HU223563B1 - Testtömeg modulátorok, megfelelő nukleinsavak és proteinek, és ezek diagnosztikai és gyógyászati felhasználása - Google Patents

Testtömeg modulátorok, megfelelő nukleinsavak és proteinek, és ezek diagnosztikai és gyógyászati felhasználása Download PDF

Info

Publication number
HU223563B1
HU223563B1 HU9901249A HU9901249A HU223563B1 HU 223563 B1 HU223563 B1 HU 223563B1 HU 9901249 A HU9901249 A HU 9901249A HU 9901249 A HU9901249 A HU 9901249A HU 223563 B1 HU223563 B1 HU 223563B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polypeptide
seq
histidine
sequence
protein
Prior art date
Application number
HU9901249A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT78052A (hu
Inventor
Stephen K. Burley
Jeffrey M. Friedman
Ketan Gajiwala
Jeffrey L. Halaas
Margherita Maffei
Ricardo Proenca
Yiying Zhang
Original Assignee
The Rockefeller University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/292,345 external-priority patent/US6001968A/en
Priority claimed from US08/438,431 external-priority patent/US6429290B1/en
Application filed by The Rockefeller University filed Critical The Rockefeller University
Publication of HUT78052A publication Critical patent/HUT78052A/hu
Publication of HU223563B1 publication Critical patent/HU223563B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát emlősök testtömegének csökkentésére képes OBpolipeptid és azonos biológiai aktivitással rendelkező származékai,emlősök testtömegének növelésére képes OB-polipeptid-antagonisták,valamint az említett peptideket kódoló DNS-molekulák és ezen DNS-molekulák kifejezésére képes transzformált gazdaszervezetek, valamintaz általuk termelt peptidek tisztítási eljárásai képezik. Az említetttesttömegmodulátor-peptidek és/vagy azokat kódoló DNS-molekulákfelhasználhatók gyógyszerkészítmények hatóanyagaként elhízottsággalvagy kóros soványsággal összefüggő betegségek diagnózisában éskezelésében. A találmány tárgyát képezik még biológiai mintákban OBpolipeptidek kimutatására szolgáló eljárások is. ŕ

Description

A találmány tárgyát általánosan emlősök - beleértve állatokat és embereket - testtömegének kontrollja, és részletesebben itt testtömeg-modulátorokként azonosított anyagok, és olyan diagnosztikai és terápiás alkalmazások képezik, amelyekhez ilyen modulátorok bevethetők.
A zsírtalan húsos testtömeghez viszonyított testzsír fölöslegeként definiált elhízottság összefüggésben van fontos pszichológiai és testi betegségekkel, az utóbbiak közé tartozik a magas vérnyomás (hypertensio), megemelkedett vérlipidszint, és a II. típusú vagy nem inzulinfüggő cukorbaj (NIDDM=non-insulin dependent diabetes mellitus). AZ USA-ban 6-10 millió NIDDM-ben szenvedő egyén van, beleértve a 65 éves népesség 18%-át [Harris et al., Int. J. Obes. 11, 275-283 (1987)]. NIDDM-ben szenvedők közül körülbelül 45% férfi és 70% nő elhízott, és cukorbajuk lényegesen javul vagy megszűnik a testtömeg csökkenésével [Harris, Diabetes Care 14 (3), 639-648 (1991]. Ahogyan azt lent leírjuk, mind az elhízottság, mind az NIDDM erősen örökletes, jóllehet a hajlamosító géneket még nem azonosították. Ezeknek a metabolikusan rokon rendellenességeknek a molekuláris genetikai alapja fontos, kevéssé értett probléma.
A táplálék energiájának asszimilációja, raktározása és hasznosítása egy komplex homeosztatikus rendszert alkot, központban a többsejtű élőlény túlélésével. Szárazföldi emlősök körében a metabolikus üzemanyag nagy mennyiségeinek trigliceridekként zsírszövetben történő tárolása döntő jelentőségű az élelemtől való megfosztottság periódusainak túlélésében. A szükség energiatartalékok állandó szintjének a fenntartására a szervezet méretének és alakjának állandó változásai nélkül, megkívánja az energiabevitel és -felhasználás közötti egyensúly elérését. Az energia-egyensúlyt szabályozó molekuláris mechanizmusok azonban magyarázatra várnak. Olyan molekulák izolálása, amelyek részt vesznek a táplálkozási információ transzdukciójában és ellenőrzik az energia-egyensúlyt, kritikus a testtömeg szabályozásának megértésében egészségben és betegségben.
Egy egyénnek a kövérségi szintje nagymértékben genetikailag meghatározott. A testtömeg és kövérség arányok összhangjának vizsgálata egypetéjű és kétpetéjű ikrek, vagy adoptáltak és azok biológiai szülei körében azt sugallták, hogy az elhízottság örökölhetősége (0,4-0,8) felülmúl sok egyéb olyan jellemző vonást, amelynek gyakran jelentős genetikai okot tulajdonítanak, úgymint skizofréniát, alkoholizmust és érelmeszesedést (atherosclerosis) [Stunkard et al., N. Engl. J. Med. 322, 1483-1487 (1990)]. Az energiafelhasználás arányainak családi hasonlóságairól szintén beszámolnak [Bogardus et al., Diabetes 35, 1-5 (1986)]. Földrajzilag elhatárolt népességek genetikai analízise felvetette, hogy a géneknek viszonylag kis száma tehető felelőssé a test összetételének 30-50%-os eltéréséért [Moll et al., Am. J. Hűm. Génét. 49, 1243-1255 (1991)]. Azonban az általános népességben az elhízásért felelős gének egyikét sem térképezték föl meghatározott kromoszomális elhelyezkedésükre nézve.
Az elhízás rágcsálómodelljei hét, nyilvánvalóan egyedülálló génmutációt tartalmaznak. A legintenzívebben tanulmányozott egérelhízási mutációk az ob (obese=elhízott) és db (diabetes=cukorbaj) gének. Ha ugyanazon genetikai származási háttérben van jelen, ob és db megkülönböztethetetlen metabolizmusú és viselkedésű fenotípust eredményez, felvetve azt, hogy ezek a gének ugyanazon fiziológiai útvonalon működnek [Coleman et al., Diabetologia 14, 141-148 (1978)]. Mindegyik mutációra nézve homozigóta egerek túlzottan falánkak és túlzott metabolizmusúak, ez elhízott fenotípushoz vezet, amely egy hónapos korban észrevehető. Ezeknek az állatoknak a tömege 60-70 g-on stabilizálódik (összehasonlítva a kontroliegerek 30-35 g-jával). Az ob és db állatokban számtalan egyéb hormonális és metabolikus változás jut kifejezésre, amely nehézzé tette a mutációnak tulajdonítható elsődleges hiba azonosítását [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr. 50, 891-902(1989)].
Minden egyes elhízott rágcsálómodellnél olyan kísérő változások vannak a szénhidrát-metabolizmusban, mint a II. típusú cukorbaj az emberben. Néhány esetben a cukorbaj komolysága részben a háttér egértörzstől függ [Leiter, Endocrinology 124, 912-922 (1989)]. Veleszületetten ob és db C57BL/Ks egerekben komoly cukorbaj fejlődik ki végső β-sejtelhalással (necrosis) és szigetecskesorvadással (isiét atrophy) viszonylagos inzulinopéniát eredményezve. Ezzel ellentétben veleszületetten ob és db C57BL/6J egerekben átmeneti inzulinrezisztens cukorbaj fejlődik ki, amelyet végül βsejttúltengés (hypertrophy) ellensúlyoz, humán II. típusú cukorbajhoz hasonlóan.
Az ob és db egerek fenotípusa a humán elhízottsághoz hasonló - más módokon mint a cukorbaj kifejlődése -, a mutáns egerek többet esznek és kevesebb energiát használnak föl, mint a sovány kontrollok (ahogyan az elhízott emberek is teszik). Ez a fenotípus azokhoz az állatokhoz is hasonló, amelyeknek a ventromediális hipotalamuszában sérülések keletkeztek, amely azt sugallja, hogy mindkét mutáció megakadályozza a táplálkozási információ megfelelő integrálását és válaszadást a központi idegrendszeren belül. Ennek a hipotézisnek az alátámasztását adják parabiózis-kísérletek eredményei [Coleman, Diabetologia 9, 294-298 (1973)], amelyek felvetik, hogy ob egerekből hiányzik a keringő jóllakottsági faktor, és hogy db egerek érzéketlenek az ob faktor hatásaira (valószínűleg egy ob receptorhibának köszönhetően). Ezek a kísérletek ahhoz a következtetéshez vezettek, hogy ezekben a mutáns egerekben az elhízást a test összetételét ellenőrző, szükséges feedback-mechanizmusnak egy afferens loop és/vagy integráló központjában bekövetkező különböző hibák eredményezhetik.
Molekuláris és klasszikus genetikai markerek alkalmazásával feltérképezték az ob és db géneket egyenként a közeli 6. kromoszómán és 4. középső kromoszómán [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics 11, 1054-1062 (1991)]. A mutációk mindkét esetben az egérgenom olyan régióit térképezik fel, amelyek össz2
HU 223 563 Bl hangban vannak humán genomrégiókkal, azt sugallva, hogy ha léteznek ob és db humán homológok, ezeket hasonlóan lehet feltérképezni, külön-külön a humán 7q és lp kromoszómákon. Hibák a db génben más emlősfajban is elhízást eredményezhetnek: Zuckerfa/fa patkányok és Brown Norway +/+ patkányok közötti genetikai keresztezésben a fa mutációt (patkány 5. kromoszóma) ugyanazok a lókuszok szegélyezik, mint amely a db-t egérben [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7806-7809 (1991)].
A számtalan faktor miatt, amelyek úgy tűnik, befolyásolják a testtömeget, még nem sikerült előre megmondani mely faktorok, és részletesebben, mely homeosztatikus mechanizmusok a testtömeg elsődleges meghatározói. így tehát a találmány alapjául szolgáló legfontosabb probléma olyan testtömeg-modulátorok szolgáltatása, amelyek lehetővé teszik az emlősök kövérségének és zsírtartalmának kontrollját.
A találmány szerint megoldottuk állatok - különösen emlősök - kövérségének és zsírtartalmának kontrollját elhízási (OB) polipeptideket és ezeket a polipeptideket kódoló nukleinsavmolekulákat nyújtva, ahogyan azt itt leírjuk. A találmány először nyújt testtömeg és kövérség modulációjára, azaz kontrolljára és szabályozására alkalmas izolált polipeptideket ugyanúgy, mint ilyen polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciákat, amelyek nemcsak az OB polipeptidek rekombináns előállítását teszik lehetővé, hanem magtik is hasznosak a testtömeg modulációjában.
A találmány szerinti elhízási (OB) polipeptidek körülbelül 145-167 aminosavból állnak - képesek a testtömeg modulálására állatokban, különösen emlősökben - és beletartoznak ezek alléi módosulatai vagy analógjai, beleértve ezek fragmentumait, amelyek ugyanazzal a biológiai aktivitással rendelkeznek. A polipeptidek előállíthatok rekombináns vagy kémiai szintetikus módszerekkel. A jelenleg előnyben részesített OB polipeptidek közé tartoznak a 2., 4., 5. vagy 6. szekvenciákkal, vagy ezek alléi módosulataival vagy analógjaival - beleértve ezek fragmentumait - rendelkezők.
A találmány szerinti OB polipeptidek immunogén fragmentumai közé tartoznak: Val-Pro-Ile-Gln-LysVal-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (18. számú szekvencia); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-LeuSer-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (19. számú szekvencia); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-SerGly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (20. számú szekvencia); and Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-LeuGln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-GluCys (21. számú szekvencia).
Humán OB polipeptidanalógok közé tartoznak azok, amelyek a 4. és 6. humán aminosavszekvenciákkal rendelkeznek, ahol az 53., 56., 71., 85., 89., 92.,
95., 98., 110., 118., 121., 122., 126., 127., 128., 129.,
132., 139., 157., 159., 163. és 166. (a 4. számú szekvencia számozása szerint) aminosavak közül egy vagy több aminosavat más aminosav helyettesít, úgymint az egér OB polipeptid divergens aminosavja, ahogyan azt a 2. számú szekvenciában közzétesszük, vagy egy alanin. Ilyen analógok közé tartozhatnak azok, amelyekben: a) az 53. helyen levő szerinmaradékot glicinnel, alaninnal, valinnal, ciszteinnel, metioninnal vagy treoninnal helyettesítjük; b) a 98. helyzetben levő szerinmaradékot glicinnel, alaninnal, valinnal, ciszteinnel, metioninnal vagy treoninnal helyettesítjük; és c) a 92. helyzetben levő argininmaradékot lizinnel, hisztidinnel, glutaminnal, glutaminsawal, aszparaginsavval, szerinnel, treoninnal, metioninnal vagy ciszteinnel helyettesítjük. Egy találmány szerinti OB polipeptidanalóg előnyösen 83% vagy ennél nagyobb aminosavhomológiával rendelkezik a humán OB polipeptid aminosavszekvenciájához - 2., 4., 5. vagy 6. szekvenciákhoz - viszonyítva.
További, találmány szerinti humán OB polipeptidanalógok a 4. és 6. szekvenciák aminosavszekvenciájával rendelkeznek és: a) egy vagy több aszparaginsavmaradékot glutaminsawal helyettesítve; b) egy vagy több izoleucinmaradékot leucinnal helyettesítve; c) egy vagy több glicin- vagy valinmaradékot alaninnal helyettesítve; d) egy vagy több argininmaradékot hisztidinnel helyettesítve; e) egy vagy több tirozin- vagy fenil-alanin-maradékot triptofánnal helyettesítve; f) egy vagy több 121-128. maradékot (a 4. számú szekvencia számozása szerint) glicinnel vagy alaninnal helyettesítve; és g) egy vagy több 54-60. vagy 118-166. maradékot (a 4. számú szekvencia számozása szerint) lizinnel, glutaminsawal, ciszteinnel vagy prolinnal helyettesítve tartalmaznak.
A jelenleg előnyben részesített, találmány szerinti humán OB polipeptid csonkolt analógok közé tartoznak azok, amelyekben (a 4. számú szekvencia számozása szerint): a) egy vagy több 121-128. helyzetű maradékot kivágtunk (deleted); b) az 1-116. maradékokat kivágtuk; c) az 1-21. és 54-167. maradékokat kivágtuk; d) az 1 -60. és 117-167. maradékokat kivágtuk; az 1-60. maradékokat kivágtuk; f) az 1-53. maradékokat kivágtuk; és g) az a) alrész analógja, ahol az 1-21. maradékokat kivágtuk. A találmány szerinti OB polipeptidek és OB polipeptidanalógok, amelyekből hiányzik a 21 aminosavhosszúságú „szignáf’-szekvencia (például a 4. szekvencia 1-21. aminosavai), rendelkezhetnek N-terminális aminosavval vagy aminosavszekvenciával, úgymint 1. metioninnal, 2. glicin-szerin-hisztidin-metionin-szekvenciával (38. számú szekvencia), 3. metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-szerin-szeringlicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-szerinhisztidin-metionin-szekvenciával (98. számú szekvencia), 4. leucin-glutaminsav-lizin-arginin-glutaminsavalanin-glutaminsav-alanin-szekvenciával (26. számú szekvencia), 5. glutaminsav-alanin-glutaminsavalanin-szekvenciával (27. számú szekvencia), 6. leucin-glutaminsav-lizin-arginin-szekvenciával (28. számú szekvencia), 7. metionin-glicin-szerin-szerinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidinhisztidin-szerin-szerin-glicin-leucin-valin-prolinarginin-glicin-szerin-prolin-szekvenciával (99. számú szekvencia) és 8. glicin-szerin-prolin-szekvenciával.
A találmány szerinti OB polipeptid származékai egy vagy több hozzákapcsolt kémiai résszel rendelkez3
HU 223 563 Bl nek, beleértve vízoldható polimereket, úgymint polietilénglikolt. A polietilénglikol-származékok lehetnek mono-, di-, tri- vagy tetrapegilezettek, például N-terminálisan monopegilezettek. A találmány szerinti OB polipeptidek előnyben részesített N-terminálisan monopegilezett származékai közé tartoznak a 4. számú szekvencia 22-167. maradékait vagy a 6. számú szekvencia 22-166. maradékait tartalmazó OB polipeptidek, adott esetben a 21. helyzetben (pegilezett) metioninnal rendelkezők.
A találmány tárgyát képező izolált nukleinsavmolekula OB polipeptidet, alléi módosulatot vagy analógot - beleértve fragmentumokat - kódol, ahogyan azt fent leírtuk. Specifikusan emlősben testtömeg-moduláló biológiai aktivitással rendelkező OB polipeptid kifejeződésének biztosításában történő felhasználásra nyújtunk DNS-molekulákat, és a következőket tartalmazó csoportból választjuk ki azokat: a) az 1. és 3. számú szekvenciavázlatokban közzétett DNS-molekulák vagy azok fragmentumai; b) DNS-molekulák, amelyek hibridizálnak az a)-ban definiált DNS-molekulákkal vagy azok hibridizálásra képes fragmentumaival; és c) olyan DNS-molekulák, amelyek az előző DNS-molekulák bármelyike által kódolt aminosavszekvenciák kifejeződését kódolják.
Előnyben részesített találmány szerinti DNS-molekulák olyan polipeptidet kódolnak, amelyik a következőkben közzétett aminosavszekvenciával rendelkezik:
a) 2. számú szekvencia; b) a 2. számú szekvencia 22-167. aminosavjai; c) 4. számú szekvencia; d) a 4. számú szekvencia 22-167. aminosavjai; e) 5. számú szekvencia; f) az 5. számú szekvencia 22-166. aminosavjai; és g) 6. számú szekvencia; és h) a 6. számú szekvencia 22-166. aminosavjai ugyanúgy, mint olyan polipeptideket, amelyek az előzőek szerint említett Nterminális aminosavval vagy aminosavszekvenciával rendelkeznek. Szemléletesen, előnyben részesített DNS-molekula a 3. számú szekvenciavázlat fehérjét kódoló szekvenciájaként közzétett szekvenciával rendelkezik, és különösen a 22-167. aminosavakat kódoló szekvenciaként közzétett szekvenciával rendelkezik.
Detektálhatóan jelölt, a találmány szerinti DNS-molekulával hibridizálni képes nukleinsavmolekulák szintén a találmány tárgyát képezik, és beleértünk OB nukleinsav nemkódoló régiójával hibridizálni képes nukleinsavmolekulákat, amely nemkódoló régiót egy intront, 5’ nemkódoló régiót, és 3’ nemkódoló régiót tartalmazó csoportból választjuk ki. A találmány tárgyát képezik OB polipeptidet kódoló humán genomiális DNS amplifikálására szolgáló oligonukleotidprimerek is, úgymint a 29-32. szekvenciavázlatokban közzétett oligonukleotidok.
A találmány tárgyát képező vektorok tartalmazzák a fentiek szerint leírt, találmány szerinti DNS-molekulát, és előnyösen olyan expressziós vektorformával rendelkeznek, amely a DNS-molekulát expressziós kontrollszekvenciával működőképesen összekapcsolva foglalja magában. A találmány szerinti egysejtű gazdaszervezeteket a találmány szerinti DNS-molekulával vagy a fent leírt vektorral transzformáltuk vagy vetettük alá transzfekciónak. Előnyben részesített gazdasejtek közé tartoznak baktériumok, élesztősejtek, emlőssejtek, növényi sejtek, rovarsejtek és emberi sejtek szövetkultúrában. Szemléletesen, ilyen gazdasejteket a következőket tartalmazó csoportból választunk: E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, élesztő-, CHO-, Rl.l, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 és Sf9 sejtek. Jelenleg előnyben részesített élesztőgazdasejtek közé tartoznak Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula és Torulopsis fajok. Olyan emlőssejteket is nyújtunk, amelyek OB polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak és in vitro úgy módosítottak, hogy lehetővé tegyék OB polipeptid nagyobb arányú kifejeződését homológ rekombináns művelet segítségével, amely expressziós szabályozószekvenciának az OB polipeptidet kódoló szekvenciához funkcionális közelségben történő inszertálásából áll. Az expressziós szabályozószekvencia lehet OB polipeptidet kifejező vagy nem, és helyettesíthet mutáns OB-polipeptid-szabályozó szekvenciát a sejtben.
A találmány tárgyát képezik OB polipeptid előállítására szolgáló módszerek, amelyek tartalmazzák: a) a fent leírt sejtnek olyan körülmények között történő tenyésztését, amely gondoskodik az OB polipeptid kifejeződéséről; és b) a kifejeződött polipeptid kinyerését. Ez az eljárás kiegészülhet a következő lépésekkel: c) a polipeptid kromatografálásával Ni-kelát-oszlopon; és
d) a polipeptid gélszűréses tisztításával. Előnyben részesített megvalósítási formában a c) lépés után és a d) lépés előtt a módszer tartalmazza az OB polipeptid kromatografálását erős kationcserélő oszlopon.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti OB polipeptidekre specifikus jelölt és nem jelölt monoklonális és poliklonális antitestek, és a találmány szerinti monoklonális antitestet termelő halhatatlan sejtvonalak. Antitestkészítés a találmány szerint magában foglalja: a) OB polipeptidnek hordozófehérjéhez történő konjugálását; b) gazdaállat immunizálását az a) szerinti OB polipeptidfragmentum/hordozó fehérje konjugátummal adjuváns hozzákeverésével; és c) antitest kinyerését az immunizált gazdaállatból.
A találmány tárgyát képezik OB polipeptid mintában való jelenlétének mérésére szolgáló módszerek, tartalmazva: a) a várhatóan OB polipeptidet tartalmazó minta érintkeztetését az OB polipeptidet specifikusan kötő antitesttel (előnyösen szilárd támasztékhoz kötve) olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az antitestet és az OB polipeptidet tartalmazó reakciós komplexek kialakulását; és b) az antitestet és az OB polipeptidet tartalmazó reakciós komplexek kialakulásának detektálását a mintában, ahol a reakciós komplexek képződésének detektálása jelzi a mintában OB polipeptid jelenlétét. Ennek megfelelően nyújtunk in vitro módszereket az OB polipeptid szintjének biológiai mintában történő becslésére, amely tartalmazza: a) reakciós komplexek kialakulásának detektálását biológiai mintában a fent említett módszerrel; és b) a keletkezett reakciós komplexek mennyiségének becslését, amely reakciós komplexek mennyisége választ ad a biológiai mintában levő OB polipeptid mennyiségére. Amikor
HU 223 563 Bl megemelkedett vagy lecsökkent, találmány szerinti OB polipeptidszinttel összefüggő betegség jelenlétét mutatjuk ki vagy diagnosztizáljuk, a fenti meghatározást végezzük, és a detektált OB polipeptidszintet összevetjük normálalanyokban vagy a vizsgált alanyban korábbi időpontban jelen levő OB polipeptidszinttel. Az OB polipeptid szintjében a normál- vagy előző szintekhez képest bekövetkezett növekedés OB polipeptid megemelkedett szintjeivel összefüggő betegséget jelez, és a normálszintekhez képest lecsökkent OB polipeptidszint az OB polipeptid lecsökkent szintjeivel összefüggő betegséget jelez. Ennek megfelelően nyújtunk in vitro módszereket emlős alanyban OB polipeptid megemelkedett vagy lecsökkent szintjeivel összefüggő betegség terápiás kezelésének nyomon követésére, amely tartalmazza az OB polipeptidszintek fent leírtak szerinti becslését olyan biológiai minták sorozataiban, amelyeket ilyen terápiás kezelésnek alávetett emlős alanyból vettünk különböző időpontokban.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a fent leírtak szerinti OB polipeptidet tartalmaznak gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt, és állat testtömegének csökkentésére irányuló terápiás módszerekben alkalmazhatók. További - állat testtömegének növelésére szolgáló terápiás módszerekben történő felhasználásra szánt - találmány szerinti gyógyszerkészítmények OBpolipeptid-antagonistát tartalmaznak, előnyösen az OB polipeptidhez kötődő és annak aktivitását semlegesítő antitestet, az OB polipeptidnek olyan fragmentumát, amely hozzákötődik az OB polipeptidreceptorhoz, de nem aktiválja azt, és az OB polipeptid kis molekulájú antagonistáját tartalmazó csoportból kiválasztva. A találmány tárgyát képezik megfelelő, testi megjelenést javító kozmetikai készítmények is az egyén testtömegének csökkentésére vagy növelésére, amely készítmények az egyén testi megjelenését javító eljárásokban használhatók fel. Ilyen kozmetikai készítményeket az egyénnek olyan adagban adunk be, amely mennyiség elegendő az egyén testtömegének kívánt mértékű modulálására.
Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti nukleinsavmolekuláknak ugyanúgy, mint a találmány szerinti OB polipeptidet kódoló nukleinsavval hibridizálni képes antiszenz nukleinsavmolekuláknak a felhasználása állat testtömegének modulálására (például génterápiával) szolgáló gyógyszer készítésére. A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti OB polipeptidnek vagy antagonistának a felhasználása is, állat testtömegének modulálására szolgáló gyógyszer készítésére. Az így kifejlesztett gyógyszerek alkalmazhatók emlős testtömegének módosítására olyan rendellenesség kezelésében, amelyet a cukorbajt, magas vérnyomást és magas koleszterinszintet tartalmazó csoportból választunk, és ilyen rendellenességek kezelésére szolgáló gyógyszerekkel együtt kombinált terápia részeként. Ilyen gyógyszerek alkalmazhatók terápiás eljárásokban, beleértve intravénás, intraartériás, intraperitoneális, intramuszkuláris, szubkután, nazális, orális vagy pulmonális beviteli rendszereket.
Az itt bemutatott adatok megmutatják azt a megállapítást, hogy a találmány szerinti OB polipeptideket ebben az alakjukban elsődlegesen kövér emlősök választják ki, és hogy a polipeptidek hormonokként működnek.
A példák megmutatják, hogy az OB polipeptid egy másik elnevezés szerint itt „leptin” - az egér-, patkány- és emberi plazmában kering. Leptin hiányzik ob/ob egerek plazmájából, és tízszer magasabb koncentrációban van jelen db/db egerek és húszszor magasabb koncentrációban fa/fa patkányok plazmájában. Rekombináns leptin napi injekciói legjelentősebben ob/ob egerek testtömegét csökkentik drámaian, jelentősen befolyásolják vad típusú egerek testtömegét és nincsenek hatással db/db egerekre.
Egy további vonatkozásban, egyik fajból származó OB polipeptid biológiailag aktív egy másik fajban. Különösen a humán OB polipeptid aktív egerekben.
Először is, a találmány szerinti modulátorok nukleinsavmolekulákat, beleértve rekombináns DNS-molekulákat (például cDNS-t vagy a cDNS-t tartalmazó vektort vagy izolált genomiális DNS-t), vagy klónozott géneket (azaz izolált genomiális DNS-t), vagy ezek degenerált változatait tartalmazzák, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, amelyek önmagukban tömegkontroll-modulátorokként szolgálnak a következőkben definiáltak szerint, vagy ezek konzervatív változatait vagy fragmentumait, különösen olyan fragmentumokat, amelyekből hiányzik a szignálpeptid (másképpen itt érett OB polipeptidként említve), amely polipeptidek az 1A-E. ábrákon (2. számú szekvencia), a 3. ábrán (4. számú szekvencia), az 5. ábrán (5. számú szekvencia) és a 6. ábrán (6. számú szekvencia) közzétett aminosavszekvenciákkal rendelkeznek. Specifikus megvalósítási formákban két változat, rágcsáló és humán OB polipeptidek aminosavszekvenciáját nyújtjuk. Mindkét polipeptid olyan alakban van, amelyben a 49. helyzetű glutamin deléciója található, amely mRNS splicing anomáliát eredményezhet. A különböző fajokból származó OB polipeptidek nagymértékben homológok lehetnek; ahogyan ezt a 4. ábrán bemutatjuk, rágcsáló és humán OB polipeptidek több, mint 80%-ban homológok.
A nukleinsavmolekulák, rekombináns DNS-molekulák vagy klónozott gének rendelkezhetnek az 1A-E. ábrákon (1. számú szekvencia) és 2A. és 2B. ábrákon (3. számú szekvencia) bemutatott DNSkódoló szekvenciák nukleotidszekvenciáival vagy lehetnek ezek komplementerei. Ilyen DNS-molekulák lehetnek különösen a kromoszómáról izolált cDNS vagy genomiális DNS. A találmány szerinti nukleinsavmolekulák megfelelhetnek a DNS 5’ és 3’ szegélyezőszekvenciáinak és intron DNS-szekvenciáknak is. Ennek megfelelően szintén a találmány tárgyát képezik az 1A-E. ábrák (1. számú szekvencia) és 2A. és 2B. ábrák (3. számú szekvencia) szekvenciáiból és ezek degenerált változataiból, alléi módosulataiból és hasonló rokon molekulákból választott nukleotidszekvenciákkal rendelkező nukleinsavak azonosítása.
A találmány szerinti nukleinsavmolekula lehet DNS vagy RNS, beleértve ezek foszfát vagy foszfátanalóg, például tiofoszfátkötéssel rendelkező szintetikus változatait. Szándékunk szerint egyszálú és kétszálú szekvenciák egyaránt idetartoznak.
HU 223 563 Β1
A találmány tárgyát képezik továbbá nukleinsavmolekulák molekuláris próbákként, vagy polimerázláncreakcióban (PCR=polymerase chain reaction) amplifikálásra primerekként történő felhasználásra, azaz olyan szintetikus vagy természetes oligonukleotidok, amelyek az 1A-E. ábrákon (1. számú szekvencia), 2A. és 2B. ábrákon (3. számú szekvencia) és 20A-C. ábrákon (22. és 24. számú szekvenciák) bemutatott szekvenciák; vagy a kódolószekvenciák 5’ és 3’ szegélyezőszekvenciái; vagy a genomiális DNS intronszekvenciái egy részének megfelelő szekvenciával rendelkeznek. A találmány különösen olyan nukleinsavmolekulákat ölel fel, amelyek legalább körülbelül 10 nukleotiddal rendelkeznek, ahol a nukleinsavmolekula szekvenciája megfelel az A-E. ábrák (1. számú szekvencia), 2A. és 2B. ábrák (3. számú szekvencia) és 20A-C. ábrák (22. és 24. számú szekvenciák) nukleotidszekvenciáiban az ugyanolyan számú nukleotidok nukleotidszekvenciájának, vagy azokkal komplementer szekvenciáknak. A molekula nukleinsavszekvenciája előnyösebben legalább 15 nukleotidból áll. A nukleinsavszekvencia legelőnyösebben legalább 20 nukleotidból áll. A találmánynak egy megvalósítási formájában, amelyben az oligonukleotid egy próba, az oligonukleotid detektálhatóan jelölt, például radionukliddal (úgymint 32P-vel) vagy egy enzimmel.
További vonatkozásban a találmány tárgyát képezi klónozóvektor, amely az OB polipeptidet kódoló találmány szerinti nukleinsavakat tartalmazza; és baktérium-, rovar- vagy emlős-expressziósvektor, amely az OB polipeptidet kódoló találmány szerinti nukleinsavmolekulákat egy expressziós kontrollszekvenciával működőképesen összekapcsolva tartalmazza. Ennek megfelelően a találmány további tárgyát képezi gazdasejt, úgymint baktériumsejt, élesztősejt, rovarsejt vagy emlőssejt, amelyet megfelelő expressziós vektorral transzfekciónak vetettünk alá vagy transzformáltunk, és ennek megfelelően a fent említett szerkezetek felhasználása a találmány szerinti modulátorok elkészítésében.
Még további vonatkozásban a találmány tárgyát az OB polipeptidhez kötődő antitestek képezik. Ilyen antitestek létrehozhatók a teljes hosszúságú polipeptiddel vagy annak antigénfragmentumaival szemben. Egy vonatkozásban ilyen antitestek gátolják az OB polipeptid funkcionális aktivitását (azaz testtömeg- és zsírösszetétel-modulálást). Egy másik vonatkozásban antitestek felhasználhatók a plazmában vagy szérumban keringő OB polipeptidek szintjének meghatározására. Egy még további vonatkozásban régióspecifikus antitestek, különösen monoklonális antitestek felhasználhatók OB polipeptid szerkezetének próbáiként.
Az előző anyagok mindegyikét testtömeg- és zsírösszetétel-modulátoroknak tekintjük itt, és mint ilyeneket különböző összefüggésekben alkalmazhatjuk. A találmány specifikusan egyaránt felölel diagnosztikai és terápiás felhasználásokat, ugyanúgy mint bizonyos mezőgazdasági alkalmazásokat, az összes itt definiált modulátor felhasználásától függően, beleértve mind nukleinsavmolekulákat, mind peptideket. Ezenfelül a testtömeg modulálása specifikus terápiás implikációkat és előnyöket hordoz olyan állapotokban, ahol vagy elhízás, vagy ezzel ellentétben cachexia (senyvesség, leromlott állapot) jelentette nemkívánatos testi kondíciók orvosolhatók a találmány szerinti modulátorok közül egynek vagy többnek a beadásával.
Tehát emlősben testtömeg modulálására szolgáló módszert úgy tervezünk, hogy tartalmazza azon fehérje kifejeződésének kontrollját, amelyet az A-E. ábrák (1. számú szekvencia), a 2A. és 2B. ábrák (3. számú szekvencia) szekvenciáiból és ezek degenerált vagy alléi változataiból választott nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsav kódol. Ilyen kontroll megvalósítható a szóban forgó nukleotidoknak a beteg vagy gazdaszervezet zsírsejtjeibe történő génterápiás bevezetésével az elhízás ellenőrzése vagy csökkentése céljából. Ezzel ellentétben, a nukleotidok antagonistáinak, úgymint antiszenz molekuláknak az elkészítése és beadása javallott és követett módszer lehet olyan esetekben, ahol túlzott testtömegveszteségről - úgymint anorexia nervosáról (pszichés eredetű étvágytalanságról), rákról vagy AIDS-ről - és annak kezeléséről van szó. Ilyen szerkezetek a nukleotidokhoz hasonló módon vihetők be közvetlenül zsírsejtekbe ilyen változások véghezvitelére.
Ennek megfelelően, az 1 A-E., 3., 5. és 6. ábrákkal (1. számú szekvencia, 4. számú szekvencia, 5. számú szekvencia és 6. számú szekvencia) definiált fehérjéket, ezek konzervatív változatait, aktív fragmentumait és rokon kis molekulákat elkészíthetjük terápiás célokból történő közvetlen beadásra, túlzott testzsír vagy tömegnövekedés csökkentésének vagy ellenőrzésének végrehajtására. Ennek megfelelően, a kifejezett fehérjeanyagokkal szembeni antitestek vagy más antagonisták, úgymint ezek fragmentumai, elkészíthetők, és hasonlóan beadhatók az ellentétes hatás elérése céljából. A találmány tehát előnyösen a találmány szerinti OB polipeptidet, vagy egy másik lehetőségként ennek antagonistáját gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy excipienssel keverékben tartalmazó gyógyszerkészítményre irányul.
Ezenfelül a találmány szerinti OB polipeptid beadható kozmetikai hatásaiért, például a test megjelenésének a zsírlerakódások csökkentésével történő javítására. Az OB polipeptid - kozmetikai hatásainak kifejtésére - felhasználható függetlenül vagy összekapcsolva más kozmetikai stratégiákkal, például sebészettel.
A jelen nukleotidok és megfelelő peptidek diagnosztikai felhasználásai kiterjednek a nukleinsavak alkalmazására további alléi változataik mutációinak azonosítására oly módon, hogy mind diagnosztikai, mind terápiás alkalmazásokra használható aktív nukleotidanyagok választékát fejlesztjük ki. Különösen a szóban forgó nukleotidoknak mind homozigóta-, mind heterozigótamutációit azonosíthatjuk, amely szükséges a betegek állapotának pontosabb mérésére, az egyének kockázati potenciáljának meghatározására, tekintettel az elhízottságra. Specifikusan a heterozigótamutációkat jelenleg úgy tekintjük, hogy a gyenge, mérsékelt elhízással függnek össze, míg a homozigótamutációk sokkal kifejezettebb és komoly elhízottsági állapotokkal vannak összefüggésben. Megfelelő DNS-tesztelés végezhető az előb6
HU 223 563 Β1 biekben említett, felfedezett anyagok benchmarkként történő felhasználásával a fő tendenciák pontos, hosszú távú előrejelzésének elősegítésére oly módon, hogy képesek legyünk a táplálkozási vagy egyéb személyes szokásokban, változtatások előírására vagy közvetlen terápiás beavatkozásra ilyen állapotok elhárítása céljából.
A találmány diagnosztikai felhasználhatósága kiterjed olyan módszerekre, amelyek a találmány szerinti modulátorok jelenlétének és terjedelmének mérésére irányulnak sejtes mintákban vagy tesztalanyokból vett biológiai kivonatokban (vagy mintákban) oly módon, hogy ilyen tesztmintákban a nukleinsavak (genomiális DNS vagy mRNS) és/vagy a fehéqeszintek egyaránt meghatározhatók. Adott, hogy a nukleotid megnövekedett aktivitása és az eredményezett fehérje jelenléte tükrözi az alany elhízást gátló képességét, az ilyen eredményeket átnéző orvos elhízott alanyban meghatározza, hogy a diszfunkciótól eltérő faktor - tekintettel a találmány szerinti nukleotidok jelenlétére és aktivitására az oka az elhízottság állapotának. Ezzel ellentétben a nukleotid és/vagy a kifejezett fehérje lecsökkent szintjei azt sugallják, hogy az ilyen szinteket növelni kell ilyen elhízottsági állapot kezelésére, és ezután megfelelő terápiás életrendet lehet bevezetni.
Továbbá a felfedezett és az 1A-E. és 2A. és 2B. ábrákon bemutatott nukleotidok olyan cDNS-t képviselnek, amely ahogyan azt fent röviden megállapítottuk, felhasználható megfelelő RNS mérésére. Ehhez hasonlóan, az 1A-E. és 3. ábrák polipeptidjeinek megfelelő rekombináns fehéqeanyag elkészíthető és megfelelően jelölhető, például radioimmunmeghatározásokban történő felhasználásra, például az OB fehérje zsírés/vagy plazmaszintjeinek mérése céljából, vagy OB receptor jelenlétének és szintjének kimutatására szövetekben, úgymint a hipotalamuszban.
Még továbbá, a találmány nemcsak az itt bemutatott nukleotidok és megfelelő fehérjék azonosítását öleli fel, hanem az ilyen anyagok receptorának megvilágítását is. Ilyen összefüggésben az 1A-E., 3., 5. és/vagy
6. ábrák polipeptidjei elkészíthetők és felhasználhatók egy megfelelő expressziós könyvtár screenelésére aktív receptorok izolálásához. A receptor ezekután klónozható, és a receptor önmagában vagy a ligandummal kapcsoltan felhasználható olyan kis molekulák screenelésére, amelyek az itt leírt modulátorokhoz hasonló aktivitással rendelkeznek.
Még továbbá, a találmány tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények, amelyek tartalmazzák az itteni modulátorok némelyikét, előnyösen azokat a polipeptideket, amelyeknek a szekvenciáit a 2. számú szekvenciavázlatban, 4. számú szekvenciavázlatban, 5. számú szekvenciavázlatban és 6. számú szekvenciavázlatban mutatjuk be, ezek antitestjeit - ezek megfelelő kis molekulájú agonistáit vagy antagonistáit, vagy aktív fragmentumokat - a különböző beadási módokhoz elkészítve, ahol ilyen terápia megfelelő. Az ilyen készítmények gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat, vagy más adjuvánsokat szükség szerint tartalmaznak, és minden esetben a klinikus vagy az orvos által meghatározott hatásos adagokban készülnek.
Tehát a találmány fő tárgyát az itt definiáltak szerinti tisztított testtömeg-modulátorok képezik, amelyek bizonyos jellegzetességeket és aktivitásokat mutatnak a kövérség és emlősök zsírtartalmának kontrolljával és változásával kapcsolatban.
A találmány további tárgyát az itt közzétett testkontroll-modulátorok kimutatására és mérésére szolgáló módszerek képezik, olyan patológiai állapotok hatékony diagnózisának és nyomon követésének eszközeként, amelyekben az ilyen modulátorok szintjében bekövetkező változás sajátságos jellemző, vagy az lehet.
A találmánynak még további tárgyát olyan módszer és ahhoz kapcsolódó, vegyületek - úgymint drogok, ágensek és hasonlók - screenelésére szolgáló assayrendszer képezi, amely potenciálisan hatékony a találmány szerinti modulátorok aktivitásának utánzásában vagy gátlásában emlősökben.
A találmánynak még további tárgyát emlősök kezelésére szolgáló módszer képezi a testtömeg és zsírtartalom ellenőrzésére emlősökben, és/vagy bizonyos patológiai állapotok kezelésére, amelyeknek sajátságos jellemzőjük az abnormális depresszió és testtömeg-emelkedés.
A találmánynak még további tárgyát képezi genetikai szerkezetek készítése genetikai terápiás eljárásokban és/vagy gyógyszerkészítményekben összehasonlítható terápiás módszerekhez történő felhasználásra, amely egy vagy több olyan modulátort, kötőpartnert vagy ágenst foglal magában vagy azon alapul, amely ellenőrizheti ezek termelődését vagy utánozhatja, vagy gátolhatja ezek aktivitását.
Egyéb dolgok és előnyök a szakember számára nyilvánvalóvá válnak a következő leírások áttekintéséből, amely a következő szemléltető ábrákra való hivatkozással folytatódik.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra (A-E): Mutatja a rágcsáló OB cDNS-ből származtatott nukleinsavszekvenciát (1. számú szekvencia) és a levezetett aminosavszekvenciát (2. számú szekvencia). 39 bázispárból álló 5’ vezérszekvenciát 167 előre jelzett aminosav nyílt leolvasási kerete (open reading fiamé) és egy körülbelül 3,7 kb 3’ nem transziáit szekvencia követ. (Előzőleg benyújtott 08/347,563 és 08/438,431 sorozatszámú bejelentésekben egy további 58 bázisból álló 5’ nemkódoló szekvenciát határoztunk meg, mint mesterséges klónozóterméket. Ennek a terméknek nincs kihatása a kódolórégióra, a 39 bázisból álló 5’ nemkódoló régióra, amelyet jelenleg az 1. ábrán írunk le, vagy a gén 3’ nemkódoló régiójára.) A 3’ nem transziáit szekvenciának összesen körülbelül 2500 bázispárját mutatjuk be. Az előre jelzett fehéijeszekvenciájának analízise megfigyeléssel vagy a SigSeq számítógépes program alkalmazásával, szignálszekvencia jelenlétét jelzi (aláhúzott rész). A cDNS mikroheterogenitását jegyeztük fel, amelyben a cDNS-ek körülbelül
HU 223 563 Bl
70%-a glutamint tartalmazott a 49. kodon helyén, 30% viszont nem (lásd az 5. és
6. ábrát, alább). Ezt az aminosavat aláhúztuk, ahogyan az arginint is, amely mutáció C57BL/6J ob/ob egerekben (ÍJ egerekben).
2. ábra (A és B): Mutatja a humán OB cDNS-ből származtatott nukleinsavszekvenciát (3. számú szekvencia). A nukleotidok 1-700. számozódnak a 46. nukleotidnál starthellyel és az 550. nukleotidnál terminációval.
3. ábra: Mutatja a humán OB génből származó teljes levezetett aminosavszekvenciát (4. számú szekvencia), amely a 2A. és 2B. ábrák nukleinsavszekvenciájának felel meg. Az aminosavak 1-167, számozódnak. Szignálszekvencia hasítási hely helyezkedik el a 21. aminosav után (Alá) oly módon, hogy az érett fehérje a 22. aminosavtól (Val) a 167. aminosavig (Cys) terjed.
4. ábra: Mutatja a rágcsáló (2. számú szekvencia) és a humán (4. számú szekvencia) levezetett aminosavszekvenciák közötti összehasonlítást. A humán OB levezetett aminosavszekvenciája nagymértékben homológ az egérével. Konzervatív változásokat vonallal és nemkonzervátív változásokat csillaggal jelöltünk. A változékony glutaminkodont aláhúztuk, mivel ez a nonszensz mutáció helyzete C57BL/6J ob/ob (1J) egerekben. Összességében 83%-os azonosság van az aminosavszintben, jóllehet csak 8 szubsztitúciót találtunk a 22. valin és a 117. cisztein között (közvetlenül downstream a szignálszekvenciától fölfelé).
5. ábra: Mutatja a rágcsáló OB génből - 3. ábra származó teljes hosszúságú aminosavszekvenciát (5. számú szekvencia), a 49. helyzetben azonban hiányzik a glutamin. Az aminosavak 1-166. számozódnak. Szignálszekvencia hasítási hely helyezkedik el a 21. aminosav után (Alá) (és ilyenformán a 49. helyzetű glutamin deléciója előtt) oly módon, hogy az érett fehérje a 22. aminosavtól (Val) a 166. aminosavig (Cys) terjed.
6. ábra: Mutatja a humán OB génből - 4. ábra származó levezetett teljes aminosavszekvenciát (6. számú szekvencia) a 49. helyzetben azonban hiányzik a glutamin. Az aminosavak 1-166. számozódnak. Szignálszekvencia hasítási hely helyezkedik el a 21. aminosav után (Alá) (és ilyenformán a 49. helyzetű glutamin deléciója előtt) oly módon, hogy az érett fehérje a 22. aminosavtól (Val) a 166. aminosavig (Cys) terjed.
7. ábra: (A) A rágcsálókromoszómában ob elhelyezkedésének fizikai térképe, és a YAC és Pl klónozótérképek. „M és N”Miül és Notl restrikciós helyeknek felelnek meg. A számok olyan egyedi állatoknak felelnek meg, amelyek az általunk feljegyzett 1606 meiózis ob régiójában rekombinánsak voltak. Met, Pax4, D6Rck39, D6Rckl3 és Cpa olyan helyekre utalnak az ob régióban, amelyek kötődnek a DNS-próbához. YAC-ket izoláltunk D6Rck 13-nak és Pax4-nek próbákként történő felhasználásával, és a végeket vektorért PCR-t és/vagy plazmidvégmentést alkalmazva fedtük be és ezt követően új YAC-k izolálására használtuk fel. (B) Az eredményül kapott YAC összefüggő szerkezet (contig). Ebben az összefüggő szerkezetben az YAC-k egyike, Y902A0925 kiméra volt. A rekombináns állatok genotipizálásához használt minden egyes próbát zárójelbe tettük. (6) Megfelel YAC 107-nek; (5) megfelel M16(+)-nak [vagy M16(plus)nak)]; (4) megfelel adu(+)-nak; (3) megfelel aaí/(pICL)-nek; (2) megfelel 53(pICL)-nek; és (1) megfelel 53(+)nak. (C) A szelektált YAC-végpróbákkal izolált Pl bakteriofág kiónok Pl összefüggő szerkezete. Az ob gént egy - az YAC YB6S2F12 távolabb eső végének (4-es vég) (másképpen itt öí/n(+)-nak nevezett) felhasználásával izolált - Pl ki ónban izoláltuk.
8. ábra: A negyedik exont befogó kísérlet - amelyet PCR-rel amplifikáltunk és jellemeztünk - 192 egymástól független izolátumának etídium-bromidos festéséről készült fotót mutat be.
9. ábra: Várhatóan ob-t hordozó, PCR-rel amplifikált kiónok etídium-bromidos festéséről készült fotó. A mesterséges terméket nem hordozó 7 klón mindegyikét újra amplifikáltuk PCR alkalmazásával és elektroforézisnek vetettük alá 1%-os agarózgélen TBE-ben és etídium-bromiddal festettük. A méretmarker (messze balra számozatlan vonal) a kereskedelemben kapható „1 kb létra”. 1. sáv: „HIV-szekvenciát” tartalmazó 1D12 klón. 2. sáv: IFI, az ob régión kívüli új klón. 3. sáv: 1H3 klón. 4. sáv: 2B2 klón, amely az IFI kiónnal azonos. 5. sáv: 2G7 klón, amely ob exont tartalmaz. 6. sáv: 2G11 klón, amely az IFI klónnal azonos. 7. sáv: 2H1 klón, amely nem tartalmaz inszertet.
10. ábra: Mutatja a 2G7 klón szekvenciáját (7. számú szekvencia), amely magában foglal az OB gén egy részét kódoló exont. Az ennek az exonnak az amplifikálásához hasz8
HU 223 563 Bl nált primer szekvenciákat (8. és 9. számú szekvenciák) bekereteztük az ábrán.
11. ábra: (A) Ugyanannak az egérnek különböző szöveteiből származó mRNS reverz transzkripciós PCR-analízise (RT-PCR) a 2G7 primerekkel és aktinprimerekkel. Az RT-PCR reakciót 100 ng reverz transzkriptáit teljes RNS-nek oligo dT-vel mint primemek a felhasználásával végeztük a cDNS első szálának szintéziséhez. PCR amplifikálást végeztünk 35 ciklusban, 94 °C-on történő denaturálás 1 percig; hibridizáció 55 °C-on 1 percig; extenziók 72 °C-on 2 percig, ciklusonként 1 másodperces autoextenzióval. Az RT-PCR termékeket újra oldottuk 2%-os, alacsony olvadási pontú agarózgélben, futtattuk 1 χ TBE-pufferben. (B) Az egér különböző szerveiből származó mRNS-ek Northem-blot-analízise PCR-rel jelölt 2G7nek próbaként történő felhasználásával. A szövetek mindegyikéből 10 pg teljes RNS-t vetettünk alá elektroforézisnek formaldehiddel kiegészített agarózgélen. A próbát 65 °C-on hibridizáltuk (Rapid Hybe, Amersham). 1 órás expozíció után láthatóak voltak az autoradiográf szignálok; a bemutatott kísérlet 24 órás expozíció eredménye.
