JPH08500483A

JPH08500483A - 糖尿遺伝子ｒａｄ：２型糖尿病特異性遺伝子

Info

Publication number: JPH08500483A
Application number: JP6502411A
Authority: JP
Inventors: カーン，シー．ロナルド; レイネット，クリスティーン
Original assignee: ジョスリンダイアビーティーズセンターインコーポレイテッド
Priority date: 1992-06-19
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1996-01-23
Also published as: US5589374A; US6326141B1; US5891430A; EP0646170A1; WO1994000558A1; EP0646170A4

Abstract

(57)【要約】糖尿遺伝子ｒａｄをコード化している配列を含む精製されたＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】糖尿遺伝子ｒａｄ：２型糖尿病特異性遺伝子［発明の背景］発明の分野本発明は、糖尿病患者の遺伝的基盤に関する。（真性）糖尿病は、すべての代謝障害のうちでも最も卑近なものに属し、70才までの人口の11％までが冒される。１型糖尿病（インシュリン依存性糖尿病、すなわちＩＤＤＭ）は、この群の約５〜10％を占め、膵臓のβ細胞の、それに続くインシュリン欠乏を伴う進行性自己免疫的破壊の結果である。２型糖尿病（非インシュリン依存性糖尿病、すなわちＮＩＤＤＭ）は、冒された人口の90〜95％を占めるが、根本的な病態形成の観点からは、充分な理解がはるかに少ない。２型糖尿病の患者は、インシュリン耐性およびインシュリンの相対的欠乏の双方の要素を示す。グルコースの恒常性の変化は糖尿病の必須条件であって、この疾患の１型および２型の双方に出現する。糖尿病の最も軽症の形態では、この変化は、炭水化物負荷による挑戦後にのみ探知されるが、疾患の中程度ないし重症の形態では、空腹時および食後の双方の状態に過血糖症が存在する。経口摂食後のグルコース負荷の処理、すなわち吸収状態に関与する最も重要な組織は、骨格筋である［Kip :Diabetes Care、第13巻（1990年）228〜243ページ；Caroら：Diab. Metab. Rev.、第５巻（1989年）665〜689ページ；Bogardus：Diab. Metab. Rev. 、第５巻（1989年）527〜528ページ；Beck-Nielsen：Diab. Metab. Rev.、第５巻（1989年）487〜493ページ］。骨格筋は体質量の40％を構成するが、高インシュリン濃度、または経口グルコース負荷の後ではグルコース処分の80〜95％を占める［Beck-Nielsen（1989年）；Baronら：Am. J. Physiol.、第255巻（1988年）Ｅ769〜774ページ］。インシュリンを投与した動物では、静脈内グルコースの約25％が１分以内に筋に進入する［Danielら：J. Physiol. （Lond）、第247巻（1975年）273〜288ページ］。骨格筋は、インシュリン依存性およびインシュリン非依存性の双方の方法での促進拡散によってグルコースを吸収し、相対的に高レベルのＧＬＵＴ４（「インシュリン応答性」グルコース輸送体）および低レベルのＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ３（基底グルコース輸送に関与すると考えられる輸送体）を発現することが示されている［Mueckler：Diabetes、第39巻（1990年）６〜11ページ］。いったん筋内に達すると、グルコースはヘキソキナーゼによって急速にリン酸化されて、グルコース−６−リン酸を形成する。グルコース取り込みの律速段階は輸送のレベルに存在するものの、炭水化物代謝の主要な制御はグルコース−６−リン酸の段階の後になされるという増加する証拠が存在する［Mandarino ：Diab. Metab. Rev.、第５巻（1989年）4 74〜486ページ；Felbert ら：Diabetes、第26巻（1977年）693〜699ページ］。ホルモン環境および代謝状態に応じて、グルコース−６−リン酸は、同化または異化のいずれかの経路に進入することができる。主要な同化経路は、グルコースからグリコーゲンへの転換を必要とする。この反応の律速酵素はグリコーゲン合成酵素である。グリコーゲン合成酵素の活性は、主として、リン酸化および脱リン酸化、ならびにアロステリック調節因子の存在によって調節されるが、酵素の発現レベルも役割を果たしているはずである。異化状態では、グルコースは、解糖系を通じてピルビン酸エステルへと代謝され、次いで、乳酸エステルへと転換される（嫌気性条件下で）か、またはＣＯ₂によってアセチルＣｏＡへと酸化されるかのいずれかである。後者の反応は、多酵素複合体であるピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）に触媒される。ＰＤＨ活性も、酵素、リン酸化および脱リン酸化のレベル、ならびに多数のアロステリック修飾因子によって調節される。グルコース代謝に関与する酵素および蛋白質のほとんどは、同定かつ精製されており、過去数年間にわたって、これらのいくつかが分子レベルでクローン化されている。筋内でのグルコース代謝を調節する支配的ホルモンは、インシュリンである。インシュリンは、インシュリン受容体および、より少ない程度に、ＩＧＦ−１受容体を通じてその作用を発揮するが、両者とも骨格筋で発現される［Beguinot ら：End ocrinology、第125巻（1989年）1,599〜1,605ページ；Sinha ら：J. Clin. Inve st.、第79巻（1987年）1,330〜1,337ページ；Obermaier-Kusser ら：J.Biol. Ch em. 、第264巻（1989年）9,497〜9,504ページ；Arner ら：Diabetologia、第30 巻（1987年）437〜440ページ］。他の組織でのインシュリンおよびＩＧＦ−１受容体と同様に、これらの受容体は、インシュリンおよびＩＧＦ−１の結合に際して刺激されるチロシンキナーゼという蛋白質である［White ら：J.Clin. Invest .、第82巻1,151〜1,156ページ］。次いで、この最初のインシュリンの信号は、リン酸化および脱リン酸化はもとより、存在し得るメジエーターの生成を含む一続きの事象を通じて作用して、グルコース取り込みを促進し、グリコーゲン合成酵素を活性化することによって、グルコースからグリコーゲンへの代謝および転換を刺激し、そして炭水化物に関与する各種の細胞内酵素を調節する［Yki-Jarv inen ら：J. Clin. Invest.、第80巻（1987年）95〜100ページ；Mandarino ら： J. Clin. Invest、第80巻（1987年）655〜653ページ］。加えて、インシュリンは筋のレベルでも作用して、膜輸送、酵素活性および遺伝子発現に対する効果を通じて、脂質および蛋白質の代謝を変化させる［Kimball ら：Diab. Metab. Rev .、第４巻（1988年）773〜787ページ；Alexander ら：Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻（1988年）5,092〜5,096ページ］。１型および２型糖尿病の双方において、末梢組織がグルコースを吸収し、代謝する能力には大きな変化が存在する［DeFronzo：Diabetes、第37巻（1988年）66 7〜687ページ；Olefskyら：Am．J．Med．、第85巻（1988年）86〜105ページ；Re aven：Diabetes、第37巻（1988年）１,595〜1,607ページ；Yki-Jarvinenら：New England J．Med．、第315巻（1986年）224〜230ページ；Hother-Nielsenら：Di abetologia、第30巻（1987年）834〜40ページ］。これらの変化は、肝臓、脂肪および筋とならんで、他の組織にも影響を及ぼす。１型糖尿病では、グルコース代謝における変化は、インシュリン欠乏に対して大体において二次的であるが、これがグルコース取り込みおよび細胞内処分代謝の調節に関して急性および慢性的効果をともに有する［Nankervis （1984年）；Yki-Jarvinen （1986年）；Hot her-Nielsen（1987年）］。２型糖尿病の筋における損なわれた代謝に関する真の基盤はそれ程明確ではないが、おそらく顕著なレベルのインシュリン耐性（後天的または遺伝的要因に起因する）とならんで、相対的なインシュリン欠乏の何らかの構成要素を含む一組の因子を必要とするのであろう。肥満症および糖尿病では、筋グルコースの恒常性に各種の変化が存在する。糖尿病を伴わない肥満した個体では、主要な変化は酸化的グルコース代謝にある［ Beck-Nielsen （1989年）；DeFronzo （1988年）；Olefsky（19 88年）］。