接用常规多肽合成法制得。
有关将非天然氨基酸位点特异性地加入蛋白质一般方法的描述见Noren等人，科学，244：182-188(1989)。该方法可用来制备带有非天然氨基酸的ob多肽类似物。
                 非编码的核酸
本发明涉及对可用于在翻译水平干扰体重调控物蛋白表达的反义核苷酸或核酸酶的制备。该方法用反义核酸和核酸酶阻遏特异mRNA的翻译，或是用反义核酸屏蔽掉mRNA或将mRNA用核酸酶切割。
反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子[见Weintraub，科学美国人，(Sci.Am.)262：40-46(1990)；Marcus-Sekura，分析生物化学(Anal.Biochem)172：289-295(1988)]。它们在细胞中与该mRNA杂交形成双链分子。细胞不翻译形成双链形式复合物的mRNA。因此，反义核酸干扰mRNA表达成蛋白质。与AUG起始密码子杂交的分子和约15个核苷酸的寡聚物会特别有效，因为它们容易合成，并且引入生产体重调控物肽的细胞中对与大分子相比问题较少。反义法可以用来体外抑制许多基因的表达[Marcus-Sekura，1988，引文见上；Hambor等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，168：1237-1245(1988)]。
核酸酶是具有特异性切割其它单链RNA分子能力的RNA分子，切割方式与DNA限制性内核酸酶有些相似。观察到某些mRNA能切除其自身的内含子，才发现了核酸酶。通过修饰这些RNA的核苷酸序列，研究人员已能够设计制造识别RNA分子中特异性核苷酸序列并切割它的分子[Cech，美国医学会杂志(J.Am.Med.Assoc.)]，260：3030-3034(1988)。由于其序列特异性，仅仅是具有特殊序列的mRNA被失活。
研究者已鉴定两种核酸酶，四膜片型与“锤头”型。四膜片型核酸酶识别四碱基序列。而“锤头”型识别11到18碱基序列。识别的序列越长，越有可能排它性地在靶mRNA种类发生识别，因而，锤头型核酸酶比四膜虫型核酸酶优选用来使特异性mRNA种类失活，18碱基识别序列优于较短的识别序列。
这里描述的DNA序列于是可用于制备针对体重调控物蛋白及其配体的反义分子或切割体重调控物蛋白及其配体的mRNA的核酸酶，从而抑制ob基因的表达，导致体重增加与肥胖。
另一实施方案中，本发明提供与OB核酸编码链或互补链，或OB基因编码区5′，3′或内部(内含子的)非编码区互补的短寡聚核苷酸。这样的核酸可用做探针-直接标记的寡聚核苷酸探针或聚合酶链式反应的引物-来评价ob基因中突变是否存在或OB mRNA的表达水平。优选地，本发明的非编码核酸来自人类OB基因。
在特定的实施方案中，非编码核酸能进行使OB基因附近的可扩增基因和/或其它调节基因整合的同源重组，例如，使OB多肽高水平表达，或克服ob基因调节序列上阻止OB多肽正常水平表达的突变。(见国际专利出版物，WO91/0666，1991年5月16日出版，Skoultchi；国际专利出版物WO91/09955号，1991年7月11日出版，Chappel；以及国际专利出版物WO90/14092号，1990年11月29日出版，Kucherlapati和Campell)。
                生产多肽：表达与合成
转录和翻译控制序列是使编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，例如启动子，增强子，终止子等。真核细胞中多聚腺苷化信号是控制序列。
若RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后反式RNA被拼接和翻译成由编码序列编码的蛋白质，则该编码序列“受控于”细胞中的转录和翻译控制序列。
“信号序列”包含在于细胞表面表达的蛋白的编码序列前端。该序列编码位于成熟多肽N末端的信号肽，指导宿主细胞将多肽转移。术语“转移信号序列”在这里也用来指这类信号序列。发现转移信号序列与直核生物和原核生物内天然存在的许多蛋白质相联系，并且常在两类生物体中行使功能。
若一段表达控制序列控制并调节一段DNA序列的转录和翻译，则该DNA序列，“经操作连接”该表达控制序列。术语“经操作连接”包括在待表达DNA序列前头有合适的起始信号(例如ATG)并保持正确的阅读框架，使DNA序列在表达控制序列的控制下表达，并生产该DNA序列编码的所需产物。若需要插入重组DNA分子的基因不含有适当的起始信号，则可将起始信号插入基因上游(5′)并与基因同阅读框。
“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶并起始下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调节区。为了明确含义本发明，启动子序列3′端是转录起始位点，并向上游(5′方向)延伸，包括在本底以上可检测到的水平起始转录所必要的最小数目的碱基或成分。启动子序列中有转录起始位点(可方便地用例如核酸酶SI定位来定义)，以及结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(一致序列)。
本发明的另一特征是这里公开的DNA序列的表达。正如本领域所熟知的，将DNA序列经操作连接到适当表达载体上的表达控制序列上，再用该表达载体转化适当的单细胞宿主即可表达该DNA序列。
将本发明的DNA序列这样经操作表达控制序列，若起始密码子ATG不是该DNA序列之一部分，当然也包括将该密码子加到该DNA序列的正确阅读框架上。
很多宿主/表达载体组合可用来表达本发明的DNA序列。有用的表达载体，例如，可包括染色体，非染色体或合成DNA序列的片段。适当的载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col E1，pCRl，pBR322，pMB9，pUC或PUC质粒衍生物，例如pGEX载体，PET载体，pmal-c，pFLAG等及其衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNA，例如大量的λ噬菌体的衍生物，例如NM989，和其它噬菌体DNA，例如MB和纤维状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；用于真核细胞的载体，如用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；得自质粒与噬菌体DNA组合的载体，如经修饰采纳了噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；以及其它。在优选实施方案中，在产甲基酵母，例如巴斯德毕赤氏酵母中实现ob表达(见例如，国际专利出版物WO90/03431号1990年4月5日出版，Brierley等人；国际专利出版物WO90/10697号，1990年9月20日出版，Siegel等人)。在特定的实施方案中，见下，构造了使ob在α-交配因子信号序列控制下表达的表达载体。
许多表达控制序列的任一种-控制经操作连接于其它的DNA序列表达的序列-可用于这些载体来表达本发明的DNA序列。这样的有用表达控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期启动子，CMV，牛痘，多瘤或腺病毒，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，LTR系统，λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它蛋白水解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)，产甲基酵母的AOX1启动子，酵母α-交配因子的启动子，以及其它已知能控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的序列，及其多种组合。
许许多多单细胞宿主细胞也可用来表达本发明的DNA序列。这些宿主包括熟知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌，假单胞菌，芽孢杆菌，链霉菌的菌株；真菌如酵母(酿酒酵母，以及产甲基酵母如毕赤氏酵母、假丝酵母、汉逊氏酵母和球拟酵母)还有动物细胞如CHO，R1.1，B-W和LM细胞，非洲青猴肾细胞(例如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10)，昆虫细胞(例如Sf9)和组织培养物中的人类细胞和植物细胞。
应当理解并不是所有载体，表达控制序列和宿主在表达本发明的DNA序列时都同样好地行使功能。也不是所有宿主对同一表达系统均能很好地行使功能。然而，本领域专业人员不用超出本发明的范围也不必做过多的实验即可选择合适的载体，表达控制序列和宿主获得所需的表达。例如选择载体时必须试图到宿主。因为载体必须在宿主中起作用。还需试图载体的拷贝数，控制拷贝数的能力，任何其它该载体编码的蛋白如抗生素标记的表达。
选择表达调节序列时通常要试图许多因素。这包括，例如，系统的相对强度，其可控性，它与待表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是潜在的二级结构。选择适当的单细胞宿主时需注意，例如，它们与所选载体的相容性，它们的分泌特征，它们正确折叠成蛋白质的能力，它们的发酵要求，以及待表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性，表达产物是否容易纯化。
注意到这些及其它因素，本领域专业人员将会构建许多载体/表达控制序列/宿主组合来用发酵方法或在大规模动物培养物中表达本发明的DNA序列。
在特定的实施方案中可表达OB融合蛋白。OB融合蛋白含有至少一个功能活性部分的非OB蛋白以肽键连到至少一个功能活性部分的OB多肽上。非ob序列可以在OB的氨基或羧基端。更优选地，为使蛋白水解活性弱的OB融合蛋白稳定表达，非OB融合蛋白部分以肽键连接到OB蛋白的氨基端。编码这种融合蛋白的重组DNA分子含有编码至少一个功能活性部分的非OB的的序列在框地连到OB编码序列上，并优选地编码特异性蛋白酶。例如凝血酶或Xa因子的切割位点，优选地位于OB-非OB结合处。在特定的实施方案中，融合蛋白在大肠杆菌或巴斯德毕赤氏酵母中表达。
在特定的实施方案中，见下，制备含有或不含有gln-49的密码子的载体，它能细菌表达系统和酵母(毕赤氏)表达系统中以融合蛋白形式表达鼠类和人类ob基因。用PCR和新的引物制备ob基因，使其带有内切酶切割位点。最好能验证PCR产生的序列，因为用该技术引入点突变的可能性大。用带有组氨酸标志和蛋白水解切割位点的质粒。组氨酸存在便能在Ni螯合柱上或用亲和性纯化选择性分离出重组蛋白。下面的特定实施方案中的蛋白水解切割位点，凝血酶切割位点，设计成用蛋白酶如凝血酶处理后释放出全长的成熟(即没有信号序列)OB多肽。
另一方面可用pGEX载体(Smith等人，基因，67：31-40(1988))。该载体将日本裂体吸虫(Schistosoma japonicun)转移酶cDNA融合到感兴趣序列上。收获细菌蛋白质，然后在还原型谷胱甘肽亲和柱上很快地纯化重组蛋白质。接着用位点特异性蛋白酶消化可以从融合蛋白上切除GST载体。切除后，可通过谷胱甘肽琼脂糖吸附去掉载体和未切割的融合蛋白。有时编码的蛋白不溶于水而使本系统使用有困难。
重组蛋白在细菌系统中表达可能导致表达蛋白的折叠错误而需重新折叠。重组蛋白可在切割前或切割后再折叠，形成有功能活性的OB多肽。OB再折叠步骤可以是(i)蛋白质在含有还原剂的变性缓冲液中温育，然后(ii)蛋白质在含有氧化剂以及优选的蛋白质稳定剂或无序剂或两者兼有的缓冲液中温育。合适的氧还(还原/氧化)剂对包括但不限于还原型谷胱甘肽/二硫化谷胱甘肽，胱氨酸/半胱氨酸，胱胺/半胱胺和2-巯基乙醇/2-羟基乙基二硫化物，特别地，融合蛋白可以在移入还原性缓冲液之前在变性剂如脲中增溶。在优选实施方案中，蛋白质在移入还原性缓冲液之前例如离子交换层析或Ni螯合层析纯化。变性剂包括但不限于脲和盐酸胍。重组蛋白然后稀释约至少10倍，优选地约100倍，移入含有氧化剂的氧化缓冲液，例如，但不限于0.1M Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.15M NaCl，0.3M氧化型谷胱甘肽。融合蛋白然后在室温下氧化缓冲液中温育约1至约24小时，优选地约2至约16小时。氧化缓冲液可含有蛋白稳定剂，例如糖，醇类，或硫酸铵。氧化缓冲液可进一步含有低浓度的无序剂，使不正确的分子之间相互作用不稳定从而促进正确的折叠。合适的无序剂包括但不限于去污剂，多醇，L-精氨酸，盐酸胍和聚乙二醇(PEG)。用足够低浓度的无序剂以避免使蛋白质变性，这十分重要。再折叠的蛋白质应浓缩至少10倍，优选地是浓缩它原来稀释到氧化缓冲液中的倍数。
细菌发酵过程也可能得到含有内毒素水平超标的重组蛋白质制品。因而，本发明试图例如用内毒素特异性抗体或其它内毒素结合分子除去这类内毒素。可用标准技术如使用E-TOXATE试剂(Sigma，圣路易，密苏里州)或生物检验方法确定内毒素是否存在。
除给定的实施例外，本发明人试图使用杆状病毒，哺乳动物和酵母表达系统表达ob蛋白质。例如，在杆状病毒表达系统中，非融合转移载体，例如但不限于pVL941(BamH1克隆位点；Summers)，pVL1393(BamHI，XbaI，SamI，EcoRI，NotI，XmaIII，BglII和PstI克隆位点；Invitrogen)，pVL1392(BglII，PstI，NotI，XmaIII，EcoRI，SamI，XbaI和BamHI克隆位点，可能进行蓝/白重组筛选；Invitrogen)，以及融合转移载体，例如但不限于pAc700(BamHI和KpnI克隆位点，其中BamHI识别位点从起始密码子开始，Summers)，pAc701和pAc702(与pAc700相同，但阅读框架不同)，pAc360(BamHI克隆位点在多角蛋白起始密码子下游36碱基处；Invitrogen(195))，和pBlueBac HisA，B，C(三个不同阅读框架，有BamH1，，BglII，PstI，NcoI和HindIII克隆位点，用于ProBond纯化的N末端肽，以及蓝/白重组筛选噬菌斑；Invitrogen(220))。
本发明试图应用的哺乳动物表达载体包括带有可诱导启动子例如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子的载体，例如，带有DHFR表达载体的任何载体，或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，例如pED(PstI，SalI，SbaI，SmaI和EcoRI克隆位点，该载体既表达克隆的基因又表达DHFR；见Kaufman，分子生物学当代实验方法(Current Protocols inMolecular Biology)，16.12(1991))。此外，谷酰胺合成酶/蛋氨酸硫亚胺共扩增载体，例如pEE14(HindII，XbaI，SmaI，SbaI，EcoRI和BclI克隆位点，其中载体表达谷酰胺合成酶和克隆的基因；Celltech)。另一实施方案中，可用在Epstein Barv病毒(EBV)控制下指导附加体表达的载体，例如pREP4(BamH1，SfiI，XhoI，NheI，HindIII，NheI，PvuII和KpnI克隆位点，组成性RSV-LTR启动子，湿霉素选择标记，Invitrogen)，pCEP4(BamH1，SfiI，XhoI，NotI，NheI，HindIII，NheI，PvuII和KpnI克隆位点，组成性hCMV近早期基因，湿霉素选择标记；Invitrogen)，pMEP4(KpnI，PvuI，NheI，HindIII，NotI，XhoI，SfiI，BamH1克隆位点，可诱导methallothionein IIa基因启动子，湿霉素选择标记，Invitrogen)，pREP8(BamH1，XhoI，NotI，HindIII，NheI和KpnI克隆位点，RSV-LTR启动子，组氨醇选择标记，Invitrogen)，pREP9(KpnI，NheI，HindIII，NotI，XhoI，SfiI，和BamHI克隆位点，RSV-LTR启动子，G418选择标记，Invitrogen)，和pEBVHis(RSV-LTR启动子，湿霉素选择标记；N-末端肽可用ProBond树脂纯化并被肠激酶切割；Invitrogen)。本发明可选用的哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII，BstXI，NotI，SbaI和ApaI克隆位点，G418选择，Invitrogen)，pRc/RSV(HindIII，SpeI，BstXI，NotI，XbaI克隆位点，G418选择标记，Invitrogen)及其它。本发明可用的牛痘病毒哺乳动物表达载体(见Kaufman，1991，引文见上)包括但不限于pSC11(SamI克隆位点，TK-与β-gal选择)，pMJ601(SalI，SamI，AfiI，NarI，BspMII，BamHI，ApaI，NheI，SacII，KpnI和HindIII克隆位点，TK-与β-gal选择)，以及pTkgptF1S(EcoRI，PstI，SalI，AccI，HindII，SbaI，BamHI和Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)。
根据本发明亦可用酵母表达系统表达OB多肽。例如，根据本发明，仅举二例：非融合pYES2载体(XbaI，SphI，ShoI，NotI，GstXI，EcoRI，BstXI，BamHI，SacI，KpnI和HimdIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA，B，C(XbaI，SphI，ShoI，NotI，BstI，EcoRI，BstXI，BamHI，SacI，KpnI和HindIII克隆位点，N末端肽用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割，Invitrogen)。
从在本发明范围内获得的核苷酸序列可进一步制取体重调控物肽类似物。
除了重组表达OB多肽，本发明预计并完全可能用广为人知且高度发展的固相肽合成技术制备OB多肽或其片段。本发明试图用常用的Boc和Fmoc以及其它保护基因方案制备ob多肽或其片段。再折叠和将半胱氨酸侧链氧化成二硫键的各种技术在本领域广为人知。
                OB多肽的抗体
根据本发明，重组或化学合成的OB多肽，片段或其它衍生物或类似物，包括融合蛋白，可用作免疫原来产生识别OB多肽的抗体。这种抗体包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段及Fab表达文库。
若分子能特异性与免疫系统的抗原识别分子，如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体，相互作用，则该分子具有“抗原性”。抗原性多肽包括约至少5个，优选地约至少10个氨基酸。分子的抗原性部分可以是以抗体或T细胞受体识别有免疫显性的部分，或是可通过将抗原性部分与免疫用载体分子偶合产生对分子的抗原的部分，有抗原性的分子不一定有免疫原性，即不需载体引发免疫应答的能力。
“抗体”是结合特异性“表位”的任一免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包含多克隆，单克隆和嵌合抗体，嵌合抗体的进一步详述见美国专利4,816,397号和4,816,567号，还包含抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab′)2和F(V)(包括单链抗体)。相应地，此处用的“抗体分子”一词及其众多语法形式既指未经处理的免疫球蛋白分子又指含有抗体结合位点的免疫球蛋白分子的免疫活性部分。“抗体结合位点”指专一性结合抗体，含有重链和轻链可变区和高度可变区的抗体分子结构部分。
抗体分子的例子有未处理的免疫球蛋白的分子，基本未经处理的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子上含有抗原决定簇的部分，包括那些在本领域称为Fab，Fab′，F(ab′)2和F(V)的部分，这些部分优选地用于这里描述的治疗方法。
基本未经处理的抗体分子用熟知的方法分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解可制备抗体分子的Fab与F(ab′)2部分。见例如美国专利4,342,566号，Theofilopolous等。Fab′抗体分子部分也为人熟知，制备方法是用巯基乙醇还原F(ab′)2部分上连接两个重链部分的二硫键，然后再将得到的蛋白巯醇用试剂如碘乙胺烷基化。此处优选的是含有未经处理的抗体分子的抗体。
“单克隆抗体”以其各种语法形式指仅含一种能与特定抗原发生免疫反应的抗体结合位点的抗体。因而单克隆抗体对与之发生免疫反应的抗原仅表现单一结合亲和性。因此单克隆抗体可能含有一种抗体分子，它具有多个抗体结合位点，每一个位点都是对一种不同的抗原有免疫特异性，例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。
术语“佐剂”指一种能增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可用做缓慢释放抗体的组织贮存体，也可用做非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活物[Hood等人，《(免疫学)》384页，第二版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，加州(1984)]。通常没有佐剂，抗原单独第一次进攻(challenge)不会引起体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于，完全福氏佐剂，不完全福氏佐剂，皂苷矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢兰尼克聚醇，多聚阳离子(polyanions)，肽，油脂或碳水化合物乳剂，锁孔
Figure A9519567500541
血蓝蛋白，二硝基酚以及可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和parvum棒状杆菌。优选地，佐剂是医药可接受的。
本领域已知的多种方法可用来生产对OB多肽或其片段、衍生物或类似物的多克隆抗体。生产抗体时，可通过注射OB多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)来免疫多种宿主动物，这些动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案中，OB多肽或其片段可连到免疫原性载体上如牛血清清蛋白(BSA)或锁孔
Figure A9519567500542
血蓝蛋白KLH。根据宿主种类，可用多种佐剂增加免疫应答，包括但不限于(完全或不完全)福氏佐剂，矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克聚醇、多聚阳离子、肽、油脂、锁孔
Figure A9519567500543
血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人类佐剂如卡介苗和parvum棒状杆菌。
若制备对OB多肽或其片段，类似物或衍生物的单克隆抗体，可采用任何在培养物中用连续细胞系生产抗体分子的技术。这包括但不限于Kohler等人，自然，256：495-497(1975)研制的杂交瘤技术，Kozbar等人，现代免疫学(Immunology Today)4：72(1983)]，和生产人类单克隆抗体的EBV杂交瘤技术[Cole等人，单克隆抗体与癌症治疗，77-96页，Alan R.Liss公司(1985)]。除了用融合来产生生产抗体的不死细胞系，还可用其它技术如用癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染。见例如M.Schreier等人，“杂交瘤技术”  (1980)；Hammerling等人，“单克隆抗体和T细胞杂交瘤”(1981)；kennett等人，“单克隆抗体”(1980)；也见美国专利4,341,761号；4,399,121号，4,427,783号，4,444,887号，4,451,570号，4,466,917号，4,472,500号，4,491,632和4,493,890号。
在本发明的另一实施方案中，可用最新技术(PCT/US90/02545)在无种质动物体内生产单克隆抗体。根据本发明可用人类抗体，人类抗体可用人类杂交瘤[Cote等人，美国国家科学院院刊，80：2026-2030(1983)]或用EBV病毒体外转化人类B细胞(Cole等人，1985，引文见上)得到。实际上，根据本发明，可采用研制的通过对ob多肽特异性的小鼠抗体分子基因与具有合适的生物活性的人类抗体分子基因拼接，生产“嵌合抗体”[Morrison等人，细菌学杂志[J.Bacterol.]159-870(1984)；Neuberger等人，自然，312：604-608(1984)；Takeda等人，自然，314：452-454(1985)]。此类人类或人类化嵌合抗体优选地用于人类疾病或功能失调(描述见下)的治疗中，因为人类或人类化抗体与异源抗体相比更不容易引起免疫应答，尤其是过敏反应。
根据本发明，所描述的生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778号)。经修改可用来生产OB多肽特异性单链抗体。本发明的另一实施方案利用构建Fab表达文库的技术[Huse等人，科学，246：1257-1281(1989)]来快速而方便地鉴定具有所需要的对ob多肽或其衍生物或类似物特异性的单克隆Fab片段。
