JPH10298100A - インスリン抵抗性に起因する疾患の予防及び／又は治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インスリン抵抗性に起因する疾患の予防及び
／又は治療剤を提供する。 【解決手段】 ボンベシン受容体サブタイプ３（ＢＲＳ
−３）に親和性を有する物質、例えば、ボンベシン様ペ
プチド又はそれら誘導体を有効成分とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インスリン抵抗性
に起因する疾患の予防及び／又は治療に関し、更に詳細
には、ボンベシン受容体サブタイプ３（ＢＲＳ−３）に
親和性を有する物質を有効成分とする、糖尿病、肥満
症、高血圧症及び高脂血症等のインスリン抵抗性に起因
する疾患の予防及び／又は治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】食生活
と生活様式の欧米化に伴い、成人病の増加が重要な社会
問題となってきている。最近この成人病の中の、肥満、
糖尿病、高血圧、高脂血症が重積する臨床病態が注目さ
れ、Reaven、Keplanおよび松沢によりそれぞれSyndrome
X、Deadly Quartet（死の四重奏）及び内臓脂肪症候群
と命名されている。これらは、ほぼ同じ臨床的特徴を異
なる名称で表現したもので、動脈硬化症の危険因子とし
て、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症が重積を重視し、
重積する原因としてインスリン抵抗性に注目しているも
のである。（臨床化学 Vol.29, 421-429, 1993, 4月号
参照。）

【０００３】このように、肥満、糖尿病、高血圧、高脂
血症の患者の基盤にインスリン抵抗性が存在しているこ
とは確立した見解となっているが、そのインスリン抵抗
性の成立機序に関しては種々の説が唱えられたものの、
広く受け入れられる明確な説明は存在しておらず、また
この病態の成立機序そのものに立脚した有効な治療法も
確立していない。

【０００４】一方、ボンベシン様ヘプチドは、中枢神経
系や消化管に広く分布するニューロペプチドであり、ほ
乳類におけるボンベシン様ペプチドとしては、ガストリ
ン放出ペプチド（ＧＲＰ）とニューロメジンＢ（ＮＭ
Ｂ）がある。現在までの薬理実験によると、その作用
は、平滑筋の収縮、内外分布、細胞増殖、体温、摂食行
動の調節であり、多彩である。また、ボンベシン様ペプ
チドの受容体としては、ガストリン放出ペプチド受容体
（ＧＲＰ−Ｒ）、ニューロメジンＢ受容体（ＮＭＢ−
Ｒ）、ボンベシン受容体サブタイプ−３（ＢＲＳ−３）
が知られている。このなかで、ＢＲＳ−３は、肺ガン細
胞に発現がみられていることから、癌細胞の増殖に関わ
っていることが示唆されているが、生理的リガンドも未
だ見いだされておらず、通常の生活活動におけるその存
在意義は不明である（J. Battery et al.,Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., Vol.88, 395-399, 1991、Z. Fathi
et al.,J. Biol. Chem., Vol.268, 5979-5984, 199
3）。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ボンベシ
ン様ペプチド受容体の生理機能を明らかにすることを目
的とし、ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子機能欠損動
物、例えばＢＲＳ−３遺伝子機能欠損マウスを作成し、
その生理的表現系につき対照マウスとの比較を詳細に実
施してきた。その結果、ＢＲＳ−３遺伝子機能欠損マウ
スは生後２０週目以降より空腹時血中インスリン値の増
加、糖負荷試験における血中インスリン値の上昇と消失
遅延、インスリン耐性試験における糖処理能の低下、体
重増加、収縮期血圧の上昇等の明瞭なインスリン抵抗状
態を示すことが観察された。これらの結果は、ＢＲＳ−
３の生理機能はインスリン抵抗性の発症と密接な関連が
あることを示すものであり、ＢＲＳ−３に親和性を有し
ＢＲＳ−３の生理機能に影響を及ぼす物質（以下これを
単に「ＢＲＳ−３に親和性を有する物質」ということが
ある）は、インスリン抵抗性に起因する疾患の優れた予
防及び／又は治療剤になりうることが期待された。本発
明は、これらの知見を基に成し遂げられたものである。