インシュリンで刺激される非酸化的グルコース代謝の減退、基底およびインシュリン刺激双方のグルコースの酸化、ならびに痩身の対照より高率の脂質酸化が存在する［Felberら：Diabeto1ogia、第26巻（1987年）1,341〜1,350ページ］。肥満した個体では、グリコーゲン合成酵素は低下し、減退した非酸化的グルコース処分の一因となっている可能性がある［Bogardusら：J．Clin．Inves ．、第73巻（1984年）1,185〜1,190ページ；Freymondら：J．Clin．Invest．、第82巻（1988年）1,503〜1,509ページ］。肥満性糖尿病では、酸化的および非酸化的経路がともに変化し、後者はより定量的に重要な役割を果たしている可能性がある［Beck-Nielsen（1989年）］。肥満症および２型糖尿病の双方には、インシュリンで刺激される受容体リン酸化の低下［Caro（1987年）；Obermaier-Kuss er（1989年）；Arner（1987年）］、インシュリンで刺激されるグルコース輸送の低下［Caro（1987年）；Felber（1987）］、インシュリンで刺激されるピルビン酸脱水素酵素活性の低下［Mandarino（1989年）］、およびインシュリンで剌激されるグリコーゲン合成酵素の欠陥［Mandarino（1989年）；Freymond（1988 年）；Thorburnら：J．Clin．Invest．、第85巻（1990年）522〜529ページ］も存在する。治療されない１型糖尿病のヒトおよび齧歯類は、同じ変化の多くを示す［Nankervis（1984年）；Yki-Jarvinen（1986）；Hother-Nielsen（1987年）；Wallberg（1989）：Me d. Sci. Sports. Exerc.、第21巻（1989年）356〜362ページ］。後者の群では、これらは適正な治療とともに逆転する傾向があるが、ほとんどの研究では、インシュリンで刺激されるグルコース酸化、およびインシュリンで刺激されるＰＤＨ活性の多少の低下が、治療にもかかわらず持続する。糖尿病および肥満症でのグルコースの恒常性におけるこれらの変化に介在する因子は、複合的であり、変化したホルモン環境、変化した基質レベル、およびおそらく循環するインシュリン拮抗体さえも包含する［DeFronzo （1988年）；Sugdenら：J. Endocrinol.、第1 27巻（1990年）187〜190ページ；Leightonら：Trends Biochem. Sci.、第15巻（1 990年）295〜299ページ］。１型および２型糖尿病ならびに肥満症での筋におけるグルコース代謝の欠陥に関する要約を引用文献４に示す。２型糖尿病における根本的な欠陥に関しては議論が存在するものの、いくつかの研究は、最も初期の検出可能な異常は、筋によるグルコース処分に存在し得ることを示唆する［Bogardus （1989年）；DeFronzo（1988年）；Reaven（1988年）；Lillojaら：Acta Med. Scand. Suppl．、第723巻（1988年）103〜119ページ；Hoら：Diabetic Med．、第７巻（1990年）31〜34ページ；Erikssonら：New En gl．J．Med．、第321巻（1989年）337〜343ページ；Bogardusら：Diabetes、第3 8巻（1989年）1,423〜1,432ページ；Lillojaら：Diabetes、第36巻（1987年）1,329〜1,335ページ；Knowlerら：Diab．Metab. Rev．、第６巻（199 0年）1〜27ページ；Warramら：Ann．Int．Med．、第113巻（1990年）909〜915ページ；Martinら：刊行のため提出済み］。J．Stuart Soeldner博士によって開始された過去20年にわたる研究で、２型糖尿病の両親の200人以上の子孫がグルコース耐容性、グルコース処分およびインシュリン分泌における異常について同定され、評価された［Warram（1990年）；Martin］。子孫のうち155人は、研究開始時には正常血糖であった。その後、個体は平均14年間追跡され、その間に25人が２型糖尿病を発症した。研究に入る際に集められたデータの分析は、糖尿病前期の個体で検出し得る最も初期の欠陥に関する又とない洞察を与えた。この研究は、これらの子孫においては、糖尿病の発症を予告する第一期または第二期のインシュリン分泌能のいずれにも全く差がないことを明らかにした。しかし、全体的なグルコース処分率は低下した。Bergmanのグルコース処分モデル［Bergman:D iabetes、第38巻（1989年）1，512〜1,527ページ）］によれば、グルコース処分率のこの低下は、低下したインシュリン感受性（Ｓ₁）およびインシュリン非依存性グルコース処分（Ｓ_G）に起因する。Ｓ₁および／またはＳ_Gの低い値は、その後の糖尿病の発症を強く予告するものである［Warram（1990年）；Martin］。この研究の、インシュリン感受性の最低の五分位数にある正常血糖の子孫をインシュリン感受性の最高の五分位数中の子孫と比較するならば、追跡の間に２型糖尿病を発症する相対的危険率には、62倍の上昇が存在した（添付のMartinの前刷りを参照のこと）。同様に、低いグルコース感受性（これはインシュリン非依存性および基底インシュリン依存性双方のグルコース処分を反映する）は、糖尿病の相対的危険率を22倍も上昇させた。類似の所見および結論は、２型糖尿病の非常に高い発病率を有するピマインディアンの集団の研究からも導かれている［Lilloja（1988年）；Ho（1990年）；E rikkson（1989年）；Bogardus（1989年）；Lilloja（１９８７年）；Knowler（1 990年）］。加えて、この集団では、インシュリン感受性は家族集団内で、常染色体の優性形質を示唆する分布パターンで遺伝するという証拠が示されている［ Bogardus（1989）；Lilloja（1987年）］。グルコース代謝およびグリコーゲン合成酵素活性の変化は、臨床的糖尿病の開始期に先立つ糖尿病前期のピマインディアンからの生検においても検出することができる［Knowler（1990年）；Warra m（1990年）；Martin；Bergman（1989年）；Foley：Diab．Metab．Rev．、第４巻（1988年）487〜505ページ］。２型糖尿病はインシュリン感受性の潜在的欠陥の存在下で発症するという仮説と矛盾しないのが、２型糖尿病における攻撃的な治療は、血中グルコースおよび糖ヘモグロビンを正常化するが、この疾患で観察されるインシュリン耐性を完全に逆転させることには常に失敗することを示す多くの所見である［DeFronzo（1988 年）；Olefsky（1988年）］。インシュリン感受性の遺伝的変異性は、非糖尿病コーカサス人の集団にも存在する可能性があり［Hollenbeckら：J．Clin．Endoc rinol．Metab．、第64巻（1987年）1，169〜1,173ページ］、インシュリン感受性を制御する遺伝子は、何らかの頻度で、糖尿病の集団はもとより対照となる非糖尿病集団にも存在し得ることを示唆している。糖尿病における筋での、インシュリン受容体、グルコース輸送体、グリコーゲン合成酵素およびピルビン酸脱水素酵素の変化を初めとする各種の酵素および輸送体の代謝および活性の変化については顕著な証拠が存在するものの、変化したインシュリン作用を説明し得る、これらまたは他の蛋白質に対する遺伝子の発現の特定の変化に関する情報は比較的少ない。インシュリンに感受性であるグルコース輸送体のＧＬＵＴ１ではなくＧＬＵＴ４に対するｍＲＮＡのレベルでの変化が、ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットの骨格筋で観察され、インシュリンまたはバナジン酸塩による治療によって正常へと回復する［Bourey：J．Clin．I nvest．、第86巻（1990年）542〜547ページ；Stroutら：J．Endocrinology、第1 26巻（1990年）2,728〜2,732ページ；Sivitz：Nature、第340巻（1989年）72〜7 4ページ］。インシュリンおよびグルコースは、培養された骨格筋細胞系Ｌ６でグルコース輸送体ｍＲＮＡの発現を調節することも示されている［Walkerら：J．Bio l．Chem．、第264巻（1989年）6,587〜6,595ページ］。齧歯類およびヒトの双方の肥満症および２型糖尿病のモデルでのグルコース輸送体ｍＲＮＡの発現に関するデータは、筋組織ではなく脂肪組織でのＧＬＵＴ４の発現の変化したレベルを示すいくつかの研究、および両組織での変化を示す他の研究との、より多くの議論を生んでいる［Caro（1989年）；Pedersen：Diabetes、第39巻（1990年）865 〜870ページ］。糖尿病は、インシュリン様増殖因子１および２の筋での［Leama n：Endocrinology、第126巻（1990年）2,850〜2,857ページ］、クレアチンキナーゼの［Popovich：Amer．J．Physiol．、第257巻（1989年）E 573〜E 577ページ］、グルタミン合成酵素の［Feng：Am．J．Physiol．、第258巻（1990年）E 7 62〜E 766ページ］、そしてグアニンヌクレオチド調節蛋白質であるＧ_ｓのαサブユニットの［Griffithsら：Eur．