JP2003512852A

JP2003512852A - インスリン非依存性糖尿病のコンジェニック動物モデル

Info

Publication number: JP2003512852A
Application number: JP2001534334A
Authority: JP
Inventors: エル．ホールゲルリュシュマーン，; エル．ゲー．ヨアキンガリ，
Original assignee: アレキスアーベー
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2003-04-08
Also published as: CA2389852A1; AU780146B2; US20020035733A1; WO2001032126A3; AU780146C; US6465714B2; AU1322201A; EP1228094A2; WO2001032126A2

Abstract

(57)【要約】ＩＩ型糖尿病関連表現型を有するコンジェニック動物および動物集団が記述される。ＩＩ型糖尿病関連表現型と関連するアミノ酸置換を有するインスリン分解ポリペプチドも記述される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示す非ヒトコンジェニック動物およびコ
ンジェニック動物集団、ならびにＩＩ型糖尿病関連表現型を与える置換を含むイ
ンスリン分解ポリペプチドに関する。

【０００２】発明の背景ＩＩ型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、年老いた生
理学的不活性の太りすぎの個人に関連するため、老年人口を持つ都市化社会で増
加している健康負担である。全世界でおよそ１億３５００万人の人々が影響を受
けており、したがって、心筋梗塞、発作、末期腎疾患、色覚異常、および神経疾
患に対するリスクを増加させる。

【０００３】一般的に、本疾患は、標的組織でのインスリン活性の減損、および膵臓β−細
胞からのインスリンの分泌能力の減少の結果であるとされている。多くの家族お
よび双子試験によって、環境因子の重大な影響ならびにＩＩ型糖尿病に対するリ
スクに関する遺伝的因子の相当な影響が示された。遺伝の常染色体優性モード（
ＭＯＤＹ）を伴う糖尿病の一遺伝子性変異体または糖尿病のミトコンドリア遺伝
が、分子および臨床レベルにおいて最近記述されている。しかしながら、本疾患
の一般的な型は、多遺伝子的および環境要因の両方の影響を伴った多くの要因か
らなるように見える。

【０００４】発明の概要本発明は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を有する、コンジェニック動物およびコン
ジェニック動物集団の発展に基づくものである。コンジェニック動物種の発展に
より、定量的形質座（ＱＴＬ）内で増加している感受性遺伝子を同定すること、
ならびにそのような遺伝子の病理生理学的関連を特徴付けすることが可能である
。本発明のコンジェニック動物はＩＩ型糖尿病関連表現型を有するため、本明細
書に記載のインスリン分解酵素の変異体のような、関連遺伝子が位置的にクロー
ン化できるように、遺伝子微細マッピングもまた実施することができる。さらに
、コンジェニック種およびヘテロ接合戻し交配動物の生理学的特徴付けは、複合
表現型の病理生理に対する単一ＱＬＴの寄与に関する道標を提供する。本発明の
Ｎｉｄｄｍ１コンジェニック種は、本疾患の病理生理学的機構を明らかにしうる
、穏やかなＩＩ型糖尿病に関する特定の動物モデルを提供し、薬理学的薬剤をス
クリーニングするツールを提供する。

【０００５】一方の側面において、本発明は、ドナー動物およびレシピエント動物の遺伝的
物質を含む非ヒトコンジェニック動物を特徴とする。コンジェニック動物はＩＩ
型糖尿病関連表現型を示し、コンジェニック動物ゲノムの約１未満のクロモソー
ム（例えば約５０ｃＭ未満、２０ｃＭ未満、１０ｃＭ未満、または５ｃＭ未満）
がドナー動物から由来し、ドナーからの遺伝物質が、コンジェニック動物中での
ＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要である。コンジェニック動物は、マーカー
で定義できる。コンジェニック動物の実質的にすべてのミトコンドリアは、レシ
ピエント動物またはドナー動物いずれかから由来する。ＩＩ型糖尿病関連表現型
は、食後血糖の増加、高血圧、グルコース不耐性、インスリン耐性、異常インス
リン分泌、インスリン活性減少、体重減少、異脂肪血症、高インスリン血漿、脂
質生成障害、グリコーゲン代謝変化、凝固アテローム性動脈硬化症変化、腎機能
変化、神経機能変化、眼機能変化、肥満および炎症からなる群より選択できる。

【０００６】ドナー動物のゲノムは、Ｎｉｄｄｍ１ａゲノム区画を含むことができる。ドナ
ー由来のコンジェニック動物ゲノムはＮｉｄｄｍ１ａ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｎｉｄ
ｄｍ１ｃ、Ｎｉｄｄｍ１ｄ、Ｎｉｄｄｍ１ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｆ、Ｎｉｄｄｍ１ｇ
、Ｎｉｄｄｍ１ｈ、およびＮｉｄｄｍ１ｉからなる群より選択したゲノム区画を
含むことができる。例えば、ゲノム区画は、Ｎｉｄｄｍ１ｅゲノム区画であり得
る。また、ドナー由来のコンジェニック動物ゲノムはＮｉｄｄｍＣ２、Ｎｉｄｄ
ｍＣ３、ＮｉｄｄｍＣ５、ＮｉｄｄｍＣ７、ＮｉｄｄｍＣ９Ａ、ＮｉｄｄｍＣ９
Ｂ、ＮｉｄｄｍＣ１０、ＮｉｄｄｍＣ１１、ＮｉｄｄｍＣ１３、ＮｉｄｄｍＣ１
８、ＮｉｄｄｍＣ（１３＋１５）およびＮｉｄｄｍＣ（９＋１３＋１５）からな
る群より選別したゲノム区画より選別可能である。

【０００７】また、本発明は本発明のコンジェニック動物の単離細胞、ならびに本発明のコ
ンジェニック動物由来の細胞培養物を特徴とする。細胞は、脂肪細胞、メサンギ
ウム細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、内皮細胞および神経細胞からなる群よ
り選択できる。組織培養物は、脂肪組織、メサンギウム組織、肝臓組織、膵臓組
織、筋肉組織、血管組織および神経組織からなる群より選択可能である。

【０００８】本発明のコンジェニック動物は、非ヒト哺乳動物（例えばラット、マウスまた
はモルモット等の齧歯類、またはブタ）、昆虫または鳥類であり得る。齧歯類は
ラットであり得る。

【０００９】また、本発明は、第１の非ヒトコンジェニック動物を第２の非ヒトコンジェニ
ック動物と交配させることによって入手した非ヒトコンジェニック動物を特徴と
し、第１および第２のコンジェニック動物は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を有する
。第１および第２のコンジェニック動物は、異なる代謝表現型を有することが可
能であり、かつ／または重なり合っていないゲノム区画を有することが可能であ
る。そのようなコンジェニック動物は、重なり合っていないゲノム区画間の上位
性相互作用を評価するのに効果的である。

【００１０】他方の側面において、本発明は、多数の非ヒトコンジェニック動物を含む非ヒ
トコンジェニック動物集団を特徴とする。コンジェニック動物は、多くのＩＩ型
糖尿病表現型を示し、多数のコンジェニック動物内のそれぞれのコンジェニック
動物には、ドナー動物およびレシピエント動物からの遺伝的物質が含まれ、約０
．１％〜約５０％の各コンジェニック動物ゲノムがドナー動物から由来し、ドナ
ーからの遺伝物質は、それぞれのコンジェニック動物内のＩＩ型糖尿病関連表現
型の発現に必要である。

【００１１】また、本発明は、薬理学的に活性な化合物を試験するための方法を特徴とする
。本方法には、試験化合物を、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示す非ヒトコンジェニ
ック動物に投与する工程であって、該非ヒトコンジェニック動物には、ドナー動
物およびレシピエント動物の遺伝的物質が含まれ、約５０ｃＭ未満のコンジェニ
ック動物ゲノムがドナー動物由来であり、ドナーからの遺伝的物質がコンジェニ
ック動物でのＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要である工程、およびコンジェ
ニック動物での少なくとも１つのＩＩ型糖尿病関連表現型における効果に関して
試験化合物を評価する工程が含まれる。コンジェニック動物は、上述したような
遺伝的区画を含むことが可能である。動物は、２匹のコンジェニック親動物間で
交配した子孫動物を含むことが可能であり、親動物は異なるコンジェニック区画
を有する。

【００１２】他方の側面において、本発明は、薬理学的に活性な化合物を試験するための方
法を特徴とする。本方法は、試験化合物を、複数のＩＩ型糖尿病関連表現型を示
している複数の非ヒトコンジェニック動物に投与する工程、および少なくとも１
つのＩＩ型様尿病関連表現型上での効果に関して試験化合物を評価する工程を含
み、多数のコンジェニック動物内でのそれぞれのコンジェニック動物は、ドナー
動物およびレシピエント動物からの遺伝的物質を含み、約０．１％〜約５０％の
各コンジェニック動物ゲノムがドナー動物から由来し、ドナーからの遺伝的物質
は、それぞれのコンジェニック動物でのＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要で
ある。多数のコンジェニック動物には、異なるクロモソーム上のコンジェニック
区画を持っている少なくとも２匹のラットが含まれ得る。

【００１３】また、本発明は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示している非ヒトコンジェニック
動物の単離細胞を含む製造物品を特徴とする。本物品はさらに、細胞が、ＩＩ型
糖尿病関連表現型を軽減するのに効果的であり得る化合物を評価するために効果
的であることを示唆しているラベルまたはパッケージ貼付文章を含むことが可能
である。

【００１４】他方の側面において、本発明は、ビジネスを行う方法を特徴とする。本方法に
は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示している非ヒトコンジェニック動物、またはそ
れらから由来した細胞の販売を申し出る工程、および動物が、ＩＩ型糖尿病関連
表現型を軽減するのに効果的である化合物を、試験または評価するために効果的
であることを伝達する工程が含まれる。

【００１５】さらに他方の側面において、本発明は、ドナー動物とレシピエント動物を交配
し、子孫動物を産出する工程、および首尾よく前記子孫動物を少なくとも１０世
代、レシピエント動物と戻し交配し、コンジェニック動物を産出する工程を含む
非ヒトコンジェニック動物を作製する方法を特徴とし、該コンジェニック動物は
ＩＩ型糖尿病関連表現型を示し、約５０ｃＭ未満のコンジェニック動物ゲノムが
ドナー動物から由来し、ドナーの遺伝的物質が、コンジェニック動物でのＩＩ型
糖尿病関連表現型の発現に必要である。

【００１６】また、本発明は、単離されたインスリン分解ポリペプチドおよびインスリン分
解ポリペプチドをコードしている単離したポリヌクレオチドを特徴とし、該ポリ
ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、ＩＩ型
糖尿病関連表現型に関連している。ポリペプチドには、ＳＥＱＩＤＮＯ：２
３のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２３のアミノ酸１８で置換されたアルギニン残基および／またはアミノ酸８
９０で置換されたバリン残基を含むことが可能である。ポリヌクレオチドは、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：２２のヌクレオチド２８１７にシトシン残基を有することが
可能である。

【００１７】また、本発明は、ゲノムに、インスリン分解ポリペプチドトランス遺伝子が含
まれる、トランスジェニック非ヒト動物を特徴とし、トランス遺伝子には、イン
スリン分解ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに作用可能に連結さ
れた調節ポリヌクレオチドが含まれ、インスリン分解ポリペプチドは、ＩＩ型糖
尿病関連表現型に関連したアミノ酸置換を有する。動物はラットまたはマウスで
あり得る。

【００１８】他の定義しない限り、本明細書で使用したすべての技術的および科学的用語は
、本発明の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意
味を持つ。本明細書で記述したものと同様または等価の方法および物質を本発明
の実施に使用できるけれども、好適な方法および物質は以下に記述している。す
べての刊行物、特許明細書、特許および本明細書で言及した他の参考文献は、そ
のすべてが参考文献として組み込まれている。論争になる場合、定義を含む本明
細書が制御するであろう。さらに、物質、方法および実施例は例示的であるのみ
であり、限定することを意図していない。