【０００６】すなわち、本発明は、ボンベシン受容体サ
ブタイプ３（ＢＲＳ−３）に親和性を有する物質を有効
成分とするインスリン抵抗性に起因する疾患の予防及び
／又は治療剤である。

【０００７】この発明の好ましい態様によれば、ボンベ
シン受容体サブタイプ３（ＢＲＳ−３）に親和性を有す
る物質が、ボンベシン様ペプチド又はそれら誘導体であ
る請求項１に記載の予防及び／又は治療剤；インスリン
抵抗性に起因する疾患が、糖尿病、高インスリン血症、
肥満症、高血圧症又は高脂血症である請求項１に記載の
予防及び／又は治療剤が提供される。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下本発明を更に詳細に説明す
る。本発明において、ボンベシン様ペプチド受容体遺伝
子機能の欠損とは、該遺伝子が生来の構造とは異なって
いるために、正常なボンベシン様ペプチド受容体が産生
されないことをいう。ボンベシン様ペプチド受容体遺伝
子機能の欠損には、ボンベシン様ペプチド受容体タンパ
ク質自体が産生されないこと、及び一部を欠損するなど
して機能を発現し得ないボンベシン様ペプチド受容体タ
ンパク質を産生することが含まれる。

【０００９】本発明で用いるボンベシン様ペプチド受容
体遺伝子、例えばＢＲＳ−３遺伝子の機能を人為的に欠
損させた動物は、従来からトランスジェニック動物の作
成に用いられているそれ自体公知の方法で作成できる。

【００１０】例えば、先ずプロモーター領域又はコード
領域の少なくとも一部を欠失させたボンベシン様ペプチ
ド受容体遺伝子を動物細胞に導入し、この欠失型遺伝子
と染色体上のボンベシン様ペプチド受容体遺伝子との間
で相同組換えを起こさせ、染色体上のボンベシン様ペプ
チド受容体遺伝子を破壊する。この相同組換えを起こさ
せた動物細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞
又は８細胞期胚に注入して得られる宿主胚を動物に移植
して産仔を得、これを他の個体と交配し、Ｆ１ヘテロ変
異動物、さらにはＦ２ホモ又はヘミ変異動物を作成すれ
ばよい。

【００１１】具体的には、次の行程のとおりボンベシン
様ペプチド受容体遺伝子、例えばＢＲＳ−３遺伝子機能
欠損動物を作成できる。

【００１２】１）マウスボンベシン様ペプチド受容体遺
伝子の相同組換え用ＤＮＡ（ターゲティングベクター）
の作成 マウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡを、制限酵素で部
分消化してゲノムライブラリーを作製する。このゲノム
ライブラリーについて、ボンベシン様ペプチド受容体ｃ
ＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてハイプリダイ
ゼーションを行い、陽性クローンを得る。尚、マウスに
ついては、ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子のｃＤＮ
Ａ配列は知られている（Z. Fathi et al., J. Biol. Ch
em., Vol.268, 5979-5984, 1993、Ohki-Hamazaki et a
l., Mol. Brain Res., 印刷中、J.Battey et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1991) Vol.88, 395-399）。

【００１３】これを適当なベクターに挿入した後、制限
酵素で消化して、ＢＲＳ−３については第１エキソンか
ら第３エキソンを含む全長約９．５ｋｂのゲノムＤＮＡ
をサブクローニングする。次いで、ボンベシン様ペプチ
ド受容体遺伝子の構造を破壊するとともに、目的とする
相同組換え体を選別するために、ポジティブ／ネガティ
ブ選別を行う。かかる選別のために、例えば、Mansour
らの報告（Mansour, Thomas, Capacchi, Nature 336, 3
48-352 (1988)）に従って、ネオマイシン耐性遺伝子及
びチミジンキナーゼ遺伝子を挿入する。

【００１４】２）相同組換えによるＥＳ細胞のボンベシ
ン様ペプチド受容体遺伝子の欠損 相同組換え用ＤＮＡを、マウスＥＳ細胞（例えば、Ｅ１
４株）(Hooper, Hardy,Handside et al., Nature 326,
292-295 (1987)）を含むエレクトロポレーション用緩衝
液に懸濁させ、ＥＳ細胞への遺伝子導入を行う。次い
で、Ｇ４１８及びガンシクロビルを選択剤として用いて
選択培養を行う。選別剤に耐性のコロニーについて、相
同組換え体の確認をサザンブロットによって行う。