J．Biochem．、第193巻（1990年）357〜364 ページ］発現レベルに作用することも示されている。対照的に、重要な二官能性酵素である６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼに対するｍＲＮＡは、ＳＴＺ系糖尿病マウスの肝臓で変化するが、筋では変化しない［Colosia：J．Biol．Chem．、第263巻（1988年）18,669〜18, 677ページ］。何人かの研究者は、２型糖尿病のヒトの筋内のインシュリン受容体の代替的に切断された形態の一つの発現における変化も明らかにしたが、これは、明らかに、受容体ｍＲＮＡ全体のレベルにおける顕著な変化を伴わずに生起する［Mosthaf ら：Proc．Natl．Acad．Sci．USA、第88巻（1991年）4,728〜4,730ページ］。全ｍＲＮＡのレベル、およびアクチンのような主要な構造蛋白質のほとんどのそれは、糖尿病でも変化しない［Pedersen（1990年）］。筋におけるグリコーゲン合成酵素、ＰＤＨ、ヘキソキナーゼ、インシュリン受容体基質（ＩＲＳ−１）などについてのｍＲＮＡレベルに対する糖尿病の影響に関しては、ほとんどまたは全くデータが存在しないが、現在では、これらの多くの重要な代謝酵素に対して、遺伝子プローブが存在する［Personsら：Mol．Carcinog．、第２巻（1989年）88 〜94ページ；Dugail：Biochem．J．、第254巻（1988年）483〜487ページ；Arora ら：J．Biol．Chem．、第65巻（1990年）6,481〜6,488ページ；Minchenkoら：En docrinol．Exp．、第18巻（1984年）3〜18ページ；Sunら：Nature、第352巻（19 91年）73〜77ページ］。［発明の要約］全体として、本発明は、糖尿遺伝子ｒａｄをコード化している配列を含む精製されたＤＮＡを特徴とする。糖尿遺伝子は、ｍＲＮＡレベルでのその発現が糖尿病および／または肥満症の個体では変更される（すなわち正常な個体で認められるものと異なっている）遺伝子である。ｒａｄは、ｒａｓ／ＧＴＰアーゼに関連する遺伝子ファミリーの新たな一員をコード化している。ｒａｄは、ヌクレオチドレベルで45 〜55％の相同性を、アミノ酸レベルでは33％の相同性をＧＴＰアーゼ領域でこのファミリーの他の成員と共有するが、低分子量のＧＴＰ結合蛋白質と比較すると、余分な５’および３’のコード化配列を有する。ｒａｄは、以前は、糖尿遺伝子Ｃ９Ｄ６と呼ばれた。本発明は：糖尿遺伝子ｒａｄをコード化しているＤＮＡ配列を含有するベクター；精製された糖尿遺伝子ｒａｄのＤＮＡを含有する細胞、例えば培養細胞、例えば筋細胞；トランスジェニックな動物を発生させることが可能な細胞；糖尿遺伝子ｒａｄがコード化しているポリペプチドを発現することが可能な細胞；精製された糖尿遺伝子ｒａｄのＤＮＡをそれぞれが含む細胞の基本的に均一な集団をも包含する。別な一側面では、本発明は、ｒａｄがコード化しているポリペプチドの実質的に純粋な調製物を特徴とする。本発明は、ｒａｄに対抗させた抗体、例えばモノクローナル抗体の精製された調製物も包含する。別な一側面では、本発明は、糖尿遺伝子生産物、例えばｒａｄ蛋白質、および製薬上許容され得る担体を含む治療用組成物を特徴とする。別な一側面では、本発明は、ｒａｄＤＮＡによって形質転換した細胞を培地で培養して、蛋白質を発現させることを含むｒａｄ蛋白質の製造法を特徴とする。別の一側面では、本発明は、糖尿遺伝子生産物の不足または過剰を特徴とする疾患を有する動物（例えば、１型もしくは２型糖尿病に罹患したヒト、または実験動物、例えば、疾患もしくは障害のための動物モデル、例えばＮＯＤマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Zucker系脂肪過多ラット、またはストレプトゾトシン誘発ラット）を治療するための方法であって、治療的有効量の糖尿遺伝子生産物（不足の場合）、または糖尿遺伝子生産物の生産もしくは機能の阻害剤（過剰の場合）を該動物に投与する段階を包含する方法を特徴とする。別の一側面では、本発明は、治療効果を評価する方法であって、糖尿遺伝子の発現に対する治療を施し、かつ該治療の効果を評価することを含む方法を特徴とする。好適実施態様においては、治療は、動物、例えば、１型もしくは２型糖尿病に罹患したヒト；実験動物、例えば、疾患もしくは障害のための動物モデル、例えばＮＯＤマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Zucker系脂肪過多ラットまたはストレプトゾトシン誘発ラット、または糖尿遺伝子、例えば糖尿遺伝子ｒａｄの移入遺伝子を保有するトランスジェニックな動物；あるいは細胞、例えば、培養細胞、例えば培養筋細胞に施される。好適実施態様においては：糖尿遺伝子の発現は、２型糖尿病で増大され（かつ好ましくは１型糖尿病では増大されない）；糖尿遺伝子は、筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、クローンＦ２０８（下記を参照のこと）によってコード化されている遺伝子、または延長因子１αに対する遺伝子であり；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病では増大せず；糖尿遺伝子は糖尿遺伝子ｒａｄであり；糖尿遺伝子の発現は２型糖尿病で低下し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で増大し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で低下し；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病で増大する。別の一側面では、本発明は、被験者にグルコース関連障害、例えば糖尿病または肥満症のおそれがあるか否かを決定するための方法であって、非野生型の発現が危険性を示す、糖尿遺伝子の発現について被験者を検査することを含む方法を特徴とする。好適実施態様においては：糖尿遺伝子の発現は、２型糖尿病で増大し（かつ好ましくは１型糖尿病では増大しない）；糖尿遺伝子は、筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、クローンＦ２Ｄ６によってコード化されている遺伝子、または延長因子１αに対する遺伝子であり；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病では増大せず；糖尿遺伝子は糖尿遺伝子ｒａｄであり；糖尿遺伝子の発現は２型糖尿病で低下し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で増大し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で低下し；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病で増大する。別の一側面では、本発明は、被験者にグルコース関連障害、例えば糖尿病または肥満症のおそれがあるか否かを決定するための方法であって、その個体から得られた核酸試料を与えること、および糖尿遺伝子の構造が、それからの逸脱が危険性を示す野生型と異なるか否かを決定することを含む方法を特徴とする。好適実施態様においては、判定は、糖尿遺伝子が染色体の大きな再配置を有するか否かを、例えばブロット分析によって決定することを含み；決定は、糖尿遺伝子を配列決定することを含み；被験者はヒトであり；被験者はＮＯＤマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Zucker系脂肪過多ラット、またはストレプトゾシン誘発ラットである。好適実施態様においては：糖尿遺伝子の発現は、２型糖尿病で増大し（かつ好ましくは１型糖尿病では増大しない）；糖尿遺伝子は、筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、クローンＦ２Ｄ６によってコード化されている遺伝子、または延長因子１αに対する遺伝子であり；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病では上昇せず；糖尿遺伝子は糖尿遺伝子ｒａｄであり；糖尿遺伝子の発現は２型糖尿病で低下し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で増大し；糖尿遺伝子の発現は正常な個体で低下し；糖尿遺伝子の発現は１型糖尿病で増大する。別の一側面では、本発明は、障害または疾患状態、例えば、グルコース関連障害、例えば糖尿病もしくは肥満症のための動物モデルを評価する方法であって、該動物モデルの糖尿遺伝子が所定のレベルで発現しているか否かを決定することを含む方法を特徴とする。好適実施態様においては、所定のレベルは野生型または正常な動物でのレベルより低く；所定のレベルは野生型または正常な動物でのレベルより高い。別の一側面では、本発明は、糖尿遺伝子、例えば糖尿遺伝子ｒａｄを包含する移入遺伝子を有するトランスジェニックな齧歯類、例えばマウス、ハムスターまたはラットを特徴とする。