【００１９】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明より、かつ請求項より明ら
かになるであろう。図面の簡単な説明図１は、コンジェニック種Ｎｉｄｄｍ１ａ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、およびＮｉｄｄ
ｍ１ｉでのラットクロモソーム１の遠位部分の遺伝子マップである。Ｇｏｔｏ−
Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）由来ゲノム区画の内容を、３つのコンジェニック種に
関する黒棒として示している。白色は、最も近く隣接するマーカーによって定義
されたように、ＧＫとＦ３４４由来対立遺伝子間の交差点にまたがるゲノム区画
を示している。図２Ａ〜２Ｄは、Ｎｉｄｄｍ１コンジェニックおよびＦ３４４ラットの腹膜内
グルコース耐性試験を図示したグラフである。種Ｎｉｄｄｍ１ａ（ｎ＝１１）、
Ｎｉｄｄｍ１ｂ（ｎ＝１７）、Ｎｉｄｄｍ１ｉ（ｎ＝１２）およびＦ３４４（ｎ
＝２０）からのオスラット（９５日齢）をＩＰＧＴＴにかけた。グルコース注入
後、血中グルコース（２Ａ、２Ｂ）、および血清インスリン（２Ｃ、２Ｄ）の濃
度を、示した時間点にて測定した。結果は平均±ｓｅｍとして示している。図３Ａ〜３Ｄは、Ｆ３４４、ＧＫ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、およびＮｉｄｄｍ１ｉラ
ットでのインスリンによって刺激される合成の結果として、脂質内へのグルコー
スの取り込みを図示したグラフである。脂肪細胞を、２ヶ月齢オスＦ３４４（ｎ
＝７）、ＧＫ（ｎ＝４）、Ｎｉｄｄｍ１ｂ（ｎ＝５）、およびＮｉｄｄｎ１ｉ（
ｎ＝５）ラットの精巣上体脂肪より単離し、インスリン（０〜２０，０００μＵ
／ｍｌ）と共に２時間インキュベートした。図３Ａは、インスリンのない状態（
基礎条件）での、脂質内へのグルコース取り込み（脂質生成）が、ＧＫ（ｐ＝０
．００９）、Ｎｉｄｄｍ１ｂ（ｐ＝０．００７）、およびＮｉｄｄｍ１ｉ（ｐ＝
０．０４）ラットよりも、Ｆ３４４ラットで高いことを示している。図３Ｂは、
最大インスリン誘導脂質生成が、ＧＫ（ｐ＝０．００００４）、Ｎｉｄｄｍ１ｂ
（ｐ＝０．００８）、およびＮｉｄｄｍ１ｉ（ｐ＝０．００１）ラットよりも、
Ｆ３４４ラットで高いことを示している。最大インスリン誘導脂質生成は、ＧＫ
（ｐ＝０．０２および０．００６）に比べてＮｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１
ｉラットでより高かった。図３Ｃおよび３Ｄは、インスリンなし（３Ｃ）または
最大量の存在下（３Ｄ）で得られた、上記値の増加（平均∀ｓｅｍ）として示し
た、用量依存的インスリン刺激脂質生成を示している。図４は、ＧＫ、Ｆ３４４およびＮｉｄｄｍ１ラットでのインスリンＲＮＡの定
量的解析を示したグラフである。結果は平均∀ｓｅｍで示している。ＲＮＡの量
は、ピクセルとして示しており、リン光体イメージング技術を用いてバンド強度
より計算した。図５は、コンジェニックラット種Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｎｉｄｄｍ１ｃ、Ｎｉｄｄ
ｍ１ｆおよびＮｉｄｄｍ１ｅラットでの、ラットクロモソーム１の部分の遺伝的
マップである。ＧＫ由来ゲノム区画の範囲を、４つのコンジェニック種に関して
黒棒で示している。白棒は、最も近くに隣接しているマーカーによって定義され
たような、ＧＫおよびＦ３４４由来対立遺伝子間の交差点にまたがるゲノム区画
を示している。図６Ａ〜６Ｂは、精巣上体脂肪から単離した脂肪細胞における脂質生成を図示
したグラフである。脂肪細胞を、２ヶ月齢オスＦ３４４（ｎ＝６）、Ｎｉｄｄｍ
１ｆ（ｎ＝５）およびＮｉｄｄｍ１ｅ（ｎ＝４）ラットより単離し、インスリン
（０〜２０，０００ＴＵ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートした。図６Ａは、
インスリンのない状態（基礎条件）での、脂質生成が、Ｎｉｄｄｍ１ｆ（ｐ＝０
．００１）、およびＮｉｄｄｍ１ｅ（ｐ＝０．００２）ラットよりも、Ｆ３４４
ラットで高いことを示している。図６Ｂは、最大インスリン誘導脂質生成が、Ｎ
ｉｄｄｍ１ｆ（ｐ＝０．００００１）、およびＮｉｄｄｍ１ｅ（ｐ＝０．００３
）ラットよりも、Ｆ３４４ラットで高いことを示している。図７は、ラットインスリン分解酵素（ＩＤＥ）をコードしている遺伝子の翻訳
部分の概略図である。図８は、もともとのＣＯＳ−１細胞内での、野生型ＩＤＥおよびＩＤＥ変異体
Ａ８９０Ｖ（すなわち、アミノ酸８９０の位置でアラニンの代わりにバリンであ
るもの）、Ｈ１８Ｒ（すなわち、アミノ酸１８の位置でヒスチジンの代わりにア
ルギニンであるもの）、およびＡ８９０Ｖ＋Ｈ１８Ｒのインスリン分解活性を図
示しているグラフである。すべての値は、４つの異なるトランスフェクションか
らのものであり、任意で１００％と定義した、野生型活性（Ｆ３４４ラットから
のｐＣＭＶ４−Ｉｄｅをトランスフェクトした細胞）のパーセンテージとして表
している。各実験内で、バックグラウンドＣＯＳ−１インスリン分解活性を、各
個々の値より差し引き、活性は、総タンパク含量およびβ−ガラクトシダーゼ活
性両方に関して補正した。Ａ８９０Ｖ、Ｈ１８ＲおよびＡ８９０Ｒ＋Ｈ１８Ｒの
実際の値（平均∀ｓｅｍ）は、それぞれ９５∀９、８９∀８および６９∀６％で
ある。

【００２０】詳細説明ＩＩ型糖尿病のコンジェニック動物モデル本発明は、ドナーおよびレシピエント動物を交配した後に同定される非ヒトコ
ンジェニック動物、およびそのようなコンジェニック動物由来の細胞および組織
を特徴とする。一般的に、コンジェニック動物は、第二動物種（すなわちレシピ
エント）の遺伝的背景との関連で、１匹の動物種（すなわちドナー）からの遺伝
的物質（遺伝的区画）の分離部分を含む。同系交配しうる非ヒト動物が、ドナー
およびレシピエント動物としての使用に好適である。非限定例として、マウス、
ラットのような齧歯類、ウサギ、およびモルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、魚類
、および七面鳥およびニワトリのような鳥類が含まれる。ラット、マウスおよび
ブタがとりわけ有用な動物である。典型的に、「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」は、遺
伝的に連結したＩＩ型糖尿病関連表現型を持つ動物を意味する。ドナー動物は、
例えばＧＫラット、Ｌｏｎｇ−ＥｖａｎｓＴｏｋｕｓｈｉｍａＦａｔｔｙ（
ＯＬＥＴＦ）ラット、ＮＺＯマウス、およびＮＯＮマウスでありうる。例えばＫ
ｉｍｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９８，９（
２−４）：３２５−３４５を参照のこと。

【００２１】ＧＫラットは、ＩＩ型糖尿病に関して広範囲に研究された動物モデルである。
ＧＫ動物の表現型はよく特徴化されており、断食高血糖、グルコースへの応答に
おけるインスリン分泌障害、インスリン耐性、ならびに遅延合併症、例えばニュ
ーロパシーおよびネフロパシーのようなＩＩ型糖尿病に典型的な種々の特徴を含
む。ＧＫと、血糖値正常のＦ３４４ラット間のＦ２交雑の遺伝的連結解析は、ゲ
ノム幅重要性を伴う４つの主要なＱＴＬ（Ｎｉｄｄｍ１、Ｎｉｄｄｍ２、Ｎｉｄ
ｄｍ３およびｗｅｉｇｈｔ１）、ならびに糖尿病の分離とその関連する表現型に
影響を与える１０の副次的なＱＴＬを同定した。Ｇａｌｌｉ，Ｊ．ｅｔａｌ．
，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，１９９６，１２：３１−３７。ＯＬＥＴＦラッ
トは、緩やかな肥満を示しており、加齢とともに、性二相性ＮＩＤＤＭが発達す
る。ＯＬＥＴＦとＢＮまたはＦラット間のＦ_２交雑の解析によって、ＱＴＬとし
てＤｍｏＩが、グルコース不耐、断食血漿グルコース濃度、および体重に関連し
、ラットクロモソーム１のＮｉｄｄｍ１領域でみられることが同定されている。
上記Ｋｉｍｅｔａｌ．，１９９８。典型的には、「レシピエント（ｒｅｃｉ
ｐｉｅｎｔ）」は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示していない同系交配動物を指す
。レシピエント動物は、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４、ＤＡ、ＬＥＷ、ＡＣ
Ｉ、ＷＫＹ、ＳＤまたはＢＮラット、またはＢＡＬＢ／ｃ、ＦＶＢまたはＳＳＬ
マウスであり得る。

【００２２】一般的に、ドナー動物は、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示し、一方でレシピエン
ト動物は示さない。そのような動物の交配によって、ＩＩ型糖尿病関連対立遺伝
子を、ＩＩ型糖尿病関連表現型に関連して遺伝子移入させることが可能である。
あるいは、レシピエント動物がＩＩ型糖尿病関連表現型を示し、ドナー動物が示
さない。そのような動物の交配によって、ＩＩ型糖尿病関連対立遺伝子を、ＩＩ
型糖尿病関連表現型に関連して遺伝子移入させることが可能である。

【００２３】ドナーとレシピエントの交配の後、子孫をレシピエント動物と首尾よく戻し交
配し、当該対立遺伝子をレシピエントのゲノム上に移入して、コンジェニック動
物を産出する。典型的に、コンジェニック動物は、少なくともＦ１０世代より同
定される。あるいは、「スピードコンジェニクス（ｓｐｅｅｄｃｏｎｇｅｎ
ｉｃｓ）」または「マーカー補助交配（ｍａｒｋｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄｂｒ
ｅｅｄｉｎｇ）」として参照される手順を用いることができる。例えば、Ｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．，６６（３）：２５５−２
６５，１９９５、およびＤａｒｖａｓｉ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１８（１）：
１９−２４，１９９８を参照のこと。この方法では、各戻し交配世代の子孫を、
最大数のドナーバックグラウンド対立遺伝子を欠失しているように選択する。コ
ンジェニック動物がＦ１０世代より早く（例えばＦ９世代）同定可能であるよう
に、本方法ではより少ない交配しか必要とされない。子孫の表現型は、例えば、
腹膜内、または静脈内グルコース耐性試験（血清グルコースおよびインスリン濃
度を、グルコースを注入した断食動物で測定するもの）によって各世代で評価可
能である。さらに、グルコース濃度をインスリンの注入の後に動物において測定
するインスリン耐性試験、または栄養素またはホルモン濃度を断食、および／ま
たは誘発に続いて測定する試験を動物の表現型決定のために使用できる。ミトコ
ンドリアは母系遺伝するので、本質的にコンジェニック動物のすべてのミトコン
ドリアは、ドナーまたはレシピエントいずれか由来であり得る。

【００２４】公知の遺伝マーカーを用いて、本発明のコンジェニック動物において、遺伝子
型を評価できる。例えば、タンデムアレイ中で複数回繰り返される一−、二−、
三−または四量体配列からなるマイクロサテライト、または単純配列長多型（Ｓ
ＳＬＰ）の存在を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、マイクロサテラ
イトまたはＳＳＬＰの周辺の領域を増幅することで評価することができる。いく
つかの実施形態において、本発明のコンジェニック動物を、「マーカー−定義（
ｍａｒｋｅｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ）」として特徴付けしてよく、これは、上述した
ように遺伝子型を決定した時に、動物が遺伝的に純粋であることを示している。
したがって、ドナー動物がＧＫラットである場合、マーカー定義コンジェニック
動物は、ＧＫ特異的領域をのぞいて、レシピエント動物からのすべてのマーカー
を有しており、典型的には長さにして１クロモソーム未満である。

【００２５】したがって、食後のグルコース濃度においてほぼ３０％の遺伝的効果を示して
いる、Ｎｉｄｄｍ１のような主要なＱＴＬを、ＱＴＬの異なる部分をカバーする
コンジェニック種を確立することによって異なった遺伝的因子内に分類すること
ができる。例えば、コンジェニック種は、Ｎｉｄｄｍ１−ＧＫ体質遺伝子を、血
糖正常Ｆ３４４ラットのゲノム上に移入することによって確立することができる
。領域は、長さにして例えば約５０センチモルガン（ｃＭ）、２０ｃＭ、１０ｃ
Ｍまたは５ｃＭ未満であり得る。本明細書で記述したように、Ｎｉｄｄｍ１ａ、
Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｎｉｄｄｍ１ｉ、Ｎｉｄｄｍ１ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｄ、Ｎｉｄｄ
ｍ１ｆ、Ｎｉｄｄｍ１ｇおよびＮｉｄｄｍ１ｈコンジェニック種は、ＧＫのゲノ
ム由来で、ぞれぞれ約５２、２８、２２、３、１９、８、１３および２４ｃＭを
含む。Ｎｉｄｄｍ１座は、重なり合っていないコンジェニック種Ｎｉｄｄｍ１ｂ
とＮｉｄｄｍ１ｉによって定義された２つの遺伝子実体に分かれ、各遺伝子実体
は糖尿病表現型において異なった効果を有する。本発明のコンジェニック動物は
、以下の、食後高血糖の上昇、高血圧、グルコース不耐、インスリン耐性、イン
スリン分泌変化、インスリン活性減少、体重増加、脂質生成障害、グリコーゲン
代謝変化、凝固アテローム性動脈硬化症変化、腎機能変化（例えばネフロパシー
）、眼機能変化（例えば網膜症）、神経機能変化（例えばニューロパシー）、お
よび太大血管障害または細小血管障害の１つまたはそれ以上を含むＩＩ型糖尿病
関連表現型を示している。例えば、コンジェニック種Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉ
ｄｄｍ１ｉはそれぞれ、食後グルコース濃度の増加およびｉｎｖｉｔｒｏでの
単離した脂肪細胞中の基礎およびインスリン誘導脂質生成を示した。しかしなが
らいくつかの特徴はそれぞれの種に対して固有である。Ｎｉｄｄｍ１ｉラットは
、ｉｎｖｉｖｏで、インスリン分泌の重度の減少との組合せでインスリン耐性
を示す。Ｎｉｄｄｍ１ＱＴＬの本亜種は、体重の増加、精巣上体脂肪量の増加
、またはトリグリセリドのレベルの増加を発生させなかった。したがって、表現
型は、インスリン分泌における早期欠失を伴うＭＯＤＹの患者のものと同一であ
る。しかしながら、インスリン分泌欠失がＮｉｄｄｍ１ｉ／Ｆ３４４ヘテロ接合
体ラットで観察されなかったので、遺伝の形式は、明らかに劣性形質である。Ｉ
ＰＧＴＴ間のインスリン濃度は、若年Ｎｉｄｄｍ１ｉラットでは減少し、一方で
食後グルコース濃度はＦ３４４でよりもわずかに高く、このことはおそらく、こ
の年齢でのインスリン非依存性グルコース処理の重要な寄与を示している。

