SI9520090A - Modulatorji telesne teže, odgovarjajoče nukleinske kisline in beljakovine, diagnostika in njihova uporaba v terapiji - Google Patents

Modulatorji telesne teže, odgovarjajoče nukleinske kisline in beljakovine, diagnostika in njihova uporaba v terapiji Download PDF

Info

Publication number
SI9520090A
SI9520090A SI9520090A SI9520090A SI9520090A SI 9520090 A SI9520090 A SI 9520090A SI 9520090 A SI9520090 A SI 9520090A SI 9520090 A SI9520090 A SI 9520090A SI 9520090 A SI9520090 A SI 9520090A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
polypeptide
seq
sequence
histidine
serine
Prior art date
Application number
SI9520090A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey M. Friedman
Yiying Zhang
Ricardo Proenca
Margherita Maffei
Jeffrey L. Halaas
Ketan Gajiwala
Stephen K. Burley
Original Assignee
The Rockefeller University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/292,345 external-priority patent/US6001968A/en
Priority claimed from US08/438,431 external-priority patent/US6429290B1/en
Application filed by The Rockefeller University filed Critical The Rockefeller University
Publication of SI9520090A publication Critical patent/SI9520090A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

V splošnem se predloženi izum nanaša na kontrolo telesne teže živali, vključno s sesalci in ljudmi in natančneje na materiale, ki so tukaj predstavljeni kot modulatorji teže, ter na diagnostiko in njihovo morebitno uporabo v terapevtske namene. Iz širšega vidika, so v predloženem izumu razložene in odkrite nukleotidne sekvence in proteini, katerih ekspresijo naj bi sprožili ti nukleotidi ali njihove degenerirane variante, ki izkazujejo sposobnost prispevati k kontroli telesne teže sesalcev. Nukleotidna sekvenca okvirno predstavlja gene, ki ustrezajo glodalskemu in humanemu OB genu, za katerega velja mnenje, da naj bi igral pomembno vlogo v uravnavanju telesne teže in debelosti. Tukaj predstavljeni preliminarni podatki, dajo slutiti, da genski polipeptidni produkt, ki je vprašljiv, deluje kot hormon. V predloženem izumu je opisana tudi uporaba molekul nukleinske kisline, kot molekularnih sond ali kot verig v verižni reakciji s polimerazo (PCR) za pomnoževanje sinteznih ali naravnih ogligonukleotidov. V predloženem izumu so predstavljeni vektorji za kloniranje, ki ima nukleinske kisline, ki so predmet izuma, in bakterijske, insekticidne ali sesalske ekspresijske vektorje, ki vključuje molekule nukleinske kisline, ki so predmet izuma, ki so oparativno povezane z ekspresijsko kontrolno sekvenco. Poleg tega se izum nanaša tudi na bakterijske ali sesalske celice transfektirane ali transkomirane z ustreznim ekspresijskim vektorjem in seveda tudi uporaba zgoraj omenjenih konstruktov pri pripravi modulatorjev, ki so predmet izuma. V izumu so opisana tudi protitelesa proti OB polipeptidu. Še več, opisane so tudi metode za uravnavanje telesne teže sesalcev. V specifičnih primerih, so opisani tudi geni, ki nosijo zapis za dve izoformi obeh, glodalskega in humanega OB polipeptida.ŕ