好適実施態様においては、トランスジェニックな糖尿遺伝子は、遺伝子の突然変異形態、例えば欠失突然変異である。別の一側面では、本発明は、糖尿遺伝子を選別する方法であって、（ａ）糖尿病特異性ｃＤＮＡ分子について増強されたｃＤＮＡライブラリーを与えること；（ｂ）正常なｃＤＮＡ分子について増強されたｃＤＮＡライブラリーを与えること；および（ｃ）プローブを用いて、正常な増強されたｃＤＮＡと糖尿病の増強されたｃＤＮＡとをハイブリッド形成することを含む方法を特徴とする。正常な増強ライブラリーおよび糖尿病の増強ライブラリーに対するプローブの示差ハイブリッド形成は、糖尿遺伝子を示す。好適実施例においては、この方法は、段階（ｃ）からの示差ハイブリッド形成するあらゆるプローブを、糖尿病の個体からのＲＮＡ、および非糖尿病の個体からのＲＮＡに対してハイブリッド形成させて、示差ハイブリッド形成するプローブの示差発現を確認することも更に含む。実質的に純粋なＤＮＡは、本発明のＤＮＡがそれに由来する生物の天然に産するゲノムでは、そのＤＮＡと直接に隣接する双方のコード化配列（すなわち、５ ’末端のそれと３’末端のそれ）とは直接に隣接しないＤＮＡである。したがって、この用語は、例えば、ベクター；自発的に複製するプラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ；に組み込まれた、あるいは他のＤＮＡ配列とは無関係に、別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを包含する。それは、余分なポリペプチド配列をコード化しているハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。相同であるとは、二つのポリペプチド分子間の、または二つの核酸分子間の配列の類似性を指す。比較される二つの配列の双方における位置が、同じ塩基またはアミノ酸の単量体性サブユニットに占められているとき、例えば、二つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンに占められているならば、分子はその位置で相同である。２配列間の相同性は、この２配列による数多くの対合、またはこの２配列に共有される数多くの相同な位置の関数となる。例えば、２配列での１０ケ所のうち６ケ所の位置が対合し、または相同であるならば、２配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣとは、５０％の相同性を共有する。移入遺伝子（transgene）は、技巧を用いて細胞に挿入され、またはその細胞から発生する動物のゲノムの一部となるＤＮＡの一片として定義される。そのような移入遺伝子は、トランスジェニックな動物にとっては部分的または全体的に非相同であり得る。トランスジェニックな動物、例えばトランスジェニックマウスは、胚の一時期に、その動物または動物の祖先に導入された移入遺伝子を含有する細胞を有する動物である。ポリペプチドの実質的に純粋な調製物は、該ポリペプチドがそれとともに細胞内に天然に産する蛋白質を実質的に含まない調製物である。本発明は：正常および疾患状態でのグルコース代謝の基盤を、遺伝子の構造および遺伝子の発現のレベル（ｍＲＮＡまたは蛋白質）で探究すること；被験者にグルコース代謝関連障害、例えば、糖尿病、例えば２型糖尿病のおそれがあるか否かを決定すること；治療、例えば、グルコース代謝関連障害、例えば糖尿病の治療の効果を、糖尿遺伝子の発現のレベルで評価すること；動物モデルを、糖尿遺伝子発現のレベルで、該モデルがヒトの障害に似ているか否かに基づいて評価すること；ならびに研究に使用するためのトランスジェニックな動物、および遺伝的に変化した細胞系を製造することに有用である。本発明のその他の特徴および利点は、下記の説明および請求項から明らかとなるであろう。［詳細な説明］初めに、図面を簡単に説明する。図面図１は、本発明の選別方法の線図である。図２は、糖尿遺伝子発現の理論的パターンの線図である。筋の減数ライブラリーから得られたクローンの理論的複合ノーザンブロットの発現パターンは、下記のとおり：Ａ＝すべての糖尿病で低下する遺伝子；Ｂ＝すべての糖尿病で増大する遺伝子；Ｃ＝２型糖尿病でのみ過大に発現する遺伝子；Ｄ＝いくつかの、しかしすべてではない糖尿病または２型糖尿病で過小に発現する遺伝子；およびＥ＝集団中で可変的発現を伴う遺伝子。図３は、ヒトｒａｄのｃＤＮＡおよび推定されたアミノ酸の配列である。ライブラリーの作成正常および２型ｃＤＮＡライブラリーの作成正常な１個体および２型糖尿病の１個体からの骨格筋ｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。Sambrookら：Molecular Cloning：A Laboratory Manual、米国ニューヨーク、Cold Spring Harber Press （1989年）を参照のこと。ライブラリー構築に１個体のみを用いる決定は、２型糖尿病に存在し得る不均一性、および、この疾患における遺伝子発現の遺伝的に関連する変化が、試料をプールすることによって不明瞭になるとの懸念に基づいた。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いて調製し、ＥｃｏＲＩアダプターを用いてラムダＺａｐII（Stratagene社）内で結合した。ラムダＺａｐIIは、繊維状ファージの開始および終止配列に隣接されるB1uescriptに対するコード化配列を含有し、ヘルパーウイルスの存在下で、 Bluescript内の挿入断片の生体内での切除を可能にする。増幅されていない、および増幅されたライブラリーの力価は、糖尿病および正常筋試料について、それぞれ〜２ｘ１０⁶および〜２ｘ１０¹⁰であった。大規模ＲＮＡ抽出に充分な大きさの筋試料は、切断手術で得られ、液体窒素中で凍結し、イソチオシアン酸グアニジウム法を用いてＲＮＡを抽出した［Chomcy znskiら：Anal．Biochem．、第162巻（1987年）156〜159ページ］。患者の代謝状態に関する臨床データ、ならびに糖尿病の持続期間および存在し得るあらゆる合併症を記録した。ｍＲＮＡのいかなる分解も避けるために、筋試料を可能な限り迅速かつ清浄に得ることに多大の注意を払った。試料はすべて、四頭筋または腓腹筋のいずれかから、脚部の生存周縁から切り出した。ヒトでは、これらの筋は、赤色および白色線維とともに、異なるパターンの遺伝子発現を有し得る他の細胞型（特に血管細胞）からなる［Klip（1990年）］。減数法で個別的クローンを選別したことから、これらが実際に筋の生産物であり、糖尿病と非糖尿病との間の差異は、調べた筋の型の差異、または糖尿病の何らかの潜在的合併症、例えば尿毒症または感染症に起因しないことを確認することが根本的に重要であると思われる。筋の型および患者の病歴が既知であるノーザンブロットの選別には多数の試料を用いることになるため、これらの差異（ならびにヒトの遺伝的差異）の多くを検出しなければならない。正常ｃＤＮＡを増強したライブラリー、および２型特異性ｃＤＮＡを増強したライブラリーの作成その発現が２型糖尿病で増大または低下する遺伝子を同定する最初の段階として、Schweinfestらの方法［Schweinfestら：Genet．Anal．Techn．Appl．、第７巻（1990年）64〜70ページ］を変更し、かつInVitrogenを用いて、一方は正常ｃＤＮＡを増強し、もう一方は２型特異性ｃＤＮＡを増強した、二つの減数ライブラリーを作成した。全体的な実施方針の概略を図１に示す。最初に、Ｒ４０８ヘルパーファージを用いて、正常および２型糖尿病ｃＤＮＡライブラリーから一本鎖ＤＮＡを調製した。ポリエチレングリコール沈澱によって一本鎖ＤＮＡを単離し、反復したフェノール、クロロホルム−フェノールおよびクロロホルム抽出によって精製し、場合によっては、ＣｓＣ１勾配で更に精製した［Druguidら：Pro c．Natl．Acad．Sci．USA、第85巻（1988年）5,738〜5,742ページ］。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を用いて分析すると、ｓｓ−ＤＮＡは、ｓｓ−ｐ Bluescriptに変動する長さの挿入断片を加えた大きさの範囲を反映する、1.6〜4キロベースの幅広いバンドを移動させた。その上、ヘルパーファージを表す〜４キロベースの別個のバンドが存在した。全部で120〜150μｇのｓｓ−ＤＮＡが各ｃＤＮＡライブラリーから単離された。 Photoprobeというビオチン（Vector Laboratories）を用いて、約60μｇの各ｓｓ−ＤＮＡ調製物をビオチニル化した。具体的には、30μｇのＤＮＡを30μｌのＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、１分間音波処理し、３分間沸騰させて、ＤＮＡを剪断かつ変性させ、60μｌのPhotoprobeビオチンと混合し（0.5mg／m l）、そして10cmでの275Ｗの太陽灯からの光に15分間露出した。トリスＨＣ１の添加によって反応を消滅させ、２−ブタノルによる反復的抽出によって未反応ビオチンを除去した。ビオチニル化したＤＮＡは、エタノールで沈澱させ、ｄＨ₂ Ｏに再懸濁させた。