NO326376B1

NO326376B1 - Anvendelse av et antistoff som spesifikt binder til et OB-polypeptid under betingelser som tillater dannelse av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet for maling av tilstedevaerelse av OB-polypeptidet i en prove.

Info

Publication number: NO326376B1
Application number: NO20065287A
Authority: NO
Inventors: Jeffrey M Friedman; Yiying Zhang; Ricardo Proenca; Margherita Maffei; Jeffrey L Halaas; Ketan Gajiwala; Stephen K Burley
Original assignee: Univ Rockefeller
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2008-11-17
Also published as: SK287191B6; EE9700030A; LV11868B; OA10596A; NO970683D0; WO1996005309A2; IS4416A; IL162093A0; DE777732T1; PL183352B1; PL319021A1; RO121036B1; MD2311F2; GR970300021T1; CN1162978A; TR199501021A2; EP0777732B1; BG101228A; HK1001495A1; JP3479080B2

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for måling av tilstedeværelsen av et OB-polypeptid i en prøve.

Description

Oppfinnelsens tekniske område

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et antistoff som spesifikt binder til et OB-polypeptid under betingelser som tillater dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet for måling av tilstedeværelsen av OB-polypeptidet i en prøve.

Oppfinnelsens bakgrunn

Fedme, definert som et overskudd av kroppsfett i forhold til mager kroppsmasse, er forbundet med viktige psyko-logiske og medisinske sykeligheter, idet de sistnevnte omfatter hypertensjon, forhøyede blodlipider og type II- eller ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM). Det finnes 6-10 millioner personer med NIDDM i USA, inkludert 18 % av popu-lasjonen som er 65 år gamle [Harris et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)]. Omtrent 45 % av mennene og 70 % av kvinnene med NIDDM er tykke, og deres sukkersyke forbedres vesentlig eller elimineres ved hjelp av vektreduksjon [Harris, Diabetes Care, 14 ( 3) :639-648 (1991)]. Som beskrevet nedenunder, er både fedme og NIDDM sterkt arvelig, selv om de pre-disponerende gener ikke er blitt identifisert. Det molekylære genetiske grunnlag for disse metabolsk relaterte forstyrrelser er et viktig, dårlig forstått problem.

Assimilasjonen, lagringen og utnyttelsen av nærings-middelenergi utgjør et komplekst homøostatisk system som er sentralt for overlevelse av metazoa. Blant pattedyr som opp-holder seg på land, er lagring i fettvev av store mengder metabolsk drivstoff som triglyserider av avgjørende betydning for å overleve perioder med matmangel. Behovet for å opprett-holde et bestemt nivå av energilager uten stadige endringer i organismens størrelse og form krever oppnåelse av en balanse mellom energiinntak og -forbruk. De molekylære mekanismene som regulerer energibalanse, gjenstår imidlertid å bli belyst. Isoleringen av molekyler som omdanner næringsmessig informasjon og regulerer energibalanse, vil være av avgjørende betydning for en forståelse av reguleringen av kroppsvekt hos friske og syke.

Et individs fedmenivå er i stor grad genetisk bestemt. Undersøkelse av samsvarsgradene for kroppsvekt og fedme blant mono- og dizygote tvillinger eller adopterte barn og deres biologiske foreldre.har tydet på at arveligheten for fedme (0,4-0,8) overskrider mange andre karaktertrekk som vanligvis menes å ha en vesentlig genetisk komponent, slik som schizofreni, alkoholisme og aterosklerose [Stunkard et al.,

N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. Familiære likheter med hensyn til hastigheter for energiforbruk er også blitt rapportert [Bogardus et al., Diabetes, 35:1-5 (1986)]. Genetisk analyse i geografisk begrensede populasjoner har tydet på at et forholdsvis lite antall gener kan være ansvarlig for de 30-50 % variasjon i kroppssammensetning [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255 (1991)]. Ingen av genene som er ansvarlige for fedme i den generelle populasjon, er imidlertid blitt genetisk kartlagt til et bestemt kromosomalt sted.

Gnagermodeller for fedme omfatter sju tilsynelatende enkeltgenmutasjoner. De mest intensivt studerte musefedmemuta-sjoner er ojb(fedme)- og db (diabetes) -genene. Når de er til stede på den samme genetiske stammebakgrunn, resulterer ob og db i metabolske og oppførselsmessige fenotyper som ikke lar seg skjelne fra hverandre, noe som tyder på at disse genene kan virke i det samme fysiologiske reaksjonsspor [Coleman et al., Diabetologia, 24:141-148 (1978)]. Mus som er homozygote for begge mutasjonene, er hyperfage og hypometabolske, noe som fører til en fedmefenotype som er merkbar ved 1-månedsalder. Vekten av disse dyrene er tilbøyelig til å stabiliseres ved 60-70 g (sammenlignet med 3 0-35 g hos kontrollmus). ob- og db-dyr har et stort antall andre hormonelle og metabolske endringer som har gjort det vanskelig å identifisere primær-defekten som kan tilskrives mutasjonen [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].

Hver av gnagerfedmemodellene ledsages av endringer i karbohydratmetabolisme som tilsvarer dem ved type II-diabetes hos mennesker. I noen tilfeller avhenger alvorligheten av sukkersyken delvis av bakgrunnsmusestammen [Leiter, Endocrino-logy, 124:912-922 (1989)]. Både for ob og db utvikler kongene C57BL/Ks-mus en alvorlig sukkersyke med endelig -cellenekrose og øyatrofi, noe som resulterer i en relativ insulinopeni. Omvendt utvikler kongene C57BL/6J-ob- og -db-mus en forbigående insulinresistent sukkersyke som til sist kompenseres av cellehypertrofi som ligner på human type II-diabetes.

Fenotypen til ob- og db-mus ligner på human fedme på andre måter enn utviklingen av sukkersyke; mutantmusene spiser mer og bruker mindre energi enn det magre kontroller gjør (noe som også gjelder for fete mennesker). Denne fenotypen er også helt lik den som ses hos dyr med lesjoner i ventromedialhypotalamus, noe som tyder på at begge mutasjonene kan interferere med evnen til på korrekt måte å integrere eller gi respons på næringsmessig informasjon i sentralnervesystemet. Grunnlag for denne hypotesen kommer fra resultatene av parabioseforsøk [Coleman, Diabetologia, 5:294-298 (1973)], som tyder på at ob-mus er mangelfulle med hensyn til en overmettethetsfaktor i blodomløpet, og at db-mus er resistente overfor effekten av ob-faktoren (muligens på grunn av en ob-reseptordefekt). Disse forsøkene har ført til den konklusjon at fedme hos disse mutantmusene kan skrive seg fra forskjellige defekter i en tilførende sløyfe og/eller et integrerende senter i den postu-lerte feedback-mekanisme som regulerer kroppssammensetning.

Ved å bruke molekylære og klassiske genetiske markører er ob- og db-genene blitt kartlagt til henholdsvis proksimalt kromosom 6 og midtkromosom 4 [Bahary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. I begge tilfellene kartlegges mutasjonene til områder i musegenomet som er syntene med mennesker, noe som tyder på at, dersom det finnes humane homologer til ob og db, de sannsynligvis vil befinne seg henholdsvis i humankromosomene 7q og lp. Defekter i db-genet kan resultere i fedme hos andre pattedyrarter: i genetiske krysninger mellom Zucker fa/fa-rotter og norske +/+-brunrotter er fa-mutasjonen (rottekromosom 5) flankert av de samme stedene som flankerer db hos mus [Truett et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:7806-7809 (1991)].

På grunn av det store antall faktorer som synes å virke inn på kroppsvekt, har det ikke vært mulig å forutsi hvilke faktorer, og nærmere bestemt hvilke homøostatiske mekanismer, som primært er av avgjørende betydning for kroppsvekt. Hovedproblemet som ligger under foreliggende oppfinnelse, er således å tilveiebringe modulatorer for kroppsvekt som mulig-gjør regulering av fedme og fettinnhold hos pattedyr.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av et antistoff som spesifikt binder til et OB-polypeptid under betingelser som tillater dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet for måling av tilstedeværelsen av OB-polypeptidet i en prøve, tilveiebrakt fra et individ, hvor OB-polypeptidet:

har evnen til å modulere kropsvekt hos et dyr,

har fra omtrent 145 til omtrent 167 aminosyrer, og

omfatter aminosyresekvensen sekv. id. nr.: 2, 4, 5 eller 6 eller omfatter en allelvariant derav, en analog derav eller et fragment derav, der allelvarianten, analogen eller fragmentet har samme biologiske aktivitet som nevnte aminosyresekvens sekv. id. nr.: 2, 4, 5 eller 6,

og hvori nevnte anvendelse omfatter:

(a) at en prøve som er mistenkt for å inneholde et OB-polypeptid, bringes i kontakt med et antistoff som spesifikt bindes til OB-polypeptidet under betingelser som tillater dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet, og (b) å påvise dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet i prøven,

hvori påvisning av dannelsen av reaksjonskomplekser indikerer tilstedeværelsen av OB-polypeptid i prøven.

Kort beskrivelse av tegningene

FIGUR 1 (A-E) viser nukleinsyresekvensen (SEKV.ID. NR. 1) og den utledede aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 2) avledet fra den murine OB-cDNA. En 39 basepar stor 5'-leder ble etterfulgt av en forutsagt 167 aminosyrers åpen leseramme og en omtrent 3,7 kb stor 3<1->utranslatert sekvens. (I tidligere innleverte søknader med serienr. 08/347 563, innlevert 30. november 1994, og serienr. 08/438 431, innlevert 10. mai 1995, ble en ytterligere 58-basers 5<1->ikke-kodende sekvens deretter bestemt til å være en kloningsartefakt. Denne artefakten har ikke noe grunnlag i den kodende region, den 39-basers 5'-ikke-kodende region, nå vist i figur 1, eller den 3'-ikke-kodende region i genet.) I alt ca. 2500 basepar i den 3<1->utranslaterte sekvens er vist. Analyse av den forutsagte proteinsekvens ved observasjon og anvendelse av SigSeg-datamaskinprogrammet indikerer tilstedeværelsen av en signalsekvens (understreket). Mikroheterogenisitet i cDNA ble lagt merke til ved at omtrent 70 % av cDNA-ene hadde et glutaminkodon i kodon 49, og 30 % hadde ikke det (se figurene 5 og 6 nedenunder). Denne aminosyren er understreket, og det er også argininkodonet som er mutert i C57BL/6J-ob/ob-mus (lJ-mus).

FIGUR 2 (A og B) viser nukleinsyresekvensen (SEKV.ID. NR. 3) utledet for human- OB-cDNA-en. Nukleotidene er nummerert fra 1 til 701 med et startsete i nukleotid 46 og en terminering i nukleotid 550. FIGUR 3 viser hele den utledede aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 4) avledet for human- OB-genet som tilsvarer nukleinsyresekvensen ifølge figur 2A og B. Aminosyrene er nummerert fra 1 til 167. Et signalsekvensspaltingssete befinner seg etter aminosyre 21 (Ala), slik at det modne protein strekker seg fra aminosyre 22 (Val) til aminosyre 167 (Cys). FIGUR 4 viser sammenligningen mellom den murine (SEKV.ID. NR. 2) og humane (SEKV.ID. NR. 4) utledede aminosyresekvens. Sekvensen til den utledede human- OB-aminosyresekvens var svært homolog med sekvensen til mus. Konservative endringer er avmerket ved hjelp av en strek, og ikke-konservative endringer ved hjelp av en stjerne. Det variable glutaminkodon er understreket, noe som også gjelder for stillingen til ikke-sensemutasjonen i C57BL/6J- ob/ ob(1J)-mus. I alt er det 83 % identitet på aminosyrenivået, selv om bare 8 substitusjoner ble funnet mellom valinet i kodon 22 (umiddelbart ned-strøms for signalsekvensoverskuddet) og cysteinet i 117-stilling. FIGUR 5 viser fullengdeaminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 5) avledet for det murine OB-gen som vist i figur 3, men som mangler glutamin i 49-stilling. Aminosyrene er nummerert fra 1 til 166. Et signalsekvensspaltingssete befinner seg etter aminosyre 21 (Ala) (og således før glutamin-49-dele-sjonen), slik at det modne protein strekker seg fra aminosyre 22 (Val) til aminosyre 166 (Cys) . FIGUR 6 viser hele den utledede aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 6) avledet for human- OB-genet, som vist i figur 4, men som mangler glutamin i 49-stilling. Aminosyrene er nummerert fra 1 til 166. Et signalsekvensspaltingssete befinner seg etter aminosyre 21 (Ala) (og således før glutamin-49-delesjonen), slik at det modne protein strekker seg fra aminosyre 22 (Val) til aminosyre 166 (Cys). FIGUR 7. (A) Fysikalsk kart for lokaliseringen av ob i det murine kromosom, og YAC- og Pl-kloningskartene. "M og N" tilsvarer Afull- og Wotl-restriksjonsseter. Numrene tilsvarer de enkelte dyr som var rekombinante i ob-regionen hos de 1606 meiosene som ble registrert. Met, Pax4, D6Rck3 9, D6Rckl3 og Cpa henviser til steder i ob-regionen som bindes til DNA-probene. YAC-er ble isolert ved å bruke D6Rckl3 og Pax4 som prober, og endene ble utvunnet ved å bruke "vectorette"-PCR og/eller plasmidenderedning, og igjen brukt til å isolere nye YAC-er. (B) Den resulterende YAC-samling. Én av YAC-ene i denne samlingen, Y902A0925, var kimær. Hver av probene som ble brukt til å genotypebestemme de rekombinante dyrene, er angitt i parenteser. (6) tilsvarer YAC 107; (5) tilsvarer M16(+) (eller M16(pLUS)); (4) tilsvarer adu(+); (3) tilsvarer aad-(pICL); (2) tilsvarer 53(pICL); og (1) tilsvarer 53(+). (C) Pl-samlingen av bakteriofag Pl-kloner isolert med utvalgte YAC-endeprober. ob-genet ble isolert i en Pl-klon isolert under anvendelse av den fjerne enden av YAC-YB6S2F12 (ende (4)) (her alternativt kalt adu(+)). FIGUR 8 viser et fotografi av en etidiumbromidfarging av 192 uavhengige isolater av de fire exoninn-fangningsforsøk som ble PCR-amplifisert og karakterisert. FIGUR 9 er et fotografi av en etidiumbromidfarging av PCR-amplifiserte kloner mistenkt for å bære ob. Hver av de 7 klonene som ikke bærer artefakten, ble på nytt amplifisert ved å bruke PCR og elektroforesebehandlet på en 1 % agarosegel i TBE og farget med etidiumbromid. Størrelsesmarkørene (det unummererte felt lengst til venstre) er den kommersielt tilgjengelige "1 kB-stige". Felt 1 - klon 1D12, som inneholder en "HIV-sekvens". Felt 2 - klon 1F1, en ny klon utenfor ob-regionen. Felt 3 - klon 1H3. Felt 4 - klon 2B2, som. er identisk med 1F1. Felt 5 - klon 2G7, som inneholder et ob-exon.

Felt 6 - klon 2G11, som er identisk med 1F1. Felt 7 - klon 2H1, som ikke inneholder en innføyelse. FIGUR 10 viser sekvensen til 2G7-klonen (SEKV.ID. NR. 7), som. omfatter et exon som koder for en del av OB-genet. Primersekvensene som brukes til å amplifisere dette exonet, er innrammet i figuren (SEKV.ID. NR. 8 og 9). FIGUR 11. (A) Revers transkripsjons-PCR-analyse av mRNA fra forskjellige vev fra den samme mus med 2G7-primerne og aktinprimerne. RT-PCR-reaksjonene ble utført ved å bruke 100 ng total-RNA reverstranskribert med oligo-dT som en primer for førstetråds-cDNA-syntese. PCR-amplifikasjon ble utført i 35 sykluser ved 94° denaturering for 1', 55° hybridisering for 1', og 72 °C forlengelser for 2' med en 1' andre autoforleng-else pr. syklus. RT-PCR-produkter ble på nytt oppløst i et gelforsøk med 2 % agarose med lavt smeltepunkt i 1 x TBE-buffer. (B) Northern blot av mRNA fra forskjellige organer fra musen under anvendelse av PCR-merket 2G7 som probe. 10 g total-RNA fra hvert av vevene ble elektroforesebehandlet på en agarosegel med formaldehyd. Proben ble hybridisert ved 65 °C i "Rapid Hybe" (Amersham). Autoradiografiske signaler var åpen-bare etter 1 times eksponering; det viste forsøk var resultat av en 24-timers eksponering. FIGUR 12. (A) En etidiumbromidfarging fra en RT-PCR-reaksjon på fettcelle-RNA (hvitt fettvev) fra hver av de angitte musestammer. Total-RNA (100 ng) for hver prøve ble reverstranskribert ved å bruke oligo-dT og reverstranskriptase, og den resulterende enkelttrådede cDNA ble PCR-amplifisert med 2G7-primerne (nedre bånd) eller aktinprimerne (øvre bånd). Både 2G7- og aktinprimeren ble tatt med i den samme PCR-reaksjon. Produktene ble kjørt på en 1 % agarose-TBE-gel.

(B) Northern-analyse tilsvarende (A). 10 g fettcelle-RNA (hvitt fettvev) fra hver av de angitte stammer ble kjørt ut og

probet med den PCR-merkede 2G7-probe som i figur 11B ovenfor. En omtrent 2 0 gangers økning i nivået av 2G7-mRNA var synlig i hvitt fett-RNA fra C57BL/6J-ob/ob(lJ)-stammen i forhold til magre kullkamerater. Verken i RT-PCR- eller Northern-forsøkene var det noe påvisbart signal i 2G7-RNA fra SM/Ckc-+<Dac>ob<2J>/

ob<2J>(2J)-musene, selv etter 2-ukers eksponering. En 24-timers autoradiografieksponering er vist. Det samme filter ble hybridisert til en aktinprobe (bunndel av panelet).

FIGUR 13 er en Northern-analyse av ytterligere 2J-dyr og kontroildyr som bekrefter fraværet av ob-mRNA-en fra 2J-dyr. Northern-analysen ble utført som i figurene 11 og 12. I dette tilfellet var kontroll-RNA-en ap2, et fettspesifikt transkript. Det er ingen betydning i den varierende tetthet til ap2-båndene.

I FIGUR 14 sammenlignes DNA-sekvensen til C57BL/6J-(normale) og C57BL/6J-ob/ob(lJ)-musene i regionen til punkt-mutasjonen som fører til innføring av et for tidlig stoppkodon (ikke-sensemutasjon) i mutantstamme-cDNA-en. ob/ob-musene hadde en C-»T-mutasjon som endret en argininrest i 105-stilling. Denne baseendringen er vist som det som ble sendt ut fra det automatiserte DNA-sekvenseringsapparat. RT-PCR ble utført ved å bruke en hvitt fett-RNA fra begge stammene (+/+ og ob/ ob) under anvendelse av primere fra de 5'- og 3<1->utranslaterte regioner. PCR-reaksjonsproduktene ble gelrenset og sekvensert direkte manuelt og ved å bruke et Applied Bio-systems, Inc. 3 73A automatisert sekvenseringsapparat med primere langs begge trådene til den kodende sekvens.

FIGUR 15. (A) Southern blot av genom-DNA fra hver av musestammene som er angitt. Omtrent 5 g DNA (avledet fra genom-DNA fremstilt fra lever, nyre eller milt) ble restrik-sjonsfordøyd med det angitte restriksjonsenzym. DNA-en ble så elektroforesebehandlet i en 1 % agarose-TBE-gel og probet med PCR-merket 2G7. Restriksjonsfordøyelse med Bglll avslørte en økning i størrelsen til et omtrent 9 kB (det største) Bglll-fragment i SM/Ckc-+Dac ob2J/ ob2J (2 J) -DNA. RFLP-er var ikke påvisbare med noen andre restriksjonsenzymer. Preliminær restriksjonskartlegging av genom-DNA indikerte at det polymorfe Bglll-setet er ca. 7 kB oppstrøms for transkripsjonsstartsetet. Ingen av de øvrige enzymene som ble testet, strekker seg utover mRNA-setet. (B) Segregasjon av en Bgrlll-polymorfisme hos SM/C-kc-+ Dacob2J/ ob2J- st ammen. Seks fete og fem magre avkom fra den samme generasjon av den koisogene SM/Ckc-+Dacob<2J>/ob<2J>(2J)-koloni ble genotypebestemt ved å registrere BglII-polymorfismen som vist i (A) . Alle de fenotypisk fete dyr var homozygote med hensyn til det største allel i det polymorfe Bg2II-fragment. DNA-en i "kontroll"-feltet ble fremstilt fra en ubeslektet SM/Ckc-+Dac+/ + -mus, avlet separat fra SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J-kolo-nien.

FIGUR 16 er en Southern blot av EcoRI-fordøyd genom-DNA fra de angitte arter ved å anvende en OB-cDNA som en probe (dvs. en zoo-flekk). Hybridiseringssignaler var påvisbare i hver virveldyrprøve, selv etter en middels streng hybridisering. Katte-DNA-en i dette forsøket ble svakt nedbrutt. Den begrensede DNA ble kjørt på en 1 % agarose-TBE-gel og overført til en imobilonmembran for probing. Filteret ble hybridisert ved 65 °C og vasket i 2 x SSC/0,2 % SDS ved 65 °C to ganger i 20 minutter, og eksponert i 3 dager under anvendelse av Kodak (Rochester, N.Y.) X-OMAT-film. FIGUR 17 viser ekspresjonskloningsregionen til vektor pET-15b (Novagen) (SEKV.ID. NR. 11 og 12). FIGUR 18 viser analyse av eluatet fra en kolonne med His-bindende harpiks (Ni) for en rekombinant, moden murin OB-fusjon til et His-tag (A) og moden human OB-fusjon til et His-tag (B). Bakterier ble transformert med henholdsvis vektorene pETM9 og pETH14. Etter induksjon med 1 mM IPTG ved optimale betingelser var de transformerte bakterier i stand til å produsere 100-300 g/ml OB-fusjonsprotein, primært i inklu-sjons legemene . Inklusjonslegemene ble oppløseliggjort med 6 M guanidin-HCl eller urea, og fusjonsprotein (til stede i lyse-supernatanten) ble fylt på kolonnen med His-bindende harpiks (Ni) i 10 ml 1 x bindingsbuffer med urea. Kolonnen ble eluert trinnvis med 5 ml aliquoter av 20 M, 60 M og 300 M imidazol, og til sist med strippebuffer. Aliquotene ble analysert med hensyn til tilstedeværelse av OB-polypeptidfusjon på en 15 % akrylamidgel. Hvert felt inneholder ekvivalenten til

100 1 bakterieekstrakt.

FIGUR 19. (A) In vitro-translasjon av OB-RNA. En human OB-cDNA ble underklonet i pGEM-vektoren. Plasmidet ble gjort lineært, og pluss-tråd-RNA ble syntetisert under anvendelse av Sp6-polymerase. Den in vitro-syntetiserte RNA ble translatert i nærvær eller fravær av mikrosomale membraner fra bukspyttkjertel fra hund. Et omtrent 18 kD stort primært translasjonsprodukt ble sett etter translasjon in vitro. Tilsetningen av mikrosommembraner til reaksjonsblandingen førte til fremkomsten av et andre translasjonsprodukt ca. 2 kD mindre enn det primære translasjonsprodukt. Størrelsen til translasjonsproduktet av interleukin-1 -RNA som mangler en utkodet signalsekvens, var uforandret etter tilsetningen av mikrosommembraner. Disse dataene indikerer tilstedeværelsen av en funksjonell signalsekvens. (B) In vi tro-translasjon i nærvær eller fravær av proteinase K. Proteasebehandling resulterte i komplett proteolyse av det 18 kD store primære translasjonsprodukt, mens den 16 kD store prosesserte formen var upåvirket. Permeabilisering av mikrosomet med 0,1 % TRITON-X100 gjorde den prosesserte form proteasesensitiv. Disse resultatene indikerer at produktet var blitt translatert inn i hulrommet i mikrosomet.

FIGUR 20. (A-E) Sekvensen til humant OB-gen (SEKV.ID. NR. 22 og 24). (F) Et skjematisk diagram for det murine OB-gen. (G) Et skjematisk diagram for human-OB-genet. Både i (F) og (G) er start- og stoppkodonene understreket. Det er ikke noe bevis på at et første intron er homologt til det første museintron i humangenet, men dets eksistens kan ikke utelukkes. FIGUR 21 viser en skjematisk tegning av én av kloningsstrategiene som anvendes for å oppnå rekombinant ekspresjon av OB i Pichia-gjær. (A) Ekspresjonsvektor for OB med en " -mating"-faktorsignalsekvens. (B) Skjematisk tegning av strukturen til det rekombinante fusjonsprotein, inkludert aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 26), som viser Xhol-setet og de putative KEX-2- og STE-13-spaltingsseter, og det N-terminale overskudd av aminosyrer som er til stede etter KEX-2-spalting (SEKV.ID. NR. 27). (C) En alternativ strategi for fremstilling av modent OB involverer fremstilling av en konstruksjon med en aminosyresekvens som tilsvarer et Xhol-spaltingssete og et KEX-2-spaltingssete umiddelbart oppstrøms for den fullt ferdige ob-polypeptidsekvens (SEKV.ID. NR. 28). FIGUR 22. Alternativ ekspresjonsstrategi i Pichia.

(A) Ekspresjonsvektor for en OB-fusjon med et His-tag tatt fra pET-ekspresjonssystemet under kontroll av " -mating"-faktor-signalsekvensen (SEKV.ID. NR. 33). (B) Skjematisk tegning av strukturen til det rekombinante OB-fusjonsprotein som inne-

holder et His-tag, som inkluderer " -mating"-faktorsignal-sekvensen, putative KEX-2- og STE-13-spaltingsseter, His-tag og et trombinspaltingssete, som vil gi OB med tre overskytende N-terminale aminosyrerester.

FIGUR 23. (A) PAGE-analyse av ekspresjon av murint OB (begge mikroheterogenformer, dvs. de som inneholder og mangler Gin 49) i transformerte Pichia-gjær. Det forventede bånd på omtrent 16 kD er synlig i dyrkningsvæsken til den transformerte gjær (andre og tredje felter), men ikke i dyrkningsvæsken fra ikke-transformert gjær (første felt). (B) PAGE-analyse av delvis renset rekombinant OB-polypeptid på karboksymetylcellulose, en svak kationbytter. Et bånd på ca. 16 kD er svært synlig i fraksjonene 3 og 4 fra kolonnen, som ble eluert med 250 mM NaCl. Felt 1 - påfylt prøve, felt 2 - gjennomstrømning, feltene 3-5 - fraksjoner eluert med 250 mM NaCl.

FIGUR 24 viser at OB-proteinet er i omløp i museplasma. (A) Immunutfellinger fra museblod. 0,5 ml museplasma ble forklaret med ukonjugert sepharose og inkubert over natten med immunrensede anti-OB-antistoffer konjugert til sepharose 4B-kuler. Immunutfellingen ble fraskilt på en 15 % SDS-PAGE-gel, overført og Western-blottet med et anti-OB-antistoff.

Proteinet migrerte med en molekylvekt på omtrent 16 kD til den samme stilling som det fullt ferdige muse-ob-protein uttrykt i gjær. Proteinet var fraværende i plasma fra C57BL/6J-ob/ob-mus og forøkte 10 ganger i plasma fra C57BLB/Ks-db/db-mus i forhold til villtypemus. db-mus er blitt foreslått å overprodu-sere OB-proteinet, sekundært til resistens mot dets effekter.

(B) Forøkte nivåer av OB hos fete rotter. De fete rottene er overvektige som et resultat av recessiv mutasjon på rottekromosom 5. Genetiske data har tydet på en defekt i det samme gen mutert i db-mus. Plasma fra fete rotter og magre kullkamerater ble immunutfelt og kjørt på "Western blots". En 2 0 gangers økning i omløpsnivået av OB ses hos de mutante dyrene. (C) Kvantifisering av OB-proteinet i museplasma. Økende mengder av det rekombinante museprotein ble tilsatt til 100 plasma fra ob-mus og immunutfelt. Signalstyrken på "Western blots" ble sammenlignet med signalstyrken fra 100 plasma fra villtypemus. En lineær økning i signalstyrke ble

sett med økende mengder av rekombinant protein, noe som viser at immunutfellingene ble utført under betingelser med antistoff overskudd. Lignende signaler ble sett i villtypeplasma-prøven og prøven med 2 ng rekombinant protein, noe som indikerer at omløpsnivået i museplasma er omtrent 20 ng/ml.

(D) OB-protein i fettvevsekstrakter. Cytoplasmaekstrakter fra musefettvev ble fremstilt fra db- og villtypemus. "Western

blots" viste forøkte nivåer av det 16 kD store protein i ekstrakter fremstilt fra db-mus. FIGUR 25 viser at OB-proteinet er i omløp ved variable nivåer i humant plasma. (A) "Western blots" av humanplasma. Plasmaprøver ble erholdt fra seks magre blodgivere. Immunutfelling og "Western blotting" avslørte tilstedeværelsen av et immunreaktivt 16 kD stort protein som er identisk i størrelse med et rekombinant 146 aminosyrers humanprotein uttrykt i gjær. Variable nivåer av proteinet ble sett i hver av de seks prøvene. (B) En ELISA (Enzyme Linked Immunoassay) for human-ob. Mikrotiterplater ble belagt med immunrensede antihuman-OB-antistoffer. Kjente mengder av rekombinant protein ble tilsatt til platene og påvist under anvendelse av immunrensede biotinylerte anti-ob-antistoffer. Absorbans ved 414 nm ble plottet mot kjente konsentrasjoner av OB, hvorved man fikk en standardkurve. Den resulterende standardkurve viste at analysen var i stand til å påvise 1 ng/ml eller mer av human-OB-proteinet. (C) Kvantifisering av OB-proteinet i humanplasma. En ELISA-immunanalyse ble utført under anvendelse av 100 plasma fra de seks magre blodgiverne og standardene brukt i panel B. Nivåer av OB-proteinet som varierte fra 2 ng/ml i HP1 til 15 ng/ml i HP6, ble sett. Disse dataene korrelerte med Western blot-dataene i panel A. FIGUR 2 6 viser at OB-proteinet danner inter- og intramolekylære disulfidbindinger. (A) "Western blots" under reduserende og ikke-reduserende betingelser. "Western blots" av muse- og humanplasma ble gjentatt med og uten tilsetning av reduksjonsmidler til prøvebufferen. Når -merkaptoetanol ute-lates fra prøvebufferen, migrerer immunutfellinger fra db-plasma med en tilsynelatende molekylvekt på 16 kD og 32 kD. Tilsetning av -merkaptoetanol til bufferen fører til at den 32 kD store resten forsvinner (se figur 24). Dette resultatet rekapituleres når museproteinet uttrykkes i gjæren Pichia pastoris. I dette tilfellet migrerer muse-OB-proteinet til stillingen til en dimer. Under reduserende betingelser migrerer det rensede rekombinante museprotein med en tilsynelatende molekylvekt på 16 kD, noe som indikerer at den 32 kD store molekylformen er resultatet av én eller to intermolekylære disulfidbindinger. Humanproteinet uttrykt in vivo og i Pichia pastoris migrerer med en molekylvekt på 16 kD under både reduserende og ikke-reduserende betingelser (data ikke vist). (B) Humanproteinet uttrykt i gjær inneholder en intramolekylær disulfidbinding. Utskilte proteiner inntar generelt sin korrekte konformasjon når de uttrykkes i Pichia pastoris-ekspresjonssystemet. Det 146 aminosyrer store, modne humanprotein ble uttrykt i Pichia pastoris og renset fra gjærmediet ved hjelp av en totrinns rensingsfremgangsmåte som omfatter IMAC og gelfiltrering. Det rensede rekombinante protein ble underkastet massespektrometri før og etter cyanbromidspalting. Cyanbromid spalter i karboksyenden til metioninrester. Molekylvekten til det rekombinante gjærprotein var 16 024 ± 3 Da (beregnet molekylvekt = 16 024 Da). Cyanbromid spalter etter de tre metioninene i proteinsekvensen i aminosyrene 75, 89 og 157. Cyanbromidfragmentet med målt vekt 8435,6 Da tilsvarer aminosyrene 90-157 og 158-167 bundet sammen ved hjelp av en disulfidbinding mellom Cys-117 og Cys-167 (beregnet molekylvekt = 8434,5 Da). N.D. = ikke påvist.

FIGUR 27 viser fremstillingen av det bioaktive rekombinante protein. Nukleotidsekvensen som tilsvarer det 145 aminosyrer store, modne muse-OB-protein, ble klonet inn i pET-15b-ekspresjonsvektoren. Denne pET-vektor innføyer et polyhistidinområde (His-tag) oppstrøms for den klonede

sekvens, noe som muliggjør virkningsfull rensing under anvendelse av Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC). Det rekombinante bakterieprotein fordelte seg til å begynne med i den uoppløselige membranfraksjon etter bakterielyse. Membran-fraksjonen ble oppløseliggjort under anvendelse av guanidini-umhydroklorid og fylt på en IMAC-kolonne. Proteinet ble eluert trinnvis med økende konsentrasjoner av imidazol som vist. Det eluerte protein ble på nytt foldet og behandlet med trombin

for å fjerne His-tag, som beskrevet nedenunder. Sluttutbyttet av oppløselig protein var 45 ng/ml bakteriekultur.

FIGUR 2 8 viser de biologiske effektene av OB-proteinet. Tidsforløp for matinntak (panelene A-C) og kroppsvekt (panelene D-F). Grupper med 10 dyr fikk enten daglig intraperitoneale injeksjoner av OB-proteinet ved en dose på

5 mg/kg/dag (igjenfylte kvadrater), daglige injeksjoner av PBS (igjenfylte ringer) eller ingen behandling (igjenfylte tre-kanter) . Behandlingsgruppene omfattet C57Bl/6J-ob/ob-mus (panelene A og D), C57Bl/Ks-db/db-mus (panelene B og E) og CBA/J+/+-mus (panelene C og F). Matinntaket til musene ble målt daglig og kroppsvekten registrert ved 3-4 dagers intervaller, som angitt. (Skalaen for kroppsvekten i gram er forskjellig for villtypemusene vs. ob- og db-musene.) Matinntaket til ob-musene som fikk protein, ble redusert etter den første injeksjon og stabilisert etter den fjerde dag på et nivå som er omtrent 40 % av det som ses hos gruppen som fikk injisert placebo (p < 0,001). Kroppsvekten til disse dyrene avtok gjennomsnittlig 1,3 g/dag og stabilisertes etter 3 uker på et nivå som er omtrent 60 % av utgangsvekten (p < 0,0001) . Ingen effekt av proteinet kunne påvises hos db-mus. Små men signifikante effekter på kroppsvekt ble observert hos CBA/J-mus på to tidlige tidspunkter (p < 0,02). Standardfeilen i hver måling er vist ved hjelp av en stolpe, og den statistiske signifikans for disse resultatene er vist i tabell 1. FIGUR 29 viser resultatene av par-"mating" av ob-mus. (A) En gruppe med fire C57Bl/6J-ob/ob-mus ble foret med en matmengde som er lik med den som konsumeres av gruppen av ob-mus som får rekombinant protein. Vekttapet til begge gruppene ble beregnet etter 5, 8 og 12 dager. De forbegrensede mus tapte (skravert stolpe) mindre vekt enn ob-musene som fikk protein (igjenfylt stolpe) (p < 0,02). Dette resultatet indikerer at den vektreduserende effekt av OB-proteinet er resultatet av effekter på både forinntak og energiforbruk. (B) Fotografi av en behandlet ob-mus. Vist er to C57Bl/6J-ob/ob-mus. Musen til venstre fikk PBS og veide 65 g, som var utgangsvekten. Musen til høyre fikk daglige injeksjoner med det rekombinante OB-protein. Utgangsvekten til disse dyrene var altså 65 g, og vekten etter 3 uker med proteinbehandling var 38 g. (C) Levere fra behandlede og ubehandlede ob-mus. Det er vist levere.fra behandlede og ubehandlede C57Bl/6J-ob/ob-mus. Leveren fra musen som fikk PBS, hadde det store utseendet til en fettlever og veide 5,04 g. Leveren fra musen som fikk det rekombinante ob-protein, hadde et normalt utseende og veide 2,23 g. FIGUR 30 viser hybridiseringen in situ av ob til fettvev. Sense- og antisense-ob-RNA ble merket in vitro ved å bruke Sp6 og T7-polymerase og digoksigenin. De merkede RNA-er ble hybridisert til parafininnhyllede snitt av fettvev fra epididymalfettputer fra 8 uker gamle C57Bl/Ks-mus (merket villtype) og C57Bl/Ks-db/db-mus (merket db). I figuren frem-kommer fettdråpene som ufargede vakuoler i celler. Cytoplas-maet er en tynn kant i periferien av cellene og lar seg ikke skjelne fra cellemembranen. Hybridisering til alle adipocyttene i området ble påvist i villtypesnittene bare ved å bruke antisenseproben, og svært forøkte nivåer ble sett i vevssnit-tene fra db/db-dyrene. FIGUR 31 viser at OB-RNA uttrykkes i adipocytter in vivo og in vitro. Total-RNA (10 mikrogram) fra flere forskjellige kilder ble elektroforesebehandlet på blottet og hybridisert til en ob-probe. For det første ble forskjeller i celle-oppdrift etter kollagenasefordøyelse brukt til å rense adipocytter. OB-RNA var til stede i adipocyttfraksjonen. Felt S viser stromovaskularfraksjonen, og A viser adipocyttfraksjonen. I tillegg ble OB-RNA ikke uttrykt i de udifferensierte 3T3-442-preadipocyttceller, felt U. Differensierte adipocytter fra disse cellelinjene uttrykte klart påvisbare nivåer av OB-mRNA (felt D). FIGUR 32 viser at OB-RNA uttrykkes i alle fettvevsdepoter. Alle de testede fettvevsdepoter uttrykte ob-RNA.

Lyskefettputen uttrykte noe lavere RNA-nivåer, selv om det var variasjon i nivået til signaler i forskjellige forsøk. (FIGUR 3IA) Feltene (1)epididymal-(2)lyske-(3)bukhule-(4)parametrial-fettputer. Brunt fett uttrykte også et lavt nivå av OB-RNA.

(FIGUR 31B) Nivået av OB-ekspresjon i brunt fett var uendret hos dyr som ble holdt ved 4 °C i 1 uke mens overskuddet av den brunfettspesifikke UCP-RNA, kjent for å være kaldinduserbar, økte 5 ganger.

FIGUR 33 viser ekspresjonen av OB-RNA hos db/ db- og gulltioglukosebehandlede mus. Total-RNA fra parametrialfett - putene hos gulltioglukose(GTG)- og db/ db-behandlede mus ble elektroforesebehandlet og "Northern-blotted". GTG administrert som en enkeltdose er kjent for å forårsake fedme ved å indusere spesifikke hypotalamuslesjoner. (A) 1 måned gamle CBA-mus av hunnkjønn ble behandlet med GTG (0,2 mg/g), med en resulterende økning på > 20 g hos behandlede dyr i forhold til kontrolldyr (< 5 g). (B) Hybridisering av en OB-probe til RNA fra db/ db- og GTG-behandlede mus avslørte en 2 0 gangers økning i rikeligheten av ob-RNA i forhold til kontroll-RNA (aktin eller GAPDH). FIGUR 34 viser en Northern-blot-analyse av human-RNA. "Northern-blots" som inneholder 10 mg total-RNA fra humanfettvev (FAT, panel A) og 2 mg polyA+RNA fra andre human-vev (panel B) ble hybridisert til human-ob- og human- -aktin-prober som angitt. Et sterkt signal ved omtrent 4,5 kb ble sett med fettvevstotal-RNA. Hybridisering til polyA+RNA av-slørte påvisbare signaler i hjerte (HE) og livmor (PL), mens OB-RNA ikke ble påvist i hjerne (BR), lunge (LU), lever (LI), skjelettmuskel (SM), nyre (Kl) og bukspyttkjertel (PA). I hvert tilfelle er lengden av den autoradiografiske eksponering angitt. Det skal bemerkes at genesen til de nedre molekylbånd som ses i placenta-RNA (f.eks. alternativ spleising, RNA-nedbrytning), ikke er kjent. FIGUR 35 viser YAC-samling som inneholder human-OB-genet og 8 mikrosatellittmarkører. Det YAC-baserte STS-inn-holdskart for området til kromosom 7 som inneholder human-OB-genet, er vist, slik det utledes ved hjelp av SEGMAP/versjon 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic, 1:77-90 (1991)]. De 19 unikt ordnede STS-er (se tabell 3) er angitt langs toppen. De 8 mikrosatellittspesifikke STS-er angitt med stjerner (se tabell 4) . Også angitt er STS-ene som tilsvarer PaxA- og OB-genene samt de forutsagte stillinger til sentromeren (CEN) og 7q-telomeren (TEL) i forhold til samlingen. Hver av de 43 YAC-klonene er vist ved hjelp av en horisontal stolpe, med navnet angitt til venstre og den beregnede YAC-størrelse (i kb, målt ved hjelp av pulset feltgelelektroforese) tilveiebrakt i parentes. Tilstedeværelsen av en STS i en YAC er angitt ved hjelp av en mørklagt ring i den korrekte stilling. Når en STS tilsvarer innføyelsesenden av en YAC, er et kvadrat plassert rundt den tilsvarende ring, både langs toppen (nær STS-navnet) og ved slutten av YAC hvorfra den ble avledet. For 5 YAC-er ved bunnen (under den horisontale, prikkede linje) ble én eller flere STS(er) som var forventet å være til stede (basert på den fastslåtte STS-rekkefølge) ikke påvist (slik det ble fastslått ved testing av de individuelle YAC-er med de tilsvarende STS-spesifikke PCR-analyser minst to ganger), og disse er vist som åpne ringer i de korrekte stillinger. De fleste YAC-er ble isolert fra et humanhamster-hybrideelle-avledet bibliotek [Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995)], med sine opprinnelige navn som angitt. De gjenværende YAC-er ble isolert fra totalhumangenombiblioteker, og deres opprinnelige biblioteklokaliseringer er gitt i tabell 3. Bokser er plassert rundt navnene til de 3 YAC-ene (yWSS691, yWSS999 og yWSS2935), som ble funnet ved hjelp av FISH-analyse, og kunne kartlegges til 7q31.3. Samlingen er vist i sin "ikke-beregnede" form, hvor YAC-størrelser ikke er brukt til å beregne klonoverlappinger eller STS-mellomrom, og alle STS-ene er derfor plassert i en ekvidistant fasong. I den "beregnede" form, hvor YAC-størrelser er brukt til å beregne den relative avstand som skiller hvert par av tilgrensende STS-er, samt omfanget av klonoverlappinger, synes den totale YAC-samling så vidt å spenne over 2 Mb.

