JPH09506264A - 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途 - Google Patents

体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般に、哺乳動物（動物およびヒトを包含する）の体重の制御に関する。そしてより詳細には、本発明は、体重のモジュレーターとして本明細書中に同定された物質、およびこのようなモジュレーターが適用され得る診断および治療用途に関する。その最も広い局面では、本発明は、ヌクレオチド配列の解明および発見、およびこのようなヌクレオチドまたはそれらの変質性変異体により発現されると推定されるタンパク質に関し、それらは哺乳動物の体重の制御に関与する能力を示す。目的のヌクレオチド配列は、マウスおよびヒトのOB遺伝子に相当する遺伝子を表し、これが体重および脂肪蓄積の調節に重要な役割を果たすと仮定されている。本明細書中に示した予備的なデータは、目的の遺伝子のポリペプチド産物がホルモンとして機能することを示唆している。本発明はさらに、分子プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のプライマーとして有用な核酸分子、すなわち合成または天然のオリゴヌクレオチドを提供する。さらなる局面では、本発明は、本発明の核酸を含むクローニングベクター；および本発明の核酸を、発現制御配列と作動可能に関連させて含む細菌発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳動物発現ベクターを提供する。従って、本発明はさらに、適切な発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた細菌細胞または哺乳動物細胞、および対応して本発明のモジュレーターの調製における上記構築物の使用に関する。OBポリペプチドに対する抗体もまた提供される。さらに、哺乳動物の体重を調整する方法が提供される。特定の実施例では、マウスおよびヒトのOBポリペプチドの２つのイソ型をコードする遺伝子が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、 ならびにそれらの診断および治療用途 発明の技術分野 本発明は、一般に、哺乳動物（動物およびヒトを包含する）の体重の制御に関 する。そしてより詳細には、本発明は、体重のモジュレーターとして本明細書中 に同定された物質、およびこのようなモジュレーターが適用され得る診断および 治療用途に関する。 発明の背景 肥満症（痩身体重に対する体脂肪過剰と定義される）は、重要な心理的および 医学的な病的状態に関連している。後者は、高血圧、血中脂肪の上昇、およびII 型または非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM)を包含する。米国では600万から 1000万人がNIDDMにかかっており、この中には65歳齢群の18％を含む[Harrisら， Int．J．Obes.，11:275-283(1987)]。NIDDMにかかっている男性の約45％および 女性の約70％が肥満症であり、そして彼らの糖尿病は、体重を減少させることに より実質的に改善されるか、または取り除かれる[Harris，Diabetes Care，14(3 ):639-648(1991)]。以下に記載されるように、肥満症およびNIDDMは両方とも遺 伝性が強いが、素因となる遺伝子は未だ同定されていない。これらの代謝関連障 害の分子遺伝学的基礎は、重要であるがあまり理解されていない問題である。 栄養エネルギーの同化、蓄積、および利用は、後生動物の生存の中心にある複 雑な恒常性系を構成している。陸上生活哺乳動物の間では、トリグリセリドとし ての大量の代謝燃料の脂肪組織中の蓄積が、食物が涸渇したときの生存期間にと ってきわめて重要である。生物体の大きさおよび形状に連続的な変化を生じさせ ることなく固定レベルのエネルギー貯蔵を維持しようとする要求には、エネルギ ー摂取および消費間の平衡の達成が必要とされる。しかし、エネルギー平衡を調 節する分子機構はまだ解明されていない。栄養情報を変換してエネルギー平衡の 制御を行う分子の単離が、健康および疾患状態の体重の調節の理解にとって重要 である。 脂肪蓄積の個体レベルは、大部分は遺伝的に決定される。一卵性および二卵性 の双生児または養子とその生物学的親との間の体重および脂肪蓄積の一致率の試 験は、肥満症の遺伝性（0.4〜0.8）が、実質的遺伝成分を有すると一般に考えら れている特性（例えば、精神分裂症、アルコール依存症、およびアテローム性動 脈硬化症）の遺伝性より高いことを示唆した［Stunkardら、N．Engl．J．Med.， 322:1483-1487(1990)］。エネルギー消費率の家族制の類似もまた報告されてい る［Bogardusら、Diabetes，35:1-5(1986)］。地理的に限定した集団内の遺伝学 的解析は比較的少数の遺伝子が身体組成の変動の30〜50％の原因となり得ること を示唆する[Mollら，Am．J．Hum．Genet.，49:1243-1255(1991)]。しかし、一般 集団における肥満症の原因となる遺伝子はひとつも明確な染色体上の位置に対し て遺伝学的にマッピングされていない。 肥満症の齧歯類モデルは７つの見かけ上単一遺伝子の変異を包含する。最も集 中的に研究されているマウス肥満症変異はob（肥満）遺伝子およびdb（糖尿病） 遺伝子である。同一の遺伝系統背景上に存在する場合、obおよびdbは識別し得な い代謝および行動表現型を生じ、このことは、これらの遺伝子が同一の生理学的 経路において機能し得ることを示唆する[Colemanら，Diabetologia，14:141-148 (1978)]。いずれかの変異に対して同型接合性のマウスは過食および代謝低下性 であり、１カ月齢で顕著である肥満表現型となる。これらの動物の体重は60〜70 ｇで安定する傾向にある（比較してコントロールマウスでは30〜35ｇである）。 obおよびdb動物は非常に多くの他のホルモンおよび代謝の変化を発現し、これに より変異に寄与し得る一次欠損を同定することが困難になる[Brayら，Am．J．Cl in．Nutr.，50:891-902(1989)]。 各齧歯類肥満症モデルには、ヒトのII型糖尿病に類似する炭水化物代謝の変化 が伴う。ある場合では、糖尿病の重篤度は背景マウス系統に部分的に依存する[L eiter，Endocrinology，124:912-922(1989)]。obおよびdbの両方に対して、類遺 伝子性（congenic）C57BL/Kマウスは、極度のβ細胞壊死および小島萎縮を有す る重度の糖尿病を発症し、相対的インスリン不足（relative insulinopeni a）を生じる。逆に、類遺伝子性C57BL/6J obおよびdbマウスは、β細胞肥大によ り最終的に補償される一時的インスリン抵抗性糖尿病を発症し、これはヒトII型 糖尿病に類似する。 obおよびdbマウスの表現型は、糖尿病の進行以外の点でヒト肥満症に類似する −−変異マウスは、痩身型コントロールより食餌量が多くエネルギー消費量が少 ない（肥満者と同様）。この表現型はまた視床下部腹内側部の病巣を有する動物 で見られる表現型とかなり類似しており、このことは、両変異が適切に中枢神経 系内で栄養情報を統合するかまたはこれに応答する能力を妨害し得ることを示唆 する。この仮説の支持は並体癒合実験の結果から生じる[Colemanら，Diabetolog ia，9:294-298(1973)]。この実験結果は、obマウスは循環飽食因子が欠損してお り、そしてdbマウスはob因子の影響に対して抵抗性である（おそらくobレセプタ ー欠損のためと思われる）ことを示唆する。これらの実験は、これらの変異マウ スの肥満症が、身体組成を制御する仮定のフィードバック機構の輸入ループ（af ferent loop）および／または統合中枢における異なる欠陥から生じ得るという 結論を導いた。 分子マーカーおよび従来の遺伝子マーカーを用いて、ob遺伝子およびdb遺伝子 はそれぞれ、近位の第６染色体および第４染色体中央部にマッピングされた[Bah aryら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，87:8642-8646(1990)；Friedmanら，Genomi cs，11:1054-1062(1991)]。両場合とも、変異は、ヒトとシンテニー（syntenic ）であるマウスゲノム領域にマッピングされるので、これにより、obおよびdbの ヒトホモログが存在すれば、それらはそれぞれ、ヒト染色体7qおよび1pにマッピ ングされると思われることが示唆される。db遺伝子の欠損により、他の哺乳動物 種で肥満症が生じ得る：Zucker fa/faラットおよびBrown Norway ＋／＋ラット 間の遺伝子交雑において、fa変異（ラット第５染色体）はマウスのdbに隣接する 同じ遺伝子座により隣接される[Truettら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:78 06-7809(1991)]。 体重に影響を及ぼすと思われる非常に多くの因子のために、どの因子が、そし てより詳細にはどの恒常性機構が体重の主要な決定因子となるのか推定すること ができなかった。従って、本発明の基となる主要な問題は、哺乳動物の脂肪蓄積 および脂肪含量の制御を可能にする体重のモジュレーターを提供することである 。 発明の要旨 本発明に従えば、動物、特に哺乳動物の脂肪蓄積および脂肪含量の制御の問題 は、本明細書中に開示されている肥満症（OB）ポリペプチドおよびこれらのポリ ペプチドをコードする核酸分子の提供を通して解決された。本発明は、初めて、 体重および脂肪蓄積の調整（すなわち制御および調節）に有用な単離されたポリ ペプチド、ならびにOBポリペプチドの組換え生産を可能にするだけでなくそれ自 身体重の調整に有用である、このようなポリペプチドをコードする核酸配列を提 供する。 本発明の肥満症（OB）ポリペプチドは、約145〜約167アミノ酸を有し、動物（ 特に哺乳動物）において体重を調整し得、そして同じ生物学的活性を有するそれ らの対立遺伝子変異体またはアナログ（フラグメントを包含する）を包含する。 このポリペプチドは、組換え方法または化学合成方法によって調製され得る。本 発明の好ましいOBポリペプチドは、配列番号２、４、５、または６のアミノ酸配 列を有するOBポリペプチド、あるいはそれらの対立遺伝子変異体またはアナログ （フラグメントを包含する）を包含する。 本発明のOBポリペプチドの免疫原性フラグメントは、以下を包含する：Val-Pr o-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr（配列番号１８ ）；Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala（配列番 号１９）；Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Gl u-Ser-Leu-Asp（配列番号２０）；およびSer-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp -Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys（配列番号２１）。 ヒトOBポリペプチドアナログは、配列番号４および６のヒトアミノ酸配列を有 するOBポリペプチドアナログを含み、ここでアミノ酸53、56、71、85、89、92、 95、98、110、118、121、122、126、127、128、129、132、139、157、159、163 、および166（配列番号４の番号付けに従う）からなる群から選択される１つま たはより多くのアミノ酸が別のアミノ酸、例えば、配列番号２に記載のマウスOB ポリペプチドの分岐（divergent）アミノ酸またはアラニンと置換されている。 こ のようなアナログはまた、以下のようなアナログを包含する：（ａ）５３位のセ リン残基がグリシン、アラニン、バリン、システイン、メチオニン、またはトレ オニンと置換される；（ｂ）９８位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリン 、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換される；および（ｃ）９２ 位のアルギニン残基がアスパラギン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、グルタ ミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、メチオニン、またはシステイン と置換される。本発明のOBポリペプチドアナログは、好ましくは、配列番号２、 ４、５、または６に記載のヒトOBポリペプチドアミノ酸配列と、83％以上のアミ ノ酸配列相同性を有する。 本発明の別のヒト0Bポリペプチドアナログは、配列番号４および６のアミノ酸 配列を有し、そして以下を有する：（ａ）１つまたはより多くのアスパラギン酸 残基がグルタミン酸と置換される；（ｂ）１つまたはより多くのイソロイシン残 基がロイシンと置換される；（ｃ）１つまたはより多くのグリシンまたはバリン 残基がアラニンと置換される；（ｄ）１つまたはより多くのアルギニン残基がヒ スチジンと置換される；（ｅ）１つまたはより多くのチロシンまたはフェニルア ラニン残基がトリプトファンと置換される；（ｆ）121位から128位（配列番号４ の番号付けに従う）の１つまたはより多くの残基がグリシンまたはアラニンと置 換される；および（ｇ）54位から60位または118位から166位（配列番号４の番号 付けに従う）の１つまたはより多くの残基がリジン、グルタミン酸、システイン 、またはプロリンと置換される。 本発明の好ましいヒトOBポリペプチド短縮型（truncated）アナログは、以下 であることを包含する（配列番号４の番号付けに従う）：（ａ）121位から128位 の１つまたはより多くの残基が欠失される；（ｂ）１〜116位の残基が欠失され る；（ｃ）１〜21位および54〜167位の残基が欠失される；（ｄ）１〜60位およ び117〜167位の残基が欠失される；（ｅ）１〜60位の残基が欠失される；（ｆ） １〜53位の残基が欠失される；および（ｇ）１〜21位の残基が欠失されるサブパ ート（subpart）（ａ）のアナログ。21アミノ酸「シグナル」配列（例えば配列 番号４の１〜21位のアミノ酸）を欠く本発明のOBポリペプチドおよびOBポリペプ チドアナログは、以下のようなＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有する： （１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配 列番号３８）、（３）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒ スチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン −グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒ スチジン−メチオニン配列（配列番号９８）、（４）ロイシン−グルタミン酸− リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（ 配列番号２６）、（５）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列 （配列番号２７）、（６）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（ 配列番号２８）、（７）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン− ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリ ン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン− プロリン配列（配列番号９９）、および（８）グリシン−セリン−プロリン配列 。 本発明のOBポリペプチドの誘導体は、そこに結合している１つまたはそれより 多くの化学部分を有し、この化学部分は、水溶性ポリマー（例えばポリエチレン グリコール）を包含する。ポリエチレングリコール誘導体は、モノPEG化、ジPEG 化、トリPEG化、またはテトラPEG化であり得、例えばＮ末端モノPEG化であり得 る。本発明のOBポリペプチドの好ましいＮ末端モノPEG化誘導体は、配列番号４ の22位から167位のアミノ酸残基または配列番号６の22位から166位の残基を含み 、必要に応じて21位に（PEG化）メチオニンを有するOBポリペプチドである。 本発明により提供される単離された核酸分子は、上記のようなOBポリペプチド 、対立遺伝子変異体、またはアナログ（それらのフラグメントを包含する）をコ ードする。哺乳動物の体重を調整する生物学的活性を有するOBポリペプチドの発 現を得るために用いられるDNA分子であって、以下からなる群から選択される、D NA分子が特に提供される：（ａ）配列番号１および３に記載のDNA分子またはそ れらのフラグメント；（ｂ）（ａ）に定義したDNA分子とハイブリダイズするDNA 分子またはそれらのハイブリダイズし得るフラグメント；および（ｃ）該DNA分 子のいずれかによりコードされるアミノ酸配列の発現をコードするDNA分子。こ のような分子の例示は、配列番号２２および２４のヒトゲノムDNA分子である。 本発明の好ましいDNA分子は、以下に記載されるアミノ酸配列からなる群から 選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする：（ａ）配列番号２ ；（ｂ）配列番号２の22位から167位のアミノ酸；（ｃ）配列番号４；（ｄ）配 列番号４の22位から167位のアミノ酸；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号５の2 2位から166位のアミノ酸；および（ｇ）配列番号６；および（ｈ）配列番号６の 22位から166位のアミノ酸、ならびに既に記載したようなＮ末端アミノ酸または アミノ酸配列を有するポリペプチド。例示的には、好ましいDNA分子は、配列番 号３のタンパク質コード配列として記載される配列、および特に配列番号３の22 位から167位のアミノ酸をコードする配列として記載される配列を有する。 本発明のDNA分子にハイブリダイズし得る検出可能な標識をされた核酸分子も また提供され、そしてOB核酸の非コード領域にハイブリダイズし得る核酸分子（ 非コード領域はイントロン、５’非コード領域、および３’非コード領域からな る群から選択される）を包含する。本発明はまた、OBポリペプチドをコードする ヒトゲノムDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、この ようなオリゴヌクレオチドは、配列番号２９から３２に記載される。 本発明により提供されるベクターは、上記の本発明のDNA分子を含み、そして 好ましくは、発現制御配列と作動可能に関連されたDNA分子を含む発現ベクター の形態を有する。本発明の単細胞宿主細胞は、本発明のDNA分子または上記のベ クターでトランスフォームまたはトランスフェクトされる。好ましい宿主細胞は 、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養におけるヒ ト細胞を包含する。例示的には、このような宿主細胞は、E．coli、Pseudomonas 、Bacillus、Streptomyces、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、B SC40、BMT10、およびSf9細胞からなる群から選択される。本発明に好ましい酵母 細胞は、Saccharomyces、Pichia、Candida、Hansenula、およびTorulopsisを包 含する。OBポリペプチドをコードするDNA配列を含み、そして該OBポリペプチド をコードする配列に対して機能的に近接した位置に発現調節配列を挿入すること からなる相同組換え事象によって、OBポリペプチドの高発現を可能にするように インビトロで改変された哺乳動物細胞もまた提供される。この発現調節配列は、 OBポリペプチド発現調節配列またはそれ以外であり得、そして細胞内で変異OBポ リ ペプチド制御配列と置き換え得る。 本発明は、以下の工程を包含するOBポリペプチドを調製する方法を提供する： （ａ）上記の細胞をOBポリペプチドの発現を提供する条件下で培養する工程；お よび（ｂ）発現されたOBポリペプチドを回収する工程。この手順はまた、以下に よる工程を伴い得る：（ｃ）上記ポリペプチドをNiキレートカラムでのクロマト グラフィーにかける工程；および（ｄ）上記ポリペプチドをゲル濾過により精製 する工程。好ましい実施態様では、工程（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、この方法 は、OBポリペプチドを強陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかける工 程を包含する。 本発明はまた、本発明のOBポリペプチドに特異的な標識および非標識モノクロ ーナルおよびポリクローナル抗体ならびに本発明のモノクローナル抗体を生産す る不死化細胞系を提供する。本発明の抗体調製は、以下の工程を包含する：（ａ ）OBポリペプチドをキャリアタンパク質に複合体化（conjugate）させる工程； （ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のOBポリペプチドフラグメント−キ ャリアタンパク質複合体で宿主動物を免疫する工程；および（ｃ）免疫された宿 主動物から抗体を得る工程。 本発明はまた、以下の工程を包含する、試料においてOBポリペプチドの存在を 測定する方法を提供する：（ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料を、 該OBポリペプチドに特異的に結合する抗体と、抗体およびOBポリペプチドを含む 反応複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程；および（ｂ）抗体およ び試料中のOBポリペプチドを含む反応複合体の形成を検出する工程（ここで該反 応複合体の形成の検出が該試料におけるOBポリペプチドの存在を示す）。以下の 工程を包含する、生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルを評価するインビ トロ方法が、対応して提供される：（ａ）上記の方法に従って、生物学的試料に おける反応複合体の形成を検出する工程；および（ｂ）形成された反応複合体の 量を評価する工程（ここで反応複合体の量は、生物学的試料におけるOBポリペプ チドレベルに対応する）。本発明によりOBポリペプチドの上昇または低下に関連 した疾患の存在を検出または診断する場合、上記の評価が行われ、そして検出さ れたレベルが、正常被験体または初期の被験体に存在するOBポリペプチドレベル と比較される。正常または以前のレベルに比較したOBポリペプチドレベルの上昇 はOBポリペプチドレベルの上昇に関連した疾患を示し、そして正常レベルに比較 したOBポリペプチドレベルの低下はOBポリペプチドレベルの低下に関連した疾患 を示す。哺乳動物被験体におけるOBポリペプチドのレベルの上昇または低下と関 連した疾患の治療処置をモニターするインビトロ方法が対応して提供され、これ は、上記のようにしてOBポリペプチドの上昇または低下に関連した疾患について 治療処置を受ける哺乳動物被験体から異なる時点で得られた一連の生物学的試料 におけるOBポリペプチドレベルを評価する工程を包含する。 本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと共に上記のOBポリペ プチドを含み、動物の体重を減少させるための治療方法において有用である。動 物の体重を増大させるための治療方法において有用な本発明の別の薬学的組成物 は、OBポリペプチドのアンタゴニストを包含し、このアンタゴニストは、好まし くはOBポリペプチドに結合しそしてその活性を中和する抗体、該OBポリペプチド のレセプターに結合するがこれを活性化しないOBポリペプチドのフラグメント、 および該OBポリペプチドの小分子アンタゴニストからなる群から選択される。本 発明はまた、個体の体重を減少または増大させるための、対応する体型改善美容 組成物を提供し、これは、個体の体型を改善するための美容方法において有用で ある。このような美容組成物は、個体に、個体の体重を所望のレベルに調整する に十分な用量で投与される。 動物の体重調整（例えば遺伝子治療）のための医薬品の製造のための、本発明 の核酸分子ならびに本発明OBポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズし 得るアンチセンス核酸分子の使用についても、本発明によって述べられている。 動物の体重を改変するための医薬品の製造のための本発明のOBポリペプチドまた はアンタゴニストの使用もまた提供される。そのように開発された医薬品は、糖 尿病、高血圧、および高コレステロール症からなる群から選択される障害の処置 における、およびこのような障害の処置のための医薬品との組み合わせ療法の一 部としての、哺乳動物の体重を改変するための医薬品の製造のために用いられ得 る。このような医薬品は、静脈内送達系、動脈内送達系、腹腔内送達系、筋内送 達系、皮下送達系、鼻内送達系、経口送達系、または肺送達系において用いられ 得る。 本明細書で示したデータは、本発明のOBポリペプチドはそれら自身の形態で主 として哺乳動物脂肪細胞（adipocyte）から分泌され、そしてこのポリペプチド はホルモンとして機能することを示す。 本明細書中の実施例は、OBポリペプチド（あるいは本明細書中で「レプチン(l eptin)」と呼ばれる）がマウス、ラット、およびヒトの血漿中を循環することを 示している。レプチンはob/obマウス由来の血漿には存在せず、db/dbマウス由来 の血漿では10倍高い濃度で存在し、そしてfa/faラットでは20倍高い濃度で存在 する。最も重要なことには、組換えレプチンの毎日の注射により、ob/obマウス の体重は劇的に減少し、野生型マウスの体重は大きな影響を及ぼされ、そしてdb /dbマウスは全く影響を受けない。 さらなる局面では、１つの種に由来するOBポリペプチドが他の種において生物 学的に活性である。特に、ヒトOBポリペプチドはマウスにおいて活性である。 第１の場合では、本発明のモジュレーターは、本明細書中で定義されたように それ自身が体重制御のモジュレーターとして働くポリペプチド（このポリペプチ ドは、図１Ａ〜Ｅ（配列番号２）、図３（配列番号４）、図５（配列番号５）、 および図６（配列番号６）に記載されるようなアミノ酸配列を有する）、または それらの保存的変異体またはフラグメント、特にシグナルペプチドを欠くフラグ メント（あるいは本明細書中で成熟OBポリペプチドと呼ばれる）をコードする核 酸分子を含む。この核酸分子は、組換えDNA分子（例えばcDNA、またはcDNAまた は単離されたゲノムDNAを含有するベクター）またはクローン化遺伝子（すなわ ち単離されたゲノムDNA）、あるいはそれらの変質性（degenerate）変異体を包 含する。特定の実施態様では、マウスおよびヒトのOBポリペプチドの２つの変異 体に対するアミノ酸配列が提供される。両ポリペプチドは、49位のグルタミンが 欠失した形態で見出される。これは、mRNAスプライシングの例外から生じ得る。 種々の種に由来するOBポリペプチドは高度に相同性であり得る；図４に示される ように、マウスおよびヒトのOBポリペプチドは、80％以上相同である。 この核酸分子（組換えDNA分子またはクローン化遺伝子）は、図１Ａ〜Ｅ（配 列番号１）および図２ＡおよびＢ（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列を 有し得るか、DNAコード配列に相補的であり得る。特に、このようなDNA分子は、 cDNAまたは染色体から単離されたゲノムDNAであり得る。本発明の核酸分子はま た、DNAの５’および３’フランキング配列ならびにイントロンDNA配列に相当し 得る。従って、本発明はまた、本願において図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）および図 ２ＡおよびＢ（配列番号３）に示される配列、および変質性変異体、対立遺伝子 変異、ならびに同様の同族分子から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸の 同定に関する。 本発明の核酸分子は、DNAまたはRNAであり得、これはリン酸結合またはリン酸 アナログ（例えばチオリン酸）結合を有する合成変異体を包含する。一本鎖およ び二本鎖の両配列が、本明細書中で意図される。 本発明はさらに、分子プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のプ ライマーとして用いられる核酸分子、すなわち図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）、図２ ＡおよびＢ（配列番号３）、および図２０Ａ〜Ｃ（配列番号２２および２４）に 示される配列；またはコード配列の５’および３’フランキング配列；またはゲ ノムDNAのイントロン配列の一部分に相当する配列を有する合成または天然のオ リゴヌクレオチド、を提供する。特に、本発明は、少なくとも約10ヌクレオチド を有する核酸分子を意図し、ここでこの核酸分子の配列は、図１Ａ〜Ｅ（配列番 号１）、図２ＡおよびＢ（配列番号３）、および図２０Ａ〜Ｃ（配列番号２２） のヌクレオチド配列中の同じヌクレオチド数のヌクレオチド配列、またはそれに 相補的な配列に相当する。より好ましくは、この分子の核酸配列は少なくとも15 ヌクレオチドを有する。最も好ましくは、この核酸配列は少なくとも20ヌクレオ チドを有する。オリゴヌクレオチドがプローブである本発明の実施態様では、オ リゴヌクレオチドは、例えば放射性核種（例えば32P）または酵素で検出可能に 標識される。 さらなる局面では、本発明は、クローニングベクター（OBポリペプチドをコー ドする本発明の核酸を含む）；および細菌発現ベクター、昆虫発現ベクター、ま たは哺乳動物発現ベクター（発現制御配列と作動可能に関連させて、OBポリペプ チドをコードする本発明の核酸分子を含む）を提供する。従って、本発明はさら に、適切な発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスフォームされた宿主 細胞（例えば細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）、および対 応して、本発明のモジュレーターの調製における上記構築物の使用に関する。 なおさらなる局面では、本発明は、OBポリペプチドに結合する抗体に関する。 このような抗体は、完全長ポリペプチドまたはそれらの抗原性フラグメントに対 して生成され得る。１つの局面では、このような抗体は、OBポリペプチドの機能 的（すなわち体重および脂肪組成を調整する）活性を阻害する。別の局面では、 抗体は、血漿または血清中の循環OBポリペプチドレベルを決定するために用いら れ得る。なおさらなる局面では、領域特異的抗体（特にモノクローナル抗体）が 、OBポリペプチド構造のプローブとして用いられ得る。 前述の全ての物質が、体重および脂肪組成のモジュレーターとして考慮される べきであり、そしてこのような物質は種々の背景で用いられ得る。詳細には、本 発明は、診断および治療の両適用、ならびに特定の農業適用、本明細書で定義さ れるモジュレーター（核酸分子およびペプチドを包含する）の使用の可能性のあ る全てを意図する。さらに、体重の調整は特定の治療含意および利益を有する。 それは、肥満症または逆に悪液質が望ましくない身体状態を示すような状態が、 本発明の１つまたはそれより多くのモジュレーターの投与により治療され得る状 態においてである。 従って、哺乳動物の体重を調整する方法が提案されており、これは、図１Ａ〜 Ｅ（配列番号１）の配列、図２ＡおよびＢ（配列番号３）の配列およびそれらの 変質性変異体および対立遺伝子変異体から選択されるヌクレオチド配列を有する 核酸によりコードされるタンパク質の発現を制御する工程を包含する。このよう な制御は、遺伝子治療により目的のヌクレオチドを患者または宿主の脂肪細胞中 に導入し、肥満症を制御または低減させることによりもたらされ得る。逆に、ヌ クレオチドに対するアンタゴニスト（例えばアンチセンス分子）の調製および投 与は、過度の体重損失を包含する状態（例えば神経性食欲不振、癌、またはAIDS ）が存在しそしてその治療下にある場合においてその必要が示され、続行される 。このような構築物は、ヌクレオチドの場合と同様に直接脂肪細胞に導入されて 、このような変化を生じさせ得る。 対応して、図１Ａ〜Ｅ、３、５、および６（配列番号１、配列番号４、配列番 号５、および配列番号６）により定義されるタンパク質、それらの保存的変異体 、活性フラグメント、および同族小分子は、治療目的のために、直接投与用に処 方され、過度の体脂質または体重増加の減少または制御をもたらし得る。対応し て、上述のタンパク質物質（例えばそれらのフラグメント）に対する抗体および 他のアンタゴニストが調製され、そして同様に投与されて、逆の効果を達成し得 る。従って、本発明は、好都合に、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と 混合して、本発明のOBポリペプチド、または別の場合はそのアンタゴニストを含 む薬学的組成物に関する。 さらに、本発明のOBポリペプチドは、その美容効果、例えば脂肪蓄積を減少さ せることによる体型改善のために投与され得る。OBポリペプチドは、その美容効 果のために、独立にまたは他の美容戦略（例えば手術）と併用して用いられ得る 。 本発明のヌクレオチドおよび対応ペプチドの診断用途は、診断および治療の両 適用に有用な活性ヌクレオチド物質のレパートリーを開発するために、その対立 遺伝子変異体のさらなる変異を同定するためのその核酸の使用に及ぶ。特に、目 的のヌクレオチドの同型接合変異および異型接合変異が同定され、それにより患 者の状態をより正確に定量化すると仮定され、肥満症に対する個体の危険状態潜 在性を決定し得る。詳細には、異型接合変異は現在、軽度から中度の肥満症に関 連しているとみなされ、一方、同型接合変異はより顕著な重度の肥満状態に関連 し得る。対応するDNA試験が、次いで上述の確定された物質を水準基標として用 いて行われ、特定の体質に対する的確な長期予後を容易にし、食事習慣または他 の個人的習慣の変更、あるいは直接治療介入を規定し得、このような状態を避け 得る。 本発明の診断利用は、試験被験体から採取した細胞試料または生物学的抽出物 （または試料）における本発明のモジュレーターの存在および量を測定する方法 に及び、そこでこのような試験試料における核酸（ゲノムDNAまたはmRNA）およ び／またはタンパク質レベルが確定され得る。ヌクレオチドの活性増大およびそ の結果生じるタンパク質の存在が被験体の肥満症阻害能を反映するとした場合、 肥満性被験体においてこのような結果を観察する医師は、本発明のヌクレオチド の存在および活性に関する機能不全以外の要因が肥満状態の原因であると決定し 得る。逆に、ヌクレオチドおよび／または発現タンパク質のレベルの低下は、こ のような肥満状態を治療するためにはこのようなレベルが増大しなければならな いことを示唆し、次いで適切な治療養生法が行われ得る。 さらに、見出されそして図１Ａ〜Ｅおよび２ＡおよびＢにおいて示されたヌク レオチドは、上記で簡単に述べたように、対応するRNAの測定に有用であるcDNA を表す。同様に、図１Ａ〜Ｅおよび３のポリペプチドに相当する組換えタンパク 質物質が調製され、そして、例えばOBタンパク質の脂肪および／または血漿レベ ルの測定、または組織（例えば視床下部）上のOBに対するレセプターの存在およ びレベルの検出のための、例えばラジオイムノアッセイにおける使用のために適 切に標識され得る。 さらに、本発明は、本明細書中に示されたヌクレオチドおよび対応するタンパ ク質の同定だけでなく、このような物質に対するレセプターの明示もまた意図す る。このような背景において、図１Ａ〜Ｅ、３、５、および／または６のポリペ プチドが調製され得、適切な発現ライブラリーをスクリーニングして活性なレセ プターを単離するために利用され得る。このレセプターはその後クローン化され 得、そしてその後レセプター単独で、またはリガンドと併用して、本明細書中の モジュレーターと同様の活性を有し得る小分子をスクリーニングするのに用いら れ得る。 さらに、本発明は、本明細書において特定のモジュレーター、好ましくはその ような治療が適切である種々の投与様式の製剤形態において調製された、その配 列が配列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に示されるポリペ プチド、それらの抗体、それらの対応する小分子アゴニストまたはアンタゴニス ト、または活性フラグメントを含む薬学的組成物に関する。このような製剤形態 は、薬学的に受容可能なキャリア、または必要に応じて他のアジュバントを含み 、そして各場合において臨床医または医師により決定される有効用量範囲で調製 され得る。 従って、本発明の主要な目的は、本明細書中で定義されるような精製形態の体 重モジュレーターを提供することであり、このモジュレーターは、哺乳動物の脂 肪蓄積および脂肪含量の制御および変動に関連した特定の特徴および活性を示す 。 本発明のさらなる目的は、このようなモジュレーターのレベルの変動が特徴的 な性質であるかまたはあり得る病理学的状態の有効な診断およびモニタリングの 手段として、本明細書中に記載したような体重制御のモジュレーターの検出およ び測定方法を提供することである。 本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物において本発明のモジュレーターの活 性を模倣または阻害するに潜在的に有効な物質（例えば、薬剤、因子など）のス クリーニングのための方法および関連アッセイシステムを提供することである。 本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物において体重および脂肪含量を制御し 、そして／または体重の異常低下または異常上昇が特徴的な性質である特定の病 理学的状態を治療するための哺乳動物の処置方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、遺伝子治療プロトコルにおいて用いられる遺伝子構 築物、および／または１つまたはそれより多くのモジュレーター、結合パートナ ー、またはそれらの生産を制御し得るか、またはそれらの活性を模倣または拮抗 し得る因子を含むか、またはこれに基づく、同等の治療方法のための薬学的組成 物を調製することである。 他の目的および利点は、以下の例示の図面に関連して進行する続く記載を検討 することにより、当業者には明らかである。 図面の簡単な説明 図１(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導される核酸配列(配列番号1)および 推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167ア ミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kbの3'非翻訳配列が続く。(既 に1994年11月30日出願の出願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/43 8,431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続いて決定され、クロー ニングアーチファクトとされた。このアーチファクトは、コード領域、図1に示 されている39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード領域とは関係が ない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対のすべてを示す。観察およびSigSeqコンピ ュータプログラムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナル配列の 存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(microheterogeneity)が認められ、約7 0%のcDNAがコドン49にグルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった(以 下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下線を付し、C57BL/6J ob/ob マウス(1Jマウス)内で変異しているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。 図２(AおよびB)は、ヒトOB cDNAについて誘導された核酸配列(配列番号3)を示 す。ヌクレオチドには1〜701の番号を付し、開始部位はヌクレオチド46で終始は ヌクレオチド550である。 図３は、図2AおよびBの核酸配列に対応するヒトOB遺伝子について誘導された 全推定アミノ酸配列(配列番号4)を示す。アミノ酸には1〜167の番号を付す。シ グナル配列切断部位がアミノ酸21(Ala)の後に位置し、このため成熟タンパク質 がアミノ酸22(Val)からアミノ酸167(Cys)に伸長している。 図４は、マウス(配列番号２)とヒト(配列番号４)との推定アミノ酸配列間の比 較を示す。ヒトOB推定アミノ酸配列の配列は、マウスの配列に対して高度に相同 性である。保存的変化を破線で、そして非保存的変化をアステリスクで示す。可 変のグルタミンのコドンには下線を付し、これはC57BL/6J ob/ob(1J)マウスのナ ンセンス変異の位置にも同様に下線を付す。全体的では、アミノ酸レベルで83% の同一性があるが、コドン22のバリン(シグナル配列切断(overage)のすぐ下流と 117位のシステインとの間には8個の置換しか見出されなかった。 図５は、図３に示されたマウスOB遺伝子について誘導される全長アミノ酸配列 (配列番号5)であるが、グルタミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には1〜16 6の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21(Ala)の後(つまりグルタミ ン酸49欠失の前方)に位置し、このため成熟タンパク質がアミノ酸22(Val)からア ミノ酸166(Cys)に伸長している。 図６は、図４に示されたヒトOB遺伝子について誘導される全長推定アミノ酸配 列(配列番号6)であるがグルタミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には1〜16 6の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21(Ala)の後(つまりグルタミ ン酸49欠失の前方)に位置し、このため成熟タンパク質がアミノ酸22(Val)からア ミノ酸166(Cys)に伸長している。 図７。(A)マウス染色体におけるobの位置の物理地図ならびにYACおよびP1クロ ーニング地図。「MおよびN」はMulIおよびNotI制限部位に対応する。数字は、評価 された1606減数分裂中のobの領域において組み換えた個々の動物に対応する。Me t、Pax 4、D6Rck39、D6Rck13、およびCpaは、DNAプローブに結合するobの領域内 の位置を意味する。D6Rack13およびPax‐4を用いてYACを単離し、そしてベクト レット(vectorette)PCRおよび/またはプラスミドエンドレスキュー(plasmid end rescue)を用いて末端を回収し、そして順次新たなYACを単離するために使用し た。(B)得られたYACコンティグ(contig)。このコンティグにおけるYACの1つ(Y90 2A0925)はキメラであった。組換え動物の遺伝子型を決定するために使用したプ ローブのそれぞれを括弧内に示す。(6)はYAC107に対応する;(5)はM16(+)(または M16(pLUS))に対応する;(4)はadu(+)に対応する;(3)はaad(pICL)に対応する;(2) は53(pICL)に対応する;そして(1)は53(+)に対応する。(C)選択されたYAC末端プ ローブにより単離されるバクテリオファージP1のP1コンティグ。YAC YB6S2F12の 遠位末端(末端(4))(あるいは、本明細書中においてadu(+)と呼ぶ)を用いて、単 離されたP1クローンにおいてob遺伝子を単離した。 図８は、第４エキソンのトラッピング実験の192個の個々の単離物(PCRで増幅 し、そして特徴付けした)のエチジウムブロミド染色の写真を示す。 図９は、obを有していると思われるPCR増幅クローンのエチジウムブロミド染 色の写真である。アーチファクトを有さない７個のクローンのそれぞれをPCRを 用いて再増幅し、そしてTBE中の１%アガロースゲル上で電気泳動し、そしてエチ ジウムブロミドで染色した。サイズマーカー(最も左側の番号を付していないレ ーン)は市販の「1kBラダー」である。レーン１--「HIV配列」を含有するクローン1D1 2。レーン２‐‐クローン1F1、ob領域外の新規のクローン。レーン３‐‐クロー ン1H3。レーン４‐‐クローン2B2(1F1と同一)。レーン５‐‐クローン2G7(obエ キソンを含有)。レーン６‐‐クローン2G11(1F1と同一)。レーン７‐‐クローン 2H1(挿入物を含有しない)。 図10は、OB遺伝子の一部をコードするエキソンを含む2G7クローン(配列番号７ )の配列を示す。このエキソンの増幅に使用したプライマー配列を図の枠内に示 す(配列番号８および９)。 図11(A)2G7プライマーおよびアクチンプライマーを用いた同マウスの異なる組 織由来のmRNAの逆転写PCR分析。第1鎖cDNA合成用プライマーとして、オリゴdTを 用いて逆転写した100ngの全RNAを用い、RT‐PCR反応を実施した。PCR増幅を、94 ℃の熱変性1分間、55℃のハイブリダイゼーション１分間、１サイクルあたり１ 秒間の自動延長を含む72℃の伸長2分間で35サイクル実施した。RT‐PCR産物を１ ×TBE緩衝液中で泳動した2%低融点アガロースゲル内で分離した。(B)プローブと してPCR標識2G7を用いるマウスの異なる器官由来のmRNAのノーザンブロット。各 組織由来の全RNAの10μgを、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲル上で電気泳 動した。プローブを65℃でRapid Hybe(Amersham)内でハイブリダイズした。暴露 の1時間後にオートラジオグラフシグナルが出現した;示す実験は、24時間暴露の 結果である。 図12(A)記載される各マウス株由来の脂肪細胞(白色脂肪組織)RNA上でのRT‐PC R反応からのエチジウムブロミド染色。各サンプルに対する全RNA(100ng)を、オ リゴdTおよび逆転写酵素を用いて逆転写し、そして得られた一本鎖cDNAを2G7プ ライマー(下のバンド)またはアクチンプライマー(上のバンド)でPCR増幅した。2 G7プライマーおよびアクチンプライマーの両方は、同一のPCR反応に含まれた。 産物を1%アガロースTBEゲル上で泳動した。(B)(A)に対応するノーザン分析。示 される各株由来の脂肪細胞(白色脂肪組織)RNAの10μgを泳動し、そして上の図11 BのPCR標識2G7プローブで検出した。2G7 mRNAのレベルにおける約20倍の増加がC 57BL/6J ob/ob(1J)株由来の白色脂肪において、痩身型同腹子に比較して明白で あった。RT‐PCRおよびノーザン実験の両方において、SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J )マウス由来の2G7 RNAの検出し得るシグナルは、2週間の暴露後でも存在しなか った。24時間のオートラジオグラフ暴露が示される。同じフィルターをアクチン プローブに対してハイブリダイズした(パネル下部)。 図13は、さらなる2J動物およびコントロール動物のノーザンブロット分析であ り、ここで2J動物由来のob mRNAがないことを確認している。