正常筋で優先的に発現される遺伝子について増強されたライブラリーを作成するには、正常筋からの３μｇのｓｓ−ＤＮＡを、３μｇのポリＡおよびポリＣとともに正常筋からの30μｇのビオチニル化ｓｓ−ＤＮＡと混合し、ドライアイス上でエタノールを用いて共沈させた。得られたペレットを、10μｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁させ、等積の２倍にしたハイブリッド形成緩衝液（vitrogenに溶解）で希釈し、68℃で40〜48時間温置した。次いで、ストレプタビジンによる２回の抽出、およびVectrix Avidin（多糖類重合体にカップリングさせたアビジン）による１回の抽出を用いて、正常−糖尿病ＤＮＡのハイブリッドとならんで未ハイブリッド形成ビオチニル化「糖尿病」ＤＮＡを除去した。次いで、増強された正常ｓｓ−ＤＮＡを、同じプロトコルを用いて、第二巡の減数に付した。標識されたＤＮＡを用いた研究によれば、10倍の過剰量のＤＮＡによる２巡の減数は、両ライブラリーに共通するｃＤＮＡ種の〜95％の削減、および選ばれたｃＤＮＡの 20倍の増強を生起した。糖尿病の筋から得たｓｓ−ＤＮＡ、および正常筋ライブラリーからのビオチニル化ｓｓ−ＤＮＡを用いて、類似の方法で、糖尿病の筋で優先的に発現した遺伝子について増強された第二の減数ライブラリーを作成した。次いで、適切なプライマー（Ｔ３）およびオリゴマーヌクレオチドの混合物の存在下でのＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼとの温置によって、両減数ライブラリーを本鎖ライブラリーに転換した。１型糖尿病からのライブラリーも、正常または糖尿病の個体からの筋のライブラリーとともに、ランダムに開始させたｃＤＮＡを用いて作成することができる。１型ライブラリーは、その発現が２型糖尿病で特異的に変えられるｃＤＮＡを単離するのを助けるための２型ライブラリーでの引数として用いることができた。すべてのｃＤＮＡが同じ「相対的出発点」を有することから、オリゴｄＴライブラリーを用いると、減数は最も効率的である。（オリゴｄＴよりも）ランダムプライマーを用いて作成した正常筋ライブラリーは、オリゴｄＴライブラリーで検出されるクローンの完全な長さの配列を得るのに有用であると思われる。上記のとおり、ｃＤＮＡライブラリーは、ラムダＺａｐIIをＥｃｏＲＩアダプターとともに用いて構築することができる。１型の筋ライブラリーの利用可能性は、下記のとおりにして、追加的な減数ライブラリーおよび／または減数プローブの調製を可能にする。本明細書に記載の選別手法のそれ以上の変更は、選別のためにクローンを絞り込むのを助け、したがって、より重要なクローンを得ることができる。例えば、２型糖尿病が増強されたライブラリーは、非糖尿病の個体からのｓｓ−ＤＮＡ調製物ではなく、２型糖尿病のｓｓ−ＤＮＡ調製物に対する１型糖尿病のｓｓ−ＤＮＡ調製物を用いて減数を実施するならば、より容易に特異的な２型「糖尿遺伝子」が得られるものと思われる。加えて、減数の巡回数を増加して、糖尿病関連遺伝子に関するライブラリーを更に向上させること、および１型糖尿病が増強された減数用プローブを用いて、ドットブロットを更に選別すること（下記を参照のこと）を記載することができる。糖尿遺伝子の選別当初の選別の実施方針各減数ライブラリーのアリコート（１／40）を用いて、適格なＸＬ−１B1ue細胞（Stratagene）を形質転換させ、アンピシリン、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧで強化した培地に塗抹した。「正常増強」ライブラリーについては、ライブラリーのこのアリコートは約700のコロニーを形成した；「糖尿病増強」ライブラリーについては、このアリコートは約450のコロニーを形成した。したがって、算出されたライブラリーサイズは、「正常」および「糖尿病」増強ライブラリーについて、それぞれ〜28,000および〜18,000である。両事例において、コロニーの約87％は、挿入断片の存在を示す白色であった。BioTransナイロン膜（ＩＣＮ）を用いて、二重のコロニーリフトを細胞の各ディッシュから作成した。一方のリフトは、正常ＲＮＡから調製したｃＤＮＡプローブに、他方は、糖尿病ＲＮＡから調製したｃＤＮＡプローブにそれぞれハイブリッド形成させた［Sambrook（1989年）］。問題の約30コロニーが、示差ハイブリッド形成によって正常増強ライブラリーのアリコート中に確定され、示差ハイブリッド形成によって19コロニーが、糖尿病増強ライブラリーのアリコート中に同定された。次いで、これらのそれぞれを摘出し、５mlのミニプレプ培地に拡大した。ＤＮＡは、Maniatasの方法［Sambrook（1989年）］を用いて単離し、ＥｃｏＲＩによる制限消化に付し、0.7％アガロースでの電気泳動によって分析した。ほとんどすべての単離物が、大きさが0.4〜２キロベースの範囲の挿入断片を含んでいた。これらの制限消化物のゲルは、二重に調製し、正常および糖尿病ＲＮＡ試料からのｃＤＮＡプローブを用いた示差選別の追加の巡回のために、サザンブロット法に付した。いくつかの挿入断片は、プローブの双方と良好にハイブリッド形成し、いくつかは、両プローブと貧弱にハイブリッド形成し、そしていくつかは、これらが２種類の筋試料中で示差的に発現される遺伝子を真に示していることを示唆する示差ハイブリッド形成を示した。予備実験から、この方法の最も困難かつ時間消費的な部分は、問題のクローンについての減数ライブラリーの選別である。減数ライブラリー分析の主要な制約のうち二つは、既に暗示されているが、それらは、（ａ）最も豊富なｃＤＮＡ種のいくらかを完全に除去する手順の失敗、および（ｂ）この取組み方による非常に稀な伝達情報の同定の困難性である。２巡（または３巡さえも）の減数は、共通の伝達情報（減数クローンの少なからぬ百分率を依然として占める）を排除し得ないことがあり、問題の伝達情報のうちいくらかは豊富ではないことがあり得る可能性が極めて高い（例えば受容体または発信分子）。これらの問題を克服するのを助けるため、減数されたプローブを用いて、ライブラリーのコロニーの複製ドットブロットを分析することによって、選別の実施方針を下記のとおりに変更した［Tindallら：Biochemistry、第27巻（1988年）6,008〜6,013ページ；Erl ich：PCR Technology： Principles and Applications for DNA Amplifications 、米国ニューヨーク、M. Stockton Press（1989年）］。改良されたドットブロット選別実施方針当初の選別過程の際に、この方法の適用を限定し、偽陽性とならんで偽陰性も生起するように思われるいくつかの技術的問題が同定された。第一に、ただ１枚のプレートから二重のコロニーリフトを形成することができるが、それらは、フィルターに付着するコロニー（したがってまたＤＮＡ）の量に関して極めて変動し得る傾向がある。ビロードの鋳型を用いて、ディッシュを複製かつ塗抹することは、再現性を多少とも向上させたが、依然として最適に達しなかった。第二に、細菌のプレートは、長期間の貯蔵に最適ではなかった。陽性の候補を同定し、摘出した後、プレートは、４℃で数週間保存することはできたが、数か月間保存したならば、劣化し、または汚染を示す傾向があった。したがって、摘出したコロニーに関して以外は、ライブラリーは、その後の選別から除外された。第三の問題は、全ｃＤＮＡプローブを用いた選別は、より豊富なｍＲＮＡ種に差異を見いだすことに有利であるため、示差的に発現され、代謝上重要な種を表している可能性がある、ライブラリー中の稀なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を同定することが示差選別には不可能なことである。第四の問題は、前記の二つの問題に関連して、摘出されないクローンは長期間貯蔵できないことから、真に示差的に発現された稀なｍＲＮＡを表すｃＤＮＡを検索するためにライブラリーに復帰することが不可能なことであった。これらの問題を克服するのを助けるため、良好な二重のフィルター、すべてのコロニーの長期間の貯蔵、および豊富度が低いＤＮＡに対する改良された感度を与えるコロニー選別の実施方針を開発した。したがって、形質転換後は、滅菌した爪楊技を用いて各コロニーを摘出し、96穴プレートのただ１ウエルのみに接種することとした。最初の増殖後は、この「記録文書」プレートの複製を、96穴複製器のビーズ付きの蓋（FAST system 、Falcon）を用いて、プレートの各ウエルからの細菌細胞を接種することによって実施した。次いで、記録文書プレートのウエルを、20％グリセリンという最終濃度まで希釈し、プレートを−70℃で貯蔵した。二重のドットブロットは、ドットブロットマニホールドおよびBioTransナイロン膜（ＩＣＮ）を用いて、（感染した細菌を高密度にまで増殖させた後に）コピープレートから作成した。稀な伝達情報を同定する際の困難を克服するためには、減数されたプローブを用いて、減数されたライブラリーのドットブロットを選別する方法を開発した。