Description

MODULATORJI TELESNE TEŽE, ODGOVARJAJOČE NUKLEINSKE KISLINE IN BEUAKOVINE, NJIHOVA UPORABA V DIAGNOSTIKI IN V TERAPIJI
TEHNIČNO PODROČJE IZUMA
Predloženi izuma se v splošnem nanaša na uravnavanje telesne teže sesalcev, tako živali kot ljudi, in natančneje, na materiale, ki smo jih identificirali kot modulatorje telesne teže, ter na diagnostiko in njihovo morebitno uporabo v terapevtske namene.
TEORETIČNE OSNOVE
Debelost, definirana kot, relativni presežek telesnega maščevja glede na preostalo telesno maso, je povezana s pomembnimi psihološkimi in somatskimi boleznimi, k slednjim prištevamo povišan krvni tlak, povišane lipide v krvi in sladkorno bolezen tipa II. ali od insulina neodvisni diabetes melitus (non-insulin-dependent diabetes melitus = NIDDM). V ZDA živi približno 6 do 10 milijonska populacija ljudi z NIDDM, od tega je 18% populacije starejše od 65 let [Hariss et al., Int J. Obes., ii.-275-283(1987)]. Približno 45% moških in 70% žensk z NIDDM je tudi debelih, njihova bolezen pa se bistveno izboljša ali celo izgine z znižanjem telesne teže [ Hariss, Diabetes Čare, 14(3):639-648(1991)]. Kot bo opisano v nadaljevanju, se tako debelost, kot tudi NIDDM podedujeta, čeprav predpozicijski geni še niso bili identificirani. Molekularno genetska osnova teh metabolično pogojenih motenj je zelo pomembna, vendar še zelo slabo raziskana.
Prebava, shranjevanje in poraba energije hranil predstavlja kompleksen homeostatski sistem, ki je bistven za preživetje metazojev (vecčelična bitja z diferenciranimi tkivi). Za sesalce, ki živijo na Zemlji je nalaganje velikih količin energetsko bogatih snovi, kot so trigliceridi, v adipoznem tkivu življenskega pomena za preživetje v času pomankanja hrane. Potreba po vzdrževanju določenega nivoja zaloge energije brez stalnega spreminjanja velikosti in oblike organizma, zahteva vzdrževanje energetskega ravnovesja med vnosom in porabo. Kakorkoli, molekularni mehanizem, ki uravnava energetsko ravnovesje, še ni nepojasnjen. Izolacija molekul, ki prenašajo informacijo in nadzirajo energetsko ravnovesje, je bistvenega pomena za razumevanje regulacije telesne teže pri zdravem in bolnem posamezniku.
Količina maščevja pri vsakem posamezniku je, v veliki meri, genetsko pogojena. Preučevanje razmerja med telesno težo in tolstostjo pri eno in večjajčnih dvojčkih ali posvojencih in njihovih bioloških starših daje sklepati, da dedovanje debelosti (0.4 - 0.8) doseže enako stopnjo, kot druge značilnosti, za katere menimo, da imajo sorodne genetske komponente, kot so shizofrenija, alkoholizem in ateroskleroza [Stunkard et ai, N. Engl. J. Med., 322:1483-1487(1990)]. Družinske podobnosti v stopnji porabe energije so navedene v članku [Bogardus et al., Diabetes, 35:1-5(1986)]. Iz analize genov v geografsko omejeni populaciji lahko sklepamo, da je relativno majhno število genov odgovorno za 30 - 50% variabilnost v sestavi telesa [ Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 39:1234-1255(1991)]. Kakorkoli, nobenemu izmed genov, ki so odgovorni za debelost pri populaciji na splošno, še niso določili natančenega mesta na kromosomu.
Glodalski debelostni model vključuje sedem mutacij na očiglednoi na enem samem genu. Najbolj preučevane mutacije pri debelih miših so ob (debelost) in db (diabetes) geni. Ko so prisotne pri rodu istega porekla, ob in db kažeta neločljiva metabolna in vedenjska fenotipa, kar daje sklepati, da ti geni delujejo po enaki fiziološki poti [Coleman et al., Diabetologia, 74:141-148(1978)]. Homozigotne miši, pri tem, da so mutacije hiperfagne in hipometabolne, vodijo v debelostni fenotip, ki ga opazimo pri enem mesecu starosti. Teža teh živali se ustavi pri 60 - 70g (v primerjavi z mišmi v kontrolni skupini, katerih teža se ustavi pri 30 - 35g). ob in db živali izkazujejo številne druge hormonalne in metabolne spremembe, kjer težko določimo prvotno napako, ki prispeva k mutaciji [Bray et al., Am. J. Ciin. Nutr. 50:891-902(1989)].
Vsak glodalski debelostni model ima tudi spremenjen metabolizem ogljikovih hidratov, ki spominja na metabolizem pri ljudeh s sladkorno boleznijo tipa II. V nekaterih primerih je resnost sladkorne bolezni delno odvisna od porekla mišjega rodu [Leiter et al., Endocriology, 124:912922(1989)]. Oboje, ob in db kongenetske C57BL/Ks, miši so razvile težko sladkorno bolezen s popolno nekrozo β celic in atrofijo otočkov, kar je privedlo do relativne insulinopenije. Nasprotno, kongenetske C57BL/6J miši so obolele za prehodno, na insulin rezistentno sladkorno boleznijo, ki jo eventuelno kompenzirana s hipertrofijo β celic, kar spominja na sladkorno bolezen tipa II.
Fenotip ob in db miši je podoben debelosti pri človeku na način, ki je drugačena od debelosti pri sladkorni bolezni, mutirana miš je več in porabi manj energije, kot celotna kontrolna skupina (kot pri ljudeh s prekomerno telesno težo). Ta fenotip je zelo podoben fenotipu, ki ga opazimo pri ljudeh in živalih s poškodovanim ventromedialnim hipotalamusom, kar daje sklepati, da obe mutaciji sovpadata, z zmožnostjo pravilnega vgrajevanja ali odzivanja na prehrambene informacije znotraj centralnega živčnega sistema. Podpora tej hipotezi so rezultati poskusov s parabiozo [Coleman et al., Diabetologia, 9:294-298(1973)], ki kaže na to, da imajo ob miši pomankanje krožečega faktorja sitosti in da so db miši odporne na učinke ob faktorja (verjetno zaradi poškodbe ob receptorja). Ti poiskusi vodijo do zaključka, da je debelost pri teh miših-mutantih posledica različnih poškodb v aferentni zanki in/ali integrativnem centru omenjenega povratnega mehanizma, ki nadzoruje sestavo telesa.
Z uporabo molekularnih in klasičnih genetskih označevalcev, so bili ob in db geni prostorsko določeni na proksimalnem kromosomu 6 in midkromosomu 4, [Bahary et a!., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 87:86428646(1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1962(1991)]. V obeh primerih se mutacije nahajajo po regijah mišjega genoma, ki so podobne humanim, in dajejo sklepati, da obstajajo humanem homologi ob in db, in so podobno razporejeni na humani kromosom 7q in 1p. Napake v db genu lahko privedejo do debelosti v drugih sesalskih vrstah: pri genetskem križanju Zuker fa/fa podgan in Brown Norway +/+ podgan, se fa mutacija (podganji kromosom 5) pojavi na istem mestu kot sprememba db pri miši [Truett et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809(1991)]. Zaradi številnih faktorjev se zdi, da to zmanjša telesno težo, kajti ni možno predvideti faktorjev, bolj natančno, homeostatskih mehanizmov, ki prvenstveno določajo telesno težo. Osnovni problem, ki je tudi podlaga predloženega izuma, je priprava modulatorjev telesne teže, ki omogočajo kontrolo tolstosti in količino maščob pri sesalcih.
POVZETEK IZUMA
Glede na predloženi izum, je bil problem kontrole tolstosti in količine maščob pri živalih, posebaj sesalcih, rešen s pomočjo zaloge debelostnih (OB) polipeptidov in molekul nukleinskih kilsin, ki nosijo zapis za te polipeptide, ki so bili odkriti. V predloženem izumu, so prvič izolirali polipeptide, uporabne pri modulaciji, to je nadzoru in uravnavanju telesne teže in tolstosti, kot tudi določili sekvence nukleinskih kislin, ki imajo kodni zapis za take polipeptide, ki ne samo omogočajo pripravo OB polipeptidov z rekombinantno tehniko, ampak so uporabni za uravnavanje telesne teže.
Debelostni (OB) polipeptidi, ki so predmet predloženega izuma, imajo od približno 145 do 167 amino kislin in so sposobni uravnavanja telesne teže pri živalih, posebaj sesalcih, in obstajajo alelne variante, vključno s fragmenti z enako biološko aktivnostjo. Polipeptide pripravimo z rekombinantno ali kemično sintezo. Najbolj primerni so tisti OB polipeptidi, ki imajo zaporednje amino kislin opisano s SEQ ID NOS: 2, 4, 5, ali 6 ali alelične variante ali analogi, vključno s fragmenti.
Imunogeni fragmenti OB polipeptidov, ki so predmet izuma, obsegajo; Val-Pro-lle-Gln-Lys--Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-lle-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-lle-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln“Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-SerLeu-Asp (SEQ ID NO:20); in Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu Gln-Asp-lle-Leu-GInGIn-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu^s (SEQ ID NO;21).
Humani OB analogi polipeptidov vključujejo tiste, ki imajo zaporedje humanih amino kislin s SEQ ID NOS: 4 in 6, kjer je ena ali več amino kislin 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 in 166 (glede na številčenje SEQ ID NO:4) zamenjanih z drugo amino kislino, kot so divergentne amino kislin mišjih OB polipeptidov, kot je navedeno v SEQ ID NO:2 ali alanin. Taki analogi vključujejo tudi take, kjer so: (a): serinski ostanek na položaju 53 je zamenjan z glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ali treoninom; (b) serinski ostanek na položaju 98 je zamenjan z glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ali treoninom in (c) argininski zaostenek na položaju 92 je zamenjan z asparginom, lizinom, histidinom, giutaminom, glutaminsko kislino, aspartamsko kislino, serinom, treoninom, metioninom ali cisteinom. OB polipeptidni analog, ki je kot predmet izuma najustreznejši, ima 83% ali večjo homolognost zaporedja amino kislin s humanim OB polipeptidom, ki ima zaporedje amino kislin zapisano pod SEQ ID NO:2, 4, 5 in 6.
Dodatni humani OB polipeptidini analogi, po tem izumu, imajo zaporedje amino kislin z oznako SEQ ID NO:4 in 6 in imajo: (a) eno ali več aspartamskih kislinski ostankov z glutaminsko kislino; (b) eno ali več izoleucinskih ostankov zamenjanih z leucinom; (c) eden ali več glicinskih ali valinskih ostankov, ki jih zamenja alanin; (d) eden ali več argininskih ostankov, ki jih zamenja histidin; (e) eden ali več tirozinskih ali fenilalaninskih ostankov, ki jih zamenja triptofan; (f) eden ali več ostankov 121 do 128 (glede na številčenje SEQ ID NO:4) zamenjanih z glicinom ali alaninom in (g) eden ali več ostankov na položajih 54 do 60 ali od 118 do 166 (glede na številčenje SEQ ID NO:4), ki ga zamenja lizin, giutaminska kislina, cistein ali prolin.
Primerni skrajšani analogi humanega OB polipeptida, ki so predmet izuma, vključujejo tiste, kjer so (skladno s številčenjem (SEQ ID NO:4): (a) odstranjeni en ali več ostankov na položajih 121 do 128; (b) odstranjeni ostanki 1 do 116; odstranjeni ostanki od 1 do 21 in od 54 do 164; (d) odstranjeni ostanki od 1 do 60 in od 117 do 167; odstranjeno ostanki 1 do 60; odstranjeni ostanki 1 do 53 in (g) delni analogi (a), kjer so odstranjeni ostanki od 1 do 21. OB polipeptidi in analogi OB polipeptidov, ki so predmet izuma, ki nimajo 21 aminokislinske signalne sekvence (to je amino kislin od 1 do 21 v SEQ ID NO:4) imajo N-terminalne aminokisline ali aminokislinsko sekvenco kot je (1) metionin, (2) glicin-serinhistidin-metionin (SEQ ID NO:38), (3) sekvenco metionin-glicin-serin-serinhistidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valinprolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO:98), (4) sekvenco leucin-glutaminska kislina-lizin-arginin-glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin (SEQ ID NO:27), (6) sekvenco leucin-glutaminska kislina-lizinarginin (SEQ ID NO:28); (7) sekvenco metionin-glicin-serin-serin-histidinhistidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-argininglicin-serin-prolin (SEQ ID NO:99) in (8) sekvenco glicin-serin-prolin.
Derivati OB polipeptidov, ki so predmet predloženega izuma, imajo enega ali več kemičnih spojin vezanih nanje vključno z vodotopnimi polimeri, kot so polieilenglikol. Derivati polietilenglikola so lahko mono, di, tri ali terapegilirani, to je N-terminalno monopegilirani. Primernejši so N6 terminalni monopegilirani derivati ob polipeptidov, ki so predmet izuma, vključno z OB polpeptidi, ki imajo aminokislinske ostanke 22 do 167 iz SEQ ID NO:4 ali ostanke 22 do 166 iz SEQ ID NO:6, z opcijo, da imajo (pegiliran) metionin na položaju 21.
Izolirane molekule nukleinske kisline, ki so predmet izuma, nosijo zapis za OB polipeptide, alelične variante ali analoge, vključno s fragmenti, kot je že bilo opisano. Specifične so DNK molekule, ki so namenjene kontroli ekspresije OB polipeptidov z biološko aktivnostjo uravnavanja telesne teže pri sesalcih in so izbrani iz skupine, ki obsega; (a) molekule DNK, ki jo predstavljata SEQ ID NOS:1 in 3 ali njihovi fragmenti; (b) DNK molekule, ki jih lahko hibridiziramo v DNK molekule, ki so definirane v (a) ali njihove fragmente in (c) DNK molekule, ki nosijo kodni zapis za ekspresijo aminokislinskega zaporedja, ki jo nosi katerakoli nadaljna DNK molekula. Primer take molekule je DNK molekula humanega genoma iz SEQ ID NOS:22 in 24.
Najprimernejše DNK molekule, ki so predmet predloženega izuma, nosijo kodni zapis za polipeptid, ki ima zaporedje aminokislin, ki je zapisan v: (a) SEQ ID NO:2; (b) aminokisline od 22 do 167 v SEQ ID NO:2; (c) SEQ ID NO:4; (d) aminokisline od 22 do 167 v SEQ ID NO:4; (e) SEQ ID NO:(5); (f) aminokisline od 22 do 166 v SEQ ID NO:5 in (g) SEQ ID NO:6 in (h) aminokilsine od 22 do 166 v SEQ ID NO:6 kot tudi polipeptidi z Nterminalnimi aminokislinami ali zaporedjem aminokislin, ki je bilo opisano že prej. Ilustrativno najustreznejše DNK molekula ima zaporedje, ki je zapisano kot beljakovina s kodnim zaporedjem SEQ ID NO:3 in ima zaporedje, ki je prikazano kot zaporedje, ki ga predstavljajo aminokisline od 22 do 167.
Opisane so tudi označene molekule nukleinske kisline, ki se križajo z DNK molekulo, ki je predmet izuma, in obsegajo molekule nukleinske kisline, ki se križajo z nekodirajočim področjem OB nukleinskih kislin, katerih nekodirajoče področje je izbrano iz skupine, ki obsega intron in 5’ nekodirajoči konec in 3’ nekodirajoči konec. V predloženem izumu so opisani tudi olignukleotidne vijačnice za ojačanje humanega genoma DNK, ki nosi zapis za ob polipeptid, kot je oligonukleotid prikazan v SEQ ID NOS: 29 do 32.
Vektorji, ki so predmet predloženega izuma, obsegajo DNK molekulo, ki je že predhodno opisana in ima obliko ekspresijskega vektorja, ki obsega DNK molekulo, ki je operativno povezana z ekspresijsko kontrolno sekvenco. Enocelične gostiteljske celice, v predloženem izumu, so transformirane ali transfektirane z DNK molekulo, ki je predmet predloženega izuma, ali z vektorjem, kot je že bilo opisano. Primerne gostiteljske celice so bakterije, glive, sesalske celice, rastlinske celice, celice insektov in humane celice v obliki tkivnih kultur. Bolj ilustrativno povedano, take gostiteljske celice so izbrane iz skupine, ki obsega E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, glive in celice CHO, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, ΒΜΤΊ0 in Sf9. Najprimernejše gostiteljske glive so Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula in Tprulopsis. Zagotovljene so tudi sesalske celice, ki vsebujejo DNK sekvenco za ob polipeptide in spremenjene in vitro, kar omogoča večjo stopnjo ekspresije ob polipeptidov v homologni rekombinantnem dogodku, ki obsega vključevanje ekspresijske regulatorne sekvence v funkcionalno polipeptidno sekvenco s kodnim zapisom. Ekspresijska regulatorna sekvenca je lahko ekspresija ob polipeptidov ali tudi ne in lahko nadomesti spremenjeno polipeptidno regulatorno sekvenco v celici.
V predloženem izumu so opisane metode za pripravo ob polipeptidov, ki obsegajo: (a) gojenje celične kulture, kot je že prej opisano, pod pogoji, ki omogočajo ekspresijo ob polipeptidov in (b) oživitev ekspresiranih ob polipeptidov. To proceduro lahko spremljajo sledeči koraki; (c) kromatografsko zasledovanje polipeptidov na Ni kelatirajoči koloni in (d) čiščenje polipeptida z gelsko filtracijo. Najbolj zaželeno je, da za korakom (c), še pred korakom (d), izvedemo kromatograf iranje ob polipeptida na izmenjevalni koloni z močnim kationom.
V predloženem izumu so opisana označena in neoznačena monoklonalna in poliklonalna protitelesa, ki so specifična za ob polipeptide, ki so predmet predloženega izuma, in linija nesmrtnih celic, ki proizvaja monoklonalna protitelesa, ki so tudi predmet izuma. Priprava protiteles po izumu obsega; (a) konjugacijo ob polipeptidov na nosilno beljakovino; (b) imunizacijo gostiteljske celice z OB polipeptidnim fragmentom-nosilno beljakovino, ki smo ju povezali v koraku (a), ki je pomešan z dodatkom in (c) pridobivanje protiteles, ki smo jih dobili iz imunizirane gostiteljske živali.
V predloženem izumu so opisane metode za določevanje prisotnosti OB polipeptida v vzorcu, ki obsega; (a) dodajanje protiteles (najbolje, da so le-ti vezani na trden nosilec), ki se specifično vežejo na OB polipeptid, vzorcu za katerega menimo, da vsebuje OB polipeptid, pod pogoji, ki omogočajo nastajanje reakcijskega kompleksa, ki ga predstavlja protitelo z OB polipeptidom in (b) zasledovanje poteka reakcije nastajanja kompleksa protitelo - ob polipeptid v vzorcu, za katerega je značilno, da zasledovanje poteka nastajanja kompleksa, kaže na prisotnost OB polipeptida v vzorcu. Ustrezno temu so opisane in vitro metode za določevanje količine OB polipeptidov v biološkem vzorcu, ki obsega: (a) zasledovanje tvorbe kompleksa v biološkem vzorcu po metodi, ki je opisana zgoraj in (b) določevanje količine kompleksa, ki je v reakciji nastal, katera količina reakcijskega komleksa odgovarja količini OB polipeptida v biološkem vzorcu. Ko zasledimo ali diagnosticiramo prisotnost bolezni, ki je povezana s povečano ali znižano ravnjo OB polipeptida, ki je predmet izuma, ocenimo količino, kot je predhodno opisano in vivo, in ga nato primerjamo s količino OB polipeptida pri zdravem osebku. Povečana količina OB polipeptida, če to primerjamo z normalnim ali predhodnim stanjem, kaže na obolenje, ki je povezano s povečano vrednostjo OB polipeptida in nižjo vrednostjo OB polipeptida, če ga preimerjamo z normalno vrednostjo, kaže na obolenje, ki je povezana z znižano vrednostjo polipeptida. Ustrezno temu so opisano tudi in vitro metode za nadzorovanje terapije bolezni, povezane z boleznijo, ki je povezana s povišano ali znižano vrednostjo OB polipeptida pri sesalcih, če vrednosti primerjamo po prej opisanem postopku, vrednosti OB polipeptida v seriji bioloških vzorcev, ki smo jih odvzeli ob različnih časovnih točkah, sesalcem, ki so bili podvrženi tovrstni terapiji.
Zdravilo, ki je sestavljeno skladno z opisom v izumu, vsebuje OB polipeptid, ki je že predhodno opisan, skupaj s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem in je uporabno v terapiji zniževanja telesne teže. Dodatna zdravilo, ki je predmet izuma, uporabno v terapevtske namene, za povečevanje telesne teže živali, vsebuje antagonist OB polipeptida, najprimerneje je, da je izbran iz skupine protiteles, ki se vežejo in nevtralizirajo aktivnost OB polipeptida, fragment ob polipeptida, ki se veže, ne pa tudi aktivira OB polipeptidni receptor in majhna molekula antagonista OB polipeptida. V predloženem izumu so opisani tudi kozmetični izdelki za izboljšanje izgleda telesa, za zniževanje ali povečevanje telesne teže pri posameznikih in so primerni za uporabo v kozmetičnih posegih, s katerimi se izboljšuje izgled telesa pri posamezniku. Take kozmetične pripravke apliciramo posamezniku v količini, ki je zadostna za uravnavanje telesne teže posameznika na želeni nivo.
V predloženem izumu je opisana uporaba nukleinskih kislin, kot tudi komplementarne (antisense) molekule nukleinskih kislin, ki so križane z nukleinsko kislino, ki nosi kodni zapis za OB polipeptid, ki je predmet predloženega izuma, za pripravo zdravilnega pripravka (to je genska terapija) za uravnavanje telesne teže pri živalih. Opisana je tudi uporaba OB polipeptida ali antagonista, ki je predmet izuma, za izdelavo zdravilnega pripravka za uravnavanje telesne teže živali. Tako razvite zdravilne pripravke lahko uporabimo za uravnavanje telesne teže pri sesalcih za zdravljenje obolenj, ki jih izberemo iz skupine, v katero sodijo sladkorna bolezen, visok krvni tlak in povišan holesterol in kot del kombinirane terapije z zdravilnimi pripravki za zdravljenje navedenih obolenj. Take zdravile učinkovine lahko vgradimo v zdravilne pripravke za intravenozno, intraartealno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, nazalno, oralno ali pulmonalno aplikacijo.
Tukaj predstavljeni podatki, kažejo, da so omenjeni OB polipeptidi, ki so predmet izuma, taki kot so, izolirani prvenstveno iz sesalskih adipocitov in da polipeptidi delujejo kot hormoni.
V tem izumu navedeni Primeri kažejo, da OB polipeptidi, tukaj poimenovani z alternativnim imenom leptin, krožijo po mišji, podganji in humani plazmi. Leptin ni prisoten v plazmi ob/ob miši in je prisoten v 10kratni koncentraciji v plazmi db/db miših in v 20-krat višji koncentraciji v faffa miših. Najbolj značilno je to, da dnevno injiciranje rekombinantnega leptina drastično zniža telesno težo ob/ob miši, značilno vpliva na telesno težo divjih miši in nima učinka pri db/db miši.
V nadaljevanju bomo videli, da je ob polipeptid ene vrste, biološko aktiven v drugi vrsti. Natančneje humani OB polipeptid je aktiven pri miših.
Najprej, modulatorji, ki so predmet predloženega izuma, so molekule nukleinske kisline, vključno z rekombinantno DNK molekulo (to je cDNK ali vektorjem, ki vsebuje cDNK ali izoliran genomsko DNK) ali klonirani geni (to je izolirana genomska DNK) ali njihove degenerirane variante, ki nosijo kodni zapis za same polipeptide, ki služijo kot modulatorji kontrole telesne teže, kot je to definirano v nadaljevanju, ali konzervirane variante ali njihovi fragmenti, natančneje, taki fragmenti, ki so brez signalnega peptida (ali drugače, kot je napisano tukaj, kot zrel OB polipeptid), kateri polipeptidi imajo aminokislinska zaporedja, kot so navedena na sliki 1A do E (SEQ ID NO:2), slikil 3 (SEQ ID NO:4), sliki 5 (SEQ ID NO:5) in sliki 6 (SEQ ID NO:6). Navedeni sta tudi dve specifičnosti, zaporedje aminokislin za dve varianti glodalskega in humanega ob polipeptida. Oba polipeptida smo našli v obliki brez glutamina 49, kar lahko povzroči anomalije pri prenašanju mRNK. OB polipeptidi različnih vrst so lahko zelo homologni, kot je prikazano na sliki 4, glodaiski in humani OB polipeptidi sta večja od 80% homoiogov.
Molekule nukleinskih kislin, rekombinantne DNK molekule ali klonirani geni, imajo lahko sekvenco nukleotidov ali so komplementarni DNK, ki kodira zaporedje, kot je prikazano na slikah 1A do E (SEQ ID NOJ) in slikah 2A in B (SEQ ID NO:3). Natančneje, take DNK molekule so lahko cDNK ali genomske DNK, izloirane iz kromosoma. Molekule nukleinske kisline, ki so predmet izuma, lahko odgovarjajo 5’ in 3’ komplementarnim sekvencam DNK in intronske DNK sekvence. V predloženem izumu je opisana tudi identifikacija nukleinske kisline, ki ima nukleotidno sekvenco izbrano iz sekvence na slikah 1A do E (SEQ ID NOJ) in slikah 2A in B (SEQ ID NO:3) in degenerirane variante, alelni (ena ali dve alternativni varianti) variante in podobne sorodne molekule.
Molekula nukleinske kisline, ki je predmet izuma, je lahko DNK ali RNK, vključno s sinteznimi kislinami, ki imajo pripet fosfat ali njegov analog t.j. tiofosfat. Tukaj sta pregledani obe, enojna vijačnica in dvojna vijačnica.
V nadaljevanju predloženga izuma so opisane molekule nukleinske kisline, ki jih uporabimo kot molekularne sonde ali kot veriga za pomnoževanje v verižni reakciji s polimerazo (PCR) t.j. sintezni ali naravni oligonukleotidi imajo sekvenco, ki odgovarja delu sekvence, ki je prikazana na slikah 1A do E (SEQ ID NOJ), sliki 2A in B (SEQ ID NO:3) in slikah 20A do C ali 5’ in 3’ komplementarni sekvenci, sekvenci, ki nosi kodni zapis ali intronske sekvence genomske DNK. Natančneje, v izumu opisane molekule nukleinske kisline imajo najmanj 10 nukleotidov, katerih sekvenca molekule nukleinske kisline odgovarja sekvenci nukleotida z enakim številom nukleotidov v nukleotidnih sekvencah prikazanih na slikah 1A do E (SEQ ID NOJ), slikah 2A in B (SEQ ID NO:3) in slikah 20A do E (SEQ ID NO:22) ali sekvencah ki so njim komplementarne. Najprimernejše so sekvence nukleinskih kislin molekule, ki ima najmanj 15 nukleotidov. Še primernjeje je, da ima sekvenca nukleinske kisline vsaj 20 nukleotidov. V okvir tega izuma sodi tudi preiskušani oligonukleotid, ki je pripravljen kot sonda, označen tako, da ga lahko zasledujemo, t.j z radionuklidom (kot je 32P) ali encimom.
V nadaljevanju predloženega izuma je opisan klonirajoči vektor, ki ima nukleinski kislino, ki je predmet izuma, in nosi kodni zapis za ob polipeptid, bakterijo, insekt, ali sesalski ekspresijski vektor, ki nosi molekulo nukleinske kisline, ki je predmet izuma, s kodnim zapisom za ob polipeptid, ki je operativno povezan z ekspresijsko kontrolno sekvenco. Glede na izuma, se le-ta v nadaljevanju nanaša na gostiteljsko celico, kot je bakterijska celica, celica glive, celica insekta ali sesalsko celico, transticirano ali transformirano z ustreznim ekspresijskim vektorjem in na uporabo zgoraj opisanih konstruktov v pripravi modulatorjev, ki so predmet izuma.
Predmet predloženega izuma so tudi protitelesa, ki se vežejo na ob polipeptide. Taka protitelesa lahko delujejo proti celotnemu polipeptidu ali samo proti njegovemu antigenskemu fragmentu. Iz enega vidika, taka protitelesa inhibirajo funkcijsko (t. j. uravnavanje telesne teže in sestavo maščevja) aktivnost ob polipeptida. Z drugega vidika, lahko protitelesa uporabimo tudi za določevaje ravni krožečega ob polipeotida v plazmi aii serumu. Še nadaljni vidik, regijsko specifična protitelesa, posebaj monoklonalna protitelesa, lahko uporabimo za raziskovanje zgradbe OB polipeptida.
Vse zgoraj navedene spojine smatramo, kot modulatorje telesne teže in sestave maščevja in kot take lahko uporabimo v različnih kontekstih. Posebaj je v izumu predvidena uporaba tako v diagnostične kot terapevtske namene, kot tudi uporabo v kmetijstvu, vse vrste uporabe modulatorjev, ki so tukaj navedene, vključno z molekulami nukleinske kisline in beljakovin. Še več, uravnavanje telesne teže nosi specifično terapevtsko implikacijo in dobrobit pri obolenjih, kjer aii debelost ali nasprotno podhranjenost predstavlja neželeno stanje telesa in jo lahko odpravimo z aplikacijo enega ali več modulatorjev, ki so predmet predloženega izuma.
Metoda za uravnavanje telesne teže pri sesalcih naj bi obsegala kontrolo ekspresije beljakovin, za katere nosi zapis nukleinska kislina in imajo sekvenco nukleotidov izbrano iz sekvence, ki je predstavljena na slikah 1A do E (SEQ ID NO:1) in slikah 2A in B (SEQ ID NO:3) in njihove degenerirane ali sorodne variante. Tako kontrolo lahko izvedemo z vnosom
T2' spornih nukleotidov, z gensko terapijo, v maščobno celico pacienta ali gostitelja, z namenom nadzora ali zmanjšanja debelosti. Nasprotno, pripravki in aplikacija antagonistov nukleotidov, kot so komplementarne molekule, bodo indicirane in prepričljive v primeru, pod pogoji, ko so prisotni in ko zdravimo prekomerno izgubo telesne teže, pri anoreksiji nervosi, raku ali AIDS-u. Taki konstrukti so aplicirani podobno kot nukleotidi, neposredno v maščobno celico. Beljakovine, ki so definirane na slikah 1A do E, 3, 5 in 6 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 in SEQ ID NO:6) ohranjene variante, njihovi aktivni fragmenti in sorodne majhne molekule, lahko formuliramo za naposredno aplikacijo v terapevtske namene, za znižanje ali kontrolo presežka telesne maščobe ali prirasta telesne teže. Protitelesa ali druge antagoniste navedenim beljakovinam, kot so njihovi fragmenti, lahko pripravimo in podobno apliciramo, da dosežemo nasproten učinek. V skladu z izumom, ki je usmerjen tako, da predstavlja zdravilni pripravek, ki vsebuje OB polipeptid, ki je predmet izuma, ali nasprotno njegov antagonist v zmesi s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem ali polnilom.
OB polipeptid lahko apliciramo zaradi njegovih kozmetičnih učinkov t.j. izboljšanja izgleda telesa, s tem, da zmanjšamo maščobne obloge. OB polipeptid lahko uporabimo neodvisno ali v povezavi z drugimi kozmetičnimi postopki t.j kirurški posegom, da dosežemo kozmetične učinke.
Uporaba, omenjenih nukleotidov in odgovarjajočih beljakovin v diagnostiki, razširja področje uporabe nukleinskih kislin na določevanje nadaljnih mutiacij njihovih sorodnih variant, kot tudi razvoj palete aktivnih nukleotidov, ki so uporabni tako v diagnostiki, kot tudi v terapiji. Natančneje, oboje, homozigotne in heterozigotne mutacije vprašljivih nukleotidov lahko identificiramo, kar bo postulirano bolj točno ko bo poznano stanje pacientov, da določimo potencialno nevarnost, da bo določen pacient nagnjen k debelosti. Heterozigotne mutacije, ki jih vidim sedaj, so povezane z blago do zmerno debelostjo, medtem ko so homogizotne mutacije povezane z bolj izraženo in večjo debelostjo. Ustrezno preizkušanje DNK lahko izvedemo z uporabo prej omenjenih spojin, kot označevalcev, ki nam omogoča dolgoročno prognozo določenih tendenc, tako da lahko predpišemo spremembe ali v dieti ali drugih osebnih navadah ali neposredno posežmo z zdravili, da tako stanje preprečimo.
Diagnostična sposobnost, ki je omenjena v predloženem izumu, se razteza na metode merjenja prisotnosti in razširjenosti mudulatorjev, ki so predmet izuma, v celičnem vzorcu ali biološkem izvlečku (ali vzorcih), ki so odvezeti iz testnih osebkov, tako, da oboje, nukleinske kisline (genomska DNK in RNK) in/ali vrednost beljakovin v teh testnih vzorcih nedvoumno določimo. Povečanje aktivnosti nukleotidov in prisotnost nastalih beljakovin kaže na sposobnost osebka, da prepreči debelost, zdravnik, ki take rezultate preverja, pri debeli osebi, lahko določi faktor, ki je vzrok za debelost, ki ni le posledica nepravilnega delovanja, glede na pristnost in aktivnost nukleotidov, ki so predmet izuma,. Nasprotno pa znižana vrednost nukleotidvo in/ali izločene beljakovine daje slutiti, da je tako vrednost potrebno povečati, da take debelostne pogoje zdravimo in lahko izberemo ustrezen terapevtski režim.
Nukleotidi, ki so odkriti in predstavljeni na slikah 1A do E in 2A in B, predstavljajo cDNK, ki kot je navedeno na kratko opisano že prej, so uporabni pri merjenju odgovarjajoče RNK. Rekombinantni preoteinski material, ki ustreza polipeptidu na slikah 1A do E in 3, lahko pripravimo in ustrezno označimo, in ga uporabimo, na primer, pri radioimunskem testu, na primer, za določevaje maščobe in/ali plazemskih vrednosti OB beljakovine ali za zasledovanje prisotnosti in vrednosti OB receptorja v tkivu, kot je hipotalamus.
Nadalje v predloženem izumu ni opisano samo določevanje nukleotidov in odgovarjajočih beljakovin, ki so tukaj opisani, ampak tudi opisan receptor za tako spojino. V tem kontekstu, polipeptide, s slik 1A do E, 3, 5, in/ali 6, lahko pripravimo in koristno uprabimo, za pregledovanje primerne ekspresijske knjižnice za izolacijo aktivnih receptorjev. Receptor nato lahko kloniramo in receptor, sam ali v povezavi z ligandom, lahko nato koristno uporabimo zapregledovanje (screen) majhnih molekul, ki imajo podobno delovanje, kot tukaj omenjeni modulatorji.
Predloženi izuma se nanaša na farmacevtske pripravke, ki vključujejo določene modulatorje, najbolje polipeptide, katerih sekvence so predstavljene v SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 in SEQ ID NO:6, njihova protitelesa, njihovi odgovarjajoči agonisti ali antagonisti z majhno molekulo ali aktivni fragmenti, pripravljeni v takih terapevtskih sistemih, da je možen različen načina aplikacije, tako da je tarapija najustreznejša. Taki pripravki vključujejo farmacevtsko sprejemljive nosilce ali druga potrebna polnila in se pripravljajo v dozi, ki je učinkovita, velikost doz pa se določi na kliniki ali pri zdravniku v vsaki stopnji.
Predmet predloženega izuma je tudi, da se zagotovijo modulatorji telesne teže, kot so definirani v tem izumu, v čisti obliki, ki kažejo določene lastnosti in aktivnosti, ki so povezane z nadzorom in spreminajanjem tolstosti in vsebnosti maščobe pri sesalcih.
Predmet izuma so tudi metode določevanja in merjenja modulatorjev telesne teže, kot sredstvo učinkovitega diagnosticiranja in nadzorovanja patološkega stanja s tem, da je spreminjanje vrednosti takih modulatorjev je ali bi bila značilnost.
Predmet predloženega izuma je zagotoviti metodo in pripadajoči testni sistem za nadzorovanje snovi, kot so zdravilne učinkovine, spojine in podobno, ki so potencialno učinkovite, da pospešijo ali inhibirajo aktivnost modulatorjev, ki so predmet izuma, pri sesalcih.
Predmet izuma so še metode za zdravljenje sesalcev, za nadzor telesne teže in maščobo in/ali zdravljenje določenih patoloških sprememb, za katere je značilno nenormalno znižanje aii povišanja telesne teže.
Predmet predloženega izuma je tudi priprava genetskih konstruktov, ki so uporabni v genetskem terapevtskem protokolu in/ali zdravilnem pripravku za primerljive terapevtske metode, ki obsega ali temelji na enem ali več modulatorjev, vezalnih partnerjev ali spojin, ki lahko nadzorujejo njihovo nastajanje ali lahko pospešijo ali antagonizirajo njegovo aktivnost.
Druge stvari ali prednosti bodo razvidne strokovnjakom na svojem področju iz pregleda sledečih opisov, ki so podani skupaj z razlago sledečih ilustrativnih risb.
KRATEK OPIS SLIK
SLIKA 1 (od A do E) opisuje sekvenco nuklinske kisline (SEQ ID NO:1) in iz tega sklepamo na sekvenco aminokislin (SEQ ID NO:2), ki jo dobimo iz gledalske OB cDNK. 39 bazni par 5’ vodilni, ki mu je sledilo predvidenih 167 aminokislin, ki je predstavljal odprt okvir in približno 3.7 kb 3’ naprevedenih sekvenc. (V prejšnih vloženih patentih z vložno številko 08/347,563, ki je bila vložena 30. novembra 1994, in z vložno številko 08/438,431, ki je bila vložena 10. maja 1995, je bilo določenih naknadno 58 baz s 5’ nekodnimi sekvancami, so bile predmet kloniranja. Ta artefakt ni prenesen na kodno regijo, 39 baz 5’ nekodnega področja, ki je predstavljen na SLIKI 1A ali 3’ nekodni regiji gena). Skupno je prikazano približno 2500 baznih parov 3’ neprebrane sekvence. Analize predvidenih peptidnih sekvanc po opazovanju in uporabi SigSeq računalniškega programa, kaže na prisotnost signalne sekvece (podčrtana). Mikroheterogenost, ki smo jo opazili pri cDNK je ta, da je v približno 70% cDNK glutaminski kodon na kodonu 49 in v 30% ne. (glej sliko 5 in 6, infra). Ta aminokislina je podčrtana, kot je argininski kodonv C57BL/6J obfob miših (1J miši) spremenjen.
SLIKA 2 (A in B) prikazuje sekvenco nukleinske kisline (SEQ ID NO:3), ki jo dobimo iz humane OB cDNK. Nukleotidi so oštevilčeni od 1 do 701 z začetnim mestom na nukleotidu 46 in se konča pri nukleotidu 550.
SLIKA 3 prikazuje celotno sorodno aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO:4), ki jo dobimo iz humanega OB gena in odgovarja aminokislinski sekvenci na SLIKI 2A in B. Aminokiline so oštevilčene od 1 do 167. Cepitveno mesto signalne sekvece je locirano za aminokislino 21 (Ala), tako da zrela beljakovina sega od aminokisline 22 (Val) do aminokisline 167 (Cys).
SLIKA 4 prikazuje primerjavo med glodalsko (SEQ ID NO:2) in humano (SEQ ID NO:4) sorodno aminokislinsko sekvenco. Sekvenca humanega OB izkazuje visoko stopnjo homolognosti s sorodno aminokislinsko sekvenco pri miši. Konservativne spremembe so označene s črtico in nekonservativne z zvezdico. Spremenljivi glutaminski kodon je podčrtan, kot je podčrtano tudi mesto nesmiselne mutacije v C57BL/6J ob/ob miših. Celokupno je 83% identična na nivoju aminokislin, čeprav smo našli le osem zamenjav med valinom na kodonu 22 (takoj za signalno sekvenco) in cisteinom na mestu 117.
SLIKA 5 prikazuje celotno aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO:5), ki smo jo pridobili iz glodalskega OB gena, kot je prikazan na SLIKI 3, s tem, da manjka na mestu 49 glutamin. Aminokisline so označene s številkami od 1 do 66. Signalna sekvenca cepitvenega mesta je locirana za aminokislino 21 (Ala) (torej, pred glutaminom 49, ki je izbrisan) tako, da zrela beljakovina glodalca sega od aminokisline 22 (Val) do aminokisline 166 (Cys).
SLIKA 6 prikazuje celotno raztegnjeno aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO:6), ki smo jo izolirali iz humanega OB gena, kot je prikazana na sliki 4, brez glutamina na položaju 49. Cepitveno mesto signalne sekvence je locirano za aminokislino 21 (Ala) (torej, pred glutaminom 49, ki je izbrisan), tako, da zrela beljakovina glodalca sega od aminokisline 22 (Val) do aminokisline 166 (Cys).
SLIKA 7 (A) Fizikalni prikaz lokacije ob v kromosomu glodalca in YAC in P1 klonirana mape. M in N pomeni Mu/I in Noti omejitveni mesti. Število, ki označuje posamezno žival, ki je bila rekombinirana na mestu ob v 1606 mejozi. Met, Pax4, D6Rck39, D6Rck13 in Cpa se nanašajo na lokacije, na področju ob, na katerega se veže DNK sonda. YAC-e smo izolirali s pomočjo D6Rck13 in Pax-4, ki smo jih uporabili kot sonde, konce smo usposobili z uporabo vektorja PCR in/ali plazmidnega repa in uporabili v zamenjavo za izolacijo novih YAC. (B) Nastal je YAC stik. Eden izmed YAC v tem stiku, Υ902Α0925, je bil kimeren. Eden od teh sond, ki smo jo uporabili za genotip rekombinantnih živalih, kaže na parentezo. (6) Ustreza YAC 107; (5) predstavlja M16(+) (ali M16(pLUS); (4) predstavlja adu(+)‘, (3) predstavlja aad(plCL); (2) predstavlja 53(plCL) in (1) odgovarja 53(+). (C) P1 stik bakteriofagnega klona C1, izoliranega z izbranimi sondami na YAC repu. ob gen smo izolirali iz klona P1 s tem, da smo uporabili distalni konec YAC YB6S2F12 (konec (4)). (tukaj poimenovan tudi z alternativnim imenom adu(+).
Na SLIKI 8 je predstavljan fotografski posnetek barvanja z etidijevim bromidom 192 neodvisnih izolantov v exon trapping poskusu, ki je bil pomnožen v PCR in okarakteriziran.
SLIKA 9 predstavlja fotografski posnetek barvanja z etidijevim bromidom klonov, ki so bili pomonženi s PCR in za katere menimo, da imajo ob. Vsakega izmed sedmih klonov, ki artefakta ni imel, smo ponovno pomnožili v PCR in izvedli elektroforezo na 1% agaroznem gelu v TBE in barvali z etidijevim bromidom. Označevalci velikosti (skrajno levo neoštevilčena vrsta) so komercialno dostopni 1 kB lestev*'. Vrsta 1 - klon 1D12 vsebuje HIV sekvenco. 2. vrsta - klon 1F1, novejši klon izven ob področja. 3. vrsta -klon 1H3. 4. vrsta 2B2, ki je identičen z 1F1. 5. vrsta - klon 2G7, ki vsebuje ob ekson. 6. vrsta - klon 2011, ki je identičen z 1F1. 7. vrsta klon 2H1, ki vključka ne vsebuje.
Na SLIKI 10 je predstavljena sekvenca klona 2G7 (SEQ ID NO:7), ki vključuje tudi del gena, ki nosi kodni zapis za del OB gena. Sekvenca molekule, ki jo uporabimo za razširitev tega dela gena z zapisom, so na sliki označene z okvirom (SEQ ID NO:8 in 9).
SLIKA 11 (A) Analize mRNK z reverzno transkripcijo - PCR iz različnih tkiv iste miši z 2G7 verigo in aktinsko verigo. RT-PCR reakcijo smo izvedli z 100 ng RNK prepisane z oligo dT kot šablona za sintezo prve verige cDNK. PCR pomnoževanje smo izvedli v 35. ciklih z 94° denaturacijo za 1’; 55° hibridizacijo za 1’ raztezanje pri 72°C v 2’; z 1’ avtoekstenzijo na cikel. RT-PCR produkt smo ponovno raztopili v 2% agaroznem gelu z nizko točko tališča v 1x TBE pufru. (B) Metoda pivnanja (Northern blotting) mRNK iz različnih organov miši s PCR označenimi 2G7 kot poskus. 10 μg celotne RNK iz vsakega tkiva smo dali na agarozo gelsko elektroforezo z formaldehidom. Preiskovanec smo hibridizirali na 65°C v Rapid Hybe (Amersham). Avtoradiografski signal je bil viden po eni uri po izpostavitvi; opisan poskus je bil rezultat 24 urne izpostavitve.
SLIKA 12 (A) Barvanje z etidijevim bromidom po RT-PCR reakciji na RNK maščobnih celic (belo maščobno tkivo) iz vsake omenjene mišje linije. Celokupna RNK (100 ng) za vsak vzorec smo reverzno prepisali z oligo dT in reverzno transkriptazo in kot rezultat smo dobili enovijačno cDNK, ki smo jo pomnožili z verižno reakcijo s polimerazo z 2G7 šablono (nižja trakovi) ali vzorci aktina (zgornja trakovi). Oboji 2G7 in aktinske verige smo vključili v isto PCR reakcijo. Produkte smo dali na elektroforezo na 1% agaroznem TBE gelu. (B) Analiza pivnanja odgovarja (A). 10 gg RNK maščobnih celic (belo adipozno tkivo) iz vsakega označenega seva so iztekle in izpostavili v PCR označenih 2G7 sondah, kot na sliki 11B zgoraj. Približno 20-kratno povečanje 2G7 mRNK je bilo opaziti na RNK iz belega maščobnega tkiva C57BL76J ob/ob (1J) linije, relativno glede na celoten zarod. V obeh, RT-PCR in pivnanju po Northern-u nismo zaznali signala pri 2G7 RNK iz SM/Ckc-+Dacob2r /ob21 (2J) miših, celo dva tedna po izpostavitvi. Prikazan je avtoradiogram po 24-ih urah. Enak filter smo hibridizirali na aktinski sondi (spodnji del diagrama).
SLIKA 13 je prikazana analiza pivnanja po Northern-u dodatnih 2J živali in kontrolne skupine živali, ki so potrjeno brez ob mRNK, ki jo imajo 2J živali. Analizo pivanja smo izvedli kot je bilo opisano pri slikah 11 in 12. V tem primeru je bila kontrolna RNK ap2, maščobni specifičen prepis. Nismo opazili značilne razlike v spremembi gostote ap2 trakov.
SLIKA 14 predstavlja DNK sekvence C57BLV6J (normalna) in C57BL/6J ob/ob miši na področju točkovne mutacije, ki vodi v vnos nezrelega stop kodona (nesmiselna mutacija) v mutantni liniji cDNK. V ob/ob miših je prišlo do C -> T mutacije, ki je spremenila argininski ostanek na mestu 105. Ta sprememba baze, je prikazana na izhodu iz avtomatiziranega DNK sekvencerja. RT-PCR smo izvedli z uporabo maščobnih RNK iz obeh linij (+/+ in ob/ob) z uporabo 5’ in 3’ neprepisanih koncev. Produkte iz PCR reakcije smo čistili na gelu in naposredno sekvencirali ročno in z uporabo avtomatskega sekvencerja Applied Biosystems, Inc. 373A s šablonami vzdolž obeh verig kodne sekvence.
SLIKA 15 (A) Analiza pivnanja po Southern-u genomske DNK iz vsake naštete mišje linije. Približno 5 μρ DNK (ki smo jo pridobili iz genomske DNK iz jeter, ledvic ali vranice) smo razgradili z označenim restrikcijskim encimom. DNK smo nato dali na elektroforezo na 1% agarozni TBE gel in sondirali s PCR označenim 2G7. Omejena razgradnja z Bgi\\ je pokazala na povečanje velikosti za približno 9 kB (največji) Sg/ll fragmenta v SM/Ckc+®acob21/ob21 (21) DNK. RFLP nismo zaznali z nobenim drugim restrikcijskim encimom. Preliminarni restrikcijski maping genomske DNK kaže, da je polimorfno Bgl\\ mesto približno 7 kB navzgor of mesta začetka transkripcije. Z nobenim drugim encimom nismo testirali startnega mesta raztegnjene mRNK. (B) Segregacija Sg/ll polimorfizma v SM/Ckc+Dac0£,27/0if,27 |jnjjj. šest debelih in pet ostalih linij iz iste generacije koizogenetske SM/Ckc-+Dacob2i/ob21 (2J) kolonijam smo določili genotip z Sg/ll polimorfizmom, kot je prikazano na sliki (A). Vse fenotipsko debele živali so bile homozigotne za večji alel polimorfičnega Bglll fragmenta. DNK in kontrolna linija sta bili pripravljeni iz nesorodnih SM/Ckc+^ob21/ob21 (23) miši, gojene ločeno od SM/Ckc-+Dacob2i/ob21 kolonije.
SLIKA 16 prikazuje pivnanje po Southern-u z EcoRI cepljene genomske DNK iz naštetih vrst z uporabo OB cDNK sonde (t.j. zoo pivnik) Hibridizacjski signal smo zaznali v vzorcu vsakega vretenčarja, celo pri zmerno pomankljivi hibridizaciji. Mačja DNK je bila v tem poskusu rahlo okvarjena. Označeno DNK smo dali na 1% agarozni TBE gel in prenesli na imobilion membrano za sondiranje. Filter smo inkubirali na 65°C in spirali v 2X SSC/0.2% SDS pri 65°C, dvakrat po 20 minut in nanj za 3 dni postavili rentgenski film Χ-ΟΜΑΤ Kodak (Rochester, Ν.Υ.).
SLIKA 17 prestavlja ekspresijsko klonirani predel vektorja pET-15b (Novagen) (SEQ ID NO:11 in 12).
SLIKA 18 predstavlja analizo eluata iz His-vezalne smole (Ni) kolone rekombinantnega zrelega glodalskega ob, pripetega na His-tag (A) in zrelega humanega OB pripetega na His-tag (B). V bakterijo smo prenesli vektor pETM9 in pETH14. Po vnosu z 1 mM IPTG pod optimalnimi pogoji je bila transformirana bakterija sposobna proizvesti 100-300 μg/ml OB fuzujskega proteina, prvenstveno v inkluzijskih telesih. Inkluzijska telesa smo raztapljali s 6M gvanidin-HCI ali ureo in fuzijski proteini (prisotni v liziranem supernatantu) naložili na His vezalno smolo na (Ni) kolono v 10 ml 1 x vezalnega pufra z ureo. Kolono smo spirali postopoma, s 5 ml alikvoti 20 μΜ, 60 μΜ in 300 μΜ imidazolom in nazadnje s pufrom. V alikvotih smo analizirali prisotnost OB polipeptidov na 15% akrilamidnem gelu. Vsaka vrsta vsebuje ekvivalent 100 μΙ bakterijskega izvlečka.
SLIKA 19 (A) In vitro translacija OB RNK. Humano OB cDNK smo subklonirali v pGEM vektor. Plazmid smo linealizirali in sintetizirali plus verigo RNK z uporabo Sp6 polimeraze. In vitro sintetzirano RNK smo prevedli v prisotnosti ali odsotnosti pasje jeterne mikrosomalne membrane. Po končani in vitro translaciji smo dobili približno 18 kD velik primarni translacijski produkt. Dodatek mikrosomalne membrane v reakcijo vodi do produkta sekundarne translacije, ki je približno 2 kD krajši od primarnega translacijski produkt. Dodatek mikrosomalne membrane v reakciji, vodi do produkta sekundarne translacije, ki je približno 2 kD krajši od primarnega translacijskega produkta. Velikost translacijskega produkta interlevkin-1-α RNK, ki je brez signalne sekvence, je po dodatku mikrosomalne membrane ostala nespremenjena. Ta potatek kaže na prisotnost funkcionalne signalne sekvence. (B) In vitro translacija v prisotnosti ali brez proteinaza K. Obdelovanje s proteinazo kaža na popolno proteolizo 18 kD velikega primarnega produkta, medtem ko 16 kD spojina ostane neprizadeta. Permeabilizacija mikrosomov z 0.1% TRITONOM-X100 je povzročila procesirano obliko občutljivo na proteazo. Ti rezultati dajo slutiti, da je prišlo do translacije produkta v notranjost mikrosoma.
SLIKA 20 (od A do E) Sekvenca humanega OB gena (SEQ ID NOs: 22 in 24). (F) Shematski prikaz glodalskega OB gena. (G) Shematski prikaz humanega OB gena. V obeh (F) in (G) so začetni in končni kodoni podčrtani. Prvi intron, ki bi bil homologen mišjemu prvemu intronu v humanem genu ni viden, vendar njegovega obstoja ne moremo izključiti.
Na SLIKI 21 je predstavljen shematski prikaz ene od strategij kloniranja, ki jih lahko uporabimo za pripravo rekonbinantnih OB v glivicah Plohla. (A) Ekspresijskih vektor OB z α-.parnim faktorjem signalne sekvence. (B) Shematski prikaz strukture rekombinantnega proteina z aminokislinsko sekvenco (SEQ ID NO:26), ki kaže Xho\ mesto in domnevni ΚΕΧ-2 in STE13 cepitveni mesti in N-terminalni surplus aminokisline, prisotne za ΚΕΧ-2 cepitvi (SEQ ID NO:27). (C) Alternativna strategija za pripravo zrelega OB, ki obsega konstrukt z aminokislinsko sekvenco, ki odgovarja Xho\ cepitvenem mestu in KEM-2 cepitveno mesto takoj za sekvenco zrelega ob polipeptida (SEQ ID NO:28).
SLIKA 22. Alternativni prikaz ekspresije v Pichia. (Δ) Ekspresijski vektor OB fizuje s His-tag, ki je privzet iz pET ekspresijskega sistema pod kontrolo signalne sekvence a parnega faktorja (SEQ ID NO:33). (B) Shematski prikaz zgradbe rekombinantne OB proteina, ki je pripet na His tag, ki ima signalno sekvenco za ot parni faktor, domnevni ΚΕΧ-2 in STE-13 cepitveni mesti, His-tag in trombinsko cepitveno mesto, ki bi pustila OB tri surplus N terminalne aminokislinske ostanke.
SLIKA 23 (A) PAGE analiza glodalskega rekombinantnega OB (oboje mikroheterogena oblika, t.j. z in brez izgubljenega Gin 49) v transformiranih kavsovkah Pichia. Pričakovan trak približno 16 kD je viden v transformirani tekoči kulturi kvasovk (druga in tretja linija), ne pa tudi v tekoči kulturi netransformiranih kvasovk (prva linija). (B) PAGE analiza delno očiščenih rekombinantnih OB polipeptidov na karboksimetiicelulozi, šibkem ionskem izmenjvalcu. Trak s približno 16kD je zelo viden pri frakciji 3 in 4 iz stolpca, ki je bil spran s 250 mM NaCl. Linija 1 - naložen vzorec; linija 2- pretok; linije 3 -5 - frakcije sprane z 250 mM NaCl.
SLIKA 24 kaže da OB proteini krožijo v plazmi miši. (A) Imunopercipitacija iz mišje krvi. 0.5 ml mišje plazme smo predhodno zbistrili z nekonjugirano sefarozo in inkubirali preko noči z imunoprečiščenimi anti-OB protitelesi, vezanimi na kroglice sefaroze 4B. Imunoprecipitat smo ločili na 15% SDSPAGE gelu, prenesli in analizirali s pivnanjem (VVestern blot) z anti-OB protitelesi. Beljakovine so migrirale z molekulsko maso približno 16 kD na isto mesto kot zreli mišji ob proteini, ki smo jih bioproizvedli v kavsovkah. Proteina v plazmi C57BL/6J ob/ob miši nismo zasledili, 10-krat pa je bil višji v plazmi C57BLB/Ks db/db miši, relativno glede na divje miši. Menimo, da db miši proizvajajo OB protein prekomerno, sekundarno, da tako nevtralizirajo njegov učinek. (B) Povišana vrednost OB pri debelih miših. Debelost pri miši je rezultat recesivne mutacije mišjega kromosoma 5. Genetski podatki, dajejo slutiti, da je napaka v enakem genu kot pri db miših. Plazma debelih živali in prostale plazme so bile imunoprecipitirane in proteini analizirani s pivnanjem (VVestern blot). Pri mutiranih živalih smo opazili 20-kratno povečanje vrednosti krožečega OS. (C) Določitev količine OB proteinov v mišji plazmi. Povečano količino proteinov rekombinantnih miši smo dodali 100λ plazme iz ob miši in imunoprecipitirali. Intenziteto signala na Western blot smo primerjali s tisto pri 100λ plazmi iz divjih miši. Opazili smo linearno povečanje v intenziteti signala, skupaj s povečano količino rekombinantnih proteinov, kar kaže da je imunoprecipitacija izvedena s presežkom protiteles. Podoben signal smo zasledili v vzorcih plazme divjih miši in vzorecu z 2 ng rekombinantnih proteinov, ki kaže, ka je količina, ki kroži v mišji plazmi, približno 20 ng/ml. (D) OB protein v izvlečku maščobnega tkiva. Izvleček citoplazme mišjega adipoznega tkiva smo pripravili iz db in divjih miši. Z metodo pivnanja (VVestern blot) smo dokazali povečano vrednosti 16 kD proteina pri izvlečku pripravljenem iz db miši.
SLIKA 25 kaže, da je vrednost kožečih OB proteinov različen. (A) Pivnanje po Western-u v humani plazmi. Plazemske vzorce smo odvzeli šestim prostovoljcem. Imunoprecipitacijo in pivnanje (VVestern) smo izvedli v prisotnosti imunoreaktivnega 16 kD proteina, ki je po velikosti identičen rekombinantnemu humanemu proteinu s 146 aminokislinami, biosintetiziranega v kvasovkah. Različne vrednosti proteinov smo opazili v vsakem od šestih vzorcev. (B) ELISA (Enzyme Linked lmmunoassay) encimsko imunski test za humani ob. Mikrotiter ploščice smo obložili z imunoprečiščenimi anti humanimi OB protitelesi. Na ploščice smo dali znano količino rekombinantnih proteinov in to sledili z imunoprečiščenimi biotiniliranimi protitelesi. Narisali smo diagram absorbance pri 414 nm v odvisnosti od koncentracije OB, da smo dobili standardno krivuljo. Standardna krivulja kaže, da s testom lahko zasledimo 1 ng/ml ali več humanega OB proteina. (C) Kvantitivno določevanje OB proteina v humani plazmi. ELISA test smo izvedli z uporabo 100λ plazme iz šestih prostovoljcev in standardov, ki smo jih uporabili na sliki B. Vrednosti OB proteinov so v intervalu 2 ng/ml pri HP1 do 15ng/ml pri HP6. Ti podatki se dobro ujemajo s podatki določenimi s pivanjem (VVestern) na sliki A.
SLIKA 26 kaže, da v OB proteinu najdemo tako inter kot tudi intramolekularne disulfidne vezi. (A) Metoda pivnanja po Western-u pod reducirajočimi in nereducirajočimi pogoji. Pivnaje po Western-u smo ponovili z in brez dodatka reducenta v vzorcu pufra. Če β-merkaptoetanola nismo dodali v vzorec pufra, je imunoprecipitant iz db plazme migriral z navidezno molekulsko maso 16 kD in 32 kD. Dodatek β-merkaptoetanola v pufer vodi do izginotja 32 kD polovice (glej sliko 24). Tak rezultat smo rekapitulirali, če smo mišje proteine biosintetizirali v kavovkah vrste Pichia pastoris. M tem primeru OB proteini migrirajo na položaj dimera. Pod reducirajočimi pogoji prečiščen rekombinantni mišji protein migrira z navidezno molekulsko maso 16 kD, kar kaže da je 32 kD molekularna oblika rezultat ene ali dveh intermolekularnih disulfidnih vezi. Humani protein, biosintetiziran in vivo v kvasovki Pichia pastoris, migrira z molekulsko maso 16 kD, pod reducirajočimi in nereducirajočimi pogoji (podatki niso prikazani). (B) Humani protein, biosintetiziran v kvasovki, ima intramolekularno disulfidno vez. Izločeni proteini na splošno privzamejo njihovo pravilno konformacijo, če jih biosintetiziramo v kvasovki Pichia pastoris. Zrel humani protein, s 146 aminokislinami, smo biosintetizirali v Pichia pastoris in čistili iz fermentacijske brozge z dvostopenjskim čistilnim postopkom, ki je vključeval IMAC in gelsko filtracijo. Očiščeni rekombinantni proteini smo določevali z masno spektroskopijo, pred in po cepljenu s cianogen bromidom. Canogen bromidom cepi na karboksi repu metioninskega ostanka. Molekulska masa rekombinantnega proteina iz kvasovke je bila 16.024 ± 3 (računsko določena molekulsa masa = 16.024 Da) Cepitev s cianogen bromidom po treh metioninih v proteinski sekvenci pri aminokislini 75, 89 in 157. Cianogeno bromidni fragment ima izmerjeno molekulsko maso 8435,6 D, kar odgovarja aminokislinam 90 do 157 in 158 167, ki so povezne z disulfidno vezjo med Cys 117 in Cys 167. (izračunana molekulska masa = 8434,5 Da). (N.D. = nismo zasledili).
Na SLIKA 27 je prikazana priprava bioaktvinega rekombinantnega proteina. Nukleotidno sekvenco, ki odgovarja zrelemu mišjemu OB proteinu, s 145 aminokislinami, smo vgradili v pET 15b ekspresijski vektor. Vključek pET vektorja vsebuje polihistidni trakt (His-tag) navzgor od vgrajene sekvence, ki omogoča učinkovito čiščenje z imobilizirano metalno afinitetno kromatografijo (IMAC). Rekombinantni bakterijski protein, delno izdelan na netopni membranski frakciji po bakterijski iizi. Membransko frakcjo smo raztopili z uporabo gvanidin hidroklorida in naložili na IMAC kolono. Protein smo postopoma spirali s povečujočo koncentracijo imidazola, kot je prikazano. Sprani protein smo ponovno zvili in obdelovali s trombinom, da smo odstranili His-Tag, kot je opisano spodaj. Končni izkoristek topnega proteina je bi! 45 ng/ml bakterijske kulture.
SLIKA 28 kaže biološko učinkovitost OB proteina. Odvisnost vnosa hrane od časa (diagram A-C in telesna teže (diagram D-F). Skupine po 10 živali so prejemale dnevno intraperitonealno injekcije OB proteinov v odmerku 5 mg/kg/dan (polni kvadrati), dnevno injekcijo PBS (polni krogci) ali nič (polni trikotniki). Zdravljene skupine so obsegale C57B1/6J ob/ob miši) diagram A in D), C57B1/Ks db/db miši (diagram B in E) in CBA/J+/+ miši (diagrama C in F). Vnos hrane v miši smo merili dnevno in telesno teže beležili v tri do štiridnevnih intervalih. (Diagram telesna teža v gramih je različna za divje miši proti ob in db miši.). Vnos hrane pri ob miših, ki so prejemale protein smo zmanjšali po prvem vnosu in stabilizirali po četrtem dnevu, na nivo, približno 40% videnega pri skupini, ki smo ji injiciranje simulirali (p< 0.001). Telesna teža teh živali se je znižala v povprečju za 1.3 gramov/dan in se stabilizirala po treh tednih, na raven približno 60% začetne teže (p<0.0001). Učinka proteina pri db miših nismo opazili. Majhen, vendar očiten učinek na telesno težo, smo opazili v CBA/J miši pri dveh zgodnjih časih (p<0.02). Standardna napaka vsake meritve je označena s črto, statistična značilnost teh rezultatov je prikazana v preglednici 1.
SLIKA 28 prikazuje rezultate hranjenja para ob miši. (A) Skupina štirih C57B1/6J ob/ob miši smo hranili s količino hrane, ki je bila enaka tisti količini, ki jo je pojedla skupina ob miši, ki je prejemala rekombinantni protein. Izgubo teže pri obeh skpuinah smo izračunali po petih, osmih in dvanajstih dneh. Miši, ki smo jim odtegovali hrano, so izgubile (črtasti stolpci) manj teže kot ob miši, ki so prejemale protein (polni stolpci) (p<0.02). Ta rezultat kaže, da je učinek zmanjšanja teže OB proteina rezultat, tako vnosa količine, kot tudi porabe energije. (B) Fotografija zdravljene ob miši. Prikazani sta dve C57B1/6J ob/ob miši. Miš na levi je prejela PBS in je na začetku tehtala 65 gramov. Miš na desni je dnevno prejemala injekcije rekombinantnega OB proteina. Začetna teža te živali je bila 65 gramov in teža po treh tednih zdravljenja s proteinom, se je znižala na 38 gramov. (C) Jetra zdravljene in nezdravljene ob miši. Prikazane so jetra zdravljene in nezdravljene C57B1/6J ob/ob miši. Jetra miši, ki je prejemala PBS, imajo izgled povečanih zamaščenih jeter in tehtajo 5.04 gramov. Jetra miši, ki je prejemala rekombinantni ob protein, ima normalni izgled in tehtajo 2.23 gramov.
SLIKA 30 prikazuje in situ hibridizacijo ob maščobnega tkiva. Vzorčna in njena komplementarna ob veriga RNK sta bili označeni in vitro, z uporabo Sp6 in T7 polimeraze in digoksigenina. Označeni RNK sta bili hibridizirani na parafinsko okvirjeno področje adipoznega tkiva iz epididimalnih maščobnih blazinic osem tednov starih C57B1/ks miši (označenih z divji tip) in C57B1/Ks db/db miši (označena db). Na sliki, maščobne kapljice so vidne kot neobarvane vakuole znotraj celic. Citoplazma je tanka mrena na perifieriji celice in je neločljiva od celične membrane. Zasledili smo hibridizacija vseh adipocitov v vidnem pri divjem tipu, kjer smo uporabili le komplementarne sonde in opazili povečane vrednosti v tkivih iz db/db živali.
SLIKA 31 kaže, da se OB RNK biosintetizira v adipocitih in vivo in in vitro. RNK (10 mikrogramov) iz več različnih virov smo elektroforizirali in spremenili v ob sondo. Najprej, razlike v celični rasti, po razgradnji s kolagenazo smo uporabili za čiščenje adipocitov. OB RNK je bila prisotna le v adipocitni frakciji. Linija S kaže na stramovaskularno frakcijo in A kaže na adipocitno frakcijo. OB RNK se ni biosintetizirala v nediferencirani 3T3442 preadipocitni celici linije U. Diferencirani adipociti iz te linije so kazali lahko določljiv nivo OB mRNK (linija D).
SLIKA 32 prikazuje, da ekspresija OB RNK poteka v vseh depojih adipoznega tkiva. V vsakem adipoznem tkivu, ki smo ga preiskusili, je potekala ekspresija RNK. Ingvinalne maščobne blazinice so biosintetizira,e manj RNK, čeprav smo opazili spremenljivost v jakosti signala v različnih poskusih. (Stika 31 A) Linija (1) epididimaina, (2) inguinalna, (3) abdominalna, (4) parametrialne maščobne blazinice. V rjavi maščobi izkazuje je ekspresija OB RNK nizka. (Slika 31 B). Nivo OB ekspresije v rjavi maščobi je bila nespremenjena pri živalih, ki so živele pri 4°C en teden, medtem ko je bila količina rjave maščobe specifične UCP RNK, za katero je znano, da jo vzpodbuja mraz, 5-krat povečana.
SLIKA 33 kaža na ekspresijo OB RNK v db/db miših, ki smo jih zdravili z tioglukozo. Celokupna RNK iz parametrialnih maščobnih blazinic s aurotioglukozo (GTG) in db/db zdravljenih miši smo elektroforezirali in pivnanali po Northern-u. Za GTG je znano, aplikacija v eni dozi povzroča debelost s tem, da inducira specifične hipotalamične lezije. (A) En mesec starim CBA mišjim samicam smo dajali GTG (0.2 mg/g) in opazili povečanje za >20 g pri zdravljenih živalih, glede na kontrolno skupino (<5g). (B) Hibridizacija OB sonde v RNK iz db/db in miši, ki smo jim dajali GTG, smo opazili 20-kratno povečanje RNK, glede na kontrolno skupino RNK (aktin ali GAPDH).
SLIKA 34 predstavlja analizo humane RNK z metodo pivnanja po Northemu. Z metodo pivnanja smo 10 mg celokupne RNK iz humanega maščobnega tkiva (FAT, diagram A) in 2 mg polyA+ RNK iz drugih humanih tkiv (diagram B), hibridizirali v humano ob aii humano β-aktin sondo, kot je bilo navedeno. Signal ima jakost približno 4.5 kB in smo ga opazili na adipoznem tkivu celokupne RNK. Hibridizacija polyA+ RNK je odkrila signal, ki smo ga lahko zasledili v srcu (HE) in placenti (PL), medtem, ko OB RNK nismo zasledili v možganih (BR), pljučih (LU), jetrih (Ll), skeletni muskulaturi (SM), ledvicih (KI) in slinavki (PA). V vsakem primeru je dolžina avtoradiografskega izpostavljanja napisana. Geneza nižjih molekulskih mas, ki smo jo opazili pri placentrani RNK (t.j. spremenjena razcepljena, RNK razgradnja) ni poznana.
SLIKA 35 predstavlja YAC stik s humanim OB genom in osmimi mikrosatelitskimi označevalci. Na osnovi YAC je prikazan STS zemljevid področja kromosoma 7, ki obsega humani OB gen, kot je bilo določeno z SEGMAP/Version 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1:77-90(1991)]. 19 urejenih STS (glej preglednico 3) je navedenih vzdolž vrha. Navedeni so tudi STS, ki odgovarjajo Pax4 in OB genu, kot tudi predvideni položaj centromere in 7q telomere (tel) relativno glede na stik. Vsak od 34 YAC klonov je prikazana kot horizontalna črta, ki ima ime označeno na levi in ocena YAc velikost (v kb, izmerjeno z elektroforezo) zagotavlja v parentezi. Prisotnost STS in YAC je označena s temnimi krogci na približni lokaciji. Ko STS odgovarja vključenemu delu YAC, je to označeno s kvadratom na odgovarjajočem krogu oboje vzdolž vrha (blizu STS imena) in na koncu YAC, iz katerega smo ga dobili. Pet YAC na dnu (pod horizontalno prekinjeno črto) 1 ali več STS, ki smo jih pričakovali (temelji na oceni STS števila) vendar jih nismo zasledili (kot smo to ocenili s testiranjem posameznega YAC z odgovarjajoččo STS specifično PCR testom(i) najmanj dvakrat) in so označeni kot odprti krogi na ustreznem mestu. Večina YAC smo izolirali iz hibridne celice človeka in hrčka celične knjižnice [Green et al., Genomics., 25:170-183(1995)], navedeni s z originalnimi imeni. Preostali YAC so bili izolirani iz humane genomske knjižnice in njihova originalna mesta v knižnici so navedena v preglednici 3. Uokvirjena so imena 3 YAC (yWSS691, yWSS999 in yWSS2935), ki smo jih našli s FISH analizo z mapingom 7q31.3. Stik je prikazana v neračunalniški obliki, kjer je velikosti YAC niso uporabljeni za oceno klona ki se pokriva ali zaseda STS mesto, zato so vsi STS nameščeni paralelno. V izračunani obliki, kjer velikost YAC uporabimo za oceno relativne razdalje, ki ločuje vsak par sosednjih STS, kot tudi podaljšek klona, ki se prekriva, se zdi, da celokupen YAC stik obsega nekaj več kot 2 Mb.
PODROBEN OPIS IZUMA
V predloženem izumu je pojasnjeno odkritje peptida, ki ga imenujemo v tem izumu imenujemo ob polipeptid ali leptin, nukleinske kisline, ki nosijo kodni zapisa za ta protein, vključno s tistimi, ki so tudi degenerirani, t.j. imajo vgrajen optimalni kodon za sintezo v določenem ekspresijekem sistemu, kateri proteini izkazuje sposobnost, da kontrolira telesno težo pri sesalcih. Nukleinske kisline v tem izumu, predstavlja kodno sekvenco, ki odgovarja glodalskemu in humanemu OB polipeptidu, za katerega predpostavljamo, da igra ključno vlogo v uravnavanju telesne teže in debelosti. Tukaj predstavljeni podatki kažejo, da je polipeptid produkt nukleinske kisline, ki je predmet izuma, in ga izločajo celice, ki ga sintetizirajo, in da polipeptid deluje kot hormon. Dodatni eksperimentalni podatki kažejo, da je OB polipeptid zelo učinkovit pri zdravljenju debelosti pri miših, ki imajo mutiran ob gen. Visoke doze ali zmerne nadaljevalne doze OB polipeptida vplivajo na znižanje telesne teže pri normalnem (divjem) tipu miši.
Poleg tega, primeri v tem izumu kažejo da OB polipeptid, z alternativnim imenom lepin, kroži v mišji, podganji in humani plazmi. Lepina nismo zasledili v plazmi ob/ob miši, v 10-krat višji koncentraciji pa je prisoten v db/db miših in 20-kratni koncentraciji v fa/fa miših. Značilno je da, dnevno injicirani rekombinantni leptini značilno znižajo telesno težo ob/ob miši, značilno vpliva na telesno težo divjiega tipa miši in nima učinka pri ob/ob miših.
Nadalje, OB polipeptid iz one vrste je biološko aktiven v drugi vrsti. Natančneje, humani OB polipeptid je aktiven v miši.
Prvenstveno je predloženi izuma usmerjen v identifikacijo materialov, ki delujejo kot modulatorjitelesne teže pri sesalcih. Natančneje, predmet izuma je izolacija, čiščenje in določanje sekvence določenih nukleinskih kislin, ki odgovarjajo OB genu ali njegovem kodnem področju pri obeh, miši in ljudeh., kot tudi odgovarjajoči polipeptidi, katerih sintezo te nukleinske kisline omogočajo. V izumu je opisno tudi odkritje nukleinskih kislin, ki nosijo nukleotidne sekvence, ki so zapisane na sliki 1A do E (SEQ ID NOJ) in sliki 2A in B (SEQ ID NO:#) in tudi degenerirane variante, alale in njihovi fragmenti, vsi pa posedujejo aktivnost uravnavanja telesne teže in tolstosti. Ustreznost predstavljenih nukleinskih kislin OB gena naznanja njihov pomemben vpliv na pogoje, kot so debelost in tudi druge nepravilnosti in disfunkcije, kjer prispevajo svoj del k nenormalnosti v telesni teži. Izum je razširjen na proteine, ki jih sintetizirajo nukleinske kisline, ki so predmet izuma, natančneje tisti proteini, ki so predstavljeni na sliki 1A do E (SEQ ID NO:2), sliki 3 (SEQ ID NO:4), sliki 5 (SEQ ID NO:5) in SLIKI 6 (SEQ ID NO:6), kot tudi ohranjene variante, aktivni fragmenti in majhne aktivne molekule.
Kot je bilo že prej opisano, modulatorji telesne teže peptidi ali njihovi vezalni partnerji ali drugi Ugandi ati spojine jih posnemajo ali nasprotujejo ali kontrolirajo njihovo nastajanje, lahko pripravimo v zdravilnem pripravku z ustreznim nosilcem, v določeni dozi, za aplikacijo po različnih poteh pacientom, katerim telesna teža nenormalno niha ali so zamaščeni, kot samo ali kot spremljaoči učinek drugih obolenj, kot so rak ali AIDS za njihovo zdravljenje. Različni načini aplikacije, kot so oralna, nazalna ali druga oblika preko membrane, parenteralna aplikacija, kot so subkutana, intravenozna ali intraperitonealna in podobno. Povprečna količina prepoznavnih faktorjev ali njihovih podenot, se lahko spreminja, natančneje, naj bi temeljila na priporočilih in predpisu zdravnika ali veterinarja.
V skladu z zgoraj napisanim, lahko pripravimo sistem testiranja za preučevanje potencialne učinkovitosti zdravila, glede na pospeševanje ali nasprotovanje aktivnosti modulatorjev telesne teže. Modulator telesne teže lahko v testni sistem apliciramo, potencialno zdravilno učinkovino lahko apliciramo tudi na celične kulture, in opazujemo spremembo v aktivnosti celic, zaradi dodatka potencialnega zdravila samega ali zaradi dodane količine poznanih modulatorjev telesne teže.
Kot smo omenili že prej, tukaj opisano molekularno kloniranje OB gena vodi v identifikacijo razreda materiala, ki deluje na molekularnem nivoju in spreminja telesno težo sesalcev. Odkritje modulatorjev, ki so predmet izuma, ima pomembne implikacije v diagnozi in zdravljenju prehrambenih motenj, v katere vključujemo, to seveda ni omejitev, debelost, izguba telesne teže pri raku in zdravljenje bolezni povezanih z debelostjo kot so povišan krvi tlak, srčna obolenja in sladkorna bolezen tipa II. Poleg tega, imamo potencialno uporabnost v kmetijstvu, kot genski produkt v primerih kjer želimo uravnavati telesno težo domačih živali. Nenazadnje, da poudarimo, je en ali več modulatorjev, ki so predmet izuma, izloček, ki jih uporabimo biokemično, tako da izolirano njihov receptor, s pomočjo ekspresijskega kloniranja. Sledi razprava s specifičnimi referencami OB genov, ki jih lahko štejemo v razred modulatorjev, ki so del predloženega izuma in jih moramo tudi tako interpretirati.
Kot je že zgoraj omenjeno, funkcionalno aktivnost OB polipeptida lahko preverimo transgenetsko. V tem primeru uporabimo transgenetski mišji model, ob gen lahko uporabimo v komplementarnih študijah, v katere so vključene transgenetske miši. Transgenetski vektor, vključno z virusnim vektorjem ali kosmidi (ali fagi), ki ustreza divjemi tipu želenega gena in ga lahko sestavimo s pomočjo izoliranega ob gena. Kosmid nato vbrizgamo v transgeno miš po metodah, ki so opisane [Jaenisch et ai., Science, 240:1468-1474(1988)]. Konstrukt apliciramo v oplojeno jajce, ki ga dobimo po križanju med F1 oploditvijo C57BL/6J obfob X DBA križanjem. To križanje zahteva uporabo C57BL/6J ob/ob transplantata jajčnikov, da nastane F1 žival. DBA/2J miši uporabimo kot števni sev, ker imajo nonagouti barvo plašča, ki je pomembna v primeru uporabe transplantata jajčnika. Genotip na ob mestih v kosmidni transgeni živali lahko določimo s tipiziranjem živali, s tesno povezanimi RFLP ali mikrosateliti, ki preskočijo mutacijo in ki so polimorfne med predhodnimi sevi. Komplementacija bo pokazana na določenem konstruktu, ki nosi genetsko debelo F2 žival (določeno po RFLP analizi), normalno in brez sladkorne bolezni. Pod temi pogoji bo dokončna potrditev komplementarnosti zahtevala da oblob ali db/db, ki so transgene lahko oplodimo z ob/ob ali db/db transplantnati ovarijev. Pri tovrstnem križanju, bodo vse N2 živali, ki ne nosijo transgenov, debele in imele na insulin odporno sladkorno bolezen, medtem ko bodo tiste, ki nosijo transgen normalne in suhe, in bodo imele v plazmi normalno koncentracijo glukoze in insulina. V genetskem pomenu, transgen deluje kot supresor mutacije.
OB gen lahko preiskusimo tako, da testiramo njihove fenotipske učinke, ko izdelujemo komplementarno verigo v divjem tipu živali. S tem pristopom, je ekspresije alale divjega tipa zavirana, kar vodi do mutantskega fenotipa. RNK-RNK podvajaje (komplementarna-vzorčna) preprečuje normalno ravnanje z mRNK, kar vodi do delne ali popolne izločitve učinka gena divjega tipa. Ta tehniko je bila uporabljena, za inhibicijo TK sinteze v tkivni kulturi in za produkcijo fenotipov s Kruppel-ovo mutacijo v Drosophila in Shiverer-jevo mutacijo pri miših Izant et. ai., Celi, 36:1007-1015(1986); Katuski et ai., Science, 241:593-596(1988). Pomembna prednost tega pristopa je, da je samo majhen del gena potreben za ekspresijo učinkovite inhibicije ekspresije celotne sorodne mRNK.
Komplementarni transgen bo kontroliran z lastnim promotorjem ali promotorjem,ki je bil sintetiziran v ustreznem celičnem tipu in nameščen za SV40 polyA mestom. Ta transgen bomo uporabili za izdelavo transgenih miši. Transgene miši bomo oplodili z transplatati jajčnikov, da bi preiskusili ali so ob heterozigote občutljivejše na učinke komplementarnega konstrukta.
Dolgoročno je pojasnitev biokemične funkcije produkta OB gena (OB polipeptid ali protein) uporabna za identifikacijo agonistov z majhno molekulo in antagonistov, ki vplivajo na njihovo aktivnost.
Različni termini, ki jih uporabljamo v tem opisu bomo obrazložili v nadaljevanju.
Izraz modulator telesne teže, modulator, modulatorji in druge variante, ki tukaj niso posebaj naveden, so med seboj zamenljivi in so uporabljeni v predloženem izumu in zahtevkih ozirajoč se na oba nukleotida in na beljakovinski material, vključno s posamezni ali več proteini. Natančneje, prej omenjeni izrazi vključujejo tudi nukleotide in DNK, ki imajo sekvenco, ki je opisana tukaj in predstavljena na slikah 1A do E (SEQ ID NO:1) in slikah 2A in B (SEQ ID NO:3). Proteini, ki imajo aminokislinsko sekvenco opisano in predstavljeno na slikah 1A do E (SEQ ID NO:2) in sliki 3 (SEQ ID NO:4) in podobni pri katerih smo opazili profil aktivnosti, ki je nastavljen z upoštevanjem vseh materialov v opisu in zahtevkih. Nukleotidi, ki kažejo ekvivalentne ati spremenjene aktivnosti so pregledani, vključno z homolognimi analogi in alelnimi izvedenkami. Proteini, ki izkazujejo ekvivalenteno ali spremenjeno aktivnost, vključno s proteini, ki so spremenjeni nenamerno, kot na primer, mutageneza na mestu ali po nesreči mutacije v gostitelju, ki nato sintetizirajo modulatorje so tudi opaženi.
Mešanica, ki vsebuje A (kjer je A enojni protein, DNK molekula, vektor, rekombinantna gostiteljska celica, itd.) je popolnoma brez B (kjer B obsega enega ali več kontaminirajočih proteinov, DNK molekul, vektorjev itd, vendar brez racemne zmesi spojine a), kjer je najmanj 75 ut% proteinov, DNK, vektorjev (odvisno od kategorije vrste v katero sodita A in B) v mešanici A. Najbolj ugodno je da A vsebuje najmabj 90 ut% A+B vrst v mesnici, najbolje je da vsebuje 99 ut%. Zaželeno je, da je mešanica brez kontaminantov in vsebuje samo spojine z enako molekulsko maso, ki imajo aktivnost, ki je značilna za vrsto, ki nas zanima.
Izraz protein, ki navadno označuje polipeptid in polipeptid, ki v tem izumu pomeni tudi produkte ob gena in njihove izpeljanke. Izraz zrel protein ali zrel polipeptid se nanaša na produkt OB gena z odstranjeno signalno sekvenco (ali vezanim proteinskim faktorjem).
Kot je zgoraj napisano, v posebnem primeru ob polipeptidi, ki so predmet izuma vključujejo tiste polipeptide, ki imajo aminokislinsko sekvenco opisano pod SEQ ID NO;2, 4, 5„6 itd, vključno z ob polipeptidi, ki so spremenjeni z aminokislinsko zamenjavo, kot tudi biološko aktivni fragmenti, analogi in njigovi derivati. Izraz biološko aktiven v tem priemru uporabljamo za specifične učinke polipeptidov, vključno, kar pa ni omejujoče, za specifično vezavo t.j. na receptor, protitelo ali drugo razpoznavno molekulo; aktivacija signalne transdukcijske poti na molekularnem nivoju in/ali indukcija (ali inhibicija z antagonisti) fizioloških učinkov, ki jih vzpodbuja naravni ob polipeptid in vivo. OB polipeptidi, vključno s fragmenti, analogi in derivati, ki jih pripravimo sintezno, t.j. s tem, da uporabimo zelo poznano metodo za sintezo peptidov na trdni aii tekoči fazi. Bolj primerna je uporaba metode na trdnem nosilcu. OB polipeptide, ki so predmet izuma, lahko pripravimo tudi z zelo poznano tehniko genetskega inženiringa, kot je opisano infra. V drugem okviru, OB polipeptide lahko čistimo z imunoafinitetnim čiščenjem iz biološke tekočine, kot so, vendar to ni omejeno le na plazmo, serum ali urin, najbolje je humano plazmo, serum ali urin in bolj natančno iz osebkov, ki prekomerno sintetizirajo polipeptide, kot so debeli ljudje, ki trpijo zaradi mutacije OB receptorja ali debelosti, ki je povezana z zamaščenostjo.
Fragmenti OB polipeptida
V okviru predloženega izuma smo opazili, da so pomembni tudi fragmenti naravnega OB polipeptida. Sekvenca peptida vključuje številna mesta, ki so pogosto tarča proteolitske cepitve, t.j. argininski ostanek. Mogoče je, da je celoten polipeptid cepljen na enem ali več mestih in nastanejo biološko učinkoviti fragmenti. Taki biološko učinkoviti fragmenti lahko delujejo kot agonist aii antagonist OB polipeptida, ki zniža telesno težo.
Analogi OB oolioeotida