ノーザン分析は、 図11および12の通りに実施した。この場合、コントロールRNAはap2(脂肪特異的 転写物)であった。ap2のバンドの密度の変化に有意性は認められない。 図14は、変異株のcDNAにおける未成熟な終始コドン(ナンセンス変異)の導入を 引き起こす点突然変異の領域において、C57BL/6J(正常)マウスとC57BL/6J ob/ob (1J)マウスのDNA配列を比較している。ob/obマウスは、105位のアルギニン残基 を変化させるC→T変異を有する。この塩基の変化は、自動DNAシークエンサーか らの出力として示される。5'および3'非翻訳領域由来のプライマーを用いて両株 (+/+およびob/ob)由来の自色脂肪のRNAを用いるRT‐PCRを実施した。PCR反応産 物をゲル精製し、そしてコード配列の両鎖に沿ったプライマーを用いて直接手動 で、およびApplied Biosystems,Inc.373A自動シークエンサーを用いて配列を決 定した。 図15(A)記載される各マウス株由来のゲノムDNAのサザンブロット。約５μgのD NA(肝臓、腎臓、または脾臓から調製されるゲノムDNAに由来する)を示された制 限酵素で制限消化した。DNAを、次に1%アガロースTBEゲル内で電気泳動し、そし てPCR標識2G7プローブで検出した。BglIIによる制限消化は、SM/Ckc-+Dacob2J/o b2J(2J)DNAにおいて約9kB(最大)のBglIIフラグメントのサイズの増大があること を示した。RFLPは、他のいずれの制限酵素でも検出されなかった。ゲノムDNAの 予備制限マッピングは、多型のBglII部位が転写開始部位の約7kB上流にあること を示した。試験を行った他のいずれの酵素でもmRNA開始部位を越えるものはない 。(B)SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J株におけるBglII多型の分離。(A)に示されたBglII多 型を評価することによって、類似遺伝子型のSM/Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J)コロニー の同世代由来の6匹の肥満型の子孫および5匹の痩身型の子孫の遺伝子型を決定し た。表現型上で肥満型の動物のすべてが、多型BglIIフラグメントの大きい方の 対立遺伝子に対してホモ接合型であった。「コントロール」レーンのDNAを、SM/ck c-+Dacob2J/ob2Jコロニーとは別に飼育した血縁の無いSM/Ckc-+Dac+/+マウスか ら調製した。 図16は、記載される種由来のEcoRI消化ゲノムDNAのサザンブロットであり、プ ローブとしてOB cDNAを用いている(即ち動物ブロット)。中程度にストリンジェ ントなハイブリダイゼーション後でも、すべての脊椎動物サンプルにおいてハイ ブリダイゼーションシグナルが検出された。本実験のネコDNAは僅かに分解して いた。制限されたDNAを1%アガロースTBEゲル上で泳動し、そしてプローブ分析用 にimobilon膜に移した。65℃でフィルターをハイブリダイズし、そして2×SSC/0 .2%SDS中65℃で2回、20分間洗浄し、そしてKodak(Rochester,N.Y.)X‐OMATフィ ルムを用いて3日間暴露した。 図17は、ベクターpET‐15b(Novagen)の発現クローニング領域(配列番号11およ び12)を示す。 図18は、His‐tagに対する組換え成熟マウスob融合体(A)、およびHis‐tagに 対する組換え成熟ヒトOB融合体(B)に関するHis‐結合樹脂(Ni)カラムからの溶出 物の分析を示す。細菌をベクターpETM9およびpETH14でそれぞれトランスフォー ムした。至適条件での１mM IPTGによる誘導において、トランスフォームされた 細菌は、まず封入体(inclusion body)中に、100-300μg/mlのOB融合タンパク質 を生産し得た。インクルージョンボディを６Mグアニジン‐HClまたは尿素で可溶 化し、そして融合タンパク質(溶解物上清に存在する)を尿素を含む10mlの1×結 合緩衝液中のHis‐結合樹脂(Ni)カラムに添加した。カラムを、５mlアリコート の20μM、60μM、および300μMイミダゾールで段階的に溶出し、最後にストリッ プ(strip)緩衝液で溶出した。そのアリコートを、15%アクリルアミドゲル上でOB ポリペプチド融合体の存在について分析した。各レーンは、100μlの細菌抽出物 の同等物を含む。 図19(A)OB RNAのインビトロ翻訳。ヒトOB cDNAをpGEMベクターにサブクローニ ングした。プラスミドを線状化し、そしてSp6ポリメラーゼを用いて＋鎖RNAを合 成した。インビトロで合成されたRNAを、イヌ膵ミクロソーム膜の存在または非 存在下で翻訳した。インビトロ翻訳後に、約18kDの一次翻訳産物が認められた。 ミクロソーム膜を反応物に添加すると、一次翻訳産物より約2kD小さい第2の翻訳 産物が出現した。コードされたシグナル配列を欠くインターロイキン-1αRNAの 翻訳産物のサイズは、ミクロソーム膜の添加によっては変化しなかった。これら のデータは、機能的シグナル配列の存在を示す。(B)プロテイナーゼKの存在また は非存在下でのインビトロ翻訳。プロテアーゼ処理により、18kD一次翻訳産物の 完全な蛋白質分解を得たが、16kDのプロセスを受けた形態は影響を受けなかった 。0.1%TRITON‐X100によるミクロソームの透過化は、プロセスを受けた形態をプ ロテアーゼ感受性にした。これらの結果は、この産物がミクロソームの内腔へ翻 訳していたことを示す。 図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号22および24)。(F)マウスOB遺伝子の 概略図。(G)ヒトOB遺伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コドン および終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子における、マウスの第１イントロン に相同的な第１イントロンの証拠は認められないが、その存在は否定できない。 図21は、Pichia酵母におけるOBの組換え発現を達成するために用いたクローニ ングストラテジーの一つの概略図を示す。(A)α-接合因子シグナル配列を有する OBの発現ベクター。(B)組換え融合タンパク質構造の概略図で、XhoI部位、なら びに推定KEX‐2およびSTE-13切断部位を示したアミノ酸配列(配列番号26)、およ びKEX‐2切断後に存在するN末端余剰アミノ酸(配列番号27)を含む。(C)成熟OBを 生産するための別のストラテジーは、成熟obポリペプチド配列のすぐ上流のXhoI 切断部位およびKEX-2切断部位に対応するアミノ酸配列(配列番号28)を有する構 築物を調製する工程を包含する。 図22 Pichiaにおける別の発現ストラテジー。(A)α-接合因子シグナル配列制 御下で、pET発現系から採用されたHis‐tagを含有するOB融合体の発現ベクター( 配列番号33)。(B)His‐tagを含有する組換えOB融合タンパク質構造の概略図で、 α‐接合因子シグナル配列、推測KEX‐2およびSTE‐13切断部位、His‐tag、お よびトロンビン切断部位を含み、3つの余剰N末端アミノ酸残基を伴うOBを産出す る。 図23(A)トランスフォームされたpichia酵母におけるマウスOB(両微小不均一性 形態、即ち、Gln49を含有する形態および含有しない形態)の発現のPAGE分析。約 16kDの予想バンドが、トランスフォームされた酵母培養液において認められる(2 番目および3番目のレーン)が、トランスフォームされていない酵母の培養液では 認められない(1番目のレーン)。(B)カルボキシメチルセルロース(弱い陽イオン 交換体)上の部分精製組換えOBポリペプチドのPAGE分析。約16kDのバンドは、カ ラムから250mM NaClで溶出された画分3および4においてよく認められる。レーン １‐‐添加されたサンプル;レーン2‐‐素通り；レーン３〜５‐‐250mM NaClに よる溶出画分。 図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循環することを示す。(A)マウス血液 からの免疫沈降。0.5mlのマウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明にし、 そしてセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗OB抗体と一晩インキュベート した。免疫沈降物を15%SDS‐PAGEゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗 OB抗体でウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16kDの分子量で、酵母で 発現された成熟マウスobタンパク質と同じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマ ウス由来の血漿にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB/Ks db/dbマウ ス由来の血漿では、野生型マウスに比較して10倍増加した。dbマウスは、OBタン パク質を過剰生産することが示唆されており、またそれに伴いその効果に対する 耐性も示唆されている。(B)脂肪過多ラットにおけるOBレベルの増加。脂肪過多 ラットは、ラット第5染色体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データは 、dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆している。脂肪過多ラットお よび痩身型の同腹子由来の血漿を免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳 動した。OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認められた。(C)。マウス 血漿におけるOBタンパク質の定量。組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス 由来の100λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロットのシグナ ルの強度を野生型マウス由来の100λの血漿からのシグナル強度と比較した。組 み換えタンパク質量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認められ、本免 疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが示された。同様のシグナルが野生 型血漿サンプルおよび2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、マ ウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであることが示された。(D)肥満組織抽 出物におけるOBタンパク質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスから調製した抽出物におい て16kDのタンパク質のレベルの増加を示した。 図25は、OBタンパク質が種々のレベルでヒト血漿中を循環することを示す。(A )ヒト血漿のウエスタンブロット。6名の痩身体型の志願者から血漿サンプルを得 た。免疫沈降およびウエスタンブロッティングは、免疫反応性の16kDのタンパク 質の存在を示し、このタンパク質は酵母で発現された組換え型の146アミノ酸ヒ トタンパク質とサイズが同一であった。6つのサンプルのそれぞれにおいて、一 定しないレベルのタンパク質が認められた。(B)ヒトobに対するELISA(酵素結合 イムノアッセイ)。マイクロタイタープレートを免疫精製抗ヒトOB抗体でコート した。既知量の組換えタンパク質をプレートに添加し、そして免疫精製ビオチン 化抗ob抗体を用いて検出した。414nmでの吸光度を既知濃度のOBに対してプロ ットし、標準曲線を作成した。得られた標準曲線は、このアッセイが1ng/mlまた はそれ以上のヒトOBタンパク質を検出可能であることを示した。(C)ヒト血漿に おけるOBタンパク質の定量。ELlSAイムノアッセイを、6名の痩身型志願者由来の 100スの血漿およびパネルBで使用した標準物を用いて実施した。HP1の２ng/ml〜 HP6の15ng/mlの範囲のOBタンパク質のレベルが認められた。これらのデータは、 パネルAのウエスタンブロットのデータと相関した。 図26は、OBタンパク質が分子間または分子内のジスルフィド結合を形成するこ とを示す。(A)還元および非還元条件下でのウエスタンブロット。マウスおよび ヒト血漿のウエスタンブロットを、還元剤をサンプル緩衝液に添加するかまたは せずに繰り返した。β‐メルカプトエタノールをサンプル緩衝液から除いた場合 は、db血漿由来の免疫沈降物が見かけの分子量16kDおよび32kDで泳動する。緩衝 液にβ-メルカプトエタノールを添加すると、32kDの部分が消失する(図24を参照 のこと)。この結果は酵母(Pichia pastoris)でマウスタンパク質を発現する場合 にも再現される。この場合、マウスOBタンパク質はダイマーの位置まで泳動する 。還元状態では、精製された組換えマウスタンパク質は、見かけの分子量16kDで 泳動することから、32kDの分子形態は１つまたは２つの分子間ジスルフィド結合 の結果であることが示される。インビボおよびPichia pastorisで発現されたヒ トタンパク質は、還元および非還元状態で、分子量16kDで泳動する(データ示さ ず)。(B)酵母内で発現されたヒトタンパク質は、分子内ジスルフィド結合を有す る。分泌されたタンパク質は、一般にPichia pastoris発現系で発現された場合 でも正確なコンフォーメーションをとる。146アミノ酸成熟ヒトタンパク質をPic hia pastorisで発現させ、そしてIMACおよびゲル濾過を含む２工程の精製プロト コールによって酵母培地から精製した。臭化シアン分解の前後に、精製組換えタ ンパク質を質量分析に供した。臭化シアンはメチオニン残基のカルボキシ端で切 断する。組換え酵母タンパク質の分子質量は、16,024±3Da(算出された分子質量 ＝16,024Da)であった。臭化シアンは、タンパク質配列中のアミノ酸75、89、お よび157の3つのメチオニンの後ろを切断する。測定された質量8435.6Daを有する 臭化シアンフラグメントは、cys-117とcys-167との間のジスルフィド結合で結合 したアミノ酸90〜157およびアミノ酸158〜167に対応する(算出された分子質量=8 434.5D a)。N.D.＝検出されず。 図27は、生物活性な組換えタンパク質の調製を示す。145アミノ酸成熟マウスO Bタンパク質に対応するヌクレオチド配列を、pET15b発現ベクターにクローン化 した。このpETベクターは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC )を用いた効率的な精製を可能にする、ポリヒスチジン領域(His‐tag)をクロー ン化配列の上流に挿入している。細菌溶解後、この組換え細菌タンパク質は、は じめ不溶性の膜画分に分配された。塩酸グアニジンを用いて膜画分を可溶化し、 そしてIMACカラム上に添加した。示されたように、イミダゾールの濃度を上昇し て段階的にタンパク質を溶出した。記載の通り、溶出したタンパク質を再フォー ルディング(refold)し、そしてトロンビンで処理してHis-tagを除去した。可溶 性タンパク質の最終収量は、45ng/ml細菌培養物であった。 図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示す。食物摂取(パネルA〜C)および体 重(パネルD〜F)の時間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタンパ ク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒丸)、または未処置(黒三角) のいずれかを受けた。処置グループは、C57B1/6J ob/obマウス(パネルAおよびD) 、C57B1/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+/+マウス(パネルCおよ びF)を含んだ。示した通り、マウスの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間 の間隔で記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マウス対obおよびd bマウスで異なる。)タンパク質を受けたobマウスの食物摂取は、最初の注入後に 滅少し、そして4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められたレベルの 約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これらの動物の体重は平均1.3グラム/日 減少し、そして3週間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.0001) 。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示されなかった。早期の2つの時点でC BA/Jマウスに、体重に対して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定 値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有意性を表1に示す。 図29は、obマウスのペアフィーディングの結果を示す。(A)4匹のC57B1/6J ob/ obマウスの群に、組換えタンパク質を受けたobマウスの群が消費した量に等しい 量の食物を与えた。両グループに対する重量の消失を、５、８、および12日後に 算出した。食物制限されたマウス(斜線バー)は、タンパク質を受けたobマウス (黒色バー)よりも少ない重量を消失した(p＜.02)。この結果は、OBタンパク質の 体重滅少効果が、食物摂取およびエネルギー消費両者に対する効果の結果である ことを示す。(B)処置されたobマウスの写真。2匹のC57B1/6J ob/obマウスを示す 。左側のマウスはPBSを受け、体重65グラム(開始時の重量)であった。右側のマ ウスは、組換えOBタンパク質の連日注入を受けた。この動物の開始時の重量も65 グラムで、そしてタンパク質処理の3週間後の重量は38グラムであった。(C)処理 および未処理obマウス由来の肝臓。処理および未処理のC57B1/6J ob/obマウス由 来の肝臓を示す。PBSを受けたマウス由来の肝臓は、脂肪過多肝臓の肉眼的外観 を有し、そして重量は5.04グラムであった。組換えobタンパク質を受けたマウス は、正常な外観を有し、そして重量は2.23グラムであった。 図30は、脂肪組織に対するobのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。 センスおよびアンチセンスOB RNAを、Sp6およびT7ポリメラーゼおよびジゴキシ ゲニン(digoxigenin)を用いて、インビトロで標識した。標識したRNAを、８週齢 のC57B1/Ksマウス(野生型と標示)およびC57B1/Ks db/dbマウス(dbと標示)の副睾 丸の脂肪パッド由来の脂肪組織のパラフィン埋包切片にハイブリダイズした。こ の図では、脂質小滴が細胞内の非染色空砲として認められる。細胞質は細胞周縁 部の薄い縁であり、そして細胞膜と区別できない。アンチセンスプローブを用い た場合のみ、この範囲におけるすべての脂肪細胞に対するハイブリダイゼーショ ンが、野生型切片において検出され、そしてdb/db動物由来の組織切片において 、かなり増加したレベルが認められた。 図31は、OB RNAが、インビボおよびインビトロで発現されることを示す。いく つかの異なる供給源由来の全RNA(10マイクログラム)を電気泳動してブロットし 、obプローブに対してハイブリダイズした。まず、コラゲナーゼ消化後、細胞浮 力の差を利用して脂肪細胞を精製した。OB RNAは脂肪細胞画分にのみ存在した。 レーンSは、間質血管画分を示し、そしてレーンAは脂肪細胞画分を示す。さらに 、未分化の3T3-442前脂質細胞ではOB RNAは発現されなかった(レーンU)。これら の細胞系統由来の分化脂質細胞は、明らかに検出可能なレベルのOB mRNAを発現 した(レーンD)。 図32は、すべての脂肪組織貯蔵所(depot)においてOB RNAが発現されたことを 示す。試験したすべての脂肪組織貯蔵所がob RNAを発現した。鼠蹊脂肪パッドは 、若干低いRNAを発現したが、種々の実験においてシグナルレベルの多様性が認 められた(図31A)。レーン(１)副睾丸脂肪パッド、(２)鼠蹊脂肪パッド、(３)腹 部脂肪パッド、(４)傍子宮脂肪パッド。褐色脂肪も低レベルのOB RNAを発現した (図31B)。褐色脂肪中のOB発現レベルは、４℃で１週間飼育された動物では変化 しなかったが、褐色特異的UCP RNAの量(低温誘導性で知られる)は５倍に増加し た。 図33は、db/dbおよび金チオグルコース処理マウスにおけるOB RNAの発現を示 す。金チオグルコース(GTG)およびdb/db処理マウスの傍子宮脂肪パッド由来の全 RNAを電気泳動およびノーザンブロットした。単回用量として投与されたGTGは、 特異的な視床下部の損傷を誘導することによって、肥満症を引き起こすことが知 られている。(A)１月齢CBA雌性マウスをGTG(.2mg/g)で処理したところ、コント ロール動物(＜５ｇの増加)に比較して、処理動物では＞20gの増加が得られた。( B)db/dbおよびGTG処理マウス由来のRNAに対するOBプローブのハイブリダイゼー ションは、コントロールRNA(アクチンまたはGAPDH)に比較して20倍増加量のob R NAを示した。 図34は、ヒトRNAのノーザンブロット分析を示す。ヒト脂肪組織(FAT、パネルA )由来の全RNA10mgおよびヒト以外の組織(パネルB)由来のポリA+RNA２mgを含むノ ーザンブロットを、示されたヒトobプローブまたはヒトβ-アクチンプローブに ハイブリダイズした。脂肪組織全RNAについて、約4.5kbでの強度のシグナルが認 められた。ポリA+RNAに対するハイブリダイゼーションは、心臓(HE)および胎盤( PL)において検出可能なシグナルを示したが、脳(BL)、肺(LU)、肝臓(LI)、骨格 筋(SM)、腎臓(KI)、および膵臓(PA)ではOB RNAは検出されなかった。各場合にお ける、オートラジオグラフィー暴露の長さを示す。注:胎盤RNAに認められる低分 子の方のバンドの起源(例えば、オルタネートスプライシング(alternate splici ng)、RNA分解)については知られていない。 図35は、ヒトOB遣伝子および8個のマイクロサテライトマーカーを含むYACコン ティグを示す。ヒトOB遺伝子を含む第7染色体領域のYACに基づくSTS含有地図を 示し、これは、SEGMAP/バージョン3.29[Greenら、PCR Methods Applic.,1:77-90 (1991)]から推定した。19個の独特な順に配列したSTS(表3を参照のこと)を上部 に示す。8個のマイクロサテライト特異的STSを星印で示す(表4を参照のこと)。P ax4およびOB遺伝子、ならびにコンティグに対して相対的なセントロメア(CEN)お よびテロメア(TEL)の予想された位置も示す。各43のYACクローンを、水平の線で 示し、左側に名称を付し、そして括弧内に推定YACのサイズ(kbで、パルスフィー ルドゲル電気泳動により測定された)を示す。各YACにおけるSTSの存在を適切な 位置に黒丸で示す。STSがYACの挿入末端に対応する場合は、対応する円の周囲( 上部(STSの名称付近)およびSTSが誘導されるYACの末端の両方)に四角を置いた。 下部(水平破線の下)の５つのYACについては、(確立されたSTSの順番に基づいて) 存在が予想される1つまたはそれ以上のSTSは検出されず(対応するSTS‐特異的PC Rアッセイで少なくとも2回、個々のYACを試験することによって評価した)、そし てこれらを適切な位置で白丸で示す。ほとんどのYACをヒト-ハムスターハイブリ ッド細胞由来ライブラリー[Greenら、Genomics，25:170-183(1995)]から単離し 、示された通り元の名称を付した。残りのYACを全ヒトゲノムライブラリーから 単離し、そして元のライブラリーの位置を表3に示す。7q31.3に対してFISH分析 によってマップすることが見出された3つのYAC(yWSS691、yWSS999、およびyWSS2 935)の名称の周囲に枠を置く。コンティグは「未計算の」形態で表し、YACのサイ ズを用いてはクローンの重複またはSTSスペーシングを概算せず、従ってすべて のSTSを等間隔で配置した。「計算された」形態では、YACのサイズを用いて隣接す るSTSの各対を隔てる相対的距離およびクローンの重複の範囲が概算され、総YAC コンティグは全長が2Mbを若干超えるようである。 発明の詳細な説明 本発明は、本明細書においてobポリペプチドまたはレプチン(leptin)と呼ばれ るタンパク質、本タンパク質をコードする核酸(例えば、特定の発現系における 発現のための最適コドンを取り込み、ここでタンパク質が哺乳動物の体重の制御 に関与する能力を示す、その核酸の縮重変異体を含む)の解明および発見に関す る。対象となる核酸は、マウスおよびヒトOBポリペプチドに対応するコード配列 を示し、体重および脂肪蓄積の調節に重要な役割を果たすとされている。本明細 書に示されたデータは、本発明の核酸のポリペプチド産物は、それを発現する細 胞によって分泌されることを示し、そしてそのポリペプチドがホルモンとして機 能することを示す。別の実験データは、OBポリペプチドが、ob遺伝子の変異を有 するマウスの肥満症の治療において非常に有効であることを示す。さらに、OBポ リペプチドの高用量の一回投与または中程度の継続用量は、正常(野生型)マウス の重量滅少を起こす。 さらに、本明細書の実施例は、OBポリペプチド(あるいは本明細書において「レ プチン」と呼ばれる)が、マウス、ラットおよびヒト血漿内を循環することを示す 。レプチンはob/obマウス由来の血漿中には存在せず、db/dbマウス由来の血漿中 には10倍高い濃度で存在し、そしてfa/faラット中には20倍高い濃度で存在した 。最も有意に、組換えレプチンの連日注入は劇的にob/obマウスの体重を滅少し 、野生型マウスの体重に有意に影響し、そしてdb/dbマウスには影響を及ぼさな い。 さらなる局面において、1つの種由来のOBポリペプチドは、別の種においても 生物学的に活性である。特に、ヒトOBポリペプチドは、マウスにおいて活性であ る。 その主な局面において、本発明は、哺乳動物の体重のモジュレーターとして機 能する物質の同定に関する。詳細には、本発明は、マウスおよびヒト両者におけ るOB遺伝子およびそのコード領域に対応する特定の核酸ならびにこれらの核酸に よって発現される対応ポリベプチドの単離、精製、および配列決定に関する。従 って、本発明は、図11A-E(配列番号１)ならびに図2AおよびB(配列番号３)に記載 のヌクレオチド配列を有する核酸、ならびに縮重変異体、対立遺伝子およびその フラグメントの発見を含み、そのすべては体重および脂肪蓄積を調製する活性を 有する。本核酸のOB遺伝子への対応は、肥満症ならびに体重の異常が寄与因子と なっている他の疾病および機能不全のような状態に重要な影響を与えることを予 告する。本発明は、本発明の核酸によって発現されるタンパク質、詳細には図１ A-E(配列番号２)、図３(配列番号４)、図５(配列番号５)、および図６(配列番号 ６)ならびに保存された変異体、活性フラグメント、および同族の小分子にまで 拡張する。 前に記載の通り、重量制御モジュレーターペプチド、またはそれらの結合パー トナー、あるいはそれらに対する模倣または拮抗あるいはそれらの生産の制御の いずれかを示す他のリガンドまたは薬剤は、適切なキャリアと共に、そして、体 重の異常変動または脂肪蓄積(単独、またはガンまたはAIDSのような有害な医学 的状態の一部として)を患う患者に対する種々の手段による投与に対して有効な 強度で、その治療のために、薬学的組成物中に調製され得る。種々の投与技術が 利用され得、それらの中には、経口投与、鼻および経粘膜投与の他の形態、皮下 、静脈内注射および腹腔内注射のような非経口技術、ならびにカテーテル注入な どがある。認識因子またはそれらのサブユニットの平均量は変化し得、とくに資 格を有する医師または獣医の推奨または処方に基づくべきである。 上記に従って、体重モジュレーターの活性を模倣または拮抗するのに有効な潜 在的薬物をスクリーニングするためのアッセイシステムを調製し得る。重量モジ ュレーターは、試験システムに導入され得、そして候補薬物も得られた細胞培養 物に導入され得、培養物は細胞の活性における任意の変化を観察するためにその 後に試験され、それは候補薬物単独の添加、または既知重量モジュレーターの添 加量の効果による。 上述の通り、本明細書に記載のOB遺伝子の分子クローニングにより、哺乳動物 の体重を調整するために分子レベルで機能する物質のクラスの同定が行われた。 本発明のモジュレーターの発見は、栄養疾患の診断および治療について重要な意 味を有し、このような疾患には肥満症、ガン関連の重量の消失、および高血圧、 心臓病、およびII型糖尿病のような肥満症に関連する疾患の治療が含まれるがこ れらには限定されない。さらに、家畜の体重を調整しようとする場合の、その遺 伝子産物に対する潜在的な農業上の用途がある。最後に、本発明の１つまたはそ れ以上のモジュレーターが分泌された分子である限りは、それらのモジュレータ ーは、生物学的に使用され、発現クローニングの技術を用いてそれらのレセプタ ーを単離し得る。特にOB遺伝子について以下に行われる考察には、本発明の一部 を含有するモジュレーターのクラスへの一般的適応性が含まれ、従って解釈の程 度および範囲などと一致される。 上記の通り、OBペプチドの機能的活性は、トランスジェニックで評価され得る 。この点に関して、トランスジェニックマウスモデルが使用され得る。ob遺伝子 は、 トランスジェニックマウスを用いる相補試験において使用され得る。候補遺伝子 の野生型位置に対応するウイルスベクターまたはコスミドクローン(またはファ ージクローン)を含むトランスジェニックベクターは、単離されたob遺伝子を用 いて構築され得る。コスミドは、公表されている手順[Jaenish,Science，240:14 68‐1474(1988)]を用いてトランスジェニックマウスに導入され得る。構築物を 、C57BL/6J ob/ob×DBA交雑のF1子孫間の交雑から誘導された受精卵に導入する 。これらの交雑は、F1動物を作製するためのC57BL/6J ob/ob卵巣移植体の使用を 要する。DBA/2Jマウスは、対比株(counterstrain)として使用する。何故なら、 このマウスは、卵巣移植体を用いる際に重要な非アグーティ(nonagouti)外皮色 を有するからである。コスミドトランスジェニックマウス動物のob位置での遺伝 子型は、緊密に連鎖したRFLPまたは変異の側面に位置し、そして先祖株間で多型 であるマイクロサテライトで動物を分類することによって、決定される。相補性 は、特定の構築物が遺伝的に肥満性型のF2動物(RFLP分析により評価されたもの として)を痩身型および非糖尿的にする場合に示される。このような環境下では 、相補性を決定的に証明するために、トランスジーンを有するob/obまたはdb/db 動物を、ob/obまたはdb/db卵巣移植体と交配させる必要がある。この交配におい て、トランスジーンを有しないすべてのN2動物は肥満型およびインスリン耐性/ 糖尿病性になるが、トランスジーンを有する動物は痩身型となり、そして正常な グルコースおよびインスリン血漿中濃度を有する。遺伝的意義においては、トラ ンスジーンは抑制変異として作用する。 あるいは、野生型動物においてアンチセンスの方向で発現される場合の表現型 の効果を調べることによって、OB遺伝子を試験し得る。このアプローチにおいて 、野生型対立遺伝子の発現は抑制され、変異の表現型が生じる。RNA‐RNAの二本 鎖形成(アンチセンス‐センス)は、mRNAの正常な取り扱いを妨げ、野生型遺伝子 の効果の部分的または完全な消失を引き起こす。この技術を用いて、組織培養に おけるTK合成の阻害ならびにDrosophilaのKruppel変異およびマウスのShiverer 変異の表現型が生じさせられているIzantら、Cell，36，1007-1015(1984);Green ら、Annu.Rev.Biochem.，55:569-597(1986);Katsukiら、Science，241:593‐595 (1988)。このアプローチの重要な利点は、同種mRNA全体の発現の効果的な阻害の ため に、遺伝子の小さい部分の発現しか必要としないことである。アンチセンストラ ンスジーンを、それ自身のプロモーターまたは適切な細胞のタイプで発現される 別のプロモーターの制御下に置き、かつSV40のポリA部位の上流に置く。このト ランスジーンを用いてトランスジェニックマウスを作成する。トランスジェニッ クマウスはまた、卵巣移植体と接合させて、obヘテロ接合体が、アンチセンス構 築物の効果に対してより感受性であるかどうかについて試験する。 長期的には、OB遺伝子産物(OBポリペプチドまたはOBタンパク質)の生化学的機 能を解明することが、その活性に影響する小分子のアゴニストおよびアンタゴニ ストを同定するのに有用である。 本明細書を通して用いられる種々の用語は、例えば以下の本明細書で設定させ る定義を有する。 用語「体重モジュレーター」、「モジュレーター(単数)」、「モジュレーター(複数 )」、および具体的に列挙されていないいずれの変異体も、本明細書において相互 に入れ換えて用いられ得、そして本出願および請求の範囲で用いられる通り、一 つの例でヌクレオチドおよびタンパク質性物質を意味し、後者は単一または多数 のタンパク質を包含する。さらに具体的には、前記用語は、ヌクレオチドならび に本明細書に記載の配列および図1A-E(配列番号１)ならびに図2AおよびB(配列番 号３)に示される配列を有するDNAにまで及ぶ。同様に、本明細書に記載のアミノ 酸配列データならびに図1A〜E(配列番号２)および図３(配列番号４)に示される アミノ酸配列データを有するタンパク質ならびに、本明細書中および請求の範囲 の両方における全ての物質について記載されている活性のプロフィールも同様に 考慮される。従って、実質的に等価なもしくは変化した活性を示すヌクレオチド についても同様に考慮され、これは実質的に相同なアナログおよび対立遺伝子の 変異体を包含する。同様に、実質的に等価なもしくは変化した活性を示すタンパ ク質で、例えば部位特異的変異によって意図的に改変されたタンパク質、または モジュレーターを生産する宿主における偶発的な変異によるタンパク質を包含す るタンパク質についても同様に考慮される。 「A」(但し、「A」は、単一のタンパク質、DNA分子、ベクター、組換え宿主細胞な ど)を有する組成物には、実質的に「B」(但し、「B」は、Aのラセミ体を除く１つま たはそれ以上の混入タンパク質、DNA分子、ベクターなどを含む)が存在せず、こ の場合、組成物において、重量で少なくとも約75%のタンパク質、DNA、ベクター (これらは、AおよびBが属する種のカテゴリーに依存する)が、「A」である。好ま しくは、「A」は、組成物においてA+B種の重量で少なくとも約90%を含み、最も好 ましくは、重量で少なくとも約99%を含む。また好ましくは、実質的に混入物が 存在しない組成物は、目的の種の活性または特徴を有する単一の分子量種のみを 含有する。 OBポリペプチド 用語「タンパク質」（これは天然に存在するポリペプチドを指す）および「ポ リペプチド」は、ob遺伝子産物およびその変異体に関して、本明細書中で交換可 能に用いられる。用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は特に、 シグナル配列（または融合タンパク質パートナー）が除去されたOB遺伝子産物を 指す。 上述したように、特定の実施態様では、本発明のobポリペプチドは、本明細書 中に記載したアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、５、６など）を有するポ リペプチドを包含し、これは保存的アミノ酸置換で改変されたobポリペプチド、 ならびにそれらの生物学的に活性なフラグメント、アナログ、および誘導体を包 含する。用語「生物学的に活性」は、ポリペプチドの特定の効果を指すために本 明細書中で用いられ、これは特異的結合（例えばレセプター、抗体または他の認 識分子に対する）；分子レベルでのシグナル伝達経路の活性化；および／または インビボで天然obポリペプチドにより仲介される生理的効果の誘導（またはアン タゴニストによる阻害）を包含するが、それらに限定されない。OBポリペプチド （フラグメント、アナログ、および誘導体を包含する）は、合成により、例えば 、固相または液相ペプチド合成の周知の技術を用いて、調製され得る。好ましく は、固相合成技術が用いられ得る。あるいは、本発明のOBポリペプチドは、以下 に記載されるような周知の遺伝子工学技術を用いて調製され得る。さらに別の実 施態様では、OBポリペプチドは、例えば免疫アフィニティー精製により、生体液 から精製され得る。生体液は、例えば、血漿、血清、または尿であり、好ましく はヒ トの血漿、血清、または尿であり、そしてより好ましくはポリペプチドを過剰発 現している被験者、例えばOBレセプターにおいて変異を受けている肥満者または 「脂肪性」に対応する変異に関連した肥満症の肥満者に由来する血漿、血清、ま たは尿であるが、これらに限定されない。 OBポリペプチドのフラグメント 特定の実施態様では、本発明は、天然に存在するOBポリペプチドのフラグメン トが重要であり得ることを意図する。ペプチド配列は、しばしばタンパク質分解 切断の標的となる多くの部位（例えばアルギニン残基）を含む。完全長ポリペプ チドが１つまたはそれより多くの部位で切断され得て、生物学的に活性なフラグ メントを形成することが可能である。このような生物学的に活性なフラグメント は、体重を低下させるOBポリペプチドの機能的活性に対して作動的または拮抗的 のいずれかに作用し得る。 OBポリペプチドのアナログ 本発明は、特定的には、OBペプチドのアナログの調製を意図する。このアナロ グは、OBポリペプチドの生物学的活性を保持し得る、例えばobペプチドの特異的 結合パートナー（例えばOBレセプター）に結合し得ることにより特徴づけられる 。１つの実施態様では、アナログはOB活性に作動的に作用し、すなわちそれはob ペプチドと同様に機能する。好ましくは、OBアゴニストは天然タンパク質よりも より効果的である。例えば、OBアゴニストアナログは、より高い親和性でOBレセ プターに結合し得るか、またはインビボでより長い半減期を示し得るか、または その両方であり得る。それにも関わらず、天然タンパク質より有効性が低いOBペ プチドアゴニストアナログもまた意図される。別の実施態様では、アナログはOB 活性に拮抗的に作用する。例えば、OBレセプターに結合するがシグナル伝達を誘 導しないOBアナログは、天然OBのレセプターへの結合を競合的に阻害し得、従っ てインビボでOB活性を低下させる。このようなOBアンタゴニストアナログはまた 、obペプチドと異なる特性を示し得、例えばインビボでのより長い（または短い ）半減期、OBレセプターに対するより高い（または低い）結合親和性、またはそ の 両方を示し得る。 １つの実施態様では、OBペプチドのアナログは、ポリペプチドにおいて構造ま たは機能に必須ではない位置でのアミノ酸置換により改変されたOBペプチドであ る。例えば、ヒトOBペプチドはマウスにおいて生物学的に活性であるので、マウ スアミノ酸配列に比較してヒト配列中の分岐アミノ酸残基を置換することにより 、OBペプチドの有用なアナログが得られると思われる。例えば、ヒトの53位また は98位、またはその両位置のセリン残基（図４中に図示されるプロセスされてい ないペプチド配列）は、例えばグリシン、アラニン、バリン、システイン、メチ オニン、またはスレオニンと置換され得る。同様に、92位のアルギニン残基（図 ４）は、例えば、アスパラギン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン 酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、メチオニン、またはシステインと置 換され得る。図４をさらに参照すると、置換可能であると考えられるヒトOBペプ チドの他のアミノ酸は、118位のヒスチジン、121位のトリプトファン、122位の アラニン、126位のグルタミン酸、127位のスレオニン、128位のロイシン、132位 のグリシン、139位のグリシン、159位のトリプトファン、および166位のグリシ ンである。別の実施態様では、121位から128位（図４中に図示される）のうち１ つ以上の残基を、例えばグリシンまたはアラニンと置換するか、または123位の セリンまたは125位のロイシンを除いて一部の残基を置換することが可能であり 得る。 別の実施態様では、OBポリペプチド（好ましくはヒトOBポリペプチド）のアナ ログはポリペプチドの短縮型である。例えば、49位のグルタミンは必須ではなく 、ペプチドから欠失され得ることが既に実証されている。同様に、121位から128 位の分岐アミノ酸残基の一部または全てを欠失させることが可能であり得る。さ らに、本発明は、生物学的活性に必要な最少アミノ酸配列を有するOBアナログの 提供を意図する。これは、例えば、OBフラグメントの活性を、OB特異的抗体に結 合する、天然OBポリペプチドの活性を阻害する、または天然OBペプチドの活性に 作動的に作用する能力について試験することにより、容易に決定され得る。１つ の実施態様では、本発明は、117位および167位のシステイン残基（図４中に図示 される）間で形成するジスルフィド結合により形成されたループ構造からなる短 縮 型OBポリペプチドを提供する。別の実施態様では、短縮型アナログは、22位（推 定シグナルペプチド切断部位の後に続く）から53位（限定タンパク質分解後のOB ポリペプチドの質量分析で検出される可動性ループ領域の直前のアミノ酸残基； Cohenら、Protein Science，4:1088(1995)を参照のこと）のアミノ酸残基に相当 する。別の実施態様では、短縮型アナログは、61位（OBポリペプチドの限定タン パク質分解／質量分析で検出される可動性ループ領域の直後の残基）から116位 （最初のシステイン残基の直前の残基）のアミノ酸に相当する。さらに別の実施 態様では、短縮型アナログは、61位から167位のアミノ酸に相当する。 さらに、54位から60位の推定可動性ループの１つ以上の残基が置換される。例 えば、１つ以上の残基が、架橋結合（例えばポリマーとの）のために、リジン、 グルタミン酸、またはシステイン（好ましくはリジン）と置換され得る。これは 、可動性ループ構造はタンパク質の誘導体化に好ましい部位であるからである。 あるいは、可動性ループ部分の残基が、タンパク質分解に対してより耐性である が可動性構造を保持するアミノ酸残基、例えば１つ以上のプロリンと置換され得 る。さらに別の実施態様では、さらに誘導体化され得てそれらをより分解（例え ばタンパク質分解）に対し耐性にするアミノ酸残基での置換が意図される。 上記フラグメントサイズは概算であり、そしてジスルフィド結合ループアナロ グにおいてシステイン残基が維持されねばならないことを除いて、１個から約５ 個のアミノ酸が、ポリペプチドまたはそのフラグメント、列挙された短縮型アナ ログの各末端または両末端、あるいは内部に含められ得るかまたは欠失され得る ことが、当業者により理解される。 マウスOBペプチドは50％のαヘリックス量を含有し、そしてヒトOBポリペプチ ドは約60％のαヘリックス量を含有することが判明している。これらは、生理的 条件に近い条件下における組換えペプチドの円偏光二色性により検出される。従 って、別の実施態様では、アミノ酸残基が他の残基と置換され得て、OBポリペプ チドのアナログを形成し、このアナログは、より安定したαヘリックス構造を形 成する傾向の増加を示すかまたは形成する。例えば、Glu、Ala、Leu、His、Trp が、天然OBポリペプチド中で見出されるアミノ酸残基に対する置換基として導入 される場合、αヘリックス構造をとりやすい。好ましくは、保存的アミノ酸置換 が用いられ、例えば、29位、30位、44位、61位、76位、100位、および／または1 06位のアスパラギン酸（図４中に図示される）のグルタミン酸（Glu）での置換 ；イソロイシンのロイシンでの置換；グリシンまたはバリンあるいは任意の分岐 アミノ酸のアラニンでの置換（例えばヒトOBポリペプチドの53位のセリンのアラ ニンでの置換）；アルギニンまたはリジンのヒスチジンでの置換；およびチロシ ンおよび／またはフェニルアラニンのトリプトファンでの置換が挙げられる。α ヘリックス構造の程度、またはより重要なことに、αヘリックス構造の安定性を 高めると、より高い活性、増大された結合親和性、またはより長い半減期を有す るOBアナログが得られ得る。特定の実施態様では、22位から53位のアミノ酸残基 に相当するOBペプチド部分のヘリックス形成能力が増大される。別の実施態様で は、61位から116位のアミノ酸残基のヘリックス形成能力または安定性が増大さ れる。さらに別の実施態様では、117位から167位のアミノ酸に相当するジスルフ ィドループ構造のヘリックス形成能力が増大される。また、上記ドメインの１つ より多くにおいて増大されたαヘリックス能力または安定性を含有するOBアナロ グが意図される。さらなる実施態様では、短縮型OBポリペプチドアナログは、構 造形成性（例えばヘリックス形成性）アミノ酸残基を取り込んで、ポリペプチド フラグメントが安定構造を欠如する傾向がより高いことを補うように生成される 。 フラグメントのようなアナログは、例えば、体重モジュレーターペプチド物質 のペプシン消化により生成され得る。ムテイン（mutein）のような他のアナログ は、体重モジュレーターペプチドコード配列の標準的な部位特異的変異誘発によ り生成され得る。プロモーターまたはインヒビターのいずれとして機能するにせ よ、小分子などのような「体重モジュレーター活性」を示すアナログは、公知の インビボアッセイおよび／またはインビトロアッセイにより同定され得る。 OBポリペプチドの小分子アナログおよびペプチド模擬体(peptidomimetics)ob ポリペプチド（好ましくはヒトOBポリペプチド）の構造は、当該分野で公知の種 々の方法により分析され得る。タンパク質配列は親水性分析［例えば、Hoppら、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:3824（1981）］により特徴づけられ得る。 親水性プロフィルは、OBポリペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定する のに用いられ得、フォールディングされたポリペプチドの内部に埋まっている領 域、およびポリペプチドの外部で接近可能な領域を示し得る。さらに、二次構造 分析［例えば、Chouら、Biochem.，13:222（1974）］もまた行われ得、特定の二 次構造をとるOBポリペプチドの領域を同定し得る。二次構造推定を包含する構造 の推定または決定の操作は、当該分野で入手可能なコンピューターソフトウェア プログラムを用いて行われ得る。 組換えOBポリペプチドの豊富な供給源を提供することにより、本発明は、ポリ ペプチドの定量的構造決定を可能にする。特に、核磁気共鳴（NMR）、赤外（IR ）、ラマン、および紫外（UV）、特に円偏光二色性（CD）分光分析のために、十 分な材料が提供される。特に、NMRは、溶液中分子の非常に強力な構造分析を提 供し、分子の天然の環境により正確に近づく［Marionら，Biochim．Biophys．Re s．Comm．113:967-974（1983）；Barら，J．Magn．Reson.，65:355-360（1985） ；Kimuraら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77：1681-1685（1980）］。他の構 造分析方法もまた用いられ得る。これらは、Ｘ線結晶構造解析［Engstom、Bioch em．Exp．Biol.，11:7-13（1974）］を包含するが、これに限定されない。 