鋳型としての減数ライブラリーのそれぞれのｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡの小アリコートで開始して、ＳＫおよびＫＳプライマーを用いた（すべての挿入断片がｐ Bluescriptに存在することから）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、減数されたプローブを調製した。時間および濃度の適正な条件下で、大きさが２キロベースまでの挿入断片の非常に高能率の増幅を得る際の困難は皆無であり、次いで、これらをＥｃｏＲＩを用いて切断して、ポリリンカーを除去することができ、高い比活性の減数されたプローブを与えるために、ランダムな開始標識のための鋳型として用いた。ポリリンカーの何らかの標識によって生起されたバックグラウンドを最小化するために、ＫｐｎＩで消化された非標識ｐ B1uescriptＤＮＡをハイブリッド形成緩衝液に加えるか、またはスピンカラムを用いて、ポリリンカーをＥｃｏＲＩ消化物から除去した。「正常な」減数されたプローブとハイブリッド形成した「糖尿病増強」コロニー、および「糖尿病の」減数されたプローブから、二重のドットブロット（右側）を作成した。非常に良質の複製フィルターが得られた。糖尿病プローブによって強い陽性であり、正常なプローブによって陰性であるクローンが見いだされた。一つの減数ライブラリーの約１／６（これは、「正常な」増強ライブラリーからの〜2,000のコロニー、および糖尿病増強ライブラリーからの〜1,700のコロニーを表す）の選別の結果、示差的に発現すると思われた23の正常なコロニーおよび21の糖尿病のコロニーが得られた。これらの約半数（11の正常および10の糖尿病）は、高度に陽性であると見なされ、プラスミド調製物に挿入断片を有していた。加えて、この最初のふるい上で、各ライブラリーからの約190および140のコロニーは、可能な示差発現を判定するには低過ぎる信号を双方のフィルター上で与えた。これらは、おそらく、示差的に発現され得るか、またはされ得ないが、代謝の観点からは最も興味深いｃＤＮＡのいくつかを表している可能性がある、より豊富でないｍＲＮＡを表していると思われる。すべてのコロニーが記録文書プレートに蓄えられていることから、ここで、新鮮な二重のドットブロットフィルターを作成して、これらのより豊富でないｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを分析することが可能であると思われる。挿入断片に関する示差クローンおよびノーザンブロットによる示差発現の分析減数されたプローブを用いたドットブロット上での同定に続き、候補クローンのそれぞれを30m1の培養に拡大し、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いた制限消化によって単離かつ分析した。これによって、電気泳動による分析に充分なＤＮＡ、および４回のノーザンブロットおよび配列分析までの標識のための精製挿入断片か得られた。挿入断片は、大きさに0.4〜2.0キロベースまでの幅があり（表１）、アガロースゲル電気泳動およびGene Clean IIを用いて精製した。これらの減数ライブラリーの最初の特徴付けの最も重要な段階は、これらの仮想的な示差クローンのいずれが遺伝子発現における「糖尿病関連の」変化を真に表しているか、いずれが単に個別的な変異に起因するのか、そしていずれが１型に対比される２型糖尿病に特異的であるのかを判定することである。このために、数人の正常および糖尿病の個体（２型および１型の双方）からのＲＮＡ試料（20μｇ）を用いて選別用ノーザンブロットを作成した。これらのブロットは、示差コロニーの単離された挿入断片から調製されたランダムに開始されたプローブを用いて、ハイブリッド形成して、発現の真のパターンを判定することができる。発現の各種の予測されたパターンを示す模式図を図２に示す。５形式のパターンが予測され、この模式図に示されている。いくつかのプローブは、選別の早期の段階で示差的特性を示しているにもかかわらず、示差ハイブリッド形成を示すことに失敗するものと思われる（パターンＥ）。これらは、集団中で可変であるｍＲＮＡ、または減数によって除去されなかったが、真に示差的に発現されていない豊富なｍＲＮＡを表す。他のプローブは、正常なものの中で優先的に発現された伝達情報（パターンＡ）、１型および２型糖尿病の双方で優先的に発現されたｍＲＮＡ（パターンＢ）、またはいくつかの、もしくはすべての２型糖尿病でのみ優先的に発現されたＲＮＡ（パターンＣおよびＤ）を認識した可能性がある。これらのパターンは、その発現が糖尿病のすべての患者で変化した可能性があるｍＲＮＡ種を同定する助けとなり、このことは、専らインシュリンの欠乏に起因し、そのため、主として１型糖尿病で発現されるか、またはインシュリン耐性に起因し、主として２型糖尿病で発現される、遺伝子発現の差異に対比される何らかの全般的な代謝的変化を表す。いくつかのクローンは、発現が制御、または他の代謝的もしくは遺伝的変動要因のレベルに関連しているならば、糖尿病での様々な発現を示すものと予測された。ノーザンブロットの段階で研究された当初の２１クローンのうち、２個は正常なもので増強され（例えばクローンＧ５Ｎ７）、７個は糖尿病で増強されていた（クローンＢ１０Ｄ６およびＣ９Ｄ６）（表１を参照のこと）。クローンＢ１０Ｄ６は、クローンｒａｄが専ら２型糖尿病で過大に発現される種を表しているのに対し、すべての糖尿病で優先的に過大に発現されるｍＲＮＡ種を表していると思われることに注目されたい。選別でのこれまでのすべての努力にもかかわらず、約30％のクローンは、この段階で非示差的であった。糖尿病関連クローンの特徴付け上記のノーザン分析によって「糖尿病関連」パターンの一つを示すクローンがいったん同定されたならば、特徴付けは、配列決定、ＤＮＡおよび蛋白質配列を知るための相同性または同一性についての遺伝学のデータバンクとの比較、ヒトおよび齧歯類の組織での発現パターンの解析、ならびに、究極的には、蛋白質の発現および機能の研究のための抗ペプチド抗体の製造を包含する。そのようなクローンの数に応じて、それらの評価に優先順位をつけることが望ましいと思われる。優先順位付けは、選別用ノーザンブロットで得られた情報に大きく依存するであろう。最高の優先順位は、所定の分類群、例えば、発現の最大の示差レベルを示すクローンにおいて２型糖尿病でのみ示差的に発現するクローン（例えば表１のクローンＣ９Ｄ６）の分類群に与えることができる。最初にＴ３およびＴ７プライマーを用いることによって、クローンは、Sequen ase（United States Biochemicals）を用いて両方の鎖について配列決定することができる。完全なｃＤＮＡ配列の構築を可能にするために、好都合な間隔を置いて選ばれた別の特異的なプライマーを用いることができる。ほとんどの挿入断片は、完全な長さのクローンを表すことはないと思われ、したがって、関心が持たれるクローンの全長の配列を得るには、始原ライブラリー、および関連するｃＤＮＡについてランダムに開始された筋ｃＤＮＡのライブラリーを選別し、次いで、これらを配列決定することが必要となるであろう。すべての配列は、ＥＵＧＥＮＥおよびＳＡＭプログラムを用いて分析されなければならない。示差クローンの配列決定および同定上記の選別からの潜在的陽性のクローンを、30m1の培養に拡大し、Qiagenミニプレプカラムを用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。次いで、ＥｃｏＲＩを用いてＤＮＡを消化し、上記のアガロースゲル電気泳動を用いて挿入断片の大きさを決定した。次いで、単離されたＤＮＡから、Ｔ３およびＴ７プライマーならびにSequenase（United States Biochemicals）を用いて、部分的な配列データを得た。挿入断片の大きさ、示差発現および配列データの要約を表１に示す。ここまでは、限定された配列データは、９クローンに対して入手可能であり、それらのすべてが、ＳＡＭおよびＥＵＧＥＮＥプログラムを用いて、既知のＤＮＡおよび蛋白質配列について遺伝学データバンクに対して比較されている。過大に発現されたクローンのうち２種は、糖尿病においてはＲＮＡレベルで従来研究されなかった代謝酵素を表している。一方（Ｂ１Ｄ４）は、ラット筋グリコーゲンホスホリラーゼと96％相同であり；他方（Ｂ１０Ｄ６）は、ヒト延長因子１αと＞95％同一である。糖尿病における発現の中程度の低下を示す２クローンは、豊富な筋蛋白質であるミオシンおよびミオグロビンと100％の相同性を有する。最後に、異なって発現されたクローンのうち３種は、遺伝子銀行では全く対合を示さない。しばしば観察される「偽陽性」のうち２種も、情報を求めて配列決定した。一方は、部分的に複製されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（大腸菌）が、何らかの遺伝子再配置のために挿入断片として作用していたBl uescriptクローンとして、また他方はAlu配列として同定された。他の種における糖尿遺伝子糖尿遺伝子は、上記のと類似の方法によって、他の種から単離することができる。代替的に、いったん最初の種、例えばヒトで単離されたならば、糖尿遺伝子は、当業者には公知である方法によって、第二の種から単離することができる。