12. ábra: (A) A felsorolt egértörzsek mindegyikének zsírsejt (fehérzsír-szövet)-RNS-én végzett RT-PCR reakció etídium-bromidos festése. Minden minta teljes RNS-ét (100 ng) reverz transzkripciónak vetettük alá oligo dT és reverz transzkriptáz felhasználásával, és az eredményül kapott egyszálú cDNS-t 2G7 primerek (alsó szálak) vagy aktinprimerek (felső szálak) segítségével PCR-rel amplifikáltuk. Mind a 2G7, mind az aktinprimereket ugyanabban a PCR reakcióban használtuk. A termékeket 1%-os agarózTBE-gélen füttattuk. (B) Northem-blotanalízis (A)-nak megfelelően. A jelzett törzsek mindegyikének 10 pg zsírsejt-(fehér zsírszövet) RNS-ét kifuttattuk és PCR-rel jelölt 2G7 próbával próbának vetettük alá, ahogyan fent a 11B. ábrán. A 2G7 mRNS körülbelül 20-szoros növekedése volt látható a C57BL/6J ob/ob (1J) törzs fehérzsír-RNS-ében az azonos alomból való soványakhoz viszonyítva. Sem az RT-PCR, sem a Northernkísérletekben nem volt kimutatható jele SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J (2J) egerekből származó 2G7 RNS-nek, még 2 hetes expozíció után sem. 24 órás autoradiográfiás expozíciót mutatunk be. Ugyanazt a szűrőt aktinpróbával is hibridizáltuk (az ábra alsó része).
13. ábra: További 2J állatok és kontrollállatok
Northem-analízise, amely megerősíti az ob mRNS hiányát 2J állatokban. A Northem-analízist a 11. és 12. ábráknál leírtak szerint végeztük el. Ebben az esetben a kontroll-RNS ap2 volt, egy zsírspecifikus transzkriptum. Az ap2 sávok különböző denzitásai között nincs szignifikancia.
14. ábra: összehasonlítja a C57BL/6J (normál) és a
C57BL/6J ob/ob (1J) egerek DNS-szekvenciáját annak a pontmutációnak a régiójában, amely érés előtti stopkodon bevezetéséhez vezet (nonszensz mutáció) a mutáns törzs cDNS-ében. Az ob/ob egerek C-»T mutációval rendelkeztek, amely a 105. helyzetben egy argininmaradékot változtatott meg. Ez a báziscsere az automata DNS-szekvenáló outputjaként mutatkozik meg. RT-PCR reakciót végeztünk mindkét (+/+ és ob/ob) törzsből származó fehérzsír-RNS felhasználásával, az 5’ és 3’ nem transziáit régiókból való primerek alkalmazásával. A PCR reakció termékeit gélen tisztítottuk és közvetlenül szekvenáltuk manuálisan és Applied Biosystems Inc. 373A automata szekvenálót alkalmazva, primerekkel végig a kódolószekvencia mindkét szálán.
15. ábra: (A) Southem-blot a felsorolt egértörzsek mindegyikének genomiális DNS-ével. Körülbelül 5 pg DNS-t (májból, veséből vagy lépből preparált genomiális DNSből származó) restrikciósán emésztettünk a jelzett restrikciós enzimekkel. A DNS-t ezután 1%-os agaróz-TBE-gélben elektroforézisnek és PCR-rel jelölt 2G7-tel próbának vetettük alá. őg/II-vel történő restrikciós emésztés az SM/Ckc- + Dac ob2J/ob2J (2J) DNS-ben egy körülbelül 9 kb (a legnagyobb) Bglll fragmentum méretének növekedését tárta fel. RFLP-k semmilyen más restrikciós enzimmel nem voltak kimutathatók. A genomiális DNS előzetes restrikciós térképezése azt jelezte, hogy a polimorf Őg/II hely a transzkripciós starthelytől körülbelül 7 kb upstream helyezkedik el. A többi vizsgált enzim egyike sem terjed túl az mRNSstarthelyen. (B) A Bglll polimorfizmus szegregációja az SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J törzsben. Koizogén SM/Ckc- + Dac ob2J/ob2J (2J) kolónia ugyanazon generációjából hat elhízott és öt sovány utódot genotipizáltunk, feljegyezve a Bglll polimorfizmust, ahogyan azt (A)-ban megmutatjuk. A fenotípusosan elhízott állatok mindegyike homozigóta volt a polimorf Bglll fragmentum nagyobbik allélj ára nézve. A „kontrolf’-sávban levő DNS-t nem rokon SM/Ckc- + Dac +/+
HU 223 563 Β1 egérből preparáltuk, amelyet az SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J kolóniától elkülönítve tenyésztettünk.
16. ábra: A felsorolt fajokból származó, £eoRIgyel emésztett genomiális DNS Southem-blot-analízise, OB cDNS-nek mint próbának a felhasználásával (azaz zoo biot). Hibridizációs szignálok minden gerincesmintában kimutathatók voltak, még mérsékelten szigorú hibridizáció után is. A macska-DNS ebben a kísérletben némileg szétesett. A restrikciósán emésztett DNS-t 1%-os agaróz-TBEgélen futtattuk, és próba céljából imobilonmembránra vittük át. A szűrőt 65 °C-on hibridizáltuk és 2xSSC/0,2% SDS-ben 65 °C-on kétszer 20 percig mostuk és 3 napig Kodak (Rochester, NY) X-OMAT film expozíciónak tettük ki.
17. ábra: Mutatja a pET-15b vektor (Novagen) expressziós klónozórégióját (11. és 12. számú szekvenciák).
18. ábra: Mutatja a His-kötő gyantát (Ni) tartalmazó oszlopról lejött eluátum analízisét rekombináns érett rágcsáló OB és His-toldalék fúziójára (A) és érett humán OB és His-toldalék fúziójára (B). Baktériumokat transzformáltunk pETM9 és pETH14 vektorokkal külön-külön. 1 mM IPTG indukciójával optimális körülmények között, a transzformált baktériumok képesek voltak 100-300 pg/ml OB fúziós fehérje termelésére, elsősorban a zárványtestekben. A zárványtesteket 6 M guanidin-hidrokloriddal vagy karbamiddal oldhatóvá tettük, és a fúziós fehérjét (a lízis felülúszójában jelen levőt) felvittük a His-kötő gyantát tartalmazó (Ni) oszlopra 10 ml karbamiddal kiegészített 1 xkötőpufferben. Az oszlopot lépésenként, 20 μΜ, 60 μΜ és 300 μΜ imidazol 5 ml-es részleteivel és végül csupán pufiferrel eluáltuk. A részleteket OB polipeptidfúzió jelenlétére analizáltuk 15%-os akrilamidgélen. Minden sáv a baktériumkivonat 100 μΐ-es mennyiségét tartalmazza.
19. ábra: (A) OB RNS in vitro transzlációja. Humán OB cDNS-t szubklónoztunk a pGEM vektorba. A plazmidot linearizáltuk és plusz RNS-szálat szintetizáltunk Sp6 polimeráz alkalmazásával. Az in vitro szintetizált RNS-t kutyapankreászmikroszómamembránok jelenlétében vagy anélkül transzláltuk. Körülbelül 18 kD elsődleges transzlációs termék volt észlelhető in vitro transzláció után. Mikroszómás membránok hozzáadása a reakcióhoz egy második, az elsőnél körülbelül 2 kD-nal kisebb transzlációs termék megjelenéséhez vezetett. Interleukin-ΐα RNS transzlációs termékének amelyből hiányzik egy kódolt szignálszekvencia - a mérete nem változott a mikroszómamembránok hozzáadásával. Ezek az adatok jelezték fúnkcionális szignálszekvenciának a jelenlétét. (B) in vitro transzláció proteináz K jelenlétében vagy anélkül. Proteázos kezelés a 18 kD elsődleges transzlációs termék komplett proteolízisét eredményezte, míg a 16 kDként termelődött alak érzéketlen volt. A mikroszóma 0,1% TRITON-XlOO-zal történő permeábilizálása a termelődött alakot proteázra érzékennyé tette. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a termék a mikroszóma lumenjébe transzlálódott.
20. ábra (A-E): A humán OB gén szekvenciája (22. és 24. számú szekvenciák). (F) A rágcsáló OB gén vázlatos szerkezete. (G) A humán OB gén vázlatos szerkezete. (F)-ben és (G)-ben egyaránt aláhúztuk a start- és stopkodonokat. Nincs bizonyíték arra, hogy az első intron a humán génben homológ az egér első intronjával, de ennek fennállása sem zárható ki.
21. ábra: OB Pichia élesztőben történő rekombináns kifejeződésének elérésére alkalmazott klónozóstratégiák egyikének vázlatos ábrázolását mutatja. (A) OB expressziós vektor α-párosítófaktor szignálszekvenciával. (B) A rekombináns fúziós fehérje szerkezetének vázlatos ábrázolása, beleértve az Xho\ helyet és feltételezett KEX-2 és STE-13 hasítási helyeket tartalmazó aminosavszekvenciát (26. számú szekvencia), és a KEX-2 hasítás után jelen levő N-terminális többlet aminosavakat (27. számú szekvencia). (C) Egy másik stratégia érett OB előállítására olyan aminosavszekvenciával rendelkező szerkezet elkészítését tartalmazza, amely megfelel az Xhol hasítási helynek és KEX-2 hasítási helynek közvetlenül upstream az érett OB polipeptidszekvenciához képest (28. számú szekvencia).
22. ábra: Egy másik expressziós stratégia
Pichiában. (A) OB és His-toldalék fúziójának expressziós vektora - a pET expressziós rendszerből átvéve - az α-párosítófaktor szignálszekvencia kontrollja alatt (33. számú szekvencia). (B) Olyan, His-toldalékot tartalmazó rekombináns OB fúziós fehérje szerkezetének vázlatos ábrázolása, amely tartalmazza az α-párosítófaktor szignálszekvenciát, feltételezett KEX-2 és STE-13 hasítási helyeket, a His-toldalékot és egy trombin hasítási helyet, amely 3 többlet N-terminális amínosavmaradékkal rendelkező OB-t eredményez.
HU 223 563 Β1
23. ábra: (A) Rágcsáló OB transzformált Pichia élesztőben történő kifejeződésének (mindkét mikroheterogén formának, azaz a 49. helyen Gln-t tartalmazónak és anélkülinek) PAGE-analízise. Az elvárt, körülbelül 16 kD sáv látható a transzformált élesztő folyékony tenyészetében (második és harmadik sáv), a nem transzformáit élesztő folyékony tenyészetében azonban nem (első sáv). (B) (Karboximetil)-cellulózon, gyenge kationcserélőn részlegesen tisztított rekombináns OB polipeptid PAGE-analízise. Egy körülbelül 16 kD sáv nagyon jól látható az oszlopról lejött 3. és 4. frakcióban, amelyet 250 mM nátrium-kloriddal eluáltunk. 1. sáv: feltöltött minta; 2. sáv: átáramlás;
3-5. sávok: 250 mM nátrium-kloriddal eluált frakciók.
24. ábra: Mutatja, hogy az OB fehérje kering az egérplazmában. (A) Immunprecipitációk egérvérből. 0,5 ml egérplazmát előtisztítottunk nem konjugált sepharose-zal, és egy éjszakán át immuntisztított, sepharose 4B gyöngyökhöz konjugált anti-OB antitesttel inkubáltuk. Az immunprecipitátumot 15% SDS-PAGE gélen szeparáltuk, átvittük és Westem-blot-analízist végeztünk anti-OB antitesttel. A fehérje, körülbelül 16 kD molekulatömeggel ugyanabba a helyzetbe vándorolt, mint az élesztőben kifejezett érett egér OB fehérje. A fehérje hiányzott C57BL/6J ob/ob egerek plazmájából és tízszeresre növekedett C57BL/6J db/db egerek plazmájában, a vad típusú egerekhez viszonyítva, db egerekről feltételeztük, hogy túltermelik az OB fehérjét, mellékesen rezisztensek annak hatásaira. (B) OB megnövekedett szintje hájas patkányokban. A hájas patkány az 5. patkánykromoszómán bekövetkezett recesszív mutáció következtében elhízott. Genetikai adatok felvetették ugyanazon, mutációt szenvedett gén hibáját db egerekben. Hájas patkányok és azonos alomból való soványak plazmáját immunprecipitáltuk és Westem-blotnak vetettük alá. A keringő OB szintjében húszszoros növekedés látható a mutáns állatokban. (C) OB fehérje mennyiségi meghatározása egérplazmában. A rekombináns egérfehérje növekvő mennyiségeit adtuk ob egerek plazmájának 100 λ-jához és immunprecipitáltuk. A Westem-blot szignálintenzitását összehasonlítottuk vad típusú egerek plazmájának 100 λ-jával. A szignálintenzitásban lineáris növekedést figyeltünk meg a rekombináns fehérje növekvő mennyiségeivel, amely azt mutatta, hogy az immunprecipitátumok antitestfölösleg körülményei között keletkeztek. Hasonló szignálokat láttunk a vad típusú plazmamintában és a 2 ng rekombináns fehérjét tartalmazó mintában, jelezve, hogy a keringő mennyiség egérplazmában körülbelül 20 ng/ml. (D) OB fehérje zsírszövetkivonatokban. Egérzsírszövet citoplazmás kivonatát készítettük el db és vad típusú egerekből. Westemblot-analízisek a 16 kD fehérje megnövekedett szintjeit mutatták db egerekből készült kivonatokban.
25. ábra: Mutatja, hogy az OB fehérje változó mennyiségekben kering a humán plazmában. (A) Humán plazma Westem-blotanalízisei. Plazmamintákat vettünk hat sovány önkéntestől. Immunprecipitáció és Westem-blot bizonyította egy immunreaktív 16 kD fehérje jelenlétét, amely méretében azonos az élesztőben kifejezett rekombináns, 146 aminosavból álló humán fehérjével. A fehéqe változó szintjeit tapasztaltuk a hat minta mindegyikében. (B) Humán ob ELISA-ja (Enzyme Linked Immunosorbent Assay=enzimmel kapcsolt immunszorbens meghatározás). Mikrotiterlemezeket borítottunk be immuntisztított antihumán OB antitestekkel. Rekombináns fehérje ismert mennyiségeit adtuk a lemezhez és immuntisztított, biotinezett anti-ob antitestek alkalmazásával detektáltuk. A 414 nm-en mért abszorbanciát ábrázoltuk OB ismert koncentrációival szemben, így kaptunk standard görbét. Az eredményül kapott standard görbe azt mutatta, hogy a meghatározás 1 ng/ml vagy ennél több humán OB fehérjét volt képes kimutatni. (C) OB fehérje mennyiségének meghatározása humán plazmában. ELISA immunmeghatározást végeztünk a hat sovány önkéntes 100 λ plazmájának és a B ábrához alkalmazott standardoknak a felhasználásával. HP 1-ben 2 ng/ml-től HP6-ban 15 ng/ml-ig terjedő OB fehérjeszinteket láttunk. Ezek az adatok és az A ábrán bemutatott Westemblot-adatok kölcsönösen megfelelnek egymásnak.
26. ábra: Mutatja, hogy az OB fehérje molekulák közötti és molekulán belüli diszulfídkötéseket képez. (A) Western-blotok redukáló- és nem redukálókörülmények között. Az egér és humán plazma Westem-blotját megismételtük redukálóágensnek a mintapufferhez történő hozzáadásával és anélkül. Ha β-merkapto-etanolt elhagyjuk a mintapufferből, db plazmából származó immunprecipitátumok
HU 223 563 Bl kD és 32 kD látszólagos molekulatömeggel vándorolnak, β-merkapto-etanol hozzáadása a pufferhez a 32 kD rész eltűnéséhez vezet (lásd a 24. ábrát). Ez az eredmény megismétlődik, amikor az egérfehérjét a Pichia pastoris élesztőben fejezzük ki. Ebben az esetben az egér OB fehérje egy dimer helyzetébe vándorol. Redukálókörülmények között a tisztított, rekombináns egérfehéije 16 kD látszólagos molekulatömeggel vándorol jelezve, hogy a 32 kD molekulaforma egy vagy több, molekulák közötti diszulfidkötés eredménye. Az in vivő és Pichia pastorában kifejeződött humán fehéije 16 kD molekulatömeggel vándorol mind redukáló-, mind nem redukálókörülmények között (nem mutatunk adatokat). (B) Az élesztőben kifejezett humán fehéijemolekulán belüli diszulfidkötést tartalmaz. Kiválasztott fehérjék általában felveszik helyes konformációjukat, amikor a Pichia pastoris expressziós rendszerben fejeződnek ki. A 146 aminosavból álló érett humán fehérjét Pichia pastorisban fejeztük ki és az élesztő tápoldatától kétlépéses tisztítási eljárással tisztítottuk meg, amely magában foglalt IMAC-t (Immobilized Metál Affinity Chromatography=rögzített fém affinitás kromatográfia) és gélszűrést. A tisztított rekombináns fehérjét tömegspektrometriának vetettük alá bróm-ciános hasítás előtt és után. Bróm-cián metioninmaradékok karboxivégénél hasít. A rekombináns élesztőfehérje molekulatömege 16 024 ±3 D (számított molekulatömeg=16 024 D). Bróm-cián a három metionin után hasít a fehérjeszekvenciában, a 75., 89. és 157. aminosavaknál. A bróm-ciános fragmentum 8435,5 daltonnal megfelel a 90-157. és 158-167. terjedő aminosavaknak, amelyek a 117. Cys és 167. Cys között diszulfidkötéssel kapcsolódnak (számított molekulatömeg 8434,5 D). N. D.=not detected, nem detektáltuk.
27. ábra: Mutatja a bioaktív rekombináns fehérje elkészítését. A 145 aminosavból álló érett egér OB fehérjének megfelelő nukleotidszekvenciát klónoztuk a pET 15b expressziós vektorba. Ez a pET vektor a klónozott szekvenciától upstream egy polihisztidinrészt (His-toldalékot) inszertál, amely IMAC alkalmazásával hatékony tisztítást tesz lehetővé. A rekombináns baktériumfehérje kezdetben az oldhatatlan membránfrakcióban különül el a baktérium lízise után. A membránfrakciót guanidin-hidroklorid segítségével oldhatóvá tettük és IMAC-oszlopra töltöttük fel. A fehérjét lépésenként, imidazol növekvő koncentrációival eluáltuk, ahogyan megmutatjuk. Az eluált fehérjét újrahajtogattuk, és trombinnal kezeltük a Histoldalék eltávolítása céljából, ahogyan az alábbiakban leírjuk. Az oldható fehérje végső hozama 45 ng/ml baktériumtenyészet.
28. ábra: Mutatja az OB fehéije biológiai hatásait.
Élelmiszer-felvétel (A-C) és testtömeg (D-F) időbeli lefutása. Tíz állatból álló csoportok vagy naponta intraperitoneális 05-fehérje-injekciókat kaptak 5 mg/kg/nap adagban (tömör négyzetek), vagy naponta PBS-injekciókat (tömör körök), vagy nem kaptak kezelést (tömör háromszögek). A kezelt csoportokba tartoztak C57BL/6J ob/ob egerek (A és D), C57BL/KS db/db egerek (B és E) és CBA/J +/+ egerek (C és F). Az egerek élelmiszer-felvételét naponta mértük és a testtömeget 3-4 napos időközönként jegyeztük fel. (A gramm testtömeg ábrázolásának léptéke a vad típusú egereknél eltérő az ob és db egerekhez viszonyítva). A fehérjét kapott ob egerek élelmiszerfelvétele az első injekció után csökkent, és a 4. nap után körülbelül 40%-os szinten stabilizálódott a szimulációs oltott csoporthoz képest (p<0,001). Ezeknek az állatoknak a testtömege átlagosan
1,3 g/nap értékkel csökkent és 3 hét után a kiindulási tömegnek körülbelül 60%-án stabilizálódott (p< 0,0001). A fehérjének db egerekre nem volt kimutatható hatása. A testtömegre gyakorolt kicsi, de szignifikáns hatást figyeltünk meg CBA/J egerekben két korai időpontban (p<0,02). Minden egyes mérés standard hibáját vonallal tüntettük fel, és ezeknek az eredményeknek a statisztikai szignifikanciáját az 1. táblázatban mutatjuk meg.
29. ábra: Mutatja ob egerek páros táplálását. (A)
Négy C57BL/6J ob/ob egér csoportját ugyanolyan mennyiségű táplálékkal etettük, mint amennyit rekombináns fehérjét kapott ob egerek csoportja fogyasztott. Mindkét csoport tömegvesztését öt, nyolc és tizenkét nap után számítottuk ki. A visszafogott táplálású egerek (vonalkázott oszlop) kevesebb tömeget veszítettek, mint a fehérjét kapott ob egerek (tömör oszlop) (p<0,02). Ez az eredmény azt jelzi, hogy az OB fehérje tömeget csökkentő hatása a táplálékfelvétel, és az energiafelhasználás együttes hatásának eredménye. (B) Kezelt ob egér fotója. Két C57BL/6J ob/ob egeret mutatunk. A bal oldali egér PBS-t kapott és 65 g-ot nyomott, amely a kiindulási tömeg volt.
HU 223 563 Β1
A jobb oldalon látható egér rekombináns OB fehérje napi injekciókat kapott. Ennek az állatnak a kiindulási tömege is 65 g volt, és a háromhetes fehérjével történő kezelés után 38 g volt. (C) Kezelt és kezeletlen ob egerek májai. Kezelt és kezeletlen C57BL/6J ob/ob egerekből származó májakat mutatunk. A PBS-t kapott egér mája hájas megjelenésű, zsíros máj volt és 5,04 g-ot nyomott. A rekombináns OB fehérjét kapott egér mája normális megjelenésű, 2,33 g.
30. ábra: Mutatja ob in situ hibridizációját zsírszövettel. Szenz és antiszenz ob RNS-t jelöltünk in vitro Sp6 és T7 polimeráz és digoxigenin felhasználásával. A jelölt RNS-eket 8 hetes C57BL/KS egerek (jelölt vad típus) és C57BL/KS db/db egerek (jelölt db) epididimális (mellékheréhez tartozó) zsírpárnáiból származó zsírszövet paraffinba ágyazott szakaszaival hibridizáltuk. Az ábrán a lipidcseppecskék festetten vakuólumként jelennek meg a sejtekben. A citoplazma egy vékony szegély a sejtek szélén és megkülönböztethetetlen a sejtmembrántól. A területen levő minden zsírsejttel (adipocitával) hibridizációt mutattunk ki a vad típusú szakaszokban csak az antiszenzpróba felhasználásával, és nagymértékben megnövekedett szinteket láthattunk a db/db állatok szövetének szakaszaiban.
31. ábra: Mutatja, hogy OB RNS in vivő és in vitro kifejeződik zsírsejtekben. Különböző forrásokból származó néhány teljes RNS-t (10 pg) elektroforézisnek és blotnak vetettünk alá, és egy ob próbával hibridizáltuk. Először kollagenázemésztés után a sejtek rugalmasságában tevő különbségeket használtuk fel zsírsejtek tisztítására. OB RNS csak a zsírsejtfrakcióban volt jelen. Az S sáv jelzi a stromovaszkuláris (kötőszöveti érrendszer) frakciót és A jelzi a zsírsejtfrakciót. Továbbá, OB RNS nem fejeződött ki a nem differenciálódott 3T3-442 előzsírsejtekben (preadipocitákban) U sáv. Ezekből a sejtvonalakból differenciálódott zsírsejtek tisztán kimutatható OB mRNS-szinteket fejeztek ki (D sáv).
32. ábra: Mutatja, hogy OB RNS minden raktározott zsírszövetben kifejeződik. Minden vizsgált zsírszövetraktár kifejezett OB RNS-t. A lágyéktáji zsírpárna valamivel kisebb mennyiségeket fejezett ki, bár ingadozások voltak a különböző kísértetek szignáljainak szintjeiben. (A) 1. sáv: mellékheréhez tartozó; 2. sáv: lágyéktáji;
3. sáv: hasi (abdominális); 4. sáv: parametrium-zsírpámák. Barna zsír szintén kifejez kis mennyiségű OB RNS-t. (B) OB kifejeződés szintje barna zsírban változatlan volt egy hétig 4 °C-on tartott állatokban, míg az ismerten hideg kiváltotta, barna zsírra specifikus UCP RNS bősége ötszörösére emelkedett.