さらに別の実施態様では、OBポリペプチドのアナログが、天然OBポリペプチド またはそれらの特定のフラグメントに対して特異的な抗体と交差反応するか否か を決定するために試験され得る。交差反応度は、タンパク質の構造相同性または 類似性、あるいはフラグメント特異的抗体を生成するために用いられるポリペプ チド部分に相当する領域の接近可能性についての情報を提供する。 OBアナログのスクリーニング ポリペプチドのアナログをスクリーニングするために、種々のスクリーニング 技術が当該分野で知られている。化学物質の種々のライブラリーが利用可能であ る。従って、本発明は、このようなライブラリー（例えば、何年もの研究で生成 された合成化合物のライブラリー、天然化合物のライブラリー、および組合せの ライブラリー、以下でより詳細に記載する）を、OBポリペプチドのアナログにつ いてスクリーニングすることを意図する。１つの実施態様では、本発明は、この ようなライブラリーを抗OBポリペプチド抗体、好ましくは抗ヒトobポリペプチド 抗体に結合する化合物についてスクリーニングすることを意図する。別の局面で は、一旦OBレセプターが同定されれば（以下を参照のこと）、当該分野で公知の 任意のスクリーニング技術がOBレセプターアゴニストまたはアンタゴニストにつ いてスクリーニングするために用いられ得る。本発明は、小分子リガンドまたは リガンドアナログおよび模倣物についてのスクリーニング、ならびにインビボで OBレセプターに結合し、そしてその活性化に作動的または拮抗的に作用する天然 リガンドについてのスクリーニングを意図する。 レセプターの一次配列およびその配列と機能が公知であるタンパク質との類似 性を認識することにより、タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストに関す る端緒が提供され得る。アンタゴニストの同定およびスクリーニングは、タンパ ク質の構造特徴を、例えば、Ｘ線結晶構造解析、中性子回折、核磁気共鳴分光法 、および構造決定のための他の技術を用いて決定することにより、さらに容易に なる。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計または 同定を提供する。 別のアプローチは、大きなライブラリーを生成するために組換えバクテリオフ ァージを用いる。「ファージ法」［Scottら，Science，249:386-390（1990）;Cw irlaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:6378-6382（1990）;Devlinら，Scien ce，249:404-406（1990）］を用いて、非常に大きなライブラリーが構築され得 る（106〜108化学的実在(chemical entities)）。第２の方法は、主に化学的方 法を用いる。この方法としては、Geysen法［Geysenら，Molecular Immunology， 23:709-715（1986）;Geysenら，J．Immunologic Method，102:259-274（1987） ］およびFodorら、Science，251:767-773（1991）による最新法が挙げられる。F urkaら 14th International Congress of Biochemistry，Volume 5，Abstract FR:013（1988）;Furka，Int．J．Peptide Protein Res.，37:487-493（1991）］ ；Houghton（米国特許第4,631,211号、1986年12月発行）；およびRutterら（米 国特許第5,010,175号、1991年４月23日発行）は、アゴニストまたはアンタゴニ ストとして試験され得るペプチドの混合物を生成する方法を記載している。 別の局面では、合成ライブラリー［Needelsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 90:10700-10704（1993）;Ｌamら，国際特許公開第WO92/00252号、それぞれその 全体が本明細書中に参考として援用されている］などが、本発明のOBレセプター リガンドについてスクリーニングするために用いられ得る。このようなライブラ リーを用いれば、レセプターアンタゴニストは、実際にOBレセプターをクローニ ングしなくても、レセプターを発現する細胞を用いて検出され得る。 あるいは、組換え型のOBレセプターリガンド結合ドメインを発現する細胞への 可溶性リガンドの結合についてのアッセイが行われ得る。この可溶性リガンドは 、組換えまたは合成OBポリペプチドとして容易に提供され得る。 スクリーニングは、OBレセプターを発現する組換え細胞を用いて、あるいは精 製レセプタータンパク質（例えば、組換えにより生成された）を用いて、上述の ように行われ得る。例えば、分子のリガンド結合部分を含む標識した可溶性また は可溶化OBレセプターがリガンドに結合する能力が、上述の参照において記載さ れるように、ライブラリーのスクリーニングのために用いられ得る。 OBポリペプチドの誘導体 一般に、本発明のタンパク質（ここで用語「タンパク質」は、他に指示されな ければ「ポリペプチド」を包含するように用いられる）は、タンパク質部分への １つ以上の化学部分の結合により誘導体化され得る。化学修飾誘導体は、さらに 動脈内、腹腔内、筋内、皮下、静脈内、経口、鼻内、直腸、経頬粘膜(bucal)、 舌下、肺、局所、経皮、または他の投与経路についてさらに処方され得る。生物 学的に活性なタンパク質の化学修飾は、特定の環境下で付加的な利点を提供する ことが見出されている。この利点としては、例えば、治療タンパク質の安定性お よび循環時間の増大および免疫原性の低下が挙げられる。例えば、米国特許第4, 179,337号、Davisら、1979年12月18日発行を参照のこと。概説については、Abuc howskiら、「可溶性ポリマー−酵素付加物」、Enzyme as Drugs，367〜383頁、H olcenbergおよびRoberts編、Wiley-Interscience，New York，NY，(1981)を参照 のこと。タンパク質修飾および融合タンパク質について記載の概説的文献は、Fr ancis、Focus on Growth Factors，3:4-10(1992)である。 誘導体化のための化学部分 誘導体化に適切な化学部分は、水溶性ポリマーの中から選択され得る。選択さ れるポリマーは、それに結合されるタンパク質が生理的環境のような水性環境で 沈澱しないように、水溶性でなければならない。好ましくは、最終産物調製物の 治療的使用のために、ポリマーは薬学的に受容可能である。当業者は、ポリマー ／タンパク質複合体が治療的に用いられるかどうかというような考慮、そしても し用いられる場合、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、お よび他の考慮条件に基づいて、所望のポリマーを選択し得る。本発明のタンパク 質およびペプチドについて、これらは本明細書中に提供されるアッセイを用いて 確かめられ得る。 ポリマー分子 水溶性ポリマーは、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プ ロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン 、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポ リ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸 （ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデキストランまた はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコー ルホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリ オキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択さ れ得る。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性 のために製造に利点を提供し得る。 ポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。ポ リエチレングリコールについて、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造に容易 であるためには約２kDaと約100kDaとの間である（用語「約」はポリエチレング リコールの調製において、いくらかの分子の分子量が記された分子量よりも高く 、いくらかは低いことを示す）。他のサイズは、所望の治療プロフィル（例えば 所望の徐放期間、（もしあれば生物学的活性に対する）効果、取り扱いの容易さ 、抗原性の程度または欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリ エ チレングリコールの他の既知の効果依存して用いられ得る。 ポリマー／タンパク質比 そのように結合されるポリマー分子数は変化し得、そして当業者は機能に対す るその効果を確かめ得る。モノ誘導体化され得るか、または同一のまたは異なる 化学部分（例えば、ポリマー（例えば異なる分子量のポリエチレングリコール） ）とジ誘導体化、トリ誘導体化、テトラ誘導体化、または誘導体化の組合せが提 供され得る。タンパク質（またはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は 、反応混合物におけるそれらの濃度の変化につれて変化する。一般に、最適比（ 過剰な非反応タンパク質またはポリマーが存在しない反応効率に関する）は、所 望の誘導体化程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマーの分子 量、ポリマーが分枝であるか非分枝であるか、および反応条件のような因子によ り決定される。 タンパク質への化学部分の結合 ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能性 または抗原性ドメインにおける効果を考慮してタンパク質に結合されるべきであ る。当業者に利用可能な多くの結合方法がある（例えば、本明細書中に参考とし て援用されるEP 0 401 384（PEGのG-CSFへのカップリング））。Malikら、Exp.H ematol.，20:1028-1035（1992）（塩化トレシルを用いるGM-CSFのPEG化を報告） もまた参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基（例えば遊離ア ミノまたはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基に共有結合され得る。反応基 は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離アミノ基 を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み、遊離カ ルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基 、およびＣ末端アミノ酸残基を含む。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレング リコール分子を結合させるための反応基として用いられ得る。治療目的のために 好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端はまたはリジン基での結合で ある。レセプター結合に重要な残基での結合は、レセプター結合が所望である場 合 避けられるべきである。 Ｎ末端化学修飾タンパク質 特にＮ末端化学修飾タンパク質を所望し得る。本発明の組成物の例示としてポ リエチレングリコールを用いる場合、種々のポリエチレングリコール分子（分子 量、分枝などでの）、反応混合物中におけるタンパク質（またはペプチド）分子 に対するポリエチレングリコール分子の割合、実施されるPEG化反応のタイプ、 および選択されたＮ末端PEG化タンパク質を得る方法から選択され得る。Ｎ末端P EG化調製物を得る（すなわち、必要であれば他のモノPEG化部分からこの部分を 分離する）方法は、PEG化タンパク質分子の集団からＮ末端PEG化物質を精製する ことにより行われ得る。選択的Ｎ末端化学修飾は、還元アルキル化により行われ 得、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なるタイプのもとのアミ ノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を用いる。適切な反応条件下で、 ポリマーを含むカルボニル基によるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘 導体化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のεアミノ基とＮ末端残 基のαアミノ基との間のpKa差を利用し得るpHで反応を行うことにより、タンパ ク質を選択的にＮ末端でPEG化し得る。このような選択的誘導体化により、水溶 性ポリマーのタンパク質への結合が制御される：ポリマーとの複合体化は、タン パク質のＮ末端で優勢的に生じ、そして他の反応基（例えばリジン側鎖アミノ基 ）の有意な修飾は生じない。還元アルキル化を用いる場合、水溶性ポリマーは上 記のタイプであり得、そしてタンパク質にカップリングするため１つの反応性ア ルデヒドを有するべきである。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ １つの反応性アルデヒドを含む）は用いられ得る。 OBポリペプチドに関連する核酸 上記のように、本発明はobポリペプチドをコードする核酸、およびOB遺伝子関 連ゲノムの5'、3'、およびイントロンの非コード配列に関する。それゆえ本発明 に従って、当該分野の技術範囲において従来の分子生物学、微生物学、および組 換えDNA技術が使用され得る。このような技術は文献中に十分に説明されている 。 例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989); Glo ver編、DNA Cloning: A Practical Approach、第Ｉ巻および第II巻、MRL Press, Ltd.，Oxford，U.K．(1985);Gait編、Oligonucleotide Synthesis、Oxford Univ ersity Press(1984);Hamesら編、Nucleic Acid Hybridization、Springer-Verla g（1985）;Hamesら編、Transcription And Translation、Oxford University Pr ess(1984); Freshney編、Animal Cell Culture、Oxford University Press(1986 ); Immobilized Cells And Enzymes、IRL Press(1986); Perbal、A Practical G uide To Molecular Cloning、Wiley，New York(1984)を参照のこと。本発明に特 に関連するのは、遺伝子または核酸の、周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術 に基づいた単離、クローニング、配列決定、解析、および特徴付けのストラテジ ーである。 「レプリコン」は、インビボにおけるDNA複製の自律的なユニットとして機能 する、すなわちそれ自身の制御のもとに複製し得る任意の遺伝的要素(例えば、 プラスミド、染色体、ウイルス)である。 「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドのような、他のDNA セグメントを結合して、結合されたセグメントの複製をもたらし得るレプリコン である。 「カセット」は、特定の制限部位でベクターに挿入し得るDNAのセグメントを 意味する。DNAのセグメントは目的のポリペプチドをコードし、そしてカセット および制限部位は、転写および翻訳のための適切な読みとり枠(reading frame) でのカセットの挿入を確実にするように設計される。 「異種」DNAは、細胞内または細胞の染色体部位に天然には位置しないDNAを意 味する。好ましくは、異種DNAは細胞にとって外来の遺伝子を包含する。 細胞は外因性または異種DNAによりこのようなDNAが細胞内に導入されるとき、 「トランスフェクト」される。トランスフェクトされたDNAが表現型の変化をも たらすとき、細胞は外因性または異種DNAにより「トランスフォーム」される。 好ましくはトランスフォームDNAは染色体DNAに組み込まれて(共有結合で結合さ れて)細胞のゲノムを構成するべきである。 「クローン」は単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の 集団である。 「核酸分子」は一本鎖型または二本鎖ヘリックスにおけるリン酸エステル重合 形態のリボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン ；「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキ シグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン; 「DNA分子」)を意 味する。二本鎖のDNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAヘリックスが可能である。 核酸分子という用語（詳細にはDNAまたはRNA分子）は、分子の１次および２次構 造のみを意味し、そしていずれの特定の３次または４次形態に限定しない。それ ゆえ、この用語はとりわけ直鎖または環状のDNA分子(例えば、制限フラグメント )、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖 DNA分子の構造について記載する場合、配列は本明細書中で、DNAの非転写ストラ ンド(すなわちmRNAに相同な配列を有するストランド)に沿って5'から3'の方向の 配列のみを示す通常の慣例にしたがって記載され得る。「組換えDNA分子」は分 子生物学的操作を経たDNA分子である。 核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAのような他の核酸分子と、核酸分子 の一本鎖形態が他の核酸分子と適切な温度および溶液イオン強度の条件下でアニ ールし得るときに「ハイブリダイズし得る」(Sambrookら、(1989)上記を参照の こと)。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「厳密性(stri ngency)」を決定する。相同な核酸のための予備スクリーニングには、低い厳密 性のハイブリダイゼーション条件（55℃のＴmに相当）が使用され得る(例えば、 ５×SSC、0.1% SDS、0.25%ミルク、およびホルムアミドなし；または30%ホルム アミド、５×SSC、0.5% SDS)。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は より高いＴm値に相当する(例えば、40％ホルムアミド、５×または６×SSC)。高 い厳密性のハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴm値に相当する(例えば、 50%ホルムアミド、５×または６×SSC)。ハイブリダイゼーションには相補的な 配列を含有する２種の核酸が必要であるが、ハイブリダイゼーションの厳密性に 依存して塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適 切な厳密性は、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、当該分野に周知の程度 で変化をする。２種のヌクレオチド配列の類似性または相同性が大きければ大き いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッド形成のためのＴm値は大きく なる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性(より高いＴmに相当する)は 以下の順序で減少する: RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100ヌクレオチドを 超えるハイブリッド形成にはＴm算出のための方程式が導かれている(Sambrookら 、(1989)上記、9.50-0.51を参照のこと)。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレ オチド、とのハイブリダイゼーションにはミスマッチの位置がより重要となり、 そしてオリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する(Sambrookら、(1989) 上記、11.7-11.8を参照のこと)。好ましくは、ハイブリダイズし得る核酸の最小 の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである；より好ましくは、少なくとも約15 ヌクレオチドである；最も好ましくは、長さが少なくとも約20ヌクレオチドであ る。 「相同的組換え」はベクター中の外来DNAの染色体内への挿入を意味する。好 ましくは、ベクターは特異的な染色体の部位を相同的組換えの標的とする。特異 的な相同的組換えのために、ベクターは染色体の配列に相同な十分に長い領域を 含むことで、相補的結合およびベクターの染色体への取り込みを実現させる。相 同性の領域がより長く、そして配列類似性の程度がより大きいと、相同的組換え の効率が増加し得る。 DNA「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたときにインビトロ またはインビボにおいて細胞内でポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖の DNA配列である。コード配列の境界は5'(アミノ)末端の開始コドンおよび3'(カル ボキシル)末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は原核生物の 配列、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核(例えば、哺乳類)DNA由来のゲノムDNA配 列、および合成DNA配列をも、包含し得るがこれらに限定されない。コード配列 が真核細胞内での発現を意図される場合は、ポリアデニル化シグナルおよび転写 終結配列がコード配列の3'側に通常位置される。 OBコード配列およびフランキング配列の単離 本発明により意図される核酸は、記載の通り、本明細書の図１Ａ〜Ｄ(配列番 号２)、図３(配列番号４)、図５(配列番号５)、および図６(配列番号６)に示す ようなペプチドの発現をコードする他の核酸まで及ぶ。したがって、ob遺伝子に 関連して特異的なDNAが単離および配列決定される一方、いずれの動物細胞も潜 在的に本発明のペプチドをコードする遺伝子の分子クローニングの核酸供給源と して利用し得る。DNAはクローン化DNA(例えば、「DNAライブラリー」)から、化 学合成により、cDNAクローニングにより、もしくは所望の細胞より精製したゲノ ムDNA、またはそのフラグメントのクローニングにより得られ得る(例えば、Samb rookら、(1989)、上記; Glover、(1985)、上記を参照のこと)。ゲノムDNA由来の クローンは調節およびイントロンのDNA領域、さらにコード領域を含有し得る; c DNA由来のクローンはイントロンの配列を含有しない。供給源が何であれ、遺伝 子は、その遺伝子の増幅のために適切なベクターに分子的にクローン化される。 ゲノムDNA由来の遺伝子の分子クローニングでは、ゲノムDNAはcDNA配列から選 択されたプライマーを使用して増幅され得る。あるいは、DNAフラグメントが作 成され、そのいくつかが所望の遺伝子をコードする。DNAは特異的な部位で種々 の制限酵素を使用して切断され得る。DNAをフラグメント化するためにDNアーゼ をマンガン存在下で使用し得、またはDNAは、例えば超音波処理によって物理的 に剪断され得る。直鎖DNAフラグメントはサイズに従って標準的な技術により分 離され得るこのような標準的な技術として、アガロースならびにポリアクリルア ミドゲル電気泳動、およびカラムクロマトグラフィーが挙げられるがそれらに限 定されない。 いったんDNAフラグメントが作成されると、所望のobまたはob様遺伝子を含有 する特異的なDNAフラグメントの同定は多くの方法によって達成され得る。例え ば、一定量のobまたはob様遺伝子の部分またはその特異的RNA、あるいはそのフ ラグメントを入手し得て精製および標識し得る場合は、生じたDNAフラグメント は標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングされ 得る(Bentonら、Science，196:180(1977); Grunsteinら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，72:3961(1975))。本発明は、このような核酸プローブを提供し、これは 本明細書中で開示される特異的な配列から容易に調製され得る。例えば、図１Ａ 〜Ｅ(配列番号１)または図２ＡおよびＢ(配列番号３)に記載される配列の少な くとも10、好ましくは15ヌクレオチドフラグメントに相当するヌクレオチド配列 を有するハイブリダイズし得るプローブがある。好ましくは、フラグメントは本 発明のモジュレーターペプチドに高度に特有であるように選択される。プローブ に対して実質的に相同であるDNAフラグメントがハイブリダイズする。上記のよ うに、相同性の程度が大きければ大きいほど、より厳密なハイブリダイゼーショ ン条件が使用され得る。１つの実施態様において、低い厳密性のハイブリダイゼ ーション条件が相同性のモジュレーターペプチドを同定するために使用される。 しかし、好ましい局面において、および本明細書中で実験的に示されるように、 本発明のモジュレーターペプチドをコードする核酸は、図１Ａ〜Ｅ(配列番号１) または図２ＡおよびＢ(配列番号３)に記載されるようなヌクレオチド配列を有す る核酸、または中程度に厳密な条件でハイブリダイズし得るそのフラグメントに ハイブリダイズする；より好ましくは、核酸は高い厳密性の条件でハイブリダイ ズする。 あるいは、遺伝子の存在は、それが発現される生産物の物理的、化学的、また は免疫学的特性に基づいたアッセイにより検出され得る。例えば、cDNAクローン 、または適切なmRNAをハイブリッドで選択する（hybrid-select）DNAクローンが 選択され得、本発明のモジュレーターペプチドについて既知の特性と類似または 同一の、電気泳動の移動度、等電点電気泳動上の挙動、プロテアーゼ切断マップ 、チロシンホスファターゼ活性、または抗原特性を有するタンパク質を生産する 。例えば、本発明の抗体は他の供給源に由来するモジュレーターペプチドのホモ ログのスクリーニングに容易に利用され得る。 本発明のモジュレーターペプチドをコードする遺伝子はまた、mRNA選択、すな わち核酸ハイブリダイゼーションおよびそれに続くインビトロトランスレーショ ン、により同定され得る。この手順において、フラグメントは、相補的mRNAをハ イブリダイゼーションによって単離するために使用される。そのようなDNAフラ グメントは入手可能な精製されたモジュレーターのDNAを示し得る。単離されたm RNAの生産物のインビトロトランスレーション生産物の、免疫沈降分析または機 能的アッセイ(例えば、チロシンホスファターゼ活性)によりmRNAが同定され、そ れゆえ所望の配列を含有する相補的DNAフラグメントが、同定される。さらに、 特異的なmRNAは、細胞から単離されたポリソームの、モジュレーターペプチドに 対して特異的な固定化抗体への吸着により選択され得る。 放射性標識されたモジュレーターペプチドcDNAは、(吸着されたポリソームか ら)選択されたmRNAを鋳型として使用して合成され得る。次に放射性標識されたm RNAまたはcDNAは他のゲノムDNAフラグメントの中から相同なモジュレーターペプ チドDNAフラグメントを同定するためのプローブとして使用され得る。 上記のように、本明細書中で開示される体重モジュレーターペプチドをコード するDNA配列は、クローン化によらず合成で調製され得る。DNA配列は、体重モジ ュレーターペプチドのアミノ酸配列に適切なコドンをもって設計され得る。一般 に配列を発現に使用する場合は、意図する宿主にとって好ましいコドンを選択す る。標準的な方法で調製し、そして完全なコード配列に組み合わせた重複するオ リゴヌクレオチドから、完全な配列を組み立てる。例えば、Edge，Nature，292: 756(1981); Nambairら、Science，223:1299(1984); Jayら、J．Biol．Chem.，25 9:6311(1984)を参照のこと。 上記のように、合成DNA配列は体重モジュレーターのアナログを発現する遺伝 子の簡便な構築を可能にする。あるいは、アナログをコードするDNAは天然のOB 遺伝子またはcDNAの部位特異的突然変異によって作製され得、そしてアナログは 従来のポリペプチド合成を使用して直接作製され得る。 非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みのための一般的な方法は Norenら、Science，244:182-188(1989)に記載されている。本方法は非天然アミ ノ酸をもつobポリペプチドのアナログの作製に使用され得る。 非コード核酸 本発明は、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムの調製にまで及び、本 発明を用いて体重モジュレータータンパク質の発現を翻訳レベルで妨げ得る。本 アプローチでは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用して、特異的なmRNA の翻訳をブロックするが、これは、mRNAをアンチセンス核酸でマスクするかある いはリボザイムで切断することによる。 アンチセンス核酸は、特異的なmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNAまた はRNA分子である(Weintraub，Sci．Am.，262:40-46(1990); Marcus-Sekura，Ana l．Biochem.，172:289-295(1988)を参照のこと)。細胞内においてアンチセンス 核酸はmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖の形 態に複合体化されたmRNAを翻訳しない。それゆえ、アンチセンス核酸はmRNAのタ ンパク質への発現を妨げる。約15ヌクレオチドのオリゴマーおよびAUG開始コド ンにハイブリダイズする分子は特に効率的である。なぜならそれらは合成が容易 であり、そして体重モジュレーターペプチド産生細胞に導入する際に生じる問題 が、より大きな分子の場合よりも少ないと思われるからである。アンチセンス法 は多くの遺伝子のインビトロにおける発現を阻害するために使用されている(Mar cus-Sekura、(1988)、上記; Hamborら、J．Exp．Med.，168:1237-1245(1988))。 リボザイムは、他の一本鎖RNA分子をDNA制限エンドヌクレアーゼにいくぶん類 似する様式で特異的に切断する能力を有するRNA分子である。リボザイムは、あ る種のmRNAがそれ自身のイントロンを削除する能力を有するという観察から発見 された。これらのRNAのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者らはRNA 分子における特異的なヌクレオチド配列を認識し、そして切断する分子を設計し 得る(Cech，J．Am．Med．Assoc.，260:3030-3034(1988))。これらのリボザイム は配列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不活化される。 研究者らは２タイプのリボザイム、Tetrahymenaタイプおよび「ハンマーヘッ ド」タイプ、を同定した。Tetrahymenaタイプリボザイムは４塩基配列を認識し 、「ハンマーヘッド」タイプは11〜18塩基配列を認識する。認識配列が長ければ 長いほど、標的mRNA種により限定されて起こり得る。それゆえ、ハンマーヘッド タイプリボザイムはTetrahymenaタイプリボザイムよりも特異的なRNA種の不活化 において好ましく、そして18塩基認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。 それゆえ、本明細書中に記載のDNA配列は、体重モジュレータータンパク質お よびそのリガンドのmRNAに対するアンチセンス分子およびmRNAを切断するリボザ イムの調製に使用され得、それゆえob遺伝子の発現を阻害し、そして体重増加お よび肥満に導く。 他の実施態様において、OB核酸のコード鎖および相補鎖、またはOB遺伝子の5' 、 3'、あるいはコード領域の内部の(イントロンの)非コード領域に相補的な短いオ リゴヌクレオチドが本発明により提供される。そのような核酸は直接標識された オリゴヌクレオチドプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーのいず れかとしてプローブに有用であり、ob遺伝子内の突然変異の存在、またはOB mRN Aの発現レベルの評価を目的とする。好ましくは、本発明の非コード核酸はヒトO B遺伝子由来である。 特定の実施態様において、非コード核酸は、増幅し得る遺伝子および/または 他の調節配列をOB遺伝子の付近に組み込ませるための相同的組換えを目的とし、 例えばOBポリペプチドの高レベルの発現、またはOBポリペプチドの適切な発現レ ベルを妨げるob遺伝子調節配列における変異の克服を目的とする(国際特許公報 第WO 91/06666号、1991年５月16日Skoultchiにより公開、；国際特許公報第WO 9 1/09955号、1991年７月11日Chappelにより公開、；また国際特許公報第WO 90/14 092号、1990年11月29日KucherlapatiおよびCampbellにより公開、を参照のこと) 。 OBポリペプチドの生産: 発現および合成 転写および翻訳制御配列はプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど のようなDNA調節配列であり、宿主細胞におけるコード配列の発現を目的とする 。真核細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。 RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次いでこのmRNAがトランスRNA スプライシングを受け、そしてコード配列によってコードされるタンパク質に翻 訳されるとき、コード配列は細胞内において転写および翻訳制御配列の「制御下 」にある。 「シグナル配列」は細胞の表面に発現されるタンパク質のコード配列の始めに 含まれる。この配列は成熟ポリペプチドのN-末端側にあるシグナルペプチドをコ ードし、ポリペプチドの輸送を宿主細胞に指示する。用語「輸送シグナル配列」 もまた本明細書中に用いられ、この種類のシグナル配列を意味する。輸送シグナ ル配列は各種の真核生物および原核生物由来のタンパク質に関して見出され得、 しばしば両方のタイプの生物において機能的である。 DNA配列は発現制御配列に、発現制御配列がDNA配列の転写および翻訳を制御お よび調節するとき、「作動可能に連結される」。用語「作動可能に連結される」 とは、発現されるDNA配列の前に適切な開始シグナル(例えば、ATG)を有すること 、および発現制御配列の制御下でのDNA配列の発現およびDNA配列にコードされる 所望の生産物の生産をもたらすために正しい読みとり枠を維持することを包含す る。組換えDNA分子に挿入しようとする遺伝子が適切な開始シグナルを含有しな い場合は、このような開始シグナルがその遺伝子の上流(5')およびその遺伝子を 有する読みとり枠内に挿入され得る。 「プロモーター配列」は細胞内でRNAポリメラーゼと結合して下流(3'方向)の コード配列の転写を開始させ得るDNA調節領域である。本発明を明確にする目的 のためには、プロモーター配列はその3'末端で転写開始部位により境界付けられ 、そしてバックグラウンド以上の検出し得るレベルの転写を開始するために必要 な最小数の塩基または要素を含有するように上流(5'方向)に延長する。プロモー ター配列の内部には、転写開始部位(例えばS1ヌクレアーゼによるマッピングに より容易に定義される)、およびRNAポリメラーゼの結合するタンパク質結合ドメ イン(コンセンサス配列)が見られる。 本発明の別の特徴は、本明細書中で開示されるDNA配列の発現である。当該分 野において公知なように、DNA配列はそれを適切な発現ベクター内の発現制御配 列に作動可能に連結し、そして発現ベクターを適切な単細胞宿主にトランスフォ ームするために使用することによって発現し得る。 そのような発現制御配列への本発明のDNA配列の作動可能な連結は、当然、必 ずしもDNA配列の一部でない場合でも、開始コドンであるATGの、DNA配列上流の 正しい読みとり枠への提供を包含する。 多種多様な宿主/発現ベクターの組み合わせが、本発明のDNA配列の発現に使用 され得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成DNA 配列のセグメントからなり得る。適切なベクターは、SV40の誘導体および公知の 細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドcolE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、 またはpUCプラスミド誘導体、例えば、pGEXベクター、pETベクター、pmal-c、pF LAGなど、およびそれらの誘導体、RP4のようなプラスミド; ファージDNA、例え ば、多数のλファージの誘導体、例えば、NM989、および他のファージDNA、例え ば、M13および線状一本鎖ファージDNA; ２μプラスミドまたはその誘導体のよう な酵母プラスミド; 昆虫または哺乳類細胞において有用なベクターのような真核 細胞において有用なベクター; ファージDNAまたは他の発現制御配列を使用する ように改変したプラスミドのような、プラスミドおよびファージDNAの組み合わ せから誘導されるベクターなどを含有する。好ましい実施態様において、obの発 現はメチロトロフ酵母、例えば、Pichia pastoris酵母において達成される(例え ば、国際特許公報第WO 90/03431号、1990年４月５日Brierleyらにより公開; 国 際特許公報第WO 90/10697号、1990年９月20日Siegelらにより公開、を参照のこ と)。下記の特定の実施態様において、発現ベクターがα接合因子シグナル配列 の制御下でのobの発現のために設計される。 任意の多種多様な発現制御配列、作動可能に連結されたDNA配列の発現を制御 する配列、がこれらのベクターにおいて本発明のDNA配列を発現させるために使 用され得る。そのような有用な発現制御配列は、例えばSV40の初期または後期プ ロモーター、CMV、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウィルス、lacシステム 、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、LTRシステム、λファージのメジャ ーオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホ スホグリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホス ファターゼ(例えば、Pho5)のプロモーター、メチロトロフ酵母のAOX1プロモータ ー、酵母α-接合因子のプロモーター、および原核細胞または真核細胞、あるい はそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、およ びそれらの種々の組み合わせを包含する。 多種多様の単細胞宿主細胞もまた、本発明のDNA配列の発現において有用であ る。これらの宿主は、E．coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、；酵母 などの菌類(Saccharomyces、およびPichia、Candida、Hansenula、およびTorulo psisのようなメチロトロフ酵母); および、CHO、R1.1、B-W、およびLM細胞、ア フリカミドリザル肝臓細胞(例えば、COS1、COS7、BSC1、BSC40、およびBMT10)、 昆虫細胞(例えば、Sf9)、およびヒト細胞のような動物細胞、ならびに組織培養 の植物細胞のような周知の真核性および原核性宿主を包含し得る。 すべてのベクター、発現制御配列、および宿主が、本発明のDNA配列を発現す るために同等に良好に機能するわけではないと理解される。いすれの宿主も同一 の発現系に同等に良好に機能するわけではない。しかし、当業者は適切なベクタ ー、発現制御配列、および宿主を、所望の発現を達成するために必要以上に実験 をしたり、本発明の範囲を逸脱することなく選択し得る。例えば、ベクターの選 択において、宿主を考慮する必要がある、なぜならベクターはその中で機能する はずであるからである。ベクターのコピー数、コピー数の制御能、および抗生物 質マーカーのようなベクターにコードされる他のいずれのタンパク質の発現も考 慮され得る。 発現制御配列の選択において、種々の因子が通常考慮される。これらは例えば 、系の相対的な強度、その制御能、および、特に取り得る２次構造に関して、そ の発現される特定のDNA配列または遺伝子との適合性を包含する。適切な単細胞 宿主は、例えば選択されたベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に フォールディングする能力、および発酵要求性、ならびに発現されるDNA配列に コードされる生産物の宿主に対する毒性、および発現生産物の精製の容易さを考 慮することによって選択される。 これらおよびその他の因子を考慮して当業者は、本発明のDNA配列を発酵また は大規模動物細胞培養において発現する種々のベクター/発現制御配列/宿主の組 み合わせを構築し得る。 特定の実施態様において、OB融合タンパク質が発現され得る。OB融合タンパク 質は、少なくとも機能的に活性なOBポリペプチドの部分にペプチド結合によって 結合された少なくとも機能的に活性な非OBタンパク質の部分を包含する。非ob配 列はOB配列のアミノまたはカルボキシ末端であり得る。より好ましくは、タンパ ク質分解的に不活性なOB融合タンパク質の安定な発現のためには、非OB融合タン パク質の部分はOBタンパク質のアミノ末端にペプチド結合によって結合される。 このような融合タンパク質をコードする組換えDNA分子は、OBコード配列に読み 取り枠内で結合された少なくとも機能的に活性な非OBタンパク質の部分をコード する配列を含み、好ましくは、特異的なプロテアーゼ例えば、トロンビンまたは 第Xa因子に対する切断部位を、好ましくはOB-非OB連結部でコードする。特定の 実施態様において、融合タンパク質はEscherichia coliまたはP．pastorisにお いて発現される。 下記の特定の実施態様において、ベクターはマウスおよびヒトob遺伝子を、gl n-49のコドンを有しておよび有さないで、細菌発現系および酵母(Pichia)発現系 において融合タンパク質として発現するために調製した。ob遺伝子は例えばPCR および新規なプライマーを使用して、エンドヌクレアーゼ切断部位を有して調製 される。PCRによって生じた配列を確認するのが望ましい、なぜなら本技術に関 しては点突然変異を含有する可能性がより高いからである。ヒスチジンtag(His- Tag)およびプロテアーゼ切断部位を含有するプラスミドが使用される。ヒスチジ ンの存在により組換えタンパク質のNi-キレートカラムまたはアフィニティー精 製により選択的単離が可能になる。プロテアーゼ切断部位（下記の特定の実施態 様ではトロンビン切断部位）が設計されプロテアーゼ（例えばトロンビン）によ る処理で完全長の成熟（すなわちシグナル配列を欠く）OBポリペプチドを放出す る。 他の局面において、pGEXベクター(Smithら、Gene 67:31-40(1988))が使用され 得る。本ベクターは住血吸虫(schistosoma japonicum)グルタチオンS-トランス フェラーゼcDNAを目的の配列に融合する。細菌のタンパク質を回収し、組換えタ ンパク質を還元型グルタチオンアフィニティーカラムで迅速に精製し得る。GST キャリアーは後に部位特異的プロテアーゼを用いた切断によって融合タンパク質 から切断され得る。切断の後、キャリアーおよび切断されなかった融合タンパク 質はグルタチオンアガロースへの吸着によって除去され得る。この系は、コード されるタンパク質が水溶液に不溶性である場合、時おり問題が生じる。 細菌系における組換えタンパク質の発現は、発現タンパク質の不正確なフォー ルディングを生じ得、再フォールディングが必要である。組換えタンパク質を切 断の前または後に再フォールディングし、機能的に活性なOBポリペプチドを形成 し得る。OBポリペプチド、は以下の工程により再フォールディングされる：(i) タンパク質の還元剤を含有する変成バッファー中でインキュベートする工程、(i i)タンパク質を酸化剤、好ましくはタンパク質安定化剤またはカオトロピック剤 の一方または両方もまた含有する緩衝液中でインキュベートする工程。適切な酸 化還元（還元/酸化剤）の対は以下を包含するがそれに限定されない、還元型グ ルタチオン/グルタチオンジスルフィド、シスチン/システイン、シスタミン（cy stamine）/システアミン、および2-メルカプトエタノール/2-ヒドロキシエチル ジスルフィド。特定の局面において、融合タンパク質は還元バッファーに交換す る前に尿素のような変成剤中で可溶化され得る。好ましい実施態様においては、 タンパク質は還元バッファーに交換する前に例えば、イオン交換クロマトグラフ ィーまたはNi-キレートクロマトグラフィーによっても精製される。変成剤は尿 素および塩酸グアニジンを含有するがそれに限定されない。次に組換えタンパク 質を少なくとも約10倍以上に、より好ましくは約100倍に、0.1MTris-HCl,pH8.0 、1mM EDTA、0.15M NaCl、0.3M酸化型グルタチオンのような、しかし限定されな い、酸化剤を含有する酸化バッファーに希釈する。次に融合タンパク質は約１か ら約24時間、好ましくは約２から約16時間、室温で酸化バッファー中でインキュ ベートされる。酸化バッファーは、例えば糖、アルコール、または硫酸アンモニ ウムのようなタンパク質安定化剤を含み得る。酸化バッファーはさらにカオトロ ピック剤を低濃度で含有して、不正確な分子間相互作用を不安定化し、それゆえ に適切なフォールディングを促進する。適切なカオトロピック剤としては、界面 活性剤、ポリオール、L-アルギニン、塩酸グアニジン、およびポリエチレングリ コール(PEG)が挙げられるがそれに限定されない。十分に低濃度のカオトロピッ ク剤を使用してタンパク質の変成を避けることが重要である。再フォールディン グしたタンパク質は少なくとも約10倍以上に、より好ましくは酸化バッファーに 希釈されたもとの量に濃縮される。 細菌発酵方法はまた、受容され得ないレベルのエンドトキシンを含有するタン パク質調製物を生じさせ得る。それゆえ、本発明は、例えばエンドトキシン特異 的抗体または他のエンドトキシン結合分子を使用したそのようなエンドトキシン の除去を意図する。エンドトキシンの存在はE-TOXATE試薬(Sigma，St.Louis，Mi ssouri)の使用、またはバイオアッセイのような標準的な技術によって決定され 得る。 特定の実施例に加え、本発明者はバキュロウィルス、哺乳類、および酵母発現 系のobタンパク質の発現への使用を意図する。