Nærmere beskrivelse

Belysningen og oppdagelsen av et protein, her kalt ob-polypeptid eller leptin, nukleinsyrer som koder for proteinet, inkludert degenererte variasjoner derav, f.eks. som inkorporerer optimale kodoner for ekspresjon i et bestemt ekspresjonssystem, hvilke proteiner oppviser evne til å delta i reguleringen av pattedyrkroppsvekt er her beskrevet. De aktuelle nukleinsyrer utgjør de kodende sekvensene som tilsvarer murin- og human-OB-polypeptidet som er postulert å spille en avgjørende rolle ved reguleringen av kroppsvekt og fedme. Data som her er presentert, indikerer at polypeptid-produktet av en nukleinsyre utskilles av cellene som uttrykker det, og at polypeptidet virker som et hormon. Ytterligere forsøksdata viser at OB-polypeptidet er svært effektivt når det gjelder å behandle fedme hos mus som bærer en mutasjon i ob-genet. I tillegg bevirker høye bolusdoser eller middels .kontinuerlige doser av OB-polypeptid vektreduksjon hos normale (villtype) mus.

I tillegg viser eksemplene her at OB-polypeptidet, her alternativt kalt "leptin" er i omløp i muse-, rotte- og humanplasma. Leptin er fraværende i plasma fra ob/ob-mus og er til stede ved 10 ganger høyere konsentrasjoner i plasma fra db/db-mus og 2 0 ganger høyere konsentrasjoner hos fa/ fa-rotter. Mest betydningsfullt er det at daglige injeksjoner av rekombinant leptin dramatisk reduserer kroppsvekten til ob/ob-mus, påvirker i betydelig grad kroppsvekten til villtypemus og har ingen effekt på db/db-mus.

Ved et ytterligere aspekt er OB-polypeptidet fra én art biologisk aktivt hos en annen art. Særlig er human-OB-polypeptidet aktivt hos mus.

I sitt hovedaspekt beskrives heri identifikasjonen av materialer som virker som modulatorer for

pattedyrkroppsvekt. Det er også beskrevet isoleringen, rensingen og sekvenseringen av visse nukleinsyrer som tilsvarer OB-genet eller dets kodende område hos både mus og mennesker, samt de tilsvarende polypeptider uttrykt av disse nukleinsyrene. Det beskriver således oppdagelsen av nukleinsyrer som har nukleotidsekvensene angitt i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 1) og figur 2A og B (SEKV.ID. NR. 3) og degenererte varianter, alleler og fragmenter derav, som alle har den aktivitet at de modulerer kroppsvekt og fedme. Samsvaret mellom de foreliggende nukleinsyrer og OB-genet bebuder deres betydelige virkning på slike tilstander som fedme, samt andre feil og dysfunksjoner hvor unormaliteter i kroppsvekt er en bidragende faktor. Proteinene uttrykt av nukleinsyrene, og særlig de proteinene som er angitt i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 2) og figur 3 (SEKV.ID. NR. 4), figur 5 (SEKV.ID. NR. 5) og figur 6 (SEKV.ID. NR. 6), samt de konserverte varianter, aktive fragmenter og beslektede småmolekyler beskrives.

Som tidligere omtalt, kan vektkontrollmodulator-peptidene eller deres bindingspartnere .eller andre ligander eller midler som utviser enten etterligning eller antagonisme til dem, eller kontroll over deres produksjon, fremstilles i farmasøytiske preparater med en egnet bærer og ved en styrke <g>om er effektiv når det'gjelder administrering ved hjelp av forskjellige midler til en pasient som har unormale fluktua-sjoner i kroppsvekt eller fedme, enten alene eller som en del av en alvorlig medisinsk tilstand, slik som kreft eller AIDS, for behandling av den. Mange forskjellige administrative teknikker kan benyttes, blant dem oral administrering, nasal og andre former av transmukosal administrering, parenterale teknikker, slik som subkutane, intravenøse og intraperitoneale injeksjoner, kateteriseringer og lignende. Gjennomsnittlige mengder av gjenkjennelsesfaktorene eller deres underenheter kan variere og bør særlig baseres på anbefalingene til og det som foreskrives av en kvalifisert lege eller veterinær.

I overensstemmelse med det ovenfor nevnte kan det fremstilles et analysesystem for screening av potensielle legemidler som er effektive når det gjelder å etterligne eller antagonisere aktiviteten av vektmodulatoren. Vektmodulatoren kan innføres i et testsystem, og det påtenkte legemiddel kan også innføres i den resulterende cellekultur, og kulturen kan deretter undersøkes for å observere eventuelle endringer i aktiviteten til cellene, enten på grunn av tilsetningen av det eventuelle legemiddel alene eller på grunn av effekten av til-satte mengder av den kjente vektmodulator.

Som angitt tidligere, har den molekylære kloning av OB-genet som her er beskrevet, ført til identifikasjonen av en klasse materialer som virker på det molekylære nivå til å modulere pattedyrkroppsvekt. Oppdagelsen av modulatorene har viktige implikasjoner for diagnosen og behandlingen av næringsmessige forstyrrelser, inkludert, men ikke begrenset til, fedme, vekttap forbundet med kreft og behandlingen av sykdommer som er forbundet med fedme, slik som hypertensjon, hjertesykdom og diabetes av type II. I tillegg finnes det potensielle landbruksmessige anvendelser for genproduktet i tilfeller hvor man kan ønske å modulere kroppsvekten til husdyr. Endelig kan de, i den utstrekning at én eller flere av modulatorene er utskilte molekyler, anvendes biokjemisk til å isolere sin reseptor under anvendelse av teknikken med ekspresj onskloning.

Som angitt ovenfor, kan den funksjonelle aktivitet av OB-polypeptidet evalueres transgent. I dette henseende kan det anvendes en transgen musemodell. ob-genet kan brukes ved komplementeringsundersøkelser under anvendelse av transgene mus. Transgene vektorer, inkludert virusvektorer, eller kosmidkloner (eller fagkloner) som tilsvarer villtypestedet i kandidatgen, kan konstrueres ved å bruke det isolerte ob-gen. Kosmider kan innføres i transgene mus under anvendelse av publiserte fremgangsmåter [Jaenisch, Science, 240:1468-1474

(1988)]. Konstruksjonene innføres i fertiliserte egg utvunnet fra en krysning mellom Fl-avkom fra en C57BL/6J-ob/ob-X-DBA-kryssing. Disse krysningene krever bruk av C57BL/6J-ob/ob-ovarietransplantater for å frembringe Fl-dyrene. DBA/2J-mus brukes som motstammen, ettersom de har en ikke-agutidekkfarge som er viktig når ovarietransplantatene brukes. Genotype i ob-stedene hos kosmidtransgene dyr kan bestemmes ved å type dyrene med tett sammenbundne RFLP-er eller mikrosatellitter som flankerer mutasjonen, og som er polymorfe mellom forløper-stammene. Komplementering vil bli vist når en bestemt konstruksjon gjør et genetisk tykt F2-dyr (som bedømt ved hjelp av RFLP-analyse) magert og ikke-diabetisk. Under disse omstendighetene vil sluttbevis for komplementering kreve at db/ db- eller db/db-dyret som bærer transgenet, pares med ob/ ob- eller db/db-ovarietransplantatene. Ved denne krysningen vil alle N2-dyr som ikke bærer transgenet, være tykke og insulinresistente/diabetiske, mens de som bærer transgenet, vil være magre og ha normale glukose- og insulinkonsentra-sjoner i plasma. I genetisk betydning virker transgenet som en suppressormutasj on.

Alternativt kan OB-gener testes ved å undersøke deres fenotypiske effekter når de uttrykkes i antisense-orientering i villtypedyr. Ved denne fremgangsmåten under-trykkes ekspresjon av villtypeallelet, noe som fører til en mutant fenotype. RNA-RNA-dupleksdannelse (antisense-sense) forhindrer normal håndtering av mRNA, noe som resulterer i delvis eller fullstendig eliminering av villtypegeneffekt. Denne teknikken er blitt brukt til å inhibere TK-syhtese i vevskultur og til å fremstille fenotyper av Kruppel-mutasjonen i Drosophila og Shiverer-mutasjonen hos mus, Izant et al.,

Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241:593-595

(1988). En viktig fordel ved denne fremgangsmåten er at det bare er nødvendig å uttrykke en liten del av genet for effektiv inhibering av ekspresjon av hele kognat-mRNA-en. Antisensetransgenet vil bli plassert under kontroll av sin egen promoter eller en annen promoter uttrykt i den korrekte celletype og plassert oppstrøms for SV40-polyA-setet. Dette transgenet vil bli brukt til å lage transgene mus. Transgene mus vil også bli paret med ovarietransplantater for å teste hvorvidt ob-heterozygoter er mer sensitive overfor effektene av antisensekonstruksjonen. På lang sikt er belysningen av den biokjemiske funksjonen til OB-genproduktet (OB-polypeptidet eller -proteinet) nyttig for identifisering av småmolekylagonister og -antagonister som påvirker dets aktivitet. Forskjellige uttrykk som er brukt i denne beskrivelsen, skal ha de definisjonene som her er angitt f.eks. nedenunder . Uttrykket "kroppsvektmodulator", "modulator", "modulatorer" og eventuelle varianter som ikke er spesielt angitt, kan her brukes om hverandre og henviser slik de er brukt i den foreliggende søknad og de foreliggende krav, i ett tilfelle til både nukleotider og til proteinholdig materiale, idet det sistnevnte tilfellet omfatter både enkelt- og multippelprote-iner. Nærmere bestemt omfatter de ovenfor nevnte uttrykk nukleotidene og den DNA som har sekvensene som her er beskrevet og vist i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 1) og figur 2A og B (SEKV.ID. NR. 3). På samme måte omfattes proteinene som har aminosyresekvensdataene som er beskrevet her, og som er vist i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 2) og figur 3 (SEKV.ID. NR. 4), og det er også aktivitetsprofilen som er angitt med hensyn til alle materialene både her og i kravene. Følgelig er nukleotider som oppviser vesentlig ekvivalent eller endret aktivitet, på samme måte omfattet, inkludert i det vesentlige homologe analoger og allelvariasjoner. Likeledes er proteiner som utviser vesentlig ekvivalent eller endret aktivitet, inkludert proteiner som er bevisst modifisert, som f.eks. ved seterettet mutagenese, eller tilfeldig gjennom mutasjoner hos verter som produserer modulatorene, på samme måte omfattet. Et preparat som omfatter "A" (hvor "A" er et enkelt-protein, DNA-molekyl, en vektor, en rekombinant vertscelle etc), er i det vesentlige fritt for "B" (hvor "B" omfatter ett eller flere forurensende proteiner, DNA-molekyler, vektorer etc, men ikke racemiske former av "A") når minst ca. 75 vekt% av proteinene, DNA-en, vektorene (avhengig av kate-gorien av art som A og B tilhører) i preparatet er "A". Fortrinnsvis omfatter "A" minst ca. 90 vekt% av A+B-arten i preparatet, mest foretrukket minst ca. 99 vekt%. Det er også foretrukket at et preparat som er i det vesentlige fritt for forurensning, inneholder bare en eneste molekylvektart som har aktiviteten eller kjennetegnene til den aktuelle art.

OB- polypeptidene

Uttrykket "protein", som henviser til det naturlig forekommende polypeptid, og "polypeptid" brukes her om hverandre med hensyn til ob-genproduktet og variantene derav. Uttrykket "modent protein" eller "modent polypeptid" henviser særlig til QB-genproduktet med signalsekvensen (eller en fusjonsproteinpartner) fjernet.

Ved bestemte utførelsesformer omfatter, som angitt ovenfor, ob-polypeptidene dem som har aminosyresekvensene som her er angitt, f. eks. SEKV. ID. NR. 2, 4, 5, 6 etc, inkludert ob-polypeptidet modifisert med konservative aminosubstitu-sjoner, samt biologisk aktive fragmenter, analoger og derivater derav. Uttrykket "biologisk aktiv" henviser slik det her er brukt, til en bestemt defekt av polypeptidet, inkludert, men ikke begrenset til, spesifikk binding, f.eks. til en reseptor, et antistoff eller et annet gjenkjenningsmolekyl; aktivering av signalomdannelsesreaksjonsspor på molekylært nivå; og/eller induksjon (eller inhibering ved hjelp av antagonister) av fysiologiske effekter formidlet av det naturlig forekommende ob-polypeptid in vivo. OB-polypeptider, inkludert fragmenter, analoger og derivater, kan fremstilles syntetisk, f.eks. ved å bruke de velkjente teknikkene med fastfase- eller oppløsningsfasepeptidsyntese. Fortrinnsvis anvendes fastfasesynteseteknikker. Alternativt kan OB-polypeptider fremstilles ved å bruke velkjente genteknikker, som beskrevet nedenunder. Ved nok en annen utførelsesform kan OB-polypeptidet renses, f.eks. ved immunaffinitetsrensing, fra en biologisk væske, slik som, men ikke begrenset til, plasma, serum eller urin, fortrinnsvis humanplasma, -serum eller - urin, og mer foretrukket fra et individ som overuttrykker polypeptidet, slik som eh tykk person som lider av en mutasjon i OB-reseptoren, eller av fedme relatert til en mutasjon som tilsvarer "fatty".

Fragmenter av OB- polypeptidet

Ved en bestemt utførelsesform angis det at naturlig forekommende fragmenter av OB-polypeptidet kan være viktige. Peptidsekvensen omfatter et antall seter som ofte er målet for proteolytisk spalting, f.eks. argininrester. Det er mulig at fullengdepolypeptidet kan spaltes i ett eller flere slike seter, hvorved det dannes biologisk aktive fragmenter. Slike biologisk aktive fragmenter kan enten agonisere eller antagonisere den funksjonelle aktivitet av OB-polypeptidet for å redusere kroppsvekt.

Analoger til OB- polypeptidet

Det beskrives særlig fremstilling av analoger av 0B-peptidet som er kjennetegnet ved å ha en av OB-polypeptidets biologiske aktiviteter, f.eks. binding til en bestemt bindingspartner for OB-peptid, slik som OB-reseptoren. Ved én utførelsesform agoniserer analogen OB-aktivitet, dvs. at den virker på samme måte som ob-peptidet. Fortrinnsvis er en 0B-agonist mer effektiv enn det naturlig forekommende protein. For eksempel kan en OB-agonistanalog bindes til OB-reseptoren med høyere affinitet eller oppvise en mer langvarig halveringstid in vivo, eller begge deler. Ikke desto mindre er også OB-peptidagonistanaloger som er mindre effektive enn det naturlig forekommende protein, også omfattet. Ved en annen utførelsesform antagoniserer analogen OB-aktivitet. For eksempel kan en OB-analog som bindes til OB-reseptoren, men som ikke induserer signalomdannelse, inhibere binding av naturlig forekommende OB til reseptoren kompetitivt, slik at OB-aktivitet in vivo reduseres. En slik OB-antagonistanalog kan også oppvise andre egenskaper enn ob-peptid, f .eks. mer langvarig (eller kortere) halveringstid in vivo, høyere (eller lavere) bindingsaffinitet for OB-reseptoren, eller begge deler.

Ved én utførelsesform er en analog av OB-peptid 0B-peptidet som er modifisert ved substitusjon av aminosyrer-i stillinger på polypeptidet som ikke er av avgjørende betydning for struktur eller funksjon. Ettersom det er kjent at human-OB-peptid er biologisk aktivt hos mus, vil f.eks. utbytting av forskjellige aminosyrerester i humansekvensen sammenlignet med den murine aminosyresekvens sannsynligvis gi anvendbare analoger av OB-peptid. Serinresten i 53-stilling eller 98-stilling, eller begge to (i den uprosesserte peptidsekvens vist i figur 4), fra menneske kan f.eks. byttes ut, f.eks. med glysin, alanin, valin, cystein, metionin eller treonin. Likeledes kan argininresten i stilling nummer 92 (figur 4) byttes ut, f.eks. med asparagin, lysin, histidin, glutamin, glutaminsyre, asparaginsyre, serin, treonin, metionin eller cystein. Idet det fortsatt henvises til figur 4, er andre aminosyrer i human-OB-peptidet som synes å være i stand til å bli byttet ut, histidin i 118-stilling, tryptofan i 121-stilling, alanin i 122-stilling, glutaminsyre i 126-stilling, treonin i 127-stilling, leucin i 128-stilling, glysin i 132-stilling, glysin i 139-stilling, tryptofan i 159-stilling og glysin i 166-stilling. Ved en annen utførelsesform kan det være mulig å bytte ut én eller flere av restene 121-128 (som vist i figur 4), f.eks. med glysinrester eller alaninrester, eller bytte ut noen av restene med unntak av serin i 123-stilling og leucin i 125-stilling.

Ved en annen utførelsesform er en analog av OB-polypeptidet, fortrinnsvis human-OB-polypeptidet, en avkortet form av polypeptidet. For eksempel er det allerede blitt vist at glutaminet i 49-resten ikke er av avgjørende betydning og kan fjernes fra peptidet. Likeledes kan det være mulig å utelate noen eller alle de forskjellige aminosyrerestene i stillingene 121-128. I tillegg beskrives tilveiebringelse av en OB-analog som har den minimale aminosyresekvens som er nødvendig for en biologisk aktivitet. Dette kan lett bestemmes f.eks. ved å teste aktiviteten til fragmenter av OB med hensyn til evne til å binde til OB-spesifikke antistoffer, inhibere aktiviteten til det naturlig forekommende OB-polypeptid eller agonisere aktiviteten til det naturlig forekommende OB-peptid. Ved én utførelsesform beskrives et avkortet OB-polypeptid bestående av sløyfestrukturen dannet av disulfidbindingen som dannes mellom cysteinrestene 117 og 167 (som vist i figur 4). Ved en annen utførelsesform tilsvarer den avkortede analog aminosyrene fra rest 22 (som følger etter det putative signalpeptidspaltingssete). til 53 (aminosyreresten umiddelbart foran en fleksibel sløyferegion påvist med begrenset proteolyse, etterfulgt av massespektrometrisk analyse av OB-polypeptidet; se Cohen et al., Protein Science, 4:1088 (19-95)). Ved en annen utførelsesform tilsvarer den avkortede analog aminosyrene fra rest 61 (resten umiddelbart etter den fleksible sløyferegion, som påvist med den begrensede proteolyse-/massespektrometriske analyse av OB-polypeptidet) til aminosyrerest 116 (resten umiddelbart forut for den første cystein-rest). Ved nok en annen utførelsesform tilsvarer den avkortede analog aminosyrene fra rest 61 til aminosyrerest 167.

Dessuten er én eller flere av restene i den putative fleksible sløyfe i restene nr. 54-60 byttet ut. For eksempel kan én eller flere av restene byttes ut med lysin, glutaminsyre eller cystein (fortrinnsvis lysin) for kryssbinding, f.eks. til en polymer, ettersom fleksible sløyfestrukturer er foretrukne seter for derivatisering av et protein. Alternativt kan restene i de fleksible sløyfestillingene byttes ut med aminosyrerester som er mer resistente overfor proteolyse, men som bibeholder en fleksibel struktur, f.eks. én eller flere prolinrester. Ved nok en annen utførelsesform er utbyttinger med aminosyrerester som kan være ytterligere derivatiserte for å gjøre dem mer resistente overfor nedbrytning, f.eks. proteolyse, omfattet.

Det vil forstås av fagfolk innen teknikken at fragmentstørrelsene ovenfor er omtrentlige, og at fra 1 til ca. 5 aminosyrer kan være inkludert eller delert fra hver av eller begge endene, eller fra de indre deler av polypeptidet eller fragmentene derav, av de angitte avkortede analoger, bortsett fra at cysteinrestene i de disulfidbundne sløyfe - analogene må bære beholdt.

Det er blitt funnet at murint OB-peptid inneholder 50 % -heliksinnhold, og at human-OB-polypeptidet inneholder ca. 60 % -heliksinnhold, som påvist ved hjelp av sirkulærdikroisme av de rekombinante peptidene under tilnærmet fysiologiske betingelser. Ved en annen utførelsesform kan følgelig aminosyrerestene byttes ut med rester slik at det dannes analoger av OB-polypeptid som oppviser forøkt tilbøyelighet til dannelse av -heliksstrukturer eller som danner mer stabile -heliksstrukturer. For eksempel ville -heliksstruk-tur være foretrukket dersom Glu, Ala, Leu, His, Trp innføres som substitutter for aminosyrerester som finnes i det naturlig forekommende OB-polypeptid. Fortrinnsvis anvendes konservative aminosyresubstitusjoner, f.eks. ved å bytte ut asparaginsyre i resten(e) 29, 30, 44, 61, 76, 100 og/eller 106 (som vist i figur 4) med glutaminsyren(e) (Glu); bytte ut isoleucin(er) med leucin; bytte ut glysin eller valin, eller hvilken som helst avvikende aminosyre med alanin (f.eks. serin i 53-stilling i human-OB-polypeptidet med alanin), bytte ut arginin eller lysin med histidin og bytte ut tyrosin og/eller fenyl-alanin med tryptofan. Økning av graden eller, viktigere, av stabiliteten av -heliksstrukturen kan gi en OB-analog med større aktivitet, forøkt bindingsaffinitet eller mer langvarig halveringstid. Ved en bestemt utførelsesform økes det heliksdannende potensial til den delen av OB-peptidet som tilsvarer aminosyrerestene 22-53. Ved en annen utførelsesform økes det heliksdannende potensial eller stabiliteten til aminosyrerestene 61-116. Ved nok en annen utførelsesform økes det heliksdannende potensial til disulfidsløyfestrukturen som tilsvarer aminosyrene 117-167. Det er også omfattet OB-analoger som inneholder forøkt -helikspotensial eller -stabilitet i mer enn ett av de ovenfor nevnte domener. Ved en ytterligere utførelsesform frembringes avkortede OB-polypeptidanaloger som inkorporerer strukturdannende, f.eks. heliksdannende, aminosyrerester for å kompensere for den større tilbøyelighet hos polypeptidfragmenter til å mangle stabil struktur.

Analoger, slik som fragmenter, kan fremstilles f.eks. ved hjelp av pepsinfordøyelse av vektmodulator-materiale. Andre analoger, slik som muteiner, kan fremstilles ved hjelp av standard seterettet mutagenese av vektmodulator-peptidkodende sekvenser. Analoger som oppviser "vektmodulator-aktivitet", slik som småmolekyler, kan uansett om de virker som promoterer eller inhibitorer identifiseres ved hjelp av kjente analyser in vivo og/eller in vitro.

Småmolekylanaloger og peptidetterligninger av OB- polypeptid

Strukturen til ob-polypeptidet, fortrinnsvis human-OB-polypeptid, kan analyseres ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Proteinsekvensen kan karakteriseres ved hjelp av en hydrofilisitetsanalyse [f.eks. Hopp et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:3824 (1981)]. En hydrofilisitetsprofil kan brukes til å identifisere de hydrofobe og hydrofile områdene i OB-polypeptidet, noe som kan indikere områder begravd i det indre av det foldede polypeptid, og områder som er tilgjengelige på det ytre av polypeptidet. I tillegg kan det også gjøres sekundærstrukturanalyse [f.eks. Chou et al., Biochem., 13:222 (1974)] for å identifisere områder i OB-polypeptid som antar spesifikke sekundærstrukturer. Manipulering av den forutsagte eller bestemte struktur, inkludert sekundærstrukturforutsigelse, kan utføres ved å bruke datamaskinprogrammer som er tilgjengelige innen teknikken.

Ved å tilveiebringe en rikelig kilde for rekombinant OB-polypeptid, muliggjøres kvantitativ strukturbestemmelse av polypeptidet. Særlig tilveiebringes tilstrekkelig materiale for kjernemagnetisk resonans(NMR)-, infrarød(IR)-, Råman- og ultrafiolett(UV)-, spesielt sirkulærdikroisme(CD)-, spektroskopianalyse. Særlig NMR gir svært kraftfull strukturanalyse av molekyler i oppløsning, noe som kommer nærmere opp til deres naturlig forekommende miljø [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. , 113:96'7-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimura et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:1681-1685 (1980.)]. Andre fremgangsmåter for strukturanalyse kan også anvendes. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, røntgenkrystallografi [Engstrom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].

Ved nok en ytterligere utførelsesform kan en analog av OB-polypeptid testes for å bestemme hvorvidt den kryss-reagerer med et antistoff som er spesifikt for naturlig forekommende OB-polypeptid eller spesifikke fragmenter derav. Graden av kryssreaktivitet gir informasjon om strukturhomologi eller likhet mellom proteiner, eller om tilgjengeligheten for områder som tilsvarer deler av polypeptidet som ble brukt til å frembringe fragmentspesifikke antistoffer.

Screening med hensyn til OB- analoger

Innen fagområdet er det kjent forskjellige screen-ingsteknikker for screening med hensyn til analoger av polypeptider. Forskjellige biblioteker med kjemikalier er tilgjengelige. Følgelig angis det heri screening av slike biblioteker, f.eks. biblioteker med syntetiske forbindelser frembrakt gjennom mange års forskning, biblioteker med naturlige forbindelser og kombinasjonsbiblioteker, som beskrevet nærmere nedenunder, for analoger av OB-polypeptid. Ved én utførelsesform beskrives screening av slike biblioteker med hensyn til forbindelser som binder til anti-OB-polypeptidantistoffer, fortrinnsvis antihuman-ob-polypep-tidantistoffer. Ved et annet aspekt kan, når OB-reseptoren først er identifisert (se nedenunder), hvilken som helst screeningsteknikk som er kjent innen fagområdet, brukes til å screene med hensyn til OB-reseptoragonister eller - antagonister. Det beskrives screeninger for småmolekylligander eller ligandanaloger og etterligninger, samt screeninger for naturlige ligander som binder til og agoniserer eller antagoniserer aktivering av OB-reseptor in vivo.

Kunnskap om primærsekvensen til reseptoren og lik-heten mellom den sekvensen og proteiner med kjent funksjon kan gi et første holdepunkt med hensyn til agonistene eller antagonistene for proteinet. Identifikasjon og screening av antagonister lettes ytterligere ved å bestemme strukturtrekk hos proteinet, f.eks. ved å bruke røntgenkrystallografi, nøytrondiffraksjon, kjernemagnetisk resonansspektrometri og andre teknikker for strukturbestemmelse. Disse teknikkene sørger for rasjonell utforming eller identifikasjon av agonister og antagonister.

Ved en annen fremgangsmåte anvendes rekombinant bakteriofag til å fremstille store biblioteker. Ved å anvende "fagmetoden" [Scott et al., Science, 249:386-390 (1990);

Cwirla et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378-6382

(1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)] kan det konstrueres svært store biblioteker (IO<6->IO<8> kjemiske enheter). En andre fremgangsmåte gjør bruk av hovedsakelig kjemiske metoder, hvorav Geysen-metoden [Geysen et al., Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method; 102:259-274 (1987)] og den nyere metoden til Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991) er eksempler. I Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, volum 5, sammendrag FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991)]; Houghton (US patentskrift nr. 4 631 211, utgitt i desember 1986); og Rutter et al. (US patentskrift nr. 5 010 175, utgitt 23. april 1991) beskrives fremgangsmåter for fremstilling av en blanding av peptider som kan testes som agonister eller antagonister.

Ved et annet aspekt kan syntetiske biblioteker [Needels et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10700-10704

(1993); Lam et al., internasjonal patentpublikasjon nr. WO 92/00252 og lignende brukes til å screene med hensyn til OB-reseptorligander. Med slike biblioteker kan

reseptorantagonister påvises ved å bruke celler som uttrykker reseptoren uten egentlig å klone OB-reseptoren.

Alternativt kan det utføres analyser med hensyn til binding av oppløselig ligand til celler som uttrykker rekombinante former av det OB-reseptorligandbindende domenet. De opp-løselige ligander kan lett tilveiebringes som rekombinant eller syntetisk OB-polypeptid.

Screeningen kan utføres med rekombinante celler som uttrykker OB-reseptoren eller alternativt ved å bruke renset reseptorprotein, f.eks. rekombinant fremstilt, som beskrevet ovenfor. For eksempel kan evnen til merket, oppløselig eller oppløseliggjort OB-reseptor, som omfatter den ligandbindende del av molekylet, til å binde ligand brukes til screening av biblioteker, som beskrevet i litteraturhenvisningene ovenfor.

Derivater av OB- polypeptider

Generelt vil det foreliggende protein (her er uttrykket."protein" brukt slik at det omfatter "polypeptid", med mindre annet er angitt) kunne derivatiseres ved hjelp av festingen av én eller flere kjemiske rester til proteinresten. De kjemisk modifiserte derivater kan formuleres videre for intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulær, subkutan, intravenøs, oral, nasal, rektal, bukkal,- sublingual, pulmonal, topisk, transdermal eller annen administreringsmåte. Kjemisk modifikasjon av biologisk aktive proteiner er blitt funnet å gi ytterligere fordeler under visse omstendigheter, slik som økning av stabiliteten og omløpstiden til det terapeutiske protein, og reduksjon av immunogenisitet. Se US patentskrift nr. 4 179 337, Davis et al., utgitt 18. desember 1979. For en oversikt, se Abuchowski et al., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", i Enzymes as Drugs, s. 367-383, Holcenberg og Roberts, red. Wiley-Interscience, New York, NY (1981). En oversiktsartikkel som beskriver proteinmodifikasjon og fusjonsproteiner, er Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10

(1992) .

Kjemiske rester for derivatisering

De kjemiske restene som er egnet for derivatisering, kan velges blant vannoppløselige polymerer. Den utvalgte polymer bør være vannoppløselig slik at proteinet som den er festet til, ikke utfelles i et vandig miljø, slik som et fysiologisk miljø. Fortrinnsvis vil polymeren, for terapeutisk anvendelse av sluttproduktpreparatet, være farmasøytisk akseptabelt. Fagfolk innen teknikken vil være i stand til å velge ut den ønskede polymer basert på slike betraktninger som hvorvidt konjugatet av polymer og protein skal brukes terapeutisk og, dersom det er tilfellet, den ønskede dosering, omløpstid, motstandsevne mot proteolyse og andre vurderinger. Når det gjelder de foreliggende proteiner og peptider, så kan disse fastlegges ved å bruke de analyser som her er tilveiebrakt.

Polymermolekyler

Den vannoppløselige polymer kan velges fra gruppen bestående av f.eks. polyetylenglykol, kopolymerer av etylenglykol/propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1, 3-dioksolan, poly-1,3,6-trioksan, kopolymer av etylen og maleinsyreanhydrid, polyaminosyrer (enten homopolymerer eller vilkårlige kopolymerer) og dekstran eller poly(n-vinylpyrrolidon)polyetylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, kopolymerer av polypropy-lenoksid og etylenoksid, polyoksyetylerte polyoler og polyvinylalkohol. Polyetylenglykolpropionaldehyd kan gi fordeler ved fremstilling på grunn av dets stabilitet i vann.

Polymeren kan ha hvilken som helst molekylvekt og kan være forgrenet eller uforgrenet. For polyetylenglykol er den foretrukne molekylvekt mellom ca. 2 kDa og ca. 100 kDa (uttrykket "ca." indikerer at noen molekyler i preparater av polyetylenglykol vil veie mer, noen mindre, enn den angitte molekylvekt) av hensyn til lettvint håndtering og fremstilling. Andre størrelser kan brukes, avhengig av den ønskede terapeutiske profil (f.eks. den ønskede varighet av langvarig frigjørelse, eventuelle effekter på biologisk aktivitet, lettvint håndtering, graden av eller mangel på antigenisitet og andre kjente effekter av polyetylenglykolen på et terapeutisk protein eller en terapeutisk analog).

Forhold mellom polymer og protein

Antallet polymermolekyler festet på denne måten kan variere, og fagfolk innen teknikken vil være i stand til å fastlegge effekten på virkning. Man kan monoderivatisere eller sørge for en di-, tri-, tetra- eller annen kombinasjon av derivatisering, med de samme eller forskjellige kjemiske rester (f.eks. polymerer, slik som forskjellige vekter av polyetylenglykoler). Blandingsforholdet mellom polymermolekyler og proteinmolekyler (eller peptidmolekyler) vil variere, noe som også gjelder for konsentrasjoner i reaksjonsblandingen. Generelt vil det optimale forhold (når det gjelder reaksjonsvirkningsfullhet ved at det ikke er noe overskudd av uomsatt protein eller polymer) bli bestemt av faktorer, slik som den ønskede derivatiseringsgrad (f.eks. mono-, di-, tri-etc), molekylvekten til den valgte polymer, hvorvidt polymeren er forgrenet eller uforgrenet, og reaksjonsbetingelsene.

Festing av den kjemiske rest til proteinet

Polyetylenglykolmolekylene (eller andre kjemiske rester) bør festes til proteinet under hensyntagen til effekter på funksjonelle eller antigene domener i proteinet. Det er en rekke festemetoder tilgjengelig for fagfolk innen teknikken, f.eks. EP 0 401 384 (kobling av PEG til G-CSF). Se også Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (som rappor-terer pegylering av GM-CSF under anvendelse av tresylklorid). For eksempel kan polyetylenglykol bindes kovalent gjennom aminosyrerester via en reaktiv gruppe, slik som en fri amino-eller karboksylgruppe. Reaktive grupper er de som et aktivert polyetylenglykolmolekyl kan bindes til. Aminosyrerestene som har en fri aminogruppe, kan omfatte lysinrester og de N-terminale aminosyrerestene, de som har en fri karboksylgruppe, kan omfatte asparaginsyrerester, glutaminsyrerester og den C-terminale aminosyrerest. Sulfhydrylgrupper kan også brukes som en reaktiv gruppe for festing av polyetylenglykolmolekylet eller -molekylene. Foretrukket for terapeutiske formål er festing i en aminogruppe, slik som festing i N-enden eller lysingruppen. Festing til rester som er viktige for reseptorbinding, bør unngås dersom reseptorbinding er ønsket.

N- terminalt, kjemisk modifiserte proteiner

Man kan spesifikt ønske N-terminalt, kjemisk modifisert protein. Ved å bruke polyetylenglykol som en illustra-sjon for de foreliggende preparater, kan man velge blant mange forskjellige polyetylenglykolmolekyler (ved hjelp av molekylvekt, forgrening etc.), blandingsforholdet mellom polyetylenglykolmolekyler og proteinmolekyler (eller peptidmolekyler) i reaksjonsblandingen, typen av pegyleringsreaksjon som skal utføres og fremgangsmåten for oppnåelse av det utvalgte N-terminalt pegylerte protein. Fremgangsmåten for oppnåelse av det N-terminalt pegylerte preparat (dvs. separasjon av denne resten fra andre monopegylerte rester om nødvendig) kan skje ved hjelp av rensing av det N-terminalt pegylerte materiale fra en populasjon av pegylerte proteinmolekyler. Selektiv N-terminal, kjemisk modifikasjon kan utføres ved hjelp av reduktiv alkylering hvor differensiell reaktivitet hos-forskjellige typer av primære aminogrupper (lysin versus N-enden) som er tilgjengelige for derivatisering i et bestemt protein, utnyttes. Under de passende reaksjonsbetingelser oppnås i det vesentlige selektiv derivatisering av proteinet i N-enden med en. karbonylgruppeholdig polymer. For eksempel kan man selek-tivt pegylere proteinet N-terminalt ved å utføre reaksjonen ved en pH-verdi som gjør det mulig å dra fordel av pKa-forskjellene mellom -aminogruppene i lysinrestene og -amino-gruppen i den N-terminale rest i proteinet. Ved hjelp av selektiv derivatisering reguleres festing av en vannoppløselig polymer til et protein; konjugeringen med polymeren finner sted hovedsakelig i N-enden av proteinet, og det inntrer ingen betydelig modifikasjon av andre reaktive grupper, slik som lysinsidekjedeaminogruppene. Ved å.bruke reduktiv alkylering kan den vannoppløselige polymer være av den ovenfor beskrevne type og bør ha ett enkelt reaktivt aldehyd for kobling til proteinet. Polyetylenglykolpropionaldehyd som inneholder ett enkelt reaktivt aldehyd, kan brukes.

Nukleinsyrer forbundet med OB- polypeptid.

Som angitt ovenfor, beskrives nukleinsyrer som koder for ob-polypeptider, samt ledsagende genomiske, ikke-kodende sekvenser 5', 3' og intronisk i forhold til OB-genet. Det kan således anvendes konvensjonelle teknikker innen molekylærbiologi, mikrobiologi og rekombinant DNA som ligger innenfor fagkunnskaper på områdene. Slike teknikker er fullstendig forklart i litteraturen. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York

(1989); Glover, red., DNA Cloning: A Practical Approach, volu-mene I og II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait,

red., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (198-4); Hames et al., red., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et al., red., Transcription and Translat-ion, Oxford University Press (1984)]; Freshney, red., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986)]; Perbal, A Practical

Guide to Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). Av særlig relevans for foreliggende oppfinnelse er strategier for isolering, kloning, sekvensering, analysering og karakterisering av et gen eller en nukleinsyre basert på de velkjente teknikker med polymerasekjedereaksjon (PCR).

Et "replikon" er hvilket som helst genetisk element (f.eks. plasmid, kromosom, virus) som virker som en autonom enhet i DNA-replikasjon in vivo, dvs. som er i stand til replikasjon under sin egen kontroll.

En "vektor" er et replikon, slik som et plasmid, en fag eller et kosmid, hvortil et annet DNA-segment kan være festet for å■tilveiebringe replikasjonen av det festede segment.

En "kassett" henviser til et segment av DNA som kan innføres i en vektor i spesifikke restriksjonsseter. Segmentet av DNA som koder for et polypeptid av interesse og kassetten og restriksjonssetene utformes for å sikre innføring av kassetten i den korrekte leseramme for transkripsjon og translasjon.

"Heterolog" DNA henviser til DNA som ikke befinner seg naturlig i cellen eller i et kromosomsete i cellen. Fortrinnsvis omfatter den heterologe DNA et gen som er fremmed for cellen.

En celle er blitt "transfektert" ved hjelp av eksogen eller heterolog DNA når slik DNA er blitt innført i cellen. En celle er blitt "transformert" av eksogen eller heterolog DNA når den transfekterte DNA bevirker en fenotypisk endring. Fortrinnsvis bør den transformerende DNA integreres (bindes kovalent) i kromosomal DNA som utgjør cellens genom.

En "klon" er en populasjon av celler avledet fra en eneste celle eller en felles forløper ved hjelp av mitose.

Et "nukleinsyremolekyl" henviser til den polymere fosfatesterform av ribonukleosider (adenosin, guanosin, uridin eller cytidin; "RNA-molekyler") eller deoksyribonukleosider (deoksyadenosin, deoksyguanosin, deoksytymidin eller deoksy-cytidin; "DNA-molekyler"), enten i enkelttrådet form eller en dobbelttrådet heliks. Dobbelttrådete DNA-DNA-, DNA-RNA- og RNA-RNA-helikser er mulig. Uttrykket nukleinsyremolekyl og særlig DNA- eller RNA-molekyl henviser bare til primær- og sekundærstrukturen til molekylet, og begrenser det ikke til noen bestemte tertiær- eller kvaternærformer. Dette uttrykket omfatter således dobbelttrådet DNA som finnes blant annet i lineære eller sirkulære DNA-molekyler (f.eks. restriksjons-fragmenter), plasmider og kromosomer. Når strukturen til bestemte dobbelttrådete DNA-molekyler omtales, kan sekvenser her beskrives i henhold til den normale konvensjon hvorved sekvensen bare angis i 5'- til 3'-retningen langs den ikke-transkriberte DNA-tråd (dvs. tråden som har en sekvens som er homolog med mRNA). Et "rekombinant DNA-molekyl" er et DNA-molekyl som har gjennomgått en molekylærbiologisk manipulasjon.