【００２６】ＧＫラットと同様に、糖尿病患者において、インスリン分泌とインスリン活性
両方の欠失が、疾患の発展に密接に関わっている。これらの欠失の関連病因重要
性はまだ論争の的である。６５日齢Ｎｉｄｄｍ１ｉラットにおいては、食後グル
コース濃度がわずかに上昇するにすぎず、基底グルコースが通常であるので、イ
ンスリン分泌および活性における欠失は、単なるグルコ毒性の結果ではないとみ
られる。特定の機構によって基づくことなく、Ｎｉｄｄｍ１ｉは、膵臓β細胞中
でのインスリン分泌および脂肪細胞でのインシュリン活性に共通の機構を減じた
可能性がある。インスリンレセプター基質２、ＩＲＳ−２をコードしている遺伝
子と同様に、マウスにおけるインスリン分泌および活性両方で欠失を引き起こす
。Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１：
９００−９０４。Ｉｒｓ−２遺伝子はヒトにおいてクロモソーム１３に、そして
マウスにおいてクロモソーム８に局在している。シンテニー保存に従って、Ｉｒ
ｓ−２遺伝子はＮｉｄｄｍ１ｉ表現型に関する候補遺伝子ではない。

【００２７】若年Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびヘテロ接合体Ｎｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４ラットは、
わずかに食後グルコース濃度が上昇したが、本質的にインスリン濃度が上昇し、
このことは、インスリン耐性が、インスリン分泌の増加によって代償されている
ことを示唆している。高齢ヘテロ接合体ラットにおいては、インスリン活性の欠
失がまだ代償されているが、絶食高血糖、絶食高インスリン血症、体重および精
巣上体脂肪量の増加、ならびに脂質生成障害が起こっているホモ接合体Ｎｉｄｄ
ｍ１ｂラットでは代償されていない。この座は、インスリン耐性が、代謝症候群
での基礎として考えられている、糖尿病患者においてよく認識されている。Ｎｉ
ｄｄｍｌｂラットでのインスリン耐性が、主な欠失である可能性があることは、
Ｎｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４ヘテロ接合体ラットでもインスリン耐性の兆候が示さ
れているが、他の糖尿病関連表現型のレベルは、通常かまたは通常より低く示さ
れているという事実より支持されている。

【００２８】ヒトにおけるインスリン耐性および糖尿病が、しばしば高トリグリセリド血漿
、ＬＤＬコレステロール濃度の増加、およびＨＤＬコレステロール濃度減少に関
連する。Ｎｉｄｄｍ１ｂラットは、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロー
ルの増加とともに、トリグリセリド濃度の増加を示している。総コレステロール
とＨＤＬコレステロール間の差は、ＬＤＬとＶＬＤＬコレステロール濃度をほぼ
反映しているに違いなく、Ｎｉｄｄｍ１ｂとＦ３４４ラット間で差は観察されな
かった。したがって、Ｎｉｄｄｍ１ｂでの脂質代謝の障害は、糖尿病患者でのパ
ターンに正確に適用していない。この矛盾はおそらく、ヒトと比較して、齧歯類
の脂質生成障害の顕在化における種特異的差違を反映している。

【００２９】本明細書で説明するデータは、２つの糖尿病座Ｎｉｄｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１
ｉ間の非対立遺伝子相互作用または上位性の存在を示唆している。Ｆ３４４ラッ
トと比較して、（Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉ両方を含む）Ｎｉｄｄｍ
１ａにおいて、食後グルコース濃度の増加が、２つの亜種の追加的効果より予想
され得るものよりも重度ではない。生理学的用語における上位性の解釈は、動物
が（ＧＫでのように）さらなる糖尿病遺伝子を含んでいるか、環境ストレスを受
けていない限り、過剰なグルコース濃度に対して器官を保護する逆調節機構が、
高血糖症を制限していることを示唆している。

【００３０】ヒトにおけるＮｉｄｄｍ１ａに相当する相同的クロモソーム領域は、１１ｑ１
３、９ｐ２４、および１０ｑ２４〜２６である。興味深いことに、メキシコ人−
アメリカ人集団での糖尿病に関連した座が、最近クロモソーム１０ｑ上で報告さ
れた。本発明者らはまた、Ｎｉｄｄｍ１ｂに相当する、ヒトクロモソーム９ｐ上
で、糖尿病への関連を示唆する座を報告した。

【００３１】本発明のさらなるコンジェニック動物を、第１コンジェニック動物を、１匹ま
たはそれ以上の第２のコンジェニック動物と交配することによって産出してよい
。第１および第２のコンジェニック動物は、各々上述したように、ドナーおよび
レシピエント動物の交配の後、Ｆ１０世代から得てよい。典型的には、第１およ
び第２のコンジェニック動物は、ドナーから由来した重なり合っていないゲノム
区画を有しており、典型的にはＩＩ型糖尿病関連表現型を有する。そのような交
配によって得たコンジェニック動物は、重なり合っていない区画間の上位性相互
作用を評価するために効果的である。

【００３２】コンジェニック動物集団本発明は、多数のＩＩ型糖尿病関連表現型を示しているコンジェニック動物集
団を特徴とする。コンジェニック動物集団は、上述したように、ドナーおよびレ
シピエント動物の交配より同定されるが、Ｆ３から少なくともＦ１０世代（例え
ばＦ１２世代）までの多数の動物を含む。そのような動物集団の中の各動物は、
ドナー動物に由来したそのゲノムの約０．１％〜約５０％を有している。したが
って、コンジェニック動物集団中の各動物は、ドナー動物から由来した異なる部
分のゲノムを有し、それは、集団中の他のコンジェニック動物とは異なる。

【００３３】本発明のコンジェニック動物集団およびそれより由来する組織、細胞および細
胞抽出物は、ＩＩ型糖尿病関連表現型の上位性効果を評価するのに効果的であり
、ＩＩ型糖尿病を処置するために有用である可能性のある薬理学的剤を同定する
のに使用できる。例えば、試験化合物を本発明のコンジェニック動物またはコン
ジェニック動物集団に添加し、食後高血糖の上昇、高血圧、グルコース不耐、イ
ンスリン耐性、インスリン分泌変化、インスリン活性減少、体重増加、脂肪血症
異常、高インスリン欠血症、脂肪合成障害、およびグリコーゲン代謝変化のよう
な糖尿病関連表現型を、対照動物と比較してモニタする。試験化合物を、薬理学
的に許容可能な非毒性賦形剤または担体と混合することによって、薬理学的組成
物内に処方でき、任意の投与経路にて本発明のコンジェニック動物に投与できる
。例えば、皮下、筋肉内、脈管内、皮内、鼻内、吸入、鞘内、または腹膜内投与
のような非経口経路、および舌下、経口、または直腸投与のような腸経路を使用
できる。

【００３４】インスリン分解ポリペプチド本発明は、天然のポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含
み、ＩＩ型糖尿病関連表現型に関連する、単離した、インスリン分解酵素（ＩＤ
Ｅ）ポリペプチドを特徴とする。本明細書で使用するところの、語句「ポリペプ
チド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、長さまたは翻訳修飾に関係なく、任意の
アミノ酸鎖である。アミノ酸は本明細書で、標準の３文字、および１文字略語で
表される。ＩＤＥ活性または発現に影響を与える薬剤（例えば小分子または生物
学的巨大分子）を、標準の方法で同定できる。

【００３５】ＩＤＥは、高い特異性と低いＫｍにてインスリンと結合し、インスリンの細胞
内処理および分解で重要な役割を演じる金属プロテアーゼである。ＩＤＥは、活
性にＺｎ^２＋が必要であるが、典型的なＺｎ^２＋結合部位は含んでおらず、ＨＸ
ＸＥＨ活性部位モチーフを含むプロテアーゼの新種に属することを示している。
ＩＤＥタンパク質は進化的によく保存されており、このことは、そのインスリン
除去機能に加えて、おそらく他のより複雑な細胞機能を有している。ＩＤＥは、
細胞表面、エンドソーム、細胞質、およびペルオキシソームを含む種々の細胞内
区画に局在化し、体内に広く発現している。インスリンはＩＤＥに対するもっと
も大きな親和性を持つ基質であり、このタンパク質は、ＩＤＥに結合するが、ほ
とんど分解されないプロインスリン、表皮増殖因子、およびインスリン様増殖因
子−１（ＩＧＦ−１）、およびＩＤＥに結合し、簡単に分解されるＩＧＦ−ＩＩ
、心房性ナトリウム利尿因子、および形質転換増殖因子−Ｉのような様々な他の
増殖因子と相互作用する。研究ではまた、ＩＤＥが、細胞内タンパク質分解の主
な場所であるプロテオソームと相互作用することが示されたので、他の型の細胞
内タンパク質分解におけるＩＤＥの役割が明らかになった。ほかに、ＩＤＥが、
グルココルチコイドおよびアンドロゲンレセプター両方と相互作用することが示
されたので、ＩＤＥに関する機能は、ステロイド活性における調節の役割である
ことが明らかにされた。例えば、Ａｕｔｈｉｅｒｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．，１９９６，１９（３）：１４９−１６０を参照のこと。

【００３６】インスリン分解ポリペプチドの改変には、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２３の
アミノ酸配列の残基１８または８９０での少なくとも１つのアミノ酸置換が含ま
れうる。置換は、保存的であっても、そうでなくてもよい。保存アミノ酸置換は
、アミノ酸を同型のアミノ酸と置換し、一方で非保存アミノ酸置換はアミノ酸を
他の型のアミノ酸と置換する。保存置換の例には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３の
残基１８のヒスチジンに対するアルギニン（Ｈ１８Ｒ）、および残基８９０での
アラニンに対するバリン（Ａ８９０Ｖ）が含まれる。非保存置換は、結果として
ポリペプチドの疎水性の本質的変化、または残基側鎖の大きさの変化となる。さ
らに、非保存置換は、電気陽性電荷の減少、または電気陰性電荷の導入のような
、ポリペプチドの電荷の本質的変化を起こし得る。非保存置換の例には、非極性
アミノ酸に対する塩基性アミノ酸、または酸性アミノ酸に対する極性アミノ酸が
含まれる。

【００３７】本明細書で説明したように、Ｎｉｄｄｍ１ｂ座は、コンジェニック種Ｎｉｄｄ
ｍ１ｅによって定義されたほぼ３．７ｃＭの小さな遺伝的領域にサブマップ化さ
れた。ＩＤＥをコードしている遺伝子はこの領域内にマップされ、ＩＤＥのＧＫ
特異的対立遺伝子変異体が同定された。ＧＫ対立遺伝子の翻訳された領域での２
つのヌクレオチド変異体が、結果としてアミノ酸の変化、Ｈ１８ＲおよびＡ８９
０Ｖとなった。ＩＤＥｃＤＮＡが１２の他のラット種で配列決定され、同定さ
れた変異体の頻度が調査された。Ａ８９０Ｖは、ＧＫに固有であるが、一方でＨ
１８Ｒは解析したラット種のおよそ５０％で存在し、このことは、Ａ８９０Ｖ変
異体が、糖尿病表現型に関して重要である可能性を示唆している。さらに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ発現解析により、両方の変化を含むＧＫ変異体による、インスリン
分解の約３０％の減少が示された。Ｈ１８ＲおよびＡ８９０Ｖ変異体が、別々に
研究され、Ａ８９０Ｖに対しては明らかな効果は観察されず、Ｈ１８Ｒは、イン
スリン分解能力のわずかな減少のみを示した。このことは、２つの変異体が、イ
ンスリン分解における効果を仲介するために、相乗的に作用していることを示し
ている。ＧＫ変異体は、Ｉｄｅトランスフェクト細胞の細胞溶解物中のインスリ
ン分解に、なんの影響も持たないので、ＩＤＥにおける欠失は、インスリンのレ
セプター仲介内在化に特異的であり、共役し得る。５０％までのインスリンが、
培養した細胞の表面上で直接ＩＤＥによって分解されるので、ＩｄｅＧＫ変異
体の実際の効果は、まだすべて検出されていないことに注目すべきである。

【００３８】改変インスリン分解ポリペプチドをコードしている核酸本発明の改変インスリン分解ポリペプチドをコードしている単離された核酸分
子を、標準の技術によって産出できる。本明細書で使用するところの、「単離さ
れた（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、改変インスリン分解ポリペプチドをコードして
いる遺伝子の部分またはすべてに相当する配列を意味し、ただし、通常哺乳動物
ゲノム中の野生型遺伝子の１つまたは両方の側に隣接する配列を含まない。単離
されたポリヌクレオチドは、例えば組換え体ＤＮＡ分子であってよく、天然に存
在するゲノム内の組換え体ＤＮＡ分子が除去されたか、または存在しない直近で
隣接していることが通常知られている核酸配列の１つまたは両方を提供する。し
たがって、単離されたポリヌクレオチドには、限定はしないが、他の配列から独
立した分離分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産
出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換え体ＤＮＡ、な
らびに、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、ア
デノウイルスまたはヘルペスウイルス）内、または真核細胞または原核細胞のゲ
ノムＤＮＡ内に組み込まれた組換え体ＤＮＡが含まれる。さらに、単離されたポ
リヌクレオチドには、ハイブリッドの一部、または融合ポリヌクレオチドである
組換え体ＤＮＡ分子が含まれ得る。

【００３９】例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含
むゲルスライス内の他の数百〜数百万のポリヌクレオチドの中に存在しているポ
リヌクレオチドが、単離されたポリヌクレオチドと見なされないことは、当業者
に明らかであろう。

【００４０】単離されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約１４ヌクレオチドで
あり、野生型からの配列内に置換を含む。例えば、核酸は、ＳＥＱＩＤＮＯ
：２２のヌクレオチド６８にグアニン、ヌクレオチド２６８４にチミン、または
ヌクレオチド２８１７にシトシンを含む。核酸分子は、長さにして約１４〜２０
、２０〜５０、５０〜１００または１５０以上である。いくつかの実施様態にお
いて、単離された核酸分子は、全長、改変インスリン分解ポリペプチドをコード
している。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、直線または環状、そしてセンスま
たはアンチセンス方向であってよい。