例えば、バキュロウィルス発現系 において、pVL941(BamHIクローニング部位; Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、 XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII、およびPstIクローニング部位; Invitrogen )、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、およびBamH1クロ ーニング部位; SummersおよびInvitrogen)、およびpBlueBacIII(BamH1、BglII、 PstI、NcoI、およびHindIIIクローニング部位、青色/白色組換え体スクリーニン グ可能; Invitrogen)のような、しかし限定されない非融合トランスファーベク ター、およびpAc700(BamHIおよびKpnIクローニング部位、BamHI認識部位は開始 コドンから始まる; Summers)、pAc701およびpAc702(pAc700と同様、異なる読み とり枠を有する)、pAc360(ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流のBamHIクロ ーニング部位; Invitrogen(195))、およびpBlueBacHisA、B、C(３種の異なる読 みとり枠、BamHI、BglII、PstI、NcoI、およびHindIIIクローニング部位、ProBo nd精製のためのN-末端ペプチド、およびプラークの青色/白色組換え体スクリー ニング; Invitrogen(220))のような、しかし限定されない融合トランスファーベ クターの両方が包含される。 本発明において使用を意図する哺乳類発現ベクターはジヒドロ葉酸レダクター ゼ(DHFR)プロモーターのような誘導性プロモーターを有するベクターを包含する 。それは例えば、DHFR発現ベクター、またはpED(PstI、SalI、SbaI、SmaI、およ びEcoRIクローニング部位、クローン化遺伝子およびDHFRの両方を発現するベク ター; Kaufmann，Current Protocols in Molecular Biology、16.12(1991)を参 照のこと)のようなDHFR/メトトレキセート共増幅ベクターの任意な発現ベクター である。あるいは、pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、およびBclIクロ ーニング部位、ベクターはグルタミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を発現 ; Celltech)のようなグルタミンシンターゼ/メチオニンスルフォキシミン共増幅 ベクター。その他の実施態様における、pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI 、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的RSV-LTRプロモ ーター、ヒグロマイシン選択マーカー; Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI 、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的hC MV即時初期遺伝子、ヒグロマイシン選択マーカー; Invitrogen)、pMEP4(KpnI、P vuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHIクローニング部位、誘導性メタ ロチオネインIIa遺伝子プロモーター、ヒグロマイシン選択マーカー; Invit rogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI、およびKpnIクローニング部 位、RSV-LTRプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー; Invitrogen)、pREP9( KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、およびBamHIクローニング部位、RSV- LTRプロモーター、G418選択マーカー; Invitrogen)、およびpEBVHis(RSV-LTRプ ロモーター、ヒグロマイシン選択マーカー、ProBond樹脂で精製可能で、そして エンテロキナーゼで切断されるN-末端ペプチド; Invitrogen)などのようなエプ スタイン-バーウィルス（Epstein Barr Virus）(EBV)の制御下でのエピソーム発 現に導くベクター。本発明において使用される選択し得る哺乳類発現ベクターは 、pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、およびApaIクローニング部位、G418選 択; Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部 位、G418選択; Invitrogen)などを含む。本発明に従って使用されるワクシニア ウィルス哺乳類発現ベクター(Kaufman、(1991)、上記を参照のこと)は、pSC11（ SmaIクローニング部位、TK-およびβ-gal選択)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、Nar I、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、およびHindIIIクローニング部位 ; TK-およびβ-gal選択)、およびpTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII 、SbaI、BamHI、およびHpaクローニング部位、TKまたはXPRT選択)などを含むが それに限定されない。 酵母発現系もまた本発明に従ってOBポリペプチドの発現に使用され得る。例え ば、非融合pYES2ベクター(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GStXI、EcoRI、BstXI、Bam H1、SacI、Kpn1、およびHindIIIクローニング部位; Invitrogen)または融合pYES HisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、およ びHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断 されるN-末端ペプチド; Invitrogen)の２例のみ挙げるが、本発明に従って使用 され得る。 体重モジュレーターペプチドアナログが、本発明の範囲に由来するヌクレオチ ド配列から調製され得ることがさらに意図される。 OBポリペプチドの組換え発現に加え、本発明は、OBポリペプチド、またはその フラグメントの、周知で高度に開発された固相ペプチド合成技術を用いての、調 製を想定し完全に可能にする。本発明は一般的なBocおよびFmocの両方、および その他の保護基ストラテジーのobポリペプチドまたはそのフラグメントの調製へ の使用を意図する。再フォールディングおよびシステイン側鎖の酸化をしてジス ルフィド結合を形成する種々の技術もまた当該分野に周知である。 OBポリペプチドに対する抗体 本発明に従い、組換えまたは化学合成で生産したOBポリペプチド、およびその フラグメントまたはその他の誘導体あるいはアナログ（融合タンパク質を含む） は、OBポリペプチドを認識する抗体を生じさせるための免疫原として使用され得 る。そのような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab フラグメント、およびFab発現ライブラリーを含むがそれに限定されない。 分子は、免疫グロブリン(抗体)またはＴ細胞抗原レセプターのような免疫系の 抗原認識分子と特異的に相互作用し得るときに「抗原性」である。抗原性のポリ ペプチドは少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約10個アミノ酸を含有する 。分子の抗原性部分は、抗体またはＴ細胞レセプター認識に免疫優先である部分 であり得、または免疫感作のために抗原性部分をキャリアー分子にコンジュゲー トすることにより分子に対する抗体を生じさせるのに使用される部分であり得る 。抗原性の分子はそれ自身が免疫原性である、すなわちキャリアーなしで免疫応 答を引き起こし得る、必要はない。 「抗体」は特異的なエピトープに結合する任意の免疫グロブリンであり、この 免疫グロブリンには抗体およびそのフラグメントが含まれる。この用語はポリク ローナル、モノクローナル、キメラ抗体(米国特許第4,816,397号および同第4,81 6,567号にさらに詳細に記載)、ならびにFab、F(ab')2、およびF(v)(一本鎖抗体 を含む)を含む抗体の抗原結合部分を含む。従って、語句「抗体分子」は、本明 細書中で用いられる種々の文法的形態において、インタクトな（intact）免疫グ ロブリン分子および抗体結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫的に活性 な部分の両方を意図する。「抗体結合部位」は抗原に特異的に結合するＨ鎖およ びＬ鎖の可変および超可変領域から構成され抗体分子の構造的部分である。抗体 分子の例としては、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免 疫グロブリン分子、および当該分野においてFab、Fab'、F(ab')2、およびF(v)と して公知の部分を含むパラトープを含有する免疫グロブリンの部分が挙げられる 。 抗体分子のFabおよびF(ab')2部分はパパインおよびペプシンそれぞれのタンパ ク質分解反応により調製され、実質的にインタクトな抗体分子については周知の 方法による。例えば、米国特許第4,342,566号、Theofilopolousらを参照のこと 。Fab'抗体分子部分もまた周知であり、そしてF(ab')2部分から、メルカプトエ タノールで二本のＨ鎖部分を連結しているジスルフィド結合を還元し、続いて得 られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化 して生産される。インタクトな抗体分子を含む抗体が本明細書中において好まし い。 語句「モノクローナル抗体」は種々の文法的形態において、特定の抗原と免疫 反応し得る抗体結合部位を１種類のみ有する抗体を意味する。モノクローナル抗 体はそれゆえ、それが免疫反応する任意の抗原に対して単一の結合親和性を典型 的に提示する。従って、モノクローナル抗体は、複数の、それぞれが異なる抗原 に免疫特異的な抗体結合部位を有する抗体分子、例えば２特異性(キメラ)モノク ローナル抗体、を含み得る。 用語「アジュバント」は抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物 を意味する。アジュバントは、徐々に抗原を放出する組織貯蔵所として、また免 疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性因子として作用し得る[Hoodら、Immun ology、384頁、第２版、Benjamin/Cummings，Menlo Park，California(1984)]。 しばしば、抗原のみによる、アジュバント非存在下の、１次の免疫は、体液性ま たは細胞性免疫応答を引き起こし得ない。アジュバントは完全フロイントアジュ バント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのよう なミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール 、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペ ットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(bacille Calmette-Guerin) およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントを包含 するがそれに限定されない。好ましくは、アジュバントは薬学的に受容される。 当該分野に公知の種々の工程が、OBポリペプチド、あるいはそのフラグメント 、誘導体、またはアナログに対するポリクローナル抗体の生産に使用され得る。 抗体の生産のためには、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むがそ れ に限定されない種々の宿主動物が、OBポリペプチドまたはその誘導体(例えば、 フラグメントまたは融合タンパク質)の注入によって免疫され得る。１つの実施 態様において、OBポリペプチドまたはそのフラグメントは、例えばウシ血清アル ブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)の免疫原性キャリア ーに結合され得る。種々のアジュバント、フロイント(完全および不完全)、水酸 化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性物質、プ ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(bacille Calmette-G uerin)およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバント を含むがそれに限定されない、が宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させる ために使用され得る。 OBポリペプチド、あるいはそのフラグメント、アナログ、または誘導体に関す るモノクローナル抗体の調製のためには、培養中の連続的細胞株による抗体分子 の生産を提供する任意の技術が使用され得る。これらの技術は、Kohlerら(Natur e，256:495-497(1975))によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならび にヒトB細胞ハイブリドーマ技術であるトリオーマ技術(Kozbrら、Immunology To day，4:72(1983))、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブ リドーマ技術[Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77-96頁， Alan R．Liss，Inc.，(1985)]を包含するがそれに限定されない。不死の抗体生 産細胞株は、Ｂリンパ吸の癌遺伝子DNAによる直接トランスフォーメーション、 またはエプスタイン-バーウィルスによるトランスフェクションなどの融合以外 の技術により作製され得る(例えば、M．Schreierら、「Hybridoma Techniques」 (1980); Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas」(19 81); Kennettら、「Monoclonal Antibodies」(1980)を参照のこと; また米国特 許第4,341,761号; 同第4,399,121号; 同第4,427,783号; 同第4,444,887号; 同第 4,451,570号; 同第4,466,917号;同第4,472,500号; 同第4,491,632号; および同 第4,493,890号を参照のこと)。 本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル抗体は近年の技術を利用 して無菌動物において生産され得る(PCT/US90/02545)。本発明に従って、ヒト抗 体は使用され得、そしてヒトハイブリドーマを使用して[Coteら、Proc．Natl．A cad．Sci．USA，80:2026-2030(1983)]、またはヒトＢ細胞をEBVウィルスにより インビトロにおいてトランスフォームすることにより(Coleら、1985、上記)、獲 得され得る。実際、本発明に従い、「キメラ抗体」[Morrisonら、J．Bacteriol. ,159-870(1984); Neubergerら、Noture，312:604-608(1984); Takedaら、Noture ，314:452-454(1985)]の生産のために、obポリペプチドに特異的なマウス抗体分 子からの遺伝子と適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とを組み継ぐ ことによって開発された技術が使用され得る; そのような抗体は本発明の範囲内 である。このようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾病または疾患の治 療における使用(以下で記載)に好ましい、なぜならヒトまたはヒト化抗体は異種 移植抗体よりもそれ自身で免疫応答、特にアレルギー反応を引き起こす可能性が 非常に低いからである。 本発明に従って、一本鎖抗体の生産のために記載された技術(米国特許第4,946 ,778号)、がOBポリペプチド特異的一本鎖抗体の生産に適応され得る。本発明の さらなる実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築のために記載される技術[Huse ら、Science，246:1275-1281(1989)]が、obポリペプチド、あるいはその誘導体 またはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速で 容易な同定をもたらすために利用する。 抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを公知の技術により生 じさせ得る。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化で生 産され得るF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋の還 元で生じさせ得るFab'フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で 処理して生じさせ得るFabフラグメントを含むが、それに限定されない。 抗体の生産において、所望の抗体のスクリーニングは当該分野に公知の技術、 例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素免疫吸着測定法)、「サンドウィッ チ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免 疫拡散測定法、インサイチュイムノアッセイ(例えば、金コロイド、酵素、また は放射性同位元素標識物使用)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集測定法(例 えば、ゲル凝集測定法、血液凝集測定法)、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、 プロテインＡ測定法、および免疫電気泳動測定法など、により達成され得る。１ つの実施態様において、抗体は１次抗体の標識を検出することにより検出される 。他の実施態様において、１次抗体は２次抗体または試薬の１次抗体の結合を検 出することにより検出される。さらなる実施態様において、２次抗体は標識され る。イムノアッセイにおける結合の検出のための多くの方法が当該分野において 公知であり、本発明の範囲内にある。例えば、OBポリペプチドの特異的なエピト ープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含有するOBポリ ペプチドフラグメントに結合する生産物について、生じたハイブリドーマをアッ セイし得る。特定の動物種からのOBポリペプチドに特異的な抗体の選択のために 、動物種の細胞から発現または単離されるOBポリペプチドとの陽性結合に基づい て選択し得る。 上記の抗体はOBポリペプチドの位置測定(localization)および活性に関連して 、例えば、ウェスタンブロッティング、インサイチュにおけるOBポリペプチドの イメージング、適切な生理学的サンプル中のそのレベルの測定など、当該分野で 公知の方法で使用され得る。 特定の実施態様において、OBポリペプチドの活性を作動的または拮抗的に作用 する抗体を生じ得る。そのような抗体は後述のリガンド同定のためのアッセイを 使用して試験され得る。 特定の実施態様において、抗体は、タンパク質の配列から予想された合成ペプ チドまたは細菌発現ベクターを使用して作製された組換えタンパク質でウサギを 免疫して開発される。合成ペプチドの選択は上記のように、予想されるタンパク 質構造の慎重な解析によりなされる。特に、推定上の切断部位の間のペプチド配 列が選択される。合成ペプチドはKLHヘモシアニンまたはBSAのようなキャリアー にカルボジイミドを使用して結合され、フロイントアジュバント中でウサギの免 疫に使用される。組換えタンパク質を調製するために、pGEXベクターがポリペプ チドの発現に使用され得る(Smithら、1988、上記)。あるいは、親水性ドメイン のみが融合タンパク質を生じさせるために使用され得る。発現タンパク質は大量 に調製されフロイントアジュバント中でウサギの免疫に使用される。 他の特定の実施態様において、組換えOBポリペプチドはニワトリの免疫に使用 され、ニワトリ抗OB抗体は卵黄から、例えば、OBカラムのアフィニティ精製によ って、回収される。好ましくは、免疫に使用されるニワトリは特定の無病原体(S PF)状態に保たれる。 他の実施態様において、レプチンに対する抗体が、循環OBタンパク質を欠くob /obマウスにおいて生じ、それゆえ抗OBポリペプチド応答を生じる得ると期待さ れる、なぜなら、それはポリペプチドおよび野生型マウスにたいして寛容でない からである。 さらなる実施態様において、組換えOBポリペプチドはウサギの免疫に使用され 、ポリクローナル抗体は以後の使用前に免疫精製される。精製された抗体は、半 定量的アッセイ、特に血清または血漿中の循環OBポリペプチドの存在の検出に、 特に有用である。 モジュレーターペプチドに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルは種 々の特性、すなわちイソタイプ、エピトープ、親和性など、についてスクリーニ ングされ得る。特に重要なのはモジュレーターペプチドの活性を中和するモノク ローナル抗体である。そのようなモノクローナルは体重モジュレーターの活性ア ッセイで容易に同定される。高親和性抗体はまた、天然のまたは組換えモジュレ ーターの免疫親和性精製が可能であるときに有用である。 好ましくは、本発明の診断および治療方法に使用される抗モジュレーター抗体 は親和性精製されたポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノク ローナル抗体(mAb)である。さらに、本明細書中で使用される抗モジュレーター 抗体は、抗体分子全体のFab、Fab'、F(ab')2、またはF(v)の形態であることが好 ましい。 診断用途 本発明はまた、本発明の体重モジュレーターに媒介される活性を引き出すそれ らの能力に関連して、体重の異常または脂肪症に影響を与える状態および/また は刺激の存在を検出する方法を包含する、種々の診断への応用に関する。上に記 載したように、体重モジュレーターペプチドは種々の公知の技術により本ペプチ ドに対する抗体を産生するために使用され得、次いでこのような抗体が単離され 、 そして対象の標的細胞における特定の転写活性の存在についての試験において使 用され得る。あるいは、本発明の核酸は診断に使用され得る。 抗体に基づいた診断 上に示唆したように、本発明において有用な診断法は、抗モジュレーター抗体 、好ましくはアフィニティー精製したポリクローナル抗体、より好ましくはモノ クローナル抗体(mAb)のようなモジュレータータンパク質に対するアンタゴニス トの有効量を含むアッセイによって細胞サンプルまたは培養液を試験することを 包含する。さらに、本明細書中で使用される抗モジュレーター抗体分子は、好ま しくは抗体分子全体のFab、Fab'、F(ab')2、あるいはF(v)部分の形態または抗体 分子全体である。既に論じたように、この方法からの利益を得られ得る患者は癌 、AIDS、肥満症または異常な体重が特徴または因子となる他の状態を患う患者を 含む。モジュレーターを単離し、そして抗モジュレーター抗体を誘導する方法お よび抗モジュレーター抗体の能力を測定し、そして最適化して標的細胞の試験を 援助する方法は当該分野に周知である。 また、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む抗体、および体 重モジュレーターおよび他の認識因子および/またはそのサブユニットの産生ま たは活性を調節する薬物は、ある種の診断への応用を有し得、例えば、体重の異 常が発症しているかあるいは発達しそうであり得る状態を検出および/または測 定する目的のために利用され得る。例えば、モジュレーターペプチドまたはその 活性なフラグメントは、例えば、融合されたマウス脾臓リンパ球および骨髄腫細 胞を利用するハイブリドーマ技術のような公知の技術によって、種々の細胞培地 中に自身に対するポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体を産生するこ とに使用され得る。これらの技術については以下に詳細に記載する。同様に、本 発明のレセプター認識因子の活性を模倣するまたはそれに拮抗する小分子が発見 または合成され得、診断的および/または治療的プロトコールに使用され得る。 細胞中の体重モジュレーターの存在は、このような測定に応用され得る通常の 免疫学的手順によって確認され得る。多くの有用な手順が公知である。３つのこ のような特に有用な手順は、検出可能な標識で標識されたレセプター認識因子、 検出可能な標識で標識された抗体Ab1、または検出可能な標識で標識された抗体A b2を利用する。手順は以下の式で要約され、ここで式中のアステリスク（*）は 粒子が標識されていることを示し、「WM」は体重モジュレーターを表す。 Ａ．ＷＭ*＋Ａｂ1＝ＷＭ*Ａｂ1 Ｂ．ＷＭ＋Ａｂ* 1＝ＷＭＡｂ1 * Ｃ．ＷＭ＋Ａｂ1＋Ａｂ2 *＝Ａｂ1ＷＭＡｂ2 * 手順およびその応用はすべて当業者に周知であり、従って本発明の範囲で利用さ れ得る。「競合」手順、手順Ａ、は米国特許第3,654,090号および同第3,850,752 号に記載されている。手順Ｂは周知の競合アッセイ技術の典型である。手順Ｃ、 「サンドウィッチ」手順、は米国特許第RE 31,006号および同第4,016,043号に記 載されている。さらに「２重抗体」、または「DASP」手順のような他の手順が公 知である。 各々の場合において、体重モジュレーターは１つまたはそれ以上の抗体または 結合パートナーと複合体を形成し、複合体の１つのメンバーが検出可能な標識で 標識されている。複合体が形成された事実および、所望する場合その量は、標識 の検出に応用され得る公知の方法により測定され得る。 Ab2の特徴的特性はそれがAb1と反応することであることが上記から理解される 。なぜなら、これは１種の哺乳類種から生じたAb1が、その他の動物種において 抗体Ab2を生じる抗原として使用されたからである。例えばAb2は、ウサギ抗体を 用いて、ヤギ中で生じさせ得る。Ab2はそれゆえヤギで生じた抗ウサギ抗体であ る。本明細書中および特許請求の範囲の目的のために、Ab1は１次または抗体重 モジュレーター抗体を意味し、そしてAb2は２次または抗Ab1抗体を意味する。 これらの研究のために最も一般的に使用される標識は、放射性要素、酵素、紫 外光線にさらすと蛍光を発する化学物質などである。 多くの蛍光物質が公知であり標識として利用され得る。これらは例えば、フル オレセイン、ローダミンおよびオーラミンを含む。特定の検出物質はヤギで調製 された抗ウサギ抗体であり、イソチオシアネートによりフルオレセインと結合さ れる。 体重モジュレーターまたはその結合パートナーは放射性要素または酵素で標識 され得る。放射性標識は任意の現在入手し得る計数手順により検出され得る。好 ましい同位体元素は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃ ｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、および186Ｒｅから選択され得る。 酵素標識は同様に有用であり、任意の現在利用される比色、分光光度、蛍光分 光光度、電流測定またはガス測定の技術により検出され得る。酵素は選択された 粒子にカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドのような架橋分 子を用いた反応により結合される。これらの手順で使用され得る多くの酵素が公 知であり、そして利用され得る。好ましくは、ペルオキシダーゼ、β-グルクロ ニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコ ースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。 米国特許第3,654,090号; 同第3,850,752号; および同第4,016,043号が他の標識 物質および方法の開示例として引用される。 本発明のさらなる実施態様において、医学専門家による使用に適切な試験キッ トが、対象の標的細胞における所定の転写活性の有無、あるいは所定の転写活性 能を測定するために調製され得る。上記の試験技術に従って、このようなキット の１つのクラスは少なくとも標識された体重モジュレーターまたはその結合パー トナー、例えばそれに特異的な抗体、およびもちろん、例えば「競合」、「サン ドウィッチ」、「DASP」などの選択された方法に依存して、説明書を含有する。 キットはバッファー、安定化剤などの周辺試薬もまた含有し得る。 従って、試験キットは所定の転写活性について細胞での存在または能力を示す ために調製され得、以下のものを含有する: (a)所定量の少なくとも１つの標識された免疫化学的に反応性の成分であって 、検出されるレベルの本発明の体重モジュレーターまたはその特異的な結合パー トナーの直接的または間接的な付着により得られる成分; (b)他の試薬; および (c)そのキットの使用説明書 より具体的には、診断試験キットは以下のものを包含し得る: (a)既知の量の上記の体重モジュレーター(または結合パートナーであって)一 般に固相に結合して免疫吸着剤を形成するか、あるいは適切なタグ、または複数 のそれらの最終産物など(またはそれらの結合パートナー)の各々の１つに結合し た、体重モジュレーター; (b)必要な場合、他の試薬; および (c)そのキットの使用説明書。 さらなる多様性において、試験キットは上記の目的のために調製および使用さ れ、所定のプロトコール(例えば、「競合」、「サンドウィッチ」、「２重抗体 」など)に従って作用し、以下のものを包含する: (a)体重モジュレーターを検出し得る標識に結合して得られる標識された成分; (b)１つまたはそれ以上の別の免疫化学的試薬であって少なくとも１つの試薬 がリガンドまたは固定化されたリガンドであり、リガンドが以下からなる群より 選択される免疫化学的試薬: (i) 標識された成分(a)に結合可能なリガンド; (ii) 標識された成分(a)の結合パートナーに結合可能なリガンド; (iii) 測定しようとする単一または複数の成分の少なくとも１つに結合 可能なリガンド; および (iv) 測定しようとする少なくとも１つの単一または複数の成分の少な くとも１つの結合パートナーに結合可能なリガンド; ならびに (c)体重モジュレーターとその特異的な結合パートナーとの間の免疫化学的反 応の１つまたはそれ以上の成分の検出および/または測定のプロトコールの実施 のための説明書。 核酸に基づいた診断 下記の実施例に示すように、本発明の核酸は、結果として肥満表現型を生じる OBポリペプチドにおける欠陥に関連する欠陥の検出に使用され得る。例えば、核 酸プローブ(例えば、ノーザン解析またはRT-PCR解析)が肥満表現型がOBmRNA発現 の欠損、または非機能性OBmRNAの発現、例えば、db/dbマウス(その欠陥はOBレセ プターの欠損から生じる)または突然変異により非転写mRNAを生じる場合、のい ずれと関連するのかを決定するために使用される。そのうえ、本発明の核酸に基 づいた診断技術は抗体に基づいた技術とともに使用され得、さらなる肥満または 無食欲症の表現型の分子的理解を発展させる。 近年単離されたヒトcDNAクローンが本明細書中で示すように配列決定された。 これによりヒト遺伝子の完全な配列の決定が容易になった(図20A〜C; 配列番号2 2を参照のこと)。ヒトOB遺伝子のイントロンからのDNA配列が得られ(図20)、そ してこれらはOB遺伝子の突然変異または対立遺伝子変異体(allelic variant)を 同定するためにヒトゲノムDNAからOB遺伝子のコード配列をPCR増幅するためのPC Rプライマーを調製するために使用され、すべては本明細書中で上に詳細に記載 したプロトコールに従う。ヒトゲノムOBの増幅のための特異的なPCRプライマー は下記の特定の実施例に記載される。 最新の仮説では、ob遺伝子におけるヘテロ接合体の突然変異は軽度/中程度の 肥満に関連し、一方ホモ接合体の突然変異は肥満のためのいくつかのDNA配列に 基づいた診断的試験に関連する。これが真実であれば、発症のおそれのある人々 の肥満の進行についての確認が行え、体重の増加が完全に進行する前に薬物治療 および/または生活様式の変化の適用が可能になる。 あるいは、変異型ヒトOBとともに分離するマイクロサテライト(microsatellit e)の存在が診断に使用され得る。（図20A〜Cに提供されるヌクレオチド配列に基 づいたプライマーを含む）種々のPCRプライマーが、これに関して使用され得る 。 OB遺伝子はまた、特に栄養障害においてそのコードするRNAおよびタンパク質 の測定に診断上有用であり得る。特定の栄養障害において、OB RNAおよび/また はそれにコードされるタンパク質が調節されていないかまたは負の調節がなされ ているかを知ることは重要である。それゆえ、肥満型の人がOBレベルの増加を有 する場合は、問題はOBの下流にありそうであり、一方OBが減少していれば、OBの 不適切に低いレベルが肥満の原因であり得る(欠陥がOB遺伝子内であるか否かに かかわらず)。逆に、体重を落とした癌またはAIDSの患者が上昇したレベルのOB を有する場合は、不適切に高いOBの発現が体重低下の原因であると結論され得る 。 クローン化されたヒトcDNAはヒトOB RNAのレベルの測定に使用される。さらに 、組換えヒトタンパク質は調製され、そしてOBタンパク質の脂肪およびおそらく 血漿レベルの測定を可能にするイムノアッセイの開発に使用される。 治療用途 本発明のポリペプチド、核酸、および抗体は顕著な治療能力を有する。 好ましくは、このような試薬の治療有効量を、薬学的に受容可能なキャリア、希 釈剤、または賦形剤中で投与する。 用語「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投与する場合、生理学的に許容可能で あり、代表的にはアレルギーまたは同様の厄介な反応(例えば、胃の不調、めま いなど)を起こさない分子の実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細 書で用いる場合、用語「薬学的に受容可能な」は、動物における、そしてさらに 特定すればヒトにおける使用のために、連邦または州政府の規制局により認可さ れていること、もしくは米国薬局方(U.S．Pharmacopeia)、または他の一般に認 められた薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、化合物 とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する 。このような薬学的なキャリアは、水、および油などの滅菌した液体であり得、 これらは、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような石油、動物、植物、 または合成起源の液体を含む。好ましくは、水、または生理食塩水およびデキス トロース水溶液およびグリセロール溶液が、キャリアとして、特に注射液として 使用される。適切な薬学的キャリアは、Martin，Remington's Pharmaceutical S ciens，第18版、Mack Publishing Co.，Easton，PA，(1990)に記載されている。 本明細書中で用いられる用語「治療有効量」は、宿主の活性、機能、および応 答において、臨床的に重篤な欠陥を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50 ％、さらに好ましくは少なくとも90％減少するために、そして最も好ましくは予 防するに十分な量を意味する。あるいは、治療有効量は、宿主の、臨床的に重篤 な症状を改善するに十分である。 組換えOBポリペプチドの投与は、体重減少、特に脂肪組織の減少をもたらす。 本明細書で先に全てを詳細に記述したように、OBポリペプチドは、標準の、細菌 および／または哺乳動物発現ベクターを用いて、合成的に、調製され得、または 血漿または血清から精製され得る。あるいは、天然OBポリペプチドの増加した発 現が、上記のように相同組換え技術により誘導され得る。 OBポリペプチド活性の減少(アンタゴニスト、インヒビター、中和抗体の使用 、またはアンチセンス分子を開発することによる)は、癌、AIDS、または神経性 食欲不振にともなう体重減少の処置が望まれる場合、体重増加の結果を生じる。 OB活性の調整は、体重の減少(その活性を増加することによる)または体重の増加 (その活性を減少することによる)に有用であり得る。 ポリペプチドを基礎にした治療処置 最も単純な分析では、OB遺伝子は、哺乳動物、特にマウスおよびヒトで体重を 決定する。OB遺伝子産物および対応して同種の分子は、脂肪組織が脳および他の 器官と連絡するシグナル経路の一部分であるようである。OBポリペプチドはそれ 自身がシグナル分子、すなわちホルモンであると考えられている。 OBポリペプチド、または機能的に活性なその断片、またはそのアンタゴニスト は、経口または非経口、好ましくは非経口的に投与され得る。なぜなら、代謝恒 常性は連続的なプロセスであり、OBポリペプチドの制御された放出投与が好まし いからである。例えば、ポリペプチドは、静脈内注入、移植性浸透圧ポンプ、経 皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与され得る。１つの実施 態様では、ポンプが用いられ得る[Langerら編、Medical Applications of Contr olled Release，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974); Sefton，CRC Crit．R ef．Biomed．Eng.，14:201(1987); Buchwaldら、Surgery，88:507(1980); Saude kら、N．Engl．J．Med.，321:574(1989)]。別の実施態様では、ポリマー材料が 用いられ得る[Langer、1974、前出; Sefton，1987、前出; Smolenら編、Control led Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Wiley，Ne w York(1984); Rangerら、J．Macromol．Sci．Rev．Macromol．Chem.，23:61(19 83); 以下も参照のこと、Levyら、Science，228:190(1985); Duringら、Ann．Ne urol.，25:351(1989); Howardら、J．Neurosurg.，71:105(1989)]。さらに別の 実施態様では、制御された放出系は治療標的(すなわち、脳)に近接して配置され 得、従って、全身投与量の一画分のみを必要とする[例えば、Goodson，Medical Applications of Controlled Release，第２巻、115-138頁(1984)参照]。他の制 御放出系は、Langer、Science，249:1527-1533(1990)による総説で述べ られている。別の実施態様では、治療用化合物は、小胞、特にリポソームを用い て送達され得る(Langer、1990前出,を参照); Treatら、Liposomes in the Thera py of Infectious Disease and Cancer，Lopez-BeresteinおよびFidler(編)、Li ss，New York，353-365頁(1989); Lopez-Berestein,同書、317-327頁;一般に同 書を参照)。 さらなる局面において、OB遺伝子でトランスフォームされた組換え細胞および 高レベルのポリペプチドを発現する細胞は、OBポリペプチドを必要とする被験体 に移植され得る。好ましくは、拒絶を避けるために、OBでトランスフォームされ た自己の細胞が移植される；あるいは、免疫認識および拒絶を防ぐポリマーマト リックス内に、可溶性因子を生産する非自己の細胞を防御する技術が有用である 。 OBポリペプチドは、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下経路の投与 により送達され得る。あるいは、OBポリペプチドは、適切に製剤化され、鼻腔ま たは経口投与により投与され得る。OBの一定供給は、必要な間隔で、例えば、毎 日、12時間毎に、治療有効投与量(すなわち、被験体において代謝変化を誘導す るために有効な投与量)を提供することにより確保され得る。これらのパラメー ターは、処置されている病状の重篤度、他の作用(例えば、補充されている食餌 改変)、被験体の体重、年齢、および性別、ならびに他の基準に依存するが、そ れらは、当業者による標準の良好な医療の実践に従って容易に決定され得る。 薬学的組成物 本発明のさらに別の実施態様では、上記の薬学的組成物が提供される。このよ うな薬学的組成物は、注射用、または経口、肺、鼻腔用の投与、または他の形態 の投与用であり得る。一般に、薬学的に受容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、 乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアとともに、本発明の有効量のタ ンパク質または誘導体産物を含有する薬学的組成物が、本発明に包含される。こ のような組成物は、種々の緩衝液成分(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、 pH、イオン強度の希釈物；デタージェントおよび可溶化剤のような添加物(例え ば、Tween 80、Polysorbate 80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜 硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)、および増 量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)を含み；ポリマー化合物(例えば、 ポリ乳酸、ポリグリコール酸など)の粒子状調製物中またはリポソーム中への材 料の取り込みを含む。ヒラウロン酸(hylauronic acid)もまた用いられ得る。こ のような組成物は、身体の状態、安定性、インビボ放出速度、および本タンパク 質および誘導体のインビボクリアランス速度に影響し得る。例えば、本明細書中 に参考として援用されるMartin，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18 版、(1990、Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)1435-1712頁を参照。組成 物は、液体形態で調製され得るか、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末であり 得る。 経口送達 本明細書における使用には、参考として本明細書に援用されるMartin，Reming ton's Pharmaceutical Sciences，第18版、(1990、Mack Publishing Co．Easton PA 18042)の第89章に一般に記載されている経口固形投与量形態が意図されてい る。固形投与形態は、タブレット、カプセル、ピル、トローチまたはロゼンジ、 カシェ剤またはペレットを含む。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセ ル化(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されているプロテイノイドマイクロ スフェアのような)を用いて、本発明の組成物を処方し得る。リポソームのカプ セル化が用いられ得、そしてリポソームを種々のポリマーを用いて誘導体化し得 る(例えば、米国特許第5,013,556号)。治療用の可能な固形投与形態の説明は、 参考として本明細書に援用されるMarshallによる、Modern Pharmrceutics，第10 章、BankerおよびRhodes編、(1979)に記載されている。一般に、製剤は、タンパ ク質(または化学的に改変されたタンパク質)および胃の環境に対する保護を可能 とする不活性成分を含み、そして腸内に生物学的に活性な物質を放出し得る。 より特定すれば、上記の誘導体化タンパク質の経口投与形態もまた意図される 。タンパク質は化学的に改変され得、誘導体の経口送達を有効にする。一般に、 タンパク質(またはペプチド)分子自身への少なくとも１つの部分の付着が意図さ れる化学的改変であり、ここで、この部分は、(a)タンパク質分解を阻害し得； そして(b)胃または腸から血流中への取り込みを可能にする。タンパク質の全体 的な安定性の増加および体内での循環時間の増加もまた所望される。このような 部 分の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコー ルとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルア ルコール、ポリビニルピロリドン、ならびにポリプロリンを含む。Abuchowskiら 、1981、前出; Newmarkら、J．Appl．Biochem.，4:185-189(1982)。用いられ得 る他のポリマーは、ポリ-1,3-ジオキソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカン(tio xocane)である。上記に示したような薬学的用途には、ポリエチレングリコール 部分が好ましい。 タンパク質(または誘導体)の放出場所は、胃、小腸(十二指腸、空腸、または 回腸)、または大腸であり得る。当業者は、胃で溶解せず、十二指腸または腸の 他の場所で物質を放出する入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、タン パク質(または誘導体)の保護により、もしくは胃の環境を越えて、例えば腸にお ける生物学的に活性な物質の放出によるのいずれかにより胃環境の有害な影響を 避ける。 胃腸管における耐性を十分に確実にするために、少なくともpH5.0までは不浸 透性であるコーティングが必須である。腸溶コーテイング剤として用いられる、 より一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート(CAT)、 ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、 ポリビニルアセテートフタレート(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、セルロー スアセテートフタレート(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、およびShellacである 。これらのコーティング剤は混合フィルムとして用いられ得る。 コーティングまたはコーティング混合物はまた、胃に対する保護を意図しない で、タブレット上で用いられ得る。これは、糖コーティング、またはタブレット を飲み込み易くするコーティングを含み得る。