Et nukleinsyremolekyl er "hybridiserbart" til et annet nukleinsyremolekyl, slik som en cDNA, genom-DNA eller RNA, når en enkelttrådet form av nukleinsyremolekylet kan annealere til det andre nukleinsyremolekylet under de korrekte betingelser med hensyn til temperatur og oppløsningsionestyrke (se Sambrook et al., 1989, supra). Betingelsene med hensyn til temperatur og ionestyrke bestemmer "strengheten" for hybridiseringen. For preliminær screening med hensyn til homologe nukleinsyrer kan det brukes lite strenge hybridiseringsbetingelser som tilsvarer en Tm på 55 °C, f.eks. 5 x SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % melk og ikke noe formamid; eller 30 % formamid, 5 x SSC, 0,5 % SDS). Middels strenge hybridiseringsbetingelser tilsvarer en høyere Tm, f.eks. 40 % formamid, med 5 x eller 6 x SCC. Svært strenge hybridiseringsbetingelser tilsvarer den høyeste Tm, f.eks. 50 % formamid, 5 x eller 6 x SCC. Hybridisering krever at de to nukleinsyrene inneholder komplementære sekvenser, selv om det, avhengig av hybridiseringsstrengheten, er mulig med feilparinger mellom baser. Den korrekte strenghet for hybridisering av nukleinsyrer avhenger av lengden av nukleinsyrene og graden av komplementering, variable størrel-ser som er godt kjent innen teknikken. Dess større grad av likhet eller homologi mellom to nukleotidsekvenser, dess høyere er Tm-verdien for hybrider av nukleinsyrer som har de sekvensene. Den relative stabilitet (som tilsvarer høyere Tm) av nukleinsyrehybridiseringer avtar i den følgende rekkefølge: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. For hybrider som er mer enn

100 nukleotider lange, er det blitt utledet ligninger for beregning av Tm (se Sambrook et al., 1989, supra, 9,50-0,51). For hybridisering med kortere nukleinsyrer, dvs. oligonukleotider, blir stillingen til feilparinger mer viktig, og lengden av oligonukleotidet bestemmer dets spesifisitet (se Sambrook et al., 1989, supra, 11,7-11,8). Fortrinnsvis er en minimal lengde for en hybridiserbar nukleinsyre minst ca. 10 nukleo-

tider; mer foretrukket minst ca. 15 nukleotider; mest foretrukket er lengden minst ca. 2 0 nukleotider.

"Homolog rekombinasjon" henviser til innføyelsen av en fremmed-DNA-sekvens fra en vektor i et kromosom. Fortrinnsvis sikter vektoren seg inn på et spesifikt kromosomsete for homolog rekombinasjon. For spesifikk homolog rekombinasjon vil vektoren inneholde tilstrekkelig lange områder med homologi til sekvenser i kromosomet til å muliggjøre komplementær binding og inkorporering av vektoren i kromosomet. Lengre områder med homologi og større grader av sekvenslikhet kan øke virkningsfullheten ved homolog rekombinasjon.

En "kodende DNA-sekvens" er en dobbelttrådet DNA-sekvens som transkriberes og translateres til et polypeptid i en celle in vitro eller in vivo når den plasseres under kontroll av korrekte regulerende sekvenser. Grensene til den kodende sekvens bestemmes av et startkodon i 5'-enden (aminoenden) og et translasjonsstoppkodon i 3'-enden (karboksyl-enden). En kodende sekvens kan omfatte, men er ikke begrenset til, prokaryote sekvenser, cDNA fra eukaryot mRNA, genom-DNA-sekvenser fra eukaryot (f.eks. pattedyr-) DNA, og til og med syntetiske DNA-sekvenser. Dersom den kodende sekvens er ment for ekspresjon i en eukaryot celle, vil vanligvis en poly-adenyleringssignal- og transkripsjonstermineringssekvens være lokalisert 3' i forhold til den kodende sekvens.

Isolering av OB- kodende og flankerende sekvenser

Nukleinsyrene omfatter som angitt andre nukleinsyrer som etter ekspresjon koder for peptidene, slik som dem som er angitt i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 2), figur 3 (SEKV.ID. NR.

4), figur 5 (SEKV.ID. NR. 5) og figur 6 (SEKV.ID. NR. 6). Følgelig kan, selv om spesifikk DNA er blitt isolert og sekvensert i forhold til ob-genet, hvilken som helst dyrecelle potensielt tjene som nukleinsyrekilden for den molekylære kloning av et gen som koder for peptidene. DNA-en kan fås ved hjelp av standardfremgangsmåter som er kjent innen teknikken, fra klonet DNA (f.eks. et DNA-"bibliotek"), ved hjelp av

kjemisk syntese, ved hjelp av cDNA-kloning eller ved hjelp av kloningen av genom-DNA, eller fragmenter derav, renset fra den ønskede celle (se f.eks. Sambrook et al., 1989, supra, Glover,

1985, supra). Kloner avledet fra genom-DNA kan inneholde regu-lator- og intron-DNA-områder i tillegg til kodende områder; kloner avledet fra cDNA vil ikke inneholde intronsekvenser. Uansett kilden bør genet være molekylært klonet i en egnet vektor for propagering av genet.

Ved den molekylære kloning av genet fra genom-DNA kan genom-DNA-en amplifiseres ved å bruke primere valgt fra cDNA-sekvensene. Alternativt frembringes DNA-fragmenter hvorav noen vil kode for det ønskede gen. DNA-en kan spaltes i spesifikke seter under anvendelse av forskjellige restriksjonsenzymer. Man kan også bruke DNase i nærvær av mangan for å fragmentere DNA-en, eller DNA-en kan kuttes opp fysisk som f.eks. ved sonikering. De lineære DNA-fragmenter kan så fraskilles etter størrelse ved hjelp av standardteknikker, inkludert, men ikke begrenset til, agarose- og polyakrylamid-gelelektroforese og kolonnekromatografi.

Så snart DNA-fragmentene er frembrakt, kan identifikasjon av det spesifikke DNA-fragment som inneholder det ønskede ob- eller ob-lignende gen, utføres på en rekke måter. Dersom f.eks. en mengde av en del av et ob- eller ob-lignende gen eller dets spesifikke RNA, eller et fragment derav, er tilgjengelige og kan renses og merkes, kan de frembrakte DNA-fragmenter screenes ved hjelp av nukleinsyrehybridisering til en merket probe [Benton et al., Science, 196:180 (1977); Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72:3961 (1975)]. Det angis heri slike nukleinsyreprober som passende kan fremstilles fra de spesifikke sekvensene som her er beskrevet, f.eks. en hybridiserbar probe med en nukleotidsekvens som tilsvarer minst et 10-, og fortrinnsvis et 15-, nukleotidfragment av sekvensene vist i figur 1A-E. (SEKV.ID. NR. 1) eller figur 2A og B (SEKV.ID. NR. 3). Fortrinnsvis velges et fragment som er svært unikt for modulatorpeptidene. De DNA-fragmentene som har vesentlig homologi med proben, vil hybridisere. Dessto større grad av homologi, dess strengere hybridiseringsbetingelser kan, som angitt ovenfor, anvendes. Ved én utførelsesform brukes lite strenge hybridiseringsbetingelser for å identifisere et homologt modulatorpeptid. Ved et foretrukket aspekt, og som vist eksperimentelt her, vil imidlertid en nukleinsyre som koder for et modulatorpeptid, hybridisere til en nukleinsyre med en nukleotidsekvens, slik som vist i figur 1A-E (SEKV.ID. NR. 1) eller figur 2A og B (SEKV.ID. NR. 3), eller et hybridiserbart fragment derav, under middels strenge betingelser; mer foretrukket vil det hybridisere under svært strenge betingelser.

Alternativt kan tilstedeværelsen av genet påvises ved hjelp av analyser basert på de fysikalske, kjemiske eller immunologiske egenskapene til dets uttrykte produkt. For eksempel kan det velges cDNA-kloner eller DNA-kloner som hybrid-selekterer de korrekte mRNA-er, som produserer et protein som f.eks. har lik eller identisk elektroforetisk migrering, iso-elektrisk fokuseringsoppførsel, like eller identiske proteolytiske fordøyelseskart, like eller identiske tyrosinfosfataseaktivitet eller like eller identiske antigene egenskaper som det eller de som er kjent for de foreliggende modulatorpeptider. Antistoffene kan f.eks. passende brukes til å screene med hensyn på homologer til modulatorpeptider fra andre kilder.

Et gen som koder for et modulatorpeptid kan også identifiseres ved hjelp av mRNA-utvelgelse, dvs. ved hjelp av nukleinsyrehybridisering etterfulgt av translasjon in vitro. Ved denne fremgangsmåten brukes fragmenter til å isolere komplementære mRNA-er ved hjelp av hybridisering. Slike DNA-fragmenter kan utgjøre tilgjengelig renset modulator-DNA. Immunologisk utfellingsanalyse eller funksjonelle analyser (f.eks. tyrosinfosfataseaktivitet) av translasjonsproduktene in vitro av produktene av de isolerte mRNA-er identifiserer mRNA-en og derfor de komplementære DNA-fragmenter som inneholder de ønskede sekvenser. I tillegg kan spesifikke mRNA-er velges ved adsorpsjon av polysomer isolert fra celler til immobiliserte antistoffer som er spesifikt rettet mot et modulatorpeptid.

En radioaktivt merket modulatorpeptid-cDNA kan syntetiseres ved å bruke den utvalgte mRNA (fra de adsorberte polysomer) som et templat. Den radioaktivt merkede mRNA kan så brukes som en probe for å identifisere homologe modulatorpeptid-DNA-fragmenter blant andre genom-DNA-fragmenter.

Som nevnt ovenfor, kan en DNA-sekvens som koder for vektmodulatorpeptider som her beskrevet, fremstilles syntetisk snarere enn klonet. DNA-sekvensen kan utformes med de korrekte kodoner for vektmodulatorpeptidaminosyresekvensene. Generelt vil man velge ut foretrukne kodoner for den påtenkte vert dersom sekvensen skal brukes for ekspresjon. Den komplette sekvens settes sammen fra overlappende oligonukleotider fremstilt ved hjelp av standardmetoder og sammensatt i en komplett kodende sekvens. Se f.eks. Edge, Nature, 292:756 (1981); Natnbair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Syntetiske DNA-sekvenser muliggjør lettvint konstruksjon av gener som vil uttrykke vektmodulatoranaloger, som beskrevet ovenfor. Alternativt kan DNA som koder for analoger, lages ved hjelp av seterettet mutagenese av naturlig forekommende OB-gener eller cDNA-er, og analoger kan lages direkte ved å bruke konvensjonell polypeptidsyntese.

En generell fremgangsmåte for setespesifikk inkorporering av unaturlige aminosyrer i proteiner er beskrevet av Noren et al., Science, 244:182-188 (1989). Denne fremgangsmåten kan brukes til å skape analoger av ob-polypeptidet med unaturlige aminosyrer.

Ikke- kodende nukleinsyrer

Det angis heri fremstillingen av

antisensenukleotider og ribozymer som kan brukes til å virke inn på ekspresjonen av vektmodulatorproteinene på transla-sjonsnivået. Denne fremgangsmåten benytter antisensenuklein-syre og ribozymer til å blokkere translasjon av en spesifikk mRNA, enten ved å maskere den mRNA-en med en antisensenuklein-syre eller ved å spalte den med et ribozym.

Antisensenukleinsyrer er DNA- eller RNA-molekyler som er komplementære til minst en del av et spesifikt mRNA-molekyl [se Weintraub, Sei. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289-295 (1988)]. I cellen hybridiserer de til mRNA, hvorved det dannes et dobbelttrådet molekyl. Cellen translaterer ikke en mRNA som er kompleksert i denne dobbelttrådete form. Antisensenukleinsyrer virker derfor inn på ekspresjonen av mRNA til protein. Oligomerer med ca. 15 nukleotider og molekyler som hybr-idiserer til AUG-initierings-kodonet., vil være særlig virkningsfulle, ettersom de er lette å syntetisere og sannsynligvis vil by på færre problemer enn større molekyler når de innføres i vektmodulatorpeptidproduserende celler. Antisensemetoder er blitt brukt til å inhibere ekspresjonen av mange gener in vitro [(Marcus-Sekura, 1988, supra; Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)].

Ribozymer er RNA-molekyler som har evne til spesifikt å spalte andre enkelttrådede RNA-molekyler på en måte som er litt analog med DNA-restriksjonsendonukleaser. Ribozymer ble oppdaget fra den observasjon at visse mRNA-er har evne til å fjerne sine egne introner. Ved å modifisere nukleotidsekvensen til disse RNA-er, har forskere vært i stand til å konstruere molekyler som gjenkjenner spesifikke nukleotidsekvenser i et RNA-molekyl og spalte det [Cech, J. Am. Med. Assoc, 260:3030-3034 (1988)]. Ettersom de er sekvensspesi-fikke, inaktiveres bare mRNArer med bestemte sekvenser.

Forskere har identifisert to typer av ribozymer, Tetrahymena-type og "hammerhode"-type. Tetrahyrnena-typeribozymer gjenkjenner 4 basesekvenser, mens "hammerhode"-type gjenkjenner 11-18 basesekvenser. Dess lenger gjenkjennelses-sekvensen er, dess mer sannsynlig er det at den opptrer utelukkende hos mål-mRNA-arten. Hammerhodetyperibozymer er derfor foretrukket fremfor Tetrahymeria-typeribozymer for inaktivering av en spesifikk mRNA-art, og 18 basegjenkjennelsessekvenser er foretrukket fremfor kortere gjenkjennelsessekvenser.

DNA-sekvensene som er beskrevet her, kan således brukes til å fremstille antisensemolekyler mot, og ribozymer som spalter, mRNA-er for vektmodulatorproteinet og deres ligander, hvorved ekspresjon av ob-genet inhiberes, og dette fører til forøkt vektøkning og fedme.

Ved en annen utførelsesform tilveiebringes korte oligonukleotider som er komplementære til de kodende og komplementære trådene i OB-nukleinsyren, eller til ikke-kodende områder i OB-genet 5', 3' eller internt (intront) til det kodende området. Slike nukleinsyrer kan anvendes som prober, enten som direkte merkede oligonukleotidprober eller som primere for polymerasekjedereaksjonen, for å evaluere tilstedeværelsen av mutasjoner i ob-genet eller ekspresjonsnivået til OB-mRNA. Fortrinnsvis er de ikke-kodende nukleinsyrer fra human-OB-genet.

Ved en bestemt utførelsesform tilveiebringer de ikke-kodende nukleinsyrer homolog rekombinasjon for inte-grasjon av et amplifiserbart gen og/eller andre regulatorsekvenser i nærheten av OB-genet, f.eks. for å sørge for høyere nivåer av ekspresjon av OB-polypeptidet, eller for å overvinne en mutasjon i ob-genregulatorsekvensene som forhindrer korrekte ekspresjonsnivåer for OB-polypeptidet (se internasjonal patentpublikasjon nr. WO 91/06666, publisert 16. mai 1991 av Skoultchi; internasjonal patentpublikasjon nr. WO 91/09955, publisert 11. juli 1991 av Chappel; se også internasjonal patentpublikasjon nr. WO 90/14092, publisert 29. november 1990 av Kucherlapati og Campbell).

Fremstilling av OB- polypeptid: ekspresjon og syntese

Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser er DNA-regulatorsekvenser, slik som promoterer, enhancere, termi-natorer og lignende, som sørger for ekspresjonen av en kodende sekvens i en vertscelle. I eukaryote celler er polyadenyler-ingssignaler kontrollsekvenser.

En kodende sekvens er "under kontroll" av transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser i en celle når RNA-polymerase transkriberer den kodende sekvens til mRNA, som så trans-RNA-spleises og translateres til proteinet som kodes for av den kodende sekvens.

En "signalsekvens" er inkludert ved begynnelsen av den kodende sekvens for et protein som skal utvikles på over-flaten av en celle. Denne sekvensen koder for et signalpeptid, N-terminal til det modne polypeptid, som styrer vertscellen til å translokere polypeptidet. Uttrykket "translokasjons-signalsekvens" brukes også her som henvisning til denne type signalsekvens. Translokasjonssignalsekvenser kan finnes forbundet med mange forskjellige proteiner som er naturlig forekommende hos eukaryoter og prokaryoter, og er ofte funksjonelle i begge typer organismer.

En DNA-sekvens er "operativt bundet" til en ekspresjonskontrollsekvens når ekspresjonskontrollsekvensen kontrol-lerer og regulerer transkripsjonen og translasjonen av DNA-sekvensen. Uttrykket "operativt bundet" omfatter tilstedeværelse av et passende startsignal (f.eks. ATG) foran DNA-sekvensen som skal uttrykkes og opprettholdelse av den korrekte leseramme for å muliggjøre ekspresjon av DNA-sekvensen under kontroll av ekspresjonskontrollsekvensen og produksjon av det ønskede produkt som kodes for av DNA-sekvensen. Dersom et gen som man ønsker å innføre i et rekombinant DNA-molekyl inneholder et passende startsignal, kan et slikt startsignal innføres oppstrøms (5') for og i leseramme med genet.

En "promotersekvens" er et DNA-regulatorområde som er i stand til å binde RNA-polymerase i en celle og initiere transkripsjon av en nedstrøms (3'-retning) kodende sekvens. For de formål å definere det som beskrives heri er promotersekvensen bundet i sin 3<1->ende ved hjelp av transkripsjons-initieringssetet og strekker seg oppstrøms (5'-retning), slik at den omfatter det minimale antall baser eller elementer som er nødvendig for å initiere transkripsjon på nivåer som er påvisbare over bakgrunnsnivået. Innenfor promotersekvensen ville det finnes et transkripsjonsinitieringssete (vanligvis definert f.eks. ved kartlegging med nuklease Sl), samt proteinbindende domener (konsensussekvenser) som er ansvarlige for bindingen av RNA-polymerase.

Et annet trekk er ekspresjonen av DNA-sekvensene som er omfattet her. Slik det er godt kjent innen teknikken, kan DNA-sekvenser uttrykkes ved operativt å binde dem til en ekspresjonskontrollsekvens i en passende ekspresjonsvektor og anvende den ekspresjonsvektoren til å transformere en passende encellet vert.

Slik operativ binding av en DNA-sekvens til en ekspresjonskontrollsekvens omfatter selvsagt tilveiebringelsen av et initieringskodon, ATG, i den korrekte leseramme opp-strøms for DNA-sekvensen dersom kodonet ikke allerede er en del av DNA-sekvensen.

Mange forskjellige kombinasjoner av vert og ekspresjonsvektor kan anvendes ved uttrykking av DNA-sekvensene. Anvendbare ekspresjonsvektorer kan f.eks. bestå av segmenter av kromosom-, ikke-kromosom- og syntetiske DNA-sekvenser. Egnede vektorer omfatter derivater av SV4 0 og kjente bakterieplasmider, f.eks. E. coli-plasmidene col El, pCRl, pBR322, pMB9, pUC, eller pUC-plasmidderivatene, f.eks. pGEX-vektorer, pET-vektorer, pmal-c, pFLAG etc, og deres derivater, plasmider, slik som RP4; fag-DNA-er, f.eks. det store antall derivater av fag , f.eks. NM989, og andre fag-DNA, f.eks. M13 og filamentær, enkelttrådet fag-DNA; gjærp-lasmider, slik som 2 -plasmidet, eller derivatene derav; vektorer som kan anvendes i eukaryote celler, slik som vektorer som kan anvendes i insekt- eller pattedyrceller; vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag-DNA-er, slik som plasmider som er blitt modifisert ved anvendelse av fag-DNA eller andre ekspresjonskontrollsekvenser; og lignende. Ved en foretrukket utførelsesform oppnås ekspresjon av ob i metylotrof gjær, f.eks. Pichia pastoris-gjær (se f.eks. internasjonal patentpublikasjon nr. WO 90/03431, publisert 5. april 1990 av Brierley et al.; internasjonal patentpublikasjon nr. WO 90/10-697, publisert 20. september 1990 av Siegel et al.). Ved en bestemt utførelsesform nedenfor konstrueres en ekspresjonsvektor for ekspresjon av ob under kontroll av " -mating"-fa-ktors ignalsekvensen.

Hvilke som helst av mange forskjellige ekspresjonskontrollsekvenser - sekvenser som regulerer ekspresjonen av en DNA-sekvens operativt bundet til den - kan brukes i disse vektorene til å uttrykke DNA-sekvensene. Slike anvendbare ekspresjonskontrollsekvenser omfatter f.eks. de tidlige eller sene promoterer i SV40, CMV, vaccinia, polyom eller adenovirus, lac-systemet, trp-systemet, TAC-systemet, TRC-systemet, LIR-systemet, hovedoperator- og promoterområdene til fag , kontrollområdene i fd-kappeprotein, promoteren for 3-fosfo-glyseratkinase eller andre glykolytiske enzymer, promoterne for sur fosfatase (f.eks. Pho5), AOX 1-promoteren til metylotrof gjær, promoterne til gjær-" -mating"-faktdrene og andre sekvenser som er kjent for å regulere ekspresjonen av gener i prokaryote eller eukaryote celler eller deres virus, og forskjellige kombinasjoner derav.

Mange forskjellige encellede vertsceller er også anvendbare ved uttrykking av DNA-sekvensene. Disse vertene kan omfatte godt kjente eukaryote og prokaryote verter, slik som stammer av E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; sopper, slik som gjær [ Saccharomyces, og metylotrof gjær, slik som Pichia, Cand- ida, Hansenula og Torulopsis) ; og dyreceller, slik som CHO-, Rl.l-, B-W- og LM-celler, nyreceller fra afrikansk grønnape (f.eks. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 og BMT10), insektceller (f.eks. Sf9) og menneskeceller og plan-teceller i vevskultur.

Det vil forstås at ikke alle vektorer, ekspresjonskontrollsekvenser og verter vil virke like godt til å uttrykke DNA-sekvensene. Heller ikke vil alle verter virke like godt med det samme ekspresjonssystem. Fagfolk innen teknikken vil imidlertid være i stand til å velge de korrekte vektorer, ekspresjonskontrollsekvenser og verter uten unødig eksperi-mentering for å utføre den ønskede ekspresjon uten å avvike fra omfanget av denne oppfinnelsen. Ved utvelgelse av en vektor må f.eks. verten vurderes, ettersom vektoren må virke i den. Vektens kopiantall, evnen til å regulere kopiantallet og ekspresjonen av eventuelle andre proteiner som kodes for av vektoren, slik som antibiotikamarkører, vil også bli vurdert.

Ved utvelgelse av en ekspresjonskontrollsekvens vil mange forskjellige faktorer normalt bli vurdert. Disse omfatter f.eks. den relative styrke til systemet, dets kontroller-barhet og dets forenlighet med den bestemte DNA-sekvens eller gen som skal uttrykkes, særlig når det gjelder potensielle sekundærstrukturer. Egnede encellede verter vil bli valgt ved å vurdere f.eks. deres forenlighet med den valgte vektor, deres sekresjonsegenskaper, deres evne til å folde proteiner korrekt og deres fermentasjonskrav, samt toksisiteten til verten for produktet som kodes for av DNA-sekvensene som skal uttrykkes, og lettheten ved rensing av ekspresjonsproduktene.

Etter vurdering av disse og andre faktorer vil fagfolk innen teknikken være i stand til å konstruere mange forskjellige kombinasjoner av vektor, ekspresjonskontrollsekvens og vert som vil uttrykke DNA-sekvensene etter fermentering eller i storskaladyrekultur.

Ved en bestemt utførelsesform kan det uttrykkes et OB-fusjonsprotein. Et OB-fusjonsprotein omfatter minst en funksjonelt aktiv del av et ikke-OB-protein bundet via en peptidbinding til minst en funksjonelt aktiv del av et OB-polypeptid. Ikke-ob-sekvensene kan være amino- eller karboksy-terminale i forhold til OB-sekvensene. For stabil ekspresjon av et proteolytisk inaktivt OB-fusjonsprotein er det mer foretrukket at delen av ikke-OB-fusjonsproteinet bindes via en peptidbinding til aminoenden av OB-proteinet. Et rekombinant DNA-molekyl som koder for et slikt fusjonsprotein, omfatter en sekvens som koder for minst en funksjonelt aktiv del av et ikke-OB-protein bundet i ramme til den OB-kodende sekvens, og som fortrinnsvis koder for et spaltingssete for en spesifikk protease, f.eks. trombin eller faktor Xa, fortrinnsvis i 0B-ikke-OB-sammenknytningspunktet. Ved en bestemt utførelsesform uttrykkes fusjonsproteinet i Escherichia coli eller i P. pastoris.

Ved en bestemt utførelsesform nedenunder ble det fremstilt vektorer for ekspresjon av murin- og human-ob-genene, med og uten kodonet for gln-49, i bakterieekspresjons-systemer og gjærekspresjonssystemer { Pichia) som fusjonsproteiner, ob-genet fremstilles med et endonukleasespaltingssete, f.eks. under anvendelse av PCR og nye primere. Det er ønskelig å bekrefte sekvenser frembrakt ved hjelp av PCR, ettersom sannsynligheten for å inkludere en punktmutasjon er større med denne teknikken. Et plasmid som inneholder et histidin-tag (His-tag) og et proteolytisk spaltingssete, anvendes. Tilstedeværelsen av histidinet muliggjør selektiv isolering av rekombinante proteiner på en Ni-chelateringskolonne, eller ved hjelp av affinitetsrensing. Det proteolytiske spaltingssete konstrueres, ved en bestemt utførelsesform nedenunder - et trombinspaltingssete, slik at behandling med proteasen, f.eks. trombin, vil frigjøre det modne OB-polypeptid i full lengde (dvs. uten en signalsekvens).

Ved et annet aspekt kan pGEX-vektoren anvendes [Smith et al., Gene, 67:31-40 (1988)]. Denne vektoren fusjonerer glutationin S-transferase-cDNA-en fra Schistosoma japonicum til den aktuelle sekvens. Bakterieproteiner inn-høstes, og rekombinante proteiner kan hurtig renses på en affinitetskolonne med redusert glutation. GST-bæreren kan deretter spaltes fra fusjonsproteinene ved fordøyelse med setespesifikke proteaser. Etter spalting kan bæreren og uspaltet fusjonsprotein fjernes ved absorpsjon på glutation-agarose. Vanskeligheter med systemet oppstår av og til når det utkodede protein er uoppløselig i vandige oppløsninger.

Ekspresjon av rekombinante proteiner i bakterie-systemer kan resultere i ukorrekt folding av det uttrykte protein, noe som krever refolding. Det rekombinante protein kan refoldes før eller etter spalting, slik at dét dannes et funksjonelt aktivt OB-polypeptid. OB-polypeptidet kan refoldes ved hjelp av trinnene (i) inkubering av proteinet i en denatu-reringsbuffer som inneholder et reduksjonsmiddel, og så (ii) inkubering av proteinet i en buffer som inneholder et oksida-sjonsmiddel og fortrinnsvis også inneholder et proteinstabiliserende middel eller et kaotropt middel, eller begge deler. Egnede redokspar (reduserende/oksiderende) omfatter, men er ikke begrenset til, redusert glutation/glutationdisulfid, cystin/cystein, cystamin/cysteamin og 2-merkaptoetanol/2-hydroksyetyldisulfid. Ved et bestemt aspekt kan fusjonsproteinet oppløseliggjøres i et denatureringsmiddel, slik som urea, før bytting i den reduserende buffer. Ved en foretrukket utførelsesform renses proteinet også, f.eks. ved hjelp av ionebytter- eller Ni-chelateringskromatografi, før bytting i den reduserende buffer. Denatureringsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, urea og guanidin-HCl. Det rekombinante protein fortynnes så ca. minst 10 ganger, mer foretrukket ca. 100 ganger, i en oksiderende buffer som inneholder et oksida-sjonsmiddel, slik som, men ikke begrenset til, 0,1 M Tris-Hel, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oksidert glutation. Fusjonsproteinet inkuberes så i ca. 1 til ca. 24 timer, fortrinnsvis ca. 2 til ca. 16 timer, ved romtemperatur i den oksiderende buffer. Den oksiderende buffer kan omfatte et proteinstabiliserende middel, f.eks. et sukker, en alkohol eller ammoniumsulfat. Den oksiderende buffer kan videre omfatte et kaotropt middel ved lav konsentrasjon for å destabi-lisere ukorrekte intermolekylære interaksjoner og således fremme korrekt folding. Egnede kaotrope midler omfatter, men er ikke begrenset til, en detergent., en polyol, L-arginin, guanidin-HCl og polyetylenglykol (PEG). Det er viktig å bruke en tilstrekkelig lav konsentrasjon av det kaotrope middel for å unngå denaturering av proteinet. Det refoldede protein kan konsentreres minst ca. 10 ganger, mer foretrukket med den mengde det ble fortynnet til i oksidasjonsbufferen.

Bakterielle fermenteringsprosesser kan også resultere i et rekombinant proteinpreparat som inneholder uakseptable nivåer av endotoksiner. Det beskrives derfor fjerning av slike endotoksiner, f.eks. ved å anvende endotok-sinspesifikke antistoffer eller andre endotoksinbindende molekyler. Tilstedeværelsen av endotoksiner kan bestemmes ved hjelp av standardteknikker, slik som ved å anvende E-TOXATE-reagenser (Sigma, St. Louis, Mussouri) eller med biologiske analyser.

I tillegg til det spesifikke eksemplet har de foreliggende oppfinnere tenkt på anvendelse av baculovirus-, pattedyr- og gjærekspresjonssystemer for å uttrykke ob-proteinet. I baculovirusekspresjonssystemer kan det f.eks. anvendes både ikke-fusjonsoverføringsvektorer, slik som, men ikke begrenset til, pVL941 (BaniHI-kloningssete; Summers) , pVL1393 ( Banan-, Smal-, Xbal-, EcoRI-, Noti-, Xmalll-, Bglll- og Ps ti-kloningssete; Invitrogen), pVL1392 (Bglll-, Pstl-, Noti-, Xmalll-, EcoRI-, Xbal-, Smal- og BanRI-kloningssete; Summers og Invitrogen) og pBlueBacIII ( BamEI-, Bglll-, Pstl-, Noti- og HindiII-kloningssete, idet blått/hvitt-rekombinantscreening er mulig; Invitrogen), og fusjonsoverføringsvektorer, slik som, men ikke begrenset til, pAc700 (BamHI- og Kpnl-kloningssete, hvor BamHI-gjenkjennelsessetet begynner med initierings-kodonet; Summers), pAc701 og pAc702 (det samme som pAc700, med forskjellige leserammer) , pAc360 ( BantUI-kloningssete 36 basepar nedstrøms for et polyhedrininitieringskodon; Invitrogen

(195)) og pBlueBacHisA, B, C (tre forskjellige leserammer, med BamHI-, Bglll-, Pstl-, Ncol- og HindiII-kloningssete, et N-terminalt peptid for ProBond-rensing, og blått/hvitt-rekombinantscreening av plakker; Invitrogen (220)).

Pattedyrekspresjonsvektorer som det er tenkt på for anvendelse heri, omfatter vektorer med induserbare promoterer, slik som dihydrofolatreduktasepromoteren (DHFR), f.eks. hvilken som helst ekspresjonsvektor med en DHFR-ekspresjonsvektor, eller en DHFR-/metotrexatsamamplifikasjonsvektor, slik som pED (Pstl-, Sali-, Sbal-, Smal- og EcoRI-kloningssete, idet vektoren uttrykker både det klonede gen og DHFR; se Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991); alternativt en glutaminsyntetase-/metioninsulfoksiminsamampli-fikasjonsvektor, slik som pEE14 { HindiII-, Xbal-, Smal-, Sba-I-, EcoRT- og Bell-kloningssete, hvor vektoren uttrykker glutaminsyntase og det klonede gen; Celltech). Ved en annen utførelsesform kan en vektor som styrer episomal ekspresjon under kontroll av Epstein-Barr-virus (EBV) brukes, slik som pREP4 (BamHI-, Sfil-, Xhol-, Noti-, Nhel-, Hindi II-, Nhel-, PvuII- og Kpnl-kloningssete, konstitutiv RSV-LTR-promoter, hygromycinselekterbar markør; Invitrogen), pCEP4 (BamHI-, Sfi-I-, Xhol-, Noti-, Nhel-, HindiII-, Nhel-, PvuII- og Kpnl-kloningssete, konstitutivt hCMV-"immediate early"-gen, hygromycinselekterbar markør; Invitrogen), pMEP4 ( Kpnl-, Pvul-, Nhel-, Hindlll-, Noti-, Xhol-, Sfil-, BamHI-kloningssete, induserbar metallotionein Ila-genpromoter, hygromycinselekterbar markør; Invitrogen), pREP8 ( BamHI-, Xhol-, Noti-, HindIII-, Nhel- og Kpnl-kloningssete, RSV-LTR-promoter, histi-dinolselekterbar markør; Invitrogen), pREP9 ( Kpnl-, Nhel-, Hindlll-, Noti-, Xhol-, Sfil- og BamHI-kloningssete, RSV-LTR-promoter, G418-selekterbar markør; Invitrogen) og pEBVHis (RSV-LTR-promoter, hygromycinselekterbar markør, N-terminalt peptid rensbart via ProBond-harpiks og spaltet ved hjelp av enterokinase; Invitrogen). Selekterbare pattedyrekspresjonsvektorer for anvendelse heri omfatter pRc/CMV (Hindlll-, BstXI-, Noti-, Sbal- og Apal-kloningssete, G418-seleksjon; Invitrogen), pRc/RSV (Hindlll-, Spel-, BstXI-, Noti-, Xbal-kloningssete, G418-seleksjon; Invitrogen) og andre. Vacciniaviruspattedyrekspresjonsvektorer (se Kaufman, 1991, supra) for anvendelse heri omfatter, men er ikke begrenset til, pSCll (Smal-kloningssete, TK- og -gal-seleksjon), pMJ601 (Sali-, Smal-, Afll-, Narl-, Bsp-MII-, BamHI-, Apal-, Nhel-, SacII-, Kpnl- og Hindlll-kloningssete; TK- og -gal-seleksjon) og pTKgptFIS (EcoRI-, Pstl-, Sali-, AccI-, Hindll-, Sbal-, BamHI- og Hpa-kloningssete, TK- eller XPRT-seleksjon).

Gjærekspresjonssystemer kan også brukes til å uttrykke OB-polypeptid. For eksempel kan ikke-fusjons-pYES2-vektoren (Xbal-, SphI-, Shol-, Noti-, Gst- XI-, EcoRI-, BstXI-, BamHI-, SacI-, Kpnl- og Hindlll-kloningssete; Invitrogen) eller fusjonsvektoren pYESHisA, B, C ( Xbal-, SphI-, Shol-, Noti-, BstXI-, EcoRI-, BamHI-, SacI-, Kpnl- og ffindlll-kloningsseté, N-terminalt peptid renset med ProBond-harpiks og spaltet med enterokinase; Invitrogen), bare for å nevne to, anvendes.

Det er videre ment at kroppsvektmodulatorpeptid-analoger kan fremstilles fra nukleotidsekvenser avledet innenfor omfanget av det som er beskrevet heri.

I tillegg til rekombinant ekspresjon av OB-polypeptid beskrives heri og muliggjøres fullt ut fremstilling av OB-polypeptid eller fragmenter derav under anvendelse av de velkjente og høyt utviklede teknikker med fast-f - asepeptidsyntese. Anvendelse av både de populære Boe og Fmoc, så vel som andre beskyttelsesgruppestrategier, for fremstilling av ob-polypeptid eller fragmenter derav beskrives. Forskjellige teknikker for refolding og oksidasjon av cysteinsidekjedene slik at det dannes en disulfidbinding, er også velkjent innen teknikken.

Antistoffer mot OB- polypeptidet

OB-polypeptid som er fremstilt rekombinant eller ved hjelp av kjemisk syntese, og fragmenter eller andre derivater eller analoger derav, inkludert fusjonsproteiner, kan brukes som et immunogen for å frembringe antistoffer som gjenkjenner OB-polypeptidet. Slike antistoffer omfatter, men er ikke begrenset til, polyklonale, monoklonale, kimære, enkelt-kjedete, Fab-fragmenter og et Fab-ekspresjonsbibliotek.

Et molekyl er "antigent" når det er i stand til spesifikt å reagere med et antigengjenkjennelsesmolekyl i immunsystemet, slik som et immunglobulin (antistoff) eller en T-celleantigenreseptor. Et antigent polypeptid inneholder minst ca. 5 og fortrinnsvis minst ca. 10 aminosyrer. En antigen del av et molekyl kan være den delen som er immunologisk dominant for antistoff eller T-cellereseptorgjenkjennelse, eller den kan være en del som brukes til å frembringe et antistoff mot molekylet ved konjugering av den antigene del til et bærermolekyl for immunisering. Et molekyl som er antigent, behøver ikke i seg selv å være immunogent, dvs. i stand til å utløse en immunrespons uten en bærer.

Et "antistoff" er ethvert immunglobulin, inkludert antistoffer og fragmenter derav, som binder en spesifikk epitop. Uttrykket omfatter polyklonale, monoklonale og kimære antistoffer, idet de sistnevnte er beskrevet nærmere i US patentskrifter nr. 4 816 397 og 4 816 567, samt antigen-bindende deler av antistoffer, inkludert Fab, F(ab')2 og F (v)

(inkludert enkeltkjedeantistoffer). Uttrykket "antistoffmole-kyl" omfatter følgelig i sine forskjellige grammatikalske former som her er brukt, både et intakt immunglobulinmolekyl og en immunologisk aktiv del av et immunglobulinmolekyl som inneholder det antistoffkombinerende setet. Et "antistoffkombinerende sete" er den strukturelle delen av et antistoff-molekyl som består av tung- og lettkjedevariable og -hyper-variable områder som spesifikt binder antigen.

Eksempelvise antistoffmolekyler er intakte immun-globulinmolekyler, i det vesentlige intakte immunglobulinmole-kyler og de delene av et immunglobulinmolekyl som inneholder paratopen, inkludert de delene som er kjent innen teknikken som Fab, Fab', F(ab')2 og F (v), som er deler som er foretrukket for bruk ved de terapeutiske metodene som her er beskrevet .

Fab- og F (ab') 2-deler av antistoffmolekyler fremstilles ved hjelp av den proteolytiske reaksjon til henholdsvis papain og pepsin på det i det vesentlige intakte antistoff-molekyl eller ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjent. Se f.eks. US patentskrift nr.' 4 342 566, Theofilopolous et al. Fab<1->antistoffmolekyldeler er også velkjent og fremstilles fra F (ab 1) 2-deler, etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som binder de to tungkjededelene sammen, som med merkaptoetanol, og etterfulgt av alkylering av det resulterende proteinmerkaptan med et slikt reagens som. jodacetamid. Et antistoff som inneholder intakte antistoffmolekyler er her foretrukket.

Uttrykket "monoklonalt antistoff" i sine forskjellige grammatikalske former henviser til et antistoff som har bare én type antistoffkombinerende sete som er i stand til å reagere immunologisk med et bestemt antigen. Et monoklonalt antistoff utviser således vanligvis en eneste bindingsaffinitet for et eventuelt antigen som det reagerer immunologisk med. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et anti-stoffmolekyl med flere antistoffkombinerende seter, som hvert er immunologisk spesifikt for et forskjellig antigen; f.eks. et bispesifikt (kimært) monoklonalt antistoff.

Uttrykket "adjuvans" henviser til. en forbindelse eller en blanding som øker immunresponsen til et antigen. Et adjuvans kan tjene som et vevsdepot som sakte frigjør anti-genet, og også som en lymfoidsystemaktivator som ikke-spesifikt øker immunresponsen [Hood et al., i Immunology, s. 384, 2. utg., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Ofte vil en primærutfordring med et antigen alene i fravær av et adjuvans ikke utløse en humoral eller cellulær immunrespons. Adjuvanser omfatter, men er ikke begrenset til, komplett Freunds adjuvans, ukomplett Freunds adjuvans, sapo-nin, mineralgeler, slik som aluminiumhydroksid, overflateaktive stoffer, slik som lysolecitin, pluronsyrepolyoler, polyanioner, peptider, olje- eller hydrokarbonemulsjoner, nøkkelhullalbuskjellhemocyaniner, dinitrofenol og potensielt anvendbare humanadjuvanser, slik som BCG ( bacille Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum. Fortrinnsvis er adjuvanset farmasøytisk akseptabelt.

Forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, kan anvendes for fremstillingen av polyklonale antistoffer mot OB-polypeptidet eller fragment, derivat eller analog derav. For fremstilling av antistoff kan forskjellige vertsdyr immuniseres ved injeksjon med OB-polypeptidet eller et derivat (f.eks. fragment eller fusjonsprotein) derav, inkludert, men ikke begrenset til, kaniner, mus, rotter, sauer, geiter etc. Ved én utførelsesform kan OB-polypeptidet eller fragmentet derav konjugeres til en immunogen bærer, f.eks. bovint serumalbumin (BSA) eller nøkkelhullalbuskjell-hemocyanin (KLH). Forskjellige adjuvanser kan brukes for å øke den immunologiske respons, avhengig av vertsarten, inkludert, men ikke begrenset til, Freunds (komplette eller ukomplette), mineralgeler, slik aluminiumhydroksid, overflateaktive stoffer, slik som lysolecitin, pluronsyrepolyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, nøkkelhullalbuskjellhemocyaniner, dinitrofenol og potensielt anvendbare humanadjuvanser, slik som BCG ( bacille Calmette- Guerin) og Corynebacterium parvum.

For fremstilling av monoklonale antistoffer rettet mot OB-polypeptidet eller fragment, analog eller derivat derav, kan det anvendes hvilken som helst teknikk som sørger for fremstillingen av antistoffmolekyler ved hjelp av kontinuerlige cellelinjer i kultur. Disse omfatter, men ér ikke begrenset til, hybridomteknikken opprinnelige utviklet av Kdhler et al., Nature, 256:495-497 (1975), samt triomteknikken, human-B-cellehybridomteknikken [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72

(1983)] og EBV-hybridomteknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer [Cole et al. i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, s. 77-96, Alan R. Liss, Inc. (1985)]. Udødelige, antistoffproduserende cellelinjer kan skapes ved hjelp av andre teknikker enn fusjon, slik som direkte transformasjon av B-lymfocytter- med onkogen DNA, eller transfeksjon med Epstein-Barr-virus. Se f.eks. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" ( | 989); se også US patentskrifter nr. 4 341 761, 4 399 121, 4 427 783, 4 444 887, 4 451 570, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632 og 4 493 890. Ved en ytterligere utførelsesform kan monoklonale antistoffer fremstilles hos smittestoffrie dyr ved å benytte ny teknologi (PCT/US90/02545). Humanantistoffer brukes og kan fås ved å bruke humanhybridomer [Cote et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:2026-2030 (1983)], eller ved å transformere human-B-celler med EBV-virus in vitro (Cole et al., 1985, supra). Teknikker utviklet for fremstillingen av "kimære antistoffer" [Morrison et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)] ved spleising av genene fra et museantistoffmolekyl som er spesifikt for et ob-polypeptid, sammen med gener fra et humanantistoffmolekyl med passende biologisk aktivitet, kan faktisk brukes; slike antistoffer er innenfor omfanget av heri. Slike human- eller humaniserte kimære antistoffer er foretrukket for anvendelse ved behandling av humansykdommer eller forstyrrelser (beskrevet nedenunder) , ettersom det er mye mindre sannsynlig at humananti-stoffene eller de humaniserte antistoffer induserer en immunrespons, særlig en allergisk respons, selv enn xenogene antistoffer. Teknikker beskrevet for fremstillingen av enkeltkjedeantistoffer (US patentskrift nr. 4 946 778) kan tilpasses for å fremstille OB-polypeptidspesifikke enkeltkjedeantistoffer. Ved en ytterligere utførelsesform benyttes teknikkene som er beskrevet for konstruksjonen av Fab-ekspresjonsbiblioteker [Huse et al., Science, 246:1275-1281

(1989)] for å muliggjøre hurtig og lettvint identifikasjon av monoklonale Fab-fragmenter med den ønskede spesifisitet for et ob-polypeptid, eller dets derivater eller analoger.

Antistoffragmenter som inneholder idiotypen til antistoffmolekylet, kan frembringes ved hjelp av kjente teknikker. For eksempel omfatter slike fragmenter, men er ikke begrenset til: F (ab1)2-fragmentet som kan fremstilles ved hjelp av pepsinfordøyelse av antistoffmolekylet; Fab'-fragmentene som kan frembringes ved å redusere disulfidbindingene til F (ab1)2-fragmentet og Fab-fragmentene som kan frembringes ved å behandle antistoffmolekylet med papain og et reduksjonsmiddel .

Ved fremstillingen av antistoffer kan screening med hensyn til det ønskede antistoff utføres ved hjelp av teknikker som er kjent innen fagområdet, f.eks. radioimmunologisk analyse, ELISA (enzymbundet immunsorbentanalyse), "sandwich"-immunologiske analyser, immunologiske radiometriske analyser, geldiffusjonsutfellingsreaksjoner, immunologiske diffusjons-analyser, immunologiske analyser in situ (ved å anvende f.eks. kolloidalt gull, enzymer eller radioisotoper som markører), "Western blots", utfellingsreaksjoner, agglutineringsanalyser (f.eks. gelagglutineringsanalyser, hemagglutineringsanalyser), komplementfikseringsanalyser, immunologiske fluorescens-analyser, protein A-analyser og immunologiske elektroforese-analyser etc. Ved én utførelsesform påvises antistoffbinding ved å påvise en markør på primærantistoffet. Ved en annen ut-førelsesform påvises primærantistoffet ved å påvise binding av et sekundærantistoff eller et reagens til primærantistoffet. Ved ytterligere en utførelsesform merkes sekundærantistoffet. Mange midler er kjent innen teknikken for å påvise binding ved en immunologisk analyse og er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan man, for å velge ut antistoffer som gjenkjenner en spesifikk epitop i et OB-polypeptid, analysere frembrakte hybridomer med hensyn til et produkt som bindes til et OB-polypeptidfragment som inneholder en slik epitop. For utvelgelse av et antistoff som er spesifikt for et OB-polypeptid fra en bestemt dyreart, kan man velge ut på grunnlag av positiv binding med OB-polypeptid uttrykt ved hjelp av eller isolert fra celler fra den dyrearten.

De ovenfor nevnte antistoffer kan brukes ved fremgangsmåter som er kjent innen teknikken vedrørende lokaliseringen og aktiviteten til OB-polypeptidet, f.eks. for "Western blotting", bildedannelse av OB-polypeptid in situ, målings-nivåer derav i passende fysiologiske prøver etc.

Ved én bestemt utførelsesform kan det frembringes antistoffer som agoniserer eller antagoniserer aktiviteten til OB-polypeptid. Slike antistoffer kan testes ved å bruke analysene som er beskrevet nedenunder for å identifisere ligander.

Ved én bestemt utførelsesform fremkalles antistoffer ved å immunisere kaniner med syntetiske peptider som er forutsagt ved hjelp av proteinsekvensen, eller med rekombinante proteiner laget ved å bruke bakterielle ekspresjonsvektorer. Valget av syntetiske peptider gjøres etter nøye analyse av den forutsagte proteinstruktur, som beskrevet ovenfor. Særlig velges det peptidsekvenser mellom putative spaltingsseter. Syntetiske peptider konjugeres til en bærer, slik som KLH-hemocyanin eller BSA under anvendelse av karbodiimid, og brukes i Freunds adjuvans for å immunisere kaniner. For å fremstille rekombinant protein kan pGEX-vektoren brukes til å uttrykke polypeptidet (Smith et al., 1988, supra). Alternativt kan man bruke bare hydrofile domener til å frembringe fusjonsproteinet. Det uttrykte protein vil bli fremstilt i stor mengde og brukes til å immunisere kaniner i Freunds adjuvans.

Ved en annen spesifikk utførelsesform brukes rekombinant OB-polypeptid til å immunisere kyllinger, og kyllingan-ti-OB-antistoffene utvinnes fra eggeplomme, f.eks. ved affinitetsrensing på en OB-kolonne. Fortrinnsvis holdes kyllinger brukt ved immunisering under spesifikke patogenfrie (SPF) betingelser .

Ved en annen utførelsesform frembringes antistoffer mot leptin hos ob/ob-mus som mangler OB-protein i omløp og således forventes å være i stand til å frembringe en anti-OB-polypeptidrespons, ettersom de ikke vil bli tolerert for polypeptidet og villtypemus. Miltceller fra begge grupper av mus kan fusjoneres med myelomceller for å fremstille hybridomer for monoklonale antistoffer.

Ved nok en annen utførelsesform brukes rekombinant OB-polypeptid til å immunisere kaniner, og de polyklonale antistoffene immunrenses før videre bruk. De rensede antistoffer er særlig anvendbare for halvkvantitative analyser, særlig for påvisning av tilstedeværelsen av OB-polypeptid i omløp i serum eller plasma.

Paneler med monoklonale antistoffer fremstilt mot modulatorpeptider kan screenes med hensyn til forskjellige egenskaper; dvs. isotype, epitop, affinitet etc. Av særlig interesse er monoklonale antistoffer som nøytraliserer aktiviteten til modulatorpeptidene. Slike monoklonale antistoffer kan lett identifiseres i aktivitetsanalyser med hensyn til vektmodulatorene. Høyaffinitetsantistoffer er også anvendbare når immunologisk affinitetsrensing av naturlig forekommende eller rekombinant modulator er mulig.

Fortrinnsvis er antimodulatorantistoffet som brukes ved de diagnostiske og terapeutiske fremgangsmåtene, et affinitetsrenset polyklonalt antistoff. Mest foretrukket er antistoffet et monoklonalt antistoff (mAb). I tillegg er det foretrukket at antimodulatorantistoffmolekylene som her anvendes, er i form av Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller F(v)-deler av hele antistoffmolekyler.

Diagnostiske implikasjoner

Det beskrives også mange forskjellige diagnostiske applikasjoner, inkludert fremgangsmåter for påvisning av tilstedeværelsen av betingelser og/eller stimuli som virker inn på unormaliteter i kroppsvekt eller fedme, med henvisning til deres evne til å utløse aktivitetene som formidles av de foreliggende vektmodulatorer. Som tidligere nevnt, kan vektmodulatorpeptider brukes til å fremstille antistoffer mot seg selv ved hjelp av mange forskjellige kjente teknikker, og slike antistoffer kan så isoleres og benyttes som i tester med hensyn til tilstedeværelsen av bestemt transkripsjonen aktivitet i mistenkte målceller. Alternativt kan nukleinsyrene anvendes ved diagnose.

Antistoffbaserte diagnostika

Som tidligere foreslått, omfatter en diagnostisk fremgangsmåte som kan anvendes heri, undersøkelse av en celleprøve eller et medium ved hjelp av en analyse som omfatter en effektiv mengde av en antagonist mot et modulatorprotein, slik som et antimodulatorantistoff, fortrinnsvis et affinitetsrenset, polyklonalt antistoff, og mest foretrukket et mAb. I tillegg er det foretrukket at anti-modulatorantistof f molekylene som her brukes, er i form av Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller F(v)-deler eller hele antistoffmolekyler. Som tidligere omtalt, omfatter pasienter som er i stand til å dra fordel av denne fremgangsmåten, dem som lider av kreft, AIDS, fedme eller andre tilstander hvor unormal kroppsvekt er et kjennetegn eller en faktor. Fremgangsmåter for isolering av modulatoren og indusering av antimodulatorantistoffer, og for bestemmelse og optimalisering av evnen til antimodulatorantistoffer når det gjelder å hjelpe til ved undersøkelsen av målcellene, er alle velkjent innen teknikken.

Dessuten kan antistoffer som omfatter både polyklonale og monoklonale antistoffer, og legemidler som modulerer fremstillingen av eller aktiviteten til vektkontroll-modulatorene og andre gjenkjennelsesfaktorer og/eller deres underenheter, ha visse diagnostiske anvendelser, og kan f.eks. benyttes for det formål å påvise og/eller måle tilstander hvor unormaliteter i kroppsvekt utvikles eller sannsynligvis vil utvikles. For eksempel kan modulatorpeptidene eller deres aktive fragmenter brukes til å fremstille både polyklonale og monoklonale antistoffer mot seg selv i mange forskjellige cellemedier ved hjelp av kjente teknikker, slik som hybridomteknikken hvor f.eks. fusjonerte musemiltlymfocytter og myelomceller benyttes. Disse teknikkene er nærmere beskrevet nedenunder. Likeledes kan småmolekyler som etterligner eller antagoniserer aktiviteten(e) til reseptorgjenkjennelses-faktorene oppdages eller syntetiseres, og de kan brukes i diagnostiske og/eller terapeutiske fremgangsmåter.

Tilstedeværelsen av vektmodulatorer i celler kan bekreftes ved hjelp av de vanlige immunologiske, fremgangsmåter som er anvendbare for slike bestemmelser. En rekke anvendbare fremgangsmåter er kjent. Ved tre slike fremgangsmåter som er spesielt anvendbare, benyttes enten reseptorgjenkjennelses-faktoren merket med en påvisbar markør, antistoff Abx merket med en påvisbar markør eller antistoff Ab2 merket med en påvisbar markør. Fremgangsmåtene kan oppsummeres ved hjelp av de følgende ligninger, hvor stjernen angir at partikkelen er merket og "WM" står for vektmodulatoren:

A. WM + Abx = WM<*>Abx

B. WM + Ab<*>x = WMAbx<*>

C. WM + Abt + Ab2<*><=> Ab1WMAb2<*>

Fremgangsmåtene og deres anvendelse er alle godt kjent for fagfolk innen teknikken og kan følgelig' benyttes heri. Den "kompetitive" fremgangsmåte, fremgangsmåte A, er beskrevet i US patentskrifter nr. 3 654 090 og 3 850 752. Fremgangsmåte B er representativ for velkjente kompetitive analyseteknikker. Fremgangsmåte C, "sandwich"-fremgangsmåten, er beskrevet i US patentskrifter nr. RE 31 006 og 4 016 043. Ytterligere andre fremgangsmåter er kjent, slik som "dobbeltantistoff"- eller "DASP"-fremgangsmåten.

I hvert tilfelle danner vektmodulatorene komplekser med ett eller flere antistoffer, eller bindingspartnere, og ett medlem av komplekset merkes med en påvisbar markør. Det faktum at et kompleks er blitt dannet og, om ønsket, mengden derav, kan bestemmes ved hjelp av kjente fremgangsmåter som kan anvendes til påvisningen av markører.

Det vil ses fra det ovenfor nevnte at en karakteristisk egenskap ved Ab2 er at det vil reagere med Abx. Dette skyldes at Ablf frembrakt i én pattedyrart, er blitt brukt i en annen art som et antigen til å frembringe antistoffet Ab2. For eksempel kan Ab2 frembringes i geiter under anvendelse av kaninantistoffer som antigener. Ab2 vil derfor bli antikanin-antistoffrembrakt i geiter. For denne beskrivelses og disse kravs formål vil Ab1 bli henvist til som et primært eller antivektmodulatorantistoff, og Ab2 vil bli henvist til som et sekundært eller ant i-Ab^ antistof f .

De markørene som mest vanlig anvendes for disse undersøkelsene, er radioaktive grunnstoffer, enzymer, kjemikalier som fluorescerer når de eksponeres for ultrafiolett lys og andre.

Et antall fluorescerende materialer er kjent og kan benyttes som markører. Disse omfatter f.eks. fluorescein, rhodamin og auramin. Et spesielt påvisningsmateriale er anti-kaninantistoff fremstilt i geiter og konjugert med fluorescein gjennom et isotiocyanat.

Vektmodulatorene eller deres bindingspartnere kan også merkes med et radioaktivt grunnstoff eller med et enzym. Den radioaktive markør kan påvises ved hjelp av hvilken som helst av de for tiden tilgjengelige tellingsfremgangsmåter. Den foretrukne isotop kan velges blant <3>H, 14C, 32P, 3<5>S, <36>C<l>, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 131I og 186Re.

Enzymmarkører er likeledes anvendbare og kan påvises ved hjelp av hvilken som helst av de tidligere benyttede kolorimetriske, spektrofotometriske, fluorspektrofotometriske, amperometriske eller gasometriske teknikker. Enzymet konjugeres til den utvalgte partikkel ved omsetning med brodannende molekyler, slik som karbodiimider, diisocyanater, glutar-aldehyd og lignende. Mange.enzymer som kan brukes ved disse fremgangsmåtene, er kjent og kan benyttes. De foretrukne er peroksidase, -glukuronidase, -D-glukosidase, -D-galakto-sidase, urease, glukoseoksidase, plussperoksidase og alkalisk fosfatase. Det henvises til US patentskrifter nr. 3 654 090, 3 850 752 og 4 016 043 som eksempler på beskrivelse av alternative merkingsmaterialer og -metoder.

Ved en ytterligere utførelsesform kan prøvesett egnet for anvendelse av en medisinsk spesialist fremstilles for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av forutbestemt transkripsjonsaktivitet eller forutbestemt transkripsjonsaktivitetsevne hos mistenkte målceller. I overensstemmelse med prøveteknikkene som er omtalt ovenfor, vil én type slike sett inneholde minst den merkede vektmodulator

eller dens bindingspartner, f.eks. et antistoff som er spesifikt for den, og selvsagt retningslinjer, avhengig av den valg-

te metode, f.eks. "kompetitiv", "sandwich", "DASP" og lignende. Settene kan også inneholde slike perifere reagenser som buffere, stabiliseringsmidler etc.

Følgelig kan det fremstilles et prøvesett for påvisning av tilstedeværelse eller evne hos celler til forutbestemt transkripsjonsaktivitet, kjennetegnet ved at det omfatter: (a) en forutbestemt mengde av minst én merket immunkjemisk reaktiv komponent erholdt ved hjelp av direkte eller indirekte festing av den foreliggende vektmodulator, eller en spesifikk bindingspartner til den, til en påvisbar markør,

(b) andre reagenser og

(c) retningslinjer for bruk av settet.

Nærmere bestemt kan det diagnostiske prøvesett omfatte : (a) en kjent mengde av vektmodulatoren, som beskrevet ovenfor (eller en bindingspartner), vanligvis bundet til en fast fase for dannelse av en immunsorbent, eller alternativt bundet til en egnet markør, eller flere slike slutt-produkter etc. (eller deres bindingspartnere), en av hver, (b) om nødvendig andre reagenser og (c) retningslinjer for bruk av prøvesettet.

Ved en ytterligere variasjon kan prøvesettet fremstilles og brukes for de formål som er angitt ovenfor, hvor det anvendes i henhold til en forutbestemt fremgangsmåte (f.eks. "kompetitiv", "sandwich", "dobbelt antistoff" etc.) og omfatter: (a) en merket komponent som er blitt erholdt ved sammenkobling av vektmodulatoren og en påvisbar markør, (b) ett eller flere ytterligere immunkjemiske reagenser hvorav minst ett reagens er en ligand eller en immobilisert ligand, hvor liganden er valgt fra gruppen bestående av: (i) en ligand som kan bindes til den merkede komponent (a), (ii) en ligand som kan bindes til en bindingspartner for den merkede komponent (a), (iii) en ligand som kan bindes til minst én av komponentene som skal bestemmes og (iv) en ligand som kan bindes til minst én av bindingspartnerne til minst én av komponentene som skal

■ bestemmes, og

(c) retningslinjer for utførelsen av en fremgangsmåte for påvisning og/eller bestemmelse av én eller flere komponenter i en immunkjemisk reaksjon mellom vektmodulatoren og en bestemt bindingspartner for den.

Nukleinsyrebaserte diagnostika

Som vist i eksemplene nedenunder, kan nukleinsyrer brukes til å påvise feil forbundet med feil i OB-polypeptidet som fås hos tykke fenotyper. For eksempel kan nukleinsyreprober (f.eks. ved Northern-analyse eller RT-PCR-analyse) anvendes til å bestemme hvorvidt en tykk fenotype er forbundet med mangel på ekspresjon av OB-mRNA eller ekspresjon av ikke-funksjonell OB-mRNA, f.eks. som hos db/db-mus (hvor mangelen skriver seg fra mangel på en OB-reseptor), eller hvor en mutasjon gir en ikke-transkribert mRNA. Dessuten kan de nukleinsyrebaserte diagnostiske teknikkene brukes sammen med antistoffbaserte teknikker for ytterligere å utvikle en molekylær forståelse av tykke eller anoreksiske fenotyper.

Human-cDNA-klonene som nylig er blitt isolert, er blitt sekvensert slik som her vist. Dette letter bestemmelsen av den komplette sekvens til humangenet (se figur 2 0A-C, SEKV.ID. NR. 22). DNA-sekvenser fra intronene til human-OB-genet er blitt erholdt (figur 20), og disse er blitt brukt til å fremstille PCR-primere for å PCR-amplifisere den kodende sekvens i OB-genet fra humangenom-DNA, for igjen å identifisere mutasjoner eller allelvarianter av OB-genet, alt i overensstemmelse med fremgangsmåter som her tidligere er beskrevet nærmere. Spesifikke PCR-primere for amplifisering av humangenom-OB er beskrevet i et bestemt eksempel nedenunder.

Den nåværende hypotese er at heterozygote mutasjoner i ob-genet vil være forbundet med mild/middels fedme, mens homozygote mutasjoner vil være forbundet med flere DNA-sekvensbaserte diagnostiske tester for fedme. Dersom dette er tilfellet, vil det muliggjøre fastleggelsen av folk med risiko for utvikling av fedme, og kan muliggjøre anvendelsen av lege-middelbehandling og/eller livsstilsendringer før en økt kroppsvekt er fullt utviklet.

Alternativt kan tilstedeværelsen av mikrosatellitter som segregerer med mutantformer av human-OB, brukes for diagnose. Forskjellige PCR-primere, inkludert dem som er basert på nukleotidsekvensen som er angitt i figur 20A-C, kan brukes i dette henseende.

OB-genet kan også være nyttig diagnostisk for målinger av dets utkodede RNA og protein ved næringsmessige forstyrrelser. Det vil være av betydning å vite, særlig ved en bestemt næringsmessig forstyrrelse, hvorvidt OB-RNA og/eller dets utkodede protein er uregulert eller nedregulert. Dersom en. tykk person har forøkte nivåer av OB, vil det således synes som om problemet er nedstrøms for OB, mens dersom OB er redusert, vil det synes som om upassende lave nivåer av OB kan være årsak til fedme (uansett om defekten er i OB-genet). Omvendt kan det, dersom en kreft- eller AIDS-pasient som tapte vekt hadde forhøyede nivåer av OB, konkluderes med at upassende høy ekspresjon av OB er ansvarlig for vekttapet.

Den klonede human-cDNA vil kunne anvendes til målingen av nivåene av human-OB-RNA. I tillegg vil rekombinant humanprotein bli fremstilt og brukes for å utvikle immun-analyser for å muliggjøre måling av fett- og muligens plasmanivåene av OB-proteinet.

Terapeutiske implikasjoner

Polypeptidene, nukleinsyrene og antistoffene har betydelig terapeutisk potensial. Fortrinnsvis administreres en terapeutisk effektiv mengde av et slikt middel i en farma-søytisk akseptabel bærer, fortynner eller eksipiens.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabel" henviser til molekylære enheter og preparater som er fysiologisk tolerer-bare, og som vanligvis ikke gir en allergisk eller lignende uheldig reaksjon, slik som magebesvær, svimmelhet og lignende, når de administreres til et menneske. Fortrinnsvis betyr, slik det her er brukt, uttrykket "farmasøytisk akseptabelt" god-kjent av en godkjennelsesmyndighet eller angitt i U.S. Pharma-copeia eller andre generelt anerkjente farmakopeer for bruk hos dyr, og nærmere bestemt hos mennesker. Uttrykket "bærer" henviser til en fortynner, et adjuvans, en eksipiens eller et vehikkel som forbindelsen administreres sammen med. Slike farmasøytiske bærere kan være sterile væsker, slik som vann eller oljer, inkludert dem av jordolje-, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, slik som peanøttolje, soyabønne-olje, mineralolje, sesamolje og lignende. Vann eller salt-oppløsninger og vandige dekstrose- og glyseroloppløsninger anvendes fortrinnsvis som bærere, særlig for injiserbare opp-løsninger. Egnede farmasøytiske bærere er beskrevet av Martin, Remington'3 Pharmaceutical Sciences, 18. utg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" brukes her i betydning en mengde som er tilstrekkelig til å redusere med minst ca. 15 %, fortrinnsvis med minst 50 %, mer foretrukket med minst 90 %, og mest foretrukket forhindre, en klinisk signifikant mangel på aktivitet, funksjon og respons hos verten. Alternativt er en terapeutisk effektiv mengde tilstrekkelig til å forårsake en forbedring i en klinisk signifikant tilstand hos verten.

Administrering av rekombinant OB-polypeptid resulterer i vekttap, særlig en reduksjon i fettvev. OB-polypeptid kan fremstilles ved å bruke standard bakterie- og/eller pattedyrekspresjonsvektorer, syntetisk eller renset fra plasma eller serum, alt som her tidligere nærmere angitt. Alternativt kan forøkt ekspresjon av naturlig forekommende OB-polypeptid induseres ved hjelp av homologe rekombinasjonsteknikker, som beskrevet ovenfor.

Reduksjon av OB-polypeptidaktivitet (ved utvikling av antagonister, inhibitorer, anvendelse av nøytraliserende antistoffer eller antisensemolekyler) bør resultere i vek-tøkning, slik det vil kunne være ønskelig for behandlingen av vekttapet forbundet med kreft, AIDS eller anorexia nervosa. Modulering av OB-aktivitet kan være nyttig for å redusere kroppsvekt (ved å øke aktiviteten) eller øke kroppsvekt (ved å redusere aktivitet).

Polypeptidbasert terapeutisk behandling

I den enkleste analysen bestemmer OB-genet kroppsvekt hos pattedyr, særlig mus og mennesker. OB-genproduktet og tilsvarende kognatraolekyler synes å være en del av et signali-seringsspor hvorved fettvev kommuniserer med hjernen og de øvrige organer. Det antas at OB-polypeptidet selv er et signaliseringsmolekyl, dvs. et hormon.

Ob-polypeptidet eller et funksjonelt aktivt fragment derav, eller en antagonist derav, kan administreres oralt eller parenteralt-, fortrinnsvis parenteralt. Ettersom metabolsk homøostase er en kontinuerlig prosess, er det foretrukket med administrering for regulert frigjørelse av ob-polypeptidet. For eksempel kan polypeptidet administreres ved å bruke intravenøs innsprøyting, en implanterbar osmotisk pumpe, et transdermalt plaster, liposomer eller andre administrer-ingsmåter. Ved én utførelsesform kan det anvendes en pumpe [Langer et al., red., Medical Applications of Controlled Release, CRC Press, Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. Ved en annen utførelsesform kan det anvendes polymermaterialer [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen et al., red., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); se også Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. Ved nok en annen utførelsesform kan et system med regulert frigjørelse plasseres i nærheten av det terapeutiske mål, dvs. hjernen, slik at det bare kreves en liten del av den systemiske dose [se f.eks. Goodson i Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, s. 115-138 (1984)]. Andre systemer for regulert frigjørelse er omtalt i oversikten av Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Ved en annen ut-førelsesform kan den terapeutiske forbindelse avleveres i en vesikkel, særlig et liposom (se Langer, 1990, supra) ; Treat et al. i Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (red.), Liss New York,

s. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., s. 317-327; se generelt ibid.).

Ved et ytterligere aspekt kan rekombinante celler som er blitt transformert med OB-genet, og som uttrykker høye nivåer av polypeptidet, transplanteres i et individ som trenger ob-polypeptid. Fortrinnsvis transplanteres autologe celler transformert med OB for å unngå avvisning; alternativt er det tilgjengelig teknologi for å beskytte ikke-autologe celler som produserer oppløselige faktorer i en polymermatriks som forhindrer immungjenkjennelse og -avvisning.

OB-polypeptidet kan avleveres ved hjelp av intra-venøs, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulær eller subkutan administreringsvei. Alternativt kan OB-polypeptidet, korrekt formulert, administreres ved hjelp av nese- eller oral administrering. En konstant tilførsel av OB kan sikres ved å tilveiebringe en terapeutisk effektiv dose (dvs. en dose som er effektiv når det gjelder å indusere metabolske endringer hos et individ) ved de nødvendige intervaller, f.eks. daglig, hver 12. time etc. Disse parametrene vil avhenge av alvorligheten av sykdomstilstanden som behandles, andre tiltak, slik som diettmodifikasjon, som implementeres, vekten, alderen og kjønnet til individet og andre kriterier som lett kan bestemmes i henhold til standard god medisinsk praksis av fagfolk innen teknikken.

Farmasøytiske preparater

Ved nok et annet aspekt tilveiebringes farmasøytiske preparater av det ovenfor nevnte. Slike farmasøytiske preparater kan være for administrering ved injeksjon eller for oral, pulmonal, nasal eller andre former for administrering. Generelt er farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av protein eller derivatprodukter sammen med farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, preserveringsmidler, oppløseliggjøringsmidler, emulgeringsmidler, adjuvanser og/eller bærere, omfattet. Slike preparater omfatter fortynningsmidler med forskjellig bufferinnhold (f.eks. Tris-HCl, acetat, fosfat), pH- og ionestyrke; slike additiver som detergenter og oppløseliggjøringsmidler (f.eks. Tween 80, Polysorbate 80), antioksidanter (f.eks. askor-binsyre, natriummetabisulfitt), preserveringsmidler (f.eks. Thimersol, benzylalkohol) og volumøkningsstoffer (f.eks. laktose, mannitol); inkorporering av materialet i partikkel-preparater av polymerforbindelser, slik som polymelkesyre, polyglykolsyre etc, eller i liposomer. Hyaluronsyre kan også anvendes. Slike preparater kan påvirke den fysikalske tilstand, stabilitet, hastighet for in vivo-frigjørelse og hastighet for in vivo-uttømming av de foreliggende proteiner og derivater. Se f.eks. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), sidene 1435-1712. Preparatene kan fremstilles i væskeform eller kan være i tørket pulverform, slik som lyofil-isert form.

Oral avlevering

Det er her tenkt på orale faste doseringsformer som er beskrevet generelt av Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), kapittel 89. Faste doseringsformer omfatter tabletter, kapsler, piller, pastiller eller sugetabletter, kapsler med pulver eller pelleter. Det kan også anvendes liposomal eller proteinoid innkapsling for å formulere de foreliggende preparater (som f.eks. proteinoidmikrokuler rapportert i US patentskrift nr. 4 925 673). Liposomal innkapsling kan brukes, og liposomene kan derivatiseres med forskjellige polymerer (f.eks. US patentskrift nr. 5 013 556). En beskrivelse av mulige faste doseringsformer for det terapeutiske middel er angitt av Marshall i Modem Pharmaceutics, kapittel 10, Banker and Rhodes, red. (1979). Generelt vil formuleringen omfatte proteinet (eller kjemisk modifisert protein) og inerte ingredienser som muliggjør beskyttelse mot magemiljøet og frigjørelse av det biologisk aktive materialet i tarmen.

Det er også spesifikt omfattet orale doseringsformer av de ovenfor derivatiserte proteiner. Protein kan modifiseres kjemisk, slik at oral avlevering av derivatet er virknings-fullt. Generelt er den kjemiske modifikasjon som det er tenkt på, festingen av minst én rest til selye proteinmolekylet (eller peptidmolekylet), hvor resten muliggjør (a) inhibering av proteolyse og (b) opptak i blodstrømmen fra magesekken eller tarmen. Det er også ønsket en økning i total stabilitet for proteinet og økning i omløpstid i kroppen. Eksempler på slike rester omfatter: polyetylenglykol, kopolymerer av etylenglykol og propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon og polyprolin, Abuchowski et al., 1981, supra; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Andre polymerer som vil kunne brukes, er poly-1,3-dioksolan og poly-1,3,6-tioksokan. Foretrukket for farmasøytisk anvendelse er, som angitt ovenfor, polyetylen-glykolrester.

For proteinet (eller derivatet) kan frigjørelses-stedet være magesekken, tynntarmen (tolvfingertarmen, fast-tarmen eller den siste delen av tynntarmen) eller tykktarmen. Fagfolk innen teknikken har tilgjengelige formuleringer som ikke vil oppløses i magesekken, men som likevel vil frigjøre materialet i tolvfingertarmen eller andre steder i tarmen. Fortrinnsvis vil frigjørelsen unngå de skadelige effektene av magesekkmiljøet, enten ved beskyttelse av proteinet (eller derivatet) eller ved frigjørelse av det biologisk aktive materialet etter magesekkmiljøet, slik som i tarmen,

For å sikre fullstendig mageresistens er det av av-gjørende betydning med et belegg som er ugjennomtrengelig inntil minst pH 5,0. Eksempler på de mer vanlige inerte bestand-delene som anvendes som enteriske belegg, er celluloseacetat-trimellitat (CAT), hydroksypropylmetylcelluloseftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylacetatftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celluloseacetatftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S og skjellakk. Disse beleggene kan anvendes som blandede filmer.

Et belegg eller en blanding av belegg kan også brukes på tabletter, noe som ikke er ment til beskyttelse mot magesekken. Dette kan omfatte sukkerbelegg eller belegg som gjør tabletten lettere å svelge. Kapsler kan bestå av et hardt skall (slik som gelatin) for avlevering av tørt terapeutisk middel, dvs. pulver; for flytende former kan det anvendes et mykt gelatinskall. Skallmaterialet i kapsler med pulver kan være tykk stivelse eller annet spiselig papir. For piller, sugetabletter, støpte tabletter eller tablettriturater kan det anvendes teknikker med dannelse av fuktig masse.

Det terapeutiske middel kan inkluderes i preparatet som fine multipartikler i form av granuler eller pelleter med partikkelstørrelse ca. 1 mm. Formuleringen av materialet for kapseladministrering vil også kunne være som et pulver, svakt pressede plugger eller til og med som tabletter. Det terapeutiske middel vil kunne fremstilles ved pressing.

Fargestoffer og smaksmidler kan alle være inkludert. For eksempel vil proteinet (eller derivatet) kunne formuleres (slik som ved liposom- eller mikrokuleinnkapsling) og så videre bli inneholdt i et spiselig produkt, slik som en av-kjølt drikk som inneholder fargestoffer og smaksmidler.

Man kan fortynne eller øke volumet av det terapeutiske middel med et inert materiale. Disse fortynningsmidlene kan omfatte karbohydrater, spesielt mannitol, -laktose, vann-fri laktose, cellulose, sukrose, modifiserte dekstraner og stivelse. Visse uorganiske salter kan også brukes som fyll-stoffer, inkludert kalsiumtrifosfat, magnesiumkarbonat og natriumklorid. Noen kommersielt tilgjengelige fortynningsmidler er Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress og Avicell.

Desintegrasjonsmidler kan inkluderes ved formuleringen av det terapeutiske middel i en fast doseringsform. Materialer som anvendes som desintegrasjonsmidler, omfatter, men er ikke begrenset til, stivelse, inkludert det kommer-sielle desintegrasjonsmiddel basert på stivelse, Explotab. Natriumstivelsesglykolat, Amberlite, natriumkarboksymetylcellulose, ultramylopektin, natriumalginat, gelatin, appelsin-skall, sur karboksymetylcellulose, naturlig svamp og bentonitt kan alle anvendes. En annen form for desintegrasjonsmidler er de uoppløselige kationiske bytterharpikser. Pulveriserte gummier kan brukes som desintegrasjonsmidler og som bindemidler, og disse kan omfatte pulveriserte gummier, slik som agar, karaya eller tragant. Alginsyre og dens natriumsalt kan også anvendes som desintegrasjonsmidler.

Bindemidler kan brukes til å holde det terapeutiske middel sammen, slik at det dannes en hard tablett, og omfatter materialer fra naturlige produkter, slik som akasie, tragant, stivelse og gelatin. Andre omfatter metylcellulose (MC), etylcellulose (EC) og karboksymetylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) og hydroksypropylmetylcellulose (HPMC) kan begge anvendes i alkoholoppløsninger for å granulere det terapeutiske middel.

Et antifriksjonsmiddel kan inkluderes ved formuleringen av det terapeutiske middel for å forhindre klebing under formuleringsprosessen. Smøremidler kan brukes som et lag mellom det terapeutiske middel og støpeformveggen, og disse kan omfatte, men er ikke begrenset til: stearinsyre inkludert dens magnesium- og kalsiumsalter, polytetrafluoretylen (PTFE), flytende parafin, vegetabilske oljer og vokser. Oppløselige smøremidler kan også anvendes, slik som natriumlaurylsulfat, magnesiumlaurylsulfat, polyetylenglykol med forskjellige molekyl vekter og Carbowax 4000 og 6000.

Glidemidler som vil kunne forbedre strømningsegen-skapene til legemidlet under formulering og hjelpe til omordning under pressing, vil kunne tilsettes. Smøremidlene kan omfatte stivelse, talkum, pyrogen silika og hydratisert sili-koaluminat.

For å fremme oppløsning av det terapeutiske middel i vandig miljø vil et overflateaktivt middel kunne tilsettes som et fuktemiddel. Overflateaktive midler kan omfatte anioniske detergenter, slik som natriumlaurylsulfat, dioktylnatrium-sulfosuccinat og dioktylnatriumsulfonat. Kationiske detergenter vil kunne brukes og kan omfatte benzalkoniumklorid eller benzetoniumklorid. Listen av potensielle ikke-ioniske detergenter som kan inkluderes ved formuleringen som overflateaktive midler, er lauromakrogol 400, polyoksyl 40-stearat, hydrogenert polyoksyetylenricinusolje 10, 50 og 60, glyserol-monostearat, Polysorbate 40, 60, 65 og 80, sukrosefettsyre-ester, metylcellulose og karboksymetylcellulose. Disse overflateaktive midlene kan være til stede i preparatet av proteinet eller derivatet, enten alene eller som en blanding i forskjellige mengdeforhold.

Additiver som potensielt øker opptak av proteinet (eller derivatet), er f.eks. fettsyrene oljesyre, linolsyre og linolensyre.

Det kan være ønskelig med preparater med regulert

frigjørelse. Legemidlet kan inkorporeres i en inert grunnmasse som muliggjør frigjørelse enten ved hjelp av- diffusjons- eller utlekkingsmekanismer, dvs. gummier. Sakte degenererende grunn-masser kan også inkorporeres i preparatet. En annen form for

en regulert frigjørelse av dette terapeutiske middel er ved

hjelp av en fremgangsmåte som er basert på Oros terapeutiske system (Alza Corp.), dvs. legemidlet er innelukket i en semi-permeabel membran som lar vann komme inn og skyve legemiddel ut gjennom en eneste liten åpning på grunn av osmotiske effekter. Noen enteriske belegg har også en effekt med forsinket frigj ørelse.

Andre belegg kan brukes til formuleringen. Disse omfatter mange forskjellige sukkere som kan påføres i en beleg-ningspanne. Det terapeutiske middel kan også gis i en film-belagt tablett; materialene som anvendes i dette tilfellet, er delt i to grupper. Den første er de ikke-enteriske materialer og omfatter metylcellulose, etylcellulose, hydroksyetylcellu-lose, metylhydroksyetylcellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, povidon og polyetylenglykolene. Den andre gruppen består av de enteriske materialene som er vanlige estere av ftalsyre.

En blanding av materialer vil kunne brukes til å tilveiebringe det optimale filmbelegg. Filmbelegging kan utføres i en pannebelegger eller i et fluidisert lag, eller ved pressbelegging.

Pulmonal avlevering

Det er her også omfattet pulmonal avlevering av det foreliggende protein (eller derivater derav). Proteinet (eller derivatet) avleveres til lungene hos et pattedyr mens det in-halerer, og krysser over lungeepitelforingen til blodstrømmen. Andre rapporter om dette omfatter Adj ei et al., Pharmaceutical Research, 7 ( 6):565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5):143-146 (1989) (endotelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3 ( 3):206-212 (1989) ( 1-anti-trypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989)

( 1-proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado (mars 1990) (rekombinant humant vekst-hormon) ; Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988), og

Platz et al., US patentskrift nr. 5 284 656 (granulocytt-kolonistimulerende faktor). For anvendelse ved utøvelsen av denne oppfinnelsen er det omfattet en lang rekke mekaniske anordninger utformet for pulmonal avlevering av terapeutiske produkter, inkludert, men ikke begrenset til, forstøvere, inhalatorer med utmålt dose og pulverinhalatorer, som alle er godt kjent for fagfolk innen teknikken.

Noen spesifikke eksempler på kommersielt tilgjengelige anordninger som er egnet for utøvelsen av denne oppfinnelsen, er Ultravent-forstøveren, produsert av Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acorn II-forstøveren, produsert av Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin-inhalatoren med utmålt dose, produsert av Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; og Spinhaler-pulverinhalatoren, produsert av Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Alle slike anordninger krever bruk av formuleringer som er egnet for dispensering av protein (eller derivat). Vanligvis er hver formulering spesifikk for typen av anordning som anvendes, og kan omfatte bruken av et passende driv-materiale i tillegg til de vanlige fortynningsmidlene, adju-vansene og/eller bærerne som kan anvendes ved terapi. Bruken av liposomer, mikrokapsler eller mikrokuler, inklusjons-komplekser eller andre typer av bærere er også omfattet. Kjemisk modifisert protein kan også fremstilles i forskjellige formuleringer, avhengig av typen av kjemisk modifikasjon eller typen av anordning som anvendes.