可用已知技术产生含有抗体分子个体基因型的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于，F(ab′)2片段，可用胃蛋白酶消化抗体分子来生产；Fab′片段，用通过还原F(ab′)2片段的二硫桥来生产；Fab片段，可用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子来生产。
生产抗体时，可用本领域已知的技术筛选所需抗体，例如，放射性免疫检验，ELISA(酶联免疫吸附检验)，“三明治”免疫检验，免疫放射性计量检验，凝胶扩散沉淀检验，免疫扩散检验，原位免疫检验(例如用胶体金，酶或放射性同位素标记)，Western印迹，沉淀反应凝集检验(例如，凝胶凝集检验，凝血检验)，补体固定检验，免疫荧光检验，蛋白A检验和免疫电泳检验等。在一个实施方案中，通过检测初级抗体上的标记检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测二级抗体或试剂对初级抗体的结合检测初级抗体，在另外一个实施方案中，二级抗体被标记。本领域已知多种方法检测免疫检验中的结合，它们均在本发明范围内。例如，为了选择OB多肽上特异性表位的抗体，可以在生成的杂交瘤中检验与含有这种表位的OB多肽片段相结合的产物。为了从某一特定动物物种中选择出对OB多肽特异性的抗体，可根据与该动物物种的细胞表达的或从中分离到的OB多肽的阳性结合来选择。
前述抗体可用于本领域已知的与OB多肽定位及活性相关的方法中，例如western印迹，原位OB多肽定位，在合适的生理样本中测量OB多肽的水平，等等。
在特定的实施方案中，可生成激动或抑制OB多肽活性的抗体。这些抗体可用下文描述的用来鉴定配体的检验方法来检测。
在特定的实施方案中，用从蛋白序列得来的合成肽或用细菌表达载体制的重组蛋白免疫兔子来研制抗体。如上述，经仔细分析所预测的蛋白结构选择合成肽。特别地，选择假定的切割位点之间的肽序列。将合成肽连接到载体例如KLH血蓝蛋白或用羧二亚胺的BSA上，连同福氏佐剂，免疫兔子。为制备重组蛋白，用pGEX载体表达多肽(Smith等人，1988，引文见上)。备选地，可以仅用亲水性结构域生成融合蛋白质。批量制备表达的蛋白并与福氏佐剂免疫兔子。
在另一特定实施方案中用重组OB多肽免疫小鸡，用OB柱亲和纯化从蛋黄中回收小鸡抗OB抗体。优选地，免疫用小鸡保持处于无专一性致病毒(SPF)环境中。
另一实施方案中，从缺少循环OB蛋白的ob/ob小鼠中制备抗瘠素的抗体，由于这些小鼠不耐受该多肽，因而预期可能产生抗OB多肽的应答，另外也从野生型小鼠中制备抗瘠素的抗体。两组小鼠的脾细胞可与肌肉瘤细胞融合制备生产单克隆抗体用的杂交瘤。
另一实施方案中，用重组OB多肽免疫兔子，多克隆抗体在进一步使用前要免疫纯化，纯化的抗体对半定量检验特别有用，尤其是检测OB多肽在血清与血浆中是否存在。
得到的抗调控物肽的一组单克隆抗体可对各种性质，即同型(isotype)表位、亲和性等进行筛选。特别令人感兴趣的是能中和调控物肽活性的单克隆抗体。这样的单克隆可用体重调控物的活性检验方便地鉴定。若可以免疫亲和性纯化天然或重组调控物，高亲和性抗体也很有用。
优选地，本发明的诊断和治疗方法中应用的抗调控物抗体是亲和性纯化的多克隆抗体。更优选地，抗体是单克隆抗体(mAb)。另外，此处所用的抗调控物抗体分子是完整抗体分子的Fab、Fab′、F(ab′)2或F(V)部分。
                    诊断应用
本发明还涉及许多诊断应用，包括检测影向体重异常或肥胖的情况和/或刺激是否存在的方法，参照的是它们(情况或刺激)引发本体重调控物介导的活性的能力。如前述，可许多已知技术体重调控物肽的抗体，然后分离这些抗体并用于检测怀疑的靶细胞中特定转录活性是否存在的试验中。备选地，本发明的核酸可用于诊断中。
                    基于抗体的诊断
如前述，用于本发明的诊断方法包括用含有有效量的调控物蛋白拮抗物如抗调控物抗体(优选的是亲和性纯化的多克隆抗体，更优选的是mAb)的检验方法检查细胞样本或培养基。另外此处应用的抗调控物抗体是完整的抗体分子或其Fab、Fab′、F(ab′)2或F(V)部分。如前述，能受惠于该方法的病人包括癌症、肥胖症患者或其它以不正常体重为特征或因素的情况的患者。分离调控物，诱导抗调控物抗体以及确定抗调控物抗体协助检查靶细胞的能力并将其最优化的方法在本领域广为人知。
另外，抗体，包括多克隆和单克隆抗体，调控体重调控物的生产或活性的药物和其它识别因子和/或其亚基可能会有某些诊断应用，可以，例如用于检测和/或测量可能或必能发生体重异常的情况。例如，调控物肽或其片段可用于用已知技术在多种细胞培养基中生产多克隆抗体或单克隆抗体，诸如利用例如融合的小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤技术。这些技术详述见下。同样，可发现或合成模仿或拮抗本发明的受体识别因子活性的小分子，并可用于诊断和/或治疗方法中。
用通常可以应用的免疫方法可证实细胞中体重调控物的存在。已知一些有用的方法。三种这样的方法特别有用，它们利用由可检测标记物标记的受体识别因子，由可检测标记物标记的抗体Ab1，或由可检测标记物标记的抗体Ab2。这些方法可用下述方程总结，其中星号表示该颗粒被标记，“WM”代表体重调控物。
A.  WM*+Ab1＝WM*Ab1
B.  WM+Ab1 *＝WMAb1 *
C.  WM+Ab1+Ab2 *＝Ab1WMAb2 *
这些方法及其应用对本领域专业人员都很熟悉因而可在本发明范围内应用。“竞争性”方法(方法A)的描述见美国专利3,654,090号和3,850,752号。方法B代表熟知的竞争性检验技术。方法C(“三明治”方法)的描述见美国专利RE31,006号和4,016,043号。已知其它方法，诸如“双抗体”或“DASP”方法。
每种情况下，体重调控物与一种或多种抗体或结合物形成复合物，其中之一用可检测标记物标记。用已知的用于检测标记物的方法可确定复合物的形成，若需要的话，及其含量。
由上可见，Ab2的特征性质是它与Ab1反应。这是因为一个哺乳动物物种产生的Ab1用作抗原可以在另一物种中产生抗体Ab2。例如，可在山羊中用兔抗体作抗原制得Ab2。Ab2则为山羊的抗兔抗体。在该描述及权利要求中，Ab1称为初级或抗体重调控物抗体，Ab2称作二级或抗Ab1抗体。
这类研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、紫外光下的荧光化合物等。
已知一些荧光材料，可用作标记物。这包括例如荧光素，罗丹明和金胺。一种特别的检测材料是在山羊中制备的抗兔抗体并通过异硫氰基与荧光素结合。
体重调控物或其结合物可用放射性元素或酶标记。可用任一种现在可得到的计数方法检测放射性标记物。优选的同位素选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
酶标法同样有用，并可用现有的色度计量、光度计量、荧光光度计量、电流计量或气体计量技术中的任一种来检测。通过与桥联分子如碳二亚胺，二异氰，葡糖醛等反应将酶偶联到选定的颗粒上。已知许多酶可用于这些方法并加以采用。优选的是的过氧化物酶，β-葡糖苷酸酶，β-D-葡糖苷酸酶，β-D-半乳糖苷酶、脲酶，葡糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利3,654,090号；3,850,752号和4,016,043引用了作为其它标记材料与方法的例子。
在本发明的进一步实施方案中，可制备适于医学专家使用的试剂盒，来确定在可疑的靶细胞中预先确定的转录活性或转录活性能力是否存在。与上述检验技术相适应，一类这样的试剂盒含有至少是标记的体重调控物或其结合物，例如对其特异性的抗体，其用法当然依赖所造的方法，例如“竞争性”“三明治式”“DASP”等。试剂盒也可含有外围试剂如缓冲液稳定剂等。
相应地，可制备检验用试剂盒来显示细胞中预先确定的转录活性的存在或能力，它包含：
(a)预定量的至少一种标记的有免疫化学反应性的成分，通过将本调控物或特异性结合物直接或间接连到可检测的标记物上得到。
(b)其它试剂；和
(c)试剂盒的用法。更具体地，诊断试剂盒可以包括：
(a)一定量的上述体重调控物(或结合物)，通常结合到固相上形成免疫吸附物，或备选地结合合适的标志，或多种此类终产物等(或其结合物)每样一种；
(b)如需要，其它试剂；和
(c)试剂盒的用法。
在进一步的变型中，检验用试剂盒可制备来用于上述目的，根据预定的操作(如“竞争性”“三明治式”“双抗体”等)起使用并且包括：
(a)通过将体重调控物与可检测标记物偶联得到的一种标记的组分；
(b)一种或多种附加的免疫化学试剂，其中至少一种试剂是配体或固定化配体，该配体选自：
    (i)能与标记的组分(a)结合的配体；
    (ii)能与标记组分(a)的结合物结合的配体；
    (iii)能与至少一种待确定的组分结合的配体；
    (iv)能至至少一种待确定组分的至少一种结合物相结合的配体；和
(c)检测和/或确定体重调控物与其特异性结合物之间免疫化学反应的一个或多个组分的操纵方法的执行说明。
                    基于核酸的诊断
由实施例可见，本发明的核酸可用来检测与OB多肽缺陷相关并导致肥胖表型的缺陷。例如，核酸探针(例如，Northern分析或RT-PCR分析中)可有来确定肥胖表型是否与OB mRNA表达不定，或非功能性OB mRNA表达，例如在db/db小鼠中(其中缺陷起因于缺乏OB受体)相关联或是何处突变产生不转录的mRNA。而且，本发明的基于核酸的诊断技术可与基于抗体的技术联合使用。进一步在分子水平了解肥胖或厌食表型。
最近分离的人类cDNA克隆被测序，已在这里给出。这就帮助我们确列人类基因的完整序列(见图20A至C；SEQ ID NO：22)。得到了人类OB基因内含子的DNA序列(图20)，该序列被用来制备PCR引物，PCR扩增人类基因组DNA的OB基因编码序列，来鉴定OB基因的突变或等位变异体，所有这些均与上面详述的操作方法相符。用来扩增人类基因组OB的PCR引物的描述见下文的特定实施例中。
目前的假说是ob基因的杂合突变与轻微/中度肥胖相联系而纯合突变与几种基于DNA序列的肥胖症诊断检验相联系。如果该假说成立，就可确证某些人有得肥胖症的危险，并且能在体重增加到得肥胖症之前进行药物治疗和/或改变人的生活习惯。
此外，以人类OB突变形式分离的杂合子的存在可用于诊断。多种PCR引物，包括基于图20A至C给出的核苷酸序列的PCR引物可用于此。
OB基因也可用于诊断测量营养失调中其编码的RNA和蛋白质。知道在某种特定的营养失调症中OB RNA和/或其编码的蛋白是否不受调节或减量调节十分重要。因此，若胖人OB水平增加，问题应当发生在OB下游，而若OB减少，应当是不适当的低水平OB造成肥胖(不论缺陷是否在OB基因上)。反过来，若是体重减轻的癌症或爱滋病患者OB水平升高，则可下结论说OB的不正常的高度表达造成体重减轻。
克隆的人类cDNA可用于测量人类OB RNA的水平。另外，可制备重组人类蛋白用以研制免疫检验方法来测量脂肪和，如果可能的话，OB蛋白的血浆水平。
                     治疗应用
本发明的多肽，核酸和抗体有显著的治疗潜力。优选地，治疗有效量的该试剂与药用载体，稀释剂或赋形剂一起给药。
术语“药用”指分子实体或组合物，它们在生理上可耐受，对人类给药时一般不会产生过敏或其它不适反应，如反胃，眩晕等。优选地，此处应用的“药用”指受联邦或州政府的管理部门批准或列在《美国药典》或其它动物用，更具体地人用的，受到广泛承认的药典。术语“载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或化合物给药时的载体(vehicle)。这样的药用载体可以是无菌液体如水和油、包括石油、动物、植物或合成来源的如花生油、矿物油、芝麻油等，水或盐溶液和水溶右旋糖和甘油溶液优选地用做载体，尤其是用于注射用溶液。适宜的药用载体的描述见Martin《雷明顿氏医药科学》18版，Mark出版公司，Easton，宾州(1990)。
“治疗有效量”一词在这里用来指足够使宿主的活性、功能和反应降低至少约15％，优选地至少50％，更优选地至少90％，最优选地完全阻止其临床上重要的亏缺(deficit)的量。备选地，治疗有效量足以引起宿主中临床上重要的病情的改善。
用重组OB多肽给药导致体重减轻，特别是脂肪组织减少。OB多肽可用标准细菌和/或哺乳动物表达载体，或合成法或从血浆或血清中纯化方法制备，所有这些均在前面有详述。备选地，用上文描述的同源重组技术可诱导天然OB多肽表达增加。
OB多肽活性降低(通过利用拮抗物，抑制物，使用中和抗体或反义分子)会导致体重增加，在治疗与癌症、爱滋病或神经性厌食症相关的体重减轻时需要体重增加。OB活性的调控可用于减轻体重(通过增大其活性)或增加体重(通过降低其活性)。
                      基于多肽的治疗处理
在最简单的分析中，OB基因决定哺乳动物，特别是小鼠和人的体重。OB基因产物及相应的同源分子看似一种信号途径的一部分，脂肪组织通过该途径与脑和其它器官进行通讯。相信OB多肽本身即是信号分子，即激素。
OB多肽或其功能活性部分或其拮抗物可以口服或肠胃外给药，优选地肠胃外给药，由于代谢自稳态是持续过程，ob多肽优选地要可控地释放给药。例如，多肽可通过静脉注入，内植渗透泵，片下膜，脂质体及其它给药方式给药。在一个实施方案中，可用泵[Langer等人编，《可控释放技术的医学应用》，CRC出版社Boca Raton，弗罗里达州(1974)；Sefton，CRC生物医学工程评论与参考，14：201(1987)；Buchwald等人，外科(Surgery)88：507(1980)]。Saudek等人，新英格兰医学杂志321：574(1989)]。另一实施方案中，可用聚合材料[Langer，1974，引文见上；Sefton，1987，引文见上；Smolen等人编，可控药物生物供应，药产品设计与功能，Wiley，纽约(1984)；Ranger等人，高分子科学综述，高分子化学杂志(J.Macromol.Sci.Rev.Macromol Chem.23：16(1983)，也见Levy等人，科学，228：190(1985)；During等人，神经学年鉴(Ann.Neurol)25：351(1989)；Howard等人，神经外科杂志(J.Neurosurg)71：105(1989)。另一实施方案中，可控释放系统置于治疗目标(即脑)附近，因而仅需全身剂量的一部分量[见例如，(Goodson，可控释放技术的医学应用，卷2，115-138页(1984))。其它可控释放系统的讨论见综述，Langer，科学，249：1527-1533(1990)。另一实施方案中，治疗化合物通过载体(特别是脂质体)给药(见Lenger，1990，引文见上)；Treat等人，传染病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，纽约，353-365(1989)；Lopez-Berestein，出处同上，317-327页；见上述引文。)
另一方面，用OB基因转化并高水平表达该多肽的重组细胞可移植入需要ob的受试者中。优选地，移植OB转化的自体细胞以避免排斥；备选地，可用已知技术将生产可溶性因子的非自体细胞屏蔽在聚合物基质中避免免疫识别与排斥。
OB多肽可通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内或皮下施用途径给药。备选地，OB多肽经适当配制，可通过鼻腔或口腔给药。以必要的时间间隔例如每日、每12小时等给治疗有效剂量的药(即能有效诱导受试者代谢变化的剂量)可保证OB的恒定供给。这些参数依赖待治的疾病的严重程度，相伴的其它措施如食谱调控，受试者的体重，年龄与性别，以及其它标准，这些均可根据本领域技术人员良好的标准医治实践来确定。
                 药物组合物
本发明另一方面提供上述药物组合物。这些药物组合物可以供注射给药，口服，或肺部，鼻腔及其它给药方式。一般地，本发明涉及的药物组合物含有有效量的本发明蛋白质或衍生产物，还有药用稀释剂、保鲜剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体、这些成分包括各种缓冲液成分(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，pH和离子强度的稀释剂；添加剂如去污剂和增溶剂(例如Tween 80，多聚乙氧基醚，抗氧化剂(例如抗坏血酸，偏二亚硫酸钠)，保鲜剂(例如Thimersol，苯醇)和填充物质(例如乳糖，甘露醇)；将这些材料加入到颗粒状聚合物如聚乳酸、聚葡糖酸等的制剂中或加入脂质体中。也可用透明质酸。这些组合物可能影响本蛋白及衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。见例如马丁，雷明顿氏医药科学，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，宾州18042)1435-1712页，在此引入作为参考。组合物可以是液体形式或干粉形式，如冻干形式。
               口服
此处涉及口服固体制剂形式，综述见马丁，雷明顿氏医药科学，第18版(1990，Mack出版公司，Eastin，宾州18042)第89章，在此引入作为参考。固体制剂形式包括药片、胶囊、药丸、锭剂或糖锭，扁囊剂或小药丸。另外脂质体或蛋白样胶囊包衣可用于配制本组合物(见例如美国专利4,925,673号报道的蛋白样微球)。可用脂质体胶囊包衣，脂质体可用多种聚合物衍生(例如美国专利5,013,556号)。关于可能用于治疗的固体制剂形式的讨论见Marshall，现代医药，第10章，Banker和Rhodes编(1979)，在此引入作为参考。通常制剂中包括该蛋白质(或化学修饰的蛋白质)以及使之免受胃内环境破坏的惰性成分，并在肠内释放出生物活性物质。
也特别涉及到上述衍生蛋白的口服制剂形式。可以化学修饰蛋白，使衍生物口服更有效。通常所涉及的化学修饰是将至少一个部分(moiety)连到蛋白质(或肽)分子上，该部分能够(a)抑制蛋白水解；和(b)使蛋白(或肽)分子从胃或肠进入血流。最好是蛋白质稳定性增加并且在体内循环时间增加。这样的部分例子包括：聚乙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski等人，1981，引文见上；Newmark等人，应用生物化学杂志(J.Appl.Biochem)4：185-189(1982)。其它可用的聚合物有聚-1，3-二茂烷和聚-1，3，6-三茂烷，如上述，优选用于医药用途的是聚乙二醇部分。
蛋白质(或衍生物)的释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。对本领域专业人员来说存在这样的制剂，它不溶在胃里，但会在十二指肠或肠的其它部位释放物质。优选地，这种释放将避免对胃环境的有害作用，作用方式或是保护蛋白质(或衍生物)或是在胃环境以外如肠内释放生物活性物质。
为了保证完全抵抗胃液，包衣必须对至少pH5.0不可渗透。可以采用作为肠包衣的常用惰性成分，其例子有乙酸纤维素苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)，Eudragit L30D，Aquateric，乙酸纤维素邻苯二甲酸酯(CAP)，Eudragit L，EudragitS.和Shellac。包衣可作混合膜用。
包衣或包衣的混合物也可用于药片，但不是为了保护药片不受胃破坏。这可包括糖衣或是使药片更易吞咽的包衣。胶囊可会有硬壳(如明胶)以输送干药物即粉末；对液体可用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是厚淀粉或其它可食用纸。对药丸、锭剂、模压药片或片剂研磨剂，可用湿混技术(moist massing technique)。
药物可以是颗粒大小约为1mm的小球或小片形式的细多颗粒制剂。胶囊给药的制剂材料也可以是粉末，轻压的填料甚至是药片。可用挤压法制备药物。
加色剂(colorant)与香味剂可包括在内。例如蛋白质(或衍生物)可先配制(例如用脂质体或微球胶囊)，再进一步加到食用品中去，例如含有加色剂和香味剂的冰镇饮料。
可以用惰性材料稀释或填加药物的体积。稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露醇，α-乳糖、脱水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填充物，包括磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。可购得的稀释剂有Fast-Flo，Emdex，STA-Rx1500，Emcompress和Avicell。
崩解剂也可包括在药物制剂中制成固体制剂形式。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉以及可购得的基于淀粉的崩解剂(淀粉乙醇酸钠)。还可用葡糖钠淀粉，离子交换树脂，羧甲基纤维素钠，ultramylopectin、褐藻酸钠、明胶、桔皮、羧甲基纤维素酸、天然海绵和皂土。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉末状树胶可用做崩解剂和结合剂，这包括诸如琼脂，Karaya或黄蓍胶等粉末状树胶。褐藻酸及其钠盐也可用做崩解剂。
结合剂可用来将药剂结合在一起形成硬的药片，包括天然材料如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉、和明胶。其它的结合剂包括甲基纤维素(MC)，乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。醇溶液中用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)使药物成粒。
抗摩擦剂可用在药物制剂中防止配制过程中发生粘连。在药物与模壁之间可用一层润滑剂，包括但不限于：硬脂酸及其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可用可溶自润滑剂如用月桂酸硫酸钠、月桂酸硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇和Carbowax4000和6000。
助流剂(glidant)可用来增加配制时药品流动性，并在挤压过程中帮助重整。助流剂可能包括淀粉、滑石、热解硅胶和水合硅铝盐。
为帮助药物在水性环境中溶解，可用表面活性剂作润湿剂。表面活性剂可包括阳离子去污剂如月桂酸硫酸钠，十六烷基硫化琥珀酸钠和十六烷基磺酸钠。也可用阳离子去污剂如氯苄烷铵或氯化苄乙氧铵。可以用在制剂中作表面活性剂的非离子型去污剂包括lauromacrogol400，硬脂酸-40-聚烃氧基酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，甘油单硬脂酸多乙氧基醚40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂或单独或以不同比例混合地用在蛋白质或衍生物的制剂中。
可以促进蛋白质(或衍生物)吸收的添加剂有例如脂肪酸、油酸，亚油酸和亚麻酸。
可能需要可控释放的制剂。药物可加入允许以扩散或渗漏机制释放的惰性基质即树胶中。缓慢降解的基质也可加入制剂中。本药物的另一种可控释放方式可以是基于Oros治疗系统(Alza公司)的方法，即该药物由半透膜包裹，由渗透作用允许水从单个小孔进入，药物从单个小孔排出。有些肠包衣也有延缓释放的作用。
其它包衣也可用于制剂，这包括许多可用于包衣锅(pan)的糖类。治疗剂也可以是膜包衣药片；这种情况下用的材料分为两组。第一组为非肠道材料，包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲基羟基-乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基-甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，providone和聚乙二醇。第二组包括肠道物质，即常用的苯二酸酯。
可用混合材料得到最佳的膜包衣。膜包衣可用包衣釜(pancoater)或流化床(fluidized bed)或用挤压包衣。
                 肺部给药
本发明也涉及将本蛋白(或其衍生物)肺部给药。当哺乳动物吸气时，该蛋白(或衍生物)给药到肺部，并穿过肺上皮衬进入血流。有关的报道见Adjei等人，医药研究，7(6)：565-569(1990)；Adjei等人，国际医药杂志，63：135-144(1990)(leuprolideacetate)；Braquet等人，心血管药学杂志13(增刊5)：143-146(1989)(endothelin-1)；Hubbard等人，内科药年刊(Annals ofInternal Medicine)3(3)：206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)84：1145-1146(1989)(α1-蛋白酶)，Oswein等人，“蛋白质的气溶胶化”，呼吸系统送药研讨会进展II，Keystone，科罗拉多(1990年3月)(重组人类生长激素)，Debs等人，免疫学杂志，140：3482-3488(1988)和Platz等人，美国专利5,284,656号(粒细胞集落刺激因子)。本发明实际应用时也涉及到大量的为治疗产品肺部送药设计的机械装置，包括但不限于雾化器，计量剂量吸入器(metered-dose inhaler)和粉末吸入器，所有这些均为本领域专业人员所熟知。
某些适用于本发明实践的可购得仪器例子有Ultravent雾化器，Mallinckrodt公司制造，圣路易，密苏里州；AcornII雾化器，Marqust医药产品公司制造，Englewood，科罗拉多州；Ventolin计量剂量吸入器，葛兰素公司制造，研究三角公园，北卡罗来纳州；Spinhaler粉末吸入器，Fison公司制造，Bedford，麻省。