カプセルは乾燥治療剤、すなわち 、粉末の送達には硬い殻(例えば、ゼラチン)からなり；液体形態には、柔軟なゼ ラチン殻が用いられ得る。カシェ剤の殻材料は厚いデンプンまたは他の食用紙で あり得る。ピル、ロゼンジ、成形タブレットまたはタブレット粉薬には、湿潤塊 状化技術が用いられ得る。 治療剤は、粒子サイズ約1mmの顆粒またはペレットの形態で微細な複数粒子と して製剤に含まれ得る。カプセル投与のための物質の製剤はまた、粉末、軽く圧 縮されたプラグ、またはタブレットであり得る。治療剤は圧縮により調製され得 る。 着色料および香料もすべてに含有され得る。例えば、タンパク質(または誘導 体)(例えば、リポソームまたはマイクロスフェアのカプセル化により)は処方さ れ得、次いで、食品、例えば、着色料および香料を含有する冷却飲料中にさらに 含有され得る。 不活性物質を用いて治療剤の容量を希釈または増加し得る。これらの希釈剤は 、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース 、スクロース、改変デキストランおよびデンプンを含み得る。特定の無機塩もま た、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含有する 充填剤として用いられ得る。いくつかの市販の希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA Rx 1500、Emcompress、およびAvicellである。 崩壊剤が、固形投与形態の治療剤の製剤中に含まれ得る。崩壊剤として使用さ れる物質は、デンプン、Explotabに基づく市販の崩壊剤を含むデンプンを包含す るが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カ ルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン(ultramylopect in)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ皮、酸性カルボキシメチルセ ルロース、天然スポンジおよびベントナイトも全て用いられ得る。崩壊剤の別の 形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末化ゴムは崩壊剤および結合剤とし て用いられ得、そしてこれらは寒天、Karaya、またはトラガカントゴムのような 粉末化ゴムを含み得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤とし て有用である。 結合剤を用いて、治療剤を一緒に保持し硬いタブレットを形成し得、そして結 合剤には、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプン、およびゼラチンのよう な天然物由来の物質が含まれる。その他には、メチルセルロース(MC)、エチルセ ルロース(EC)、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)が含まれる。ポリビニ ルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は、とも にアルコール溶液中で使用し得、治療剤を顆粒化し得る。 減摩剤が治療剤の製剤に含まれ得、製剤プロセスの間、粘着を妨ぐ。潤滑剤が 治療剤と型版の壁の間の層として使用され得、そしてそれらは、ステアリン酸マ グネシウムおよびステアリン酸カルシウムを含むステアリン酸、ポリテトラフル オロエチレン(PTFE)、液体パラフィン、植物油、およびワックスを含み得るが、 それらに限定されない。可溶性潤滑剤がまた使用され得、これには、ラウリル硫 酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコ ール、およびCarbowax 4000および6000が含まれる。 製剤の間の薬剤の流動特性を改良し、そして圧縮の間の転位を補助するために 滑材を添加し得る。滑材は、デンプン、タルク、火成シリカ、およびシリコアル ミネート水和物を含み得る。 水溶性環境への治療剤の溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添 加し得る。界面活性剤は、アニオン性デタージェント、例えば、ラウリル硫酸ナ トリウム、ジオクチルスルホスクシネートナトリウム、およびジオクチルスルホ ン酸ナトリウムを含み得る。カチオン性デタージェントが用いられ得、そして塩 化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムを含み得る。界面活性剤として製 剤中に含まれ得る可能な非イオン性デタージェントを列挙すれば、ラウロマクロ ゴール400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ひまし油10 、50、および60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート40、60、65お よび80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチ ルセルロースを含み得る。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製 剤中に、単独または異なる割合の混合物としてのいずれかで存在し得る。 潜在的にタンパク質(または誘導体)の取り込みを促進する混合剤は、例えば、 脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。 制御放出製剤が所望され得る。薬剤は、拡散または浸出メカニズム(すなわち ゴム)のいずれかにより放出を許容する不活性なマトリックス中に取り込まれ得 る。ゆっくりと変性するマトリックスもまた処方剤に取り込まれ得る。この治療 剤の制御放出の他の形態は、Oros治療系(Alza Corp.)に基づく方法により、換言 すれば、薬剤が半透膜に包まれている。半透膜は、浸透性効果に起因して、単一 な小さな開口部を通じて水を入れ、そして薬剤を押し出させる。いくつかの腸溶 コーティングがまた、遅延放出効果を有する。 他のコーティングを製剤に用い得る。これらは、コーティングパンで付加し得 る種々の糖を含む。治療剤はまた、フィルムでコートされたタブレットであり得 ；この例で用られる物質は、２つのグループに分けられる。第１のグループは、 非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル セルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシナトリウム-メチルセル ロース、プロビドン、およびポリエチレングリコールを含む。第２のグループは 、一般にフタル酸のエステルである腸溶性物質からなる。 物質の混合物を用いて、最適なフィルムコーティングを提供し得る。フィルム コーティングは、コーティング機または流動床でまたは圧縮コーティングにより 実施され得る。 肺送達 本発明のタンパク質(またはその誘導体)の肺送達もまた本明細書中で意図され る。タンパク質(または誘導体)は、吸入する間に哺乳動物の肺に送達され、そし て血流に沿って肺の上皮を横切って移動する。このことを示す他の報告は、以下 を含む： Adjeiら，Pharmaceutical Research,7(6):565-569(1990);Adjeiら，Internation al Journal of Pharmaceutics,63:135-144(1990)(酢酸ロイプロレリソ); Braque tら，Journal of Cardiovascular Pharmacology,13(同上 5):143-146(1989)(エ ンドセリン-1);Hubbardら，Annals of Internal Medicine，3(3):206-212(1989) (α1-アンチトリプシン);Smithら，J.Clin.Invest.,84:1145-1146(1989)(α1-プ ロテイナーゼ);Oswein et al.,"Aerosolization of Proteins",Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II,Keystone,Colorado,(March 1990) (組換えヒト成長ホルモン);Debs et al.,J.Immunol.,140:3482-3488(1988)およ びPlatzら，米国特許第5,284,656号(顆粒球ユロニー刺激因子). 本発明の実施ににおける使用には、治療用製品の肺送達に設計された広範囲の機 械的デバイスが意図され、その全てが当業者によく知られたネブライザー、投与 量測定吸入器、および粉末吸入器を含むがこれらに限定されない。 本発明の実施に適切な市販されているデバイスのいくつかの特定の例は、Mall inckrodt，Inc.、St．Louis，Missouriにより製造されるUltraventネブライザー ;Marquest Medical Products，Englewood，Coloradoにより製造されるAcornIIネ ブライザー；Glaxo Inc.、Research Triangle Park，North Carolinaにより製造 されるVentolin投与量測定吸入器；およびFisons Corp.、Bedford，Massachuset tsにより製造されるSpinhaler粉末吸入器である。 このようなデバイス全ては、タンパク質(または誘導体)の調剤に適した製剤の 使用を必要とする。代表的には、各製剤は、使用したデバイスのタイプに特異的 であり、そして治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、および/またはキャ リアに加えて適切な推進剤の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプ セルまたはマイクロスフェア、封入複合体、または他のタイプのキャリアの使用 が意図される。化学的に改変されたタンパク質もまた、化学的改変のタイプまた は使用するデバイスのタイプに依存して異なる製剤中で調製され得る。 ジェットまたは超音波のいずれかのネブライザーでの使用に適した製剤は、代 表的には、溶液１mlにつき約0.1〜25mgの生物学的に活性なタンパク質の濃度で 水に溶解されたタンパク質(または誘導体)を含む。製剤はまた、緩衝液および単 糖を(例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のために)含み得る。ネブ ライザーの製剤はまた、界面活性剤を含み得、エアロゾルの形成において、溶液 の噴霧により生じるタンパク質の表面誘導凝集を減少または妨ぎ得る。 投与量測定吸入デバイスで用いる製剤は、一般に、界面活性剤の助けで、推進 剤中に懸濁されるタンパク質(または誘導体)を含有する、微細に分けられた粉末 を含む。この推進剤は、この目的のために用いられる任意の従来物質であり得、 例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフル オロカーボン、または炭化水素(トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオ ロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロ エタンを含む)、またはそれらの組合せを含む。適切な界面活性剤は、ソルビタ ントリオレートおよび大豆レシチンを含む。オレイン酸もまた界面活性剤として 有用であり得る。 粉末吸入デバイスから調剤される製剤は、タンパク質(または誘導体)を含有す る、微細に分けられた乾燥粉末を含み、そしてまた、増量剤、例えば、デバイス からの粉末の散布を促進する量のラクトース、ソルビトール、スクロース、また はマンニトールを、例えば、製剤の50〜90重量％で含む。タンパク質(または誘 導体)は、肺末端に最も効率的に送達するために、10μm(またはミクロン)以下の 、最も好ましくは0.5〜5μmの平均粒子サイズで粒子形態で最も有利に調製され 得る。 鼻腔送達 タンパク質(または誘導体)の鼻腔送達もまた意図される。鼻腔送達は、鼻に治 療製品を投与した後、肺における製品の沈着を必要とせずに、直接的に、血流へ のタンパク質輸送を可能にする。鼻腔送達のための製剤は、デキストランまたは サイクロデキストランともにこれらを含む。 処置方法、薬物の調製法 本発明のさらに他の局面では、処置方法および薬物の製造方法が提供される。 本発明の誘導体の投与による緩和または調整される症状は、上記の症状である。 投与量 上記の分子の全てについて、さらなる研究が行われ、種々の患者における種々 の症状の処置に対する適切な投与量レベルについての情報が増え、そして受容体 の治療情況、年齢、および全身的な健康を考慮する当業者は、適切な投与量を確 かめる。一般に、注射または注入について、投与量は、0.01μgの生物学的活性 タンパク質/kg体重(化学的改変のないタンパク質のみの量を計算)と10mg/kg(同 様に基づく)との間である。投与量スケジュールは、用いるタンパク質または誘 導体の循環半減期、ポリペプチドがボーラス投与量または連続注入により送達さ れるかどうか、および用いる製剤に依存して変化し得る。 他の化合物との投与 肥満症に関連した治療に対しては、本発明のタンパク質(または誘導体)を、肥 満症の他の医療合併症を処置するために用いられる１つまたはそれ以上の薬学的 組成物、例えば、糖尿病(例えば、インスリン)、高血圧、高コレステロール、お よび肥満症に付随する他の有害な症状の処置に用いられる薬学的組成物とともに 投与し得る。また、他の食欲抑制剤、例えばアンフェタミンが、ともに投与され 得る。投与は同時であり得る(例えば、本発明のタンパク質およびインスリンの 混合物の投与)か、または逐次であり得る。 核酸を基礎にした治療処置 OB遺伝子は、肥満症の遺伝子治療を開発するために、ヒト脂肪細胞中に導入さ れ得る。このような治療は、体重を減少させると予期され得る。反対に、ヒト脂 肪細胞中へのアンチセンス構築物の導入は、活性OBポリペプチドのレベルを減少 し得、身体の脂肪症を増加すると予測され得る。 １つの実施態様では、OBポリペプチドをコードしている遺伝子は、インビボで ウイルスベクターで導入される。このようなベクターは弱毒化または欠陥DNAウ イルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタ インバーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)などを含む がこれらに限定されない。完全にまたはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠陥ウ イルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入した後、感染性でない。欠陥ウ イルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮せずに、 細胞中の特異的な局在領域に投与することが可能である。従って、脂肪組織が特 異的に標的され得る。特定のベクターの例は、欠陥ヘルペスウイルス1(HSV1)ベ クター[Kaplittら、Molec．Cell．Neurosci.，2:320-330(1991)]、弱毒化アデノ ウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetら、J．Clin．Invest.，90: 626-630(1992)により記載されるベクター、および欠陥アデノ随伴ウイルスベク ター[Samulskiら、J．Virol.，61:3096-3101(1987); Samulskiら、J．Virol.,63 :3822-3828(1989)]を含むが、これらに限定されない。 もう一つの実施態様では、遺伝子は、例えば以下に記載されるように、レトロ ウイルスベクターで導入され得る：Andersonら、米国特許第5,399,346号; Mann ら、Cell，33:153(1983); Teminら、米国特許第4,650,764号; Teminら、米国特 許第4,980,289号; Markowitzら、J．Virol.，62:1120(1988); Teminら、米国特 許第5,124,263号; Doughertyらによる、1995年3月16日に公開された国際特許公 開第WO95/07358号; およびKuoら、Blood，82:845(1993)。 あるいは、ベクターはインビボでリポフェクションにより導入され得る。過去 10年間、インビトロで、核酸のカプセル化およびトランスフェクションのための リポソームの使用が増加している。リポソームが介在するトランスフェクション で遭遇する困難性および危険性を限定するために設計された合成のカチオン性脂 質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリ ポソームを調製するために用いられ得る[Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，84:7413-7417(1987); Mackeyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:8027-80 31(1988)参照]。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促 進し得、そして負に荷電した細胞膜との融合も促進する[Felgnerら、Science，3 37:387-388(1989)]。外因性遺伝子を、インビボで、特定の器官に導入するため のリポフェクションの使用は、特定の実用的な利点を有する。特定細胞へのリポ ソームの分子標的は、１つの有益な領域である。特定の細胞タイプをトランスフ ェクションすることは、細胞の不均質性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎 臓、および脳で特に有益であり得る。脂質は、標的の目的のために他の分子に化 学的に結合され得る(Mackeyら、1988、前出)。標的されたペプチド、例えば、ホ ルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド 分子が化学的にリポソームに結合され得る。 裸のDNAプラスミドとしてインビボでベクターを導入することも可能である。 遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、トラ ンスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質 導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、 またはDNAベクタートランスポーターの使用により、所望の宿主細胞に導入され 得る(例えば、Wuら、J．Biol.，Chem.，267:963-967(1992); Wuら、J．Biol.，C hem.，263:14621-14624(1988); 1990年3月15日に出願されたHartmutら、カナダ 特許出願第2,012,311号を参照)。 農業への応用 OB遺伝子はまた、家畜動物から単離され得、そしてそれによって相当するOBポ リペプチドが得られ得る。下記の特定の例では、マウスOB遺伝子由来のプローブ は、多数の種の動物由来の相当する相同性のコード配列にハイブリダイズする。 ヒトの治療について述べられたように、組換えタンパク質がまた調製され得、そ して家畜動物に投与され得る。ポリペプチドの投与は、より痩身型の食用動物、 例えば、ウシ、ブタ、家禽、ヒツジなどを生産するために実行され得る。好まし くは、自己のポリペプチドOBポリペプチドが投与されるが、本発明はまた、抗自 己のポリペプチドの投与を意図する。OBポリペプチドは約160のアミノ酸残基か らなるので、高度に免疫原性であり得ない。従って、非自己のポリペプチドの投 与は、免疫応答を生じ得ない。 あるいは、トランスジェニック家畜動物へのクローン化遺伝子の導入は、OBト ランスジーンの過剰発現によるトランスジェニック家畜動物の潜在的な体重およ び脂肪症の減少を可能にし得る。このことを達成するための最も簡単な手法は、 それ自身のまたは別の脂肪特異的なプロモーターを用いて、OBトランスジーンを 脂肪に標的することであり得る。 反対に、体脂肪の増加は、神戸牛またはフォアグラをつくるための肥大肝臓の 開発の目的のような他の情況では所望される。これは、アンチセンスなOBトラン スジーンを脂肪に標的すること、または遺伝子ノックアウト技法を用いることに より達成され得た。あるいは、体重において脂肪パーセントの増加が所望される 場合、OBポリペプチドのインヒビターまたはアンタゴニストが投与され得る。こ のようなインヒビターまたはアンタゴニストは、ポリペプチドと反応性の抗体、 およびOBレセプターに結合するが活性化しないポリペプチドの断片、すなわちOB ポリペプチドのアンタゴニストを含むが、それらに限定されない。 美容用途 OBポリペプチドは、健康の利益に加えて美容使用に重要な価値を有する。特に 、誘導体およびそのアゴニストアナログを含む本発明のOBポリペプチドが、動物 の 脂肪細胞沈着の速度および量の調整に有用であるので、目ざわりな脂肪組織、例 えば、肥満状態に必ずしも達しないが、やはり個人の外見を損なう腹部、股関節 部、腿、首、および顎での脂肪沈着を減少するために有用である。脂肪減少効果 は、部分的には、食欲の減少、すなわち食糧摂取の減少によるか、基礎代謝の増 加によるか、または両方により達成されると考えられている。従って、本発明の OBポリペプチド、もしくはその誘導体またはアゴニストアナログは、脂肪沈着を 調整することにより、食欲を減少することにより、またはその両方により、脂肪 組織沈着において美容上の変化をもたらすために、被験体への投与に有用である 。 さらに、本発明の組成物および方法は、脂肪組織のパーセントを減少し、そし て身体の外見を改善するための試み得る方法の例として、種々の手順、例えば、 身体の全体の外見を変えるために設計された美容手術(例えば、脂肪組織を吸引 または除去することにより体重を減少するために設計された脂肪吸引(liposucti on)またはレーザー手術)、運動(特に、ランニングおよびウエートトレーニング) 、低脂肪食餌、催眠、生体フィードバックとともに用いられ得る。 従って、本発明は、個体において美容のために脂肪組織調整を行う方法に関し 、この方法は、OBポリペプチド、もしくは誘導体またはそのアゴニストアナログ の脂肪調整量を、身体全体の外見を改善するために、美容のために脂肪組織調整 を所望する個体に投与する工程を包含する。特定の局面では、脂肪組織調整は食 欲抑制の結果である。好ましくは、脂肪組織調整は、脂肪組織の減少である。 さらなる実施態様では、本発明は、美容のために脂肪組織損失を行う方法に関 し、この方法は、OBポリペプチド、もしくは誘導体またはそのアゴニストアナロ グの脂肪調整量を、身体全体の外見を改善するために、美容のために脂肪組織調 整を所望する個体に投与することにより身体の外見を変化させるための手順を組 み合わせる工程を包含する。 OBレセプター OB因子の小分子アゴニストおよびアンタゴニストの開発は、そのレセプターの 単離により大きく促進される。これは、活性なOBポリペプチドを調製しそしてそ れを標準的な方法を用いて発現ライブラリーをスクリーニングするために使用し て達成され得る。発現ライブラリー中のレセプターの結合は、細菌または哺乳動 物発現ベクターのいずれかを用いて調製された組換えポリペプチドを投与する工 程、および発現ライブラリーの細胞について組換えポリペプチドの短期間および 連続投与の効果を観察する工程、または細胞へのOBポリペプチドの結合を直接検 出する工程により試験され得る。 OBレセプターは、現在、視床下部およびおそらく肝臓に局在するようであると 考えられているので、好ましくは、これらの組織由来のcDNAライブラリーが、標 準的な発現クローニングベクター中で構築される。次に、これらのcDNAクローン が、プールとしてCOS細胞に導入され得、そして得られるトランスフォーマント は、OBレセプターを発現するCOS細胞を同定するために、活性リガンドを用いて スクリーニングされ得る。次いで、陽性のクローンが、クローン化レセプターを 回収するために単離され得る。クローン化レセプターは、OBリガンド(それがホ ルモンであると仮定して)とともに用いられ、OBの小分子モジュレーターのスク リーニングに必要な成分を開発する。 本発明に従って利用されるべき特定のアッセイ系は、レセプターアッセイとし て公知である。レセプターアッセイでは、アッセイされるべき物質は、適切に標 識され、次いで、特定の細胞試験コロニーは、所定量の標識および非標識の両物 質が接種され、その後、標識物質が細胞レセプターに結合する程度を決定するた めに結合研究が行われる。このように、物質間の親和性の違いが確認され得る。 従って、所定量の精製体重モジュレーターが、放射性標識され得、そして例え ば、抗体またはそれらに対する他のインヒビターと組み合わされ、その後結合研 究が実施された得る。次いで、種々の量の標識および非標識の組み合わされてい ない体積モジュレーターを含む溶液が調製され得、次いで細胞試料が接種され、 そしてその後インキュベートされ得る。得られる細胞の単層を、次いで洗浄し、 可溶化し、そして５％以下の標準誤差を生じるに十分な時間の長さの間、ガンマ ーカウンターで計測した。次いで、これらのデータは、スキャッチャード分析に 供せられ、その後、物質の活性についての観察および結論づけが行われ得る。先 行する記載は例示であり、それは、レセプターアッセイが行われ用いられる様式 を例示し、例ではアッセイした物質の細胞結合能力が区別する特徴として供し得 る。あるいは、レセプターアッセイは、dbレセプターのような本発明のモジュレ ーターに対する特異的レセプターの同定に特に有用である。 本発明による有用なそして意図されたさらなるアッセイは、「シス／トランス 」アッセイとして知られている。簡単に説明すると、このアッセイは、２つの遺 伝子構築物を使用し、その内の１つは、代表的には、適切な細胞株にトランスフ ェクトする場合、目的の特定のレセプターを速続的に発現するプラスミドであり 、そしてその第２番目は、レセプター／リガンド複合体の制御下で、ルシフェラ ーゼのようなレポーターを発現するプラスミドである。従って、例えば、特定の レセプターに対するリガンドとして化合物を評価することが所望される場合、プ ラスミドの１つは、選択された細胞株でレセプターの発現を生じる構築物であり 得、その一方、第二のプラスミドは、特定のレセプターに対して応答要素が挿入 されるルシフェラーゼ遺伝子に連結されたプロモーターを所有する。試験される 化合物がレセプターに対するアゴニストである場合、リガンドはレセプターと複 合体化し、そして生じた複合体は応答要素と結合し、そしてルシフェラーゼ遺伝 子の転写を開始する。次いで、生じた化学発光を光度計により測定し、投与量応 答曲線を得、そして既知のリガンドの投与量応答曲線と比較する。前記のプロト コールは、当業者が参考とする目的のために、米国特許第4,981,784号およびPCT 国際公開第WO88/03168号で詳細に記載されている。 一旦、OBレセプター遺伝子配列を発現する組換え体が同定されると、組換えOB レセプターが分析され得る。これは、レセプターの放射性標識を含むOBレセプタ ーの物理学または機能的特徴に基づくアッセイとそれに続くゲル電気泳動、イム ノアッセイ、リガンド結合などによる分析により達成される。さらに、OBレセプ ターに対する抗体が上記のように生成され得る。 OBレセプターの構造は、当該分野で公知の種々の方法により分析され得る。好 ましくは、種々のドメインの構造、特にOB結合部位が分析される。構造分析は、 他の公知のタンパク質、特にホルモンおよびタンパク質レセプターとの配列類似 性を同定することにより行われ得る。類似性(または相同性)の程度は、OBレセプ ターまたはそのドメインの構造および機能を推定するための基礎を提供し得る。 特定の実施態様では、配列比較は、例えば、FASTAおよびFASTPプログラム[Pears onら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:2444-48(1988)]を用いてGenBankで見い 出される配列を用いて行われ得る。 タンパク質配列は、親水性分析によりさらに特徴付られ得る(例えば、Hoppら 、1981、同上)。親水性プロフィールを用いて、OBレセプタータンパク質の疎水 性および親水性領域を同定し得、それはまた、細胞質外、膜結合性、および細胞 質内領域を示し得る。 二次構造の分析(例えば、Chouら、1974、同上)がまた行われ、特異的な二次構 造をとると推定されるOBレセプターの領域を同定し得る。 操作、翻訳、および二次構造の推定、ならびにオープンリーディングフレーム の推定および製図(plotting)はまた、当該分野で利用可能なコンピューターソフ トウェアプログラムを用いても達成され得る。 組換えOBポリペプチドの大量の供給源、およびOBレセプター(すなわち、db遺 伝子産物)を単離する機会を提供することにより、本発明は、OBポリペプチドお よびOBレセプター、またはそのドメインの活性なコンホメーションの定量的な構 造決定を可能にする。特に、十分量の物質が、核磁気共鳴(NMR)、赤外(IR)、Ram an、および紫外(UV)、特に円二色性(CD)、分光分析のために提供される。特に、 NMRは、溶液中の分子の非常に強力な構造分析を提供し、それは、それらの天然 環境により緊密に近づける(Marionら、1983、同上: Barら、1985、同上; Kimura ら、1980、同上)。構造分析の他の方法がまた使用され得る。これらは、Ｘ線結 晶学(Engstom，1974,同上)を含むがこれらに限定されない。 さらに好ましくは、OBポリペプチドおよびOBレセプターの共結晶(co-crystal) が研究され得る。共結晶の分析は、結合についての詳細な情報を提供し、それは さらに、リガンドアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計を可能にする 。コンピューターモデリングもまた使用され得、特にNMRまたはＸ線法[Fletteri ckら編、Computer Graphics and Molecular Modeling，in Current Communicati ons in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har bor，New York(1986)]と組み合わせて使用され得る。 本発明のOBレセプターをコードする遺伝子の同定および単離は、天然供給源か ら単離され得るより大量に、または細胞のトランスフェクションまたはトランス フォーメーション後に発現するレセプターの活性を示すように特に加工されたイ ンジケーター細胞でレセプターの発現を提供する。従って、OBポリペプチドの構 造に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計に加えて、本発明は 、当該分野で公知の種々のスクリーニングアッセイを用いて、OBレセプターの特 異的リガンドを同定する代替の方法を意図する。 本発明は、以下の実施例を参照してより良好に理解され得、実施例は、本発明 の例示であり、そして限定することを意図しない。 実施例セクション 以下は、本発明の例示である遺伝子物質を同定するために使用する方法の概要 を述べる。この努力は４つの連続的な工程を含む：Ａ）遺伝子地図作製、Ｂ）物 理地図作製、Ｃ）候補遺伝子単離、およびＤ）変異検出。目的のマウス遺伝子が 単離された(工程Ｄ)ことの確認の後、相同なヒト遺伝子が捜され、そしてマウス およびヒトの両遺伝子および推定タンパク質が特徴付られた。この工程は、さら に詳細に以下に要約される。Ａ ．遺伝子地図作製 ob変異は遺伝的交雑で分離し、そして標準の連鎖分析を用いて、RFLP(制限酵素 断片長多型)に対する変異を位置付けた。これらのデータは、OB遺伝子をマウス 第６染色体近位約５cＭに置いた。（５cMは、100匹の動物当たりの５つのみかけ の遺伝的交差に相当する遺伝子距離の測定値である。）全部で771の情報を与え る減数分裂が生じ、そしてその後の遺伝子地図作製(Friedmanら、1991、同上)で 用いられた。OBに対してマップされた遺伝子座は、全て先に公開された。記載さ れた最も近い２つのRFLPは、カルボキシペプチダーゼおよびmetガン遺伝子由来 のプローブにより定義された。 上記の実験の遺伝子解析は、原理的には、いずれの遺伝子マーカーも強く連鎖 しないので、obをクローン化するためには不適当であった。強く連鎖する必要と するRFLPを同定するために、特別のプローブが単離され、そして遺伝的交雑を行 った。公知の方法である染色体顕微解剖を用いて、マウス第６染色体の近位から DNAのランダムな小片を単離した[Baharyら、Mammalian Genome，4:511-515(1993 )]。個々のクローン化プローブをobに対する強い連鎖について試験した。これら の研究を基礎にして、１つのプローブD6Rck13(psd3とも称せられる)を、OBに対 するその遺伝的近接性によりさらなる解析のために選択した。 このプローブを、種間および亜種間交雑由来の835のob子孫の遺伝子型決定の ために用い、D6Rck13が、Baharyらに報告されているように、835匹全ての動物に おいて非組換え体であることを示した。物理地図作製の過程で、新規な多型マー カーを、YAC53A6由来のコスミドのサブクローンから同定した。この新規マーカ ーは、D6Rck13とOB遺伝子との間に位置し、種間内交雑および戻し交雑由来の別 の771の情報を与える減数分裂の遺伝子型決定のために用いた。１匹の動物＃167 は、obとD6Rck39との間の組換え交差を保有すると同定された。これらの研究は 、D6Rck39/D6RcK13がobから約0.06cMであることを示した。別のプローブPax4は 、obに0.12cM近接していたことが同定された。Pax4は２匹の動物(＃111および＃ 420)で組換えられていた。Pax4は、Grussおよび共同研究者により、マウス第６ 染色体近位に先にマップされた偽遺伝子である[Grussら、Genomics，11:424-434 (1991)]。これを基礎に、OB遺伝子は、Pax4とD6Rck13との間の約0.2cM間隔で存 在すると決定された。これは、OBを単離する成果において介在DNAをクローンす る成果を導く。Ｂ ．物理地図作製 この間隔でのDNAのクローニングには、酵母人工染色体(YAC)を使用した。YAC は、比較的新しいクローニングベクターであり、しばしば長さが100万塩基対以 上の連続するDNAの長い鎖をクローニングし得る。 酵母人工染色体は、D6Rck13およびPax4を用いて単離された。これは、精製DNA プローブを調製し、そして対応するYACを単離するためにそれらを使用すること により達成された。これらのYAC(#8、#16、#107、および#24)を単離し、そして 最初に特徴付け、そして得られた分析に基づき、YAC16は最も遠くまで、すなわ ちobの最も近くまで伸びたYACであったと結論された。次いで、YAC#16の重要な 末端を回収し、そしてこの末端がPax4よりobに近いと決定された。この末端を16 M(+)と名付けた。このプローブは動物#420においては(Pax4と同様に)組換えられ ていなかったことが示されたので、この結果が得られた。この末端を配列決定し 、そしてPCRアッセイを開発するために用いた。このPCRアッセイを用いて、YAC ライブラリーをスクリーニングした。４つの陽性のクローンを単離した。続いて 、エンド-レスキュー法、制限地図作製、パルスフィールドゲル電気泳動、およ び遺伝的交雑を用いるサザンブロットによるこれらのYACの特徴付けにより、こ れらのYACのうちの２つaduおよびaadが、引き続く研究に重要であることを決定 した。YAC aadは、最も遠くまで伸びた550kBの非キメラYACである。従って、こ のYAC、aad(pICL)の遠位末端を用いて物理地図を完成した。YAC aduは370kbの非 キメラYACであり、そしてその遠位末端adu(+)は、動物#111および#167を含む遺 伝的交雑の全てのob子孫において非組換え体であることが決定され、OB遺伝子が このYACに存在することを示唆した。 これら２つの末端、aad(pICL)およびadu(+)に対するPCRアッセイを開発し、物 理地図作製を続行するために、さらにYACおよびP1クローンを単離するために用 いた。重要なP1クローンを、498、499、500(aad(pICL)由来のプローブを用いて 単離された)、ならびに322、323、および324(adu(+)由来のプローブを用いて)を 含むこの成果により単離した。 こうして、D6Rck13により単離されたYAC(53A6、25A8、25A9、25A10)を特徴付 けた。これらの研究により、53A6がaad YACの近くの方向に最も遠くまで伸びる ことが決定された。53A6とaadとの間のギャップのサイズは、約70kBであると決 定された。次いで、53A6の重要な末端である53(pICL)を用いて、３つの利用可能 なYACライブラリーおよびP1ライブラリーをスクリーニングした。重要なP1クロ ーン、325を単離した。このP1クローンは、上記のように、aad(pICL)により単離 されたP1クローンとオーバーラップし、そしてそれ故53(pICL)とaad(pICL)の間 のギャップを近づけるために供された。結果として、長さが約2.5百万塩基対のY ACおよびP1クローンを含み、そしてPax4、16M(+)、adu(+)、aad(pICL)、53(pICL )、D6Rck39、およびD6Rck13に達する全コンティグがクローン化された。動物＃1 11および#167における明らかな組換え部位を注意深くマッピングすることにより 、OBが400kB間隔で位置していたと結論された。OB遺伝子を単離するために作用 す るDNAの供給源を提供するために、この非組換え領域をカバーする約500kBを合計 24のP1クローンで単離した。これらのP1クローンは、322および323を含み、それ らは後に有用なクローンであることが見い出され、エキソントラッピングのため に用いた。 OBを有する染色体の１部分の物理地図を図７Ａに示す。図７ＢはYAコンティグ を示す。図７ＣはP1コンティグを示す。Ｃ ．候補遺伝子の単離 この間隔にある遺伝子を単離するために用いた方法は、エキソントラッピング である。この方法では、市販のベクターを用い、試験構築物中に導入されたゲノ ムDNAにおける機能的なスプライスアクセプターおよびドナー配列について選択 することにより、エキソンDNA(すなわち、コード配列)を同定した。これらのP1 クローン由来のDNAを増幅し、エキソントラッピングベクターにサブクローニン グした。これらのクローンは、Blescriptベクターにクローン化された短い挿入 物であった。各クローンを、挿入物に近接するプラスミド配列に対応するPCRプ ライマーを用いてPCR増幅した。PCR増幅を、プラスミドを有する細菌に対し直接 行った。反応はBiomekロボットを用いてセットアップした。PCR産物は、臭化エ チジウムを含むTBE緩衝液中１％アガロースゲルで電気泳動した。エキソントラ ッピング技術を改変し、P1クローンから混入しているE．coli DNAを除去し、そ して大量の人工エキソンをスクリーニングした。人工エキソンはトラップされた 推定エキソンの80〜90％を超えた。エキソントラッピングベクターは、HIV配列 ；この人工産物に対応するこれらベクター配列の短いセグメントを含む。 エキソントラッピング実験は種々のP1クローンを用いて行った。次いで、エキ ソントラッピング産物をPCRにより増幅し、選択し、そして配列決定した。推定 「エキソン」配列を、Blastコンピュータープログラムを用いて、Genbankの配列 と比較した。約15のエキソンを、さらなる実験のために、RT-PCR、ノーザン分析 、および対応するRNAまたは保存配列の存在についてのズーブロット(zoo blot) により選択した。15の推定エキソンのうち７つ、325-2、323-9、322-5、D1-F7、 1H3、および2G7が、RNA転写物をコードすることが見い出された。325-2は、精巣 に 特異的な遺伝子であり；323-8および323-9は、主に脳および腎臓で発現される同 じ遺伝子由来の２つのエキソンのようである。IH3および322-5は、２つの低レベ ルの脳転写物を示す。D1-F7は、先にクローン化された遺伝子であるイノシンモ ノホスフェートデヒドロゲナーゼ(IMPDH)由来のエキソンで、遍在性発現パター ンを有する。これらの遺伝子は、いずれも、OBをコードしないようであった。OB エキソンである2G7を以下でさらに説明する。 OB遺伝子をエキソントラップできなかった３回の結果の後に、他の試みを、重 要なOB領域由来の全てのP1からのDNAをプールすることにより行った。これらは 、以下のP1を含む：258、259、322、323、324、325、498、499、500、653、654 、およびその他。その後、258、260、322、498、および499のP1をエキソントラ ッピングベクターにサブクローニングし、次にいくつかのプレートを、推定エキ ソンを有していた細菌クローンで調製した。推定OB候補を示す約192のクローン を得た。上記のように、多くの単離物がベクター由来の２つのトラップされたエ キソン含むことに一致する人工産物が観察された。従って、クローンは、それら のサイズによる、およびゲルのサザンブロット上の対応するバンドにハイブリダ イズするこの人工産物に対応するDNAプローブのハイブリダイゼーションの事実 による両方により同定された。この方法で、192クローンのうち185をさらなる評 価から除外した。結局、OBに対応するエキソンの排除に至り得るので、サイズ単 独を基礎にした人工産物の排除は不可能であった。 従って、192のエキソンのうち、合計７つのエキソンをさらなる研究のために 選択した。７つのエキソンの配列決定のための鋳型を調製し、そして配列決定を 行った。７つのエキソンの配列を分析し、そして７つが同一であり、そして１つ が明らかに人工産物であることが見い出された。特に、クローン1D12は、「HIV 配列」、すなわち人工産物バンドを含んでいた。これは、さらなる分析のために ３つのエキソン：1F1、2G7、および1H3を残した。1F1が重要領域の外側にマップ されたので排除された。1H3および2G7の両方に対するPCRプライマーを選択し、 そして合成した。 2G7に関するエキソン配列を決定し、図10(配列番号７)に示す。2G7に対するPC Rプライマーを選択し、そして合成した。PCRプライマーに対応する配列部分に下 線を引く。用いたプライマーは以下のとおりである： これらのプライマーは、以下のようなPCR条件でゲノムDNAを増幅した：標準PC R緩衝液中、55℃で２分間のアニーリング、72℃で２分間の伸長、94℃で１分間 の変性の25〜30サイクル。これらのプライマーをまた、非放射能dCTP量を対応し て減少させ、PCR反応において、32P-dCTPを含めることにより標識プローブを生 成するために用いた。 RT-PCRを種々の組織RNAについて行い、そして2G7が試験された組織の中で白色 脂肪において排他的に発現されたと結論された(図11A)。その後、32Pで標識した 2G7を組織RNAのノーザンブロットとハイブリダイズし(図11B)、そしてそのRNAが 脂肪組織で高レベルで発現するが、他の全ての組織(ここで、シグナルは、組織 調製物中に混入する脂肪の結果であり得る)においては、発現されないか、また は非常に低いレベルで発現されたことを示した。列挙された各組織由来の全RNA の10μgを、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気泳動した。プローブ を、標準ハイブリダイゼーション緩衝液Rapid Hybe(Amersham)中、65℃で、ブロ ットにハイブリダイズさせた。RNAのサイズは約4.9kBであった。この時点で、2G 7はOBについての有効な候補遺伝子であると考えられ、そしてさらに分析された 。Ｄ ．変異検出。 2G7がOB遺伝子をコードしていたことを確認するために、野生型動物と比較し て、変異体におけるこの遺伝子のDNA配列のRNA発現のレベルの違いを示すことが 必要であった。ob遺伝子の２つの別の変異(C57BL/6J ob/ob(1J)およびCkc/Smj o b/ob(2J))が、研究に利用可能である。これらは、以降1Jおよび2Jとそれぞれ呼 ばれる。（非公式な命名を、研究されるマウス株を呼ぶために用いる。本明細書 および図面では、C57BL/6Jは、C57BL/6J +/+を意味し；CKC/smjは、SM/Ckc-＋Da c -+/+を意味し;CKC/smj ob/obは、SM/Ckc-＋Dac-ob2J/ob2Jを意味することを理 解 されたい)。RNAは、1J、2J、およびコントロール動物から単離された脂肪組織か ら調製された。各試料由来の全RNAを、DNアーゼで処理し、次いで、プライマー としてのオリゴ-dT、および逆転写酵素を用いて逆転写した。次いで、得られる １本鎖cDNAを、下方のバンドについて2G7プライマー(上記の条件)または上方の バンドについて市販のアクチンプライマーのいずれかを用いてPCR増幅した。RT- PCR産物を、臭化エチジウムで染色した１％アガロースTBEゲルで泳動した(図12A )。RT-PCRを用いて、2G7 mRNAが、1Jおよび全ての他のコントロールマウスで発 現されたが、それは2Jマウスでは完全に見あたらなかったことが見い出された。 30サイクルの増幅後、シグナルは検出されなかった。この実験は、2G7がOB遺伝 子由来のエキソンに対応する直接的な証拠を提供した。 2J変異は比較的最近であり、そして類似遺伝子型株として維持されているので 、この結果は、2G7がOB遺伝子由来のエキソンであることを示した最初に得られ た証拠であった。変異は、mRNA合成の全体的な停止に至るプロモーター領域に位 置するようである。このRT-PCR実験における1Jマウスにおけるシグナルの存在は 、1JがRNA試料のサイズに大きな変化を生じない点突然変異を有し得ることを示 唆した。さらに、RT-PCRにより試験された場合、2G7 mRNAは、４匹の追加の2J動 物には存在しなかった。 この結果は、ノーザンブロット上で確認された(図12B)。脂肪細胞RNAを、各株 (C57B1/6J、1J、CKC/smj、および2J)から調製した。これらのRNAの10μgを泳動 してブロットした。このブロットは、PCR反応中に、32P-dCTPを用いる物質、す なわち図11中のバンドの増幅により、PCR標識された2G7プローブで釣った。アク チンは、付与されたRNAの量に対するコントロールである。アクチンシグナルは 、全ての試料中でほぼ同じである。mRNAが脂肪細胞に特異的であるので、OBシグ ナルは脳では存在していない。 ノーザン分析の結果は、2G7特異的RNAが2Jマウスでは存在していないことを確 認した。この肥満型変異株においては、RNAが作られないように遺伝子が破壊さ れているので、ob RNAはCKC/smj ob/obマウスで存在していない。さらに、2G7 R NAのレベルは1Jおよびdb/db脂肪で約10-20倍増加した。これらの結果は、OBが循 環ホルモンをコードしている、またはOBが体重を調整する脂肪細胞からのシグナ ル発生の原因であるといういずれかの仮説に適合する。これらの結果は、2G7がO B遺伝子であるという結論を支持し、そして1Jマウスが、点突然変異、おそらく 未成熟翻訳終止に至るナンセンス変異を有することを予測した。 これらのノーザンの結果は、４つの異なる2J動物からの脂肪細胞RNA調製物を 用いても繰り返された(図13)。このアッセイでは、ap2は、図12Bのアクチンと全 く同様に、コントロールとして用いた脂肪特異的転写物である。ap2バンドの変 化する濃度には有意差はない。ap2は、公開されたap2配列からPCRプライマーを 設計することにより標識された。次いで、脂肪細胞RNAのRT-PCR産物は、PCR標識 のための同じプロトコールを用いて再度標識された。この分析は、正常の同型接 合(homozygous)または異型接合(heterozygous)動物におけるOB mRNAの存在、お よび2J変異体動物におけるその不在を示す。 変異は、1Jマウスで同定された。変異はＣからＴへの塩基の変化であり、それ はアミノ酸108でアルギニンの見かけ上未成熟終止コドンへの変化を生じ、そし て、おそらくこれがob mRNAの高レベル発現に反する1J変異(図14)の原因である( 図12および13、C57BL/6J ob/obレーン参照)。 