例えば、マウスの糖尿遺伝子ｒａｄは、ヒトの糖尿遺伝子ｒａｄと相同なプローブを用いてマウスｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを探ることによって単離することができる。ヒトの糖尿遺伝子ｒａｄクローンＣ９Ｄ６（上記のとおりに単離された）は、以前は未知であったヒトの遺伝子ｒａｄに対応する。糖尿遺伝子ｒａｄの発現は、ＮＩＤＤＭの患者で増大するが、ＩＤＤＭの患者ではそうではない。正常な３例、１型糖尿病の２例および２型糖尿病の５例のノーザンブロット分析を実施した。２型糖尿病５例のうち４例は、１型糖尿病および非糖尿病の個体と比較して、この興味深い遺伝子のためのｍＲＮＡの顕著な増加を示す。この結果は、他のブロットでも再現可能であった。ｒａｄのＤＮＡ配列（および推定されるアミノ酸配列）を図３に示す（配列認識番号１、SEQ ID NO:1 ）。ｒａｄ遺伝子の配列は、Met¹²²およびMet²⁴¹で開始コドンを含む。いずれの部位で始まる蛋白質（およびそれらをコード化しているＤＮＡ配列）も本発明の範囲内であるが、生体内での開始部位はMet²⁴¹に存在すると考えられる。この配列は、遺伝子銀行の公知のいかなる配列とも対合しないが、一つの領域は、公知の転写因子との相同性を示唆するいくつかの特徴を有する。クローン化された配列は、発現系で発現させて、組換えｒａｄポリペプチドを得ることができる。当業者には公知である方法によって、抗体、好ましくは、糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質に対抗させた、より多くのクローナル抗体を製造することができる。他のヒト糖尿遺伝子上記の方法によって単離されたいくつかの糖尿遺伝子は、既知の機能を有する既知の遺伝子に対応する。これらの遺伝子または配列のうち３種類、筋グリコーゲンホスホリラーゼ（クローンＢ１Ｄ４に対応）、ヒト延長因子１α（クローンＢ１０Ｄ６に対応）、ならびにシトクロム酸化酵素およびいくつかの転移ＲＮＡをコード化しているヒトミトコンドリアゲノムの断片（クローンＦ２Ｄ８に対応）の発現は、１型および２型糖尿病で上昇することが示されている。クローンＢ１Ｄ４は、ヒトの筋グリコーゲンホスホリラーゼを表すことが示されている。グリコーゲン代謝のこの重要な酵素に対するｍＲＮＡは、１型および２型双方の糖尿病の骨格筋で増加し、ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットでも増加する。組織培養での筋細胞系（Ｌ６）における、インシュリンおよびグルコースの双方によるこの遺伝子の調節の研究は、これらの変化を蛋白質および酵素活性の変化と相関させることになるであろう。グリコーゲンホスホリラーゼにおけるこれらの変化は、糖尿病で観察されるグリコーゲン合成活性の変化に寄与する可能性がある。クローンＢ１０Ｄ６は、ヒトの延長因子１α（ＥＦ１α）として同定されている。これはＧＴＰ結合蛋白質であって、蛋白質合成およびリボソーム形成の初期段階で決定的に重要な役割を果たすが、糖尿病におけるその調節は、未だに研究されていない。追加的なノーザンブロット分析では、伝達情報のレベルは、１型および２型双方の糖尿病の個体の筋では、正常なそれと比較して５〜10倍に上昇することが示されている。以前に膵臓移植を受けたことがある１型糖尿病の一個体からの筋試料では、ＥＦ１αのレベルは、正常値に向けて低下することも示されている。ＥＦ１αの伝達情報は、ストレプトゾシンによる糖尿病ラットの筋および肝臓でも増加するが、ｏｂ／ｏｂマウスの筋ではそうではないことが示されている。クローンＦ２Ｄ８は、１型および２型双方の糖尿病で増加することが以前に同定された。このクローンの事前の配列分析は、シトクロム酸化酵素およびいくつかの転移ＲＮＡをコード化しているヒトのミトコンドリアゲノムの断片と97％同一であることを示している。ミトコンドリア遺伝子の伝達の欠陥に関連付けられる糖尿病の一形態に罹患した患者の非常に最近の記載に照らして、この所見は非常に興味深い。使用本発明のペプチドは、生物分解可能な、生体適格である重合体を用いた徐放配合物として、またはミセル、ゲルおよびリポゾームを用いた部位指向送達もしくはトランスジェニックな様式によって、従来からの様式の一つ（例えば経口的、非経口的、経皮的または経粘膜的）で動物、特にヒトに投与し得る。その他の実施態様一つまたは一組の糖尿遺伝子の発現のレベルは、正常な、実験的に擾乱した、または疾患状態の代謝の研究に用いることができる。例えば、治療、例えば薬物の投与の効果は、糖尿遺伝子の発現に対するその効果によって調べることができる。この取組み方は、治療を最適化もしくは監視すること、または新規治療、例えば新薬の発見もしくは評価を支援することに用いることができるであろう。治療、例えば薬物の投与の効果は、動物、例えばヒトで、または実験動物、例えば、トランスジェニックな動物、例えば突然変異性糖尿遺伝子ｒａｄという移入遺伝子を有するトランスジェニックな動物、または「糖尿病モデル」である動物、例えばＮＯＤマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Zucker系脂肪過多ラットもしくはストレプトゾトシン誘発ラットで；あるいは培養細胞または組織での糖尿遺伝子ｍＲＮＡもしくは蛋白質のレベルに対するその効果によって評価することができるであろう。有用な治療法は、例えば、糖尿遺伝子の発現を野生型の方向に移行させるようなそれであると思われる。糖尿遺伝子の発現パターンは、望ましいモデルが所定のパターンの糖尿遺伝子発現、例えば、ヒトの疾患状態に見られるそれに類似するパターンを有する、新規の、または既存の動物糖尿病のモデルを評価するのに用いることもできるであろう。同様に、遺伝子、例えば、グルコース代謝に関与する遺伝子における突然変異の効果は、野生型と突然変異の細胞、例えば細胞系、または野生型と突然変異の生物における糖尿遺伝子の発現を比較することによって調べることができるであろう。糖尿遺伝子をコード化している核酸を用いて、細胞を形質転換することができる。例えば、糖尿遺伝子ｒａｄ、例えば遺伝子の突然変異形態、例えば欠失を用いて細胞を形質転換し、細胞のゲノムの糖尿遺伝子ｒａｄの複写が、形質転換した遺伝子によって置換されている細胞を生産して、例えば遺伝子の複写が欠失した細胞を生産するのに用いることができる。この取組み方を培養で増殖することが可能な細胞、例えば培養筋細胞で用いて、遺伝子の機能を調べることができる。糖尿遺伝子、例えば、糖尿遺伝子ｒａｄ、例えば遺伝子の突然変異形態、例えば欠失を用いて細胞を形質転換し、次いで、それがトランスジェニックな動物を生起するようにすることができる。この取組み方は、例えば、遺伝子の複写が、例えば欠失によって不活性化されているトランスジェニックな動物を創出するのに用いることができる。同型接合のトランスジェニックな動物は、創始者であるトランスジェニックな動物の子孫間の交配によって製造することができる。遺伝的に変化した細胞系をトランスジェニックな動物から作成することができる。そのような動物および細胞系は、研究に有用であろうと思われる。一つまたは一組の糖尿遺伝子の発現のパターンは、糖尿病または他の障害のおそれがある人間の診断に用いることができるであろう。これは、糖尿遺伝子ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現を監視することによって達成できるであろう。例えば糖尿遺伝子ｒａｄは、２型糖尿病の個体においては、１型糖尿病の、または正常な個体におけるより高度に発現され、したがって、その発現を、２型糖尿病の危険性を診断する手段として用いることができるであろう。グルコース関連障害のおそれがある個体は、糖尿遺伝子に構造的欠陥を有することによって同定することができる。例えば、ある個体からの核酸を、染色体の大きな再配置、例えば欠失、挿入もしくは転座、またはフレームシフト、あるいは糖尿遺伝子における点突然変異について、ブロットまたは配列分析を用いて分析することができる。たとえ決定的に重要な糖尿遺伝子の傷害が特徴付けられていないとしても、遺伝子の読み枠を変化させたいかなる大きな再配置、またはいかなる傷害も、機能を変化させる可能性は高いであろう。糖尿遺伝子ｒａｄの場合、発現を増大させる可能性があるいかなる傷害も、疾患状態を誘導する可能性が高い。本発明は、糖尿遺伝子の機能を阻害する調製物および／またはその生産物、例えば抗体もしくはアンチセンス核酸も包含する。本発明は、図３（配列認識番号１）に記載の糖尿遺伝子ｒａｄによってコード化されている蛋白質、または糖尿遺伝子ｒａｄもしくは糖尿遺伝子ｒａｄのフラグメントに実質的に相同であるあらゆる蛋白質はもとより、他の天然に産する糖尿遺伝子をも包含する。やはり包含されるのは：対立遺伝子の変異；自然突然変異体；誘発突然変異体、例えば生体外で誘発された欠失；高度または低度に厳重な（例えば、少なくとも40ヌクレオチドのプローブ長を有して、２ｘＳＳＣで40 Ｃで洗浄する）条件下で、天然に産する核酸とハイブリッド形成するＤＮＡによってコード化された蛋白質［高度および低度の厳格性の定義については、引用によってここに組み込まれる、Current Protocols in Molecular Bio1ogy、米国ニューヨーク、John Wiley & Sons 社（1989年）6.3.l〜6.3.6を参照のこと］；および糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質に対する抗血清によって、特に糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質の活性部位または結合領域に対する抗血清によって特異的に結合するポリペプチドもしくは蛋白質がある。