【００１５】３）相同組換えＥＳ細胞によるキメラマウ
スの作製 ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子機能が欠損している
相同組換えＥＳ細胞を適切な系列のマウス、例えばＣ５
７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞又は８細胞期胚等の宿主
胚に注入した後、得られた宿主胚に偽妊娠マウスの子宮
角に移植して産仔を得る。宿主胚をどのような系統のマ
ウスから得るかの選択は、常法に従い毛色等の表現型に
よりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別す
ることができるように行う。

【００１６】４）相同組換えＥＳ細胞の生殖系列への伝
達の検定 移植によって得られたキメラマウスを、例えばＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ系、１２９／Ｊ系又はＩＣＲ系マウスと交配
し、ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子機能が欠損した
ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定する。例え
ばＥ１４株のＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／Ｊ系の宿主胚を用
いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配
する場合は、娩出される産仔は、キメラマウスの生殖細
胞が、相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該ＥＳ細胞
が由来するマウスと同じ野性色を呈し、宿主胚に由来し
ていれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈す
る。ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子の欠損は、離乳
に至った後に尾からＤＮＡを抽出後、サザンブロット又
はＰＣＲを行って、確認することができる。

【００１７】上記のようにして得られるトランスジェニ
ック動物は、体細胞及び生殖細胞の染色体上のボンベシ
ン様ペプチド受容体遺伝子（ＢＲＳ−３遺伝子）の機能
が欠損している。また、この欠損は遺伝的に安定であ
る。更に、上記のようにして得られるＢＲＳ−３遺伝子
機能欠損マウスは、空腹時血中インスリン値の増加、糖
負荷試験における血中インスリン値の上昇と消失遅延、
インスリン耐性試験における糖処理能の低下、体重増
加、収縮期血圧の上昇等のインスリン抵抗状態を示す。

【００１８】すなわち、これらの結果は、ＢＲＳ−３の
生理機能はインスリン抵抗性の発症と密接な関連がある
ことを示すものであり、ＢＲＳ−３に親和性を有しＢＲ
Ｓ−３の生理機能に影響を及ぼす物質（ＢＲＳ−３に親
和性を有する物質）は、インスリン抵抗性に起因する疾
患、例えば糖尿病、高インスリン血症、肥満症、高血圧
症、高脂血症等の予防及び／又は治療剤になりうると考
えれる。

【００１９】次に、本発明の予防及び／又は治療剤につ
いて述べる。本発明の予防及び／又は治療剤は、上記の
とおりＢＲＳ−３に親和性を有する物質を有効成分とす
るものである。本発明の予防及び／又は治療剤の有効成
分としては、ＢＲＳ−３に親和性を有するものであれば
特に制限はなく、ＢＲＳ−３のアゴニスト、アンタゴニ
スト又は部分アゴニストとして作用する天然又は合成の
如何なる物質も用いることができる。具体的には、ボン
ベシン（ＢＮ；配列番号１）、ニューロメジンＢ（ＮＭ
Ｂ；配列番号２）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ；
配列番号３）、アリステシン（Alystesin；配列番号
４）、リトリン（Litorin；配列番号５）、ラナテンシ
ン（Ranatensin；配列番号６）等のボンベシン様ペプチ
ド及びそれらのアミノ酸配列において１個以上のアミノ
酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列
からなるボンベシン様ペプチド誘導体が挙げられる。