Formuleringer egnet for bruk med en forstøver, enten gassdrevet eller ved ultralyd, vil vanligvis omfatte protein (eller derivat) oppløst i vann ved en konsentrasjon på ca. 0,1-25 mg biologisk aktivt protein pr. ml oppløsning. Preparatet kan også omfatte en buffer og et enkelt sukker (f.eks. for proteinstabilisering og regulering av osmotisk trykk). Forstøverpreparatet kan også inneholde et overflateaktivt middel for å redusere eller forhindre overflateindusert aggre-gasjon av proteinet forårsaket av atomisering av oppløsningen ved dannelse av aerosolen.

Preparater for anvendelse med en inhalatoranordning med utmålt dose vil generelt omfatte et fint oppdelt pulver som inneholder proteinet (eller derivatet) oppslemmet i et drivmiddel ved hjelp av et overflateaktivt middel. Drivmidlet kan være hvilket som helst vanlig materiale som anvendes for dette formål, slik som klorfluorkarbon, et hydroklorfluor-karbon, et hydrofluorkarbon eller et hydrokarbon, inkludert triklorfluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluoretanol og 1,1,1,2-tetrafluoretan, eller kombinasjoner derav. Egnede overflateaktive midler omfatter sorbitantrioleat og soyaleci-tin. Oljesyre kan også være anvendbart som et overflateaktivt middel.

Preparater for dispensering fra en pulverinhalator-anordning vil omfatte et fint oppdelt, tørt pulver som inneholder protein (eller derivat), og kan også omfatte et volum-økningsmiddel, slik som laktose, sorbitol, sukrose eller mannitol, i mengder som letter spredning av pulveret fra anordningen, f.eks. 50-90 vekt% av preparatet. Proteinet (eller derivatet) bør mest fordelaktig være fremstilt i partikkelform med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse som er mindre enn 10 m (eller mikrometer), mest foretrukket 0,5-5 m, for mest effektiv avlevering til de fjerneste deler av lungene.

Neseavlevering

Neseavlevering av proteinet (eller derivatet) er også omfattet. Neseavlevering lar proteinet passere til blodstrømmen direkte etter administrering av det terapeutiske produkt til nesen, uten nødvendigheten av avsetning av produktet i lungene. Formuleringer for neseavlevering omfatter dem med dekstran eller syklodekstran.

Fremgangsmåter for behandling, fremgangsmåter for fremstilling av et medikament

Ved nok et annet aspekt er det tilveiebrakt fremgangsmåter for behandling og fremstilling av et medikament. Tilstander som lindres av eller moduleres ved hjelp av administreringen av de foreliggende derivater, er de som er angitt ovenfor.

Doseringer

For alle de ovenfor nevnte molekyler vil det, etter hvert som ytterligere undersøkelser utføres, komme frem informasjon vedrørende passende doseringsnivåer for behandling av forskjellige tilstander hos forskjellige pasienter, og fagfolk på området som vurderer den terapeutiske sammenheng, alder'og generell helsetilstand hos mottakeren, vil være i stand til å sikre den korrekte dosering. Generelt vil, for injeksjon eller innsprøyting, doseringen være mellom 0,01 g biologisk aktivt protein/kg kroppsvekt (idet proteinvekten beregnes alene, uten kjemisk modifikasjon) og 10 mg/kg (basert på det samme). Doseringsplanen kan variere, avhengig av halveringstiden under omløp for proteinet eller derivatet som anvendes, hvorvidt polypeptidet avleveres ved hjelp av bolusdose eller kontinuerlig innsprøyting, og det anvendte preparat .

Administrering sammen med andre forbindelser

For terapi forbundet med fedme kan man administrere det foreliggende protein (eller derivatene) sammen med ett eller flere farmasøytiske preparater som anvendes til behandling av andre kliniske komplikasjoner ved fedme, slik som dem som brukes til behandling av diabetes (f.eks. insulin), høyt blodtrykk, høyt kolesterolinnhold og andre ugunstige tilstander som naturlig hører med til fedme. Andre appetitt-undertrykkere kan også samadministreres, f.eks. amfetaminer. Administrering kan skje samtidig (f.eks. administrering av en blanding av det foreliggende protein og insulin) eller kan være i rekkefølge.

Nukleinsyrebasert terapeutisk behandling

OB-genet kan innføres i humanfettceller for å utvikle genterapi for fedme. Slik terapi vil forventes å redusere kroppsvekt. Omvendt vil innføring av antisense-konstruksjoner i humanfettceller redusere nivåene av aktivt OB-polypeptid og vil kunne forutsis å øke kroppsfedme.

Ved én utførelsesform innføres et gen som koder for et OB-polypeptid in vivo i en virusvektor. Slike vektorer omfatter et svekket eller defekt DNA-virus, slik som, men ikke begrenset til, herpes simplexvirus (HSV), papillomvirus, Epstein-Barr-virus (EBV), adenovirus, adenoassosiert virus (AAV) og lignende. Defekte virus som helt eller nesten fullstendig mangler virusgener, er foretrukket. Defekt virus er ikke infeksiøst etter innføring i en celle. Bruk av defekte virusvektorer muliggjør administrering til celler i et spesifikt, lokalisert område, uten at man behøver å bekymre seg for at vektoren kan infisere andre celler. Man kan således målrette spesifikt mot fettvev. Eksempler på bestemte vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, en defekt herpes virus 1-vektor (HSVl-vektor) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], en svekket adenovirusvektor, slik som vektoren beskrevet av Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992), og en defekt adenoassosiert virusvektor [Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)].

Ved en annen utførelsesform kan genet innføres i en retrovirusvektor, f.eks. som beskrevet av Anderson et al., US patentskrift nr. 5 399 346; Mann et al., Cell, 33:153 (1983); Temin et al., US patentskrift nr. 4 650 764; Temin et al., US patentskrift nr. 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et al., US patentskrift nr. 5 124 263; internasjonal patentpublikasjon nr. WO 95/07358, publisert 16. mars 1995 av Dougherty et al.; og Kuo et al., Blood, 82:845 (1993).

Alternativt kan vektoren innføres in vivo ved lipofeksjon. I det siste tiår har det vært en økende bruk av liposomer for innkapsling og transfeksjon av nukleinsyrer in vitro. Syntetiske kationiske lipider utformet til å begrense vanskelighetene og farene som man støter på med liposommediert transfeksjon, kan brukes til å fremstille liposomer for transfeksjon in vivo av et gen som koder for en markør [Felgner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:7413-7417 (1987); se Mackey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:8027-8031

(1988)]. Anvendelsen av kationiske lipider kan fremme innkapsling av negativt ladede nukleinsyrer og fremme fusjon med negativt ladede cellemembraner [Felgner et al., Science, 337:387-388 (1989)]. Anvendelsen av lipofeksjon for å innføre eksogene gener i spesifikke organer in vivo har visse praktiske fordeler. Molekylær målretting av liposomer mot spesifikke celler utgjør ett gunstig område. Det er klart at styring av transfeksjon mot bestemte celletyper- vil være særlig fordelaktig i et vev med cellulær heterogenitet, slik som bukspyttkjertelen, leveren, nyrene og hjernen. Lipider kan kobles kjemisk til andre molekyler for målrettingsformål [se Mackey et al., 1988, supra). Målrettede peptider, f.eks. hormoner eller neurotransmittere, og proteiner, slik som anti-" stoffer, eller ikke-peptidmolekyler kan kobles kjemisk til liposomer.

Det er også mulig å innføre vektoren in vivo som et nakent DNA-plasmid. Nakne DNA-vektorer for genterapi kan inn-føres i de ønskede vertsceller ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, f.eks. transfeksjon, elektropora-sjon, mikroinjeksjon, transduksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfatutfelling, anvendelse av en genpistol eller bruk av en DNA-vektortransportør (se f.eks. Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., canadisk patentsøknad nr. 2 012 311, innlevert 15. mars 1990).

Landbruksapplikasj oner

OB-genet kan også isoleres fra husdyr og det tilsvarende OB-polypeptid derved oppnås. I et bestemt eksempel nedenunder hybridiserer proben avledet fra det murine OB-gen til tilsvarende homologe kodende sekvenser fra et stort antall dyrearter. Som omtalt for humanterapier, kan rekombinante proteiner også fremstilles og administreres til husdyr. Administrering av polypeptidet kan implementeres for å produsere dyr som gir magrere mat, slik som kjøttkveg, svin, fjær-kre, sauer etc. Fortrinnsvis administreres et autologt OB-polypeptid, selv om oppfinnelsen også beskriver administrering av antiautologt polypeptid. Ettersom OB-polypeptidet består av omtrent 160 aminosyrerester, kan det ikke være høyimmunogent. Administrering av ikke-autologt polypeptid vil således ikke resultere i en immunrespons.

Alternativt vil innføringen av de klonede gener i transgene husdyr gjøre det potensielt mulig å redusere kroppsvekt og fedme ved å overuttrykke et OB-transgen. Det enkleste middel for å oppnå dette ville være å målrette et OB-transgen mot fett ved å bruke dets egen eller en annen fettspesifikk promoter.

Omvendt vil økninger i kroppsvekt kunne være ønskelig ved andre omstendigheter, slik som for utviklingen av Kobe-kjøtt eller fettlever for å lage "foie gras". Dette kan utføres ved å målrette et antisense-OB-transgen mot fett, eller ved å bruke genutslagningsteknikk. Når en økning i kroppsvekt ved prosentandel av fett er ønsket, kan alternativt en inhibitor eller antagonist for OB-polypeptidet administreres. Slike inhibitorer eller antagonister omfatter, men er ikke begrenset til, antistoffer som er reaktive med polypeptidet og fragmenter av polypeptidet som binder, men ikke aktiverer, OB-reseptoren, dvs. antagonister for OB-polypeptidet .

Kosmetiske implikasjoner

OB-polypeptidet har signifikant verdi for kosmetisk anvendelse i tillegg til helsefordelene. Etter som OB-polypeptidene, inkludert derivater og agonistanaloger derav, kan anvendes til modulering av hastigheten og mengden av fett-celleavsetning hos et dyr, er de særlig anvendbare til å redusere usynlig fettvev, f.eks. fettavsetninger i bukhulen, hoftene, lårene, nakken og kinn, som ikke nødvendigvis utgjør en tykk tilstand, men som ikke desto mindre forringer et individs utseende. Fettreduksjonseffekten menes å bli oppnådd delvis av en reduksjon i appetitt, dvs. en reduksjon i matinntak, ved en økning i basalmetabolisme eller begge deler. Det foreliggende OB-polypeptid eller dets derivater eller agonistanaloger er således anvendbare for administrering til et individ for å bevirke kosmetiske endringer i fettvevs-avsetninger, enten ved modulering av fettavsetning, reduksjon av appetitt eller begge deler.

I tillegg vil de foreliggende preparater og fremgangsmåter kunne anvendes sammen med forskjellige fremgangsmåter, slik som kosmetisk kirurgi utformet for å endre total-utseendet til en kropp (f.eks. fettsuging eller laserkirurgi utformet for å redusere kroppsvekt ved å suge ut eller fjerne fettvev), trening (spesielt løping og vektløfting), lavfett-diett, hypnose, biofeedback, som eksempler på måter som man kan forsøke for å redusere prosentandelen av fettvev og forbedre utseendet til kroppen.

Det beskrives heri følgelig en fremgangsmåte for å bevirke kosmetisk fettvevsmodulering hos et individ, som omfatter å administrere en fettmodulerende mengde av et OB-polypeptid, eller et derivat eller en agonistanalog derav, til et individ som ønsker kosmetisk fettvevsmodulering for å forbedre totalt kroppsutseende. Ved et bestemt aspekt er fettvevsmoduleringen en følge av appetittundertrykkelse. Fortrinnsvis er fettvevsmoduleringen en reduksjon av fettvev.

Ved en ytterligere utførelsesform beskrives heri en fremgangsmåte for å bevirke kosmetisk fettvevstap, som omfatter å kombinere en fremgangsmåte for å endre kroppsutseende med administrering av en fettmodulerende mengde av et OB-polypeptid, eller et derivat eller en agonistanalog derav, til et individ som ønsker kosmetisk fettvevsmodulering for å forbedre totalt kroppsutseende.

OB- reseptoren

Utvikling av småmolekylagonister og antagonister for OB-faktoren vil lettes i stor grad ved isoleringen av dens reseptor. Dette kan utføres ved å fremstille aktivt OB-polypeptid og bruke det til å screene et ekspresjonsbibliotek under anvendelse av standardmetodikk. Reseptorbinding i ekspresjonsbiblioteket kan testes ved å administrere rekombinant polypeptid fremstilt ved å bruke enten bakterie- eller pattedyrekspresjonsvektorer, og observere effektene av kort-varig og kontinuerlig administrering av det rekombinante polypeptid på cellene i ekspresjonsbiblioteket, eller ved direkte påvisning av binding av OB-polypeptid til cellene.

Ettersom man for tiden mener at OB-reseptoren sannsynligvis er lokalisert i hypotalamus og muligens i lever, vil fortrinnsvis cDNA-biblioteker fra disse vevene bli konstruert i standard ekspresjonskloningsvektorer. Disse cDNA-klonene vil deretter bli innført i COS-celler som blandinger, og de resulterende transformanter vil bli screenet med aktiv ligand for å identifisere COS-celler som uttrykker OB-reseptoren. Positive kloner kan så isoleres for å gjenvinne den klonede reseptor. Den klonede reseptor vil bli brukt sammen med OB-liganden (under antakelse av at den er et hormon) for å utvikle de<:>nød-vendige komponentene for screening av småmolekylmodulatorer for OB.

Et bestemt analysesystem som skal benyttes i overensstemmelse med foreliggende beskrivelse, er kjent som en reseptoranalyse. Ved en reseptoranalyse merkes materialet som skal analyseres på passende måte, og så inokuleres visse cellulære testkolonier med en mengde av både det merkede og umerkede materialet, hvoretter bindingsundersøkelser utføres for å bestemme i hvilken utstrekning det merkede materialet bindes til cellereseptorene. På denne måten kan det fastslås forskjeller i affinitet mellom materialer.

Følgelig kan en renset mengde av vektmodulatoren merkes radioaktivt og kombineres f.eks. med antistoffer eller andre inhibitorer for den, hvoretter bindingsundersøkelser vil bli utført. Det vil så bli fremstilt oppløsninger som inneholder forskjellige mengder av merket og umerket, ukombinert vektmodulator, og celleprøver vil så bli inokulert og deretter inkubert. De resulterende cellemonolag vaskes så, oppløselig-gjøres og telles så i en gammateller i en tilstrekkelig lang tid til å gi en standardfeil på < 5 %. Disse dataene under-kastes så Scatchard-analyser, hvoretter det kan gjøres obser-vasjoner og konklusjoner vedrørende materialaktivitet. Selv om det ovenfor nevnte er eksempelvis, illustrerer det den måten som en reseptoranalyse kan utføres på, og utnyttes i tilfellet hvor den cellulære bindingsevne til det analyserte materialet vil kunne tjene som en kjennetegnende egenskap. Deretter vil en reseptoranalyse være særlig anvendbar ved identifikasjonen av de spesifikke reseptorene for de foreliggende modulatorer, slik som db-reseptoren.

En ytterligere analyse som kan anvendes og som omfattes i overensstemmelse med foreliggende beskrivelse, er kjent som en "cis-/trans"-analyse. I korte trekk gjør denne analysen bruk av to genetiske konstruksjoner, hvorav én vanligvis er et plasmid som kontinuerlig uttrykker en bestemt reseptor av interesse når det transfekteres i en passende cellelinje, og hvorav den andre er et plasmid som uttrykker en slik rapportør som luciferase, under kontroll av et kompleks av reseptor og ligand. Dersom det således f.eks. er ønsket å evaluere en forbindelse som en ligand for en bestemt reseptor, vil ett av plasmidene være en konstruksjon som resulterer i ekspresjon av reseptoren i den valgte cellelinje, mens det andre plasmidet vil ha en promoter bundet til luciferasegenet hvor responselementet mot den bestemte reseptor er innføyd. Dersom forbindelsen som testes er en agonist for reseptoren, vil liganden danne kompleks med reseptoren, og det resulterende kompleks vil binde responselementet og initiere transkripsjon av luciferasegenet. Den resulterende kjemi - luminescens måles så fotometrisk, og doseresponskurver fås og sammenlignes med dose-responskurvene for kjente ligander. Fremgangsmåten ovenfor er beskrevet nærmere i US patentskrift nr. 4 981 784 og i PCT internasjonalt publikasjonsnr. WO 88/03168, som det henvises til.

Når først en rekombinant som uttrykker OB-reseptor-gensekvensen er blitt identifisert, kan den rekombinante OB-reseptor analyseres. Dette oppnås ved hjelp av analyser basert på de fysiske eller funksjonelle egenskapene til OB-reseptoren, inkludert radioaktiv merking av reseptoren, etterfulgt av analyse ved hjelp av gelelektroforese, immunologisk analyse, ligandbinding etc. Dessuten kan det frembringes antistoffer mot ob-reseptoren, som beskrevet ovenfor.

Strukturen til OB-reseptoren kan analyseres ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Fortrinnsvis analyseres strukturen til de forskjellige domenene, særlig OB-bindingssetet. Strukturanalyse kan utføres ved å identifisere sekvenslikhet med andre kjente proteiner, bestemte hormon- og proteinreseptorer. Graden av likhet (eller homologi) kan gi et grunnlag for å forutsi strukturen og funksjonen til OB-reseptoren, eller et domene derav. Ved en bestemt utførelsesform kan sekvenssammen-ligninger utføres med sekvenser som finnes i GenBank under anvendelse av f.eks. FASTA- og FASTP-programmene [Pearson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:2444-48 (1988)].

Proteinsekvensen kan videre karakteriseres ved hjelp av en hydrofilisitetsanalyse (f.eks. Hopp et al., 1981, supra). En hydrofilisitetsprofil kan brukes til å identifisere de hydrofobe og hydrofile områdene i OB-reseptorproteinet, som igjen kan gi indikasjon på ekstracytoplasma-, membranbindende og intracytoplasmaområder.

Sekundærstrukturanalyse (f.eks. Chou et al, 1974, supra) kan også gjøres for å identifisere områder i OB-reseptoren som inntar spesifikke sekundærstrukturer.

Manipulasjon, translasjon og.sekundærstrukturforutsigelse samt åpen leserammeforutsigelse og -plotting kan også utføres ved å bruke datamaskinprogrammer som er tilgjengelige innen teknikken.

Ved å tilveiebringe en rikelig kilde for rekombinant OB-polypeptid, og gjennom muligheten for å isolere OB-reseptoren (dvs. db-genproduktet), muliggjøres kvantitativ strukturbestemmelse av den aktive konformasjon til OB-polypeptidet og OB-reseptoren, eller domener derav. Særlig tilveiebringes tilstrekkelig materiale for kjernemagnetisk resonans(NMR)-, infrarød(IR)- Råman- og ultrafiolett(UV)-, spesielt sirkulærdikroisme(CD)-, spektroskopianalyse. Særlig NMR gir svært kraftfull strukturanalyse av molekyler i oppløsning som kommer nærmere opp til deres naturlige miljø

(Marion et al., 1983, supra; Bar et al., 1985, supra; Kimura et al., 1980, supra). Andre fremgangsmåter for strukturanalyse kan også anvendes. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, røntgenkrystallografi (Engstrom, 1974, supra) .

Mer foretrukket kan kokrystaller av OB-polypeptid og OB-reseptorer undersøkes. Analyse av kokrystaller gir detal-jert informasjon om binding, som igjen muliggjør rasjonell utforming av ligandagonister og -antagonister. Datamaskin-modellering kan også brukes, spesielt i forbindelse med NMR-og røntgenmetoder [Fletterick et al., red., Computer Graphics and Molecular Mbdeling, i Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)] .

Identifikasjon og isolering av et gen som koder for en OB-reseptor, sørger for ekspresjon av reseptoren i mengder som er større enn det' som kan isoleres fra naturlige kilder eller i indikatorceller som er spesielt laget for å indikere aktiviteten til en reseptor uttrykt etter transfeksjon eller transformasjon av cellene. Følgelig omfatter foreliggende beskrivelse, i tillegg til rasjonell utforming av agonister og antagonister basert på strukturen til OB-polypeptidet, en alternativ fremgangsmåte for identifisering av spesifikke ligander for OB-reseptor under anvendelse av forskjellige screeningsanalyser som er kjent innen teknikken.

Oppfinnelsen kan forstås bedre under henvisning til de følgende eksempler.

Eksempeldel

Det følgende skisserer fremgangsmåten som brukes for å identifisere det genetiske materialet som gir eksempler på foreliggende oppfinnelse. Dette forsøket omfatter fire sekvensvise trinn: A) genetisk kartlegging, B) fysikalsk kartlegging, C) kandidatgenisolering og D) mutasjonspåvisning. Etter bekreftelse på at det aktuelle murine gen ble isolert (trinn D), ble det søkt etter det homologe humangen, og både murin- og humangenet og putative proteiner ble karakterisert. Trinnene er oppsummert nærmere nedenunder.

A. Genetisk kartlegging

ob-mutasjonen ble segregert i genetiske krysninger, og standard bindingsanalyse ble brukt til å posisjonere mutasjonen i forhold til RFLP-er (restriksjonsfragmentlengdepoly-morfisme). Disse dataene plasserte OB-genet i et ca. 5 cM intervall på proksimalt musekromosom 6. (5 c'M er et mål for

genetisk avstand som tilsvarer 5 tilsynelatende krysninger pr. 100 dyr.) I alt 771 informative meioser ble frembrakt og brukt ved etterfølgende genetisk kartlegging (Friedman et al., 1991, supra). De genetiske stedene som ble kartlagt i forhold til

OB, var alle tidligere publisert. De to nærmeste beskrevne RFLP-er ble definert ved hjelp av prober avledet fra karboksy-peptidase- og met-onkogengenene.

Den genetiske oppløsning av forsøkene beskrevet ovenfor var upassende til å klone ob, hovedsakelig på grunn av at ingen av de genetiske markørene forelå i tett binding. For å identifisere de påkrevde, tett bundne RFLP-er ble det isolert ytterligere prober, og den genetiske krysning ble utvidet. En fremgangsmåte kjent som kromosommikrodisseksjon ble brukt til å isolere vilkårlige stykker av DNA fra proksimalt musekromosom 6 [Bahary et al., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. Individuelt klonede prober ble testet med hensyn på tett binding til ob. På grunnlag av disse studiene ble én probe, D6Rckl3, også kalt psd3, valgt ut for videre analyse på grunn av dens genetiske nærhet til OB. Denne proben ble brukt til å genotype 835 ob-avkom fra interspesifikke og interunderspesifikke krysninger, noe som indikerte at D6Rckl3 er ikke-rekombinant hos alle de 835 dyrene som ble rapportert av Bahary et al. I løpet av den fysikalske kartlegging ble en ny polymorf markør identifisert fra en kosmidsubklon avledet fra YAC 53A6. Denne nye markøren ble plassert mellom D6Rckl3 og OB-genet, og ble brukt til å genotype de ytterligere 771 informative meioser fra intraspesifikk interkrysning og tilbakekrysning. Ett enkelt dyr, nr. 167, ble identifisert til å bære en rekombinasjonsoverkrysning mellom ob og D6Rck3 9. Disse studiene indikerte at D6Rck3 9/D6Rckl3 er ca. 0,06 cM fra ob. Det ble identifisert en ytterligere probe, Pax4, som var 0,12 cM proksimalt til ob. Pax4 var rekombinant hos to dyr, nr. 111 og nr. 420. Pax4 er et pseudogen som tidligere ble kartlagt til proksimalt musekromosom 6 av Gruss og med-arbeidere [Gruss et al., Genomics, 11:424-434 (1991)]. På dette grunnlag ble det bestemt at OB-genet befinner seg i det ca. 0,2 cM intervallet mellom Pax4 og D6Rckl3. Dette førte til forsøk på å klone den innskutte DNA i et forsøk på å isolere

OB.

B. Fysikalsk kartlegging

Kloningen av DNA-en i dette intervallet gjorde bruk av kunstige gjærkromosomer (YAC-er), en forholdsvis ny kloningsvektor som muliggjør kloning av lange strekninger av sammenhengende DNA som ofte er mer enn 1 million basepar lange.

Kunstige gjærkromosomer ble isolert ved å bruke D6Rckl3 og Pax4. Dette ble utført ved å fremstille rensede DNA-prober og bruke dem til å isolere de tilsvarende YAC-er. Disse YAC-ene (nr. 8, nr. 16, nr. 107 og nr. 24) ble isolert og først karakterisert, og på grunnlag av de resulterende analyser ble det konkludert med at YAC 16 var det YAC som strakte seg lengst bort, dvs. nærmest opp til ob. Nøkkelenden av YAC nr. 16 ble så gjenvunnet, og det ble bestemt at denne enden var nærmere ob enn Pax4. Denne enden ble kalt 16M(+). Denne konklusjonen ble nådd ettersom det ble påvist at denne proben ikke var rekombinant hos dyr nr. 420 (noe som Pax4 var). Denne enden ble sekvensert og brukt til å utvikle en PCR-analyse. Denne PCR-analysen ble brukt til å screene et YAC-bibliotek. Fire positive kloner ble isolert. Etterfølgende karakterisering av disse YAC-ene ved hjelp av enderedning, restriksjonskartlegging, pulsfeltgelelektroforese og "Southern blots" med de genetiske krysningene bestemte at to av disse YAC-ene, adu og aad, var av avgjørende betydning for etter-følgende undersøkelser. YAC- aad er et 550 kB stort ikke-kimært YAC som strakte seg lengst bort. Den fjerneste enden av dette YAC, aad(pICL), ble derfor brukt til å gjøre ferdig det fysikalske kart. YAC-adu er 370 kB ikke-kimært YAC, og dets fjerne ende, adu(+), ble bestemt til å være ikke-rekombinant hos alt ob-avkommet fra de genetiske krysningene, inkludert dyrene nr. 111 og nr. 167, noe som tyder på at OB-genet vil kunne befinne seg i dette YAC.

En PCR-analyse for disse to endene, aad(pICL)og adu(+), ble utviklet og brukt for å isolere flere YAC-er og Pl-kloner for å fortsette fysisk kartlegging. De viktige Pl-klonene isolert ved hjelp av dette forsøket, inkluderte 498, 499, 500 (isolert ved å bruke en probe avledet fra aad(pICL)) og 322, 323 og 324 (ved å bruke en probe fra adu(+)).

I mellomtiden ble YAC-er isolert ved hjelp av D6Rckl3 (53A6, 25A8, 25A9, 25A10) karakterisert. Disse undersøkelsene bestemte at 53A6 strakte seg lengst proksimalt mot aad-YAC. Størrelsen på åpningen mellom 53A6 og aad ble bestemt til å være ca. 70 kB. Nøkkelenden av 53A6, 53(pICL), ble så brukt til å screene tre tilgjengelige YAC-biblioteker og et Pl-bibliotek. En avgjørende Pl-klon, 325, ble isolert. Denne Pl-klonen overlappet med Pl-klonene isolert ved hjelp av aad(pICL), som beskrevet ovenfor, og tjente derfor til å lukke åpningen mellom 53(pICL) og aad(pICL). Som et resultat av dette ble hele sammenstillingen, inneholdende YAC-er og Pl-kloner, på ca. 2,5 millioner basepar i lengde, og som spente over Pax4, 16M(+), adu(+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 og D6Rckl3, klonet. Ved hjelp av forsiktig kartlegging av setene for rekombinasjon, som er tydelige hos dyr nr. 111 og nr. 167, ble det konkludert med at OB befant seg i et 400 kB stort intervall. For å tilveiebringe en virkende DNA-kilde for isolering av OB-genet ble ca. 500 kB, som dekker dette ikke-rekombinasjonsområdet, isolert hos totalt 24 Pl-kloner. Disse Pl-klonene, inkludert 322 og 323, som senere ble funnet å være nyttige kloner, ble brukt til exoninnfanging.

Det fysiske kart over den delen av kromosomet som bærer OB, er vist i figur 7A. Figur 7B utgjør YAC-sammenstillingen. Figur 7C utgjør Pl-sammenstillingen.

C. Isolering av kandidatgener

Fremgangsmåten anvendt til å isolere gener i dette intervallet var exoninnfanging. Ved denne fremgangsmåten ble det brukt en kommersiell vektor for å identifisere exon-DNA (dvs. kodende sekvenser) ved å selektere med hensyn til funksjonelle spleiseakseptor- og donorsekvenser i genom-DNA innført i en testkonstruksjon. DNA-en fra disse Pl-klonene ble dyrket og subklonet i exoninnfangingsvektoren. Disse klonene var korte innskudd klonet i en Bluescript-vektor. Hver klon ble PCR-amplifisert med PCR-primere som tilsvarer plasmid-sekvenser som flankerte innføyelsen. PCR-amplifikasjonen ble utført direkte på bakteriene som bar plasmidet. Reaksjonene ble satt opp ved å bruke en Biomek-robot. PCR-produktene ble elektroforesebehandlet på en 1 % agarosegel i TBE-buffer som inneholdt etidiumbromid. Exoninnfangingsteknikken ble modifisert for å fjerne forurensende E. coli-DNA fra Pl-klonene, og for å screene ut de overflødige artefaktexonene som over-skred 80-90 % av de putative exoner som ble innfanget. Exon-innf angingsvektoren omfatter HIV-sekvenser; et kort segment av disse vektorsekvensene tilsvarer denne artefakten.

Exoninnfangingsforsøket ble utført ved å bruke forskjellige Pl-kloner. Exoninnfangingsprodukter ble så amplifisert ved hjelp av PCR, selektert og sekvensert. Sekvenser av putative "exoner" ble sammenlignet med sekvenser i GenBank under anvendelse av Blast-datamaskinprogrammet. Cirka 15 exoner ble selektert for videre undersøkelse ved hjelp av RT-PCR, Northern-analyse og "zoo-blot" med hensyn til tilstedeværelse av tilsvarende RNA eller konserverte sekvenser. 7 av de 15 putative exonene, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 og 2G7, ble funnet å kode for et RNA-transkript. 325-2 er et tes-tikkelspesifikt gen; 323-8 og 323-9 er sannsynligvis to exoner fra det samme gen uttrykt hovedsakelig i hjerne og nyre. 1H3 og 322-5 utgjør to lavnivåhjernetranskripter. D1-F7 er et exon fra et tidligere klonet gen, inosinmonofosfatdehydrogenase ( IMPDH), som har allestedsnærværende ekspresjonsmønster. Ingen av disse genene syntes å kode for OB. 2G7, som er OB-exonet, er omtalt nærmere nedenunder.

Etter tre ikke vellykkede forsøk på exoninnfanging av OB-genet ble det gjort nok et forsøk ved å slå sammen DNA fra alle Pl-ene fra det avgjørende OB-området. Disse omfatter Pl-ene: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 og andre. Deretter ble Pl-ene 258, 260, 322, 498 og 499 subklonet i exoninnfangingsvektoren, og deretter ble flere plater fremstilt med bakteriekloner, som hver bar et putativt exon. Omtrent 192 kloner som utgjør putative OB-kandidater, ble erholdt. Som angitt ovenfor, ble det observert en gjennomført artefakt, slik at mange av isolatene inneholdt to innfangede exoner avledet fra vektoren. Kloner ble således identifisert både ved hjelp av deres størrelse og ved hjelp av det faktum at hybridisering av DNA-prober som tilsvarer denne artefakten, hybridiserte til de tilsvarende bånd på en

"Southern blot" av gelen. På denne måte ble 185 av 192 kloner utelukket fra videre evaluering. Utelukkelse av artefaktene på grunnlag av størrelse alene var ikke mulig, ettersom dette til sist kunne ha ført til utelukkelse av exonet som tilsvarer OB.

Av de 192 exonene ble således i alt 7 exoner valgt

ut for videre undersøkelse. Templater for sekvensering av de 7 exonene ble fremstilt, og sekvensering ble utført. Sekvensene til de 7 exonene ble analysert, og det ble funnet at 7 var identiske og 1 var en åpenbar artefakt. Det skal særlig bemerkes at klon 1D12 inneholdt "HIV-sekvensen", dvs. arte-faktbåndet. Dette etterlot 3 exoner for videre analyse: 1F1, 2G7 og 1H3. 1F1 ble eliminert på grunn av at den ble kartlagt

utenfor det kritiske området. PCR-primere for både 1H3 og 2G7 ble valgt ut og syntetisert.

Sekvensen til exonet pa 2G7 ble bestemt og er vist i figur 10 (SEKV.ID. NR. 7). PCR-primere for 2G7 ble valgt ut og syntetisert. De delene av sekvensen som tilsvarer PCR-primerne, er understreket. Primerne som ble brukt, var:

Disse primerne amplifiserte genom-DNA med PCR-betingelser på følgende måte: 25-30 sykluser ved 55 °C ved annealering i 2 minutter, 72° forlengelse i 2 minutter, 94 °C denaturering i 1 minutt i standard PCR-buffer. Disse primerne ble også brukt til å frembringe en merket probe ved å inkludere <32>P-dCTP i PCR-reaksjonen med en tilsvarende reduksjon i mengden av kald dCTP.

En RT-PCR ble utført på mange forskjellige vevs-RNA-er, og det ble konkludert med at 2G7 ble uttrykt utelukkende i hvitt fett blant de undersøkte vev (figur 11A). Deretter ble <32>P-merket 2G7 hybridisert til en "Northern blot" av vevs-RNA-er (figur 11B) og viste at dens RNA ble uttrykt ved høyt nivå i fettvev, men ble enten ikke uttrykt eller uttrykte svært lave nivåer i alle andre vev (hvor signalene kan være resultat av fettforurensning av vevspreparatene). 10 g total-RNA fra hvert av de angitte vev ble elektroforesebehandlet på en agarosegel med formaldehyd. Proben ble hybridisert til flekken ved 65 °C i en standard hybridiseringsbuffer, Rapid Hybe (Amersham). Størrelsen på RNA-en var omtrent 4,9 kB. På dette punkt ble 2G7 betraktet som å være et levedyktig kandidatgen for OB og ble analysert videre.

D. Mutasj onspåvisning

For å bekrefte at 2G7 utkodet OB-genet var det nød-vendig å demonstrere forskjeller i nivåene av RNA-ekspresjon i

DNA-sekvensen til dette genet hos mutant, sammenlignet med villtypedyr. To separate mutasjoner av ob-genet er tilgjengelig for undersøkelse, C57BL/6 J- ob/ ob (1J) og Ckc/Smj- ob/ ob (2J). Disse vil heretter bli henvist til som henholdsvis 1J og 2J. (Uformell nomenklatur er brukt for å henvise til musestammene som ble undersøkt. Gjennom denne beskrivelsen og i tegningene skal det forstås at C57BL/6J henviser til C57BL/6J-+ /+; CKC/smj henviser til SM/Ckc-+Dac-+/+; CKC/smj- ob/ ob hen-viser til SM/Ckc-+Dac-ob2J/ob2J) . Det ble fremstilt RNA fra fettvev som var blitt isolert fra 1J, 2J og kontrolldyr. Total-RNA for hver prøve ble behandlet med DNase og så reverstranskribert under anvendelse av oligo-dT som en primer, og reverstranskriptase. Den resulterende enkelttrådede cDNA ble så PCR-amplifisert enten med 2G7-primerne (betingelser vist ovenfor) for det nedre bånd eller med kommersielt tilgjengelige aktinprimere for det øvre bånd. RT-PCR-produktene ble kjørt på en 1 % agarose-TBE-gel som ble farget med etidiumbromid (figur 12A). Ved å anvende RT-PCR ble det funnet at mens 2G7-mRNA ble uttrykt hos 1J og alle de øvrige kontrollmus, var den fullstendig fraværende hos 2J-mus. Det ble ikke påvist noe signal etter 30 sykluser med ampiifikasjon. Dette forsøket ga direkte bevis på at 2G7 tilsvarte et exon fra OB-genet .

Ettersom 2J-mutasjonen er forholdsvis ny og opprett-holdes som en koisogen stamme, var dette resultatet det første tilgjengelige bevis som indikerte at 2G7 er et exon fra OB-genet. Mutasjonen befinner seg sannsynligvis i promoterområdet som fører til total stans i mRNA-syntese. Tilstedeværelsen av et signal hos lJ-mus ved dette RT-PCR-forsøk tydet på at 1J kan bære en punktmutasjon som ikke resulterer i en stor endring i størrelse på RNA-prøven. I tillegg var 2G7-mRNA fraværende hos fire ytterligere 2J-dyr når det ble testet ved hjelp av RT-PCR.

Dette resultatet ble bekreftet ved hjelp av en "Northern blot" (figur 12B). Fettcelle-RNA ble fremstilt fra hver av stammene (C57B1/6J, 1J, CKC/smj og 2J).10 g av disse RNA-ene ble kjørt ut og blottet. Blottingen ble probet med 2G7-proben som var PCR-merkét ved amplifikasjon av materialet, dvs. bånd, i figur 11 under anvendelse av "P-dCTP ved PCR-reaksjonen. Aktin er en kontroll på mengden av RNA påfylt. Aktinsignalet er ganske likt i alle prøvene. OB-signalet er fraværende i hjernen, ettersom mRNA-en er spesifikk for fettceller .

Resultatene av Northern-analysen bekrefter at 2G7-spesifikk RNA er fraværende hos 2J-mus. ob-RNA-en er fraværende hos CKC/smj-ob/ob-mus, ettersom genet hos denne tykke mutantstammen er avbrutt slik at det ikke lages noen RNA. I tillegg ble nivået av 2G7-RNA økt ca. 10-20 ganger hos 1J samt db/ db-fett. Disse resultatene er forenlig med den hypotese at OB enten koder for hormon i omløp eller er ansvarlig for frem-bringelsen av et signal fra fettceller som modulerer kroppsvekt. Disse resultatene understøttet den konklusjon at 2G7 er OB-genet, og forutsa at lJ-mus har en punktmutasjon, sannsynligvis en nonsense-mutasjon som fører til en for tidlig translasjonsterminering.

Disse Northern-resultatene er blitt replikert under anvendelse av fettcelle-RNA-preparater fra fire forskjellige 2J-dyr (figur 13). Ved denne analysen er ap2 et fettspesifikt transkript som ble brukt som en kontroll omtrent på samme måte som aktin i figur 12B. Det er ingen signifikans i den varierende tetthet til ap2-båndet. ap2 ble merket ved å ut-forme PCR-primere fra den publiserte ap2-sekvens. RT-PCR-produktene fra fettcelle-RNA ble så på nytt merket under anvendelse av den samme fremgangsmåte for PCR-merking. Denne analysen viser tilstedeværelsen av OB-mRNA hos normale homozygote eller heterozygote dyr, og dens fravær fra 2J-mutant-dyr.

Mutasjonen er blitt identifisert hos lJ-mus. Mutasjonen er en C- til T-baseendring som resulterer i en endring i et arginin til et tilsynelatende for tidlig stoppkodon i aminosyre 108, og som sannsynligvis er ansvarlig for lJ-mutasjonen (figur 14) til tross for høynivåekspresjon av ob-mRNA-en (se figurene 12 og 13, C57BL/6J-ob/ob-felter).

Senere er "Southern blots" blitt brukt til å konklu-dere med at 2J-mutasjonen er resultatet av en påvisbar DNA-endring i 5'-enden av OB som synes fullstendig å ødelegge RNA-ekspresjon. Den nøyaktige type av denne mulige omordning gjenstår å bli bestemt.

En genom-" Southern blot" av DNA fra CKC/smj (SM/Ckc-+Dac) - og C57BL/6J-mus under anvendelse av fire forskjellige restriksjonsendonukleaser ble utført for å bestemme hvorvidt mutant-ob ga et unikt fragmentmønster (figur 15A). Omtrent 10 g DNA (utvunnet fra genom-DNA fremstilt fra lever, nyre eller milt) ble fordøyd med det angitte restriksjonsenzym. DNA-en ble så elektroforesebehandlet i en 1 % agarose-TBE-gel. DNA-en ble overført til en imobilonmembran og hybridisert til den PCR-merkede 2G7-probe. Nøkkelbåndet er det øverste bånd i Bglll-fordøyelsen for CKC/smj- ob/ ob (SM/Ckc-+DA<C>ob<2J>/ob<2J->DNA. Dette båndet er av en høyere molekylvekt enn i den andre stammen, noe som indikerer en mutasjon i denne stammen.

Figur 15B er en "Southern blot" av en Bglll-for-døyelse av genom-DNA fra avkommet fra en ob2J/ + x ob2J/ + - krysning. Noen av DNA-ene har bare det øvre bånd, noen bare

det nedre bånd, og noen har begge båndene. Dyrene med bare det øvre bånd er allo-tykke, dvs. ob2J/ ob2J. Disse dataene viser at polymorfismen (dvs. mutasjonen) vist i figur 15A segregerer i en genetisk betydning.