V predloženem izumu so navedeni tudi specifični analogi OB peptida, za katerega je značilno, da je sposoben biološke aktivnosti, ki je enaka aktivnosti OB polipeptida, t.j. vezava specifičnega vezalnega partnerja ob peptida, kot je OB receptor. Analog vzpodbuja OB aktivnost t.j. deluje podobno kot ob peotid. OB agonist je učinkovitejši kot naravni protein. Na primer, analog OB agonista se lahko veže na OB receptor z višjo afiniteto ali demonstrira daljšo razpolovno dobo in vivo, ali oboje. Obstajajo tudi analogi agonista OB peptida, ki so manj učinkoviti kot naravni proteini. V drugem primeru analog vzpodbuja OB aktivnost. Na primer, OB analog, ki se veže na OB receptor, ne vzpodbudi signalne transdukcije in lahko popolnoma inhibira vezavo naravnega OB na receptor, torej zmanjša OB aktivnost in vivo. Tak analog OB agonista lahko kaže drugačne lastnosti kot ob peptid, t.j. daljšo (ali krajšo) razpolovno dobo in vivo, večjo (ali manjšo) vezalno kapaciteto za OB receptor ali oboje.
Analog OB peptida je modificiran OB pepetid, tako da ima substituirano aminokislino na položaju v polipeptidu, ki ni esencialen za strukturo ali zgradbo. Na primer, od kar je znano, da je OB peptid biološko aktiven v miši, zamenjava divergentnih aminokislinskih ostankov v sekvenci humanega, če ga primerjamo z sekvenco aminokislin pri glodalcih, dobimo uporabne analoge OB peptida. Na primer, serinski ostanek na mestu 53 ali mestu 98 ali obeh (v nespremenjeni peptidni sekvenci prikazan na sliki 4) v humane peptidu lahko zamenjamo, t.j. z glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ali treoninom. Ker argininski ostanek na mestu 92 (slika 4) lahko zamenjamo t.j. z asparaginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminsko kilsino, aspartamsko kislino, serinom, treoninom, metioninom ali cisteinom. Glej sliko 4, druge aminokisline v humanem OB peptidu, ki jih lahko zamenjamo, so histidin na mesti 118, tritofan na mestu 121, alanin na položaju 122, glutaminska kislina na položaju 126, treonin na položaju 127, leucin na mestu 128, glicin na mestu 132, glicin na mestu 139, tritofan na mestu 159 in glicin na mestu 166. Lahko zamenjamo tudi enega ali več ostankov na mestu 121 do 128 (kot je prikazano na sliki 4), t.j. glicini ali alanini ali zamnejali nekatere izmed ostanokov z izjemo serina na položaju 123 ali levcina na položaju 125.
V drugem okviru, analog OB polipeptida, najbolje je humanega OB polipeptida, je skrajšana oblika polipeptida. Na primer, že prej je bilo opisano, da je glutaminski ostanek na mestu 49 ni bistven in ga lahko iz peptida spustimo. Podobno, lahko izpustimo nekatere ali vse divergentne aminokislinske ostanke na položajih 121 do 128. Dadatno, pregledane spojine v izumu lahko zagotovimo OB analog, ki ima munimalno aminokislinsko sekvenco, ki je potrebna za biološko aktivnost. To lahko enostavno določimo, t.j. s testiranjem aktivnosti fragmentov OB in njihovo sposobnost, da se vežejo na OB specifična protitelesa, ki inhibirajo aktivnost naravnega OB polipeptida ali pospešijo aktivnost naravnega OB peptida. V enem okviru, je v izumu skrajšan OB polipeptid, ki ima v strukturi zavoj, ki ga tvori disulfidna vez, ki nastane med dvema cisteinskima ostankoma na mestih 117 in 167 (kot je prikazano na sliki 4). V drugem okviru, skrajšan analog odgovarja aminokislinam iz ostanka 22 (ki sledi domnevnemu cepitvenemu mestu na peptidu) do 53 (aminokislinski ostanki, ki tvorijo gibljivo zanko, ki jo zasledimo z omejeno proteolizo, s masno spektometrično analizo OB polipeptida; glej Cohen et al., Protein Science, 4:1088(1995). V drugem okviru skrajšan analog ustreza aminokislinskim ostankom 61 (ostanek, ki sledi gibljivi zanki, ki smo jo zasledili z omejeno proteolizo/masna spekrtoskopska analiza OB polipeptida) do aminokislinskega ostanka 116 (ostanek, ki mu sledi prvi cisteinski ostanek). Še v drugem okviru izuma, skrajšani analog usteza aminokislinam iz ostanka 61 do aminokislinskega ostanka 167.
Nadalje, eden ali več ostankov domnevne gibljive zanke pri ostankih 54 do 60 so zamenjani. Na primer, eden ali več ostankov lahko zamenjamo z lizinom, glutaminsko kislino ali cisteinom (bolje z lizinom) zaradi prečne povezave), t.j. do polimera, ker so gibljive zankaste strukture primerno mesto za pripravo proteinskih derivatov. Ali drugače, ostanke na gibljivih zankah lahko zamenjamo z aminokislinskim ostankom, ki so odpornejši proti proteolizi, vendar je gibljiva struktura ohranjena t.j. z enim ali več prolini. Še v drugem okviru izuma smo opazili, da lahko zamenjamo aminokislinske ostanke, s tem pa nastanejo derivati, ki so bolj odporni na razgradnjo t.j. proteolizo.
Nekdo, ki je strokovanjak na tem področju, bo uvidel, da so velikosti fragmenta približne in da lahko vključimo enega do pet aminokislin ali jih tudi odstranimo iz vsakega konca ali iz notranjosti polipeptida ali njegovega fragmenta, omenjenih skrajšanih analogov z izjemo, da mora pri analogih z disulfidno vezjo, ki omogoča nastanek zavoja, le-ta biti ohranjena.
Ugotovljeno je bilo, da glodalski OB peptid vsebuje 50% α vijačnice in da humani OB polipeptid obsega približno 60% a- vijačnice, kot to zasledimo s krožnim dikroizmom rekombinantnega peptidov pod skoraj fiziološkimi pogoji. V skladu z drugim okvirom izuma, aminokislinske ostanke lahko zamenjamo z ostanki, in tako tvorimo drug analog OB polipeptida, ki izkazuje izboljšane lastnosti za tvorbo oziroma tvorijo stabilnejšo α vijačnico. Na primer, α vijačnica nastane, če uvedemo Glu, Ala, Leu, His ali Trp, kot zamenjava za aminokislinske ostanke, ki jih najdemo v naravni obliki OB polipeptida. Najbolje, je da uporabimo konservativne aminokislinske zamenjave, t.j. zamenjava aspartinske kislinske ostanke na mestih 29, 30, 44, 61, 76, 100 in/ali 106 (kot je prikazano na sliki 4) z glutaminsko kislino(ami) (Glu); zamenjava izolevcina(ov) z levcinom; zamenjava glicina ali valina ali katerekoli divergentne aminokisline z alaninom (t.j. serina na položaju 53 humanega OB polipeptida z alaninom), zamenjava arginina ali lizina z histidinom in zamenjava tirozina in/ali fenilalanina z triptofanom. Povečanje stopnje, ali kar je pomembneje, stabilnosti α-vijačnice, lahko pripravimo ONB analog z večjo aktivnostjo, povečanje vezalne affinitete ali daljše razpolovni čas. V specifičnem okviru, je tvorba vijačnice, na delu OB peptida, ki zajema aminokislinske ostanek od 22 do 53, povečana. V drugem okviru, je povečena tvorba vijačnice ali stabilnost aminokislinskih ostankov od 61 do 116. Povečana je zmožnost tvorbe vijačnice zankaste strukture z disulfidno vezjo, ki ga tvorijo aminokisline na mestih 117 do 167. Enako pregledani OB analogi kažejo povečano možnost nastanka α vijačnice ali stabilnost pri eni ali več sledečih dognanj. Nadalje, skrajšani OB polipeptidni analogi nastanejo tako, da vgradimo aminokislinske ostanek, ki omogočajo tvorbo strukture, t.j. avijačnice in tako kompenziramo večjo naklonjenost polipeptidnega fragmenta, da ima manj stabilno strukturo.
Analogi, taki kot so fragmenti, lahko pripravimo, na primer, z razgradnjo peptida, ki je modulator telesne teže, s pepsinom. Druge analoge, kot so muteini, lahko pripravimo s standardno mutegenezo, ki je usmerjena na mesto kodne sekvence peptidnega modulatorja telesne teže. Analogi, ki izkazujejo aktivnost modulatorja telesne teže, kot so majhne molekule, pa naj delujejo kot promotorji ali inhibitorji, lahko identificiramo s poznanim in vivo in/ali in vitro testom.
Majhni molekularni analogi in peptidomimetiki OB polipeptida
Zgradbo ob polipeptida, posebaj humanega OB polipeptida, lahko analiziramo z različnimi metodami, ki so poznani v stroki. Proteinska sekvenca je lahko okarakterizirana z analizo hidrofilnosti [t.j. Hopp et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA. 78:3824(1981)]. Profil hidrofilnosti lahko uporabimo za identifikacijo hidrofobnih in hidrofilnih področij OB polipeptida, ki lahko nakazujejo področja, skrita v notranjosti polipeptida in področja, ki so dostopna od zunaj. Z analizo sekundarne strukture [t.j. Chou ei al., Biochem., 13:222(1974)] lahko določimo mesta OB polipeptida, ki omogočajo specifično sekundarno strukturo. Manipulacija predvidene ali določene strukture, vključno s sekundarno strukturo, lahko potrdimo z uporabo računalniškega programa, ki je na voljo.
Z zagotovitvijo stalnega vira rekombinantnega OB polipeptida, v tem izumu, omogoča kvantitativno določitev strukture polipeptida. Natančneje, dovolj materiala za nuklearno magnetno resonanco (NMR), infrardečo (IR), Raman in ultravijolično (UV), posebno krožno dikroizno (CD), spektroskopsko analizo. Natančneje, NMR zagotavlja zelo močno strukturno analizo molekule v raztopini, ki je bolj natančen posnetek obnašanja v naravnem okolju [Marion et.al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 113:967-974 (1983); Bar ef al., J. Magn. Reson., 65:355-360(1985); Kimura et al., Proč. Natl. Sci. USA, 77:1681-1785(1980)]. Uporabimo lahko tudi druge metode, s katerimi analiziramo strukturo. Te obsegajo, to sevedea ni omejitev, kristalografijo z X žarki [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11;7-13(1974)].
Analoge OB polipeptida lahko preiskusimo tako, da določimo ali navzkrižno reagirajo s protitelesi, ki so specifični za OB polipeptid ali njegove specifične fragmente. Stopnja nazkrižne reaktivnosti daje informacijo o strukturni homolognosti ali podobnosti proteinov ali dostopnosti do področij, ki odgovarjajo delno poUpeptidu, ki je bil uporabljen, za tvorbo specifičnih protiteles proti fragmentom.
Seianje(screenina) OB analogov
Poznane so različne sejalne tehnike za pregledovanje analogov polipeptidov. Na voljo so različne knjižnice kemičnih spojin. V okviru predloženega izuma smo pregledali take knjižnice, t.j. knjižnice sinteznih spojin, ki so nastala tekom let v številnih raziskavah, knjižnice naravnih spojin in kombinatorične knjižnice, ki so v nadaljevanju tudi podrobneje opisane, infra, za analoge OB polipeptidov. V okviru predloženege izuma smo pregledali take knjižnice, da bi našli spojine, ki se vežejo na anti OB polipeptidna protitelesa, najbolje protihumana ob polipeptidna protitelesa. Z drugega vidika, ko je bi OB receptor identificiran (glej infra) se lahko uporabi katerakoli sejalna tehnika, da najdemo agonista ali antagonista OB receptorja. V predloženem izumu smo iskali ligande z majhno molekulo aii njihove analoge, kot tudi naravne ligande, ki se vežejo nanj in vzpodbujajo ali antagonizirajo aktivacijo OB receptorja in vivo.
Poznavanje primarne sekvence receptorja in podobnosti te sekvence s proteini z znano funkcijo, lahko zagotovi začetno točko tako agonistov kot antagonistov. Identifikacija in sejanje antagonistov nadalje vzpodbujamo z določitvijo stuktumih posebnosti proteina t.j. z uporabao kristalografije z X žarki, nevtronsko difrakcijo, nukelarno magnetno resonančno spektrometrijo in drugimi metodami za določevanje strukture. Te metode omogočajo racionalen pristop k načrtovanju in identifikaciji agonistov in antagonistov.
Drugi pristop je uporaba rekombinantnih bakteriofagov, ki producirajo velike knjižnice. Z uporabo 'fagne metode [Scott ef a/., Science, 249:386390(1990); Cwirla et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382(1990); Devlin et al., Science, 249:404-406(1990)] lahko pripravimo zelo obsežne knjižnice (106 -108 kemijskih enot). Drugi pristop primarno uporablja kemične metode, od katerih je Geysen-ova metoda [Geysen et al., Molecular lmmunology, 23:709-715(1986); Geysen et al., J. immunologic Method, 102:259-274(1987)] in novejše metode po Fedorju in sodelavcih, ki je bila opisana v Science, 251:767-773(1991) so le primeri. Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013; Furka. Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493(1991)]; Houghton (U.S. Patent No. 4,634,211 izdan v decembru 1986) in Rutter et al., (U.S. Patent No. 5,010,175. izdan v aprilu 1991) so opisane metode za proizvodnjo mešanice peptidov, ki jih lahko preiskusimo kot agoniste ali antagoniste.
Sintetične knjižnice [Needels ef al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704(1993); Lam ef al., International Patent Publication No. VV092/00252, vsak je vključen z referencami v celoti], in podobne so lahko uporabljene za iskanje ligandov OB receptorja, ki je predmet predloženega izuma. S takimi knjižnicami, lahko zasledimo antagonist receptorja z uporabo celic, ki proizvajajo receptor brez dejanskega kloniranja OB receptorja.
Kot alternativo lahko uporabimo teste za vezavo topnih ligandov na celice, ki sintetizirajo rekombinantne oblike in vezavo lahko tudi izvedemo. Topne ligand lahko pripravimo kot rekombinantni ali sintezni OB poiipetid.
Pregled lahko izvedemo z rekombinantnimi celicami, ki proizvajajo OB receptor ali drugače, z uporabo prečiščenih receptorskih proteinov, t.j. ki so produkt rekombinacije, kot je opisano zgoraj. Na primer, sposobnost označenega, topnega ali solubiliziranega OB receptorja, ki vključuje del molekule, ki veže ligand, vezan ligand lahko uporabimo za pregled knjižnic, kot je opisano v zgoraj navedenih referencah.
Derivati OB oolioeotidov
Na splošno, lahko iz opisanih proteinov (v tem primeru izraz proteini vključuje tudi polipeptide, če ni drugače navedeno) pripravimo derivate z vezavo ene ali več kemijskih spojin na proteinski del. Kemijsko modificirane derivate lahko kasneje vgradimo v pripravek za intraarterialno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, intravenozno, oralno, nazalno, rektatno, sublingvalno, pulmonarno, topikalno, transdermalno ali drugačno aplikacijo. Po kemijski modifikaciji biološko aktivnih proteinov so ugotovili še dodatne prednosti pod določenimi pogoji, kot so povečanje stabilnosti in krožeči čas terapevtskega proteina ter zmanjšano imunogenost. Glej U.S Patent No. 4,179,337 avtorja Davis in sodelavcev, ki je bil izdan 18. decembra 1979. Za pregled, glej Abuchowski ef a/., Soluble PolymerEnzyme Adducts v Enzymes as Drugs, str. 367-383., Holcenberg and Roberts, ured. Wiley-lnterscience, New York, NY, (1981). V preglednem članku so opisane modifikacije proteinov in fuzijski proteini avtorja Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10(1992).
Priprava kemijskih derivatov
Kemijske spojine, ki so primerne za derivatizacijo, lahko izberemo med vodotopnimi polimeri. Izbrani polimer mora biti vodotopen, tako da proteini, na katere jih pripnemo, v vodnem okolju, kot so fiziološki pogoji, ne precipitirajo. Najbolje je, zaradi uporabe končnega zdravilnega pripravka v terapevtske namene, farmacevtsko sprejemljiv. Strokovnjak s tega področja bo izbral ustrezen polimer, po takih kriterijih, da bo konjugat polimer/protein uporaben v terapevtske namene in seveda bo temu primerno izbral tudi želen odmerek, čas kroženja v plazmi, odpornost na proteolizo in druge lastnosti. Za proteine in peptide, ki so predmet izuma, lahko uporabimo teste, ki so navedeni v izumu.
Vodotopne polimere lahko izberemo iz skupine, v katero sodijo na primer, polietilenglikol, kopolimer etilen/propilenglikol, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinilalkohol, polivinilpirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6trioksan, etilen/malein anhidrid kopolimer, poliaminokisline (ali kot homopolimere ali naključni kopolimeri) in dekstrani ali poli(nvinilpirolidon)polietilen glikol, propilenglikol homopolimeri, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimer, polioksetilirani polioli in polivinil alkohol. Polietilen glikoli propionaldehid ima določene prednosti pri izdelavi, zaradi svoje stabilnosti v vodi.
Polimeri imajo katerokoli molekulsko maso, o lahko razvejani ali nerazvejani. Za polietilenglikol je najprimernejša molekulska masa med približno 2 kDa in približno 100 kDa (izraz približno kaže, da imajo pri uporabi polietilenglikola nekatere molekule večjo, nekatere pa manjšo molekulsko maso) kar olajšuje rokovanje in izdelavo. Lahko uporabimo tudi večje polimere, odvisno od terapevtskega profila, ki ga želimo (t.j. trajanje podaljšanega sproščanja, učinek, če je biološka aktivnost, lahkota uporavljanja, stopnja ali pomanjkanje antigenosti in drugi poznani učinki polietilenglikola na terapevtski protein ali analog).
Razmerje polimer/protein
Število tako pripetih molekul polimera se lahko spreminja, strokovnjak na tem področju pa bo sposoben oceniti morebitne učinke na funkcijo. Nekateri so lahko mono derivatizirani ali pa so di-, tri-, tetra- ali nekatere kombinacije derivatizacije, z enakim ali različnimi kemičnimi spojinami (t.j. polimeri kot so polietilenglikoli z različno molekulsko maso). Delež polimerne molekule glede na proteinsko (ali peptidno molekulo) je lahko različen, kot se spreminja tudi njihova koncentracija v reakcijski zmesi. Na splošno, optimalno razmerje (kar se tiče učinkovitosti reakcije je tako, da ni presežka nezreagiranih proteinov ali polimera) bo določeno s faktorji, kot so želena stopnja derivatizacije (t.j. mono, di-, tri-, itd.), molekulska masa izbranega proteina ali je polimer razvejan ali nerazvejan in reakcijski pogoji.
Pripenjanje kemične soožine na protein
Polietilenglikolne molekule (ali druge kemijske spojine) morajo biti pripete na protein, z upoštevanjem učinkov na funkcijo ali antigene lastnosti proteina. Poznane so številne metode pripenjanja, poznane strokovnjakom, t.j. EP 0 401 384 tukaj omenjen z referenco (povezovanje PEG na G-CSF). Glej tudi Malik ei a/., Exp. Hematol., 20:1029-1035(1992) (opisana vezava poletilenglikola na GM-CSF z uporabo tresilklorida). Na primer, polietilenglikol lahko kovalentno povežemo na aminokislinski ostanek preko reaktivne skupine, kot so proste amino ali karboksilne skupine. Reaktivne skupine so tiste, na katere lahko vežemo aktivirane molekule poletilenglikola. Aminokislinski ostanki imajo prosto aminoskupino ki je lahko v lizinskem ostanku in N-terminalni aminokislinski ostanki, ki imajo proste karboksline skupine, vključno z aspartamskim kislinskim ostankom, ostankom glutaminske kisline in C-terminalnimi aminokislinskimi ostanki. Sulfhidrilne skupine lahko uporabimo kot reaktivne skupine, za pripenjanje molekul polietilenglikola. Najustreznejši za terapevtsko uporabo je pripenjanje aminoskupine, kot je pripenjanje na N-terminus ali lizinsko skupino. Pripenjanju na ostanke, ki so pomembni za vezavo na receptor, se moramo izogniti, če hočemo da pride do vezave na receptor.
N-terminalno modificirani proteini
Če želimo lahko pripravimo N-terminalno kemijsko modificiran protein. Z uporabo polietilenglikola, kot ilustracije predložene sestave, lahko izbiramo med polietilenglikolnimi molekulami (po molekulski masi, razvejanosti itd.) delež polietilenskih molekul glede na proteinsko (ali peptidno) molekulo v reakcijski zmesi, vrsto reakcij s PEG, ki jo želimo izvesti in metodo, da dobimo na N konec peptida vezan PEG. Metoda za pripravo z vezanim PEG na N-koncu (t.j. ločevanje te spojine od drugih z mono-PEG spojino, če je potrebno) lahko s čiščenjem N-terminalno veznega PEG iz populacije proteinskih molekul z vezanim PEG. Selektivna kemijska modifikacija Nkonca lahko spremlja reduktivna alkilacija, ki izrablja reaktivnost različnih tipov primarnih aminoskupin (lizin proti N-koncem), ki so na voljo za pripravo derivata določenega proteina. Pod ustreznimi reakcijskimi pogoji dosežemo selektivno derivatizacijo proteina na N-koncu s karbonilno skupino, ki ima vezan polimer. Na primer, na en N-konec proteina se lahko selektivno veže PEG tako, da izvedemo reakcijo pri pH, ki dovoljuje, da izkoristimo prednost pK, razlike med ε-aminoskupinami na lizinskem ostanku in temi na α-amino skupinami na N-koncu ostanka proteina. S tako selektivno derivatizacijo je pripenjanje vodotopnega polimera na protein kontrolirano; konjugacija s polimerom je prednostna na N-koncu proteina in ni značilne modifikacije drugih reaktivnih skupin, kot so lizinska amino skupina na stranski verigi. Z uporabo reduktivne alkilacije so vodotopni polimeri lahko tipa, ki je opisna zgoraj, in mora imeti eno samo reaktivno aldehidno skupino, za vezavo s proteinom. Polietilenglikol propionaldehid ima samo eno uporabno reaktivno aldehidno skupino.
Nukleinske kisline povezane z OB Dolioeotidom
Kot je bilo že predhodno napisano, je predloženi izum usmerjen predvsem na nukleinske kilsine, ki nosijo kodni zapis za ob polipeptid, kot tudi pripadajoče genomske nekodirajoče sekvence 5’, 3’ in intron OB gena. Torej je v skladu s predloženim izumom vanj vključena tudi konvencionalna molekularna biologija, mikrobiologija in rekombinantne DNK tehnike. Te tehnike so v literaturi podrobno opisne. Glej Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, druga izdaja, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989): Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, volumen I in II, MRL Press LTD., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames st al., eds. Transcription And Translation, Oxford Universitiy Press (1984); Freshney ed., Animal Celi Culture, Oxford University Press (1986)]; Immobilized Celiš And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New york (1984). Določen pomen v predloženem izumu igrajo tudi strategije za izolacijo, kloniranje, določanje sekvence, analiziranje in določevanje gena ali nukleinske kisline, ki temelji na dobro poznani metodi verižne reakcije s polimerazo (PCR).
Replikon je katerikoli genetski element (t.j. plazmid, kromosom, virus) ki deluje kot samostojna enota DNK replikacije In vivo, t.j. ima lasten nadzor nad replikacijo.
Vektor41 je replikon, kot je plazmid, fag ali kozmid, v katerega lahko vgradimo drugo DNK in pride do replikacije (podvojevanja) pripetega segmenta.
Kaseta se nanaša na del DNK, ki ga vstavimo v vektor na specifičnem mestu. Del DNK nosi zapis za polipeptide, ki nas zanimajo, kasetna in restrikcijska mesta so oblikovana tako, da zagotavljajo vstavljanje kasete v ustrezen okvir za transkripcijo in translacijo.
Heterologna DNK je DNK, ki se normalno ne nahaja v celici ali na kromosomskem mestu celice. Najustrezneje je, da heterogena DNK vključuje gen, ki je celici tuj.
Celica je transficirana z eksogeno ali heterologno DNK, ko je le-ta vstavljena v notranjost celice. Celica je bila transformirana z eksogena ali heterologna DNK, ko učinki transficirane DNK sprožijo fenotipske spremembe. Najustrezneje je, da je transformirajoča DNK vgrajena (kovalentno povezana) v kromosomsko DNK in tvori genom celice.
Klon je populacije celic, ki jih dobimo iz ene celice ali navadno iz prednika, z mitozo.
Molekula nukleinske kisline se nanaša na ribonukleozid v obliki fosfatnega estra (adenozin, gvanozin, uridin ali citidin; RNK molekula) ali deoksiribonukleozid (deoksiadenozin, deoksigvanozin, deoksitimidin ali deoksicitidin; DNK molekule), kot enojna vijačnica ali dvojna vijačnica. Možne so dvojna DNK-DNK, DNK-RNK in RNK-RNK vijačnice. Izraz molekula nukleinske kisline, natančneje DNK in RNK molekule, se nanaša le na primarno in sekundarno strukturo molekule in ne predstavlja omejite za nobeno terciarno ali kvarterno obliko. Torej ta izraz vključuje dvojo verigo DNK, inter alia, v krožni ali DNK molekulah (t.j. restrikcijski fragmenti), plazmidih in kromosomih. Ko govorimo o zgradba določene dvojne verige DNK moleule, sekvenco lahko opišemo tukaj, glede na normalen dogovor podajanja samo sekvence v smeri od 5’ do 3’ vzdolž ne prepisane DNK (t.j. veriga, ki ima sekvenco homologno mRNK). Rekombinantna DNK molekula je DNK molekula ki je bila podvržena molekularni biološki manupulaciji.
Molekula nukleinske kisline je na voljo za hibridizacijo drugi molekuli nukleinske kisline, kot so cDNK, genomska DNK ali RNK, ko ima molekula nukleinske kisline obliko enojne verige in se, pod določenimi pogoji, kot so temperatura in ionska moč raztopine (glej Sambrook et al.r 1989, supra), lahko spremeni v drugačno molekulo nukleinske kisline. Pogoja, kot sta temperatura in ionska moč, določata ostrost' hibridizacije. Za prelimini pregled homolognih nukleinskih kislin, blagi pogoji za ostrost hibridizacije pomenijo: Tm 55°C lahko uporabimo t.j. 5 x SSC, 0.1% SDS, 0.25% mleka in nič formamida ali 30% formamida, 5X SSc, 0.5% SDS). Zmerno ostri hibridizacijski pogoji pomenijo višja Tm, t.j. 40% formamida, s 5x ali 6x SCC. Zelo ostri hibridizacijski pogoji pomenijoa najvišja Tm t.j. 50% formamida, 5x ali 6x SCC. Hibridizacija zahtava, da imata dve nukleinski kislini komplementarni sekvenici, čeprav je odvisno od ostrosti hibridizacije, je mogžno tudi, da se baze ne ujemajo. Ustrezna ostrost hibridizacije nukleinskih kislin je odvisna od dolžine nukleinskih kislin in stopnje dopolnjevanja, dve spremenljivki, ki sta v stroki dobro znani. Večja stopnja podobnosti ali homologije med dvema nukleotidnima sekvencama, večja je vrednost za Tm za hibride z nukleinskimi kislinami, ki imajo te sekvence. Relativna stabilnost (pri višji hibridizacije nukleinske kisline pada v sledečem zaporedju: RNK:RNK, DNK:RNK, DNK:DNK. Za hibride, z več kot 100 nukleotidi v dolžino, so izpeljali enačbo za izračun Tm (glej Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-0.51). Za hibridizacijo z manjšim številom nukleinskih kislin t.j. oligonukleotidi, mesto neujemanja postane bolj pomembno, saj dolžina oligonukleotida določa njegovo specifičnost (glej Sambrook et al., 1989, supra, 11.7-11-8). Najprimernejša dolžina za nukleinsko kislino, ki jo hibridiziramo, je najmanj 10 nukleotidov; najbolje je najmanj 15 nukleotidov, še primernejša je dolžina s približno najmanj 20 nukleotidi.
Homologna rekombinacija pomeni, da vstavimo sekvenco tuje DNK sekvenco vektorja v kromosom. Najprimerneje je vektorski cilj na specifičnem kromosomskem mestu za homologno rekombinacijo. Za specifično homologno rekombinacijo bo vektor imel dovolj dolg del homologne sekvence kormosoma, da je omogočena komplmentarna vezava in vključitev vektorja v kromosom. Daljše je področje homolognosti in večja je stopnja podobnosti sekvence bolj učinkovita je homologna rekombinacija.
DNK kodna sekvenca je sekvenca dvojne verige DNK, ki se najprej prepiše in nato prevede v polipeptid v celici /ri vitro ali in vivo, če so pod kontrolo ustrezne regulatome sekvence. Meje kodne sekvence so določene z začetnim kodonom na 5’ (amino) repu in translacijskim stop kodonom, na 3’ (karboksilnem) repu. Kodna sekvenca lahko vključuje, vendar to ni omejeno, prokariontsko sekvenco, cDNK iz evkariontske celice mRNK, genomska DNK sekvenco iz evkariontske (t.j. sesalske) DNK in celo sintetska DNK sekvenco. Če je kodna sekvenca namenjena ekspresiji v evkariontski celici, se signal za poliadenilacijo in sekvenca za zaključek transkripcijo navadno nahaja na 3’ glede na kodno sekvenco.
Izolacija OB kodne in komplementarne sekvence
Nukleinske kisline, ki smo jih opisali v predloženem izumu, se raztezajo kot je bilo že opisano, do druge nukleinske kisline, ki kodirajo sintezo peptidov prikazanih na sliki 1A do D (SEQ ID NO:2), sliki 3 (SEQ ID NO:4), sliki 5 (SEQ ID NO;5) in sliki 6 (SEQ ID NO:6). Po izolaciji specifične DNK in določitvi sekvence v povezavi z ob genom, lahko vsaka živalska celica predstavlja potencialni vir nukleinske kisline za molekularno kloniranje gena, ki nosi zapis za peptide, ki so predmet izuma. DNK lahko pridobimo, s poznanimi standardnimi tehnikami, iz klonirane DNK (t.j. DNK knjižnice) s kemijsko sintezo, s kloniranje cDNK ali s kloniranjem genomske DNK ali njenih fragmentov, ki jih dobimo s čiščenjem iz želene celice (glej na primer, Sambrook et al., 1989, supra, Glover, 1985, supra). Kloni, ki jih dobimo iz genomske DNK, lahko vsebujejo regulatorno in intronsko področje DNK poleg kodnega področja, kloni, pridobljeni iz cDNK, nimajo sekvence introna. Ne glede na vir, mora biti gen molekularno kloniran v primeren vektor, da pride do propagacije gena.
Pri molekularnem kloniranju gena iz genomske DNK, genomsko DNK lahko pomnožimo s šablonami, izbranimi iz sekvenc cDNK. Ali drugače, pripravimo DNK fragmente in nekateri izmed njih nosijo kodni zapis za želeni gen. DNK lahko cepimo na specifičnih mestih z različnimi restrikcijskimi encimi. Lahko uporabimo DNaze v prisotnosti mangana, ki fragmentira DNK ali DNK lahko fizikalno delimo, kot na primer, s sonikacijo. Linearni DNK fragmente nato lahko ločujemo glede na velikost s stardadnimi tehnikami, vključno, in ne samo temi, agarozno in poliakrilamidno gelsko elektroforezo in kolonsko kromatografijo.
Ko so fragmenti pripravljeni, lahko izvedemo identifikacijo specifičnega DNK fragmenta, ki ima želeni ob ali ob podoben gen na več načinov. Na primer, če je na voljo večja količina ob ali ob podobnega gena ali njegova specifična RNK ali njegov fragment, in ga lahko očistimo in označimo pripravljeni DNK fragment pregledao s hibridizacijo nukleinske kisline z označeno sondo [Benton et al., Science, 196:180(1977); Grunstein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 72:3961(1975)]. V predloženem izumu so opisane take nukleinsko kislinske sonde, ki jih lahko pripravimo na konvencialne način, iz specifičnih sekvenc, ki so tukaj opisane, t.j. hibridizirane sonde, ki imajo zaporednje nukleotidov, ki odgovarja fragmentu z najmanj 10 in še bolje 15 nukleotidi, s sekvenco, ki je predstavljena na sliki 1A do E (SEQ ID NOJ) ali sliki 2A in B (SEQ ID NO:3). Izbrani fragment je visoko selektiven za modulatorni peptid, ki je predmet izuma. Hibridizirali bomo te DNK fragmente, ki imajo precej homologije s sondo. Kot je že zgoraj napisano, večja je stopnja homologije bolj ostre pogoje hibridizacije lahko uporabimo. V enem okviru izuma, blage pogoje pri hibridizaciji uporabimo za identifikacijo homolognega peptidnega modulatorja. Vendar je bolj primernejše, kot je tukaj ponazorjeno tudi eksperimentalno, da nukleinsko kislino, ki nosi kodni zapis za modulatorni peptid, ki je predmet izuma, hibridiziramo v nukleinsko kislino z nukeiotidno sekvenco, ki so navedene na sliki 1A do E (SEQ ID NO:1) ali sliki 2A in B (SEQ ID NO:3) ali njegov hibridizirajoči fragment, pod zmerno ostrimi pogoji, še bolje je, da hibridizirajo pod zelo ostrimi pogoji.
Prisotnost gena lahko zaslednimo s testi, ki izkoriščajo fizikalne, kemijske ali imunološke lastnosti ekspresiranih produktov. Na primer, cDNK kloni aii DNK kloni, katerih s hibridom izbrane ustrezne mRNK, so lahko izbrani glede na protein, ki ga izločajo, to je imajo podobne ali idnetično migracijo na elektroforezi, izoelektrično obnašanje, podobna cepitvena sliko, tirozinfosfatazno aktivnost ali antigenske lastnosti, kot jih poznamo pri dosedanjih modulatornih peptidih. Na primer, protitelesa, ki so predmet predloženega izuma, so primerni za ločevanje modulatornih peptidov od drugih virov.
Gen, ki kodira medulatorni peptid, ki je predmet izuma, lahko identificiramo s selekcijo mRNK, t.j. s hibridizacijo nukleinske kisline, ki ji sledi in vitro translacija. V tem postopku za izolacijo komplementarnih mRNK uporabimo hibridizacijo. Taki DNK fragmenti lahko predstavljajo dostopen, očiščen modulator DNK. Imunoprecipitacijska analiza ali funkcijski testi (t.j. tirozinfosfatazna aktivnost) in vitro translacijskega produkta produktov izoliranih mRNK identificirajo mRNK in zato imajo komplementarni DNK fragmenti želeno sekvenco. Specifične mRNK lahko izberemo z adsorpcijo polisomov, izoliranih iz celic, na imobilizirane protitelesa, ki so usmerjena specifično proti modulatornemu peptidu.
Radioaktivno označeno cDNK modulatornega peptida lahko sintetiziramo z uporabo mRNK (iz adsorbiranih polisomov) kot šablono.
Radioaktivno označeno mRNK ali cDNK lahko uporabimo kot sondo, za identifikacijo homolognih modulatornih peptidnih DNK fragmentov od drugih fragmentov genomske DNK.
Kot je že prej omenjeno, je primernejša sintezna priprava DNK sekvenca z zapisom za peptid modulatorja teže, ki je opisan v tem izmumu od kloniranja. DNK sekvenco lahko oblikujemo z ustreznimi kodoni za aminokislinsko sekvenco modulatorni peptid, ki uravnava težo. Na splošno, izberemo ustrezne kodone, če uporabimo sekvenco za ekspresijo v izbranem gostitelju. Celotno sekvenco izberemo iz prekrivajočih se oligonukleotidov s standardnimi metodami in iz tega sestavimo celotno kodno sekvenco. Glej Edge, Nature, 292:756(1981); Nambair et al., Science, 223: 1299(1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6344(1984).
Sintetična DNK sekvenca omogoča ustrezno izgradnjo genov, ki ekspresirajo analoge modulatorjev teže, kot je opisano zgoraj. Ali tudi drugače, DNK, s kodnim zapisom za analoge lahko pripravimo s na mesto usmerjeno mutagenezo naravnega OB gena ali cDNK tako so lahko analogi pripravljeni neposredno z uporabo konvencionalno sintezo polipeptidov.
Splošna metoda za vključevanje nenaravnih aminokislin na specifično mesto v protein, je opisal Noren skupaj s sodelavci v Science, 244:182188(1989). To metodo lahko uporabimo za pripravo analogov ob polipeptida z nenaravnim aminokislinami.
Nekodiraioče aminokisline
Predloženi izum se nanaša tudi na pripravo komplementarnih nukleotidov in ribozimov, ki se lahko vmešajo v ekspresijo proteinskih modulatorjev telesne teže na translacijskem nivoju. Ta pristop zahteva komplementarno nukleinsko kislino in ribozimov za ustavitev translacije specifične mRNK ali z maskiranjem mRNK s komplementarno nukleinsko kislino ali cepitvijo ribozima.
Komplementarne nukleinske kisline so molekule DNK ali RNK, ki se ujemajo z najmanj delom specifične mRNK molekule (glej VVeintraub, Sci. Am.,262:40-46(1990); Marcus-Sekura. Anal. biochem., 172:289-295(1988). V celici, le-te hibridizirajo v mRNK, ki tvorijo dvojno vijačnico. V celici ne poteka translacija mRNK, ki je vključena v to dvojno verigo. Torej se komplementarna nukleinska kislina vmeša v ekspresijo mRNK v protein. Oligomeri s približno petnajstimi nukleotidi in molekulami, ki hibridizirajo v
AUG začetni kodon bodo posebaj učinkoviti, saj jih enostavno sintetiziramo in povročajo manj problemov kot velike molekule, ko jih vnesemo v celico, ki proizvaja peptidni modulator telesne teže. Antisense metodo (metoda priprave komplementarne verige) smo uporabili za inhibicijo ekspresije številnih genov in vitro [Marcus-Sekura, 1988 supra; Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245(1988)].
Ribozimi so molekule RNK, ki imajo sposobnost specifične cepitve drugih enojnih molekul RNK v smislu enakega delovanja kot DNK restrikcijska endonukleaza. Ribozome so odkrili pri ugotovitvi, da imajo določene mRNK sposobnost odstraniti lastne introne. Z modificiranjem nukleotidne sekvence teh RNK so bili raziskovalci sposobni pripraviti molekule, ki prepoznajo specifično nukleotidno sekvenco v RNK molekuli in jih cepiti [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034(1988)]. Ker so specifične, kar se tiče sekvence, so inaktivirane samo mRNK z določeno sekvenco.
Raziskovalci so identificirali dva tipa ribozimov. Tetrahymena tip in hammerhead (nakovalo) tip. Ribosom tipa Tetrahymena spoznajo štiribazne sekvence, medtem ko, ribozimi tipa nakovalo prepoznajo enajst do osemnajst bazne sekvence. Daljša je sekvenca, ki jo prepoznajo, večja verjetnost je, da se bo to zgodilo v tarčni mRNK vrsti. Torej je ribozim tipa nakovalo ustreznejši od tetrahymena tipa za inaktivacijo specifičnih vrst mRNK in sekvence z osemnajstimi bazami so primernejše od krajših sekvenc.
Tukaj opisane sekvence DNK, lahko uporabimo za pripravo komplementarnih molekul proti in ribozimov, ki cepijo mRNK za proteinske modulatorje telesne teže in njihove ligande, ki inhibirajo ekspresijo ob gena, kar vodi do povečanja telesne teže in tolstosti.
V tem izumom so opisani tudi kratki oligonukleotidi, komplementarni kodirajočim in komplementarnim verigam OB nukleinske kisline aii nekodirajočim področjem OB gena 5’, 3’ ali znotraj (intronično) kodirajočega področja. Take nukleinske kisline so uporabne kot sonde, ali neposredno označene oligonukleidne sonde ali kot osnovna veriga za polimerazno verižno reakcijo, za določevanje prisotnosti mutacij v ob genu ali velikost ekspresije OB mRNK. Najustrezneje je, da so nekodirajoče nukleinske kisline, ki so predmet izuma iz humanega OB gena.
Nekodirajoče nukleinske kisline namenjene homologni rekombinaciji za integracijo pomnoževanega gena in/ali drugih regulatornih sekvenc približek OB genu., t.j. zagotavljajo višjo ekspresije OB polipeptida ali presežejo mutacije v regulatorni sekvenci ob gena, ki preprečuje pravilen nivo ekspresije OB polipeptida (glej International Patant Publication WO 91/06666, ki ga je objavil 16. maja 1991 Skoultchi; International Patent Publication No. WO 91/09955, ki ga je objavlil 11. julija 1991 Chapel; glej tudi International Patent publication No. WO 90/14092, ki sta ga 29. novembra 1990 objavila Kucherlapati in Campbell).
Produkcija OB polipeptida: ekspresija in sinteza
Transkripcijske in translacijske kontrolne sekvence so DNK regulatorne sekvence, kot so promotorji, pospeševalci, terminatorji in podobni, ki zagotavljajo ekspresijo kodirajoče sekvence v gostiteljski celici. V evkariontskih celicah so poliadenilacijski sigana kontrolne sekvence.
Kodirajoča sekvenca je pod kontrolo transkripcijskih in translacijskih kontrolnih sekvenc v celici, ko RNK polimeraza prepisuje kodirajočo sekvenco v mRNK, ki je nato prepisna v ocepljeno trans-RNK in translatirana v protein, ki ga kodira kodna sekvenca.
Signalna sekvenca je vključena na začetek kodne sekvence proteina, ki naj bi se sintetiziral na površini celice. Ta sekvenca kodira signalni peptid, ki je na N-repu zrelega polipeptida, ki usmerja gostiteljsko celico, da translocira polipeptida. Izraz translokacijska signalna sekvenca tukaj uporabimo za poimenovanje tovrstne signalne sekvence. Translokacijska signalna sekvenca je povezana s številnimi proteini ki so naravno prisotni v evkariontih in prokariontih in so pogosto funkcionalni v obeh tipih organizmov.
DNK sekvenca je operativno povezana z ekspresijsko kontrolno sekvenco, ko ekspresijska kontrolna sekvenca kontrolira in uravnava transkripcijo in translacijo DNK sekvence. Izraz operativno povezana pomeni tudi, da ima ustrezen startni signal (t.j. ATG) pred DNK sekvenco, ki se bo ekspresirala in vzdržuje pravilni bralni okvir, ki dovoljuje ekspresijo DNK sekvence pod kontrolo ekspresijske kontrolne sekvence in produkcije želenih produktov, ki jih kodira DNK sekvenca. Če je gen, ki ga želi nekdo vključiti v rekombinantno DNK molekulo, ne vsebuje ustereznega startnega signala je tak startni signal vključen na začetnem (5’) repu in bralnem okviru z genom.
Promotorska sekvenca je regulatorno področje DNK sposobna vezave RNK polimeraze v celici in začetne transkripcije končne (3’ smeri) kodirajoče sekvence. Za namene definiranja predloženega izuma, je promotorska sekvenca vezana na njegov 3’ rep na začetnem transkripcijskem mestu in se razteza po verigi (v smeri 5’) in vključuje minimalno število baz ali elementov, potrebnih za začetek transkrpicije na nivoju, ki ga zasledimo nad osnovo. Znotraj promotorske sekvence se nahaja transkripcijski inicjacijsko mesto (navadno definiran na primer z določevanjem lokacije z nukleazo S1), kot tudi vezava proteinov (soglasne sekvence), ki so odgovorne za vezavo RNK polimeraz.
Druga značilnost predloženega izuma je ekspresija DNK sekvnce, ki je tukaj opisana. Kot je v strokovnih krogih dobro poznano, so lahko DNK sekvence ekspresirane z njihovo operativno vezavo na ekspresijsko kontrolno sekvenco, v ustrezen ekspresijski vektor, uporaba le-tega za transformacijo ustreznega enoceličnega gostitelja.
Tako operativno pripenjanje DNK sekvence, ki je predmet tega izuma, na ekspresijsko kontrolno sekvenco vključuje, če ni že del DNK sekvence, pripenjanje začetnega kodona, ATG, v pravilni bralni okvir po verigi DNK sekvence.
Veliko število kombinacij gostitelj/ekspresijski vektor lahko uporabimo v DNK sekvencah, ki so predmet tega izuma. Uporabni ekspresijski vektorji, na primer, lahko obsegajo segmente kormosomskih, nekromosomskih in sintetskih DNK sekvenc. Ustrezni vektorji vključujejo derivate SV40 in poznane bakterijske plazmide, t.j. plazmide E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC ali pUC plazmidne derivate, t.j. pGEX vektorji, pET vektorji, pmal-c, pFLAG, itd. in njihove derivate, plazmidi, kot so RP4; fagi DNK, t.j. številni derivati faga λ, t.j. NM989 in drugi fagi DNK t.j. M13 in filamentna enojna veriga fagna DNK; plazmid kvasovk, kot je 2μ plazmidi ali njihovi derivati; vektorji uporabni v evkariontskih celicah, kot so vektorji, ki so uporabni v celicah insektov in sesalcev; vektorji, ki jih dobimo po kombinaciji plazmidov in fagne DNK, kot so plazmidi, ki so bili modificirani z namenom, da uporabimo fagno DNK ali druge ekspresijske kontrolne sekvence in podobno. V okviru izuma, eskpresijo ob dosežemo v metiltropnih glivicah t.j. kvasovka Pichia pastoris (glej International Patent Publication No. WO 90/03431, ki ga je objavil 5. aprila 1990 Brierley s sodelavci; International Patient Publication No. WO 90/10697, ki ga je objavil 20. septembra 1990 Siege, skupaj s sodelavci). V specifičnem okviru, infra, ekspresijski vektor izgradimo za ekspresijo ob pod kontrolo signalne sekvence α-parnega faktorja.
Katerikoli od številne množice ekspresijskih kontrolnih sekvenc sekvence, ki kontrolirajo ekspresijo DNK sekvence operativno vezana nanjolahko vstavimo v te vektorje, da pride do ekspresije DNK sekvenc, ki so opisne v tem izumu. Taka uporabna ekspresijska kontrolna sekvenca vključuje, na primer, zgodnje ali pozne promotorje SV40, CMV, vaccinia, polioma ali adenoviruse, lac sistem, trp sistem, TAC sistem TRC sistem, LTR sistem, glavna operatorska in promotorska področja faga λ, kontrolna področja fd krovnega proteina, promotor za 3-fosfogliceratno kinazo ali druge glikolitične encime, promoterje kisle fosfataze (t.j. Pho5), ΑΟΧ 1 promotor in metiiotropne kvasovke, promotorje kvasovkinega a-pridružitvenih faktorjev in drugih sekvenc, za katere vemo, da kontrolirajo gensko ekspresijo v prokariontski in evkariontskih celicah ali njihovih virusih in njihove številne kombinacije.
Številni enocelični gostitelji so uporabni za ekspresijo DNK sekvenc, ki so predmet izuma. Ti gostitelji lahko vključujejo dobro poznane evkariontske in prokariontske gostitelje, kot so sevi E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, glive kot so kvasovke (Saccharomyces in metiiotropne kvasovke kot so Pichia, Candida, Hanseula in Torulopsis) in živalske celice kot so CHO, R1.1, B-W in LM celice, celice ledvic afriške zelene opice (t.j. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 in BMT10), celice insektov (t.j. Sf19) in humane celice in rastlinske celice v tkivnih kulturah.
Razumljivo je, da ekspresija DNK, ki je predmet izuma, ne bo potekala enako učinkovito v vseh vektorjih, ekspresijskih kontrolnih sekvencah in gostiteljih. Niti vsi gostitelji ne bodo delovali dobro z istim ekspresijskim sistemom. Vendar, bo strokovnjak s tega področja znal izbrati ustrezne vektorje, ekspresijske kontrolne sekvence in gostitelja, brez nepotrebnega eksperimentiranja, da bi dosegli ekspresijo brez odaljevanja od cilja izuma. Na primer, v izbranem vektorju moramo gosta upoštevati, saj mora vektor v njem delovati. Upoštevati moramo številko kopije vektorja, sposobnost, da številko kopije kontroliramo in ekspresija drugih proteinov ki jih vektor kodira, kot so antibiotični markerji.
Pri izbiri ekspresijske kontrolne sekvence moramo seveda upoštevati številne faktorje. Ti vključujejo, na primer, relativno moč sistema, sposobnost njegove kontrole in njegovo združljivost z določeno DNK sekvenco ali genom, ki ga bomo ekspresirali, posebaj kar se tiče potencialne sekundarne strukture. Primernega enoceličnega gostitelja izberemo z upoštevanjem njegove združljivosti z izbranim vektorjem, njegove lastnosti sekrecije, njegovo sposobnost, da protein pravilno zavija in njegove potrebe pri fermentiranju, kot tudi toksičnost produkta, ki ga kodira DNK sekvenca, do gostitelja, enostavnost čiščenja ekspresijskih produktov.
Upoštevajoč te in druge faktorje, bo strokovnjak s tega področja sposoben konstruirati številne kombinacije vektor/ekspresijska kontrolna sekvenca/gostitelj, ki bo ekspresiral DNK sekvence, ki so predmet izuma, s fermentacijo ali veliko serijsko proizvodnjo na živalskih kulturah.
V specifične namene lahko ekspresiramo OB fuzijski protein. OB fuzijski protein obsega najmanj, funkcionalno aktiven del ne-OB proteina, ki je preko peptidne vezi povezan z vsaj funkcionalno aktivnim delom OB polipeptida. Ne-ob sekvenca je lahko amino ali karboksi terminalna glede na OB sekvenco. Primerneje za stabilno ekspresijo proteolitično nekativnega OB fuzijskega proteina je, da je del non-OB fuzijskega proteina povezan preko peptidne vezi na amino konec OB proteina. Rekombinantna molekula DNK, ki kodira tak fuzijski protein, obsega vsaj sekvenco funkcionalno aktivnega dela ne-OB proteina, ki je vključen v okvir OB kodne sekvence in kodira cepitveno mesto za specifične proteaze t.j. trombin ali Faktor Xa na OB-non-OB združitvenem mestu. V specifične delu izuma, so elspresijo fuzijski protein izvedli v Escherichia coli in P pastoris.
Pripravili smo vektorje, ki ekspresirajo glodalske in humane ob gene z in brez kodona za gln-49 v bakterijskem ekspresijskem sistemu in kvasovkah (Pichia), kot fuzijske proteine, ob gen pripravimo z endonukleaznim cepitvenim mestom, t.j. z uporabo PCR in novejšimi osnovnimi verigami. Zaželeno je, da potrdimo sekvenco, ki jih pripravimo s PCR, saj je verjetnost prisotnosti točkovne mutacije, pri tej tehniki, večja. Uporabimo plazmid s histidinskim trakom (His-tag) in proteolitično cepitveno mesto. Prisotnost histidina omogoča selektivno izolacijo rekombinantnih proteinov na Ni-kelirajoči koloni ali z afinitetnim čiščenjem. Proteolitično cepitveno mesto, v specifičnem okviru tega izuma, infra, trombinsko cepitveno mesto pripravimo tako, da uporabimo proteaze, t.j. trombin, ki bodo sprostile celoten zrel (t.j. brez signalne sekvence) OB polipeptid.
Gledano z drugega vidika, lahko uporabimo pGEX vektor [Smith ef al., Gene, 67:31-40(1981)]. Ta vektor združuje schistiosama japonicum glutationin S-transferazo cDNK v sekvenco, ki jo želimo. Bakterijske proteine poberemo in rekombinantne proteine hitro očistimo na reducirani glutation afinitetni koloni. GST nosilec lahko ustrezno odcepimo od fuzijskega proteina encimsko, z za mesto specifičnimi proteazami. Po cepitvi nosilec in necepljen fuzijski protein odstranimo z adsorpcijo na glutation agarozo. Občasno se pojavijo težave s sistemom v primeru, ko je kodirani protein netopen v vodni raztopini.
Ekspresija rekombinantnih proteinov v bakterijskem sistemu lahko poteka v smeri nepravilnega zavijanja ekspesiranega proteina in potrebno je razvitje. Rekombinantni portein lahko ponovno zavijemo, pred ali po cepitvi, da nastane funkcionalno aktiven OB polipeptid. OB polipeptid lahko ponovno razvijemo v naslednjih korakih (i) inkubacija proteina v denaturacijskem pufru, ki vsebuje reducent in nato (ii) inkubacija proteina v pufru, ki vsebuje oksidant in tudi vsebuje spojino, ki protein stabilizira ali kaotropno spojino ali oboje skupaj. Primeren redoks (reducirajoče/oksldirajoči) par spojin vključuje, kar seveda ni omejitev, reduciran glutation/glutation disulfid, cistin/cistein, cistamin/cisteamin in 2merkapotetanol/2-hidroksietildisulfid. Gledano s posebnega vidika, fuzijski protein lahko raztopimo v denaturantu, kot je sečnina, še pred izmenjavo z reducirajočim pufrom. Proteine tudi čistimo z ionski kromatografijo ali Nikelatirajočo kromotografijo, pred izmenjavo z reducirajočim pufrom. Kot denaturant lahko uporabimo sečnino in gvanidin-HCI in seveda tudi druge spojine. Rekombinantni protein nato redčimo najmanj 10-krat, še primernjeje je 100-krat, v oksidirajočem pufru, ki vsebuje oksidant, kot na primer 0.1 M tris-HCI, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.15M HCl, 0.3M oksidiran glutation. Fuzijski protein nato inkubiramo od približno 1 ure do približno 24 ur, najprimerneje je od 2 do približno 16 ur, pri sobni temperaturi, v oksidirajočem pufru. Oksidirajoči pufer lahko vsebuje spojino za stabilizacijo proteina, t.j. sladkor, alkohol ali amonijev sulfat. Oksidirajoči pufer lahko vsebuje tudi kaotropno spojino, v nizki koncentraciji, za destabilizacijo nepravilne intermolekularnih interakcij in torej pospešuje zavijanje. Ustrezne kaotropne spojine so, seveda to ni omejitev, detergent, poliol, L-arginin, gvanidin-HCI in polietilenglikol (PEG). Pomembna je uporaba dovolj nizke koncentracije kaotropske spojine, da ne pride do denaturacije proteina. Ponovno zavit protein lahko koncentriramo najmanj 10-krat, še bolje s količino s katereo je bil redčen v oksidirajočem pufru.
Bakterijski fermentacijski postopek lahko privede do priprave rekombinantnega proteina, ki vsebuje neprimerno količino endotoksinov. Torej, v izumu je predvidena odstranitev takih endotoksinov, z uporabo endotoksin specifičnih protiteles ali drugih molekul, ki vežejo te endotoksine. Prisotnost endotoksinov lahko določimo s standardnimi tehnikami, kot je uporaba Ε-ΤΟΧΑΤΕ reagentov (Sigma, St. Louis. Missouri) ali z biotesti.
Poleg specifičnega primer, avtorji predloženega izuma za ekspresijo ob proteina priporočajo uporabo baculovirusov, sesalskih in kvasovskih ekspresijskih sistemov. Na primer, v baculovirusu, kot ekspresijskem sistemu, obeh ne-fuzijskih transfer vektor, kot je pVL941 (BamHI klonirajoče mesto; Summers), pVL13493 (BamHI, Smal, Xbal, EcoRI, Noti, Xmalll,Bg/ll in Psti klonirajoče mesto; Invitrogen), pVL1392 (Bg/ll, Psti, Noti, EcoRI, Xbal, Smal in BamHI klonirajoče mesto; Summers in Invitrogen) in pBlueSaclll (BamHI, Bglll, Psti, Ncol in Hindlll klonirajoče mesto, možno je modro-belo rekombinanten pregled; Invitrogen) in fuzijski transferski vektorji, kot so pAc700 (BamHI in Kpnl klonirajoče mesto, pri katerem je BamHI mesto prepoznavanja, ki se začne z inicijacijskim kodonom; Summers), pAc701 in pAc702 (enako kot pAc700, z drugim bralnim okvirom), pAc360, (BamHI klonirajoče mesto 36 baznega para po polihedrinskem iniacijskem kodonu; Invitrogen (195)) in pBlueBacHisA, B, C (tri različni bralni okviri z BamHI, Bglll, Psti, Ncol in Hindlll klonirajoče mesto, terminalnim peptidom za ProBond čiščenje in modro-belim rekombinantnim pregledom plakov; Invitrogen (220)).
Sesalski ekspresijski vektorji, ki smo jih pregledali za uporabo v predloženem izumu, obsegajo vektorje z inducibilnimi promoterji, kot so promoterji dihidrofolat reduktaze (DHFR), t.j. katerokoli ekspresijski vektor z DHFR ekspresijskim vekotrjem ali DHFR/metotreksat pomnoževalni vektor, kot je pED (Psfl, I, Sbal, Smal in EcoRI klonirajoče mesto, z vektorjem ki ekspresira oba klonirana gena in DHFR; glej Kaufnam, Current Protocols in Molecular BiologyAG.)2 (1991). Alternativno, glutamin sintetaza/ metionin sulfoksimin ko-pomnoževalni vektor, kot je pEE14 (Hindlll, Xbal, Smal, Sbal, EcoRI in Bell klonirajoče mesto, v katerem vektor ekspresira glutamin sintetazo in klonirane gene; Celltech). V drugem okviru, lahko uporabimo vektor, ki usmerja ekspresijo pod kontrolo Epstein Barr Virusa (EBV), kot so PREP4 (BamHI, Sffl, Noti, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull in Kpnl klonirajoče mesto, konstruktivni RSV-LRT promoter, za higromicin selektivni označevalec; Invitrogen), pCEP4 (BamHI, Sfil, Xhol, Noti, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull in Kpnl klonirajoče mesto, konstitutivni hCMV bližnji zgodnji gen, za higromicin selektivni označevalec; Invitrogen) pMEP4 (Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Noti,
ΧΛϊοΙ, Sfil, BamH/ klonirajoče mesto, inducibilni metalotionein Ha genski promotor, za higromicin selektivni marker; Invitrogen) pREP8 (SamHI, Xhol, Nhel, in Kpnl, klonirajoče mesto, RSV-LTR promoter, za histidinoi selektiven marker; Invitrogen), pREP9 (Kpnl, Nhel, Hindlll, Noti, Xhol, Sfil in BamHl klonirajoče mesto, RSV-LTR, za G418 selektiven označevalec; Invitrogen) in pEBVHis (RSV-LTR promotor, za higromicin selektiven marker, N-terminalni peptid, ki smo ga čistili s ProBond smolo in cepili z enterokinazami). Selektiven sesalski ekspresijski vektor, ki ga uporabimo v izumu, vključuje pRc/CMV (Hindlll, SsfXI, Noti, Sbal in Apal klonirajoče mesto, G418 selekcija; Invitrogen), pRc/RSV (Hindlll, Spel, BsfKl, Noti, Xbal klonirajoče mesto, G418 selekcija; Invitrogen) in drugi. Vaccinia virus sesalski ekspresijski vektor (glej Kaufman, 1991, supra), ki ga uporabimo skladno z izumom, vključuje, vendar to ni omejitev, pSC11 (Smal klonirajoče mesto, TK in β-gal selekcija), pMJ601 (Sall, Smal, Afil, Nad, SspMII, SamHI, Apal, Nhel, Sacll, Kpnl in Hindlll klonirajoče mesto; TK in β-gal selekcija) in pTKgptFIS (EcoRI, Psfl, Sa/I, Accl, Hindll, Sbal, SamHI in Hpa klonirajoče mesto, Tk ali XPRT selekcija).
Ekspresijski sistem kvasovk lahko uporabimo skladno z izumom za ekspresijo OB polipeptida. Na primer, ne-fuzijski pYES vektor (Xhal, Sphl, Shol, Noti, GsfKl, EcoRI, SsfXI, SamHI, Sacl, Kpnl in Hindlll klonirajoče mesto; invitrogen) ali fuzijski pYESHisA, B, C (Xhal, Sphl, Shol, Λ/ofl, SsfXI, EcoRI, Sacl, Kpnl in Hindlll klonirajoče mesto, N-terminalni peptid prečiščen z ProBond smolami in cepljen z enterokinazo; Invitrogen), da omenimo samo dva, ki sta lahko uporabljena skladno z izumom.
V nadaljevanju je opisano, da se peptidni analogi modulatorjev telesne teže pripravijo iz nukleotidne sekvence, skladno s ciljem predloženega izuma.
Poleg rekombinantne ekspresije OB polipeptida, je v predloženem izumu predstavlja in v celoti opisana priprava OB polipeptidov ali njihovih fragmenotv z uporabo, dobro poznanih in visoko razvitih tehnik, sinteze trdnih peptidov. V izumu je pregledana uporaba obeh polularnih Boc in Fmoc, kot drugih zaščitinih strategij za pripravo ob polipeptida ali njihovih fragmentov. Različne tehnike za odvijanje in oksidacijo cisteinskih stranskih verig, da nastanejo disulfidne vez so v stroki tudi dobro poznane.
Protitelesa proti OB poUpeptidom
Kot je navedeno v predloženem izumu, OB polipeptid pripravimo rekombinantno ali s kemično sintezo, fragmente ali druge njihove derivate ali analoge, vključno s fuzijskimi proteini, lahko uporabimo kot imunogene, za tvorbo protiteles, ki prepoznajo OB polipeptid. Taka protitelesa so lahko, pa ni omejujoče, poliklonalna, monoklonalna, kimerična, enoverižna, Fab fragmenti in Fab ekspresijska knjižnica.
Molekula je antigenska, ko je sposobna specifične interakcije z molekulo imunskega sistema, ki prepozna antigen, kot so imunoglobulini (protitelo) ali receptor T celičnega antigena. Antigenski polipeptid obsega najmanj 5, še primerneje je, najmanj 10 aminokislin. Antigenski del molekule je lahko del, ki je imunodominanten za prepoznavo protitelesa ali receptorjev T celic ali je lahko del, ki ga uporabimo za nastajanje protiteles proti molekuli s konjugacijo antigenskega dela nosilne molekule za imunizacijo. Molekula, ki je antigen ni nujno, da je imunogena, t.j. sposobna izzvati imunski odgovor brez nosilca.
Protitelo je imunoglobilin, vključno s protitelesi in njihovimi fragmenti, ki vežejo specifični epitop. Izraz zajema poliklonalna, monoklonalna in kimerična protitelesa, slednji so podrobneje opisani v U.S. Patent Nos: 4,816,397 in 4,816,567, kot tudi antigen vezalni del protitelesa, vključno z Fab, F(ab’)2 in F(v) (vključno z enoverižnimi protitelesi). Fraza molekula protitelesa in njegove izpeljanke, so tukaj uporabljene za označevanje intaktnih imunoglobulinskih molekul in imunološko aktivnega dela imunoglobulinske molekule, ki nosi protetelesno kombinirajoče mesto. Protitelesno kombinirajoče mesto je strukturni del molekule protitelesa, ki ima variabilno in hipervariabilno področje na težki in lahki verigi, ki specifično vežeta antigen.
Kot primer, molekule protiteles so intaktne imunoglobulinske molekule, v osnovi intaktne imunoglobulinske molekule in tisti deli imunoglobulinske molekule, ki obsegajo paratop, vključno s tistimi, v stroki poznanimi, deli kot so Fab, Fab’, F(ab’)2 in F(v), ki so bolj primerni za uporabo v tukaj navedenih terapevtskih metodah.
Fab in F(ab’)2 odlomka molekule protitelesa pripravimo s proteolitično reakcijo papaina in pepsina, na drugače nepoškodovanih molekulah protiteles z dobro poznanimi metodami. Za primer glej, U.S. Patent. No. 4,342,566 avtorja Theofilopolus in sodelavcev. Fab’ molekule protiteles so dobro poznane in jih pripravimo iz F(ab’)2 dela z redukcijo disulfidne vezi, ki povezuje dve težki verigi, z merkaptoetanolom, temu sledi še alkilacija dobljenega proteinskega merkaptana, z reagentom, kot je jodacetamid. Najprimernejše je protitelo, ki obsega nepoškodovane molekule protitelesa.
Izraz monoklonalno protitelo, v različnih gramatičnih oblikah, se nanaša na protitelo, ki ima samo eno vrsto variabilnega dela protitelesa, ki je sposoben imunoreakcije z določeneim antigenom. Monoklonalno protitelo tipično izkazuje samo enovezno afiniteto za antigen s katerim reagira. Monoklonalno telo lahko vsebuje molekulo protitelesa s številnimi variabilnimi deli protitelesa, vsak pa je imunospecifičen za drug antigen; t.j. bispecifično (kimerično) monoklonalno protitelo.
Izraz adjuvans se nanaša na spojino ali zmes, ki pospešuje imunski odgovor na antigen. Adjuvans lahko služi kot tkivni depo, ki počasi sprošča antigen in tudi kot aktivator limfnega sistema, ki nespecifično pospešuje imunski odgovor [Hood et al., v lmmunology, p. 384, druga izdaja, Benjamin/Cumminga, Menlo Park, California (1984). Pogosto primarni stik z antigenom samim, brez prisotnosti adjuvansa, ne bo izzval humoralnega ali celičnega imunskega odziva. Med adjuvanse prištevamo, in seveda ne samo te, Freudov adjuvans, nepopolen Freudov adjuvans, saponin, mineralne gele, kot so aluminijev hidroksid, površinsko aktivne substance, kot so lizolecitin, pluronski polioli, polianioni, peptidi olja ali ogljikovodikove emulzije, polžje hemocianine, dinitrifenol in potencialno uporabni humani adjuvansi kot so BCG (bacille Calmette-Guerin) in Corynebacterium parvum. Adjuvans mora biti farmacevtsko sprejemljiv.
Različne, v stroki poznane tehnike, lahko uporabimo za proizvodnjo poliklonalnih protiteles proti OB polipeptidu ali fragmentu, njegovemu derivatu ali analogu. Za prozivodnjo protiteles, imuniziramo različne gostiteljske živali z injiciranjem OB polipeptida ali njegovega derivata (t.j. fragment ali fuzijski protein), vključno in ne le, zajce, miši, podgane, ovce, koze itd. V izumu je predvideno, da OB polipeptid ali njegov fragment konjugiramo z imunegenskim nosilecem t.j. svinjski serumski albumin (BSA) ali ključni hemocianin morskega polža (KLH). Da povečamo imunski odziv lahko uporabimo različne adjuvanse, odvisno pač od gostiteljske vrste, vključno, vendar ni omejiteno na Freundov (popoln ali nepopoln), mineralne gele, kot so aluminijev hidroksid, površinsko aktivne substance, kot je lizolecitin, pluronski polioli, polianioni, peptidi, oljne emulzije, ključni hemocianaini morskega polža, dinitrofenol in potencialno uporabni humani adjuvansi, kot sta BCG (bacille Calmette-Guerin) in Corynebacterium parvum.
Za pripravo monoklonalnih protiteles, ki so usmerjeni proti OB polipeptidu ali fragmentu, analogu ali njegovemu derivatu lahko, za proizvodnjo molekul protitelesa, uporabimo katerokoli tehniko, ki zagotavlja uporabo neprekinjene celične linije v kulturi. V to je vključena, kar seveda ne omejuje, tudi 'hibridoma’ metoda, ki jo je skupaj s sodelavci razvil Kohler, Nature, 256:495-497 (1979), kot tudi 'trioma' metoda, 'humane B celice hibridoma’ metoda [Kozbor et al., Immunology Today, 4;72(1983)] in 'EBV hibridoma’ metoda za pripravo humanih monoklonalnih protiteles [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Nesmrtno celično linijo za proizvodnjo protiteles lahko pripravimo s pomočjo metod, mednje ne sodi fuzija, in so neposredna transformacija B limfocitov z onkogeno DNK ali transfekcija z Epstein-Barr virusom. Glej. M. Schreirer et al., Hybridoma Techniques (1980): Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); glej tudi U.S. Patent Nos 4,341,761, 4,341,61; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 in 4,493,890.
Poleg tega je predmet izuma tudi, proizvodnja monoklonalnih protiteles v živalih brez mikrobov, z uporabo novejše tehnologije (PCT/US90/02545). Skladno z izumom, humana protitelesa lahko uporabimo in lahko pridobimo z uporabo humanih hibridomov [Cote et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 80;2026-2030 (1983)] ali s transformacijo humanih B celic z EBV virusom in vitro [Cole et al., (1985), supra]. Dejstvo je, da skladno z izumom metode, ki smo jih razvili za proizvodnjo kimernih protiteles [ Morrison et al., J Bacteriol, 159-870(1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984); Takeda et al., Nature, 314;452-454(1985)] lahko uporabimo združevanje genov mišje molekule protitelesa, ki je specifičen za ob polipeptid, skupaj z geni humane molekule protitelesa ustrezne biološke aktivnosti; taka protitelesa so eden izmed ciljev tega izuma. Taka humana ali humanizirana kimerna protitelesa so primerna za uporabo v terapiji humanih bolezni ali motenj (opisano infra), saj so humana ali humanizirana protitelesa veliko manj kot ksenogena protitelesa sama izovejo imunski odgovor, natančneje alergijski odziv.
Glede na izum, opisane metode za proizvodnjo enoverižnih protiteles (U.S. Patent 4,946,778) lahko prilagodimo tako, da proizvajajo za OB polipeptid specifična enoverižna protitelesa. V izumu je opisana tudi uporabnost metod za izgradnjo Fab ekspresijskih knjižnic [Huse et al., Science, 246; 1275-1281 (1989)], ki omogoča hitro in enostavno identifikacijo monoklonalnih Fab fragmentov z želeno specifičnostjo za ob polipeptid ali njegov derivat ali analoge.
Fragmente protitelesa, ki imajo idiotip molekule protitelesa lahko pripravimo s poznanimi metodami. Na primer, taki fragmenti vključujejo, vendar to ni omejeno, F(ab’)2 fragment, ki ga lahko pripravimo z razgradnjo molekule protitelesa s pepsinom; Fab’ fragmente, ki jih lahko pripravimo z redukcijo disulfidnih vezi in Fab fragmente, ki jih lahko pripravimo tako, da molekulo protitelesa podvržemo delovanju papaina in reducenta.
Priprava protiteles, iskanje želenega protitelesa opravimo s stroki poznanimi metodami t.j. radioimunski test, ELISA (encimsko imunski test), sendvič imunskim testom, imunoradiometrični test, rekacijo gelske difuzijske precipitacije, imunskodifuzijski test in situ imunski test (na primer uporaba koloidnega zlata, označen z encimom ali radioizotopom), metoda pivnanja (Western blots), aglutinacijski test (t.j. gelski aglutinacijski test, hemaglutininski test), reakcija vezave komplementa, imunoflorescenčni test, test proteina A, imunoelektroforeza. itd. Vezavo protitelesa zasledujemo z zasledovanjem označevalca na primernem protitelesu. Primarno protitelo določimo z vezavo sekundarnega protitelesa ali reagenta na primarno protitelo. V nadaljevanju označimo sekundarno protitelo. Poznana so številna sredstva za določevanje vezave v imunotestu in so eden izmed ciljev predloženega izuma. Na primer, da izberemo protitelesa, ki prepoznajo specifičen epitop OB polipeptida lahko uporabimo pripravljen hibridom za produkt, ki se veže na fragment OB polipeptida, ki ima tak epitop. Za izbiro specifičnih protiteles za OB polipeptid iz določene živalske vrste lahko izberemo na osnovi pozitivne vezave z OB polipeptidom, ki ga ekspresirajo ali izolirajo iz celice izbrane živalske vrste.
Omenjena protitelesa lahko uporabimo v stroki poznanih metodah glede na mesto in aktivnost OB polipeptida t.j. metodi pivnanja (VVestern blotting), imaging OB polipeptida in situ. Merjenje njegove vrednosti v ustreznih fizioloških vzorcih itd.
Pripravimo lahko protitelesa, ki pospešujejo ali antagonizirajo aktivnost OB polipeptida. Taka prititelesa lahko testiramo z uporabo, ki so opisana z infra, za identifikacijo lignadov.
Protitelesa pripravimo z imunizacijo zajcev s sinteznimi peptid, ki jih napovemo s proteinski sekvenco ali rekombinantnimi proteini, ki jih pripravimo z uporabo bakterijskih ekspresijskih vektorjev. Izbiro sinteznih peptidov izvedemo po pazljivi analizi predvidene proteinske zgradbe, kot je opisano zgoraj. Natančneje, izberemo peptidno sekvenco med dvema domnevnima cepitvenima mestoma. Sintezne peptide konjugiramo z nosilcem, kot je KLH hemocianin ali BSA z uporabo karboimida in ga uporabimo pri Freundsovem adjuvansu za imunizacijo zajcev. Z namenom priprave rekombinantnega proteina, uporabimo pGEx vektor za ekspresijo polipeptida (Smith ef a/., 1988, supra). Ali drugače, lahko uporabimo samo hidrofilni polimer za pripravo fuzijskega proteina. Ekspresijski protein lahko pripravimo v količini, ki jo uporabimo za imunizacijo zajcev v Freundovem adjuvansu.
Rekombinantni OB polipeptid uporabimo za imunizacijo kokoši, kokošja anit Ob protitelesa pridobimo iz jajčnega beljaka t.j. z afinitetnim čiščenjem na OB koloni. Kokoši, ki jih imuniziramo, živijo pod posebnimi pgoji, v okolju brez patogenov (SPF).
Protitelesa proti leptinu tvorijo tudi ob/ob miši, ki so brez krožečega OB proteina in torej pričakujemo, da so sposobne tvoriti anti-OS polipeptidni odziv, ker nimajo tolerance na polipeptid in divje miši. Celice vranice iz obeh skupin lahko združimo z mieioma celicami, da pripravimo hibride za monolonalna protitelesa.
Rekombinantni OB polipeptid uporabimo za imunizacijo zajcev, pred uporabo poliklonalna protitelesa imunočistimo. Prečiščena protitelesa so posebaj uporabna za semikvantitativne teste, posebaj za zasledovanje prisotnosti krožečega OB polipeptida v serumu ali plazmi.
Diagram monoklonalnih protiteles proti modulatornim peptidom lahko pregledamo po različnih lastnostih; t.j. izotip, epitop, afiniteta itd. Posebaj so zanimiva monokionalna protitelesa, ki nevtralizirajo aktivnost modulatornih peptidov. Taka monokionalna protitelesa lahko določimo z aktivnostnim testom za modulatorje telesne teže. Visoko afinitetna protitelesa so uporabna, ko je možno imunoafinitetno čiščenje naravnega ali rekombinantnega modulatorja.
Protitelesa proti modulatorju, ki jih uporabimo pri diagnostičnih in terapevtskih metodah pri tem izumu, so afinitetno prečiščena poliklonalna protitelesa. Še primernejje je, da so protitelesa monokionalna protitelesa (mAb). Polege tega je zaželeno, da so antimodulatorne molekule protiteles, ki jih tukaj uporabimo, v obliki Fab, Fab’, F(ab’)2 ali F(v) odlomki celotne molekule protitelesa.
Uporaba v diagnostiki
Predloženi izuma se nanaša na številne uporabe v diagnostiki, vključno z metodami za zasledovanje pogojev in/ali stimulusa, ki vpliva na nenormalnosti v telesni teži ali tolstost, s navedbami o njihovo sposobnosti, da izovejo aktivnosti, ki jih povzročajo prisotni modulatorji teže. Kot je bilo omenjeno že prej, peptidne modulatorje teže lahko uporabimo za pripravo protiteles proti njim samim, s številnimi poznanimi metodami in taka protitelesa nato lahko izoliramo in koristno uporabimo za testiranje prisotnosti določenih transkripcijskih aktivnosti v določenih tarčnih celicah. Ali drugače, nukleinske kisline, ki so predmet izuma, lahko uporabimo v diagnostiki.
Diagnostika, ki temelji na protitelesih
Kot je bilo že prej omenjeno, metode, ki jih koristno uporabimo v namene predloženega izuma obsegajo, pregled celičnega vzorca ali medija s različnim testi, med katere štejemo učinkovito količino antagonista modulatomega proteina, kot so protimodulatorna protitelesa, najpreimernejša so afinitetno čiščena poliklonalna protitelesa in še primerneje mAB. Poleg tega je napreimernejše, da je molekule protitelesa proti modulatorjem, ki jih tukaj uporabimo, v obliki Fab, Fab’, F(ab’)2 ali F(v) odlomkov ali celotne molekule protitelesa. Kot je razprava tekla že prej, je metoda koristna pri pacientih, ki so oboleli za rakom, AIDS-om, debelim ali drugim, pri katerih je značilna abnormalna telesna teža. V stroki so dobro poznane metode za izolacijo modulatorjev in tvorbo protitelesa proti modulatorjem ter za določevanje in optimizacijo sposobnosti protiteles proti modulatorjem, za pomoč pri pregledovanju tarčnih celic.
Protitelesa, oboja poliklonalna in monoklonalna, in zdravilne učinkovine, ki uravnavajo tvorbo aii aktivnost modulatorjev telesne teže in drugi znani faktorji in/ali njihove podenote, imajo lahko določeno uporabnost v diagnostiki in jih lahko, na primer, koristno uporabimo za določevanje in/ali merjenje pogojev, kjer se nenormalnosti v telesni teži so ali bi se lahko pojavile. Na primer, modulatorni peptid ali njegov aktivni fragmente lahko uporabimo za pripravo obeh, poliklonalnih ali monoklonalnih protiteles, proti njim samim, v številnih celičnih medijih s poznanimi metodami, kot so hibridizacijska metoda, pri kateri uporabimo, na primer, združene limfocite mišje vranice in mieloma celice. Te metode so v podrobnosti opisane v nadaljevanju. Podobno, majhne molekule, ki pospešujejo ali antagonizirajo aktivnost(i) faktorjev, ki prepoznajo receptor, ki so predmet izuma, lahko odkrijemo ali sintetiziramo in jih lahko uporabimo v diagnostične in/ali terapevtske namene.
Prisotnost modulatorjev telesne teže v celicah lahko zagotovimo z običajnimi imunološkimi postopki, ki jih lahko apliciramo za tako določevanje. Poznani so številni uporabni postopki. Trije taki postopki, ki so posebaj primerni za uporabo so ali faktor, ki prepozna receptor, označen z markerjem, ki ga lahko detektiramo, protitelo Ab1( označen z markerjem, ki ga lahko sledimo ali protitelo Ab2 označen z markerjem, ki ga lahko sledimo. Postopek lahko strnemo v sledeče enačbo, kjer zvezdica kaže, da je delec označen in je WM oznaka za modulator teže:
A. WM* + Afy = WM*Ab-,
B. WM + Ab^ = VVMAb^
C. WM + Ab! + Ab2* = Ab-iWMAb2*
Postopki in njihova aplikacija je strokovanjakom dobro poznana, in jih lahko uporabimo za namene predloženega izuma. Kompetativni postopek, Postopek A je opisan v U.S. Patent Nos 3,654,090 in 3,850,752. Postopek B je reprezentativna, zelo poznana kompetativni testna tehnika. Postopek C, postopek sendviča je opisan v U.S. Patentu št. RE 31,006 in 4,016,043. Poznane so tudi druge metode, kot je dvojno protitelo in DASP' postopek.
V vsakem primeru modulator telesne teže tvori komplekse z enim ali več protitelesom (i) ali vezalnim partnerjem in eden v tem kompleksu je označen z označevalcem, ki ga lahko sledimo. Dejstvo je, da nastane kompleks, ki ga če je le potrebno, kvantitativno določimo s poznanimi metodami, ki so določene označevalecem.
Iz zgornjega zapisa je razvidno, da so lastnosti Ab2, tiste, ki pogojujejo vezavo z Ab^ Zaradi tega, ker Ab-j, v nekaterih sesalskih vrstah je njihova vrednost povišana, jih uporabimo v drugi vrsti kot antigen, da povišamo vrednost protiteles Ab2. Na primer, Ab2 lahko povišamo pri kozah, če uporabimo zajčja protitelesa kot antigen. Ab2 je zato poviša vrednosti protiteles proti zajčjim protitelesom v kozah. Za namene tega opisa in zahtevkov, Ab! so prevenstveno primarna ali protitelesa proti modulatorju telesne teže in smatramo Ab2 kot sekundarna ali proti-Ab·, protitelesa.
Označevalci, ki jih v tovrstnih študijah najpogosteje uporabljamo so radioaktivni elementi, encimi, kemikalije, ki pod ultravijolično svetlobo flurescirajo in drugo.
Poznani so številne fluorescentne spojine, ki jih lahko uporabimo kot označevalce. Ti so, na primer, fluorescein, rodamin in auramin. Material, ki ga zasledujemo so protizajčja protitelesa, ki jih je tvorila koza in jih nato konjugiramo s fluoesceinom s pomočjo izotiocianata.
Modulatorje telesne teže ali druge vezalne partnerje lahko zasledujemo z radioaktivnimi elementi ali z encimi. Radioaktivni označevalec lahko zasledujemo s katerokoli sedaj poznano števno metodo. Najprimernejši izotopi so naslednji: 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 59Fe, 90γ, 125|( 131| jn 186Re.
Enako so uporabni encimski označevalci in jih lahko zasledujemo kalorimetričnim, spektrofotometričnimi, fluorospektrofotometričnimi, amperometričnimi ali plinskimi metodami. Encim konjugiramo z izbranim delcem, z reakcijo tvorbe mosta, z molekulami kot so karboimidi, diizocianati, glutaraldehid in podobni. Številni encimi, ki so uporabni v teh postopkih so znani in jih lahko uporabimo. Najprimernejše so peroksidaza, β-glukoronidaza, β-D-glukozidaza, β-D-galaktozidaza, uraza, glukozna oksidaza plus peroksidaza in alkalna fosfataza. U.S. Patent Nos. 3,654,090; 3,850,752 in 4,016,043 so navedeni tukaj momogrede, kot primer odkritja alternativnih označevalcev in metod.
Testni pribor, ki je primeren za uporabo v medicini, lahko pripravimo, za določevanje prisotnosti ali odsotnosti predhodno določenih transkripcijskih aktivnosti ali predhodno določenih sposobnosti za transkripcijske aktivnosti v osumljenih tarčnih celicah. V skladu s testnimi tehnikami, o katerih smo tukaj govorili, je en razred takih priborov, ki vsebuje najmanj označen modulator teže ali njegov vezalni partner na primer specifičeno protitelo in smer, ki je seveda odvisna od izbrane metode, t.j. kompetitivna, sendvič, DASP in podobno. Ti pribori lahko obsegajo tudi periferne reagnete, kot so pufri, stabilizatorji itd.
Testni pribor lahko pripravimo za demonstracijo prisotnosti ali sposobnosti celic za predhodno določeno transkripcijsko aktivnostjo, ki obsega;
(a) predhodno določena količina najmanj ene označene imunokemične reaktivne komponente, ki jo dobimo z direktno ali indirektno vezavo prisotnega modulatorja telesne teže ali specifičnega vezalnega partnerja na določljivi vrednosti;
(b) drugi reagneti in (c) navodila za uporabo omenjenega pribora.
Natančnejši opis diagnostičnega testnega pribora, ki obsega:
(a) znano količino modulatorja telesne teže, kot je opisano zgoraj (ali vezalnega partnerja) v splošnem vezan na trdno fazo, da nastane imunosorbent ali alternativno vezan na ustreženo vrečo ali večino končnih produktov itd (ali njihovi veza,ni partnerji) eden;
(b) če je potrebno drugi reagneti in (c) navodila za uporabo omenjenega testnega pribora.
V drugih variantah, testni pribor lahko pripravimo in uporabimo za namene, ki so zgoraj navedeni, ki delujejo glede na poprej določen protokol (t.j. kompetativni, sendvič, dvojno protitelo itd) in obsega:
(a) označeno spojino, ki jih pridobimo z povezovanjem modulatorja telesne teže in označevalcem, ki ga lahko zasledujemo;