【００２０】ボンベシン様ペプチド誘導体の具体例とし
ては、例えば配列番号１に示されるボンベシン（ＢＮ）
の６〜１３番目のアミノ酸配列に基づいて改変されたＤ
−Ｐｈｅ⁶−ＢＮ（６−１３）ｐｒｏｐｙｌ ａｍｉｄ
ｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶−ＢＮ（６−１３）ｅｔｈｙｌ ａｍ
ｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶ −Ｌｅｕ⁷ −ＢＮ（６−１３）ｐ
ｒｏｐｙｌ ａｍｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶ −Ｐｈｅ¹³−Ｂ
Ｎ（６−１３）ｐｒｏｐｌｙ ａｍｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ
⁶ −Ｌｅｕ⁷ −Ｔｈｒ¹⁰−ＢＮ（６−１３）ｐｒｏｐｙ
ｌ ａｍｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶ −Ｔｈｒ¹⁰−ＢＮ（６−
１３）ｐｒｏｐｙｌ ａｍｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶ −Ｔｈ
ｒ¹⁰−Ｐｈｅ¹³−ＢＮ（６−１３）ｐｒｏｐｙｌ ａｍ
ｉｄｅ、Ｄ−Ｐｈｅ⁶ −Ｌｅｕ⁷ −Ｔｈｒ¹⁰−Ｐｈｅ¹³
−ＢＮ（６−１３）ｐｒｏｐｌｙ ａｍｉｄｅ；配列番
号２に示されるニューロメジンＢ（ＮＭＢ）の２番目の
アスパラギン（Ａｓｎ）がアラニン（Ａｌａ）に置換さ
れた［Ａｌａ²ＮＭＢ］（以上、Molecular Pharmacolog
y, 50: 1355-1363 (1996)参照）；配列番号２に示され
るニューロメジンＢ（ＮＭＢ）の３〜１０番目のアミノ
酸配列を有するＡｃ−ＮＭＢ（３−１０）(Molecular P
harmacology, 50: 1346-1354 (1996)参照) 等が挙げら
れる。これらのペプチドは、それ自体既知の通常用いら
れるペプトド合成法により容易に合成できる。

【００２１】本発明の予防及び／または治療剤は、これ
を必要とする患者に対して経口的、または非経口的、一
般的には皮下、筋肉若しくは静脈内注射、直腸内投与に
より、その所定量を単回、もしくは複数回に分けて投与
するか、または連続的に投与する。かかる投与量は、患
者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整される
が、通常、経口的に用いる場合は、成人に対し１回１〜
２００ｍｇを１日１〜３回投与するのが好ましく、静脈
注射の場合は、成人に対し１回０．０１〜１０ｍｇを１
日１〜５回投与するか１日０．０１〜５０ｍｇを持続注
入するのが好ましく、また、直腸内投与の場合は、１回
１〜１００ｍｇを１日１〜３回投与するのが好ましい。

【００２２】本発明の予防及び／又は治療剤は、前記し
たＢＲＳ−３に親和性を有する物質をそのまま、或いは
適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤形態（剤
型）に調合され、使用される。剤型としては、例えば、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、乳
剤、懸濁剤、シロップ剤、注射用アンプル剤等が使用さ
れる。各種剤型への調製は、この技術分野で慣用される
通常の手法を用いて行われる。製剤化に使用される製剤
担体としては、各種剤型への調製に慣用される希釈剤や
添加剤などが用いられる。それらの具体例としては、乳
糖、白陶土（カオリン）、ショ糖、結晶セルロース、コ
ーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、アカシア、ス
テアリン酸、ステアリン酸マグシネム、レシチン、塩化
ナトリウム等の固体担体；水、シロップ、グリセリン、
落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノ
ール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール等の
液状担体が挙げられる。

【００２３】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説
明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明につい
て具体的な認識を得るための一助としてみなすべきもの
であり、本発明は以下の実施例によって何ら限定される
ものではない。

【００２４】実施例１ ＢＲＳ−３遺伝子機能欠損マウ
スの作製 １）マウスＢＲＳ−３遺伝子ＤＮＡの相同組換え用ＤＮ
Ａ（ターゲティングベクター）の作製 １２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ（野性
型マウスＢＲＳ−３遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
で部分消化し、ラムダＦＩＸＩＩに連結して組換えファ
ージを得、これをＸＬＩ−Ｂｌｕｅに感染させた。こう
して得られたマウスゲノムライブラリーについて、ヒト
ＢＲＳ−３遺伝子のｃＤＮＡ（Ｆａｔｈｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，５９７９−
５９８４（１９９３））をプローブとしてハイブリダイ
ゼーションを行い、１×１０⁶ 個のプラークについて検
索した結果、５個の陽性クローンを得た。これを用いて
ＢＲＳ−３遺伝子のエキソン１から３までを含む全長約
９．５ｋｂのゲノムＤＮＡ１をサブクローニングした。