Eksempel 1

cDNA- kloning og sekvensbestemmelse av OB

Ved å bruke den merkede 2G7-PCR-probe ble i alt

50 muse-cDNA-kloner fra et murint fettcelle- gtll-cDNA-bibliotek (Clonetech 5<1->STRETCH-cDNA fra testikkelfettputer fra sveitsiske mus, nr. ML3005b) og 30 krysshybridiserende human-cDNA-kloner fra et humant fettcelle- gtlO-cDNA-bibliotek (Clonetech 5'-STRETCH-cDNA fra bukhule nr. HL1108a) isolert. Bibliotekscreening ble utført ved å bruke plakkløftefremgangs-måten. Filtrene fra plakkløftet ble denaturert ved å bruke autoklavmetoden. Filtrene ble hybridisert in duplo med den PCR-merkede 2G7-probe (Rapid Hybe-buffer, 65 °C, over natten) . Etter 2-4 timers forhybridisering ble filtrene vasket i 2 x SSC, 2 % SDS, to ganger i 30 minutter ved 65 °C og eksponert mot røntgenfilm. Positive resultater in duplo ble plakkrenset. Plakkrenset fag ble PCR-amplifisert under anvendelse av kommersielt tilgjengelige vektorprimere, f.eks. gtlO og

gtll. De resulterende PCR-produkter tilsvarte cDNA-innføyel-sen for hver fag med en liten mengde vektorsekvens i hver

ende. Båndene ble gelrenset og sekvensert under anvendelse av det automatiserte ABI-sekvenseringsapparat og vektorprimerne for å probe DNA-polymerasen.

Råsekvenseringsdataene ble så manuelt undersøkt base for base for å korrigere feil fra datamaskinprogrammet. Etter hvert som den korrekte sekvens ble tilgjengelig, ble ned-strømsprimerne syntetisert og brukt til å fortsette sekvensering. Slike forsøk ble gjentatt inntil hver tilgjengelig cDNA-klon var sekvensert og syntetisert til en sammenstilling. Hittil er det blitt satt sammen ca. 3000 basepar fra 5'-enden av mRNA-en. Én av cDNA-klonene strakk seg til 5<1->enden av mRNA-en, ettersom dens sekvens var identisk med sekvensen til 5'-RACE-produktet fra fettvevs-RNA (data ikke vist).

Sekvensdataene avslørte at det er en 167 aminosyrer stor åpen leseramme (figur 1). En Kozak-translasjonsinitier-ingskonsensussekvens var til stede med en adenosinrest tre baser oppstrøms for ATG. Det ble funnet to klasser av cDNA som atskilte seg fra hverandre ved innlemmelse eller utelukkelse av ett enkelt glutaminkodon. Denne resten finnes i en stilling umiddelbart 3' i forhold til spleiseakseptoren i 2G7-exonet. Ettersom CAG-kodonet i glutamin omfatter en mulig AG-spleise-akseptorsekvens, synes det som om det er glidning mellom spleiseakseptorsetet med den tilsynelatende 3 basepars dele-sjon i et undersett av cDNA-en, som vist nedenunder.

"ag" i sekvensene ovenfor tilsvarer den antatte intronsekvens oppstrøms for glutaminkodonet, og AG er det putative alternative spleisesetet. Denne glutaminresten be-

finner seg i et høykonservert område i molekylet, og dens viktighet for biologisk aktivitet er hittil ukjent.

Det ble påvist en putativ N-terminalsignalsekvens hvis signalspaltingssete•er forutsagt å være karboksyterminalt i forhold til alaninresten i aminosyrestilling 21. Denne putative signalsekvens ble bekreftet ved anvendelse av en data-maskinalgoritme for metoden til von Heijne. Ved å bruke denne teknikken ble den mest sannsynlige signalsekvens identifisert i det polypeptidkodende området som tilsvarer aminosyrene 1-23, og som har sekvensen:

hvor pilen angir det putative signalsekvensspaltingssetet. Resten av aminosyresekvensen var stort sett hydrofil og hadde ikke noen merkbare strukturmotiver eller membranomspennende domener, bortsett fra den N-terminale signalsekvens. Nærmere bestemt fant vi ikke konsensussekvenser for N-bundet glykosylering eller dibasiske aminosyresekvenser som gir indikasjon på proteinspalting i det forutsagt prosesserte protein (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease,

s. 177-223, CV. Scriver et al., red. McGraw-Hill, New York). Databasesøk under anvendelse av Blast- og Block-programmer identifiserte ikke noen homologe sekvenser.

Humant fettvevs-RNA ble analysert på "Northern

blots", en RNA-art med en lignende størrelse som muse-ob-genet ble påvist. Sekvensering og analyse av cDNA-kloner avslørte at humant OB også koder for et 167 aminosyrers polypeptid (figur 2A og B og figur 3). To klasser av cDNA, med eller uten 3 basepardelesjoner, ble funnet også hos mennesker (figur 6). Muse- og human- OB-genene var svært homologe i det forutsagte kodende området, men hadde bare 3 0 % homologi i de tilgjengelige 3'- og 5'-utranslaterte områder. En N-terminal signalsekvens var også til stede i human-OB-polypeptidet. Sammenligning av human- og muse-OB-polypeptidsekvensene viste at de to molekylene totalt hadde til felles 83 % identitet på amino-syrenivå (figur 4). N-endene av de modne proteiner fra begge arter har til felles enda høyere homologi, med bare seks

konservative og tre ikke-konservative aminosyresubstitusjoner blant de N-terminale 100 aminosyrerester.

Genom-DNA ble isolert fra mus, rotte, kanin, jord-rotte, katt, ku, sau, gris, menneske, kylling, ål og Drosophila, og restriksjonsfordøyd med EcoRI. Fordøyelsene ble elektroforesebehandlet på 1 % agarose-TBE-gel. DNA ble så overført til en imobilonmembran og probet med den PCR-merkede 2G7-probe. Filteret ble hybridisert ved 65 °C og vasket med 2 x SSC, 0,2 % SDS ved 65 °C to ganger i 20 minutter for hver vask, dvs. at det var to bufferutbyttinger. Disse dataene indikerer at OB er konservert blant virveldyr (figur 16). I dette henseende bes det lagt merke til at det er et 2+-signal i ål-DNA; ål er en fisk.

Til sammen tyder tilgjengelig bevismateriale på at kroppsvekt og fedme er regulert fysiologisk. For 7 år siden begynte man anstrengelser for å identifisere to av nøkkel-komponentene i dette systemet: OB- og DB-genene. Som vist i dette eksemplet, er OB-genet nå blitt identifisert som et fettspesifikt gen som spiller en nøkkelrolle ved regulering av kroppsvekt. Produktet av dette genet, som mest sannsynlig er et utskilt hormon, vil ha viktige implikasjoner for diagnosen og behandlingen av næringsmessige forstyrrelser hos mennesker og ikke-humane dyr.

Eksempel 2

Ekspresjon av OB i bakterier

Både murin- og human-cDNA-er som koder for ob, er blitt klonet i en pET-15b-ekspresjonsvektor (Novagen). Denne

vektoren inneholder en T7-promoter sammen med en lac-operator, og uttrykker et fusjonsprotein som inneholder et histidin-tag (His-tag) og et trombinspaltingssete umiddelbart oppstrøms for innføyelsessetet i den kodende sekvens (figur 17) (SEKV.ID. NR. 11 og 12).

Muse- og human-cDNA-ene ble modifisert slik at alaninet i enden av signalsekvensen ble omdannet til et Ndel-sete, noe som også gjaldt for en separat sekvens i 3'-området. Innføyelse av Ndel-setet ble utført ved å bruke PCR med nye primere:

Primerne inneholder en 6-basepars feilparing i midten som innfører Ndel-restriksjonsseter i hver ende av PCR-fragmentet. Fag som bærer enten muse- eller human-cDNA, ble PCR-amplifisert under anvendelse av disse primerne. PCR-produktet ble fordøyd med Ndel og gelrenset på en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt. De gelrensede bånd ble subklonet i pET-vektoren. De resulterende plasmider ble sekvensert for å sikre at mutasjoner ikke var blitt innført under PCR-amplif ikasjonstrinnet i kloning. Konstruksjoner for human- og murin-cDNA-en som koder for, og den som mangler glutamin 49, er blitt fremstilt. Særlig er det blitt fremstilt pET-15b-konstruksjoner som inneholder enten human- eller muse-0B-kodingssekvensen, minus signalsekvens og fusjonert til et His-tag, under anvendelse av en PCR-kloningsmetode. Konstruksjonen er blitt sekvensert for å sikre at det ikke ble innført noen sekvensfeil i det kodende området i OB-genet under PCR-ampli-fikasjonstrinnet.

To resulterende plasmidkonstruksjoner, pETM9 og pETH14, ble valgt ut for å transformere en bakteriell ekspresjonsvert. Etter induksjon med 1 mM IPTG under optimale betingelser var de transformerte bakterier i stand til å produsere 100-300 g/ml av OB-fusjonen. Hoveddelen av OB-fusjonsproteinet ble funnet i inklusjonslegemet. Etter oppløselig-gjøring med 6 M guanidin-HCl eller urea ble fusjonsproteinet renset gjennom en His-bindende (Ni-chelatering) harpiks-kolonne. Betingelsene for kolonnerensing av OB-fusjonsproteinet (inkludert binding, vasking og eluering) ble fastslått eksperimentelt. OB-fusjonsproteinet bindes til harpiksen ved 5 mM imidazol/6 M guanidin-HCl og forblir bundet ved opp-til 20 mM imidazol/6 M guanidin-HCl. Proteinet kan elueres fra harpiksen ved 60 mM imidazol/6 M guanidin (figur 18A, B). Både det rensede human- og muse-OB-fusjonsprotein ble ytterligere dialysert i PBS for å fjerne guanidin-HCl fra preparatet, og ble så brukt til å frembringe polyklonale antistoffer.

For å teste den biologiske aktivitet av fusjons-proteinproduktene ble refoldingsbetingelsene for det rensede protein testet og utviklet. Dette omfatter innledende dialyse av fusjonsproteinet i en 1 M guanidinoppløsning, etterfulgt av fortynning med en 0,4 M argininoppløsning. His-tag ble fjernet fra fusjonsproteinene før analysering med hensyn til biologisk funksjon, tag-fjerningen ble oppnådd ved å behandle fusjonsproteinet med trombin fra menneskemorkake.

I tillegg innføyes hver av human- og muse-OB-genkodingssekvensene minus signalsekvensen i en pET-12c-vektor under anvendelse av PCR-kloningsmetode. Disse konstruksjonene kan styre de syntetiserte OB-fusjonsproteiner inn i det periplasmatiske rom hos den bakterielle vertscelle. OB-fusjonsproteinet utvunnet fra det periplasmatiske rom kan bare trenge en enkel gelfiltrering for å bli renset fra andre vertsprote-iner, og vil ikke bli denaturert under en slik prosess.

Eksempel 3

Fremstilling av antistoffer mot OB- polypeptidet

I tillegg til bruk av det rekombinante protein til å frembringe polyklonale antistoffer ble et sett med fire peptidsekvenser fra den utledede murin-OB-sekvens identifisert, under anvendelse av immunogenisitetsplottingsprogram-vare (GCG-pakning). De fire karboksylendepeptidfragmenter er:

Disse peptidene ble konjugert til KLH, og peptid-KLH-konjugatene ble brukt til å immunisere kaniner under anvendelse av standardteknikker. Polyklonale antisera som er spesifikke for hvert peptid, utvinnes fra kaninene.

Eksempel 4

Translokasjon in vitro av et OB- polypeptid

For å bekrefte tilstedeværelsen av en funksjonell signalsekvens ble en human-cDNA som omfattet hele den åpne leseramme, subklonet i pGEM-vektoren. Bare human-cDNA-en ble brukt i dette forsøket, ettersom egnede musesubkloner ikke ble utvunnet. Positiv tråd av human-ob-RNA ble transkribert under anvendelse av Sp6-polymerase og brukt i en translasjonsreak-sjon in vitro med og uten mikrosommembraner fra hundebukspytt-kjertel. Det primære translasjonsprodukt migrerte med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 18 kD, noe som er i overensstemmelse med det som ble forutsagt ved hjelp av cDNA-sekvensen. Inklusjon av de mikrosomale membraner i reaksjonen inhiberte den totale virkningsfullhet av translasjon ca. fem ganger. Ikke desto mindre ble omtrent 50-70 % av OB-primær-translasjonsproduktet avkortet med omtrent 2 kD i nærvær av membranpreparatet, noe som tyder på at signalsekvensen er funksjonell (figur 19A). Størrelsen på det primære translasjonsprodukt av interleukin-1 -RNA, som ikke koder for en signalsekvens, var uendret når mikrosommembraner ble tatt med i reaksjonen. For å bekrefte at translokasjon av OB-proteinet hadde funnet sted ble in vitro-translasjonsproduktene behandlet med proteinase-K. Proteasebehandling resulterte i komplett proteolyse av det 18 kD store primære translasjonsprodukt, mens den 16 kD store prosesserte form var upåvirket av enzym-behandlingen, noe som indikerer at den hadde translokert inn i hulrommet i mikrosomene (figur 19B). Disse dataene er kompa-tible med den hypotese at OB er et utskilt molekyl.

Etter signalsekvensspalting vil to cysteinrester bli tilbake i det forutsagte protein, noe som frembringer den mulighet at molekylet inneholder en disulfidbinding karakteristisk for andre utskilte polypeptider [Shen et al., Science, 224:168-171 (1984)].

Eksempel 5

Karakterisering av OB- genet

For å fastslå forholdet mellom fedme og genetiske endringer i OB-genet hos mennesker ble sekvensen til human-OB-genet bestemt (figur 20A-C) (SEKV.ID. NR. 22 og 24). Spesifikke primere fra humankodingssekvensen ble brukt til å screene et human-Pl-bibliotek. Tre forskjellige Pl-kloner ble erholdt, dyrket opp og PCR-amplifisert under anvendelse av primere som flankerer spleisesetet mellom det første og det andre kodende exon. Hele intronområdet, ca. 2 kB, ble amplifisert og delvis sekvensert (se figur 20A, og som angitt i SEKV.ID. NR. 22 og 24).

Genstrukturen til både murin- og humangenet ble karakterisert ved å bruke PCR-analyser og andre standardteknikker. Muse-OB-genet ble funnet å bestå av tre exoner, hvorav det andre og det tredje utgjør den kodende sekvens (figur 20D). Det kodende området i human-OB-genet har til felles den samme struktur; humangenet mangler imidlertid et 5'-exon og -intron (figur 20E).

To sett av primere frembrakt fra intronsekvensene i humangenet er blitt fremstilt (figur 20A-C). Sekvensene til primerne følger (F og R henviser til henholdsvis forover og bakover):

DNA-prøver er blitt erholdt fra forskjellige kilder, og disse settene av primere anvendes til å amplifisere humangenom-DNA fra folk med alvorlig fedme. PCR-produktene ble kjørt på en agarosegel med lavt smeltepunkt, og båndene ble skåret ut og fordøyd med agarase. Sekvensene ble erholdt ved.å bruke ABI 373A-DNA-sekvenseringsapparatet og Taq-dideoksy-terminatorsettet (ABI, Perkin-Elmer). Én punktmutasjon i et ob-gen fra en pasientprøve er hittil blitt påvist. Denne mutasjonen er i det første exon og endrer ikke aminosyresekvensen. Preliminære data indikerer at en innføyelsessekvens kan være til stede i det første exon hos en annen pasient.

En annerledes, automatisert sekvenseringsfremgangs-måte under anvendelse av Sequenase i stedet for Taq-DNA-polymerase kan anvendes for å få lettere lesbare sekvenser for mutasj onspåvisning.

Eksempel 6

Ekspresjon av OB hos gjær

Etter den stillingsmessige kloning av OB ble det viktig å avdekke den fysiologiske mekanisme hvorved OB-proteinet reduserer matinntak og kroppsvekt. Det første trinnet i denne retning var å produsere et funksjonelt protein rekombinant under anvendelse av et ekspresjonssystem. I tillegg til det vellykkede bakterielle ekspresjonssystem ble det også valgt ut et gjærekspresjonssystem. Gjærekspresjon har flere attraktive trekk for uttrykking av OB. Det viktigste er at det er mer sannsynlig at det vil bli produsert biologisk aktive, eukaryote proteiner. OB-polypeptidet utskilles fra pattedyrceller. Proteinutskillelse er svært lik for alle eukaryoter, noe som betyr at det sekretoriske apparat hos gjær er mye mer likt det sekretoriske reaksjonsspor hos pattedyr enn det bakterielle sekretoriske reaksjonsspor vil være. Særlig vil proteinmodifikasjoner i OB som ses hos pattedyrceller, sannsynligvis også ses ved ekspresjonen gjennom det sekretoriske gjærsystem. I tillegg utføres proteinfolding ved passering gjennom det sekretoriske apparat, og avlevering av ob gjennom det sekretoriske apparat hos gjær vil sannsynligvis gi et korrekt foldet protein med naturlig forekommende biologisk aktivitet. Dette er av betydning for OB, ettersom de to cysteinrestene kan danne en disulfidbro. I motsetning til sekretoriske reaksjonsspor forhindrer det reduserende miljø i cellecytoplasma dannelse av disulfidbroer, og det er derfor av. avgjørende betydning at OB passerer gjennom det sekretoriske reaksjonsspor for at denne disulfidbinding skal dannes in vivo. Andre fordeler har å gjøre med den lettvinte og hurtige manipulering av gjær, tilgjengeligheten av vektorer og stammer og den enorme erfaring med rekombinant teknikk på gjær.

Et Pichia pastoris-ekspresjonssystem ble valgt av fire grunner: (1) det har høyere nivåer av heterolog proteinekspresjon enn andre gjærsysterner, slik som S. cerevisiae; (2) proteinglykosylering er mer lik pattedyrsystemet hos P. pastoris enn S. cerevisiae (selv om glykosyleringsseter ikke ble påvist i ob under anvendelse av et datamaskinsøk, gjensto fortsatt muligheten for glykosylering i ikke-gjenkjente seter); (3) P. pastoris utskiller svært få proteiner naturlig, og det er derfor generelt enkelt å rense det uttrykte fremmed-protein; og (4) vektorene og gjærstammene er kommersielt tilgjengelige (fra Invitrogen). To strategier for frembringelse av gjærekspresjonsvektorer er vist i figurene 21 og 22.

Den valgte vektor var pPIC.9. Denne vektoren inneholder et kloningssete like nedstrøms for " -mating"-faktor-prepro-kodingssekvensen som styrer proteinet som kodes for av genet klonet i kloningssetet til å bli utskilt ved hjelp av det sekretoriske reaksjonsspor. Det andre viktige trekk ved vektoren er et HJS4-gen som muliggjør utvelgelse for opptak av vektoren under anvendelse av en auxotrof gjærstamme dyrket på histidinmangelfullt medium etter transformasjon av gjæren med vektoren. Kloningsstrategien var som følger: PCR-amplifisering av OB-cDNA under anvendelse av en 5<1->primer som inneholder i sin 3<1->ende en sekvens som er komplementær til sekvensen til OB like etter det forutsagte lederpeptidspaltingssetet, og i sin 5'-ende en sekvens som er komplementær til 3<1->enden av " - mating"-faktorsekvensen i vektoren. 5'-primeren inneholder også et Xhol-sete. 3'-primeren ble fordøyd slik at den har i sin 3'-ende en sekvens som er komplementær til de siste få aminosyrene i OB, og et EcoRI-sete i sin 5'-ende. Etter PCR-amplif ikas jon ble PCR-produktet fordøyd med Xhol og EcoRI og klonet inn i likeledes fordøyd pPIC.9. Etter kloningen av både muse- og human-OB-cDNA-ene, hver med og uten glutaminet i kodon 49, ble individuelle kloner isolert for alle fire konstruksjonene og sekvensert for å verifisere at konstruksjonene var klonet i den korrekte orientering, og i den korrekte ramme, og ikke inneholdt noen mutasjoner fra PCR-amplif ikasjonstrinnet . Etter identifikasjon av kloner med den korrekte sekvens ble disse transformert inn i P. pastoris-stamme GS115, en histidinauxotrof.

For de to muse-OB-konstruksjonene ble transformerte gjærkloner screenet med hensyn til proteinekspresjon. Som bevis på at den transformerte gjær inneholder OB, ble det gjort en DNA-"dot-blot"-analyse og en kolonihybridiseringsanalyse som begge viste OB-sekvens i den transformerte gjær, men ikke i den utransformerte gjær. Dessuten utskilte den transformerte gjær nå et 16 kDa stort protein i dyrkningsmediet, mens den utransformerte gjær ikke utskiller et protein med denne størrelse (figur 23A). Dette er den forutsagte størrelse for OB. Det er blitt identifisert individuelle kloner for begge musekonstruksjonene som er høyekspressorer for OB, og for tiden utvikles det en rensestrategi for å rense ob til homogenitet. Én strategi har vært å rense OB på en kat-ionbytterkolonne (figur 23B); foreløpige data tyder på at det kan være nyttig med en sterk kationbytter. Etter kationbytterkromatografi går imidlertid det putative ob-produkt tapt. Dette indikerer tilstedeværelsen av en protease i prøven.

Én strategi for å overvinne dette problemet er å fremstille ob-His-tag-fusjoner■for ekspresjon i gjær (figur 22). Videre evaluering har vist at OB uten et His-tag bindes sterkt til en Ni-chelateringskolonne. Rensing av OB-polypeptidet ved hjelp av Ni-chelatering, etterfulgt av gelfiltrering, ga et produkt med tilstrekkelig renhet for masse-spektralanalyse. Massespekter bekrefter at molekylvekten til det uttrykte protein er identisk med den forventede molekylvekt, noe som sterkt bekrefter at OB med hell er blitt uttrykt i Pichia.

Rensefremgangsmåten med Ni-chelatering og gelfiltrering gir imidlertid ikke et OB-polypeptid i tilstrekkelig ren form. Ytterligere småmolekyler er til stede. Det synes som om den proteolytiske aktivitet elueres fra Ni-chelaterings-kolonnen i det tomme rom. Følgelig er det planlagt en tre-trinns rensefremgangsmåte: Ni-chelatering, etterfulgt av kationbytting (noe som eliminerer småmolekylforurensningene) , etterfulgt av gelfiltrering.

Beregning av ekspresjonsnivået ved hjelp av Coomassie-blåfarging av SDS-PAGE-geler avslører omtrent 10 mg/l når gjær dyrkes i ristekolber. Disse nivåene forventes å øke i fermentasjonsbeholdere, og vi er i ferd med å starte opp fermentasjon med håp om å oppnå store mengder protein. Når det gjelder human- OB-konstruksjonene, er det blitt identifisert transformerte gjærkloner som inneholder høye kopiantall av OB-genet, og disse forventes å uttrykke OB-protein. Etter hvert som antistoffer utvikles vil disse bli brukt til å bekrefte identiteten til det utskilte 16 kDa store protein.

Eksempel 7

Høynivåekspresjon av et OB- fusjonspeptid hos bakterier

Fremstilling av fryserstandarder

Til hver av to 4 ml aliquoter av sterilisert M9ZB-medium uten karbonkilden ble 40 1 standarddekstrose

(0,4 g/ml, filtersterilisert), 10 1 ampicillinstandard (20 0 mg/ml) og 5 1 kloramfenikolstandard (34 mg/ml, i etanol) tilsatt. En enkeltkoloni av hver av E. coli med klonet muse-og human-OBl-DNA i en Novagen pET-14b-vektor ble brukt for å inokulere disse. Rørene ble inkubert ved 37 °C over natten.

0,5 ml av kulturene som hadde stått over natten, ble brukt til å inokulere 50 ml M9ZB-medium med dekstrose, ampicillin og kloramfenikol. Disse ble inkubert ved 30 °C, og absorbansen ved 600 nm (A600) ble periodevis overvåket. Ved A600 på ca. 1-1,2 ble 175 1 aliquoter av kulturen blandet med 25 1 60 % glyserol i 2 ml Eppendorf-rør, hurtignedfryst i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C.

Kulturvekst

50 ml M9ZB-medium med 40 % dekstrose, 125 1 ampicillinstandard og 50 1 kloramfenikolstandard ble inokulert med 1 ml fryserstandard og inkubert ved 30 °C. Ved A600 på 1-1,2 ble 10 ml av denne kulturen brukt til å inokulere hver av fire 2-liters kolber med 500 ml M9ZB-medium med dekstrose, ampicillin og kloramfenikol. Disse ble inkubert ved 30 °C inntil induksjon av A600 på ca. 1-1,2 med en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM IPTG. Kulturene ble inkubert over natten. Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 4000 rpm i 20 minutter. Dette ekspresjonssystemet ga et rekombinant OB-polypeptid som en ganske høy prosentandel av det totale protein; i størrelses-orden gram/liter av E. coli.

Cellelyse og resuspensjon av inklusjonslegemer

Cellepasta ble på nytt oppslemmet i et minimalt volum av 20 mM HEPES, pH 7,2, 10 % glyserol, 0,1 M KCl, 5 mM MgCl2, 1 % aprotinin, 1 mM PMSF, 5 g/ml leupeptin og 50 g/ml DNase I. Suspensjonen ble nedfryst og opptint tre ganger under anvendelse av flytende nitrogen og lunkent vann. Lyserte celler ble sentrifugert ved 18 000 rpm i 3 0 minutter og på nytt oppslemmet i 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 NaCl. Suspensjonen ble sonikert, og Triton X100 ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 2 %. Dette ble sentrifugert i 15 minutter ved 18 000 rpm. Etter to ytterligere slike sykluser ble det gitt tre sykluser med Triton-frie vaskinger. Til sist ble pelleten oppløst i 6 M GdHCl (guanidin-HCl), 2 0 mM HEPES, pH 7,5, ved sonikering, etterfulgt av sentrifugering. Supernatanten ble brukt for videre rensing.

OB-proteinet ble renset i den ufoldede tilstand ved hjelp av immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC). Oppløsningen ble tilført en 40 ml kolonne med Pharmacia chela-terende hurtigstrømnings-Sepharose fylt med 5 kolonnevolumer 50 mM NiS04 og ekvilibrert i 6 M GdHCl, 20 mM HEPES, pH 7,5. Kolonnen ble vasket med 6 M GdHCl, 3 0 mM imidazol, 20 mM HEPES, pH 7,5. Til sist ble proteinet eluert med den samme buffer inneholdende 0,2 M imidazol. Ufoldet protein i 6 M GdHCl ble lagret ved 4 °C etter tilsetning av natriumacetat (NaAc) til 10 mM, og regulering av pH til ca. 4,5 med eddik-syre.

Refolding og rensingen av proteinet

6 M GdHCl-oppløsning inneholdende 100 mg protein ble behandlet med 67 1 1 M ditiotreitol (DTT) og fortynnet til ca. 67 ml med 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4,5. Den fikk stå under omrøring ved romtemperatur i ca. 1 time. Den ble så fortynnet i 4 1 20 % glyserol, 2,5 mM CaCl2, 2 0 mM Tris, pH 8,4, buffer med omrøring. Etter korrekt blanding fikk oppløsningen stå ved romtemperatur i ca. 8 timer uten ytterligere omrøring. Så ble 2 0 00 enheter renset bovint trombin (fra trombostat, et produkt fra Parke-Davis) tilsatt, og oppløsningen fikk' stå med forsiktig omrøring. Etter 2,5 timer ble den på nytt dosert med 2000 enheter trombin, og spaltingen av histidin-tag ble fortsatt i ytterligere 3 timer. Trombinspaltingen ble stanset ved å tilsette PMSF inntil en sluttkonsentrasjon på 0,1 mM. Opp-løsningen ble filtrert og lagret ved 4 °C.

Det spaltede protein ble renset videre på den samme IMAC-kolonne som ovenfor, ekvilibrert i 1 M KCl, 2 0 % glyserol, 20 mM HEPES, pH 8,4, buffer. Etter påfylling av protein-oppløsningen ble den vasket med den samme buffer, og det spaltede protein ble eluert med 1 M KCl, 20 % glyserol, 40 mM imidazol, 2 0 mM HEPES, pH 8,4. Uspaltet protein eluerte ved 0,2 M imidazol.

Renset, spaltet protein ble konsentrert, behandlet med 50-100 mM EDTA, 10 mM kaliumferricyanid (for å fullføre eventuell ufullstendig oksidasjon) og gelfiltrert på en Superdex 75 16/60-kolonne. Utbytter under anvendelse av denne fremgangsmåten nådde 50 % av utgangspeptidet.

Når det først er blitt renset, er det uttrykte protein blitt karakterisert ved hjelp av flere metoder. Fysisk karakterisering omfatter dynamisk lysspredning for å bestemme strukturhomogenitet, og brukt som et mål for korrekt folding. Lysspredningsdata indikerer at human-OB-polypeptidet uttrykkes hovedsakelig eller utelukkende som en monomer, mens murin-OB-polypeptidet kan finnes både som en dimer og som en monomer.

Analyser med Ellmans reagens og massespektroskopisk analyse bekrefter at cysteinrestene danner en disulfidbinding i proteinet. Denne oksiderte form av polypeptidet ble administrert til mus, som beskrevet nedenunder, og oppviste biologisk aktivitet.

Sirkulærdikroisme har vært brukt for grovt å bestemme strukturgeometrien til proteinet. CD-spektra i en fysiologisk buffer (pH ca. 8, omtrent fysiologisk ionestyrke) indikerer at human-OB-polypeptidet har ca. 60 % -helisk struktur og ca. 40 % vilkårlig oppkveilet struktur. Murin-OB-polypeptidet ble funnet å ha ca. 50 % -heliks og 50 % vilkårlig oppkveiling ved hjelp av CD-spektroskopi.

Begrenset proteolyse, etterfulgt av massespektrometri (Cohen et al., 1995, supra), er blitt anvendt for å identifisere deler av OB-polypeptidet som er tilgjengelig for proteolyse. Denne analysen har vist tilstedeværelsen av en fleksibel sløyfestruktur av aminosyrerestene 54-60 (som vist i figur 4). Det er sannsynlig at denne fleksible sløyfe binder sammen to domener med definert 2 graders struktur, f.eks. en

-heliks.

Som vist i de følgende eksempler, er det viktig at bioaktivitet av det rensede protein ble analysert ved å administrere proteinet til både magre og fete gnagere via en osmotisk pumpe (f.eks. en ALZET osmotisk pumpe fra Alza Corpo-ration, Palo Alto, CA) eller ved hjelp av daglig bolusdose i.p. over minst en 2 ukers periode, og virkninger på forings-oppførsel og kroppsvekt ble observert.

Eksempel 8

Vektreduserende effekter av OB- polypeptidet ( leptin)

Genproduktet av muse-OB-locus spiller en viktig rolle ved regulering av kroppsvekt. Det foreliggende eksempel fastslår at OB-proteinet er i omløp i muse-, rotte- og humanplasma. Formen som er i omløp hos alle tre artene, har en identisk molekylvekt ved hjelp av SDS-PAGE med den utledede polypeptidsekvens uten signalsekvensen, noe som tyder på at proteinet in vivo ikke prosesseres etter spalting av signalsekvensen. OB-proteinet var fraværende i plasma fra C57B1/6J-ob/ob-mus og til stede ved 10 ganger høyere konsentrasjoner i plasma fra db/db-mus, og 20 ganger høyere nivåer i plasma fra fa/fa-rotter i forhold til kontroller. Det er foreslått at disse tykke dyremutanter er resistente overfor effektene av OB. Det var 7 gangers forskjeller i plasmanivåer av OB-proteinet innenfor en gruppe med 6 magre humanindivider. Daglige injeksjoner av det rekombinante muse-OB-protein reduserte dramatisk kroppsvekt hos ob/ob-mus, hadde betydelige virkninger på kroppsvekt hos villtypemus, men hadde ingen effekt på db/db-mus. Disse dataene tyder på at genproduktet fra OB-stedet utøver en endokrin funksjon for å regulere kroppsvekt.

Materialer og metoder

Kaniner ble immunisert med rekombinant protein i Freunds adjuvans (HRP, Inc.). Immunrensede antimuse-OB-antistoffer ble fremstilt ved passering av antiserum over en Sepharose 4B-kolonne konjugert til det rekombinante protein, som beskrevet [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

(1988)]. Immunutfelling av museplasma ble utført på følgende måte: 0,5 ml plasma fra mus, rotte og menneske inneholdende omtrent 2,5 mM EDTA ble førklaret med ukonjugert Sepharose-4B ved romtemperatur med rugging i 2 timer. Sepharosen ble fjernet ved sentrifugering, og 50 ml av en 50 % oppslemming av antistoffkonjugert Sepharose inneholdende affinitetsrenset antistoff ved en konsentrasjon på 1 mg/ml pakket Sepharose ble tilsatt. 0,5 ml 2 x RIPA-buffer ble tilsatt, hvorved man fikk de følgende endelige bindingsbetingelser: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,5 % natriumdeoksy-cholat og 0,025 % natriumazid. Reaksjonen ble utført over natten ved 4 °C med rugging. Den antistoffkonjugerte Sepharose ble vasket åtte ganger under anvendelse av RIPA-buffer, etterfulgt av skylling tre ganger med PBS og kjørt på en 15 % SDS-PAGE. Proteinene ble overført til nitrocellulose og Western-blottet med et biotinylert, immunrenset antistoff mot det rekombinante protein. Sekundærantistoffet som ble brukt, var HRP-streptavidin, og ECL ble brukt for påvisning.

For å kvantifisere mengden av OB i museserum ble økende mengder av det refoldede rekombinante muse-OB-protein (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) tilsatt til 100 C57BL/6J-ob/ob-plasma og inkubert ved 4 °C i 3 timer med det protein A-Sepharosekonjugerte antistoff. Etter omfattende vasking med buffer A (10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 % Triton X100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) ble prøver på nytt oppslemmet i prøvebuffer, fylt på en 15 % SDS-PAGE og ble overført

til en nitrocellulosemembran. Western-blotting ble utført ved å bruke et immunrenset, biotinylert antiaminoendeantistoff som

primært antistoff og HRP-streptavidin som sekundært antistoff, etterfulgt av ECL-påvisning.

Det ble fremstilt cytoplasmaekstrakter ved å homo-genisere fettvev i NDS-buffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0,15 mM spermin, 0,5 mM spermidin, 14 mM merkaptoetanol, 0,5 M EGTA, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40) ved hjelp av polytron- og dounce-homogenisering, og fjerning av kjerner ble utført med sentrifugering ved 700 g.

Immunutfellinger ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at immunrenset antihuman-OB-antistoffer ble brukt. For ELISA ble 100 ml av en 1 mg/ml oppløsning immunrenset antihuman-OB-antistoff oppløst i en boratbufret PBS-oppløsning og påført over natten til mikrotiterplater (Corning, katalognr. 2595) ved 4 °C. Platene ble så vasket fire ganger med boratsaltoppløsning inneholdende 0,05 % Tween 20, og overskudd av væske ble fjernet. Plater ble blokkert ved inkubasjon ved romtemperatur i 2 timer med 240 ml pr. brønn av boratsaltbuffer inneholdende 0,3 % gelatin, og det ble vasket og tørket. Enten kjente mengder av et refoldet human-OB-protein eller plasmaprøver i et 100 ml volum ble inkubert i individuelle brønner over natten ved 4 °C. Etter vasking ble platene inkubert med 100 ml av et biotinylert, immunrenset antihumanantistoff (0,1 mg/ml i en gelatin-boratbufret oppløs-ning) i 4 timer ved romtemperatur. Etter vasking ble pepper-rotperoksidase (HRP)-streptavidin tilsatt til platene

(0,1 mg/ml i boratbuffer, 0,3 % gelatin). HRP-substratoppløs-ning (ABTS, 0,3 mg/ml og H202, 0,01 % i sitronsyre) ble så brukt for påvisning, og optisk tetthet ble målt ved 414 nm for å kvantifisere antistoffbindingen.

Muse- og human-OB-genkodingssekvensene ble PCR-amplifisert fra plasmider inneholdende OB-cDNA-sekvenser og subklonet i pPIC.9-plasmidet (Invitrogen). Den anvendte human-5'-primer var

og 3<1->primeren var For mus var 5<1->primeren og 3<1->primeren var

5<1->primeren for både mus og menneske inneholder et Xhol-sete i 5'-enden og kodende sekvenser for de siste fire aminosyrene i " -mating"-faktorsignalsekvensen som er til stede i vektoren pPIC.9. Denne vektoren styrer utskillelse av heterologt uttrykte gener fra cellen i dyrkningsmediet. 5'-PCR-primeren omfatter også de første 19 nukleotidene i den åpne leseramme i OB-gen etter signalsekvensspaltingssetet, før alaninet i aminosyrestilling 21. 3<1->primeren inneholder et EcoRI-sete i sin 5'-ende, som umiddelbart etterfølges av sekvenser som er komplementære til det putative OB-stoppkodon. PCR-betingelsene var som følger: denaturering i 1 minutt ved 94 °C, annealering i 1 minutt ved 55 °C og forlengelse i 2,5 minutter ved 72 °C. Lavsyklus-PCR (15 sykluser) og bevis-avlesende polymerase-PFU (Stratagene) ble brukt for å begrense antallet PCR-genererte mutasjoner. PCR-produktene ble fordøyd, med Xhol og EcoRI og klonet i likt fordøyd vektor, pPIC.9. Alle konstruksjoner ble sekvensert på begge tråder for å sikre fravær av eventuelle PCR-genererte mutasjoner. Kloner ble transformert i Pichia pastoris (His") ved hjelp av sfæroplast-metoden og valgt ut på histidinfattig medium. Omtrent 2 00 muse- og humankloner ble screenet med hensyn til høykopi-antallintegrasjon ved hjelp av en kolonihybridiseringsanalyse. Høykopiantallklonene ble så analysert med hensyn til OB-ekspresjon, først ved hjelp av Coomassie-farging som viser tilstedeværelsen av et nytt 16 kD stort protein som er til stede i dyrkningsmediet til transformerte gjær. 16 kD-båndet ble

bekreftet å være OB under anvendelse av antistoffer frembrakt mot det bakterielt uttrykte OB-protein. De rekombinante proteiner ble renset ved hjelp av en totrinns rensemetode beskrevet nedenunder. Massespektrometri og cyanbromidbehandling ble utført som beskrevet av Beavis et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6873-6877 (1990).

Hele den OB-kodende sekvens i muse- og human- OB-genene C-terminalt for signalsekvensen ble subklonet i pET-15b-ekspresjonsvektoren (Novagen) og overuttrykt i Escherichia coli [BL21(DE3)plYsS] under anvendelse av T7-RNA-polymerase-systemet [Studier et al., Meth. Enzymology, 185:80-89 (1990)]. Celler dyrket ved 30 °C inntil en absorbans på 0,7 ved 595 nm og indusert med 0,5 mM isopropyl- -D-tiogalaktopyranosid over natten ble samlet opp ved hjelp av lavhastighetssentrifuger-ing. Lyse ble utført ved hjelp av tre sykluser med nedfrysing og opptining, og DNA-fordøyelse ble utført med DNase I. Membranekstraksjon ble utført ved hjelp av sonikering og detergentoppløseliggjøring, og sluttinklusjonslegemepelleten ble oppløst i 6 M guanidin-HCl, 20 mM HEPES, pH 8,4. Rekombinante OB-proteiner ble renset under denaturerende betingelser ved hjelp av IMAC under anvendelse av en Ni-ionaffinitets-kolonne og vasking med økende mengder imidazol. Renset, denaturert OB-protein ble så lagret i 6 M guanidin-HCl, 10 mM natriumacetat (NaAc), pH 5, og redusert under anvendelse av 1 mM DTT ved romtemperatur i 1 time. Denaturering ble utført ved å fortynne det reduserte protein i 20 % glyserol, 5 mM CaCl2, 5 mM NaAc, pH 5, gjennom blanding og inkubasjon ved romtemperatur i 8-12 timer. Etter denaturering ble pH regulert til 8,4 ved tilsetning av Tris inntil 10 mM, og heksahistidin-tag ble fjernet ved trombinspalting. Spaltet, renaturert protein ble igjen renset ved hjelp av IMAC for å skille produkt fra trombin og uspaltet fusjonsprotein. Spaltet renaturert protein elueres fra Ni-ionaffinitetskolonnen ved 40 mM imidazol, mens trombin ikke beholdes, og uspaltet fusjonsprotein elueres ved 0,2 mM imidazol. Produktet ble så konsentrert, behandlet med 100 mM EDTA og 10 mM kaliumferricyanid og ytterligere renset ved hjelp av gelfiltrering under anvendelse av Pharmacia Superdex 75 16/60-kolonne.