【００４１】特定の点変化は、例えばオリゴヌクレオチド部位特異的変異導入によって、野
生型インスリン分解ポリペプチドをコードしている核酸分子内に導入することが
できる。この方法において、望んだ変化をオリゴヌクレオチド内に導入し、つい
で野生型核酸にハイブリッド形成させる。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメ
ラーゼにて伸長させ、導入した点変化の部分でミスマッチを含むヘテロ二本鎖、
および５’末端での一本鎖ニックを作製し、これをＤＮＡリガーゼにて密閉する
。ミスマッチは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換において修復され、改変イ
ンスリン分解ポリペプチドをコードしている遺伝子が大腸菌より再単離できる。
部位特異的変異を導入するためのキットが商業的に購入できる。例えば、Ｍｕｔ
ａ−Ｇｅｎｅ７ｉｎ−ｖｉｔｒｏ変異導入キットが、バイオラッドラボラ
トリー社(Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ，ＣＡ）より購入できる。

【００４２】ＰＣＲ技術もまた、変異を導入するために使用できる。例えば、Ｖａｌｌｅｔ
ｔｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９８９，１７
：７２３−７３３を参照のこと。ＰＣＲは、標的核酸を増幅する手順または技術
を言う。対象領域の末端から、またはそれを超えた配列情報を典型的に、増幅す
べき鋳型の反対鎖に対する配列と同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設
計するのに利用し、一方、変異導入のためには、望む変化を組み込むオリゴヌク
レオチドを対象の核酸配列を増幅するために使用する。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮ
Ａまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含むＤＮＡならびにＲＮＡからの特定の配列
を増幅するために使用できる。プライマーは典型的には、長さにして１４〜４０
ヌクレオチドであるが、長さにして１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲
であり得る。一般的なＰＣＲ技術は、例えばＰＣＲプライマー：研究室マニュア
ル（ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），Ｄ
ｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．及びＤｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．編，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９５に記載さ
れている。

【００４３】改変インスリン分解ポリペプチドをコードしている核酸はまた、単一核酸分子
として、または連続したオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学合成によ
って産出できる。例えば、長いオリゴヌクレオチド（例えば＞１００ヌクレオチ
ド）の１つまたはそれ以上の対を、所望の配列を含んで合成でき、各対は、オリ
ゴヌクレオチド対がアニールした時に二本鎖が形成されるように、相補性の短い
区画（例えば約１５ヌクレオチド）を含んでいる。ＤＮＡポリメラーゼを使用し
てオリゴヌクレオチドを伸長させ、結果として、オリゴヌクレオチド対あたり１
本の二本鎖核酸分子となり、ついでベクター内にライゲーション可能である。

【００４４】改変インスリン分解ポリペプチドの産出本発明の改変インスリン分解ポリペプチドは、ポリペプチドをコードしている
核酸分子を、発現ベクターのような核酸構造物内にライゲーションし、発現ベク
ターを細菌または真核宿主細胞に形質導入することで産出することができる。一
般的に、核酸構造物には、インスリン分解ポリペプチドをコードしている核酸配
列に作用可能に連結された調節配列が含まれる。調節配列は、典型的には遺伝子
産物をコードしてはおらず、代わりに、核酸配列の発現に影響を与える。本明細
書で使用するところの、「作用可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋ
ｅｄ）」は、核酸配列の転写および翻訳を促進する様式での、調節配列の核酸配
列への連結を意味する。調節区画には、例えば、プロモーター配列、エンハンサ
ー配列、応答区画、または誘導可能区画が含まれる。

【００４５】細菌系において、ＢＬ−２１のような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）株が使用できる。好適な大腸菌ベクターには、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質を産出するベクターのｐＧＥＸシリー
ズが限定はしないが、含まれる。形質転換した大腸菌は典型的には指数関数的に
増殖し、ついで、回収の前にイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
で刺激する。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオ
ン−アガロースに吸着させ、遊離グルタチオンの存在下で溶出することで、溶解
細胞より簡単に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化した標的遺伝子産
物がＧＳＴ部位から放出されるように、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテア
ーゼ開裂部位を含むように設計されている。

【００４６】真核宿主細胞において、多くのウイルスに基づく発現系が、改変インスリン分
解ポリペプチドを発現するために利用できる。インスリン分解ポリペプチドをコ
ードしている核酸を、例えばｐＢｌｕｅＢａｃ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなバキュロウイルスベクター内
にクローン化し、ついで、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞に、オウトグラファカリフォルニカ
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多重エンベロープ核多角体
病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）からの野生型ＤＮＡとコトランスフェクトするのに
使用する。改変インスリン分解ポリペプチドを産出している組換え体ウイルスは
、標準の方法論にて同定できる。あるいは、インスリン分解ポリペプチドをコー
ドしている核酸は、ＳＶ４０、レトロウイルスまたはワクシニアに基づくウイル
スベクター内に導入でき、宿主細胞を感染させるのに使用できる。

【００４７】安定に改変インスリン分解ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞株を、適
切な制御区画および選択可能マーカーを持つ発現ベクターを用いることで産出で
きる。例えば、真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１^＋（インビトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）が、例えばＣＯＳ細胞、Ｈ
ＥＫ２９３細胞、または胎児ハムスター腎臓細胞内での改変インスリン分解ポリ
ペプチドの発現に好適である。エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン
−、リン酸カルシウム−、リポソーム−仲介トランスフェクションまたは他の好
適な方法による発現ベクターの導入の後、安定細胞株を選択できる。あるいは、
一過性にトランスフェクトした細胞株を用いて、改変インスリン分解ポリペプチ
ドを産出する。改変インスリン分解ポリペプチドはまた、小麦抽出物、またはウ
サギ角膜溶解物を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏで転写および翻訳可能である。

【００４８】改変インスリン分解ポリペプチドは、従来のクロマトグラフィー方法、または
標準の技術を用いた化学合成によって精製できる。タンパク質合成技術の概説に
関して、Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄＫｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３，４（４）：４２０−４２７を参照のこと
。

【００４９】トランスジェニック非ヒト動物本発明はまた、核酸構造物を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を特徴と
する。本明細書で使用するところの、「トランスジェニック非ヒト哺乳動物（ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃｎｏｎ−ｈｕｍａｎｍａｍｍａｌ）」には、創始トラン
スジェニック非ヒト哺乳動物ならびに創始動物の子孫が含まれる。核酸構造物に
は、インスリン分解ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに作用可能
に連結された調節核酸配列が含まれ、それにはＩＩ型糖尿病関連表現型に関連し
た少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる。とりわけ有用な置換は以上で記載
している。核酸構造物は、標準の組換え体ＤＮＡ技術を介して産出できる。

【００５０】トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、馬、およ
びウサギなどの家畜動物、ラット、モルモット、マウスのような齧歯類、および
ヒヒ、サルおよびチンパンジーのような非ヒト霊長類であってよい。トランスジ
ェニックマウスがとりわけ有用である。

【００５１】本技術分野で公知の種々の技術を、核酸構造物を非ヒト哺乳動物に導入し、ト
ランスジェニック非ヒト哺乳動物の創始系を産出するのに使用できる。そのよう
な技術には、プロヌクレアーマイクロインジェクション（米国特許第４８７３
１９１号）、生殖細胞系へのレトロウイルス仲介遺伝子移入（Ｖａｎｄｅｒ
Ｐｕｔｔｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８，１９８５）、胚幹細胞内への遺伝子ターゲッティング（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６：３１３，１９８９）、胚のエレ
クトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３：１
９８３）およびｉｎｖｉｔｒｏでの体細胞の形質転換と、続く核移植（Ｗｉｌ
ｍｕｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５（６６１９）：８１０−８１３，
１９９７、およびＷａｋａｙａｍａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３
６９−３７４，１９９８）が限定はしないが、含まれる。

【００５２】いったんトランスジェニック非ヒト哺乳動物が作製されると、インスリン分解
ポリペプチドの発現は、標準の技術を用いて評価できる。初期スクリーニングを
、サザンブロット解析およびＰＣＲによって実施し、トランス遺伝子の取り込み
が行われたかどうかを決定することができる。例えば、サザン解析の記述に関し
て、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９，「分子クローニング、研究室
マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）」第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹの第９．３７−９．５２項を参照のこと。

【００５３】トランスジェニック非ヒト哺乳動物の組織中のインスリン分解ポリペプチドを
コードしている核酸配列の発現は、動物から得た組織標本のノザンブロット解析
、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ
−ＰＣＲ）を含むが、それらに限定されない技術を用いて評価できる。

【００５４】本発明について以下の実施例においてさらに記載するが、これらは請求項に記
載した本発明の範囲を限定しない。

【００５５】

【実施例】実施例１−材料と方法：純系Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４（Ｆ３４４）ラットを、チャールズリバーラボ
ラトリーズ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より購
入し、兄弟姉妹交配により維持した。ラットは水および食べ物を自由に得られる
ようにし、１２時間の昼夜サイクル（６ａｍ／６ｐｍ）で飼育した。特定のラッ
トには１２０日齢から、２％のコレステロール、２０％のオリーブ油、および０
．５％の胆汁酸を標準食に混合した高脂肪食餌を与えた。

【００５６】ラット種ＧＫを、Ｇａｌｌｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，
１９９６，１２：３１〜３７に記載のように得、繁殖させた。ＧＫ由来の遺伝的
間隔を、１０回の連続戻し交配（Ｆ１０）および続くヘテロ接合体動物との交雑
によりＦ３４４の遺伝的バックグラウンドに移転させ、ホモ接合体コンジェニッ
ク種を確立した。それぞれの世代において、Ｎｉｄｄｍ１領域からの遺伝マーカ
ーを、ＧＫ−感受性ハプロタイプの完全性を証明するために用いた。Ｎｉｄｄｍ
１ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｆ、Ｎｉｄｄｍ１ｃコンジェニック種を、Ｆ３４４との１２
の連続戻し交配、続いて交配により繁殖させ、ホモ接合体系統を確立した。

【００５７】腹膜内のグルコース耐性試験：９５〜２２５日齢のオスのラットに対し、前記Ｇａｌｌｉｅｔａｌ．，１
９９６，に記載のように腹膜内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を行なった。
動物を６〜７時間絶食させた。体重１ｋｇ当たり２．０ｇのグルコース注入後、
０（基線）、１５、３０、６０、および９０分後に血中グルコース濃度を測定し
た。また０、１５、３０分後に血清免役応答性インスリン濃度を測定した。表１
、２、および３中の血清インスリン濃度はラットインスリンに対するＥＬＩＳＡ
（ＭｅｒｃｏｄｉａＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により、製品に記
載の通り測定した。ＥＬＩＳＡ解析から得たインスリン値（Ｔｇ／ｌ）を、１７
４倍し、ｐｍｏｌ／ｌに変換した。曲線下面積（ＡＵＣ）を、基線、１５、３０
、６０および９０分でのグルコース測定値（ｍｍｏｌ／ｌ×分）から台形の法則
に従い計算した。図２に示したグルコース値およびインスリン値を対応するＦ３
４４の平均値との割り算により標準化し、続いて表２に示すＦ３４４の平均値を
掛けた。図２に示した実験におけるＦ３４４のグルコース平均値は、５．０（基
点）、１８．６（１５分）、１３．８（３０分）、６．６（６０分）、そして６
．２ｍｍｏｌ／ｌ（９０分）である。相当するインスリン平均値は、６３（基点
）、２００（１５分）、および２１５ｐｍｏｌ／ｌ（３０分）である。

【００５８】脂質解析：トリグリセリド、全コレステロール、およびＨＤＬコレステロールの血清濃度
をＶｉｔｒｏｓＴＲＩＧＳｌｉｄｅｓ、ＶｉｔｒｏｓＣＨＯＬＳｌｉｄ
ｅｓ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆ＪｏｈｎｓｏｎＣｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｃ．，Ｕ
ＳＡ）、およびＬｉｑｉｄＮ−ｇｅｎｅｏｕｓＨＤＬ−ｃｒｅａｇｅｎｔ
ｋｉｔ（Ｂｉｏｍｅｄ−ＲＫ，Ｊｏｎｋｏｐｉｎｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて
測定した。

【００５９】脂質生成と脂質分解：オスのラット（７５日齢）を、二酸化炭素麻酔後、断頭し、精巣上体の脂肪蓄
積物（１〜２ｇ）を取り除いた。Ｋａｍｅｉｅｔａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，１９９７，４１：５６３〜５６７に記載のように脂肪細胞を調製した
。脂質内へのグルコース取り込み（脂質生成）の研究を、細胞へのグルコース輸
送が速度限界である、グルコース濃度１ＴＭで行なった。脂肪細胞を４０ｍｇ／
ｍｌのアルブミン（シグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
．），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．２ＴＭの[^３Ｈ]−グルコース（５×１０ ^６ｃｐｍ）、１．０ＴＭの非標識グルコース、および指示濃度のインスリンを含
む、２％（ｖ／ｖ）濃度の０．５ｍｌのケルビスリンガー（ＫｒｅｂｓＲｉ
ｎｇｅｒ）リン酸緩衝液（ＫＲＰ）中でインキュベートした。それぞれのインス
リン濃度において、３７℃で２時間、３回解析を行い、４℃まで急冷することに
より反応を終わらせた。脂質へのグルコースの取り込みを、Ｍｏｏｄｙｅｔ
ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，１９７４，６：１２〜１６に記載の
ように、６．０ＭのＨ_２ＳＯ_４４５Ｔｌおよびトルエン４．０ｍｌを２、５−
ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）と混合し、脂肪細胞を含むそれぞれのバイア
ルに加えることにより測定した。バイアルをシンチレーション計数の前に一晩、
室温にて放置した。脂質分解の特徴付けのために、脂肪細胞を４０ｍｇ／ｍｌの
アルブミン（Ｓｉｇｍａ）および５．６ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＫＲＰ
緩衝液中で３７０℃にて２時間インキュベートした。最終の脂肪細胞懸濁液は１
％（ｖ／ｖ）であった。インキュベーション終了後、培養液の部分標本を、脂質
分解の指標として用いたグリセロール放出の解析のために取り除いた。最大脂質
分解を評価するために、ノルアドレナリン（１ｎｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／
ｌ）をインキュベーション培地に加えた。脂質生成と脂質分解は、脂肪細胞の大
きさのみに依存する違いを除去するために、細胞面積当たりで表した。最大イン
スリン誘導脂質生成を、最大でのグルコース取り込み量からインスリンが存在し
ない時のグルコースの取り込み量を引いた差として計算した。最大ノルアドレナ
リン誘導脂質分解の刺激（応答）は、最大グリセロール放出としてそれぞれの個
々の投与−応答曲線から、ノルアドレナリンが存在しない倍の最大グリセロール
放出量を引いたものとして計算した。最大効果の５０％（ＥＣ_５０、感受性）を
産出したノルアドレナリン濃度またはインスリン濃度を個々の投与−応答曲線か
ら計算した。