【００２５】ついで、ＢＲＳ−３遺伝子の構造を破壊す
るために、第２エキソンを含むＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶ
認識部位に挟まれた約１．５ｋｂを欠損させ、そこにネ
オマイシン耐性遺伝子を挿入し、さらに５’側上流には
チミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。ゲノムＤＮＡとの
相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナー
ゼ遺伝子との間が２．５ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子
とチミジンキナーゼ遺伝子との間が２．５ｋｂ、ネオマ
イシン耐性遺伝子の下流が５ｋｂとなるように構築し
た。この相同組換え用コンストラクトを、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ^-に挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制
限酵素Ｓａ１Ｉで切断して線状化し、ターゲティングベ
クター２を得た。（以上、図１参照）

【００２６】２）相同組換え用ＤＮＡの導入によるＥＳ
細胞のＢＲＳ−３遺伝子の欠損 相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４
株）３×１０⁷ 個を含むエレクトロポレーション用緩衝
液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 、１．８ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄ ）に懸
濁させ、電界強度（Ｆｉｅｌｄ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ）２
１０Ｖ／ｃｍ、静電容量（Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）５
００μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４時
間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓｉ
ｎ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）濃度で選択培養を行った。

【００２７】Ｇ４１８耐性コロニーを、遺伝子導入後１
９２時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌの
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０と１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０とからな
る溶液）を含む９６穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯ
Ｎ ３０７７）に移し換え、数分間処理した後、ピペッ
ティングすることによって単一細胞にし、これらを２４
穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移
し換え、培養を継続した。採取したコロニーは、その長
径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもの
で、この時の細胞数は、１×１０⁴ 〜１０⁵ 個であっ
た。

【００２８】２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜
４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を
０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間処理後、順
次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ
（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で
培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養
は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の
確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。

【００２９】サザンブロット解析については、Ｇ４１８
耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化後、エキソン１より約１．５ｋｂ上流のＳｐａ
Ｉ部位までの断片約０．５ｋｂをプローブとして用いて
行った。破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体（図
１の符号３）及び非相同組換え体の確認は、それぞれ、
５．５ｋｂ及び４ｋｂのバンドの検出によって行った
（図１参照）。相同組換え体コロニー数は、Ｇ４１８耐
性コロニー３４７個中１個であった。

【００３０】３）ＥＳ細胞及びその培養方法 ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来の
Ｅ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコ変
法イーグル培養液（ＤＭＥＭ、１１９６０−０１０ Ｇ
ＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍＭ
の２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、
非必須アミノ酸溶液及び１０³ ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ
（白血病阻害因子、ＡＭＲＡＤ）を添加したＳＣＭ培養
液（Robers on, Teratocarcinomas and embryonicstem
cells a practical approach 1987）を用いた。

【００３１】また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用
いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０
％ＦＣＳを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細
胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜
１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カル
シウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝臓
及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。次
いで、得られた細切片を０．２５％トリプシン及び０．
０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下ＴＥ溶液という）
で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。

【００３２】細胞浮遊液を１５００ｒｐｍ、５分間の遠
心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁さ
せて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除
いた細胞浮遊液を１００×２０ｍｍの組織培養用シャー
レ（Ｆａｌｃｏｎ ３００３）に移し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂ 、９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細胞浮
遊液をＰＢＳ^- で１回洗浄し、培養を継続した。継代
は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞をフ
ィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を施
した。

【００３３】コンフルエント状態にまで増殖したマウス
胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５
μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ^-で３回洗浄後、ＴＥ
溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、
遠心後、細胞数を５×１０⁵／ｍｌに調整し、６０×１
０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３０
０２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフ
ィーダー細胞は、１週間以内に使用した。

【００３４】ＥＳ細胞の継代は、室温で５分間ＴＥ溶液
で処理後、ピペッティングによってＥＳ細胞を単一細胞
に分散させ、４×１０⁵ 個の細胞をフィーダー細胞層上
に播種することによって行った。培養液は、２４時間間
隔で交換し、継代間隔は、５６〜６４時間とした。ま
た、凍結保存する際には、１×１０⁶ 個の細胞をＳＣＭ
に懸濁して凍結用チューブ（２ｍｌ、ＦＡＬＣＯＮ ４
８１８）に移し、０．５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭ
ＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴下した後、−８０℃一晩放置し、
液体窒素中で保存した。