En Ellman-analyse ble utført som beskrevet av

Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959). Ellmans reagens ble fremstilt ved å oppløse 39,6 mg 5,5 1 -ditiobis-'(2-nitrobenzosyre) (DTNB) i 10 ml 0,05 M fosfat, pH 8. En kali-breringskurve ble konstruert i konsentrasjonsområdet 10-12 0 mM fritt sulfhydryl (under anvendelse av en 1 mM standardoppløs-ning av redusert DTT) ved 412 nm. Hver analyse ble utført under anvendelse av 0,02 ml Ellmans reagens og en total reaksjonsblanding på 0,5 ml. Den målte ekstinksjonskoeffisient var 12 974 M^cm"<1> for fri sulfhydrylgruppe (korrelasjons-koeffisient 0,99987), som er innenfor 5 % av den tidligere rapporterte verdi på 13 600 M^cm"<1>. 50 ml 2 mg/ml rent gelfiltrert protein som tilsvarer en mulig fri sulfhydrylkonsentrasjon på ca. 24 mM i slutt-reaksjonsblåndingen, ble underkastet Ellmans analyse. Den resulterende oppløsning ga Am på ca. 0,02, noe som tyder på at de to cysteinrestene i proteinet er i en oksidert tilstand hvor det dannes cystin, eller at deres frie sulfhydrylgrupper er fullstendig begravd i den utilgjengelige kjerne i det foldede protein. Identiske resultater ble oppnådd ved å utføre den samme analyse på ufoldet protein i nærvær av 6 M guanidin-HCl.

Mus ble individuelt buret inn i et patogenfritt miljø og akklimatisert til en kost som inneholder 35 %

(vekt/vekt) Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9 % (vekt/vekt) tapiokapuddingblanding (General Foods) og 59,1 % vann som har et energiinnhold på 1,30 kcal/g. Kosten ble sterilisert ved hjelp av autoklav og pakket i 60 mm plast-skåler som var festet til toppene på 100 mm petriskåler. Tapioka gir kosten en deigaktig konsistens som gjør det vanskelig for dyret å spre foret i buret. Lokket med 100 mm i diameter gjenvinner den lille mengden f6r som spilles av dyret. Et nytt fat med for ble plassert i buret hver morgen,

og den forutgående dags fat ble fjernet og veid. Forskjellene i vekt ga et mål for daglig forkonsum. Effekter av rekombinant protein på forinntak og kroppsvekt ble målt hos tre stammer av mus: C57B1/6 J- ob/ ob, C57Bl/Ks- db/ db og CBA/J+/+, innkjøpt fra Jackson Laboratory. 30 mus fra hver stamme ble delt opp i grupper å 10. Én gruppe fra hver stamme fikk daglig intraperitoneale (i.p.) injeksjoner av det refoldede bakterie-ob-

protein ved en dose på 5 mg/g/dag i 3 00 1 PBS. En andre gruppe fikk i.p.-injeksjoner av det samme volum av PBS. Disse kontroilmusene fikk injeksjoner av PBS-dialysatet av det rekombinante protein. PBS ble klaret for endotoksin under anvendelse av en Acticlean ETOX-kolonne. En tredje gruppe dyr fikk ingen injeksjoner. Forinntak ble målt daglig, og kropps-vektmålinger ble registrert regelmessig i løpet av et intervall på 3,5 uker. For parforingsforsøket ble forinntaket til en separat gruppe ob-mus tilpasset på daglig grunnlag av det som ble konsumert av ob-musene som fikk protein.

Resultater

OB-proteinet er i omløp i muse-, rotte- og humanplasma

Rekombinant muse- og human-OB-protein ble fremstilt ved å bruke den bakterielle ekspresjonsvektor pET-15b (Novagen) og ved å klone i Pichia pastoris, et gjærekspresjonssystem som utskiller rekombinante proteiner direkte til dyrkningsmediet. ob-proteinet uttrykt i gjær omfatter de 146 aminosyrer karboksyterminalt til signalsekvensen. Kaniner ble immunisert med bakterieproteinene (HRP, Inc.). Antistoffer ble immunrenset (Research Genetics) og brukt til immunutfellinger og "Western blots" av protein fra plasma og fettvev.

OB-proteinet fra museplasma migrerer med en tilsynelatende molekylvekt på 16 kD ved hjelp av SDS-PAGE. Den elektroforetiske mobilitet er identisk med det rekombinante OB-protein utskilt av gjær etter signalsekvensfjerning (figur 24A). Proteinet ble ikke påvist i plasma fra C57BL/6J-ob/ob-mus som har en nonsense-mutasjon i kodonet 105. Flere forskjellige antisera identifiserte ikke den avkortede,

105 rester store polypeptidkjede forutsagt av cDNA-sekvensen.

En 10 gangers økning i nivået for protein i omløp ble observert hos db/db-mus i forhold til et kontrolldyr (figur 24A) . Immunutfelling av plasma fra villtype- og fa/ fa-rotter avslørte en 20 gangers økning i nivået av OB-protein hos mutantrotten sammenlignet med villtype (figur 24B). db-mutasjonen resulterer i en tykk fenotype som er identisk med det som ses hos ob-mus (Bahary et al., 1990, supra). Fett-rotter er fete som et resultat av en recessiv mutasjon i et gen som er homologt med db (Truett et al., 1991, supra) . For å kvantifisere nivået av OB i museplasma ble økende mengder av rekombinant protein tilsatt til serum og immunutfelt (figur 24C). En lineær økning i signalstyrken på "Western blots" kunne ses med økende mengder rekombinant protein. Sammenligning av signalstyrken til det naturlig forekommende protein hos museplasma med standardene indikerte at omløpsnivået for OB-proteinet hos villtypemus er omtrent 20 ng/ml. Disse dataene viser at' immunutfellingene og "Western blots" ble utført under betingelser med antistoffoverskudd. Forøkte nivåer av OB-proteinet ble også sett i proteinekstrakter av fettvev fra db/db-mus i forhold til kontroller (figur 24D). Som forventet for et utskilt protein fraksjonerte proteinet fra fettvevet med den urene membranfraksjon (data ikke vist).

Plasmaprøver fra 6 magre menneskeindivider med en kroppsvektindeks som er mindre enn 25 (BMI = vekt/kvadrat-lengde) ble immunologisk utfelt under anvendelse av immunologisk rensede antistoffer mot humanproteinet. Det immun-utfelte materialet forflyttet seg med en elektroforesemobili-tet som er identisk med det som ses for det 146 aminosyrer store humanprotein uttrykt i gjær. Styrken til signalene varierte betydelig mellom de 6 prøvene (figur 25A). Densito-metri av autoradiografen avslørte en omtrent fem gangers forskjell i nivåene hos individer HP1 og HP6, med mellomprodukt-nivåer for de øvrige individer. En enzymbundet immunologisk analyse (ELISA) ble utviklet ved å bruke det immunrensede antistoff og det refoldede bakterieprotein som en standard (se nedenunder). Den resulterende standardkurve er vist i figur 25B. Ved å bruke denne analysen varierte plasmanivåene for OB-proteinet i de 6 humanplasmaprøvene med mellom 2 og 15 ng/ml (figur 25C) . Nivået for OB-proteinet i. plasma fra HP6 var utenfor det lineære området for immunologisk analyse og er

> 15 ng/ml. Disse kvantitative forskjeller korrelerte med dem som ses på "Western blots".

Preliminære data tyder på at leptin kan sirkulere i det minste delvis, kompleksert til et annet protein eller andre proteiner. Denne konklusjonen ble basert på heterogenitet hos formen til titreringskurven for serum sammenlignet med rekombinant standard.. Analyse av en stor mengde leptin immunrenset på en kaninanti-OB-kolonne ved hjelp av-gelfiltrerings-HPLC under denaturerende og ikke-denaturerende betingelser, med overvåkning ved hjelp av ELISA og SDS-PAGE, tydet på at OB-polypeptidet oppførte seg som et kompleks med høyere molekylvekt. Disse dataene forblir imidlertid foreløpige; 0B-bindingsproteinet må nå karakteriseres.

Strukturelle trekk ved OB-proteinet

Ettersom OB-proteinet har to cysteinrester, kan det danne enten intra- eller intermolekylære disulfidbindinger under oksiderende betingelser in vivo. "Western blots" ble gjentatt med og uten tilsetning av reduksjonsmidler til prøve-buf feren. Under begge betingelsene migrerte OB-proteinet i menneskeserum som en monomer (data ikke vist). Under ikke-reduserende betingelser ble protein immunutfelt fra db-museserum påvist i stillinger som er i overensstemmelse med stillingene til både en monomer på 16 kD og en dimer på omtrent 32 kD (figur 26A). Den høyeste molekylvektrest forsvant under reduserende betingelser, noe som tyder på at en fraksjon av muse-OB er i omløp som en art med høyere molekylvekt via dannelse av en intermolekylær disulfidbinding. Omtrent 80 % av muse-OB er i omløp som det omtrent 16 kD store protein, og 2 0 % som den omtrent 32 kD store form.

De samme molekylformene ses når muse- og humanproteinene uttrykkes i Pichia pastoris [Abrams et al., Immunol. Rev., 5-24 (1992)]. I disse undersøkelsene ble DNA-sekvensen som tilsvarer det 146 aminosyrer store, modne OB-protein, klonet nedstrøms for gjær-" -mating"-faktorsignalsekvensen i pPIC.9-vektoren (Invitrogen). OB-proteinet ble renset fra gjærmediet med stammer som uttrykker muse- og humanproteinene, og elektroforesebehandlet under reduserende og ikke-reduserende betingelser (figur 26A). Museproteinet ble uttrykt i gjær hovedsakelig som en dimer under ikke-reduserende betingelser og bare som en monomer i nærvær av reduksjonsmidler. Det rekombinante humanprotein migrerte til stillingen til en monomer under begge betingelsene (data ikke vist).

Det rensede humanprotein uttrykt i Pichia hadde en molekylvekt på 16 024 ± 3 Da, som bestemt ved hjelp av massespektrometri, 1990 (Beavis, 1990, supra). Denne verdien er i overensstemmelse med den masse som ble beregnet ut fra aminosyresekvensen til proteinet som inneholder en enkelt intramolekylær disulfidbro (16 024 Da). Matriksassistert laser-desorpsjonsmassespektrometrisk analyse av cyanbromidspaltings-produkter av proteinet indikerer at cysteinene 117 og 167 er bundet over en intramolekylær disulfidbinding (figur 26B). Cyanbromid spalter karboksyterminalt i forhold til metioninrester.

Fremstilling og karakterisering av bioaktivt, rekombinant protein

Muse-OB-protein ble uttrykt i E. coli fra et pET-15b-plasmid som et uoppløselig fusjonsprotein, med en 20-resters, N-terminal heksa-histidin-tag inneholdende et trombinspaltingssete. Bakterielle inklusjonslegemer ble oppløseliggjort under anvendelse av guanidin-HCl og renset under denaturerende betingelser ved å anvende immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC) (figur 27). Renset, denaturert fusjonsprotein ble redusert, fortynnet og fikk refoldes i vandig oppløsning ved romtemperatur. Etter trombinspalting ble renaturert muse-OB-protein inneholdende fire ytterligere N-terminale rester (Gly-Ser-His-Met; SEKV.ID. NR. 38) på nytt renset ved hjelp av IMAC inntil > 98 % homogenitet, som benevnt ved hjelp av SDS-PAGE og massespektrometri. Matriksassistert laserdesorpsjonsmassespektrometri ga en målt vekt på 16 414 + 3 Da (forutsagt vekt = 16 415 Da). Både reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE-geler oppviste en eneste molekylart med tilsynelatende molekylvekt på 16 kD (data ikke vist).

Dynamisk lysspredning under anvendelse av en DP801 molekylstørrelsesdetektor (Protein Solutions, Inc.) viste at det renaturerte muse-OB-protein stort sett var monomert, med noen aggregater av høyere orden. Proteinet ble behandlet med EDTA og oksidert kjemisk. Høyere molekylvektarter ble så fjernet ved gelfiltrering. Ytterligere dynamisk lysspredning bekreftet at det rensede, renaturerte, rekombinante muse-OB-protein var monodisperst. Etter dialyse mot fosfatbufret salt-oppløsning (PBS) ble bakterieendotoksin fjernet under anven-deise av en Acticlean ETOX-kolonne (Sterogene Bioseparations, Inc.). Sluttutbyttet av protein var 45 mg/l.

Ellmans analyse ble utført på det rensede, renaturerte, rekombinante muse-OB-protein for å fastslå dets oksida-sjonstilstand (Ellman, 1959, supra). Både renaturert protein og protein som var utfoldet ved hjelp av 6 M guanidin-HCl, oppviste < 0,5 % fritt sulfhydrylinnhold, noe som viser at det monomere produkt inneholder en intramolekylær disulfidbinding. Dette ble bekreftet ved hjelp av massespektrometri av cyan-bromidspaltingsproduktene av det refoldede bakterieprotein (data ikke vist).

Bioaktivitet av OB-proteinet

Det rensede, renaturerte, rekombinante muse-OB-protein ble administrert som en daglig intraperitoneal injeksjon av 5 mg/kg/dag for grupper med 10 C57B1/6J- ob/ ob- (alder: 16 uker), C57B1/KS- db/ db- (alder: 12 uker) og CBA/J+/+-(alder: 8 uker) mus. Et likt antall dyr fikk PBS som en daglig injeksjon. Den anvendte PBS for kontrollinjeksjoner ble avledet fra dialysatet etter ekvilibrering av proteinet. Ti ytterligere dyr fra de tre musestammene fikk ikke injeksjoner. Forinntaket til individuelle dyr ble overvåket daglig, og vekten til dyrene registrert ved 3 eller 4 dagers intervaller. De kumulative resultatene for forinntak og kroppsvekt fra hver av de ni gruppene av mus er vist i figur 28A-F, og den statistiske signifikans for dataene er vist i tabell 1. F6rinntaket til C57Bl/6J-ob/ob-musene injisert med protein ble signifikant redusert etter den første injeksjonen og fortsatte med å avta inntil den 5. dag, da det ble stabilisert på et nivå som er likt med omtrent 40 % av inntaket til dyrene som fikk injeksjoner av PBS (p < 0,001). De falskt injiserte OB-mus tapte ikke vekt over den 3 uker lange undersøkelsesperioden. C57Bl/6J-ob/ob-musene som fikk protein, tapte omtrent 10 % av sin kroppsvekt etter 5 dager (p < 0,001). Disse dyrene fortsatte med å tape vekt over de 3 ukene med behandling, hvoretter vekten til ob-dyrene som fikk protein, hadde avtatt til et gjennomsnitt på 60 % av deres startkroppsvekt (p < 0,0001). En separat gruppe med ob-mus ble parforet i forhold til ob-musene som fikk protein. Dataene i figur 2 9B viser at de par-forede mus tapte signifikant mindre vekt enn dyrene som fikk det rekombinante protein (p < 0,02). Et fotografi av to mus som fikk injeksjoner av enten protein eller bærer, viser den store forskjellen i utseende som skrev seg fra proteinbehand-lingen (figur 29B). For ytterligere å fastslå effektene av proteinet ble det utført autopsier på to mus i hver av gruppene. Grovinspeksjon av ob-musene som fikk protein, av-slørte en dramatisk reduksjon i kroppsfett samt størrelse på leveren. Levervektene til db- og villtypemusene var uendret med behandling. Levrene fra ob-musene som fikk injeksjonene med PBS, veide 5,04 og 5,02 g vs. 2,23 og 2,03 g hos dyrene som fikk det rekombinante protein. I motsetning til den lyse fettlever som er karakteristisk for ob-mus, antok leveren fra ob-musene som fikk protein, en mørkere farge som er karakteristisk for normal lever (figur 2 9C). Histologiske snitt av leveren indikerte at de ubehandlede dyrene hadde en fettlever som ble merkbart forbedret hos proteinbehandlede dyr (data ikke vist).

I motsetning til ob-musene var det ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt eller forinntak hos C57BL/KS-db/db-musene som fikk protein i forhold til kontrollgruppen som fikk bærer (figur 28A-F, tabell 1). Alle tre gruppene med db/db-mus tapte mellom 2 og 5 g under behandlingsperioden. Den gjennomsnittlige blodglukose hos db-musene ble målt ved å bruke et glukometer og var > 500 mg/dl hos alle musene, noe som indikerer at disse dyrene hadde utviklet sukkersyke sekundært til fedme. Injeksjonene av db-mus ble avsluttet etter 2 uker.

Hos villtypemus var det en liten, men signifikant reduksjon i kroppsvekt etter administrering av det rekombinante ob-protein (figur 28A-F, tabell 1). Etter 5 dagers proteininjeksjon tapte de behandlede mus gjennomsnittlig

0,5 g, mens kontrollmus vant 0,4 g (p < 0,02). På to senere tidspunkter veide dyrene som fikk protein, signifikant mindre enn musene som fikk daglige injeksjoner av PBS. Signifikansen i vektendringen ble redusert på de seneste tidspunktene. Hos dyrene som tapte vekt, var forinntaket ikke signifikant forskjellig fra kontrolldyr. Injeksjonene av PBS hadde en liten, men signifikant effekt på forinntak og kroppsvekt hos ob-, db-

og villtypemus sammenlignet med mus som ikke fikk injeksjoner (p < 0,05) ..

Diskusjon

En endokrin funksjon for proteinproduktet fra 0B-stedet ble først foreslått av Coleman, som viste at kroppsvekten til ob/ob-mus ble redusert etter parabiotisk union med snormale eller db-mus (Coleman et al., 1978, supra). De ovenfor angitte resultater understøtter denne hypotesen ved å vise at OB-protein er i omløp i blodstrømmen, og at injeksjoner av rekombinant protein reduserer kroppsvekt. Molekylvekten til genproduktet kodet for av OB-genet er omtrent 16 kD, noe som ioer likt med den 146 store aminosyresekvensen karboksyterminalt til signalsekvensen. Det rekombinante OB-protein modifiseres ikke når det uttrykkes i Pichia pastoris. Ekspresjon av patte-dyrgener i Pichia resulterer generelt i dannelsen av den korrekte proteinstruktur [Cregg et al., Bio/Technology, 1511:905-914 (1993)]. Disse funn tyder på at OB-proteinet ikke glykosyleres og ikke prosesseres posttranslasjonelt in vivo. Dataene utelukker ikke den mulighet at OB-proteinet bindes ikke-kovalent til seg selv eller andre proteiner i plasma eller fettvev. Selv om proteolytisk spalting av proteinet ikke 2oer blitt utelukket, ble det ikke påvist lavere molekylvekt-former av OB-proteinet ved noen av de anvendte antisera, inkludert fire antipeptidantistoffer.

OB-proteinet har to cysteinrester og er i omløp som en monomer hos mennesker og som en monomer og dimer hos mus. 25En intramolekylær disulfidbinding som er typisk for utskilte molekyler, finnes når humanproteinet uttrykkes i Pichia pastoris, noe som tyder på at det sannsynligvis er til stede in vivo. Dette understøttes av bioaktiviteten av det rekombinante bakterieprotein som har en intramolekylær disulfid-30binding. Muse-OB-proteinet kan finnes i plasma som en monomer og som en dimer. Monomeren og dimeren ses når muse-OB-proteinet uttrykkes i gjær, noe som viser at sannsynligheten for at museproteinet skal danne en dimer, er et resultat av forskjeller i primærsekvensen i forhold til humanproteinet. 35Selv om det er klart at monomeren har bioaktivitet, er den funksjonelle aktivitet av dimeren ukjent.

Effekten av OB-proteinet på forinntak og kroppsvekt hos ob-mus er dramatisk. Etter 3 ukers behandling hadde ob-musene som fikk daglige injeksjoner med rekombinant.protein, tapt 40 % av sin vekt og konsumerte 40 % mer for enn kontroll-dyrene. Dessuten hadde vekten av de behandlede ob-mus fortsatt ikke ekvilibrert på tidspunktet da forsøket ble avsluttet. sResultatene av parforingsforsøket indikerer vekttap som et resultat av effekter på både forinntak og energiforbruk. En separat gruppe av ob-mus hvis kaloriinntak var begrenset til det for ob-mus som fikk protein, tapte således signifikant mindre vekt enn dyrene som fikk protein. Reduksjonen i for-loinntak hos ob/ob-mus til et lavere nivå enn hos villtypemus, innenfor en dag med mottak av OB-proteinet, indikerer at de er spesielt følsomme for dets effekter. OB-reseptoren vil faktisk kunne bli oppregulert hos disse dyrene. Forinntak hos behandlede ob-mus ble forholdsvis konstant etter 5 dagers behand-lsling. Dersom dette er et resultat av at proteinet har nådd likevektstilstandsnivåer, vil det tyde på at proteinet har en forholdsvis lang halveringstid [The Pharmacological Basis of Therapeutics, s. 19-45, Goodman og Gilman, red. Pergamon Press, New York (1990)]. Denne konklusjonen er i overensstem-20melse med data fra parabioseforsøk [Coleman et al., 1978, supra; Weigle, Int. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].

Effekter av rekombinant protein på kroppsvekten til villtypemus var små, men statistisk signifikant under de første 2 ukene av undersøkelsen. Selv om forskjellen i vekt 25mellom villtypemus som fikk protein vs. PBS ble opprettholdt på senere tidspunkter, avtok den statistiske signifikans til dataene mye etter 3 uker. Det tidlige vekttapet kunne ikke tilskrives en forskjell i forinntak. Sannsynligvis var målingen av forinntak ikke tilstrekkelig presis til å påvise 3oen reduksjon som resulterer i 1 g forskjell i kroppsvekt under behandling. Disse observasjonene atskiller seg fra resultatene av tidligere forsøk, hvor villtypegnagere er blitt knyttet sammen ved hjelp av parabiotisk union med db-mus, fa-rotter, rotter med hypotalamuslesjoner og rotter som er gjort fete ved 35hjelp av en høykalorikost [Coleman et al., 1978, supra; Harris et al., 1987, supra; Harris et al., "Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats", i Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy og Straatman, red. Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. I hvert tilfelle blir villtype-dyrene anorektiske og taper store mengder vekt. Etter hvert som nivåene av OB-protein økes hos db-mus og fa-rotter, og snivået av OB-RNA økes hos mus med hypotalamuslesjoner, er det sannsynlig at villtypemus kan gi respons på OB når det er i omløp i plasma på et tilstrekkelig høyt nivå. Funnene som her er rapportert, er i overensstemmelse med den mulighet at nivåene av det administrerte protein var under endogene lonivåer, noe som fører til ekvilibrering på en litt lavere kroppsvekt. Kvantifisering av nivåene av OB-proteinet som er i omløp hos behandlede mus, vil løse dette. Selv om en immunologisk analyse av museproteinet fortsatt ikke er tilgjengelig, har immunutfellinger tydet på at nivåene av OB-proteinet i isomløp ikke ble vesentlig forhøyet hos villtypemusene som fikk protein.

Den mindre effekt av proteinet på villtypemus og fraværet av en respons hos db-mus gjør det sannsynlig at behandlingen har ikke-spesifikke eller aversjonseffekter. Alle 20db-musene tapte en liten mengde vekt under behandlingsperioden, uansett om de fikk ob-proteinet. db-dyrene ble merkbart hyperglykemiske, og vekttapet er sannsynligvis et resultat av sukkersyke og ikke forsøksfremgangsmåten. C57BL/Ks-db/db-mus utvikler ofte sukkersyke og begynner å tape 25små mengder vekt når de har alderen til dyrene som brukes i denne undersøkelsen (Coleman et al., 1978, supra). C57B1/6J-ob/ob-mus med en lignende alder utvikler ikke signifikant hyperglykemi. Disse fenotypiske forskjeller menes å være resultat av genetiske forskjeller hos stammene (C57B1/6J vs. 3oC57Bl/fCs) som bærer mutasjonene (Coleman et al., 1978, supra) .

Mangelen på påvisning av det avkortede 105 aminosyrer lange protein forutsagt av cDNA-sekvensen til OB-genet hos C57B1/6J-ob/ob-mus tyder på at mutantproteinet enten er nedbrutt eller ikke translatert. Den mulighet at de anvendte 35antisera ikke påviser dette avkortede protein, kan imidlertid ikke utelukkes. Den observerte 10 gangers økning i nivåene av ob-proteinet hos db-mus sammenlignet med villtype tyder på at ob-proteinet overproduseres når det er resistens mot dets effekter. Disse dataene korrelerer med undersøkelser av 0B-mRNA-en. Som nevnt har tidligere forsøk vist at mutasjoner av muse-dJb- og rotte-fa-genene som kan kartlegges til homologe kromosomområder, resulterer i overproduksjon av en plasma-sfaktor som undertrykker kroppsvekt (Truett et al., 1991, supra; Coleman, 1978, supra; Hervey, 1959, supra). I begge tilfellene er det blitt foreslått at mutantdyrene er resistente overfor effektene av OB-proteinet. Denne mulighet bekreftes av den observasjon at OB-proteinet ikke har noen loeffekt på kroppsvekt eller forinntak når det administreres til db-mus.

Fedme hos mennesker kan assosieres med forøkte nivåer av OB-proteinet i plasma hos individer som er forholdsvis ikke-responsive overfor hormonet. På den annen side kan uredusert ekspresjon av OB også føre til fedme, i hvilket tilfelle "normale" (dvs. upassende lave) nivåer av proteinet vil kunne finnes. Nivåene av OB-protein i humanplasma kan således være en markør for forskjellige former av fedme. Hos en liten gruppe magre individer med BMI < 25 er lave nanogram-2onivåer av OB-protein i omløp påvisbare ved hjelp av ELISA. Det er betydningsfullt at variable konsentrasjoner ble lagt merke til, noe som tyder på at nivået av ekspresjon og/eller følsom-het overfor proteinet kan spille en rolle ved bestemmelse av kroppsvekt. 25 Virkningsstedet for OB-proteinet er ukjent. Proteinet påvirker både forinntak og energiforbruk, et funn som er i overensstemmelse med de kliniske studier som indikerer at endringer i begge systemene virker til å regulere kroppsvekt [Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332:621-628 (1995); Keesey 3oet al., "Metabolic defense of the body weight set-point", i Association for Research in Nervous and Mental Disease, s. 87-96, Stunkard og Stellar, red. Raven Press, New York (1984)]. Hypotalamusen er sannsynligvis nedstrøms for OB i reaksjonssporet som regulerer kroppsvekt, selv om det er mulig med 35direkte effekter på mange forskjellige organer.

Eksempel 9

Forøkt ekspresjon i adipocytter av OB- RNA hos mus med lesjoner 1 hypotalamus og med mutasjoner i db- stedet

Genproduktet fra det nyklonede musefedmegen (OB) ■ sspiller en viktig rolle ved regulering av fettvevsmasse. OB-RNA uttrykkes spesifikt av museadipocytter in vivo i hvert av de mange forskjellige fettcelledepotene, inkludert brunt fett. Den uttrykkes også i dyrkede 3T3-442A-preadipocyttceller som er blitt indusert til å differensiere. Mus med lesjoner i lohypotalamus, samt mus som er mutante i db-stedet, uttrykker et 2 0 ganger høyere nivå av OB-RNA i fettvev. Disse dataene tyder på at både db-genet og hypotalamus er nedstrøms for OB-genet i reaksjonssporet som regulerer fettvevsmassen, og er i overensstemmelse med tidligere forsøk som tyder på at db-stedet koder 15for OB-reseptoren. Hos db/db-mus og mus med lesjoner korrelerte kvantitative forskjeller i ekspresjonsnivået for OB-RNA med lipidinnholdet i adipocytter. Molekylene som regulerer ekspresjonsnivået til OB-genet i adipocytter, spiller sannsynligvis en viktig rolle ved bestemmelse av kroppsvekt, noe 2osom også gjelder for molekylene som formidler effekten av OB på dets virkningssted.

Materialer og metoder

25Hybridisering in situ

Hvitt fettvev fra identiske bukhuleområder hos villtype (wt)- og db-mus ble bearbeidet samtidig i henhold til den modifiserte metode beskrevet av Richardson et al., Growth, Development & Aging, 56:149-157 (1992). I korte trekk ble vev 3ofiksert i Bouins oppløsning i 2 timer ved 4 °C. De ble så dehydratisert ved seriebehandling av økende konsentrasjoner av etanol fra 10 % til 100 %,' hver gang i 5 minutter ved 4 °C. Videre inkubasjon av vev med xylen (1 time) og parafin

(2 timer) ble utført ved 65 °C. Innhyllet wt- og db/ db- fettvev 35ble snittet opp og montert ved de samme betingelser senere. Snitt ble varmet opp ved 65 °C i 1 time og behandlet med xylen og seriefortynninger av etanol fra 100 % til 50 %, hver gang i 3 minutter ved romtemperatur. En antisense-RNA-probe fra OB-

gen ble syntetisert ved hjelp av transkripsjon in vitro av linearisert OB-gen som koder for sekvens oppstrøms for en Sp6-RNA-polymerasepromoter. Hybridisering in situ ble utført nøy-aktig i henhold til Schaeren-Wiemers et al., Histochemistry, 5100:431-440 (1993).

RNA-fremstilling og celledyrkning

Total-RNA og "Northern blots" ble fremstilt som beskrevet. Vaskulære stromaceller og adipocytter ble fremstilt ioi henhold til Rodbell, og RNA fra begge fraksjonene ble fremstilt i henhold til Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbel, J. Biol. Chem., 239:375-380 (19 ). Etter subkloning ble 3T3-F442-celler dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10 % bovint fosterserum is (definert som standardmedium) [Dani et al., "Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation", i Obesity in Europe, vol. 88, s. 371-376, Bjorntorp og Rossner, red. John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. Ved sammenflyting ble celler behandlet i standardmedium supplert 2omed 2 nM trijodtyronin (T3) og 17 nM insulin. 12 dager senere ble RNA fremstilt som ovenfor.

Gulltioglukosebehandling (GTG)

2 måneder gamle CBA/J-mus av hunnkjønn ble behandlet 25med en enkelt intraperitoneal injeksjon av aurotioglukose (Sigma, katalognr. A0632) ved en dose på 0,2 mg/g i normal saltoppløsning. Kontrolldyr ble injisert med normal salt-oppløsning. Mus ble veid 1 måned etter behandlingen. Fettvevs-RNA ble isolert fra de behandlede dyrene hvis vekt hadde økt 3omer enn 20 g etter GTG-behandling.

Resultater

OB-genet ble nylig funnet å bli uttrykt i fettvev [Zhang et al., Nature, 372:425-432 (1994)]. Ettersom fettvev 35er sammensatt av mange celletyper, inkludert adipocytter, pre-adipocytter, fibroblaster og vaskulære celler, ble hybridisering in situ utført på snitt av epididymalfettputer fra normale dyr med sense- og antisense-OB-riboprober [Richardson et al., supra; Wasserman, "The concept of the fat organ", i Rodahl, Issekutz, fat as a tissue, s. 22-92, McGraw Hill, New York

(1964)]. Når antisenseproben ble brukt, var positive signaler påvisbare i alle adipocyttene i snittet (figur 3 0 - merket 5Wt). Signaler ble ikke lagt merke til når antisenseproben ble hybridisert til snitt fra hjerne (data ikke vist). Hybridisering av antisenseproben til snitt av fettvev fra C57Bl/Ks-db/db-mus ble økt i stor grad, noe som bekrefter den adipo-cyttspesifikke ekspresjon av OB-RNA, og som viser en stor loøkning i nivået av OB-RNA pr. adipocytt hos disse dyrene (figur 3 0 - merket db/ db). Mus som er mutante i db-stedet, er svært tykke som en del av et syndrom som er fenotypisk identisk med det som ses hos C57B1/6J-ob/ob-mus (Bahary et al., 1990, supra) .

is OB-RNA ble ikke syntetisert av fettvevsstromaceller separert fra adipocytter. Som forventet uttrykte celler i adipocyttfraksjonen OB-RNA under anvendelse av "Northern blots" (figur 31). Det samme resultatet ble oppnådd ved å bruke RT-PCR (data ikke vist). Disse dataene understøtter den 20konklusjon at bare adipocytter uttrykker OB-genet. Data fra dyrkede adipocytter bekrefter denne konklusjonen. Ved disse undersøkelsene ble 3T3-F442A-celler dyrket under anvendelse av betingelser som fører til lipidakkumulering, som den del av et cellulært program som fører til differensiering til adipocyt-25ter. OB-RNA ble ikke uttrykt i eksponentielt voksende celler, og heller ikke i sammenflytende 3T3-F442A-preadipocyttceller som uttrykker tidlige markører, mens differensiering av disse cellene til adipocytter førte til ekspresjon av påvisbare nivåer av OB-RNA (figur 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 30264:10119-10125 (1989)]. Nivået av OB-RNA er ekstremt sensi-tivt for kulturbetingelsene, ettersom det ikke ble observert noe budskap hos sene, ettersammenflytende celler som ikke var eksponert for insulin.

Hybridiseringsstudier viste at OB-RNA uttrykkes in 35vivo i flere forskjellige fettdepoter, inkludert epididymal-, parametrial-, abdominal-, perirenal- og inguinalfettputene (figur 32A). Det nøyaktige ekspresjonsnivå i hvert av depotene var noe variabelt, idet inguinal- og parametrialfett uttrykker lavere nivåer av OB-RNA. OB-RNA uttrykkes også i brunt fettvev, selv om nivået av ekspresjon er omtrent 50 ganger lavere hos brunt fett i forhold til de øvrige fettvevsdepoter. Disse kvantitative forskjeller korrelerer løselig med tidligere srapporterte forskjeller i cellestørrelse mellom de forskjellige fettcelledepoter [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:2-11

(1972)]. Mengden av OB-RNA i brunt fett er upåvirket av kald-eksponering (figur 32B). Ved dette "forsøket økte nivået av ikke-koblende protein-RNA (UCP) i brunt fett etter kaldekspo-lonering, mens nivået av ob-RNA ikke endret seg [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260:16250-16254 (1985)]. Til sammen bekrefter disse dataene at alle adipocytter er i stand til å produsere OB-RNA og oppvise et variabelt ekspresjonsnivå i forskjellige fettdepoter. Disse dataene understøtter den umulighet at nivået av det utkodede protein korrelerer med den totale fettvevsmasse. Nivåer av OB-RNA hos db/db-mus og mus med lesjoner i hypotalamus ble målt. Lesjoner i ventromedialhypotalamus (VMH) resulterer i fedme som en del av et syndrom som ligner det som 20ses hos ob/ ob- og db/db-mus [Bray et al., Metabolism, 24:99-117 (1975)]. Parabioseforsøk tyder på at slike lesjoner resulterer i ekspresjon av en blodbåret faktor som undertrykker forinntak og kroppsvekt (Hervey, 1959, supra). Lignende resultater legges merke til når mus som er mutante i db-stedet, 25"parabioseres" til normale mus, noe som tyder på at OB-reseptoren kan kodes for av db-stedet (Coleman et al., 1979, supra). Fedme som skriver seg fra VMH-lesjoner og db-mutasjonen, kan således være resultatet av resistens mot effekten av OB-proteinet. Dersom dette er tilfellet, vil det kunne 3oforutsis en sekundærøkning i nivåene av OB-RNA i fettvev. Hypotalamuslesjoner ble indusert hos hunn-CBA-mus under anvendelse av kjemikaliet gulltioglukose (GTG) [Debons et al., Fed. Proe, 36:143-147 (1977)]. Denne behandlingen resulterer i spesifikke hypotalamuslesjoner, hovedsakelig i 35ventromedialhypotalamus (VMH), med påfølgende utvikling av fedme i løpet av flere uker. Vanligvis resulterer en enkelt peritoneal injeksjon av GTG på 0,2 mg/g kroppsvekt i utvikling av fedme i løpet av 4 uker. 1 måned gamle hunn-CBA/J-mus (20-25 g) ble behandlet med GTG, og den etterfølgende vektøkning hos behandlede dyr og kontrolldyr er vist (tabell 2). Fettvevs-RNA ble fremstilt fra db/db-mus og fra de GTG-behandlede dyr som økte > 20 g. "Northern blots" viste en 20 gangers søkning i nivået av OB-RNA hos 2 måneder gamle db/ db- og GTG-behandlede mus sammenlignet med normale dyr (figur 33). 2 måneder gamle hunn-CBA/J-mus ble behandlet med gulltioglukose (GTG). Gulltioglukose (Sigma A0632) ble administrert intraperitonealt i normal saltoppløsning ved en dosering på 2,0 mg/g. Kroppsvekt til kontroll- og injiserte dyr ble registrert før og 1 måned etter injeksjonen. Dyr ble oppbevart fem i et bur og ble foret ad libitum. Mengden av vekt som ble vunnet 1 måned etter injeksjon, er vist i tabell 2. Dyrene med en kroppsvektøkning som er større enn 2 0 g 1 måned etter injeksjon, ble valgt ut for videre undersøkelse.

Diskusjon

Genproduktet av muse-OB-genet er i omløp i muse- og humanplasma hvor det kan virke til å regulere fettvevsmassen. Ytterligere undersøkelser vedrørende reguleringen av ekspresjon av og virkningsmekanismen til OB vil ha viktige implikasjoner for vår forståelse av det fysiologiske reaksjonsspor som regulerer kroppsvekt.

Det foreliggende eksempel viser at OB-genproduktet uttrykkes utelukkende av adipocytter i alle fettvevsdepoter. Dette resultat er i overensstemmelse med den mulighet at proteinproduktet av OB-genet korrelerer med kroppens lipid-Lager. Dessuten oppreguleres OB-RNA 2 0 ganger hos db-mus og Tius med hypotalamuslesj oner. Hos disse dyrene er det sannsynlig at den faktiske økning i nivået av OB-RNA pr. celle er =nda høyere enn 2 0 ganger, ettersom adipocyttcellestørrelsen akes omtrent fem ganger hos disse dyrene (se figur 30) (Debons et al., 1977, supra). Disse dataene plasserer db-genet og hypotalamus nedstrøms for OB i reaksjonssporet som regulerer kroppsvekt, og er i overensstemmelse med den hypotese at OB-reseptoren kodes for i db-stedet [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Den molekylære kloning av OB-reseptoren og/eller db-genet vil løse dette spørsmålet. Økningen i nivået av OB-RNA hos db/ db- og GTG-behandlede mus tyder også på en ikke-celleautonom funksjon av OB-genproduktet i fettceller [Ashwell et al., Proe. R. Soc. Lond., 195:343-353

(1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15:465-470]. Dersom det utkodede protein virket direkte på fettceller til å inhibere vekst eller differensiering, ville således overekspresjonen av villtype-OB-genet hos GTG-behandlede mus resultere i en mager fenotype.

Den mest sparsommelige forklaring på disse data er at OB-proteinet virker som et endokrint signalmolekyl som utskilles av adipocytter og virker, direkte eller indirekte, på hypotalamus. Direkte effekter på hypotalamus vil kreve at det foreligger mekanismer som lar OB-genproduktet passere over blod-hjernebarrieren. Mekanismer som involverer det omslutt-ende organ og/eller spesifikke transportører, kan gi hjerne-adgang for et molekyl med størrelsen til det som kodes for av OB-genet [Johnson et al., FASEB J., 7:678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92:1824-1830 (1993); Pardridge, Endo-crine Reviews, 7:314-330 (1986)]. Denne hypotesen må imidlertid betraktes med forsiktighet inntil midlene hvorved proteinet vil kunne krysse blod-hjernebarrieren er blitt identifisert. Dessuten vil det være nødvendig å evaluere mulige effekter på andre målorganer.

Fettcellesignalet eller -signalene som er ansvarlige for den kvantitative variasjon i ekspresjonsnivået til OB-genet, er ennå ikke kjent, men korrelerer med forskjeller i adipocyttcellestørrelse. Adipocytter fra db/db-mus er fem ganger større enn dem fra normale mus, med en cellestørrelse på omtrent 1,0 g lipid/celle (Johnson et al., 1972, supra).

["idligere bevismateriale har indikert at fettcellelipidinnhold Dg/eller størrelse er en viktig parameter ved bestemmelse av croppsvekt [Faust et al., Am. J. Physiol., 235:279-286 (1978); ?aust et al., Science, 157:393-396 (1977)]. Det kan være at iver fettcelle uttrykker et lavt nivå av OB-RNA som videre aker i forhold til cellestørrelsen. Det er også mulig at cellestørrelse ikke er den følte parameter, men kun korrelerer ned det intracellulære signal som øker ekspresjonen av OB-genet i adipocytter fra db/ db- og VMH-skadede mus. I hvert tilfelle er det sannsynlig at komponentene i signaltransduk-3jonsreaksjonssporet som regulerer syntesen av OB-RNA, er viktig ved bestemmelse av kroppsvekt. Genetiske og miljø-nessige påvirkninger som reduserer ekspresjonsnivået for OB, vil virke til å øke kroppsvekt, som også påvirkninger som ga det utkodede protein nedsatt sensitivitet. De spesifikke molekylene som regulerer ekspresjonsnivået for OB-genet, er hittil ukjent og avventer en bestemmelse av nivået eller nivåene for genkontroll som fører til kvantitativ variasjon i nivået av OB-RNA, og en undersøkelse av regulatorelementene i OB-genet. Identifikasjonen av molekylene som regulerer ekspresjonen av OB-genet i adipocytter, og de som formidler effektene av det utkodede protein på dets virkningssete(r), vil i stor grad øke vår forståelse av de fysiologiske mekanismene som regulerer kroppsvekt.