【００６０】インスリンｍＲＮＡ解析：膵臓中のラットインスリン遺伝子、Ｉｎｓ１およびＩｎｓ２のＲＮＡレベルを
、半定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。５ヶ月齢のオスのラットを７時間絶食さ
せ、膵臓をすぐに、またはグルコース投与後に摘出した。後者の場合、グルコー
ス（２ｇ／ｋｇ体重、続いて１ｇ／ｋｇ体重）を０分後と６０分後に腹膜内に注
射し、ラットを１２０分後に犠牲死させた。全膵臓ＲＮＡ（０．７５Ｔｇ）を、
ＢＲＬＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、製品に記載の通りに、全量２０Ｔｌ中
で逆転写した。Ｉｎｓ１およびＩｎｓ２の２つの転写物を両方のインスリン遺伝
子に共通のプライマー（５’−ＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＧＧＴ−３
’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡ反応（５Ｔｌ）を
ＤｙｎａｚｙｍｅＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液（ＦｉｎｎｚｙｍｅｓＯ
ｙ）を含む２５ＴｌのＰＣＲ溶液中に直接導入した。Ｉｎｓ１およびＩｎｓ２遺
伝子を、^３２Ｐ標識した特異的なプライマー（Ｉｎｓ１プライマー：５’―ＧＴ
ＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、およ
び５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣ−３’、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３；Ｉｎｓ２プライマー：５’−ＧＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＴＣＧＧＡ
Ａ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、および５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧ
ＡＡＧＧＴＣＡ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：５）を用いた分離反応にて、９４
℃にて３分間変性させ、続いて９４℃にて３０秒間変性させ、６２℃にて３０秒
間アニ−ルし、７２℃にて１分間伸張させる２０サイクル、最終伸張は７２℃に
て７分間を行なうことにより、増幅した。インスリン特異的産物がサイクル２４
まで指数関数的に増大した。試料（１５Ｔｌ）を６％のポリアクリルアミドゲル
上で分離し、乾燥させ、放射能で可視化し、リン光体イメージャー解析（Ｆｕｊ
ｉｘＢＡＳ１０００）により定量化した。

【００６１】遺伝子型解析およびマーカーの位置測定：ラットを、それぞれの対の一つのプライマーを標識するために、^３３Ｐ−ＫＡ
ＴＰを用いたことを除いては、Ｊａｃｏｂ，Ｈ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，
１９９１，６７：２１３〜２２４に記載のようにマイクロサテライトマーカーの
ＰＣＲ増幅により、遺伝子型決定した。新規マーカーの遺伝的マッピングのため
に、ＧＫおよびＦ３４４ラットの初めのＦ２交雑ラットからのもっとも極端なグ
ルコース値を持つ４５匹のラットを遺伝子型決定し、マーカーをコンピュータ−
パッケージ、Ｍａｐｍａｋｅｒ／ｅｘｐ３．０を用いて遺伝子マップ上に位置付
けた。

【００６２】新規ＲＦＬＰマーカーの生成およびサザンブロット解析：ハイブリダイゼーションプローブをＲＴ−ＰＣＲまたはゲノムＰＣＲにより、
入手可能なラットｃＤＮＡ配列および遺伝子特異的なプライマーを用いて合成し
た。全ＲＮＡを前記のように調製した。６ＴｇのＲＮＡをＢＲＬＳｕｐｅｒｓ
ｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ））を用いて、製品に記載の通り転写した。Ｊａｋ２プローブに対しては、
１日齢のラット全体を用いて、トータルＲＮＡを逆転写酵素反応（ｃＤＮＡプラ
イマー：５’−ＡＡＧＧＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧ−３’、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６）より調製した。２Ｔｌの逆転写酵素反応液を、９６℃にて４分間の
変性、続いて９６℃にて３０秒間の変性、５５℃にて１分間のアニ−ル、７２℃
にて２分間の伸長の３５サイクル、そして７２℃にて７分間の最終伸張というＰ
ＣＲプロフィールを用いた、連続ＰＣＲ増幅（プライマー：５’−ＡＡＧＧＧＣ
ＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、および５’−Ｇ
ＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）に
導入した。ｊａｋ２遺伝子は、ＧＫ中の断片長が８．６ｋｂ、Ｆ３４４では６．
４ｋｂを持つＨｉｎｄＩＩＩＲＦＬＰにより、位置決定した。全膵臓ＲＮＡ
由来のＰｎｌｉｐｍＲＮＡを、５’−ＡＣＴＡＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＡＣ
ＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）の核酸配列を持つプライマーを用い
て逆転写した。ＰＣＲの条件は、アニ−ルの温度が５０℃であったことを除いて
はｊａｋ２反応と同一であった（プライマー：５’−ＣＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＴ
ＴＧＴＧＧＡＴＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、および５’−ＡＣＴＡＣＡ
ＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）。最初
の増幅からの１Ｔｌを第二ネスト化ＰＣＲの鋳型として用いた（プライマー：５
’−ＡＣＴＴＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＣ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：
１１および５’−ＴＴＧＧＧＴＡＧＡＧＴＴＧＧＧＴＴＧＡＴ−３’、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１２；アニ−ルを５３℃にて行なった以外はＪａｋ２と同様の条件
）。ＳｔｕＩＲＦＬＰを、Ｐｎｌｉｐ遺伝子を遺伝的に位置決定するために用
いた。ＧＫ中の断片は１８ｋｂであり、Ｆ３４４中では１４および４ｋｂであっ
た。Ｈｔｒ７遺伝子はＰｎｌｉｐと同様の条件のゲノムＰＣＲにより増幅した（
第一ＰＣＲ増幅のプライマー：５’−ＣＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣ
ＴＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３および５’−ＧＧＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴ
ＧＡＡＣＴＧＴＧＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４；第二繰り込みＰＣＲプ
ライマー：５’−ＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧ−３’、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１５および５’−ＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＴＡ
−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）。ＭｓｐＩＲＦＬＰを、ＧＫで５．５ｋ
ｂおよびＦ３４４で４．５ｋｂの断片を生じさせたＰｎｌｉｐに対して同定した
。サザンブロット解析を、ラット肝臓から抽出し、適切な制限エンドヌクレアー
ゼで分解した高分子量ＤＮＡ（１０Ｔｇ）で行なった。０．８％アガロースゲル
中での分画およびナイロン膜（Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）への転
写後、^３２ＰＫ標識ＲＦＬＰプローブ（ランダムプライミング）を用いて、膜を
プローブ化した。

【００６３】Ｉｄｅの遺伝的位置決定：ハイブリッド形成のためのＩｄｅプローブを、入手可能なラットｃＤＮＡ配列
（ジーンバンク受け入れ番号（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．）
Ｘ６７２６９Ｓ５３９６９）および遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ
−ＰＣＲにより合成した。逆転写反応のために、トータルＲＮＡを、前記のよう
に１日齢ラット全体から調製した。６ＴｇのＲＮＡを、ＢＲＬＳｕｐｅｒｓｃ
ｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ））を用いて、製品に記載の通りに、全量で２０Ｔｌ中で転写した。ＩＤＥ
ｍＲＮＡを５’−ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１７）の核酸配列を持つプライマーを用いて逆転写し、２Ｔｌの逆
転写酵素反応を続くＰＣＲ増幅（プライマー：５’−ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧ
ＡＴＴＡＡＣＴＡＡＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８および５’−ＡＧＣＴ
ＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）に導入
した。使用したＰＣＲプロフィールは、９４℃にて４分間の変性、そして９４℃
にて３０秒間の変性、５５℃にて１分間のアニ−ル、および７２℃にて２分間の
伸張の３０サイクル、および７２℃にて７分間での最終伸長であった。サザンブ
ロット解析を前記のように行なった。ＨｉｎｃＩＩＲＦＬＰを、ＧＫでは２．
７ｋｂ、Ｆ３４４では０．７ｋｂの断片を産出したと同定した。

【００６４】ラットＩＤＥｃＤＮＡの配列決定：遺伝子特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した３１２８ｂｐ
のラットＩｄｅｃＤＮＡ断片を配列決定した。６Ｔｇのラットの肝臓から調製
したトータルＲＮＡを５’−ＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＴＡＡＴＴＧＣ−３’
（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）の核酸配列を持つｃＤＮＡプライマーを用いた２
Ｔｌ逆転写酵素反応に用いた。逆転写酵素反応の２Ｔｌを、ＥｘｐａｎｄＬｏ
ｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）を用いて、製品に記載の通りにＰＣＲ反応を行なった（ＰＣＲプ
ライマー：５’−ＡＴＧＣＧＧＡＡＣＧＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧ−３’、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２０および５’−ＡＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣ−３
’、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＰＣＲプロフィールは、９４℃にて２分間、そ
して３０サイクルの、９４℃にて１０秒間、５４℃にて３０秒間、６８℃にて２
．５分間、ただし最後の２０サイクルにおいてはそれぞれ６８℃にて２０秒間延
長し、そして６８℃にて７分間の最終伸長である）。ＲＴ−ＰＣＲ産物のＤＮＡ
配列をＡＢＩＰＲＩＳＭＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎキットおよびＩｄｅ特
異的プライマーを用いて、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７セミオートマチックシー
クエンサー（アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）、ＵＳＡ）にて決定した。

【００６５】プラスミド構築およびＣＯＳ１細胞トランスフェクション：ＧＫおよびＦ３４４からのＩｄｅｍＲＮＡを、上述したように、制限部位を
伴って伸長するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにて増幅した。完全な翻訳領
域を含む得られた３．１ｋｂｃＤＮＡ産物を、サイトメガロウイルスプロモー
ターの制御下、発現ベクターｐＣＭＶ４（Ｄ．ＷＲｕｓｓｅｌ，Ｄｅｐｔ．ｏ
ｆＭｏｌ．Ｇｅｎ．，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＳｏｕｔｈ
ｗｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃａｌｃｅｎｔｅｒ）のＢｇｌＩＩおよびＭｌｕＩ
制限部位内にライゲーションした。得られた構造物ｐＣＭＶ４−Ｉｄｅ（ＧＫ）
およびｐＣＭＶ４−Ｉｄｅ（Ｆ３４４）内のＩｄｅｃＤＮＡ挿入物を配列決定
し、ＰＣＲ人工産物を排除した。内部制限部位を使用して、ＧＫ配列変異体産出
ｐＣＭＶ４−Ｉｄｅ（Ｈ１８Ｒ）およびｐＣＭＶ４−Ｉｄｅ（Ａ８９０Ｖ）を分
離した。約６×１０^６個のＣＯＳ−１細胞に、エレクトロポレーション（バイオ
ラッドジーンパルサー（Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）、Ｒｉ
ｃｈｍｏｎｄＣＡ；１２００，Ｖ２５ＴＦ）によって、１Ｔｇのβ−ガラクト
シダーゼベクターｐＣＨ１１０（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）とともに１０ＴｇのｐＣＭＶ４−Ｉｄｅプラスミドを一過性にトランス
フェクトした。

【００６６】インスリン分解活性のアッセイ：トランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を６ｃｍペトリディッシュにまき、３６
時間、１０％ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でイン
キュベートした。続いて、細胞をＰＢＳにて２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
を含む３ｍｌのＤＭＥＭ中３７℃で前インキュベートし、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
と１５，０００ｃｐｍ／ｍｌの^１２５Ｉ−インスリン（標識インスリンの非標識
インスリンに対する比、１：１５０）を含む２ｍｌＤＭＥＭ中でインキュベー
トした。１００Ｔｌの３通りの分液を、インスリンの添加後３０、４５および６
０分の時点で取り除き、分解していないインスリンを２５％ＴＣＡの１容量にて
、氷上で３０分間沈殿させた。サンプルは１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離
され、上澄みが回収され、分解していないインスリンの量は放射能活性計数によ
って測定された。細胞をさらに２回ＰＢＳにて洗浄し、ＤＭＥＭ中で２時間イン
キュベートし、トリプシン処理し、ＰＢＳにて３回洗浄した。細胞（およそ３×
１０^６細胞／プレート）を、３００Ｔｌの０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中で１５秒間の超音波処理によって均質化の
ために回収した。ホモジネートを３５０ｇにて１０分間遠心し、インスリン分解
活性、タンパク質濃度（ＢｒａｄｌｅｙＡＮＤＲＥＪ）、β−ガラクトシダー
ゼ活性（ＭａｎｉａｔｉｓＡＮＤＲＥＪ）の測定、およびウエスタン解析のた
めに上清を回収した。１Ｔｇタンパク質を含む細胞溶解物の３通り分液を、２，
０００ｃｐｍの^１２５Ｉインスリンを含む１００Ｔｌのアッセイ緩衝液中で３７
℃にて１５分間インキュベートし、分解したインスリンの量を上記のように測定
した。すべての実験において、（ｐＣＭＶプラスミドをトランスフェクトした細
胞中の）バックグラウンドＣＯＳ１インスリン分解活性は、野生型ラットＩＤＥ
を発現している細胞の２０〜２５％であった。ＩＤＥタンパク質は、Ｍ．Ｒ．Ｒ
ｏｓｎｅｒ博士（ＡＮＤＲＥＪＡｄｒｒｅｓｓ）よりご供与いただいたＩＤＥ
抗体を用いて、標準の手順に従って免疫ブロットにより検出した。