(b) eden ali več imunokemičnih reagentov, v katerem je najmanj en reagnet ligand ali imobiliziran ligand, ki ga izberemo iz skupine sledečih:
(i) ligand, ki je sposoben vezave z označeno spojino (a), (ii) ligand, ki je sposoben vezave z vezalnim partnerjem označene komponente (a);
(iii) ligand, ki je sposoben vezave z najmanj eno komponento za določevanje in (iv) ligand, ki je sposoben vezave z najmanj enim vezalnim partnerjem najmanja ene komponente, ko jo določujemo in (c) navodila za izvedbo protikola za določevanje in/ali določevanje ene ali več komponent imunokemične reakcije med modulatorjem telesne teže in specifičnim vezalnim partnerjem.
Diagnostiki na osnovi nukleinske kisline
Kot je bilo ponazorjeno na primerih, infra, nukleinske kisline, ki so predmet izuma, lahko uporabimo za določevanje napak, ki so povezane z napakami v OB polipeptidu, ki imajo za posledico debel fenotip. Na primer, nukleinska kislina kot sonda (t,j, pri povnanju po Northern-u ali RT-PCR analizi) lahko uporabimo za preučevanje ali je debel fenotip povezan s pomankanjem ali ekspresijo OB mRNK ali ekspresijo ne-funkcionalenge OB mRNK t.j. kot pri db/db miših (kjer je pomankanje posledica odsotnega OB receptorja) ali, kjer zaradi mutacije pride do neprepisane mRNK. Diagnostične metode na osnovi nukleinske kisline, ki so predmet predloženega izuma, lahko uporabimo za konjugacijo s protitelesom na osnovi tehnik pri katerih uporabimo protitelesa za nadaljne razumevanje debelih in anoreksičnih fenotipov, na molekularnem nivoju.
Humani cDNK kloni so bili izolirani pred nedavnim, njihova sekvence pa je bila določena, kot je opisano v tem izumu. To omogoča določitev celotne sekvence humanega gena (glej Sliko 20 do C; SEQ ID NO:22). DNK sekvence smo dobili iz intronov humanega OB gena (slika 20) in to smo uporabili za pripravo PCR osnovnih verig za pomnoževanje kodnih sekvenc OB gena s PCR iz humane genomske DNK tako, da smo določili mutacijo ali alalno varianto OB gena, vse skladno s protokolom, ki je bil podrobneje opisan. Specifične PCR osnovne verige za pomnoževanje humanega genomskega OB so opisne v posebnih Primerih, infra.
Sedanja hipoteza pravi, da je heterozigotna mutacija v ob genu povezana z blago/zmerno debelostjo medtem, ko naj bi bile homozigotne mutacije povezane z več diagnostičnimi testi, ki temeljijo na DNK sekvenc za debelost. Če je to pravilno, bo to omogočalo odkrivanje rizičnih posameznikov, pri katerih naj bi do debelosti prišlo in omogočalo zdravljenje z zdravili in/ali spremembe v načinu življenja, še preden bi prišlo do povečanja telesne teže.
Drugače, prisotnost mikrosatelitov, ki segregirajo z mutantinimi oblikami humanega OB lahko uporabimo za diagnosticiranje. Različne PCR verige, vključno z verigami, ki temeljijo na nukleotidni sekvenci, ki je predstavljena na sliki 20A do C, lahko uporabimo v te namene.
OB gen lahko uporabimo v diagnostiki za določevanje kodirane DNK in proteina pri motnjah v prehranjevanju. Pomembno je vedeti, pri določenih prehranjevalnih motnjah, aii so OB RNK in/ali njegovi kodirani proteini, nereguliran ali navzdol reguliran. Torej, če ima debela oseba povišano vrednost OB bo po vsej verjetnosti problem tok OB, medtem ko se pri znižani vrednosti OB zdi, da neustrezno nizek nivo OB lahko povzroči debelost (če je ali ni napake na OB genu). Ali obratno, če je pacient, ki je obolel za rakom ali AIDS-om izgubil težo in ima povišano vrednosti OB lahko zaključimo, da je neprimerno visoka ekspresija OB odgovorna za izgubo telesne teže.
Klonirano humano cDNK lahko uporabimo za določevanje vrednosti humanega OB RNK. Poled tega, rekombinantni humani protein pripravimo in uporabimo za razvoj imunotesta, ki omogoča merjenje maščob in mogoče tudi plazemskega nivoja OB proteina.
Uporabnost v terapiji
Polipeptidi, nukleinske kisline in protitelesa, ki so predmet izuma, so potencialno v terapiji zelo pomembni. Najprimerneje je, da terapevtsko učinkovito količino take spojine apliciramo v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, diluentu ali ekscipientu.
Izraz farmacevtsko sprejemljiv pomeni na molekularne entitete in sestavine, ki so fiziološko sprejemljive in, ki po aplikaciji človeku ne povzročajo alergijskih ali podobnih nezeželenih reakcij, kot so zgaga, slabost in podobno. Farmacevtsko sprejemljiv pomeni, da je ustrezen, ker je regulatorna federalna ustanova, državna vlada na tako določila in je navedena v USP (ameriška farmakopeja) ali v drugih priznanih farmakopejah in je primerna za uporabo pri ljudeh in živalih. Izraz nosilec se nanaša na diluent, adjuvans, ekscipient ali pomožno sredstvo s katerim spojino apliciramo. Taki farmecevtski nosilci so sterilne tekočine, kot sta voda in olja, vključno s parafinom, olji živalskega, rastlinskega ali sinteznega izvora, kot so arašidovo olje, sojino olje, mineralno olje, sezamovo olje in podobno. Voda ali raztopine, slane raztopine, vodno dekstrozne ali glicerolne raztopine, so najprimernješi nosilci posebaj za injektabilne raztopine. Primerni farmacevtski nosilci so opisani v Martin, Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 18. izdaja, Mačk Publishing Co., Easton, PA (1990).
Izraz terapevtsko učinkovita količina tukaj pomeni količino, ki zadostuje za znižanje najmanj 10%, še bolje je najmanj 50%, še najbolje je najmanj 90% in še primerneje je, da prepreči klinično določljivo pomankanje aktivnosti, funkcije in odziva gostitelja. Ali drugače, terapevtsko učinkovita količina mora biti dovolj za izboljšanje kliničnega pogoja gostiltelja.
Aplikacija rekombinantnega OB polipeptida povzroči izgubo teže, natančneje, zmanjšanje maščobnega tkiva. OS polipeptid lahko pripravimo s standardno bakterijskim in/ali sesalskim ekspresijskimi vektorji, sintetično ali očiščeno iz plazme ali seruma, kot je bilo podrobneje že opisano. Ali drugače, povečano ekspresijo naravnega OB polipeptida lahko izzove homologna rekombinantna metoda, kot je bilo opisano, supra.
Zmanjšanje aktivnosti OB polipeptida (z razvojem antagonistov, inhibitorjev uporabe nevtralizicijskih protiteles ali komplementarnih molekul) bi moral povzročiti povečanje telesne teže, kot je zaželeno za zdravljenje izgube telesne teže, ki je povezana z rakavimi obolenji, AIDS-om ali anoreksijo nervoso. Modulacija OS aktivnosti je lahko uporabna za zmanjšanje telesne teže (s povečanjem njegove aktivnosti) ali povečanje telesne teže (z zmanjšanjem njegove aktivnosti).
Zdravljenje s zdravilnimi učinkovinami na osnovi Doiioeotida
Z najenostavnejšimi analizami, OB gen določa telesno težo pri sesalcih, natančneje pri miših in ljudeh. Produkt OB gena in ustrezna, sorodne molekule, se zdijo del signalne poti, po kateri adipozno tkivo komunicira z možgani in drugimi tkivi. Prepričani so, da je OB polipeptid sam signalna molekula t.j. hormon. OB polipeptid, ali njegov funkcionalno aktiven fragment ali njegov antagonist lahko apliciramo oralno ali parenteralno, primerjenje je parenteralno. Zaradi metabolne homestaze, ki je kontinuiran proces, je po aplikaciji zaželeno kontrolirano sproščanje. Na primer, polipeptid lahko apliciramo z intravenozno infuzijo, z vgrajeno ozmotsko črpalko, s transdermalnim obližem, liposomi in drugimi načini aplikacije. Lahko uporabimo črpalko [Langer et al., eds, Medical Applications of Controlled Release, CRC Preš., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201(1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507(1980); Saudek et ai., N. Eng. J. Med., 321:574(1989)].
Lahko uporabimo polimerni material [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen ef a/., eds., Controlled Drug Bioavailability; Drug Product Design and Performance; Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61(1983); glej tudi Levy ef a/., Science., 228:190(1985); During ef al., Ann. Neurol., 25:351(1989); Howard ef al., J. Neurosurg., 71:105(1989)]. Sistem z nadzorovanim sproščanjem lahko namestimo približno v terapevtsko tarčo t.j. možgane, kar zahteva samo del sistemske doze [glej Goodson v Medical Applications od Controlled Release, vol. 2, str. 115-138(1984)]. Drugi sistemi z nadzorovanim sproščanjem so opisanim v preglednem članku avtorja Langer-ja v Science, 249:1527-1533(1990). Zdravilno učinkovino lahko dostavimo v veziklu, natančneje z liposomom (glej Langer, 1990, supra).', Treat ef al., v Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBerestein in Fidler (uredniki), Liss, New York, str. 353-365(1989); LopezBerestein, ibid., str. 317-327; glej splošno ibid.)
Rekombinantne celice, ki so bile transformirane z OB genom in, ki ekspresirajo velike količine polipeptida, lahko transplantiramo v osebek, s pomankanjem ob polipeptida. Avtologne celice, ki jih transformiramo z OB transplantiramo zato, da se izognemo ponovnemu injiciranju; ali drugače, s tehnologijo, ki je na voljo, ščitimo neavtologne celice, ki producirajo topen faktor znotraj polimernega matriksa, ki prepreči imunsko prepoznavanje in ponovno injiciranje.
OB polipeptid lahko apliciramo intravensko, intraarterialno, intraperitonealno, intramuskularno ali subkutano. Ali drugače, OB polipeptid, pravilno formuliran, lahko apliciramo nazalno ali oralno. Konstanatno dostavo OB lahko zagotovimo z aplikacijo terapevtsko učinkovite doze (t.j. doze, ki je dovolj učinkovita, da vzbudi spremembe v osebku) v potrebnih intervalih, t.j. dnevno, vsakih 12 ur, itd. Ti parametri so odvisni od resnosti obolenja, ki ga zdravimo, drugega delovanja, kot je sprememba diete, ki jo ima pacient, teže, starost in spola in drugih kriterijev, ki jih lahko določi glede na standardno dobro medicinski prakso, strokovnjak na tem področju.
Farmacevtski pripravki
Predmet predloženega izuma so tudi farmacevtski pripravki, ki so bili omenjeni že zgoraj. Taki farmacevtski pripravki so lahko namenjeni injiciranju, oralni, pulmonarni, nazalni ali drugi obliki aplikacije. Na splošno so v izumu našteti farmacevtski pripravki, ki imajo učinkovito količino proteina ali derivata, ki je predmet izuma, skupaj s farmacevtsko sprejemljivimi diluenti, konzervansi, solubilizatorji, emulgatorji, adjuvansi in/ali nosilci. Tak pripravek sestavljajo topila ki imajo različne pufri (TRIS-HCI, acetatni, fosfatni), pH in ionsko moč; dodatke, kot so detergenti in solubilizatorji (Tween 80, Polysorbat 80) antioksidante (askorbinsko kislino, natrijev metabisulfit), konzervanse (tiomersal, benzilni alkohol) in pomočno sredstvo (laktozo, manitol), vgrajevanje materiala med pripravo polimernih spojin, kot so polimiečna kislina itd. ali v liposom. Lahko uporabimo tudi hialuronski kislino. Taki pripravki lahko vplivajo na fizikalno stanje, stabilnost, hitrost in vivo sproščanja in na hitrost in vivo izločanja prisotnega proteina in derivatov. Glej Martin Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 18. izdaja (1990 Mačk Publishing Co., Easton, PA 18042) strani 1345-1712, ki so tukaj vključene v literaturo. Pripravki lahko pripravimo kot tekočino ali jih posušimo v prašek, kot je liofilizirana oblika.
Oralna aplikacija
Za tukajšnjo uporabo so opisane oralne zdravilne oblike, ki so na spološno navedene v Martin Remingtoris Pharmaceutical Sciences, 18. izdaja (1990, Mačk Publishing Co. Easton, PA 18042) v poglavju 89, ki je tudi naveden v literaturi. Trdne zdravilne oblike so tablete, kapsule, dražeje, pastile, ali pelete. Zdravilno učinkovino lahko vgradimo v liposom ali v polimerno ogrodje in to vgradimo v zdravilni pripravek (kot na primer, mikrosfere, ki so opisane v U.S. Patentu št. 4,925,673). Učinkovino lahko vgradimo v liposom, liposome lahko pripravimo iz različnih polimerov (glej U.S. Patent št. 5,013,556). Opis možnih trdnih zdravilnih oblik za uporabo v terapiji je naveden v Marshall v Modern Pharmaceutics, poglavje 10, Banker in Rhodes, urednika (1979), ki je tudi vključna v literaturo. Na splošno, zdravilni pripravek ima vgrajen protein (ali kemično modificiran protein) in inertna pomožna sredstva, ki omogočajo zaščito pred kislo želodčno vsebino in sproščanje biološko aktivne spojine v tankem črevesju.
Posebaj so opisani zdravilni pripravki za peroraino aplikacijo s spremenjenim proteinom. Protein je lahko kemijsko modificiran tako, da je oralna aplikacija tega derivata učinkovita. Na splošno, opisna kemijska modifikacija, je pripetje vsaj enega dela na proteinsko (ali peptidno) molekulo samo, kjer omenjena del omogoča (a) inhibicijo proteolize in (b) prevzem v krvni obrok iz želodca ali črevesja. Zaželeno je povečanje celokupne stabilnosti proteina in podaljšanje časa kroženja v telesu. Primeri teh spojin so polietilenglikol, kopolimeri etilenglikola in propilenglikola, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinilalkohol, polivinilpirolidon in poliprolin. Abuchowski et al., 1981, supra; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185189(1982). Drugi polimeri, ki bi jih lahko uporabili, so poli-1,3-oksolan in poli-1,3,6-tioksolan. Najprimernejše za farmacevtsko uporabo so, kot je zgoraj navedeno, spojine polietilenglikola.
Mesto sproščanja proteina (ali njegovega derivata) naj bi bil želodec, tanko črevo (dvanajstnik, jejnum ali ileum) aii debelo črevo. Strokovnjak s tega področja lahko pripravi zdravilni pripravek, ki v želodcu ne razpada in se bo učinkovina sprostila šele v dvanjastniku ali drugje v črevesju. Najprimerneje je, da do sproščanja ne pride v želodcu in se tako izognemo njegovem škodljivem okolju ali z zaščito proteina (ali derivat) ali s sproščanjem biološko aktivne učinkovine črevesju.
Da zagotovimo gastrično rezistenco, je nujno oblaganje s prevleko, ke je neprepustna pri pH 5.0. Primeri navadnih sestavin ki jih uporabimo za gastrorezistentne obloge so celulozni acetattrimelitat (CAT), hidroksipropilmetilcelulozni ftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinilacetat ftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celulozni acetat ftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S in šelak. Te prevleke lahko uporabimo za pripravo mešanih filmov.
Tableto lahko prevlečemo tudi s prevleko ali mešano prevleko, ki pa ne nudi zaščite pred želodčno vsebino. Med te prevleke štejemo sladkorno prevleko ali prevleko, ki olajšuje požiranje. Kapsule so lahko trdne (kot so želatinske) v katere polnimo suh presek ali tekoče pripravke, ki ga polnimo v mehke želatinske kapsule. Prevleka za pelete je lahko škrob ali papir namenjen prehrani. Dražeje, obložene tablete ali tabletne triturate, lahko pripravljamo z vlažno granulacijo.
Zdravilno učinkovino lahko vključimo v zdravilni pripravek, kot drobne delce v obliki granul ali pelet, ki imajo velikost približno 1 mm. V kapsulo lahko zdravilno učinkovino polnimo kot prašek, komprimat ali kot tablete. Zdravilni pripravke lahko izdelamo s stiskanjem.
Lahko dodamo tudi barvila in sredstva za izboljšanje okusa. Na primer, protein (ali njegov derivat) lahko oblikujemo (vgradimo v liposom ali pripravimo mikrosfere) in nato ga vgradimo v prehrambeni izdelek, kot so ohlajene pijače, ki imajo dodana barvila in sredstva za izboljšanje okusa.
Volumen zdravilne učinkovine lahko redčimo ali povečamo z inertnim materialom. Te pomožna sredstva so ogljikovi hidrati, posebaj manitoi, alaktoza, brezvodna laktoza, celuloza, modificirani dekstrani in škrob. Določene anorganske soli lahko uporabimo kot polnila, vključno z kalcijevim trifosfatom, magnezijevim karbonatom in natrijevim kloridom. Nekatera komercialno dostopna polnila so Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress in Avicel.
V trdno zdravilno obliko, v katero vgradimo zdravilno učinkovino, lahko vključimo tudi razgrajevalce. Sredstva, ki jih uporabimo kot razgrajevalce, niso omejena na škrob med katerega štejemo tudi komercialno dostopne razgrajevalce izdelane na osnovi škroba; lahko uprabimo tudi sledeče materiale Explotab, natrijev škrobni glikolat, Amberlite, natrijevo karboksimetilcelulozo, ultramilopektin, natrijev alginat, želatina, pomarančne lupine, kislo karboksimetilceluloza, naravne alge (kremenčev pesek) in bentonit. Drugačna oblika razgrajevalce je netopna kationska izmenjevaina smola. Uprašene gumje lahko uporabimo kot razgrajevalce in kot vezalce in pod te mislimo uprašene gumije, kot so agar, Karaya ali tragakant. Aiginska kislina in njena natrijeva sol sta tudi uporabni kot razgrajevalci.
Uporaba vezalcev omogoča izdelavo trdnih tablet in vključujejo materiale, ki so naravni produkti, kot so akacija, tragakant, škrob in želatina. Drugi obsegajo metilcelulozo (MC), etilcelulozo (EC) in karboksimetilcelulozo (CMC). polivinilpirolidon (PVP) in hidroksipropiimetilcelulozo (HPMC), lahko uporabimo alkoholno raztopino za pripravo granulata, ki vsebuje zdravilno učinkovino.
Drsljivece vgradimo v pripravek, da preprečimo lepljenje med proizvodnim procesom. Lubrikatorji tvorijo med zdravilnim pripravkom in steno pečata tanko plast, mednje pa prištevamo stearinsko kislino vključno z magnezijevo in kalcijevo soljo, politetrafluoretilen (PRFE), tekoči parafin, raslinska olja in voske. Topni drsljivci, ki jih uporabimo, so natrijev lavril sulfat, magnezijev lavril sulfat, poletileglikol različnih molekuslkih mas in Carbowax 4000 in 6000.
Drsljivci lahko izboljšajo pretočne lastnosti med izdelavo zdravilnega pripravka in jih lahko dodamo tudi med samim stiskanjem. Primerni drsljivci so škrob, smukec,kremenčev pesek in hidriran silikoaluminat.
Površinsko aktivne snovi lahko dodajamo kot močljivce, ki pomagajo pri raztapljanju v vodnem mediju. Med te površinsko aktivne snovi štejemo anionske detergente, kot je natrijev lavril sulfat, dioktil natrijev sulfosukcinat ali dioktil natrijev solfonat, benzetomijev klorid. Seznam potencialnih neionskih detergentov, ki jih lahko vključimo v zdravilni pripravke, kot površinsko aktivne snovi so lauromacrogol 400, polioksil 40 stearat, poioksietilen hidrogenirano ricinusovo olje 10, 50 in 60, glicerolmonostearat, poiisorbat 40, 60, 65 in 80, sukrozni ester z maščobno kislino, metilceluloza in karboksimetilceluloza. Te površinsko aktivne snovi so lahko prisotne v zdravilnem pripravku s proteinom ali derivatom, ali same, ali v zmesi, v različnih razmerjih.
Dodatki, ki potencialno povečujejo prevzem proteina (ali derivata) so na primer maščobne kisline, oleinska kislina, linolenska kislina in linolna kislina.
Zaželeni so zdravilni pripravki z nadzorovanim sproščanjem. Zdravilno učinkovino lahko vgradimo v inerten matriks, ki dovoljuje sproščanje z difuzijo ali z izpiranjem to so gumiji. V zdravilni pripravek lahko vgradimo matriks, ki se počasi razgrajuje. Drugačna oblika nadzorovanega sproščanja zdravilne učinkovine temelji na Oros terapevtskem sistemu (Alza Corp) t.j., da je zdravilna učinkovina zaprta s polprepustno membrano, ki dovoljuje vstop vode in zaradi nastalega ozmotskega pritiska skozi majhne odprtine učinkovina izhaja. Nekatere gastrorezistentne prevleke omogočajo zakasnjeno sproščanje.
Za pripravek lahko uporabimo druge prevleke. Mednje prištevamo številne sladkorje, s katerimi lahko izvedemo oblaganje v dražirnih bobnih. Zdravilno učinkovino lahko vgradimo v filmske tablete, material, ki ga porabimo za to pa delimo v dve skupini. V prvo skupino sodijo materiali, ki niso gastrorezistentni in vanjo prištevajo metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, metilhidroksietilceluloza, hidroksipropilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijeva karboksimetilceluloza, providon in polietilenglikoli. Drugo skupino sestavljajo gasrorezistentni materiali, ki so navadno estri ftalne kisline.
Zmes materialov lahko uporabimo, da zagotovimo optimalno filmsko prevleko. Filmsko oblaganje izvedemo v dražirnem bobnu ali v plasti zvrtinčenega zraka ali s kompresijskim oblaganjem.
Pulmonama aplikacija
V predloženem izumu je opisna aplikacija proteina (ali derivata) preko pljuč. Protein (ali njegov derivat) apliciramo preko pljuč pri sesalcih z inhalacijo in prehoda preko pljučnega epitela v krvni obtok. V drugih tovrstnih poročilih Adjel et al., Pharmaceutical Research, 7(6):656-569(1990): Adjei et al., Interrnational Journal of Pharmaceutics, 63:135-144(1990) (leuprolid acetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(supp. 5):143-146(1989)(endothelin-l); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3(3):206-212(1989) (ot1-antitripsin); Smith et al., J. Ciin. Invest., 84:1145-1146(1989) (a1-proteinaze); Oswein et al., Aerosolization of Proteins, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (marec 1990)(rekombinantni humani rastni faktor); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488(1988) in Platz et al., U.S.Patent št. 5,284,656 (granolocitno kolonijo stumulirajoči faktor). Za uporabo v praksi smo, v namene predloženega izum preiskusili širok spekter mehnskih naprav, ki so bile izdelane za pulmonalno aplikacijo zdravilnega pripravka, vključno in ne le, nebulizatorji, dozirani inhalatorji in praškasti inhalatorji, vsi, ki so poznani strokovnjakom.
Nekateri specifični primeri komercialno dosegljivih naprav, ki so primerne za praktično uporabo, skladno s tem izumom, je Ultravenotov nebulizator, ki ga proizvaja Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; the Acorn il nebulizator, ki ga izdeluje Marquest Medica, Products, Englewood, Colorado; Ventolin dozirani inhalatorji, ki jih izdeluje Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina in Spinhalrjev praškasti inhaler, ki ga proizvaja Fison Corp., Bedford, Massachusetts.
Vse te naprave zahtevajo zdravilni pripravek, ki je oblikovan za razprševanje proteina (ali derivat). Tipično, je to, da je vsak zdravilni pripravek specifičen in pripravljen za tip naprave in lahko uporabimo ustrezni propelent poleg običajnih polnil, dodatkov in/ali nosilcev, ki jih uporabimo v terapiji. Preiskusili smo tudi uporabo liposomov, mikrokapsul ali mikrosfer, vključno s kompleksi ali drugimi vrstami nosilcev. Kemično spremenjen protein lahko pripravimo v različnih zdravilnih pripravkih, odvisno pač od tipa kemične modifikacije ali tipa naprave, ki jo uporabimo.
Zdravilni pripravek, ki je primeren za uporabo v nebulizatorjih, z ustnikom ali ultrasonični, je tak, da protein (ali derivat) raztopimo v vodi, v koncentraciji približno 0.1 do 25 mg biološko aktivnega proteina na mililiter raztopine. V pripravek lahko vgradimo pufer ali enostaven sladkor (za stabilizacijo proteina in uravnavanje ozmotskega pritiska). Zdravilni pripravek za nebulizator lahko vsebuje površinsko aktivno snov, ki zmanjša ali prepreči površinsko izzvano agregacijo proteina, ki ga povzroči razprševanje raztopine pri tvorbi aerosola.
Zdravilni pripravek za dozni inhalator navadno vsebuje fino uprašen prašek, v katerem je vgrajen protein (ali derivat), ki je suspendiran v potisnem plinu s pomočjo površinsko aktivne snovi. Potisni plin je lahko snov, ki jo običajno uporabna v te namene, kot je klorofluoroogljik, hidroklorofluoroogljik, hidrofluoroogljik ali hidroogljik, vključno z triklorofluorometanom, diklorofluorometanom, diklorofluoroetanolom in 1,1,1,2tetrafluoroetanom ali njihova kombinacija. Primerne površinsko aktivne snovi so sorbitantrioleat in sojin lecitin. Kot površinsko aktivno spojino lahko uporabimo tudi oleinsko kislino.
Zdravilni pripravki, ki jih uporabimo za razprševanje iz praškastih inhalerjev, vsebuje fino uprašen suh prašek s proteinom (ali derivatom) in lahko vsebuje polnilo, kot je laktoza, sorbitol, sukroza ali manitol in količine ki pospešujejo disperzijo praška iz naprave t.j. 59 do 90% teže pripravka. Protein (ali derivat) lahko pripravimo v pravilni obliki s povprečno velikostjo delcev, ki je manjša od 10 pm (ali mikrona), najprimerneje je med 0.5 do 5 pm, za učinkovito aplikacijo v distalna pljuča.
Nazalna aplikacija
Preiskusili so nazalno aplikacijo proteina (ali derivata). Nazalna aplikacija omogoča prehod proteina v krvni obtok neposredno po aplikaciji zdravilnega pripravka v nos, brez nepotrebnega odlaganja produkta v pljuča. Zdravilni pripravek, namenjen nazalni aplikaciji, vsebuje dekstrane ali ciklodekstrane.
Metode zdravljenja, metode za pripravo zdravilnega pripravka
V nadaljevanju so opisne metode zdravljenja in izdelave zdravilnega pripravka. Pogoji pri aplikaciji predloženih derivatov so bili opisani zgoraj
Doziranje
Za vse zgoraj navedene molekule so izvedene študije, podatki se bodo nanašali na pravilno doziranje pri terapiji različnih obolenj pri različnih pacientih in navadno usposobljen delavec upoštevajoč terapevtski kontekst, starost in splošno zdravstveno stanje prejemnika, bo sposoben prilagoditi ustrezno dozo. Na splošno, za injiciranje ali aplikacijo infuzije, je doza med 0,01 pg biološko aktivnega proteina/kg telesne teže (preračunano na maso proteina samega, brez kemične modifikacije) in 10 mg/kg (na enaki osnovi). Dozirna shema se lahko spreminja, odvisno pač od razpolovne dobe med kroženjem uporabljenega proteina, ali derivata, ali polipeptid apliciramo enkrat ali kot kontinuirano infuzijo in uporabljen zdravilni pripravek.
Aplikacija z drugimi spojinami
Za terapijo debelosti lahko apliciramo opisani protein (ali derivat) v povezavi z eno ali več farmacevtskih pripravkov, ki jih uporabljamo za terapijo drugih kliničnih komplikacij, ki spremlja debelost, kot je zdravljenje sladkorne bolezni (t.j. insulin), visokega krvnega tlaka, holesterola in drugih stranskih učinkov, ki so povezani z debelostjo. Zraven lahko apliciramo druge supresorje teka, kot so amfetamini. Aplikacija je lahko simultana (npr. aplikacija zmesi proteinov in insulina) ali in seriatum.
Zdravljenje z nukleinskimi kislinami
OB gen lahko vnesemo v humano maščobno celico, da razvijemo gensko terapijo za debelost. Tako lahko pričakujemo, da bo prišlo do zmanjšanja telesne teže. Ali nasprotno, vnos komplementarne verige v humane maščobne celice lahko zmanjša vrednost oktivnega OB polipeptida in predvidimo, da pride do povečanja telesnega maščevja.
Gen, ki nosi kodni zapis za OB polipeptid vnesemo in vivo v virusni vektor. Tak vektor, oslabljen ali omrtvičen DNK virus, kot je, kar seveda ni omejitev, virus herpes simplex (HSV), papiloma virus, Epstein Barr virus (EBV), adenovirus, adeno vezan virus (AAV) in podobno. Najprimernejši so okvarjeni virusi, ki v celoti ali skoraj v celoti nimajo virusnih genov. Okvarjen virus po vnosu v celico ni infektiven. Uporaba defektivnih virusnih vektorjev omogoča vnos v celico v specifično lokalizirano področje, brez bojazni, da bo vektor okužil drugo celico. Torej adipozno tkivo lahko izberemo kot tarčno. Primeri določenih vektorjev so, kar pa ni omejitev, oslabljen herpes virus 1 (HSV1) vektor [Kaplitt et al., Moleč. Celi. Neurosci., 2:320-330(1991)] in mrtev adenovirus vektor, kot je vektor, ki so ga opisali Stratford-Perricaudet in sodelavci v J. Ciin. Invest., 90:626-630(1992) in oslabljen adeno povezan virusni vektor [Samulski et al., J. Virol., 61:30963101(1987); Samulski et at., J. Virol., 63:3822-3828(1989)].
Gene lahko vključimo v retrovirusni vektor, t.j. kot je opisal Anderson s sodelavci v U.S. Patentu št. 5,399,346; Mann et al., Celi, 33:153(1983); Temin et al., U.S. Patent št. 4,650,764; Temin et al., v U.S. Patentu št. 4,980,289; Markowitz ef la., J. Virol., 62:1120(1988); Temin et al., U.S. Patent št. 5,124,263; International Patent Publication št. WO 95/07358, ki ga je 16. marca 1995 objavil Dougherty skupaj s sodelavci in Kou ef al., Blood, 82:845(1993).
Vektor lahko uvedemo z lipofekcijo. V zadnjih desetletjih je bila uporaba liposomov za vgrajevanje in transfekcijo nukleinskih kislin zelo povečana.
Sintetski kationski lipidi, ki so izdelani tako, da omejujejo težave in nevarnosti, do katerih pride z liposomsko transfekcijo, lahko uporabimo za pripravo liposomov za in vivo transfekcijo gena, ki nosi zapis za označevalec [Felgner et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987); glej Mackey et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031(1988)]. Uporaba kationskih lipodov lahko izzove enkapsulacijo negativno nabitih nukleinskih kislin in fuzijo z negativno nabitimi celičnimi membranami [ Felgner et al., Science, 337:387-388(1989)]. Uporaba lipoinfekcije za vnos eksogenega gena v specifičen organ in vivo, ima določene praktične prednosti. Molekularno ciljanje liposomov na specifično celico predstavlja določeno prednost. Jasno je, da usmerjanje transfekcije na določen celični tip pomeni prednost pri tkivih, ki so celično heterogena, kot je pankreas, jetra, ledvica in možgani. Lipide kemično lahko združimo z drugo molekulo za namene ciljanja (glej Mackey et ai., 1988, supra). Ciljni peptidi t.j. hormoni ali nevrotransmiterji in proteini, kot so protitelesa ali nepeptidne molekule, kemično lahko povežemo z liposomi. Možno je, da vnesemo vektor in vivo, kot gol DNK plazmid. Gol DNK vektor za gensko terapijo lahko vnesemo v zaželeno gostiteljsko celico z metodami, ki so poznane v stroki t.j. transfekcijo, elektroporacijo, mikroinjiciranjem, transdukcijo, celično fuzijo, DEAE dekstran, precipitacijo s kalcijevim fosfatom, uporabo genskega topa ali uporabo transporterjev DNK vektorja (glej Wu et ai., J. Biol. Chem., 267:963-967(1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624(1988); Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, ki je bila vložena 15. marca 1990.
Uporaba v kmetijstvu
OB gen lahko izoliramo iz domačih živali in tako pridobimo odgovarjajoče polipeptide. V posebnem primeru, infra, sondo, ki jo pripravimo iz glodalskega OB gena hibridiziramo v ustrezno homologno kodno sekvenco iz velikega števila vrst živali. Kot je bilo že prej omenjeno za humano terapijo, rekombinantne proteine lahko pripravimo in apliciramo domačim živalim. Aplikacijo polipeptida lahko implementiramo, da dobimo živali s pustim mesom, ki so namenjeni prehrani, kot so govedo, prašiči, perutnina, ovce itd. Še primerneje je, če avtologni OB polipeptid apliciramo, čeprav je v izumu preučena samo aplikacija anti-avtolognih polipeptidov. Ker OB polipeptid sestavlja približno 160 amino kislinskih ostankov, ni nujno, da so zelo imunogene. Zatorej na nujno, da aplikacija neavtolognih polipeptida privede do imunskega odziva.
Alternativno, vnos kloniranih genov v transgene domače živali, bi omogočila potencialno zmanjšanje telesne teže in tolstosti s prekomerno ekspresijo OB transgena. Najenostavnejšše sredstvo za dosego tega je ciljanje na OB transgen za maščevje z uporabo lastnega, ali drugega specifičnega promotorja.
Ali obratno, povečanje telesnega maščevaja je lahko v drugačnih okoliščinah želeno, kot je pri razvoju Kobejevega goveda ali zamaščenih jeter, da pripravimo Foie gras. To lahko dosežemo s ciljanjem komplementarnega OB transgena ali z uporabo genske knock ouf' tehnologije. Ali drugače, kjer je potreba po povečanju telesne teže na račun maščevja, lahko apliciramo inhibitor ali antagonist OB polipeptida. Taki inhibitorji ali antagonistu obsegajo, kar seveda ni omejitev, protitelesa ki reagirajo s polipeptidom, in polipeptidnimi fragmenti, ki se vežejo, vendar ne aktivirajo OB receptorja t.j. antagonisti OB polipeptida.
Uporaba v kozmetiki
OB polipeptid je zelo uporaben tudi v kozmetiki, poleg tega da je koristen tudi za zdravje. Natančneje, ker so OB polipeptidi, ki so predmet izuma, vključno z derivati in agonisti njihovih analogov uporabni za uravnavnaje hitrosti in količine odlaganja maščobe v celici pri živalih, so uporabni za zmanjšanje neželenega maščobnega tkiva, t.j. maščobnih oblog na trebuhu, stegnih, vratu in bradi, ki niso nujno poseldica debelosti ampak samo vplivajo na videz posameznika. Učinek zmanjšanja maščobe lahko izvedemo delno z zmanjšanjem apetita t.j. z manjšim vnosom hrane, s povečanjem bazalnega metabolizma ali obojim. Opisani OB polipeptid ali njegovi derivati ali agonisti analogov so uporabni za aplikacijo pri posamezniku, če hočemo doseči kozmetične spremembe v maščobnih oblogah ali s uravnavanjem maščobnih oblog, zmanjšanjem apetita ali obojim.
Poleg tega, opisane pripravke in metode lahko uporabimo v povezavi z različnim postopki, kot so kozmetični kirurški posegi, da spremenimo celoten izgled telesa (t.j. liposukcijo ali posegi z namenom zmanjšanja telesne mase z aspiracijo ali odstranitvijo maščobnega tkiva), telesnimi vajami (posebaj tekom ali treningi z utežmi), dieto z malo maščobami, biofeedbackom, kot primer načinov s katerimi skušamo zmanjšati odstotek maščobnega tkiva in izboljšati izgled telesa.
Skaldno z izumom se le-ta nanaša tudi na metode za dosego kozmetične spremembe maščobnega tkiva pri posamezniku, ki želi kozmetične popravke maščobnega tkiva, zaradi ziboljšanjega videza, z aplikacijo količino OB polipeptida, derivata ali njegovega agonista analoga, ki vpliva na uravnavanje maščobe. Uravnavanje maščobnega tkiva je posledica zaviranja apetita. Uravnavanje maščobnega tkiva pravzaprav pomeni zmanjšanje maščobnega tkiva.
V izumu so opisane tudi metode za dosego kozmetične izgube telesne maščobe, ki zajema kombinacijo postopkov, ki vodijo do spremembe izgleda telesa, z aplikacijo take količine OB polipeptida, derivata ali njegovega agonista analoga, ki uravnava maščobo pri posamezniku, ki želi kozmetično uravnavanje maščevja, z namenom izboljšanja videza telesa.
OB receptor
K sintezi agonistov in antagonistov OB faktorja z majhno molekulo, bo v veliki meri pripomogla izolacija njegovega receptorja. To lahko izvedemo s pripravo aktivnega OB polipeptida, ki ga uporabimo za pregled ekspresijske knjižnice po standardni metodologiji. Vezavo na receptor, v tej ekspresijski knjižnic lahko preiskusimo z aplikacijo rekombinantnega polipeptida, ki je pripravljen z uporabo bakterijskega ali sesalskega ekspresijskega vektorja in opazovanje kratkoročnih učinkov in stalne aplikacije rekombinantnega polipeptida na celice ekspresijske knjižnice ali neposredno zasledovanje vezave OB polipeptida na celice.
Prepričani smo, da je OB receptor najverjetneje lociran v hipotalamusu in mogoče v jetrih, cDNK knjižnice teh tkiv bodo vgrajene v ekspresijski klonirani vektor. Te cDNK klone bomo lahko vnesli v COS celice, kot bazen, in dobljene transformante bomo pregledali z aktivnim ligandom za identifikacijo COS celic, ki ekspresirajo OB receptor. Pozitivne klone lahko zatem izoliramo tako, kot bi ponovno oživili klonirani receptor. Klonirani receptor bomo uporabili v povezavi z OB ligandi (obravnavali jih kot hormon), za pripravo potrebne komponente za pregled modulatorjev OB z majhno molekulo.
Uporabili bomo določen testni sistem, ki je skladen s tem izumom in je poznan kot receptorski test. V receptorskem testu je material, ki ga testiramo, označen in nato določene celične testne kolonije inokuliramo v taki količin, da je poznana količina označenega in neoznačenega materiala, po kateri nato izvedemo vezalne študije za določitev obsega vezanega označenega materiala na celični receptor. Na ta način določimo razlike v afiniteti med materiali.
Očiščeno količino modulatorja teže lahko radioaktivno označimo in združimo, na primer, s protitelesi ali drugimi inhibitorji in nato izvedemo vezalne študije. Zatem pripravimo raztopine, ki vsebujejo različne količine označenega in neoznačenega nevezanega modulatorja teže, celične vzorce nato inokuliramo in inkubiramo. Nastalo plast celic izperemo, raztopimo in nato štejemo z gama števcem tolikokrat, da je rezultat v okviru standardne napake <5%. Te podatke nato analiziramo po Scathard-u, in iz tega naredimo opažanja in zaključke, ki jih lahko prikažemo. Medtem, ko je sledeče primer, ki ilustrira način s katerim receptorski test lahko izvedemo in uporabimo v primeru, ko sposobnost celičnega veznaj testiranega materiala lahko služi kot lastnost za razlikovanje. Ali obratno, receptorski test bo uporaben za identifikacijo specifičnih receptorjev modulatorjev, ki so opisani v izumu, ko je db receptor.
Naslednji test, ki je uporaben za namene predloženega izuma je poznan po imenom cis/trans test. Na kratko, v testu sta potrebna dva genetska konstrukta, eden izmed teh je tipičen plazmid, ki neprestano ekspresira določen receptor, ki je za nas zanimiv, ko ga transfektiramo v ustrezno celično linijo in drugi je plazmid, ki ekspresira poročevalce, kot je luciferaza, ki je pod kontrolo kompleksa receptor/ligand. Torej, na primer, če želimo oceniti spojino, kot ligand za določen receptor je eden izmed plazmidov konstrukt, ki omogoča ekspresijo receptorja v izbrani celični liniji, medtem ko drugi plazmid poseduje promoter, ki je vezan na gen luciferaze, v katerega je vključen odgovarjajoči element na določen receptor. Če je spojina podvržena testiranju, je agonist za receptor, lignad tvori kompleks z receptorjem in nastali kompleks se veže na odgovarjajoči element in sproži začetek transkripcije gena luciferaze. Nastalo kemiluminiscenco lahko merimo fotometrično in dobimo odziv v odvisnosti od doze, ki jo primerjamo z znanimi ligandi. Protokol v nadaljevanju je opisan v podrobnosti v U.S. Patentu št. 4,981,784 in PTC International Publication št. WO 88/03168, za katere namene je prispevek naveden.
Ko rekombinantna genska sekvenca, ki omogoča ekspresijo OB receptorja identificirana, lahko OB receptor analiziramo. To dosežemo s testom, ki temelji na fizikalnih in funkcionalnih lastnostih OB receptorja, vključno z radioaktivnim označevanjem receptorja, ki mu sledi analiza na gelski elektroforezi, imunotestu, vezavi liganda, itd. Nadalje, protitelesa proti ob receptorju lahko nastajajo, kot je opisano v nadaljevanju.
Zgradbo OB receptorja lahko analiziramo z različnimi, v stroki poznanimi metodami. Ugotovljeno je, da obstajajo različne zgradbe, posebaj
OB vezalnega mesta. Analizo zgradbe lahko izvedemo z identifikacijo podobnosti sekvence z drugimi poznanimi proteini, posebaj hormonskih in proteinskih receptorjev. Stopnja podobnosti (ali homologije) je lahko osnova za predpostavljanje strukture in funkcije OB receptorja ali njegovo področje. Lahko izvedemo primerjave zgradbe s sekvencami, ki jih najdemo v GenBanki z uporabo na primer FASTA in FASTP programov [Pearson et sl., Proč. Natl., Acad., Sci. USA, 85:2444-48(1988)].
Proteinsko sekvenco lahko nadalje karakteriziramo z analizo hidrofilnosti (Hopp et al., 1981, supra). Profil hidrofilnosti lahko uporabimo za identifikacijo hidrofobnih in hidrofilnih področij OB receptorja proteina, ki lahko v zameno nakaže ekstacitoplazmatsko, membransko vezavo in intracitopiazmatska področja.
izvedemo lahko tudi analizo sekundarne strukture (Chou et al., 1974, supra), da identificiramo področja OB receptorja, ki nakazuje na specifično sekundarno strukturo.
Manipulacija, translacija in predvidenje sekundarne strukture, kot tudi okvir, ki ga lahko preberemo in narišemo, lahko zaključimo z uporabo računalniškega programa, ki so na voljo.
S tem, da zagotovimo dodaten vir rekombinantnega OB polipeptida in možnosti, da izoliramo OB receptor (t.j. db genski produkt) predloženi izuma omogoča kvantitativno določitev strukture aktivne konformacije OB polipeptida in OB receptorja in njegovega področja. Natančneje dovolj materiala potrebnega za nuklearno magnetno resonanco (NMR) in infrardečo (IR), Raman in ultravijolično (UV) in posebaj krožno dikroizem (CD) spektroskopsko analizo. Posebaj NMR omogoča zelo učinkovito analizo strukture molekule v raztopini, ki je zelo dober približek njegovemu naravnemu okolju (Marion et al., 1983, supra; Bar ef al., 1985, supra; Kimura ef al., 1980, supra). Uporabimo lahko tudi druge metode za določevanje strukture. Te so tudi kristalografija z X-žarki (Engstom, 1974, supra).
Lahko preučujemo tudi ko-kristale OB polipeptida in OB receptorja. Analiza ko-kristalov daje podrobno informacijo o vezavi, ki v zameno omogoča racionalno načrtovanje agonistov in antagonistov lignada. Lahko se poslužimo računalniškega modeliranja, seveda v povezavi z NMR ali metode z X-žarki [Fletterick ef ai., eds. Computer Graphics and Molecular
Modeling in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].
Identifikacija in izolacija gena, ki nosi zapis za OB receptor, ki je predmet izuma, omogoča ekspresijo receptorja v količinah, ki so večje kot bi jih lahko izolirali iz naravnih virov ali v indikatorski celici, ki so oblikovane tako, da nakazujejo aktivnost ekspresiranega receptorja po transfekciji ali transformaciji celic. Poleg racionalnega oblikovanja agonistov in antagonistov, ki temelji na strukturi OB polipeptida, je v predloženem izumu opisana tudi alternativna metoda za identifikacijo specifičnih ligandov OB receptorja z uporabo različnih, v stroki poznanih, sejalnih testov.
Za boljše razumevanje izuma so opisani sledeči Primeri, ki naj bili reprezentativni primeri izuma vendar, naj ne bi pomenili ovire.
PRIMERI
V nadaljevanju bodo opisne metode, ki smo jih uporabili za identifikacijo genetskega materiala, in so reprezentativni primeri predloženega izuma. Prizadevanje obsega štiri postopne korake. A) Mapiranje genov B) Fizikalno mapiranje C) Izolacija želenega gena in D) Določanje mutacij. Sledečo trditev, da smo glodalski gen izolirali iz osebka (korak D) in iskali homologni humani gen ter oba glodalski in humani geni in domnevnim proteinom smo določili lastnosti. Koraki so podrobneje opisani v nadaljevanju.
A. Mapiranje genov
Mutacija ob je poseldica genetskega križanja, za določitev mesta mutacije relativno na RFLPs (polimorfizrm dolžine restrikcijskega gena) smo uporabili standardno vezno analizo. Dobljeni podatki kažejo, da se OB gen nahaja na « 5cM intervalu na proksimalnem mišjem kromosomu 6. (5 cM je merilo oddaljenosti gena glede na 5 navideznih križanj genov na 100 živali). Skupno je bilo izvedenih 771 mejoz, ki so bile podvržene kasnejšemu mapiranju genov (Friedman et al., 1991, supra). Genetski loči, ki je bil določen relativno glede na OB, so že bili prej objavljeni. Dva najbližja opisana RFLP-ja sta bila določena s sondo karboksipeptidaznega in met onkogenega gena.
Genetska resolucija, zoraj opisanih poskusov, je bila nezadostna za kloniranje ob, v principu, ker noben genetski označevalec ni bil tesno povezan. Z namenom določevanja je potreben tesno povezan RFLP, izolirali smo dodatne sonde in razširili genetsko križanje. Poznano metodo, kot je kromosomska mikrodisekcija, smo uporabili za izolacijo naključnih delov DNK iz proksimalnega mišjega kromosoma 6 [Bahary ef al., Mammalian Genome, 4:511-515(1993)]. Posamezne klonirane sonde smo preizkusili na jakost vezave na ob. Na osnovi teh študij smo eno sondo, D6Rck13, tudi imenovano psd3, izbrali za nadaljne analize, glede na to, da je imela lastno genetsko približnost na OB. To sondo smo uporabili za genotip 835 ob potomstva iz interspecifičnih in intersubspecifičnih križanj, kar kaže da D6Rck13 je nerekombinanten v vseh 835 živalih, kot je poročal Bahary in sodelavci. V tem primeru fizikalnega mapinga smo identficirali nov polimorfni označevalec iz kozmida subklona, ki smo ga dobili iz YAC53A6. Ta nov označevalec se nahaja med D6Rck13 in OB genom in je bil uporabljen za genotip dodatnim 771 informativnim mejozam iz intraspecifičnega interkrižanja in zadnjega križanja. Pri posamezni živali št. 167 smo določili, da prenaša rekombinantno križanje med ob in D6Rck39. Te študije kažejo, da je D6Rck39/D6Rck13 -0,06 cM oddaljen od ob. Z dodatno sonda Pax4 smo določili, da je bila 12 cM proksimalno glede na ob. Pax4 je bila rekombinantna v dveh živalih, št. 111 in št. 420. Pax4 je pseudogen, ki ga je Gruss s sodelavci predhodno mapirl na proksimalnem mišjem kromosomu 6 [Gruss ef al., Genomics, 11:424-434(1991)]. Na tej osnovi je bilo določeno da OB gen obstaja - 0,2 cM intervala med Pax4 in D6Rck13. To vodi k naporom, da kloniramo DNK in k izolaciji OB.
Fizikalno mapiranie
Kloniranje DNK v tem intervalu je omogočil uporabo umetnih kromosomov kvasovk (YAC), relativno nov vektor za kloniranje dolgih cerih kontignih DNK s pogosto več kot milijon baznimi pari v doložino.
Umetni kromosomi kvasovk so bili izoliranin z uporabo D6Rck13 in Pax4. To je bili izvedeno s pomočjo priprave prečiščeneih DNK sond in njihovo uporabo za izolacijo odgovorjajočega YAC. Te YAC (št. 8, 16, 107 in 24) smo izolirani in najprej določili lastnosti in na osnovi dobljenih rezultatov analize zaključili, da je bil YAC 16 tisti, ki je segal najdlje distalno, bližje ob. Ključni konec YAC št. 16 smo obnovili in določili, da je bil ta rep bližji ob kot Pax4. Ta rep smo poimenovali 16M(+). Do teh zaključkov smo prišli po tem, ko je bilo razvidno, da ta sonda ni bila rekombinantna v živalih št. 420 (kot je bil Pax4). Temu repu smo sekvenco določili z PCR testom. Ta PCR test smo uporabili za pregled YAC knjižnice. Izolirali smo štiri pozitivne klone. Ustrezno karakterizacijo teh YAC z določevanjem repov, restrikcijskim mapiranjem, gelsko elektroforezo in Southern blottingom z genetskih križanjem smo določili, da dve od teh YAC adu in aad sta bili kritični za ustezne študije. YAC aad ima 550 kB nekimerična YAC, ki se razteza najdlje distalno. Distalni rep tega YAC aadfpICL) smo uporabili za dopolnitev fizikalnega zemljevida. YAC adu ima 370 kB nekimerni YAC in distalni rep adu(+) smo določili, da je nerekombinanten v vseh ob potomcih po genetskem križanju, vključno z živalmi št 111 in št. 167., kar nakazuje, da je lahko OB gen ostal v tem YAC.
S PCR testom za ta dva repa, aad(plCL) in adu(+) smo razvili in uporabili za izolacijo več YAC in P1 klonov, da smo nadaljevali s fizikalnim mapiranjem. Pomemben P1 klon, ki je bil izoliran, vključuje 498, 499, 500 (izolirani imajo tudi sondo, ki smo jih pridobili iz aad(plCL)) in 322, 323 in 324 (uporaba sond iz adu(+)}.
M tem vmesnem času, smo določili lastnosti YAC, ki smo jih izolirali s D6Rck13 (54A6, 25A8„ 25A9, 25A10). Te študije so določile, da 53A6 se razteza najdlje proksimalno proti aad YAC. Določili smo, da je praznina med 53A6 in aad velika približno 70 kB. Ključni rep 53A6, 53(plCL) smo nato uporabili za pregledovanje treh YAC klnjižnic, ko so na voljo, in P1 knjižnice. Kritičen P1 klon, 325 smo izločili. Klon P1 se je prekrival s kloni P1, ki smo jih izolirali z aad(plCL), kot je bilo opisano zgoraj, in je služil za zapolnitev praznine med 53(plCL) in aad(plCL). Kot rezultat smo klonirali celotno verigo, ki jo sestavljajo YAC in P1 klon s približno 2,5 milijoni baznih parov v dolžino in podaljšek Pax4, 16M(+), adu(+), aad(plCL), 53(p!CL), D6Rck39 in D6RCK13. S pazljivim mapiranjem mest rekombinacije pri živalih št. 111 in št. 167 iahko zaključimo, da se OB nahaja na intervalu 400 kB. Da bi potrdili delovni vir DNK za izloacijo OB gena približno 500 kB krije to nerekombinirano področje v celokupnem klonu 24
Ρ1. Ta Ρ1 kloni, vključno z 322 in 323, za katerega smo kasneje ugotovili, da sta uporabna klona, ki smo jih uporabili za lovljenje eksona.
Fizikalna mapa dela kromosoma, ki nosi zapis za OB je prikazan na sliki 7A. Slike 7B predstavljajo YAC stike. Na sliki 7A je predstavljen stik P1.
C. Izolacija ustreznega gena
Metoda, ki smo jo uporabili za izolacijo genov je bila lovljenje eksonov. V tej metodi uporabimo komercialno dostopen vektor za identifikacijo podaljška DNK (t.j. kodirajpče sekvence) z izbiranjem za funkcionalni akceptor in donorsko sekvenco v genomski DNK, ki jo vnesemo v poskusni konstrukt. DNK iz teh P1 klonov zrastejo in jih nato subkloniramo v podaljšek loveči vektor. Ti kloni so kratki vložki, ki jih kloniramo v Bluescript vektor. Vsak klon smo pomnožili z reakcijo PCR z PCR verigami, ki odgovarjajo plazmidnim sekvencam, ki je komplementarna vložku. Pomnoževanje s PCR smo izvedli neposredno na bakterijo, ki nosi plazmid. Reakcijo smo vodili z uporabo Biomek robota. PCR produkt smo dali na elektroforezo, na 1% agarozni gel v TBE pufer, ki je vseboval etidijev bromid. Metodo lovljenja podaljška smo prilagodili, da smo se izognili kontaminaciji DNK E. coli iz P1 klona in da smo pregledali dodatne podaljške, ki se razrezajo v 80-90% domnevno ujetih podaljškov. Vektor, ki lovi podaljške, vključuje HIV sekvenco, kratek segment tega vektorja nosi zapis, ki odgovarjajo temu dejstvu.
Poskus lovjljenja eksona smo izvedli z uporabo P1 klonov. Tovrstne produkte smo nato pomnožili s PCR, jih selekcionirali in določili sekvenco. Sekvence domnevnih '‘podaljškov smo primerjali s tistimi v GenBank, z uporabo Blast računalnškega programa. Približno petnajst eksonov smo izbrali za nadaljne raziskave s RT-PCR, Northern analizo in zoo pivnanje za prisotnost odgovarjajoče RNK ali ohranjene sekvence. Za sedem izmed petnajst eksonov, 325-2, 323-9, D1-F7, 1H3 in 2G7 smo ugotovili, da nosijo kodni zapis za RNK transkript. 235-2 je za testis specifičen gen, 323-8 in 323-9 sta podobna eksona iz enakega gena, ki se pretežno ekspresira v možgnih in ledvicih. IH3 in 322-5 predstavljata dva transkripta nižjih možganov. D1-F7 je ekson iz predhodno kloniranih genov, inozin monofosfatne dehidrogenaze (IMPDH), ki ima splošen ekspresijski vzorec.
Noben izmed teh genov naj ne bi nosil kodnega zapisa za OB. 2G7, ki je ekson OB opisan v nadaljevanju.
Po treh neuspešnih poskusih, da bi zasledniii ekson OB gena smo izvedli drugačen poskus, da smo zbrali DNK iz vseh P1 iz kritičnih OB področij. To vključuje P1: 258, 259, 322, 323, 324, 325,498, 499, 500, 653, 654 in drugih. Nato smo P1 258, 260, 322, 498 in 499 subklonirali v vektor za lovljenje eksona in pripravili več petrijevk z bakterijskimi kloni, vsak izmed njih je vseboval domnevni gen. Izolirali so približno 192 klonov, predstavljajo domnevni OB kandidat. Kot je zapisano zgoraj, obstoječi artifakt, kot je mnogo od teh, vsebuje dva ujeta eksona, ki smo jih dobili iz opazovanega vektorja. Torej, klone smo identificirali po njihovi velikosti in po dejstvu, da hibridizacija DNK sond ustreza tem hibridiziranim artefaktom, ki se prilegajo trakovom na gelu po pivnanju po Southern-u. Na ta način smo izključili 185 izmed 192 klonov iz nadaljnih preučevanj. Izključitev teh artefaktov ki je temeljila samo na velikosti, ni bila mogoča, ker bi konec koncev vodilo do izključitve eksona, ki ustreza OB.
Izmed 192 eksonov smo jih izbrali sedem, za nadaljne preučevanje. Pripravili smo šablone za določevanje sekvenc sedmim eksonom in določili sekvence. Določili smo sekvence sedmim eksonom in ugotovili, da je bilo sedem identičnih, eden pa je bil navidezen artifakt. Natančneje, klon 1D12 je vseboval HIV sekvenco t.j. trak za artifakt. Preostali trije eksoni za nadaljno analizo 1F1, 2G7 in 1H3. 1F1 smo izločili zato, ke smo z mapingom določili, da je izven kritičnega področja. Izbrali in sintetizirali smo PCR verige za 1H3 in 2G7.
Določili smo sekvence eksona na 2G7 in je prikazana na sliki 10 ($EQ ID NO:7). Izbrali in sintetizirali smo PCR verigo za 2G7. Del sekvence, ki odgovarja RCR verigi je podčrtan. Uporabljene verige So bile:
5’ CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Trn = 60.0°) (SEQ ID NO:8)
3’ CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60.0°) (SEQ ID NO:9)
S pomočjo te verige smo genom DNK pomnožili; 25-30 ciklov pri 55 °C žgali 2 minuti, 72° raztegnitev 2 minuti, 92°C denaturacija 1 minuto v standardnem PCR pufru. Te verige smo uporabili za pripravo označenih sond z 32P-dCTP s PCR reakcijo, kar ustreza zmanjšanju količine hladnega dCTP.
RT-PCR smo izvedli na različnih tkivnih RNK in lahko zaključimo, da je do ekspresije 2G7 prišlo samo v belem maščevju med vsemi pregledanimi tkivi (slika 11A). Zatorej z 32P označen 2G7 smo hibridizirali v tkivne RNK s pivnanjem po Nothern-u (slika 11 B) in dokazali, da je bila ekspresija RNK visoka, vendar ni bila ekspresirana ali je bila ekspresija zelo nizka v ostalih tkivih (kjer so rezultati lahko posledica onečiščenja tkivnega preparata). 10 μ9 celokupne RNK iz vsakega navedenega tkiva smo dali na elektroforezo, na agarozni gel s formaldehidom. Sondo smo hibridizirali s pomočjo pivnanja, pri 65°C v standardenm hibridazicijskem pufru, Rapid Hybe (Amsersham). Velikost RNK je bila približno 4.8 kB. Pri tej točki smo mnenja, da je 2G7 primeren kandidat gena za OB in smo ga dali v nadalnje analize.
D. Zasledovanje mutacij
Da bi potrdili, da 2G7 nosi kodni zapis za OB gen, je bilo potrebno prikazati razlike v količini ekspresije RNK DNK sekvence tega gena v mutantu, v primerjavi z vrednostjo pri divjih živalih. Dve ločeni mutaciji ob gena sta bili na voljo za študij, C57BL/6J ob/ob (1J) in Ckc/Smj ob/ob (J). V nadaljevanju ju bomo poimenovali 1J in 2J (uporabljena je neformalna nomenklatura glede na miši, katere smo uporabili v študiji. V teh specifikacija in slikah je jasno, da se C57BL/6J nanaša na C57BL76J+/+; CKC/smj pa se nanaša na SM/Ckc-+Dac-+/+; CKC/smj ob/ob se nanaša na SM/Ckc-+Dac-ob21/ob21). RNK smo izolirali iz maščobnega tkiva, ki je bil izoliran iz 1J, 2J in kontrolne živali. Celokupno RNK, za vsak vzorec, smo obdelovali z DNazo in nato še reverzno prepisali z uporabo oligo-dT, kot šablona z reverzno transkriptazo. Nastalo enojna cDNK smo nato pomnožili s PCR ali s šablonami 2G7 (pogoji so navedeni zgoraj) za nižje trakove ali s komercialno dostopno aktinsko verigo za zgornje trakove. RTPCR produkt smo dali na 1% agarozni TBE gel, ki smo ga barvali z etidijevim bromidom, (slika 12A). Z uporabo RT-PCT smo ugotovili, da medtem, ko je potekala ekspresija 2G7 mRNK v 1J in vseh ostalih kontrolih miših, pri miših 2J do ekspresije sploh ni prišlo. Tudi po 30 ciklih nismo zasledili signala. Ta poskus je dokaz, da 2G7 odgovarja eksonu OB gena.
Ker je mutacija 2J relativno nova in ostaja v koizogenem sevu, je bil ta rezultat na voljo kot dokaz, ki kaže, da je 2G7 ekson OB gena. Mutacija naj bi bila locirana na promotorsekm področju, kar vodi v popolno odsotnost sinteze mRNK. Prisotnost signala pri 1J miših v RT-PCR poskusu, da je 1J lahko nosilec točkovne mutacije, ki nima za posledico velike spremembe v velikosti RNK vzorca. Poleg tega, 2G7 mRNK ni bila prisotna, ko smo preiskušali s RT-PCR štiri dodatne 2J živali.
Rezultate smo potrdili s pivnanjem po Northern-u (slika 12B). RNK maščobnih celic smo pripravili iz vsakega seva (c57B1/6J, 1J, CKC/sm in 2J). 10g gg RNK smo dali na agarozni gel in določali z metodo pivnanja. Liso smo sondirali z 2G7 sondo, ki smo jo iznačili s PCR s pomnoževanjem materiala t.j. šablone, na sliki 11 z uporabo 32P-dCTP v PCR reakciji. Aktin je kontrola za količino naložene RNK. Aktinski signal je podoben v vseh vzorcih. OB signal ni prisoten v možganih, saj je mRNK specifična za maščobne celice.
Rezultati metode pivnanja po Northern-u so potrdili, da 2G7 specifična RNK ni prisotna v 2J miših, ob RNK ni tudi v CKC/smj ob/ob miših, saj je ta gen v sevu debelih miši poškodovan tako, da se RNK ne tvori. Poleg tega, je vrednost 2G7 RNK porasla 10 do 20-krat pri 1J, kot tudi db/db maščoba. Ti rezultati so primerljivi s hipotezo, da OB kodira krožeče hormone ali je odgovorna za tvorbo signala iz maščobnih celic, ki uravnavanjo telesno težo. Ti rezultati potrjujejo, da 2G7 je OB gen in predpostavljamo, da 1J miši imajo točkovno mutacijo, po vsej verjetnosti nepomembno mutacijo, ki vodi v prezgodnjo transalcijsko zaključevanje.
Rezultate analize po Norther-u smo ponovili z RNK maščobnih celic, ki so bile izolirane iz različnih 2J živali (slika 13). V tem testu je ap2 specifičen maščobni transkript, ki smo ga uporabili, kot kontrolo podobno kot aktin na sliki 12B. V tem pirmeru ni signifikantne spremembe gostote ap2 traka. ap2 je bil označen s pripravo PCR šablon, po opisanih ap2 sekvencah. RT-PCR produkt maščobnih celic RNK smo nato ponovno označili po enakem postopku, kot pri PCR označevanju. Ta analiza potrjuje prisotnost OB mRNK v normalnih homozigotnih in heterozigotnih živalih in je odsoten pri 2J mutantih.
Mutacije smo določili pri 1J miših. Mutacija je taka, da bazo C zamenja baza T, kar povzroči spremembo arginina, v navidezno zrelem stop kodonu na aminokislini 108 kar prispeva k 1J mutaciji (slika 14) kljub visoki ekspresiji ob mRNK (glej sliki 12 in 13, C57BL/6J ob/ob vrste).
Kasnaje smo izvedli še pivnanje po Southern-u, da bi potrdili, da je 2J mutacija posledica DNK spremembe, ki smo jo zasledili na repu 5’ OB, ki kaže, da je RNK ekspresija popolnoma odsotna. Natančna narava te možne preureditve ostaja še nerazjasnjena.
Genomski pivnik DNK po Southern-u iz CKC/smj (SM/Ckc-+DaG) in C57BL/6J miših, z uporabo štirih različnih restrikcijskih endonukleaz, smo izvedli z namenom, da bi določili enkratni vzorec fragmenta mutiranega ob (slika 15A). Približno 10 pg DNK (ki smo ga izolirali iz genomske DNK, iz jeterm ledvic ali vranice) smo podvrgli delovanju restrikcijskega encima. DNK smo dali na elektroforezo, na 1% agarozni TBE gel. DNK smo prenesli na imobilion membrano in hibridizirali s PCR označeno 2G7 sondo. Ključni trak je najvišji trak pri razgradnji Bgl\\ za CKC/smj ob/ob (SM/Ckc+DACo/j2i/o/327) dnK. Ta trak ima višjo molekulsko maso, kot pri drugih sevih, kar kaže na mutacijo v tem sevu.
Slika 15B prikazuje BglU pivnik po Southern-u, ostanka genomske DNK iz roda ob21/+ x ob21/+ križanja. Nekatere DNK imajo samo zgornji trak, nekatere samo spodnji trak, nekatere pa imajo oba traka. Živali samo z zgornjim sevom so ali debele t.j. ob21/ob21. Ti podatki kažejo, da se polimorfizem (t.j. mutacija), prikazan na sliki 15A, sešteva v genetskem smislu.
PRIMER 1: Kloniranje cDNK in določevanje sekvence OB
Z uporabo označene 2G7 PCR sonde smo izolirali skupno pedesetih mišjih cDNK klonov iz glodaiski maščobnih celic Xgt11 cDNK knjižnice (Clonetech 5’-STRETCH cDNK iz testikularnih maščobnih blazinic švicarskih miši, #ML3005b) in trideset križanih hibridiziranih humanih cDNK klonov iz humanih maščobnih celic Xgt10 cDNK knjižnice (Clonetech 5’-STRETCH cDNK iz trebuha #HL1108a). Iskanje po knjižnici smo izvedli po postopku dvigovanja plošče. Filtre iz dvignjene plošče smo denaturirali s pomočjo avtoklava. Filtre smo hibridizirali v dvojniku, s PCR označeno 2G7 sondo (Rapid Hybe pufer, 65°, preko noči). Po 2 do 4-ih urah prehibridizacije smo filtre sprali v 2x SSC, % SDS, dvakrat po 30 minut pri 65°C in nanj položili rentgenski film. Duplikat s pozitivno liso smo čistili. Prečiščene fage iz lise smo pomnožili s PCR, z uporabo komercialno dostopnih vektorskih verig t.j. Xgt1O in Xgt11. Nastali PCR produkti odgovarjajo vložku cDNK, ki smo ga vstavili v vsak fag, z majhno količino vektorske sekvence na obeh repih. Trakove smo gelsko čistili in določili sekvenco v ABI avtomatskem sekventorju in vektorske verige za sondiranje DNK polimeraz.
Nekatere podatke sekvence smo pregledali ročno, bazo za bazo, da bi popravili morebitne računalniške napake. Ko smo dobili pravilno sekvenco, smo verigo sintetizirali in uporabili za nadaljnje določevanje sekvence. Take poskuse smo ponavljali, dokler vsak dostopen cDNK klon ni imel določene sekvence in imel sintetizirane komplementrane verige. Določili smo približno 3000 baznih parov iz 5’ repa mRNK. Eden izmed cDNK klonov se razteza do 5’ repa mRNK, ker je sekvenca identična sekvenci 5’ RACE, produktu maščobnega tkiva RNK (podatki niso prikazani).
Iz podatkov o sekvenci je razvidno, da je 167 aminokislin odprtih za branje (slika 1). Kozakova začetna translacijska sekvenca predstavlja z adenozinskim ostankom tri baze navzgor od ATG. Našli smo cDNK, ki ju s pomočjo inkluzije ali ekskluzije lahko razvrstimo v dva različna razreda, glede na to ali je enojni glutaminski kodon, vključen ali ne. Najdeni preostanek se nahaja na položaju, takoj za 3’ združitvi akceptorja na 2G7 eksonu. Odkar je CAG kodon glutamina vključen v možno AG združitveno mesto z akceptorsko sekvenco se zdi, da pride do zdrsa na mestu združenja akceptorskega mesta z navideznimi tremi baznimi pari zanikanjem v podverigi cDNK, kot je prikazano spodaj.
gin ser val ag CAG TCG GTA (z glutaminom) (SEQ ID NO: 17) t
(točka združitve z akceptorskim mestom) ser val ag CAG TCG GTA (brez glutamina) ΐ
(točka združitve z akceptorskim mestom) ag v zgornji sekvenci odgovarja domnevni intronski eskvenci vzdolž verige glutaminskega kodona, AG je domnevno alternativno cepitveno mesto. Ta glutaminski ostanek je nameščen v visoko ohranjenem področju molekule in njegova pomembnost za biološko aktivnost še ni poznana.
Določili smo signalno sekvenco N-terminala, signalno cepitveno mesto, za katerega smo domnevali, da je karboksi terminal na alaninskem ostanku, na položaju aminokisline 21. Ta domnevno signalno sekvenco smo potrdili z uporabo računalniškega algoritma, z metodi po von Heijne-ju. Z uporabo te metode smo določili najbolj verjetno signalno sekvenco na področju polipeptida, ki odgovarja aminokislinam 1 do 23, ki imajo sekvence:
MCWRPLCFRLWLWSYLSYVQA t VP (SEQ ID NO: 10) v kateri puščica nakazuje domnevno cepitveno mesto signalne sekvence. Preostanek aminokislinske sekvence je bil zelo hidrofiln in ni bilo strukturnih razlogov ali membranskih napak drugačnih, kot da je Nterminalna signalna sekvenca. Specifično, nismo našli kompromisne sekvence za N glikozilacijo ali dibazično aminokislinsko sekvenco, ki kaže na cepitev proteina v predvideni proizvodnji proteina (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, str. 177-223, C.V. Scriver et al., uredniki, McGraw-Hill, New York). Podatkovna baza za iskanje na osnovi Blast in block programa, ni pripeljal do identifikacije homolognih sekvenc.
Humano RNK iz maščobnega tkiva smo analizirali z metodo pivnanja po Northern-u, zasledili smo RNK vrste podobnih velikosti, kot je mišji ob gen. Določevanje sekvence in analiza cDNK klonov daje vedeti, da humani OB kodira tudi polipeptid s 167 aminokislinami, (slika 2A in B, slika 3). dva razreda cDNK z ali brez treh baznih parov smo našli tudi pri človeku (slika 6). Mišji in humani OB gena sta zelo homologna v domnevni kodnem področju, venda kažeta samo 30% homolognost pri dosegljivih 3’ in 5’ področjih, kjer do translacije ni prišlo. N-terminalna signalna sekvenca je bila prisotna tudi pri humanem OB polipeptidu. Primerjava humane in mišje OB sekvence polipeptida kaže, da sta dve molekuli identični, glede aminokislin v 83 % (slika 4). N-terminal zrelih proteinov, iz obeh vrst, sta še bolj homologni, s samo šest konzervativnih in tremi nekonzervativnimi aminokislinskimi zamenjavami med N-terminalnimi 100 aminoksilinskimi ostanki.
Genomsko DNK smo izolirali iz miši, podgane, zajca, voluharja, mačke, krave, ovce, prašiča, človeka, piščanca, in Drosophilia in jo izpostavili omejeni digestiji z £coR1. Po digestiji, smo ostanke dali na elektroforezo, na 1% agarozni gel z TBE gelom. DNK smo prenesli na negibno membrano in nato označili s sondo, ki je 2G7 označena s PCR reakcijo. Filter smo hibridizirali pri 65°C in izpirali z 2x SSC, 0.2% SDS pri 65° dvakrat po dvajset minut je trajalo vsako izpiranje t.j. izmenjali smo dva pufra. Podatki kažejo, da je OB ohranjen pri vretenčarjih (slika 16). pri tem si je pomembno zapomniti, da je 2+ signal v ribji (ell); ell je riba.
Če vse skupaj povzamamo, dokazi, ki so na voljo kažejo, da sta telesna teža in tolstost fiziološko kontrolirani. V sedmih letih raziskovanja smo začeli z identifikacijo dveh ključnih komponent tega sistema; OB in DB gena. Kot je prikazano v primeru, sedaj smo identificirali OB gen kot gen, ki je gen specifičen za debelost in ima kot tak ključno vlogo pri uravnavanju telesne teže. Produkt tega gena, ki se po vsej verjetnosti izloča kot hormon, bi imel pomembno vlogo pri postavljanju diagnoze in zdravljenju prehrambenih motenj pri ljudeh in nečloveških živalih.
PRIMER 2: Ekspresija OB v bakteriji
Glodalska in humana cDNK nosita zapis za ob, ki smo ga vnesli v pET-15b ekspresijski vektor (Novagen). Ta vektor vključuje promotor T7 v povezavi z lac operatorjem in ekspresira fuzijski protein, ki ima histidinski tag (His-tag) in mesto cepitve za trombin, takoj za kodno sekvenco vključitvenega mesta (slika 17)(SEQ ID NOS:11 in 12).
Mišji in humani cDNK smo modificirali tako, da smo alanin na koncu signalne sekvence pretvorili v Ndel mesto, kot je bilo pri ločeni sekvenci na mestu 3’. Vključevanje Ndel mesta smo izvedli z uporabo PCR z novejšimi verigami:
Mnde-5’ (glodalski peta osnovna veriga)
CTTATGTTCCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO: 13)
Mnde-3’ (glodalski tretji osnovna veriga)
TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO: 14)
Hnde-5’ (humana peta osnovna veriga)
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO: 15)
Hnde-3] (humana tretja osnovna veriga)
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO: 13)
Verige imajo šest baznih parov, ki so neustrezni v sredini, ki predstavljajo Ndel restrikcijsko mesta na vsakem koncu PCR fragmenta. V fag vgrejeno mišjo ali humano cDNK, smo pomnožili s PCR in uporabili te verige. PCR produkt smo izpostavili digestiji z Ndel in gelsko čistili na 1% agaroznem gelu z nizko talilno točko. Gelsko očiščene verige smo subklonirali v pET vektor. Dobljenim plazmidom smo določili sekvenco, da smo se prepričali da ni prišlo do mutacij, med posameznimi PCR koraki pomnoževanja pri kloniranju. Pripravili smo konstrukte humane in glodalske cDNK, ki nosijo kodni zapis in tiste, ki so brez glutamina 49. Natančneje, pET 15g konstrukt ima ali humano ali mišji OB kodno sekvenco, brez signalne sekvence in je združena z His-tag in je bila pripravljena s PCR metodo kloniranja. Konstruktu smo določili sekvenco, da bi zagotovili, da ni prišlo do napak v kodnem področju OB gena med cikli pri PCR pomnoževanju.
Dva plazmidna konstrukta, pETM9 in pETH14, smo izbrali za vcepitev v bakterijski ekspresijskega gostitelja. Po indukciji z 1 mM IPTG, pod optimalnimi pogoji, je bila transformirana bakterija sposobna producirati 100300 μ9/ΓηΙ OB fuzijskega proteina. Večino OB fuzijskega proteina smo našli v inkljuzijskih telescih. Po solubilizaciji s 6M gvanidin HCI ali sečnino smo fuzijski protein očistili preko His vezalne (Ni kelatirajoči) smolne kolone. Pogoji za kolonsko čiščenje OB fizujskega proteina (vključno s vezanjem, izpiranjem in izločanjem) smo preverili eksperimentalno. OB fuzijski protein se veže na smolo pri 5mM imidazol/6M gvanidin-HCI in ostane vezan do 20 mM imidazol/6M gvanidin-HCI. Protein lahko izperemo iz smole pri 60mM imidazol/6M gvanidina (slika 18A,B). Oba prečiščena, humani in mišji OB fuzijski protein, smo nadalje dializirali v PBS, da smo odstranili gvanidin-HCI iz preparata, nato smo uporabili poliklonalna protitelesa.
Z namenom testiranja biološke aktivnosti nastalih fuzijskih proteinov smo preiskusili in izpopolnili pogoje za ponovno razvitje prečiščenih proteinov. Postopek obsega najprej dializo fuzijskega proteina v 1M raztopini gvanidina, ki ji sledi razredčevanje z 0,4M raztopino arginina. Histag smo odstranili iz fuzijskega proteina pred testiranjem biološke funkcije. Odstranitev tag smo dosegli, če smo fuzijski protein obdelovali s trombinom humane placente.
Polega tega, sta bila humani in mišji OB gen s kodno sekvenco brez signalne sekvence vnešena v pET 12c vektor z uporabo PCR klonirajoče metode. Ti konstrukti lahko usmerijo sintetizirani OB fuzijski proteine v periplazmatski prostor bakterijske gostiteljske celice. OB fuzijski protein, ki smo ga izolirali iz periplazmatskega prostora za čiščenje potrebuje le preprosto gelsko filtracijo, da ga ločimo od ostalih gostiteljskih proteinov in med tem postopkom ne pride do denaturacije.
PRIMER 3: Priprava protiteles proti OB polipeptidu
Poleg tega, da rekombinantni protein uporabimo za tvorimo poliklonalnih protitelesa, smo identificirali tudi štiri peptidne sekvence, ki smo jih izločili iz glodalske OB sekvence in jih identificirali z uporabo imunogenskega računalniškega programa (GCG paket). Štirje karboksilni terminali fragmenti so sledeči:
{SEQJD_NOil§)
Val-Pro-lle-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-lle-Lys-Thr (SEQ ID NO: 19)
Leu-His-Pro-lle-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO-20)
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:21)
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-GluCys
Ti peptidi so bili konjugirani z KHL in ta konjugat peptid-KHL smo uporabili za imunizacijo zajcev, z uporabo standardne tehnike. Poliklonalna protitelesa specifična za vsak peptid so pridobili iz zajcev.
PRIMER 4: In vitro translokacija OB polipeptida
Z namenom, da bi potrdili prisotnost funkcionalne signalne sekvence smo humano cDNK, s celotno odprtim bralnim okvirjem, subklonirali v vektor pGEM. V tem poskusu smo uporabili samo humano cDNK, zaradi tega, ker se ustrezni mišji subkloni niso obnovili. Pozitivno verižno humano ob RNK smo podvrgli transkripciji z uporabo Sp6 polimeraze in uporabili in vitro translacijsko reakcijo, z in brez pasje pankreasne mikrosomalne membrane. Primarni translacijski produkt se je gibal z navidezno molekulsko maso približno 18 kD, kar se sklada z cDNK sekvenco. Vključevanje mikrosomalne membrane v reakcijo inhibira celokupno učinkovitost translacije približno 5-krat. Približno 50-70% primarnega OB translacijskega produkta je bilo odsekano, približno 2 kD v prisotnosti membranskega preparata, kar nakazuje, da je signalna sekvenca funkcionalna (slika 19A). Velikost primarnega translacijskega produkta interleukina-1a RNK, ki ne nosi signalne sekvence, je bila nespremenjena, ko je bila v reakcijo vključena tudi mikrosomalna membrana. Z namenom, da bi potrdili translokacijo OB proteina, je bil in vitro translacijski produkt izpostavljen delovanju Proteinaze-K. Posledica delovanja proteaze je bila popolna proteoliza 18 kD primarnega translacijskega produkta, medtem ko je bil 16 kD produkt po encimskem delovnaju neprizadet, kar kaže, da je je prišlo do translokacije v lumnu mikrosomov (Slika 19B). Ti podatki se skladajo s hipotezo, da je OB molekula, ki se izloča.
Po cepitvi signalne sekvence ostaneta dva cisteinska ostanka znotraj predpostavljenega proteinskega porasta, kar nakazuje na možnost, da molekule vsebujejo disulfidno vez, ki je značilna tudi za druge polipeptide, ki se izločajo [Shen et al., Science, 224; 168-171 (1984)].
PRIMER 5: Določevanje lastnosti OB gena
Z namenom, da bi določili razmerje med debelostjo in genetskimi spremembami v OB genu pri ljudeh, smo določili sekvenco humanega OB gena (slike 20A do C) (SEQ ID NOS:22 in 24). Specifične verige iz humane kodirajoče sekvence smo uporabili za pregled humane P1 knjižnice. Našli smo tri različne klone P1, jih kultivirali in pomnožili s PCR tiste verige, ki so komplementarne cepitvenemu mestu med prvim in drugim kodnim eksonom. Celotno področje introna, približno 2 kB, smo pomnožili in delno določili sekvenco (glej sliko 20A in kot je nakazano v SEQ ID NO: 22 in 24).
Struktura gena obeh glodalskih in humanih, genov smo določili lastnosti z uporabo PCR testa in drugih standardnih metod. Našli smo, da obstaja mišji OB gen s tremi kodoni, drugi in tretji, ki šteje za kodno sekvenco (slika 20D). Kodno področje humanega OB gena ima enako strukturo, kakorkoli, humanemu geni manjka 5’ ekson in intron (slika 20E).
Pripravili smo dve skupini osnovnih verig iz intronske sekvence humanega gena /slika 20A do C). Sekvenca osnovnih verig je sledeča (F in R pomenita naprej in nazaj).
HOBIgF
HOBIgR
HOB2gF
HOB2gR
5OCCAAGAAAGCCCATCCTG-3’ (SEQ
5’-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3’ (SEQ
5’CCACATGCTGAGCACZZGTT-3’ (SEQ
5’-CTTCAATCCTGGAGATACCTGGG-3’ (SEQ
ID NO ID NO ID NO ID NO
29)
30)
31)
32)
DNK vzorci, ki smo jih pridobili iz različnih virov, in te skupine osnovnih verig smo uporabili za pomnoževanje humane genomske DNK iz več debelih posameznikov. PCR produkt smo dali na agarozni ge! z nizko točko tališča in trakove izsekali in izpostavili delovanju agaraze. Sekvenco smo določili z ABI 373A DNK sekventorjem in setom 'Taq dideoxy (ABI, Perkin-Elmer). Zasledili smo enotočkovne mutacije v ob genu, v vzorcu odvzetem pri pacientu. Ta mutacija je bil v prvem eksonu in ni vplivala na sekvenco aminokislin. Preliminarni podarki kažejo, da je vključena Sekvenca lahko prisotna v prvem eksonu drugega pacienta.
Lahko uporabimo različne avtomatizirane metode za določevanje sekvence z uporabo sekvenaze namesto Taq DNK polimeraze, da je branje sekvenc in določevanje mutacije olajšano.
PRIMER 6: Ekspresija OB v kvasovkah
Pozicijsko kloniranje OB, je postalo pomembno za razkritje fiziološkega mahanizma, s katerim OB protein zmanjša vnos hrane in telesno težo. Prvi korak v tej smeri je bil, z rekombinacijo pridobiti funkcionalni protein, s pomočjo ekspresijskega sistema. Polega tega smo, polega primernega bakterijskega ekspersijskega sistema, izbrali tudi ekspresijski sistem gliv kvasovk. Ekspresijski sistem gliv kvasovk je imel več lastnosti za ekspresijo OB. Najpomembnejše je, da se ekspresira biološko aktiven evkariontski protein. OB polipeptid izloča sesalske celice. Izločanje proteina je sorodno vsem evkationtom, kar pomeni, da je sekretorni aparat gliv kvasovk bolj podoben sesalskim sekretorni poti, kot bakterijski sekretorni poti. Natančneje, proteinska modifikacija OB, ki smo jo opazili v sesalskih celicah, smo opazili pri ekspresiji v sekretornem sistemu kvasovk. Poleg tega, do zvijanja proteina pride pri prehodu skozi sekretorni aparat in torej po prehodu ob skozi sekretorni aparat kvasovk naj bi bil protein v pravilni konfiguraciji, kot naravno bolioško aktiven protein. To je značilno za OB, ker dva cisteinska ostanka lahko tovrita disulfidni most. V nasprotju s sekretornimi potmi reducirajoče okolje v celični citoplazmi preprečuje nastajanje disulfidnih mostov in zatorej je nujno, da OB prehaja skozi sekretorne poti z namenom, da te disulfidne vezi nastajajo in vivo. Druge prednosti naj bi bile v zvezi z olajšanjem in pospešitvijo ravnanja s kvasovkami, dostopnost vektorjev in sevov in predhodne izkušnje v rekombinantni tehnologiji s kvasovkami.
Ekspresijski sistem Pichia pastoris smo izbrali zaradi štirih razlogov: (1) ima višjo vrednost heterologne proteinske ekspresije kot druge kvasovke, kot S. cerevisiae·, (2) glikolizacija proteinov je bolj podobna sesalskemu sistemu pri P pastoris kot pri S. cerevisiae (čeprav glikozilacijska mesta nismo zasledili v ob pri iskanju s pomočjo računalnika, še vedno obstaja možnost glikolizacije na neprepoznanem mestu); (3) P. pastoris izloča naravno zelo malo proteinov in je torej splošno nujno čiščenje ekspresiranih tujih proteinov in (4) vektorji in sevi kvasovk so komercialno dosegljivi (iz Invitrogena). Na slikah 21 in 22 sta prikazani dve strategiji za pripravo ekspresijskih vektorjev na osnovi gliv kvasovk.