Eksempel 10

RNA- ekspresjonsmønster og kartlegging på det fysikalske, cyto-genetiske og genetiske kart over kromosom 7

OB-RNA uttrykkes ved høye nivåer i humant fettvev og ved vesentlig lavere nivåer i morkake og hjerte. Human-OB-genet kartlegges til en stor gjærartefaktkromosomsammenstil-ling (YAC) avledet fra kromosom 7q31.3. I tillegg til å bekrefte den relative lokalisering av genet basert på musehuman-komparativ kartlegging, har denne undersøkelsen identifisert åtte etablerte mikrosatellittmarkører i nær fysisk nærhet til luman-OB-genet. Ettersom mutasjoner i muse-OB kan resultere i ■ 2t syndrom som ligner svært på morbid fedme hos mennesker, atgjør disse genetiske markørene viktige redskaper for å jndersøke den mulige rolle til OB-genet i nedarvede former av Tienneskef edme.

Materialer og metoder

"Northern blot"-analyse

Total-RNA ble fremstilt fra fettvev under anvendelse av fremgangsmåten til Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299

(1979). "Northern blots", radioaktiv merking og hybridiser-inger ble utført som beskrevet (Zhang et al., 1994, supra). "Northern blots" av polyA<+->RNA (Human-MTN, human-MTN II og humanfoster-MTN II) ble erholdt fra CLONETECH (Palo Alto, CA), og det ble også PCR-primere brukt til å frembringe den radioaktivt merkede humanaktinprobe.

STS-utvikling

Sekvensmerkede sete(STS)-spesifikke PCR-analyser ble utviklet og optimalisert hovedsakelig som beskrevet [ (Green et al., PCR Methods Applic, 1991; Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, "Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites", i Methods in Molecular Genetics, vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (del A), s. 192-210, Adolph, red. Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)]. Hver STS navngis under anvendelse av forstavelsen "sWSS", etterfulgt av et unikt tall. Detaljer ved-rørende de 19 STS-er som her er rapportert, er gitt i tabell 3 med ytterligere informasjon (f.eks. PCR-reaksjonsbetingelser, komplett DNA-sekvens) tilgjengelig i GenBank og/eller Genome Data Base (GDB). For de mikrosatellittspesifikke STS-er tilsvarte oligonukleotidprimerne som ble brukt ved PCR-analysene (tabell 3) enten dem som ble anvendt for genotypeanalyse (tabell 4) eller dem som ble utformet (som oftest med datamaskinprogrammet OSP) [Hillier et al., PCR Methods Applic, 1:124-128 (1991)] under anvendelse av DNA-sekvensen som er tilgjengelig i GenBank. Tabell 3 illustrerer STS-er i YAC-sammenstillingen som inneholder human- OB-genet.

De 19 kromosom 7-spesifikke STS-er kartlagt til YAC-sammenstillingen som inneholder human-OB-genet (figur 35), er oppført. I hvert tilfelle er det angitt det tildelte "sWSS"-navn, det relevante alternative navn, det GDB-tildelte stedsnavn, STS-kilden, PCR-primersekvensene, STS-størrelsen og GDB-identifikasjonsnummeret. Kildene for STS-er er som følger: "YAC-ende" (isolert innføyeIsesende av et YAC) (Green, 1993, supra), "lambda-klon" (vilkårlig kromosom 7-spesifikk lambda-klon) (Green et al., 1991, supra; Green, 1993, supra), "genetisk markør" (mikrosatellittmarkør, se tabell 2) (Green et al., 1994, supra), "YAC-innføyelse" (vilkårlig segment fra YAC-innføyelse) og "gen" (genspesifikk STS). Legg merke til at for noen genetisk markør-spesifikke STS-er PCR-primerne som ble anvendt for å identifisere YAC-er (oppført i denne tabellen), forskjellige fra dem som ble brukt for å utføre genotypeanalyse (tabell 4), ettersom påvisningen av YAC-er som inneholder en genetisk markør, ikke krever amplifikasjon av selve det polymorfe området. Ved alle de angitte PCR-analyser ble det benyttet en annealeringstemperatur på 55 °C, bortsett fra for SWSS494, sWSS883, SWSS1529 og SWSS2619 (hvor det ble brukt 50 °C) , SWSS999 og SWSS1174 (hvor det ble brukt 60 °C) og SWSS808 (hvor det ble brukt 65 °C) . Ytterligere detaljer vedrørende de STS-spesifikke PCR-analyser er tilgjengelige i GDB.

De åtte mikrosatellittmarkørene kartlagt til YAC-sammenstillingen som inneholder human-OB-genet (figur 35), ér Dppført. I hvert tilfelle er det angitt markørnavnet (angitt som det alternative"navn i tabell 3), typen av mikrosatellitt-notiv (tetranukleotid-"tetra"-gjentakelse eller (CAjj-gjen-zakelse), det GDB-tildelte stedsnavn, primersekvensene som oenyttes for PCR-basert genotypeanalyse og GDB-identifika-3jonsnummeret. Ytterligere detaljer vedrørende PCR-analysene Dg polymorfismene er tilgjengelige i GDB.

Den human-OB-spesifikke STS (sWSS2619) ble utformet ved å anvende DNA-sekvens erholdt fra det 3'-utranslaterte området i cDNA-en. Den human- Pax4-spesifikke STS (sWSS808) ble fremkalt ved å bruke den følgende strategi. Oligonukleotid-primere som er spesifikke for muse- Pax4-genet (GGCTGTGTGAGC-AAGATCCTAGGA) (SEKV.ID. NR. 63) og (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG)

(SEKV.ID. NR. 93) [Walther et al., 1991, Genomics, 11:424-434

(1991)] ble brukt til å amplifisere et 204 bp stort fragment fra humangenom-DNA (som var det samme størrelsesprodukt som det frembrakt fra musegenom-DNA). Denne PCR-analysen var ikke egnet for å identifisere tilsvarende YAC-er, ettersom et like stort (200 bp) produkt også ble amplifisert fra gjær-DNA. DNA-sekvensanalyse av PCR-produktet frembrakt fra human-DNA av-slørte imidlertid substitusjoner i 20 stillinger blant de 156 basene som ble analysert (data ikke vist). Ved å anvende denne humanspesifikke sekvens ble det utformet en ny primer (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEKV.ID. NR. 64) som ble brukt med den første av de ovenfor nevnte muse-Pax4-spesifikke primere (se tabell 3). Den resulterende human-Pax4-spesifikke PCR-analyse amplifiserte ikke et signifikant produkt fra gjær-DNA, og ble således brukt til å identifisere tilsvarende YAC-er.

Identifikasjon av YAC-er ved hjelp av PCR-basert screening

De fleste YAC-er vist i figur 35 ble avledet fra en samling av kloner som var svært anriket på humankromosom 7-DNA ("kromosom 7 YAC-hjelpekilde") (Green et al., 1995, supra) ved å bruke en PCR-basert screeningsstrategi [Green et al., 1995, supra, Greena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:1213-1217

(1990)]. I noen få tilfeller ble kloner isolert ved hjelp av

PCR-basert screening (Greena et al., supra) av tilgjengelige totalhumangenom-YAC-biblioteker konstruert ved CEPH [Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:4256-4260 (1990)] eller ICI [Anand et al., Nucleic Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et al., Nucleic Acids Res., 18:1951-1956 (1990)]. Hvert YAC er navngitt ved å bruke forstavelsen "yWSS", etterfulgt av et unikt nummer.

Resultater og diskusjon

Undersøkelse av vevsekspresjonen av human-OB-genet ved hjelp av "Northern blot"-analyse avslørte at OB-RNA uttrykkes ved et høyt nivå i humanfettvev og mye lavere nivåer i morkake og hjerte (figur 34). Størrelsen til RNA-en (omtrent 4,5 kb) var ekvivalent hos menneske og mus samt i hvert av de uttrykkende vev. Ved disse undersøkelsene fikk man fem ganger sterkere signaler i 10 g total fettvevs-RNA enn i 2 g poly-A<+->morkake-RNA. Man fikk et fem ganger svakere signal i polyA<+->RNA fra hjerte sammenlignet med morkake. Det er beregnet at nivået av OB-RNA er omtrent 250 ganger lavere i morkake enn i fettvev. Ved dette forsøket ble OB-RNA ikke påvist i noen av de øvrige analyserte vev, inkludert hjerne, lunge, lever, skjelettmuskel, nyre og bukspyttkjertel. Ytterligere forsøk avslørte ikke OB-RNA i milt, thymus, prostata, testikkel, egg-stokk, tynntarm, tykktarm, perifere blodleukocytter eller i fosterhjerne, -lever eller -nyrer (data ikke vist). Det er mulig at OB uttrykkes ved et upåvisbart nivå (ved hjelp av "Northern blot"-analyse) i disse sistnevnte vevene eller i andre vev som ikke ble undersøkt. Det observerte ekspresjons-mønster hos menneske atskiller seg noe fra mus, hvor OB-RNA påvises nesten utelukkende i fettvev.

Sammenlignende kartlegging av OB-genområdet i muse- og human-genomene

i Muse-OB-gen befinner seg på proksimalt kromosom 6 i et område som er homologt med en del av humankromosom 7q. Gener med dette segmentet omfatter (fra nært til fjernt): Met-protoonkogenet, cystisk fibrosetransmembrankonduktansregu-

latoren ( Cftr), det parede boks-holdige gen 4 ( Pax4), OB og JcarboJcsypeptidase A (CpaJ (Zhang et al., 1994, supra, Friedman et al., 1991, supra). Hos musen ble genetisk kartlegging brukt til å vise at Pax4 er sterkt bundet til ob [Walther et al., 1991, supra; Zhang et al., 1994, supra]. Den fysiske avstand mellom OB og Pax4 ble funnet å være omtrent ett megabasepar (Mb) (Zhang et al., 1994, supra). Basert på disse sammenlignende kartleggingsundersøkelser ble det forventet at human-OB-genet ville befinne seg mellom Pax4 og CPA på kromosom 7q. Ettersom human-CFTR [Heng et al., Cell Genet., 62:108-109

(1993)] og Pax4 [Tamura et al., Cytogenet. Cell Genet., 66:132-134 (1994)] ble kartlagt ved hjelp av fluorescenshybri-disering in situ (FISH) til henholdsvis 7q31.3 og 7q32, vil dessuten den mest sannsynlige cytogene stilling til human-OB-genet være i nærheten av 7q31.3-q32-grensen.

Kartlegging av OB-genet på humankromosom 7

En STS (sWSS2619) som amplifiserer et lite segment av det 3'-utranslaterte området i human-OB-genet, ble brukt itil å screene en samling av YAC-kloner som er sterkt anriket på humankromosom 7-DNA (Green et al., 1995a, Genomics, 25:170-183), og det ble identifisert ni YAC-er (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 og yWSS5004). For å verifisere at disse YAC-ene inneholder det sautentiske human-OB-gen ble det utført to ytterligere forsøk. Først ble hver av YAC-ene testet med en andre human- OB-spesifikk PCR-analyse, og alle ble funnet å være positive (data ikke vist). Deretter ble gjær-DNA fra hver klon fordøyd med EcoRI og analysert ved hjelp av geloverføringshybridisering lunder anvendelse av en human-OB-cDNA-avledet probe. I alle tilfeller ble det sett ett enkelt hybridiserende bånd, og dette båndet hadde samme størrelse i YAC-ene og en Pl-klon som er kjent for å inneholde human-OB-genet (data ikke vist).

Ved å bruke datamaskinprogrammet SEGMAP (Green og sGreen, 1991, supra) og andre YAC-baserte STS-innholdsdata som vi har frembrakt for kromosom 7 (Green et al., 1991, supra; Green et al., 1994, supra, Green et al., 1995, supra), ble human-OB-genet funnet å befinne seg innenfor YAC-sammenstillingen vist i figur 35. Denne sammenstilling består nærmere bestemt av 43 overlappende YAC-er og 19 unikt ordnede STS-er. Detaljer vedrørende hver av de 19 STS-er er gitt i tabell 3. I tillegg til den OB-spesifikke STS inneholder sammenstillingen også en STS (sWSS808) som er spesifikk for human- Pax4-genet (Tamura et al., supra; Stapleton et al., 1993, Nature Genet., 3:292-298), 7 STS-er avledet fra kromosom 7-spesifikke YAC-er, 2 STS-er avledet fra kromosom 7-spesifikke lambda-kloner og, som er ganske viktig, 8 mikrosatellittspesifikke STS-er. Ytterligere detaljer vedrørende disse 8 genetisk markører, inkludert sekvenser til primerne som ble brukt for genotypeanalyse, er gitt i tabell 2. Legg merke til at det er rikelig YAC-basert sammenknyting gjennom sammenstillingen (dvs. det er to eller flere YAC-er som binder sammen hvert tilgrensende par av STS-er), noe som sterkt understøtter den relative rekke-følge av STS-er som er vist i figur 35.

Som vist i figur 35, er den forutsagte orientering av den human-OB-holdige YAC-sammenstilling slik at SWSS1734 er den mest sentromere STS (dvs. nærmest opp til CFTR), mens sWS-S2367 er den mest telomere STS (dvs. nærmest opp til CPA). Denne orienteringen er hovedsakelig basert på sammenlignende kartleggingsdata som plasserer Pax4 nært og OB fjernt innenfor den syntene blokk som er til stede i muse- og human-DNA (Zhang et al., 1994, supra). OB-genet kartlegges nært den telomere ende av sammenstillingen, basert på plasseringen av den 0B-spesifikke STS (sWSS2619).

Mens sammenstillingen vist i figur 35 ble utledet ved hjelp av SEGMAP uten vurdering av YAC-størrelse (for derved å fremvise STS-er like langt fra hverandre), indikerte en lignende analyse av dataene ved hjelp av SEGMAP som tok i betraktning YAC-størrelser, at totalstørrelsen til området som er dekket av sammenstillingen, er like over 2 Mb (data ikke vist). Selv om alle åtte av de mikrosatellittspesifikke STS-er (tabell 4) befinner seg innenfor et genomintervall som spenner grovt sett over 2 Mb, er de tre nærmest den telomere ende av sammenstillingen (sWSS1392, SWSS1148 og SWSS2367) særlig nært selve OB-genet (muligens innenfor et intervall som er så lite som omtrent 500 kb). Faktisk er alle tre av de sistnevnte STS-er til stede i minst ett av de human-OB-holdige YAC-er. Legg merke til at intervallet mellom human Pax4 (sWSS808) og ob (sWSS2619) er beregnet til å være omtrent 400 kb, mens dette området var forutsagt å spenne over omtrent 1 Mb hos mus (Zhang et al., 1994, supra). Endelig er også tre av YAC-ene innenfor sammenstillingen (yWSS691, yWSS999 og yWSS2935) blitt analysert ved hjelp av FISH, og hvert ble funnet å hybridisere utelukkende til 7q31.3. Ett av disse YAC-ene (yWSS691) inneholder den OB-spesifikke STS, mens de andre to klonene inneholder den Pax4-spesifikke STS.

De sistnevnte resultater er generelt i overensstemmelse med den tidligere cytogene tilskrivelse av human- Pax4 til 7q32 (Tamura et al., 1994, supra). Basert på disse dataene kan human-OB-genet anvises til cytogenetisk bånd 7q31.3.

Eksempel 11

Human- OB- polypeptid er biologisk aktivt hos mus

Grupper å 10 ob/ob-mus ble behandlet ved hjelp av i.p. injeksjon med 10 g/g/dag rekombinant (bakterielt) human-og murin-OB-polypeptid eller saltoppløsning. Etter 4 dager økte gruppen som fikk saltoppløsning med 0,3 g. Gruppen som fikk murin OB, tapte 3,2 g. Gruppen som fikk human-OB, tapte 2 g (p < 0,01 sammenlignet med saltoppløsningskontroller). Disse gruppene ble også testet med hensyn til forinntak. Dataene for forinntak er vist i tabell 5; dataene for kroppsvekt er vist i tabell 6.

Disse dataene viser at human-OB er biologisk aktiv hos raus.

Eksempel 12

En høy dose av OB påvirker villtypemus

Villtypemus (C57B16J +/?) ble behandlet med

10 g/g/dag i.p. av rekombinant murin OB, og kroppsvekten ble målt hver 4. dag. Resultatene er vist i tabell 7.

Disse dataene viser at OB påvirker kroppsvekten til villtype så vel som fete ( ob/ ob)-mus, dog i en langt mindre grad.

Eksempel 13

OB- polypeptid administrert ved hjelp av kontinuerlig pumpe-infusjon

Dette eksemplet viser at kontinuerlig innsprøyting av OB-polypeptid resulterer i vekttap hos normale mus. Normale (ikke-fete) mus ble administrert med murint ob-polypeptid via ;osmotisk pumpeinnsprøyting. En dosering på 0,5 mg protein/kg kroppsvekt/dag resulterte i et 4,62 % tap (+/- 1,34 %) fra utgangsvekten 6 dager etter innsprøyting.

Materialer og metoder

Dyr

Villtype (+/+) C57Bl6-mus ble brukt i dette eksemplet. Mus ble oppbevart alene i bur og holdt under humane forhold. Alderen til musene ved starttidspunktet var 8 uker, og dyrene ble vektstabilisert. Ti mus ble brukt i hver gruppe (vehikkel vs. protein).

Foring og vektmåling

Mus ble gitt oppmalt gnagerf&r (PMI Feeds, Inc.) i fdringsapparater for oppmalt f6r (Allentown Caging and Equip-ment), noe som muliggjorde en mer nøyaktig og følsom måling av fårinntak enn bruk av vanlig blokkfor. Vekt ble målt på samme tid hver dag (kl 1400) i et tidsrom på 6 dager. Kroppsvekt på dagen før innsprøytingen ble definert som utgangsvekt.

Kloning av murin- QB- DNA

Kloningen av murin-QB-DNA-en for ekspresjon i E. coli ble utført som følger. DNA-sekvensen utledet fra den publiserte peptidsekvens som fremkom i Zhang et al., 1994, supra, dvs. eksempel 1, supra, ble reverstranslatert under anvendelse av optimale E. coli-kodoner. De terminale klonings-setene var Xbal til BamHI. En ribosomalbindende forsterker og iet sterkt ribosomalt bindingssete ble inkludert foran det kodende området. Dupleks-DNA-sekvensen ble syntetisert ved å bruke standardteknikker. Korrekte kloner ble bekreftet ved å demonstrere ekspresjon av det rekombinante protein og tilstedeværelse av den korrekte OB-DNA-sekvens i det iboende iplasmid. Aminosyresekvensen (og DNA-sekvensen) er som følger:

Rekombinant murin met-OB-DNA (dobbelttrådet)og aminosyresekvens (SEKV,ID, NR. 94 og 95) :

Ekspresjonsvektor og vertsstamme

Plasmidekspresjonsvektoren som ble brukt til å fremstille proteinet, var pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC) deponeringsnummer 69576. Den ovenfor nevnte DNA ble ligert i ekspresjonsvektoren pCFM1656, som var blitt linearisert med Xbal og BamHI, og transformert i E. coli-vertsstamme PM5. E. coli-FM5-celler ble avledet ved Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, fra E. coli- K-12-stammen [Bachmann et al., Bacterlol. Rev., 40:116-167 (1976)] og inneholder det Integrerte lambda-fagrepressorgen cl857 [Sussman et al., CR. ^.cad. Sei., 254:1517-1579 (1962)]. Vektorproduksjon, celle-:ransformasjon og koloniutvelgelse ble utført ved hjelp av standardmetoder, f.eks. Sambrook et al., 1989, supra. Vertsceller ble dyrket i LB-medium.

Administrering av protein eller bærer

Rekombinant murint OB-polypeptid ble brukt til de foreliggende forsøk, generelt ved en konsentrasjon på ca.

3,9 mg/ml fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,4. Aminosyresekvensen (og DNA-sekvensen) som ble brukt, er angitt umiddelbart over. Protein eller bærer (på fosfatbufret saltoppløs-ning, pH 7,4) ble administrert ved hjelp av innsprøyting med osmotisk pumpe. Alzet osmotiske minipumper (Alza, Palo Alto, 2A, modell nr. 1007D) ble plassert kirurgisk i hver mus i en subkutan lomme i området under skulderen. Pumpene ble kali-brert til å administrere 0,5 ml protein i oppløsning pr. time ved en dosering på 0,5 mg protein/kg kroppsvekt/dag. Kontrolldyr fikk innsprøytet fosfatbufret saltoppløsning (pH 7,4) via en Alzet osmotisk minipumpe.

Fermentasjons fremgangsmåte

En trefasers fermentasjonsfremgangsmåte kjent som en satsvis tilført prosess ble brukt til å fremføre proteinet. Mediumsammensetninger er angitt nedenunder.

Sats

En nitrogen- og fosfatkilde ble sterilisert (ved å øke temperaturen til 122 °C i 35 minutter, 18-20 psi) i fermentasjonsbeholderen (Biolafitte, 12 liters kapasitet). Etter avkjøling ble kilder for karbon, magnesium, vitaminer og spormetall tilsatt aseptisk. En over natten-kultur (16 timer eller mer) av de ovenfor nevnte rekombinante murinprotein-produserende bakterier på 500 ml (dyrket i LB-næringsvæske) ble tilsatt fermentoren.

rilførsel I

Etter å ha nådd mellom 4,0 og 6,0 OD600 ble tilførsel I tilsatt til kulturer. Glukosen ble tilsatt ved en begren-sende hastighet for å regulere veksthastigheten ( ). Et automatisert system (kalt det distribuerende kontrollsystem) ble programmert til å regulere veksthastigheten ved 0,15 gene-rasjoner pr. time.

Tilførsel II

Etter at OD nådde 30 ble temperaturen sakte økt til 42 °C, og tilførselen ble endret til tilførsel II beskrevet nedenunder. Fermentasjonen fikk så fortsette i 10 timer med prøvetaking hver 2. time. Etter 10 timer ble innholdet i fermentoren avkjølt til under 2 0 °C og innhøstet ved sentrifugering.

Mediesammensetning:

Vitaminoppløsning (sats, tilførsel I): 0,5 g biotin, 0,4 g folinsyre og 4,2 g riboflavin ble oppløst i 450 ml H20 og 3 ml 10 N NaOH, og oppløsningen ble brakt til 500 ml med H20. 14 g pyridoksin-HCl og 61 g niacin ble oppløst i 150 ml H20 og 50 ml 10 N NaOH, og oppløsningen ble brakt til 250 ml med H20. 54 g pantotensyre ble oppløst i 2 00 ml H20, og opp-løsningen ble brakt til 250 ml. De tre oppløsningene ble slått sammen og brakt til 10 1 totalvolum.

Spormetalloppløsning (sats, tilførsel I) :

Jernklorid (FeCl3-6 H20) : 27 g/l

Sinkklorid (ZnCl2-4 H20) : 2 g/l

Koboltklorid (CoCl2-6 H20) : 2 g/l

Natriummolybdat (NaMo04-2 H20) : 2 g/l

Kalsiumklorid (CaCl2-2 H20) : 1 g/l

Kobbersulfat (CuS04-5 H20) : 1,9 g/l

Borsyre (H3B03) : 0,5 g/l

Manganklorid (MnCl2-4 H20) : 1,6 g/l

Natriumsitratdihydrat: 73,5 g/l

Renseprosess for murint OB-polypeptid

Rensing ble utført ved hjelp av de følgende trinn (med mindre annet er angitt ble de følgende trinn utført ved

4 °C) :

1. Cellepasta. E. coli-cellepasta ble oppslemmet i

5 gangers volum av 7 mM EDTA, pH 7,0. Cellene i EDTA ble videre brutt opp ved to passeringer gjennom et mikrofluidi-seringsapparat. De oppbrutte celler ble sentrifugert ved 4,2 k rpm i 1 time i en Beckman JB-6-sentrifuge med en J5-4,2-rotor. 2. Inklusjonslegemevasking nr. 1. Supernatanten fra ovenfor ble fjernet, og pelleten ble på nytt oppslemmet med 5 gangers volum av 7 mM EDTA, pH 7,0, og homogenisert. Denne blandingen ble sentrifugert som i trinn 1. 3. Inklusjonslegemevasking nr. 2. Supernatanten fra ovenfor ble fjernet, og pelleten ble på nytt oppslemmet i 10 gangers volum av 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT og 1 % de-oksycholat og homogenisert. Denne blandingen ble sentrifugert som i trinn 1. 4. Inklusjonslegemevasking nr. 3. Supernatanten fra ovenfor ble fjernet, og pelleten på nytt oppslemmet i

LO gangers volum destillert.vann, og det ble homogenisert. Denne blandingen ble sentrifugert som i trinn 1. 5. Refolding. Pelleten ble refoldet med 15 volumer LO mM HEPES, pH 8,5, 1 % natriumsarkosin (N-laurylsarkosin) /ed romtemperatur. Etter 60 minutter ble oppløsningen gjort :il 60 mM kobbersulfat og så omrørt over natten. 6. Fjerning av sarkosin. Refoldingsblandingen ble Eortynnet med 5 volumer 10 mM Tris-buffer, pH 7,5, og det ble sentrifugert som i trinn 1. Supernatanten ble samlet opp og Dlandet med risting i 1 time med Dowex l-X4-harpiks, 20-50 mesh, kloridform (ved 0,066 % totalvolum av fortynnet re-foldingsblanding. Denne blandingen ble helt over i en kolonne, og eluenten ble samlet opp. Fjerning av sarkosin ble fastslått ved hjelp av HPLC. 7. Syreutfelling. Eluenten fra trinnet ovenfor ble samlet opp og pH regulert til pH 5,5, og det ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Denne blandingen ble sentrifugert som i trinn 1. 8. Kationbytterkromatografi. pH i supernatanten fra trinnet ovenfor ble regulert til pH 4,2, og det ble fylt på CM Sepharose "Fast Flow". 20 kolonnevolumer saltgradient ble brukt ved 2 0 mM NaOAc, pH 4,2, 0 M-1,0 M NaCl. 9. HIC-kromatografi. CM Sepharose-blandingen av toppfraksjoner (fastslått fra ultrafiolett analyse) fra trinnet ovenfor ble regulert til å være 0,2 M ammoniumsulfat. En 20 kolonnevolumer reverssaltgradient ble laget ved 5 mM NaOAc, pH 4,2, med 0,4 M-0 M ammoniumsulfat. Dette materialet ble konsentrert og diafiltrert i PBS.

Resultater

Presentert nedenunder er de prosentvise (%) forskjeller fra utgangsvekt hos C57Bl6J-mus (8 uker gamle):

Ved slutten av et 6 dagers kontinuerlig innsprøyt-ingsregime tapte, som det kan ses, dyr som fikk OB-polypeptidet over 4 % av sin kroppsvekt i forhold til utgangsverdien. Dette er et vesentlig hurtigere vekttap enn det som er blitt observert med intraperitoneal (i.p.) injeksjon. Vekttap på bare 2,6-3,0 % ble sett ved slutten av en 32 dagers injek-sjonsperiode hos villtypemus (normale mus), med daglige i.p.-injeksjoner av rekombinant murint OB-polypeptid ved en dose på 10 mg/kg, og hadde ikke vært mer enn 4 % på noe tidspunkt under doseringsplanen (data ikke vist). De foreliggende data indikerer at ved en 2 0 ganger lavere dosering (0,5 mg/kg vs. 10 mg/kg) oppnås mer vekttap i løpet av et kortere tidsrom.

Resultatene som her ses, er statistisk signifikante, f.eks. -4,62 % med p < 0,0001.

Eksempel 14

Kloning og ekspresjon av en rekombinant human OB- polypeptid-analog

Dette eksemplet tilveiebringer preparater og fremgangsmåter for fremstilling av en analog rekombinant human-versjon av OB-polypeptidet.

Humanversjonen av OB-DNA ble konstruert fra murin-QB-DNA, som i eksempel 13 ovenfor, ved å erstatte området mellom Mlul- og BamHI-setene med dupleks-DNA (laget fra syntetiske oligonukleotider) hvor 20 kodonsubstitusjoner var blitt utformet. Kodoner for arginin i moden musestilling 35 og leucin i moden musestilling 74 var uendret. Mlul-setet er.vist under den heltrukne linje i sekvensen nedenunder. Denne DNA ble plassert i pCFM 1656-vektoren (ATCC deponeringsnummer 69576) på samme måte som det rekombinante murinprotein, som beskrevet ovenfor.

sRekoxnbinant human met-OB-DNA (dobbelttrådet) og aminosyresekvens (SEKV.ID. KR. 96 og 97) :

Fermentas jon

Fermentasjon av de ovenfor nevnte vertsceller for å fremstille rekombinant humant OB-polypeptid ble utført ved å bruke betingelsene og sammensetningene som er beskrevet ovenfor for rekombinant murint materiale. Resultatene ble analysert med hensyn til utbytte (gram/liter), forrensing av det rekombinante human-OB-materialet (og mindre mengder bakterie-sprotein) og korrelert for å analysere bakterieekspresjon.

Forkortelser:

Ind. + betyr timene etter induksjon av proteinekspresjon, som beskrevet i eksempel 13, for det rekombinante murin-materialet under anvendelse av pCFM 1656

O.D.: optisk tetthet, som målt ved hjelp av spektrofotometer, milligram pr. O.D.-enhet pr. liter

mg/O.D.-L: ekspresjon uttrykt som mg protein pr. O.D.-enhet pr. liter

Rensing av det rekombinante human-ob-polypeptid

Rekombinant humanprotein kan renses ved å bruke lignende fremgangsmåter som dem som er brukt for rensing av rekombinant murint protein, som i eksempel 13 ovenfor. For fremstilling av rekombinant human-OB-polypeptid ble trinn 8 iutført ved å regulere pH i supernatanten fra trinn 7 til pH 5,0 og fylle denne på en CM Sepharose-hurtigstrømningskolonne. De 20 kolonnevolumsaltgradientene ble utført ved 2 0 mM NaOAC, pH 5,5, 0 M-0,5 M NaCl. Trinn 9 ble utført ved å fortynne CM Sepharose-blandingen fire ganger med vann og regulere pH til 7,5. Denne blandingen ble gjort til 0,7 M ammoniumsulfat. En 2 0 kolonnevolumer reverssaltgradient ble gjort ved 5 mM NaOAc, pH 5,5, 0,2 M-0 M ammoniumsulfat. Ellers var trinnene ovenfor sidentiske.

Eksempel 15

Doseresponsundersøkelser

En ytterligere undersøkelse viste at det var en odoserespons på kontinuerlig administrering av OB-protein. Ved denne undersøkelsen ble villtypemus (ikke-tykke, CD-1-mus, som veide 35-40 g) administrert med rekombinant murin-OB-protein under anvendelse av lignende fremgangsmåter som i eksemplene 12 og 13. Resultatene var som følger (med % kroppsvekttap 5sammenlignet med utgangsverdi, målt som ovenfor):

Økning av dosen fra 0,03 mg/kg/dag til 1 mg/kg/dag økte, som det kan ses, vekttapet fra 3,5 % til 7,5 %. Det er også verdt å legge merke til.at doseringen på 1 mg/kg/dag på dag 14 resulterte i en 14 % reduksjon i kroppsvekt.

Eksempel 16

Effekter av leptin på kroppssammensetning hos ob/ ob- mus

16 uker gamle C57B1/6J-ob/ob-mus ble behandlet med 5 g/g/dag murint leptin, bærer eller fikk ingen behandling i 3 3 dager. Ved et andre forsøk ble 7 uker gamle ob/ob-mus behandlet med 10 g/g/dag humant leptin, murint leptin eller bærer i 12 dager. Musene ble avlivet, og total kroppsvekt, kroppssammensetning, insulinnivåer og glukosenivåer ble evaluert. Dataene fra disse forsøkene er rapportert i tabell 11.

Kroppssammensetningsdataene viser effekten av leptin på tre deler av kroppen: fettmasse, mager kroppsmasse og vann-masse. Dataene indikerer at leptin signifikant reduserer kroppsfettmasse og har en marginal effekt på mager kroppsmasse. Effektene på mager kroppsmasse var imidlertid ikke statistisk signifikante.

Sammenligning av insulin- og glukosenivåene hos leptinbehandlede og kontrollmus (ubehandlede) indikerer at leptin reduserer blodsukker- og insulinnivåer og således for-bedrer disse indisiene på sukkersyke.

Eksempel 17

Høydoseeffekter av leptin på villtypemus

Magerkontroller på ob/ob-musene (C57B16J +/?) ble injisert én gang daglig i.p. med 10 g/g murint leptin eller bærer (PBS), og kroppsvekt og forinntak ble målt over de neste 2 ukene. Det var en signifikant reduksjon i kroppsvekt fra dag

4 og utover og en signifikant reduksjon i forinntak i den første uken. Etter 1 uke kunne imidlertid ikke nivåene for forinntak skjelnes fra hverandre i de to gruppene av mus. Dyrene ble avlivet ved slutten av de 2 ukene, og kroppssammen-setningen ble bestemt. Resultatene av kroppssammensetnings-analysen er vist i tabell 12. Dataene viser en reduksjon i kroppsfett hos dyrene som fikk leptin i forhold til dyrene som fikk PBS.

Et andre forsøk viste effektene av i.p.-injeksjoner to ganger daglig med 12,5 g/g murint leptin på villtype-C57Bl/6J-mus. Det var en signifikant reduksjon i kroppsvekt og f6rinntak forbundet med to ganger daglige injeksjoner av polypeptidet. Por dette forsøket ble dyrene plassert i metabolske kamre. P6r besto av en oppmalt Purina nr. 5001 forkost. Denne kosten atskilte seg fra tidligere forsøk hvor det ble brukt kost bestående av fårkost, tapioka og vann. F6ret som ble anvendt i de metabolske kamrene, hadde således høyere kalori-innhold, noe som forklarer hvorfor mengden av konsumert f6r atskiller seg fra de dyrene som var på vannholdig kost.

Det følgende er en liste med referanser relatert til beskrivelsen ovenfor, og særlig til forsøksfremgangsmåtene og diskusjonene.

Bahary et al., Genomics, 11:33-47 (1991),

Bahary et al., Genomics, 13:761-769 (1992),

Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991), Blank et al., Mammalian Genome, I:s51-s78 (1991),

Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences, £30:100-115 (1991),

Friedman et al., Mammalian Genome, 1:130-144 (1991), Harris, FASEB J., 4:3310-3318 (1990),

Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315:96-100

(1986) ,

Kessey, i Obesity, s. 144-166, Stunkard, red. Phila-delphia, W.B. Sauders Co. (1980),

Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22

(1986),

Leibel et al., "Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity", i Genetic Variation and Nutrition, s. 90-101.1, Simopoulos and Childs, red. S. Karger, Basel (1990),

Siegel et al., Cytogenet. Cell Genet., 61(3):184-185

(1992) .

Forskjellige referanser er angitt i denne beskrivelsen, og hver enkelt er her inkorporert ved henvisning i sin helhet.

Oppfinnelsen slik den er krevd er muliggjort i overensstemmelse med beskrivelsen ovenfor og lett tilgjengelige referanser og utgangsmaterialer. Ikke desto mindre har søkerne den 9. august 1995 gjort de følgende deponeringer ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, USA, i henhold til reguleringene i Budapest-konvensjonen vedrørende internasjonal anerkjennelse av depo-neringen av mikroorganismer for patentformål: E. coli H14 som bærer plasmid pETH14, deponeringsnummer 69880, og E. coli M9 som bærer plasmid pBTM9, deponeringsnummer 69879.

Claims

1. Anvendelse av et antistoff som spesifikt binder til et OB-polypeptid under betingelser som tillater dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet for måling av tilstedeværelsen av OB-polypeptidet i en prøve, tilveiebrakt fra et individ, hvor OB-polypeptidet: har evnen til å modulere kropsvekt hos et dyr, har fra omtrent 145 til omtrent 167 aminosyrer, og omfatter aminosyresekvensen sekv. id. nr.: 2, 4, 5 eller 6 eller omfatter en allelvariant derav, en analog derav eller et fragment derav, der allelvarianten, analogen eller fragmentet har samme biologiske aktivitet som nevnte aminosyresekvens sekv. id. nr.: 2, 4, 5 eller 6, og hvori nevnte anvendelse omfatter: (a) at en prøve som er mistenkt for å inneholde et OB-polypeptid, bringes i kontakt med et antistoff som spesifikt bindes til OB-polypeptidet under betingelser som tillater dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet, og (b) å påvise dannelsen av reaksjonskomplekser som omfatter antistoffet og OB-polypeptidet i prøven, hvori påvisning av dannelsen av reaksjonskomplekser indikerer tilstedeværelsen av OB-polypeptid i prøven.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori antistoffet bindes til en fastfasebærer.

3. Anvendelse ifølge krav 1, som videre omfatter et trinn (c) som blir utført etter nevnte trinn (b) er utført, hvori nevte trinn (c) omfatter: (c) in vi tro-evaluering av mengden av reaksjonskomplekser som dannes, der mengden av reaksjonskomplekser tilsvarer nivået av OB-polypeptid i prøven.

4. Anvendelse ifølge krav 2, som videre omfatter et trinn (c) som blir utført etter trinn (b) er utført, hvori nevte trinn (c) omfatter: (c) in vi tro-evaluering av mengden av reaksjonskomplekser som dannes, der mengden av reaksjonskomplekser tilsvarer nivået av OB-polypeptid i prøven.

5. Anvendelse ifølge krav 3, som videre omfatter et trinn (d) som blir utført etter nevnte trinn (c), hvori nevnte trinn (d) omfatter: d) sammenligning av OB-polypeptidnivået i prøven som blir evaluert ved å utføre nevnte trinn (c) til et 0B-polypeptidnivå som- er til stede i normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt: hvori en forhøyelse av OB-polypeptidnivået i prøven som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller hos nevnte individ på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et forhøyet OB-polypeptidnivå, og hvor et nedsatt OB-polypeptidnivå i prøven sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller hos nevnte individ på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med nedsatt OB-polypeptidnivå.

6. Anvendelse ifølge krav 4, som videre omfatter et trinn (d) som blir utført etter nevnte trinn (c), hvori nevnte trinn (d) omfatter: d) sammenligning av OB-polypeptidnivået i prøven som blir evaluert ved å utføre nevnte trinn (c) til et OB-polypeptidnivå som er til stede i normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt: hvori en forhøyelse av OB-polypeptidnivået i prøven som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller hos nevnte individ på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et forhøyet OB-polypeptidnivå, og hvor et nedsatt OB-polypeptidnivå i prøven sammenlignet med OB-poly-hos nevnte invivid på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med nedsatte OB-polypeptidnivåer.

7. Anvendelse ifølge krav 3, hvori anvendelsen videre omfatter å overvåke en terapeutisk behandling av en sykdom forbundet med et forhøyet eller nedsatt OB-polypeptidnivå i nevnte individ, hvori nevnte individ er et individ som gjennomgår en terapeutisk behandling for nevnte sykdom, og hvori nevnte trinn (c) i anvendelsen ytterligere omfatter: evaluering av OB-polypeptidnivået i en serie av prøver tilveiebrakt fra individet ved forskjellige tidspunkt.

8. Anvendelse ifølge krav 4, hvori anvendelsen videre omfatter å overvåke en terapeutisk behandling av en sykdom forbundet med et forhøyet eller et nedsatt OB-polypeptidnivå hos individet, hvori individet er et individ som gjennomgår en terapeutisk behandling av nevnte sykdom, og hvori nevnte trinn (c)i anvendelsen videre omfatter: evaluering av OB-polypeptidnivået i en serie av prøver tilveiebrakt fra individet ved forskjellige tidspunkt.

9. Anvendelse ifølge krav 7, som videre omfatter et trinn (d) som blir utført etter nevnte trinn (c), hvori nevnte trinn (d) omfatter: (d) sammenlingning av det evaluerte OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre nevnte trinn (c) med et OB-polypeptidnivå som er til stede hos normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt, hvori en forhøyelse av OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre nevnte trinn (c) som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et forhøyet OB-polypeptidnivå, og hvor en nedsettelse av OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre trinn (c) som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller hos nevnte invivid på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et nedsatt OB-polypeptidnivå.

10. Anvendelse ifølge krav 8, som videre omfatter et trinn (d) som blir utført etter nevnte trinn (c), hvori nevnte trinn (d) omfatter: (d) sammenlingning av det evaluerte OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre nevnte trinn (c) med et OB-polypeptidnivå som er til stede hos normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt, hvori en forhøyelse av OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre nevnte trinn (c) som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller i nevnte individ på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et forhøyet OB-polypeptidnivå, og hvori en nedsettelse av OB-polypeptidnivået tilveiebrakt ved å utføre trinn (c) som sammenlignet med OB-polypeptidnivået som er til stede hos normale individer eller hos nevnte invivid på et tidligere tidspunkt, indikerer en påvisning av, eller en diagnose på, en sykdom forbundet med et nedsatt OB-polypeptidnivå.