【００６７】実施例２−Ｎｉｄｄｍ１副座の特徴付け：正常血糖Ｆ３４４ラットのバックグラウンドゲノム上へのＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１
糖尿病感受性対立遺伝子の移入を可能にするように飼育プロトコールを確立した
。長い区画をＧＫからＦ３４４ヘ移入し、このクロモソーム領域での感受性遺伝
子が欠失していないことを確かにした（図１）。コンジェニック種Ｆ３４４．Ｇ
Ｋ−Ｎｉｄｄｍ１ａ（Ｎｉｄｄｍ１ａ）のＧＫ特異的領域は、５２∀３ｃＭ長で
あり、およそ１５ｃＭの追加的ＧＫ対立遺伝子が隣接したＮｉｄｄｍ１に関して
すでに定義された、完全な２０ｃＭ９５％信頼区間を含んだ。多くの亜種をＮ
ｉｄｄｍ１ａより産出し、Ｎｉｄｄｍ１感受性遺伝子／遺伝子群の局在を定義し
た。これらの種のうち２つ、Ｆ３４４．ＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１ａ（Ｎｉｄｄｍ１ｂ
）およびＦ３４４．ＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１ｉ（Ｎｉｄｄｍ１ｉ）が、２８∀１ｃ
Ｍおよび２２∀１ｃＭのＧＫ間隔を保持した。２つのＧＫ領域を分離している
２つのマーカー（Ｃｙｐ２ｃ１２およびＤ１Ｍｇｈ２９）がＦ３４４対立遺伝子
に関してホモ接合体であるので（図１）、Ｎｉｄｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１ｉにお
けるＧＫ領域は、個別であり、重なり合っていない。すべてのコンジェニック種
を、戻し交配１０世代を経、遺伝的に純粋な動物を得た。種の純粋さを確認する
ために、ゲノム幅アッセイを、平均２０ｃＭの空間を持つ１１１マーカーで実施
した。糖尿病関連表現型に関する公知の座を解析するために特別に注意を払った
。ＧＫ由来対立遺伝子の残余はみられなかった。

【００６８】ＩＰＧＴＴを用いて、もともとのＦ２−交雑種中のＮｉｄｄｍ１座を想定し、
またコンジェニック種を特徴付けするのに適用した。さらなる動物をテストする
ために、ＩＰＧＴＴをより老齢ラットにて実施した（７０日と比較して９５日）
。完全なＮｉｄｄｍ１クロモソーム領域（５２ｃＭ）を持つＮｉｄｄｍ１ａラッ
トは、ＩＰＧＴＴの間、グルコース耐性においてＦ３４４と明らかに異なった（
図２Ａ）。Ｆ３４４と比較して、グルコースＡＵＣがＮｉｄｄｍ１ａ（ｐ＝０．
０００７）、Ｎｉｄｄｍ１ｂ（ｐ＝０．００２）およびＮｉｄｄｍ１ｉ（ｐ＝０
．００００１）にて有意に高かった。１５および３０分の時点での血清インスリ
ン濃度は、Ｆ３４４でのものに比べてＮｉｄｄｍ１ｉにて有意に低かった（ｐ＝
０．０１および０．００２）。Ｆ３４４ラットでＮｉｄｄｍ１ａ、Ｎｉｄｄｍ１
ｂまたはＮｉｄｄｍ１ｉを比較したときに、本実験では体重の差違は観察されな
かった。もっとも明白な差違は、グルコース注入の１５分後に観察され、Ｎｉｄ
ｄｍ１ａの平均グルコース濃度がＦ３４４（ｐ＝０．０００５）でのものよりも
４．０ｍｍｏｌ／ｌ（２６％）高かった。また、Ｎｉｄｄｍ１座の分離部分を持
つ２つのコンジェニック種は、対照Ｆ３４４ラットと比較して有意に高い食後グ
ルコース濃度を示した。

【００６９】対照Ｆ３４４ラットと比較した、Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉのＩＰ
ＧＴＴの結果を図２Ｂに示している。グルコース注入後１５分の時点で、Ｎｉｄ
ｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１ｉラットは、Ｆ３４４にくらべて２．３ｍｍｏｌ／ｌ（
１５％）および４．７ｍｍｏｌ／ｌ（３１％）高いグルコース濃度を示した（ｐ
＝０．００８およびｐ＝０．００００５）。２つの亜種（Ｎｉｄｄｍ１ｂおよび
Ｎｉｄｄｍ１ｉ）に関するＦ３４４に対するＡＵＣ増加の合計は、親株（Ｎｉｄ
ｄｍ１ａ）のＡＵＣ増加よりも明確に大きかった。Ｎｉｄｄｍ１ａの１７１と比
較して、Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉの合計ＡＵＣは３２５であり、こ
のことは明らかに、非対立遺伝子相互作用（エピスタシス）がＮｉｄｄｍ１座内
で働いていることを示唆している。

【００７０】Ｎｉｄｄｍ１ｂと比較した場合のＮｉｄｄｍ１ｉの識別特徴は、１５および３
０分の時点での有意に低い血清インスリン濃度である（ｐ＝０．０３およびｐ＝
０．００２）。注入後１５および３０分の時点で、Ｎｉｄｄｍ１ｉのインスリン
値は、Ｆ３４４に比べて、３８５ｐｍｏｌ／ｌ（２７％、ｐ＝０．０１２）およ
び２９４ｐｍｏｌ／ｌ（２４％、ｐ＝０．００２）低かった（図２Ｄ）。Ｆ３４
４と、Ｎｉｄｄｍ１ａまたはＮｉｄｄｍ１ｂいずれかを比較した場合に、インス
リン濃度に有意な差は観察されなかった（図２ＣおよびＤ）。Ｎｉｄｄｍ１ｉと
Ｎｉｄｄｍ１ｂ両方が、グルコース濃度に影響を与えるが、クロモソーム１の異
なる部分をカバーしており、ｉｎｖｉｖｏでのグルコース刺激インスリン分泌
の主要な差違を示しているので、Ｎｉｄｄｍ１座が、少なくとも２つのグルコー
ス恒常性に影響を与える分離遺伝子含んでいることが明らかである。

【００７１】実施例３−Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉでの糖尿病進行：Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉ座でのＧＫ対立遺伝子に関連した糖尿病
表現型をさらに調査するために、コンジェニックラットを、見込み研究において
、異なる年齢で研究した。座におけるそれぞれのＧＫ体質遺伝子の表現型的効果
を特徴付けするために、ＧＫ／Ｆ３４４ヘテロ接合体動物も研究した。ヘテロ接
合体動物は、Ｎｉｄｄｍ１ｂまたはＮｉｄｄｍ１ｉをＦ３４４と戻し交配して産
出した。これらの動物はＮｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４およびＮｉｄｄｍ１ｉ／Ｆ３
４４と表示し、各座でのヘテロ接合体性質を示した。Ｆ３４４ラットからのホモ
接合体（ＧＫ／ＧＫ）またはヘテロ接合体（ＧＫ／Ｆ３４４）中にＮｉｄｄｍ１
ｂまたはＮｉｄｄｍ１ｉ座を持つオスラットに、６５および９５日の時点でＩＰ
ＧＴＴを実施した。１８５日齢の時点で、血中グルコース、血清インスリン、ト
リグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールの基礎レベルを決
定し、続いて、動物を犠牲死させ、精巣上体脂肪貯蔵体を計量した。

【００７２】６５日の時点で、Ｎｉｄｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４が、Ｆ３４４ラ
ットと比較して、ＩＰＧＴＴの間の早い時点（１５および３０分）で、食後グル
コース濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）のわずかな上昇を示した（表１）。しかしながら、
基礎および３０分血漿インスリン濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）が、Ｎｉｄｄｍ１ｂおよ
びＮｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４において有意に高かった（表１）。

【表１】

【００７３】Ｎｉｄｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４での基準インスリン濃度（ｐ
ｍｏｌ／ｌ）は、Ｆ３４４と比較して、５８％および４２％高く、注入後３０分
時点の相当する増加は、９７％および７２％であった。図２で示した実験にした
がって、中年齢（９５日）Ｎｉｄｄｍ１ｂラットでの食後グルコース濃度（ｍｍ
ｏｌ／ｌ）はＦ３４４での濃度に比べて有意に高かった（表２）。

【表２】

【００７４】Ｎｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４とＦ３４４の間で、グルコース濃度における差は観
察されなかった。この日齢で、ヘテロ接合体動物中の血清インスリン濃度はまだ
わずかに高かった（１５および３０分）。反対に、ホモ接合体動物で、わずかな
インスリン減少が観察された（表２）。Ｎｉｄｄｍ１ｂでのインスリンレベルは
、ＩＰＧＴＴの間、Ｆ３４４とは有意に異なっていなかったけれども、インスリ
ン分泌が、グルコース濃度の増加を考慮して減損された。

【００７５】より後期（１８５日）に、Ｎｉｄｄｍ１ｂでの基準グルコースおよび基準イン
スリン濃度はＦ３４４ラットにおける濃度よりも有意に高かった（表３）。トリ
グリセリドおよびＨＤＬコレステロールの濃度もまた、Ｎｉｄｄｍ１ｂにおいて
、Ｆ３４４ラットにおけるよりも有意に高く（表３）、一方で総コレステロール
濃度は異ならなかった。Ｎｉｄｄｍ１ｂラットでのコレステロール濃度に比べて
、ヘテロ接合体ラット（Ｎｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４）中の総コレステロール濃度
およびＨＤＬコレステロール濃度両方が、Ｆ３４４ラット中の濃度よりも有意に
低かった。Ｎｉｄｄｍ１ｂ／Ｆ３４４とＦ３４４の間では基礎グルコース、イン
スリン又はトリグリセリド濃度における差異は観察されなかった。更に、Ｎｉｄ
ｄｍ１ｂラットは本実験群（表１〜３）で、Ｆ３４４ラットに比べて有意に重く
（６５、９５および１８５日の時点でそれぞれ１０％、９％および６％）、精巣
上体脂肪重量は１８％まで増加した（表３）。Ｎｉｄｄｍ１ｂ体重の増加は、第
一実験では観察されず、このことは、単に幼少期の間の栄養の違いの結果を反映
している可能性が排除できない。しかしながら、体重に対する遺伝的関連が、Ｎ
ｉｄｄｍ１ｂに相当する領域でのＧＫラットの本来の遺伝的解析で観察された。
上記Ｇａｌｌｉｅｔａｌ．，１９９６を参照のこと。

【表３】

【００７６】Ｎｉｄｄｍ１ｉラットにおいて、９５日での食後グルコース濃度は、Ｆ３４４
ラットと比較して、有意に高かった（表２）。さらに、第一実験群（表２）と同
様に、ＩＰＧＴＴの間の血清インスリン濃度はＮｉｄｄｍ１ｉラットにおいてよ
り低かった（表２）。また、６５日齢Ｎｉｄｄｍ１ｉラットにおいて、インスリ
ン濃度が、Ｆ３４４ラットと比較して低く、このことは、Ｎｉｄｄｍ１ｉにおけ
る明白な、そして早期のＢ細胞欠失を示唆している。グルコース注入の１５分後
に、血中グルコース濃度がわずかに上昇したにもかかわらず、Ｎｉｄｄｍ１ｉラ
ットでのインスリン濃度は、Ｆ３４４ラットのものの５６％であった（表１）。
６５または９５日の時点で、Ｎｉｄｄｍ１ｉ／Ｆ３４４とＦ３４４ラット間で、
グルコースまたはインスリン濃度における主要な差違はみられなかった。１８５
日齢にて、Ｎｉｄｄｍ１ｉおよびＮｉｄｄｍ１ｉ／Ｆ３４４両方でＨＤＬコレス
テロールが高いことを除いて、Ｎｉｄｄｍ１ｉ、またはＮｉｄｄｍ１ｉ／Ｆ３４
４いずれもが、任意の解析した表現型に関してＦ３４４と異ならなかった（表３
）。

【００７７】実施例４−脂肪細胞でのインスリン活性：Ｎｉｄｄｍ１表現型をさらに特徴付けするために、脂肪細胞を、７５日齢のラ
ットの精巣上体脂肪貯蔵から単離した（Ｎｉｄｄｍ１ｉ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｆ３
４４およびＧＫ）。脂質生成を、インスリンの濃度の増加に対する応答での、脂
質内への放射活性グルコースの取り込みとして測定した。Ｆ３４４ラットと比較
して、Ｎｉｄｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１ｉラット両方からの脂肪細胞において、有
意に低い基準およびインスリン誘導脂質生成があったが、ＧＫラットからの脂肪
細胞よりも有意に高く、このことは、インスリンの活性の重度の減少を示してい
る（図３）。コンジェニック種Ｎｉｄｄｍ１ｂとＮｉｄｄｍ１ｉの間で有意な差
はなかった。インスリン誘導脂質生成のＥＣ_５０は、インスリン感受性での種内
差を表さなかった。さらに、脂肪分解を、単離した脂肪細胞からのグリセロール
放出を測定することで研究した。基礎脂肪分解またはノルアドレナリン誘導脂肪
分解のいずれでも有意な差は観察されなかった。このことは、インスリン活性に
て観察された差が、経路特異的欠失を反映しているが、一般的脂肪細胞不全を反
映してはいないことを示している。