所有这些仪器均需用适于蛋白质(或衍生物)散发的制剂。典型地，每种制剂针对某种仪器，除了治疗中常用的稀释剂，佐剂和/或载体外可能还要用适当的推进剂材料。也试图用脂质体，微胶囊或微球，包含复合物或其它类型的载体。根据化学修饰类型或所用仪器类型在不同的制剂中也可采用化学修饰的蛋白。
适用于喷气式或超声式雾化器的制剂一般包括溶于水的蛋白质(或衍生物)，其浓度为每毫升溶液约0.1至25毫克生物活性蛋白。制剂亦可包括缓冲液和简单糖(Simple sugar)(例如用于稳定蛋白质，调节渗透压)。雾化器制剂也可含有表面活性剂，以减小或避免蛋白质形成气溶胶时溶液原子化导致的表面诱导聚集。
用于计量剂量吸入器的制剂通常包含精细分离的粉末，它含有经表面活性剂协助悬浮于推进剂的蛋白质(或衍生物)。推进剂可以是任何常规使用的材料，如氯氟烃，氢氯氟烃，氢氟烃，氢烃，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括山梨醇三油酸和大豆卵磷酯。油酸也可用作表面活性剂。
用于粉末吸入器散发的制剂包含含有蛋白质(或衍生物)的精细分离的干粉末，也可含有填充剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，其含量足以协助粉末从仪器中散发出去，例如占制剂重量的50％至90％。蛋白质(或衍生物)最好制成颗粒形式，平均颗粒大小小于10μm最优选地0.5至5μm，以最有效地送药到肺远端。
                         鼻腔给药
本发明也涉及鼻腔给药本蛋白(或衍生物)。鼻腔给药使蛋白在给药后直接进入血流，而不必将药物沉积于肺部。鼻腔给药的制剂包括葡聚糖或环葡聚糖。
                   治疗方法，制备药品的方法
本发明另一方面提供治疗处理(treatment)与制备药物的方法。能通过施用本衍生物而缓解或调控的病症描述如上。
                           剂量
对所有上述分子，进行进一步研究后会得到治疗不同病人的不同情况所需合适剂量水平的资料，普通的技术人员应注意治疗前后情况，受药人的年龄和一般健康状况，即能确定正确的剂量。通常对注射或输液，剂量在0.01μg生物活性蛋白质/kg体重(只计算无化学修饰的蛋白质量)与10mg/kg(同上说明)之间。剂量表可根据所有蛋白或衍生物循环半衰期，多肽是丸剂给药还是连续输液及所用制剂而变化。
                 与其它化合物一起给药
对于与肥胖症相联系的疗法，本蛋白(或衍生物)可与治疗其它肥胖症的临床并发症的一种或多种药物组合物共用，例如那些用来治疗糖尿病(例如用胰岛素)、高血压、高胆固醇及其它与肥胖症伴生的病症的药物组合物，另外其它抑制食欲的药也可一起给药，例如苯异丙胺可同时给药(例如将本蛋白与胰岛素混合物给药)或依次给药。
                 基于核酸的治疗处理
OB基因可引入人体脂肪细胞用于肥胖症基因疗法。这种疗法预计会降低体重。反过来，将反义构建体引入人体脂肪细胞会降低活性OB多肽的水平，预计会使身体更肥胖。
在一个实施方案中，将编码OB多肽的基因通过病毒载体引入体内。这样的载体包括毒性减弱的或缺陷型DNA病毒，例如但不限于单纯疱疹病毒(HSV)，乳头状瘤病毒，Epstein-Barr病毒(EBV)，腺病毒，腺相关病毒(AAV)等。优选的是缺陷型病毒，其病毒基因全部或几乎全部缺失。缺陷型病毒引入细胞后不会感染。用缺陷型病毒可给药到专一性定位区域的细胞中，而不必考虑载体可能感染其它细胞。因此，脂肪组织可特异性定向。某些载体和例子包括但不限于缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体[Kaplitt等人，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)，2：320-330(1990)]，毒性减弱的腺病毒载体，如Stratford-Perricaudet等人，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)，90：626-630(1992)描述的载体，以及缺陷型腺相关病毒载体[Samulski等人，病毒学杂志，(J.Virol.)61：3096-3101(1987)；Samulski等人，病毒学杂志，63：3822-3828(1989)]。
另一实施方案中，可通过逆转录病毒载体引入基因。例如Anderson等人，美国专利5,399,346号；Mann等人，细胞，33：153-(1983)；Temin等人，美国专利4,650,764号，Temin等人，美国专利5,124,263号；国际专利出版物WO95/07358号，1995年3月16日出版，Dougherty等，以及Kuo等人，血液(Blood)82：845(1993)。
备选地，载体可通过脂感染(lipofection)引入体内。过去十年里，越来越多地应用脂质体制胶囊及体外核酸转染。设计来限制脂质体介导转染遇到的困难与危险的合成性阳离子类脂可用来制备用于编码标记物的基因体内转染的脂质体[Felgner等人，美国国家科学院院刊，84：7413-7417(1987)；见Mackey等人，美国国家科学院院刊，85：8027-8031(1988)]。用阳离子类脂可能促进带负电荷的核酸的成胶囊作用，也可能促进带负电荷的细胞膜的融合(Felgner等人，科学，337：387-388(1989))。用脂感染将外源基因引用特定体内器官在实践上有某些优点。将脂质体分子定向到特定细胞代表了一方面优点。很明显，在具有细胞异质性的组织，如胰，肝，肾和脑中定向转染特定细胞类型会特别有用。脂肪可与其它分子化学偶联，用于定向用途(见Mackey等人，1988，引文见上)。定向的肽类，例如激素或神经递质，和蛋白质如抗体，或非肽分子可与类脂化学偶联。
也可以以裸露的DNA质粒形式将载体引入体内。用于基因疗法的裸露DNA载体引入所需的宿主细胞中可采用本领域已知的方法，例如转染，电穿孔，微注射，转导，细胞融合，DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀，应用基因枪或利用DNA载体转运物(见例如Wu等人，生物化学杂志，267：963-967(1992)；Wu等人，生物化学杂志，263：14621-14624(1988)；Hartmut等人，加拿大专利申请，2,102,311号1990年3月15日提交。
                       农业应用
OB基因也可从家养动物中分离得到，并由此获得相应的OB多肽，在特定实施方案中，见下，从小鼠OB基因得到的探针与得自大量动物物种的相应同源编码序列杂交。如对人类疗法讨论的那样，也可制备重组蛋白质，对家养动物给药。用多肽给药可生产瘦肉型食用动物，如肉用牛、猪、家禽、绵羊等。优选地施用自体OB多肽，尽管本发明也试图用抗自体多肽给药。由于OB多肽包含约160个氨基酸残基，它不是高度免疫原性的。因此，用非自体多肽给药可能不引起免疫应答。
备选地，将克隆的基因引入转基因家养动物可能会通过OB转基因过度表达而降低体重改善肥胖。实现这个设想的最简单方法是用自身的或其它脂肪特异性启动子将OB转基因定位到脂肪中。
反过来，在其它情况下如培育Kobe(神户)牛肉或肥胖的肝脏做肥肝(foie gras)时需要增加体内脂肪含量。将反义OB转基因定位到脂肪中或用基因剔除(knockout)技术可实现这一点。此外，若需要体重中脂肪百分比增大，可用OB多肽的抑制物或拮抗物给药。这样的抑制物或拮抗物包括但不限于与多肽反应的抗体和与OB受体结合但不激活它的多肽片段，即OB多肽的拮抗物。
                         美容应用
OB多肽除有利健康外，在美容上也有重要价值。特别地，因为本发明的OB多肽，包括其衍生物和激动剂类似物，可用于调控动物脂肪细胞贮存的速率与数量，故可用来减少不美观的脂肪组织，例如腹部，臀部，大腿，颈部或颏部的脂肪贮存，它们虽不会导致肥胖，但有损个人形象。据认为部分地可通过降低食欲，即降低食物摄入量，增加基础代谢率，或二者兼用来达到减少脂肪的效果。因此，本OB多肽或其衍生物或激动物类似物，可给药至受试者中，通过调控脂肪贮存，降低食欲或二者兼用，在脂肪组织贮存处产生美容的变化。
另外，本组合物与方法可与许多方法合用，例如改变身体整体形象的美容手术(例如吸脂术到激光手术，通过吸除或切割脂肪组织来降低身体质量)，锻炼(尤其是跑步和体重训练)，低脂肪食谱，催眠，生物反馈，这些都是尝试降低脂肪组织百分比，改善体形的方法。
相应地，本发明涉及一种调控个体脂肪组织的美容方法，包括用可调控脂肪的量的OB多肽或其衍生物或激动物类似物，给药至需要调控脂肪组织美容及改善体形的个体中。优选地，调控脂肪组织即减少脂肪组织。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种减少脂肪组织的美容方法，该方法包括用可调控脂肪的量的OB多肽或其衍生物或激动物类似物，给药至需要调控脂肪组织美容或改善体形的个人中。
                    OB受体
分离出OB因子的受体会大大有助于研制其小分子激动剂或拮抗物。制备活性OB多肽并用它来用标准方法筛选表达文库可实现该目的。用细菌或哺乳动物表达载体制备的重组多肽给药并观察其短期效果以及用重组多肽持续给药至表达文库的细胞中，或直接检测OB多肽对细胞的结合，用这些方法可检测受体与表达文库的结合。
目前认为OB受体可能位于下丘脑或肝中，优选地用标准表达克隆载体构建这些组织的cDNA文库。然后将这些cDNA克隆引入COS细胞库中，用活性配体筛选得到的转化体来鉴定表达OB受体的COS细胞。分离阳性克隆，回收克隆受体。克隆受体与OB配体(假设它是激素)共用研制出筛选小分子OB调控物的必要组分。
本发明应用的特定检验系统称为受体检验。受体检验(receptorassay)中，待检验材料适当地标记，然后用一定量的标记与未标记的材料接种到某种细胞检查克隆中，再进行结合研究，确定标记的材料结合细胞受体的程度。这样即可确定材料间亲和性的差别。
相应地，一定量的纯化体重调控物放射性标记再，例如，与抗体或其其它抑制物结合，然后进行结合研究。制备含有不同量的标记的与未标记的未结合的体重调控物的溶液，然后接种细胞样本再温育。得到的细胞单层经冲洗溶解然后用伽马计数器计数足够长时间，使标准差小于5％。对这些数据作Scatchard分析，然后做出有关材料活性的观察与结论。虽然上述仅为一例，但其说明的一种方法，即当检验材料的细胞结合能力可能是供区别用的特征时，可采用受体检验。因而，受体检验对于鉴定本调控物的特异性受体如db受体特别有用。
本发明涉及的进一步的有用检验方法是“顺反(cis/trans)”检验。简言之，本检验用到两种遗传结构，其一通常是一种质粒，转染量合适的细胞系中会持续表达特定的感兴趣受体，另一是一种质粒，在受体/配体复合物控制下表达标志物如荧光素酶。因而，例如若需要评价一化合物是否特定受体的配体，其中一种质粒结构在选定的细胞系中表达受体，另一质粒含有一启动子，与荧光素酶基因相连，特定受体的反应元件插入荧光素酶基因中。如果受检验的化合物是受体的激动剂，配体会与受体形成复合物，该复合物就结合反应元件，并起始荧光素酶基因的转录。用光计量方法测量所得的化学发光得到剂量反应曲线，将其与已知的配体的剂量反应曲线相比。前述方法的详述见美国专利4,981,784号和PCT国际出版物WO88/03168号；用于技术人员参考。
一旦鉴定出表达OB受体基因序列的重组体即可分析重组OB受体。用基于OB受体的物理与功能特性的检验方法可实现这一目的，包括将受体放射性标记，然后用凝胶电泳，免疫检验，配体结合等分析。而且，可如上述产生ob受体的抗体。
OB受体的结构可用本领域已知的许多方法来分析。优选地，分析不同结构域的结构，特别是OB结合位点的结构。可通过鉴定与其它已知蛋白质，尤其是激素和蛋白质受体的序列相似性来进行结构分析。相似性(或同源性)程度可提供预测OB受体或其一个结构域的结构与功能的基础。在特定的实施方案中，可利用例如FASTA和FASTP程序[Pearson等，美国国家科学院院刊，85：2444-48(1988)]与GenBank中的序列进行序列比较。
可用亲水性分析(例如Hopp等人，1981，引文见上)进一步分析蛋白序列的特征。可用亲水性图谱鉴定OB受体蛋白的疏水性与亲水性区域，进而可预测细胞外区，膜结合区和细胞内区。
也可进行二级结构分析(例如Chou等人，1974，引文见上)来鉴定OB受体采取特定二级结构的区域。
用本领域提供的计算机软件程序还可进行操纵，翻译和二级结构预测，以及开放阅读框架预测与绘制。
本发明提供充足来源的重组OB多肽，并能分离OB受体(即db基因产物)，故能定量确定OB多肽和OB受体或其结构域的活性构象结构。特别地，有足够的材料用于核磁共振(NMR)，红外(IR)，拉曼和紫外(UV)，尤其是圆二色(CO)，光谱分析。特别是NMR是溶液中分子结构分析的有力工具，溶液中更接近分子的天然环境(Marion等人，1983，引文见上：Bar等人，1985，引文见上；Kimura等人，1980，引文见上)。也可运用其它结构分析方法。这包括但不限于X射线晶体学分析(Engstom，1974，引文见上)。
更优选地，可研究OB多肽和OB受体的共结晶。分析共结晶可提供有关结合的详细资料，进而可能合理地设计配体激动剂和拮抗物。也可用计算机模型，特别是与NMR或X射线方法共用(Fletterick等人编，当代分子生物学通讯中的计算机绘图与分子模型，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1986)]。
鉴定并分离本发明的编码OB受体的基因，能提供比从天然来源分离所得量多得多的受体表达，或是使受体在专门设计或细胞转染或转化后指示表达的受体的活性的指示细胞中表达。相应地，除了基于OB多肽结构合理地设计激动剂和拮抗物，本发明还涉及其它用本领域已知的不同筛选检验方法鉴定OB受体的特异性配体。
本发明参考下述实施例可能更易理解，这些实施例仅是本发明的应用实例而不具有限制性。
                    实施例部分
下述文字概述了鉴定基因材料的方法，以举例说明本发明。该方案包括四个连续步骤：A)遗传定位(Genetic Mapping)，B)物理定位，C)分离候选基因，和D)检测突变，在此之前先确证从受试者中分离到小鼠基因(D步)，找到同源人类基因，并测定了小鼠和人类基因以及假设(putative)的蛋白质的性质。这些步骤详述如下。A.遗传定位
从遗传交叉实验中分离出ob突变，用标准连锁分析将突变相对RFLP(限制片段长度多态性)定位。从这些数据知，OB基因在近端小鼠6号染色体的～5cM间隔上。(5cM是相当于每100个动物发生5个遗传交叉的遗传距离测量单位。)共得到771个能提供资料的减数分裂后代，并用于后来的遗传定位(Friedman等人，1991，引文见上)。相对于OB定位的遗传座位均先前见于报道。所述的最近的两个RFLP由得自羧肽酶基因和met癌基因的探针确定。
上述实验的遗传分辨能力不足以克隆ob，主要是因为没有一个遗传标记是紧密连锁的。为了鉴定必需的紧密连锁RFLP，分离到另外的探针并扩展了遗传杂交。一种称为染色组微切(microdissection)的方法用来从近端小鼠6号染色体分离到DNA的随机片段(Bahary等人，哺乳动物基因组，4：511-515(1 993))。对每个克隆的探针检验其与ob的紧密连锁。甚于这些研究，选出一种探针，D6RcK13，又称psd3，由于其遗传上接近OB，可用于进一步分析。
该探针用于确定来自种间杂交与亚种间杂交的835个ob后代的基因型，这表明D6RcK13在所有853个动物中并非都重组，这同Bahary等人报道的相同。在物理定位过程中，从来自YAC53A6的粘粒亚克隆中鉴定到一种新的多形性标记。这种新标记位于D6RcK13和OB基因之间，用来确定来自种内杂交和回交的另外771个能提供资料的减数分裂后代的基因型。鉴定出一个动物#167，其在ob与D6RcK39中有重组交换。这些研究显示D6RcK39/D6RcK13距ob约0.06cM。另一个探针，Pax4经鉴定距ob0.12cM。Pax4在两个动物#111和#420中重组。Pax4是早先被Gruss及合作者定位到小鼠6号染色体近端上的假基因[Gruss等人，基因组学11：424-434(1991)]。在此基础上确定OB基因位于Pax4和D6RcK13之间～0.2cM的间隔上。下一步是将中间这段DNA克隆来分离OB。B.物理定位
这一段克隆DNA用于酵母人工染色体(YAC)，一种相对来说新的克隆载体，可以克隆通常是长度超过一百万碱基对的连续DNA长段。
用D6RcK13和Pax4分离酵母人工染色体。为实现这一目的，制备纯化的DNA探针用来分离相应的YAC。这些YAC(#8，#16，#107和#24)先分离并测定特性，基于检验结果，结论是YAC16是延伸最远，即距ob最近的YAC。回收YAC#16的关键末端(key end)，确定该末端距ob比距Pax4近。该末端被称为16M(+)。因为该探针与动物#420中不重组(如Pax4)故得此结论。该末端经测序用来做PCR检验。用PCR检验来筛选YAC文库。分离到4个阳性克隆。接下来的用末端补救(end-rescung)，限制定位，脉冲电场凝胶和用遗传交叉做的Southern印迹，检测这些YAC的性质，确定这些YAC中的两个adu和aad，对进一步的研究十分重要。YAC aad是550KB非嵌合YAC，延伸最远。因而该YAC的远端，aad(pICL)，被用来完成物理图谱。YAC adu是370kb的非嵌合YAC，其远端adu(+)经确定，与所有遗传交叉的ob后代包括#111和#167均不重组，显示OB基因可能在该YAC上。
设计了对这两个末端add(pICL)和adu(+)的PCR检验并用来分离更多的YAC和P1克隆继续物理定位。这样分离的重要P1克隆包括498，499，500(用于自aad(pICL)探针分离到)和322，323和324(用来自adu(+)的探针)。
同时，检测有D6RcK13分离到的YAC(53A6，25A8，25A9，25A10)。这些研究确定53A6近端向aad YAC延伸得最远。53A6与aad之间的空档的大小确定为～70KB。53A6，53(pICL)关键末端然后被用来筛选现有的3个YAC文库和一个P1文库。分离到一个关键的P1克隆，325。该P1克隆与上述aad(pICL)分离到的那些P1有重叠，因而可用来填上53(pICL)和aad(pICL)之间的空档。结果是克隆到含有YAC和P1克隆的整个结构区(contig)，它长约2.5百万碱基对，并跨越Pax4，16M(+)，adu(+)，aad(pICL)，53(pICL)，D6RcK13和D6RcK39。仔细将动物#111和#167的重组位点定位，即可做出结论，OB位于400KB间隔上。为了提供用于分离OB基因的可用的DNA来源，在其24个P1克隆中分离了涵盖该非重组区的500KB。这些克隆包括后来证明有用的322和323，它们被用于外显子捕捉(exon trapping)。
携带OB的染色体部分物理图谱由图7A给出。图7A显示YAC结构，和7显示P1结构区。C.分离候选基因
这一段用来分离基因的方法是外显子捕捉。该方法利用购得的载体通过选择引入试验结构的基因组DNA中功能性切割受体与功体序列来鉴定外显子DNA(即编码序列)。来自P1克隆的DNA生长后亚克隆到外显子捕捉载体中。这些克隆是克隆到Bluescopt载体中的短插入序列。每个克隆用对应于包围插入序列的质粒序列的PCR引物进行PCR扩增。PCR扩增直接在携带质粒的载体上进行。反应由Biomek机器手布置(set up)。PCR产物于含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶、TBE缓冲液中电泳。外显子捕捉技术经修饰除去P1克隆中的污染大肠杆菌DNA，并筛选掉丰富的伪迹外显子，这些外显子占设想捕捉到的外显子的超过80-90％。外显子捕捉载体包括HIV序列；这些载体序列的短片段对应该伪迹。
用多种P1克隆进行外显子捕捉实验。外显子捕捉产物用PCR扩增，选择并测序。假设的“外显子”序列用Blast计算机程序跟GenBank中的序列比较。选出约15个外显子进一步用RT-PCR，Northern分析和动物印迹(200blit)检查对应的RNA或保守序列是否存在。发现15个假设的外显子中的7个325-2，323-9，322-5，D1-F7，1H3和267编码RNA转录物。325-2是睾丸特异性基因；323-8和323-9象是主要在脑和肾表达的同一基因的两个外显子。1H3和322-5代表两种低水平脑内转录物。D1-F7是来自前面克隆的基因，肌醇单磷酸脱氢酶(1MPDH)，的外显子，该基因具有普适的表达形式。所有这些基因都不象是编码OB。2G7是OB外显子，进一步讨论见下面。
三次尝试外显子捕捉OB基因失败后，将所有来自关键OB区的P1的DNA汇集起来做另一次尝试。这包括P1，258，259，322，323，324，325，498，499，500，653，654及其它。此后P1 258，260，322，498和499亚克隆到外显子捕捉载体中，然后用细菌克隆制备几个平板(plate)，每一个带有一种假设的外显子。得到了约192个代表假设的OB候选物的克隆。如上述，观察到总有一伪迹存在，使得许多分离物含有两个来自该载体的捕捉到的外显子。因此通过克隆的大小以及通过对应该伪迹的DNA探针杂交物与凝胶上Southern印迹对应带相杂交这一事实来鉴定克隆。这样，192个克隆中的185个排除掉，不再做进一步评价。仅靠大小就排除伪迹是不可能的，因为这样最后可能排除了对应于OB的外显子。
因此，192个外显子中共有7个外显子选来做进一步研究。先制备将这7个外显子测序的模板，然后测序。分析7个内显子的序列发现这7个完全相同并且有一个明显是伪迹。更具体地，克隆1D12含有“HIV序列”即伪迹带。这样就剩下3个外显子作进一步分析：(F1，2G7和1H3。1F1被排除是因为它定位在关键区之外。1H3和267的PLR引物都选来合成。
确定了2G7上外显子的序列，由图10给出(SEQ ID NO：7)。2G7的PLR引物选来合成。序列上对应于PLR引物的部分7划线。所用引物为：
5′CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm＝60.0℃)
(SEQ ID NO：8)
3′CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G(Tm＝60.0℃)
(SEQ ID NO：9)
这些引物扩增基因组DNA，PCR条件为：25-30轮，55℃退火2′，72℃延伸2′，94℃变性1′，标准PCR缓冲液。PCR反应中加上32P-dCTP相应地减少冷的(cold)dCTP的量，即可用这些引物产生标记的探针。
对许多组织RNA作RT-PCR、结论是，在所有检查过的组织中2G7仅在白脂肪中表达(图11A)。此后，32P标记的2G7与组织RNA的Northern印迹杂交(图11B)显示该RNA在脂肪组织中高水平表达，在所有其它组织中不表达或以很低水平表达(这里的信号是可能是污染组织制备物的脂肪造成的)。每种上述组织的10μg总RNA甲醛的琼脂糖凝胶上电泳。该探针与印迹65℃在标准杂交缓冲液，Rapid Hybe(Amersham)中杂交。RNA大小约4.9KB。此时2G7已试图为OB基因的可能候选物并进一步分析。D.检测突变
为了证实2G7编码OB基因，有必要摆出该基因DNA序列的RNA表达水平在突变型与野生型动物之间的差别。现有ob基因的两种不同突变可供研究，C57BL/GJ ob/ob(IJ)和CKc/Smi ob/ob(2J)。此后分别称之为1J和2J。(非正式的术语用来指所研究的小鼠株。该实施例与附图中均应理解为C57BL/6J指C57BL/6J+/+；CKC/Smj指SM/CKc-+Pac-+/+；CKC/smj ob/ob指SM/CKc-+Dca-ob2J/ob2J )。从分离自1J，2J和对照动物的脂肪组织制取RNA。每个样品的总RNA用DNase处理，然后用寡聚dT作引物以及逆转录酶进行逆转录。得到的单链cDNA然后用2G7引物(条件由面给出)对下面的带或用购置的肌动蛋白引物对上面的带做PCR扩增。RT-PCR产物在1％琼脂糖TBE凝胶上走过用溴乙锭染色(图12A)。用RT-PCR发现2G7mRNA在1J和所有其它对照小鼠中表达。但完全不见于2J小鼠。30轮扩增后未见任何信号。该实验直接证明2G7对应OB基因的一个外显子。
由于2J突变相对来说发现较晚并被认为是同类系株，该结果第一次提供证据说2G7是OB基因的一个外显子。该突变可能位于启动子区故导致mRNA全部不合成。该RT-PCR实验中1J小鼠的信号存在预示1J可能携带点突变，但并不造成RNA样品大小的大变化。另外，用RT-PCR检测另外4个2J动物也没有2G7mRNA.
该结果由Northern印迹证实(图12B)。从每一株(C57B 1/6J 1J，CKC/smj和2J)制备脂肪细胞RNA。各10μg RNA专胶单做印迹。印迹用2G7探针做探针杂交，该探针是用32P-dCTP对图11中的材料即带做PCR扩增而PCR标记的。肌蛋白作所载的RNA量的对照。在所有样品中肌动蛋白信号相当相似。OB信号在脑中不存在因为mRNA对脂肪细胞有特异性。
Northern分析的结果证实2G7特异性RNA在2J小鼠中不存在。obRNA在CKC/smj ob/ob小鼠中不存在是因为该肥胖突变型株中该基因被破坏(disrupt)不产生RNA。另外，在1J和db/db脂肪中2G7RNA的水平增加约10-20倍。这些结果与下面的假说不矛盾，即OB或是编码循环激素或是与脂肪细胞产生一种调控体重的信号有关。这些结果支持2G7即OB基因这一结论并预示1J小鼠有一个点突变，可能是无义突变，导致翻译过早终止。
用来自4个不同2J动物的脂肪细胞RNA制备物重复了这些Northern结果(图13)。该检验中，ap2是脂肪特异性转录物，用做对照，几乎与图12B的肌肉蛋白作用相同。ap2带密度变化并无任何深义。利用报道的ap2序列设计PCR引物来标记ap2。用PCR标记的同样方法对脂肪细胞RNA的RT-PCR产物再标记。这种分析表明正常纯合或杂合动物中存在OBmRNA，2J突变体动物中不存在OB mRNA.