【００３５】４）ＢＲＳ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞による
キメラマウスの作製 ａ）ＢＲＳ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入 ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚盤胞に注入し
た後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植し
て産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈ
ｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地
で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いた
ＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理を
行った後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置す
ることによって、フィーダー細胞を除去し、顕微操作に
供するまで、氷上に静置した。

【００３６】ＥＳ細胞の注入用ピペットは、外径１ｍｍ
の微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製
器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細かく引
き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約
２０μｍとなるように先端を研磨し、さらにマイクロフ
ォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工
した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばした
ガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１０
０μｍの部分で切断した後、さらに口径を１０〜２０μ
ｍに加工して用いた。

【００３７】注入用ピペットと保定用ピペットは、先端
から約５ｍｍの部分を約３０度曲げて、マイクロピュレ
ーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用いたチ
ャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜
蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの５％
ＦＣＳ加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅ
ｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、その上面をミネラル
オイル（Ｍ８４１ｉ０、Ｓｉｇｍａ）で覆った。一方の
ドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方に
は、拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０
〜１５個のＥＳ細胞を注入した。なお、上記において、
顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。

【００３８】操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２
日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日
に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝
王切開を施し、里親に哺育させた。自然交配４日目に、
子宮を灌流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ
系マウスの胚盤胞１７７個にＥＳ細胞ＩＦ５を注入した
結果、１７１個が生存し、成功率は９７％であった。１
７１個を偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮に移植し
た結果、３０匹の産仔が得られた。離乳に至った産仔の
うち、毛色でキメラマウスと判定できたのは１６匹で、
このうち１４匹が、外見的に雄を示していた。これらの
キメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は１０〜９５％
の幅であった。

【００３９】ｂ）キメラマウスの交配 移植によって得られたキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マ
ウス）がＢＲＳ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか否
かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由
来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒
色を呈する。

【００４０】ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以上）９
例（Ｎｏ．１，２，３，４，６，８，９，１１，１２）
のキメラマウスのうち、６例（Ｎｏ．１，３，４，６，
８，１２）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確
認された。Ｎｏ．４とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの
交配では、５回の分娩で合計２９匹の産仔が得られ、こ
のうち１２匹が野生色の毛色を示していた。Ｎｏ．１２
とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配で得られた１６
匹の産仔のうち、１６匹が野生色の毛色を示していた。
これらの野生色のマウスのうち合計１０匹が雌であり、
理論的に雌はすべてヘテロ型であると考えられたので、
２例についてＰＣＲによる確認を行った結果、２例とも
にＢＲＳ−３遺伝子の欠損を確認した。

【００４１】次に、Ｆ１ヘテロ型マウスの雌とＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ系雌マウスとを交配し、１０１匹の産仔が得ら
れた。このうち１０１例についてＰＣＲによる解析を行
った結果、雄５４例のうち２９例についてＢＲＳ−３遺
伝子欠損についてＦ２ヘミ型のマウスを得た。さらに、
Ｆ２ヘミ型雄マウスとヘテロ型雌マウスとを交配し、１
８匹の産仔が得られた。このうち１８例についてＰＣＲ
による解析を行った結果、雄７例のうち３例についてＢ
ＲＳ−３遺伝子欠損についてＦ３ヘミ型、また雌１１例
のうち６例についてＦ３ホモ型マウスを得た。

【００４２】ＰＣＲ解析については、野生型ではエキソ
ン１とエキソン２の間約１ｋｂが、相同組み換え体では
エキソン１とネオマイシン耐性遺伝子の間約１．２ｋｂ
が増幅されるようにプライマーを設計した。すなわち、
エキソン１の３′端より１２４ｂｐ上流の位置から下流
に向かう配列（図１中「ａ」、配列番号７）、およびエ
キソン２の５′端より６１ｂｐ下流の位置から上流に向
かう配列（図１中「ｂ」、配列番号８）、およびネオマ
イシン耐性遺伝子の開始コドンより７３９ｂｐ上流の位
置から下流に向かう配列（図１中「ｃ」、配列番号９）
のそれぞれの塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを合成
し、９４℃、５分間の処理後、ＤＮＡの変性９４℃、１
分、プライマーのアニーリング６１℃、２分、プライマ
ーの伸長７２℃、３分、で３０サイクルの増幅後、７２
℃、７分間ＤＮＡ伸長反応を行い、アガロース電気泳動
により、１ｋｂと１．２ｋｂのバンドを検出した。尚、
上記の記載において、ネオマイシン耐性遺伝子に相当す
るプライマーｃの向きは、ネオマイシン耐性遺伝子の転
写の向きに合わせてある。