33. ábra: Mutatja az OB RNS kifejeződését db/db és arany-tioglükózzal (GTG = gold thioglucose) kezelt egerekben. GTG és db/db egerek parametrium-zsírpámáinak teljes RNS-ét elektroforézisnek vetettük alá és Northem-blotot végeztünk. GTG egyszeri dózisban történő beadása ismerten elhízást okoz specifikus hipotalamuszsérülések kiváltásával. (A) Egy hónapos nőstény CBA egereket kezeltünk GTG-vel (0,2 mg/g), amely a kezelt állatok >20 g-os növekedését eredményezte a kontrollállatokhoz képest (<5 g). (B) OB próba hibridizációja db/db és GTGvel kezelt egerek RNS-ével húszszoros növekedést tárt fel az ob RNS mennyiségében a kontroll-RNS-hez képest (aktin vagy GAPDH).
34. ábra: Humán RNS Northern-blot-analízisét mutatja. 10 mg humán zsírszövetből (az A ábrán FAT) származó teljes RNS-t és 2 mg poliA+RNS-t más humán szövetekből (az ábra B része) hibridizáltuk humán ob vagy humán β-aktinpróbákkal, ahogyan mutatjuk. Körülbelül 4,5 kb erős szignált tapasztaltunk a zsírszövet teljes RNS-sel. A poliA + RNS hibridizációja kimutatható szignálokat tett láthatóvá a szívben (HE) és a méhlepényben (placentában) (PL), ugyanakkor nem mutattunk ki OB RNS-t az agyban (BR), tüdőben (LU), májban (LI), vázizomban (SM), vesében (KI) és a hasnyálmirigyben (pankreászban) (PA). Minden esetnél jelezzük az autoradiográfiás expozíció tartamát. Megjegyezzük, hogy a méhlepény-RNSnél látható kisebb molekulasávok keletkezése (például váltakozó splicing, RNS-degradáció) nem ismert.
35. ábra: A humán OB gént és 8 mikroszatellitmarkert tartalmazó YAC összefüggő szerkezet. A SEGMAP/Version 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic. 1, 77-90 (1991)] segítségével levezetett, humán OB gént tartalmazó 7. kromoszóma régiójának YAC-n alapuló STS-összetételtérképét mutatjuk be. A 19 egyedülállóan rendelt STS-t (lásd a 3. táblázatot) a felső részen soroljuk fel. A 8 mikroszatellit specifikus STS-t csillagokkal jelöljük (lásd a 4. táblázatot). Megmutatjuk a Pax4-nek és OB géneknek megfelelő STS-eket is ugyanúgy, mint a centroméra (CEN) és 7q teloméra (TEL) összefüggő
HU 223 563 Β1 szerkezethez viszonyított előre jelzett helyzeteit. A 43 YAC klón mindegyikét vízszintes vonallal jelöljük, bal oldalon megadva a nevüket és zárójelben a becsült YAC-méretet (pulzáló gélelektroforézissel mért kb-ban). YAC-ben STS jelenlétét a megfelelő helyzetnél feketített körök jelzik. Ha az STS megfelel az YAC-inszertum végének, a megfelelő fekete kör köré négyszöget rajzoltunk, mind a felső rész mentén (az STS név mellé), mind annak az YAC-nek a végéhez, amelyből származott. Az alul levő 5 YAC-hez (a vízszintes szaggatott vonal alatt) egy vagy több STS-t, amelynek jelenlétét - a megállapított STS-rend alapján - elvártuk, nem mutattunk ki (az egyes YAC-ket a megfelelő STS-specifikus PCR-rel legalább kétszer tesztelve) és ezeket üres körökkel jelöltük a megfelelő helyzeteknél. A legtöbb YAC-t humánhörcsög hibrid sejtből származó könyvtárból izoláltuk [Green et al., Genomics 25, 170-183 (1995)], a jelzett eredeti nevükkel. A maradék YAC-t teljes humán genomiális könyvtárakból izoláltuk, és ezek eredeti könyvtári elhelyezkedését a
3. táblázatban adjuk közre. Három olyan YAC nevét bekereteztük (yWSS691, yWSS999 és yWSS2935), amelyeket FISH-analízissel találtunk a 7q31.3 térképezésénél. Az összefüggő szerkezetet (contigot) annak nem komputerizált formájában ábrázoljuk, ahol YAC-méreteket nem használunk klónátfedések vagy STS-távolságok (spacing) becslésére, és ezért az STS-ek mindegyikét egyenlő távolságban helyeztük el. A komputerizált formában, ahol az YAC-méreteket egyaránt felhasználjuk minden szomszédos STS-pár relatív távolságának és a klónátfedések kiterjedésének becslésére, a teljes YAC összefüggő szerkezet éppen 2 Mb-ot fog át.
A találmány részletes leírása A találmány tárgyát képezi olyan fehérje szerepének megvilágítása és felfedezése - melyet itt ob polipeptidnek vagy leptinnek nevezünk - amely fehérje az emlős testtömegkontrolljában való részvétel képességét mutatja, továbbá a fehérjét kódoló nukleinsav felkutatása, beleértve ennek degenerált változatait is (például amely egyedi expressziós rendszerben történő kifejeződéshez optimális kodonokat épít be). Az illető nukleinsavak képviselik annak a rágcsáló és humán OB polipeptidnek a kódolószekvenciáját, amely szükségszerűen kritikus szerepet játszik a testtömeg és a kövérség szabályozásában. Az itt bemutatott adatok azt jelzik, hogy a találmány szerinti nukleinsav polipeptidtermékét az azt kifejező sejtek kiválasztják, és hogy a polipeptid hormonként működik. További kísérleti adatok azt mutatják, hogy az OB polipeptid nagyon hatékony az ob génmutációt hordozó egerek elhízásának kezelésében. Továbbá OB polipeptid egyszeri nagy dózisú vagy mérsékelt folyamatos dózisokban történő beadása tömegcsökkenést okoz normális (vad típusú) egerekben.
Továbbá az itt leírt példák bemutatják, hogy az OB polipeptid - amelyet itt másképpen „leptin”-nek nevezünk - egér-, patkány- és humán plazmában kering. A leptin hiányzik ob/ob egerek plazmájából és tízszeresen magasabb koncentrációban van jelen db/db egerek plazmájában, és húszszorosán magasabb koncentrációban fa/fa patkányok plazmájában. Rekombináns leptin napi injekciói legjelentősebben ob/ob egerek testtömegét csökkentik drámaian, vad típusú egerek testtömegét jelentősen befolyásolják és nincsenek hatással db/db egerekre.
Egy további vonatkozásban az egyik fajból származó OB polipeptid biológiailag aktív egy másik fajban. Különösen a humán OB polipeptid aktív egerekben.
A találmány elsődleges vonatkozásában az emlős testtömeg-modulátoraiként működő anyagok azonosítására irányul. Különösen a találmány tárgykörébe tartozik bizonyos olyan nukleinsavak izolálása, tisztítása és szekvenálása, amelyek az OB génnek vagy kódolórégiójának felelnek meg egerekben és emberekben, valamint az ezen nukleinsavak által kifejezett megfelelő polipeptidek. A találmány tehát felöleli az 1. ábrán (A-E) (1. számú szekvencia) és a 2. ábrán (A és B) (3. számú szekvencia) bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavaknak, ezek degenerált változatainak, allélj ainak és fragmentumainak - amelyek mind rendelkeznek a testtömeg és kövérség modulálásának aktivitásával - a felfedezését. E nukleinsavak OB géneknek való megfelelése előrevetíti ezek szignifikáns hatását olyan állapotokra - mint az elhízottság ugyanúgy, mint egyéb olyan betegségek és rendellenességek - ahol a normálistól eltérő testtömeg a közreműködő faktor. A találmány kiterjed a találmány szerinti nukleinsavak által kifejezett fehérjékre és különösen azokra a fehérjékre, amelyeket az 1. ábrán (A-E) (2. számú szekvencia), 3. ábrán (4. számú szekvencia),
5. számú ábrán (5. számú szekvencia) és 6. ábrán (6. számú szekvencia) teszünk közzé, valamint ezek konzervatív változataira, aktív fragmentumaira és rokon kis molekulákra.
Ahogyan korábban fejtegettük, a testkontroll-modulátor peptidek - vagy olyan hozzájuk kötődő partnerek vagy egyéb ligandumok, vagy ágensek, amelyek ezekkel hasonlóságot vagy antagonizmust mutatnak, vagy szabályozzák ezek keletkezését - elkészíthetők gyógyszerkészítményekben megfelelő hordozóval és hatékony erősségben, a testtömegében abnormális ingadozásokat vagy kövérséget - egymagában, vagy egy ellentétes orvosi állapot, úgymint rák vagy AIDS részeként - mutató beteg kezelésére különböző módokon történő beadáshoz. Beadási technikák változatait alkalmazhatjuk, közöttük orális beadást, nazális vagy a nyálkán keresztül történő beadásnak más formáját,
HU 223 563 Bl parenterális technikákat, úgymint szubkután, intravénás és intraperitoneális injekciókat, katéterezéseket és hasonlókat. A felismerőfaktorok vagy ezek alegységeinek átlagos mennyiségei változtathatók, és különösen képzett orvos vagy állatorvos ajánlásain és előírásain kell alapulniuk.
A fentieknek megfelelően elkészíthető egy meghatározási rendszer a testtömeg-modulátorok aktivitását hatékonyan utánzó vagy antagonista potenciális drogok screenelésére. A testtömeg-modulátor bevezethető egy tesztrendszerbe és a jövendőbeli drog is bevezethető az eredményül kapott sejttenyészetbe, és a tenyészetet ezután megvizsgáljuk a sejtek aktivitásában - egyedül a jövendőbeli drog hozzáadásának vagy az ismert testtömeg-modulátor hozzáadott mennyiségei hatásának köszönhetően - bekövetkezett bármilyen változás megfigyelésével.
Ahogyan korábban állítottuk, az OB gén itt leírt molekuláris klónozása olyan anyagok osztályának az azonosításához vezetett, amelyek az emlőstesttömeg molekuláris szinten történő modulálásában működnek. A találmány szerinti modulátorok felfedezése fontos bevonásukat jelenti a táplálkozási rendellenességek idetartoznak, de korlátozást nem jelentenek, az elhízottság, rákkal összefüggő tömegvesztés és az elhízottsággal kapcsolatos betegségek, úgymint magas vérnyomás, szívbetegség és II. típusú cukorbaj - diagnózisára és kezelésére. Továbbá lehetségesek a géntermék mezőgazdasági felhasználásai olyan esetekben, ahol háziállatok testtömegét szeretnénk modulálni. Végül oly mértékig, amennyire a találmány szerinti modulátorok közül egy vagy több kiválasztott (szekretált) molekula, biokémiailag felhasználhatók receptoraik izolálására az expressziós klónozási technológia alkalmazásával. A következő, specifikusan az OB génre vonatkozó taglalás a modulátorok osztályának olyan általános alkalmazhatóságát adja, amely a találmány részét képezi, és ilyenformán összhangban kell lennie az értelmezés ilyen kiterjesztésével és oltalmi körével.
A fenti megjegyzés szerint, az OB polipeptid fünkcionális aktivitása transzgenikusan értékelhető ki. Ebben a vonatkozásban transzgén egérmodellt használhatunk. Az ob gén felhasználható transzgén egereket alkalmazó komplementációs tanulmányokhoz. A szóban forgó gén vad típusú lókuszának megfelelő transzgén vektorok - beleértve vírusvektorokat vagy kozmid kiónokat (vagy fág kiónokat) - összeállíthatók az izolált ob gén felhasználásával. Kozmidok bevezethetők transzgén egerekbe publikált eljárások alkalmazásával [Jaenisch, Science 240, 1468-1474 (1988)]. A szerkezeteket C57BL/6J ob/ob X DBA keresztezések FI utódainak keresztezéséből származó, megtermékenyített petékbe visszük be. Ezekhez a keresztezésekhez szükséges C57BL/6J ob/ob petefészek-transzplantátumok felhasználása FI állatok létrehozására. DBA/2J egereket használunk ellenőrző törzsként, mivel ezek nonaguti kültakarószínnel rendelkeznek, amely fontos a petefészek-transzplantátumok alkalmazásánál. Kozmid transzgén állatok ob fókuszainak genotípusai meghatározhatók az állatoknak szorosan kötött RFLP-vel vagy
- a mutációt szegélyező és az előd állatok között polimorf - mikroszatellittel történő tipizálásával. Komplementáció kimutatható, ha az egyedi szerkezet genetikailag elhízott F2 állatot (RFLP-analízissel megjelölt) sovánnyá és nem cukorbajossá változtat. Ezen körülmények között a komplementáció végső bizonyítása szükségessé teszi, hogy a transzgént hordozó ob/ob vagy db/db állatok párosodjanak az ob/ob vagy db/db petefészek-transzplantáltakkal. Ebben a keresztezésben minden olyan N2 állat, amely nem hordozza a transzgént, elhízott lesz és inzulinrezisztens/cukorbajos, míg azok amelyek hordozzák a transzgént, soványak lesznek és plazmájukban normális glükóz- és inzulinkoncentrációval rendelkeznek. Genetikai értelemben a transzgén a mutáció szupresszoraként működik.
Másképpen, OB gének tesztelhetek ezek fenotípusos hatásainak vizsgálatával, ha antiszenz orientációban kifejeződnek vad típusú állatokban. Ebben a megközelítésben a vad típusú alléi kifejeződése szupresszálva van, amely mutáns fenotípushoz vezet. RNSRNS duplex képződés (antiszenz-szenz) megakadályozza az mRNS normális irányítását, a vad típusú gén hatásának részleges vagy teljes eltüntetését eredményezve. Ezt a technikát használták TK-szintézis gátlására szövettenyészetben és Drosophilában a Kruppelmutáció és egerekben a Shiverer-mutáció fenotípusainak előállítására [Izant et al., Cell. 36, 1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rév. Biochem. 55, 569-597 (1986); Katsuki et al., Science 241, 593-595 (1988)]. Ennek a megközelítésnek fontos előnye, hogy a génnek csak egy kis részét szükséges kifejezni a teljes rokon mRNS kifejeződésének hatékony gátlásához. Az antiszenz transzgént saját promoterének vagy egy másik, a helyes sejttípusban kifejezett és az SV40 poliA helytől upstream elhelyezkedő promotemek a kontrollja alatt helyezzük el. Ezt a transzgént használjuk fel transzgén egerek előállítására. Transzgén egereket szintén pároztatunk petefészek-transzplantáltakkal annak tesztelésére, vajon ob heterozigóták érzékenyebbek-e az antiszenz szerkezet hatásaira.
Hosszú távon hasznos az OB géntermék (az OB polipeptid vagy fehérje) biokémiai funkciójának pontosítása olyan kis molekulájú agonisták és antagonisták azonosítására, amelyek befolyásolják aktivitását.
Ebben a specifikációban használt különböző kifejezések az itt, például az alábbiakban közzétett definíciókkal rendelkeznek.
A „testtömeg-modulátor”, „modulátor”, „modulátorok” kifejezések és ezek bármilyen, specifikusan fel nem sorolt változatai itt egymással felcserélhetően használhatók, és ahogyan az egész találmányi leíráson keresztül és az igénypontokban használjuk, nukleotidokra és fehérjeanyagokra egyaránt vonatkoznak, az utóbbi közé tartozhatnak mind egyszerű, mind összetett fehérjék. Specifikusabban, az előbb említett kifejezések kiterjednek az itt leírt, és az 1A-E. ábrán (1. számú szekvencia) és a 2A. és 2B. ábrán (3. számú szekvencia) bemutatott szekvenciákkal rendelkező nukleotidokra és DNS-ekre. Ehhez hasonlóan, az itt leírt és az 1A-E. ábrán (2. számú szekvencia) és a 3. ábrán (4.
HU 223 563 Bl számú szekvencia) bemutatott aminosavszekvenciaadatokkal rendelkező fehérjéket hasonlóan beleértjük ugyanúgy, mint az itt és az igénypontokban leírt minden anyagra vonatkozó aktivitási profilt. Ezek szerint olyan nukleotidok, amelyek lényegében azonos vagy módosított aktivitást mutatnak, beleértve lényegében homológ analógokat és alléi módosulatokat, szándékunk szerint hasonlóan idetartoznak. Ehhez hasonlóan, lényegében azonos vagy módosított aktivitást mutató fehérjéket, beleértve - szándékosan, például helyre irányított mutagenezissel, vagy véletlenszerűen a modulátorokat termelő gazdaszervezetben történő mutációk során - módosított fehérjéket, szándékunk szerint hasonlóan idesorolunk.
Egy „A”-t (ahol „A” egyszerű fehérje, DNS-molekula, vektor, rekombináns gazdasejt stb.) tartalmazó készítmény lényegében mentes „B”-től (ahol „B” magában foglal egy vagy több szennyező fehérjét, DNSmolekulát, vektort stb., de kivéve „A” racém formáját), ha a készítményben a fehérjének, DNS-vektornak (annak a fajnak a kategóriájától függően, amelyhez A és B tartozik) legalább 75%-a (tömegszázalék) „A”. „A” előnyösen az A+B fajta legalább 90%-át adja a szennyeződéstől mentes készítményben, legelőnyösebben legalább 99%-át. Előnyben részesítünk olyan készítményt is, amely lényegében szennyeződéstől mentes, csak a fontos fajta aktivitásával és jellemzőjével rendelkező egyszerű molekulatömegű fajtát tartalmaz.
Az OB polipeptidek
A természetben előforduló polipeptidre utaló „fehérje” és a „polipeptid” kifejezéseket itt egymással felcserélhetően használjuk az ob géntermékre és annak változataira vonatkozóan. Az „érett fehérje” vagy „érett polipeptid” kifejezés különösen olyan OB géntermékre utal, amelyből eltávolítottuk a szignálszekvenciát (vagy egy fúziós fehérjepartnert).
Ahogyan fent megjegyeztük, a találmány szerinti ob polipeptidek specifikus megvalósítási formái közé tartoznak azok, amelyek az itt közzétett, például 2., 4.,
5., 6. stb. számú szekvenciák aminosavszekvenciáival rendelkeznek, beleértve a konzervatív aminosavszubsztitúciókat tartalmazó módosított ob polipeptideket ugyanúgy, mint azok biológiailag aktív fragmentumait, analógjait és származékait. A „biológiailag aktív” kifejezéssel itt a polipeptid specifikus hatására utalunk, beleértve - de korlátozást nem jelentve - specifikus kötéseket, például receptorhoz, antitesthez vagy egyéb felismerőmolekulához; szignál transzdukciós útvonalak aktiválását molekuláris szinten; és/vagy a natív polipeptid által in vivő közvetített fiziológiai hatások indukcióját (vagy antagonistával történő gátlását). OB polipeptideket, beleértve fragmentumokat, analógokat és származékokat, elkészíthetünk szintetikusan, például a jól ismert szilárd fázisú vagy oldott fázisú peptidszintézis technikáinak alkalmazásával. Előnyösen szilárd fázisú szintetizálótechnikákat alkalmazunk. Más lehetőségként, a találmány szerinti OB polipeptidek elkészíthetők a lent leírt, jól ismert génsebészeti technikák alkalmazásával. Egy még további megvalósítási formában az OB polipeptid tisztítható, például immunaffinitás-tisztítással biológiai folyadékból, úgymint - de korlátozást nem jelentve - plazmából, szérumból vagy vizeletből, előnyösen humán plazmából, szérumból vagy vizeletből, és még előnyösebben a polipeptidet feleslegben kifejező alanyból, úgymint az OB receptor mutációjától vagy „hájasságnak” megfelelő mutációval rokon elhízástól szenvedő elhízott személyből.
Az OB polipeptid fragmentumai
Egy különleges megvalósítási formában a találmány szándékai szerint az OB polipeptid természetben előforduló fragmentumai fontosak lehetnek. A peptidszekvencia számos olyan helyet tartalmaz, amely gyakran szolgál proteolitikus hasítás célpontjául, például argininmaradékokat. Előfordulhat, hogy a teljes hosszúságú polipeptid egy vagy több ilyen helyen hasítható, biológiailag aktív fragmentumokat képezve. Az ilyen biológiailag aktív fragmentumok az OB polipeptid testtömegcsökkentő funkcionális aktivitásának agonistái vagy antagonistái.
Az OB polipeptid analógjai
A találmány szándékai szerint idetartozik az olyan OB polipeptidanalógok készítése, amelyek úgy jellemezhetők, hogy rendelkeznek az OB polipeptid biológiai aktivitásának képességével, például kötődnek az ob polipeptid specifikus kötőpartneréhez, úgymint az OB receptorhoz. Egy megvalósítási formában az analóg O2?-aktivitás-agonista, azaz az ob pepiidhez hasonlóan viselkedik. Egy OB agonista előnyösen hatékonyabb, mint a natív fehéije. Például OB-agonistaanalóg az OB receptorhoz nagyobb affinitással kötődhet, vagy in vivő hosszabb felezési időt mutathat, vagy mindkettő. Mindazonáltal, szándékaink szerint olyan CZÖ-peptidanalóg-agonisták is idetartoznak, amelyek kevésbé hatékonyak, mint a natív fehérje. Egy másik megvalósítási formában az analóg Oö-aktivitás-antagonista. Például olyan analóg, amely kötődik az OB receptorhoz, de nem vált ki szignáltranszdukciót, versengve gátolhatja a natív OB receptorhoz történő kötődését, ily módon in vivő csökkentve az OB aktivitást. Ilyen OB-antagonista-analóg az ob polipeptidtől eltérő sajátságokat is mutathat, például in vivő hosszabb (vagy rövidebb) felezési időt, nagyobb (vagy kisebb) kötődési affinitást az OB receptorhoz, vagy mindkettőt.
Egy megvalósítási formában OB peptidanalóg az olyan OB peptid, amelyet a polipeptiden a szerkezethez vagy funkcióhoz nem létfontosságú helyzetekben történő aminosavak szubsztitúciójával módosítunk. Például, mivel ismert, hogy humán OB peptid egérben biológiailag aktív, divergens aminosavmaradékok szubsztitúciója a humán szekvenciában összevetve a rágcsáló aminosavszekvenciájával, hasonlóan alkalmas OB peptidanalógokat fog eredményezni. Például a humán 53. vagy 98. helyzetben levő szerinmaradéka, vagy mindkettő (a 4. ábrán bemutatott, kialakulatlan peptidszekvenciában) helyettesíthető például glicinnel, alaninnel, valinnal, ciszteinnel, metioninnal vagy treoninnal. Hasonlóan, a 92. helyzetben levő argininmaradék (4. ábra) helyettesíthető például aszparaginnal, lizinnel, hiszti16
HU 223 563 Bl dinnel, glutaminnal, glutaminsavval, aszparaginsavval, szerinnel, treoninnal, metioninnal vagy ciszteinnel. Utalva még a 4. ábrára, a humán OB peptidben egyéb, szubsztitúcióra képesnek tűnő aminosavak a 118. helyzetű hisztidin, 121. helyzetű triptofán, 122. helyzetű alanin, 126. helyzetű glutaminsav, 127. helyzetű treonin, 128. helyzetű leucin, 132. helyzetű glicin, 139. helyzetű glicin, 159. helyzetű triptofán és 166. helyzetű glicin. Egy másik megvalósítási formában lehetséges 121 - 128-ig terjedő (a 4. ábrán mutatva) egy vagy több maradék helyettesítése például glicinnel vagy alaninnal, vagy a maradékok némelyikének helyettesítése kivéve a 123. helyzetű szerint és a 125. helyzetű leucint.
Egy másik megvalósítási formában OB polipeptid- előnyösen a humán OB polipeptid - analóg a polipeptidnek a csonkolt formája. Például már bemutattuk, hogy a 49. helyzetű glutamin nem létfontosságú és kivágható (delete) a peptidből. Ehhez hasonlóan, lehetséges a 121-128-ig terjedő divergens aminosavmaradékok némelyikének vagy mindegyikének a kivágása. Továbbá a találmány tárgyát képezi olyan OB analóg, amely a biológiai aktivitáshoz szükséges legkevesebb aminosavszekvenciával rendelkezik. Ez könnyen meghatározható, például OB fragmentumok aktivitását tesztelve OB specifikus antitestekhez való kötődési, a natív OB polipeptid aktivitását gátló vagy a natív OB peptidagonista-aktivitás képességére. Egy megvalósítási formában a találmány olyan csonkolt OB polipeptidet szolgáltat, amely tartalmazza a 117. és 167. helyzetű ciszteinmaradékok közötti diszulfidkötésekkel kialakult hurokszerkezetet (4. ábra). Egy másik megvalósítási formában a csonkolt analóg megfelel a 22. aminosavmaradéktól (amely a feltételezett szignálpeptid hasítási helyet követi) az 53-ig (az OB polipeptid korlátozott proteolízisét követően tömegspektrometriával feltárt, flexibilis hurokrégiót közvetlenül megelőző aminosavmaradékig) [Cohen et al., Protein Science 4, 1088 (1995)] terjedő résznek. Egy másik megvalósítási formában a csonkolt analóg megfelel a 61. aminosavmaradéktól (az OB polipeptid korlátozott proteolízisét követően tömegspektrometriával feltárt, flexibilis hurokrégiót közvetlenül követő aminosavmaradéktól) a 116. aminosavmaradékig (az első ciszteinmaradékot közvetlenül megelőző aminosavmaradékig) terjedő résznek. Egy még további megvalósítási formában a csonkolt analóg megfelel a 61-167. aminosavmaradékoknak.