在1J小鼠中鉴定了突变。该突变是C变成T的氨基酸10s的精氨酸变成早熟终止密码子，这很可能解释了为什么1J突变中ob mRNA表达水平很高(图14)(见图12和13，C57BL/6J ob/ob道)。
最近用Southern印迹得出结论2J突变是由于OB5′端的可检测的DNA变化向使RNA完全不表达。这种可能重排的真正性质尚待确定。
用四种不同的限制性内核酸酶对来自CKC/smj(SM/CKc-+Dac)和C57BL/6J小鼠的DNA作基因组Southern印迹。以确定突变型ob是否产生专一的片段模式(pattern)(图15A)。约10μg DNA(来自从肝、胃或脾制备的基因组DNA)用所述限制性酶消化。DNA然后在1％琼脂糖TBE凝胶上电泳。DNA转移到Imobilion膜上与PCR标记的2G7探针杂交。关键带是最上面的CKC/Smj ob/ob/SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J)DNABilII消化物的带。该带比其它株的分子量要高，预示该株有突变。
图15B是ob2J/+杂交后代基因组DNA的BglII消化物的Southern印迹。有些DNA仅有上带，有些仅有下带，有些两带均有。仅有上带的动物异常肥胖(allo-obese)即ob2J/ob2J。这些数据显示图15A给出的多形性(即突变)按遗传意义分离。
        实施例1  cDNA克隆与OB序列确定
用标记的2G7 PCR探针，从小鼠脂肪细胞λgt 11 cDNA文库(Cbnetech 5′-STRETCH cDNA来自瑞士小鼠的睾丸脂肪垫，#WL 30056)分离到共50个小鼠cDNA克隆。从人类脂肪细胞λgt ID cDNA文库(Clonetech 5′-STRETCH cDNA腹部，#HL1108a)分离到30个杂交人类cDNA克隆。用噬菌斑lift方法进行文库筛选。噬菌斑lift的滤膜用高温灭菌锅法变性。滤膜副本与PCR标记的2G7探针(Rapid Hybe缓冲液，65℃过夜)杂交。预杂交2-4小时后，滤膜65℃用2×SSC，2％ SDS冲洗2次，30分钟，然后在X射线胶片下曝光。副本阳性的用噬菌斑纯化。噬菌斑纯化的噬菌体用购置的载体引物，例如λgt10和λgt11PCR扩增。得到的PCR产物对应于每种噬菌体的cDNA插入序列，两端各有少量载体序列。带用凝胶纯化，用AB1自动测序仪和载体引物测序后探测DNA聚合酶。
粗的测序数据用手工逐个碱基地检查，校正计算机程序的的小错误。一得到正确的序列，就合成下游引物用来继续测序。重复这种实验直到每个现有的cDNA克隆均已测序并合成到一个结构区(contig)中。到现在已整理出mRNA5′端的～300个残基对。一个cDNA克隆延伸到mRNA的5′端，因为该序列与脂肪组织RNA的5′RACE产物完全相同(数据未给出)。
序列数据显出有一个167个氨基酸的开放阅读框架(图1)。存在一个Ko2aK翻译起始一致序列且ATG上游三个残基处有腺苷残基。按含有还是不含单个谷酰胺密码子分出两类cDNA。该残基位置紧靠2G7外显子拼接受体的3′端。由于谷酰胺的CAG密码子含有一个可能的AG拼接受体序列，看起来在一亚类cDNA中拼接受体位点滑动造成三个碱基对的缺失，如下所示。
      gln  ser  val
  ag  CAG  TCG  GAT(带谷酰胺)(SEQ ID NO：17)
      ↑
     (拼接受体位点)
        gln  ser  val
    ag  CAG  TCG  GTA    (不带谷酰胺)
           ↑
          (拼接受体位点)
上面序列的ag对应于谷酰胺密码子上游假定的内含子序列，而AG是假定的备选拼接位点。该谷酰胺残基位于分子的高度保守区，它对生物活性有何重要性尚不清楚。
检测了假定的N末端信号序列，其信号切割序列预计在氨基酸21位丙氨酸残基的羧基端。该假定的信号序列应用根据von Heijne方的计算机算法证实了。用该技术、最可能的信号序列经鉴定在对应于氨基酸1-23的多肽编码区，其序列为：
MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA↑VP(SEQ ID NO：10)其中箭头指出假定的信号序列切割位点。氨基酸序列的其余部分主要亲水，除N末端信号序列外没有什么值得注意的超二级基元(motif)或膜跨越结构域。特别的。我们没有找到N联糖基化作用的一致序列或在预计含有的蛋白质中预示蛋白切割的双碱性氨基酸序列Sabatini等人，遗传病的代谢基础，177-223页，C.V.Scriver等人编。McGeaw-Hill纽约)。用Blast和Block程序搜索数据库并未鉴定出任何同源序列。
用Northern印迹分析人类脂肪组织RNA，检测到与小鼠ob基因大小相似的RNA种。对cDNA克隆测序并分析发现人类OB还编码167氨基酸的多肽(图2A和B和图3)。带有或不带有3个碱基对缺失的两类cDNA在人类中也找到了(图6)。小鼠和人类OB基因在预计的编码区中高度同源，但在现有的3′和5′非翻译区仅有30％同源性。人类OB多肽中也有N末端信号序列。比较人类和小鼠OB多肽序列可以看出两个分子在氨基酸水平共有83％相同(图4)。两个物种的成熟蛋白N末端同源性更高，在N末端100个氨基酸残基中仅有6个保守的和3个非保守的氨基酸替换。
从小鼠，大鼠，兔，田鼠，猫，牛，绵羊，猪，人，鸡，鳗鱼和果蝇中分离基因组DNA，用EcoRI限制性消化。消化物在1％琼脂糖TBE凝胶上电泳，DNA然后转移到immobilon膜上用PCR标记的2G7探针探测。滤膜在65℃杂交。用2×SSCO.2％ SDS 65℃冲洗再次，每次20分钟。即换两次缓冲液。这些数据显示OB在脊椎动物中是保守的(图16)。注意鳗鱼DNA有2+信号；鳗鱼是一种鱼。
总之，现有证据显示体重与肥胖是受生理控制的。7年前开始尝试鉴定该系统的两个主要成分，OB与OB基因。本实施例表明，0B基因现在鉴定为脂肪特异性基因。在调节体重中起重要作用。该基因的产物，很可能是分泌的激素在诊断与治疗人和非人类动物的营养失调时有重要应用。
              实施例2：OB在细菌中表达
鼠类和人类编码ob的cDNA被克隆到pET-156表达载体(Novagen)中。该载体含有T7启动子和la操纵基因，表达的融合蛋白含有组氨酸尾标(His标志)，并在编码序列插入位点紧接的上游有凝血酶切割位点(图17)(SEQ ID NO：11和12)。
小鼠和人类cDNA经修饰，信号序列末端的丙氨酸变成NdeI位点，与3′区-独立的序列相同。用新的引物作PCR可插入NdeT位点：Mnde-5′(鼠类5′引物)CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC(SEQ ID NO：13)Mnde-3′(鼠类3′引物)TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC(SEQ ID NO：14)Mnde-5′(鼠类5′引物)TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC(SEQ ID NO：15)Mnde-3′(鼠类3′引物)TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA(SEQ ID NO：16)引物在中间含有6个碱基对的错配，在PCR片段的两端NdeI了限制位点。携带小鼠或人类cDNA的噬菌体用这些引物PCR扩增。PCR产物用NdeI消化在1％低熔点琼脂糖凝胶上纯化。凝胶纯化带亚克隆到pET载体中。得到的载体要测序保证在克隆的PCR扩增一步没有引入突变。制备了编码和缺失谷酰胺49的人类和鼠类cDNA结构。特别地，用PCR克隆方法后，pET15b结构含有人类或小鼠OB编码序列，除去信号序列并与His-标志融合。该结构经测序以保证在PCR扩增一步OB基因编码区未引入序列错误。
得到的两个质粒结构，pETM9和pETH14，选来转化细菌表达宿主。在最佳状态下用1mM IPTG诱导，转化细菌能生产100-300μg/ml的OB融合物。OB融合蛋白的主体在包涵体中。用8M盐酸胍或脲溶解后，融合蛋白通过His-结合(N1-螯合)树脂柱纯化。OB融合蛋白的柱纯化条件(包括结合，冲洗和洗脱)由实验确定。OB民蛋白在5mM咪唑/6M盐酸胍时结合树脂，高达20mM咪唑/6M盐酸胍时仍结合。蛋白可用60mM咪唑/6M盐酸胍从树脂上洗脱(图18A，B)。纯化的人类和小鼠OB融合蛋白进一步在PBS中透析从制备物中除去盐酸胍，然后用来制造多克隆抗体。
为了检查融合蛋白产物的生物活性，试验研究纯化蛋白的再折叠条件。这包括首先融合蛋白在1M胍溶液中透析，再用0.4M精氨酸溶液稀释。检验生物功能之前将His标志从融合蛋白上除去。用来自人胎盘的凝血酶处理融合蛋白可办到这一点。
另外，用PCR克隆方法将没有信号序列的人类和小鼠OB基因编码序列个个插入pET 12c载体中。这些结构可指导合成的OB融合蛋白进入细菌宿主细胞的胞外质空间。从胞外质空间回收的OB融合蛋白仅需简单的凝胶过滤即可从其它宿主细胞中纯化出来，并且在此过程中不会变性。
                实施例3  制备OB多肽的抗体
除了用重组蛋白产生多克隆抗体，用免疫原性作图(plo+)软件(GCG软件包)也鉴定了来自推导出的鼠类OB序列的一组4段肽序列。这4个羧基端肽片段是：(SEQ ID NO：18)Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQ ID NO：19)Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gin-Thr-Leu-Ala(SEQ ID NO：20)Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO：21)Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys这些肽与KLH偶合，用标准技术以11s肽-KLH偶合物免疫兔子。从兔子中回收对每种多肽特异性的多克隆抗血清。
               实施例4  OB多肽的体内转运
为了证实功能性信号序列的存在，包含整个开放阅读框架的人类cDNA亚克隆到pGEM载体中。该实验仅用人类cDNA是因为没有回收到合适的小鼠亚克隆。正链人类ob mDNA用Sp6聚合酶转录，与或还与猫胰微球体膜用于体外翻译反应。初级转录产物以～18KD的分子量迁移，这与从cDNA序列推断的一致。反应中加微球体膜使翻译总效率抑制约5倍。但是，有膜的制备物中约50-70％的OB初级翻译产物截短了约2KD，显示信号序列有功能(图19A)。白介素-1αRNA，不编码信号序列，当反应中含有微球体膜时，其初级翻译产物的大小不变。为了证实OB蛋白发生了转运，用蛋白酶-K处理体外翻译产物。蛋白酶处理使18KD初级翻译产物完全水解而16KD处理过的形式不受影响，显示后者转运到了微球体的囊腔内(图19B)。这些数据与OB是分泌分子的假说相符。
信号序列切割后，两个半胱氨酸残基留在推断的蛋白中，有可能该分子与其它分泌多肽一样特征地具有二硫键[Shen等人，科学.224：168-171(1984)]。
              实施例5：确定OB基因的性质
为了确定肥胖病与人类OB基因的遗传变化之间的关系，确定人类OB基因的序列(图20A至C)(SEQ ID NO：22至24)。用人类编码序列的特异性引物来筛选人类P1文库。得到3个不同的P1克隆。待其长大，用包围第一个和第二个编码外显子之间的切割位点的引物进行PCR扩增。整个内含子区，约2Kb，扩增后部分测序(见图20A；如SEQ ID NO：22和24所示)。
用PCR检验和其它标准技术确定了鼠类和人类基因的基因结构。发现小鼠OB基因含有3个外显子，其中第二个和第三个是编码序列。(图20D)。人类OB基因的编码区有相同结构。但人类基因缺少一个5′外显子和内含子(图20E)。
制备了两组来自人类基因的内含子序列的引物(图20A至C)。引物序列如下(F和R分别指向前和反向)。HOB 1gF 5′-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3′(SEQ ID NO：29)HOB 1gR 5′-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3′(SEQ ID NO：30)
HOB 2gF 5′-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3′(SEQ ID NO：31)
HOB 2gR 5′-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3′(SEQ ID NO：32)从多种来源得到DNA样本，然后用这些组引物扩增严重肥胖病人的人类基因组DNA。PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶上走胶。将带切下并用琼脂酶消化。用AB1 S73A DNA侧序列仪和Tag双脱氧终止子试剂盒(AB1，珀金-埃尔默)得到序列。到现在检测到一个病人样本的ob基因有一个点突变。该突变在第一个外显子上，不改变氨基酸序列。初步的数据显示另一个患者的第一个外显子中可能有插入序列。可以用测序酶代替Tag DNA聚合酶的另一种自动测序方法得到对检测突变可读性更强的序列。
               实施例6：OB在酵母中表达
OB克隆定位后，重要的是发现OB蛋白减少食物摄入量和体重的生理机制。朝这个方向迈出的第一步是用表达系统重组生产出有功能的蛋白。除了成功的细菌表达系统，也可选用酵母表达系统。酵母表达OB有几个吸引人的特点。最重要的是更可能生产有生物活性的真核蛋白。哺乳动物细胞分泌OB多肽。所有真核生物分泌蛋白都很相似，就是说酵母分泌器与哺乳动物分泌途径比与细菌分泌途径更相似。特别地，哺乳动物对OB的蛋白修饰可能也见于酵母分泌系统的表达。另外，蛋白折叠在通过分泌器时进行因而ob通过酵母分泌器运送更可能产生具有天然生物活性的正确折叠的蛋白。这对OB很重要，因为两个半胱氨酸残基可能形成二硫桥。与分泌途径不同，细胞质的还原环境阻止二硫桥的形成，因此为了体内形成二硫键OB通过分泌途径至关重要。其它的优点有操纵酵母时方便快捷，载体和菌株易得，酵母重组技术有丰富的经验。
选巴斯德毕赤氏酵母表达系统有四个原因，(1)它与其它酵母系统如酿酒酵母相比异源蛋白表达水平要高；(2)巴斯德毕赤氏酵母比酿酒酵母其蛋白糖基化与哺乳动物系统中更相似(尽管用计算机搜索并未检测到ob中有糖基化位点，但仍可能在未辨认出的位点有糖基化)。(3)巴斯德毕赤氏酵母天然情况下分泌很少的蛋白，因而纯化表达的外源蛋白时通常直接了当；和(4)载体和酵母菌株可购得(购自Invitrogen)。生成酵母表达载体的两种策略见图21和22。
选用的载体是pPIC9。该载体含有一个克隆位点，就在α-交配因子早前编码序列的下游，该序列指导被克隆进克隆位点的基因编码的蛋白通过分泌途径分泌出去。该载体的另一重要性质是有HIS4基因，当酵母被载体转化后用酵母营养缺陷株在缺组氨酸的培养基上生长可选择出载体是否被摄入。克隆策略如下：PCR扩增OB cDNA，所用的5′引物在其3′端所含序列与紧跟在推断的导肽切割位点后面的OB序列互补，其5′端所含序列与载体的α-交配因子序列的3′端互补。5′引物还含有XhoI位点，3′引物设计成其3′端序列与OB的最后几个氨基酸互补，其5′端含有EcoRI位点。PCR扩增之后，PCR产物用XhoI和EcoRI消化并克隆到同样消化的pPIC9中。将含有和不含49位密码子的谷酰胺的小鼠和人类OB cDNA克隆后，对所有4个结构分离出单个的克隆，测序来确证该结构以正确的方向和阅读框克隆，并且PCR扩增一步没有引入突变。鉴定这些克隆有正确的序列后，将其转化入P.pastons菌株GS11S，一种组氨酸营养缺陷型。
对两个小鼠OB结构，对转化的酵母克隆筛选蛋白表达。转化酵母含有OB的证据是，做了DNA点印迹(dot-blot)检验和菌落杂交检验，均显示转化酵母中有OB序列，未转化酵母中没有。并且，转化酵母往培养基中分泌16KDa的蛋白，而未转化酵母不分泌这样大小的蛋白(图23A)。推断的OB大小即16KDa。对两种小鼠构建体均已鉴定出单个克隆为OB的向效表达物。目的正在研制一种策略将ob纯化至同质。一种策略是在阳离子交换柱上纯化OB(图23B)，初步数据显示强阳离子交换剂可能有用。然而，阳离子交换层析后，假定的OB产物丢失了。这显示样品中有蛋白酶。
一种解决这个问题的策略是制备ob-His标志融合物用于酵母中表达(图22)。进一步的评价显示没有His标志的OB与Ni-螯合柱紧密联结。用Ni-螯合纯化OB多肽，再凝胶过滤，得到产物纯度足够做质谱分析。质谱证实了表达的蛋白的分子量与预计的分子量相同，强有力地证实了ob在毕赤氏酵母中成功表达。
然而，Ni-螯合/凝胶过滤纯化方法得到的OB纯度不够。还存在其它小分子。看起来Ni螯合柱空体积(void volume)中洗脱下了蛋白水解活性。相应地，计划用三步纯化过程：Ni-螯合。随后是阳离子交换(除去小分子污染物)再凝胶过滤。
用考马斯蓝给SDS-PAGE凝胶染色，估计表达水平，结果显示出当酵母在摇瓶中生长时约为10mg/l。在发酵罐中预计水平会上升，我们已准备进行发酵，希望得到更大量的蛋白质。对于人类OB结构，鉴定到含有高拷贝数OB基因的转化酵母克隆。它们预计会表达OB蛋白。研制出抗体后，将用抗体来证实确实鉴定到分泌的16KDa蛋白。
      实施例7：ob融合蛋白在细菌中的高水平表达制备冷冻贮备物(freezer stock)：
在灭菌过的无碳源M9ZB培养基的2个4ml等分中，各加入40μl贮备的右旋糖(0.4g/ml，滤器灭菌过)，10μl氨苄青霉素贮备物(200mg/ml)，和5μl氯霉素贮备物(34mg/ml，在乙醇中)。每个单个大肠杆菌菌落均含有克隆的Novagen pET-146载体中的小鼠和人类OB/DNA，用来接种。试管37℃温育过夜。
0.5ml过夜培养物用来接种于50ml含有右旋糖，氨苄青霉素和氯霉素的M9ZB培养基。这些在30℃温育并定期监测600nm处吸收(A600)。A600约1-12时，将175μl等分小份的培养基与25μl 60％甘油混合于2ml Eppendorf管中，用液氮快速冷冻，贮于-80℃。培养物生长：
含有0.5ml 40％右旋糖，125μl氨苄青霉素贮备物和50μl氯霉素贮备物的50ml M9ZB培养基用1ml冷冻贮备物接种，30℃温育。A600为1-1.2时，4个2L烧瓶每个用10ml该培养物接种，每个烧瓶中有含有右旋糖，氨苄青霉素和氯霉素的500ml M9ZB培养基。30℃温育直到A600为约1-1.2时加入终浓度为0.5mM的1PTG诱导。培养物温育过夜。离心4000rpm 20分钟收获细胞。该表达系统产出的重组OB多肽占总蛋白的百分比相当高，数量级为克/每升大肠杆菌。细胞裂解与内含体的重悬浮：
细胞浆重悬浮于最小体积的2mM HEPES，pH7.2 10％甘油，0.1MKCl，5mM MgCl2，1％ aprotinin，1mM pMSF 5mg/ml leupentin，和50μg/ml DNase I中。悬浮液用液氮和温水冷冻解冻三次。裂解的细胞离心18000rpm 30分钟，重悬浮于20mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl中。悬浮物经超声处理，加Triton×100至终浓度2％。再离心18000rpm 15分钟。两轮这样的操作之后，再进行三轮Triton自由冲洗(free wash)。最后片状沉淀物溶于6M盐酸胍，20mM HEPES，pH7.5，超声处理然后离心。上清用于进一步纯化。
OB蛋白在未折叠状态下用固定化金属离子亲和层析(1MAC)纯化。40ml Pharmcia螯合快速流动琼脂糖柱用5倍柱体积的50mM NiSO4装料再用6M盐酸胍，20mM HEPES，pH7.5平衡。溶液上柱。用6M盐酸胍，30mM咪唑，20mM HEPES，pH7.5洗柱。最后蛋白用含有0.2M咪唑的同一缓冲液洗脱。6M盐酸胍中的未折叠蛋白加乙酸钠(NaAc)至10mM后贮于4℃，用乙酸调pH至约4.5。再折叠及蛋白质的纯化；
含有100mg蛋白的6M盐酸胍用67μl 1M二硫苏糖醇(DTT)处设，然后用6M盐酸胍，10mM NaAc，pH4.5稀释至约67ml。室温搅拌约一小时。然后边搅拌边稀释入4L的20％甘油，2.5mM CaCl2，20mMTris，pH8.4中。适当混合后。溶液室温下放置约8小时，无需进一步搅拌。然后加入2000单位的纯化牛凝血酶(来自thrombostat，Parke-Davis产品)，轻轻搅拌溶液。约2.5小时后再加2000单位的凝血酶再切割组氨酸-标志3小时。加PMSF至终浓度0.1mM中止凝血酶切割。溶液过滤后置于4℃。
切割后的蛋白进一步如上用同一根1MAC柱纯化，柱子用1M KCl，20％甘油，20mM HEPES，pH8.4缓冲液平衡。蛋白质溶液加样后，用相同缓冲液洗再用1M KCl，20％甘油，40mM咪唑，20mM HEPESpH8.4将切割后的蛋白洗脱。未切割的蛋白被0.2M咪唑洗脱。
纯化的切割后蛋白浓缩后，用50-100mM EDTA，10mM铁氰化钾处理(将未完全的氧化进行到底)再用superdex 75 16/60柱凝胶过滤。该方法的产量接近起始蛋白的50％。
一旦纯化，表达的蛋白即可用几种方法测定性质。物理定性包括用动态光散射确定结构同质性并作为正确折叠的量度，光散射数据显示人类OB多肽主要或完全表达成单体，而小鼠OB多肽可是单体亦可是二聚体。
用Ellman氏试剂检验及质谱分析证实半胱氨酸残基在蛋白中形成二硫键。将这种氧化形式的多肽给药至小鼠，描述如下，该多肽显示有生物活性。
用圆二色粗略确定蛋白质的结构几何。生理缓冲液(pH约8，约生理离子强度)中的CD谱显示人类OB多肽含约60％α-螺旋结构和约40％无规卷曲结构。鼠类OB多肽用CD谱发现有约50％α-螺旋和50％无规卷曲。
用有限水解，随后做质谱(Cohen等人，1995，引文见上)来鉴定OB多肽上能被水解的部分。该分析显示氨基酸残基54至60有一柔性环结构(描绘见图4)。很可能该柔性环连接两个已确定的2°结构结构域，例如α-螺旋。
重要的是，如下面的实施例显示，可用下述方法检验纯化蛋白的生物活性：用渗透泵(例如AZLET渗透泵，Alza公司，PaloAlto，加洲)或每日腹膜内单次注射将蛋白给药至瘦的与肥胖的啮齿动物体内，至少两个星期，观察对进食行为和体重的影响。
             实施例8：OB多肽(瘠素)的体重减轻效应
小鼠OB座位的基因产物在调节体重时起重要作用。本实施例证实OB蛋白在小鼠、大鼠和人类血浆中循环。所有三个物种中循环形式对没有信号序列的推导出的多肽序列做SDS-PAGE得到分子量相同，显示在体内该蛋白切除信号序列后没有再被处理。OB蛋白不存在于C57/Bl6J ob/ob小鼠的血浆中，以相对于对照10倍高的浓度存在于db/db小鼠的血浆中，以相对于对照20倍高的浓度存在于fa/fa小鼠的血浆中。这显示这些肥胖动物突变体对OB的作用有抵抗力。在一组6个瘦人受试者中OB蛋白的血浆水平有7倍的差别。每日注射重组小鼠OB蛋白显著减轻ob/ob小鼠的身体质量，对野生型小鼠体重的影响明显，对db/db的小鼠无影响。这些数据显示OB座位的基因产物有内分泌功能，调节体重。
                   材料和方法
用重组蛋白同福氏试剂(HRP公司)免疫兔子。将抗血清通过偶联上重组蛋白的琼脂糖4B柱制备得免疫纯化的抗小鼠OB抗体，描述见[Harlow等人，抗体，实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988)]。小鼠血浆免疫沉淀如下：用未偶联的琼脂糖4B室温下振荡2小时将含有约25mM EDTA的各0.5ml的小鼠，大鼠和人血浆预澄清。离子(Spin)除去琼脂糖，加入50ml含有亲和纯化抗体的50％抗体偶联琼脂糖悬浮液，浓度为1mg/ml压缩琼脂糖。加入半ml 2×RIPA缓冲液，得到最终结合条件如下：50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠和0.025％叠氮化钠。4℃振荡反应过夜。用RIPA缓冲液将抗体偶联的琼脂糖洗8遍，然后用PBS漂洗3遍，在15％ SDS-PAGE上走胶，蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，与抗重组蛋白的生物素偶联免疫纯化的抗体作Western印迹。所用的二抗是HRP-链亲和素，用ECL作检测。
为了将小鼠血清中的OB定量，将递增量的再折叠重组小鼠OB蛋白(0.01，0.1，0.5，2.0，15.0ng)加入100λ的C57BL/GJ ob/ob血清中，4℃与蛋白A′琼脂糖偶联抗体温育3小时，用缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，100mM NaCl，1％Triton X-100；5mM EDTA，(mM PMSF)充分洗涤后，样品重悬浮于样品缓冲液中，装到15％SDS-PAGE上转移至硝酸纤维素膜上。用免疫纯化的生物素偶联抗氨基末端抗体作一抗，HRP-链亲和素作二抗进行Western印迹，然后是ECL检测。
用polytron和dounce匀浆在NPS缓冲液(10mM Tris，pH7.5，10mMNaCl，10mM ICCI，0.15mM精胺，0.5mM亚精胺，14mM β-巯基乙醇，0.5mM EGTA，2mM EDTA，0.5％NP-40)将脂肪组织匀浆制备细胞质提取物700g离心去除细胞核。
如上述作免疫沉淀只不过用的是免疫纯化的抗人类OB抗体。对于ELISA，将100ml的1mg/ml免疫纯化抗人类OB抗体溶液溶解到硼酸盐缓冲的PBS溶液中，加到微滴板(Carning货号#2595)4℃过夜。用含有0.05％ Tween20的硼酸盐溶液洗板4次去除多余的液体。已知量的再折叠人类OB蛋白或血浆样品100ml加入每个小孔，4℃温育过夜。清洗后，滴板加100ml生物素偶联的免疫纯化抗人类抗体(0.1mg/ml于明胶-硼酸盐缓冲溶液中)室温温育4小时。清洗后加辣根过氧化物酶(HRP)-链亲和素到滴定板上(O.1mg/ml于硼酸盐缓冲液，0.3％明胶)。用HRP底物溶液(ABTS.0.3mg/nl和H2O2，0.01％于柠檬酸中)来检测，414nm处测O.D将抗体结合定量化。
将小鼠和人类OB基因编码序列从含有OB cDNA序列的质粒中PCR扩增出来，亚克隆到pPIC.9质粒(Invitrogen)中。所用的人类5′引物是5′GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3′(SEQ ID NO：34)3′引物是5′GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3′(SEQ IDNO：35)对于小鼠，5′引物是5′GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3′(SEQ ID NO：36)3′引物是5′GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3′(SEQ ID NO：37)。小鼠和人类的5′引物在5′端含有XhoI位点并且含有载体pPIC9中α-交配因子信号序列最末四个氨基酸的编码序列。该载体指导异源表达的基因从细胞分泌到培养基中。5′RCR引物还包括OB基因开放阅读框架中信号序列切割位点之后氨基酸位置21的丙氨酸之前的前面19个核苷酸。3′引物在其5′端含有EcoRI位点，其后紧跟着与假设的OB终止密码子互补的序列。PCR条件如下：变性94℃ 1分钟，退火55℃ 1分钟，延伸72℃ 2.5分钟。用纸循环次数PCR(15轮)和校正阅读聚合酶PFU(Stratagene)来限制PCR产生的突变的个数。PCR产物用XhoI和EcoRI消化并克隆到同样消化的载体pFPIC.9里。所有的结构均对两条链测序保证没有任何PCR产生的突变。克隆用原生质球洗转化到巴斯德毕赤氏酵母(His-)中在组氨酸缺陷培养基上选择。对约200个小鼠和人类克隆用菌落杂交筛选高拷贝数的整合。对高拷贝数克隆然后检测OB表达，先用考马斯染色显示转化酵母的培养基中存在新的16KD蛋白质。用抗细菌表达的OB蛋白的抗体证实16KD带是OB。重组蛋白用下述两步纯化法纯化。进行质谱和溴化氰处理，描述见Beavis等人，美国国家科学院院刊，87：6873-6877(1990)。
小鼠和人类OB基因信号序列C末端的全部OB编码序列亚克隆到pET156表达载体(Novagen)中，在大肠杆菌[BL21(DE3)plYsS]中用T7RNA聚合酶系统[Studier等人，酶学方法(Meth.Enzymology)，185：80-89(1990)]。过度表达。30℃细胞生长到595nM吸收为0.7，用0.5mM异丙基-β-D-硫化半乳糖-吡喃诱导过夜，用低速离心收集。用三轮冷冻解冻实现裂解，用Dnase I进行DNA消化。用超声处理和去污溶解进行膜提取、最终的包涵体片状沉淀溶于6M盐酸胍，20mMHEPES，pH8.4。在变性条件下用Ni-离子亲和柱和递增量的咪唑冲洗以1MAC纯化重组OB蛋白。纯化的变性OB蛋白然后贮存于6M盐酸胍，10mM乙酸钠(NaAc)pH5中用1mM DTT室温下还原1小时。将还原的蛋白稀释入20％甘油，5mM CaCl2，5mM NaAc.pH5中，搅拌并于室温温育8-12小时完成变性。变性后添加Tris至10mM将pH调至84，用凝血酶切割去除六组氨酸-尾标。切割过并变性的蛋白质用1MAC再纯化并将产物从凝血酶和末切割的融合蛋白中分离出来。切割过并复性的蛋白质用40mM咪唑从Ni-离子亲和柱洗脱，而凝血酶留不住，未切割的融合蛋白用0.2mM咪唑洗脱。然后浓缩样品，用100mMEDTA和10mM铁氰化钾处理，用Pharmacia Superdex 75 16/60柱凝胶过滤进一步纯化。