この用語は、糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質を含むキメラのポリペプチドも包含する。本発明は、糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質の生物学的に活性であるあらゆるフラグメントまたは類似体も包含する。「生物学的に活性である」という表現によって、該糖尿遺伝子蛋白質に特徴的である生体内または生体外のいかなる活性をも保有することを意味する。好適な類似体は、その配列が保存的アミノ酸置換、例えば同じ分類群の一つのアミノ酸ともう一つとの（例えばバリンとグリシンとの、アルギニンとリジンとのなど）置換においてのみ、あるいは、ポリペプチドの生物学的活性を破壊しない一つまたはそれ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは挿入においてのみ野生型と異なる、糖尿遺伝子ｒａｄ類似体（または生物学的に活性であるそのフラグメント）を包含する。好適な類似体は、ぺプチドの安定性を増大させること目的として修飾された糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質（または生物学的に活性であるそのフラグメント）も含有し；そのような類似体は、例えば、該ペプチド配列中の一つまたはそれ以上の不飽相ペプチド結合もしくはＤ−アミノ酸を含み得る。類似体は、アミノ酸配列の差異、または配列に影響しない修飾、またはその双方において天然に産する糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質と異なることができる。本発明の類似体は、一般に、天然に産する糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質の配列の全部もしくは一部との少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％または99％までもの相同性を示す。比較配列の長さは、一般に、少なくとも20アミノ酸残基であり、好ましくは40アミノ酸残基を上回る。修飾、またはポリペプチドの生体外の化学的誘導体化は、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。やはり含まれるのは、グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンを、その合成および加工の際に、またはその後の加工段階で修飾すること、例えば、そのような加工を正常に与える細胞に由来する酵素、例えば哨乳類のグリコシル化酵素に影響するグリコシル化にポリペプチドを曝すことによってなされるそれらである。やはり包含されるのは、リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニンを有する同じアミノ酸の一次配列の改訂物である。類似体は、天然に産する糖尿遺伝子ｒａｄの蛋白質とは、それらの一次配列の変更において異なることができる。これらは、自然および誘発の双方の遺伝的変種を含む。やはり含まれるのは、天然に産するＬ− アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然産もしくは合成アミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸である。代替的に、ペプチド分子の環化によって、増大した安定性を与えてもよい。実質的に完全な長さであるポリペプチドに加え、本発明は、ポリペプチドの生物学的に活性であるフラグメントも包含する。ここに用いられる限りで、「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに適用される限り、通常、少なくとも約 10の隣接するアミノ酸、代表的には少なくとも約20の隣接するアミノ酸、より代表的には少なくとも約30の隣接するアミノ酸、通例として少なくとも約40の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも約50の隣接するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約60〜80またはそれ以上の隣接するアミノ酸の長さであろう。糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質は、当業者には公知である方法によって生成することができる。候補であるフラグメントが糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質の生物学的活性を示し得る能力は、当業者には公知である方法によって評価することができる。やはり包含されるのは、ポリペプチドの生物学的活性には不要である余分なアミノ酸、または代替的なｍＲＮＡのスプライシング、もしくは代替的な蛋白質加工の事象の結果として得られる余分なアミノ酸をはじめとする、蛋白質の加工の際に通常除去されるアミノ酸を含む糖尿遺伝子ｒａｄ蛋白質のポリペプチドである。本発明は、本発明のポリペプチドをコード化している核酸も包含する。その他の実施態様は下記の請求項の範囲内にある。（２）配列番号に関する情報１：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：1,443 （Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｍ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．ｒａｄをコード化している配列を含む精製されたＤＮＡ。２．ｒａｄをコード化しているＤＮＡ配列を含むベクター。３．請求項１記載の精製されたＤＮＡを含有する細胞。４．ｒａｄによってコード化されているポリペプチドの実質的に純粋な調製物。５．ｒａｄに対抗させた抗体の精製された調製物。６．糖尿遺伝子ｒａｄの蛋白質の製造法であって、請求項３記載の細胞を培地中で培養して、該蛋白質を発現させることを含む製造法。７．糖尿遺伝子生産物の欠乏を特徴とする疾患の治療用組成物を調製するための糖尿遺伝子または糖尿遺伝子生産物。８．糖尿遺伝子生産物の過剰を特徴とする疾患の治療用組成物を調製するための糖尿遺伝子の生産物または糖尿遺伝子の機能の阻害剤。９．治療の効果を評価する方法であって、糖尿遺伝子発現の生産物を用いて、該治療を施すこと、および糖尿遺伝子の発現に対する該治療の効果を評価することを含む方法。 10．治療が、ＮＯＤマウス；ｏｂ／ｏｂマウス；ｄｂ／ｄｂマウス；Zucker系脂肪過多ラット；ストレプトゾシン誘発ラット；または培養された細胞、例えば培養された筋細胞に施される請求項９記載の方法。 11．糖尿遺伝子が、筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、ヒト延長因子１αに対する遺伝子、糖尿遺伝子ｒａｄ、またはクローンＦ２Ｄ８における遺伝子である請求項９記載の方法。 12．被験者に糖尿病または肥満症のおそれがあるか否かを決定する方法であって、糖尿遺伝子発現の生産物を用いて、非野生型の発現が危険性を示す糖尿遺伝子の発現について該被験者を検査することを含む方法。 13．糖尿遺伝子が筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、ヒト延長因子１αに対する遺伝子、糖尿遺伝子ｒａｄ、またはクローンＦ２Ｄ８における遺伝子である請求項３記載の方法。 14．被験者に糖尿病のおそれがあるか否かを決定する方法であって、該個体からの核酸試料を与えること、および糖尿遺伝子発現の生産物を用いて、糖尿遺伝子の構造が野生型と異なるか否かを決定することを含む方法。 15．糖尿遺伝子が、筋グリコーゲンホスホリラーゼに対する遺伝子、ヒト延長因子１αに対する遺伝子、糖尿遺伝子ｒａｄ、またはクローンＦ２Ｄ８における遺伝子である請求項14記載の方法。 16．動物モデルを障害または疾患状態について評価する方法に有用である組成物の製造に有用である糖尿遺伝子発現の生産物であって、該方法が該動物モデルにおける糖尿遺伝子が所定のレベルで発現されるか否かを決定することを含む生産物。 17．糖尿遺伝子ｒａｄを含む移入遺伝子を有するトランスジェニックな齧歯類。 18．糖尿遺伝子について選別する方法であって、（ａ）糖尿病特異性ｃＤＮＡ分子について増強されたｃＤＮＡライブラリーを与えること；（ｂ）正常なｃＤＮＡ分子について増強されたｃＤＮＡライブラリーを与えること；および（ｃ）該正常増強および該糖尿病増強ｃＤＮＡライブラリーを、該正常増強および該糖尿病増強ライブラリーに対するその示差ハイブリッド形成が糖尿遺伝子を示すプローブを用いてハイブリッド形成することを含む方法。