Továbbá a feltételezett flexibilis hurok egy vagy több aminosavmaradéka szubsztituált az 54-60. maradékok közötti részen. Például egy vagy több maradékot helyettesíthet lizin, glutaminsav vagy cisztein (előnyösen lizin) keresztkötéshez, például egy polimerhez, mivel flexibilis hurokszerkezetek előnyben részesített helyek a fehérjeszármaztatáshoz. Más lehetőségként a flexibilis hurokhelyzetekben levő maradékok olyan aminosavmaradékokkal helyettesíthetők, amelyek proteolízissel szemben ellenállóbbak, de amelyek megtartják a flexibilis szerkezetet, például egy vagy több prolinnal. Egy még további megvalósítási formában szándékaink szerint olyan aminosavmaradékokkal helyettesítünk, amelyek tovább származtathatók, hogy ellenállóbbá tegyük azokat a lebomlással, például proteolízissel szemben.
Egy szakember meg tudja ítélni, hogy az előbb említett fragmentumméretek közelítőek, és hogy körülbelül 1-5 aminosavat foglalhatunk bele vagy vághatunk ki a felsorolt csonkolt analóg polipeptidnek vagy fragmentumának valamelyik vagy mindkét végéről, vagy belsejéből, azzal a kivétellel, hogy a diszulfidhíddal kötött hurokkal rendelkező analógokban a ciszteinmaradékoknak meg kell maradniuk.
Azt találtuk, a rekombináns peptidek közel fiziológiai körülmények között végzett cirkuláris dichroizmusával kimutatva hogy a rágcsáló OB polipeptid 50% α-helikális szerkezetet, és hogy a humán OB polipeptid körülbelül 60% α-helikális szerkezetet tartalmaz. Ennek megfelelően, egy másik megvalósítási formában aminosavmaradékok helyettesíthetők maradékokkal olyan OB polipeptidanalógok kialakítására, amelyek fokozott hajlamot mutatnak α-hélixszerkezetek kialakítására, vagy amelyek stabilabb α-hélixszerkezeteket alakítanak ki. Például α-hélixszerkezetet részesítünk előnyben, ha Glu-, Alá-, Leu-, His-, Trp-maradékokat viszünk be szubsztituensként a natív OB polipeptidben található aminosavmaradékok helyére. Előnyösen konzervatív aminosavszubsztitúciókat alkalmazunk, például aszparaginsavat a 29., 30., 44., 61., 76., 100. és/vagy 106. helyzetekben (ahogyan a 4. ábrán mutatjuk) glutaminsavval; izoleucin(oka)t leucinnal; glicint vagy valint, vagy bármilyen divergens aminosavat alaninnal (például a humán OB polipeptid 53. helyzetű szerbijét alaninnal); arginint vagy lizint hisztidinnel és tirozint és/vagy fenilalanint triptofánnal helyettesítünk. Az a-hélixszerkezet fokának vagy még fontosabban a stabilitásának növekedése nagyobb aktivitású, megnövekedett kötési affinitásé vagy hosszabb felezési idejű OB analógot eredményez. Specifikus megvalósítási formában az OB peptid 22-53. aminosavmaradékig teijedő részének hélixképző potenciálja megnövekedett. Egy másik megvalósítási formában a 61-116. aminosavmaradékig teijedő rész hélixképző potenciálja és stabilitása megnövekedett. Egy még további megvalósítási formában a 117-167. aminosavaknak megfelelő diszulfid hurokszerkezet hélixképző potenciálja megnövekedett. Szintén a találmány tárgyát képezik olyan OB analógok, amelyek egynél több, az előbbiekben említett doménen tartalmaznak fokozott α-helikális potenciált és stabilitást. Egy további megvalósítási formában olyan csonkolt OB polipeptidanalógokat hozunk létre, amelyekbe szerkezetformáló, például hélixet formáló aminosavmaradékokat építünk be polipeptidfragmentumok azon hajlamának ellensúlyozására, hogy nem rendelkeznek stabil szerkezettel.
Analógok, úgymint fragmentumok előállíthatok például a testtömeg-modulátor peptidanyag pepszines emésztésével. Egyéb analógok, úgymint muteinek előállíthatok a testtömeg-modulátor pepiidet kódoló szekvenciák standard, helyre irányított mutagenezisével. „Tömegmodulátor-aktivitást” mutató analógok, úgymint vagy promoterként, vagy inhibitorként működő kis molekulák, ismert in vivő és/vagy in vitro meghatározásokkal azonosíthatók.
HU 223 563 Bl
Az OB polipeptid kis molekulájú analógjai és peptidutánzatai
Az ob polipeptid szerkezete, előnyösen a humán OB polipeptidé, a szakmában ismert különböző módszerekkel analizálható. A fehéijeszekvencia hidrofiljelleg-analízissel jellemezhető [például Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824 (1981)]. A hidrofiljelleg-profil felhasználható az OB polipeptid hidrofób és hidrofil régióinak azonosítására, amely jelezhet a hajtogatott polipeptid belsejében rejtett régiókat, és olyan régiókat, amelyek a polipeptid külső részén elérhetők. Továbbá másodlagos szerkezeti analízis [például Chou et al., Biochem. 13, 222 (1974)] is végezhető olyan OB polipeptid régiók azonosítására, amelyek specifikus másodlagos szerkezeteket öltenek. Az előre megjósolt és meghatározott szerkezetek manipulációja, beleértve másodlagosszerkezet-előrejelzést, elvégezhető a szakmában hozzáférhető számítógépes programok segítségével.
Rekombináns OB polipeptidek bőséges forrását nyújtva, a találmány lehetővé teszi a polipeptid kvantitatív szerkezeti meghatározását. Különösen elegendő anyagot szolgáltat magmágneses rezonancia (NMR=nuclear magnetic resonance), infravörös (IR=infrared), Rámán, és ultraviola (UV), különösen cirkuláris dikroizmus (CD), spektroszkópiai analízisekhez. Különösen az NMR szolgáltatja - természetes környezetüket jobban közelítve - oldatban levő molekulák nagyon hathatós szerkezeti analízisét [Marion et al., Biochim. Biophys. Rés. Comm. 113, 967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985); Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1681-1685 (1980)]. A szerkezeti analízis egyéb módszerei szintén alkalmazhatók. Ezek közé tartozik - de korlátozást nem jelent - a röntgenkristallográfia [Engstom, Biochem. Exp. Bioi. 7/, 7-13. (1974)].
Egy még további megvalósítási formában az OB polipeptidanalóg megvizsgálható, vajon ad-e keresztreakciót natív OB polipeptidre vagy annak specifikus fragmentumára specifikus antitesttel. A keresztreakció foka információt nyújt a fehérjék szerkezeti homológiájáról vagy hasonlóságáról, vagy olyan régiók hozzáférhetőségéről, amelyek a polipeptid fragmentumspecifikus antitest létrehozásához felhasznált részeinek felelnek meg.
OB analógok screenelése
Polipeptidanalógok screenelésére különböző screenelési technikák ismertek a szakmában. Hozzáférhetők különböző vegyszerek könyvtárai. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi ilyen könyvtáraknak - például a kutatás évei során keletkezett szintetikus vegyületek könyvtárainak, természetes vegyületek könyvtárainak és kombinált könyvtáraknak - lent részleteiben leírtak szerint OB polipeptidanalógokra történő screenelése. A találmány egy megvalósítási formájában felöleli ilyen könyvtáraknak olyan vegyületekre történő screenelését, amelyek anti-07? polipeptidantitestekhez, előnyösen anti-humán ob polipeptidantitestekhez kötődnek. Egy másik vonatkozásban, ha az OB receptort már azonosítottuk (lásd lent), a szakmában ismert bármilyen screenelési technika alkalmazható OB-receptor-agonisták vagy -antagonisták screenelésére. A találmány tárgyát képezi kis molekulájú ligandumok vagy ligandumanalógok és utánzatok screenelése ugyanúgy, mint olyan természetes ligandumok screenelése, amelyek in vivő kötődnek az OB receptorhoz és annak agonistái vagy antagonistái.
A receptor elsődleges szekvenciájának az ismerete és ennek a szekvenciának a hasonlósága ismert funkciójú fehérjék szekvenciájával, kiindulási alapot nyújthat a fehérje agonistáihoz és antagonistáihoz. Antagonisták azonosítása és screenelése elősegíthető továbbá a fehéqe szerkezeti jellemzőinek meghatározásával, például röntgenkristallográfia, neutrondiffrakció, magmágnesesrezonancia-spektrometria és egyéb szerkezetmeghatározó technikák alkalmazásával. Ezek a technikák agonisták és antagonisták ésszerű tervezését vagy azonosítását nyújtják.
Egy másik megközelítés rekombináns baktriofágokat alkalmaz nagy könyvtárak előállítására. A „fágmódszer” alkalmazásával [Scott et al., Science 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science 249, 404-406 (1990)] nagyon nagy könyvtárak hozhatók létre (ΙΟ6—108 kémiai egységek). Egy második megközelítés elsődleges kémiai módszereket alkalmaz, amelyre példa a Geysen-módszer [Geysen et al., Molecular Immunology 23, 709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method 102, 259-274 (1987)] és az újabb Fodor-féle módszer [Fodor et al., Science 257, 767-773 (1991)]. Az alábbi közlemények agonistaként vagy antagonistaként tesztelhető peptidek keverékének előállítási módszereit írják le [Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry Vol. 5, Abstr. FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Rés. 37, 487-493 (1991); Houghton, 1986. decemberében megadott U.S.P. 4,631,211 és Rutter et al., 1991. április 23-án megadott U.S.P. 5,010,175 számú szabadalmi iratok].
Egy másik vonatkozásban szintetikus könyvtárak [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10 700-10 704 (1993) és Lám et al., WO 92/00252 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, amelyeket itt teljes terjedelmükben beépítettünk referenciaként] és hasonlók használhatók a találmány szerinti OB receptorligandumok screenelésére. Ilyen könyvtárakkal receptorantagonisták kimutathatók a receptort az OB receptor tényleges klónozása nélkül kifejező sejtek alkalmazásával.
Egy másik lehetőségként meghatározások végezhetők oldható ligandumoknak olyan sejtekhez történő kötődésére, amelyek az OB receptorligandum-kötő dómén rekombináns formáját fejezik ki. Az oldható ligandum, mint rekombináns vagy szintetikus OB polipeptid könnyen biztosítható.
A screenelés elvégezhető az OB receptort kifejező rekombináns sejtekkel vagy másképpen, tisztított receptor fehérje - például a fentiek szerint rekombinánsan előállított - felhasználásával. Például a jelölt, oldható vagy oldhatóvá tett OB receptor - amely magában foglalja a molekula ligandumkötő részét - ligan18
HU 223 563 Bl dumkötő képességét felhasználhatjuk könyvtárak screenelésére a következő referenciákban leírtak szerint.
OB polipeptidszármazékok
A jelen fehérjét (itt a „fehérje” kifejezésbe beleértjük a „polipeptidet”, kivéve ha másképpen jelezzük) általában egy vagy több kémiai résznek a fehérjerészhez történő hozzákapcsolásával származtathatjuk. A kémiailag módosított származékokat tovább formulázhatjuk intraartériás, intraperitoneális, intramuszkuláris, szubkután, intravénás, orális, nazális, rektális, bukális, szublingvális, pulmonális, topikális, transzdermális vagy egyéb úton történő beadáshoz. A biológiailag aktív fehérjék kémiai módosítása bizonyos körülmények között további előnyöket nyújt, úgymint a terápiás fehérje stabilitásának és keringési idejének növekedését, és az immunogenitás csökkenését [Davis et al., 1979. december 18-án megadott U.S.P. 4,179,337 számú szabadalmi irat; Abuchowski et al., „Soluble PolymerEnzyme Adducts” in Enzyme and Drugs 367-383, Holcenberg and Roberts eds., Wiley-Interscience, New York (1981)]. Fehéijemódosításokat és fúziós fehérjéket leíró áttekintő cikk [Francis, Focus on Growth Factors 3, 4-10(1992)].
Kémiai alkotórészek a származékok elkészítéséhez
A származékok készítéséhez alkalmas kémiai részek vízoldható polimerek közül választhatók. A kiválasztott polimereknek annyira kell vízoldhatóknak lenniük, hogy a hozzákapcsolt fehérje ne csapódjon ki vizes közegben, úgymint fiziológiai környezetben. A polimer - a végtermék készítmény terápiás alkalmazásához - előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható. A szakember ki tudja választani az ilyen szempontokon alapuló kívánt polimert ha a polimer/fehérje konjugátum terápiás felhasználásra kerül, és ha igen, a kívánt adagolást, keringési időtartamot, proteolízisrezisztenciát és egyéb szempontokat. A jelen fehérjékre és peptidekre ezek megállapíthatók az itt megadott assay-k felhasználásával.
Polimer molekulák
A vízoldható polimer kiválasztható például polietilénglikolt, etilénglikol/propilénglikol kopolimert, (karboxi-metil)-cellulózt, dextránt, poli(vinil-alkohol)-t, poli(vinil-pirrolidon)-t, poli-l,3-dioxolánt, poli-1,3,6trioxánt, etilén/maleinsavanhidrid kopolimert, poliaminosavakat (vagy homopolimereket vagy random kopolimereket) és dextránt vagy poli(vinil-pirrolidon)-polietilénglikolt, polipropilénglikol homopolimereket, polipropilén-oxid/etilén-oxid kopolimereket, polioxi-etilezett poliolokat és poli(vinil-alkohol)-t tartalmazó csoportból. Polietilénglikol-propionaldehid vízben való stabilitásának köszönhetően előnyt jelenthet az elkészítésnél.
A polimer bármilyen molekulatömegű lehet, és lehet elágazó vagy egyenes láncú. Polietilénglikolra az előnyben részesített molekulatömeg körülbelül 2 kD és körülbelül 100 kD közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelenti, hogy a polietilénglikolos készítményekben néhány molekula nagyobb, néhány pedig kisebb tömegű, mint a megadott molekulatömeg) a könnyű kezelhetőség és elkészítés céljából. Más méretek is alkalmazhatók a kívánt terápiás profiltól (például a kívánt elengedés fenntartásának időtartamától, ha létezik, a biológiai aktivitásra gyakorolt hatásaitól, a könnyű kezelhetőségtől, az antigenitás mértékétől vagy hiányától és a polietilénglikolnak a terápiás fehérjére vagy analógjára gyakorolt egyéb ismert hatásaitól) függően.
Polimer/fehérje arány
Az így hozzákapcsolt polimer molekulák száma változhat, és egy szakember képes megállapítani a működésre gyakorolt hatást. Lehet készíteni egyszeres vagy kétszeres, háromszoros, négyszeres vagy kombinált származékot ugyanazzal vagy különböző kémiai résszel (például polimerekkel, úgymint különböző tömegű polietilénglikollal). A polimer molekulák aránya a fehérjéhez (vagy pepiidhez) képest aszerint változik, ahogyan ezek koncentrációi a reakciókeverékben. Általában, az optimális arányt (a reakció hatékonyságának olyan értelmében, hogy nincsen felesleges reagálatlan fehérje vagy polimer) olyan faktorokkal határozzuk meg, mint a származtatás kívánt foka (például egyszeres, kétszeres, háromszoros stb.), a kiválasztott polimer molekulatömege, a polimer elágazó vagy egyenes láncú és a reakciókörülményei.
A kémiai alkotórész hozzákapcsolása a fehérjéhez
A polietilénglikol-molekulákat (vagy kémiai részeket) úgy kell hozzákapcsolni a fehérjéhez, hogy figyelembe vegyük a fehérje funkcionális vagy antigén doménjeire gyakorolt hatásokat. A szakember számára számos kapcsolási módszer áll rendelkezésre, például az itt referenciaként beépített EPO 401384 számú szabadalmi irat (PEG hozzákötése G-CSF-hez). Lásd még [Malik et al., Exp. Hematol. 20, 1028-1035 (1992)] GM-CSF pegilezését trezil-klorid felhasználásával. Például polietilénglikol kovalensen köthető aminosavmaradékokon keresztül reakciós csoporttal, úgymint szabad amino- vagy karboxilcsoporttal. Reakciós csoportok azok, amelyekhez aktivált polietilénglikol-molekula hozzáköthető. A szabad aminocsoporttal rendelkező aminosavmaradékok közé tartozhatnak lizinmaradékok és az N-terminális aminosavmaradékok, a szabad karboxilcsoporttal rendelkezők közé aszparaginsavmaradékok, glutaminsavmaradékok és a C-terminális aminosavmaradékok tartozhatnak. Szulfhidrilcsoportok is használhatók reakciós csoportként polietilénglikol-molekula(k) hozzákapcsolásához. Terápiás célokra előnyben részesítjük az aminocsoporton - úgymint az N-végen vagy lizincsoporton - keresztül történő hozzákapcsolást. A receptorkötéshez fontos maradékokon keresztül történő kapcsolás kerülendő, ha receptorkötésre szükség van.
N-terminálisan kémiailag módosított fehérjék
Specifikusan szükség lehet N-terminálisan kémiailag módosított fehérjére. A jelen készítmények szemléltetésére polietilénglikolt alkalmazva, polietilénglikolmolekuláknak (molekulatömeg, elágazások stb. szerint), a polietilénglikol-molekulák fehérje (vagy peptid)-molekulákhoz viszonyított arányának a reakciókeverékben, az elvégzendő pegilezési reakció típusának és a szelektált N-terminálisan pegilezett fehérje kinyerésére szolgáló módszernek számos változata közül választhatunk. Az N-terminálisan pegilezett készítmény
HU 223 563 Β1 kinyerésére szolgáló módszer (azaz ennek a résznek az elválasztása más egyszeresen pegilezett részektől, ha szükséges) lehet az N-terminálisan pegilezett anyagnak pegilezett fehérjemolekulák populációjából történő tisztítása. Szelektív N-terminális kémiai módosítás végezhető reduktív alkilezéssel, amely az egyes fehérjében a származtatáshoz hozzáférhető, különböző típusú elsődleges aminocsoportok különböző reaktivitását (az N-véggel szemben lizin) használja ki. A megfelelő reakciókörülmények között a fehérje N-végén karbonilcsoportot tartalmazó polimerrel történt, lényegében szelektív módosítást érünk el. Például a fehérje szelektíven N-terminálisan pegilezhető a reakciónak olyan pH-η történő elvégzésével, amely lehetővé teszi a lizinmaradékok ε-aminocsoportjai és a fehérje N-terminális α-aminocsoportjai közötti pKa-differenciák előnyeinek kihasználását. Vízoldható polimernek fehérjéhez történő ilyen szelektív módosító hozzákapcsolása ellenőrzött: a polimerrel való konjugáció főleg a fehérje N-végén játszódik le, és más reakciós csoportoknak - úgymint a lizinoldallánc aminocsoportjainak - nem történik számottevő módosítása. Reduktív alkilezést alkalmazva a vízoldható polimer lehet a fent leírt típusú, és rendelkeznie kell egy egyedülálló aldehiddel a fehérjéhez történő kötődéshez. Felhasználható egyedülálló reaktív aldehidet tartalmazó polietilénglikol-propionaldehid.
OB polipeptiddel kapcsolatos nukleinsavak
A fent említettek szerint a találmány tárgyát ugyanúgy képezik ob polipeptideket kódoló nukleinsavak, mint az OB génhez kapcsolódó genomiális 5’, 3’ nemkódoló szekvenciák és intronok. Tehát a találmánynak megfelelően alkalmazhatók a szakmán belüli hagyományos molekuláris biológiai, mikrobiológiai és rekombináns DNS-technikák. Az ilyen technikákat teljes mértékben leírták az irodalomban. Lásd például [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer Verlag (1985); Hames et al., eds., Transcription and Translation, Oxford University Press (1984); Freshney ed., Animál Cell Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Celis and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, Wiley, New York (1984)]. A találmány tárgyához tartoznak a jól ismert PCR technikán alapuló gén- vagy nukleinsavizolálási, -klónozási, -szekvenálási, -analizálási és -jellemzési stratégiák.
A „replikon” olyan genetikai elem (például plazmid, kromoszóma, vírus), amely in vivő DNS-replikáció autonóm egységeként működik, azaz képes saját kontrollja alatt replikálódni.
A „vektor” egy replikon, úgymint plazmid, fág vagy kozmid, amelyhez egy másik DNS-szegmens kapcsolódhat oly módon, hogy a kapcsolódó szegmens replikációját átvigye.
A „kazetta” olyan DNS-szegmensre utal, amely specifikus restrikciós hasítási helyeken egy vektorba inszertálható. A DNS-szegmens a szóban forgó polipeptidet kódolja, és a kazettát és restrikciós helyeket úgy tervezzük meg, hogy biztosítsuk a kazetta inszercióját a megfelelő leolvasási keretbe transzkripcióhoz és transzlációhoz.
„Heterológ” DNS olyan DNS-re utal, amely természetes körülmények között nem található meg a sejtben vagy a sejt kromoszomális helyén. A heterológ DNS előnyösen a sejt számára idegen gént tartalmaz.
A sejt exogén vagy heterológ DNS-sel történt „transzfekción” esett át, ha ilyen DNS-t vittünk be a sejtbe. A sejtet „transzformáltuk” exogén vagy heterológ DNS-sel, ha a transzfekciós DNS fenotípusos változást okoz. A transzformáló DNS-nek előnyösen integrálódnia (kovalensen kötődni) kell a sejt genomját alkotó kromoszomális DNS-be.
A „klón” egy sejtből vagy közös ősből mitózissal származó sejtek populációja.
A „nukleinsavmolekula” a ribonukleozidok (adenozin, guanozin, uridin vagy citidin; „RNS-molekulák”) foszfát-észter polimer formájára vagy a dezoxiribonukleozidok (dezoxiadenozin, dezoxiguanozin, dezoxitimidin vagy dezoxicitidin; „DNS-molekulák”) foszfátészter polimer formájára utal, vagy egyszálú vagy kettős szálú hélix formájában. Kettős szálú DNS-DNS, DNS-RNS és RNS-RNS hélixek lehetségesek. A nukleinsavmolekula kifejezés - és különösen DNS- vagy RNS-molekula - csak a molekula elsődleges és másodlagos szerkezetére utal, és nem korlátozódik annak valamely harmadlagos vagy negyedleges alakjára. Tehát ez a kifejezés kettős szálú DNS-t foglal magában, amely többek között lineáris vagy cirkuláris DNS-molekulákban (például restrikciós fragmentumokban), plazmidokban és kromoszómákban található. Az egyes kettős szálú DNS-molekulák szerkezetének kifejtésekor szekvenciákat leírhatunk itt a normálszokások szerint, csak az 5’-től 3’ -ig terjedő irányú szekvenciát a DNS át nem írt szála (azaz a mRNS-sel homológ szekvenciájú szála) mentén. A „rekombináns DNS-molekula” olyan DNS-molekula, amely molekuláris biológiai manipuláción ment át.
Egy nukleinsavmolekula „hibridizálható” egy másik nukleinsavmolekulával, úgymint cDNS-sel, genomiális DNS-sel vagy RNS-sel, ha a nukleinsavmolekula egyszálú formája fokozatos hűtéssel összekapcsolható a másik nukleinsavmolekulával a megfelelő hőmérséklet és ionerősség körülményei között (lásd a Sambrook és munkatársai által leírtakat, fent). A hőmérséklet és ionerősség körülményei határozzák meg a hibridizáció „szigorúságát”. Homológ nukleinsavak előzetes screeneléséhez gyenge szigorúságú hibridizációs körülményeket - 55 °C Tm-nek megfelelőt - alkalmazhatunk, például 5xSSC, 0,1% SDS, 0,25% tej, és formamid nélkül; vagy 30% formamid, 5xSSC, 0,5% SDS. Mérsékelten szigorú hibridizációs körülményeknek magasabb Tm, például 40% formamiddal, 5 x vagy 6 χ SSC-vel, felel meg. Nagy szigorúságú hibridizációs körülményeknek a legmagasabb Tm, például
HU 223 563 Bl
50% formamiddal, 5x vagy 6xSSC-vel, felel meg. A hibridizációhoz szükséges, hogy a két nukleinsav komplementer szekvenciákat tartalmazzon, bár a hibridizáció szigorúságától függően a bázisok között „mismatch” (hibás párosodás) előfordulhat. A nukleinsavak hibridizációjához megfelelő szigorúság a nukleinsavak hosszától és a komplementáció fokától függ, változatok jól ismertek a szakmában. Minél nagyobb a nukleotidszekvenciák közötti hasonlóság vagy homológia foka, annál nagyobb az ilyen szekvenciákkal rendelkező nukleinsavak hibridjeinek Tm-értéke. A nukleinsavhibridizációk relatív stabilitása (magasabb Tmnek megfelelő) a következő sorrendben csökken: RNS:RNS, DNS:RNS, DNS:DNS. 100 nukleotidnál hosszabb hibridekhez Tm kiszámítására egyenleteket vezettek le (lásd Sambrook et al., (1989) 9.50-9.51, fent). Rövidebb nukleinsavakkal, azaz oligonukleotidokkal történő hibridizáció számára a mismatchhelyek fontosabbá válnak, és az oligonukleotid hosszúsága határozza meg ezek specifitását (lásd Sambrook et al., (1989) 11.7-11.8, fent). A hibridizálható nukleinsavak minimális hosszúsága előnyösen legalább körülbelül 10 nukleotid; még előnyösebben legalább körülbelül 15 nukleotid; legelőnyösebben a hosszúság legalább körülbelül 20 nukleotid.