さらに最近では、サザンブロットを用いて、2J変異が、RNA発現を完全になく するように見えるOBの5'末端で検出可能なDNA変化の結果であると結論された。 この可能な再配置の正確な性質は、決定されるべきままである。 ４つの異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて、CKC/smj(SM/Ckc-+Dac)および C57BL/6Jマウス由来のDNAのゲノムサザンブロットを、変異obが独特なフラグメ ントパターンを生じるかどうかを決定するために行った(図15A)。約10μgのDNA( 肝臓、腎臓、または脾臓から調製されたゲノムDNA由来)を、示された制限酵素で 切断した。次いで、DNAを１％アガロースTBEゲルで電気泳動した。DNAをイモビ ロン(imobilon)膜にトランスファーし、PCR標識2G7プローブにハイブリダイズし た。重要なバンドは、CKC/smj ob/ob(SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J)DNAのBglII消化物 中の一番上のバンドである。このバンドは、他の株におけるより分子量が大きく 、この株における変異を示している。 図15Bは、ob2J/+×ob2J/+交雑の子孫由来のゲノムDNAのBglII消化物のサザン ブロットである。いくつかのDNAは、上方のバンドのみを有し、いくつかは下方 の バンドのみを有し、そしていくつかは両方のバンドを有する。上方のバンドのみ を有する動物は、アロ型の肥満型(allo-obese)、すなわちob2J/ob2Jである。こ れらのデータは、図15Aに示される多型(すなわち、変異)が遺伝的意味で(in a g enetic sense)分離することを示す。 実施例１：OBのcDNAクローニングおよび配列決定 標識2G7PCRプローブを用いて、マウス脂肪細胞λgt11 cDNAライブラリー(Swis sマウスの睾丸の脂肪パッド由来のClonetech 5'-STRETCH cDNA、#ML3005b)から の合計50のマウスcDNAクローン、およびヒト脂肪細胞λgt10cDNAライブラリー( 腹部由来のClonetech 5'-STRETCH cDNA、#HL1108a)からの30のクロスハイブリダ イズするヒトcDNAクローンを単離した。ライブラリーのスクリーニングは、プラ ークリフト手順を用いて行った。プラークリフトからのフィルターを、オートク レーブ法を用いて変性した。フィルターをPCR標識2G7プローブを用いて２重(dup licate)ハイブリダイズした(Rapid Hybe緩衝液、65℃、一晩)。２〜４時間のプ レハイブリダイゼーションの後、フィルターを２×SSC、２％SDS中、65℃で30分 間２回洗浄し、そしてｘ線フィルムに感光させた。２重陽性についてプラーク精 製した。プラーク精製したファージを、市販のベクタープライマー、例えば、λ gt10およびλgt11を用いて増幅した。得られたPCR産物は、いずれかの末端に小 量のベクター配列を有する各ファージについてのcDNA挿入物に対応した。バンド をゲル精製し、そしてABI自動シークエンサーおよびDNAポリメラーゼをプローブ するためのベクタープライマーを用いて配列決定した。 次いで、生の配列データ、コンピュータープログラムに由来する誤りを正すた めに手動で塩基毎に調べた。正しい配列が利用可能になったので、下流のプライ マーを合成し、配列決定を継続するために用いた。各利用可能なcDNAクローンが 配列決定され、コンティグに合成されるまで、このような実験を繰り返した。現 在までのところ、mRNAの５'末端から約3000塩基対が蓄積された。cDNAクローン の１つは、mRNAの５'末端まで伸長しており、その配列は脂肪組織RNAの５'RACE 産物の配列と同一であった(データは示さない)。 配列データは、167アミノ酸のオープンリーディングフレームが存在すること を示した(図１)。Kozak翻訳開始共通配列は、ATGの３塩基上流のアデノシン残基 で存在した。cDNAの２つのクラスは、１つのグルタミンコドンを含むまたは含ま ないで異なることが見い出された。この残基は、2G7エキソンのスプライスアク セプターに対して３'側直ぐ近くに位置することが見い出されている。グルタミ ンのCAGコドンは可能なAGスプライスアクセプター配列を含むので、下記のよう なcDNAのサブセットにおいて見かけ上３塩基対欠失しているスプライスアクセプ ター部位でのずれが存在しているようである。 上記の配列の「ag」は、グルタミンコドンの上流の推定されたイントロン配列 に相当し、そしてAGは推定のオルタナティブスプライス部位である。このグルタ ミン残基は分子の高度に保存された領域に位置し、そして生物学的活性について のその重要性は、未だに知られていない。 推定のＮ末端シグナル配列が検出され、そのシグナル切断部位は、アミノ酸位 置21のアラニン残基のカルボキシル末端にあると推測される。この推定のシグナ ル配列は、von Heijneの方法によるコンピューターアルゴリズムの適用により確 認された。この技術を用いて、最も確からしいシグナル配列はアミノ酸1〜23に 相当するポリペプチドコード領域で同定され、以下の配列を有する： ここで、矢印は、推定のシグナル配列切断部位を示す。アミノ酸配列の残りの部 分は非常に親水性であり、そして任意の注目すべき構造モチーフまたはＮ末端シ グナル配列以外の膜に達するドメインを有さなかった。特に、本発明者らは、Ｎ 結合型グリコシル化に関する、または推定のプロセッシングされたタンパク質中 のタンパク質切断を示唆する二塩基性アミノ酸配列の共通配列を(Sabatiniら、T he metabolic basis of inherited disease，pp.177-223，C.V．Scriverら編、M cGraw-Hill，New York)見出せなかった。BlastおよびBlockプログラムを用いた データベース検索は、任意の相同性配列を同定しなかった。 ヒト脂肪組織RNAをノーザンブロットで分析し、マウスob遺伝子と同様のサイ ズのRNA種を検出した。cDNAクローンの配列決定および分析は、ヒトOBがまた、1 67アミノ酸ポリペプチドをコードすることを示した(図2AおよびB、図３)。３塩 基対の欠失を有するかまたは有さない２つのcDNAクラスが、同様にヒトで見い出 された(図６)。マウスおよびヒトOB遺伝子は、推定のコード領域において高度に 相同性であるが、得られた３'および５'の非翻訳領域で30％だけの相同性を有す る。Ｎ末端シグナル配列はまた、ヒトOBポリペプチド中に存在していた。ヒトお よびマウスOBポリペプチド配列の比較により、２つの分子はアミノ酸レベルで全 体で83％の同一性を有することを示した(図４)。両方の種由来の成熟タンパク質 のＮ末端は、Ｎ末端の100アミノ酸残基のうち６つの保存および３つの非保存ア ミノ酸置換だけを有して、より高い相同性を共有する。 ゲノムDNAを、マウス、ラット、ウサギ、ハタネズミ、ネコ、ウシ、ヒツジ、 ブタ、ヒト、ニワトリ、ウナギ、およびショウジョウバエから単離し、EcoR1で 制限切断した。切断物を１％アガロースTBEゲルで電気泳動した。次いで、DNAを イモビロン膜にトランスファーし、そしてPCR標識2G7プローブで釣った。このフ ィルターを、65℃でハイブリダイズし、そして20分間の各洗浄につき、65℃で、 ２×SSC、0.2％SDSで２回洗浄した(すなわち、緩衝液を２回変えた)。これらの データは、OBが脊椎動物間で保存されていることを示した(図16)。この観点から 、ウナギDNAに2+のシグナルがあること；ウナギは魚であることに留意。 要約すると、得られた証拠は、体重および脂肪症が生理学的に制御されること を示唆する。７年前、この系の２つの重要な成分(OBおよびDB遺伝子)を同定する 努力を開始した。この実施例に示すように、OB遺伝子は、今や、体重を調節する 重要な役割を果たす脂肪特異的遺伝子として同定された。この遺伝子の産物は、 分泌ホルモンである可能性が最も高く、ヒトおよびヒト以外の動物における栄養 障害の診断および処置のための重要な用途を有し得る。 実施例２：細菌におけるOBの発現 obをコードしているマウスおよびヒトの両方のcDNAを、pET-15b発現ベクター( Novagen)にクローン化した。このベクターは、lacオペレーターとともにT7プロ モーターを含み、そしてヒスチジンtag(His-tag)およびコード配列挿入部位の直 ぐ上流のトロンビン切断部位(図17)(配列番号１１および１２)を含む融合タンパ ク質を発現する。 マウスおよびヒトcDNAを、シグナル配列の末端のアラニンをNdeI部位に変える ように改変した。これは、別の配列が３'領域において存在していたからである 。NdeI部位の挿入は、以下の新規なプライマーを用いるPCRを用いて達成された ： プライマーは、PCRフラグメントの各末端にNdeI制限部位を導入する、中央に ６塩基対のミスマッチを含む。マウスまたはヒトcDNAのいずれかを有するファー ジを、これらのプライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物をNdeIで切断し、１％ 低融点アガロースゲルでゲル精製した。ゲル精製したバンドをpETベクターにサ ブクローニングした。得られるプラスミドを配列決定し、変異がクローニングの PCR増幅工程の間に導入されないことを確実にした。グルタミン49をコードする 、およびグルタミン49を欠失するヒトおよびマウスcDNAの構築物を調製した。特 に、ヒトまたはマウスいずれかのOBコード配列を含み、シグナル配列がなく、そ してHis-tagと融合したpET 15b構築物を、PCRクローニング法を用いて作成した 。この構築物は、配列の誤りがPCR増幅工程の間にOB遺伝子のコード領域に導入 されていないことを確認するために配列決定した。 ２つの得られたプラスミド構築物であるpETM9およびpETH14を細菌発現宿主を トランスフォームするために選択した。最適条件下で1mM IPTGを用いた誘導に際 し、トランスフォームされた細菌は、100-300μg/mlのOB融合物を生産し得た。 大部分のOB融合タンパク質が封入体で見い出された。6Mグアニジン-HClまたは尿 素を用いた可溶化の後、融合タンパク質は、His結合(Ni-キレート化)樹脂カラム を通して精製された。OB融合タンパク質のカラム精製のための条件(結合、洗浄 、および溶出を含む)は、実験的に確立された。OB融合タンパク質は、5mMイミダ ゾール/6Mグアニジン-HClで樹脂に結合し、そして20mMまでのイミダゾール/6Mグ アニジン-HClで結合したままである。タンパク質は、樹脂から60mMイミダゾール /6Mグアニジンで溶出し得る(図18A、B)。精製ヒトおよびマウスの両OB融合タン パク質を、PBS中でさらに透析し、調製物からグアニジン-HClを除去し、次いで ポリクローナル抗体を惹起するために用いた。 融合タンパク質産物の生物学的活性を試験するために、精製タンパク質の再フ ォールディング条件を試験しそして開発した。これは、1Mグアニジン溶液中で融 合タンパク質を最初に透析し、次いで0.4Mアルギニン溶液を用いて希釈すること を含む。His-tagを、生物学的機能をアッセイする前に、融合タンパク質から除 去した。tagの除去は、ヒト胎盤由来のトロンビンで融合タンパク質を処理する ことにより達成された。 さらに、シグナル配列のないヒトおよびマウスOB遺伝子コード配列を、PCRク ローニング法を用いてpET12cベクターにそれぞれ挿入した。これらの構築物は、 細菌宿主細胞の周辺腔(periplasmic space)に合成したOB融合タンパク質を指向 し得る。周辺腔から回収したOB融合タンパク質は、他の宿主タンパク質から精製 するために簡単なゲル濾過を必要とするだけで、そしてこのようなプロセスの間 変性されない。 実施例３：ＯＢポリペプチドに対する抗体の調製 ポリクローナル抗体を生成するために組換えタンパク質を用いることに加えて 、論理的に推理されたマウスＯＢ配列由来の４種のペプチド配列のセットを、免 疫原性プロットソフトウエア(GCG Package)を用いて同定した。４つのカルボキ シ末端ペプチドフラグメントは以下の通りである： これらのペプチドは、KLHと結合し、そしてこのペプチド−KLH結合体を用いて 、標準的技術を用いてウサギを免疫した。各ペプチドに特異的なポリクローナル 抗血清をウサギから回収する。 実施例４：ＯＢポリペプチドのインビトロ転移 機能的シグナル配列の存在を確認するために、オープンリーディングフレーム 全体を含むヒトcDNAをpGEMベクターにサブクローニングした。この実験にはヒト cDNAのみを用いた。なぜなら、適切なマウスサブクローンは回収されなかったか らである。ポジティブ鎖であるヒトob RNAをSp6ポリメラーゼを用いて転写し、 イヌ膵臓ミクロソーム膜を伴ってまたは伴わずにインビトロ翻訳反応に用いた。 一次翻訳産物は、約18kD（これは、cDNA配列から予想された分子量と一致する） の見かけの分子量で移動した。ミクロソーム膜を反応物中に含有することにより 翻訳の全体的な効率が約５倍阻害された。それにも関わらず、約50〜70％のOBの 一次翻訳産物は、膜調製物の存在下では約２kDに短縮された。このことは、シグ ナル配列が機能的であることを示唆する（図19A）。インターロイキン-1αRNA（ これはシグナル配列をコードしない）の一次翻訳産物のサイズは、反応物にミク ロソーム膜が含まれない場合には、変化しなかった。OBタンパク質の転移(trans location)が起こったことを確認するために、インビトロ翻訳産物をプロティナ ーゼ-Ｋで処理した。プロテアーゼ処理の結果、18kDの一次翻訳産物は完全に タンパク質分解されたが、16kDのプロセスされた形態は酵素処理により影響を受 けなかった。このことは、それがミクロソームの内腔へ転移したことを示す（図 19B）。これらのデータは、OBが分泌された分子であるという仮説に適合する。 シグナル配列の開裂後、２つのシステイン残基が予想されたタンパク質中に残 り、この分子が他の分泌ポリペプチドの特徴であるジスルフィド結合を含む可能 性を高めた[Shenら、Science，224:168-171(1984)]。 実施例５：ＯＢ遺伝子の特徴付け ヒトにおける肥満症とＯＢ遺伝子内の遺伝的改変との関係を確証するために、 ヒトＯＢ遺伝子の配列を決定した（図20A〜20C）（配列番号22および24）。ヒト コード配列由来の特定のプライマーを用いてヒトP1ライブラリーをスクリーニン グした。３つの異なるP1クローンを入手し、増殖させ、そして第１コードエキソ ンと第２コードエキソンとの間のスプライシング部位に隣接するプライマーを用 いてPCR増幅を行った。約2kbの全イントロン領域を増幅し、部分的に配列決定し た(図20A参照；および配列番号22および24に示す)。 マウス遺伝子およびヒト遺伝子の両方の遺伝子構造を、PCRアッセイおよび他 の標準的技術を用いて特徴付けた。マウスＯＢ遺伝子は、３つのエキソンからな ることが見出され、第２および第３のエキソンがコード配列を占める（図20D） 。ヒトＯＢ遺伝子のコード領域は、同じ構造を有する；しかし、ヒト遺伝子は５ ’エキソンおよびイントロンを欠いている（図20E）。 ヒト遺伝子のイントロン配列から生成された２セットのプライマーを調製した （図20A〜C）。プライマーの配列は以下の通りである（ＦおよびＲはそれぞれフ ォワードおよびリバースを表す）： DNAサンプルを種々の供給源から入手し、そしてこれらのプライマーのセット を用いて深刻な肥満の人由来のヒトゲノムDNAを増幅させた。このPCR産物を低融 点アガロースゲル上で流し、バンドを切り出してアガラーゼ(agarase)で消化し た。ABI 373A DNAシークエンサーおよびTaqジデオキシターミネーターキット(AB I,Perkin-Elmer)を用いてその配列を得た。患者サンプル由来のob遺伝子内に１ 点変異が現在までに検出された。この変異は第１エキソン内にあり、アミノ酸配 列を変化させない。予備データは、別の患者の第１エキソン内に挿入配列が存在 し得ることを示す。Taq DNAポリメラーゼの代わりにSequenaseを用いる異なる自 動化された配列決定法が、変異検出のためにより容易に読める配列を得るために 用いられ得る。 実施例６：酵母におけるＯＢの発現 ＯＢのポジショナルクローニングに続き、ＯＢタンパク質が食物の摂取量およ び体重を減少させる生理学的メカニズムを明らかにすることが重要になった。こ の方針の第１段階は、発現系を用いて機能的タンパク質を組換えによって産生さ せることであった。細菌の発現系が好結果であることに加えて、酵母の発現系も また選択された。酵母発現は、ＯＢの発現のためにいくつかの魅力的な特徴を有 する。最も重要なのは、生物学的に活性な真核生物のタンパク質が産生されやす いということである。ＯＢポリペプチドは哺乳動物細胞によって分泌される。タ ンパク質の分泌は全ての真核生物について非常に類似している。このことは、細 菌の分泌経路が似ているよりずっと酵母の分泌器官が哺乳動物の分泌経路に似て いることを意味する。特に、哺乳動物細胞で見られるＯＢのタンパク質改変は、 酵母の分泌系を通じての発現においてもよく見られる。さらに、タンパク質のフ ォールディングは分泌器官を通過中に行われ、従って酵母の分泌器官を介してob を送達することは、天然の生物学的活性を有する適切にフォールディングしたタ ンパク質を生じやすい。このことは、２つのシステイン残基がジスルフィド結合 を形成し得るのでＯＢについて著しい。分泌経路とは対照的に、細胞の細胞質の 還元環境は、ジスルフィド結合の形成を妨げる；従って、インビボでこのジスル フィド結合が形成されるためにはＯＢが分泌経路を通過することが必須である。 他の利点は、酵母の操作の簡便性と迅速性、ベクターおよび株の利用性、ならび に酵母の組換え技術の膨大な経験に関係する。 Pichia pastoris発現系を以下の４つの理由により選択した：（１）それが他 の酵母の系（例えば、S.cerevisiae）より高レベルの異種タンパク質の発現を有 する；（２）P.pastorisにおけるタンパク質のグリコシル化がS.cerevisiaeにお いてより哺乳動物の系に類似している（もっとも、コンピューターサーチを用い てグリコシル化部位をobにおいて検出したのではないが、認識されていない部位 でのグリコシル化の可能性はまだ残っている）；（３）P.pastorisは、天然には ほとんどタンパク質を分泌しない、従って、一般に発現した外来タンパク質を精 製することが容易である；そして（４）ベクターおよび酵母の株が市販されてい る（Invitrogenから）。図21および22に酵母発現ベクターを生成する２つのスト ラテジーを示す。 選択されたベクターはpPIC.9であった。このベクターは、α-接合因子(α-mat ing factor)プレプロコード配列のすぐ下流のクローニング部位を含む。この配 列は、分泌経路によって分泌されるクローニング部位にクローン化された遺伝子 によってコードされるタンパク質を支配する。このベクターの別の重要な特徴は HIS4遺伝子である。この遺伝子は、このベクターによって酵母をトランスフォー ムした後、ヒスチジン欠損培地で増殖させた酵母の栄養要求性株を用いてこのベ クターの取り込みに関して選択を可能にする。クローニングのストラテジーは以 下の通りであった：ＯＢcDNAを５'プライマーを用いてPCR増幅する。このプライ マーは、３'末端部に、予想されるリーダーペプチド開裂部位のすぐ後ろのＯＢ 配列と相補的な配列を、そしてそのほぼ５'末端部にはベクターのα-接合因子配 列の３'末端部に相補的な配列を含む。この５'プライマーはまたXhoI部位も含む 。３'プライマーは、その３'末端部にＯＢの最後の数個のアミノ酸に相補的な配 列を、その５'末端部にはEcoRI部位を有するように設計された。PCR増幅の後、 このPCR産物をXhoIおよびEcoRIで消化して同様に消化したpPIC.9にクローニング した。マウスおよびヒトの両ＯＢ cDNAをクローニングした後（各々、コドン49 位にグルタミンを有するものおよび有さないもの）、個々のクローンを４つの構 築物全てについて単離し、配列決定して構築物が正しい方向、およびフレームに クローニングされたこと、およびPCR増幅工程に由来する変異を含まないことを 立証した。正しい配列を有するクローンの同定後、これらをP.pastoris GS115株 （ヒスチジン要求株）にトランスフォームした。 ２つのマウスＯＢ構築物に関して、トランスフォームされた酵母クローンをタ ンパク質の発現に関してスクリーニングした。トランスフォームされた酵母はＯ Ｂを含むという証拠として、DNAドット−ブロットアッセイおよびコロニーハイ ブリダイゼーションアッセイを行った。これらはどちらもＯＢ配列がトランスフ ォームされた酵母内にはあるが、トランスフォームされていない酵母内にはない ことを示した。さらに、トランスフォームされた酵母は今では16kDaのタンパク 質を培養培地に分泌したが、トランスフォームされていない酵母はこのサイズの タンパク質を分泌しない（図23A）。これはＯＢの予想されたサイズである。Ｏ Ｂの高い発現体である両方のマウスの構築物の個々のクローンを同定した。現在 、obを均一に精製するための精製ストラテジーが開発されている。１つのストラ テジーは、ＯＢをカチオン交換カラムで精製することである（図23B）；予備デ ータは、強いカチオン交換体が有用であり得ることを示唆している。しかし、カ チオン交換クロマトグラフィー後、推定されるob産物は失われている。このこと は、サンプル中のプロテアーゼの存在を示す。 この問題を克服する１つのストラテジーは、酵母における発現のためにob-His -tag融合物を調製することである（図22）。さらなる評価は、His-tagを持たな いＯＢがNi-キレート化カラムにしっかりと結合していることを示した。Ni-キレ ート化とそれに続くゲル濾過によるＯＢポリペプチドの精製は、質量分析法に十 分な純度の産物を生じた。質量分析は、発現されたタンパク質の分子量が予想し た分子量と同じであることを裏付け、このことはＯＢがPichiaにおいて成功裡に 発現されたことを強く確証する。 しかし、Ni-キレート化/ゲル濾過精製プロトコルは、ＯＢポリペプチドを十分 に純粋な形態で生じない。別の小分子が存在する。タンパク質分解活性はNi-キ レート化カラムからの排除体積に溶出するようである。従って、3工程の精製プ ロセスを計画する：Ni-キレート化、続いてカチオン交換（これは小分子混入物 を除く）、その後ゲル濾過。 SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色による推定発現レベルは、酵母が振とうフ ラスコ内で増殖された場合には、約10mg/lであることを示す。これらのレベルは 発酵容器内で増加することが期待され、そして本発明者らはより多量のタンパク 質を得るという希望を持って発酵を開始しようとしている。ヒトＯＢ構築物に関 しては、高コピー数のＯＢ遺伝子を含むトランスフォームされた酵母のクローン が同定され、それらはＯＢタンパク質を発現することが予想される。抗体が開発 されれば、分泌された16kDaのタンパク質の独自性(identity)の確認のためにそ れらが用いられるであろう。 実施例７：細菌におけるＯｂ融合ペプチドの高レベルの発現 フリーザー貯蔵物の調製： 炭素供給源を含まない滅菌されたM9ZB培地の2つの4mlアリコートのそれぞれに 、40μlのストックデキストロース(0.4g/ml、フィルター滅菌済み)、10μlのア ンピシリンストック(200mg/ml)、および5μlのクロラムフェニコールストック(3 4mg/ml、エタノール中)を添加した。それらに、Novagen pET-14bベクター内にク ローン化されたマウスおよびヒトOB1 DNAを有するE.coliの単一のコロニーそれ ぞれを用いてこれらを接種した。チューブを37℃で一晩インキュベートした。 一晩培養した培養物0.5mlを用いて、デキストロース、アンピシリン、および クロラムフェニコールを含む50mlのM9ZB培地に接種した。これらを30℃でインキ ュベートして600nmでの吸光度(A600)を定期的にモニターした。A600が約1〜1.2 の時点で、175μlの培養物のアリコートを2mlのエッペンドルフチューブ内で25 μlの60％グリセロールと混合し、液体窒素中で瞬間凍結し-80℃で保存した。 培養物の増殖： 0.5mlの40％デキストロース、125μlのアンピシリンストックおよび50μlのク ロラムフェニコールストックを含む50mlのM9ZB培地に1mlの凍結ストックを接種 して30℃でインキュベートした。A600が1〜1.2の時点で、この培養物10mlを用い て、デキストロース、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含む500mlのM 9ZB培地の入った2Lのフラスコ4本に接種した。これらを、A600が約1〜1.2の時点 で最終濃度0.5mMのIPTGを用いた誘導まで30℃でインキュベートした。培養物を 一晩インキュベートした。細胞を4000rpmで20分間遠心分離して回収した。この 発現系は全タンパク質のかなり高い割合（グラム/１リットルE.coliのオーダー で）として組換えＯＢポリペプチドを生じる。 細胞溶解および封入体の再懸濁： 細胞ペーストを最少容量の20mM HEPES,pH7.2、10％グリセロール、0.1M KCl、 5mM MgCl2、1%アプロチニン、1mM PMSF、5μg/mlロイペプチン、および50μg/ml DNase Iに再懸濁した。懸濁物を液体窒素および温湯を用いて凍結融解を3度行 った。溶解した細胞を18000rpmで30分間遠心分離して、20mM HEPES,pH7.5、0.1M NaClに再懸濁した。懸濁物を超音波処理してTriton X100を最終濃度2％になる ように添加した。これを18000rpmで15分間遠心分離した。このサイクルをさらに 2回行った後、Tritonなしで3サイクル洗浄した。最後に、ペレットを、超音波処 理およびそれに続く遠心分離により6M GdHCl(グアニジン-HCl)、20mM HEPES,pH7 .5に溶解した。上清をさらなる精製に用いた。 フォールディングされていない状態のＯＢタンパク質を固定化金属イオンアフ ィニティークロマトグラフィー(IMAC)により精製した。5カラム容量の50mM NiSO4 で帯電させて6M GdHCl、20mM HEPES,pH7.5で平衡化したPharmacia chelating f ast flow sepharoseの40mlカラムに溶液をかけた。このカラムを6M GdHCl、30mM イミダゾール、20mM HEPES,pH7.5で洗浄した。最後に、タンパク質を0.2Mイミダ ゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。6M GdHCl中のフォールディングされていな いタンパク質を、酢酸ナトリウム(NaAc)を10mMまで添加してpHを酢酸で約4.5に 調整した後、4℃で保存した。 タンパク質の再フォールディングおよび精製： 100mgのタンパク質を含む6M GdHCl溶液を、67μlの1Mジチオスレイトール(DTT )で処理し、そして6M GdHCl、10mM NaAc，pH4.5で約67mlまで希釈した。それを 室温で約1時間撹拌した。それを撹拌しながら4Lの20％グリセロール、2.5mM CaC l2、20mM Tris，pH8.4緩衝液に希釈した。適切に混合した後、この溶液をさらに は撹拌せずに室温に約8時間おいた。次いで、2000単位の精製ウシトロンビン(Pa rke-Davis製品のthrombostat由来)を添加し、そしてこの溶液を緩やかに撹拌し ながら放置した。2.5時間後、2000単位のトロンビンを再度投与し、ヒスチジン- tagの開裂をさらに3時間続けた。トロンビンの開裂はPMSFを最終濃度0.1mMまで 添加することにより停止させた。この溶液を濾過して4℃で保存した。 開裂したタンパク質を、1M KCl、20%グリセロール、20mM HEPES，pH8.4緩衝液 で平衡化した上記と同じIMACカラムでさらに精製した。タンパク質溶液をロード 後、それを同じ緩衝液で洗浄し、そして開裂したタンパク質を1M KCl、20%グリ セロール、40mMイミダゾール、20mM HEPES，pH8.4で溶出した。開裂しなかった タンパク質を0.2Mイミダゾールで溶出した。 精製された開裂タンパク質を濃縮し、50〜100mＭのEDTA、10mMフェリシアン化 カリウムで処理して（全ての不完全な酸化を完全にするため）、superdex 75 16 /60カラムでゲル濾過した。この手順を用いた収率は出発ペプチドの約50％に近 づいた。 一旦精製されると、発現されたタンパク質はいくつかの方法によって特徴付け られた。物理的な特徴付けは、構造の均一性を決定するための動的光散乱を含み 、そして適切なフォールディングの尺度として用いられる。光散乱データは、ヒ トＯＢポリペプチドは、主に、または専らモノマーとして発現され、一方、マウ スＯＢポリペプチドは、ダイマーならびにモノマーとして見出され得ることを示 した。 Ellman試薬および質量分析法を用いるアッセイは、システイン残基がタンパク 質内でジスルフィド結合を形成することを確証した。このポリペプチドの酸化型 は以下のようにマウスに投与され、そして生物学的活性を示した。 円偏光二色性を用いてこのタンパク質の構造的な形状を概略で決定した。生理 学的緩衝液（pH約8、およそ生理学的イオン強度）中のCDスペクトルは、ヒトＯ Ｂポリペプチドが約60％のαヘリックス構造および約40％のランダムコイル構造 を有することを示す。マウスＯＢポリペプチドは、CD分光学により約50％のαヘ リックスおよび50％のランダムコイルを有することが見出された。 制限タンパク質分解に続く質量分析(Cohenら、1995、前出)を用いて、タンパ ク質分解の影響を受けやすいＯＢポリペプチドの部分を同定した。この分析はア ミノ酸残基54位〜60位の可動性ループ構造の存在を示した（図４に図示）。この 可動性ループは定義された２°の構造（例えば、α-ヘリックス）の２つのドメ インに結合しているようである。 重要なことは、次の実施例で示すように、精製されたタンパク質の生物学的活 性を、そのタンパク質を痩身型齧歯類および肥満型齧歯類の両方に浸透圧ポンプ （例えば、Alza Corporation，Palo Alto，CAのALZET浸透圧ポンプ）を介して投 与することにより、または少なくとも2週間にわたって毎日腹腔内にボーラス投 与することによりアッセイし、そして摂食行動および体重に及ぼす影響を観察し た。 実施例８：ＯＢポリペプチド（レプチン）の体重減少効果 マウスＯＢ遺伝子座の遺伝子産物は、体重調節に重要な役割を果たす。この実 施例は、マウス、ラット、およびヒト血漿においてＯＢタンパク質が循環してい ることを立証する。３つの全ての種における循環形態は、SDS-PAGEによるとシグ ナル配列を持たない推定ポリペプチド配列と同じ分子量を有する。このことは、 インビボではこのタンパク質がシグナル配列を開裂した後でプロセスされないこ とを示す。ＯＢタンパク質はC57/B16J ob/obマウス由来の血漿には存在せず、コ ントロールと比較してdb/dbマウスの血漿中には10倍高い濃度で存在し、fa/faラ ットの血漿中には20倍高いレベルで存在した。これらの肥満動物変異体はＯＢの 効果に耐性であることが示唆される。６人の痩身型ヒト被検者の群内でＯＢタン パク質の血漿レベルに７倍の差があった。組換えマウスＯＢタンパク質の毎日の 注射は、ob/obマウスの体重を劇的に減少させ、野生型マウスの体重に対して有 意な効果を有したが、db/dbマウスに対しては影響を有さなかった。これらのデ ータは、ＯＢ遺伝子座の遺伝子産物が体重調節のための内分泌機能を提供するこ とを示唆する。 材料および方法 ウサギをフロイントアジュバント(HRP，Inc.)中の組換えタンパク質で免疫し た。免疫精製された抗マウスＯＢ抗体を、記載されたように組換えタンパク質に 結合させたsepharose 4Bカラムに抗血清を通過させることにより調製した[Harlo wら、Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor，NY(1988)]。マウス血漿の免疫沈降を次のように行った： 約2.5mMのEDTAを含むマウス、ラット、およびヒト由来の血漿0.5mlを、結合して いないsepharose-4Bと揺り動かしながら室温で２時間予め明澄化(pre-cleared) した。スピンによりsepharoseを取り出し、アフィニティー精製した抗体を1mg/m lのパックされたsepharoseの濃度で含む抗体結合sepharoseの50％スラリー50ml を添加した。1/2mlの２×RIPA緩衝液を添加して最終結合条件を次のようにした ：50mM Tris-HCl，pH7.5、100mM NaCl、1％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％デオキシ コール酸ナトリウム、および0.025％アジ化ナトリウム。反応を揺らしながら４ ℃で一晩行った。抗体結合sepharoseをRIPA緩衝液を用いて８回洗浄し、続いて 、PBSを用いて３回濯ぎ、15％のSDS-PAGE上で泳動した。タンパク質をニトロセ ルロースフィルターに移し、組換えタンパク質に対するビオチン化した免疫精製 抗体でウエスタンブロットした。用いた二次抗体はHRP-ストレプトアビジンであ り、ECLを検出に用いた。 マウス血清中のＯＢの量を定量するために、再びフォールディングした(refol ded)組換えマウスＯＢタンパク質の量を増加させて(0.01、0.1、0.5、2.0、15.0 ng)100λのC57BL/6J ob/ob血漿に添加し、protein A sepharoseに結合した抗体 と共に４℃で３時間インキュベートした。緩衝液Ａ(10mMリン酸ナトリウム緩衝 液，pH7.4；100mM NaCl；1％ Triton X-100、5mM EDTA、1mM PMSF)による多数回 の洗浄の後、サンプルをサンプル緩衝液に再懸濁し、15％SDS-PAGEにロードして 、ニトロセルロースメンブレンに移した。免疫精製ビオチン化抗アミノ末端抗体 を一次抗体として、HRP-ストレプトアビジンを二次抗体として用いてウエスタン ブロットを行い、続いてECL検出を行った。 細胞質抽出物は脂肪組織をNDS緩衝液(10mM Tris，pH7.5、10mM NaCl、60mM IC CI、0.15mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、14mM β-メルカプトエタノール、0 .5mM EGTA、２mM EDTA、0.5％ NP-40)中でpolytronおよびdounceホモジナイゼー ションによってホモジナイズすることにより調製し、そして核の除去は700gでの 遠心分離によって行った。 免疫沈降は、免疫精製抗ヒトＯＢ抗体を用いたこと以外は、上記のように行っ た。ELISAに関しては、免疫精製抗ヒトＯＢ抗体の1mg/ml溶液100mlをホウ酸緩衝 PBS溶液に溶解し、マイクロタイター(Corning cat.＃2595)プレートに入れ一晩 ４℃でおいた。次いで、このプレートを0.05%Tween20を含むホウ酸生理食塩水溶 液で４回洗浄し、余分な液体を除いた。プレートを室温で２時間１ウェル当たり 240mlの0.3%ゼラチンを含むホウ酸生理食塩水溶液とともにインキュベートする ことによりブロックし、次いで、洗浄して乾燥した。既知量の再びフォールディ ングしたヒトＯＢタンパク質または血漿サンプルのいずれかを100mlの容量で個 々のウェル中４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、このプレートを100mlの ビオチン化免疫精製抗ヒト抗体（ゼラチン-ホウ酸緩衝溶液中0.1mg/ml）ととも に室温で４時間インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP )-ストレプトアビジンをこのプレートに添加した（ホウ酸緩衝液中0.1mg/ml、0. 3%ゼラチン）。次いで、HRP基質溶液（クエン酸中ABTS、0.3mg/mlおよびH2O2、0 .01%）を検出に用いてO.D.を414nmで測定して抗体の結合を定量した。 マウスおよびヒトＯＢ遺伝子コード配列を、ＯＢ cDNA配列を含むプラスミド からPCR増幅し、pPIC.9プラスミド(Invitrogen)にサブクローニングした。用い たヒト５'プライマーは であり、そして３'プライマーは マウスに関しては、５'プライマーは であり、そして３'プライマーは マウスおよびヒトのどちらの５'プライマーも、５'末端にXhoI部位、およびベ クターpPIC.9内に存在するα接合因子シグナル配列の最後の４アミノ酸のコード 配列を含む。このベクターは不均一に発現される遺伝子の細胞から培養培地への 分泌を支配する。５'PCRプライマーはまた、シグナル配列開裂部位の後で21位の アミノ酸アラニンの前のＯＢ遺伝子のオープンリーディングフレームの最初の19 ヌクレオチドを含む。３'プライマーはその５'末端にEcoRI部位を含む。この部 位のすぐ後ろに推定ＯＢ停止コドンと相補的な配列が続いている。PCR条件は次 の通りであった；94℃で１分間の変性、55℃で１分間のアニーリング、そして72 ℃で2.5分間の伸長。低サイクルPCR（15サイクル）および校正ポリメラーゼPFU( Stratagene)を用いてPCRによって生成される変異の数を制限した。PCR産物をX hoIおよびEcoRIによって消化し、そして同様に消化されたベクターpPIC.9にクロ ーニングした。全ての構築物を両方の鎖について配列決定し、PCRによって生成 された変異がないことを確認した。クローンを、スフェロプラスト法によってPi chia pastoris(His-)にトランスフォームし、ヒスチジン欠損培地で選択した。 コロニーハイブリダイゼーションアッセイによって高コピー数の組み込みに関し て約200のマウスおよびヒトクローンがスクリーニングされた。次いで、高コピ ー数のクローンを、ＯＢ発現についてアッセイした。始めはクマシー染色によっ て、トランスフォームされた酵母の培養培地中に存在する新規な16kDタンパク質 の存在が示された。この16kDのバンドは、細菌で発現されたＯＢタンパク質に対 して生じた抗体を用いてＯＢであることが確証された。この組換えタンパク質は 以下に記載する２段階の精製方法によって精製された。質量分析および臭化シア ン処理をBeavisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6873-6877(1990)に記載のよう に行った。 マウスおよびヒトＯＢ遺伝子のＣ末端からシグナル配列までの全ＯＢコード配 列をpET15b発現ベクター(Novagen)にサブクローニングし、そしてEscherichia c oli[BL21(DE3)plYsS]内でT7 RNAポリメラーゼ系を用いて過剰発現させた[Studie rら、Meth.Enzymology，185:80-89(1990)]。30℃で595nmにおける吸光度が0.7に なるまで増殖させ、そして0.5mMのイソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド で一晩誘導した細胞を低速遠心分離により回収した。溶解を３サイクルの凍結溶 解によって行い、DNA消化はDNaseIを用いて行った。膜抽出を超音波処理および デタージェント可溶化(detergent solubilization)によって行い、そして最終封 入体ペレット(final inclusion body pellet)を6Mグアニジン-HCl、20mM HEPES, pH8.4に溶解した。組換えＯＢタンパク質を、Niイオンアフィニティーカラムを 用い、イミダゾールの量を増加させながら洗浄するIMACによって、変性条件下で 精製した。次いで、精製された変性ＯＢタンパク質を6Mグアニジン-HCl、10mM酢 酸ナトリウム(NaAc),pH5中で貯蔵し、そして1mM DTTを用いて室温で１時間還元 した。還元したタンパク質を20%グリセロール、5mM CaCl2、5mM NaAc，pH5に希 釈し、混合して室温で８〜12時間インキュベートすることによって変性を行った 。変性後、Trisを10mMまで添加することによりpHを8.4に調整し、そしてヘキサ- ヒ スチジンtagをトロンビン開裂によって除いた。開裂され、復元されたタンパク 質をIMACによって再精製し、トロンビンおよび開裂されなかった融合タンパク質 から生成物を分離した。開裂され、復元されたタンパク質はNiイオンアフィニテ ィーカラムから40mMイミダゾールで溶出するが、トロンビンは保持されず、そし て開裂されなかった融合タンパク質は0.2mMイミダゾールで溶出する。次いで、 生成物を濃縮し、100mM EDTAおよび10mMフェリシアン化カリウムで処理してPhar macia superdex 75 16/60カラムを用いるゲル濾過によってさらに精製した。 EllmanアッセイをEllman,Arch.Biochem.Biophys.,82:70-77(1959)に記載のよ うに行った。Ellman試薬は、39.6mgの5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)(DTN B)を10mlの0.05Mホスフェート、pH8に溶解することにより調製した。較正曲線を 10〜120mMの遊離スルフヒドリル（還元DTTの1mMストック溶液を用いる）の濃度 範囲で412nmで構成した。各アッセイは0.02mlのEllman試薬および総反応混合物0 .5mlを用いて行った。測定された消衰係数は遊離スルフヒドリル基に関しては12 974M-1cm-1(相関係数0.99987)であり、これは、先に報告された値13600M-1cm-1 の５％以内である。 50mlの2mg/ml精製ゲル濾過タンパク質（最終反応混合物中の可能な遊離スルフ ヒドリル濃度約24mMに相当）をEllmanアッセイに供した。得られた溶液はＡ412 が約0.02であり、このことはタンパク質中の２つのシステイン残基がシスチンを 形成する酸化された状態であるか、またはそれらの遊離スルフヒドリル基が、フ ォールディングしたタンパク質の近づきにくいコア内に完全に埋まっていること を示唆する。同じアッセイを６Ｍグアニジン-HClの存在下でフォールディングさ れていないタンパク質に関して行うことによって同じ結果が得られた。 マウスを病原体のない環境で個別にケージに入れ、35％(w/w)Laboratory Rode nt Diet 5001(PMP Feeds，Inc.)、5.9％(w/w)タピオカプリンミックス(General Foods)、および59.1％水を含む飼料（エネルギー含量1.30kcal/gm）に順応させ た。この飼料はオートクレーブで滅菌されそして60mmプラスチック皿（この皿は 100mmのペトリ皿の頂部に固定されている）に詰めた。タピオカは飼料に糊状の 性質を与え、それにより動物が食物をケージに散らかすのを困難にする。100mm の蓋により動物がこぼした少量の食物を回収する。毎朝新鮮な食物をケージに入 れそして前日の皿を取り出して重量を量った。重量の差は毎日の食物消費の尺度 を提供する。組換えタンパク質が食物摂取量および体重に与える影響は３系統の マウスで測定された：C57Bl/6J ob/ob、C57 Bl/Ks db/db、およびCBA/J +/+(Jac kson Laboratoryから購入）。30匹の各系統のマウスを10匹ずつの群に分けた。 各系統の１群には毎日300μlのPBS中5mg/g/日の用量で再びフォールディングし た細菌obタンパク質を腹腔内(i.p.)に注射した。第２の群には同容量のPBSを腹 腔内注射した。これらのコントロールマウスに組換えタンパク質をPBSで透析し たものを注射した。このPBSはActiclean ETOXカラムを用いてエンドトキシンを 取り除かれた。第３群の動物には注射しなかった。食物摂取量を毎日記録し、そ して体重測定値を3.5週間隔で定期的に記録した。ペアーフィーディング実験に ついては、別の群のｏｂマウスの食物摂取量は、タンパク質を与えられているｏ ｂマウスによって消費される食物摂取量と日毎ベースで(on a daily basis)一致 した。 結果 ＯＢタンパク質はマウス、ラット、およびヒト血漿中を循環している 組換えマウスおよびヒトＯＢタンパク質をpET 15b細菌発現ベクター(Novagen) を用い、そしてPichia pastoris（酵母の発現系で組換えタンパク質を培養培地 に直接分泌する）にクローニングすることにより調製した。酵母で発現されるｏ ｂタンパク質は、カルボキシ末端からシグナル配列までの146アミノ酸を含む。 ウサギを細菌タンパク質(HRP,Inc.)で免疫した。抗体を免疫精製して(Research Genetics)、免疫沈降、および血漿および脂肪組織由来のタンパク質のウエスタ ンブロットに用いた。 マウスの血漿由来のＯＢタンパク質はSDS-PAGEにより見かけの分子量16kDで移 動した。電気泳動による移動性が、シグナル配列を除去した後の酵母によって分 泌される組換えＯＢタンパク質と一致する（図24A）。このタンパク質は、105位 のコドンにナンセンス変異を有するC57BL/6J ob/obマウス由来の血漿では検出さ れなかった。いくつかの異なる抗血清は、cDNA配列から予想された短縮された10 5残基ポリペプチド鎖を同定できなかった。 db/dbマウスではコントロール動物に比べて循環タンパク質のレベルが10倍増 大していることが観察された（図24A）。野生型およびfa/faラット由来の血漿の 免疫沈降は、変異ラットにおけるＯＢタンパク質のレベルが、野生型と比較して 20倍増加していることを明らかにした(図24B)。db変異は、結果としてｏｂマウ スに見られるのと同じ肥満型表現型になる(Baharyら、1990、前出)。fattyのラ ットは、dbに相同な遺伝子内の劣性変異の結果として肥満する(Truettら、1991 、前出)。マウス血漿中ＯＢのレベルを定量するために、組換えタンパク質の量 を増加させながら血清に添加して免疫沈降させた(図24C)。組換えタンパク質の 量の増加に伴ってウエスタンブロットのシグナル強度の直線的増加が見られた。 マウス血漿中の天然タンパク質のシグナル強度と標準との比較は、野生型マウス において循環しているＯＢタンパク質のレベルは約20ng/mlであることを示した 。これらのデータは、免疫沈降およびウエスタンブロットが抗体過剰条件下で行 われたことを示す。コントロールと比較して増加したレベルのＯＢタンパク質は db/dbマウス由来の脂肪組織のタンパク質抽出物においても見られる(図24D)。分 泌されたタンパク質について予想されたように、脂肪組織由来のタンパク質は粗 膜画分と一緒に分画された（データは示していない）。 体重指数(Body Mass Index)(BMI=体重／身長2)が25より小さい６人の痩身型ヒ ト被検者の血漿サンプルを、ヒトタンパク質に対する免疫精製抗体を用いて免疫 沈降させた。免疫沈降した物質は、酵母で発現された146アミノ酸のヒトタンパ ク質で見られた電気泳動の移動度と同じ移動度で移動した。シグナルの強度は６ サンプル間で有意に異なった（図25A）。オートラジオグラフのデンシトメトリ ーは、個体HP1およびHP6におけるレベルはおよそ５倍の差があり、他の被検者に おけるレベルは中間にあることを明らかにした。酵素連結免疫アッセイ(ELISA) を、免疫精製された抗体およびスタンダードとして再びフォールディングした細 菌タンパク質を用いて行った（下記参照）。得られた標準曲線を図25Bに示す。 このアッセイを用いると、この６人のヒト血漿サンプル中のＯＢタンパク質血漿 レベルは２〜15ng/mlの間で変化した（図25C）。HP6由来の血漿中のＯＢタンパ ク質のレベルは免疫アッセイの直線範囲の外側にあり、≧15ng/mlである。これ らの量的な差はウエスタンブロットで見られる差と相関していた。 予備データは、レプチンが少なくとも部分的に別の１つのまたは複数のタンパ ク質と複合体化して循環し得ることを示唆する。この結論は、組換えスタンダー ドに比べて血清の滴定曲線の形の不均一性に基づく。変性条件および非変性条件 下でゲル濾過HPLCによりウサギ抗ＯＢカラムで免疫精製された多量のレプチンの 分析(ELISAおよびSDS-PAGEによりモニターした)は、ＯＢポリペプチドが高分子 量複合体のように振る舞うことを示唆した。しかし、これらのデータは予備的な ままである；もし必要であれば、ＯＢ結合タンパク質をさらに特徴付けなければ ならない。 