进行Ellman氏检验，描述见Ellman，生物化学与生物物理档案(Arch.Biochem.Bivphys)82：70-77(1959)。将39.6mg 5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶于10ml 0.05M磷酸，pH8.0，制得Ellman氏试剂。412nm下游离巯基(用1mM还原DTT贮液)浓度范围10-120mM作标定曲线，每次检验用0.02ml Ellman氏试剂，共0.5ml反应混合物。对游离巯基测得消光系数是12974M-1cm-1(相关系数0.99987)，与以前的报道值13600M-1cm-1相差小于5％。
对50ml的2mg/ml纯凝胶过滤的蛋白质进行Ellman氏检验，它对应于终反应混合物中可能的游离巯基浓度约为24mM。得到的溶液A412约0.02，显示蛋白中的两个半胱氨酸残基为氧化态形成胱氨酸或其游离巯基完全包埋在折叠蛋白的外面接触不到的核心中。对6M盐酸胍中的未折叠蛋白作相同的检验得到的结果。
小鼠单独关在无致病源的环境中逐步适应下列食谱。35％(W/W)实验啮齿类食谱5001(PMP饲料公司)5.9％(W/W)，木薯淀粉布丁混合物(通用食品)和59.1％水，在能量含量(Energe content)为130Kcal/gm。食物用高压蒸锅消毒，包装到60mm塑料小碟中，小蝶固定于100ml培养皿上部。木薯淀粉使食物呈浆糊状，动物很难弄得笼子中到处都是食物。100mm塞能回收动物溅出的食物。每天早晨往笼中放一碟新鲜食物，将前一天的小碟取走，称重。测重量差即可测量每日食物消耗。重组蛋白对食物摄入量的影响和体重测量工作是在从Jackson实验室购得的三株小鼠：C57Bl/6J ob/ob，C57Bl/Ks db/db和CBA/J+/+上进行的。每株30个小鼠分成10个一组。每株的一组每日接受再折叠细菌ob蛋白的腹腔内(i.p.)注射，剂量是5mg/g/天300μl PBS。第二组接受同等体积PBS的腹腔内注射。这些对照小鼠接受的是重组蛋白PBS要透析物的注射。PBS用Acticlean ETOX柱消除了内毒素。第三组动物不接受注射。每日记录食物摄入量规律性以3.5周为间隔测量体重。在配对喂食实验中另外一组ob小鼠的食物摄入量在每日基础上与接受蛋白的ob小鼠消耗量相同。
                   结果OB蛋白在小鼠，大鼠和人类血浆中循环利用pET156细菌表达载体(Novagen)并克隆至巴斯德毕赤氏酵母一种将重组蛋白直接分泌到培养基中的酵母表达系统中，制备重组小鼠和人类OB蛋白。在酵母中表达的ob蛋白含有信号序列羧基端146个氨基酸。用细菌蛋白(HPR公司)免疫兔子。抗体经免疫纯化(研究遗传学并用同血浆和脂肪组织的蛋白做免疫沉淀和Western印迹。
小鼠血浆的OB蛋白SDS-PAGE以16KD表现分子量迁移。电泳迁移率与酵母分泌的除去信号序列的重组OB蛋白相同(图24A)。在105密码了有无义突变的C57BL/6J ob/ob小鼠的血浆中未检测到该蛋白。用几种不同的抗血清也未能鉴定到cDNA序列推断的截短105残基多肽链。
db/db小鼠与对照小鼠相比，观察到循环蛋白水平升高10倍(图24A)。野生型和fa/fa大鼠的血浆做免疫沉淀，显示突变型大鼠与野生型相比OB蛋白水平增加20倍(图20B)。db突变造成与ob小鼠中见到的相同的肥胖表型(Bahary等人，1990，引文见上)。肥胖(fatty)小鼠肥胖是因为与db同源的基因上有隐性突变(Truett等人，1991，引文见上)。为了将小鼠血浆中OB水平定量，在血清中加入递增量的重组蛋白作免疫沉淀(图24C)。Western印迹上见到随着重组蛋白量增加信号强度线性增加。将小鼠血浆中天然蛋白的信号强度与标准比较，显示野生型小鼠中OB蛋白循环水平约20ng/ml。这些数据表明免疫沉淀和Western印迹在抗体过多条件下进行。db/db小鼠脂肪组织的蛋白提取物与对照相比也可看出OB蛋白水平增加(图24D)。如对分泌蛋白材料，脂肪组织的蛋白为粗膜(crude menobrane)部分分级分离(数据未给出)。
取自6个身体质量系数(BMI)小于25(BMI＝体重/身高2)的瘦人受试者的血浆样本用抗人类蛋白的抗体自免疫沉淀。免疫沉淀的材料以与酵母中表达的146氨基酸人类蛋白相同的电泳迁移率迁移。6个样本中信号强度相差很大。(图25A)自显影密度测量显示个体HP1和HP6水平相差约5倍，其它受试者水平居中。用免疫纯化抗体和再折叠的细菌蛋白作标准(见下)研制出一种酶联免疫检验(ELISA)。得到的标准曲线由图25B给出。利用该检验得知，6个人类血浆样本中CB蛋白的血浆水平在2-15ng/ml之间变化(图25C)。HP血浆中OB蛋白水平在免疫检验的线性范围外，≥15ng/ml。这些定量差别与Western印迹中所见相同。
初步数据显示瘠素可能至少部分与另一蛋白质或多个蛋白质形成复合物循环。该结论基于血清滴定曲线相对于重组标准的异质性(heterogeneity)。在兔抗OB柱上变性与非变性条件下凝胶过滤HPLC免疫纯化大量瘠素，用ELISA和SDS-PAGE监测进行分析，显示OB多肽行为类似高分子量复合物。然而，这些仅为初步数据，OB结合蛋白，如果有的话，性质尚待进一步研究。
                   OB蛋白的结构特征
由于OB蛋白有两个半胱氨酸残基，在体内氧化环境下可形成分子间或分子内二硫链。在样本缓冲液中添加或不添加还原试剂重复Western印迹。两种条件下，人类血清中的OB蛋白以单体形式迁移(数据未给出)。非还原条件下，在与16KD单体和约32KD二聚体相应的位置检测到db小鼠血清的免疫沉淀到的蛋白(图20A)。还原条件下分子量较高的部分消失，提示小鼠db的一部分通过形成分子间二硫键以高分子量形式循环。小鼠OB的约80％以约16KD蛋白形式循环，20％以约32KD形式循环。
当小鼠和人类蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达时也见到同样的分子形式[Alrams等人，免疫学综述(Immunol Rev.)，5-24(1992)]。这些研究中，对应于146氨基酸的成熟OB蛋白的DNA序列克隆到pPIC.9载体(Invitrogen)中酵母α-交配因子信号序列下游。从表达小鼠和人类蛋白的株的酵母培养基中纯化OB蛋白，在还原和非还原条件下电泳(图26A)。非还原条件下，小鼠蛋白主要以二聚体形式在酵母中表达，当还原剂存在时，仅以单体形式表达。两种情况下，重组人类蛋白质均迁移到单体的位置(数据未给出)。
在毕赤氏酵母中表达的纯化人类蛋白用质谱1990确定其分子量为16,024±3Da(Beavis，1990，引文见上)。该值与含有单个分子间二硫桥的蛋白的氨基酸序列的计算值(16.024Da)相符。用基质辅助激光去吸收质谱分析蛋白质的溴化氰切割产物，显示半胱氨酸117和167通过一个分子内二硫链相连(图26B)。溴化氰在蛋氨酸残基羧基端切割。
              生物活性蛋白的制备与定性
小鼠OB蛋白从pET156质粒在大肠杆菌中以不溶性融合蛋白形式表达，其20个残基的N末端六组氨酸尾标含有一个凝血酶切割位点。细菌包涵体用盐酸胍溶解，在变性环境下用固定化金属离子亲和层析(1MAC)纯化(图27)。纯化的变性融合蛋白经还原、稀释，在室温下水溶液中再折裂。凝血酶切割后，含有4个附加的N末端残基(Gly-Ser-His-Net；(SEQ ID NO：38)的复性小鼠OB蛋白用1MAC再纯化，直到用SDS-PAGE和质谱制定已＞98％同质。基质辅助激光去吸收质谱给出分量测量值16,414±3Da(推测值＝16,415Da)。还原性和非还原性SDS-PAGE凝胶显示出表观分子量16KD的单一分子。(数据未给出)。
用Dp801分子大小检测仪(蛋白质解决方案公司)做动态光散射，显示复性的小鼠OB蛋白大多是单体。有些高阶聚集物。蛋白用EDTA处理并化学氧化。然后用凝胶过滤去除高分子量物质。进一步用动态光散射证实纯化的复性重组小鼠OB蛋白是单一分散相。用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)透析后，用Acticlean ETOX柱(Sterogene生物分离公司)去除细菌内毒素。蛋白质终产量是45mg/l。
对纯化的复性重组小鼠OB蛋白作Ellman氏检验来确定其氧化态(Ellman，1959，引文见上)。复性蛋白和6M盐酸胍去折叠的蛋白均显示游离巯基含量小于0.5％，这表明单体产物含有一个分子内二硫键。对再折叠细菌蛋白的溴化氰切割产物作质谱证实了这一点(数据未给出)。OB蛋白的生物活性
纯化的复性重组小鼠OB蛋白每日腹膜内单次注射5mg/kg日给药至10个C57Bl/6J ob(年龄16周)，C57Bl/Ks db/db(年龄12周)和CBA/J+/+(年龄8周)小鼠的各组中。同样数量的动物每日接受PBS注射。用于对照注射的PBS来自蛋白平衡后的透析物。三个小鼠株的另外10个动物不接受注射。每日监测每个动物的食物摄入量，以3或4日间隔记录动物体重。9组小鼠每一组食物摄入量和体重的累积结果由图28A至F给出，数据的统计意义由表1给出。接受蛋白注射的C57Bl/6J ob/ob小鼠的食物摄入量在第一次注射后显著降低，并持续降低至第五天，稳定到与接受PBS注射的动物摄入量的约40％相等的水平上(p＜0.001)。假注射OB小鼠在三周研究期间体重不减。接受蛋白的C57Bl/6J db/db小鼠5天后失去约10％体重(p＜0.001)。这些小鼠在三周处理中体重继续减轻，直到其体重减至初始体重的平均60％(p＜0.001)。另一组ob小鼠与接受蛋白的ob小鼠成对饲养。图29B的数据显示成对饲养的小鼠比接受重组蛋白的动物体重减轻要少得多(p＜0.02)。接受蛋白或媒介物(vehicle)的两只小鼠的照片显示了蛋白质处理造成的外观巨大差别(图29B)。为了进一步确证蛋白质的效果，对每组的两个小鼠做尸体解剖。粗检接受蛋白的ob小鼠即看出体内脂肪和肝大小减少很多。db和野生型小鼠肝重在处理过程中不变。接受PBS注射的ob小鼠肝重5.04和5.02克，而接受重组蛋白的动物肝重2.23和2.03克。与ob小鼠特征的浅色肥肝相对照，接受蛋白的ob小鼠肝具正常有肝特有的颜色(图29C)。肝组织切片显示未处理的动物有肥肝，而蛋白处理的动物中情况大为改善(数据未给出)。
与ob小鼠不同，接受蛋白的C57BL/Ks db/db小鼠相对接受媒介物的对照组体重与食物摄入量并无显著差别(图28A至F，表1)。所有3组db/db小鼠在处理过程中减重2-5克。用血糖计测量db小鼠平均血糖。在所有小鼠均≥500mg/dl显示这些小鼠得了肥胖症后带来的糖尿病，对db小鼠的注射两周后结束。
野生型小鼠中，用重组蛋白给药后体重减轻小组明显(图28A至F，表1)。蛋白注射5周后，受处理的小鼠平均减重0.5克而对照小鼠增重0.4克(P＞0.02)。在随后的两个时间点接受蛋白的动物体重比每日接受PBS注射的小鼠明显要轻。体重变化在后来的时间点变得不明显。在体重减轻的动物中，食物摄入量与对照动物并无显著不同。注射PBS对ob，ab和野生型小鼠的食物摄入量和体重与未接受注射的小鼠相比有小而明显的影响(P＜0.05)。
                              表1
动物组别   处理组别   体重变化日      n    平均值          标准差         p
 ob/ob   蛋白媒介物 1-5     10  -6.38000000    0.47628190     ＜0.0019   -0.14444444    0.24444444
  蛋白媒介物 1-12    10  -14.45000000   0.70793126    ＜0.0019    0.98888889    0.38058597
  蛋白媒介物 1-27    6   -24.28333333   0.69924563    ＜0.00015    4.30000000    0.79874902
 db/db   蛋白媒介物 1-5     10  -1.47000000    0.36939891      0.24010  -2.00000000    0.23142073
  蛋白媒介物 1-12    10  -3.75000000    0.77348418      0.61010  -4.19000000    0.34655447
 CBA/J   蛋白媒介物 1-5     10  -0.48000000    0.17876117      0.00610   0.38000000    0.21489015
  蛋白媒介物 1-12    10  -0.12000000    0.45748103      0.01510   1.20000000    0.18378732
  蛋白媒介物 1-27    5    1.98000000    0.48723711    ＜0.6516    2.23333333    0.20763215
                           讨论
Coleman首先提示OB座位的蛋白产物有内分泌功能，他显示ob/ob小鼠与正常或db小鼠联体生活(parabiotic union)时体重减轻(Coleman等人，1978，引文见上)。上述结果显示OB蛋白在血液中循环，注射重组蛋白降低体重。从而支持了这个假说。OB基因编码的基因产物分子量约16KD，与信号序列羧基端146个氨基酸的序列分子量相等。重组OB蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达时不受修饰。哺乳动物基因在毕赤氏酵母中表达通常能形成正确的蛋白结构[Cregg等人，生物/工程Bio/Technology)11905-914(1993)]。这些发现提示OB蛋白没有糖基化，在体内无翻译后加工。这些数据并不能排除OB蛋白在血浆或脂肪组织中与自身或其它蛋白非共价连接的可能性。尽管不能排除蛋白的水解切割，但在任何所用的含有4种抗肽抗体的抗血清中均没有检测到OB蛋白的小分子量形式。
OB蛋白有两个半胱氨酸残基，在人体内以单体形式循环，在小鼠体内以单体和二聚体形式循环。当人类蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达时发现有分泌分子特有的分子内二硫键，提示该键在体内存在。含有分子内二硫键的重组细菌蛋白的生物活性也支持这一点。小鼠血浆中OB蛋白以单体和二聚体形式存在。小鼠OB蛋白在酵母中表达时见到单体和二聚体，显示小鼠蛋白形成二聚体的倾向来源于其一级序列与人类的差别。已清楚单体有生物活性，但尚不知二聚体的功能活性。
OB蛋白对ob小鼠的食物摄入量和体重的影响十分显著。处理三周后，每日接受重组蛋白注射的ob小鼠失去体重的40％而且比对照动物多消耗40％的食物。而且实验停止时受处理的小鼠体重仍未平衡。成对饲养实验结果显示体重减轻是由于OB多肽对食物摄入量和能量消耗的影响。因而，另外一组ob小鼠其热量摄入量限制跟接受蛋白的ob小鼠一样，它们体重减少就比接受蛋白的动物小得多。在OB蛋白一天之内，ob/ob小鼠食物摄入量就减少到比野生型小鼠减少的还要低的水平，说明ob/ob小鼠对OB蛋白影响特别敏感。受处理的Ob小鼠食物摄入量处理5天后变得相对恒定。如果这是由于蛋白达到了稳态水平，则提示该蛋白半衰期相对较大(药物的药学基础，19-45页，Goodman和Gilman编，Pergamon出版社，纽约(1990)]。该结论与联体生活实验的数据一致[Coleman等人，1978，引文见上；Weigle，国际肥胖症杂志(Int.J.Dbpsity)，12：567-578(1988)]。
在研究的前两个星期中，重组蛋白对野生型小鼠体重的影响小而明显。虽然接受蛋白与PBS的野生型小鼠体重差别在后来的时间点上也存在，但三周后这些数据的统计重要性大大降低。起先的体重减轻不能由食物摄入量的不同来解释。推测是食物摄入量的测量不够精确，不足以检测出处理过程中造成体重一克之差的食物摄入量的减少。这些观察结果与前述实验结果不同，那些实验中，野生型啮齿类动物与db小鼠，fa大鼠，下丘脑损伤的大鼠和因高热量食谱而肥胖的大鼠联体生活[Coleman.等人，1978，引文见上；Harris等人，1987，引文见上；Harris等人，“肥胖大鼠的联体生活伙伴的生理与代谢变化”激素，生热与肥胖症，Lardy和Straatmar编，Elsecler科学出版公司，纽约，(1989)；Hervey，生理学杂志(J.Physiol.)，145：336-352(1959)]。每种情况下，野生型动物厌食并失去大量体重。由于db小鼠和fa大鼠中OB蛋白水平升高，下丘脑损伤的小鼠中OB RNA水平升高，很可能当OB在血浆中以足够高水平循环时野生型小鼠会对OB作出响应。这些报道的发现与下述可能性相符，即给药的蛋白水平低于内源水平。造成在稍低的体重处达到平衡。将受处理的小鼠OB蛋白循环水平定量可解决这个问题。虽然尚没有做小鼠蛋白的免疫检验，免疫沉淀已提示在接受蛋白的野生型小鼠中循环OB蛋白的水平并未明显上升。
该蛋白对野生型小鼠作用不大以及db小鼠没有反应说明该处理方法不是没有针对性，也不是有不良影响。在处理期间，所有的db小鼠，不管它是否接受了ob蛋白，都减少少量体重。db动物血糖很高，体重减轻可能是由于糖尿病而非由于实验方法。C57BL/Ks db/db小鼠达到本研究所用动物的年龄时通常患糖尿病并开始减少少量体重(Coleman等人，1978，引文见上)。年龄相似的C57Bl/16J ob/ob小鼠不患明显高血糖。这些表型差别认为是由于携带突变的株(C57Bl6J和C57Bl/Ks)秩遗传差别(Coleman等人，1978，引文见上)。
在C57Bl/6J ob/ob小鼠中未能检测到根据OB基因cDNA序列推导出的截短的105个氨基酸的蛋白质，提示突变型蛋白质被降解或不被翻译。但是不能排除所用的抗血清检测不出该截短蛋白的可能性。观察到db小鼠比野生型ob蛋白水平上升10倍，提示当对其效果有抵抗时ob蛋白过量产生。这些数据与OB mRNA的研究相符。提到的上述实验显示小鼠db基因和大鼠fa基因突变定位于同源染色体区，造成一种抑制体重增加的血浆因子过度生产(Truett等人，1991，引文见上)；Coleman 1987，引文见上，Hervey，  1959，引文见上)。两种情况均提示突变动物对OB蛋白的效果有抵抗作用。当OB蛋白给药至db小鼠时对体重和食物摄入量没有影响。这一观察结果证实了上述可能性。
人类肥胖症可能与相对对OB蛋白不敏感的个体血浆中该激素水平升高有关。另一方面，OB表达减少也可能导致肥胖症，这是可发现该蛋白水平“正常”(即不适当地低)。因此人类血浆中OB蛋白水平可用作不同类型肥胖症的标志物。在一小组BNI＜25的瘦受试者中，用ELISA检测到低纳克水平的循环OB蛋白。特别明显的是观察到了各种不同浓度，这表明表达水平和/或对该蛋白的敏感性在决定体重时可能起一定作用。
OB蛋白的作用位点尚不知道。该蛋白既影响食物摄入量又影响能量消耗，该发现与两种系统的改变均可调节体重的临床研究一致[Leibel等人，新英格兰医学杂志，332：621-628(1995)，Keesey等人，“体重调定点的代谢防御”，神经与精神疾病研究协，87-96页，Stunkard和Stellar编，Raven出版社，纽约(1984)]。下丘脑在体重控制途径中OB的下游，尽管有可能对许多器官有直接作用。
        实施例9  在下丘脑损伤与db座位有突变
        的小鼠中脂肪细胞中OB RNA表达上升
最近克隆到的小鼠肥胖症基因(OB)的基因产物在调节脂肪组织质量中起重要作用。在体内包括褐色脂肪的几种不同脂肪细胞贮存处每一处的小鼠脂肪细胞均特异性表达OB RNA。在已诱导分化的培养的373-442前脂肪细胞中也表达。下丘脑损伤的小鼠以及db座位突变的小鼠脂肪组织中OB RNA表达水平高20倍。这些数据提示db基因和下丘脑在调节脂肪组织质量的途径中位于OB基因的下游，这与前述显示db座位编码OB受体的实验相一致。在db/db和有损伤的小鼠中，OB RNA表达水平的定量差别与脂肪细胞的脂含量相关。在脂肪细胞中调节OB基因表达水平的分子可能在决定体重中起重要作用。正如在OB作用位点介导效应的OB分子一样。
                材料与方法原位杂交
取自野生型(wt)和db小鼠相同腹部区域的白脂肪组织根据Richardson等人，生长，发育与衰老，56：149-157(1992)描述的修饰方法同时处理。组织在Bouin氏浴液4℃简短定型2小时。然后用从10％到100％的递增浓度的乙醇系列处理脱水，每次4℃ 5分钟。进一步65℃用二甲苯(1小时)和石蜡(2小时)温育组织。包埋的wt和db/db脂肪组织切片，以后在相同条件下装片。切片65℃烘烤1小时用二甲苯和从100％到50％的乙醇系列稀释，每次室温3分钟。将SpbDNA聚合酶启动子上游线性化的OB基因编码序列体外转录，合成OB基因的反义RNA探针。严格按照Schaeren-Wiemers等人，组织化学(Histochemistry)100：431-440(1993)的描述进行原位杂交。
              RNA制备和细胞培养
如描述制备总RNA和Northern印迹。根据Rodbell的方法制备基质肌肉细胞和脂肪细胞，两部分的RNA制备依据Dari等人，分子细胞内分泌学，63：199-208(1989)；Rodbell生物化学杂志，239：375-380(19)。再克隆以后，3T3-F442细胞生长于Dulbecco氏修饰Eagle培养基，含10％胎牛血清(定义为标准培养基)[Davi等人“脂肪细胞分化研究中的分子生物学技术，欧洲肥胖症，88卷，371-376页，Bjorntorp和Rossner编，John Libbey有限公司，伦敦，英国(1989)]。汇合后，细胞用加了2nM三碘甲腺原氨酸(T3)和17nM胰岛素的标准培养基处理。12天后如上述制备RNA。
                硫化葡糖金(GTG)处理
12月大雌性CBA/J小鼠腹膜内单次注射硫化葡糖金(Sigma货号AO6321)剂量是0.2mg/g，正常盐水。对照动物用正常盐水注射。处理后一月给小鼠称重。从GTG处理后体重增加超过20克的动物中分离脂肪组织RNA。
                 结果
最近发现OB基因在脂肪组织中表达[Zhang等人，自然，372：425-432(1994)]。由于脂肪组织由许多细胞类型组合物，包括脂肪细胞，前脂肪细胞，成纤维细胞和肌肉细胞，用有义和反义OB核探针对正常动物附睾脂肪垫的切片作原位杂交[Richardson等人，1992，引文见上；Wasserman，“脂肪器官的概念”，Rodahl，Issekutz，脂肪作为一种组织，22-92页，McGraw-Hill，纽约(1964)]。用反义探针，在所有切片的脂肪细胞中均检测到阳性信号(图30，标记为wt)。反义探针与脑切片杂交时未观察到信号(数据未给出)。反义探针与C57Bl/Ksdb/db小鼠的脂肪组织切片大大增加，证实了OB RNA的脂肪细胞特异性表达，并表明这些动物中每个脂肪细胞中OB RNA水平有很大增加(图30标记为db/db)。db座位突变的小鼠特别肥胖是一种综合症的一部分，该综合症与C57Bl/6J db/db小鼠的表型完全相同[Bahary等人，1990，引文见上]。
与脂肪细胞分离的脂肪组织基质细胞不合成OB RNA。如所期望那样，脂肪细胞部分的细胞用Northern印迹看表达OB RNA(图31)。用RT-PCR得到相同结果(数据未给出)。这些数据支持仅有脂肪细胞表达OB基因的结论。培养的脂肪细胞的数据证实这一结论。这些研究中，所用的373-F442A细胞培养条件会造成脂肪积累，这是导致分化脂肪细胞的细胞程序的一部分。OB RNA在指数生长细胞中不表达，在表达早期标记物的3T3-F442A前脂肪细胞汇合中也不表达，但这些细胞分化成脂肪细胞会造成OB RNA的可检测水平的表达(图31)[Darvi等人，生物化学杂志，264：10119-10125(1989)]。OB RNA水平对培养条件极其敏感，在不接触胰岛素的晚期后汇合细胞中观察不到信号。
杂交研究表明OB RNA在体内几种不同的脂肪贮存处表达，包括附睾，子宫旁，腹部，肾旁和腹股沟脂肪垫(图32A)。每个贮存处的精确表达水平不同，腹股沟和子宫旁脂肪OB RNA表达水平较低。OB RNA也在褐色脂肪组织表达，虽然表达水平比其它脂肪组织贮存处的要低50倍。这些定量差别与前面报道的不同脂肪细胞贮存处细胞大小不同不很紧密地相关[Johnson等人，脂类研究杂志(J.Lipid.Res)，13：2-11(1972)]。褐色脂肪中OB RNA的量遇冷不受影响(图32B)。在该实验中，褐色脂肪遇冷后非偶合蛋白RNA(VCP)水平升高而ob RNA水平不变[Jacobsson等人，生物化学杂志，260：16250-16254(1985)]。总和起来，这些数据证实所有的脂肪细胞都能生产OB RNA，不同脂肪贮存处表达水平不同。这些数据支持这样一种可能：编码的蛋白的水平与整个脂肪组织的质量是相关。
测量了db/db小鼠与下丘脑损伤小鼠中OB RNA水平。腹中部下丘脑(VMH)损伤导致的肥胖症是一种综合症的一部分，该综合症与ob/ob与db/db小鼠中见到的相同[Bray等人，新陈代谢(Metabolism)，24：99-117(1975)]。联体生活实验提示这种损伤会导致一种抑制食物摄入量和体重的血液携带因子的过度表达(Hervey，1959，引文见上)。当db座位突变的小鼠与正常小鼠联体生活时也观察到相似结果，提示OB受体可能被db座位编码(Coleman等人，1978，引文见上)。因此，VMH损伤和db突变造成的肥胖症可能是对OB蛋白效果的抵抗作用的结果。如果是这样，推测脂肪组织中OB RNA水平会伴生增加(sewndarymcreare)。
用化学品硫化葡糖金(GTG)会在雌性CBA小鼠中诱导出下丘脑损伤(Debons等人，Fed.Proc.36：143-147(1977)]。该处理导致特异性下丘脑损伤，特别是在腹中部下丘脑(VMH)，几周内即表现肥胖症。通常单次腹腔内注射0.2mg/gm体重的GTG导致四周内表现肥胖症。一月大雌性CBA/J小鼠(20-25克)用GTG处理，受处理动物与对照动物的随后的体重增加已给出(表2)。从db/db小鼠和体重增加＞20gm的GTG处理的动物中制备脂肪组织RNA。Northern印迹显示二月大db/db和GTG处理的小鼠比正常动物OB RNA水平上升20倍(图33)。
       表2.硫化葡糖金处理的小鼠的体重增加
              对照(n＝41)          GTG(n＝93)
＜10g          41，(100％)          4，(4％)
10g-20g        0，(0％)             15，(16％)
＞20g          0，(0％)             74，(80％)
用硫化葡糖金(GTG)处理二月大雌性OBA/J小鼠。硫化葡糖金(Sigma，A0632)在正常盐溶液中以2.0mg/g的剂量腹腔内给药。注射前和注射一月后记录对照和注射过的动物的体重。每5个动物装入一笼，自由(ad libitfum)取食。注射后一月体重增加量由表2给出。注射后一月体重增加大于20g的动物选来做进一步研究。
                       讨论
小鼠OB基因产物在小鼠和人类血浆中循环，可能调节脂肪组织质量。关于OB表达和作用机制的调节的进一步研究将会对我们了解调节体重的生理途径有重要意义。
本实施例显示在所有脂肪组织贮存处仅有脂肪细胞表达OB基因产物。该结果与OB基因的蛋白质产物与体内脂贮藏相关这一假设相符。而且在db小鼠和下丘脑损伤小鼠中OB RNA上调20倍。这些动物中，每个细胞OB RNA水平实际增长可能高于20倍，因为这些动物中脂肪细胞增大约5倍(见图30)(Debons等人，1977，引文见上)。这些数据将db基因和下丘脑定位于体节控制途径中OB的下游，并且与OB受体由db座位编码这一假说相等[Coleman等人，糖尿病学，14：141-148(1978)]。OB受体和/或db基因的分子克隆将解决这个问题。在db/db和GTP处理的小鼠中OB RNA水平升高也提示在脂肪细胞中OB基因产物有非细胞自主性功能[Ashwell等人，伦敦皇家学会进展(Proc.R.Aoc.Lond.)，195：343-353(1977)；Ashwell等人，糖尿病学，15：465-470]。因此，如果编码的蛋白直接作用于脂肪细胞来抑制生长或分化，GTG处理的小鼠中野生型OB基因的过度表达将会导致瘦的表型。
对这些数据的最小心谨慎的解释是OB蛋白起内分泌信号分子作用，由脂肪细胞分泌，直接或间接作用于下丘脑。直接作用于下丘脑需要存在一种机制，使OB基因产物能透过血脑屏障。涉及环脑器官和/或特定连载体的机制将允许OB基因编码分子大小的分子进入脑[Johnson等人，FASEB J.7：678-686(1983)；Baura等人，临床调查杂志，92：1824-1830(1993)；Pardridge内分泌综述，7：314-330(1986]。然而在鉴定了该蛋白透过血脑屏障的途径之前必须谨慎对待该假说。而且需要评价对其它靶器官的可能影响。