„Homológ rekombináció” kifejezés egy vektor idegen DNS-szekvenciájának kromoszómába történő inszerciójára utal. A vektor előnyösen egy specifikus kromoszómahelyet céloz meg a homológ rekombinációhoz. Specifikus homológ rekombinációhoz a vektor elegendő hosszúságú, a kromoszóma szekvenciájával homológ régiót tartalmaz ahhoz, hogy lehetővé tegye a vektor komplementer kötődését és beépülését a kromoszómába. Hosszabb homológ régiók és nagyobb fokú szekvenciahasonlóság növelheti a homológ rekombináció hatékonyságát.
Egy DNS „kódolószekvencia” olyan kettős szálú DNS-szekvencia, amely a sejtben in vitro vagy in vivő átíródik és lefordítódik (transzkripció és transzláció) polipeptiddé, amennyiben megfelelő szabályozószekvenciák kontrollja alá helyezzük. A kódolószekvencia határait az 5’ (amino-) végen levő startkodon és 3’ (karboxil-) végen levő transzlációs stopkodon határozza meg. A kódolószekvencia tartalmazhat - de nem korlátozódik ezekre - prokariótaszekvenciákat, eukarióta-mRNS-ből cDNS-t, eukarióta (például emlős)DNS-ből genomiális DNS-szekvenciákat, és még szintetikus DNS-szekvenciákat. Ha a kódolószekvenciát eukarióta sejtben szándékozunk kifejezni, általában poliadenilációs szignál- és transzkripciós terminációs szekvencia helyezkedik el a kódolószekvenciához képest 3 ’ irányban.
OB-kódolö és -szegélyező szekvenciák izolálása
A találmány tárgyát képező nukleinsavak, ahogyan jeleztük, kiterjednek egyéb olyan nukleinsavakra, amelyek az 1A-D. ábrán (2. számú szekvencia), 3. ábrán (4. számú szekvencia), 5. ábrán (5. számú szekvencia) és a 6. ábrán (6. számú szekvencia) közzétett peptidek kifejeződését kódolják. Ezek szerint, bár az ob gént illetően specifikus DNS-t izoláltunk és szekvenáltunk, potenciálisan bármilyen állati sejt nukleinsavforrásként szolgálhat a találmány szerinti peptideket kódoló gén molekuláris klónozásához. A DNS-t a szakmában ismert standard eljárásokkal megkaphatjuk klónozott DNS-ből (például DNS-„könyvtárból”) - kémiai szintézissel, cDNS-klónozással, vagy a genomiális DNS vagy fragmentumainak klónozásával - tisztítva a kívánt sejtből (lásd például Sambrook et al., (1989) és Glover, (1985), fent). Genomiális DNS-ből származó kiónok a kódolórégiókon felül tartalmazhatnak szabályozó- és intron-DNS-régiókat; cDNS-ből származó kiónok nem tartalmaznak intronszekvenciákat. Bármi legyen a forrás, a gént megfelelő vektorba molekulárisán klónoznunk kell a gén elszaporítása céljából.
A génnek genomiális DNS-ből történő molekuláris klónozásánál a genomiális DNS amplifikálható (sokszorozható) cDNS-szekvenciákból választott primerek alkalmazásával. Más lehetőségként olyan DNS-fragmentumokat hozunk létre, amelyek közül néhány a kívánt gént kódolja. A DNS specifikus helyeken hasítható különböző restrikciós enzimek alkalmazásával. DNáz szintén használható mangán jelenlétében a DNS fragmentálására, vagy a DNS osztható fizikailag, például szonifikálással. A lineáris DNS-fragmentumok azután méret szerint szétválaszthatok standard technikákkal - beleértve, de korlátozást nem jelentve - agaróz- és poliakrilamid-gélelektroforézist és oszlopkromatográfiát.
Amint létrehoztuk a DNS-fragmentumokat, a kívánt ob vagy ob-hez hasonló gént tartalmazó specifikus DNS-fragmentum azonosítása számos úton elvégezhető. Például, ha ob vagy oú-hez hasonló gén vagy ennek specifikus RNS-e, vagy annak fragmentuma elegendő mennyiségben rendelkezésre áll, és tisztítható és jelölhető, a létrehozott DNS-fragmentumok screenelhetők jelölt próbával történő nukleinsavhibridizációval [Benton et al., Science 196, 180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)]. A találmány olyan nukleinsavpróbákat nyújt, amelyek az itt közzétett specifikus szekvenciákból kényelmesen elkészíthetők, például egy hibridizálható próba az 1A-E. ábrán (1. számú szekvencia) vagy a 2A. és 2B. ábrán (3. számú szekvencia) bemutatott szekvenciák legalább 10, és előnyösen 15 nukleotidból álló fragmentumának megfelelő nukleotidszekvenciával rendelkezik. Előnyösen olyan fragmentumot választunk, amely a találmány szerinti modulátor pepiidhez nagyon egyedi. A próbával lényegében homológ DNS-fragmentumok hibridizálni fognak. A fent említettek szerint minél nagyobb fokú a homológia, annál szigorúbb hibridizációs körülmények alkalmazhatók. Egy megvalósítási formában gyenge szigorúságú hibridizációs körülményeket használunk homológ modulátor peptidek azonosítására. Előnyben részesített megvalósításban azonban - és itt kísérletesen bemutatva a találmány szerinti modulátor peptidet kódoló nukleinsav az 1A E. ábrán (1. számú szekvencia) és 2A. és 2B. ábrán (3. számú szekvencia) bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavval, vagy annak hibridizálható fragmentumával mérsékelten szigorú kö21
HU 223 563 Bl rülmények között hibridizál; még előnyösebben, nagy szigorúsági! körülmények között hibridizál.
Más lehetőségként a gén jelenléte kimutatható kifejezett termékének fizikai, kémiai vagy immunológiai sajátságokon alapuló meghatározásaival. Például kiválaszthatók a megfelelő mRNS-ekkel hibridszelektív olyan cDNS-klónok vagy DNS-klónok, amelyek például a jelen modulátor peptidekhez hasonló vagy azonos elektroforetikus vándorlású, izoelektromos fókuszáló viselkedésű, proteolitikus emésztési térképű, tirozin-foszfatáz-aktivitású vagy antigénsajátságú fehérjét termelnek. Például a találmány szerinti antitestek kényelmesen használhatók egyéb forrásokból származó modulátor peptidhomológok screenelésére.
A találmány szerinti modulátor pepiidet kódoló gén azonosítható mRNS-szelekcióval is, azaz nukleinsavhibridizációt követő in vitro transzlációval. Ebben az eljárásban fragmentumokat használunk komplementer mRNS-ek hibridizációval történő izolálására. Ilyen DNS-fragmentumok hozzáférhető, tisztított modulátor DNS-t képviselhetnek. Az izolált mRNS in vitro transzlációs termékeinek immunprecipitációs analízise vagy funkciós analízise (például tirozin-foszfatáz-aktivitása) azonosítja a mRNS-t és ilyenformán a komplementer DNS-fragmentumot, amely a kívánt szekvenciákat tartalmazza. Továbbá specifikus mRNS-ek szelektálhatok sejtekből izolált poliszómáknak olyan rögzített antitestekhez történő adszorpciójával, amelyek specifikusan modulátor peptid ellen irányulnak.
Radioaktívan jelölt modulátor peptid cDNS szintetizálható a szelektált mRNS-nek (az adszorbeált poliszómákból) templátként történő felhasználásával. A radioaktívan jelölt mRNS vagy cDNS azután felhasználható próbaként, homológ modulátor peptid DNS-fragmentumoknak egyéb DNS-fragmentumok közül történő azonosítására.
A fent említettek szerint, tömegmodulátor peptideket kódoló DNS-szekvenciát az itt leírtak szerint inkább szintetikusan készíthetünk, mint klónozással. A DNS-szekvencia megtervezhető a tömegmodulátor peptid aminosavszekvenciájának megfelelő kodonokkal. Általában a jövendőbeli gazdasejt számára előnyben részesített kodonokat választunk, ha a szekvenciát expresszióhoz használjuk. A teljes szekvenciát egymást átfedő, standard módszerekkel előállított, és teljes kódolószekvenciává összeállított oligonukleotidokból rakjuk össze [Edge, Natúré 292, 756 (1981); Nambair et al., Science 223, 1299 (1984); Jay et al., J. Bioi. Chem. 259, 6311 (1984)].
Szintetikus DNS-szekvenciák a fentiek szerint lehetővé teszik olyan gének kényelmes összeállítását, amelyek tömegmodulátor-analógokat fejeznek ki. Más lehetőségként, analógokat kódoló DNS készíthető a natív OB gének vagy cDNS-ek helyre irányított mutagenezisével, és analógok készíthetők közvetlenül, hagyományos polipeptidszintézis alkalmazásával.
Nem természetes aminosavaknak fehérjékbe történő helyspecifikus beépítésére szolgáló általános módszert írnak le Noren és munkatársai [Science 244, 182-188 (1989)]. Ez a módszer alkalmazható az ob polipeptid nem természetes aminosavakkal rendelkező analógjainak elkészítésére.
Nemkódoló nukleinsavak
A találmány kiterjed antiszenz nukleotidok és ribozimok előállítására, amelyek felhasználhatók a tömegmodulátor fehérjék kifejeződésének a transzlációs szintnél történő gátlására. Ez a megközelítés antiszenz nukleinsavakat és ribozimokat használ fel specifikus mRNS transzlációjának gátlására, vagy az mRNS antiszenz nukleinsavval történő álcázásával, vagy ribozimmal történő hasításával.
Antiszenz nukleinsavak olyan DNS- vagy RNSmolekulák, amelyek a specifikus mRNS-molekulának legalább egy részével komplementerek [Weintraub, Sci. Am. 262, 40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172, 289-295 (1988)]. Ezek a sejtben hibridizálnak ezzel a mRNS-sel kettős szálú molekulát képezve. A sejt nem fordít le ebben a kettős szálú alakban komplexben levő mRNS-t. Ilyenformán antiszenz nukleinsavak gátolják az mRNS kifejeződését fehérjévé. Körülbelül 15 nukleotidból álló oligomerek és az iniciációs AUG kodonnal hibridizáló molekulák különösen hatékonyak, mivel ezeket könnyű szintetizálni, és valószínűleg kevesebb problémát vernek fel, mint a nagyobb molekulák, ha bevezetjük azokat a tömegmodulátor peptideket termelő sejtekbe. Antiszenz módszereket már sok gén in vitro kifejeződésének gátlására felhasználtak [Marcus-Sekura (1988), fent; Hambor et al., J. Exp. Med. 168, 1237-1245 (1988)].
A ribozimok olyan RNS-molekulák, amelyek más egyszálú RNS-molekulák specifikus hasításának képességével rendelkeznek, némileg hasonló módon, mint a DNS restrikciós endonukleázok. A ribozimokat azon megfigyelés alapján fedezték fel, hogy bizonyos mRNS-ek rendelkeznek saját intronjaik kivágásának képességével. Ezen RNS-ek nukleotidszekvenciájának módosításával kutatók olyan molekulákat tudtak készíteni, amelyek egy RNS-molekulában specifikus nukleotidszekvenciákat felismernek, és kivágják azokat [Cech, J. Am. Med. Assoc. 260, 3030-3034 (1988)]. Mivel ezek szekvenciaspecifikusak, csak különleges szekvenciával rendelkező mRNS-ek inaktiválódnak.
Kutatók a ribozimok két típusát azonosították, Tetrahymena-típust és „hammerhead” („kalapácsfejű”) típust. A Tetrahymena típusú ribozimok 4 bázisból álló szekvenciákat, míg a „kalapácsfejű” típusúak 11-18 bázisból álló szekvenciákat ismernek fel. Minél hosszabb a felismert szekvencia, annál valószínűbb kizárólagosan a cél-mRNS fajtában történő előfordulása. Ilyenformán a kalapácsfejű típusú ribozimok előnyösebbek a Tetrahymena típusú ribozimoknál specifikus mRNS-ek inaktiválása céljából, és a 18 bázist felismerő szekvenciák előnyösebbek a rövidebb felismerőszekvenciáknál.
Az itt leírt DNS-szekvenciák tehát felhasználhatók mRNS-ekkel szembeni antiszenz molekulák elkészítésére és ribozimok, amelyek hasítják a fenti, a tömegmodulátor fehérjéknek és azok ligandumainak kifejezésében részt vevő mRNS-eket, ily módon gátolva az ob gén kifejeződését, és megnövekedett tömeggyarapodáshoz és kövérséghez vezetve.
HU 223 563 Β1
Egy másik megvalósítási formában az OB nukleinsav kódoló- és komplementer szálaival, vagy az OB gén 5’, 3’ nemkódoló régióival komplementer rövid oligonukleotidok, vagy a kódolórégió intronjai szintén a találmány tárgyát képezik. Ilyen nukleinsavak használhatók próbaként, mint közvetlenül jelölt oligonukleotidpróbák, vagy mint primerek a polimerázláncreakcióhoz az ob génben mutációk jelenlétének, vagy OB mRNS kifejeződési szintjének kimutatására. A találmány szerinti nemkódoló nukleinsavak előnyösen a humán OB génből származnak.
Egy specifikus megvalósítási formában a nemkódoló nukleinsavak gondoskodnak homológ rekombinációról a sokszorozható gén és/vagy egyéb, az OB gén szomszédságában levő szabályozószekvenciák beépülésére, például az OB polipeptidkifejeződés magasabb szintjeinek biztosítására, vagy az ob gén szabályozószekvenciáiban az OB polipeptid megfelelő szintű kifejeződését gátló mutáció legyőzésére (lásd a WO 91/06666, WO 91/09955 és WO 90/14092 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentéseket).
OB polipeptid előállítása: expresszió és szintézis
A transzkripciós és transzlációs kontrollszekvenciák DNS szabályozószekvenciák, úgymint promoterek, fokozok (enhancers), terminátorok és hasonlók, amelyek biztosítják a kódolószekvencia kifejeződését a gazdasejtben. Eukarióta sejtekben poliadenilációs szignálok a kontrollszekvenciák.
A kódolószekvencia transzkripciós és transzlációs kontrollszekvenciák „kontrollja alatt” van a sejtben, amikor RNS polimeráz átírja a kódolószekvenciát mRNSbe, amely azután splicinggal transz-RNS-sé alakul és a kódolószekvencia által kódolt fehéijére fordítódik le.
A „szignálszekvencia” a sejt felszínén kifejezendő fehérje kódolószekvenciájának elején található. Ez a szekvenciaszignál pepiidet kódol az érett polipeptid N-terminálisán, amely irányítja a gazdasejtet a polipeptid áthelyezésében. A „transzlokációs szignálszekvencia” kifejezést szintén használjuk itt az ilyen típusú szignálszekvenciára utalva. Transzlokációs szignálszekvenciák találhatók eukarióták és prokarióták különböző natív fehérjéivel összekapcsolva, és gyakran mindkét típusú szervezetben működőképesek.
DNS-szekvencia „működőképesen kapcsolódik” egy expressziós kontrollszekvenciához, ha az expressziós kontrollszekvencia ellenőrzi és szabályozza ennek a DNS-szekvenciának a transzkripcióját és transzlációját. A „működőképesen kapcsolódik” kifejezésbe beletartozik egy megfelelő startszignál (például ATG) a kifejezendő DNS-szekvencia előtt és a helyes leolvasási keret fenntartása, hogy lehetővé tegye a DNS-szekvencia kifejeződését az expressziós kontrollszekvencia kontrollja alatt és a kívánt, a DNS-szekvencia által kódolt termék előállítását. Ha a rekombináns DNS-molekulába bevinni kívánt gén nem tartalmaz megfelelő startszignált, úgy egy startszignál inszertálható upstream (5’) a gén leolvasási keretébe.
A „promoter szekvencia” olyan DNS szabályozórégió, amely képes RNS-polimeráz megkötésére a sejtben és downstream (3’) kódolószekvencia transzkripciójának elindítására. A találmány definiálásának céljából, a promoter szekvencia 3’ végével a transzkripciós iniciációs hellyel határos, és kiterjed upstream (5’ irányban) magában foglalva a háttérhez képest kimutatható szintű transzkripció elindításához szükséges minimális számú bázist vagy elemet. A promoter szekvencián belül ugyanúgy található transzkripciós iniciációs hely (megfelelően definiálva, például SÍ nukleázzal térképezve), mint az RNS-polimeráz kötéséért felelős fehérjekötő domének (konszenzusszekvenciák).
A találmánynak egy másik jellegzetessége az itt nyilvánosságra hozott DNS-szekvenciák kifejeződése. A szakmában ismert módon DNS-szekvenciák kifejezhetek úgy, hogy expressziós kontrollszekvenciával működőképesen összekötjük azokat egy megfelelő expressziós vektorban, és ezt az expressziós vektort alkalmazzuk megfelelő egysejtű gazdaszervezet transzformálására.
A találmány szerinti DNS-szekvencia ilyen működőképes hozzákapcsolása expressziós kontrollszekvenciához természetesen magában foglalja - ha nem képezi már eleve a DNS-szekvencia részét - a DNS-szekvencia ellátását egy ATG iniciációs kodonnal upstream a helyes leolvasási keretbe.
Gazdaszervezet/expressziós vektor kombinációk széles választéka alkalmazható a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezésére. Használható expressziós vektorok például kromoszomális, nem kromoszomális és szintetikus DNS-szekvencia-szegmensekből állhatnak. Megfelelő vektorok közé tartoznak SV40 és ismert bakteriális plazmidok származékai, például E. coli plazmidok, colEl, pCRl, pBR322, pMB9, pUC vagy pUC plazmidszármazékok, például pGEX vektorok, pET vektorok, pmal-c, pFLAG stb. és ezek származékai, plazmidok, úgymint RP4; fág DNS-ek, például a λ-fág számos származéka, például NM989, és egyéb fág DNS, például M13 és fonalas egyszálú fág DNS; élesztőplazmidok, úgymint a 2 μ plazmid és ennek származékai; eukarióta sejtekben használható vektorok, úgymint rovar- vagy emlőssejtekben használható vektorok; plazmidok és fág DNS-ek kombinációjából származó vektorok, úgymint olyan plazmidok, amelyeket fág DNS vagy más expressziós kontrollszekvenciák alkalmazásához módosítottunk; és hasonlók. Egy előnyben részesített megvalósítási formában ob kifejeződését metilotróf élesztőben, például Pichia pastoris élesztőben étjük el (lásd a WO 90/03431 és WO 90/10697 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentéseket). Egy specifikus megvalósítási formában (lent) egy expressziós vektort készítünk ob kifejezésére az a-párosítófaktor szignálszekvencia-kontrollja alatt.
Az expressziós kontrollszekvenciák - a DNS-szekvenciával működőképesen összekapcsolt, annak kifejeződését ellenőrző szekvenciák - széles választékának bármelyike használható ezekben a vektorokban a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezésére. Ilyen használható expressziós kontrollszekvenciák közé tartoznak például, az SV40, CMV, vakcinia-, poliómavagy adenovirus korai vagy késői promoterei, a lac23
HU 223 563 Bl rendszer, a írp-rendszer, a 7L4C-rendszer, a TRCrendszer, az Á77?-rendszer, a λ-fág fő operátor- és promoterrégiói, az fd burokfehérje kontrollrégiói, a 3foszfo-glicerát kináz vagy más glikolitikus enzimek promotere, a savas foszfatáz (például Pho5) promoterei, a metilotróf élesztő AOX 1 promotere, az élesztő α-párosítófaktorok promoterei és egyéb, közismerten prokarióta vagy eukarióta sejtek vagy ezek vírusai, és ezek különböző kombinációi génjeinek kifejeződését ellenőrző szekvenciák.
Egysejtű gazdaszervezeteknek szintén széles választéka használható a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezésére. Ezek a közé a gazdaszervezetek közé tartoznak jól ismert eukarióta és prokarióta gazdaszervezetek, úgymint E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces törzsek; gombák, úgymint élesztők (Saccharomyces és metilotróf élesztő, úgymint Pichia, Candida, Hansenula és Torulopsis); és állati sejtek, úgymint CHO, Rl.l, B-W és LM sejtek, afrikaizöldmajomvesesejtek (például COS1, COS7, BSC1, BSC40 és BMT10), rovarsejtek (például Sf9) és humán sejtek és növényi sejtek szövetkultúrában.
Leszögezzük, hogy nem minden vektor, expressziós kontrollszekvencia és gazdaszervezet működik egyformán jól a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezésében. A gazdaszervezetek mindegyike sem működik egyformán jól ugyanazzal az expressziós rendszerrel. A szakember azonban fölösleges kísérletezgetés nélkül képes kiválasztani a megfelelő vektorokat, expressziós kontrollszekvenciákat és gazdaszervezeteket a kívánt expresszió elvégzésére anélkül, hogy eltérne e találmány oltalmi körétől. Például vektor kiválasztásánál figyelembe kell venni a gazdaszervezetet, mivel abban kell működnie. A vektorpéldányok másolatainak a számát, e másolatok számát kontrolláló képességet és a vektor által kódolt valamennyi egyéb fehérje - úgymint antibioikus markerek - kifejeződését szintén figyelembe vesszük.
Expressziós kontrollszekvencia kiválasztásánál normális esetben számos faktort veszünk figyelembe. Ezek közé tartozik például, a rendszer relatív szilárdsága, ellenőrizhetősége, és összeegyeztethetősége az egyes kifejezendő DNS-szekvenciával vagy génnel, különösen potenciális másodlagos szerkezetekre való tekintettel. Használható egysejtű gazdaszervezeteket úgy választunk ki, hogy például ezeknek a választott vektorral való összeférhetőségét, kiválasztási jellemzőit, helyes fehérjehajtogatási képességét, és fermentációs feltételeit ugyanúgy figyelembe vesszük, mint a kifejezendő DNS-szekvencia által kódolt termék gazdaszervezetre gyakorolt toxicitását és az expressziós termékek egyszerű tisztítását.
Figyelembe véve ezeket és egyéb faktorokat, a szakmában jártas egyén képes olyan vektor/expressziós kontrollszekvencia/gazdaszervezet kombinációk választékát összehozni, amelyek a találmány szerinti DNS-szekvenciákat fermentációs úton vagy nagyméretű állati sejtkultúrában kifejezik.
Egy specifikus megvalósítási formában kifejezhető OB fúziós fehérje. OB fúziós fehérje tartalmaz legalább egy fúnkcionálisan aktív nem-OS fehérjerészt legalább egy fúnkcionálisan aktív OB polipeptidrészhez peptidkötésen keresztül hozzákapcsolva. A nem-ob szekvenciák amino- vagy karboxiterminálisan kapcsolódhatnak az OB szekvenciákhoz. Proteolitikusan inaktív OB fúziós fehérje stabil kifejeződéséhez a nem-GS fehérjerész még előnyösebben az OB fehérje aminovégéhez kapcsolódik peptidkötésen keresztül. Ilyen fúziós fehérjét kódoló rekombináns DNS-molekula tartalmaz legalább egy, fúnkcionálisan aktív nem-OB fehérjerészt kódoló szekvenciát kereten belül összekapcsolva az OB kódolószekvenciával, és előnyösen kódol egy specifikus proteáz - például trombin vagy Xa faktor - hasítási helyet, előnyösen az OB-nem-OB kapcsolódási pontban. Egy specifikus megvalósítási formában a fúziós fehéijét Escherichia coliban vagy P. pastorisban fejezzük ki.