Izbrali smo vektor pPIC.9. V vektroju se nahaja klonimo mesto vzdolž kodne sekvence α-združitvenega faktorja, ki usmerja protein, ki ga kodira gen, ki je bil kloniran v klonirajoče mesto, da bi se izločal po poti izločanja. Druga pomembna lastnost vektorja je, da njegov HIS4 gen omogoča selekcijo za prevzem vektorja z uporabo avtotrofnega seva kvasovk, ki raste na mediju brez hisitidina, ki ji sledi pretvorba kvasovk z vektrojem. Strategija kloniranja je bila sledeča: cDNK OB so pomnožli z rekacijo PCR z uporabo 5’ verige, ki vsebuje na 3’ repu sekvenco, ki je komplementarna sekvenci OB, ki mu sledi napovedano cepitveno mesto vodilnega peptida in 5’ rep in sekvenca komplementarna 3’ repu sekvence α-združitvenega faktorja v vektorju. 5’ verige vsebujejo Xhol mesto. 3’ verigo smo oblikovali tako, da ima sekvenco 3’ repa komplementarno z zadnjimi aminokislinami OB in EcoRI mestu na njegovem 5’ repu. Po končanem PCR pomnoževanju smo PCR produkt izpostavili delovanju Xho\ in EcoRI in klonirali v podobno razgrajen pPic.9. Po opravljanem kloniranju obeh, mišjega in humane OB cDNK, z in brez glutamina na kodonu, so bili posamezni kloni izolirani za vse štiri konstrukte in smo jim določili sekvenco, da bi se prepričali, da je bil kloniran v pravilni orientaciji in okviru in nima mutacij ,ki so posledica PRC pomnoževanja. Temu siedi identifikacija klonov s pravilno sekvenco, ki smo jih nato prenesli v P. pastoris sev GS1115, hisitidn aukstrof.
Za dva mišja OB konstrukta, smo pregledali transformirane klone kvasovk na proteinsko ekspresijo. Kot dokaz, da transformirana kvasovka vsebuje OB smo izvedli DNK dot-blot test in kolonizacijski hibridizacijski sev in z obema potrdili, da se OB sekvenca nahaja v transformirani kvasovki, ni pa prisoten v netransformirani kvasovki. Nadalje, sedaj so transformirane kvasovke izločale 16 kD protein v medij, medtem ko netransformirane kvasovke niso izločale tako velikega proteina (slika 23Α): To naj bi bila pričakovana velikost OB. Posamezne klone obeh mišjih konstruktov smo identificirali in so visoko ekspresorski za OB, sedaj je strategija čiščenja bila tako dovršena, da pri čiščenju dosežemo ob homogenost. Ena strategija za čiščenje je bila, da čistimo OB na koloni za izmenjavo kationov (slika 23B); preliminarni podatki so dali vedeti, da je primeren izmenjevalec močnih kationov. Po končani kationsko izmenjvelni kromatografijhi smo domneven ob pridukt izgubili. To kaže na prositnost proteaz v vzorcu.
Ena izmed strategij, s katero se izognemu tovrstnemu problemu, je priprava ob-His- tag fuzije za ekspresijo v kvasovkah (slika 22). Nadaljna ocena je prikazala, da se OB brez His-tag močno veže na Ni kelatirajočo kolono. Čiščenje OB polipeptida z Ni keliranjem, ki ji sledi gelska filtracija, privede do produkta dovolj velike čistosti za masno spektralno analizo. Masna sepktroskopija potrdi molekulsko maso izločenega proteina, ki je identična predvideni molekulski masi, kar je močen dokaz da je bila ekspresija Ob v Pichii uspešna.
Kakorkoli,čiščenje z Ni keliranjem/gelsko filtracijo ne zadošča za dovolj čist produkt OB polipeptida. Prisotne so še druge majhne molekule. Zdi se, da proteolitska aktivnost izpira kolino z Ni kelatorjem v nezaseden volumen. Poleg tega, načrtujemo tristopenjski postopek čiščenja; keliranje z Ni, temu sledi izmenjava kationov (s katerim odstranimo nečistote z majhno molekulsko maso) in nazadnje še gelska filtracija.
Ocena ekspresije z barvanjem z modrilom po Coomassi-ju SDS-PAGE gelu kaže, je da dobimo približno 10 mg/l, če kvasovke rastejo v elenmajerici z neprestanim mešanjem. Pričajujemo tri nivoje povečanja fermantacijeskega mešanja in s tem, upamo, da bomo vzpodbudili fermentacijo in tako dobili večje količine proteina. Glede na humani OB konstrukt je v transformiranih klonih kvasovk visoko število OB genov, ki smo jih identificirali in od njih pričakujemo, da vzpodbudijo ekspresijo OB proteinov. Protitelesa smo pripravili z namenom, da bi jih uporabili za potrditev identitete izločenih 16 kD proteinov.
PRIMER 7:
Visoka stopnja ekspresije oB fuzijskega peptida v bakterijah
Priprava vzorcev za zmrzovanje
Vsakemu od 4 ml alikvotu steriliziranega medija M9ZB brez vira ogljika,smo dodali 40 μΙ dekstroze (0.4 g/ml, sterilizirano preko filtra), 10 μΙ ampicilina (200 mg/ml) in 5 μΙ kloramifenikola (34 mg/ml, v etanolu). Posamezno kolonijo vsake E. coli s kloniranjem mišje in humane OB1 DNK v Novagen pET-14b vektr, smo uporabili za inokulacijo. Epruvete smo inkubirali pri 37°G preko noči.
V 0.5 ml kulture, ki smo jo inkubirali preko noči, smo inokulirali 50 ml medija M9ZB z dekstrozo, ampicilinom in kloramfenikolom. To smo inkuburali pri 30°C in v določenih časovnih presledkih merili absorbanco pri 600 nm (A600). Absorbanca pri 600 nm je bila 1 - 1.2, 175 μΙ alikvot kulture smo pomešali s 25 μΙ 60% glicerola v 2 ml Eppendorfovih epruvetah, sveže zamrznili s čistim dušikom in hranili pri -80°C.
Rast kulture mi medija M9ZB z 0,5 ml 40% dekstroze, 125 μΙ dekstroze, 125 μΙ ampicilina in 50 μΙ kloramfenikola smo inokulirali z 1 ml zamrznjenega vzorca in inkubirali pri 30°C. Ko je bila absorbanca pri 600 nm bila 1 1.2 smo 10 ml kulture uporabili za inokulacijo vsake od štirih 2 literških erienmajeric s 500 ml medija M9ZB z dekstrozo, ampicilinom in kioramfenikolom. To smo inkubirali pri 30°C, dokler ni bila absorbanca pri 600 nm 1-1,2 s končno koncentracijo 0.5 mM IPTG. Kulture smo nato inkubirali preko noči. Celice smo ločili s centrifugiranjem pri 400 obratih na minuto, 20 minut. Izkoristek pri tem ekspresijskem sistemu je bil za rekombinantni OB polipeptid precej visok glede na celokupen protein; reda gram/liter E. coli.
Liza celic in ponovno suspendiranje inkluziiskih teles
Celice smo suspendirali v minimalnem volumnu t.j. v 20 mM HEPES, pH 7,2 10% glicerola, 0,1 M KCI, 5 mM MgCI2, 1% aprotinu, 1mM PMSF, 5 μg/ml leupeptina in 50 μρ/ml DNaze I. Suspenzijo smo zamrznili in odmrznili trikrat, z uporabo tekočega dušika in mlačno vodo. Lizirane celice smo centrifugirali pri 18000 obratih na minuto, 30 minut in ponovno suspendirali v 20 mM HEPES, pH 7.5, 0,1 M NaCl. Suspenzijo smo sonicirali in dodali Triton Χ100, da je bil akončna koncentracija 2%. To smo centrifugirali 15 minut pri 18.000 obratih na minuto. Po še dveh takih cilklih, smo imeli tri cikle izpiranja brez Tritona. Nazadnje smo pelete raztopili v 6 M GdHCI (gvanidin-HCI), 20 mM HEPEs, pH 7.5 s sonofokacijo, ki mu je sledila centrifuguranje. Za nadaljno čiščenje smo uporabili supernatant.
OB protein smo čistili v nerazvitem stanju z imobilizacijo z afinitetno kromatografijo s kovinskim ionom (IMAC - immobilized metal ion affinity chromatography). Raztopino smo dali na 40 ml kolono farmacevtske kelirajoče hitropretočne sefaroze, ki je bila napolnjena s 5 colonskimi volumni 50 mM NiSO4 in ekvilibrirana v 6 M GdHCI, 20 mM HEPES, pH
7.5. Kolono smo izprali s 6 m gDhcL, 30 Mm imidazolom, 20 Mm HEPES s pH 7.5. Nazadnje smo protein sprali v enakem pufru, ki je vseboval 0,2 M imidazoi. Nerazvit protein v 6M GdHCI smo shranili pri 4°c po dodatku natrijevega acetata (NaAC) v 10 mM in uravnali pH na približno 4.5 z ocetno kislino.
Razvijanje in čiščenje proteina
M GdHCI raztopine, ki je vsebovala 100 mg proteina, smo dodali 67 μϊ 1M ditiotretiola (DTT) in razredčili na približno 67 ml s 6M GdHCI, 10 ml NaAc, pH 4.5. To smo mešali pri sobni temperaturi približno eno uro. Nato smo redčili v 4 I 20% glicerola, 2,5 mM CaCI2, 20 mM pufra Tris s pH 8.4 med mešanjem. Po ustreznem mečanju smo raztopino pustili na sobni temperaturi, približno 8 ur brez mešanja. Nato smo dodali 2.000 enot čistega govejega trombina (iz trombostat, Park-Davis produkt) in pustili raztopino rahlo mešati. Po 2.5 urah smo ponovno dodali 2.000 enot trombina in z odcepljanjem histidin-tag nadaljevali še tri ure. Cepitev trombina smo prekinili z dodatkom PSMF na končno koncentracijo na 0.1 mM. Raztopino smo filtrirali in shranili na 4°C.
Cepljeni protein smo nadalje čistili na enaki IMAC kolono, kot je opisano zgoraj, ki smo jo uravnali z 1M KCI, 20% glicerolom, 20 mM pufrom HEPES s pH 8.4. Nato smo raztopino proteina sprali z enakim pufrom in cepljen protein sprali z 1M KCI, 20% glicerolom, 40 mM imidazolom, 20 mM HEPESs pH 8.4. Nato smo cepljen protein sprali z 0.2 M imidazolom.
Očiščen cepljen protein smo koncentrirali, obdelovali z 50-100 m! EDTA, 10 mM kalijevim fericianidom (da bi izvedli nepopolno oksidacijo) in gelsko filtrirali na superdexu 75 16/60 koloni, izkoristek pri tej metodi je bil 50% izhodnega peptida.
Enkrat očiščenemu ekspresiranemu proteinu smo določili lastnosti z različnimi metodami. Fizikalno določevanje vključuje dinamično razprševanje svetlobe, da bi določili homogenost zgradbe in jo uporabimo za določevanje pravilne konfiguracije. Podatki o razprševanju svetlobe kažejo, da je humano OB polipeptid ekspresiran pretežno ali izključno kot monomer, medtem, ko glodalski OB polipeptid najdemo kot diamer in tudi kot monomer.
100
Preiskus z Ellmanovim reagentom in masna spektroskopija potrjujeta, da cisteinski ostanek tvori disulfidno vez v proteinu. Oksidirano obliko polipeptida smo aplicirali miši, kot je opisano infra, in demonstrirali biološko aktivnost.
Krožni dikroizem smo uporabili za grobo določevanje strukturne geometrije proteina. CD spekter v fiziološkem pufru (pH približno 8, približna fiziološka ionska moč) kaže, da ima humani OB polipeptid približno strukturo α-heliksa in približno 40% strukturo naključnega klopčiča. Z CD spektroskopijo smo ugotovili, da je pri glodalskem OB polipeptidu približno 50% α-heliksa in 50% kot naključnega klopčiča.
Omejena proteoliza, ki ji sledi masna spektroskopija (Cohen et al., 1995, supra) smo uporabili za identifikacijo delov OB polipeptida, ki si dostopni za proteolizo. S to analizo smo prikazali prisotnost gibljive zankaste strukture aminokislinskih ostankov 54 do SO (kot je prikazano na sliki 4). Ta gibljiva zanka se veže z dvema ostankoma definirane seukndarne strukture t.j. a-heliksom.
Pomembno je, kot je prikazano v sledečih primerih, bioaktivnost očiščenega proteina smo določili z aplikacijo proteina v normalne in debele glodalce preko ozmotske črpalke (ALZET ozmotska črpalka iz Alza Corporation, Paii Alto, CA) ali z dnevno dozo v bolusu v najmanjšem časovnem obdobju dveh tednov in nato opazovali navade hranjenja in telesno težo.
PRIMER 8: Učinek zmanjšanja telesne teže Ob polipeptida (Leptin)
Genski produkt mišjega OB igra pomembno vlogo v uravnavanju telesne teže. Opisani Primer ponazarja, da OB protein kroži v miši, podgani in humani plazmi. Krožeča oblika v vseh treh vrstah ima enako molekulsko maso, s SDS-PAGE smo določili polipeptidno sekvenco brez signalne sekvence, kar kaže na to, de se in vivo protin ne tvori po cepitvi signalne sekvence. OB ni bilo v plazmi pri C57/B16J ob/ob miših in je bil prisoten v 10-krat višji koncentraciji v plazmi db/db miši in dvajsetkrat višji koncentraciji pri fa/fa podganah, ralativno pač na kontrolno skupino. To nakazuje, da so mutanti debelih živali odporni na učinek OB. Opazili smo sedemkratno razliko v plazmski vrednosti OB proteina znotraj skupine šestih normalnih ljudi. Dnevno injiciranje rekombinantnega mišjega OB protina je
101 zelo zmanjšal telesno težo ob/ob miši in je imel značilen učinek na telesno težo divjih živali in nobenega učinka pri db/db živalih. Ti podatki kažejo, da genski produkt OB lokusa služi kot endokrina snov, ki uravnava telesno težo.
Materiali in metode
Zajce smo imunizirali z rekombinantnim proteinom v Freundovem adjuvansu (HRP, Inc.). Imuno očiščena protimišja OB protitelesa smo pripravili s prehodom protiseruma preko kolone s Sepharozo 4B, ki je bil konjugiran z rekombinantnim protinom, kot je opisano [Harlow ef a/., antibodies: A Laboratory Manuai, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. imunoprecipitacijo mišje plazme smo izvedli na sledeč način: 0,5 ml mišje, podganje in humane plazme, ki je vsebovala približno 2,5 mM EDTA smo predhodno čistili z nekonjugirano sepharozo-4B, pri sobni temperaturi s tresenjem 2 uri. Sepharozo smo odstranili s centrifugo in 50 ml 50% onesnaženih protiteles konjugiranih s sefarozo, ki vsebuje protitelesa očiščena z afiniteto v koncentraciji 1 mg/ml sefaroze. Pol mililitra 2x RIPA pufra smo dodali, da smo dobili končne pogoje za vezavo: 50 mM Tris-HCi s pH 7,5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0.5% natrijevega deoksiholata in 0,025% natrijevega azida. Reakcijo smo izvjaii preko noči pri 4°C pri neprestanem tresenju. S protitelesi konjugirano sefarozo smo izprali 8-krat z RIPA pufrom, temu je sledilo 3-kratno spiranje z PBS in potovanje na 15% SDS-PAGE. Proteine smo prenesli na nitrocelulozo in z analizo po VVestern-u z biotiniliziranimi imunočiščenimi protitelesi proti rekombinantnemu proteinu. Sekundarna protitelesa smo uporabili kot HPR-strepavidin in ECL smo uporabili za detekcijo.
Količina OB v mišjem serumu, povečano količino razvitega rekombinantnega mišjega OB proteina (0.01, 0.1, 0.5, 2.0, 15.0g) smo dodali k 100 λ C57BL/6J ob/ob plazmi in inkubirali pri 4°C 3 ure s proteinom A protitelesi konjugiranimi s sefarozo. Po obilnem izpiranju s pufrom A (10 mM pufrom natrijevega fosfata s pH 7.4; 100 mM NaCl; 1% Tritonom Χ-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF), smo vzorce ponovno suspendirali v vzorčnem pufru, naložili na 15% SDS-PAGE in prenesli na nitroceluiozno membrano. Pivnanje po Westernu-u smo izvedli z
102 imunočiščenimi biotiniziranimi anti-amino terminiranimi protitelesi, kot primarna protitelesa in HRP- strepavidin, kot sekundarmini protitelesi, ki jim je sledilo zasledovnje z ECL.
Ekstrakt citoplazme smo pripravili s homogneiziranjem adipoznega tkiva v NDS pufru (10 mM Tris s pH 7.5, 10 mM NaCI, 60 mM ICCI, 0.15 mM spermine, 0.5 mM spermidin, 14 mM β-merkaptoetanol, 0.5 m EGTA, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40). s politronsko in dounce homogenozacijo in z odstranitvijo jedra zaključili s centrifugiranjem pri 700 g.
Imunoprecipitacijo smo izvedli, kot je opisano zgoraj z izjemo, da smo uporabili imunoprecipitirana protihumana OB protitelesa. Za ELISA smo raztopili 100 ml 1 mg/ml raztopine imunoprečiščenih protihumanih OB protiteles v boratnem pufru PBS raztopini in dodali preko noči mikrotitrirne plošče (Corning cat. #2595) pri 4°C. Plošče smo nato sprali 4-krat z boratno-fiziološko raztopino, ki je vsebovala 0.05% Tween 20 in višek tekočine odstranili. Plošče smo blokirali z inkubacijo pri sobni temperaturi 2 uri z 240 ml na vir boratno slanega pufra, ki je vseboval 0.3% želatine in jo nato sprali in sušili. Poznano količino ponovno zvitega humanega OB proteina ali plazemskega vzorca v 100 ml, smo inkubirali v posamezni erienmajerici, preko noči pri 4°C. Po izpiranju smo plošče inkubirali v 100 ml biotiniziranega imunoprečiščenega humanega protitelesa (0.1 mg/ml v želatinsko- boratni puferni raztopini) 4 ure pri sobni temperaturi. Po izpiranju smo na ploščo (0.1 mg/ml v boratnem pufru, 0.3% želatino), dodali peroksidazo konjske redkvice (HPR)-streptavidin. HPR raztopino substrata (ABTS, 0.3 mg/ml in H2O2 0.01 % v citronski kislini) samo uporabili za zasledovanje in merjenje O.D. pri 414 nM, da smo kvantitativno določili vezavo protitles.
Mišji in humani OB genski kodni zapis smo pomnožili s PCR iz plazmida, ki je vseboval OB cDNK in ga subklonirali v pPIC.9 plazmid (Invitrogen). Uporabljena humana veriga 5’ je bila:
5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3’ (SEQ ID NO:34) in 3’ veriga je bila
5’ GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3’ (SEQ ID NO:35)
Za miš je bila 5’ veriga
5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3’ ($EQ ID NO:36)
103 in 3’ veriga je bila
5’ GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3’ (SEQ ID NO:37)
5’ veriga mišja in humana obsega Xhol mesto na 5’ repu in kodno sekvenco za zadnje štiri aminokisline sekvence α-cepitvenega faktorja prisotnega v vektorju pPlC 9. Ta vektor usmerja izločanje heterologno ekspresiranih genov iz celice v medij kulture. 5’ PCR veriga vključuje prvih 19 nukleotidov OB gena odprti bralni okvir, po cepitvenem mestu signalne sekvence, pred alaninom na položaju aminokisline 21. 3’ veriga vsebuje EcoRI mesto na njegovem 5’ repu, ki mu sledijo sekvence, ki so komplementarne domnevnemu stop kodonu OB. Pogoji pri PCR so bili sledeči: denaturacija 1 minuto pri 94°C, segrevati 1 minuto pri 55°C in ekstenzija 2.5 minut pri 72°C. Nizki cikli PCR (15 ciklov) in polimeraza PFU (Stratagene) smo uporabili, da bi omejili število PCR nastalih mutacij. PCR produkt smo izpostavlili digestiji z Xho\ in EcoRI in klonirali v podobno prebavljeni vektor pPIC.9. Vsem konstruktom smo določili sekvenco na obeh verigah, da smo se prepričali, da ni prišlo v PCR do mutacij. Klone smo prenesli v Pichia pastoris (His) s sferoplastno metodo in izbrali medij brez histidina. Približno 200 mišjih in humanih klonov smo pregledali za integracijo velikega števila kopij s kolonizacijsko hibridizacijskim testom. Veliko število klonov smo nato pregledali ali pride do OB ekspresije, prvenstveno z barvanjem po Coomassi-ju, ki kaže na prisotnost novejšega 16 kD proteina v mediju transformiranih kvasovk. Potrdili smo, da 16 kD trak veže OB s pomočjo protiteles proti bakterijsko ekspresiranem OB proteinu. Rekombinante proteine smo čistili z dvostopenjskim čiščenjem, ki je opisan v nadaljevanju. Masna spektroskopija in obdelavo s cianogenim bromidom smo izvedli, kot je opisano v Beavis et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877(1990).
Celotno OB kodno sekvenco mišjega in humanega OB gena C terminalnega, glede na signalno sekvenco, smo subklonirali v pET15b ekspresijjski vektor (Novagen) in ekspresirali v Escherichio coli [ BL21 (DE3)plYsS] z uporabo T7 RNK polimeraze [Studier ef al., Meth Enzymology, 185:80-89(1990)]. Celice, ki smo jih pustili rasti pri 30°C do absorbance 0.7 pri 595 nM in jih inducirali z 0.5 mM izopropil-p-Dtiogalakto-piranozidozo preko noči in zbirali z nizkohitrostno centrifugiranjem. Lizo smo izvedli v treh ciklih zmrzovanja in tajanja in digestijo DNK z
104
DNazol. Ekstrakcijo membrane smo izvedli s sonifikacijo in solubilizacijo z detergentom in končne inkluzijske pelete raztopili v 6M gvanidin-HCI, 20 mM HEPES s pH 8.4. Rekombinantne OB proteine smo čistili pod denaturacijskmi pogoji z IMAC, z uporabo Ni-ion afinitetne kolone in izpirali z naraščajočo količino imidazola. Prečiščen denaturiran OB protein smo shranili v 6 M gvanidin-HCL, 10 mM natrijevem acetatu (NaAc s pH 5 in reducirali z uporabo 1 mM DTT pri sobni temperaturi 1 uro. Denaturacijo smo izvedli z razredčevanjem reduciranega proteina v 20% glicerolu, 5 mM CaGI2, 5 mM NaAc s pH 5 med mešanjem in inkubacijo pri sobni temperaturi 8 do 12 ur. Po denaturaciji smo pH uravnali na 8.4 z dodatkom Tris do 10 mM in odstranili heksa-histidinsko vrečko s pomočjo cepitve s trombinom. Cepljen, renaturiran protein smo ponovno čistili z IMAC, da smo produkt ločili od trombina in necepljenega fuzijskega proteina. Cepljen, renaturiran protein smo spirali iz Ni-ionske afinitetne kolone z 40 mM imidazolom, medtem ko trombin ni ostal in se je necepljeni fuzijski protein izpral z 0.2 mM imidazolom. Nato smo produkt koncentrirali in obravnavali z 100 mM EDTA in 10 mM kalijevega fericianida in nadalje čistili z gelsko filtracijo z uporabo kolone Pharmacia superdex 75 16/60.
Ellmanov test smo izpaljali, kot je opisano v Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77(1959). Ellmanov reagent smo pripravili z raztapljanjem
39.6 mg 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzojske kisline)(DTNB) v 10 ml 0,05 M fosfata s pH 8. Umeritveni krivuljo smo pripravili v koncentrcijskem intervalu med 10 do 120 mM prostega sulfhidrila (z uporabo 1 mM raztopine reduciranega DTT) pri 412 nm. Pri vsakem poskusu smo uporabili 0.02 ml Ellmanovega reagenta in 0.5 ml celokupne reakcijske zmesi. Izmerjeni ekstinksijski koeficient je bil 12974 M-1cm-1 za prosto sulfhidrilno skupino (korelacijski koeficient 0.99987), ki je znotraj 5% prehodno ugotovljenih vrednosti 13.600 M-1 cm·1.
ml 2 mg/ml čistega, preko gela filtriranega proteina, odgovarja verjetni prosti sulfhidrilni koncentraciji približno 24 mM v končni reakcijski zmesi, smo nato testirali po Ellmanu. Nastala raztopina je imela A412 približno 0.02, kar kaže, da sta dva cisteinska preostanka v proteinu v oksidiranem stanju in tvorita cistein ali so njihove sulfhidrilne skupšine popolnoma skrite znotraj nedostopnega jedra zavitega proteina. Identične
105 rezultate smo dobili s izvedbo enakega testa na nezavitem protinu v prisotnosti 6 M gvanidin-HCI.
Miši smo posamezno zaprli v okolje brez patogenov in jih privadili na dieto, ki je vsebovala v 35% (ut/ut) laboratorijsko glodalsko dieto 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5.9% (ut/ut) zmes tapioke in pudinga (General Foods) in 59,1% vode, ki je energetsko vredna 1.30 kcal/gm. Dietno hrano smo sterilizirali z avtoklaviranjem in shranili v 60 mm plastične posode, ki smo jih namestili na vrh 100 mm petrijevke. Tapioka zagotavlja dietni hrani gosto konsistenco in onemogoča, da živali razmečejo hrano po kletki. 100 mm pokrov lovi majhne količine hrane, ki jo živali razlijejo. Posodo s sveže pripravljeno hrano smo dali v kletko vsako jutro, posodo prejšnjega dne pa smo odstranili in stehtali. Razlika v masi je predstavljala merilo dnevno zaužite hrane. Učinek rekombinantnega proteina na količino zaužite hrane in telesna teža smo spremljali pri treh različnih sevih miši; C57B1/6J ob/ob, C57 B1/Ks db/db in CBA/J +/+, ki smo jih dobili iz Jackson Laboratory. Trideset miši iz vsakega seva smo razdelili v skupine po 10. Ena skupina iz vsakega seva je dnevno intraperitonealno (i.p.) prejemala injekcije zavitega bakterijskega proteina v dozi 5 mg/g/dan v 300 μΙ PBS. Druga skupina je prejemala i.p. injekcije enakega volumna PBS. Ta kontrolna skupina je prejemala PBS dializat rekombinantnega proteina. Iz PBS smo odstranili endotoksin s pomočjo kolone Acticiean ΕΤΟΧ. Tretja skupina živali ni prejemala injekcij. Vnos hrane smo beležili dnevno, telesno težo pa smo beležili redno, v 3.5 tedenskih intervalih. Za poskus s hranjenjem dnevni vnos hrane ločene skupine ob miši smo beležili na dnevni osnovi hrane, ki so jo zaužile ob miši, ki so prejemale protein.
Rezultati
OB protein, ki kroži v mišji, podganji in humani plazmi
Rekombinanrtni mišji in humani OB protein smo pripravili z uporabo pET 15b bakterijskega ekspresijskega vektroja (Novagen) in s kloniranjem v Pichia pastoris, ekspresijski sistem kvasovk, ki izločajo rekombinantni protein neposredno v kulturo, ob protein, ki izloča kvasovke ima 146 aminokislin s karboksi koncem s signalno sekvenco. Zajce smo imunizirali z bakterijskimi proteini (HRP, Inc.). Protitelesa smo imunočistili (Research
106
Genetics) in uporabili za imunoprecipitacijo in za pivnanje po Western-u proteinov iz plazme in maščobnega tkiva.
OB proteini iz mišje plazme migrirajo z navidezno molekulsko maso 16 kD po SDS-PAGE: Gibljivost na elektroforezi je identična kot pri rekombinantnem OB proteinu, ki jih izločajo kvasovke po odstranitvi signalne sekvence (slika 24A). Proteina v plazmi nismo zasledili pri miših C57BL76J obfob, ki imajo nesmiselne mutacije na kodonu 105. Več različnih protiteles nismo zasledili na skrajšanem 105 ostanku polipeptidne verige, ki smo jo predvidevali z cDNK sekvenco.
10-kratno povečanje vrednosti krožečega proteina smo opazili pri db/db miših glede na kontrolno skupino živali (slika 24A). Imunoprecipitacija plazme iz divjega tipa živali in fa/fa podgan je izvedla 20-kratno povečanje vrednosti OB proteina v mutirani podgani, če primerjamo z divjo živaljo (slika 24B). db mutacija povzroči debeli fenotip, ki je identičen tistemu, ki smo ga opazili pri ob miših (Bahary et al., 1990, supra). Debele podgane so debele zaradi recesivne mutacije gena, ki je homologen db (Truett et al., 1991, supra). Da bi določili količino OB v plazmi, smo dodali povečano količino rekombinantnih proteinov v serum in jih imunoprecipitirali (slika 24C). Opazili smo linearno povečanje intenzitete signala s pivnanjem po Western-u, zaradi povečane količine rekombinantnega proteina. Primerjava intenzitete signala naravnega proteina v mišji plazmi glede na standard kaže, da je krožeča vrednost OB proteina pri divjih miših približno 20 ng/ml. Ti podatki kažejo, da sta bila imunoprecipitacija in pivnanje po
Westernu izvedena pod pogoji, da je bi! prisoten višek protiteles. Povečana vrednost OB proteina smo opazili v ekstraktu proteina v maščobnem tkivu iz dbfdb miši glede na kontrolno skupino (slika 24D). Kot je pričakovati za izločene proteine, proteini iz adipoznega tkiva frakcionirani s surovo membransko frakcijo (podatki niso prikazani).
Plazemski vzorci iz šestih normalnih pacientov s telesnim masnim indeksom manj kot 25 (BMI^teža/višina2) smo imunoprecipitirali s imunoprečiščenimi protitelesi proti humanem proteinu. Imunoprecipitiran material se je na elektroforezi giba! identično kot smo opazili pri humanem proteinu s 146 aminokislinami, ki je bil ekspresiran v kvasovkah. Intenziteta signala je med šestimi vzorci varirala (slika 25A). Z denzimetrijo avtografa smo dokazali 5-kratno razliko v vrednosti pri posameznikih HP1 in HP6 z povprečno vrednostjo pri drugih osebkih. ELISA test smo izvedli z
107 imunoprecipitiranimi protitelesi in uporabili ponovno zvit bakterijski protein kot standard (glej spodaj). Dobljena standardna krivulja je prikazana na sliki 25B. Z uporabo tega testa plazemska vrednost OB proteina v šestih humanih plazemskih vzorcih niha med 2-15 ng/ml (slika 25C). Vrednost OB proteina v plazmi iz HP6 je bila zunaj linearnega območja imunotesta in je > 15 ng/ml. Ta kvantitativna razlika se ujema s tisto, ki smo jo opazili pri pivnanju po Western-u.
Preliminarni podatki kažejo, da leptin lahko kroži, nenazadnje vsaj delno, vezan na drug protein ali proteine. Tak zaključek temelji na heterogenosti oblike titracijske krivulje za serum, v primerjavi z rekombinantnim standardom. Analiza velike količine leptina čiščenega z imunizacijo na zajčji anti-OB koloni z gelsko filtracijo HPLC pod denaturacijskimi in nednaturacijskimi pogoji in nadzorom z ELISA in SDSPAGE, daje slutiti, da se OB polipeptid obnaša kot visokomolekularni kompleks. Kakorkoli, ti podatki ostajajo preliminarni, OB vezalni protein, če je, mora biti še karakteriziran.
Strukturne lastnosti Ob proteina
Ker ima protein dva cisteinska ostanka, lahko tvori ali intra ali intermolekularne disulfidne vezi pod oksidacijskimi pogoji in vivo. Pivnanje po Western-u smo ponovili z in brez dodatka reducenta glede na vzorčni pufer. Pod obema pogoji je OB protein v humanem serumu migriral kot monomer (podatki niso prikazani). Pod nereducirajočimi pogoji smo imunoprecipitiran protein iz seruma db miši zasledili na položaju, ki je podoben temu, ki ga imata oba monomera s 16 kD in dimer s približno 32 kD (slika 26A). Večja molekulska masa spojine izgine pri reducirajočih pogojih, kar kaže, da je frakcija mišjega OB kroži kot vrsta z večjo molekulsko maso preko tvorbe intermolekularnih disulfidnih vezi. Približno 80% mišje OB kroži kot približno 16 kD protein in 20 % kot približno 32 kD oblika.
Enake molekularne oblike smo opazili, ko sta bila mišji in humani protein ekspresirana v Pichia pastoris [Abrams et af., fmmunol. Rev., 524(1992)]. V teh študijah DNK sekvenca odgovarja zrelemu OB proteinu s 146 aminokislinami, ki je bil kloniran vzdolž signalne sekvence apridružitvenega faktorja v pPIC.9 vektorju (Invitrogen). OB protein smo čistili iz kulture kvasovk vrste, ki so ekspresirale mišje in humane proteine in jih
108 elektroforizirali pod reducirajočimi in nereducirajočimi pogoji (slika 26A). Mišji protein smo ekspresirali v kvasovkah pretežno kot dimer pod nereducirajočimi pogoji, in kot monomer v prisotnosti reducenta. Rekombinantni humani protein je potoval na položaj monomera pod obojimi pogoji (podatki niso prikazani).
Čisti humani protein, ki ga je ekspresirala Pichia, ima molekulsko maso 16.024 ± 3 Da, kot smo jo določili z masno spektroskopijo, 1990 (Beavis, 1990, supra). To vrednost je v skladu z maso, ki je izračunana iz aminokislinskega zaporedja proteina, ki ima eno intramolekularno disulfidni most (16.024 Da). Laserska desorpcijska masna spektroskopija produkta po cepitvi proteina s cianogenim bromidom kaže, da sta cisteina na 117 in 167 povezana z intramolekularnim disulfidnim mostom (slika 26B). Cianogeni bromid cepi karboksi terminus na metioninski ostanek.
Priprava in določanje lastnosti bioaktivnega rekombinantnega proteina
Mišji OB protein smo ekspresirali v F. coli iz pET 15b plazmida kot netopen fuzijski protein z 20 ostanki, N-terminalnim heksa-histidinsko torbo, ki vsebuje trombinsko cepitveno mesto. Bakterijska vključitvena telesa smo raztopili z gvanidin-HCI in čistili pod denaturacijskimi pogoji z uporabo imobilizirane metalno ionske afinitetne kromatografije (IMAC) (slika 27). Očiščen, denaturiran fuzijski protein smo reducirali, redčili in omogočili razvitje v vodni raztopini na sobni temperaturi. Po končani cepitvi s trombinom, je renaturirani mišji OB protein vseboval štiri dodatne Nterminalne ostanke (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO:38) in smo ga ponovno čistili z IMAC do >98% homogenosti, kot smo ocenili z SDS-PAGE in masno spektroskopijo. Z lasersko desorpcijsko masno spektroskopijo smo določili maso 16.414 ± 3 Da (predvidena masa = 16.415 Da). Oba reducirajoči in nereducirajoči SDS-PAGE gel je kazal enojno molekularno vrsto z navidezno molekulsko maso 16 kD (podatki niso prikazani).
Dinamično svetlobno sipanje, pri katerem smo uporabili DP801 detektor molekulske mase (protein Solutions, INC.), je pokazal, da je renaturirani mišji OB protein pretežno monomer z enako veliko stopnjo agregatov. Protein smo obdelovali z EDTA in kemično oksidirali. Spojine z višjo molekulsko maso smo odstranili z gelsko filtracijo. Nadaljne dinamično sipanje svetlobe smo potrdili, da je očiščen, renatururan rekombinantni mišji OB protein monodispeizen. Temu je sledila dializa nasproti slanemu
109 fosfatnemu pufru (PBS), bakterijske endotoksine smo odstranili s pomočjo kolone Acticlean ΕΤΟΧ (Sterogene Bioseparations, Inc.). Končni izkoristek je bil 45 mg/l.
Ellmanov test smo izvedli na očiščenem, renaturiranem rekombinantnem mišjem OB proteinu, da smo dobili oksidirano obliko (Ellman, 1959, supra). Oba, renaturirani protein in nezavit protein, z 6M gvanidin-HCI kažeta < 0.5% vsebnosti prostega sulfhidrila, kar kaže, da ima monomerni produkt intramolekularno disulfidno vez. To smo potrdili z masno spektroskopijo produkta po cepitvi s cianogen bromida ponovno zavitega bakterijskega proteina (podatki niso prikazani).
Bioaktivnost OB proteina.
Očiščen, renaturiran rekombinantni mišji OB protein smo aplicirali dnevno kot inntraperitonealno injekcijo v 5 mg/kg/dan skupini 10 C57B1/6J ob/ob /starost 16 tednov), C57B1/Ks db/db (starost 12 tednov) in CBA/J+/+ (starost 8 tednov) miši. Enako število živali je prejemalo PBS dnevno, kot injekcijo. PBS, ki smo ga uporabili za injiciranje v kontrolni skupini smo pridobili iz dializata po uravnoteženju proteina. Deset dodatnih živali iz treh mišjih sevov ni prejemalo injekcije. Vnos hrane pri posamezni živali smo nadzorovali dnevno in težo živali beležili v tri do štiri dnevnih intervalih. Kumulativne rezultate vnosa hrane in telesne teže iz vsake od 9. skupin miši so prikazane na sliki 28A do F, statistični podatki pa so prikazani v preglednici I. Vnos hrane C57B16J ob/ob miši injiciranih s proteinom se je značilno zmanjšal po prvi injekciji in se je zmanjševal do petega dne, ko se je stabiliziral na vrednosti, ki je bila približno 40% vnosa hrane živali, ki so dobile injekcije PBS (p<0.001). Pri OB miših, ki smo jim aplicirali paicebo, se teže v treh tednih ni znižala. C57B1/6J ob/ob miši, ki so dobivale protein so izgubile približno 10% njihove telesne teže po 5. dneh (p<0.001). Teža teh živali se je zmanjševala vse tri tedne zdravljenja in na tej točki se je teža ob živali, ki so prejemale protein znižala za povprečno 60% njihove začetne telesne teže (p<0.0001). Ločeno skupino ob miši smo hranili kot ob miši, ki so prejemale protein. Podatki na sliki 29B kažejo, da je izguba teže znatno nižja, kot pri živali, ki so prejemale rekombinantni protein (p<0.02). Fotografija dveh miši, ki so prejemale injekcije ali proteina aii vehikla kaže veliko razliko v izgiedu, ki je posledica zdravljenja s proteinom (slika 29B). Z namenom, da bi potrdili učinke proteina smo na
110 dveh miših iz vsake skupine naredili avtopsijo. Natančen pregled ob miši, ki je prejemala protein, potrjuje veliko znižanje telesne maščobe kot tudi velikost jeter. Teža jeter db in divjih miši je bila med zdravljenjem nespremenjena. Jetra ob miši, ki so prejemale injekcije PBS, so tehtala med 5.04 in 5.02 grami nasproti 2.23 in 2.03 grami pri živalih, ki so prejemale rekombinantni protein. V nasprotju s svetlimi zamaščenimi jetri, ki so značilne za ob miši, so jetra iz ob miši, ki so prejemale protein temnejše barve, ki je značilna za normalna jetra (slika 29C). Histološki prerez jeter kaže, da so nezdravljene živali imele zamaščena jetra, katerih stanje se je vidno popravilo pri živalih, ki so prejemale protein (podatki niso prikazani).
V nasprotju z ob mišmi ni bilo značilne razlike v telesni teži ali vnosu hrane pri C57BL/Ks db/db miši, ki so prejemale protein, če to primerjamo s kontrolno skupino, ki je prejemala placebo (slika 28A do F, preglednica I). Vse tri skupine db/db miši so izgubile med 2 do 5 g v času zdravljenja. Povprečna vrednost glukoze v krvi db miši smo izmerili z glukometrom in je bila > 500 mg/dl pri vseh miših kar kaže, da so te živali razvile diabetes sekundarno glede na debelost. Injekcije ob mišim smo prenehali dajati po dveh tednih.
Pri divjih živalih smo opazili majhen, vendar značilen padec telesne teže, po aplikaciji rekombinantnega ob proteina (slika 28A do F, preglednica I). Po petih dnevih injiciranja so zdravljene živali v povprečju izgubile 0.5 gramov, medtem ko so miši v kontrolni skupini izgubili 0.4 grame (<0.02). V dveh časovnih točkah so živali, ki so prejemale protein tehtale značilno manj kot miši, ki so dnevno prejemale injekcije PBS. Velikost spremembe telesne teže je bila zmanjšana v kasnejših časovnih intervalih. Pri živalih, ki so izgubile telesno težo, vnos hrane ni bil značilno drugačen, kot pri kontrolnih živalih. Injekcija PBS je imela majhen, vendar značilen, učinek na vnos hrane in telesno težo pri ob, db in divjih miših v primerjavi z mišmi, ki injekcij niso prejemale (p<0.05).
111
Preglednica I
Skupina živali zdravljenje skupina sprememba dnevi n telesne povprečje teže stand. napaka P
ob/ob protein 1-5 10 -6.38000000 0.47628190 <0.001
placebo 9 -0.14444444 0.24444444
protein 1-12 10 -14.45000000 0.70793126 <0.001
placebo 9 0.98888889 0.38058597
protein 1-27 6 -24.23333333 0.69924563 <0.000
placebo 5 4.30000000 0.79874902 1
db/db protein 1-5 10 -1.47000000 0.36939891 0,240
placebo 10 -2.00000000 0,23142073
protein 1-12 10 -3,75000000 0,77348418 0,610
placebo 10 -4,19000000 0,34655447
CBA/J protein 1-5 10 -0,48000000 0,178761117 0,006
placebo 10 0,38000000 0,21489015
protein 1-12 10 -0,12000000 0,45748103 0,015
placeba 10 1,20000000 0,18378732
protein 1-27 5 1,98000000 0,48723711 <0,651
placebo 6 2,23333333 0,20763215
Razprava
Endokrino funkcijo za produkcijo proteina OB iokusa je prvi predpostavljal Coleman, ki je pokazal, da se je telesna teža ob/ob miši zmanjšala po parabiotični združitvi normalne miši z db mišjo (Coleman et ai, 1978, supra}. Zgornji rezultati podpirajo to hipotezo s tem, da je iz njih razvidno, da OB protein kroži v krvnem obtoku in da injekcije rekombinantnih proteinov znižajo telesno težo. Molekulska masa genskega produkta, za katerega zapis je nosil OB gen, je približno 16 kD, in je enak kot pri 146 aminokislinski sekvenci karboksi terminala signalne sekvence. Pri ekspresiji v Pichia pastoris, do modifikacije rekombinantnega OB proteina ne pride. Ekspresija sesalskih genov v Pichii je v splošnem rezultat tvorbe pravilne proteinske strukture [Cregg et al., Bio/Technoiogy, 11:905-914(1993)]. Te ugotovitve kažejo, da OB protein ni glikoziliran in ni
112 posttranslacijsko procesiran in vivo. Podatki ne izključujejo možnosti, da OB proteini ni nekovalentno vezan sam nase v plazmi ali adipoznem tkivu.
Čeprav proteolitična cepitev proteina ni izključena, oblike OB proteina z nižjo molekulsko maso nismo zasledili pri nobenem od uporabljenih protiserumov, vključno s štirimi protipeptidnimi protitelesi.
OB protein ima dva cisteinska ostanka in kroži kot monomer v človeku in kot monomer in dimer pri ljudeh, intramolekularne vezi, tipične za izločene molekule najdemo, ko pride do ekspresije humanega proteina v Pichia pastoris, kar nakazuje, da naj bi bi! prisoten in vivo. To je potrjeno z bioaktivnostjo rekombinantnega bakterijskega proteina, ki ima intramoiekuiarno disuiiiano vez. Mišji OB protein najdemo v plazmi, kot monomer ali kot dimer. Monomer in dimer vidimo, ko je mišji OB protein ekspresiran v kvasovkah, kar kaže na nagnjenost mišjega proteina, da tvori dimer, kot rezultat razlik v primarni sekvenci glede na humano sekvenco. Jasno je, da je monomer bioaktiven, funkcionalna aktivnost monomera pa ni poznana.
Učinek OB proteina na vnos hrane in telesno težo pri ob miših je očiten. Po treh tednih zdravljenja, ko so miši dnevno prejemale injekcije rekombinantnega proteina so izgubile 40% njihove telesne teže in so konzumirale 40% toliko hrane, kot kontrolne živali. Še več, teža zdravljenih ob miši se ni uravnotežila v času trajanja poskusa. Rezultati hranjenja para kaže na izgubo teže, ki je rezultat vpliva na oboje, vnos hrane in porabo energije. Torej, ločena skupina ob miši, pri katerih je kaloričen vnos omejen glede na ob miši, ki so prejemale protein, je bila izguba teže manjša, kot pri živalih, ki so prejemale protein Zmanjšanje vnosa hrane v ob/ob miših na nivo, ki je bil manjši kot pri divjih živalih v času prejemanja OB proteina kaže, da so posebaj občutljive na njegov učinek. Pravzaprav, so lahko OB receptorji pri teh živalih dodatno regulirani. Vnos hrane zdravljenih ob miši postanejo relativno konstatno po petih dneh zdravljenja. Če je to rezultat proteina, ki je dosegel ravnotežno stanje bi predpostavljali, da ima ta protein relativno dolgo razpolovno dobo [The Pharmacofogica! Basis of Therapeutics, str. 19-45, Goodman and Gilman, eds. Pergamon Press, New York (1990)]. Ta zaključek smo naredili s pomočjo podatkov iz parabioznega poskusa [Coleman ef al., 1978, supra; Weigie, int. J. Obesity, 12:567-578(1988)].
113
Učinek rekombinantnega proteina na telesno težo pri divjih miših je bil majhen, vendar statistično značilen, v prvih dveh tednih študije. Medtem, ko je bila razlika v teži med divjo mišjo, ki je prejemala protein in tisto, ki je prejemala PBS opazna veliko kasneje, statistično pomembna razlika je izginila po treh tednih. Zgodnjo izgubo teže naj ne bi šteli, zaradi raziike v vnosu hrane. Merjenje vnosa hrane ni bilo dovolj natančno, da bi opaziii zmanjšanje, ki je rezultat enega grama razlike v telesni teži med zdravljenjem. Ta opažanja se razlikujejo od rezultatov prejšnih poskusov pri katerih divji glodalci niso bili pridruženi parabiotični zvezi k db mišim, fa podganam, podganam s poškodbami hipotalamusa in podganam, ki so bile ponovno debele, zaradi visokokalorične diete [Coleman et ai., 1978, supra; Harris et al., 1987, supra, Harris et la., Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats, v Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Pubiishing Co., New Vork (1989); Harvey, J. Physilo., 145:336-352(1959)]. V vsakem primeru, pri divjih živalih pride do anoreksije in do velike izgube teže. Na tem nivoju so vrednosti OB proteina povišane pri db miših in fa podganah in vrednosti OB RNK se poviša pri miših s poškodbo hipotalamusa, to je podobno, kot se odzivajo divje miši, ki se odziva na OB, ki kroži po plazmi v dovolj visoki količini. Ugotovitve, o katerih poročamo tukaj so zanesljive z verjetnostjo, da je vrednost apliciranih proteinov pod vrednostjo endogenih proteinov, kar vodi do izenačitve pri rahlo znižani telesni teži. Določevanje količine krožečega OB proteina pri zdravljenih miših bi to tkivo razkrojilo. Ker še ne moremo določiti mišji protein z imunotestom, smo imunoprecipitacijo uporabili za to, da smo ocenili, da vrednost krožečih OB proteinov ni bila dovolj visoka pri divjih miših, ki so prejemale protein.
Manj pomemben učinek pri divjih miših in pomankanje odziva pri db miših, nakazuje na dejstvo, da ima zdravljenje nespecifične ali odklonilne učinke. Vsem db miši se je med zdravljenjem telesna teža znižala malenkostno, pa naj so ali niso prejemale ob protein, db živali so bile opazno hipoglikemične in izguba telesne teže naj bi bila rezultat sledkorne bolezni in ne eksperimentalnega protokola. G57Bl/Ks db/db miši so pogosto razvile sladkorno bolezen in prišlo je do manjše izgube telesne teže, zaradi starosti uporabljenih živali v tej študiji (Coleman et al., 1978, supra) C57B1/6J ob/ob miši podobne starosti ni prišlo do značiine hipoglikemije. Menimo, da so te fenotipske raziike posledica genetskih
114 razlik v sevih (C57BI&J proti C57BI/Ks), kjer pride do mutacij (Coleman et al., 1978, supra).
Nezmožnost določitve odsekanosti 105 aminokislinskega proteina, kar predvideva cDNK sekvenca OB gena pri C57B1/6J objob miših kaže, da je mutirani protein aii razgrajen ali ni prišlo do translacije. Kakorkoli, verjetnosti, da s pomočjo uporabljenega protiseruma tega odekanega proteina ne moremo zaslediti, ne moremo izključiti. Opaženo 10-kratno povečanje vrednosti ob proteina pri db miših v primerjavi z divjo, kaže da je pride do povečanje produkcije ob proteina, ko pride do rezistence nanj. Ti podatki se ujemajo s študijami OB mRNK. Kot smo že omenili so predhodni poskusi pokazali, da so mutacije mišjih db in podganjih fa genov, ki se nahajajo homologno s kromosomsko regijo, posledica prekomerne produkcije plazemskega faktorja, ki znižuje telesno težo (Truett et al., 1991; Coleman, 1978, supra, Hervey, 1959, supra). V obeh primerih je opaziti, da so živali z mutacijami odporne na učinke OB proteina. To verjetnost potrjujejo opazovanja, da OB protein nima učinka na telesno teži ali vnos hrane, ko ga apliciramo db mišim.
Debelost pri ljudeh lahko povežemo s povečano vrednostjo OB proteina v plazmi pri posamezniku, ki se ne odziva na hormon. Drugače povedano, zmanjšana ekspresija OB lahko vodi v debelost, tudi v primerih, ko v plazmi določimo normalno (t.j. neprimerno nizko) vrednost proteina. Torej, je vrednost OB proteina v humani plazmi, lahko znak različnih oblik debelosti. V majhnih skupinah normalnih posameznikov z BMI<25, smo s poločjo ELISA testa določili nižje nanogramske vrednosti krožečega OB proteina. Določili smo različne koncentracije, kar nakazuje, da nivo ekspresije in/ali občutljivosti na protein lahko igra pomembno vlogo pri določanju telesne teže.
Mesto delovanja OB proteina ni znano. Proteina vpliva na oboje, vnos hrane in porabo energije, te ugotovitve se ujemajo s kliničnimi študijami, kar kaže, da je spreminjanje obeh sistemov lahko reguliramo telesno težo [ Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332:621-628(1995); Keesey et al., Metabolic defense of the body weight set-point v Assiclatlon for Research in Nervous and Mental Disease, str. 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York (1984)]. Hipotalamus naj bi bil navzdolžen OB na poti, ki kontrolira telesno težo, čeprav so možni neposresni učinki na številnih organih.
115
PRIMER 9:
Povečana ekspresija v adioocitih OB RNK ori miših s poškodbami hipotalamusa in z mutacijami na db tocusu
Genski produkt nedavno kloniranega mišjega debelostnega gena (OB) igra pomembno vlogo pri uravnavanju mase adipoznega tkiva. OB RNK ekspresiramo specifično z mišjimi adipociti in vivo, v vsakem od številnih različnih maščobnih celičnih depotov vključno z rjavo maščobo. Enako je ekspresiran v kultiviranih 3T3-442A preadipocitnih celicah, ki so bile inducirane za diferenciacijo. Miši s poškodbami hipotalamusa, kot tudi mišji mutanti na db locusu, izločajo 20-krat večjo količino OB RNK v adipoznem tkivu. Ti podatki nakazujejo, da je db gen in hipotalamus sta nizhodna glede na OB gen na poti, ki uravnava maso adipoznega tkiva in se ujema s predhodnimi eksperimenti, ko kažejo, da db locus nosi zapisa za OB receptor. Pri db/db in miših s poškodbami pride do kvantitativne razlik v vrednostih izločene OB RNK, ki se pokriva z vsebnostjo maščob v adipocitih. Molekule, ki uravnavanjo ekspresijo OB gena v adipocitu naj bi igrale pomembno vlogo v določanju telesne teže, ko molekule, ki pospešujejo vpliv OB na mesto delovanja.
Materiali in metode
In situ hibridizacija
Belo maščobno tkivo identičnega področja trebuha divjih miši (wt=wild type) in db miši smo pridobili simultano po modificirani metodi, ki jo je opisal Richardson s sodelavci v Growth, Development & Aging, 56:149-157(1992). Na kratko, tkiva smo namestili v Bouinovo raztopino 2 uri pri 4°C. Nato smo jih dehidrirali v seriji obdelav z etanolom v naraščajoči koncentraciji od 10% do 100%, vsakič 5 minut pri 4°C. Nadaljnja inkubacija tkiva s ksilenom (1 uro) in parafinom (2uri) smo izvajali pri 65°C. Omenjene wt in db/db maščobna tkiva smo razrezali in dali na mikroskopsko steklo pod enakimi pogoji. Dele smo segreli na 65°C 1 uro in obdelali s ksilenom in serijo razredčenega etanola od 100% do 50%, vsakič po 3 minute pri sobni temperaturi. Komplementarno RNK sondo OB gena smo sintetizirali z in vitro transkripcijo lineariziranega OB gena, ki nosi zapis za vzdolž sekvenco Sp6 RNK polimeraznega promotorja. In situ
116 polimerizacija smo izvedli natančno po Schaeren-VViemers et al., Hlstochemistry, 100:431 -440(1993).
Priprava RNk in celične kutture
Celokupna RNK in pivnanje po Northern-u je bila izvedena, kot je bilo opisano. Krvne celice in adipocitiesmo pripravili po Rodbellu in pripravili RNK iz obeh frakcij skladno z Dani et al., Mol. Celi. Endocrinol., 63:199-208(1989); Rodbell, J. Biol. Chem, 239:375-380(19 ). Po končanem subkloniranju smo 3T3-F442 celice gojili na mediju po Eagl-u modificiranem po Dulbecc-u, ki vsebuje 10% govejega seruma (definiran kot standarden medij) [Dani et al., Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation, v Obesity in Europe vol 88, str 371-376, Bjorntorp and Rossner, urednika, John Libbey Company Ltd., London, Aanglija (1989)]. Pri pretoku smo celice obdelovali v standardnem mediju, ki mu je bil dodan 2 nM trijodtironin (T3) in 17 nM insulina. Po dvanajstih dneh smo RNK pripravili enako, kot je opisano zgoraj.
Obdelovanje z aurotioglukozo (GTG)
Dva meseca stare samice CBA/J miši smo z enkratno intraperitonealno injekcijo aplicirali aurotioglukozo (Sigma kataloška številka A0632) v odmerku 0.2 mg/g v fiziološki raztopini. Kontrolnim živalim smo aplicirali samo fiziološko raztopino. Miši smo stehtali en mesec pred zdravljenjem. RNK adipoznega tkiva smo izolirali iz tistih zdravljenih živali, ki se jim je teža povečala za več kot dvajset gramov po končanem GTG zdravljenju.
Rezultati
Pred nedavnim so ugotovili, da se OB gen izloča v maščobnem tkivu [Zhang et al., Nature, 372:425-432(1994)]. Ker je adipozno tkivo sestavljeno iz več tipov celic vključno z adipociti, preadipociti, fibroblastov in krvnih celic, je bila narejena in situ hibridizacija, da bi ločili epidermalne maščobne blazinice iz normalnih živali z osnovno in komplementarno OB ribosondo [Ridchardson ef al., 1992, supra; VVasserman, 'The concept of the fat organ v Rohadl, Issekutz as a tissue, str. 22-92, McGravv Hill, New York (1994)]. Ko smo uporabili komplementarno sondo smo zasledili
117 pozitivni signal v vseh adipocitih v odrezku (slika 30- označeni Wt). Signala nismo zasledili, ko je bila komplementarna sonda hibridizirana v delu možganov (podatki niso prikazani). Hibridizacija komplementarne sonde na odrezek adipoznega tkiva iz C57B1/Ks db/db miši je bila povečana, kar potrjuje specifično ekspresijo OB RNK in kaža na veliko povečanje vrednosti OB RNK na adipocit pri teh živalih (slika 30- označena db/db). Mišji mutanti na db locusu so zelo debeli, kot del sindroma, ki je fenotipsko identičen tistemu, ki smo ga videli pri C57B1/6J ob/ob miših (Bahary et al., 1990, supra).
OB RNK nismo sintetizirali v adipoznem tkivu stromalnih celic, ki so ločene od adipocitov. Kot smo predvidevali, celice adipocitne frakcije, ki ekspresirajo OB RNK z metodo pivnanja po Northern-u (slika 31). Enake rezultate smo dobiii pri uporabi RT-PCR. Ti zaključki podpirajo sklep, da samo adipociti ekspresirajo OB gen. Podatki, ki smo jih dobili iz kultiviranih adipocitov potrjujejo te zaključke. V teh študijah, 3Z3-F442A celice smo gojili pod pogoji, ki vodijo v akumulacijo maščob, kot del celičnega programa, ki vodi v diferencijacijo v adipocitih. Do ekspresije OB RNK ni prišlo v celicah z eksponencialno rastjo, niti v konfluentnih 3T3-F442A preadipocitih, ki izločajo zgodnje označevalce, medtem ko diferenciacija teh celic v adipocite vodi do ekspresije OB RNK, ki ga lahko zasledimo (slika 31) [Dani et al., J.Biol. Chem., 264:10119-10125(1989)]. Vrednost OB RNK je zelo občutljiva na pogoje v kulturi, ker pozneje nismo opazili nobenega sporočila, nato izločene celice niso bile izpostavljene insulinu.
Hibridizacijeske študije kažejo, da je OB RNK, ki se ekspresira in vivo v več različnih maščobnih depotih, vključno z epididimalnimi, parametrialnimi, abdominalnimi, perirenalnimi in ingvinalnimi maščobnimi blazinicami (slika 32A). Natančna vrednost ekspresije v vsakem depoju je bila včasih različna, z ingvinalnimi in parametrialnimi maščobami, kjer je ekspresija OB RNK nižja. Ekspresija OB RNK poteka tudi v rjavem adipoznem tkivu, čeprav je vrednost ekspresije v rjavem maščevju približno 50-krat nižja glede na druge maščobne tkivne zaloge. Ta kvantitativne razlike lahko vzporedimo s prej navedenimi razlikami v veliksoti celic med različnimi celičnimi zalogami [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:2-11(1972)]. Količina OB RNK v rjavi maščobi je na mraz neobčutljiva (slika 32B). V tem poskusu je vrednost nevezanih proteinske RNK (UCP) povišana v rjavi maščobi po izpostavitvi mrazu, medtem ko se vrednost ob RNK ni
118 spremenila [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 206:16250-16254(1985)]. Če povzamemo vse skupaj ti podatki potrjujejo, da so vsi adipociti sposobni producirati OB RNK in izkazovati razičine vrednosti ekspresije v različnih maščobnih depotih. Ti podatki potrjujejo možnost, da je količina kodiranega proteina korelira s celokupno maso maščobnega tkiva.
Izmerili smo količino OB RNK pri db/db miših in miših s poškodbo hipotalamusa. Poškodbe ventromedialnega hipotalamusa (VHM) vidijo do debelosti kot del sindroma, ki je podobno tistemu, kar smo videli pri ob/ob in db/db miših [Bray et al., Metabolism, 24:99-117(1975)]. Parabiozni ekspreiment kaže, da imajo take poškodbe za rezultat prekomerno ekspresijo krvnega faktorja, ki zavira vnos hrane in telesno težo (Hervey, 1959, supra). Podobne rezultate smo zasledili ko so mišji mutanti db locusa v parabiozi z normalnimi mišmi, kar kaže, da je lahko OB receptor enkodiran na db locusu. (Coleman et al., 1978, supra). Torej je debelost posledica poškodbe VMH in je mutacija db lahko posledično rezultat odpornosti na učinke OB proteina. Če je tako, lahko napovemo sekundarno povečanje vrednosti OB RNK v adipoznem tkivu.
Poškodbe hipotalamusa smo pri samicah GBA miši izzvali kemično s aurotioglukozo (GTG) [Debons et al., Fed. Proč., 36:143-147(1977)]. Tovrstno obdelovanje povzroči specifične poškodbe hipotalamusa, posebaj ventromedialnega hipotalamusa (VMH), s postopnim razvojem debelosti v nekaj tednih. Navadno, posamezna intraperitonealna injekcija GTG v odmerku 0.2 mg/gm telesne teže, vodi v nastanek debelosti v štirih tednih. Mesec dni starim samicam CBA/J miši (20 - 25 gramov) smo dajali GTG, podatki o telesni teži zdravljenih živali in kontrolnih živali so prikazani (preglednica 2). RNK adipoznega tkiva smo pripravili iz db/db miši iz tistih z GTG obravnavanih živali, kateri teža se je povečala za > 20 gm. Pivnanje po Northern-u kaže na 20-kratno povečanje vrednosti OB RNK pri dveh mesecih starih db/db in GTG obravnanvanih živalih, v primerjavi z normalnimi živalmi (slika 33).
Preglednica 2: _
kontrolna s. (n=4) GTG (n=93)
< 10g 41, (100%) 4, (4%)
10g - 20g 0, (0%) 15 (16%)
0, (0%) 74, (80%)
119
Dva meseca starim samicam CBA/J miši smo aplicirali aurotioglukozo (GTG). Aurotioglukozo (Sigma A0623) smo aplicirali intraperitonealno v fiziološki raztopini, v odmerku 2.0 mg/g. Telesno težo kontrolne in injiciranih živali smo beležili pred in en mesec po injiciranju. Živali smo namestili v kletke po pet skupaj in hranili ad libitium. Količina narasle teže 1 mesec po injiciranju je prikazana v preglednici 2. Živali s telesno težo večjo za 20 g en mesec po injiciranju smo izbrali za nadalnje preučevanje.
Razprava
Genski produkt mišjega OB gena kroži v mišji in humani plazmi kjer naj bi uravnaval maso maščobnega tkiva. Nadaljne študije o regulaciji ekspresije in mahanizma delovanja OB bodo pomembne za naše razumevanje fiziološke poti, ki uravnava telesno težo.
Predloženi Primer kaže, da do ekspresije genske produkta OB pride le v zalogah adipoznega tkiva. Ta rezultat je skladen z verjetnostjo, da preoteinski produkt OB gena korelira z zalogami telesnih lipidov. Še več, OB RNK je 20-krat večja pri db miših in miših s poškodovanim hipotalamusom. Pri teh živalih dejansko povečanje vrednosti OB RNK na celico je še višje kot 20-krat, ker je velikost adipocitnih celic pri teh živalih povečana za približno 5-krat (glej sliko 30) (Debons ef al., 1977, supra). Ti podatki o db genu in hipotalamusno aferentani OB poti, ki kontrolira telesno težo in skladna s hipotezo, da je zapis za OB receptor na db locusu [Coleman ef al., Diabetologia, 14:141-148(1978)]. Molekularno kloniranje OB receptorja in/ali db gena bo rešil to tkivo. Povečana vrednost OB RNK pri db/db in GTG zdravljenih miših, daje misliti na ne avtonomno fukncijo celic OB genskega produkta v maščobnih celicah [Ashvvell ef al., Proč. R. Soc. Lond, 195:343-353(1977); Ashvvell ef a/., Diabetologia, 15:465270]. Torej, če kodirani protein deluje neposredno na maščobne celice, da inhibira rast ali diferenciacijo, bi prekomerna ekspresija divjega tipa OB gena pri miših, ki so prejemale GTG vodil do normalnega fenotipa.
Najbolj verjetna razlaga teh podatkov je, da OB protein deluje kot endokrina signalna molekula, ki jo izločajo adipociti in deluje posredno ali neposredno na hipotalamus. Neposreden učinek na hiporalamus zahteva obstoj mehanizma, ki dovoljuje prehod OB genskega produkta preko možganskih membran. Mehanizem, ki vključuje ciricumventriklularni organ
120 in/ali specifični transporter bi omogočal dostop do možganov molekulske velikosti, za katerega zapis nosi OB gen [Johnson et al., FASEB J., 7:678686(1983); Bura et al., J: Ciin. Invest., 92:1924-1830(1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7:314-330(1986)]. Kakorkoli, to hipotezo moramo jemati z rezervo, dokler način prehoda protein preko možganskih open ni v
identificiran. Se več, oceniti moramo tudi možne učinke na druge tarčne organe.
Maščobni celični signal, ki je odgovoren za kvantitativno nihanje v količini ekspresije OB gena še ni poznan, vendar se ujema z razlikami v velikosti adipocitnih celic. Adipociti db/db miši so 5-krat večji, kot tisti pri normalnih miših, celična velikost približno 1.0 μg Iipida/celico (Johnson et ai., 1972, supra). Predhodni dokazi kažejo, da sta vsebnost celičnih lipidov in/ali velikost pomemben parameter pri določevanju telesne teže [Faust et al., Am. J. Physiol., 235:279-286(1978); Faust et al., Science, 197:393396(1977)]. Lahko, da ima vsaka maščobna ceiica nizko stopnjo ekspresije OB RNK, ki pa se poveča glede na povečanje celične velikosti. Verjetno je tudi, da celična velikost ni izmerjiv parameter, vendar se v večini ujema z intracelularnim signalom, ki poveča ekspresijo OB gena v adipocitih iz db/db in VMH poškodovanih miših. V vsakem primeru komponente signalne prenosne poti uravnavanjo sintezo OB RNK in naj bi bili pomembni pri določevanju telesne teže. Genetski vplivi in vplivi okolja, ki zmanjšajo stopnjo ekspresije OB, naj bi delovali tako, da se telesna teža poveča, kot tudi naj bi vplivali na zmanjšano občutljivost kodiranega proteina. Specifične molekule, ki uravnavajo stopnjo ekspresije OB gena še niso poznane in pričakovana določevanje vrednosti genske kontrole, ki vodi do kvantitativnega variranja v vrednosti OB RNK in preiskušanja regulatomih elementov OB gena. identifikacija molekul, ki uravnavajo ekspresijo OB gena v adipocitih in tisth, ki vzpodbujajo učinek kodiranega proteina in njegovega mest(a) delovanja, bo v veliki meri pospešil naše razumevanje fiziološkega mehnizma uravnavanja telesne teže.
121
PRIMER 10:
Vzorec RNK ekspresije in maoiranie na fizikalni, citogenetski in genetski mapi kromosoma 7
Visoka stopnja ekspresije OB RNK zasledimo v humanem maščobnem tkivu in precej nizke stopnje v placenti in srcu. Humani OB gen leži na velikem umetnem kromosomu kvasovk (YAC), ki ga dobimo iz kromosoma 7q31.3. Poleg tega, potrditev relativnega mesto na genu temelji na mišje-humanem primerjalnem mapiranju, te študije so določili 8 obstoječih mikrosatelitskih označevalcev s približno fizikalno humanem OB genu. Ker so mutacije v mišjem OB lahko posledica v sindromu, ki skoraj podobna morbidni debelosti pri ljudeh, ti genetski označevalci predstavljajo pomembnen pripomoček za preučevanje možne vloge OB gena pri podedovani obliki humane debelosti.
Materiali in metode
Pivnanie po Northern-u
Celokupno RNK smo pripravili iz adipoznega z metodo, ki jo je opisal Chirgvvin s sodelavci v Biochem., 18: 5294-5299(1979). Metoda pivnanja po Northern-u, radiooznačevanje in hibridizacije smo izvedli, kot je opisano (Zhang et al., 1994,supra). Metodo pivnanja po Northern-u polyA+ RNK (humane MTN, humane MTN II in humane fetalne MTN II), ki smo jo dobili iz CLONETECH (Palo Alto, CA), kot so bile verige, ki smo jih uporabili za tvorbo radiooznačenih aktinskih sond.
Razvoj STS
Za označeno mesto na sekvenci (STS - sequence tagged-site) specifičen PCR test smo razvili in optimizirali prvotno, kot je opisano v [ Green et ai., PCR Method Appiic., 1991: Green et al., Genomics, 11:548564(1991); Green, Physical mapping of human chormosomes: generetion of chromosome-specific sequence-tagged sites, v Methods in Molecular Genetics vol 1, Gene and Chromosome Analysis (part A), str. 192-210, Adolph ur„ Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et af., hum. Mol. Genet., 3:489-501(1994). Vsak STS smo poimenovali s ’sWSS? pred imenom, ki mu sledi številka. Podrobnosti o 19 STS-jih, ki so tukaj
122 navedeni, so navedni v preglednici 3, skupaj z dodatnimi informacijami (t.j. PRC reakcijski pogoji, popolna DNK sekvenca), ki je na voljo v GenBank in/ali Genome Data Base (GDB). Za mikrosatelitske specifične STS-je so uporabljene oligonukleotidne verige uporabljene v PCR testih (preglednica 3) odgovarja aii tistim, ki so uporaibjene v analizi genotipa (preglednica 4) ali pri tistih, ki so oblikovani (najpogosteje z računalniškim programom OSP) [ Hillier et la., PCR Methods Applic., 1:124-128(1991)] z uporabo DNK sekvenc, ki so dostopne v GenBanki. Preglednica 3 ponazarja STS-je v YAC plazmidu, ki ima humani OB gen.
123 ca c
Ό
Φ
CT
Φ ο
α ω
ο ο
LO CO 5t CM b- 5}· ca Tt CD CO o
CM O CO 5t 5t ca ’ςτ CO co LO
1 LO Itf 1 CM 1 OJ | Ol Γγ O CO CM CM
LO in LO in P Tf 4 LO 1 LO
*t co in in in O 4 co io io
1 O o co 1 5T 1 •a· 5t ca CO co nf
o o ό 6 ό ό t o 1 O 1 O
o o o o o o o O o
CD □ (D CD CD CD CD CD O ω
Ο ,-,
LU Ο Ο) ο (02 η t s
O _q CJ > A
CD
CT i
tE
O
CL
T- CJ ω tf
ΤΓ 5f m to
5* T r- ca
Ί· 5t
Oj o tt in r- CJ in m ca tt m in m co in in in co b- bo
O)
OJ
5t
OJ in bca in o
to
CD co
P 8
Sš t=e
H [=
O P CD h šs p σ o < < o O CD (D H H CD se
T9 ω
c
Φ
CT
in cn 00
co τ- cn
T™ Ο 5t
V) Ol Ol •r*
□ CO co CO
o b- h- N.
o α Cl Q
co cfl
je , je 3e
ω J2 φ IS © 13 φ
Φ je Φ Je © je
t. Cfl s« S ® r- ·— Φ £
CT
CT
CT
O ©
C
O je o
č je
Φ >O
O .3, < -* > >
o φ
c o
je g
CD
CJ
P
=)
I p
ω
5f
ca 5Γ ca
b CD co
t— 5t co
co CO co
co co co
£ 5
co <0 co
ca rco v
(fi b□
5f
Γοο
T”
CO bQ
CD
C?
M in co o
co s
LL <
T š
m
OJ
LL <
O) m
ca
OJ co §
co co ca ca
OJ
CO §
co
CD £ t t P
P □
P P o < gk
H CD O CD
2§ O «£
Je >_ -S φ Φ se.
f* ke
Φ «
CT E
to 5* to LO
o T— Γ- co b-
oo CD ΙΟ τ- co
co T“ T“ ΟΙ t—
co CO (fi CO CO
Ν- b- b b- b
α □ O o o
Š)
o ca Σ LL <
CD CM
τ- O cn in
ΟΙ Tf CD b»
T— T- cn r-
co CO co CO
co CO co CO
b •b £
co <0 co co
s s
in
5t ca ca
Σ
LL <
S.
CO ca oi co co co
124
Λ o co uj m «fr in CM CJ) co T~
w o m CM o γ— in T· m tn
N- CM r in m «fr 00 (p T- CM CM
Q rl ιό «fr N- N. Tt in 1 «fr
o m «t 1 co o O CO in «fr
CQ co Ί· co co CO co co
ό o O O 1 o 1 O 1 O 1 O 1 O 1 o
O o o o o O o O o
P P P O P P P P P □
Q
O o
lil N- CO CJ) o co «fr r- CM in cn N- CO CJ) o T- CM co
co 2? LO in in co co co «it «e CO co CO CO co h- r- n- N
Ί·
N•κ p
= α 2 O co CM co to CM
Φ _Q o tn V” cn o T~* o CM
> ϋ t- CM T- t— n- co T“ T“ T
m .σι
IX
O
CL
i
p o < H θ P P
Š g
P p P <
< P < o P < P p
H O k- p P P P i—
B
0) c
Φ cn o
Φ c
o
Ji
P $
c
Φ cn jf.
g φ S cn E φ
Ji
Ί φ
Φ Ji
Φ g cn E jc φ
c
Φ cn
Φ ji k— tn
E o
φ c
o
Ji c
Φ cn c
o jc tfi
Ή n
E tn
'i 00 co CD
Tt 00 ιη CJ) t O- tn
r* T— co o CJ) O)
tn CM co T- in T— V·
UJ ω χ UJ ω UJ UJ co
N« ν- < Ν- Ν- ν- ν- CO b»
O ω 0. α α ο ο o O
CM vJE
O)
CJ)
Φ c
m tn x>
o c
o
r* •J? a
oo co
r· CM 5 2 o CM 5 OO CM to
LL co LL H
< cu < O
LL
M β
υ c:
T)
Φ
Pl
Φ »_
CL
«fr «Γ- CM co O) cn
N» ΙΟ co O) co CM Ht
v o O co 00 T“ IO co O
T“ CM co t— co T“ CM »t
co to UJ UJ to UJ UJ UJ UJ
2 S2 co to UJ UJ UJ UJ UJ
s 5 ž Ž Ž £ $
VJ m m m m cn m OT m
125
Navedeni so 19 kromosom 7 specifična STS mapirana na YAC plazmidu, ki vsebuje humani OB gen (slika 35). V vsakem primeru so navedeni: oblikovano ’sWWS’ ime, pripadajoči alias, GDB locus ime, STS vir, sekvenca PCR verige, STS velikost in GDB identifikacijska številka, viri STS so sledeči: ’YAC konec’ (izoliran vključek YAC)(Green, 1993, supra), 'lambda klon’ (naključni kromosom 7-specifični lambda klon)(Green et al., 1991, supra; Green, 1993, supra), 'genetski označevalec’ (mikrosatelitski marker, glej preglednico 2)(Green ef al., 1994, supra) ’YAC vključek’ (naključni segment iz YAC vključka) in ’gen’ (gensko specifičen STS), Omeniti je potrebno, da se nekateri genetski marker-specifični STS, PCR verige, ki jih uporabljamo za identifikacijo YAC (nevedeni v tej preglednici) razlikujejo od tistih, ki smo jih uporabili za predstavitev analize genotipa (preglednica 4), ker je zasledovanje YAC, ki ima genetski marker, ne zahteva pomnoževanja samega polimorfnega traka. Vsi navedeni PCR testi so izvedeni pri temperaturi 55°C, z izjemo sWSS494, sWSS883, sWSS1529, in sWSS2619 (kjer je bila temperatura 50°C, sWSS999 in sWSS1174 (temperatura 60°C) in sWSS808 (temperatura 65°C). Dodatne podrobnosti upoštevajoč, STS specifičen PCR test so na voljo v GDB.
126
ri (0 co co co
4 m co 03
'Z. CM CM CM
ΓΊ CM N. N o
L—J t- co co o
rp «ι- T CM
CO o ό o o
o o o o o
o ϋ o o 0
't o o O)
o M· co to
CM CM co
ώ ά ob N
co O) 00 co
T- τ- τ- •J·
o 0 ο ό
o o o o
o 0 0 0
O
O O
ω r«. co 0) o T- CM o
co z S- K K a> CO CO co
to co r^. (30 0) o γ—
co co co CO co c» O)
Preglednica 4. Mikrosatelitski markerji v YAC stiku, ki ima humani ob gen
co CO 'T Lfl
cn N. N. o m <5}· N.
'i CO CO co γ— co O CO
T— t— T- co in to m 1—
ω w co ω ω co ω CO
N s r-· Γ- rx N. h- N
O 0 0 0 O 0 0 O
c c c c: c C C
«r <
0 0 0, U 0 »Sr*· £ 0
« ‘C* cn CT N m co Y“ JZ O O CM S
ω Ar »_ co 5 in CM i T ‘te 00 T O & T XX & S m -4·
E GO o »n· o T“ o 0) co
s « 03 co CM CM *— m
φ p S s 5 5 S S 5
E H LL LL LL LL LL LL LL
0 < < < < < < <
127
Navedenih je osem mikrostelitskih markerjev, mapiranih na YAC stiku, ki vsebuje humani OB gen (slika 35). V vsakem primeru je ime markerja (označen tudi kot aiias v preglednici 3), tip mikrosatelitskega motiva (tetranukieotid, tetra aii (CA)n se ponavlja)pripadajoče GDB locus ime, sekvenca verige, ki se uporablja za genotip na osnovi PCR analize in GDB identifikacijska številka. Dodatne podrobnosti glede na PCR test in polimorfizem so na voljo v GDB.
Humani OB specifični STS (sWSS2619) je bil oblikovan tako, da smo uporabili DNK sekvenco, ki smo jo dobili iz 3’ neprevedenega področja cDNK. humani Pax4-specifičen STS (sWSS808) smo razvili s pomočjo naslednje strategije. Oligonukelidno verigo, ki so specifične pri mišjem Pax4 genu (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO:63) in (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID NO:93) [VValther et al., 1991, Genomics, 11:424-434(1991)] smo uporabili za pomnoževnje 204 bp fragmenta iz humane genomske DNK (ki je bil produkt z enako velikostjo kot ta, ki smo ga generirali iz mišje genomske DNK). Ta PCR test ni bil primeren za identifikacijo odgovarjajočega YAC, ker smo produkt podobne velikosti (200-bp) pomnožili iz DNK kvasovk. Analiza DNK sekvence na PCR produktu, ki smo ga pripravili iz humane DNK je odkril, da je prišlo do zamenjave na položaju 20 med 156 analiziranimi bazami (podatki niso prikazani). Z uporabo humane specifične sekvence, smo oblikovali novo verigo (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID NO:64) in uporabili s prvo od zgornjih mišjo Pax4 specifično verigo (glej preglednico 3). Nastali humani Pax4 specifični PCR test ni pomnožil znatne količine produkta iz DNK kvasovke in smo ga torej uporabili za identifikacijo odgovarjajočih YAC.
Identifikacija YAC-ov s sejanjem na osnovi PCR
Večina YAC-ov, ki so bili prikazani na sliki 35, smo dobili po zbiranju klonov, ki so zelo bogati s humanim kromosomom 7 DNK ('kromosmoski 7 YAC vir’) (Green et al., 1995, supra) z uporabo pregledovanja na osnovi PCR [Green ef al., 1995, supra; Greena et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217(1990)]. V nekaj primerih so bili koni izolirani na osnovi PCR pregledovanja (Greena ef al., 1990, supra) dostopne celokupne humane genomske YAC knjižnic, ki je izdelana na CEPH [Dausset ef al., Behring Inst. Miti., 91:13-20(1992); Albertsen ef al.,
128
Proč. Natl. Acad. USA, 87:4256-4260(1990)] ali ICI [Anand et al., Nucl. Acids. Res., 17:3425-3433(1989): Anand et al., Nucl. Acids Res., 18:19511956(1990)]. Vsak YAC je poimenovan s prefiksom ’yWSS’ ki mu sledi lastna številka.
Rezultati in razprava
Pregledovanje ekspresije humanega OB gena s pivnanjem po Northern-u v tkivu je odkrila, da je ekspresija OB RNK v humanem adipoznem tkivu zelo visoka, veliko nižja pa v placenti in srcu (slika 34). Velikost RNK (približno 4.5 kB) je bila enakovredna pri ljudeh in miših, kot tudi v vsakem tkivu, kjer ekspresija poteka. V teh študijah smo opazili 5krat višji signal pri 10 qg celokupnega adipoznega tkiva RNK, kot pri 2 gg polyA+ piacentalne RNK. 5-krat nižji signal pri polyA+RNK pri srcu v primerjavi s placento. Ugotovimo lahko, da so vrednosti OB RNK približno 250-krat nižja v placenti, kot v maščobnem tkivu. V tem poskusu OB RNK nismo zasledili v nobenem drugem analiziranem tkivu vključno z možgani, pljuči, jetri, skeletnimi mišicami, ledvici in pankreasom. Z dodatnimi poskusi nismo odkrili OB RNK v vranici, timusu, prostati, testisih, ovarijih, tankem črevesju, kolonu, levkocitih prerferne krvi aii v možganih, jetrih ali ledvicih zarodka (podatki niso prikazani). Možno je, da je ekspresija OB nizka in je ne moremo zaslediti (z metodo pivnanja po Northern-u) v teh tkivih ali v drugih tkivih, ki jih nismo preučevali. Vzorec ekspresije, ki smo ga opazili, pri ljudeh se nekoliko razlikuje od ekspresije pri miših, kjer OB RNK zasledimo skoraj samo v maščobnem tkivu.
Primerjalno mapiranje področa OB gena pri mišjem in humanem genomu
Mišji OB gen se nahaja na proksimalnem kromosomu 6, področju, ki je homologne z delom humanega kromosoma 7g. Geni s tem segmentom vključujejo (od proksimalnega do distalnega); Met protoonkogen, cistični fibrozni transmembranski prenosni regulator (Cftr), sparjeni gen s škatlo 4 (Pax4), OB in karboksipeptidazo A(Cpa) (Zhang et al., 1994, supra; Friedman et al., 1991, supra). Pri miših smo genetsko mapiranje uporabili za predstavitev, da je Pax4 tesno povezan z ob [VValther et ai., 1991, supra; Zhang et al., 1994, supra]. Ugotovili smo, da je fizikalna oddaljenost med OB in Pax4 približno en megabazni par (Mb) (Zhang et al., 1994,
129 supra). Temelječ na teh študijah mapiranja smo pričakovali, da naj bi se humani OB nahajal med Pax4 in CPA na kromosomu 7q. Nadalje, ker so bili humani CFTR [Heng et ai, Celi. Genet., 62:108-109(1993)] in Pax4 [ Tamura et al., Cytogenet. Celi Genet., 66:132-134(1994)] mapirani s fluorescentno in situ hibridizacijo (F1SH) do 7q31.3 in 7q32, naj bi bilo najverjetnejše citogenetsko mesto humanega OB gena bližina 7q31.3-q32 meje.
Mapiranie OB gena na humanem kromosomu 7
STS (sWSS2619) pomnoževanje majhnega segmenta 3' netransiatiranega področja humanega OB gena smo uporabili za pregled zbirke YAC klonov, ki so zelo bogati s humanim kromosomom 7 DNK (Green et al., 1995a, Genomics 25: 170-183) in identificirali 9 YAC-ov (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 in yWSS5GG4). Da bi preverili ali ti YAC vsebujejo tudi avtentični humani OB gen , smo izvedli še dva dodatna poskusa. Prvič, smo vsak YAC preiskušali s sekundarnim humanim za OB specifičnim PCR testom in ugotovili smo, da so vsi pozitivni (podatki niso prikazani). Drugič, DNK kvasovke iz vsakega klona smo izpostavili razgradnji z EcoRI in jih analizirali z gelsko transfer hibridiziacijo z uporabo sonde, ki smo jo dobili iz OB cDNK. V vseh primerih smo opazili posamezen hibridizacijski trak in ta trak je bil enake veliksoti pri YAC in P1 klonu in je vseboval human OB gen (podatki niso prikazani).
Z uporabo računalniškega programa SEGMAP (Green and Green, 1991, supra) in drugih podatkov o YAC na osnovi STS, ki jih lahko pridobimo iz kromosoma 7 (Green et la., 1991, supra; Green et al., 1994, supra; Green et al., 1995, supra) smo ugotovili, da se humani OB gen nahaja znotraj YAC stika na sliki 35. Specifično je da, ta stik obsega 43 prekrivajočih se YAC in 19 enkratno urejenih STS. Podrobnosti o vsakem od 19-ih STS so napisane v preglednici 3. Poleg tega OB specifični STS, stik kljub temu vsebuje STS (sWSS808), ki je specifičen za humani Pax4 gen (Tamura et al., 1994, supra; Stapleton et ia., 1993, Nature Genet. 3:292-298), 7 STS-jev, ki smo jih pridobili iz kromosomskega 7-specifičnega YAC, 2 STS pridobljena iz kromosoma 7-specifičnega lambda klona in najpomembneje, 8-mikrosatelitskih specifičnih STS-jev. Dodatni podrobnosti o teh osmih genetskih markerjih, vključno s sekvencami verig, uporabljenih za
130 analizo genotipa, so opisane v preglednici 2. Neuradno, je preobilna povezanost na osnovi YAC skozi stik (t.j. tukaj sta 2 ali več YAC povezana z vsakim sosednjim parom STS), nudi močno oporo relativni urejenosti STS, ki je prikazana na sliki 35.
Kot je prikazano na sliki 35, predpostavljamo, da je orientacija YAC stika, ki vsebuje OB taka, da je sWSS1734 centromeričen večini STS (t.j. bliže CFRT), medtem ko je sWSS2377 telomeričen večini STS (t.j. bliže CPA). Taka orientacija predominantno temelji na primerjalnih podatkih mapinga, ki uvršča Pax4 proksimalno in OB disalno znotraj sinteničnega bloka, ki je prisoten v mišji in humani DNK (Zhang ef al., 1994, supra). Položaj OB gena biizu telomeričnega dela stika, temelji na namestitvi OB specifičnega STS (sWSS2619).
Medtem, ko je bil stik, pikazana na sliki 35 določen s SEGMAP brez upoštevanja velikosti YAC (tukaj prikazana STS kot enaka medsebojan oddaljenost), smo s podobno analizo podatkov s SEGMAP, ki upošteva velikost YAC, kaže, da je celokupna velikost področja prekrita s stiki velika nekaj več kot 2 Mb (podatki niso prikazani). Torej, medtem ko je vseh 8 mikrosateiitskih specifičnih STS (preglednica 4) znotraj genomičnega intervala, ki v grobem obsega 2 Mb, so 3 bližje telomeričnemu koncu stika (sWSS1392, sWSS1148, in sWSS2367) in so bližje OB genu samemu (verjetno znotraj intervala majhni kot približno 500 kb). Dejstvo je, da vsi 3 zadnji STS prisotni v vsaj enem od humanih OB, ki vsebuje YAC. Interval med humanim Pax4 (sWSS808) in ob (sWSS2619) ocenjujemo, da je približno 400 kb, medtem ko predvidevamo, da se to področje razteza na 1 Mb pri miši (Zhang et al., 1994. supra). Nazadnje, trije YAC znotraj stika (yWSS691, yWSS999 in yWSS2935) smo analizirali s pomočjo FISH in pri vsakem ugotovili da hibridizira samo v 7q31.3. Ened izmed teh YAC (yWSS691) ima OB specifično STS, medtem ko imata druga dva klona Pax4-specifične STS. Poznejši rezultati se v splošnem ujemajo s predhodnim citogenetskimi določitvami humanega Pax4 glede 7q32 (Tamura ef al., 1994, supra). Temelječ na teh podatkih, humani OB gen lahko povežemo s citogenetskim trakom 7q31.3.
131
PRIMER 11;
Humani OB polipeptid /e biološko učinkovit pri miših
Skupino 10 ob/ob miši smo zdravili z i.p. injekcijo z 10 pg/g/dan rekombinantnega (bakterijskega) humanega in glodalskega OB polipeptida ali fiziološke raztopine. Po štirih dneh je skupina, ki je prejemala fiziološko raztopino pridobila 0.3g. Skupina, ki je prejemala glodalski OB je izgubila
3.2 g. Skupini, ki je prejemala humani OB, pa se je znižala teža za 2.0g (p<0.01 primarjavi s kontrolno skupino, ki je prejemala fiziološko raztopino). Te skupine smo tudi preiskusili na vnos hrane. Podatki za vnos hrane so navedeni v preglednici 5; podatki za telesno težo, pa so prikazani v preglednici 6.
Preglednica 5:
Dnevni vnos hrane (g) pri zdravljenih ob/ob miših (vrednost + stand. dev)
zdrav. 0. dan 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan
fiziološka 13.4+2.6 12.8 12.8 13.1 14.0 12.3 12.4 8.3
glodal. OB 14.9 3.7 4.4 5.1 8.9 8.1 8.7 3.5
human OB 14.3 10.3 8.7 7.0 8.9 5.3 3.8 13.0
Preglednica 6:
Telesna teža in sprememba teže pri zdravljenih ob/ob miših (vrednost ± SD)
zdravljenje telesna teže (0. dan) telesna teža (4. dan) % spremembe (od 1.-4. dne) telesna teža (6. dan) % spremembe (od 0.-6. dne)
fiziološka 39.9 ± 1.8 40.7 ±1.6 0.8 ± 0.5 41.1 ± 2.2 1.2 ± 1.1
glodalski OB 39.5 ± 2.1 36.2 ± 2.0 - 3.3 ± 1.2 36.3 ± 2.2 -3.1 ± 1.2
humani OB 39.5 ± 2.0 37.6 ± 1.7 - 2.0 ± 1.0 36.1 ± 1.3 -3.5 ± 1.3
Ti podatki ponazarjajo, da je humani OB aktiven pri miših.
132
PRIMER 11:____Visoki odmerki OB imajo učinek pri divjem tipu miši
Divjem tipu miši (C57B16J+/?), ki smo jim aplicirali 10 gg/g/dan i.p. rekombinantnega glodalskega OB in merili telesno težo vsake štiri dni. Rezultati so prikazani v pregledni 7.
Preglednica 7: Telesna teža (g) normalne miši, ki je prejemala OB
zdrav. 0. dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan
fiziološka 22.6 ± 1.4 22.2 ± 1.2 22.5 ± 1.3 23 22.5
glodal. OB 22.4 + 1.5 20.6 + 1.5 20.8 ± 1,3 20.8 21.8
Ti podatki, kažejo, da OB vpliva na telesno težo pri divem tipu, kot tudi pri debelih (ob/ob) miših, čeprav v veliko manjšem obsegu.
PRIMER 13:
OB polipeptid apliciran s pomočjo stalne infuzije s črpalko
Ta primer kaže, da neprestana infuzija OB polipeptida povzroči izgubo teže pri normalni populaciji miši. Normalnim (ne debelim) mišim smo aplicirali infizijo glodalskega ob polipeptida s pomočjo ozmotske črpalke. Doziranje 0.5 mg proteina (kg telesne teže /dan je povzročil 4.62% izgubo (+/- 1.34%) telesne teže od bazne linije v šestih dneh, ko so prejemale infuzijo.
Materials in metode
Živali
V tem poskusu smo uporabili divji tip živali (+/+) C57B16 miši. Miši so bile v kletki same in vzdrževali smo jih v humanih pogojih. Starost miši ob začetku je bila 8 tednov in so imele uravnoteženo telesno težo. V vsaki seriji poskusov smo uporabili deset miši (placebo proti proteinu).
Hranjenje in merjenje telesne teže
Miši smo hranili z osnovno glodalsko hrano (PMI Feeds, Inc.) v obliki prahu, v posodi za hranjenje (Allentown Caging and Egupment), ki je
133 omogočala bolj natančno in zanesljivo merjenje vnosa hrane, kot uporaba navadne hrane v briketih. Težo smo merili vsak dan ob istem času (ob 14.00) šest dni. Telesno težo na dan pred aplikacijo infuzije smo definirali kot bazno linijo telesne teže.
Kloniranje glodalske OB DNK
Kloniranje glodalske OB DNK za ekspresijo v E. coli smo izvedli, kot je opisano v nadaljevanju. DNK sekvenco, kot smo jo prebrali iz objavljene peptidna sekvence ki je bila navedena v (Zhang et al., 1994, supra, t.j. Primer 1, supra) je bila reverzno prevedena s pomočjo optimalnih kodonov
E. coli. Terminalno mesto kloniranja je bil Xbai do SamHi pospeševalec ribosomalne vezave in močno ribosomalno vezalno mesto smo vključili pred kodirajočo področjem. Dvojno DNK sekvenco smo sintetizirali z uporabo standardne tehnike. Pravilne klone smo potrdili s ponazoritvijo ekspresije rekombinantnega proteina v prisotnosti pravilne OB DNK sekvence v prisotnem plazmidu. Sekvenca aminokislin (in DNK sekvenca) je naslednja:
Rekombinantna giodalska met OB (dvojna vijačnica) DNK in sekvenca aminokislin (SEQ ID No.94 in 95):
TCTAGATTrGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT g - + ------ +---------j----------+---------+--------- + -------- 68
AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA
M V P I Q K V TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA
-+---------^— - + -- -- -- -- - +----------h-- - + -- -- — - - 128
AGTCCTIGCTGTCGTTTrGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT
QDDTKTLIKTIVTRINDISHCACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA
129 - + ------ - -t— - -- - — - + ..------ 188
GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT
TQSVSAKQRVTGLDFI P G L H CCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC
189 -+---------+----248
GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG
PILSLSKMDQTLAVYQQVLTCTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT
249 - + - — 308
GAGGGACGGCAGGGTC?rrGCAAGAAGTOTAGCGA7T?GCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA
134 slpsqnvlqiandlenlrdlGCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA 309 - +.........+.........+.........+ -......-- +.........+-------- 363
CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT
LHLLAFSKSCSLPQTSGLQKACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT 369 - +.........+.........+.........+.........+.......+........ 428
TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA
PESLDGVLEASLYSTEVVALGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG 429 - + ---j.---------+---------4----------4.---------4.-------- 488
CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC
SRLQGSLQDILQQLDVSPECTTAATGGATCC 489 - +.........
AATTACCTAGG
Ekspresijski vektor in gostiteljski sev
Plazmidni ekspresijski vektor, ki smo ga uporabili za pripravo proteina, je bil pCFM1656, ameriški tip zbirke kultur (ATCC) številka dostopa 69576. Zgornja DNK je vključena v ekspresijki vektor pCFM1656, ki je bil lineariziran z Xbal in BamHI in transformiran v gostiteljski sev E. coli, FM5. E. coli FM5 celice so bile pridobljene v Amgen Inc., Thousand Oaks, CA iz seva E. coli K-15 [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40:116-167(1976)] in vsebujejo integrirane lambda fagne represorske gene cl857 [Sussman et la., C.R. Acad. Sci., 254:1517-1579(1962)]. Produkcija vektorja, celična transformacija in selekcijo kolonij smo izvedli po standardnih metodah. T.J. Sambrook et al., 1989, supra. Gostiteljske celice so rastle na LB mediju.
Aplikacija proteina ali placebo
Rekombinantni glodalski OB polipeptid smo uporabili za predloženi poskus v splošnem v koncentraciji približno 0.9 mg/ml fosfatnega pufra v fiziološki s pH 7.4. Aminokislinska sekvenca (in DNK sekvenca), ki smo jo uporabili je napisana zgoraj. Protein ali placebo (fosfatni pufer v fiziološki raztopini s pH 7.4) smo aplicirali z infuzijo s pomočjo ozmotske črpalke. Alzet osmotska miničrpalka (Alza, Palo Alto, CA, model št. 1007D) smo s pomočjo kirurškega posega namestili vsaki miši subkutano na subskapularno področje. Črpalke smo uravnotežili, da smo aplicirali 0,5 ml
135 proteina v raztopini na uro, v odmerku 0.5 mg proteina/kg telesne teže dnevno. Kontrolni skupini živali smo z infuzijo aplicirali fosfatni pufer v fiziološki raztopini s pH 7.4, s pomočjo Alzet ozmotske mini črpalke.
Fermentacijski postopek
Trifazni fermentacijski postopek, poznan kot fed-batch postopek, smo uporabili za pripravo proteina. Sestava medija je navedena v nadaljevanju
Serija
Vir dušika in fosfata smo sterilizirali (s segrevanjem na temperaturi 122°C 35 minut, 18-20 psi) v fermentacijski posodi (Biolafitte, 12 litrov volumna). Po ohlajanju smo, pod aseptičnimi pogoji dodali ogljik, magnezij, vitamine in sledove kovin. Po kultiviranju bakterij preko noči (16 ur in več), ki producirajo prej omenjeni rekombinantni glodalski protein, smo 500 mi (rastoče in LB brozge) dodali v fermentator.
Obrok I
Ko smo dosegli 4.0 - 6.0 Ο.ϋ.θθθ smo v kulturo dodali obrok I. Glukozo smo dodali v omejeni količini, da bi kontrolirali hitrost rasti (μ). Avtomatiziran sistem (ki ga imenujemo distributivni kontrolni sistem) smo programirali tako, da je dovoljeval hitrost rasti 0.15 generacije na uro.
Obrok II
Ko je O.D. dosegel 30 smo temperaturo počasi povišali na 42°C in začeli dodajati obrok II, ki je opisan spodaj. S fermentacijo smo nato nadaljevali še 10 ur s tem, da smo vzorce odvzemali vsaki 2 uri. Po 10 urah smo vsebino fermentorja ohladili pod 20°C in pridelek ločili s pomočjo centrifugiranja.
Sestava medija:
Serija:
g/l ekstrakt kvasa 5.25 g/l (NH4)2SO4
3.5 g/l K2HPO4
4.0 g/l KH2PO4
5.0 g/l glukoze
136
1.0 g/l 2.0 ml/l 2.0 ml/l 1.0 ml/l
Obrok I 50 g/l
MgSO4 x 7H2O raztopina vitaminov raztopina sledi kovin P2000 protipenilca bacto- tripton
Obrok II 200 g/l g/l ekstrakt kvasa 450 g/l glukoze
8.75 g/l MgSO4 x 7H2O ml/l raztopina vitaminov ml/l raztopina sledi kovin
100 g/l 110 g/l bacto-triptona ekstrakta kvasa glukoze
Raztopina vitaminov (serija, obrok I) vsebuje: 0,5 g biotina, 0,4 g folne kisline in 4.2 g riboflavina, ki smo jih raztopili v 450 m! vode in 3 ml 10N natrijevega hidroksida in dopolnili do 500 ml z vodo. 14 g piridoksin-HCI in 61 g niacina smo raztopili 150 ml vode in 50 ml 10N natrijevega hidroksida in dopolnili do 250 mi z vodo. 54 g pantotenske kisline smo raztopili v 200 ml vode in dopolnili do 250 ml. Tri raztopine smo združili in dopolnili volumen tako, da je bil celopkupen volumen 10 litrov.
Raztopina sledov kovin (serija, obrok I):
železov klorid (FeCI3 x 6H2O) 27g/l cinkiv klorid (ZnCI2 x 4H2O) 2 g/l kobaltov klorid (CoCI2 x 6H2O) 2 g/l natrijev molibdat (NaMoO4 x 2H2O) 2 g/l kalcijev klorid (CaCI2 x 2H2O) 1 g/l bakrov supfat (CuSO4 x 5H2O) 1.9 g/l borna kislina (H3BO3) 0.5 g/l manganov klorid (mnCI2 x 4H2O) 1.6 g/l natrijev citrat dihidrat 73.5 g/l
Postopek čiščenja glodalskega OB polipeptida
Čiščenje smo izvedli v sledečih korakih (če ni drugače napisano so bili sledeči koraki izvedeni pri 4°C:
137
1. Celična pasta. Pasta E. cofi smo suspendirali v 5-kratnem volumnu 7 mM EDTA s pH 7.0. Te celice v EDTA smo razbili z dvema prehodoma skozi mikrofiuidizer. Razbite celice smo centrifugirali pri 4.2k rpm 1 uro v Beckman JB-6 centrifugi z J5-4.2 rotorjem.
2. Izpiranje inkluzijskih teles - prvič. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in pelete ponovno suspendirali v 5-kratnem volumnu 7 mM EDTA s pH 7.0 in homogenizirali. To zmes smo centrifugirali kot v prvem koraku.
3. Izpiranje inkluzijskih teles - drugič. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in pelete ponovno suspendirali v 10-kratnem volumnu 20 mM trisa s pH 8,5, 10 mM DTT in 1% deoksiholatu in homogenizirali. Zmes smo centrifugirali enako kot v koraku 1.
4. Izpiranje inkluzijskih teles - tretjič. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in pelete ponovno suspendirali v 10-kratnem volumnu destilirane vode in homogenizirali. Zmes smo centrifugirali enako, kot v koraku 1.
5. Ponovno zavijanje. Pelete smo ponovno zavijali s 15 volumni 10 mM HEPES s pH 8.5, 1% natrijevim sarkozinom (N-iavril sarkozin) pri sobni temperaturi. Po 60. minutah je v ratropini nastal 60 mM bakrov sulfat in nato pustili mešati preko noči.
6. Odstranitev sarkozina. Raztopino smo po zavijanju redčili s 5-kratnim volumnom 10 mM tris pufra s pH 7.5 in centrifugirali, kot v koraku 1. Zbrali smo supernatant in mešali s tresenjem eno uro z Dowex 1-Χ4 resin, mreža 20-50 odprtin v mreži., tvorba klorida (pri 0.066% celokupnega volumna redčene oborjene zmesi. To zmes smo prelili v kolono in zbirali eluat. Odstranitev sarkozina smo potrdili s HPLC.
7. Precipitacija s kislino. Zbirali smo eluant iz prejšnjega koraka in pH uravnavali na pH 5.5 in inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. To zmes smo centrifugirali, kot v koraku 1.
8. Kationska izmenjevaina kromatografija. pH supernatanta iz prejšnjega koraka smo uravnali na pH 4.2 in naložili na CM Sepharose Fast Flow. Dvajset volumnov kolone slanega gradienta smo uporabili pri 20 mM NaOAC s pH 4.2, 0M do 1.0M NaCl.
9. HIC kromatografija. Zbirali smo frakcije CM Sepharose (potrjene z UV analizo) iz prejšnjega koraka in uravnali na 0.2M amonijev sulfat. 20 volumnov kolone reverzni slani gradient smo izvedli pri 5 mM NaOac s
138 ρΗ 4.2 z 0.4Μ do OM amonijevim sulfatom. To smo koncentrirali in diafiltrirali v PBS.
Rezultati
Spodaj so predstavljeni odstotki (%) odmikov od bazne linije telesne teže pri C57B16J miših (starih 8 tednov).
Preglednica 8: Izguba telesne teže po aplikaciji stalne infuzije
čas (dnevi) placebo (PBS) rekombinantni OB polipeptid
1.-2- dan 3,24 ±1,13 1,68 ± 1,4
3.-4- dan 4,3 ± 0,97 - 2,12 ± 0,79
5.-6. dan 4,64 ± 0,96 - 4,62 ± 1,3
Iz podatkov je razvidno, da je po končanem 6. dnevu stalnega dodajanja infuzije pri živalih, ki so prejemale OB polipeptid, izguba teže preko 4% njihove telesne teže v primerjavi z bazno linijo. To je veliko hitrejši način izgube telesne teže, kot smo jo opazili po intraperitonealni (i.p.) injekciji. Izguba telesne teže samo 2.6 do 3%, ki smo jo opazili na koncu 32 dneva po injiciranju pri divjem tipu (normalnih) živali z dnevno i.p. injekcijo rekombinantnega glodalskega PB polipeptida v odmerku 10 mg/kg, ki ni bila večja od 4% katerikoli drug čas v dozirni shemi (podatki niso prikazani). Iz teh podatkov lahko sklepamo, da s stalno infuzijo kljub 20-krat nižjem odmerku (0.5 mg/kg v primerjavi z 10 mg/kg) dosežemo večjo izgubo telesne teže v krajšem času.
Tukaj prikazani rezultati so statistično signifikantni t.j. -4,62/ z p< 0,0001.
PRIMER 14:
Kloniranje in ekspresija rekombinantnega humanega OB polipeptidnepa analoga
V tem primeru je opisna sestava in metode za pripravo analoga rekombinantneg humanega OB polipeptida.
139
Humana OB DNK smo sestavili iz glodalskega OB DNK kot v Primeru 13 zgoraj z zamenjavo področja med mestoma Mlul in SamHI z dvojno DNK (pripravljena iz sintetskih oligonukleotidov), v katerem smo oblikovali zamenjave za 20 kodonov. Kodoni za arginin pri zrelem mišjem položaju 35 in levcin na položaju 74 ostaneta nespremenjena. Mesto M/ul je prikazano spodaj pod strnjeno črto v sekvenci spodaj. To DNK smo vložili v pCFM 1656 vektor (ATCC številka dostopa 69576) na enak način, kot je opisan zgoraj, pri rekombinantnem glodalskem proteinu.
Rekombinantni humani met OB (dvojna vijačnica) DNK in aminokislinska sekvenca (SEQ ID NOS: 96 in 97)
CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT
---------+----------h----------h----------h----------h----------h 60
GTATACCATCGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAA mvpiqkvqddtktliktiv
ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC
---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. - --------4* 120
TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG
TRINDISHTQSV SSKQRVTG
CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG
121 ---------4-----------h- - — - ----+ — - -- -- -- 4.---------4.---------4. ISO
GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC
LDFIPGLHPILTLSKMDQTL
GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC
181 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 240
CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG
AVYQQILTSMPSRNVLQISN
GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG
241 .........+.........+ ---------4·.........4·.........+.........+ 300
CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC
DLENLRDLLHVLAFSKSCHL
CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT
301 .........+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA
P WASGLETLDSLGGVLEASG
TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG
361---------+ · — ------4.---------4----------4----------4.---------4. 420
ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC
YSTEVVALSRLQGSLQDMLW
CAGCTGGACCTGTCTCCGGGITGTTAATGGATCC 421 .........+.........+.........+ .--- 454
GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG
QLDLSPGC*
140
Fermentacija
Fermentacija zgornjih gostiteljskih celic za pripravo rekombinantnega humanega OB polipeptida je bila zaključena pod pogoji in v sestavi, kot je opisano zgoraj za rekombinantni glodalski material. Dobljene rezultate smo analizirali glede na izkoristek (g/l), predhodno čiščenje materiala rekombinantnega humanega OB (in manjše količine bakterijskega proteina) in to vzporedili, da bi analizirali bakterijsko ekspresijo:
Preglednica 9: Analiza ekspresije humanega OB polipeptida
čas OD (600 nm) izkoristek (g/0 ekspresija mg/OD I
ind. + 2 uri 47 1,91 41
ind. + 4 uri 79 9,48 120
ind. + 6 uri 95 13,01 137
ind. + 8 uri 94 13,24 141
ind. + 10 ur 98 14,56 149
Okrajšave:
Ind + _ ure ........ure po indukciji proteinske ekspresije, kot ke opisano v primeru 13 za rekombinantni glodalski material z uporabo pCFM 1656
O.D.,..................optična gostota, izmerjena s spektrofotometrom v miligramig na O.D. enote na liter mg/O.D: I..........ekspresija izražena v miligramih proteina na O.D. enoto na liter
Čiščenje rekombinantnega humanega ob poUpeptida
Rekombinantni humani protein lahko čistimo po podobni metodi, kot smo jo uporabili za čiščenje rekombinantnega humanega OB polipeptida, v a pripravo rekombinantnega humanega OB polipeptida smo v koraku 8 uravnali pH supernatanta iz koraka 7 na pH 5.0 in to naložili na kolono s CM Sepharose Fast Flow. 20 volumnov kolone gradient soli so izvedli na 20 mM NaOAC s pH 5.5 do 0.5M NaCL. V koraku 9 smo redčili SM Sepharose 4-krat z vodo in pH uravnali na pH 7.5. To zmes smo pripravili s pomočjo 0.7 M amonijevega sulfata. 20-kratno volumski reverzni gradient soli smo izvedli pri 5mM NaOAc s pH 5.5 do 0.2M do 0M amonijev sulfat. Drugače so bili koraki identični.
141
PRIMER 15: ........ Določevanje velikosti odmerkov
Dodatne študije so pokazale, da smo imeli pri konstantni aplikaciji OB proteina razpon doz. V tej študiji, smo divjemu tipu miši (ne debele, CD-1 miši, ki so tehtale med 35 - 40 g) aplicirali rekombinantni glodalski OB protein z metodo, ki je podobna metodi v Primerih 12 in 13. Ti rezultati so bili sledeči (s % izgubljene telesne teže v primerjavi z bazno linijo, ki smo jo izmerili, kot je bilo opisano).:
Preglednica 10: Velikost odmerkov pri neprekinjeni aplikaciji
odmerek čas % zmanjšanja
(mg/kg/dan) telesne teže
0,03 2. dan 3,5%
1 2. dan 7,5%
1 4. dan 14%
Iz preglednice je razvidno, da povečanje doza od 0.03 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan poveča izgubo telesne teže iz 3,5% na 7,5%. Omembe je vreden podatek, da je 14. dan odmerek 1 mg/kg/dan povzročil 14% zmanjšanje telesne teže.
PRIMER 16: Vpliv leptina na sestavo telesa pri ob/ob miših
C57B1/6J ob/ob mišim, starim 16 tednov, smo aplicirali 5 μρ/g/dan glodalskega leptina, placebo ali jim niso aplicirali ničesar 33 dni. V drugem poskusu so 7 tednov starim ob/ob mišim aplicirali 10 gg/g/dan humanega leptina, glodalskega leptina ali placebo 12 dni. Miši srn nato usmrtili in določili celokupno telesno težo, sestavo telesa, vrednost insulina in glukoze. Podatki iz tega poskusa so navedeni v preglednici 11.
tn
CM
142
TIČU _ 54 -H
CT 03
Preglednica! 1: Telesna teža, sestava, vrednost insulina in glukoze pri zdravljenih miših
C «J
S
CT
H in
E co c
‘54 (ή _W
CO
Ό
CTl rt
T- N to σί
-H -H
N TjCO rt O O Tt CD
LO CO O r-
-H -H rt n» !\ in
Ύ—
O CM v CM
-H -H
O O
TCO GO -r- CM
O T04
H H
O O m n cd oi 05 1X5 m- 04 o' ·.-H -H
O O CO 05
Γ-. o o' r•H -H
C5 O 04 -e co’ co’ T- 04
Ol ®
H _M ca
TJ _o (35 r- μι- 05’ -H -H O o
T- -X 05 co’ 04 o r*.
-H -H
O o eo 05 to' r-’ 04
C0 04 θ’ ΊΤ
-H -H
O O O 05 co’ o’ t- m □5
S?
S s?
9ž?
<ΕΞ>
C35
E.
S o
□
C0|
143
Podatki o sestavi telesa kažejo, da leptin vpliva na tri dele telesa: delež maščobe, celokupno telesno maso in količino vode. Podatki kažejo, da leptin značilno zniža količino telesne maščobe in ima zelo majhen vpliv na celotno telesno težo. Kakorkoli vplivi na celotno telesno maso niso bili statistično signifikantni.
Primerjava vrednosti glukoze in insulina pri živalih, ki so dobivale leptin in kontrolni (niso prejemale ničesar) skupini miši, kaže, da leptini zmanjšajo količino sladkorja in insulina in torej izboljšajo znake diabetesa.
PRIMER 17:_Učinki visokih odmerkov lepima na divji tip miši
Normalnim kontrolnim ob/ob mišim (C57B1/6J+/?) smo injicirali enkrat dnevno i.p. v dozi 10 μρ/g glodalskega leptina ali placebo (PBS) in merili telesno težo in vnos hrane v odbodju dveh tednov. Opazili smo značilno zmanjšanje telesne teže od 4. dneva naprej in tudi značilno zmanjšanje vnosa hrane v prevem tednu. Kakorkoli po dveh tednih je bila količina vnešene hrane enaka pri obeh skupinah. Živali so bile usmrčene po dveh tednih in določena je bila sestava telesa. Rezultati analize sestave telesa so podane v preglednici 12. Iz podatkov je razvidno znižanje telesne maščobe pri živalih, ki so prejemale leptin v primerjavi z živalmi, ki so prejemale PBS.
144
Preglednica 12: Sestava telesa in teža pri divjem tipu (+/?) miših
£ C^lOCMT-OTCOCOCOr-O 0O)COCM«fr'frF'['--0CO l·?- oj r< o> o co o co cn' 0000000^00 67,43 3,52 cncor^«frcoco«frcocoro M-CnCOT-CO^COCOCMO cd τ-' τ-' ι< t£ cm' cd ό < cd 000000000CO 62,45 3,83
voda celokupna ooooooooog OiMCOCOncOCoSo? cm cm T-“ cm cm v-“ o ’Γ- t-“ o' ir- m- t— χ- t— t— t— v* t— t— 11,62 j 0,74 ! oooooooooo 0 cn T-_ CM 0 co 0> 0 O> ro CMOt- t-t-OCM',— t~CM~ T- τ— T— τ- τ— i— TT“ τ— T -r— 11,66 0,72
masa i% \p xQ Lp lO qS 9' θ'· 0' pM pM (yx qX coocnn-oocococn O) 'L Ί O CO 0 «fr CM co co' co' co' co' io' co' t< co' CMCMCMCMCMCMCMCMCM 27,79% 1,05% •sP ·χθ χθ '.0 χθ \O .0 xP pL· pM o'' 0L. pL. qL. COroO)CMCM0«frCQ«fr io n- io in to cm o cn co 0 0' 0 ro' 0' 0' 0' co' 0' CMCMCMCMCMCMCMCMCM 25,54% 1,10%
telesna celokupna Ot-COCOCOM-COt-Im· g 'F ι\ Ί ‘P. *Ρ. ’Ρ. ιο ό «fr' ό «fr' «fr' «fr' «fr' 4,87 0,30 OroT--r-0frCM«frCM 0 0 0 0 0 a. cn i\ 0 «fr' «fr' «fr «fr' «fr' 0 «fr' «fr 0 0 (\ CM «fr' O
0^ •Λ -Λ ΧΟ -Λ . ο 0^ |Γ| (Λ θ' ί- Α, ώ- ί1· '•-gcncM^vcocnco s 4 cn to ιο ' ω n ο τ- τ- «fr cm cm τ-' 0 5,04% 4,52% — \O «sO sO vp sp _ sp _ om 22 2? 0? £ 0; <22 0° gcOb-000^!i-$? cd cm' cm' cn' cm' v-' ,< g' ω~ ! 12,09% 5,08%
maščoba celokupna ocn-fr-frM-ror^cnro COCOCOCO^lOCOCMOO ο cm' ο ο ο cm' ο ο ο 0,93 ! 0,9 0^0)0)00000 C0t“C\ISWCT)W^O T-' cm' cm' cd cm' T-' T- «fr' V-' 2,28 1,07
telesna teže coiocncoiM.rM.iM.ifriocn ι< ο co' οο ι< co' ό ό ό «fr' τ— CMt— τ— τ— τ— τ— τ— τ-τ— 17,3 1,6 ro 0 0 co co ro ro 0 i. 0 od < 00' cn ro' s? cn 0' i< cn v- v- τ- τ- v t— 1— CM T- t- | 18,7 1,1
| C57B1/6J ! I T-CMCO^IOCOIM-COO)^ povprečje SD T-cMco«fr00r^rocno v-v-v-T— T-T— T— T— T— CM povprečje SD
Skupina preotein placebo
145
V drugem poskusu se je pokazal učinek po i.p. njiciranju 12.5 gg/g glodalskega leptina dvakrat dnevno pri divjem tipu miši C57B1/6J. Opazili smo značilno znižanje telesne teže in vnosa hrane, ki je povezana z aplikacijo polipeptida dvakrat na dan. Za ta poskus smo živali namestili v metabolno komoro. Hranili smo jih z uprašeno Purina #5001 dietno hrano. Ti podatki se razlikujejo od prejšnih poskusov, pri katerih smo uporabili dieto, ki je obsegala dietno prehrano, tapioko in vodo. Hrano, ki smo jo uporabili v metabolni komori bila bolj kalorična, kar je tudi vzrok za količino zaužite hrane, ki se razlikuje od tistih živali, ki so v dieti imele vodo.
V nadaljevanju je naveden seznam literature, ki se nanašajo na predložena odkritja on še posebaj na eksperimentalne postopke in diskusijo.
* Bahary ef a/., Genomics, 11:33-47(1991).
* Bahary ef al., Genomics, 13:761-769(1992).
* Bahary ef al., Molecular mapping of mouse chormosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991).
* Blank ef al., Mammaiian Genome, 1:s51-s81 (1991).
* Bogardus et al., annais of the New York Academy of Sciences, 630:100-115(1991).
* Friedman ef al., Mammalina Genome, 1:130-144(1991).
* Hariss, FASEB J., 4:3310-3318(1990).
* Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315:96-100(1986).
* Kassey v Obesity, str 144-166, Stunkard ur. Philadelphia, W.B. Sauders Co. (1980).
* Kassey ef a/., Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22(1986).
* Leibel ef al., Genetic variation and nutritition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesit/, v Genetic Variation and Nutritition, str. 90-101, Simopoulos in Childs ured., S. Karger, Basel (1990).
* Siege! ef al., Cytogenet. Celi Genet., 61(3):184-185(1992).
Predloženi izuma lahko izvedemo tudi drugače tudi na druge načine brez tega, da bi spremenili njegove bistvene lastnosti in cilj. torej moramo ta izuma jemati kot ilustrativen v vseh pogledih in ne omejevalen, cilji izuma
-146· pa so navedeni v priloženih patentnih zahtevkih in vse spremembe, ki so znotraj pomena in obsega so v njih zajeti.
Različni viri literature, ki so navedeni že v samem tekstu, vsak od njih je naveden v celoti v literaturi.
Izum, kot je naveden v skladu z zgoraj navedenimi specifikacijami in dosegljivi litersturnimi viri ter izhodiščnim materialom. Vlagatelji so 9. avgusta 1995 pripravili sledeče depozite z American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, ZDA v skladu s predpisi dogovora iz Budimpešte o Mednarodnem prepoznanju depozitov mikroorganizmov za namene patentnih postopkov: E cofi H14 delovni osnovnega plazmida pETH14, številka dostopa 69880 in E coli M9 osnovni plazmid pETM9 s številko dostopa 69879.
Τ47
SEZNAM SEKVENC (1) Splošne informacije (i) vlagatelj: THE ROCKEFFELLER UNIVERSIIY (II) naslov izuma: MODULATORJI TELESNE TEŽE, ODGOVARJAJOČE
NUKLEINSKE KISLINE IN BELJAKOVINE, NJIHOVA UPORABA V DIAGNOSTIKI IN V TERAPIJI (ii) število sekvenc: 99 (iv) naslov za dopise:
(A) naslov: KLAUBER & JACKSON (B) ulica: 411 HACKENSACK AVENUE (C) mesto: HACKENSACK (D) država: NEW JERSEY (E) dežela: ZDRUŽENE DRŽAVE AMERIKE (F) ZIP: 07601 (v) elektronski mediji:
(A) vrsta medija: GIBLJIVI DISK (B) računalnik: ZDRUŽLJIV Z IBM PC (G) operacijski sistem: PC-DOS/MS-DOS (D) programska oprema: Patentln Release #1.0, verzija #1.25 (vi) dosedanj podatki o vlogi:
(A) številka vloge:
(B) datum vloge:
(C) razvrstitev:
(vii) podatki o prejšnjih vlogah:
(A) številka vloge: 08/483,211 (B) datum vloge: 7. junij 1995 (C) razvrstitev:
(vii) podatki o prejšnjih vlogah:
(A) številka vloge: 08/438,431 (B) datum vloge: 10. maj 1995 (C) razvrstitev:
(vii) podatki o prejšnjih vlogah:
(A) številka vloge: 08/347,563 (B) datum vloge: 30. november 1995 (C) razvrstitev:
(vii) podatki o prejšnjih vlogah:
(A) številka vloge: 08/292,345 (B) datum vloge: 17. avgust 1995 (C) razvrstitev:
(vlii) podatki o zastopnku:
(A) ime: JACKSON ESQ., DAVID A:
(B) številka registracije: 26,742
148
600-1-087 PCT (ix) (C) številka referenc:
Informacije o telekomunikaciji
(A) Telefon: 201 487-5800
(B) Telefaks: 201 343-1684
(C) Teleks: 133521
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:1:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: (B) tip: (C) oblika: (D) topologija: 2793 baznih parov nukleinska kislina dvojna veriga linaerna
(H) tip molekule:
(A) opis: glodalska ob cDNK
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(v) originalen izvor: (A) organizem: glodalci
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: CDS
(B) lokacija: 57..560
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:1:
GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA 56
AGT TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTG CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG 104
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr I Leu
1 5 10 15
TCT TAT GTT CAA GCA GTG CTT j ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA 152
Ser Tyr Vai Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys
20 25 30
ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC ; AAT GAC ATT TCA CAC ACG 200
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTG ATT CCT
Gin Ser Val Ser Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
GGG CK CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA
Gly Leu His Pro lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala
65 70 75 80
GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344
Val Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin
90 95
149
ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392
Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu AIA
100 105 110
TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440
Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro
115 120 125
GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488
Glu Ser 130 Leu Asp Gly Val Leu 135 Glu Ala Ser Leu Tyr 140 Ser Thr Glu Val
GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CH GAA CAG
Val 145 Ala Leu Ser Arg Leu 150 Gin Gly Ser Leu Gin 155 Asp Ile Leu Gin Gin 160
TTG GAT Leu Asp GTT AGC Val Ser CCT GAA TGC TGA AGTTTCCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA Pro Glu Cys * 165
ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC 648
ACACATCCAT CAITCATTrC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA 708
CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG 768
AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG 828
TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA 888
GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA 948
GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT 1008
TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT GAGGCTTTGG 1068
GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG 1128
CCCGAGGCAA ACCTAATiTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG 1188
ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA 1308
AGCAGA TGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG 1368
TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT 1428
TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGAAACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG 1488
ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGAAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGGTA 1548
AAGCTACAGG CGTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACAITTGA 1608
GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTTGAT 1668
150
CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA 1728
TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCAKCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT 1788
GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT 1848
GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG1908
CTTGGGTTTT TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT 1968
GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT 2028
CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG 2088
TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG 2148
GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA 2208
GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TATTGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC 2268
CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA 2328
TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTC GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA 2388
TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA CATGAAGTTC 2448
ATTTATATTT CATAATACCG TATAGACACT GGTTGAAGTG TAGTTTTATA CAGTGTTTTA 2508
AATAACGrFG TATGCATGAA AGACGTTTTT ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA 2568
CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT 2628
AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC 2688
TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTTTTGTG 2748
GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC 2793 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:2:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 168 aminokislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: linearna (ii) tip molekule:
(A) opis: glodalski ob polipeptid (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:2:
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 15 10 15
Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
151
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45
Gin Ser Val Ser Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin
90 95
Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr ser Gly Leu Gin Lys Pro 115 120 125
Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu val 130 135 140
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin
145 150 155 160
Leu Asp Val Ser Pro Glu Sys 165
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:3:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: (B) tip: (C) oblika: (D) topologija: 700 baznih parov nukleinska kislina dvojna veriga linearna
(H) tip molekule: cDNK
(A) opis: humana ob cDNK, kjer N predstavlja katerikoli nukleotid
(lil) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(v) originalen izvor: (A) organizem: človek
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: CDS
(B) lokacija: 46..546
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:3:
NNNGNNGTTG GAAGGCCCAA GAAGCCGANN NTCCTGGAAA GAAAA ATG CAT TGG
Met His Trp
152
GGA ACC CTG TGC GGA , KC KG TGG CK TGG CCC TAT CK KC TAT GTC 102
Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val
5 10 15
CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 150
Gin Ala Val Pro lle Gin Lys Val Gin As p Asp Thr Lys Thr Leu lle
20 25 30 35
AAG ACA AK GTC ACC AGG ATC AAT GAC AK ' TCA CAC ACG CAG TCA GTC 198
Lys Thr lle Val Thr Arg lle Asn Asp lle Ser His Thr Gin Ser Val
40 45 50
TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT KG GAC KC AK CCT GGG CTC CAC 246
Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lle Pro Gly Leu His
55 60 65
CCC ATC CTG ACC KA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC : TAC CAA 294
Pro lle Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin
70 75 80
CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 342
Gin lle Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lle Gin lle Ser Asn
90 95
GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CK CK CAC GTG GTG GCC KC TCT AAG 390
Asp 100 Leu Glu Asn Leu Arg 105 Asp Leu Leu His Val 110 Leu Ala Phe Ser Lys 115
AGC TGC CAC KG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC KG GAC AGC CTG 438
Ser Cys His Leu Pro Trp 120 Ala Ser Gly Leu Glu 125 Thr Leu Asp Ser Leu 130
GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 486
Gly Gly Val Leu 135 Glu AIA Ser Gly Tyr Ser Thr 140 Glu Val Val Ala Leu 145
AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 534
Ser Arg Leu 150 Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu 155 Trp Gin 160 Leu Asp Leu
AGC CCT GGG TGC TGAGGCCK GAAGGTCACT CKCCTGCAA GGACTNACGT 585 Ser Pro Gly Cys
165
TAAGGGAAGG AACTCTGGK TCCAGGTATC TCCAGGAKG AAGAGCAKG CATGGACACC 645
CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG
700
153 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:4:
lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 167 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
tip molekule: protein
(A) opis: humani ob polipeptid (v) originalen izvor: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID N0:4:
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 15
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg ll e Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala
65 70 75 80
Val Tzr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val I le Gin
85 ! 30 s i5
Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala
100 105 110
Phe Ser Lys ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu
115 120 125
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val
130 135 140
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Giy Ser Leu Gin Asp Me1 : Leu Trp Gin
145 1 I50 155 160
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:5:
(0 lastnosti sekvence: (A) dolžina: 166 aminokislin
(B) tip: aminokislina
(D) topologija: linaerna
(ii) tip molekule: protein
154 (A) opis: glodalski ob polipeptid brez Gin na položaju 49 (v) originalen izvor: glodalec (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:5:
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15
Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin A; 3p A sp Thr Lys
20 25 3l 0
Thr Leu Ile Lys Thr Ile V 'al Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
Ser Val Ser Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly
50 55 60
Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile
85 90 95
Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe
100 105 110
Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu
115 120 125
Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val
130 135 140
Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu
145 1 I50 155 160
Asp Val Ser Pro Glu Cys
165 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:6:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 167 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: protein (A) opis: humani ob polipeptid brez Gin na položaju 49 (v) originalen izvor: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:6:
155
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45
Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 50 55 60
Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val 65 70 75 80
Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile 85 90 95
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 100 105 110
Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp
115 120 125
Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val
130 135 140
Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu
145 150 155 160
Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:7:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 175 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: linaerna
(H) tip molekule: DNK (genomska)
(A) opis: ekson 2G7
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:7:
GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC
NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG
120
156
ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG
175 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:8:
lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: PCR 5’ veriga za ekson 2G7 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:8:
CCAGGGCAGG AAAATGTG (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:9:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 22 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis; 3’ osnovna veriga za ekson 2G7
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:9:
CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 22 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:10:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 23 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linaerna
(ii) tip molekule: peptid (A) opis: domnevna N-terminalna signalni peptid (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:10:
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15
157
Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro 20 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:11:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 287 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: krožna
«P molekule: DNK (plazmid)
(A) opis: pET-15b ekspresijski vektor
(iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (ix) lastnosti:
(A) ime/ključ: T7 promotor (B) lokacija: 20 37 (ix) lastnosti:
(A) Ime/ključ: lac operator (B) lokacija: 39 64 (ix) lastnosti:
(A) ime/ključ: CDS (B) lokacija: 108 243 <ix) lastnosti:
(A) ime/ključ: His-tag (B) lokacija: 123 137 (ix) lastnosti:
(A) ime/ključ: trombinsko cepitveno mesto (B) lokacija: 184 196 (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:11:
AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACA 60
TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAAGTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC 116 Met Gly Ser
AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGG 164
Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
10 15
CAT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG 212
His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu
25 30 35
TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT 263
Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gin *
158
AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG
287 (2) INFORMACIJE ZA SEQ 10 NO:12:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 45 aminokislina
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: protein (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:12:
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15
Arg Giy Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg lys 20 25 30
Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gin 35 40 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:13:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 32 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: giodalska 5' osnovna veriga
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
<χί) opis sekvence; SEQ ID NO:13:
CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC 32 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:14:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 32 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: giodalska 3’ osnovna veriga (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ja (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:14:
159
TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC
INFORMACIJE ZA SEO IO NO: 15:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 32 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: humana 5' osnovna veriga
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(xi) opis sekvence: SEQ ID NOJ 5:
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCGAAAAAG TC
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:16:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 32 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: humana 3' osnovna veriga
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ja
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:16:
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:17:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 11 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: cDNK (A) opis: združitveno akceptorsko mesto v ob (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (ix) lastnosti:
(A) ime/ključ: združitveno akceptorsko mesto (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:17:
AGCAGTCGGT A
160 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:18:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 16 aminokislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: neznana (ii) tip molekule: peptid (A) opis: ob peptidni fragment (v) tip fragmenta: notranji (v) originalen Izvor:
(A) organizem: glodalci (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:18:
Val Pro ile gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu ile Lys Thr 15 10 15 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:19:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 15 aminokislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: neznana (ii) tip molekule: peptid (A) opis: ob peptidni fragment (v) tip fragmenta: notranji (v) originalen izvor:
(A) organizem: glodalci (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:19:
Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala
1 5 10
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:20
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 19 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: neznana
(ii) tip molekule: peptid
(A) opis: ob peptidni fragment (v) tip fragmenta: notranji (v) originalen izvor:
(A) organizem: glodalci (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:20:
Ser Leu Asp
Ser Lys Ser Cys Ser Gys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Leu Gin Lys Pro Glu
10 15
161
INFORMACIJE ZA SEO ID NO:21:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: neznana
(ii) tip molekule: peptid (A) opis: ob peptidni fragment (v) tip fragmenta: karboksi rep (v) originalen izvor:
(A) organizem: glodalci (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:21:
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Vat 15 10 15
Ser Pro Glu Cys 20
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:22:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 414 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(G) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: linaerna
(ii) tip molekule: DNK (genomska)
(A) opis: del humanega ob gena, vključno z nekodirajočo sekvenco
naprej od prvega eksona, kodna sekvenca prvega eksona
5’ I oodročje prvega introna
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(v) originalen izvor: (A) organizem: humani
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: CDS
(B) lokacija: 38..181
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: 5' področje prvega introna
(B) lokacija: 182..414
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: 5’ nekodirajoča sekvenca humanega ob gena iz katerega smo pripravili HOB 1gF DNK verigo
(B) lokacija: 11..28
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: intronska sekvnca humanega ob gena iz katerega smo pripravili HOB 1gR verigo
(B) lokacija: 241..260
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:22:
162
GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55 Met His Trp Gly Thr Leu 1 5
TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG 103
Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val Gin Ala Val
15 20
CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT 151
Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile
30 35
GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201
Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
45
CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261
AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGTC GAGAAGGATT 321
TTGGATAGCA CAGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTITCTTN TGGCCCCTC TGCCTGCTGA 381
GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:23:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 48 aminokislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: linearna (ii) tip molekule: beljakovina (A) opis: ob peptldni fragment (v) tip fragmenta: N terminalni del humanega ob proteina, ki ga kodira prvi ekson (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:23:
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:24:
lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 801 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: linearna
163 (ii) tip molekule: DNK (genomska) (A) opis: del humanega ob gena, vključno 3’ področjem prvega introna, kodna sekvenca drugega eksona in 3’ področje nekodne sekvnece
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(v) originalen izvor: (A) organizem: humani
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: CDS
(B) lokacija: 291..648
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: 3’ področje prvega introna
(B) lokacija: 1..290
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: intronska sekvnca humanega ob gena iz katerega smo pripravili HOB 2gF verigo
(B) lokacija: 250..269
(vi) značilnosti (A) ime/ključ: 3' nekodirajoča sekvenca humanega ob gena iz katerega smo pripravili HOB 2gR DNK verigo
(B) lokacija: 707..726
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:24:
CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT 60
GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120
CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACCAAG GGXXTGAGXX AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180
AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240
CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296
Gin Ser
GTC Val TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC
Ser Ser 5 Lys Gin Lys Val Thr 10 Gly Leu Asp Phe Ile 15 Pro Gly Leu
CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC
Gin 35 Gin Ile Leu Thr Ser 40 Met Pro Ser Arg Asn 45 Val Ile Gin Ile Ser 50
AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG i GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT
Asn Asp Leu Glu Asn 55 Leu Arg Asp Leu Leu His 60 Val Leu Ala Phe Ser 65
AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser
75 80
536
164
CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC 584
Leu G(y Giy Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala
90 95
CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632
Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp
100 105 110
CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA 688
Leu Ser Pro Gly Cys
115
GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC 748
TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801 (2) INFORMACIJE ZA SEQ 10 NO:25:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 119 aminokislin (B) tip: amino kislina (D) topologija: linearna (ii) tip molekule: beljakovina (A) opis: C terminalni del humanega ob polipeptida, ki ga kodira drugi ekson (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:25:
Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
10 15
Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 20 25 30
Val Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin 35 40 45
Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 50 55 60
Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Giy Leu Glu Thr Leu
70 75 80
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 85 90 95
Val Aia Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 100 105 110
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 115
165 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO;26:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 8 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: neznana
(ii) tip molekule: beljakovina (v) tip fragmenta: notranji (vi) originalni vir:
(A) organizem: kvasovka Pichia (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:26:
Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala
5 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:27:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 4 aminokisline (B) tip: amino kislina (D) topologija: Ineznana
(ii) tip molekule: beljakovina
(v) tip fragmenta: notranji
(vi) originalni vir: (A) organizem: kvasovka Pichia
(X!) Opis sekvence: SEG ID NO:27:
Glu Ala Glu 1 Ala
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:28:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 4 aminokisline
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: Ineznana
(il) tip molekule: beljakovina (v) tip fragmenta: notranji (vi) originalni vir:
(A) organizem: kvasovka Pichia (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:28:
Leu Glu Lys Arg (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO.29:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
166
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
tip molekule:
(A) opis:
hipotetična:
komplementarna:
(ϋ) (iii) (iv) (xi)
DNK (osnovna veriga)
HOB 1gF DNK osnovna veriga, ki smo jo dobili z 5’ nekodirajoče sekvence humanega ob gena ne ne opis sekvence: SEQ ID NO:29:
CCCAAGAAGC CCATCCTG (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:30:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: HOB 1gR DNK osnovna
(iii) hipotetična:
(iv) komplementarna:
intronske sekvence humanega ob gena ne ja (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:30:
GACTATCTGG GTCCAGTGCC (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:31:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina (C) oblika: enojna veriga (D) topologija: linearna
DNK (osnovna veriga)
HOB 2gF DNK osnovna veriga, ki smo jo dobili iz prve intronske sekvence humanega ob gena ne (ii) tip molekule:
(A) opis:
(iii) hipotetična:
(iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:31:
CCACATGGTG AGGAGTTGTT (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:32:
(i) lastnosti sekvence:
167
(A) dolžina: 22 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: HOB 2gR DNK osnovna veriga, ki smo jo dobili iz 3’ nekodirajoče sekvence humanega ob gena (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ja (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:32:
cttcaatcct ggagatacct gg 22 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:33:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 51 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: krožna
(ii) tip molekule: DNK (A) opis: pPIC.9 klonirajoče mesto (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:33:
ctcgagaaaa gagaggctga agcttacgta gaattcccta ggcgggcggg g
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:34:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 40 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: PCR 5' veriga za pomnoževanje humane ob cDNK sekvence (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:34:
GTATCACACG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAA 40 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:35:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 31 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina
168 (C) oblika: enojna veriga (D) topologija: linearna (ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: PCR 3’ veriga za pomnoževanje humane ob cDNK sekvence (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ja (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:35:
GCGCGAATTG TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C (2) INFORMACIJE ZA SEQ 10 NO:36:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 40 baznih parov (B) tip: nukleinska kislina (C) oblika: enojna veriga (D) topologija: linearna (ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: PCR 5' veriga za pomnoževanje glodalske ob cDNK sekvence (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:36:
GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:37:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 31 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: PCR 3' veriga za pomnoževanje glodalske ob cDNK sekvence (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ja (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:37:
GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:38:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 4 aminokisline (B) tip: amino kislina
169 (D) topologija: linearna (Ii) tip molekule: beljakovina (A) opis: tetrapeptid na N-repu renatururanega glodalskega ob proteina po cepljenju s trombinom (vi) originalni vir:
(A) organizem: glodalci (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:38:
Gly Ser His Met
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:39:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(G) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno mesto specifične PCR verige sWSS1734
(iii) hipotetična: ne
(M komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
<xi) CAAGACAAAT opis sekvence: SEQ ID NO:39:
GAGATAAGG 19
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:40:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1734
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:40:
AGAGTTACAG CTTTACAG 18
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:41:
(i) lastnosti sekvence:
170
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tiP molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvencno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS494
(iii) hipotetična: ne
(M komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) Opis sekvence: SEQ ID NO:41:
CTAAACACCT TTCCATTCC 19
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:42:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 22 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) «P molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvencno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS494 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:42:
TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:43:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvencno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS883
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:43:
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG
171 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:44:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS883
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:44:
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC (2)
INFORMACIJE ZA SEO ID NO:45:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2359 hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:45:
AGTGTTGTGT TTCTCCTG (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:46:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične hipotetična: ne
PCR verige sWSS2359 (ih')
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:46:
AAAGGGGATG TGATAAGTG
172 (2) INFORMACIJE ZA SEQ 10 NO:47:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(G) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
00 tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWDD2336
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:47:
GGTGTTACGT TTAGTTAC
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:48:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule; DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2336
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna; ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:48:
GGAATAATGA GAGAAGATTG 20 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO;49:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWW1218 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:49:
GCTCAACTGA CAGAAAAC
173 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:50;
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1218
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID N0:50:
GACTATGTAA AAGAAATGCC (2)
INFORMACIJE ZA SEO ID NO:51:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
sekvenčno ciljano mesto specifične ne
PCR verige SVVSS1402 (A) opis: hipotetična:
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:51
AAAGGGCTTC TAATCTAC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:52:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga) (A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1402 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:52:
CCTTCCAACT TCTTTGAC
174
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:53;
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS999
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir. (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:53:
TAAACCCCCT TTCTGTTC 18 (2) INFORMACIJE ZA $EQ ID NO:54:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS999
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:54:
TTGCATAATA GTCACAACCC 19
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:55:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 22 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(G) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1751 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (vi) originalni vir:
(A) organizem: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:55:
CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG
175 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:56:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
00 tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1751 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (vi) originalni vir:
(A) organizem: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:56:
AAAGCGAAGT TGAGATACAG 20
INFORMACIJE ZA $EQ ID NO:57:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PGR verige sWSS1174
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEO ID NO:57:
AATATCTGAC ATTGGCAC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:58:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1174 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:58:
TTAGACCTGA GAAAAGAG
176
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:59:
(0 lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PGR verige sWSS2061
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
M) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:59:
GTTGCAGAAT ACAAAATCC 19
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:60:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2061
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:60:
CTTCCATTAG TGTCTTATAG 20
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:61:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2588
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:61:
ATCACTACAC ACCTAATC
177
(2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:62:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS25B8 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (vi) originalni vir:
(A) organizem: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:62:
GCATTCTACA TTTCCACC (2)
INFORMACIJE ZA $EQ ID NO:63:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 24 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: Sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS808 hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:63:
GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:64:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 23 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) «P molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS808 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:64:
TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC
178
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:65:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
00 tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1392
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: Človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:65:
CTCAGGTATG TCTTTATC 18
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:66:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1392 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:66:
TGTCTCTGCA TTCTTTTC 18 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:67:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične (iii) hipotetična: ne
PCR verige sWSS1148
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:67:
GACACATACA AACACAAG
179 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:68:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1148 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (vi) originalni vir:
(A) organizem: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:68:
ATTGAGTTGA GTGTAGTAG 19 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:69:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1529 (iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:69:
CAGGGATTTC TAATTGTC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:70:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS1529 (iii) hipotetična: ne (iv) komplementarna: ne (vi) originalni vir:
(A) organizem: človek (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:70:
AAAAGATGGA GGCTTTTG
180 (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:71:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 21 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto :
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:71:
sWSS2619
CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G (2)
INFORMACIJE ZA $EQ ID NO:72:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
sekvenčno ciljano mesto specifične ne
PCR verige sWSS2619 (A) opis: hipotetična:
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:72:
TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:73:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige
SVVSS404
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:73:
ACCAGGGTCA ATACAAAG
181
INFORMACIJE ZA SEO ID NO:74:
(O lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(H) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS404
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
M) originalni vir:
(A) organizem: človek
(χϊ) opis sekvence: SEQ ID NO:74:
TAATGTGTCC TTCTTGCC
INFORMACIJE ZA SEO ID NO:75:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2367
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:75:
CAATCCTGGC TTCATTTG (2)
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:76:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 18 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(□) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: sekvenčno ciljano mesto specifične PCR verige sWSS2367 {iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:76:
AAGGTGGGTA GGATGCTA
182 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:77:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker UT528
(ίϋ) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
M) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:77:
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG (2) INFORMACIJE ZA $EQ ID NO:78:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker UT528
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:77:
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:79:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMa065zg9
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:79:
AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT
183 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID N0:80:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMaO65zg9
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:80:
GGTCAGCAGC ACTGTGATT (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:81:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 19 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMa125wh1
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir.
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:81:
TCACCTTGAG ATTCCATCC
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:82:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMa125wh1
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:82:
AACACCGTGG TCTTATCAAA
184 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:83:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM309yf10
(Hi) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:83:
CATCCAAGTT GGCAGTTTTT (2) INFORMACIJE ZA SEO IO NO:84:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM3Q9yf10
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
<xi) opis sekvence: SEQ ID NO:84:
AGATGCTGAA TTCCCAGACA 20 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:85:
(i) iastnosti sekvence:
(A) dolžina: 16 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM218xf10
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:85:
TGGGCAACAC AGCAAA
185 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:86:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ϋ) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM218xf10
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:86:
TGCAGTTAGT GCCAATGTCA 20 (2} INFORMACIJE ZA $EQ ID NQ:87:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 16 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM206xcl
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:87:
CCAGGCCATG TGGAAC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:88:
(I) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM206xcl
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:88:
AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT
186 (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:89:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 16 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFM199xh12
(ίϋ) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:89:
TCTGATTGCT GGCTGC (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:9O:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 17 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMl99xh12
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID N0:90:
GCGCGTGTGT ATGTGAG (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:91:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMa345wc9
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir:
(A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:91:
AGCTCTTGGC AAACTCACAT
187
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO.92:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 20 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(H) tip molekule: DNK (osnovna veriga)
(A) opis: marker AFMa345wc9
(Hi) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:92:
GCCTAAGGGA ATGAGACACA
(2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:93:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 24 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: enojna veriga
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: DNK ( (osnovna veriga)
(A) opis: veriga mišjega Pax4 gena
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: glodalec
(xi) opis sekvence: SEQ ID NO:93:
GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG (2) INFORMACIJE ZA SEO ID NO:94:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: (B) «p: (C) oblika: (D) topologija: 491 baznih parov nukleinska kislina dvojna veriga linearna
(ii) tip molekule: cDNK
(A) opis: rekombinanten glodalski met ob
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (Λ) organizem: glodalec
(ix) značilnost: (A) ime/ključ: CDS
(B) lokacija: 41..478
188 (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:94:
TCTAGAKG AGTTTTAACT TKAGAAGGA GGAATAACAT AGT GTA CCG ATC CAG 55 Met Val Pro Ile Gin 1 5
AAA Lys GH Val CAG Gin GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT 103
Asp Asp 10 Thr Lys Thr Leu Ile 15 Lys Thr Ile Val Thr Arg 20
ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GK 151
Ile Asn Asp ile Ser His Thr Gin Ser Vai Ser Ala Lys Gin Arg Val
25 30 35
ACC GGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC KG TCC 199
Thr Gly Leu Aspn Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Se
40 45 50r
AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG KA ACC TCC CTG 247
Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu
55 60 65
CCG TCC CAG AAC GTT CK CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CK CGC 295
Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg
70 75 80 95
GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA KG TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343
Asp Leu Leu His leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin
90 95 100
ACC TCA GGT CK CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA 391
Thr Ser Gly leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala
105 110 115
TCC CTG TAC AGC ACC GAA GK GK GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439
Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser
120 125 130
CTG CAG GAC ATC CK CAG CAG CTG GAC GK TCT CCG GAA TGT TAAATGGA 488
Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys
135 140 150
TCC 491 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:95:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 146 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: beljakovina
189 (A) opis: rekombinantni glodalski met ob protein (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:95:
Met Val Pro Ite Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu ile Lys 15 10 15
Thr Ile Val Thr Arg ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30
Ala lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 40 45
Ile Leu SerLeu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Aia Val Tyr Gin Gin 50 55 60
Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile Ala Asn Asp 65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser lys Ser 85 90 95
Cys ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125
Arg Leu Gin Gly Ser leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser 130 135 140
Pro Glu Cys
145
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:96:
(i) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 454 baznih parov
(B) tip: nukleinska kislina
(C) oblika: dvojna veriga
(D) topologija: linearna
OD tip molekule: DNK
(A) opis: rekombinantni humani met ob
(iii) hipotetična: ne
(iv) komplementarna: ne
(vi) originalni vir: (A) organizem: človek
(ix) značilnost: (A) ime/ključ: GDS
(B) lokacija: 4..444
190 (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:96:
CAT ATG GTA CCG ATC CAG AAA GK CAG GAC GAG ACC AAA ACC KA ATT 48
Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr lys Thr Leu Ile
10 15
AAA ACG ATC GK ACG CGT ATG AAC GAC ATG AGT CAC ACC CAG TCG GTG 96
Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val
25 30
AGC TCT AAA CAG CGT GK ACA GGC CTG GAC KC ATC CCG GGT CTG CAC 144
Ser Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His
40 45
CCG ATC CTG ACC KG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192
Pro Ile leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin
55 60
CAG ATC KA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GK CK CAG ATC TCT AAC 240 Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gin Ile Ser Asn
70 75
GAC CTC GAG AAC CK CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA KC TCC AAA 288 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 80 85 90 95
TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CK GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu
100 105 110
GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GK GK GCT CTG 384
Gly Gly Val Leu 115 Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 120 Val 125 Ala Leu
TCC CGT CTG CAG GGT TCC CK CAG GAC ATG CK TGG CAG CTG GAC CTG 432
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu
130 135 140
TCT CCG GGT TGT TAATGGATGG 432
Ser Pro Gly Cys
145 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO;97:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 147 aminokislin
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: beljakovina (A) opis: rekombinantni humani met ob protein
191 (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:97:
Met Val Pro lle Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lle Lys 15 10 15
Thr lle Val Thr Arg lle Asn Asp lle Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30
Ser Lys Gin Arg Val Thg Gly Leu Asp Phe lle Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lle Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lle Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gin lle Ser Asn Asp 65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95
Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125
Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140
Pro Gly Cys
145
INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:98:
(!) lastnosti sekvence: (A) dolžina: 21 aminokislinv
(B) tip: amino kislina
(D) topologija: linearna
(ii) tip molekule: beljakovina (v) tip fragmenta: N-terminalni His-tag (xi) opis sekvence: SEQ ID NO:98:
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met 20
192 (2) INFORMACIJE ZA SEQ ID NO:98:
(i) lastnosti sekvence:
(A) dolžina: 21 arr (B) tip: amino aminokislin amino kislina (D) topologija: linearna (ii) tip molekule: beljakovina (v) tip fragmenta: N-termlnalni His-tag (xl) opis sekvence: SEQ ID NO:98:
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15
Arg Gly Ser Pro
THE ROCKEFELLER UNIVERSITY 1230 York Avenue NewYork,NY 10021-6399 ZDA
Za:
193