ＯＢタンパク質の構造的特徴 ＯＢタンパク質は２つのシステイン残基を有するので、インビボの酸化条件下 では分子内または分子間ジスルフィド結合を形成し得る。サンプル緩衝液に還元 剤を添加してまたはしないでウエスタンブロットを繰り返した。どちらの条件下 でも、ヒト血清中のＯＢタンパク質はモノマーとして移動した（データは示さな い）。非還元条件下ではdbマウス血清から免疫沈降したタンパク質が、16kDのモ ノマーおよび約32kDのダイマーの両方のタンパク質と一致した位置に検出された （図26A）。高分子量部分が還元条件下で消失したことは、マウスＯＢ画分が分 子間ジスルフィド結合の形成を通じて高分子量種として循環していることを示唆 する。約80％のマウスＯＢが約16kDのタンパク質として循環し、そして20％が約 32kDの形態で循環している。 マウスおよびヒトのタンパク質がPichia pastori中で発現される場合に、同じ 分子形態が見られる[Abramsら、Immunol.Rev.,:5-24(1992)]。これらの研究にお いて、146アミノ酸の成熟ＯＢタンパク質に対応するDNA配列がpPIC.9ベクター(I nvitrogen)内の酵母α接合因子シグナル配列の下流にクローニングされた。ＯＢ タンパク質を、マウスおよびヒトのタンパク質を発現する株の酵母培地から精製 し、そして還元条件および非還元条件下で電気泳動した（図26A）。マウスのタ ンパク質は非還元条件下では主にダイマーとして酵母内で発現され、還元剤存在 下でモノマーとしてのみ発現された。組換えヒトタンパク質はどちらの条件下で もモノマーの位置に移動した（データは示さない）。 Pichia内で発現された精製ヒトタンパク質は、質量分析1990(Beavis，1990,前 出)により測定された16,024±3Daの分子量を有した。この値は、１個の分子内ジ スルフィド架橋を含むタンパク質のアミノ酸配列から計算した質量(16,024Da)と 一致する。このタンパク質の臭化シアン開裂産物のマトリックスアシストレーザ ー脱着(Matrix-assisted laser desorption)質量分析は、117位のシステインと1 67位のシステインとが分子内ジスルフィド結合を通じて結合していることを示す （図26B）。臭化シアンはカルボキシ末端からメチオニン残基までを開裂する。 生物活性な組換えタンパク質の調製および特徴付け マウスＯＢタンパク質は、E.coli内でpET 15bプラスミドから、トロンビン開 裂部位を含む20残基のN-末端のヘキサ-ヒスチジンtagを有する不溶性融合タンパ ク質として発現された。細菌の封入体をグアニジン-HClを用いて可溶化しそして 固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を用いて変性条件下 で精製した（図27）。精製され、変性された融合タンパク質を還元、希釈して室 温で水溶液中で再びフォールディングさせた。トロンビン開裂に続いて、さらに ４つのN-末端残基(Gly-Ser-His-Met；配列番号38)を含む復元した(renatured)マ ウスＯＢタンパク質を、IMACによって（SDS-PAGEおよび質量分析による判定によ ると）＞98％均一まで再精製した。マトリックスアシストレーザー脱着質量分析 は、16,414±3Daの質量を測定された（予想された質量＝16,415Da）。還元およ び非還元SDS-PAGEゲルは共に、見かけの分子量が16kDである単一の分子種を示し た（データは示していない）。 DP801 Molecular Size Detector(Protein Solutions,Inc.)を用いる動的光散 乱測定は、復元したマウスＯＢタンパク質が主としてモノマー性であり、いくつ かはより高次の凝集物であることを示した。このタンパク質をEDTAで処理して化 学的に酸化した。次いで、高分子量種をゲル濾過により除いた。さらなる動的光 散乱測定は、精製され復元された組換えマウスＯＢタンパク質が単分散している ことを確証した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析した後、細菌のエン ドトキシンをActiclean ETOXカラム(Stereogene Bioseparations,Inc.)を用いて 除去した。タンパク質の最終収量は45mg/lであった。 精製され復元された組換えマウスＯＢタンパク質についてEllmanアッセイを行 い、その酸化状態を評価した(Ellman,1959,前出)。復元されたタンパク質も6Mグ アニジン-HClによってフォールディングしないタンパク質もどちらも遊離のスル フヒドリル含有量が＜0.5％であることを示し、モノマー産物が分子内ジスルフ ィド結合を含むことが示された。このことは再フォールディングした細菌性タン パク質の臭化シアン開裂生成物の質量分析により確かめられた。 ＯＢタンパク質の生物活性。精製され、復元された組換えマウスＯＢタンパク質 を、５mg/kg/日の腹腔内注射として10匹のC57B1/6J ob/ob(16週齢)、C57B1/Ks d b/db（12週齢）、およびCBA/J +/+（８週齢）マウスの群に毎日投与した。同数 の動物にPBSを毎日注射した。コントロール注射に用いたPBSは、タンパク質を平 衡化した後の透析物に由来した。３種のマウス系統のさらに10匹の動物は注射を 受けなかった。個々の動物の食物摂取量を毎日モニターし、そしてその動物の体 重を３、４日おきに記録した。９群のマウスのそれぞれの食物摂取量と体重の累 積結果を図28A〜Fに示し、そしてデータの統計学的な有意性を表１に示す。タン パク質を注射したC57B1/6J ob/obマウスの食物摂取量は、最初の注射の後有意に 減少し、第５日目（すなわち、PBSの注射を受けた動物の摂取量の約40％と同じ レベルに安定したとき）まで減少し続けた(p＜0.001)。擬注射したＯＢマウスは ３週間の研究期間を通じて、体重が減少しなかった。タンパク質を与えたC57B1/ 6J ob/obマウスは、５日後に体重が約10％減少した(p＜0.001)。これらの動物は ３週間の処理を通して体重が減少し続け、その時点で、タンパク質を与えられて いたｏｂ動物の体重は、平均でそれらの始めの体重の60％まで減少していた(p. ＜0.0001)。別の群のｏｂマウスとタンパク質を与えられているｏｂマウスとを ペアフィードした。図29Bに示したデータは、ペアフィードしたマウスの体重の 減少が組換えタンパク質を与えられた動物より有意に少ないことを示す(p＜0.02 )。タンパク質またはビヒクルのいずれかの注射を受けた２匹のマウスの写真は 、タンパク質処置の結果として外見に著しい違いを示している（図29B）。この タンパク質の効果をさらに確かめるために、各群の２匹のマウスの剖検を行った 。タンパク質を与えたｏｂマウスの総合的な視診により、体脂肪および肝臓のサ イズの劇的な減少が明らかにされた。dbマウスおよび野生型マウスの肝臓の重量 は処置によって変化しなかった。PBSの注射を受けたｏｂマウスの肝臓は5.04ｇ および5.02ｇであり、これに対して組換えタンパク質を与えた動物のそれは2.23 ｇおよび2.03ｇであった。ｏｂマウスに特徴的な色の薄い脂肪肝とは対照的に、 タ ンパク質を与えたｏｂマウスの肝臓は、正常な肝臓の特徴である濃い色をしてい た（図29C）。肝臓の組織切片は、未処置の動物は、タンパク質で処置した動物 では著しく改善された脂肪肝を有することを示した（データは示していない）。 このｏｂマウスとは対照的に、タンパク質を与えたC57BL/Ks db/dbマウスの体 重または食物摂取量はビヒクルを与えたコントロール群と比較して有意差はなか った（図28A〜F、表１）。db/dbマウスの３つ全ての群は処置期間中に２〜５ｇ 体重が減少した。ｄｂマウスの平均血糖値をグルコメーターを用いて測定し、そ れは全てのマウスで≧500mg/dlであった。このことは、これらの動物が肥満症に 続いて糖尿病を発症したことを示す。ｄｂマウスの注射は、２週間後に終止した 。 野生型マウスでは、組換えｏｂタンパク質の投与に続いて少ないが有意な体重 減少があった（図28A〜F、表１）。タンパク質注射の５日後、処置したマウスは 平均0.5gの減少であったが、コントロールマウスは0.4g増加していた(p＜0.02) 。続く２回の時点では、タンパク質を与えたマウスは毎日PBSを注射されたマウ スより有意に軽かった。体重変化の有意性は、後の時点では減少した。体重の減 った動物では、食物摂取量はコントロール動物と有意差はなかった。PBSの注射 は、注射を受けなかったマウスと比較して少ないが有意な影響をｏｂ、ｄｂ、お よび野生型マウスの食物摂取量および体重に及ぼした(p＜0.05)。 考察 ＯＢ遺伝子座位のタンパク質産物に対する内分泌機能は、Colemanによって最 初に示唆された。彼は、ob/obマウスの体重が正常またはｄｂマウスに対する並 体癒合(parabiotic union)の後減少することを示した(Colemanら、1978、前出) 。上記に示した結果は、ＯＢタンパク質が血流中で循環し、組換えタンパク質の 注射が体重を減少させることを示すことによりこの仮説を支持した。ＯＢ遺伝子 によってコードされる遺伝子産物の分子量はおよそ16kDであり、これは、カルボ キシ末端からシグナル配列までの146アミノ酸配列と等しい。組換えＯＢタンパ ク質はPichia pastoris中で発現される場合には改変されない。Pichiaにおける 哺乳動物遺伝子の発現は、一般に結果として、正しいタンパク質構造の形成に至 る[Creggら、Bio/Technology，11:905-914(1993)]。これらの知見は、インビボ で ＯＢタンパク質がグリコシル化されず、そして翻訳後にプロセスされないことを 示唆する。このデータは、ＯＢタンパク質が、それ自身あるいは血漿または脂肪 組織内の他のタンパク質に非共有結合している可能性を排除するものではない。 このタンパク質のタンパク質分解性開裂は排除されていないが、低分子量形態の ＯＢタンパク質は、どのような抗血清（４種の抗ペプチド抗体を含む）を用いて も検出されなかった。 ＯＢタンパク質は、２つのシステイン残基を有し、ヒトにおいてはモノマーと して、マウスにおいてはモノマーおよびダイマーとして循環している。分泌され る分子に典型的な分子内ジスルフィド結合は、ヒトタンパク質がPichia pastris 内で発現される場合に見出され、このことは、それがインビボで存在しやすいこ とを示唆する。このことは、分子内ジスルフィド結合を有する組換え細菌タンパ ク質の生物活性によって支持される。マウスＯＢタンパク質は、血漿中でモノマ ーおよびダイマーとして見出され得る。このモノマーおよびダイマーは、マウス ＯＢタンパク質が酵母で発現される場合に見られ、このマウスタンパク質がダイ マーを形成する傾向は、一次配列がヒトと比べて異なることに起因することを示 す。モノマーが生物活性を有することは明らかであるが、ダイマーの機能的活性 は不明である。 ｏｂマウスにおいてＯＢタンパク質が食物摂取量および体重に与える影響は、 劇的である。３週間の処置の後、組換えタンパク質を毎日注射されたｏｂマウス はその体重を40％減少させ、そしてコントロール動物の40％程度の食物を消費し た。さらに、処置されたｏｂマウスの体重は、実験を終了した時点でもまだ平衡 化していなかった。ペアーフィーディング実験の結果は、体重の減少が、食物摂 取量およびエネルギー消費量の両方に対する影響の結果であることを示す。従っ て、カロリー摂取量が、タンパク質を与えられたｏｂマウスの摂取量に制限され た別の群のｏｂマウスは、タンパク質を与えた動物より体重減少が有意に少なか った。ＯＢタンパク質を与えて１日以内に、ob/obマウスの食物摂取量が野生型 マウスのそれよりも低いレベルに減少することは、ob/obマウスかＯＢタンパク 質の効果に対して特に感受性であることを示す。実際、ＯＢレセプターは、これ らの動物においてアップレギュレートされ得る。処置されたｏｂマウスの食物摂 取量は５日間の処置後には比較的一定になった。もしこれがタンパク質が定常期 レベルに達したことの結果なら、このタンパク質が比較的長い半減期を有するこ とが示唆される[The Pharmacological Basis of Therapeutics，pp．19-45，Goo dmanおよびGilman編、Pergamon Press，New York，(1990)]。この結論は、並体 癒合実験のデータに一致する[Colemanら、1978、前出；Weigle，Int.J.Obesity, 12:567-578(1988)]。 実験の最初の２週間の間に、組換えタンパク質が野生型マウスの体重に与える 影響は小さいが、統計的には有意であった。タンパク質を与えた野生型マウスと PBSを与えた野生型マウスとの間の体重の差は後の時点でも維持されたが、デー タの統計的有意性は３週間後に著しく減少した。初期の体重減少は、食物摂取量 の違いによると説明され得ない。おそらく、食物摂取量の測定は、処置期間中の 体重の１ｇの差を生じる減少を検出するには正確さが十分ではなかった。この観 察は、先の実験の結果と異なる。先の実験では、野生型の齧歯類が、ｄｂマウス 、ｆａラット、視床下部を損傷したラット、および高カロリーの飼料によって肥 満にさせたラットとの並体癒合によって結合された[Colmanら、1978、前出；Har risら、1987、前出；Harrisら、「Physiological and metabolic changes in pa rabiotic partners of obese rats」、Hormones，Thermogenesis and Obesity， LardyおよびStraatman編、Elsevier Science Publishing Co.，New York(1989) ；Hervey、J.Physiol.,145:336-352(1959)]。それぞれの場合において、野生型 動物は食欲が減退し大量の体重が減少する。ｄｂマウスおよびfａラットではＯ Ｂタンパク質のレベルが増加し、そして視床下部を損傷したマウスではOB RNAの レベルが増加するので、野生型マウスは、ＯＢタンパク質が十分に高いレベルで 血漿中を循環している場合には、ＯＢに応答し得るようである。本明細書で報告 される知見は、投与されるタンパク質のレベルが内因性レベルよりも低かったと いう可能性と一致し、それは、僅かに少ない体重で平衡化することにつながる。 処置されたマウスにおいてＯＢタンパク質の循環レベルを定量することは、この 問題を解決するであろう。マウスタンパク質の免疫アッセイは未だ利用し得ない が、免疫沈降は、循環ＯＢタンパク質のレベルがタンパク質を与えた野生型マウ スにおいて実質的に上昇しないことを示唆した。 このタンパク質が野生型マウスに与える影響の低さおよびｄｂマウスにおける 応答の欠如により、この処置が非特異的または有害な影響を有するということは ありそうもない。全てのｄｂマウスは、それらがｏｂタンパク質を与えられたか 否かに関わらず、処置期間中に少量の体重が減少した。ｄｂ動物は明らかに高血 糖症であり、体重の減少は糖尿病の結果であって、実験プロトコルの結果ではな いようである。C57BL/Ks db/dbマウスは、しばしば糖尿病を発症し、この実験に 用いられた動物の年齢で少量の体重が減少し始める(Colemanら、1978、前出)。 同様な年齢のC57B1/6J ob/obマウスは、著しい高血糖症を発症しない。これらの 表現型的な違いは、変異を有する系統間(C57B16J対C57B1/Ks)の遺伝的違いの結 果であると考えられる(Colemanら、1978、前出)。 C57B1/6J ob/obマウスにおけるＯＢ遺伝子のcDNA配列から予想された短縮され た105アミノ酸タンパク質の検出の失敗は、変異タンパク質が分解されるか翻訳 されないかのどちらかであることを示唆する。しかし、用いた抗血清がこの短縮 されたタンパク質を検出しないという可能性は排除され得ない。ｄｂマウスにお けるｏｂタンパク質のレベルが野生型と比較して10倍増加していることが観察さ れたことは、ｏｂタンパク質の効果に対して耐性がある場合にはｏｂタンパク質 が過剰に産生されることを示唆する。これらのデータは、OB mRNAの研究と相関 する。言及したように、先の実験は、マウスｄｂ遺伝子およびラットｆａ遺伝子 の変異（これらは相同な染色体領域に位置する）が、体重を抑制する血漿因子の 過剰生産に結果として至ることを示した(Truettら、1991、前出；Coleman、1978 、前出；Hervey、1959、前出)。どちらの場合においても、変異動物がＯＢタン パク質の効果に対して耐性であることが示唆された。この可能性は、ＯＢタンパ ク質がｄｂマウスに投与された場合には体重または食物摂取量に影響を及ぼさな いという観察によって確認される。 ヒトの肥満症は、ホルモンに比較的非応答性である個人の血漿中のＯＢタンパ ク質のレベルの増加と関連し得る。一方、ＯＢの発現の減少もまた肥満症につな がる。この場合、「正常」（すなわち、不適切に低い）レベルのこのタンパク質 が見出され得る。したがって、ヒト血漿中のＯＢタンパク質のレベルは、肥満症 の別の形態のマーカーであり得る。BMI＜25である痩身型被検者の少人数の群で は、低いナノグラムレベルの循環ＯＢタンパク質がELISAによって検出される。 重要なのは、種々の濃度が示されたことにより、発現のレベルおよび／またはタ ンパク質に対する感受性が体重の決定にある役割を果たし得るということが示唆 されることである。 このＯＢタンパク質の作用部位は不明である。このタンパク質は、食物摂取量 およびエネルギー消費量のどちらにも影響する。これは両システムの変更が、体 重の調節に働くことを示す臨床研究[Leibelら、N.Engl.J.Med.、332:621-628(19 95)；Keeseyら、「Metabolic defense of the body weight set-point（体重セ ットポイントの代謝的防御）」、Association for Research in Nervous and Me ntal Disease、pp.87-96、StunkardおよびStellar編、Raven Press，New York.( 1984)]と一致する知見である。視床下部は、体重を制御する経路においてＯＢの 下流にあるようであるが、直接的な影響を種々の器官に及ぼすことは可能である 。 実施例９：視床下部に損傷を受けたマウスおよびdb遺伝子座に変異を有するマウ スにおけるOB RNAの脂肪細胞における発現の増加 最近クローニングされたマウス肥満遺伝子(OB)の遺伝子産物は、脂肪組織の量 の調節に重要な役割を果たす。OB RNAは、褐色脂肪を含むいくつかの異なる脂肪 細胞貯蔵部それぞれにおいてインビボでマウス脂肪細胞によって特異的に発現さ れる。それはまた、分化に誘導された培養3T3-442A前脂肪細胞においても発現さ れる。視床下部に損傷を有するマウスおよびdb遺伝子座に変異を有するマウスは 、脂肪組織中で20倍高いレベルのOB RNAを発現する。これらのデータは、db遺伝 子および視床下部のどちらも、脂肪組織の量を調節する経路においてＯＢ遺伝子 の下流にあることを示唆し、そしてdb遺伝子座がＯＢレセプターをコードするこ とを示唆する先の実験と一致する。db/dbおよび損傷マウスでは、OB RNAの発現 レベルにおける量的な差が脂肪細胞の脂質含有量と相関していた。脂肪細胞中で ＯＢ遺伝子の発現レベルを調節する分子は、ＯＢの作用部位でＯＢの効果を仲介 する分子のように、体重の決定に重要な役割を果たしているようである。 材料および方法 インサイチュハイブリダイゼーション 野生型(wt)およびdbマウスの同じ腹部領域由来の白色脂肪(white fat)組織を 、Richardsonら、Growth,Development & Aging,56:149-157(1992)によって記載 された改変方法に従って、同時にプロセスした。簡単にいうと、組織をBouin溶 液中で２時間４℃で固定した。次いで、それらをエタノール濃度を10％から100 ％まで増加させる連続処理（４℃で各５分間ずつ）により脱水した。組織をキシ レン（１時間）とそしてパラフィン（２時間）とともに65℃でさらにインキュベ ートした。包埋されたwtおよびdb/db脂肪組織を切片にし、後に同じ条件により マウントした。薄切片を65℃で１時間ベイクし、そしてキシレン、およびエタノ ールの100％から50％の連続希釈液（室温で各３分間ずつ）で処理した。ＯＢ遺 伝子のアンチセンスRNAプローブを、Sp6 RNAポリメラーゼプロモーターの上流の 直鎖状化(linearized)されたＯＢ遺伝子コード配列のインビトロ転写により合成 した。インサイチュハイブリダイゼーションをSchaeren-Wiemersら、Histochemi stry,100:431-440(1993)に正確に従って行った。 RNA調製および細胞培養 全RNAおよびノーザンブロットを記載されたように調製した。間質血管細胞お よび脂肪細胞をRodbellに従って調製し、そしてDaniら、Mol.Cell.Endocrinol., 63:199-208(1989)；Rodbell,J.Biol.Chem.239:375-380(19)に従って、両画分か らRNAを調製した。サブクローニング後、3T3-F442細胞を、10％ウシ胎児血清を 含むDulbeccoの改変Eagle培地（標準培地と規定した）中で生育させた[Daniら、 ”Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation （脂肪細胞の分化の研究における分子生物学技術）”、Obesity in Europe vol 88,pp.371-376,BjorntorpおよびRossner編、Johon Libbey Company Ltd.,London ,England(1989)]。集密時に、細胞を、2nMトリヨードチロニン(T3)および17nMイ ンスリンを補足した標準培地中で処理した。12日後、上記のようにRNAを調製し た。 金チオグルコース処理(GTG) ２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスをオーロチオグルコース(aurothioglucose)(Sigma Catalog No.A0632)単回腹腔内注射（用量0.2mg/g、正常生理食塩水中）で処置し た。コントロール動物には正常生理食塩水を注射した。処置の１ヶ月後にマウス の体重を測定した。GTG処理後に20g以上体重が増加した処置動物由来の脂肪組織 RNAを単離した。 結果 最近、ＯＢ遺伝子は脂肪組織で発現されることが見出された[Zhangら、Nature ,372:425-432(1994)]。脂肪組織は脂肪細胞、前脂肪細胞、線維芽細胞、および 血管細胞を含む多くの細胞タイプから成るので、インサイチュハイブリダイゼー ションをセンスおよびアンチセンスＯＢリボプローブを用いて正常動物の精巣上 体脂肪パッドの薄切片に対して行った[Richardsonら、1992、前出；Wasserman," The concept of the fat organ（脂肪器官の概念）"、Rodhal,Issekutz,fat as atissue",pp.22-92,McGraw Hill,New York(1964)]。アンチセンスプローブを用 いる場合、ポジティブシグナルは薄切片中の全ての脂肪細胞において検出された 。（図30、Wtと標記した）。アンチセンスプローブを脳の薄切片とハイブリダイ ズさせた場合、シグナルは示されなかった（データは示さず）。C57B1/Ks db/db マウス由来の脂肪組織の薄切片へのアンチセンスプローブのハイブリダイゼーシ ョンは、著しく増加し、そのことは、OB RNAの脂肪細胞特異的発現を確証し、そ してこれらの動物における脂肪細胞当たりのOB RNAレベルの大きな増加を示した （図30、db/dbと標記した）。db遺伝子座におけるマウスの変異は、C57B1/6J ob /obマウスに見られる症候群と表現型的に同一の症候群の一部としての広範囲の 肥満である(Baharyら、1990、前出)。 OB RNAは、脂肪細胞から分離された脂肪組織間質細胞によって合成されなかっ た。予想したように、脂肪細胞画分中の細胞はノーザンブロットを用いるとOB R NAを発現していた（図31）。RT-PCRを用いても同じ結果が得られた（データは示 さず）。これらのデータは、脂肪細胞のみがＯＢ遺伝子を発現するという結論を 支持する。培養された脂肪細胞由来のデータはこの結論を確証する。これらの研 究において、3T3-F442A細胞は、脂肪細胞への分化につながる細胞プログラムの 一部としての脂質蓄積を導く条件を用いて、培養された。OB RNAは指数関数的に 増殖する細胞内で発現されたのでも、集密3T3-F442A前脂肪細胞（初期のマーカ ーを発現する）内で発現されたのでもない。しかし、これらの細胞の脂肪細胞へ の分化は、検出可能なレベルのOB RNAの発現につながった（図31）[Daniら、J.B iol.Chem.,264:10119-10125(1989)]。OB RNAのレベルは、培養条件に非常に感受 性である。なぜなら、インスリンに曝されなかった後期の集密後(post-confluen t)細胞では、メッセージが観察されなかったからである。 ハイブリダイゼーション研究は、OB RNAが精巣上体、子宮傍組織、腹部、腎周 囲、および鼠蹊部の脂肪パッドを含むいくつかの異なる脂肪貯蔵部においてイン ビボで発現されることを示した（図32A）。各貯蔵部における正確な発現レベル はいくらか可変であり、鼠蹊部および子宮傍組織の脂肪はより低いレベルのOB R NAを発現した。OB RNAはまた、褐色脂肪組織でも発現されるが、発現レベルは他 の脂肪組織貯蔵部と比べて褐色脂肪内ではおよそ50倍低い。これらの量的な違い は、先に報告された異なる脂肪細胞貯蔵部間の細胞サイズの違いと緩やかに相関 している[Johnsonら、J.Lipid Res.,13:2-11(1972)]。褐色脂肪中のOB RNAの量 は低温に曝されることによって影響を受けない（図32B）。この実験では、カッ プリングしていないタンパク質RNA(UCP)のレベルは低温に曝された後に褐色脂肪 中で増加したが、ob RNAレベルは変化しなかった[Jacobssonら、J.Biol.Chem.,2 60:16250-16254(1985)]。凝集体において、これらのデータは、全ての脂肪細胞 がOB RNAを産生し得、そして異なる脂肪貯蔵部で種々の発現レベルを示すことを 確証する。これらのデータは、コードされたタンパク質のレベルが脂肪組織の総 量と相関するという可能性を支持する。 db/dbマウスおよび視床下部に損傷を受けたマウスにおけるOB RNAレベルを測 定した。腹内側視床下部(VMH)の損傷は、ob/obマウスおよびdb/dbマウスに見ら れるのと似た症候群の一部としての肥満症に至る[Brayら、Metabolism,24:99-11 7(1975)]。並体癒合実験は、そのような損傷が結果として血液によって運ばれる 食物摂取量および体重を抑制する因子の過剰発現につながることを示唆する(Her vay,1959,前出)。db遺伝子座に変異を有するマウス変異体を正常マウスと並体癒 合させる場合、同様の結果が示され、このことは、ＯＢレセプターがdb遺伝子座 によってコードされ得ることを示唆する(Coleman等、1978、前出)。従って、VM H損傷およびdb変異の結果に由来する肥満症は、ＯＢタンパク質の効果に対する 耐性の結果であり得る。もしそうなら、脂肪組織中のOB RNAのレベルの二次的な 増加が予想される。 化学物質金チオグルコース(GTG)を用いて雌性CBAマウスに視床下部損傷を誘導 した(Debonsら、Fed.Proc.,36:143-147(1977)]。この処置は結果として視床下部 （主として腹内側視床下部(VMH)）に特定された損傷を生じ、続いて、数週間の うちに肥満症が発症した。通常、単回のGTG腹腔内注射(0.2mg/gm体重)の結果、 ４週間以内に肥満症が発症する。１ヶ月齢の雌性CBA/Jマウス(20〜25g)をGTGで 処置し、その後の体重増加の処置およびコントロール動物を示す（表２）。脂肪 組織RNAをdb/dbマウスおよび＞20gm体重増加したこれらGTG処置動物から調製し た。ノーザンブロットは、２ヶ月齢のdb/dbマウスおよびGTG処置マウスでは正常 動物に比べてOB RNAレベルが20倍増加していることを示した（図33）。 ２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスを金チオグルコース(GTG)で処置した。金チオグル コース(Sigma A0632)を正常生理食塩水中で2.0mg/gの用量で腹腔内投与した。コ ントロールおよび処置動物の体重を注射の前および１ヶ月後に記録した。１つの ケージに５匹の動物をいれ、自由に摂食させた。注射の１ヶ月後に増えた体重の 量を表２に示す。注射１ヶ月後に体重が20g以上増加した動物を更なる研究用に 選択した。 考察 マウスＯＢ遺伝子の遺伝子産物はマウスおよびヒトとの血漿中で循環する。こ こでは、その産物は脂肪組織の質量を調節するように作用し得る。ＯＢの作用の 発現およびメカニズムの調節に関するさらなる研究は、体重を調節する生理学的 経路についての理解にとって重要な示唆を有するであろう。 この実施例はＯＢ遺伝子産物が脂肪組織貯蔵部中の脂肪細胞によって著しく発 現されることを示す。この結果は、ＯＢ遺伝子のタンパク質産物が身体の脂質貯 蔵と相関するという可能性と一致する。さらに、OB RNAは、dbマウスおよび視床 下部損傷を受けたマウスにおいて20倍アップレギュレートされる。これらの動物 においては、細胞当たりのOB RNAレベルの実際の増加は20倍より高いようである 。なぜなら、脂肪細胞の細胞サイズはこれらの動物において約５倍増加している からである（図30参照）（Debonsら、1977、前出）。これらのデータはdb遺伝子 および視床下部が体重を調節する経路においてＯＢの下流にあると位置づけ、そ してＯＢレセプターがｄｂ遺伝子座でコードされるという仮説に一致する[Colem anら、Diabetologia 14:141-148(1978)]。ＯＢレセプター遺伝子および／または db遺伝子の分子クローニングがこの問題を解決するであろう。db/dbマウスおよ びGTG処置マウスにおけるOB RNAレベルの増加もまた、脂肪細胞におけるＯＢ遺 伝子産物の非細胞自律機能を示唆する[Ashwellら、Proc.R.Soc.Lond.,195:343-3 53(1977);Ashwellら、Diabetologia,15:465-470]。従って、コードされたタンパ ク質が脂肪細胞に直接作用して成長または分化を阻害するならば、GTG処置され たマウスにおける野生型OB遺伝子の過剰発現は、結果として痩身型表現型となる 。 このデータの最も注意深い(parsimonious)説明は、ＯＢタンパク質が脂肪細胞 によって分泌される内分泌シグナル分子として機能し、視床下部に直接あるいは 間接的に作用するというものである。視床下部への直接の影響には、ＯＢ遺伝子 産物が血液脳関門を通過することを可能にするメカニズムの存在が必要である。 脳室周囲器官(circumventricular organ)および／または特定の輸送体を含むメ カニズムが、ＯＢ遺伝子によってコードされるサイズの分子を脳へ進入させ得る であろう[Johnsonら、FASEB J.,7:678-686(1983)；Bauraら、J.Clin.Invest.,92 :1824-1830(1993)；Pardridge，Endocrine Reviews,7:314-330(1986)]。しかし 、この仮説は、タンパク質を血液脳関門を通過させ得る手段が同定されるまでは 注意して考慮されなければならない。さらに、他の標的器官におよぼす可能な影 響が評価されることが必要であろう。 ＯＢ遺伝子の発現レベルの量的な変動の原因である脂肪細胞シグナルは未だ知 られていないが、脂肪細胞の細胞サイズの差と相関する。db/dbマウスの脂肪細 胞は正常マウスのそれの５倍の大きさであり、細胞サイズはおよそ1.0μｇ脂質 ／細胞である(Johnsonら、1972、前出)。先の証拠は、脂肪細胞の脂質含有量お よび／またはサイズが体重決定の重要なパラメーターであることを示した[Faust ら、Am.J.Physiol.,235:279-286(1978)；Faustら、Science,197:393-396(1977)] 。各脂肪細胞は、細胞サイズに比例してさらに増加する低レベルのOB RNAを発現 し得る。細胞サイズは意味のあるパラメーターではなく、db/dbマウスおよびVMH 損傷マウスの脂肪細胞内のＯＢ遺伝子発現を増加させる細胞内シグナルと単に相 関することもあり得る。どの場合も、OB RNAの合成を調節するシグナル伝達経路 の要素が体重の決定には重要であるようである。コードされたタンパク質に対す る感受性を減少させる影響が働くにつれ、ＯＢの発現レベルを低下させる遺伝的 および環境的影響が働いて体重を増加させるであろう。ＯＢ遺伝子の発現レベル を調節する特定の分子は、未だ不明であり、OB RNAのレベルにおける量的な変動 につながる遺伝子コントロールのレベルの決定、およびＯＢ遺伝子の調節因子の 研究が待たれる。脂肪細胞におけるＯＢ遺伝子の発現を調節する分子、およびコ ードされたタンパク質の効果をその作用部位で仲介する分子の同定は、体重を調 節する生理学的メカニズムに対する理解を大いに高めるであろう。実施例10: RNA発現パターンおよび第7染色体の物理的、細胞遺伝学的、遺伝学的 地図におけるマッピング OB RNAはヒトの脂肪組織において高いレベルで発現し、そして胎盤および心臓 においてはかなり低いレベルで発現する。ヒトOB遺伝子地図は、染色体7q31.3に 由来する大きな酵母人工染色体(YAC)コンティグに、マッピングされる。マウス- ヒト比較マッピングに基づいて遺伝子の相対位置を確証することに加えて、この 研究は、ヒトOB遺伝子に物理的に近接した位置にある、８つの確立されたマイク ロサテライトマーカーを同定した。マウスOBにおける突然変異は、ヒトの病的肥 満に非常に類似する症候群を生じさせ得るので、これらの遺伝マーカーは、ヒト 肥満症の遺伝形態におけるOB遺伝子の可能な役割を研究するための重要なツール を表す。 材料と方法 ノーザンブロット分析 全RNAを脂肪組織からChirgwinら、Biochem.，18:5294-5299(1979)の方法を用 いて調製した。ノーザンブロット、放射性標識法、およびハイブリダイゼーショ ンは記述(Zhangら、1994、上記)に従って行った。ポリA+RNA(ヒトMTN、ヒトMTNI I、およびヒト胎児MTNII)のノーザンブロットは、放射性標識化したヒトアクチ ンプローブを生成するために用いられるPCRプライマーと同様に、CLONETECH(Pal o Alto，CA)から得た。 STS展開 配列タグ部位(STS)特異的PCRアッセイは、本質的に次の記述に従って展開およ び最適化した[(Greenら、PCR Methods Applic.，1991;Greenら、Genomics，11:5 48-564(1991); Green，「ヒト染色体の物理的マッピング:染色体特異的配列タグ 部位の生成」，Methods in Molecular Genetics Vol.1，Gene and Chromosome A nalysis(Part A)，pp．192-210，Adolph編.，Academic Press，Inc.，San Diego (1993); Greenら、Hum．Mol．Genet.,3:489-501(1994)]。それぞれのSTSは接頭 辞「sWSS」の後に独自の番号をつなげたものを用いて命名する。ここで報告した 19のSTSについての詳細は、表3に示し、追加情報(例えば、PCR反応条件、完全DN A配列)は、GenBankおよび／あるいはGenome Data Base(GDB)で入手可能である。 マイクロサテライト特異的STSについて、PCRアッセイに用いたオリゴヌクレオチ ドプライマー(表3)は、遺伝子型分析に使用したもの(表4)、あるいはGenBankで 入手可能なDNA配列を用いて設計されたもの(通常コンピュータープログラムOSP を用いる)[Hillierら、PCR Methods Applic.，1:124-128(1991)]のどちらかに相 当した。表3は、ヒトOB遺伝子を含むYACコンティグでのSTSを示す。 ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピングされた19の第７染色体特異的STS (図35)を列挙する。それぞれの場合において、各「sWSS」名、関連別名、GDB指 定遺伝子座名、STS供給源、PCRプライマー配列、STSサイズ、GDB同定番号を示す 。STSの供給源は次の通りである：「YAC末端」(YACの単離された挿入物末端)(Gr een,1993,上記)、「ラムダクローン」(ランダム第７染色体特異的ラムダクロー ン)(Greenら、1991,上記；Green，1993,上記)、「遺伝子マーカー」(マイクロサ テライトマーカー，表２参照)(Greenら、1994,上記)、「YAC挿入物」(YAC挿入物 由来のランダムセグメント)、および「遺伝子」(遺伝子特異的STS)。注意すべき ことは、いくつかの遺伝マーカー特異的STSについて、YACを同定するために用い たPCRプライマー(この表に示した)は遺伝子型分析を行うために用いられたもの( 表４)と異なっていることであり、この理由としては、遺伝子マーカーを含むYAC の検出には多型領域自体の増幅を必要としないことが挙げられる。指示したPCR アッセイは、全て55℃のアニーリング温度を用いた[但しsWSS494、sWSS883、sWS S1529、およびsWSS2619(50℃)、sWSS999およびsWSS1174(60℃)、ならびにsWSS80 8(65℃)を除く]。STS特異的PCRアッセイに関する追加の詳細は、GDBにおいて入 手可能である。 ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピングされた８つのマイクロサテライ トマーカー(図35)を列挙する。それぞれの場合において、マーカー名(表3に別名 として示した)、マイクロサテライトモチーフのタイプ(テトラヌクレオチド-「T etra」反復あるいは(CA)n反復)、GDB指定遺伝子座名、PCRに基づいた遺伝子型分 析で用いたプライマー配列およびGDB同定番号を示す。PCRアッセイおよび多型性 に関する追加の詳細は、GDBで入手可能である。 ヒトOB特異的STS(sWSS2619)を、cDNAの３'非翻訳領域から得られたDNA配列を 用いて設計した。ヒトPax4特異的STS(sWSS808)は、次のストラトジーを用いて生 成した。マウスPax4遺伝子(GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA)(配列番号63)および(GGG AGCCTTGTCCTGGGTACAAAG)(配列番号93)[Waltherら、1991,Genomics 11:424-434)( 1991)]に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒトゲノムDN A(マウスゲノムDNAから生成させたものと同サイズの産物)由来の204bpフラグメ ントを増幅した。このPCRアッセイは、対応するYACを同定するのには適していな かった。これは、同様のサイズの産物(200bp)もまた酵母DNAから増幅されたから である。しかしながら、ヒトDNAから生成されたPCR産物のDNA配列分析は、分析 された156の塩基中20箇所で置換が生じていることを明らかにした(データは示し ていない)。このヒト特異的配列を用いて、新しいプライマー(TTGCCAGGCAAAGAGG GCTGGAC)(配列番号64)を設計し、また、最初の上記マウスPax4特異的プライマー と共に用いた(表3を参照のこと)。得られるヒトPax4特異的PCRアッセイは、酵母 DNAからの有意な産物を増幅しなかったので、このアッセイを対応するYACの同定 に用いた。 PCRに基づくスクリーニングによるYACの同定 図35に示したYACの多くは、PCRに基づくスクリーニングストラトジー[Greenら 、1995,上記；Greenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：1213-1217(1990)] を用いたヒト第７染色体DNA「第７染色体YAC供給源」(Greenら、1995,上記)につ いて高く富化されたクローンのコレクションに由来した。数例では、クローンは 、CEPH[Daussetら、Behring Inst．Mitt.，91:13-20(1992)；Albertsenら、Proc . Natl．Acad．Sci．USA，87：4256-4260(1990)]あるいはICI[Anandら、Nucl．Aci ds Res.，17：3425-3433(1989)；Anandら.，Nucl．Acids Res.18：1951-1956(19 90)]で構築された入手可能な全ヒトゲノムYACライブラリーのPCRに基づくスクリ ーニング(Greenaら、1990，上記)により単離された。それぞれのYACは、接頭辞 「yWSS」の後に独自の番号をつなげたものを用いて命名する。 結果および考察 ノーザンブロット分析によるヒトOB遺伝子の組織発現の検査では、OB RNAがヒ ト脂肪組織において高レベルで発現し、そして胎盤および心臓においてはかなり 低レベルで発現することが示された(図34)。RNAのサイズ(およそ4.5kb)は、ヒト およびマウスにおいてならびに発現している組織のそれぞれにおいて等価であっ た。これらの研究では、2μgのポリA+胎盤RNAにおいてと同様に、5倍高いシグナ ルが10μgの全脂肪組織RNAで見られた。胎盤と比較して心臓のポリA+RNAでは、5 倍低いシグナルが見られた。OB RNAのレベルは、脂肪組織よりも胎盤組織の方が およそ250倍低いと概算される。この実験では、OB RNAは、脳、肺、肝臓、骨格 筋、腎臓、および膵臓を含む、分析を行った他の組織のいずれにおいても、検出 されなかった。追加の実験では、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸 、末梢血白血球、あるいは、胎児の脳、肝臓または腎臓においてOB RNAを示さな かった(データは示していない)。OBは、これらの後者の組織あるいは研究されて いない他の組織において、検出できない(ノーザンブロット分析により)レベルで 発現している可能性がある。ヒトで観測された発現パターンは、OB RNAが脂肪組 織においてほぼ独占的に検出されるマウスの場合と幾分異なっている。 マウスおよびヒトゲノムにおけるOB遺伝子領域の比較マッピング。マウスOB遺伝 子は、ヒト第７染色体qの一部と相同な領域にある近位の第６染色体上に位置し ている。このセグメント内の遺伝子は、以下を含んでいる(近位から遠位へ)：Me t癌原遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子(Cftr)、対合ボックス含有遺伝 子4(Pax4)、OB、およびカルボキシペプチダーゼA(Cpa)(Zhangら、1994,上記；Fr iedmanら、1991,上記)。マウスでは、遺伝的マッピングを用いて、Pax4が強くob に連鎖していることが示された[Waltherら、1991,上記；Zhangら、1994,上記]。 OBおよびPax4間の物理的距離は、およそ1メガ塩基対(Mb)であることが明らかと なった(Zhangら、1994、上記)。これらの比較マッピングの研究に基づくと、ヒ トOB遺伝子は染色体7q上のPax4およびCPA間に存在すると予測された。さらに、 ヒトCFTR[Hengら、Cell Genet.，62:108-109(1993)]およびPax4[Tamuraら、Cyto genet．Cell Genet.，66:132-134(1994)]は、蛍光インサイチュハイブリダイゼ ーション(FISH)により、それぞれ、7q31.3および7q32にマッピングされたので、 ヒトOB遺伝子の最も考えられる細胞遺伝的位置は、7q31.3〜q32境界の付近であ り得る。 ヒト第７染色体におけるOB遺伝子のマッピング ヒトOB遺伝子の3'非翻訳領域の小セグメントを増幅しているSTS(sWSS2619)を 、ヒト第７染色体のDNA(Greenら、1995a，Genomics 25：170-183)について高く 富化されているYACクローンのコレクションをスクリーンするのに用いた。そし て、９のYACを同定した(yWSS691、yWSS1332、yWSS1998、yWSS2087、yWSS3319、y WSS3512、yWSS4875、yWSS4970、およびyWSS5004)。これらのYACが真正ヒトOB遺 伝子を含むことを証明するために、二つの追加実験を行った。第一に、YACのそ れぞれを別のヒトOB特異的PCRアッセイでテストした。その結果、全てが陽性で あることが明らかとなった(データは示していない)。第二に、それぞれのクロー ン由来の酵母DNAを、EcoRIで消化し、ヒトOB cDNA-由来プローブを用いたゲルト ランスファーハイブリダイゼーションにより分析した。全ての例において、単独 のハイブリダイズバンドが見られた。そしてこのバンドは、ヒトOB遺伝子を含む ことが既知であるYACおよびP1クローンにおいて同サイズであった(データは示し ていない)。 コンピュータープログラムSEGMAP(GreenおよびGreen，1991，上記)および本発 明者らが第７染色体について生じさせた他のYACに基づくSTS内容データ(Greenら 、1991,上記; Greenら、1994,上記;Greenら、1995,上記)を用いて、ヒトOB遺伝 子が図35に示したYACコンティグ内に存在することが明らかとなった。特筆すべ きは、このコンティグは、43の重複YACおよび19の独自に整列化したSTSから構成 さ れていることである。19のSTSのそれぞれについての詳細は、表3に示す。OB特異 的STSに加えて、コンティグはまたヒトPax4遺伝子に対して特異的なSTS(sWSS808 )(Tamuraら、1994,上記；Stapletonら、1993，Nature Genet．3：292-298)、第 ７染色体特異的YAC由来の７つのSTS、第７染色体特異的ラムダクローン由来の２ つのSTS、および重要なことに、８つのマイクロサテライト特異的STSを含む。遺 伝子型分析に用いたプライマーの配列を含む、これらの８つの遺伝マーカーにつ いての追加の詳細は、表2に示す。ここで注意したいのは、コンティグ全体にわ たって多くのYACに基づく連結性がある(すなわち、STSのそれぞれの隣接対に接 続する２あるいはそれ以上のYACが存在する)ことであり、図35に示されるSTSの 相対順序に対する強い支持を与える。 図35に示したように、ヒトOB含有YACコンティグの推定配位は、sWSS1734は最 もセントロメア側(centrometric-most)STS(すなわち、CFTRに最も近接)であり、 一方、sWSS2367は、最もテロメア側(teromeric-most)STS(すなわち、CPAに最も 近接)である。この配位は、主として、比較マッピングデータに基づき、これは マウスおよびヒトDNAに存在するシンテニックブロック内のPax4近位およびOB遠 位に位置する(Zhangら、1994,上記）。OB遺伝子は、OB特異的STS(sWSS2619)の配 置に基づくと、コンティグのテロメア末端近傍にマップされる。 図35に示すコンティグは、YACサイズを考慮せずにSEGMAPより推定した(それに より、STSを互いから等距離で示す)が、YACサイズについて説明したSEGMAPによ るデータの同様の解析は、コンティグによりカバーされた領域の全サイズがちょ うど２Mb強であることを示した(データは示していない)。このように、８つのマ イクロサテライト特異的STS(表４)の全てが、概算で２Mbにわたるゲノム区間間 隔内に含まれている一方、コンティグのテロメア末端に最も近い３つ(sWSS1392 、sWSS1148、およびsWSS2367)は、特にOB遺伝子自体に近い(おそらく約500kb程 度の小さな間隔内)。実際、後者の３つのSTSの全ては、ヒトOB含有YACの少なく とも１つに存在する。ここで注意したいのは、ヒトPax4(sWSS808)およびob(sWSS 2619)の間の間隔がおよそ400kbと見積もられている一方、この領域はマウスにお いては、約1Mbにわたると予測されていたことである(Zhangら、1994,上記)。最 後に、コンティグ内の３つのYAC(yWSS691、yWSS999およびyWSS2935)もまたFISH に より分析されており、そしてそれぞれは、専ら7q31.3とハイブリダイズすること が明らかとなった。これらのYACの1つ(yWSS691)は、OB特異的STSを含む一方、そ の他の２つのクローンは、Pax4特異的STSを含む。