Egy specifikus megvalósítási formában (lent) vektorokat készítettünk a rágcsáló és humán ob gének 49. Gin kodonnal és 49. Gin kodon nélküli - kifejezésére bakteriális expressziós rendszerben és élesztő (PZcúíoj-expressziósrendszerben fúziós fehérjeként. Az ob gént endonukleázos hasítási hellyel készítettük el, például PCR és új primerek alkalmazásával. A PCR-rel létrehozott szekvenciákat szükséges megerősíteni, mivel ezzel a technikával nagyobb annak a valószínűsége, hogy pontmutációt tartalmaznak. Hisztidintoldalékot (His-toldalékot) és proteolitikus hasítási helyet tartalmazó plazmidot alkalmaztunk. A hisztidin jelenléte lehetővé teszi rekombináns fehérjék szelektív izolálását Ni-kelát-oszlopon vagy affinitástisztítással. A proteolitikus hasítási helyet, specifikus megvalósítási formában (lent) trombin hasítási helyet, úgy építjük be, hogy a proteázos, például trombinos kezelés a teljes hosszúságú érett (azaz szignálszekvencia nélküli) OB polipeptidet tegye szabaddá.
Egy másik vonatkozásban a pGEX vektor [Smith et al., Gene 67, 31-40 (1988)] alkalmazható. Ez a vektor egyesíti a Schistosoma japonicum glutation S-transzferáz cDNS-t a számunkra fontos szekvenciával. A baktériumfehérjéket kinyerjük, és a rekombináns fehérjéket gyorsan megtisztíthatjuk redukált glutation-affinitásoszlopon. A GST-hordozót ezután lehasíthatjuk a fúziós fehérjékről helyspecifikus proteázokkal történő emésztéssel. A hasítás után a hordozót és a nem hasított fúziós fehéijét glutation agarózon történő abszorpcióval választhatjuk el. Néha adódhat a rendszenei probléma, ha a kódolt fehéije nem oldódik vizes oldatokban.
Rekombináns fehérjék kifejezése bakteriális rendszerekben a kifejezett fehérje helytelen hajtogatottságát eredményezheti, amely újrahajtogatást tesz szükségessé. A rekombináns fehérje újrahajtogatható a funkcionálisan aktív OB polipeptid lehasadása előtt vagy után. Az OB polipeptid újrahajtogatható a következő lépésekkel, (i) a fehéije inkubálása olyan denaturációs pufferben, amely redukálóágenst tartalmaz, és azután (ii) a fehérje inkubálása olyan pufferben, amely oxidálóágenst, és előnyösen fehérjestabilizáló ágenst is vagy chaotrop ágenst is, vagy mindkettőt tartalmaz. Alkalmazható redox (redukáló/oxidáló) ágens párok közé tartoznak - de korlátozást
HU 223 563 Bl nem jelentenek - redukált glutation/glutation-diszulfid, cisztin/cisztein, cisztamin/ciszteamin és 2-merkapto-etanol/2-hidroxi-etil-diszulfid. Egy különleges vonatkozásban a fúziós fehérjét feloldhatjuk a denaturálószerben, úgymint karbamidban, a redukálópufferbe történő csere előtt. Előnyben részesített megvalósítási formában a fehérjét meg is tisztítjuk, például ioncserével vagy Nikelát-kromatográfiával a redukálópufferbe történő csere előtt. Denaturálóágensek közé tartozik - de korlátozást nem jelent - a karbamid és guanidin-hidroklorid. A rekombináns fehérjét azután legalább körülbelül 10szeresére hígítjuk, még előnyösebben körülbelül 100szorosára egy oxidálópufferbe, amely oxidálóágenst tartalmaz, úgymint - de nem korlátozódva erre - 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oxidált glutation keverékét. A fúziós fehérjét azután az oxidálópufferben körülbelül 1 -24 órát, előnyösen körülbelül 2-16 órát szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az oxidálópuffer tartalmazhat fehérjestabilizáló ágenst, például cukrot, alkoholt vagy ammónium-szulfátot. Az oxidálópuffer tartalmazhat továbbá kis koncentrációban chaotrop ágenst a molekulák közötti helytelen kölcsönhatások destabilizálása és a megfelelő hajtogatás elősegítése céljából. Megfelelő chaotrop ágensek közé tartoznak - de korlátozást nem jelentenek - detergens, poliol, L-arginin, guanidin-hidroklorid és polietilénglikol (PEG). Fontos a chaotrop ágenst kellően kis koncentrációban alkalmazni a fehérje denaturálódásának elkerülésére. Az újrahajtogatott fehérje koncentrálható legalább körülbelül 10-szeresére, még előnyösebben olyan mértékben ahogyan az oxidálópufferbe hígítottuk.
Bakteriális fermentációs eljárások eredményezhetnek olyan rekombináns fehérjekészítményt is, amely endotoxinok elfogadhatatlan szintjét tartalmazza. Ilyenformán tehát a találmány tárgyát képezi ilyen endotoxinok eltávolítása, például endotoxinspecifikus antitestek vagy más endotoxinkötő molekulák alkalmazásával. Endotoxinok jelenléte meghatározható standard technikákkal, úgymint E-TOXATE reagensek (Sigma, St. Louis, Missouri) alkalmazásával vagy bioassaymérésekkel.
A specifikus példákon felül a feltalálók szándékuk szerint alkalmaznak baculovírus-, emlős- és élesztőexpressziósrendszereket az ob fehérje kifejezésére. Például baculovírus-expressziósrendszerekben mind nem fúziós transzfervektorok, úgymint - de nem korlátozódva ezekre - a pVL941 (BamHl klónozóhely; Summers), pVL1393 (BamHl, Smal, Xbal, EcoRl, Notl, Xmalll, Bglll és Pstl klónozóhely; Invitrogen), pVL1392 (Bglll, Pstl, Notl, Xmalll, EcoRl, Xbal, Smal és BamHl klónozóhely; Summers és Invitrogen) és pBlueBacIII (BamHl, Bglll, Pstl, Ncol és Hindlll klónozóhely; kék/fehér rekombináns screenelés lehetséges; Invitrogen), mind fúziós transzfervektorok, úgymint - de nem korlátozódva ezekre - pAc700 (BamHl és Kpnl klónozóhely; amelyben a BamHl felismerőhely az iniciációs kodonnal kezdődik; Summers), pAc701 és pAc702 (ugyanaz, mint pAc700 eltérő leolvasási keretekkel), pAc360 [BamHl klónozóhely 36 bázispárral downstream a polihedrin iniciációs kodontól; Invitrogen (195)] és pBlueBacHisA, B, C [három különböző leolvasási keret BamHl, Bglll, Pstl, Ncol és Hindlll klónozóhellyel, N-terminális pepiid ProBond-tisztításhoz és plakkok kék/fehér rekombináns screenelése; Invitrogen (220)] használhatók.
A találmányban szándékunk szerint használni kívánt emlős-expressziósvektorok közé tartoznak indukálható promoterekkel - úgymint a dihidrofolát reduktáz (DHFR) promoterrel, például bármilyen expressziós vektor DHFR expressziós vektorral vagy DHFR/ methotrexate ko-amplifíkációs vektorral, úgymint pED-vel (Pstl, Sáli, Sbal, Smal és EcoRl klónozóhely, olyan vektorral, amely egyaránt kifejezi a klónozott gént és DHFR-t) [Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology 16.12 (1991)] - rendelkező vektorok. Más lehetőségként glutamin szintetáz/metionin szulfoximin ko-amplifikációs vektor, úgymint pEE14 (Hindlll, Xbal, Smal, Sbal, EcoRl és Bell klónozóhely, amelyben a vektor glutamin szintetázt és a klónozott gént fejezi ki; Celltech). Egy másik megvalósítási formában olyan vektort használhatunk, amely Epstein-Barr-vírus (EBV) kontrollja alatt episzomális kifejeződést irányít, úgymint pREP4 (BamHl, Sfll, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Évüli és Kpnl klónozóhely, konstitutív RSV-LTR promoter, higromicin szelekciós marker; Invitrogen), pCEP4 (BamHl, Sfll, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull és Kpnl klónozóhely, konstitutív hCMV közvetlen korai gén, higromicin szelekciós marker; Invitrogen), pMEP4 (Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfll, BamHl klónozóhely, indukálható metallotionein Ha gén promoter, higromicin szelekciós marker; Invitrogen), pREP8 (BamHl, Xhol, Notl, Hindlll, Nhel és Kpnl klónozóhely, RSV-LTR promoter, hisztidinol szelekciós marker; Invitrogen), pREP9 (Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfll és BamHl klónozóhely, RSVLTR promoter, G418 szelekciós marker; Invitrogen) és pEBVHis (RSV-LTR promoter, higromicin szelekciós marker, ProBond gyantán tisztítható és enterokinázzal hasított N-terminális peptid; Invitrogen). Szelektálható emlős-expressziósvektorok találmány szerinti felhasználásra magukban foglalják pRc/CMV-t (Hindlll, BstXl, Notl, Sbal és Apai klónozóhely, G418 szelekciós marker; Invitrogen), pRc/RSV-t (Hindlll, Spel, BstXl, Notl, Xbal klónozóhely, G418 szelekciós marker; Invitrogen) és egyebeket. Vaccinia vírus emlősexpressziósvektorok (Kaufman, 1991, lásd fent) találmány szerinti felhasználásra magukban foglalják, de korlátozást nem jelentve, pSCl 1-et (Smal klónozóhely, TK- és β-val szelekciós marker), pMJ601-et (Sáli, Smal, Afll, Narl, BspMll, BamHl, Apai, Nhel, SacII, Kpnl és Hindlll klónozóhely; TK- és β-val szelekciós marker) és pTKgptFIS-t (EcoRl, Pstl, Sáli, Accl, Hindii, Sbal, BamHl és Hpa klónozóhely, TK vagy XPRT szelekciós marker).
Elesztő-expressziósrendszerek a találmány szerint szintén felhasználhatók OB polipeptid kifejezésére. Például a nem fúziós pYES2 vektor (Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXl, EcoRl, BstXl, BamHl, Sacl, Kpnl és Hindlll klónozóhely; Invitrogen) vagy a fúziós
HU 223 563 Β1 pYESHisA, B, C vektor (Xba\, Sphl, Shol, Notl, BstXl, EcóRl, BamHl, Sacl, Kpnl és Hindlil klónozóhely, ProBond gyantán tisztítható és enterokinázzal hasított N-terminális peptid; Invitrogen) csak két említett, amely a találmány szerint alkalmazható.
Továbbá testtömeg-modulátor peptidanalógokat szándékaink szerint készíthetünk a találmány oltalmi köréből származó nukleotidszekvenciákból.
OB polipeptid rekombináns kifejezésén túl a találmány előre megtervezi és teljes mértékben lehetővé teszi OB polipeptidnek vagy fragmentumának elkészítését szilárd fázisú peptidszintézis jól ismert és magasan kifejlesztett technikáját alkalmazva. A találmány egyaránt felöleli a népszerű Boc és Fmoc alkalmazását ugyanúgy, mint más védőcsoport-stratégiákat ob polipeptidnek vagy fragmentumának elkészítésére. A ciszteinoldalláncok újrahajtogatására és oxidálására diszulfídkötések kialakításához különböző technikák szintén jól ismertek a szakmában.
OB polipeptid elleni antitestek
A találmány szerint a rekombináns úton vagy kémiai szintézissel előállított OB polipeptid és annak fragmentumai vagy egyéb származékai, vagy analógjai, beleértve fúziós fehérjéket, immunogénként alkalmazhatók az OB polipeptidet felismerő antitestek létrehozására. Ilyen antitestek közé beleértendők - de nem korlátozódnak ezekre - poliklonális, monoklonális, kiméra, egyszálú antitestek, Fab fragmentumok és Fab expressziós könyvtár.
Egy molekula „antigén” hatású, ha képes specifikusan kölcsönhatásba lépni az immunrendszer antigént felismerő molekulájával, úgymint immunglobulinnal (antitesttel) vagy T-sejt antigén receptorral. Antigén polipeptid legalább körülbelül 5, előnyösen legalább körülbelül 10 aminosavat tartalmaz. A molekula antigén hatású része az a rész lehet, amely T-sejt-receptor felismerésére immundomináns, vagy lehet a molekulával szembeni antitest létrehozására, az antigén résznek hordozómolekulához való konjugációjával immunizációra felhasznált rész. Az antigén molekulának önmagában kell immunogénnek lennie, azaz képesnek kell lennie immunválasz kiváltására hordozó nélkül.
Az „antitest” valamilyen immunglobulin, beleértve olyan antitesteket és azok fragmentumait, amelyek specifikus epitóphoz kötődnek. A kifejezés felölel poliklonális, monoklonális és kiméra antitesteket - az utóbb említettet részleteiben leírják az U.S.P. 4,816,397 és 4,816,567 számú szabadalmi iratokban - ugyanúgy, mint antitestek antigént kötő részei, beleértve Fab, F (ab’)2 és F(v) (beleértve egyszálú antitesteket) részeket. Ezek szerint az „antitest molekula” kifejezés az itt használt különböző nyelvtani formáiban egyaránt magában foglal intakt immunglobulin-molekulát és immunglobulin-molekulának az antitestegyesítő helyet tartalmazó, immunológiailag aktív részét. Az „antitestegyesítő hely” az antitest molekulának az a szerkezeti része, amely magában foglalja a nehéz és könnyű lánc variábilis és hipervariábilis régióit és specifikusan kötődik antigénhez.
Példaszerű antitest molekulák intakt immunglobulin-molekulák, lényegében intakt immunglobulin-molekulák és immunglobulin-molekulák azon részei, amelyek a paratópot tartalmazzák - beleértve a szakmában Fab, Fab’, F(ab’)2 és F(v) részekként ismerteket amely részeket az itt leírt terápiás módszerekben történő alkalmazáshoz előnyben részesítünk.
Antitest molekulák Fab és F(ab’)2 részeit lényegében intakt antitest molekulák papinnal és pepszinnel külön-külön történő proteolitikus reakciójával állítjuk elő jól ismert módszerek szerint. Lásd például az U.S.P. 4,342,566 számú szabadalmi iratot. Fab’ antitest molekularészek szintén jól ismertek, és F(ab’)2 részekből állítjuk elő azokat a két nehéz láncot összekötő diszulfidkötések merkapto-etanolos redukciójával, és az eredményül kapott fehérjemerkaptánnak azt követő jód-acetamidos alkilezésével. Itt intakt antitest molekulákat tartalmazó antitesteket részesítünk előnyben.
A „monoklonális antitest” kifejezés különböző nyelvtani formáiban olyan antitestre utal, amely csak egyfajta, bizonyos antigénnel immunreakcióra képes antitestegyesítő hellyel rendelkezik. A monoklonális antitest tehát tipikusan egyedülálló affinitást mutat valamilyen antigénnel, amellyel immunreakcióba lép. A monoklonális antitest ilyenformán többszörös antitestegyesítő hellyel rendelkező antitest molekulát tartalmaz, amelyek közül minden egyes különböző antigénre specifikus, például bispecifikus (kiméra) monoklonális antitest.
Az „adjuváns” kifejezés olyan vegyületet vagy keveréket jelent, amely fokozza az antigénre adott immunválaszt. Az adjuváns szolgálhat szöveti lerakóhelyként, amely lassan engedi el az antigént és limfoidrendszer-aktivátorként is, amely nem specifikusan fokozza az immunválaszt [Hood et al., Immunology, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Califomia p. 384 (1984)]. Gyakran az antigénnel egyedül kiváltott elsődleges kihívás - adjuváns jelenléte nélkül - nem elegendő humorális vagy celluláris immunválasz kiváltásához. Adjuvánsok közé tartoznak - korlátozást azonban nem jelentenek - a komplett Freund-féle adjuváns, inkomplett Freund-féle adjuváns, szaponin, ásványi gélek, úgymint alumínium-hidroxid, felületaktív anyagok, úgymint lizolecitin, összetett poliolok, polianionok, peptidek, olaj vagy szénhidrogén-emulziók, tapadó hemocianinok, dinitro-fenol, és potenciálisan alkalmazható humán adjuvánsok, úgymint BCG (Bacille Calmette-Guerin) és Corynebacterium parvum. Az adjuváns előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható.
OB polipeptidekkel vagy fragmentumaikkal, származékaikkal és analógjaikkal szembeni poliklonális antitestek előállítására a szakmában ismert különböző eljárások alkalmazhatók. Az antitest előállítására különböző gazdaállatok immunizálhatok az OB polipeptiddel vagy származékával (például fragmentumával vagy fúziós fehérjéjével) való beoltással, beleértve - korlátozást azonban nem jelentve - nyulakat, egereket, patkányokat, birkákat, kecskéket stb. Egy megvalósítási formában az OB polipeptid vagy fragmentuma konjugálható immunogén hordozóval, például szarvasmarhaszérumalbuminnal (BSA=bovine serum albumin) vagy tapadó
HU 223 563 Β1 hemocianinnal (KLH=keyhole limpet hemocyanin). Különböző adjuvánsok használhatók az immunválasz növelésére a gazdaszervezet fajától függően, beleértve - korlátozást azonban nem jelentve - Freund-féle (komplett és inkomplett) adjuvánst, ásványi géleket, úgymint alumínium-hidroxidot, felületaktív anyagokat, úgymint lizolecitint, összetett poliolokat, polianionokat, peptideket, olaj emulziókat, tapadó hemocianinokat, dinitro-fenolt, és potenciálisan alkalmazható humán adjuvánsokat, úgymint BCG-t (Bacille Calmette-Guerin) és Corynebacterium parvumot.
OB polipeptidekkel vagy fragmentumaikkal, analógjaikkal vagy származékaikkal szembeni monoklonális antitestek előállítására bármelyik olyan technika alkalmazható, amely antitest molekulák termelését folyamatos sejtvonaltenyészetekben biztosítja. Ezek közé tartozik - bár nem korlátozódik ezekre - az eredetileg Kohler és munkatársai által kidolgozott hibridómatechnika [Natúré 256, 495-497 (1975)] ugyanúgy, mint a triómatechnika, a humán B-sejt-hibridómatechnika [Kozbor et al., Immunology Today 4, 72 (1993)] és az EBV-hibridómatechnika [Colé et al., in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy p. 77-96, Alán R. Liss, Inc., (1985)] monoklonális antitestek előállítására. Halhatatlan, antitesttermelő sejtvonalakat készíthetünk fúziótól eltérő technikákkal, úgymint B-limfocitáknak onkogén DNS-sel történő közvetlen transzformációjával vagy Epstein-Barr-vírussal történő transzfekciójával [lásd például Schreier et al., „Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling et al., „Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981); Kennett et al., „Monoclonal Antibodies” (1980); lásd még az U.S.P. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500;
4,491,632 és a 4,493,890 számú szabadalmi iratokat].
A találmánynak egy további megvalósítási formájában csíramentes állatokban állíthatók elő monoklonális antitestek új keletű technológia felhasználásával (PCT/US 90/02545). A találmány szerint humán antitestek alkalmazhatók és kinyerhetők humán hibridómák felhasználásával [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030 (1983)] vagy humán B-sejteknek EBV-vírussal in vitro történő transzformálásával (Colé et al., 1985, fent). A találmány szerint valójában „kiméra antitestek” előállítására kifejlesztett technikákat [Morrison et al., J. Bacteriol. 159-870 (1984); Neuberger et al., Natúré 312, 604-608 (1984); Takeda et al., Natúré 314, 452-454 (1985)] használhatunk ob polipeptidre specifikus egér antitest molekula géneknek megfelelő biológiai aktivitással rendelkező humán antitest molekula génjeivel történő összekapcsolásával; ilyen antitestek a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ilyen humán vagy humanizált kiméra antitesteket előnyben részesítünk (lent leírt) humán betegségek vagy rendellenességek terápiájában történő felhasználásra, mivel a humán vagy humanizált antitestek sokkal kisebb valószínűséggel váltanak ki maguknak immunválaszt - különösen allergiás választ - mint a xenogén antitestek.
A találmány szerint egyszálú antitestek előállítására leírt technikák (U.S.P. 4,946,778 számú szabadalmi irat) átvehetők OB polipeptidre specifikus egyszálú antitestek elkészítéséhez. A találmánynak egy további megvalósítási formája felhasználja a Fab expressziós könyvtárak összeállítására leírt technikákat [Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989)] a kívánt, ob polipeptidre specifikus monoklonális Fab fragmentumok vagy azok származékai, vagy analógjai gyors és könnyű azonosításának lehetővé tételére.
Olyan antitest fragmentumok, amelyek tartalmazzák az antitest molekula idiotípusát, ismert technikákkal létrehozhatók. Például ilyen fragmentumok közé tartoznak - de nem jelentenek korlátozást - a F(ab’)2 fragmentum, amely az antitest molekula pepszines emésztésével állítható elő; a Fab’ fragmentumok, amelyek létrehozhatók a F(ab’)2 fragmentum diszulfidhídjainak redukciójával, és a Fab fragmentumok, amelyek az antitest molekulának papainnal és redukálóágenssel való kezelésével hozhatók létre.
Antitestek előállításakor a kívánt antitest screenelése elvégezhető a szakmában ismert technikákkal, például radioimmun-meghatározással, ELISA-val, „szendvics”-immunmeghatározással, immunradiometriás meghatározással, géldiffúziós precipitinreakcióval, immundiffúziós meghatározással, in situ immunmeghatározásokkal (kolloidális arany-, enzim- vagy radioizotópjelölések alkalmazásával például), Westemblottal, precipitációs reakciókkal, agglutinációs meghatározással (például gél agglutinációs assay-vel, hemagglutinációs assay-vel), komplement fixációs meghatározással, immunfluoreszcens-meghatározással, protein A assay-vel, immunelektroforézis-meghatározással stb. Egy megvalósítási formában antitestkötődést az elsődleges antitesten levő jelölés kimutatásával detektálunk. Egy másik megvalósítási formában az elsődleges antitestet egy második antitestnek vagy reagensnek az első antitesthez való kötődése kimutatásával detektáljuk. Egy további megvalósítási formában a második antitest jelölt. A szakmában sok mód ismert immunoassay-kötések kimutatására, és ezek a találmány oltalmi körébe tartoznak. Például OB polipeptiden levő specifikus epitópot felismerő antitest kiválasztására meghatározhatunk olyan termékre létrehozott hibridómákat, amely ilyen epitópot tartalmazó OB polipeptidffagmentumhoz kötődik. Egyes állatfajból származó OB polipeptidre specifikus antitest kiválasztására ezen állatfaj sejtjeiből kifejezett vagy izolált OB polipeptiddel való pozitív kötődés alapján szelektálhatunk.
Az említett antitestek felhasználhatók a szakmában ismert olyan módszerekben, amelyek az OB polipeptid elhelyezkedésére és aktivitására vonatkoznak, például Westem-blothoz, OB polipeptid in situ elképzeléséhez, szintjének méréséhez megfelelő fiziológiai mintákban stb.
Egy specifikus megvalósítási formában olyan antitesteket hozhatunk létre, amelyek az OS-polipeptidaktivitás agonistái vagy antagonistái. Ilyen antitestek tesztelhetők lentebb leírt meghatározások alkalmazásával ligandumok azonosítására.
Egy specifikus megvalósítási formában antitesteket fejlesztünk ki nyulaknak a fehérjeszekvenciára alapo27
HU 223 563 Bl zott szintetikus peptidekkel, vagy baktérium-expressziósvektorok felhasználásával előállított rekombináns fehérjékkel történő immunizálásával. A szintetikus peptidek választékát a fent leírtak szerint, az előre jósolt fehérjeszerkezet óvatos analízise után készítjük el. Különösen feltételezett hasítási helyek közötti peptidszekvenciákat választunk. A szintetikus peptideket hordozóhoz, úgymint KLH-hoz vagy BSA-hoz konjugáljuk karbodiimid alkalmazásával, és Freund-féle adjuvánsban használjuk nyulak immunizálására. Rekombináns fehéqe előállítása céljából a pGEX vektort alkalmazhatjuk a polipeptid kifejezésére (Smith et al., 1988, fent). Más lehetőségként hidrofil doméneket használhatunk fúziós fehéqe előállítására. A kifejezett fehérjét megfelelő mennyiségben állítjuk elő, és nyulak immunizálására használjuk fel Freund-féle adjuvánsban.
Egy másik specifikus megvalósítási formában rekombináns OB polipeptidet használunk fel csirkék immunizálására, és a csirke anti-OB antitesteket kinyerjük a tojásfehérjéből, például OB oszlopon történő affinitástisztítással). Az immunizáláshoz alkalmazott csirkéket előnyösen specifikusan patogénmentes (SPF=spéciire pathogen free) körülmények között tartjuk.
Egy másik megvalósítási formában leptin elleni antitesteket hozunk létre ob/ob egerekben - amelyekből hiányzik a keringő OB fehérje, és így várhatóan képesek anti-OB polipeptidválaszra, mivel nem toleránsak a polipeptidre - és vad típusú egerekben. Az egerek mindkét csoportjának lépsejtjeit egyesíthetjük mielómasejtekkel hibridómák készítésére monoklonális antitestekhez.