Claims (88)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Debelostni (OB) polipeptid, ki imajo približno 145 do približno 167 aminokislin in njihove alelne vatiante ali analogi, vključno s fragmenti, označen s tem, da uravnava telesno težo.
  2. 2. OB polipeptid, alelne variante ali analogi, vključno s fragmenti, po zahtevku 1, označen s tem, daje njegova aminokislinska sekvenca zapisana s SEQ ID NO: 2, 4, 5, ali 6.
  3. 3. Fragment OB polipeptida, po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, daje imunogen.
  4. 4. Imunogeni fragment OB polipeptida, označen s tem, da je izbran med enim ali več naslednjimi:
    Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18) Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19) Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:20) in
    Ser-Arg-Leu-Gln-Glv-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-GluCys (SEQIDNO:21).
  5. 5. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 2, označen s tem, da je ena ali več aminokislin izbrana med aminokislinami v SEQ ID NO.4 in se skrivajo pod številkami 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 157, 157, 163 in 166 (glede na številčenje v SEQ ID NO:4), zamenjana z drugo aminokislino.
  6. 6. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 5, označen s tem, da aminokislino zamenjamo z divergentno aminokislino mišjega OB polipeptida v skladu s SEQ ID NO;2,
    194
    Ί. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 5, označen s tem, da zamenjamo z alaninom.
  7. 8. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 5, označen s tem, da je izbran med enim ali več naslednjimi polipeptidi:
    (a) serinski ostanek na položaju 53 substituiramo z glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ali treoninom;
    (b) serinski ostanek na položaju 98 substituiramo z glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ali treoninom;
    (c) argininski ostanek na položaju 92 substituiramo z asparginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminsko kislino, asparmatsko kislino, serinom, treoninom, metioninom ali cisteinom.
  8. 9. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 2, označen s tem, da je 83% ali več aminokislinske sekvence homologne aminokislinski sekvenci humanega OB polipeptida, kije opisana v SEQ ID NOS: 2,4,5, ali 6.
  9. 10. Analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 2, označen s tem, da je izbran med enim ali več naslednjih:
    (a) je ena ali več asparmatskih kislinskih ostankov substituiranih z glutaminsko kislino;
    (b) en ali več izolevcinskih ostankov substituiranih z levcinom;
    (c) en ali več glicinskih ali valinskih ostankov substituiranih z alaninom;
    (d) en ali več argininskih ostankov substituiranih s histidinom, (e) en ali več tirozinov ali fenilalaninskih ostankov substituiranih s triptofanom;
    (f) en ali več ostankov v SEQ ID NO:4 od položaja 121 do 128 substituiranih z glicinom ali alaninom in (g) en ali več ostankov na položaju 54 do 60 ali 118 do 116, kot je oštevilčeno v SEQ ID NO:4, substituiran z lizinom, glutaminsko kislino, cisteinom ali prolinom.
    195
  10. 11. OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov 1, 2, 3, 5, 6 in 9, označen s tem, daje izbran med enim ali več naslednjimi polipeptidi, ki:
    (a) so brez ostankov od 1 do 21 in (b) ima peptid naveden pod (a) metionin na položaju 21 ali ima sekvenco glicin-serinhistidin-metionin (SEQ ID NO:38) na položaju od 18 do 21, ali ima sekvenco metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serinserin-glicin-levcin-valin-prolin-arginin-glicin-srein-histidin-metionin na položaju 1 do 21.
  11. 12. OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov 1, 2, 3, 5, 6 ali 9, označen s tem, da je izbran med enim ali več naslednjimi peptidi:
    (a) ki so brez ostankov na mestih 21 in (b) polipeptidi, ki so del (a) in imajo sekvenco (SEQ ID NO:21) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin-glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin, na položaju 14 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:27) glutaminska kislina-alaninglutaminska kislina-alanin na položaju od 18 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:28) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin na položaju 18 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:99) metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin- histidinhistidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-levcin-valin-prolin-arginin-glicin-serinprolin na položaju od 2 do 21 ali imajo sekvenco glicin-serin-prolin na položaju 18 do 21.
  12. 13. OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov 7, 8, 9 ali 10, označen s tem, daje izbran med enim ali več naslednjimi peptidi, ki:
    (a) so brez ostankov na mestih 1 do 21 in (b) polipeptidi, ki so del (a) in imajo sekvenco (SEQ ID NO:38) glicin-serin-histidinmetionin na položaju 18 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:98) metionin-glicinserin-serin-histidin-histidin-histidin- histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-levcinvalin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin položaju od 1 do 21 ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:26) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin-glutaminska
    196 kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin na položaju 14 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:27) glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin na položaju 18 do 21, ali imajo sekvenco (SEQ ID NO:28) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin na položaju 18 do 21 ali imajo sekvenco (SEQ ID NO;99) metionin-glicin-serin-serinhistidin-histidin- histidin-histidin-histidin-histidm-serin-serin-glicin-levcin-valinprolin-arginin-glicin-serin-prolin na položaju od 2 do 21 ali imajo sekvenco glicinserin-prolin na položaju 18 do 21.
  13. 14. Topi analog humanega OB polipeptida, po zahtevku 2, označen s tem, da je izbran med enim ali več naslednjih peptidov (glede na številčenje iz SEQ ID NO;4), kije:
    (a) brez enega ali več ostankov na položajih 121 do 128.
    (b) brez ostankov na položajih od 1 do 116, (c) brez ostankov na položajih od 1 do 21 in položajih 54 do 167 (d) brez ostankov na položajih od 1 do 60 in položajih 117 do 167 (e) brez ostankov na položajih od 1 do 60 (f) brez ostankov na položajih od 1 do 53 (g) analog iz dela (a), brez ostankov na položajih od 1 do 21 in (h) imajo analogi iz odstavkov (a) do (h) N-terminalno aminokislino ali aminokislinsko sekvenco izbrano iz skupine, v katero štejemo:
    (1) metionin (2) sekvenco glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO:38) (3) sekvenco metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin- histidin-histidinhistidin-serin-serin-glicin-levcin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQIDNO:98) (4) sekvenco levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin-glutaminska kislina-alaninglutaminska kislina-alanin (SEQ ID NO:26) (5) sekvenco glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin (SEQ ID NO:27) (6) sekvenco levcin-glutaminska-kislina-lizin-arginin (SEQ ID NO:28)
    197 (7) sekvenco metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinhistidin-serin-serin-glicindevcin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-prolin (SEQ IN NO:99) in (8) sekvenco glicin-serin-prolin.
  14. 15. OB polipeptid, po kateremkoli izmed zahtevkov od 1 do 14, označen s tem, da je pripravljen z rekombinantno tehniko.
  15. 16. OB polipeptid, po kateremkoli izmed zahtevkov od 1 do 14, označen s tem, da je pripravljen s kemično sintezo.
  16. 17. Derivat OB polipeptida, po kateremkoli izmed zahtevkov od 1 do 16, označen s tem, daje nanj vezanih ena ali več kemičnih spojin.
  17. 18. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 17, označen s tem, da je kemična spojina vodotopen polimer.
  18. 19. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 18, označen s tem, da je vodotopen polimer polietilenglikol.
  19. 20. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 19, označen s tem, da ima vezane eno, dve ali tri verige poletilenglikola.
  20. 21. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 20, označen s tem, daje na N-terminus vezana ena poletilenglikolna veriga.
  21. 22. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 21, označen s tem, da ima aminokislinske ostanke od 22 do 167 glede na številčenje v SEQ ID NO:4 ali ostanek 22 do 166 glede na številčenje v SEQ ID NO:6.
    198
  22. 23. Derivat OB polipeptida, po zahtevku 21, označen s tem, da ima aminokislinske ostanke od 22 do 167, glede na številčenje v SEQ ID NO:4, ali ostanke 22 do 166, glede na številčenje v SEQ ID NO:6 in metionin na položaju 21.
  23. 24. Molekula nukleinske kisline, s kodnim zapisom za OB polipeptid po kateremkoli izmed zahtevkov od 1 do 6, 9 ali 11, označena s tem, daje bila izolirana.
  24. 25. Molekula nukleinske kisline, s kodnim zapisom za OB polipeptid, po kateremkoli izmed zahtevkov 7,8,10,12,13 ali 14, označena s tem, daje bila izolirana.
  25. 26. DNK molekula, označena s tem, da zagotavlja gotovo ekspresijo OB polipeptida, kije biološko aktiven pri uravnavanju telesne teže pri sesalcih, izbrano med enim ali več naslednjimi:
    (a) DNK molekulami, ki so opisane z SEQ ID NO:1 in 3 ali njihovimi fragmenti, (b) DNK molekulami, ki se hibridizirajo v DNK molekule, ki so definirane v (a) ali njihovi hibridni fragmenti in (c) DNK molekule, ki nosijo zapis ekspresijo aminokislinske sekvence, ki jo kodira katerakoli, v nadaljevanju opisana, DNK molekula.
  26. 27. DNK molekula, po zahtevku 26, označena s tem, da je humana genomska DNK molekula s SEQ ID NO: 22 in 24.
  27. 28. DNK molekula, po zahtevku 24, označena s tem, da kodira polipeptid z aminokislinsko sekvenco, izbrano med eno ali več naslednjimi aminokislinskimi sekvencami:
    (a) SEQ ID NO:2, (b) aminokisline od 22 do 167 v SEQ ID NO:2, (c) SEQIDNO:4, (d) aminokisline od 22 do 167 v SEQ ID NO:4, (e) SEQEDNO:5
    199 (f) aminokisline od 22 do 166 v SEQ ID NO:5, (g) SEQ ID NO:6, (h) aminokisline od 22 do 166 v SEQ ID NO:6 in (i) ki so del (a), (d), (f) ali (h), ki imajo N-terminalno aminokislino ali aminokislinsko sekvenco izbrano iz ene ali več naslednjih:
    (1) metionin (2) sekvence glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO:38) in (3) sekvenco metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin- histidin-histidinhistidin-serin-serin-glicin-levcin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO:98)
    28. DNK molekula, po zahtevku 28, označena s tem, da imajo aminokisline v (a), (d), (f) ali (h) N-terminalno aminokislinsko sekveco izbrano med eno ali več naslednjmi sekvencami:
    (1) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin-glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin (SEQ ID NO:26) (2) glutaminska kislina-alanin-glutaminska kislina-alanin (SEQ ID NO:28) (3) levcin-glutaminska kislina-lizin-arginin (SEQ ID NO:28) (4) metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serinserin-glicin-levcin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-prolin (SEQ IN NO:99) in (5) glicin - serin - prolin.
  28. 30. DNK molekula, po zahtevku 24, označena s tem, da je sekvenca enaka proteinski kodni sekvenci SEQ ID NO:3.
  29. 31. DNK molekula, po zahtevku 24, označena s tem, daje sekvenca enaka aminokislinski sekvenci od 22 do 167 v SEQ ID NO:3.
  30. 32. Nukleinska kislina, označena s tem, da je označena in se lahko hibridizira v DNK molekulo, po enem od zahtevkov od 24 do 31.
    200
  31. 33. Nukleinska kislina, označena s tem, da lahko hibridizira v nekodirajoče področje OB nukleinske kisline, izbrana med enim ali več intronov 5' nekodirajočega področja in 3' nekodirajočega področja.
  32. 34. Oligonukleotidna veriga, označena s tem, da je namenjena pomnoževanju DNK s kodnim zapisom za OB polipeptid.
  33. 35. Oligonukleotid, po zahtevku 32, označen s tem, da je izbran med eno ali več naslednjimi:
    HOB lgF5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO:29)
    HOB IgR 5'-GACTATCTGGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ED NOGO)
    HOB 2gF 5-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NOG 1) in
    HOB 2gr 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NOG2).
  34. 36. Vektor, označen s tem, da vsebuje DNK molekulo, po kateremkoli izmed zahtevkov od 24 do 31.
  35. 37. Ekspresijski vektor z DNK molekulo, po kateremkoli izmed zahtevkov 24, 26, 30 ali 31, označen s tem, daje operativno povezan z ekspresij sko kontrolno sekvenco.
  36. 38. Ekspresijski vektor z DNK molekulo, po kateremkoli izmed zahtevkov 27 ali 29, označen s tem, daje operativno povezan z ekspresij sko kontrolno sekvenco.
  37. 39. Ekspresijski vektor z DNK molekulo, po zahtevku 25, označen s tem, daje operativno povezan z ekspresij sko kontrolno sekvenco.
  38. 40. Enocelični gostitelj, označen s tem, da je transformiran ali transficiran z DNK molekulo, iz zahtevkov 24 ali 25, ali ekspresijskim vektorjem, po enem izmed zahtevkov 36 do 39.
    201
  39. 41. Enocelični gostitelj, po zahtevku 40, označen s tem, da je enocelični gostitelj bakterija, kvasovka, sesalska celica, rastlinska celica, celica insekta in humana celica v tkivni kulturi.
  40. 42. Enocelični gostitelj, po zahtevku 40, označen s tem, daje enocelični gostitelj E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, kvasovka, celice CHO, Rl.l, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40,BMT10 in Sf9.
  41. 43. Enocelični gostitelj, po zahtevku 40, označen s tem, da je enocelični gostitelj kvasovka izbrana med naslednjimi: Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula in Torulopsis.
  42. 44. Sesalska celica, ki vsebuje OB polipeptid, ki kodira DNK sekvenco, označena s tem, da je midificirana in vitro in tako omogoča večjo ekspresijo OB polipeptida s homologno rekombinantno tehniko, ki vključuje vključevanje ekspresijske regulatome sekvence v funkcionalni približnosti v OB polipeptidno kodno sekvenco.
  43. 45. Celica, po zahtevku 44, označena s tem, da je ekspresijska regulatoma sekvenca OB polipeptidna regulatoma sekvenca in s homolognim rekombinantnim dogodkom zamenjamo mutirano OB polipeptidno ekspresijsko regulatomo sekvenco.
  44. 46. Celica, po zahtevku 45, označena s tem, da je vključena ekspresijska regulatoma sekvenca ni regulatoma sekvenca OB polipeptida.
  45. 47. Metoda za pripravo OB polipeptida, označena s tem, da obsega:
    (a) gojenje celic v kulturi, po kateremkoli zahtevku od 40 do 46, pod pogoji, ki zagotavljajo ekspresijo OB polipeptida in (b) izolacijo ekspresiranega OB polipeptida.
    202
  46. 48. Metoda, po zahtevku 47, označena s tem, daje celica bakterija ali kvasovka.
  47. 49. Metoda po zahtevkih 47 ali 48, označena s tem, da obsega še:
    (c) kromatografiranje OB polipeptida na Ni-kelatirajoči koloni, (d) čiščenje OB polipeptida z gelsko filtracijo.
  48. 50. Metoda po zahtevku 49, označena s tem, da obsega še po koraku (c) in pred korakom (d), kromatografiranje OB polipeptida na izmenjevalni koloni z močnim kationom.
  49. 51. Protitelesa, označena s tem da so specifična za OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljeno z metodo po zahtevkih 47 do 50.
  50. 52. Protitelesa, po zahtevku 51, označena s tem, da so monoklonalna ali poliklonalna protitelesa.
  51. 53. Protitelesa, po zahtevku 52, označena s tem, da so označena z označevalcem, ki ga lahko zasledujemo.
  52. 54. Nesmrtna celična linija, označena s tem, da proizvaja monolonalna protitelesa, po zahtevku 52.
  53. 55. Metoda za pripravo specifičnih OB protiteles označena s tem, da obsega:
    (a) konjugacijo OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov 1 do 16, ali pripravljenim z metodo, po zahtevkih 47 do 50, na nosilni protein, (b) imunizacijo gostiteljske živali s fragmentom OB polipeptida vezanega z nosilnim proteinom v koraku (a) s pomožno snovjo in (c) pripravo protiteles iz imunizirane gostiteljske živali.
  54. 56. Metoda za merjenje prisotnosti OB polipeptida v vzorcu, ki obsega:
    203 (a) stik vzorca, za katerega predvidevamo, da ima OB polipeptid, s protitelesom, ki se specifično veže na OB polipeptid pod pogoji, ki omogočajo nastanek reakcijskega kompleksa med protitelesom in OB polipeptidom, (b) zasledovanje nastanka reakcijskega kompleksa med protitelesom in OB polipeptidom v vzorcu., označena s tem, da določitev nastanka kompleksa kaže na prisotnost OB polipeptida v vzorcu.
  55. 57. Metoda, po zahtevku 56, označena s tem, da so protitelesa vezana na trden nosilec.
  56. 58. In vitro metoda namenjena določevanju vrednosti OB polipeptida v biološkem vzorcu, označena s tem, da obsega:
    (a) zasledovanje nastajanja reakcijskega kompleksa v biološkem vzorcu po metodi po zahtevkih 56 ali 57 in (b) določevanje količine nastalega reakcijskega kompleksa, katerega količina ustreza vrednosti OB polipeptida v biološkem vzorcu.
  57. 59. In vitro metoda za zasledovanje ali diagnosticiranje prisotnosti bolezni, ki je povezana s povišano ali znižano vrednostjo OB polipeptida pri sesalcu, s tem da obsega:
    (a) določevanje vrednosti OB polipeptida v biološkem vzorcu, ki je bil odvzet pri sesalcu skladno z zahtevkom 58 in primerjava določene vrednosti OB polipeptida, ki smo jo določili v koraku (a) z vrednostmi v povprečnem osebku ali istem osebku v prejšnih časih, označena s tem, da je vrednost OB polipeptida, če jo primerjamo z normalnimi vrednostimi, kaže na bolezen, ki je povezana s povišano vrednostjo OB polipeptida in znižanjem vrednosti polipeptida v primeijavi z normalnimi vrednostmi, kaže na obolenje povezano z znižano vrednostjo OB polipeptida.
  58. 60. In vitro metoda za nadzorovanje terapije bolezni, ki je povezana s povišano ali znižano vrednostjo OB polipeptida pri sesalcu, označena s tem, da obsega določevanje vrednosti OB polipeptida v seriji bioloških vzorcev, odvzetih pri tem sesalcu v
    204 različnih časovnih intervalih med trajanjem zdravljenja pri boleznih, ki so povezane s povišano ali znižano vrednostjo OB polipeptida, po zahtevku 58.
  59. 61. Farmacevtska oblika, označena s tem, da vsebuje OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov 1 do 16, ali je pripravljena s postopkom, po enem izmed zahtevkov 47 do 50, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
  60. 62. Farmacevtska oblika, po zahtevku 61, označena s tem, da je namenjena za zniževanje telesne teže pri živalih.
  61. 63. Farmacevtska oblika za povečevanje telesne teže pri živalih, označena s tem, da vsebuje antagonist OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov od 1 do 16, ali je pripravljena z metodo, po zahtevkih od 47 do 50, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
  62. 64. Farmacevtska oblika, po zahtevku 63, označena s tem, da je antagonist izbran med enim ali več: protitelesi, ki z vezavo nevtralizirajo aktivnost OB polipeptida, fragmenta OB polipeptida, ki se veže, vendar ne aktivira OB polipeptidnega receptorja in antagonista OB polipeptida z majhno molekulo.
  63. 65. Kozmetični pripravek, za izboljšanje izgleda telesa, za zniževanje telesne teže pri posamezniku, označen s tem, da vsebuje OB polipeptid po enem izmed zahtevkov 1 do 16, ali je pripravljen z metodo po zahtevkih 47 do 50, in sprejemljiv nosilec.
  64. 66. Kozmetični pripravek, za izboljšanje izgleda telesa, za povečevanje telesne teže pri posamezniku, označen s tem, da vsebuje antagonist OB polipeptida po zahtevkih od 1 do 16, ali je pripravljen z metodo po zahtevkih 47 do 50, in sprejemljiv nosilec.
  65. 67. Kozmetični pripravek, po zahtevku 66, označen s tem, da je antagonist izbran med enim ali več naslednjih: protiteles, ki z vezavo nevtralizirajo aktivnost OB polipeptida, fragmenta OB polipeptida, ki se veže, vendar ne aktivira OB polipeptidnega receptorja in antagonista OB polipeptida z majhno molekulo.
    205
  66. 68. Kozmetični postopek za izboljšanje videza telesa pri posamezniku, označen s tem, da je kozmetični pripravek, po kateremkoli izmed zahtevkov od 64 do 67, apliciran posamezniku v dovolj velikem odmerku, da uravna telesno težo posameznika na želen nivo.
  67. 69. Uporaba komplementarne molekule nukleinske kisline, ki jo hibridiziramo v nukleinsko kislino s kodnim zapisom za OB polipeptid, po zahtevku 1 do 4 ali 9, označena s tem, daje namenjena zdravljenju uravnavanja telesne teže pri sesalcih.
  68. 70. Uporaba nukleinske kisline s kodnim zapisom za OB polipeptid, po kateremkoli od zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljena po metodi, po kateremkoli od zahtevkov od 47 do 50, označena s tem, da je namenjena za izdelavo zdravila za gensko terapijo za uravnavanje telesne teže pri živalih.
  69. 71. Uporaba OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljenega po metodi, po kateremkoli od zahtevkov od 47 do 50, označena s tem, da je namenjena izdelavi zdravila za spreminajnje telesne teže pri živalih.
  70. 72. Uporaba OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljenega po metodi, po kateremkoli od zahtevkov od 47 do 50, označena s tem, da je namenjena izdelavi zdravila za spreminjanje telesne teže pri sesalcih pri zdravljenju obolenj izbranih iz skupine, v katero štejemo sladkorno bolezen, visok krvni tlak in povišan holesterol.
  71. 73. Uporaba OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljen po metodi, po kateremkoli od zahtevkov od 47 do 50, označena s tem, da je namenjena izdelavi zdravila za spreminjanje telesne teže sesalcev v kombinaciji z drugimi zdravili za zdravljenje sladkorne bolezni, visokega krvnega pritiska in povišanega holesterola.
    206
  72. 74. Uporaba antagonista OB polipeptida, po kateremkoli izmed zahtevkov od 1 do 16, ali pripravljen po metodi, po kateremkoli od zahtevkov od 47 do 50, označena s tem, da je namenjena izdelavi zdravila za povečanje telesne teže pri živalih.
  73. 75. Uporaba, po zahtevku 74, označena s tem, daje antagonist izbran med enim ali več naslednjih: protiteles, ki z vezavo nevtralizirajo aktivnost OB polipeptida, fragmenta OB polipeptida, ki se veže, vendar ne aktivira OB polipeptidnega receptorja in antagonista OB polipeptida z majhno molekulo.
  74. 76. Uporaba, po kateremkoli od zahtevkov od 71 do 75, za izdelavo zdravila, označenega s tem, da je namenjen intravenski, intraarterialni, intraperitonealni, intramuskulami, subkutani, nazalni, oralni ali pulmonami aplikaciji.
  75. 77. Debelostni (OB) polipeptid, ki ima približno 145 do približno 167 aminokislin in njihove alelne variante ali ananlogi, vključno s fragmenti, označen s tem, da uravnava telesno težo.
  76. 78. OB polipeptid, alelne variante ali analogi, vključno s fragmenti, ki imajo lahko pripete vodotopne polimerne spojine, po zahtevku 77, označeni s tem, daje njegova aminokislinska sekvenca zapisana s SEQ ID NO: 2, 4, 5 ali 6.
  77. 79. Analog humanega OB polipeptida ali njihovi fragmenti, po zahtevku 78, označen s tem, daje 83% ali več aminokislinske sekvence homologne aminokislinski sekvenci humanega OB polipeptida, ki je opisana v SEQ ID NO: 2, 4, 5 ali 6.
  78. 80. Molekula nukleinske kisline, s kodnim zapisom za OB polipeptid, po kateremkoli izmed zahtevkov od 77, 78 ali 79, označena s tem, daje bila izolirana.
  79. 81. DNK molekula, označena s tem, da zagotavlja gotovo ekspresijo OB polipeptida, ki je biološko aktiven pri uravnavanju telesne teže pri živalih, izbrano med enim ali več naslednjimi: (a) DNK molekulami, ki so opisane s SEQ ID NO: 1 ali 3 ali
    207 njihovimi fragmenti, (b) DNK molekulami, ki se hibridizirajo v DNK molekule, ki so definirane v (a) ali njihovi hibridni fragmenti in (c) DNK molekule, ki nosijo zapis za ekspresijo aminokislinske sekvence, ki jo kodira katerakoli, v nadaljevanju opisana, DNK molekula.
  80. 82. Nukleinska kislina, označena s tem, da je označena in se lahko hibridizira v DNK molekulo, po enem izmed zahtevkov 80 ali 81.
  81. 83. Nukleinska kislina, označena s tem, da se lahko hibridizira v nekodirajoče področje OB nukleinske kisline, izbrano med enim ali več: intromom, 5’ nekodirajočim področjem in 3’ nekodirajočim področjem.
  82. 84. Vektor, označen s tem, da vsebuje DNK molekulo, ki je izbrana iz skupine: (a) DNK molekul po kateremkoli izmed zahtevkov 80, 81, 82 ali 83 in (b) DNK molekulo po kateremkoli izmed zahtevkov 80, 81 ali 82, operativno povezana z ekspresij sko kontrolno sekvenco.
  83. 85. Metoda, za pripravo OB polipeptida, označena s tem, da obsega: (a) gojenje enoceličnega gostitelja transformiranega ali transficiranega z DNK, po kateremkoli zahtevku 80, 81 ali 82, ali vektor, po zahtevku 84, pod pogoji, ki zagotavljajo ekspresijo OB polipeptida in (b) izolacijo ekspresiranega OB polipeptida.
  84. 86. Protitelo ali fragmenti, ki se veže na antigen, označena s tem, da sta specifična za OB polipeptid, po enem izmed zahtevkov 77, 78, ali 79, ali pripravljena z metodo po zahtevku 85.
  85. 87. Protitelo, po zahtevku 86, označeno s tem, da je označeno z označevalcem, ki ga lahko zasledujemo.
  86. 88. Farmacevtska oblika za zmanjšanje telesne teže živali, označena s tem, da vsebuje
    208
    OB polipepid, po enem izmed zahtevkov 77, 78 ali 79, ali je pripravljena s postopkom, po zahtevku 85, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
  87. 89. Farmacevtska oblika za povečanje telesne teže pri živalih, označena s tem, da vsebuje antagonist OB polipeptida, po enem izmed zahtevkov 77, 78 ali 79, ali je pripravljena z metodo, po zahtevku 85, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
  88. 90. Farmacevtska oblika, po zahtevku 89, označena s tem, da je antagonist izbran med enim ali več: protitelesom, ki z vezavo nevtralizira aktivnost OB polipeptida, fragmenta OB polipeptida, ki se veže, vendar ne aktivira OB polipeptidnega receptorja in antagonista OB polipeptida z majhno molekulo.
SI9520090A 1994-08-17 1995-08-17 Modulatorji telesne teže, odgovarjajoče nukleinske kisline in beljakovine, diagnostika in njihova uporaba v terapiji SI9520090A (sl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/292,345 US6001968A (en) 1994-08-17 1994-08-17 OB polypeptides, modified forms and compositions
US08/347,563 US5935810A (en) 1994-08-17 1994-11-30 Mammalian ob polypeptides capable of modulating body weight, corresponding nucleic acids, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US08/438,431 US6429290B1 (en) 1994-08-17 1995-05-10 OB polypeptides, modified forms and derivatives
US08/483,211 US6309853B1 (en) 1994-08-17 1995-06-07 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
PCT/US1995/010479 WO1996005309A2 (en) 1994-08-17 1995-08-17 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9520090A true SI9520090A (sl) 1998-08-31