後者の結果は、一般的に7q32 へのヒトPax4の以前の細胞遺伝的割り当て(Tamuraら、1994,上記)と一致する。 これらのデータに基づいて、ヒトOB遺伝子は、細胞遺伝的バンド7q31.3に割り当 てられ得る。 実施例11: ヒトOBポリペプチドは、マウスにおいて生物学的に活性である 10匹のob/obマウスのグループを、10μg/g/日の組換え(細菌性)ヒトおよびマウ スOBポリペプチドあるいは食塩水の腹腔内注射により処理した。４日後、食塩水 を与えたグループは、0.3g増加した。マウスOBを与えたグループは、3.2g減少し た。ヒトOBを与えたグループは、２g減少した(p＜0.01食塩水コントロールと比 較)。これらのグループへは、食物摂取のテストも行った。食物摂取のデータを 表５に、体重に対するデータを表６に示す。 これらのデータは、ヒトOBがマウスにおいて生物学的に活性であることを実証 している。 実施例12：高用量OBが野生型マウスに影響を及ぼす 野生型マウス(C57B16J +/?)を、10μg/g/日の組換えマウスOBの腹腔内注射で 処理し、4日ごとに体重の測定を行った。その結果を表7に示す。 これらのデータは、非常に程度が低いとはいえ、OBが肥満型(ob/ob)マウスと 同様、野生型マウスの体重に影響を及ぼすことを実証している。 実施例13: 連続ポンプ注入により投与されたOBポリペプチド 本実施例は、OBポリペプチドの連続注入が正常なマウスの体重損失をもたらす ことを実証している。正常な(肥満型でない)マウスに浸透ポンプ注入によってマ ウスのobポリペプチドを投与した。0.5mgタンパク質/kg体重/日の用量が、６日 目の注入により、基線体重から4.62%損失(+/-1.34%)を生じさせた。 材料および方法 動物 本実施例では、野生型(+/+)C57B16マウスを用いた。マウスには、個室を与え ゆったりとした条件下で飼育した。初期時点におけるマウスの年齢は８週齢であ り、また、動物の体重は安定していた。各グループ(媒体(vehicle)対タンパク質 )に対して、10匹のマウスを用いた。 給餌および体重測定 マウスへは、粉末化食物フィーダー(Allentown Caging and Equipment)で粉末 状齧歯類用食物(PMI Feeds,Inc.)を与え、これにより通常の固形状食物を用いる 場合より正確および鋭敏な食物摂取の測定が可能であった。体重は、6日間、毎 日同時刻(午後2:00)に測定した。注入前の日の体重を、基線体重として定義した 。 マウスOB DNAのクローニング E．coliでの発現のために、マウスOB DNAのクローニングを以下のように行っ た。発行された(Zhangら、1994,上記,すなわち、実施例１,上記)公開ペプチド配 列から推定したDNA配列を、E．coli最適コドンを用いて逆翻訳した。末端クロー ニング部位は、XbaIからBamHIであった。リボソーム結合エンハンサーおよび強 いリボソーム結合部位は、コード領域の前方に含まれていた。二本鎖DNA配列を 標準的な技法により合成した。正確なクローンは、組換えタンパク質の発現およ びレジデント(resident)プラスミド中の正確なOB DNA配列の存在を実証すること により確認した。アミノ酸配列(およびDNA配列)は、以下の通りである： 発現ベクターおよび宿主株 タンパク質を生産するために用いたプラスミド発現ベクターは、pCFM1656、ア メリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)受託番号第69576号であった。上 記のDNAを、XbaIおよびBamHIで線形化した発現ベクターpCFM1656に連結し、E．c oli宿主株FM5をトランスフォームさせた。E．coli FM5細胞は、Amgen Inc.,Thou sand Oaks，CAにおいて、E．coli K-12株[Bachmannら、Bacteriol．Rev.，40:11 6-167(1976)]から派生したが、これは組み込みラムダファージリプレッサー遺伝 子cI857[Sussmanら、C.R.Acad．Sci.，254:1517-1579(1962)]を含んでいる。ベ クター生産、細胞トランスフォーメーションおよびコロニー選択は標準的な方法 (例えば、Sambrookら、1989,上記)に従って行った。宿主細胞を、LB培地で成長 させた。 タンパク質あるいは媒体の投与 この実験では、組換えマウスOBポリペプチドを一般的に約0.9mg/ml濃度でリン 酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中で用いた。用いたアミノ酸配列(およびDNA配列)を すぐ上に示す。タンパク質あるいは媒体(リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4)を、 浸透ポンプ注入によって投与した。Alzert浸透ミニポンプ(Alza，Palo Alto，CA ，model no．1007D)を、それぞれのマウスの肩甲下領域にある皮下ポケットへ外 科的に配した。ポンプは、0.5mgタンパク質/kg 体重/日の用量のために、１時間 当たり0.5mlの溶液中にタンパク質を投与するように目盛りを付けた。コントロ ール動物は、Alzert浸透ミニポンプを用いてリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)を 注入した。 発酵プロセス：供給バッチプロセスとして知られる三相発酵プロトコールをタン パク質を調製するために用いた。培地組成は以下に説明する。 バッチ：窒素およびリン酸塩源を、発酵容器(Biolafitte，12リットル容量)内で 滅菌した(18〜20psiで35分間122℃まで温度を上昇させることによった)。冷却時 に、炭素源、マグネシウム源、ビタミン源および微量金属源を、無菌的に添加し た。一晩培養(16時間あるいはそれ以上)500mlの上記組換えマウスタンパク質生 産細菌(LB培地内で成長)を、発酵槽に加えた。 供給材Ｉ：4.0〜6.0 O.D.600間に達した際に、供給材Ｉを培養物に加えた。その 後、グルコースを成長速度(μ)を制御するために、制限速度で加えた。自動シス テム(分布制御システムと呼ばれる)は、0.15世代hr-1に成長速度を制御するよう プログラムした。 供給材II: O.D.が30に達したとき、温度をゆっくり42℃まで上げ、供給材を以下 に記述のように供給材IIに変更した。その後、発酵を２時間ごとにサンプリング を行いながら10時間続けた。10時間後、発酵槽の中身を20℃以下に冷却した後、 遠心分離により採集した。 培地組成： ビタミン溶液(バッチ、供給材Ｉ):0.5gビオチン、0.4g葉酸、および4.2gリボフ ラビンを450mlのH2Oおよび3mlの10N NaOHに溶解し、その後H2Oを加えて500mlと した。14gのピリドキシン-HClおよび61gのナイアシンを150mlのH2Oおよび50mlの 10N NaOHに溶解し、その後をH2Oを加えて250mlとした。54gのパントテン酸を200 mlのH2Oに溶解して250mlとした。3つの溶液を混合し、全容積を10リットルとし た。 微量金属溶液(バッチ、供給源Ｉ)： 塩化鉄(FeCl3・6H2O)：27g/L 塩化亜鉛(ZnCl2・4H2O)：2g/L 塩化コバルト(CoCl2・6H2O):2g/L モリブデン酸ナトリウム(NaMoO4・2H2O)：2g/L 塩化カルシウム(CaCl2・2H2O)：1g/L 硫酸銅(CuSO4・5H2O)：1.9g/L ホウ酸(H3BO3)：0.5g/L 塩化マンガン(MnCl2・4H2O)：1.6g/L クエン酸ナトリウム二水和物：73.5g/L マウスOBポリペプチドの精製プロセス 精製は、以下の工程により行った(もし他に記されていなければ、以下の工程 は４℃で行った)。 １．細胞ペースト．E．coli細胞ペーストを、５倍容量の７mM EDTA(pH7.0)で懸 濁した。EDTA中の細胞を、マイクロフルイダイザー(microfluidizer)の2つの流 路により、さらに破壊した。破壊した細胞を、J5-4.2ローターを用いてBeckman JB-6遠心機において4.2krpmで１時間遠心分離した。 ２．封入体洗浄＃1．上記から上清を除去し、ペレットを5倍容量の7mMのEDTA(pH 7.0)で再懸濁させ、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離 した。 ３．封入体洗浄＃2．上記から上清を除去し、ペレットを10倍容量の20mM Tris(p H8.5)、10mM DTT、1%デオキシコール酸塩で再懸濁し、ホモジナイズした。この 混合物を、工程１と同様に遠心分離した。 ４．封入体洗浄＃3．上記から上清を除去し、ペレットを10倍容量の蒸留水で再 懸濁し、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。 ５．再フォールディング．ペレットを15倍容量の10mM HEPES(pH8.5)、1%ナトリ ウムサルコシン(N-lauryl sarcosine)を用い、室温で再フォールディングさせた 。60分後、溶液を60mM 硫酸銅にし、その後一晩撹拌した。 ６．サルコシンの除去．再フォールディング混合物を5倍容量の10mM Tris緩衝液 (pH7.5)で希釈し、その後、工程１と同様に遠心分離した。上清を集め、Dowex 1 -X4樹脂、20〜50メッシュ、塩化物型とともに１時間撹拌して混合した(0.066%希 釈再フォールディング混合物の全容量)。次に、この混合物をカラムに通し、そ の溶出液を集めた。サルコシンの除去は、HPLCによって確認した。 ７．酸沈殿．以前の工程からの溶出液を集め、そのpHをpH5.5に調整した後、室 温で30分間インキュベートした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。 ８．カチオン交換クロマトグラフィー．以前の工程からの上清のpHをpH4.2に調 整し、CMSepharose Fast Flow上に流した。20カラム容量の塩勾配を、20mM NaOA C、PH4.2、0M〜1.0M NaClで用いた。 ９．HICクロマトグラフィー．上記工程からのピーク画分CMSepharoseプール(紫 外分析から確認)を、0.2Mの硫酸アンモニウムとなるよう調整した。20 カラム容 量の逆塩勾配は、0.4Mから0Mの硫酸アンモニウムを有する5mM NaOAc，pH4.2で行 った。この物質を濃縮し、PBS中へダイアフィルトレートした。 結果 以下に、C57B16Jマウス(８週齢)の基線体重からのパーセント(%)差を示す。 見て分かるように、6日間の連続注入処方の終わりに、OBポリペプチドを与え ていた動物では、基線と比較して体重が４%以上減少した。これは、腹腔内(i.p. )注射で観測された体重損失よりも、実質的に急速な体重損失である。10mg/kg用 量の組換えマウスOBポリペプチドの毎日のi.p.注射では、受けた野生型(正常)マ ウスにおいて、32日注入期間の終わりで、ほんの2.6〜3.0%の体重損失しか見ら れなかった。また、投与スケジュール中いかなるときにも、体重損失は４%を超 えることはなかった(データは示していない)。本データは、連続注入において20 倍低い投与量(10mg/kgに対して0.5mg/kg)が、より短い期間でさらなる体重損失 を達成することを示す。 ここに見られた結果は、統計学的に有意である、例えば、-4.62%はp＜0.0001 である。 実施例14：組換えヒトOBポリペプチドアナログのクローニングおよび発現 本実施例は、OBポリペプチドのアナログ組換えヒト型の組成および調製方法を 提供する。 OB DNAのヒト型は、上記実施例13と同様に、20のコドン置換が設計されている 2本鎖DNA(合成オリゴヌクレオチドから生成)を有するMluIおよびBamHI部位間の 領域を置換することによってマウスOB DNAから構築した。マウス成熟35位のアル ギニンおよびマウスの成熟74位のロイシンに対するコドンは変化しなかった。下 記の配列ではMluI部位を実線の下に示す。このDNAは、上記のように、組換えマ ウスタンパク質と同様の様式で、pCFM1656ベクター(ATCC受託番号第69576号)中 に入れた。 組換えヒトmet OB(二本鎖)DNAおよびアミノ酸配列(配列番号96および97) 発酵 組換えヒトOBポリペプチドを生産するための上記宿主細胞の発酵を、組換えマ ウス物質について上述した条件および組成を用いて行った。結果は、組換えヒト OB物質(および微量の細菌性タンパク質)の収率(グラム/リットル)(精製前)につ いて解析を行い、そして細菌発現を解析するために関連づけた。 略語：Ind.＋＿時間は、タンパク質発現の誘導後の時間を意味し、これはpCFM16 56を用いた組換えマウス物質のための実施例１３の記載と同様である。 O.D.：光学濃度、分光光度計で測定。１リットル当たり1O.D.当たりミリグラムm g/O.D.・L：１リットル当たり1O.D.単位当たりタンパク質mgに換算した発現 組換えヒトobポリペプチドの精製 組換えヒトタンパク質は、上記実施例13のように組換えマウスタンパク質の精 製について用いられた方法と同様の方法を用いて精製され得る。組換えヒトOBポ リペプチドの調製のために、工程７の上清のpHをpH5.0に調整することにより工 程８を行い、これをCMSepharose fast flowカラムへ流した。20カラム容量塩勾 配は、20mM NaOAC，pH5.5，0M〜0.5MのNaClで行った。工程９はCMSepharoseプー ルを水で4倍に希釈し、pHを7.5に調整することによって行った。この混合物を、 0.7Mの硫酸アンモニアにした。20カラム容量の逆塩勾配を5mMのNaOAc,pH5.5，0. 2Mから0Mの硫酸アンモニアで行った。その他の点では、上記の工程は同一であっ た。 実施例15: 用量応答研究 追加研究は、OBタンパク質の連続投与に対する用量応答が存在することを実証 した。この研究では、野生型マウス(肥満型でない、体重35〜40gのCD-1マウス) に実施例12および13と同様の方法を用いて組換えマウスOBタンパク質を投与した 。その結果は次の通りであった(上記のように測定した、基線と比較した体重損 失%を示す)。 見て分かるように、0.03mg/kg/日から1mg/kg/日まで用量の増加に伴い、体重 損失も3.5%から7.5%へ増加した。注目すべきは14日目において、1mg/kg/日投与 量の結果が、14%の体重損失となったことである。 実施例16: ob/obマウスの体組成におけるレプチンの効果 C57B1/6J ob/ob 16週齢マウスに、5μg/g/日のマウスレプチン、媒体で処理する か、あるいは33日間いかなる処理も施さなかった。第二の実験では、、7週齢ob/ obマウスに10μg/g/日のヒトレプチン、マウスレプチン、あるいは媒体で12日間 処理した。マウスを屠殺し、全体重、体組成、インスリンレベル、およびグルコ ースレベルを評価した。これらの実験のデータを表11において報告する。 体組成データは、以下の体の３つのコンパートメントにおけるレプチンの効果 を実証している:脂肪量、痩身体重、および水分量。データは、レプチンが、体 脂肪量を有意に減少させ、そして痩身体重には最低限の効果を及ぼすことを示し ている。しかしながら、痩身体重への効果は、統計上有意ではなかった。 レプチン処理マウスおよびコントロール(未処理)マウスにおけるインスリンおよ びグルコースレベルの比較により、レプチンが血糖およびインスリンレベルを低 下させ、従ってこれらの糖尿病の徴候を改善することが示された。 実施例17: 野生型マウスにおけるレプチンの高用量効果 ob/obマウス(C57B1/6J+/?)の痩身コントロールに、10μg/gのマウスレプチンあ るいは媒体(PBS)を一日一度腹腔内注射し、体重および食物摂取を次の二週間に わたって測定した。４日目から体重に有意な減少が現れ、最初の一週間は食物摂 取にも有意な減少が現れた。しかしながら、一週間後には食物摂取のレベルは双 方のマウスグループ間で区別が付かなくなった。動物を、二週間後に屠殺し、体 組成を測定した。体組成分析の結果を表12に示す。データは、レプチンを与えた 動物対PBSを与えた動物の体脂肪の減少を示す。 第二の実験は、野生型マウスC57B1/6Jへの12.5μg/gのマウスレプチンの一日二 度の腹腔内注射の効果を示した。ポリペプチドの一日二度の注射と関連した体重 および食物摂取の有意の減少が見られた。この実験のために、動物は代謝室に配 した。食物は、粉末状Purina＃5001チャウダイエットで構成された。この食物は 、チャウダイエット、タピオカ、および水で構成された食物を用いた初期の実験 とは異なった。このように代謝室で用いた食物は、高カロリーであった。これに より、消費した食物の量が、水分含有食物を与えられたこれらの動物とは異なる ことが説明される。 以下は、上記の開示および特に実験手順および考察に関連する参考文献のリスト である。 Baharyら、Genomics,11:33-47(1991). Baharyら、Genomics,13:761-769(1992). Baharyら、Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow- sorted Robertsonian chromosome(1991). Blankら、Mammalian Genome，1:s51-s78(1991). Bogardusら、Annals of the New York Academy of Scienses，630:100-115(1991 ). Friedmanら、Mammalian Genome，1:130-144(1991). Harris，FASEB J.，4:3310-3318(1990). Jacobowitzら、N．Engl．J．Med.，315:96-100(1986). Kessey，Obesity，pp.144-166，Stunkard編.，Philadelphia，W.B．Sauders Co. (1980). Kesseyら、Ann．Rev．Psychol.，37:109-133.22(1986). Leibelら、「肥満症における遺伝子変化および栄養: 肥満症の分子遺伝学へのア プローチ」Genetic Variation and Nutrition，pp.90-101.1，Simopoulosおよび Childs編、S．Karger，Basel(1990). Siegelら、Cytogenet．Cell Genet.，61(3):184-185(1992). 本発明は、その意図的あるいは不可欠な特性から逸脱することなく、他の形式 で実施され得たり、他の方法で実行され得る。従って、本開示は、全ての点で例 示的でありかつ非限定的であり、発明の範囲は添付の請求の範囲によって示され てると考えられるべきである。また、意味および等価の範囲内の全ての変化が、 本発明中に含まれることが意図される。 様々な参考文献が本明細書に引用され、それぞれの文献は、その全体が、本明 細書中で参考として援用される。 クレームされた発明は、上記の明細書および容易に入手できる参考文献および 開始物質に従って実施可能である。それにも関わらず、出願人は、1995年8月9日 に以下の寄託をアメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Dri ve,Rockville,MD,20852-1178,U.S.A.に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブダペスト条約の規定に従って行った：プラスミドpETH14保有E．coli H14、受託番号第69880号；プラスミドpETM9保有E．coli M9；受託番号第69879号 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 9356−4Ｈ 14/47 14/47 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 7804−4Ｂ 1/21 1/21 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 9358−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＮ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／４８３，２１１ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ザン，イイン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10010, ニューヨーク，ウォーターサイド プレイ ス 30，アパートメント 27エフ (72)発明者 プロエンカ，リカード アメリカ合衆国 ニューヨーク 11102, アストリア，30ティーエイチ ストリート 26―62 (72)発明者 マフェイ，マルガリータ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 504，アパートメント 36エ ス (72)発明者 ハラース，ジェフリー エル. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 70ティーエイチ ストリート 420，アパートメント ９ ジェイ (72)発明者 ガジワラ，ケタン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 500，アパートメント 11エ フ (72)発明者 バーリー，スティーブン ケイ. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク，イースト 63アールディ ストリート 500，アパートメント 20エ イ 【要約の続き】 現制御配列と作動可能に関連させて含む細菌発現ベクタ ー、昆虫発現ベクター、または哺乳動物発現ベクターを 提供する。従って、本発明はさらに、適切な発現ベクタ ーでトランスフェクトまたはトランスフォームされた細 菌細胞または哺乳動物細胞、および対応して本発明のモ ジュレーターの調製における上記構築物の使用に関す る。OBポリペプチドに対する抗体もまた提供される。さ らに、哺乳動物の体重を調整する方法が提供される。特 定の実施例では、マウスおよびヒトのOBポリペプチドの ２つのイソ型をコードする遺伝子が提供される。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．動物において体重を調整し得る、約145〜約167アミノ酸を有する肥満症（ OB）ポリペプチド、あるいはフラグメントを包含する、同じ生物学的活性を有す るそれらの対立遺伝子変異体またはアナログ。 ２．配列番号２、４、５、または６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のOB ポリペプチド、あるいはフラグメントを包含する、それらの対立遺伝子変異体ま たはアナログ。 ３．請求項１または２に記載のOBポリペプチドの免疫原性フラグメント。 ４．以下の配列からなる群より選択されるOBポリペプチドの免疫原性フラグメ ント： ５．アミノ酸53、56、71、85、89、92、95、98、110、118、121、122、126、1 27、128、129、132、139、157、159、163、および166（配列番号４の番号付けに 従う）からなる群から選択される１つまたはより多くのアミノ酸が別のアミノ酸 と置換されている、請求項２に記載のヒトOBポリペプチドアナログ。 ６．前記置換が、配列番号２に記載のマウスOBポリペプチドの分岐アミノ酸と で行われる、請求項５に記載のヒトOBポリペプチドアナログ。 ７．前記置換が、アラニンとで行われる、請求項５に記載のヒトOBポリペプチ ドアナログ。 ８．以下のポリペプチドからなる群から選択される、請求項５に記載のヒトOB ポリペプチドアナログ： （ａ）５３位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリン、システイン、メチ オニン、またはトレオニンと置換される； （ｂ）９８位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリン、システイン、メチ オニン、またはトレオニンと置換される；および （ｃ）９２位のアルギニン残基がアスパラギン、リジン、ヒスチジン、グルタ ミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、メチオニン、また はシステインと置換される。 ９．配列番号２、４、５、または６に記載のヒトOBポリペプチドアミノ酸配列 と、83％以上のアミノ酸配列相同性を有する、請求項２に記載のOBポリペプチド アナログ。 １０．以下のポリペプチドからなる群から選択される、請求項２に記載のヒト OBポリペプチドアナログ： （ａ）１つまたはより多くのアスパラギン酸残基がグルタミン酸と置換される ； （ｂ）１つまたはより多くのイソロイシン残基がロイシンと置換される； （ｃ）１つまたはより多くのグリシンまたはバリン残基がアラニンと置換され る； （ｄ）１つまたはより多くのアルギニン残基がヒスチジンと置換される； （ｅ）１つまたはより多くのチロシンまたはフェニルアラニン残基がトリプト ファンと置換される； （ｆ）121位から128位（配列番号４の番号付けに従う）の１つまたはより多く の残基がグリシンまたはアラニンと置換される；および （ｇ）54位から60位または118位から166位（配列番号４の番号付けに従う）の １つまたはより多くの残基がリジン、グルタミン酸、システイン、またはプロリ ンと置換される。 １１．以下のポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、２、３、５ 、６、または９のいずれかに記載のOBポリペプチド： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている；および （ｂ）21位でメチオニン、または18位から21位でグリシン−セリン−ヒスチジ ン−メチオニン配列（配列番号３８）、または１位から21位でメチオニン−グリ シン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒ スチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリ ン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号９ ８）を有するサブパート（ａ）のポリペプチド。 １２．以下のポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、２、３、５ 、６、または９のいずれかに記載のOBポリペプチド： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている；および （ｂ）14位から21位でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−グルタ ミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、または18位 から21位でグルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２ ７）、または18位から21位でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列 （配列番号２８）、または２位から21位でメチオニン−グリシン−セリン−セリ ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ ン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グ リシン−セリン−プロリン配列（配列番号９９）、または18位から21位でグリシ ン−セリン−プロリン配列を有するサブパート（ａ）のポリペプチド。 １３．以下のポリペプチドからなる群から選択される、請求項７、８、９、ま たは１０のいずれかに記載のOBポリペプチド： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている：および （ｂ）21位でメチオニン、または18位から21位でグリシン−セリン−ヒスチジ ン−メチオニン配列（配列番号３８）、または１位から21位でメチオニン−グリ シン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒ スチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリ ン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号９ ８）、または14位から21位でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−グ ルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、または 18位から21位でグルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番 号２７）、または18位から21位でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン 配列（配列番号２８）、または２位から21位でメチオニン−グリシン−セリン− セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒス チジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン −グリシン−セリン−プロリン配列（配列番号９９）、または18位から21位でグ リシン−セリン−プロリン配列を有するサブパート（ａ）のポリペプチド。 １４．以下のポリペプチドからなる群（配列番号４の番号付けに従う）から選 択される、請求項２に記載のヒトOBポリペプチド短縮型アナログ： （ａ）121位から128位の１つまたはより多くの残基が欠失される； （ｂ）１〜116位の残基が欠失される； （ｃ）１〜21位および54〜167位の残基が欠失される； （ｄ）１〜60位および117〜167位の残基が欠失される； （ｅ）１〜60位の残基が欠失される； （ｆ）１〜53位の残基が欠失される； （ｇ）１〜21位の残基が欠失されるサブパート（ａ）のアナログ；および （ｈ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有 するサブパート（ａ）から（ｇ）のアナログ： （１）メチオニン、 （２）グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号３８）、 （３）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン− ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン −ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン− メチオニン配列（配列番号９８）、 （４）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラ ニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、 （５）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２ ７）、 （６）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２８） 、 （７）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン− ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン −ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリン配列 （配列番号９９）、および （８）グリシン−セリン−プロリン配列。 １５．請求項１から１４のいずれかに記載の組換えOBポリペプチド。 １６．請求項１から１４のいずれかに記載の化学合成OBポリペプチド。 １７．１つまたはそれより多くの化学部分が結合している、請求項１から１６ のいずれかに記載のOBポリペプチドの誘導体。 １８．前記化学部分が水溶性ポリマーである、請求項１７に記載の誘導体。 １９．前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１８に記 載の誘導体。 ２０．モノPEG化、ジPEG化、トリPEG化、またはテトラPEG化されている、請求 項１９に記載の誘導体。 ２１．Ｎ末端がモノPEG化されている、請求項２０に記載の誘導体。 ２２．配列番号４の22位から167位のアミノ酸残基または配列番号６の22位か ら166位の残基を含むOBポリペプチドである、請求項２１に記載の誘導体。 ２３．配列番号４の22位から167位のアミノ酸残基または配列番号６の22位か ら166位の残基を含み、そして21位にメチオニンを有するOBポリペプチドである 、請求項２１に記載の誘導体。 ２４．請求項１から６、９、または１１のいずれかに記載のOBポリペプチドを コードする単離された核酸分子。 ２５．請求項７、８、１０、１２、１３、または１４のいずれかに記載のOBポ リペプチドをコードする単離された核酸分子。 ２６．哺乳動物の体重を調整する生物学的活性を有するOBポリペプチドの発現 を得るために用いられるDNA分子であって、以下からなる群から選択される、DNA 分子： （ａ）配列番号１および３に記載のDNA分子またはそれらのフラグメント； （ｂ）（ａ）に定義したDNA分子とハイブリダイズするDNA分子またはそれらの ハイブリダイズし得るフラグメント；および （ｃ）該DNA分子のいすれかによりコードされるアミノ酸配列の発現をコード するDNA分子。 ２７．配列番号２２および２４のヒトゲノムDNA分子である、請求項２６に記 載のDNA分子。 ２８．以下に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする、請求項２４に記載のDNA分子： （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号２の22位から167位のアミノ酸； （ｃ）配列番号４； （ｄ）配列番号４の22位から167位のアミノ酸； （ｅ）配列番号５； （ｆ）配列番号５の22位から166位のアミノ酸； （ｇ）配列番号６； （ｈ）配列番号６の22位から166位のアミノ酸； （ｉ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有 するサブパート（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、または（ｈ）のアミノ酸配列： （１）メチオニン、 （２）グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号３８）、 （３）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン− ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン −ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン− メチオニン配列（配列番号９８）。 ２９．以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸配列を有する（ｂ）、（ ｄ）、（ｆ）、または（ｈ）のアミノ酸配列をコードする、請求項２８に記載の DNA分子： （１）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラ ニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、 （２）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２ ７）、 （３）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２８） 、 （４）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン− ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン −ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリン配列 （配列番号９９）、および （５）グリシン−セリン−プロリン配列。 ３０．配列番号３のタンパク質コード配列として記載される配列を含む、請求 項２４に記載のDNA分子。 ３１．配列番号３の22位から167位のアミノ酸をコードする配列として記載さ れる配列を含む、請求項２４に記載のDNA分子。 ３２．請求項２４から３１のいずれかに記載のDNA分子にハイブリダイズし得 る検出可能な標識をされた核酸分子。 ３３．OB核酸の非コード領域にハイブリダイズし得る核酸であって、該非コー ド領域がイントロン、５’非コード領域、および３’非コード領域からなる群か ら選択される、核酸。 ３４．OBポリペプチドをコードするヒトゲノムDNAを増幅するためのオリゴヌ クレオチドプライマー。 ３５．以下からなる群から選択される、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチ ド： ３６．請求項２４から３１のいずれかに記載のDNA分子を含むベクター。 ３７．発現制御配列と作動可能に関連された、請求項２４、２６、３０、また は３１に記載のDNA分子を含む発現ベクター。 ３８．発現制御配列と作動可能に関連された、請求項２７または２９に記載の DNA分子を含む発現ベクター。 ３９．発現制御配列と作動可能に関連された、請求項２５に記載のDNA分子を 含む発現ベクター。 ４０．請求項２４または２５に記載のDNA分子または請求項３６から３９のい ずれかに記載の発現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた 単細胞宿主。 ４１．前記単細胞宿主が細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、お よび組織培養におけるヒト細胞からなる群から選択される、請求項４０に記載の 単細胞宿主。 ４２．前記単細胞宿主が、E．coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、 酵母、CHO、R1.1、B-W、LM、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、およびSf9細胞 からなる群から選択される、請求項４０に記載の単細胞宿主。 ４３．前記単細胞宿主が、Saccharomyces、Pichia、Candida、Hansenula、お よびTorulopsisからなる群から選択される酵母宿主である、請求項４０に記載の 単細胞宿主。 ４４．OBポリペプチドをコードするDNA配列を含み、そして該OBポリペプチド をコードする配列に対して機能的に近接した位置に発現調節配列を挿入すること か らなる相同的組換え事象によって、OBポリペプチドの高発現を可能にするように インビトロで改変された、哺乳動物細胞。 ４５．前記発現調節配列がOBポリペプチド発現調節配列であり、そして前記相 同的組換え事象が変異OBポリペプチド発現制御配列を置き換える、請求項４４に 記載の細胞。 ４６．前記発現制御配列挿入部がOBポリペプチド制御配列ではない、請求項４ ５に記載の細胞。 ４７．以下の工程を包含する、OBポリペプチドを調製する方法： （ａ）請求項４０から４６のいずれかに記載の細胞をOBポリペプチドの発現を 提供する条件下で培養する工程；および （ｂ）該発現されたOBポリペプチドを回収する工程。 ４８．前記細胞が細菌または酵母である、請求項４７に記載の方法。 ４９．以下の工程をさらに包含する、請求項４７または４８に記載の方法： （ｃ）前記OBポリペプチドをNiキレートカラムでのクロマトグラフィーにかけ る工程；および （ｄ）前記OBポリペプチドをゲル濾過により精製する工程。 ５０．工程（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、前記OBポリペプチドを強陽イオン交 換カラムでのクロマトグラフィーにかける工程をさらに包含する、請求項４９に 記載の方法。 ５１．請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されるOBポリペプチドに対して特異的な抗体。 ５２．モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項５１に記 載の抗体。 ５３．検出可能な標識で標識された、請求項５２に記載の抗体。 ５４．請求項５２に記載のモノクローナル抗体を生産する不死化細胞系。 ５５．以下の工程を包含する、OBポリペプチドに対して特異的な抗体を調製す る方法： （ａ）請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されたOBポリペプチドを、キャリアタンパク質 に複合体化させる工程； （ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のOBポリペプチドフラグメント− キャリアタンパク質複合体で宿主動物を免疫する工程；および （ｃ）該免疫宿主動物から抗体を得る工程。 ５６．以下の工程を包含する、試料においてOBポリペプチドの存在を測定する 方法： （ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料を、該OBポリペプチドに特異 的に結合する抗体と、該抗体および該OBポリペプチドを含む反応複合体の形成を 可能にする条件下で接触させる工程；および （ｂ）該抗体および該試料中の該OBポリペプチドを含む反応複合体の形成を検 出する工程であって、 ここで該反応複合体の形成の検出が該試料におけるOBポリペプチドの存在を示す 、工程。 ５７．前記抗体が固相支持体に結合される、請求項５６に記載の方法。 ５８．以下の工程を包含する、生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルを 評価するインビトロ方法： （ａ）請求項５６または５７に記載の方法に従って、生物学的試料における反 応複合体の形成を検出する工程；および （ｂ）形成された反応複合体の量を評価する工程であって、ここで該反応複合 体の量は、該生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルに対応する、工程。 ５９．以下の工程を包含する、哺乳動物被験体におけるOBポリペプチドレベル の上昇または低下に関連した疾患の存在を検出または診断するインビトロ方法： （ａ）請求項５８に記載の哺乳動物被験体由来の生物学的試料におけるOBポリ ペプチドレベルを評価する工程；および （ｂ）工程（ａ）において検出されたレベルと、正常被験体または初期の該被 験体に存在するOBポリペプチドレベルとを比較する工程であって、 ここで、正常レベルに比較した該OBポリペプチドレベルの上昇はOBポリペプチド レベルの上昇に関連した疾患を示し、そして正常レベルに比較した該OBポリペプ チドレベルの低下はOBポリペプチドレベルの低下に関連した疾患を示す、工程。 ６０．哺乳動物被験体におけるOBポリペプチドのレベルの上昇または低下と関 連した疾患の治療処置をモニターするインビトロ方法であって、請求項５８に記 載の方法に従って、OBポリペプチドレベルの上昇または低下に関連した疾患につ いて治療処置を受ける哺乳動物被験体から異なる時点で得られた一連の生物学的 試料におけるOBポリペプチドレベルを評価する工程を包含する、方法。 ６１．請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されたOBポリペプチドと、薬学的に受容可能な キャリアとを含む薬学的組成物。 ６２．動物の体重を減少させるための、請求項６１に記載の薬学的組成物。 ６３．請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されるOBポリペプチドのアンタゴニストと、薬 学的に受容可能なキャリアとを含む、動物の体重を増大させるための薬学的組成 物。 ６４．前記アンタゴニストが、前記OBポリペプチドに結合しそしてその活性を 中和する抗体、該OBポリペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化しない 該OBポリペプチドのフラグメント、および該OBポリペプチドの小分子アンタゴニ ストからなる群から選択される、請求項６３に記載の薬学的組成物。 ６５．請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されたOBポリペプチドと、薬学的に受容可能な キャリアとを含む、個体の体重を減少させるための体型改善美容組成物。 ６６．請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７ から５０に記載の方法により生産されたOBポリペプチドのアンタゴニストと、薬 学的に受容可能なキャリアとを含む、個体の体重を増大させるための体型改善美 容組成物。 ６７．前記アンタゴニストが、前記OBポリペプチドに結合しそしてその活性を 中和する抗体、該OBポリペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化しない 該OBポリペプチドのフラグメント、および該OBポリペプチドの小分子アンタゴニ ストからなる群から選択される、請求項６６に記載の美容組成物。 ６８．個体の体型を改善するための美容方法であって、請求項６５から６７の いずれかに記載の美容組成物が、個体に、該個体の体重を所望のレベルに調整す るに十分な用量で投与される、方法。 ６９．哺乳動物の体重を調整するための医薬品の製造のための、請求項１から ４、または９のいずれかに記載のOBポリペプチドをコードする核酸にハイブリダ イズし得るアンチセンス核酸分子の使用。 ７０．動物の体重を改変するための遺伝子治療医薬品の製造のための、請求項 １から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載 の方法により生産されたOBポリペプチドをコードする核酸分子の使用。 ７１．動物の体重を改変するための医薬品の製造のための、請求項１から１６ のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方法によ り生産されたOBポリペプチドの使用。 ７２．糖尿病、高血圧、および高コレステロール症からなる群から選択される 障害の処置における哺乳動物の体重を調整するための医薬品の製造のための、請 求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７から５０に 記載の方法により生産されたOBポリペプチドの使用。 ７３．糖尿病、高血圧、および高コレステロール症の処置のための医薬品と組 み合わせて用いられる哺乳動物の体重を調整するための医薬品の製造のための、 請求項１から１６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７から５０ に記載の方法により生産されたOBポリペプチドの使用。 ７４．動物の体重を増大させるための医薬品の製造のための、請求項１から１ ６のいずれかに記載のOBポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方法に より生産されたOBポリペプチドのアンタゴニストの使用。 ７５．前記アンタゴニストが、前記OBポリペプチドに結合しそしてその活性を 中和する抗体、該OBレセプターに結合するがこれを活性化しない該OBポリペプチ ドのフラグメント、および該OBポリペプチドの小分子アンタゴニストからなる群 から選択される、請求項７４に記載の使用。 ７６．静脈内送達、動脈内送達、腹腔内送達、筋内送達、皮下送達、鼻内送達 、経口送達、または肺送達のための医薬品の製造のための、請求項７１から７５ のいずれかに記載の使用。
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