【００７８】実施例５−候補遺伝子機能およびシンテニー保存：インスリン１遺伝子（Ｉｎｓ１）は、Ｎｉｄｄｍ１ｉ内に含まれ、グルコース
恒常性減損を引き起こす変異の候補であったＧＫ区画内で局在化されている。両
方の種が、膵臓において、同様の比較的多量のＩｎｓ１とＩｎｓ２ｍＲＮＡを含
んでいるけれども、ＧＫおよびＦ３４４ラット間のＩｎｓ１プロモーター配列で
の差が、転写開始部位に関連したヌクレオチド位置−２５８ｂｐで報告されてき
た。上記Ｇａｌｌｉ eｔａｌ．，１９９６。さらに詳細に、本遺伝的変異体
の潜在的な役割を調査するために、Ｉｎｓ１およびＩｎｓ２に対する安定状態ｍ
ＲＮＡの膵臓濃度を、７時間の断食期間後、および繰り返しグルコース注入の２
時間後、ＧＫ、Ｆ３４４およびＮｉｄｄｍ１ｉラット（ｎ＝４）での半定量ＲＴ
−ＰＣＲにて見積もった（図４）。Ｆ３４４と比較して、インスリン応答の減損
がＩＰＧＴＴの間に見られたにもかかわらず、総インスリンｍＲＮＡ濃度は、Ｎ
ｉｄｄｍ１ｉラットで３０％高かった。しかしながら、Ｉｎｓ１とＩｎｓ２の相
対的発現は、基準またはグルコース刺激状態いずれにおいても、種間で異ならな
かった。したがって、Ｉｎｓ１は、Ｎｉｄｄｍ１ｉ表現型に対する候補として排
除される。インスリンＲＮＡデータは、Ｎｉｄｄｌｍｉで観察されたインスリン
分泌の欠失が、インスリン転写の調節の下流に局在することを示している。

【００７９】ヒトおよびマウスにおけるＮｉｄｄｍ１に相当する相同領域の情報が、候補遺
伝子の局在化、およびＩＩ型糖尿病に関連した他の感受性座を伴うＮｉｄｄｍ１
ラット座、またはヒトまたはマウスでのその関連した表現型の比較のために重要
である。ラットクロモソーム１上で先にマップされた遺伝子およびラット、ヒト
およびマウス間で保存されたシンテニーによっておおよそ導かれて、３つの新規
な遺伝子が、ラットクロモソーム１上のＮｉｄｄｍ１座にマップされた。これら
は、（図１で太字で示した）Ｊａｎｕｓキナーゼ２（ＪＡＫ２）、５−ヒドロキ
シトリプタミンレセプター７（ＨＴＲ７）、および膵臓リパーゼ（ＰＮＬＩＰ）
をコードしている遺伝子である。このことは、Ｎｉｄｄｍ１座とヒトクロモソー
ム領域９ｐ２４間の相同性を示しており、さらには、ラットクロモソーム１、ヒ
トクロモソーム領域１０ｑ２４−２６、およびマウスクロモソーム１９間のシン
テニー保存を確かにしている（表４）。

【表４】

【００８０】実施例６−コンジェニック亜種および関連表現型：Ｎｉｄｄｍ１ｂのさらなる特徴付けのために、コンジェニック亜株を確立した
。Ｎｉｄｄｍ１ｂラットを、Ｆ３４４に戻し交配し、組換え体をＧＫ区画内で同
定した。ＧＫ区画の異なる部分をカバーしている３つの組換え体を選択し、ホモ
接合体株をＧＫ対立遺伝子に関して確立した。得られたコンジェニック種、Ｆ３
４４．ＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１ｃ（Ｎｉｄｄｍ１c)、Ｆ３４４．ＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１
ｆ（Ｎｉｄｄｍ１ｆ）、およびＦ３４４．ＧＫ−Ｎｉｄｄｍ１ｅ（Ｎｉｄｄｍ１
ｅ）は、ＧＫ対立遺伝子の、それぞれ、２３∀１ｃＭ、７．６∀１ｃＭ、および
３．７∀２ｃＭを保持した（図５）。

【００８１】腹膜内グルコース耐性試験をＮｉｄｄｍ１を同定するために、ならびにＮｉｄ
ｄｍ１ｂおよびＮｉｄｄｍ１ｉ亜座を定義するために使用したので、同様の試験
を、１ｃ、１ｅおよび１ｆ種を特徴付けするために適用した。Ｎｉｄｄｍ１ｂ内
の感受性遺伝子をマップするために、新規コンジェニック亜種（Ｎｉｄｄｍ１ｅ
、Ｎｉｄｄｍ１ｆ、およびＮｉｄｄｍ１ｃ）およびＦ３４４からのラットを、９
５日齢時にＩＰＧＴＴにかけた。Ｎｉｄｄｍ１ｂと同様に、Ｎｉｄｄｍ１ｅおよ
びＮｉｄｄｍ１ｆ両方における腹膜内グルコース濃度が、Ｆ３４４の場合と比べ
て有意に高かった（表５）。最も明白な差は、グルコース注入後３０分の時点で
観察され、その時、グルコース濃度は、Ｎｉｄｄｍ１ｅおよびＮｉｄｄｍ１ｆ両
方で２１％であった。基礎および３０分インスリン濃度もまた、Ｆ３４４におい
てよりも有意に高かった。グルコースまたはインスリン濃度における有意な差は
、Ｎｉｄｄｍ１ｃとＦ３４４の間では観察されなかった。

【表５】

【００８２】さらなる特徴付けのために、コンジェニック種を、多量の脂質を含む食事での
処置の後に調査した。Ｎｉｄｄｍ１ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｆおよびＦ３４４ラットを
、１２０日齢時点で開始して、実施例１で記述した高脂質食事で処置した。ラッ
トをＩＰＧＴＴにかけ、トリグリセリド、総コレステロール、およびＨＤＬコレ
ステロールの基準を２２５日齢時に測定し、続いて動物を犠牲死させ、精巣上体
脂肪貯蔵を計量した。この年齢にて、食後グルコース濃度は、Ｎｉｄｄｍ１ｅお
よびＮｉｄｄｍ１ｆにて、Ｆ３４４と比較してまだ有意に高かった（表６）。９
５日の時点でのＩＰＧＴＴとは対照的に、グルコース注入後のより遅い時点で差
がより顕著であった（表５）。注入後９０分の時点で、両コンジェニック中のグ
ルコース濃度は、Ｆ３４４に比べておよそ３０％高かった。基礎インスリン濃度
は、コンジェニックにおいて、Ｆ３４４に比べて有意に高かったが、しかしグル
コース注入後のインスリン濃度は高くなかった。この日齢において、体重および
腹膜内脂肪重量両方の増加が観察されたが、しかし、Ｎｉｄｄｍ１ｅで有意に増
加したのみであった。

【表６】

【００８３】実施例２で記述したように、Ｎｉｄｄｍ１ｂにおける基礎およびインスリン誘
導脂肪分解は、Ｆ３４４と比較して有意に減少した。同様の試験をＮｉｄｄｍ１
ｂ亜種、Ｎｉｄｄｍ１ｅおよびＮｉｄｄｍ１ｆおよび対照Ｆ３４４にて実施した
。脂肪分解はまた、Ｆ３４４と比較して、Ｎｉｄｄｍ１ｅおよびＮｉｄｄｍ１ｆ
両方において減少した（図６）。これらのデータに基づいて、Ｎｉｄｄｍ１ｂ糖
尿病感受性遺伝子／遺伝子群が、Ｎｉｄｄｍ１ｅの３．７ｃＭＧＫ区画に局在
化される。

【００８４】実施例７−ＤＮＡ配列解析およびＩｄｅの発現：候補遺伝子を、ヒトおよびマウスからの遺伝的マッピングデータを用いて同定
した。シンテニーが、ラットクロモソーム１ヒトクロモソーム９および１０、お
よびマウスクロモソーム１９上のＮｉｄｄｍ１領域間で保存されている。先に糖
尿病に関する候補として考えられてはいなかった１つの遺伝子は、インスリン分
解酵素（ＩＤＥ）をコードしている遺伝子であり、これは、ヒトクロモソーム１
０ｑ２４およびマウス１９にマップされた。Ｉｄｅ遺伝子は、制限断片長多型（
ＲＦＬＰ）解析によって、Ｎｉｄｄｍ１ｅのＧＫ区画内のラットクロモソーム１
上に遺伝的にマップされた（図５）。

【００８５】ＩＤＥタンパク質構造の変化が、Ｎｉｄｄｍ１ｅの表現型を説明する可能性を
調査するために、ＩＤＥのｃＤＮＡ配列を、ＧＫおよびＦ３４４ラットで決定し
た。遺伝子の完全翻訳部分の配列決定によって、ＧＫとＦ３４４ラットの間に３
つのヌクレオチドの違いが明らかになり、コード領域の５’−末端に１つ（コド
ン１８）、３’末端に２つ（コドン８９０および９３４）である（図７）。これ
らの２つはアミノ酸変化を起こし、コドン１８でのＣＡＣからＣＧＣの変化は、
結果としてヒスチジンに対するアラニンの置換、コドン８９０におけるＧＣＧか
らＧＴＧの変化は、結果としてアラニンに対するバリンの置換となる。第三の変
異体はサイレントであり、コドン９３４の最後の塩基が変化している（ＧＡＴが
ＧＡＣに）。さらに、ＩＤＥｃＤＮＡ配列を１２の他のラット種（ＤＡ、ＰＶ
Ｇ／ＲＴ１、ＰＶＧ／Ｂｋ、Ｌｅｗ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｃｏｐ、ＢＢ、Ｗ、ＳＤ、
ＦＲＬおよびＦＳＬ）で決定した。Ａ８９０Ｖ変異体はＧＫにとって特有であり
、一方でＨ１８Ｒはまた、種ＤＡ、ＡＣＩ、ＳＤ、ＦＲＬおよびＦＳＬにて見ら
れた（表７）。

【表７】

【００８６】ＩＤＥのＧＫ変異体の効果を研究するために、インスリン分解活性を、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ発現系で測定した。ＩＤＥは、トランスフェクトしたＣＯＳ１細胞で
過剰発現しており、細胞溶解物の、インスリンを加水分解する能力を研究した。
抗ＩＤＥ抗体を用いたウエスタンブロット解析によって、トランスフェクトした
ＩＤＥｃＤＮＡが確認された。ＧＫ対立遺伝子における２つのアミノ酸変異体
、Ｈ１８ＲおよびＡ８９０Ｖを、別々に、または組み合わせて研究した。Ｈ１８
ＲおよびＡ８９０Ｖ両方を含むＧＫ対立遺伝子をトランスフェクトしたもともと
の細胞におけるインスリン分解活性は、対照と比較して３４％（ｐ＜０．００１
）減少した（図８）。２つの変異体を別々に解析した場合、Ｈ１８Ｒのみが野生
型の活性のわずかな減少（８９％）、対照と比較してｐ＜０．００１を示し、一
方、Ａ８９０Ｖは正常であり、このことは、２つの変異体の相乗作用を示唆して
いる。細胞溶解物において、正常変異体と比較して、インスリン分解におけるＧ
Ｋ対立遺伝子に関して差は観察されなかった。

【００８７】Ｎｉｄｄｍ１ｅは、食後グルコース濃度の増加、単離した脂肪細胞での基礎お
よびインスリン誘導脂質生成の減損、体重および腹膜内脂肪量の増加、および高
インスリン血症を示した。さらに、Ｎｉｄｄｍ１ｅを、３．５ヶ月の期間、高脂
肪食で処理し、続いてこのラットを７．５ヶ月の時点でＩＰＧＴＴにかけた。こ
の年齢の時点で、Ｆ３４４と比較した場合に、グルコース濃度の最も明白な差が
、グルコース注入のさらに後の時点で観察され、より速い時点での若い動物では
見られなかった。したがって、糖尿病座Ｎｉｄｄｍ１ｂは、コンジェニック種Ｎ
ｉｄｄｍ１ｅ中の３ｃＭ領域であると再定義される。

【００８８】これらのデータは、ＩＤＥをコードしている遺伝子が、ＧＫラットでの糖尿病
表現型を部分的に説明しており、細胞内でのその多重活性のいくつかを通して、
Ｎｉｄｄｍ１ｅにおける高血糖およびインスリン耐性を引き起こしている。いく
つかの他の研究が、インスリン耐性と糖尿病に関連したインスリンクリアランス
の減少を示しており、このことは、インスリン分解における減少が、糖尿病表現
型を仲介可能であることを示唆している。可能性のある分子的説明は、末梢組織
において、そのレセプターに結合したインスリンの細胞内分解の減少が、インス
リンレセプターの、細胞膜へ戻る再循環を阻害し、したがって、細胞内の利用可
能なレセプターの数が減少するというものである。

【００８９】実施例８−ＮｉｄｄｍＣコンジェニック動物：上記Ｇａｌｌｉｅｔａｌ．，１９９６にて記述されたように、ゲノム幅連
結解析を使用して、糖尿病関連表現型に対する遺伝的連結を示しているクロモソ
ーム領域を局在化した。糖尿病関連表現型に対する連結に関する密接なゲノム幅
調査のために、ＧＫとＦ３４４ラット間で作製した交雑子孫のＦ２集団を、性お
よび相互交配に関して別々に、すべてのＦ２動物と一緒に解析した。表８は、少
なくとも１つの糖尿病関連表現型に関して、３以上のＬＯＤ（オッズ比の対数）
を持つ座を記述している。各クロモソーム領域の中央に位置するマーカーを表８
に示している。これはおよそ２５ｃＭの中央に局在しており、糖尿病関連表現型
に関するこれらのＱＴＬのそれぞれを含む。

【００９０】ＮｉｄｄｍＣ群のコンジェニック動物（ＮｉｄｄｍＣ２、ＮｉｄｄｍＣ３、Ｎ
ｉｄｄｍＣ５、ＮｉｄｄｍＣ７、ＮｉｄｄｍＣ９Ａ、ＮｉｄｄｍＣ９Ｂ、Ｎｉｄ
ｄｍＣ１０、ＮｉｄｄｍＣ１１、ＮｉｄｄｍＣ１３、ＮｉｄｄｍＣ１８、Ｎｉｄ
ｄｍＣ（１３＋１５）、ＮｉｄｄｍＣ（９＋１３＋１５））を、Ｆ３４４上にＧ
Ｋを戻し交配し、各世代で（ドナー）対立遺伝子由来の最大ＧＫを欠失している
子孫を選択すること（マーカー補助選別、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｔＲｅｓ．，６６（３）：２５５−６５，１９９５、およびＤａｒｖ
ａｓｉ，ＮａｔＧｅｎｅｔ．，１８（１）：１９−２４，１９９８を参照のこ
と）によって産出した。