【００４３】実施例２ 変異マウスの体重変化 実施例１で得られたＢＲＳ−３遺伝子機能欠損Ｆ２ヘミ
型雄性マウス（以下これを「変異マウス」と略称するこ
とがある）を通常の条件で飼育し、その体重変化を追跡
した。その結果、図２に示したとおり、変異マウスの体
重は対照マウスに比し、有意に高い値を示した。Ｃ５８
ＢＬ／６Ｊマウスとのバッククロスによって得られた、
全ての世代のマウスにつき、同様の体重増加が観察され
た。

【００４４】体重測定後にマウスを屠殺し各組織の脂肪
組織重量を測定した。その結果、表１に示したとおり、
２７〜３４週齢の変異マウスでは、体重の増加と共に、
各種の脂肪組織重量の増加が観察された。

【００４５】

【表１】 体 重 脂肪パッド重量（％ body wt.) （ｇ） 精巣上体 鼠径部 腹膜外部 雄 (13 weeks) 対照マウス n=5 25.4±0.7 1.33 ±0.16 1.45±0.15 0.35±0.10 変異マウス n=5 25.2±2.1 1.44 ±0.35 1.60±0.37 0.35±0.06 P=0.44 P=0.29 P=0.24 P=0.44 ％対照群 99% 108% 110% 100%雄 (27-34 weeks) 対照マウス n=8 36.0±4.4 2.4 ±0.8 2.6±1.0 0.7±0.3 変異マウス n=7 46.2±4.5 3.5 ±0.6 4.7±0.9 1.1±0.3 P<0.0006 P<0.02 P<0.0008 P<0.008 ％対照群 128% 146% 181% 157%

【００４６】実施例３ 変異マウスの血漿生化学値 変異マウスを実施例１と同様に飼育し、２４時間の絶食
後に尾静脈より採血して血漿生化学検査を行った。血漿
インスリン値はＥＬＩＳＡ法（森永）、血糖値はグルコ
ースオキシダーゼ法（Ｍｅｒｃｋ）、総コレステロール
及び中性脂肪は比色法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）にて測
定した。

【００４７】その結果、表２に示したとおり、２０週齢
以上の変異マウスでは、空腹時インスリン値の上昇と血
糖値・総コレステロール値・中性脂肪値の上昇傾向が観
察された。

【００４８】

【表２】 体 重 ク゛ルコース インスリン コレステロール 中性脂肪 （ｇ） (mg/dl) (ng/ml) (mg/dl) (mg/dl)雄 (8-10 weeks) 対照マウス 24.5±2.2 101.0±12.7 0.57±0.23 ND ND (12) 変異マウス 25.5±1.4 105.3±18.0 0.79±0.29 ND ND (12) P=0.12 P<0.03雄 (20-23 weeks) 対照マウス 30.5±5.4 117.6±31.6 0.42±0.26 102.9±18.8 70.0±28.9 (12) 変異マウス 37.9±4.3 123.6±28.4 0.69±0.39 116.7±20.9 80.9±18.7 (12) P<0.0006 P=0.31 P<0.04 P=0.051 P=0.22

【００４９】実施例４ 変異マウスの血圧変化 変異マウスを実施例１と同様に飼育し、覚醒下心拍数・
収縮期血圧測定器（室町機械ＭＫ−１０３０）を用い測
定した。その結果、表３に示したとおり、４０週齢の変
異マウスでは収縮期血圧の上昇が観察された。

【００５０】

【表３】 体 重 心拍数 収縮期血圧 （ｇ） (pulse/min) (mmHg)雄 (14-16 weeks) 対照マウス(n=6) 26.1 ±2.6 682.2±62.3 109.8±8.5 変異マウス(n=6) 28.1 ±2.8 698.7±32.3 111.0±7.4雄 (40 weeks) 対照マウス(n=6) 30.6 ±4.9 709.2±23.9 115.8±5.8 変異マウス(n=6) 44.8 ±4.1 699.0±42.8 131.2±6.3 P<0.0003 P<0.0012