造成OB基因表达水平量的变化脂肪细胞信号尚不清楚，但它与脂肪细胞大小差别相关。db/db小鼠的脂肪细胞比正常小鼠的大5倍，细胞大小约为10μg脂类/细胞(Johnsun等人，1972，引文见上)。以前的证据显示脂肪细胞脂含量和/或大小是决定体重的重要参数[Faust等人，美国生理学杂志(Am.J.Physiol)，235：279-286(1978)；Faust等人，科学，197： 393-396(1977)]。可能每个脂肪细胞都表达低水平的OB RNA并跟细胞大小成比例进一步增加表达。也可能细胞大小并不是感觉到的(sensed)参数，而仅仅是表在db/db和VMH损伤的小鼠的脂肪细胞中造成OB基因表达增加的细胞内信号相关。无论哪种情况，调节OB RNA合成的信号传导途径的成分都可能对决定体重很重要。降低OB表达水平的遗传和环境影响将增加体重，降低对编码的蛋白的敏感性的影响也会增加体重。调节OB基因表达水平的特定分子还未找到，还需要确定导致OB RNA水平量的变化的基因调控水平以及检查OB基因的调节元件。鉴定脂肪细胞中调节OB基因表达的分子和那些在编码的蛋白质的作用位点介导其效应的分子，将会极大增进我们对调节体重的生理和机制的了解。
        实施例10  RNA表达模式及在7号染色体的
            物理，细胞遗传和遗传图谱上的定位
OB多肽在人类脂肪组织高水平表达，在胎盘和心中表达水平相当低。人类OB基因定位到来自染色体7q 31.3的大酵母人2染色体(YAC)结构区。除了证实基于鼠-人比较定位的基因相对位置，本研究还鉴定了与人类OB基因物理上相当近的8个已建立的微型卫星标记物。由于小鼠OB突变能导致与人类病态肥胖相似的综合症，这些遗传标记可作为重要工具，研究OB基因在人类遗传性肥胖症中的可能作用。
                    材料与方法Northern印迹分析
用Chirgwin等人，生化杂志(Biochem)，18：5294-5299(1979)的方法从脂肪组织制备总RNA。如所述(Zhang等人，1994引文见上)进行Northern印迹，放射性标记和杂交。PolyA+RNA(人类MTN，人类MTNII和人类胚胎MTNII的Northern印迹和用来产生放射性标记的人类肌动蛋白探针的PCR引物均从CLONETECH(PaloAlto，加州)得到。
                   研制STS
基本上如所述[Green等人，PCR方法应用，1991，Green等人，基因组学，11：548-564(1991)；Green“人类染色体的物理定位；生成染色体特异性序列-尾标位点”，分子遗传学方法卷1，基因和染色体分析(A部分)，192-210页，Adolph编，学术出版社公司，圣迭戈(1993)；Green等人，人类分子遗传学(Hum.Mol.Genetr)，3：489-501(1994)]研制序列尾标-位点(STS)-特异性PCR检验并最优化。每个STS命名用前缀‘SWSS’后面接一个专一的数字。此处报导的19个STS的详细资料见表3，另外的资料(如PCR反应条件，总DNA序列)见GenBank和/或基因组数据库(GDB)。对于微型卫星特异性STS，PCR检验用的寡聚核苷酸引物(表3)对应于基因型分析所用的引物(表4)，或对应于用GenBank(基因银行)提供的DNA序列设计的引物(最经常地用计算机程序OSP)[Hillier等人，PCR方法应用，1：124-128(1991)]。表3描述了含有人类OB基因的YAC结构区(contig)中的STS。
                                表3
                                                                                         SEQ
                                                                                大小     IDSTS名称          别名            座位      来源                  PCR引物            (bp)     NO：  GDB ID No.sWSS1734                        D7S2185   YAC末端          CAAGACAAATGAGATAAGG       72      39    G00-455-235
                                                       AGAGTTACAGCTTTACAG                40sWSS494                         D7S2016   λ克隆           CTAAACACCTTTCCATTCC       112     41    G00-334-404
                                                       TTATATTCACTTTTCCCCTCTC            42sWSS883         UT528           D7S1498   遗传标记         TGCAGTAAGCTGTGATTGAG      490     43    G00-455-262
                                                       GTGCAGCTTTAATTGTGAGC              44sWSS2359        AFMa065zg9      D7S1873   遗传标记         AGTGTTGTGTTTCTCCTG        142     45    G00-455-247
                                                       AAAGGGGATGTGATAAGTG               46sWSS2336        AFMa125wh1      D7S1874   遗传标记         GGTGTTACGTTTAGTTAC        112     47    G00-455-244
                                                       GGAATAATGAGAGAAGATTG              48sWSS128         AFM309yf1       D7S680    遗传标记         GCTCAACTGACAGAAAAC        154     49    G00-307-733
                                                       GACTATGTAAAAGAAATGCC              50sWSS1402                        D7S1916   YAC末端          AAAGGGCTTCTAATCTAC        137     51    G00-344-044
                                                       CCTTCCAACTTCTTTGAC                52sWSS999                         D7S1674   YAC插入序列      TAAACCCCCTTTCTGTTC        105     53    G00-334-839
                                                       TTGCATAATAGTCACACCC               54sWSS1751                        D7S2186   YAC末端          CCAAAATCAGAATTGTCAGAAG    186     55    G00-455-238
                                                       AAACCGAAGTTCAGATACAG              56sWSS1174        AFM218xf10      D7S514    遗传标记         AATATCTGACATTGGCAC        144     57    G00-307-700
                                                       TTAGACCTGAGAAAAGAG                58sWSS2061                        D7S2184   YAC末端          GTTGCACAATACAAAATCC       200     59    G00-455-241
                                                       CTTCCATTAGTGTCTTATAG              60
                      表3续
                                                                                         SEQ
                                                                                大小     IDSTS名称          别名            座位      来源                  PCR引物            (bp)     NO：  GDB ID No.sWSS2588                       D7S2187    YAC末端          ATCACTACACACCTAATC        117     61    G00-455-253
                                                       CCATTCTACATTTCCACC                62sWSS808        Pax-4           PAX4       基因             GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA  153     63    G00-455-259
                                                       TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC           64sWSS1392       AFM206xc1       D7S635     遗传标记         CTCAGGTATGTCTTTATC        75      65    G00-307-815
                                                       TGTCTCTGCATTCTTTTC                66sWSS1148       AFM199xh12      D7S504     遗传标记         GACACATACAAACACAAG        60      67    G00-307-652
                                                       ATTGAGTTGAGTGTAGTAG               68sWSS1529                       D7S1943    YAC末端          CAGGGATTTCTAATTGTC        116     69    G00-334-119
                                                       AAAAGATGGAGGCTTTTG                70sWSS2619       OB              OB         基因             CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG     106     71    G00-455-256
                                                       TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA              72sWSS404                        D7S1956    λ克隆           ACCAGGGTCAATACAAAG        122     73    G00-334-251
                                                       TAATGTGTCCTTCTTGCC                74sWSS2367       AFMa345wc9      D7S1875    遗传标记         CAATCCTGGCTTCATTTG        81      75    G00-455-250
                                                       AAGGTGGGTAGGATGCTA                76列出的是定位到含人类OB基因的YAC结构(图35)的19个染色体下特异性STS。每种情况下都给出指定的“sWSS”名称，相关别名，GDB分派的座位名，STS来源，PCR引物序列，STS大小和GDB鉴别号。STS的来源如下： YAC末端’(分离到的YAC插入序列末端)(Green，1993，引文见上)，‘Lambda克隆’(随机染色体7-特异性Lambda克隆)(Green等人，1991，引文见上；Green等人，1993，引文见上)“遗传标记”(微型卫星标记物，见表2)(Green等人，1994，引文见上)，“YAC插入序列’(YAC插入序列的随机片段)，和‘基因’(基因特异性STS)。注意对某些遗传标记特异性STS，用于鉴定YAC(表中列出)的引物与用于基因型分析的引物(表4)不同，因为检测含有遗传标记的YAC并不需要扩增多形性片段本身。所有给出的PCR检验退火温度均为55℃，除了sWSS494，sWSS883，sWSS1529，sWSS2619(用50℃)，sWSS999和sWSS1174(用60℃)，和sWSS808(用65℃)。关于STS特异性PCR检验的其它详细资料由GDB提供。
                     表4含有人类ob基因的YAC结构区中的微型卫星标记物
                                                                SEQ
                                                                ID标记物名称       类型            座位              引物             NO：    GDB ID  No.UT528           Tetra.          D7S1498    TGCAGTAAGCTGTGATTGAG     77      G00-312-446
                                       GTGCAGCTTTAATTGTGAGC     78AFMa065zg9      (CA)n          D7S1873    AGCTTCAAGACTTTNAGCCT     79      G00-437-253
                                       GGTCAGCAGCACTGTGATT      80AFMa125wh1      (CA)n          D7S1874    TCACCTTGAGATTCCATCC      81      G00-437-263
                                       AACACCGTGGTCTTATCAAA     82AFM309yf10      (CA)n          D7S680     CATCCAAGTTGGCAGTTTTT     83      G00-200-283
                                       AGATGCTGAATTCCCAGACA     84AFM218x110      (CA)n          D7S514     TGGGCAACACAGCAAA         85      G00-188-404
                                       TGCAGTTAGTGCCAATGTCA     86AFM206xc1       (CA)n          D7S635     CCAGGCCATGTGGAAC         87      G00-199-240
                                       AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT     88AFM199xh12      (CA)n          D7S504     TCTGATTGCTGGCTGC         89      G00-188-280
                                       GCGCGTGTGTATGTGAG        90AFMa345wc9      (CA)n          D7S1875    AGCTCTTGGCAAACTCACAT     91      G00-437-259
                                       GCCTAAGGGAATGAGACACA     92列出的是定位到含有人类OB基因的YAC结构(图35上的8个微型卫星标记。每种情况均给出标记名称(图3中以别名给出)，微型卫星超二级结构(motif)的类型(四核苷酸-‘四’重复或(CA)n重复)，GDB分派的座位名，用于基于PCR的基因型分析的引物序列和GDB鉴别号。关于PCR检验和多形性的其它详细资料由GDB提供。
用得自cDNA 3′不翻译区的DNA序列设计人类OB特异性STS(sWSS2619)。用下述策略研制出人类Pax4特异性STS(sWSS808)。对小鼠Pax4基因特异性的寡聚核苷酸引物(GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA)(SEQ ID NO：63)和(GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG)(SEQ ID NO：93)[Watther等人，1991，基因组学，11：424-434(1991)]用来扩增人类基因组DNA的204bp片段(该产物与从小鼠基因组DNA生产的大小相同)。该PCR检验不适于鉴定相应的YAC，因为从酵母DNA能扩增出另一个大小相似(200bp)的产物。然而，从人类DNA产生的PCR产物作DNA序列分析，显示在156个分析的残基中有20个位置有替换(数据没有给出)。用这个人类特异性序列设计了一个新的引物(TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC)(SEQ ID NO：64)跟上述小鼠Pax4特异性引物的第一个一起用(见表3)。得到的人类Pax4特异性PCR检验不从酵母DNA中扩增出明显的产物，因而用来鉴定相应的YAC。
           用基于PCR的筛选鉴定YAC
图35描绘的大多数YAC得自用基于PCR的筛选策略[Green等人，1995，引文见上，Greena等人，美国国家科学院院刊，87：1213-1217(1990)]对人类7号染色体DNA高度富集的克隆的集合(‘ 7号染色体YAC源’)(Green等人，1995，引文见上)。一些情况下，用基于PCR的筛选(Greena等人，1990，引文见上)可得到的在CEPH[Dausset等人，白令研究所通报(Behring Inst.Mitt.)91：13-20(1992)，Albertson等人，美国国家科学院院刊，87：4256-4260(1990)]或ICI(Ancond等人，核酸研究，17：3425-3433(1989)；Anand等人，核酸研究18：1951-1956(1990)]构建的全人类基因组YAC文库分离到克隆。每个YAC的命名用前缀‘yWSS’后跟一个专一的数字。
                结果与讨论
用Northern印迹分析检查人类OB基因的组织表达，显示OB RNA在人类脂肪组织中高水平表达但在胎盘和心中表达水平很低(图34)。RNA大小(约45kb)在人类和小鼠的每一种表达组织中均相等。在这些研究中，10μg全脂肪组织RNA比2μg polyA+胎盘RNA中见到高5倍的信号，在心的polyA+RNA比胎盘的polyA+RNA中见到低5倍的信号。据估计OB RNA水平在胎盘中比在脂肪组织中约低250倍。该实验中在任何其它分析过的组织中均未检测到OB RNA，包括脑，肺，肝，骨骼肌，肾和胰。另外的实验在脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠，外周血白细胞或胎儿脑，肝或肾中也未发现OB RNA(数据未给出)。很可能在后面这些组织或其它未研究的组织中OB以检测不到的水平表达(用Northern印迹分析)。在人类观察到的表达模式与小鼠有些不同，后者OB RNA几乎只在脂肪组织里表达。
       OB基因区在小鼠和人类基因组中的比较定位
小鼠OB基因定位于6号染色体近端与人类7q染色体一部分同源的区域上。该段内的基因(从近端到远端)包括：Met原癌基因，囊性纤维变性跨膜传导调节子(Cftr)成对含盒(box)基因4(Pax4)，OB和羧肽酶A(Cpa)(Zhang等人，1994，引文见上；Friedman等人，1991，引文见上)。在小鼠中，遗传定位用来显示Pax4与ob紧密连锁[Watther等人，1991，引文见上；Zhang等人，1994，引文见上]。OB和Pax4之间距离约为一千碱基对(Mb)(Zhang等人，1994，引文见上)。基于这些比较定位研究，预计人类OB基团定位于7q染色体上Pax4和CPA之间。另外，由于人类CFTR[Herg等人，细胞遗传学(Cell Geneti)，62：108-109(1993)]和Pax4[Tamura等人，细胞遗传学(Cytogenet.Cell Gent.)66：132-134(1994)]用荧光原位杂交(FISH)分别定位于7q31.3和7q32，人类OB基因最可能的细胞遗传位置在靠近7q31.3-q32边界的地方。
         将OB基因定位到人类7号染色体上
一个扩增人类OB基因3′不翻译区的一小段STS(sWSS2619)用来筛选一个对人类7号染色体DNA高度富集的YAC克隆集合(Green等人，1995a，基因组学，25：170-183)，鉴定到9个YAC(yWSS691，yWSS1332，yWSS1998，yWSS2087，yWSS3319，yWSS3512，yWSS4875，yWSS4970和yWSS5004。为确证这些YAC含有真正的人类OB基因，又做了两个实验。首先，每个YAC用第二种人类OB特异性PCR检验检查一遍，所有的都呈阳性(数据未给出)。第二，每个克隆的酵母DNA用EcoRI消化后用凝胶转移杂交拿人类OB cDNA来源的探针分析。所有情况下均见到单个杂交带；该带在所有YAC中与一个已知含有人类OB基因的P1克隆中大小相同(数据未给出)。
用计算机程序SEGMAP(Green和Green，1991，引文见上)和我们对7号染色体做出的其它基于YAC的STS含量数据(Green等人，1991，引文见上；Green等人，1994，引文见上；Green等人，1995，引文见上)，发现人类OB基因位于图35所描绘的YAC结构中。特别地，该结构含有43个交互重叠的YAC和19个专一性排序的STS。19个STS每一个详情由表3提供。除了OB特异性STS，该结构还包含1个人类Pax4基因特异性的STS(sWSS808)(Tamura等人，1994，引文见上；Stapleton等人，1993，自然遗传学(Nature Genet3：292-298)，7个来自7号染色体特异性YAC的STS，2个来自7号染色体特异性Lambcla克隆的STS和重要的，8个微型卫星特异性STS。这8个遗传标记的其它详情，包括用于基因型分析的引物的序列，由表2提供。注意，整个结构中过冗余的基于YAC的连接(即有2个或多个YAC连接相邻的一对STS)，充分支持图35给出的STS相对顺序。
如图35描绘的，含人类OB的YAC结构推断的取向是sWSS1734是最近着丝粒的STS(即离CATR最近)而sWSS2367是最近端粒的STS(即离CPA最近)。该取向主要基于比较定位数据，将Pax4定位于小鼠和人类DNA中存在的syntenic block的近端，ob定位于远端(Zhang等人，1994，引文见上)。OB基因定位于近结构的端粒端，这基于OB特异性STS(sWSS2619)的放置。
虽然图35绘出的结构是由SEGMAP不试图YAC大小推导出来的(因而显示STS彼此等距)，用SEGMAP试图到YAC大小对数据作相似的分析显示被该结构覆盖的区域全长刚过2Mb(数据未给出)。因此，虽然所有8个微型卫星特异性STS(表4)全包含在跨越约2Mb的基因组间隔内，与该结构端粒端最近的3个(sWSS1392，sWSS1148，和sWSS2367)与OB基因本身特别近(可能在小到约500Kb的间隔内)。实际上，所有3个STS均处于至少1个含人类OB的YAC上。注意，人类Pax4(sWSS808)和ob(sWSS2619)的间隔据估计约400Kb，而该区域推测在小鼠中跨约1Mb(Zhang等人，1994，引文见上)。最后，在结构中的YAC的其中3个(yWSS691，yWSS999，和yWSS2935)也用FISH分析，发现每一个都只跟7q31.3杂交。这些YAC之一(yWSS691)含有OB特异性STS，而另两个克隆含有Pax4特异性STS。后一结论一般来说与前面人类Pax4细胞遗传分派定位于7q32一致(Tamura等人，1994，引文见上)。基于这些数据人类OB基因分派定位(assizn)到细胞遗传带7q31.3上。
        实施例11  人类OB多肽在小鼠中有生物活性
10个ob/ob小鼠的组用10μg/g天重组(细菌)人类和小鼠OB多肽或盐水腹腔内注射处理。十天后，接受盐水的组增重3.0g。接受鼠类OB的组减重3.2g。接受人类OB的组减重2g(与盐水对照比p＜0.01)。也检查这些组的食物摄入量。食物摄入量的数据由表5给出；体重的数据由表6给出。
                                    表5
             受处理的ob/ob小鼠每日食物摄入量(g)(数值±标准偏差)
  处理   第0天   第1天   第2天   第3天     第4天     第5天     第6天   第7天
  盐水   13.4±2.6   12.8   12.8   13.1     14.0     12.3     12.4   8.3
鼠类OB   14.9   3.7   4.4   5.1     8.9     8.1     8.7   3.5
人类OB   14.3   10.3   8.7   7.0     8.9     5.3     3.8   13.0
                                表6
       受处理的ob/ob小鼠中体重和体重变化(值±标准偏差)
  处理     体重(第0天)    体重(第4天)    变化百分比(第0天到第4天)     体重(第4天)     变化百分比(第0天到第6天)
  盐水  39.9±1.8  40.7±1.6     0.8±0.5   41.1±2.2     1.2±1.1
鼠类OB  39.5±2.1  36.2±2.0     -3.3±1.2   36.3±2.2     -3.1±1.2
人类OB  39.5±2.0  37.6±1.7     -2.0±1.0   36.1±1.3     -3.5±1.3
这些数据显示人类OB在小鼠中有生物活性。
         实施例12：高剂量OB影响野生型小鼠
野生型小鼠(C57Bl/6J+/？)10μg/g/天腹腔内注射重组鼠类OB处理每4天称一次体重。结果由表7给出。
                         表7
              正常小鼠接受OB后体重质量(g)
  处理   第0天   第4天   第8天    第12天    第16天
  盐水   22.6±1.4   22.2±1.2   22.5±1.3     23     22.5
鼠类OB   22.4±1.5   20.6±1.5   20.8±1.3     20.8     21.8
这些数据OB不但影响肥胖(ob/ob)小鼠也影响野生型的体重，尽管程度小得多。
         实施例13  通过持续泵输液给药OB多肽