【００９１】表９で列記したマイクロサテライトマーカーは、ＧＫとＦ３４４の交雑からの
Ｆ２子孫において同定されたＱＴＬをカバーしている。これらのマーカーは、Ｇ
ＫとＦ３４４対立遺伝子間を見分け、コンジェニック動物を産出するための戻し
交配の後にＧＫ対立遺伝子を表示する。それぞれのコンジェニック種の産出の間
に選別した、糖尿病関連ＱＴＬを表９に列記し、つづいて各ＱＴＬ内でのＧＫ由
来対立遺伝子を定義したマイクロサテライトマーカーを列記している。この選別
したクロモソーム領域外のすべての他の試験したマーカーはＦ３４４特異的遺伝
子型を示した。バックグラウンドマーカーは、ラットゲノムにそっておよそ５０
ｃＭごとに局在し、最大量のＧＫ由来（ドナー）バックグラウンドを欠失してい
る各戻し交配世代での子孫を選択することによって、特異的に選別された。

【００９２】表１０は、ＩＩ型糖尿病に関連した表現型（肥満、インスリン抵抗性、グルコ
ース不耐および異脂肪血症）を調節する代謝症候群ＱＴＬのまとめを提供してい
る。クロモソーム領域に連結した表現型はＦ２集団で見られる。コンジェニック
動物は、各著名な座に関して生成され、表現型は、少なくとも５匹の異なるコン
ジェニック動物内で確認された。

【表８】

【表９】

【表１０】

【００９３】他の実施形態本発明が、その詳細な記述と関連して記述される一方で、以上の記述は本発明
の範囲を例示する意図であり、限定するものではなく、付随する請求項の範囲に
よって定義される。他の観点、利点および改変は、請求項の範囲内である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】コンジェニック種Ｎｉｄｄｍ１ａ、ｎｉｄｄｍ１ｂ、およびＮｉｄｄｍ１ｉで
のラットクロモソーム１の遠位部分の遺伝子マップである。

【図２】Ｎｉｄｄｍ１コンジェニックおよびＦ３４４ラットの腹膜内グルコース耐性試
験を図示したグラフである。

【図３】Ｆ３４４、ＧＫ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、およびＮｉｄｄｍ１ｉラットでのインスリ
ンによって刺激される合成の結果として、脂質内へのグルコースの取り込みを図
示したグラフである。

【図４】ＧＫ、Ｆ３４４およびＮｉｄｄｍ１ラットでのインスリンＲＮＡの定量的解析
を示したグラフである。

【図５】コンジェニックラット種Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｎｉｄｄｍ１ｃ、Ｎｉｄｄｍ１ｆお
よびＮｉｄｄｍ１ｅラットでの、ラットクロモソーム１の部分の遺伝的マップで
ある。

【図６】精巣上体脂肪から単離した脂肪細胞における脂質生成を図示したグラフである
。

【図７】ラットインスリン分解酵素（ＩＤＥ）をコードしている遺伝子の翻訳部分の概
略図である。

【図８】もともとのＣＯＳ−１細胞内での、野生型ＩＤＥおよびＩＤＥ変異体Ａ８９０
Ｖ（すなわち、アミノ酸８９０の位置でアラニンの代わりにバリンであるもの）
、Ｈ１８Ｒ（すなわち、アミノ酸１８の位置でヒスチジンの代わりにアルギニン
であるもの）、およびＡ８９０Ｖ＋Ｈ１８Ｒのインスリン分解活性を図示してい
るグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA14 CA04 DA02 EA04 GA14 HA01 4B050 CC04 DD11 LL03 LL10 4B065 AA90X AA91Y AC14 BA03 CA33 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ドナー動物およびレシピエント動物の遺伝的物質を含む非ヒ
トコンジェニック動物であって、前記コンジェニック動物がＩＩ型糖尿病関連表
現型を示し、前記コンジェニック動物のゲノムの約１未満のクロモソームが前記
ドナー動物から由来し、前記ドナーからの前記遺伝的物質が前記コンジェニック
動物での前記ＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要である、非ヒトコンジェニッ
ク動物。
【請求項２】前記コンジェニック動物がマーカー定義される、請求項１に
記載の動物。
【請求項３】約５０ｃＭ未満の前記コンジェニック動物ゲノムが、前記ド
ナーから由来する、請求項１に記載の動物。
【請求項４】約２０ｃＭ未満の前記コンジェニック動物ゲノムが、前記ド
ナーから由来する、請求項１に記載の動物。
【請求項５】約１０ｃＭ未満の前記コンジェニック動物ゲノムが、前記ド
ナーから由来する、請求項１に記載の動物。
【請求項６】約５ｃＭ未満の前記コンジェニック動物ゲノムが、前記ドナ
ーから由来する、請求項１に記載の動物。
【請求項７】前記ＩＩ型糖尿病表現型が、食後血糖の上昇、高血圧、グル
コース不耐性、インスリン耐性、異常インスリン分泌、インスリン活性減少、体
重増加、異脂肪血症、高インスリン血漿、脂質生成障害、グリコーゲン代謝変化
、凝固アテローム性動脈硬化症変化、腎機能変化、神経機能変化、眼機能変化、
肥満および炎症からなる群より選択される、請求項１に記載の動物。
【請求項８】前記ドナー動物のゲノムが、Ｎｉｄｄｍ１ａゲノム区画を含
む、請求項１に記載の動物。
【請求項９】前記ドナー由来の前記コンジェニック動物のゲノムが、Ｎｉ
ｄｄｍ１ｅゲノム区画を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項１０】前記ドナー由来の前記コンジェニック動物ゲノムが、Ｎｉ
ｄｄｍ１ａ、Ｎｉｄｄｍ１ｂ、Ｎｉｄｄｍ１ｃ、Ｎｉｄｄｍ１ｄ、Ｎｉｄｄｍ１
ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｆ、Ｎｉｄｄｍ１ｇ、Ｎｉｄｄｍ１ｈおよびＮｉｄｄｍ１ｉか
らなる群より選択したゲノム区画から選択される、請求項１に記載の動物。
【請求項１１】前記ドナー由来の前記コンジェニック動物のゲノムが、Ｎ
ｉｄｄｍＣ２、ＮｉｄｄｍＣ３、ＮｉｄｄｍＣ５、ＮｉｄｄｍＣ７、Ｎｉｄｄｍ
Ｃ９Ａ、ＮｉｄｄｍＣ９Ｂ、ＮｉｄｄｍＣ１０、ＮｉｄｄｍＣ１１、Ｎｉｄｄｍ
Ｃ１３、ＮｉｄｄｍＣ１８、ＮｉｄｄｍＣ（１３＋１５）、およびＮｉｄｄｍＣ
（９＋１３＋１５）からなる群より選択したゲノム区画から選択される、請求項
１に記載の動物。
【請求項１２】前記コンジェニック動物の実質的にすべてのミトコンドリ
アが、前記レシピエント動物または前記ドナー動物のいずれかから由来する、請
求項１に記載の動物。
【請求項１３】前記コンジェニック動物の実質的にすべてのミトコンドリ
アが、前記レシピエントから由来する、請求項１に記載の動物。
【請求項１４】請求項１に記載のコンジェニック動物の単離細胞。
【請求項１５】前記細胞が、脂肪細胞、血管間膜細胞、肝細胞、膵臓細胞
、筋肉細胞、内皮細胞および神経細胞からなる群より選択される、請求項１４に
記載の細胞。
【請求項１６】請求項１に記載のコンジェニック動物から由来した組織培
養物。
【請求項１７】前記培養物が、脂肪組織、血管間膜組織、肝臓組織、膵臓
組織、筋肉組織、血管組織、および神経組織からなる群より選択される、請求項
１６に記載の組織培養物。
【請求項１８】前記コンジェニック動物が、非ヒト哺乳動物、昆虫および
鳥類からなる群より選択される、請求項１に記載のコンジェニック動物。
【請求項１９】前記非ヒト哺乳動物が、齧歯類動物またはブタである、請
求項１に記載のコンジェニック動物。
【請求項２０】前記齧歯類動物がラット、マウスまたはモルモットである
、請求項１９に記載のコンジェニック動物。
【請求項２１】前記齧歯類動物がラットである、請求項２０に記載のコン
ジェニック動物。
【請求項２２】複数の非ヒトコンジェニック動物を含む非ヒトコンジェニ
ック動物集団であって、前記コンジェニック動物が複数のＩＩ型糖尿病関連表現
型を示し、前記複数のコンジェニック動物内の各コンジェニック動物はドナー動
物およびレシピエント動物からの遺伝的物質を含み、約０．１％〜約５０％の各
コンジェニック動物のゲノムは前記ドナー動物から由来し、前記ドナー動物由来
の前記遺伝的物質が各前記コンジェニック動物での前記ＩＩ型糖尿病関連表現型
の発現に必要である、非ヒトコンジェニック動物集団。
【請求項２３】薬理学的に活性な化合物を試験する方法であって、ａ）試験化合物を、ＩＩ型糖尿病関連表現型を示す非ヒトコンジェニック動物
に投与する工程であって、前記非ヒトコンジェニック動物がドナー動物およびレ
シピエント動物の遺伝的物質を含み、約５０ｃＭ未満の前記コンジェニック動物
のゲノムが前記ドナー動物から由来し、前記ドナー由来の前記遺伝的物質が前記
コンジェニック動物でのＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要である工程と、ｂ）前記試験化合物を、前記コンジェニック動物での少なくとも１つのＩＩ型
糖尿病関連表現型における効果に関して評価する工程とを含む方法。
【請求項２４】前記コンジェニック動物が、Ｎｉｄｄｍ１ａ遺伝的区画を
含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記コンジェニック動物が、Ｎｉｄｄｍ１ｅ遺伝的区画を
含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】前記コンジェニック動物が、Ｎｉｄｄｍ１ａ、Ｎｉｄｄｍ
１ｂ、Ｎｉｄｄｍ１ｃ、Ｎｉｄｄｍ１ｄ、Ｎｉｄｄｍ１ｅ、Ｎｉｄｄｍ１ｆ、Ｎ
ｉｄｄｍ１ｇ、Ｎｉｄｄｍ１ｈおよびＮｉｄｄｍ１ｉからなる群より選択された
Ｎｉｄｄｍ１遺伝的区画を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】前記動物が２匹のコンジェニック親動物間の交配の子孫動
物を含み、前記親動物が異なるコンジェニック区画を有する、請求項２３に記載
の方法。
【請求項２８】薬理学的に活性な化合物を試験するための方法であって、ａ）試験化合物を、複数のＩＩ型糖尿病関連表現型を示す複数の非ヒトコンジ
ェニック動物群に投与する工程と、ｂ）少なくとも１つのＩＩ型糖尿病関連表現型における効果に関して前記試験
化合物を評価する工程であって、前記複数のコンジェニック動物内の各コンジェ
ニック動物がドナー動物およびレシピエント動物からの遺伝的物質を含み、各コ
ンジェニック動物のゲノムの約０．１％〜約５０％が前記ドナー動物から由来し
、前記ドナーからの前記遺伝的物質が各前記コンジェニック動物での前記ＩＩ型
糖尿病関連表現型の発現に必要である工程とを含む方法。
【請求項２９】前記複数のコンジェニック動物が、異なるクロモソーム上
のコンジェニック区画を有する少なくとも２匹のラットを含む、請求項２８に記
載の方法。
【請求項３０】ＩＩ型糖尿病関連表現型を示す非ヒトコンジェニック動物
の単離細胞を含む製造物品。
【請求項３１】前記物品が、前記細胞がＩＩ型糖尿病関連表現型を軽減す
るのに効果的である可能性のある化合物を評価するために有用であることを示し
ているラベルまたはパッケージ貼付文章をさらに含む、請求項３０に記載の物品
。
【請求項３２】ビジネスを行う方法であって、ａ）ＩＩ型糖尿病関連表現型を示している非ヒトコンジェニック動物、または
それから由来した細胞の販売を申し出る工程と、ｂ）前記動物が、ＩＩ型糖尿病関連表現型を軽減するために効果的である化合
物を試験しまたは評価するために効果的であることを伝達する工程とを含む方法。
【請求項３３】非ヒトコンジェニック動物を作製する方法であって、ａ）ドナー動物とレシピエント動物を交配し、子孫動物を産出する工程と、ｂ）少なくとも１０世代、前記子孫動物を前記レシピエント動物と首尾よく戻
し交配し、前記コンジェニック動物を産出する工程であって、前記コンジェニッ
ク動物がＩＩ型糖尿病関連表現型を示し、約５０ｃＭ未満の前記コンジェニック
動物のゲノムが前記ドナー動物から由来し、前記ドナーの前記遺伝的物質が前記
コンジェニック動物での前記ＩＩ型糖尿病関連表現型の発現に必要である工程と
を含む方法。
【請求項３４】単離されたインスリン分解ポリペプチドであって、前記ポ
リペプチドが少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＩＩ型
糖尿病関連表現型と関連する、ポリペプチド。
【請求項３５】前記ポリペプチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ
酸配列中、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項３４に記載のポリペプ
チド。
【請求項３６】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ酸１８でアルギニン残
基が置換されている、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ酸８９０でバリン残基
がを置換されている、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３８】前記ポリペプチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ
酸１８およびアミノ酸８９０での置換を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオ
チド。
【請求項３９】インスリン分解ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレ
オチドであって、前記ポリペプチドがアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が
ＩＩ型糖尿病関連表現型に関連している、ポリヌクレオチド。
【請求項４０】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ酸１８でアルギニン残
基が置換されている、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ酸８９０でバリン残基
が置換されている、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２のヌ
クレオチド２８１７にシトシン残基を有する、請求項３９に記載のポリヌクレオ
チド。
【請求項４３】ゲノムがインスリン分解ポリペプチドトランス遺伝子を含
むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記トランス遺伝子が、インスリン
分解ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに作用可能に連結された調
節ポリヌクレオチドを含み、前記インスリン分解ポリペプチドがＩＩ型糖尿病関
連表現型に関連したアミノ酸置換を有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】前記動物が、ラットである、請求項４３に記載の動物。
【請求項４５】前記動物が、マウスである、請求項４３に記載の動物。