【００５１】実施例５ 変異マウスの糖処理能力 変異マウスを実施例１と同様に飼育し、その糖能力を検
討するため、経口糖負荷試験を実施した。その結果、図
３に示したとおり、９〜１０週齢及び２６週齢の変異マ
ウスで対照マウスに比し、糖負荷後の血糖値の上昇と、
インスリン値の上昇及び消失遅延が観察された。同様に
変異マウスのインスリン抵抗性を検討するため、インス
リン耐性試験を実施した。その結果、図４に示したとお
り、３８週齢の変異マウスで、インスリンの作用減弱が
明瞭に認められた。

【００５２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：14 他の情報：Xaa=pyro-glutamic acid (pyro-Glu) 存在位置：14 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Xaa Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Xaa 1 5 10

【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：10 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Gly Asn Len Trp Ala Thr Gly His Phe Xaa 1 5 10

【００５４】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：27 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro 1 5 10 15 Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Xaa 20 25

【００５５】配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：1 他の情報：Xaa=pyro-glutamic acid (pyro-Glu) 存在位置：14 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Xaa Gly Arg Leu Gly Thr Gln Trp Ala Val Gly His Leu Xaa 1 5 10

【００５６】配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：1 他の情報：Xaa=pyro-glutamic acid (pyro-Glu) 存在位置：10 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Phe Xaa 1 5 10

【００５７】配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：14 他の情報：Xaa=pyro-glutamic acid (pyro-Glu) 存在位置：14 他の情報：Xaa=Met-NH₂ 配列 Xaa Val Pro Gln Trp Ala Val Gly His Phe Xaa 1 5 10

【００５８】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCAACCCA CTACCTGGCA GAA 23

【００５９】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACAGGTCTTC AGAATGGCAT TGG 23

【００６０】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACGGTATCG CCGCTCCCGA TT 22

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＢＲＳ−３遺伝子のターゲティング破壊
を示す模式図である。各記号が示す制限部位に関与する
制限酵素は以下の通りである。ＲＩ：ＥｃｏＲＩ，Ｂ：
ＢａｍＨＩ，Ｓｐ：ＳｐｅＩ，ＲＶ：ＥｃｏＲＶ，Ｓ：
ＳａＩＩ。また、ｅｘはエキソンを、ＴＫはチミジンキ
ナーゼ遺伝子を、Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を、
各々表す。ＴＫ及びＮｅｏの向きは、転写の方向を示
す。ａ，ｂ，ｃ及び矢印は、プライマーの位置と方向を
示す。なお、図１における符号１、２及び３は、それぞ
れ１．野生型マウスＢＲＳ−３遺伝子、２．破壊された
ＢＲＳ−３遺伝子を含むターゲティングベクター、３．
破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体を示す。

【図２】ＢＲＳ−３遺伝子機能欠損マウス（変異マウ
ス）の体重変化を示す図である。図中、＋／Ｙは対照マ
ウスを示し、−／Ｙは変異マウスを示す。

【図３】変異マウスに対する経口糖負荷試験の結果を示
す図である。図中、＋／Ｙは対照マウスを示し、−／Ｙ
は変異マウスを示す。

【図４】変異マウスに対するインスリン耐性試験の結果
を示す図である。図中、＋／Ｙは対照マウスを示し、−
／Ｙは変異マウスを示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ボンベシン受容体サブタイプ３（ＢＲＳ
   −３）に親和性を有する物質を有効成分とするインスリ
   ン抵抗性に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
2. 【請求項２】 ボンベシン受容体サブタイプ３（ＢＲＳ
   −３）に親和性を有する物質が、ボンベシン様ペプチド
   又はそれら誘導体である請求項１に記載の予防及び／又
   は治療剤。
3. 【請求項３】 インスリン抵抗性に起因する疾患が、糖
   尿病、高インスリン血症、肥満症、高血圧症又は高脂血
   症である請求項１に記載の予防及び／又は治療剤。