该实施例显示持续输液OB多肽导致正常小鼠体重减轻。正常(非肥胖)小鼠通过渗透泵输液给药鼠类ob多肽。剂量为0.5mg蛋白/kg体重/天在输液第6天造成从体重基线减少462％(+/-1.34％)。
                   材料与方法动物
本实施例用野生型(+/+)C57B16小鼠。小鼠单独关养，保持环境舒适。起始时刻鼠龄8周，体重稳定。每组(cohort)用10只小鼠(媒介物对蛋白质。)
                     饲养与称重
给小鼠磨碎的啮齿类食物(PMI饲料公司)，盛于粉末状食物喂食器(Allentoun笼养与设备)，这比用通常的块状食物能更能敏感而更准确地测量食物摄入量，每天相同时间(下午2：00)称重，共6天。输液前一天体重定义为基线体重。
                鼠类OB DNA的克隆
如下克隆鼠类OB DNA用于大肠杆菌的表达。从(Zhang等人，1994，引文见上，即实施例1，引文见上)报道的肽序列推导的DNA序列用大肠杆菌最优密码子逆转录。末端克隆位点是XbaI到BamHI。在编码区之前包括了一个核糖体结合增强子和一个强核糖体结合位点。用标准技术合成双螺旋DNA序列。重组蛋白表达并且正确的OBDNA序列存在于质粒中可证明克隆正确。氨基酸序列(和DNA序列)如下：
重组鼠类met OB(双链)DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：94和95)。
  TCTAGATTTGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT
9 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  68
  AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA
                                          M  V  P  I  Q  K  V   -
  TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA69 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  128
  AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT
   Q  D  D  T  K  T  L  I  K  T  I  V  T  R  I  N  D  I  S  H   -
  CACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA129 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  188
  GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT
   T  Q  S  V  S  A  K  Q  R  V  T  G  L  D  F  I  P  G  L  H   -
  CCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC189 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  248
  GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG
   P  I  L  S  L  S  K  M  D  Q  T  L  A  V  Y  Q  Q  V  L  T   -
  CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT249 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  308
  GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA
   S  L  P  S  Q  N  V  L  Q  I  A  N  D  L  E  N  L  R  D  L   -
  GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA309 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  368
  CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT
   L  H  L  L  A  F  S  K  S  C  S  L  P  Q  T  S  G  L  Q  K   -
  ACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT369 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  428
  TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA
   P  E  S  L  D  G  V  L  E  A  S  L  Y  S  T  E  V  V  A  L   -
  GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG429 -+---------+---------+---------+---------+---------+--------  488
  CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC
   S  R  L  Q  G  S  L  Q  D  I  L  Q  Q  L  D  V  S  P  E  C   -
  TTAATGGATCC489 -+---------
  AATTACCTAGG
                表达载体和宿主株
用来生产蛋白的质粒表达载体是pCFM1656，美国模式培养物贮藏中心(ATCC)登记号69576。上述DNA连接到用XbaI和BamHI线性化的表达载体PCFM1656中，并转化到大肠杆菌宿主株FM5中。大肠杆菌FM5细胞是在Amgen公司，千橡树(Thousand Oaks)，加州，从大肠杆菌K-12菌株得到的[Bachmann等人，细菌学综述(Bacteriol Rev.)，40：116-167(1976)]。并含有整合的λ噬菌体抑制基因CI 857[Sussman等人，C.R.Acad.Sci.254：1517-1579(1962)]。用标准方法进行载体生产，细胞转化和菌落筛选，例如Sambrook等人，1989，引文见上。宿主细胞生长于LB培养基。
            用蛋白或媒介物(vehicle)给药
重组鼠类OB多肽用于本实验，通常浓度约0.9mg/ml磷酸盐缓冲溶液，pH7.4。所用的氨基酸序列(和DNA序列)刚在上面给出。蛋白或媒介物(磷酸盐缓冲溶液，pH7.4)用渗透泵输液给药。Azlet渗透微型泵(Azla Palo Atto加州，型号1007D)手术植入每个小鼠肩板下区域的皮下囊里(packet)。泵调到给药每小时0.5ml溶液中蛋白，剂量0.5mg蛋白/kg体重/日。对照动物用Azlet渗透微型泵输液磷酸盐缓冲盐溶液(pH7.4)。发酵流程  用一种称为补料-批料(feed-batch)流程的三步发酵方法制备该蛋白。培养基组份如下，批料  氮源和磷源在发酵罐(Biolafitte，12升容积)内灭菌(温度升到122℃ 35分钟，18-20磅)。冷却后加入灭菌的碳源、镁源、维生素和微量金属元素。500ml生产上述重组鼠类蛋白的细菌(在LB肉汤里生长)的过夜培养物(16小时或更长)加入发酵器中。补料I OD600升到4.0-6.0时加补料I到培养物中。以限定(limiting)速率加葡萄糖以控制生长速率(μ)。自动系统(称为分发控制系统)编程至控制生长速率为0.15代每小时。补料II OD达到30，温度缓慢升至42℃，补料换成补料II，描述如下。继续发酵10小时，每2小时取一个样。10小时后，发酵器内容物降温至20℃下，离心收集。培养基组合物：批料：      10g/L      酵母提取物
          5.25g/L    (NH4)2SO4
          3.5g/L      K2HPO4
          4.0g/L      KH2PO4
          5.0g/L      葡萄糖
          1.0g/L      MgSO4·7H2O
          2.0ml/L     维生素溶液
          2.0ml/L     微量金属元素溶液
          1.0ml/L     P2000消沫剂补料I：     50g/L       细菌培养用胰蛋白胨
          50g/L       酵母提取物
          450g/L      葡萄糖
          8.75g/L     MgSO4·7H2O
          10ml/L      维生素溶液
          10ml/L      微量金属元素溶液补料II：    200g/L      细菌培养用胰蛋白胨
          100g/L      酵母提取物
          110g/L      葡萄糖维生素(批料，补料I)：0.5g生物素，0.4g叶酸和4.2核黄素溶于450ml H2O和3ml 10N NaOH，添水至500ml。14g盐酸吡哆醇和61g烟酸溶于150ml H2O和50ml 10N NaOH，加水至250ml。54g泛酸溶于200ml H2O，加水至250ml。混合三种溶液，加水至总体积10升。
微量金属元素溶液(分批，饲料I)
氯化铁(FeCl3·6H2O)：    27g/L
氯化锌(ZnCl2·4H2O)：    2g/L
氯化钴(CoCl2·6H2O)：    2g/L
钼酸钠(NaMoO4·2H2O)：   2g/L
氯化钙(CaCl2·2H2O)：    1g/L
硫酸铜(CuSO4·5H2O)：    1.9g/L
硼酸(H3BO3)：            0.5g/L
氯化锰(MnCl2.4H2O)：     1.6g/L
二水柠檬酸钠：              73.5g/L
              鼠类OB多肽的纯化流程
用下述步骤完成纯化(除非有其它说明，下述步骤在4℃进行)：
1.细胞浆。大肠杆菌细胞浆悬浮于5倍体积的7mM EDTA，pH7.0中。两次通过微孔过滤器将EDTA中的细胞进一步破碎。破碎的细胞在Beckman JB-6离心机用J5-4.2转头42kpm离心1小时。
2.包涵体洗涤#1。除去上清液，将片状沉淀再悬浮于5倍体积的7mM EDTA，pH7.0中，匀浆。仿步骤1离心混合物。
3.包涵体洗涤#2。除去上清液，将片状沉淀再悬浮于10倍体积的20mM Tris pH8.5，10mm DTT和1％脱氧胆酸中，匀浆。仿步骤1离心混合物。
4.包涵体洗涤#3。除去上清液，将片状沉淀再悬浮于10倍体积的蒸馏水中，匀浆。仿步骤1离心混合物。
5.再折叠。片状沉淀用15倍体积的10mMHEPES，pH8.5，1％肌氨酸钠(N-月桂基肌氨酸)室温下再折叠。60分钟后，溶液中加硫酸铜至60mM，然后振荡过夜。
6.除去肌氨酸。再折叠混合物用5倍体积的10mM Tris缓冲液pH7.5稀释，仿步骤1离心。收集上清，边振荡边同Dowexl-x4树脂，20-50目，氯化物形式(占稀释的再折叠混合物总体积的0.066％)混合。该混合物上柱，收集洗脱液，用HPLC证实肌氨酸已除去。
7.酸沉淀。收集上步的洗脱液，调pH至5.5，室温温育30分钟。仿步骤1离心混合物。
8.阳离子交换层析。上一步的上清pH调至4.2，上CM琼脂糖快速流动柱。用20倍柱体积的盐梯度，20mM NaOAc，pH4.2，OM到1.0M NaCl。
9.HIC层析。汇集上一步CM琼脂糖的峰组分(用紫外分析证实)调至0.2M硫酸铵。加上20倍柱体积的反向盐梯度，5mM NaOAc，pH4.2，0.4M到OM硫酸铵。该材料浓缩并透析过滤至PBS。
                  结果
下列是C57Bl6J小鼠(8周大)中与基线体重的百分比(％)差别：
              表8
    持续输液造成的体重减轻
  时间(天)    媒介物(PBS)    重组OB多肽第1-2天    3.24+/-1.13    1.68+/-1.4第3-4天    4.3+/-.97     -2.12+/-.79第5-6天    4.64+/-.96    -4.62+/-1.3
可以看出，持续输液6天后，接受OB多肽的动物失去与基线比超过4％体重。这与用腹腔内(i.p.)注射观察到的相比体重减轻相当快。在野生型(正常)小鼠每日腹腔内注射10mg/kg剂量的重组OB多肽，32天注射期之后观察到体重仅减轻2.6-3.0％，并且在给药过程中任何时间均未超过4％。(数据未给出)。本数据显示用持续输液，低20倍的剂量(0.5mg/kg对10mg/kg)在短时间内导致体重减少更多。
结果有统计意义，例如-4.62％，p＜0.0001。
         实施例14  重组人类OB多肽类似物
                  的克隆与表达
本实施例提供了制备重组人类OB多肽类似物的成分与方法。
如上面实施例 3所示，通过将小鼠OB为DNA中MluI和BamHI位点之间的区域用等换了20个密码子的双螺旋DNA(用合成寡聚核苷酸制得)，即可以鼠类OB DNA构建出人类OB DNA。小鼠成熟位置35的精氨酸密码子和位置74的亮氨酸密码子不变。MluI位点在下面序列中在实线下显示。该DNA插到pCFM1656载体(ATCC登记号69576)，方法与上述重组鼠类蛋白的一样。
重组人类met OB(双链)DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：96和97)：
CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  60
GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAA
   M  V  P  I  Q  K  V  Q  D  D  T  K  T  L  I  K  T  I  V    -
ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  120
TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG
T  R  I  N  D  I  S  H  T  Q  S  V  S  S  K  Q  R  V  T  G    -
CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  180
GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC
L  D  F  I  P  G  L  H  P  I  L  T  L  S  K  M  D  Q  T  L    -
GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  240
CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG
A  V  Y  Q  Q  I  L  T  S  M  P  S  R  N  V  L  Q  I  S  N    -
GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  300
CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC
D  L  E  N  L  R  D  L  L  H  V  L  A  F  S  K  S  C  H  L    -
CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  360
GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA
P  W  A  S  G  L  E  T  L  D  S  L  G  G  V  L  E  A  S  G    -
TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+  420
ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC
Y  S  T  E  V  V  A  L  S  R  L  Q  G  S  L  Q  D  M  L  W    -
CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC421 ---------+---------+---------+---- 454
GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG
Q  L  D  L  S  P  G  C  *
                              发酵
上述宿主细胞发酵来生产重组人类OB多肽其条件和组合物与上述重组鼠类材料的相同。对结果分析重组人类OB材料(及少量细菌蛋白)的产率(克/升)和预纯化，并与分析细菌表达相联系。
            表9
      分析人类OB多肽表达
  时刻          OD     产率   表达(600n) (g/L) (mg/OD·L)诱导+2小时      47    1.91     41诱导+4小时      79    9.48     120诱导+6小时      95    13.01    137诱导+8小时      94    13.24    141诱导+10小时     98    14.65    149
(A字)缩写：诱导十一小时表示诱导蛋白表达后多少小时，如实施例13中对用pCFM1656的重组鼠类材料的描述。ob：光密度，用光度计测量，毫克每O.D单位每升(mg/OD·L)：以蛋白mg数每O.D.单位每升表示表达。
                纯化重组人类OB多肽
重组人类蛋白所用的纯化方法与上面实施例13中用来纯化重组鼠类蛋白的方法相似。对于制备重组人类OB多肽，步骤8调步骤7的上清的pH至5.0，上CM琼脂糖(sepharose)快速流动柱。20倍柱体积的盐梯度是20mM NaOAc，pH5.5，OM至0.5M NaCl。步骤9用水将CM琼脂糖汇集物稀释4倍，调pH至7.5。该混合物加硫酸铵至0.7M。20倍柱体积反向盐梯度是5mM NaOAc，pH5.5，0.2M至0M硫酸铵。其它上述步骤相同。
              实施例15  剂量反应研究
另一些研究表明对持续给药OB蛋白有剂量反应。该研究中，野生型小鼠(非肥胖，CD-1小鼠，体重35-40克)用与实施例12和13相似的方法给药重组鼠类OB蛋白。结果如下(与基线相比％体重减轻，测量方法同上)。
                 表10
          持续给药的剂量反应
    剂量     时间   体重的％减少
  0.03mg/kg/天     第2天     3.5％
  1mg/kg/天     第2天     7.5％
  1mg/kg/天     第4天     14％
可以看出，将剂量从0.03mg/kg/天升到1mg/kg/天使体重降低从3.5％升到7.5％。还需注意在第14天，1mg/kg/天的剂量导致体重减少14％。
             实施例16  瘠素对ob/ob小鼠身体组合物
C57Bl/6J ob/ob 16周大的小鼠用5ng/g/天鼠类瘠素，媒介物或不接受处理处理33天。另一实验中，7周大ob/ob小鼠用10μg/g/天的人类瘠素，鼠类瘠素或媒介物处理12天。处死小鼠测体重，身体组合物，胰岛素水平和葡萄糖水平。这些实验的数据见表11。
                        表11
      处理小鼠的体重，组合物，胰岛素水平和葡萄糖水平
    处理组               16周龄小鼠，  5μg/g/日瘠素                7周龄小鼠，  10μg/g/日瘠素
    处理    鼠类瘠素     媒介物      对照     人类瘠素     鼠类瘠素     媒介物
    总体重     31.90±2.8     64.10±4.5      67.50±6.2     31.00±1.3     33.40±2.4     42.70±1.5
脂肪    总量(g)％     9.10±1.728.40±3.4     38.30±4.059.70±2.1      40.87±6.160.34±3.7
瘦质量  总量(g)％     6.80±1.021.30±1.7     7.60±0.411.90±1.2      7.73±0.511.57±1.6
水      总量(g)％     16.00±0.850.30±4.2     18.20±0.728.40±1.0      18.90±1.028.10±2.2
胰岛素(UIU/ml)     ＜2.0     ＜2.0     ＜2.0     ＜2.0     ＜2.0     21.4
葡萄糖(mg/dl)     170.0±20.9     337±30.3     317.5±51.0     258.3±26.8     320.0±44.0     789.0±152.1
身体组合物数据显示瘠素在身体的三部分：脂肪瘦身体物质，和水的效果。数据显示瘠素明显降低身体脂肪质量，对瘦身体物质有边界(marginal)影向。然而对瘦身体物质的影向统计意义不大。
比较瘠素处理的小鼠和对照(未处理)小鼠的胰岛素和葡萄糖水平，显示瘠素降低血糖和胰岛素水平，因此缓解这些糖尿病标志。
           实施例17：瘠素对野生型小鼠的高剂量影响
ob/ob小鼠的瘦对照(C57Bl/6J+/？)每日腹腔内注射10μg/g鼠类瘠素或媒介物(PBS)，接下来的2周内测量体重和食物摄入量。从第4天起体重明显降低，第一周食物摄入量明显降低。但是一周以后以食物摄入水平在两组小鼠中不再能分开，2周后处死小鼠，确定其身体组合物。身体组合物分析的结果由表12给出。数据显示接受瘠素的动物比接受PBS的动物身体内脂肪减少。
                             表12
             野生型(+/？)小鼠的身体组合物和体重
组别   C57Bl/6J 体重 脂肪总量％ 瘦身体物质总量  ％ 水总量  ％    ％
蛋白质     12345678910     17.320.516.918.317.718.715.716.416.514.9     0.302.390.340.840.442.560.370.290.83     1.71％11.65％1.99％4.62％2.51％13.72％2.38％1.79％5.05％     5.005.414.765.164.964.844.534.514.67     28.93％26.40％28.19％28.17％28.00％25.86％28.83％27.48％28.29％     12.0012.7011.8012.3012.3011.3010.8011.6011.0010.40     69.36％61.95％69.82％67.21％69.49％60.43％68.79％70.73％66.67％69.80％
    平均值标准偏差     17.31.6     0.930.90     5.04％4.52％     4.870.30     27.79％1.05％     11.620.74     67.43％3.52％
媒介物     11121314151617181920     18.817.618.019.618.617.319.320.617.719.5     1.302.172.293.792.351.961.384.161.08     6.93％12.34％12.74％19.34％12.65％11.32％7.12％20.19％6.13％     5.004.534.614.614.754.545.024.944.72     26.58％25.73％25.59％23.52％25.52％26.25％26.04％23.98％26.64％     12.5010.9011.1011.2011.5010.8012.9011.5011.9012.30     66.49％61.93％61.67％57.14％61.83％62.43％66.84％55.83％67.23％63.08％
    平均值标准偏差     18.71.1     2.281.07     12.09％5.08％     4.750.20     25.54％1.10％     11.660.72     62.45％3.83％
另一实验给出对野生型C57Bl/6J小鼠每日两次腹腔内注射12.5μg/g鼠类瘠素的效果。与每日两次注射该多肽相连系，体重和食物摄入量明显降低。该实验中动物置于代谢室里(metabolic chamber)食物包括粉末状Purira#5001食料。该食谱与前面的不同，那些实验用的食谱包括食料，木薯淀粉和水。因此代谢室用的食物热量含量高，这就解释了为什么食物消耗量与用含水食谱的动物的不同。
下述是参考文献表，这些文献与上述公开内容，特别是实验方法和讨论相关。Bahary  等人  基因组学  11：33-47(1991)，Bahary  等人  基因组学  13：761-769(1992)，Bahary  等人  小鼠4号和6号染色体的分子定位：流式分选
            Robertsonian氏染色体的应用(1991)，Blank   等人  哺乳动物基因组，1：s51-s78(1991)Bogardus 等人 纽约科学院年刊630：100-115(1991)Frideman 等人 哺乳动物基因组，1：130-144(1991)Harris        FASEB J.4：3310-3318(1990)Jacobowitz等人，新英格兰医学杂志315：96-100(1986)Kessey       肥胖症  144-166页Stunkard编  费城W.B.
         Sauders公司(1980)Kessey等人，  心理学年度综述37：109-133，22(1986)Leibel等人， “肥胖症的遗传变化和营养：肥胖症的分子遗传学
            方法”，遗传变化与营养，90-101.1页，
            Simopoulos和Childs编，S.Karger巴塞尔
            (1990)Siegel等人，  细胞遗传学  61(3)：184-185(1992)。
本发明可以其它形式或其它方式实施而不偏离其本质特征。本公开内容在各个方面均应视为描述说明性的而非限制性的。本发明涵盖范围由所附的权利要求指定，意义和等效范围的变化均包含在内。
本说明通篇引用了许多参考文献，每一个均全篇引入作为参考。
根据上述说明和易得到的参考资料以及起始材料，本发明是可以实现的。尽管如此，申请人还是根据国际公认的，以专利程序为目的的微生物保藏巴黎公约，于1995年8月9日，在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852-1178，美国，对如下菌种进行保藏：锚定了质粒pETH14的大肠杆菌H14，保藏号69880；锚定了质粒pETM9的大肠杆菌M9，保藏号69879。
                   序列表(1)一般资料：(i)申请人：洛克菲勒大学(ii)发明题目：体重调控物，相应的核酸和蛋白质
             及其诊断和治疗应用(iii)序列数：99(iv)相关地址：
   (A)收信人：Klauber & Jackson
   (B)街道：411 Hackensack Avenue
   (C)城市：Hackensack
   (D)州：New Jersey
   (E)国家：USA
   (F)邮编：07601(v)计算机可读形式：
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   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)当前申请数据：
   (A)申请号：
   (B)提交日期：
   (C)分类：(vii)在先申请数据：
   (A)申请号：08/483,211
   (B)提交日期：June 7，1995
   (C)分类：(vii)在先申请数据：
   (A)申请号：08/438,431
   (B)提交日期：May 10，1995
   (C)分类：(vii)在先申请数据：
   (A)申请号：08/347,563
   (B)提交日期：November 30，1994
   (C)分类：(vii)在先申请数据：
   (A)申请号：08/292,345
   (B)提交日期：August 17，1994
   (C)分类：(viii)律师/代理人资料：
   (A)姓名：Jackson Esq.，David  A.