Family

ID=27501568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9520090A SI9520090A (sl) 1994-08-17 1995-08-17 Modulatorji telesne teže, odgovarjajoče nukleinske kisline in beljakovine, diagnostika in njihova uporaba v terapiji

Country Status (32)

Country Link
US (1) US6309853B1 (sl)
EP (1) EP0777732B1 (sl)
JP (1) JP3479080B2 (sl)
CN (1) CN1162978B (sl)
AP (1) AP815A (sl)
BG (1) BG64710B1 (sl)
BR (1) BR9508596A (sl)
CA (1) CA2195955C (sl)
CZ (1) CZ295018B6 (sl)
DE (2) DE777732T1 (sl)
EE (1) EE04377B1 (sl)
ES (1) ES2108663T3 (sl)
FI (1) FI121709B (sl)
GB (1) GB2292382B (sl)
GE (1) GEP20022701B (sl)
GR (1) GR970300021T1 (sl)
HK (1) HK1001495A1 (sl)
HU (1) HU223563B1 (sl)
IL (2) IL114987A (sl)
IS (1) IS4416A (sl)
LV (1) LV11868B (sl)
MD (1) MD2311G2 (sl)
MX (1) MX9701200A (sl)
NO (2) NO323847B1 (sl)
NZ (1) NZ291689A (sl)
OA (1) OA10596A (sl)
PL (1) PL183352B1 (sl)
RO (1) RO121036B1 (sl)
SI (1) SI9520090A (sl)
SK (1) SK287191B6 (sl)
TR (1) TR199501021A2 (sl)
WO (1) WO1996005309A2 (sl)

Families Citing this family (333)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310034B1 (en) 1993-05-21 2001-10-30 Ut-Battelle, Llc Agouti polypeptide compositions
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
US5827734A (en) * 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
US5858967A (en) * 1995-01-20 1999-01-12 University Of Washington Appetite supression factor and related methods
US5552522A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0725079A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-07 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5605886A (en) * 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) * 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) * 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) * 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) * 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) * 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) * 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) * 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) * 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0736599A3 (en) * 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
AU5098396A (en) * 1995-04-07 1996-10-23 Kuyus-Stiftung Cosmetic composition for treating cellulite
US5840517A (en) * 1995-04-26 1998-11-24 Eli Lilly And Company Process for preparing obesity protein analogs
US5614379A (en) * 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
GB9509164D0 (en) 1995-05-05 1995-06-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
EP0741187A2 (en) * 1995-05-05 1996-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant obese (Ob) proteins
WO1996035787A1 (en) * 1995-05-08 1996-11-14 Chiron Corporation Nucleic acids for treating obesity
PE50997A1 (es) * 1995-05-19 1997-12-18 Lilly Co Eli Producto del gen de la obesidad
CA2221824A1 (en) * 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
US6395509B1 (en) 1995-05-26 2002-05-28 Eli Lilly And Company DNA encoding Rhesus ob protein
EP0832220A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Amgen Inc. Ob protein compositions and method
GB9511935D0 (en) * 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
WO1997000886A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
EP0759441A3 (en) * 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
ZA965346B (en) * 1995-06-30 1997-12-24 Lilly Co Eli Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions.
WO1997002004A2 (en) * 1995-06-30 1997-01-23 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
PT865294E (pt) * 1995-08-17 2004-07-30 Amgen Inc Processo para a reducao ou a manutencao de niveis reduzidos de lipidos no sangue utilizando composicoes de proteina ob
CA2232193A1 (en) * 1995-09-19 1997-03-27 Brigitte Elisabeth Schoner Dna encoding medicinal proteins
WO1997016550A1 (en) * 1995-11-02 1997-05-09 Bristol-Myers Squibb Company Polypeptide fragments derived from the obese gene product
SI0866720T1 (sl) * 1995-11-22 2004-10-31 Amgen Inc. Ob-protein za povečanje vitke telesne mase
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US20030040467A1 (en) 1998-06-15 2003-02-27 Mary Ann Pelleymounter Ig/ob fusions and uses thereof.
AU1406497A (en) * 1995-12-06 1997-06-27 Schering Corporation Mutational variants of mammalian ob gene proteins
US6225446B1 (en) 1995-12-06 2001-05-01 Schering Corporation Mutational variants of mammalian proteins
US7632922B1 (en) 1995-12-22 2009-12-15 Amgen, Inc. Osteoprotegerin
US6369027B1 (en) * 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
CA2238307A1 (en) * 1995-12-27 1997-07-10 Genentech, Inc. Ob protein derivatives having prolonged half-life
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US7074397B1 (en) 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
US6541604B1 (en) 1996-01-08 2003-04-01 Genentech, Inc. Leptin receptor having a WSX motif
US20050019325A1 (en) 1996-01-08 2005-01-27 Carter Paul J. WSX receptor agonist antibodies
US6087129A (en) 1996-01-19 2000-07-11 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US6110707A (en) * 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
WO1997026916A1 (en) * 1996-01-25 1997-07-31 Eli Lilly And Company Obesity protein analog compounds and formulations thereof
HUP0000280A3 (en) * 1996-03-01 2002-09-30 Amgen Inc Thousand Oaks Canine ob protein compositions and methods
JP2000509018A (ja) * 1996-03-26 2000-07-18 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満タンパク質製剤
JP2000509377A (ja) * 1996-04-19 2000-07-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 骨形成を誘発するための方法
US6007998A (en) * 1996-04-22 1999-12-28 Merck & Co., Inc. Leptin assay
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
ES2289759T3 (es) * 1996-06-04 2008-02-01 The Scripps Research Institute Procedimientos de diagnostico y terapeuticos relacionados con la regulacion de la movilizacion de la energia con proteina ob y anticuerpos ob.
CA2257240A1 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Smithkline Beecham P.L.C. Fragments of leptin (ob protein)
JP2000514422A (ja) * 1996-06-20 2000-10-31 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 肥満のための遺伝子治療
US6001816A (en) * 1996-06-20 1999-12-14 Merck & Co., Inc. Gene therapy for leptin deficiency
EP0954579A1 (en) * 1996-06-20 1999-11-10 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6630346B1 (en) * 1996-06-20 2003-10-07 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US5869037A (en) * 1996-06-26 1999-02-09 Cornell Research Foundation, Inc. Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes
US20020110857A1 (en) * 1996-07-31 2002-08-15 Spurlock Michael E. Bovine leptin protein, antisense and antibody
US6277592B1 (en) * 1996-07-31 2001-08-21 Purina Mills, Inc. Porcine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof
JP2001501177A (ja) * 1996-08-30 2001-01-30 アムジエン・インコーポレーテツド Ｏｂタンパク質受容体をアップレギュレートすることによりｏｂタンパク質に対する個体の感受性を増加させる方法
RU2201249C2 (ru) * 1996-09-20 2003-03-27 Хехст Акциенгезелльшафт Применение антагонистов лептина для лечения резистентности к инсулину при диабете ii типа
SE520392C2 (sv) 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
WO1998016545A1 (en) * 1996-10-11 1998-04-23 Eli Lilly And Company Therapeutic proteins
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
NL1004559C2 (nl) * 1996-11-18 1998-05-19 Unilife Boter.
AU5654998A (en) * 1996-12-06 1998-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Muteins of obese protein
EP1007648A4 (en) * 1996-12-20 2003-01-15 Lilly Co Eli ANTI-OBESITY PROTEINS
CA2217698A1 (en) * 1996-12-20 1998-06-20 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
CA2275183A1 (en) * 1996-12-20 1998-07-02 Amgen Inc. Ob fusion protein compositions and methods
EP1598054B1 (en) * 1997-04-15 2011-03-16 Csir Non-therapeutic methods of suppressing appetite
US20020019352A1 (en) * 1997-04-17 2002-02-14 David N. Brems Stable, active, human ob protein compositions and methods
CA2293504A1 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 Valur Emilsson Use of leptin antagonists for the treatment of diabetes
US6017876A (en) 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US5866547A (en) 1998-01-20 1999-02-02 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of neuroendocrine regulation of affective disorders
EP0950417A3 (en) 1998-02-23 2000-02-23 Pfizer Products Inc. Treatment of skeletal disorders
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
EP0996727B1 (en) * 1998-08-12 2003-01-08 Medical Research Council Gene conferring obese phenotype
US6777388B1 (en) * 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
US7208572B2 (en) 1998-08-21 2007-04-24 Albany Medical College Leptin-related peptides
JP2003527822A (ja) * 1998-08-27 2003-09-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ヘパリナーゼｉおよびｉｉ由来の合理的に設計されたヘパリナーゼ
US7056504B1 (en) 1998-08-27 2006-06-06 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
SI2319928T1 (sl) 1998-10-23 2013-08-30 Kirin-Amgen, Inc. Dimerni trombopoietinski peptidni mimetiki, ki se veĺ˝ejo na receptor mp1 in imajo trombopoietinsko aktivnost
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
US6602705B1 (en) 1998-12-31 2003-08-05 Chiron Corporation Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
BR0007414A (pt) * 1999-01-07 2001-10-16 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc
WO2000047741A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 Amgen Inc. Glycosylated leptin compositions and related methods
AU3910000A (en) * 1999-03-22 2000-10-09 Zymogenetics Inc. Improved methods for producing proteins in transformed (pichia)
US20050272652A1 (en) 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
CA2643162C (en) * 1999-04-23 2018-01-02 Massachusetts Institute Of Technology Polymer identification, compositional analysis and sequencing, based on property comparison
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US8106098B2 (en) 1999-08-09 2012-01-31 The General Hospital Corporation Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer
AU778611B2 (en) 1999-08-09 2004-12-16 Merck Patent Gmbh Multiple cytokine-antibody complexes
GB2396815B (en) * 1999-10-27 2004-09-08 Phytopharm Plc A composition comprising a pregnenone derivative and an NSAID
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
CA2402160C (en) * 2000-03-08 2012-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Heparinase iii and uses thereof
JP2003530870A (ja) 2000-04-21 2003-10-21 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｐｏ−ＡＩ／ＡＩＩペプチド誘導体
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB2363985B (en) * 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use
US6443013B1 (en) * 2000-08-04 2002-09-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Rotary test fixture
ATE426805T1 (de) 2000-09-12 2009-04-15 Massachusetts Inst Technology Verfahren und produkte, die mit niedermolekularem heparin assoziiert sind
CA2423469A1 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides
US7054758B2 (en) 2001-01-30 2006-05-30 Sciona Limited Computer-assisted means for assessing lifestyle risk factors
CA2438652A1 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
ES2393733T3 (es) 2001-03-07 2012-12-27 Merck Patent Gmbh Tecnología de expresión para proteínas que contienen una fracción de anticuerpo de isotipo híbrido
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
RU2306320C9 (ru) 2001-05-03 2008-01-27 Мерк Патент Гмбх Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение
EP1921088B1 (en) 2001-05-11 2014-10-08 Amgen Inc. Peptides and related molecules that bind to tall-1
US20030083286A1 (en) * 2001-08-22 2003-05-01 Ching-Leou Teng Bioadhesive compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
US20030124196A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Susan Weinbach Pulsatile release compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
DE10145553B4 (de) * 2001-09-16 2006-06-08 Gene Architects Ag Nukleinsäure für einen Klonierungsvektor
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
EP2219031B1 (en) 2001-10-22 2013-04-24 Amgen, Inc. Use of leptin for treating human lipoatrophy and method of determining predisposition to said treatment
CA2464736A1 (en) 2001-10-23 2003-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
CN100390282C (zh) 2001-12-04 2008-05-28 默克专利有限公司 具有调节的选择性的il-2融合蛋白
DE60323936D1 (de) 2002-01-14 2008-11-20 Gen Hospital Corp Bioabbaubare polyketale, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
CA2387003A1 (en) * 2002-05-21 2003-11-21 984012 Alberta Ltd. Method for improving efficiencies in livestock production
JP4800614B2 (ja) 2002-07-19 2011-10-26 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション オキシム結合体、およびそれらの形成および使用のための方法
WO2004009774A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Amgen Inc. Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biogradable polymer
PL376536A1 (pl) 2002-08-28 2006-01-09 Immunex Corporation Kompozycje i sposoby leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego
US7169904B2 (en) 2002-12-17 2007-01-30 Emd Lexigen Research Center Corp. Immunocytokine sequences and uses thereof
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
AU2004252570C1 (en) 2003-06-27 2012-03-01 Ethicon, Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
JP2007500132A (ja) 2003-07-25 2007-01-11 アムジェン インコーポレイテッド Ｌｄｃａｍのアンタゴニストおよびアゴニスト、並びにその使用法
JP4585186B2 (ja) * 2003-07-31 2010-11-24 杏林製薬株式会社 肥満、糖尿病及び脂質代謝異常の新規な予防又は治療剤
DE602004032553D1 (de) 2003-09-05 2011-06-16 Gen Hospital Corp Polyacetal-arzneimittelkonjugate als freisetzungssystem
EP1689704A2 (en) 2003-10-21 2006-08-16 CoLucid Pharmaceuticals, Inc. Carbamoyl esters that inhibit cholinesterase and release pharmacologically active agents
DE10352510A1 (de) * 2003-11-07 2005-06-23 Forschungsinstitut Für Die Biologie Landwirtschaftlicher Nutztiere Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes
WO2005067889A1 (en) 2003-12-30 2005-07-28 Durect Corporation Polymeric implants, preferably containing a mixture of peg and plg, for controlled release of active agents, preferably a gnrh
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
AU2005211755B2 (en) 2004-02-11 2012-03-15 Amylin Pharmaceuticals, Llc Hybrid polypeptides with selectable properties
JP2008505928A (ja) 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
WO2006014798A2 (en) * 2004-07-27 2006-02-09 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
WO2006034296A2 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Comentis, Inc. Amino-containing compounds which inhibit memapsin 2 beta-secretase activity and methods of use thereof
US20080260694A1 (en) 2004-09-24 2008-10-23 Angioblast Systems, Inc. Multipotential Expanded Mesenchymal Precursor Cell Progeny (Memp) and Uses Thereof
US20090029912A1 (en) 2004-09-24 2009-01-29 Stan Gronthos Method of enhancing proliferation and/or survival of mesenchymal precursor cells (mpc)
WO2006052608A2 (en) 2004-11-01 2006-05-18 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of obesity and related disorders
US8394765B2 (en) 2004-11-01 2013-03-12 Amylin Pharmaceuticals Llc Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents
CA2585549A1 (en) 2004-11-18 2006-05-26 Vib Vzw Novel type leptin receptor antagonist
US7307142B2 (en) * 2004-11-26 2007-12-11 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Leptin antagonists
EP1833496B1 (en) 2004-12-23 2013-07-31 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders using postpartum derived cells
AU2006213607A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Amylin Pharmaceuticals, Llc GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
JP2008535863A (ja) 2005-04-08 2008-09-04 コメンティス，インコーポレーテッド β−セクレターゼ活性を阻害する化合物およびその使用方法
ES2654428T3 (es) 2005-04-12 2018-02-13 Mesoblast, Inc. Aislamiento de células multipotenciales adultas por fosfatasa alcalina no específica de tejido
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AU2006279680B2 (en) 2005-08-11 2012-12-06 Amylin Pharmaceuticals, Llc Hybrid polypeptides with selectable properties
EP2330125A3 (en) 2005-08-11 2012-12-12 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US8227408B2 (en) * 2005-09-07 2012-07-24 Neurotez, Inc. Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology
EP3037544A1 (en) 2005-10-13 2016-06-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of systemic lupus erythematosus (sle) patients with autoantibody positive diseases
TW200736277A (en) 2005-11-14 2007-10-01 Amgen Inc RANKL antibody-PTH/PTHrP chimeric molecules
CN101374946B (zh) 2005-12-16 2017-07-18 伊西康公司 用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组合物和方法
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
CA2638760A1 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
WO2007136752A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Glycofi, Inc. Erythropoietin compositions
WO2008002591A2 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Amgen Inc Methods for treating atherosclerosis
WO2008005457A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Sunesis Pharmaceuticals Pyridinonyl pdk1 inhibitors
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
CA2667678A1 (en) 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
LT2083811T (lt) 2006-11-22 2017-01-25 Clinical Research Associates, Llc Dauno sindromo, trapiosios x chromosomos sindromo ir autizmo gydymo būdai
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
EP2170283B1 (en) 2007-06-22 2019-01-09 Board of Regents, The University of Texas System Formation of stable submicron peptide or protein particles by thin film freezing
NZ582794A (en) 2007-07-26 2012-09-28 Amgen Inc Modified lecithin-cholesterol acyltransferase enzymes
CA2699787A1 (en) 2007-09-24 2009-04-02 Comentis, Inc. (3-hydroxy-4-amino-butan-2-yl)-3-(2-thiazol-2-yl-pyrrolidine-1-carbonyl) benzamide derivatives and related compounds as beta-secretase inhibitors for treating
CN104080475A (zh) 2008-04-18 2014-10-01 法克斯因内特公司 鞭毛蛋白的缺失突变体以及使用方法
EP2326339A4 (en) * 2008-05-21 2012-06-20 Neurotez Inc METHOD FOR TREATING PROGRESSIVE COGNITIVE DISORDER IN CONNECTION WITH NEUROFIBRILLARY TANGLES
EP2732817B1 (en) 2008-05-23 2016-08-24 National Jewish Health A compound for use in treating injury associated with exposure to phosgene or chlorine gas
US8501686B2 (en) 2008-06-05 2013-08-06 University Of Michigan Method of treating fatty liver diseases and conditions in non-lipodystrophic subjects
AU2009262199B2 (en) 2008-06-27 2012-08-09 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
CN102264728B (zh) 2008-09-15 2015-02-04 加利福尼亚大学董事会 用于调节ire1、src和abl活性的方法和组合物
WO2010045321A2 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
CN102281865B (zh) 2008-10-15 2017-04-05 精达制药公司 高浓缩药物颗粒、制剂、混悬剂及其应用
WO2010054017A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Nikolaos Tezapsidis Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amlyoid beta
CL2009002167A1 (es) 2008-12-10 2010-10-15 Mersana Therapeutics Inc Formulacion farmaceutica para administracion endovenosa que comprende un compuesto derivado de conjugados de camptotecina-polimero biocompatibles y biodegradables, un agente de estabilizacion, uno o varios tampones y un tensoactivo, util para el tratamiento del cancer.
WO2010071862A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Ethicon, Incorporated Umbilical cord tissue derived cells for treating neuropathic pain and spasticity
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
BRPI0923068B1 (pt) 2008-12-19 2021-05-25 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CN102498204B (zh) 2009-03-26 2015-02-04 德普伊新特斯产品有限责任公司 人脐带组织细胞作为用于阿尔茨海默病的疗法
EP2416797A4 (en) 2009-04-10 2013-04-24 Amylin Pharmaceuticals Llc AMYLINAGONIST COMPOUNDS FOR OXYGEN ANIMAL MICE
JP2012530498A (ja) 2009-06-19 2012-12-06 メディミューン，エルエルシー プロテアーゼバリアント
CA2771190C (en) 2009-08-17 2020-01-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Heat shock protein binding compounds, compositions, and methods for making and using same
CN107011330B (zh) 2009-09-04 2020-07-03 比奥根Ma公司 布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂
EP2485589A4 (en) 2009-09-04 2013-02-06 Biogen Idec Inc HETEROARYARY INHIBITORS OF BTK
AU2010303567B2 (en) 2009-10-06 2016-06-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc Heterocyclic compounds useful as PDK1 inhibitors
WO2011056849A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods of treating elevations in mtor signaling
US20110136728A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-09 Patricia Grasso Methods of increasing bone formation using leptin-related peptides
SG181561A1 (en) 2009-12-10 2012-07-30 Univ California Amyloid binding agents
KR102113960B1 (ko) 2010-03-30 2020-05-21 베르선 코포레이션 트롬빈 억제제로서의 다중치환된 방향족 화합물
CN101812450B (zh) * 2010-04-28 2012-01-11 中国农业大学 辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物
WO2012050925A2 (en) 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Highly soluble leptins
US9273028B2 (en) 2010-10-29 2016-03-01 Biogen Ma Inc. Heterocyclic tyrosine kinase inhibitors
BR112013020719B1 (pt) 2011-02-14 2018-04-17 Allergan, Inc. Composições de derivados de bimatoprost tipo éster e métodos
CA2836449C (en) 2011-05-17 2021-04-27 The Regents Of The University Of California Kinase inhibitors
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
US20130178379A1 (en) * 2011-06-15 2013-07-11 Nse Products, Inc. Identifying Markers of Caloric Restriction and Caloric Restriction Mimetics
PT2729160T (pt) 2011-07-08 2019-07-08 Aegerion Pharmaceuticals Inc Polipéptidos modificados com uma maior duração da ação e uma imunogenicidade reduzida
JP5937210B2 (ja) 2011-08-10 2016-06-22 デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド 臍帯組織由来細胞を用いた末梢血管疾患の治療
MX370814B (es) 2011-09-02 2020-01-08 Univ California Pirazolo[3,4-d]pirimidinas sustituidas y usos de las mismas.
WO2013063492A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Novel compositions and methods for treating cancer
US9611513B2 (en) 2011-12-23 2017-04-04 DePuy Synthes Products, Inc. Detection of human umbilical cord tissue derived cells
EP2836482B1 (en) 2012-04-10 2019-12-25 The Regents of The University of California Compositions and methods for treating cancer
WO2013185082A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
AR091273A1 (es) 2012-06-08 2015-01-21 Biogen Idec Inc Inhibidores de pirimidinil tirosina quinasa
CA2913736A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Compounds and methods of treating cancer
CN104684904B (zh) 2012-08-27 2017-10-13 阿勒根公司 通过使用β‑氯环戊烷的亲水性酯前药减轻中央角膜增厚
US9090595B2 (en) 2012-08-27 2015-07-28 Allergan, Inc. Reduced central corneal thickening by use of hydrophilic ester prodrugs of beta-chlorocyclopentanes
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
EP2900673A4 (en) 2012-09-26 2016-10-19 Univ California MODULATION OF IRE1
LT2900230T (lt) 2012-09-27 2019-01-10 The Children`S Medical Center Corporation Junginiai, skirti nutukimo gydymui ir jų panaudojimo būdai
US9364462B2 (en) 2012-10-30 2016-06-14 The Regents Of The University Of California Alpha-1-adrenergic receptor agonist therapy
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
SG10201810087QA (en) 2013-02-06 2018-12-28 Celgene Corp Modified t lymphocytes having improved specificity
AU2014236356A1 (en) 2013-03-14 2015-09-24 The Regents Of The University Of California Thiosaccharide mucolytic agents
WO2014143643A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Acyclic nucleoside phosphonate diesters
ES2791749T3 (es) 2013-03-15 2020-11-05 Verseon Corp Halogenopirazoles como inhibidores de la trombina
AU2014228307A1 (en) 2013-03-15 2015-09-10 Allergan, Inc. Bimatoprost for enhancement of leptin production
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
CN105518018B (zh) 2013-03-15 2020-04-03 细胞基因公司 修饰的t淋巴细胞
EP2968297B1 (en) 2013-03-15 2018-09-26 Verseon Corporation Multisubstituted aromatic compounds as serine protease inhibitors
WO2015009742A2 (en) 2013-07-15 2015-01-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds and methods for treating cancer, neurological disorders, ethanol withdrawal, anxiety, depression, and neuropathic pain
EP3636264A1 (en) 2013-08-19 2020-04-15 The Regents of the University of California Compounds and methods for treating an epileptic disorder
WO2015031799A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Scintillator nanocrystal-containing compositions and methods for their use
JO3805B1 (ar) 2013-10-10 2021-01-31 Araxes Pharma Llc مثبطات كراس جي12سي
LT3074033T (lt) 2013-11-26 2019-02-25 The Children`S Medical Center Corporation Junginiai, skirti nutukimo gydymui ir jų panaudojimo būdai
ES2713196T3 (es) 2013-12-11 2019-05-20 Biogen Ma Inc Compuestos de biarilo útiles para el tratamiento de enfermedades humanas en oncología, neurología e inmunología
AU2014362231B2 (en) 2013-12-11 2019-04-04 Biogen Ma Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
AU2014386214B2 (en) 2013-12-23 2020-05-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and reagents for radiolabeling
KR20160124835A (ko) 2014-02-20 2016-10-28 알러간, 인코포레이티드 베타-클로로시클로펜탄의 친수성 에스테르 프로드럭의 사용에 의해 감소된 중앙 각막 비후
WO2015153933A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 The Children's Medical Center Corporation Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof
SG11201609336PA (en) 2014-05-13 2016-12-29 Sloan Kettering Inst Cancer Hsp70 modulators and methods for making and using the same
WO2016004383A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 City Of Hope Tumor-selective ctla-4 antagonists
US20180080008A1 (en) 2014-08-12 2018-03-22 Anthrogenesis Corporation Car-t lymphocytes engineered to home to lymph node b cell zone, skin, or gastrointestinal tract
EA036391B1 (ru) 2014-09-15 2020-11-05 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Нуклеотидные аналоги
WO2016044662A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Verseon Corporation Pyrazolyl-substituted pyridone compounds as serine protease inhibitors
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
AR102094A1 (es) 2014-09-25 2017-02-01 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas kras con una mutación g12c
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
ES2757798T3 (es) 2014-10-02 2020-04-30 Allergan Inc Profármacos de éster de gamma-lactamas y su uso
EP3244907B1 (en) 2015-01-13 2020-02-19 City of Hope Ctla4-binding protein peptide-linker masks
WO2016138138A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 The Regents Of The University Of California 5ht agonists for treating disorders
WO2016138532A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Verseon Corporation Substituted pyrazole compounds as serine protease inhibitors
US11072592B2 (en) 2015-02-27 2021-07-27 The Regents Of The University Of California Small molecules that enable cartilage rejuvenation
EA201792214A1 (ru) 2015-04-10 2018-01-31 Араксис Фарма Ллк Соединения замещенного хиназолина
US10428064B2 (en) 2015-04-15 2019-10-01 Araxes Pharma Llc Fused-tricyclic inhibitors of KRAS and methods of use thereof
AU2016247858B2 (en) 2015-04-17 2020-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. PLK4 inhibitors
US20180282310A1 (en) 2015-06-10 2018-10-04 Biogen Ma Inc. Forms and compositions of biaryl inhibitors of bruton's tyrosine kinase
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
CN105132566A (zh) * 2015-09-21 2015-12-09 上海中优生物高科技有限责任公司 毒素堆积型肥胖基因个体化干预饮品的制备方法及其系统
WO2017058805A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356339A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10882847B2 (en) 2015-09-28 2021-01-05 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058915A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058807A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058768A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3359647A1 (en) 2015-10-08 2018-08-15 Neurona Therapeutics Inc. Neural precursor cell populations and uses thereof
WO2017070256A2 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Araxes Pharma Llc Method for screening inhibitors of ras
BR112018008103A2 (pt) 2015-10-23 2018-11-06 Erx Pharmaceuticals, Inc. análogos de celastrol
BR112018008025A2 (pt) 2015-10-23 2018-10-23 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. inibidores de pdk1 heterocíclicos para uso no trata-mento de câncer
KR20180081596A (ko) 2015-11-16 2018-07-16 아락세스 파마 엘엘씨 치환된 헤테로사이클릭 그룹을 포함하는 2-치환된 퀴나졸린 화합물 및 이의 사용 방법
WO2017100546A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
JP6938509B2 (ja) 2015-12-24 2021-09-22 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア Ｃｆｔｒ制御因子及びこの使用方法
JP6938510B2 (ja) 2015-12-24 2021-09-22 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア Ｃｆｔｒ制御因子及びこの使用方法
ES2964746T3 (es) 2015-12-30 2024-04-09 Celgene Corp Métodos de producción de linfocitos T y linfocitos T producidos mediante el mismo
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
WO2017189613A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 Forma Therapeutics, Inc. Methods of using fasn inhibitors
CA3022432A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Sigma receptor binders
PE20190119A1 (es) 2016-05-12 2019-01-17 Anacor Pharmaceuticals Inc Esteres de oxaborol y sus usos
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
MX2019000884A (es) 2016-07-21 2019-09-04 Biogen Ma Inc Formas de succinato y composiciones de inhibidores de la tirosina cinasa de bruton.
IL305149A (en) 2016-07-26 2023-10-01 Biomarin Pharm Inc Novel adeno-associated virus capsid proteins
US11542261B2 (en) 2016-08-17 2023-01-03 Children's Hospital Medical Center Substituted Imidazo[1,2-a]-pyridines as IRAK 1/4 and FLT3 inhibitors
US11254667B2 (en) 2016-08-17 2022-02-22 Children's Hospital Medical Center Substituted imidazo[1,2-A]pyridines as IRAK 1/4 and flt3 inhibitors
FI3509624T3 (fi) 2016-09-12 2023-10-18 Amryt Pharmaceuticals Inc Menetelmiä neutraloivien anti-leptiini -vasta-aineiden havaitsemiseksi
US10280172B2 (en) 2016-09-29 2019-05-07 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
US10377743B2 (en) 2016-10-07 2019-08-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of RAS and methods of use thereof
JP7100028B2 (ja) 2016-10-20 2022-07-12 セルジーン コーポレイション セレブロン系のヘテロ二量体化可能なキメラ抗原受容体
CA3047125A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
CN110382482A (zh) 2017-01-26 2019-10-25 亚瑞克西斯制药公司 稠合的杂-杂二环化合物及其使用方法
WO2018140599A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018140512A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
WO2018140514A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
MX2019013954A (es) 2017-05-25 2020-08-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras.
TW201906832A (zh) 2017-05-25 2019-02-16 美商亞瑞克西斯製藥公司 用於癌症治療之化合物及其使用方法
WO2018218069A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Araxes Pharma Llc Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
CN107385020A (zh) * 2017-06-23 2017-11-24 西安医学院 瘦素在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用
WO2019070917A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 The Schepens Eye Research Institute, Inc. COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING THE DEGENERATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM AND METHODS USING SAME
WO2019074962A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Syros Pharmaceuticals, Inc. PYRROLOTRIAZINE COMPOUNDS AND METHODS FOR INHIBITING TAM KINASES
CA3088526A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Syros Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
CA3093802A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Substituted imidazopyridines as inhibitors of plasma kallikrein and uses thereof
CN113164762A (zh) 2018-05-09 2021-07-23 生物马林药物股份有限公司 苯丙酮尿症的治疗方法
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
CN114728962A (zh) 2019-09-18 2022-07-08 武田药品工业有限公司 血浆激肽释放酶抑制剂及其用途
US11370803B2 (en) 2019-09-18 2022-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heteroaryl plasma kallikrein inhibitors
JP2023522331A (ja) 2020-04-17 2023-05-30 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインの阻害剤の形態及び組成物
WO2021211938A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Solid forms of inhibitors of plasma kallikrein
EP4308227A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Imidazopyridinyl inhibitors of plasma kallikrein
CN117396469A (zh) 2021-03-17 2024-01-12 武田药品工业株式会社 血浆激肽释放酶的抑制剂
EP4308228A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors
CN117355523A (zh) 2021-03-17 2024-01-05 武田药品工业株式会社 血浆激肽释放酶的多环抑制剂
JP2024516073A (ja) 2021-03-17 2024-04-12 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインのヘテロアリール阻害剤
CA3223636A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 Christopher Walton CARROLL Compositions and methods for selective degradation of engineered proteins
WO2024040241A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Viracta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations, processes for preparation, and methods of use
WO2024059186A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited N-((isoquinolin-6-yl)methyl)-1h-pyrazole-4-carboxamid derivatives as plasma kallikrein inhibitors for the treatment of hereditary angioedema

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE31006E (en) 1968-09-24 1982-08-03 Akzona Incorporated Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
US3654090A (en) 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US3650090A (en) 1970-06-19 1972-03-21 Phillips Petroleum Co Analysis of gaseous mixtures
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4491632A (en) 1979-10-22 1985-01-01 The Massachusetts General Hospital Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
EP0043718B1 (en) 1980-07-07 1984-11-28 National Research Development Corporation Improvements in or relating to cell lines
US4341761A (en) 1980-07-25 1982-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
US4466917A (en) 1981-02-12 1984-08-21 New York University Malaria vaccine
US4493890A (en) 1981-03-23 1985-01-15 Miles Laboratories, Inc. Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays
US4451570A (en) 1981-03-26 1984-05-29 The Regents Of The University Of California Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line
US4399121A (en) 1981-11-04 1983-08-16 Miles Laboratories, Inc. Iodothyronine immunogens and antibodies
US4427783A (en) 1981-12-14 1984-01-24 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay of thymosin α1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
WO1989010932A1 (en) 1988-05-13 1989-11-16 Amgen Inc. Compositions and method for treating or preventing infections in animals
EP0436625A4 (en) 1988-09-26 1991-08-21 The Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. Mixed feed recombinant yeast fermentation
US5102789A (en) 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5098833A (en) 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
WO1990014092A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Cell Genesys, Inc. Single-strand site-directed modification of mammalian genes in vivo
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
DK0452484T3 (da) 1989-11-06 1996-10-14 Cell Genesys Inc Fremstilling af proteiner ved homolog rekombination
KR0176693B1 (ko) 1989-12-22 1999-04-01 레지널드 디. 쇼트보그; 제롬 반 쥘렌 조절요소를 사용한 내인성 유전자의 발현을 변형시키는 방법
US5139749A (en) 1990-06-22 1992-08-18 Tas, Inc. Fluidized calcining process
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
ZA924674B (en) 1991-07-02 1993-04-28 Imclone Systems Inc Cysteine depleted il-6 mutein
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
IL105406A (en) 1992-04-17 2000-01-31 Sankyo Co Derivatives of adipogenesis inhibitory factor processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same
ATE311895T1 (de) 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
JPH08500483A (ja) * 1992-06-19 1996-01-23 ジョスリン ダイアビーティーズ センター インコーポレイテッド 糖尿遺伝子ｒａｄ：２型糖尿病特異性遺伝子
DK0669929T3 (da) 1992-11-13 2007-01-29 Immunex Corp Elk-ligand, et cytokin
US5574018A (en) 1994-07-29 1996-11-12 Amgen Inc. Conjugates of vitamin B12 and proteins
US5643748A (en) 1994-09-14 1997-07-01 Progenitor, Inc. HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US5827734A (en) 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
US5532336A (en) 1995-01-31 1996-07-02 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569744A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5605886A (en) 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5525705A (en) 1995-01-31 1996-06-11 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0725079A1 (en) 1995-01-31 1996-08-07 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5521283A (en) 1995-01-31 1996-05-28 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0736599A3 (en) 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
JPH08333394A (ja) 1995-04-03 1996-12-17 Takeda Chem Ind Ltd ラット肥満遺伝子、その遺伝子産物およびその製造法
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5614379A (en) 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
EP0741187A2 (en) 1995-05-05 1996-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant obese (Ob) proteins
PE50997A1 (es) 1995-05-19 1997-12-18 Lilly Co Eli Producto del gen de la obesidad
CA2221824A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
EP0759441A3 (en) 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
WO1997002004A2 (en) 1995-06-30 1997-01-23 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
CA2232193A1 (en) 1995-09-19 1997-03-27 Brigitte Elisabeth Schoner Dna encoding medicinal proteins
US5698389A (en) 1995-11-16 1997-12-16 Tularik, Inc. Transcriptional promoter of the murine obesity gene
JP2000504319A (ja) 1996-01-19 2000-04-11 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症タンパク質製剤
JP2000505079A (ja) 1996-01-19 2000-04-25 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症タンパク質製剤
EP0784982A3 (en) 1996-01-19 1999-08-18 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
JP2000505078A (ja) 1996-01-19 2000-04-25 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症タンパク質製剤
JP2000509018A (ja) 1996-03-26 2000-07-18 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満タンパク質製剤

Also Published As

Publication number Publication date
MD2311F2 (en) 2003-11-30
DE777732T1 (de) 1998-01-29
HK1001495A1 (en) 1998-06-19
PL319021A1 (en) 1997-07-21
LV11868A (lv) 1997-10-20
AP815A (en) 2000-03-10
MX9701200A (es) 1998-05-31
HUT78052A (hu) 1999-07-28
IL114987A0 (en) 1995-12-08
BR9508596A (pt) 1997-10-21
MD970100A (en) 1998-04-30
NO323847B1 (no) 2007-07-09
GB9516947D0 (en) 1995-10-18
RO121036B1 (ro) 2006-11-30
EE04377B1 (et) 2004-10-15
WO1996005309A2 (en) 1996-02-22
FI121709B (fi) 2011-03-15
FI970656A0 (fi) 1997-02-17
SK22197A3 (en) 1998-02-04
CN1162978B (zh) 2010-06-16
SK287191B6 (sk) 2010-02-08
IS4416A (is) 1997-01-17
EP0777732B1 (en) 2011-09-28
NO20065287L (no) 1997-04-16
DE19531931A1 (de) 1996-03-07
CZ46097A3 (en) 1997-11-12
IL162093A0 (en) 2005-11-20
CA2195955C (en) 2012-03-13
HU223563B1 (hu) 2004-09-28
US6309853B1 (en) 2001-10-30
TR199501021A2 (tr) 1996-06-21
JP3479080B2 (ja) 2003-12-15
CN1162978A (zh) 1997-10-22
IL114987A (en) 2004-07-25
GB2292382B (en) 1997-07-16
GB2292382A (en) 1996-02-21
FI970656A (fi) 1997-02-17
CA2195955A1 (en) 1996-02-22
EE9700030A (et) 1997-08-15
OA10596A (en) 2002-06-26
ES2108663T3 (es) 2012-02-17
GR970300021T1 (en) 1997-07-30
MD2311G2 (ro) 2004-08-31
JPH09506264A (ja) 1997-06-24
ES2108663T1 (es) 1998-01-01
NZ291689A (en) 2000-01-28
EP0777732A1 (en) 1997-06-11
BG64710B1 (bg) 2005-12-30
WO1996005309A3 (en) 1996-03-21
AP9700919A0 (en) 1997-01-31
BG101228A (en) 1997-09-30
CZ295018B6 (cs) 2005-05-18
NO970683D0 (no) 1997-02-14
NO326376B1 (no) 2008-11-17
GEP20022701B (en) 2002-05-27
LV11868B (en) 1998-01-20
NO970683L (no) 1997-04-16
PL183352B1 (pl) 2002-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9520090A (sl) Modulatorji telesne teže, odgovarjajoče nukleinske kisline in beljakovine, diagnostika in njihova uporaba v terapiji
US6124439A (en) OB polypeptide antibodies and method of making
US8173793B2 (en) Nucleic acids encoding modulators of body weight
US6048837A (en) OB polypeptides as modulators of body weight
US20040213763A1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6350730B1 (en) OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
RU2273645C2 (ru) Полипептид ожирения (ов)(варианты), его аналог (варианты) и слитый белок (варианты), изолированная молекула нуклеиновой кислоты, молекула днк, рекомбинантный вектор клонирования, рекомбинантный вектор экспрессии, фармацевтическая композиция, моноклональное и поликлональное антитело
JP3985007B2 (ja) 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途
US6124448A (en) Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
AU738966B2 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
KR100584177B1 (ko) 체중 변조물질,상응하는 핵산 및 단백질,및 이들의 진단 및 치료학적 용도

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20110307