   (B)注册号：26,742
   (C)参考/登记号：600-1-087 PCT(ix)电讯资料：
   (A)电话：201 487-5800
   (B)电传：201343-1684
   (C)电报：133521(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：2793个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)
   (A)描述：鼠类ob cDNA(iii)假定：无(iv)反义：非(vi)来源：
   (A)生物体：鼠(ix)特征：
   (A)名称/键：CDS
   (B)位置：57..560(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA         56ATG TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG      104Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1               5                  10                  15TCT TAT GTT CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA      152Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG      200Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     35                  40                  45CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT      248Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Tnr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
 50                  55                  60GGG CTT CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA      296Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65                  70                  75                  80GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG      344Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln
             85                  90                  95ATA GCC SST GAC CTG GAG AAT CTC CAG GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC      392Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala
        100                 105                 110TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA      440Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro
    115                 120                 125GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG      488Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val
130                 135                 140GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT TCG CAG GAC ACT CTT CAA CAG      536Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln145                 150                 155                 160TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCCAAGA      588Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys  *
            165ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC    648ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA    708CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG    768AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG    828TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA   888GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA   948GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGA ACTTATTTAT  1008TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT CAGGCTTTTGG 1068GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG  1128CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG  1188TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG  1248ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA  1308AGCAGATGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG  1368TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT  1428TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG  1488ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA  1548AAGCTACAGG CCTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACATTTGA  1606GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTTGAT  1668CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA  1728TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCATTCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT  1788GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT  1848GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG  1908CTTGGGTTTT TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT  1968GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT  2028CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG  2088TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG  2148GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA  2208GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TAATGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC  2268CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA  2328TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTG GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA  2388TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA CATGAAGTTC  2448ATTTATATTT CATAATACCG TATAGACACT GCTTGAAGTG TAGTTTTATA CAGTGTTTTA    2508AATAACGTTG TATGCATGAA AGACGTTTTT ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA    2568CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT    2628AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC    2688TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTTTTGTG    2748GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC                    2793(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：168个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
  (A)描述：鼠类ob多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1               5                  10                  15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30Thr Leu IlE Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     25                  40                  45Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
 50                  55                  60Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Tnr Leu Ala65                  70                  75                  80Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln
             85                  90                  95Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala
        100                 105                 110Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro
    115                 120                 125Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val
130                 135                 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln145                 150                 155                 160Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys  *
            165(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：700个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA
  (A)描述：人类ob cDNA，其中N代表任意核苷酸(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
  (A)生物体：人(ix)特征：
  (A)名称/键：CDS
  (B)位置：46..546(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG       54
                                              Met His Trp
                                                1GGA ACC CTG TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC    102Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val
  5                  10                  15CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC    150Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile20                  25                  30                  35AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC    198Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val
             40                  45                  50TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC    246Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His
         55                  60                  65CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA    294Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln
     70                  75                  80CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC    342Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn
 85                  90                  95GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG    390Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys100                 105                 110                 115AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG    438Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu
            120                 125                 130GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG    486Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu
        135                 140                 145AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC    534Ser ARg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu
    150                 155                 160AGC CCT GGG TGC TGAGGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT         585Ser Pro Gly Cys
165TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC  645CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG       700(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：167个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白
  (A)描述：人类ob多肽(vi)来源：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1               5                  10                  15Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     35                  40                  45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
 50                  55                  60Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65                  70                  75                  80Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln
             85                  90                  95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Ash Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala
        100                 105                 110Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu
    115                 120                 125Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val
130                 135                 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln145                 150                 155                 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
            165(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：166个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
  (A)描述：鼠类ob多肽，在位置49缺失Gln(vi)来源：
  (A)生物体：鼠(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1               5                  10                  15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     35                  40                  45Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly
 50                  55                  60Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val65                  70                  75                  80Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile
             85                  90                  95Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe
        100                 105                 110Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu
    115                 120                 125Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val
130                 135                 140Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu145                 150                 155                 160Asp Val Ser Pro Glu Cys
            165(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：167个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白
  (A)描述：人类ob多肽，在位置49缺失Gln(vi)来源：
  (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1               5                  10                  15Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     35                  40                  45Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly
 50                  55                  60Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val65                  70                  75                  80Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile
             85                  90                  95Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe
        100                 105                 110Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp
    115                 120                 125Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val
130                 135                 140Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu145                 150                 155                 160Asp Leu Ser Pro Gly Cys
            165(2)SEQ ID NO：7的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：175个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)
  (A)描述：外显子2G7(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC   60NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG  120ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG      175(2)SEQ ID NO：8的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：外显子2G7的PCR 5′引物  (iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CCAGGGCAGG AAAATGTG                                          18(2)SEQ ID NO：9的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：外显子2G7的PCR 3′引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG                                     22(2)SEQ ID NO：10的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：多肽
  (A)描述：推测的N末端信号肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1               5                   10                  15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro
        20(2)SEQ ID NO：11的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：287个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：DNA(质粒)
  (A)描述：PET-15b表达载体(iii)假定：无(iv)反义：非(ix)特征：
  (A)名称/关键词：T7启动子
  (B)位置：20..37(ix)特征：
  (A)名称/关键词：乳糖操纵子
  (B)位置：39..64(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：108..243(ix)特征：
  (A)名称/关键词：His-Tag
  (B)位置：123..137(ix)特征：
  (A)名称/关键词：凝血酶切割位点
  (B)位置：184..196(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA   60TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC    116
                                                Met Gly Ser
                                                  1AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC    164Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
  5                  10                  15CAT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG    212His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu20                  25                  30                  35TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT    263Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln  *
             40AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG                                         287(2)SEQ ID NO：12的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：45个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1               5                  10                  15Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys
         20                  25                  30Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln
     35                  40(2)SEQ ID NO：13的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：鼠类5′引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC                                32(2)SEQ ID NO：14的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：鼠类3′引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC                                32(2)SEQ ID NO：15的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：人类5′引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC                                32(2)SEQ ID NO：16的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：人类3′引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA                                32(2)SEQ ID NO：17的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：11个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA
  (A)描述：ob中的拼接接受位点(iii)假定：无(iv)反义：非(ix)特征：
  (A)名称/关键词：拼接接受位点(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：AGCAGTCGGT A                                                       11(2)SEQ ID NO：18的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：16个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽
  (A)描述：ob肽片段(v)片段类型：内部(vi)来源：
  (A)生物体：鼠
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr1               5                           10          15(2)SEQ ID NO：19的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：15个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽
  (A)描述：ob肽片段(v)片段类型：内部(vi)来源：
  (A)生物体：鼠(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：20的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：19个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽
  (A)描述：ob肽片段(v)片段类型：内部(vi)来源：
  (A)生物体：鼠(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu1               5                   10                  15Ser Leu Asp(2)SEQ ID NO：21的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽
  (A)描述：ob肽片段(v)片段类型：羧基末端(vi)来源：
  (A)生物体：鼠(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val1               5                   10                  15Ser Pro Glu Cys
        20(2)SEQ ID NO：22的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：414个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)
  (A)描述：部分人类ob基因，包括第一外显子上游非编码子、
           第一外显子的编码序列以及第一内含子的5′区(iii)假定：无(iv)反义：非(vi)来源：
  (A)生物体：人(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：38..181(ix)特征：
  (A)名称/关键词：第一内含子的5′区
  (B)位置：182..414(ix)特征：
  (A)名称/关键词：人类ob基因5′非编码序列，由它得到
                  HOB 1gF DNA引物
  (B)位置：11..28(ix)特征：
  (A)名称/关键词：人类ob基因内含子序列，由它得到
                  HOB 1gR引物
  (B)位置：241..260(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG     55
                                     Met His Trp Gly Thr Leu
                                       1               5TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG     103Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val Gln Ala Val
         10                  15                  20CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT     151Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile
     25                  30                  35GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA       201Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
 40                  45CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC   261AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT   321TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA   381GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA                                414(2)SEQ ID NO：23的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：48个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
  (A)描述：第一外显子编码的人类ob蛋白的N末端部分  (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1               5                  10                  15Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
         20                  25                  30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
     35                  40                  45(2)SEQ ID NO：24的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：801个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)
  (A)描述：部分人类ob基因，包括第一内含子的3′区，第二
           外显子的编码序列和3′非编码序列(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
  (A)生物体：人(ix)特征：
  (A)名称/键：CDS
  (B)位置：291..648(ix)特征：
  (A)名称/键：第一内含子3′区
  (B)位置：1..290(ix)特征：
  (A)名称/键：人类ob基因的内含子序列，由它得到HOB 2gF
              引物
  (B)位置：250..269(ix)特征：
  (A)名称/键：人类ob基因3′非编码区，由它得到HOB 2gR
                DNA引物
  (B)位置：707..728(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT   60GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG  120CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG  180AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTGGAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG  240CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA     296
                                                   Gln Ser
                                                     1GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC ATT CCT CCT GGG CTC    344Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu
      5                  10                  15CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC    392His Pro Ile Leu Thr Lec Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr
 20                  25                  30CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC    440Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser35                  40                  45                  50AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG CAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT    488Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser
             55                  60                  65AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC    536Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser
         70                  75                  80CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC    584Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala
     85                  90                  95CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC    632Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp
100                 105                 110CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA  688Leu Ser Pro Gly Cys115GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC  748TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG         801(2)SEQ ID NO：25的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：119个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
  (A)描述：第二外显子编码的人类ob蛋白的C末端部分(xi)序列描述：SEQ ID NO：25Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro1               5                  10                  15Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala
         20                  25                  30Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln
     35                  40                  45Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala
 50                  55                  60Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu65                  70                  75                  80Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val
             85                  90                  95Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln
        100                 105                 110Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
    115(2)SEQ ID NO：26的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(iv)来源：
  (A)生物体：毕赤氏酵母  (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala1               5(2)SEQ ID NO：27的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(iv)来源：
  (A)生物体：毕赤氏酵母(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Glu Ala Glu Ala1(2)SEQ ID NO：28的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(iv)来源：
  (A)生物体：毕赤氏酵母(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Leu Glu Lys Arg1(2)SEQ ID NO：29的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：由人类ob基因的5′非编码序列得到HOB 1gF
           DNA引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：CCCAAGAAGC CCATCCTG                                                18(2)SEQ ID NO：30的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：由人类ob基因的第一内含子序列得到的HOB 1gF
           DNA引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GACTATCTGG GTCCAGTGCC                                              20(2)SEQ ID NO：31的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：由人类ob基因的第一内含子序列得到HOB 2gF
           DNA引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：CCACATGCTG AGCACTTGTT                                             20(2)SEQ ID NO：32的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：由人类ob基因的3′非编码序列得到HOB 2gR
           DNA引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CTTCAATCCT GGAGATACCT GG                                           22(2)SEQ ID NO：33的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：51个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：DNA
  (A)描述：pPIC.9克隆位点(iii)假定：无(iv)反义：无  (xi)序列描述：SEQ ID NO：33：CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G           51(2)SEQ ID NO：34的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：用于扩增人类ob cDNA序列的PCR 5′引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG                        40(2)SEQ ID NO：35的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：31个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)用于扩增人类ob cDNA序列的PCR3′引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C                                 31(2)SEQ ID NO：36的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)用于扩增人类ob cDNA序列的PCR5′引物(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG                        40(2)SEQ ID NO：37的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：31个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)用于扩增人类ob cDNA序列的PCR 3′引物(iii)假定：无(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C                                 31(2)SEQ ID NO：38的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白
  (A)描述：凝血酶切割后复性的鼠ob蛋白的N末端4肽(iv)来源：
  (A)生物体：鼠  (xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Gly Ser His Met1(2)SEQ ID NO：39的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1734(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
  (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：CAAGACAAAT GAGATAAGG                                               19(2)SEQ ID NO：40的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1734(iii)假定：无(iv)反义：非(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：AGAGTTACAG CTTTACAG                                                18(2)SEQ ID NO：41的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS494(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
  (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：CTAAACACCT TTCCATTCC                                               19(2)SEQ ID NO：42的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS494(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC                                           22(2)SEQ ID NO：43的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS883(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：TGCAGTAAGC TGTGATTGAG                                              20(2)SEQ ID NO：44的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS883(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：GTGCAGCTTT AATTGTGAGC                                              20(2)SEQ ID NO：45的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2359(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：AGTGTTGTGT TTCTCCTG                                                18(2)SEQ ID NO：46的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2359(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：AAAGGGGATG TGATAAGTG                                               19(2)SEQ ID NO：47的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2336(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：GGTGTTACGT TTAGTTAC                                                18(2)SEQ ID NO：48的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2336(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：GGAATAATGA GAGAAGATTG                                              20(2)SEQ ID NO：49的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1218  (iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：GCTCAACTGA CAGAAAAC                                                18(2)SEQ ID NO：50的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1218(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：GACTATGTAA AAGAAATGCC                                              20(2)SEQ ID NO：51的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1402(iii)假定：无(iv)反义：非  (iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：AAAGGGCTTC TAATCTAC                                                18(2)SEQ ID NO：52的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1402(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：CCTTCCAACT TCTTTGAC                                                18(2)SEQ ID NO：53的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS999(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人  (xi)序列描述：SEQ ID NO：53：TAAACCCCCT TTCTGTTC                                                18(2)SEQ ID NO：54的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS999(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：TTGCATAATA GTCACACCC                                               19(2)SEQ ID NO：55的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1751(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG                                           22(2)SEQ ID NO：56的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1751(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：AAACCGAAGT TCAGATACAG                                              20(2)SEQ ID NO：57的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1174(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：AATATCTGAC ATTGGCAC                                                18(2)SEQ ID NO：58的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1174(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：TTAGACCTGA GAAAAGAG                                                18(2)SEQ ID NO：59的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：19个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2061(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：GTTGCACAAT ACAAAATCC                                               19(2)SEQ ID NO：60的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2061(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：CTTCCATTAG TGTCTTATAG                                              20(2)SEQ ID NO：61的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2588(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：ATCACTACAC ACCTAATC                                                18(2)SEQ ID NO：62的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2588(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：CCATTCTACA TTTCCACC                                                18(2)SEQ ID NO：63的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS808(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA                                         24(2)SEQ ID NO：64的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS808  (iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC                                          23(2)SEQ ID NO：65的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1392(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：CTCAGGTATG TCTTTATC                                                18(2)SEQ ID NO：66的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1392(iii)假定：无(iv)反义：非  (iv)来源：
  (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：TGTCTCTGCA TTCTTTTC                                                18(2)SEQ ID NO：67的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1148(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：GACACATACA AACACAAG                                                18(2)SEQ ID NO：68的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：19个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1148(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人  (xi)序列描述：SEQ ID NO：68：ATTGAGTTGA GTGTAGTAG                                               19(2)SEQ ID NO：69的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1529(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
  (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：CAGGGATTTC TAATTGTC                                                18(2)SEQ ID NO：70的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS1529(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：AAAAGATGGA GGCTTTTG                                                18(2)SEQ ID NO：71的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：21个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2619(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G                                           21(2)SEQ ID NO：72的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2619(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA                                              20(2)SEQ ID NO：73的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS404(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：ACCAGGGTCA ATACAAAG                                                18(2)SEQ ID NO：74的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS404(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：TAATGTGTCC TTCTTGCC                                                18(2)SEQ ID NO：75的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2367(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：CAATCCTGGC TTCATTTG                                                18(2)SEQ ID NO：76的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：序列标记位点特异性的PCR引物sWSS2367(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：AAGGTGGGTA GGATGCTA                                                18(2)SEQ ID NO：77的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker UT528(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：TGCAGTAAGC TGTGATTGAG                                              20(2)SEQ ID NO：78的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：Marker UT528(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：GTGCAGCTTT AATTGTGAGC                                              20(2)SEQ ID NO：79的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
  (A)描述：Marker AFMa065zg9  (iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT                                              20(2)SEQ ID NO：80的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：19个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFMa065zg9(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：GGTCAGCAGC ACTGTGATT                                               19(2)SEQ ID NO：81的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：19个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFMa125wh1(iii)假定：无(iv)反义：非  (iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：TCACCTTGAG ATTCCATCC                                               19(2)SEQ ID NO：82的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFMa125wh1(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：AACACCGTGG TCTTATCAAA                                              20(2)SEQ ID NO：83的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM309yf10(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人  (xi)序列描述：SEQ ID NO：83：CATCCAAGTT GGCAGTTTTT                                              20(2)SEQ ID NO：84的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM309yf10(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：AGATGCTGAA TTCCCAGACA                                              20(2)SEQ ID NO：85的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：16个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM218xf10(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：TGGGCAACAC AGCAAA                                                  16(2)SEQ ID NO：86的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM218xf10(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：TGCAGTTAGT GCCAATGTCA                                              20(2)SEQ ID NO：87的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：16个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM206xc1(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：CCAGGCCATG TGGAAC                                                  16(2)SEQ ID NO：88的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM206xc1(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT                                              20(2)SEQ ID NO：89的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：16个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM199x12(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：TCTGATTGCT GGCTGC                                                  16(2)SEQ ID NO：90的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：17个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFM199x12(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：GCGCGTGTGT ATGTGAG                                                 17(2)SEQ ID NO：91的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFMa345wc9(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：AGCTCTTGGC AAACTCACAT                                              20(2)SEQ ID NO：92的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：Marker AFMa345wc9(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：GCCTAAGGGA ATGAGACACA                                              20(2)SEQ ID NO：93的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(引物)
   (A)描述：来自鼠类的引物Pax4基因(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：鼠(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG                                         24(2)SEQ ID NO：94的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：491个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA
   (A)描述：重组鼠met ob(iii)假定：无  (iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：鼠(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：41..478(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG     55
                                        Met Val Pro Ile Gln
                                          1               5AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT    103Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg
             10                  15                  20ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GTT    151Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val
         25                  30                  35ACC GGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC TTG TCC    199Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser
     40                  45                  50AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG    247Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu
 55                  60                  65CCG TCC CAG AAC GTT CTT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC    295Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg70                  75                  80                  85GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG    343Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln
             90                  95                 100ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA    391Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Let Asp Gly Val Leu Glu Ala
        105                 110                 115TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC    439Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser
    120                 125                 130CTT CAG GAC ATC CTT CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG GAA TGT TAATGGA    488Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys
135             140                     145TCC                                                                491(2)SEQ ID NO：95的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：146氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
  (A)描述：重组鼠met ob蛋白
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：95：Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys1               5                  10                  15Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser
         20                  25                  30Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro
     35                  40                  45Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln
 50                  55                  60Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp65                  70                  75                  80Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser
             85                  90                  95Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp
        100                 105                 110Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser
    115                 120                 125Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser
130                 135                 140Pro Glu Cys145(2)SEQ ID NO：96的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：454个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA
   (A)描述：重组人类met ob(iii)假定：无(iv)反义：非(iv)来源：
   (A)生物体：人(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：4..444(xi)序列描述：SEQ ID NO：96：CAT ATG GTA CCG ATC CAG AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT    48
Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile
  1               5                  10                  15AAA ACG ATC GTT ACG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTG    96Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val
             20                  25                  30AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC   144Sar Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His
         35                  40                  45CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG   192Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln
     50                  55                  60CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC   240Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn
 65                  70                  75GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA   288Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys80                  85                  90                  95TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG   336Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu
            100                 105                 110GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG   384Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu
        115                 120                 125TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG   432Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu
    130                 135                 140TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC                                        454Ser Pro Gly Cys
145(2)SEQ ID NO：97的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：147氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质
   (A)描述：重组人类met ob蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys1               5                  10                  15Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser
         20                  25                  30Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro
     35                  40                  45Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln
 50                  55                  60Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn Asp65                  70                  75                  80Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser
             85                  90                  95Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly
        100                 105                 110Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser
    115                 120                 125Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser
130                 135                 140Pro Gly Cys145(2)SEQ ID NO：98的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：21氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(v)片段类型：N末端His标志(xi)序列描述：SEQ ID NO：98：Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1               5                  10                  15Arg Gly Ser His Met
         20(2)SEQ ID NO：99的资料：(i)序列特征：
   (A)长度：20氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(v)片段类型：N末端His标志(xi)序列描述：SEQ ID NO：99：Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1               5                  10                  15Arg Gly Ser Pro
         20

Claims (76)

1.一种具有大约145到167个氨基酸，能够调控动物体重的肥胖症(OB)多肽，或其具有相同生物活性的等位变异体或类似物，包括片段。
2.权利要求1的OB多肽或其等位变异体或类似物，包括片段，该多肽包含SEQ ID NO：2、4、5或6的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的OB多肽的免疫原性片段。
4.OB多肽的免疫原性片段，其选自：Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQID NO：18)；Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala(SEQ IDNO：19)；Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO：20)；和Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys(SEQ ID NO：21)。
5.权利要求2的人类OB多肽类似物，其中选自氨基酸53、56、71、85、89、92、95、98、110、118、121、122、126、127、128、129、132、139、157、159、163和166(根据SEQ ID NO：4的编号)的一个或多个氨基酸被其他氨基酸替换。
6.权利要求5的人类OB多肽类似物，其中替换是用SEQ ID NO：2给出的小鼠OB多肽的趋异氨基酸进行的。
7.权利要求5的人类OB多肽类似物，其中替换是用丙氨酸进行的。
8.权利要求5的人类OB多肽类似物，其选自下列多肽，其中
(a)第53位的丝氨酸残基被甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或苏氨酸替换；
(b)第98位的丝氨酸残基被甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或苏氨酸替换；和
(c)第92位的精氨酸残基被天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸替换。
9.权利要求2的OB多肽类似物，其与SEQ ID NO：2、4、5或6给出的人类OB多肽氨基酸序列有83％或更高的  氨基酸序列同源性。
10.权利要求2的人类OB多肽类似物，其选自下列多肽，其中：
(a)一个或多个天冬氨酸残基被谷氨酸替换；
(b)一个或多个异亮氨酸残基被亮氨酸替换；
(c)一个或多个甘氨酸或缬氨酸残基被丙氨酸替换；
(d)一个或多个精氨酸残基被组氨酸替换；
(e)一个或多个酪氨酸或苯丙氨酸残基被色氨酸替换；
(f)第121至128位的一个或多个残基(根据SEQ ID NO：4的编号)被甘氨酸或丙氨酸替换，和
(g)第54至60位或118至166位的一个或多个残基(根据SEQID NO：4的编号)被赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或脯氨酸替换。
11.权利要求1、2、3、5、6或9中任一权项的OB多肽，其选自下列多肽：
(a)第1到21位残基缺失的多肽；
(b)(a)中的多肽，其第21位是蛋氨酸，或其第18位至21位是(SEQ ID NO：38)甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列，或其第1位至21位是蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：98)。
12.权利要求1、2、3、5、6或9中任一权项的OB多肽，其选自下列多肽：
(a)第1到21位残基缺失的多肽；
(b)(a)中的多肽，其第14位至21位是亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ IDNO：26)，或第18至21位是谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：27)，或第18至21位是亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸序列(SEQ ID NO：28)，或第2至21位是蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID NO：99)，或第18至21位是甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列。
13.权利要求7、8、9或10中任一权项的OB多肽，其选自下列多肽：
(a)第1到21位残基缺失的多肽；和
(b)(a)中的多肽，其第21位是蛋氨酸，或第18位至21位是甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：38)，或第1位至21位是蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：98)，或第14位至21位是亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ IDNO：26)，或第18至21位是谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：27)，或第18至21位是亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸序列(SEQ ID NO：28)，或第2至21位是蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID NO：99)，或第18至21位是甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列。
14.权利要求2的人类OB多肽的截短的类似物，它选自下列多肽(根据SEQ ID NO：4的编号)，其中：
 (a)第121位到128位的一个或多个残基缺失；
 (b)第1-116位残基缺失；
 (c)第1-21位和54到167位残基缺失；
 (d)第1-60位和117到167位残基缺失；
 (e)第1-60位残基缺失；
 (f)第1-53位残基缺失；
 (g)(a)中的类似物，其中第1-21位残基缺失；和
 (h)(a)至(g)的部分的类似物，其N末端氨基酸或氨基酸序列选自：
   (1)蛋氨酸；
   (2)甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ IDNO：38)；
   (3)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：98)；
   (4)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：26)；
   (5)谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ IDNO：27)；
   (6)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸序列(SEQ IDNO：28)；
   (7)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID NO：99)；和
   (8)甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列。
15.权利要求1至14中任一权项的重组OB多肽。
16.权利要求1至14中任一权项的化学合成的OB多肽。
17.权利要求1至16中任一权项的OB多肽衍生物，它还具有一个或多个与之相连的化学基元。
18.权利要求17的衍生物，其中化学基元为水溶性聚合物。
19.权利要求18的衍生物，其中水溶性聚合物是聚乙二醇。
20.权利要求19的衍生物，该衍生物被单、双、三或四聚乙二醇化。
21.权利要求20的衍生物，该衍生物被N末端单聚乙二醇化。
22.权利要求21的衍生物，它是一种OB多肽，该多肽包含SEQID NO：4的氨基酸残基22至167或SEQ ID NO：6的残基22至166。
23.权利要求21的衍生物，它是一种OB多肽，该多肽包含SEQID NO：4的残基22至167或SEQ ID NO：6的残基22至166的氨基酸序列，且第21位为蛋氨酸。
24.编码权利要求1至6、9或11中任一权项的OB多肽的分离的核酸分子。
25.编码权利要求7、8、10、12、13或14中任一权项的OB多肽的分离的核酸分子。
26.一种用于使具有调控哺乳动物体重的生物活性的OB多肽可靠表达的DNA分子，该DNA分子选自：
  (a)SEQ ID NO：1和3给出的DNA分子或其片段；
  (b)与(a)中定义的DNA分子杂交的DNA分子或其可杂交片段；和
  (c)编码被前述任意DNA分子编码的氨基酸序列的表达的DNA分子。
27.权利要求26的DNA分子，它是SEQ ID NO：22和24的人类基因组DNA分子。
28.权利要求24的DNA分子，其编码一种多肽，该多肽所具有的氨基酸序列选自：
  (a)SEQ ID NO：2；
  (b)SEQ ID NO：2的氨基酸22至167；
  (c)SEQ ID NO：4；
  (d)SEQ ID NO：4的氨基酸22至167；
  (e)SEQ ID NO：5；
  (f)SEQ ID NO：5的氨基酸22至166；
  (g)SEQ ID NO：6；
  (h)SEQ ID NO：6的氨基酸22至166；和
  (i)(b)(d)(f)或(h)中的氨基酸序列，其N末端氨基酸或氨基酸序列选自：
    (1)蛋氨酸；
    (2)甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ IDNO：38)，和
    (3)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-组氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO：98)。
29.权利要求28的DNA分子，它编码(b)(d)(f)或(h)中的氨基酸，其N末端氨基酸序列选自：
    (1)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：26)；
    (2)谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO：27)；
    (3)亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸-精氨酸序列(SEQ ID NO：28)；
    (4)蛋氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-组氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列(SEQ IDNO：99)；和
    (5)甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列。
30.权利要求24的DNA分子，它含有编码SEQ ID NO：3给出的蛋白质的编码序列。
31.权利要求24的DNA分子，它含有编码SEQ ID NO：3的氨基酸22至167的序列。
32.一种被可检测标记的核酸分子，它可以与权利要求24至31中任一权项的DNA分子杂交。
33.一种可以与OB核酸非编码区杂交的核酸，该非编码区选自内含子、5′非编码区和3′非编码区。
34.一种用于扩增编码OB多肽的人类基因组DNA的寡核苷酸引物。
35.权利要求32的寡核苷酸，它选自：
HOB 1gF 5′-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3′(SEQ ID NO：29)；
HOB 1gR 5′-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3′(SEQ ID NO：30)；
HOB 2gF 5′-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3′(SEQ ID NO：31)；和
HOB 2gR 5′-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3′(SEQ ID NO：32)。
36.一种含有权利要求24至31中任一权项的DNA分子的载体。
37.一种表达载体，它含有经操作与一段表达控制序列相连的权利要求24、26、30或31中任一权项的DNA分子。
38.一种表达载体，它含有经操作与一段表达控制序列相连的权利要求27或29的DNA分子。
39.一种表达载体，它含有经操作与一段表达控制序列相连的权利要求25的DNA分子。
40.一种用权利要求24或25的DNA分子或权利要求36至39中任一权项的表达载体转化或转染的单细胞宿主。
41.权利要求40的单细胞宿主，它选自细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和组织培养物中的人类细胞。
42.权利要求40的单细胞宿主，它选自大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7，BSC1、BSC40、BMT10和Sf9细胞。
43.权利要求40的单细胞宿主，其中单细胞宿主是酵母宿主，选自啤酒酵母、毕赤氏酵母、假丝酵母、汉逊氏酵母、球拟酵母。
44.含有编码OB多肽的DNA序列的哺乳动物细胞，所述DNA序列经同源重组过程而被体外修饰，使OB多肽更高效地表达，同源重组过程包括将表达调节序列插入到OB多肽编码序列的功能性相近处。
45.权利要求44的细胞，其中表达调节序列是OB多肽表达调节序列，并且同源重组过程替换掉了突变型OB多肽表达调节序列。
46.权利要求45的细胞，其中表达调节序列插入序列不是OB多肽调节序列。
47.一种制备OB多肽的方法，它包括：
   (a)在适于表达OB多肽的条件下培养权利要求40至46中任一权项的细胞；和
   (b)回收表达的OB多肽。
48.权利要求47的方法，其中的细胞是细菌或酵母。
49.权利要求47或48的方法，其进一步包括：
   (c)在Ni螯合柱上层析OB多肽；和
   (b)用凝胶过滤法纯化OB多肽。
50.权利要求49的方法，其进一步包括步骤(c)之后及步骤(d)之前在强阳离子交换柱上层析OB多肽。
51.对权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法产生的OB多肽有特异性的抗体。
52.权利要求51的抗体，它是单克隆或多克隆抗体。
53.权利要求52的抗体，它被可检测标记物标记。
54.生产权利要求52的单克隆抗体的不死细胞系。
55.一种制备OB多肽特异性抗体的方法，它包括：
   (a)将权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法产生的OB多肽结合到载体蛋白上；
   (b)用与佐剂混合的步骤(a)的OB多肽片段-载体蛋白结合物免疫宿主动物；和
   (c)从被免疫宿主动物获得抗体。
56.一种测量OB多肽在样本中是否存在的方法，该方法包括：
   (a)在适于形成包含抗体和OB多肽的反应复合物的条件下将怀疑含有OB多肽的样本接触特异性结合OB多肽的抗体；和
   (b)检测样本中含有抗体和OB多肽的反应复合物是否形成，
若检测到反应复合物的形成则说明样本中有OB多肽。
57.权利要求56的方法，其中抗体结合在固相支持物上。
58.一种体外测定生物样本中OB多肽水平的方法，该方法包括：
  (a)用权利要求56或57的方法检测生物样本中反应复合物的形成；和
  (b)测定形成的反应复合物的量，反应复合物的量对应生物样本中OB多肽的水平。
59.一种体外检测或诊断哺乳动物受试者中与OB多肽水平升高或降低相关的病症是否存在的方法，该方法包括：
  (a)根据权利要求58测定来自哺乳动物受试者的生物样本中OB多肽的水平；和
  (b)将步骤(a)中检测到的水平与正常受试者中或受试者早些时候的OB多肽水平相比较，
与正常水平相比OB多肽水平升高说明有与OB多肽水平上升相联系的疾病，与正常水平相比OB多肽水平下降说明有与OB多肽水平下降相联系的疾病。
60.一种对哺乳动物受试者中与OB多肽水平上升或下降有联系的疾病的治疗处理的体外监测方法，该方法包括在不同时间点，对患有与OB多肽水平上升或下降相联系的疾病并接受相关治疗处理的哺乳动物受试者取一系列生物样本，用权利要求58的方法，测定其中OB多肽的水平。
61.一种药物组合物，它含有权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽和药用载体。
62.权利要求61的药物组合物，它被用于减轻动物体重。
63.一种用于增加动物体重的药物组合物，它包括权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽的拮抗物和药用载体。
64.权利要求63的药物组合物，其中拮抗物选自：结合OB多肽并中和其活性的抗体，结合但不活化OB多肽受体的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
65.一种用于减轻个体体重的改善体形的美容组合物，它包含权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽和可接受的载体。
66.一种用于增加个体体重的改善体形的美容组合物，它包含权利要求1至16的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽的拮抗物和可接受的载体。
67.权利要求66的美容组合物，其中拮抗物选自结合OB多肽并中和其活性的抗体，结合但不活化OB多肽受体的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
68.一种改善个体体形的美容方法，其中权利要求64至67中任一权项的美容组合物被施用给个体，其剂量足以将个体体重调节到需要的水平。
69.与编码权利要求1至4或9中任一权项的OB多肽的核酸杂交的反义核酸分子在制造用于调节哺乳动物体重的药物方面的应用。
70.编码权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽的核酸分子在制造用于调节动物体重的基因治疗药物方面的应用。
71.用权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽在制造用于调节动物体重的药物方面的应用。
72.用权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽在制造用于调节哺乳动物体重的药物方面的应用，该药物被用来治疗糖尿病，高血压或高胆固醇。
73.用权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽在制造用于调节哺乳动物体重的药物方面的应用，该药物与治疗糖尿病，高血压或高胆固醇的药物结合使用。
74.用权利要求1至16中任一权项的或用权利要求47至50的方法制备的OB多肽的拮抗物在  制造用于增加动物体重的药物方面的应用。
75.权利要求74的应用，其中拮抗物选自：结合OB多肽并中和其活性的抗体，结合但不活化OB受体的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
76.权利要求71至75中任一权项的应用，它被用于制造静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻腔、口腔或肺部施用的药物。
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