Egy még további megvalósítási formában rekombináns OB polipeptidet használunk nyulak immunizálására, és a poliklonális antitesteket a további felhasználás előtt immuntisztításnak vetjük alá. A tisztított antitestek különösen alkalmasak szemikvantitatív meghatározásokhoz, különösen szérumban vagy plazmában keringő OB polipeptid jelenlétének kimutatására.
Modulátor peptidekkel szemben termelt monoklonális antitesteket különböző sajátságok - azaz izotípus, epitóp, affinitás stb. - alapján screenelhetünk. Különösen fontosak azok a monoklonális antitestek, amelyek a modulátor peptidek aktivitását semlegesítik. Ilyen monoklónok könnyen azonosíthatók a tömegmodulátorok aktivitásmeghatározásaiban. Nagy affinitású antitestek szintén hasznosak, amikor natív vagy rekombináns modulátor immunaffinitás-tisztítása lehetséges.
A találmány szerinti diagnosztikai és terápiás módszerekben alkalmazott antimodulátor antitestek előnyösen affinitástisztításon átesett poliklonális antitestek. Az antitest még előnyösebben monoklonális antitest (mAb). Ezenfelül az itt felhasznált antimodulátor antitest molekulák előnyösen Fab, Fab’, F(ab’)2 vagy F(v) részek vagy teljes antitest molekula formában vannak.
Diagnosztikai felhasználások
Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai alkalmazások változatai, beleértve a testtömeg abnormalitásaira vagy kövérségre kiható állapotok és/vagy stimulusok jelenlétének kimutatására szolgáló módszereket, utalva ezeknek a jelen tömegmodulátorok által közvetített aktivitást kiváltó képességére. A korábbiakban említettek szerint a tömegmodulátor peptidek felhasználhatók önmagukkal szembeni antitestek termelésére különböző ismert technikákkal, és ilyen antitestek azután izolálhatok és hasznosíthatók a kérdéses transzkripciós aktivitás jelenlétének tesztelésére gyanús célsejtekben. Más lehetőségként a találmány szerinti nukleinsavak alkalmazhatók diagnózisban.
Antitesten alapuló diagnosztikumok
A korábban felvetettek szerint a találmányban használható diagnosztikai módszer tartalmazza sejtes minta vagy tápoldat vizsgálatát olyan assay segítségével, amelybe beletartozik a modulátor fehéqe antagonistájának - úgymint antimodulátor antitestnek, előnyösen affinitástisztításon átesett poliklonális antitestnek, és még előnyösebben mAb-nek - hatásos mennyisége. Ezenfelül az itt felhasznált antimodulátor antitest molekulák előnyösen Fab, Fab’, F(ab’)2 vagy F(v) részek vagy teljes antitest molekula formában vannak. Az előzőekben taglaltak szerint, az ettől a módszertől javulni képes betegek közé tartoznak a rákban, AIDS-ben, elhízottságban vagy más olyan állapotban szenvedők, amelynek a jellemzője vagy faktora abnormális testtömeg. A modulátor izolálására és antimodulátor antitestek indukálására és az antimodulátor antitesteknek a célsejtek vizsgálatát segítő képessége meghatározására és optimalizálására szolgáló módszerek jól ismertek a szakmában.
Antitestek, beleértve poliklonális és monoklonális antitesteket egyaránt, és a testtömeg-modulátorok termelődését és aktivitását moduláló drogok és egyéb felismerőfaktorok és/vagy azok alegységei szintén bírhatnak bizonyos diagnosztikai alkalmazásokkal, és például hasznosíthatók olyan állapotok felderítésének és/vagy mérésének céljára, ahol a testtömegben abnormalitás van, vagy nagy valószínűséggel kifejlődhet. Például a modulátor peptidek vagy azok aktív fragmentumai felhasználhatók önmagukkal szemben mind poliklonális, mind monoklonális antitestek előállítására különböző sejtes közegekben ismert technikákkal, úgymint hibridómatechnikával, például füzionált egérléplimfocita és mielómasejteket felhasználva. Ezeket a technikákat részletesen leírjuk az alábbiakban. Ehhez hasonlóan, a találmány szerinti receptorfelismerő faktorok aktivitását utánzó vagy azzal antagonista kis molekulákat fedezhetünk fel vagy szintetizálhatunk, és felhasználhatjuk azokat diagnosztikai és/vagy terápiás eljárásokban.
A tömegmodulátorok jelenléte sejtekben megállapítható a szokásos, ilyen meghatározásokhoz alkalmazható immunológiai eljárásokkal. Számos használható eljárás ismert. Három ilyen eljárás, amelyek különösen alkalmasak, vagy a detektálható jellel jelölt receptorfelismerő faktort, vagy a detektálható jellel jelölt Ab! antitestet, vagy a detektálható jellel jelölt Ab2 antitestet használja fel. Az eljárások a következő egyenletekkel összegezhetők, ahol a csillag azt jelzi, hogy a részecskejelzett, és a tömegmodulátor helyén „WM” áll:
A) WM*+Ab!=WM*Ab,
B) WM+Ab,*=WMAb|*
C) WM+Ab!+Ab2*=Ab,WMAb2*
HU 223 563 Β1
Az eljárások és ezek alkalmazása mind ismerősek a szakember számára, és ennek megfelelően hasznosíthatók a találmány oltalmi körén belül. A „kompetitív” eljárást, az „A” eljárást, az U.S.P. 3,654,090 és 3,850,752 számú szabadalmi iratok írják le. A „B” eljárás jól ismert kompetitív assay-technikákat képvisel. A „C” eljárást, a „szendvics”-eljárást, az U.S.P. RE 31,006 és 4,016,043 számú szabadalmi iratok írják le. Még más eljárások is ismertek, úgymint a „dupla antitest” vagy „DASP”-eljárás.
A tömegmodulátorok minden esetben komplexeket képeznek egy vagy több antitesttel vagy kötőpartnerrel, és a komplexnek egy tagja detektálható jelöléssel van ellátva. Az a tény, hogy komplex képződött, és ha szükséges, ennek mennyisége meghatározható olyan ismert módszerekkel, amelyek a jelölések detektálására alkalmazhatók.
A fentiekből látszik, hogy Ab2-nek az a jellemző tulajdonsága, hogy reagál Ab|-gyel. Ez abból következik, hogy Ab[ egy emlősfajban termelődött, amelyet egy másik fajban antigénként használtunk fel Ab2 létrehozására. Például Ab2 termeltethető kecskékben nyúlantitesteknek mint antigéneknek a felhasználásával. Ezen leírás és igénypontok céljára Ab,-et elsődleges vagy antitömegmodulátor antitestnek és Ab2-t másodlagos vagy anti-Ab, antitestnek nevezzük.
Az e találmány számára leggyakrabban alkalmazott jelölések radioaktív elemek, enzimek, UV fényben fluoreszcens vegyületek és egyebek.
Számos fluoreszcens anyag ismert és használható jelölésként. Ezek közé tartozik például a fluoreszcein, rodamin és auramin. Különleges detektálóanyag kecskékben termeltetett és izotiocianáton keresztül fluoreszceinnel konjugált antinyúlantitest.
A tömegmodulátorok és kötőpartnereik jelölhetők radioaktív elemmel vagy enzimmel is. A radioaktív jelölés detektálható a jelenleg hozzáférhető számlálóeljárások bármelyikével. Előnyben részesített izotópokat a következők közül választhatunk 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, siCr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251,131I és 186Re.
Enzimes jelölések hasonlóan alkalmazhatók, és a jelenleg használatos kolorimetriás, spektrofotometriás, fluorospektrofotometriás, amperometriás vagy gazometriás technikák bármelyikével detektálhatok. Az enzimet hídképző molekulákkal - úgymint karbodiimidekkel, diizocianátokkal, glutáraldehiddel és hasonlókkal - történő reakcióval konjugáljuk a kiválasztott részecskével. Sok enzim ismeretes, amelyek alkalmazhatók ezekben az eljárásokban. Előnyben részesítjük a peroxidázt, β-glükuronidázt, β-D-glükozidázt, βD-galaktozidázt, ureázt, glükóz oxidáz+peroxidázt és alkalikus foszfatázt. U.S.P. 3,654,090; 3,850,752 és 4,016,043 számú szabadalmi iratokra utalunk az általuk közzétett változatos jelölőanyagok és módszerek példái útján.
A találmány egy további megvalósítási formájában orvosspecialista számára alkalmazható tesztkiteket készíthetünk előre meghatározott transzkripciós aktivitás vagy előre meghatározott transzkripciós aktivitás képessége jelenlétének vagy hiányának kiderítésére gyanús célsejtekben. A fent taglalt tesztelőtechnikáknak megfelelően, az ilyen kitek egy osztálya tartalmaz legalább egy jelzett tömegmodulátort vagy annak kötőpartnerét - például egy arra specifikus antitestet - és útmutatásokat, természetesen a kiválasztott módszertől, például „kompetitív”, „szendvics”, „DASP” és hasonlóktól függően. A kitek tartalmazhatnak periférikus reagenseket is, úgymint puffereket, stabilizátorokat stb.
Ennek megfelelően tesztkit készíthető sejtek előre meghatározott transzkripciós aktivitása jelenlétének vagy képességének kimutatására, amely tartalmazza:
a) legalább egy, olyan jelzett immunkémiailag reaktív komponens előre meghatározott mennyiségét, amelyet a jelen tömegmodulátomak vagy specifikus kötőpartnerének ehhez történő közvetlen vagy közvetett hozzáfűzésével kapunk, detektálható jelzéshez;
b) egyéb reagenseket; és
c) útmutatást a nevezett kithez.
A diagnosztikus tesztkit még specifikusabban tartalmazhat :
a) ismert mennyiségű fent leírt tömegmodulátort (vagy kötőpartnerét) általában szilárd fázishoz kötötten immunszorbenst alakítva ki, vagy másképpen, megfelelő toldalékhoz vagy több ilyen végtermékhez stb. kötötten (vagy ezek kötőpartnereit), egyet mindegyikből;
b) ha szükséges, egyéb reagenseket; és
c) útmutatást a nevezett kithez.
További változatban a tesztkit elkészíthető és felhasználható a fent megállapított célokra, amely előre meghatározott eljárás szerint működik (például „kompetitív”, „szendvics”, „dupla antitest” stb.) és tartalmaz:
a) jelzett komponenst, amelyet a tömegmodulátomak detektálható jelzéshez való hozzákötésével kapunk;
b) egy vagy több további immunkémiai reagenst, amelyek közül legalább egy reagens ligandum vagy rögzített ligandum, amely ligandumot a következőket tartalmazó csoportból választjuk ki:
(i) a jelzett a) komponenshez kötődni képes ligandum;
(ii) a jelzett a) komponens kötőpartneréhez kötődni képes ligandum;
(iii) a meghatározandó komponens(ek) legalább egyikéhez kötődni képes ligandum; és (vi) a meghatározandó komponens(ek) legalább egyikének legalább egy kötőpartneréhez kötődni képes ligandum; és
c) útmutatásokat a tömegmodulátor és specifikus kötőpartnere közötti immunkémiai reakció egy vagy több komponensének kimutatására és/vagy meghatározására szolgáló eljárás elvégzéséhez.
Nukleinsavon alapuló diagnosztikumok Ahogyan a fenti példákban bemutattuk, a találmány szerinti nukleinsavak felhasználhatók az OB polipeptidben levő hibákkal kapcsolatos olyan hibák kimutatására, amelyek elhízott fenotípusokat eredményeznek. Például nukleinsavpróbákat alkalmazhatunk (például Northem-analízisben vagy RT-PCR analízisben) annak kiderítésére, vajon egy elhízott fenotípus az OB mRNS kifejeződésének hiányával vagy nem funkcionális OB mRNS kifejeződésével - például ahogyan db/db ege29
HU 223 563 Bl rekben (ahol a fogyatékosság OB receptor hiányából ered) - vagy át nem írt mRNS-t eredményező mutációval kapcsolatos-e. Ezenkívül a találmány szerinti, nukleinsavon alapuló diagnosztikai technikák felhasználhatók antitesten alapuló technikákkal összekapcsolva, az elhízott vagy anorexiás fenotípusok molekuláris felderítésének további fejlesztésére.
Az utóbbi időben izolált humán cDNS-klónokat az itt leírtak szerint szekvenáltuk. Ez elősegíti a humán gén teljes szekvenciájának (lásd a 20A-C. ábrákat; 22. számú szekvenciát) meghatározását. A humán OB gén intronjaiból DNS-szekvenciákat nyertünk ki (20. ábra), és ezeket használtuk PCR-primerek elkészítéséhez a humán genomiális DNS-ből származó OB gén kódolószekvenciájának PCR amplifikálásához (sokszorozásához) oly módon, hogy azonosítsuk az OB gén mutációit vagy alléi módosulatait, mindezt a korábban itt leírt eljárásoknak megfelelően. Humán genomiális OB amplifikálásához specifikus PCR-primereket írunk le specifikus példában lent.
A jelenlegi hipotézis szerint heterozigótamutációk az ob génben kapcsolatban vannak gyenge/mérsékelt elhízással, míg homozigótamutációknak néhány DNSszekvencián alapuló, elhízottságra utaló diagnosztikai teszttel kell kapcsolatban lenniük. Ha ez igaz, ez lehetővé tenné embereknél az elhízás kockázatának megállapítását, és lehetőséget adna gyógyszeres kezelés és/vagy életmódváltás alkalmazására, a megnövekedett testtömeg teljes kialakulása előtt.
Más lehetőségként olyan mikroszatellitek jelenléte, amelyek a humán OB mutáns formáival szegregálódnak, alkalmazható diagnózisra. Különböző PCR-primerek beleértve a 20A-C. ábrán bemutatott nukleotidszekvencián alapulókat - alkalmazhatók ebben a vonatkozásban.
Az OB gén diagnosztikai szempontból is hasznos lehet kódolt RNS-ének és fehérjéjének mérésére táplálkozási rendellenességekben. Fontos tudni, hogy egyes táplálkozási rendellenességekben akár az OB RNS és/vagy kódolt fehérjéje szabályozatlan vagy alulszabályozott. Tehát ha egy elhízott egyén megnövekedett szintű OB-ve\ rendelkezik, úgy tűnhet, hogy a probléma OB-n kívül eső, míg ha OB csökkent, úgy tűnhet, hogy OB alkalmatlanul alacsony szintjei okozhatják az elhízást (egyik sem az OB génben levő hiba). Ezzel ellentétben ha egy rák- vagy AIDS-beteg, aki veszít testtömegéből, megemelt szintű Oő-vel rendelkezik, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az OB nem helyénvalóan magas kifejeződése felelős a testtömegvesztésért.
A klónozott humán cDNS-t használjuk majd humán OB RNS-szintjeinek mérésére. Ezenkívül rekombináns humán fehérjét készítünk és alkalmazunk immunoassay-k kifejlesztésére, lehetővé téve az OB fehérje zsírés esetleges plazmaszintjeinek mérését.
Terápiás alkalmazások
A találmány szerinti polipeptidek, nukleinsavak és antitestek jelentős terápiás potenciállal rendelkeznek. Előnyösen ilyen ágens terápiásán hatásos mennyiségét adjuk be gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy kötőanyagban.
A „gyógyszerészetileg elfogadható” kifejezés olyan molekuláris dolgokra és készítményekre utal, amelyek fiziológiailag tolerálhatok, és jellemzően nem okoznak allergiás vagy hasonlóan kellemetlen reakciót, úgymint gyomorémelygést, szédülést és hasonlókat, amikor embernek adjuk be. Az itt alkalmazottak szerint a „gyógyszerészetileg elfogadható” kifejezés azt jelenti, hogy a szövetségi vagy állami kormányzat szabályozási hivatala által jóváhagyott, vagy az U.S. Pharmacopeia-b& (amerikai egyesült államok gyógyszerkönyvébe) vagy egyéb általánosan elismert gyógyszerkönyvbe felvett, állatok számára történő vagy még előnyösebben humán felhasználásra. A „hordozó” kifejezés olyan hígítószert, adjuvánst, kötőanyagot vagy vivőanyagot jelent, amellyel a készítményt beadjuk. Ilyen gyógyszerészeti hordozók lehetnek steril folyadékok, úgymint víz és olajok - beleértve a petróleumot - állati, növényi vagy szintetikus eredetű, úgymint mogyoróolaj, szójaolaj, ásványiolaj, szezámolaj és hasonlók. Víz vagy sóoldatok és vizes dextróz és glicerinoldatok előnyösen alkalmazhatók hordozóként, különösen injektálható oldatokhoz. Megfelelő gyógyszerészeti hordozókat ír le Martin [in: Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)].
A „terápiásán hatásos mennyiség” kifejezés alatt itt olyan mennyiséget értünk, amely elegendő legalább körülbelül 15%-kal, előnyösen legalább 50%-kal, még előnyösebben legalább 90%-kal csökkenteni, és legelőnyösebben megakadályozni az aktivitásban, funkcióban és a gazdaszervezet válaszában bekövetkezett klinikailag jelentős hiányt. Másképpen, a terápiásán hatásos mennyiség elegendő a gazdaszervezet állapotában klinikailag jelentős javulást előidézni.
Rekombináns OB polipeptid beadása tömegvesztést, különösen a zsírszövetcsökkenést eredményez. OB polipeptid készíthető standard bakteriális és/vagy emlősexpressziósvektorok alkalmazásával, szintetikusan, vagy tisztítható plazmából vagy szérumból, mindezeket részletesen kifejtettük itt korábban. Másképpen, natív OB polipeptid megnövekedett kifejeződése kiváltható homológ rekombinációs technikákkal a fent leírtak szerint.
OB-polipeptid-aktivitás csökkentése (antagonisták, inhibitorok kifejlesztésével, semlegesítő antitestek vagy antiszenz molekulák alkalmazásával) kívánatos tömeggyarapodást eredményezhetne a rákkal, AIDS-szel vagy anorexia nervosával kapcsolatos tömegvesztés kezelésére. Az OB aktivitás modulálása hasznos lehet testtömeg csökkentésére (aktivitásának növelésével) vagy testtömeg növelésére (aktivitásának csökkentésével).
Polipeptiden alapuló terápiás kezelés
A legegyszerűbb elemzésben, az OB gén meghatározza az emlős testtömegét, különösen egerekben és emberben. Az OB gén terméke és megfelelően rokon molekulák úgy tűnik, egy olyan szignálútvonal részét képezik, amelyen keresztül a zsírszövet az aggyal és az egyéb szervekkel összeköttetésbe lép. Feltételezzük, hogy az OB polipeptid önmaga egy szignált adó molekula, azaz hormon.
Az OB polipeptid vagy funkcionálisan aktív fragmentuma vagy antagonistája beadható orálisan vagy
HU 223 563 Β1 parenterálisan, előnyösen parenterálisan. Mivel a metabolikus homeosztázis összefüggő folyamat, előnyben részesítjük az ob polipeptid ellenőrzött elengedéssel járó beadását. Például a polipeptid beadható intravénás infúzió, beépíthető ozmotikus pumpa, bőrön keresztüli tapasz, liposzómák alkalmazásával vagy más módon történő beadással. Egy megvalósítási formában pumpát használhatunk [Langer et al., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Prés., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14, 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88, 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)]. Egy másik megvalósítási formában polimer anyagok alkalmazhatók [Langer, 1974, fent; Sefton, 1987, fent; Smolen et al., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rév. Macromol. Chem. 23, 61 (1983); lásd még Levy et al., Science 228, 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25, 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71, 105 (1989)]. Egy még további megvalósítási formában ellenőrzött elengedő rendszer telepíthető a terápiás cél azaz az agy - közelébe, így a rendszeres adagnak csak a töredéke szükséges [lásd például Goodson, in: Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, p 115-138 (1984)]. Egyéb ellenőrzött elengedőrendszereket tárgyalnak egy áttekintésben Langer és munkatársai [Science 249, 1527-1533 (1990)]. Egy másik megvalósítási formában a terápiás készítmény bevihető egy vezikulába, különösen liposzómába [lásd Langer, (1990), fent; Treat et al., in: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fiedler (eds.), Liss, New York p. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ugyanott, p. 317-327],
Egy további vonatkozásban a polipeptid magas szintjeit kifejező, az OB génnel transzformált rekombináns sejtek ültethetők be az ob polipeptidet igénylő alanyba. Előnyösen Oő-vel transzformált autológ sejteket ültetünk be a kilökődés elkerülése végett; más lehetőségként, hozzáférhető a technológia oldható faktorokat termelő nem autológ sejtek védelmére polimer mátrixon belül, amely megakadályozza az immunológiai felismerést és kilökődést.
Az OB polipeptid bevihető intravénás, intraartériás, intraperitoneális, intramuszkuláris vagy szubkután úton történő beadással. Más lehetőségként a megfelelően előkészített OB polipeptid bevihető nazális vagy orális beadással. Állandó OB ellátás biztosítható terápiásán hatékony adag (azaz az alanyban metabolikus változások kiváltásához hatásos dózis) beadásával a szükséges időközökben, például naponta, minden 12 órában stb. Ezek a paraméterek a kezelendő betegségi állapot súlyosságától és egyéb történésektől, úgymint diétamódosítástól függnek, amelyek standard jó gyógyászati gyakorlattal a szakember számára könnyen meghatározhatók.
Gyógyszerkészítmények
A találmány még további vonatkozásában a fenti gyógyszerkészítményeket nyújtjuk. Ilyen gyógyszerkészítmények készülhetnek injekciós, orális, pulmonális, nazális vagy egyéb alakban történő beadásra. Általánosan, a találmány olyan gyógyszerkészítményeket ölel fel, amelyek a találmány szerinti fehérje vagy származtatott termékek hatékony mennyiségét, gyógyszerészetileg elfogadható hígítókkal, tartósítószerekkel, oldószerekkel, emulgeáló szerekkel, adjuvánsokkal és/vagy hordozókkal együtt tartalmazza. Ilyen készítmények magukban foglalnak különböző puffertartalmú (például Tris-HCl, acetát, foszfát), pH-jú és ionerősségű hígítókat; adalékokat, úgymint detergenseket és oldószereket (például Tween 80-at, Polysorbate 80-at), antioxidánst (például aszkorbinsavat, nátrium-metabiszulfitot), tartósítószereket (például Thimersol-t, benzil-alkoholt) és töltőanyagokat (például laktózt, mannitot); és az anyag beépítését polimer vegyületek - úgymint politejsav, poliglikolsav stb. - egyedi készítményeibe, vagy liposzómákba. Hialuronsav is használható. Ilyen készítmények befolyásolhatják a fizikai állapotot, stabilitást, az in vivő elengedés arányát, és a jelen fehérjék és származékok in vivő szabaddá válását. Lásd Martin [in: Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, p. 1435-1712 (1990)] leírását, amelyet itt referenciaként beépítettünk. A készítmények előállíthatok folyékony formában vagy száraz porként, úgymint liofilizált alakban.
Szájon át (orálisan) történő beadás
Szándékaink szerint felhasználásra kerülnek itt orális szilárd formák, amelyeket általánosan Martin (1990) írt le könyvének (lásd fent) 89 fejezetében, és amelyet itt referenciaként beépítettünk. Szilárd adagolási formák közé tartoznak tabletták, kapszulák, pirulák, kerek vagy szögletes pasztillák, ostyák vagy pelletek. Liposzómába vagy fehérjébe történő bezárás is alkalmazható a jelen készítmények formulázására (mint például az U.S.P. 4,925,673 számú szabadalmi iratban említett proteinoid mikroszférák). Alkalmazható liposzómás kapszulába zárás és a liposzómák különböző polimerekkel módosíthatók (például U.S.P. 5,013,556 számú szabadalmi irat). Terápia céljára lehetséges szilárd adagolási formák leírását adja Marshall [in: Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed., (1979)], amelyet itt referenciaként beépítettünk. Általánosan, a készítmény tartalmazza a fehérjét (vagy kémiailag módosított fehérjét) és olyan inért összetevőket, amelyek lehetővé teszik a biológiailag aktív anyag megvédését a gyomor környezetétől és elengedését a bélben.
Specifikusan idetartoznak a fent módosított fehérjék orális adagolási formái is. A fehérje kémiailag úgy módosítható, hogy a származék szájon át történő beadása hatásos. Általában a kémiai módosításba beletartozik a fehérjemolekulához (vagy pepiidhez) magához legalább egy rész hozzákapcsolása, ahol a nevezett rész lehetővé teszi (a) a proteolízis inhibícióját; és (b) a véráramba való felvételt a gyomorból vagy a bélből. Szintén megkívántatik a fehérje mindent átfogó stabilitásának növelése és a keringési idő növelése a testben. Példák ilyen részekre: a polietilénglikol, etilénglikol és propilénglikol-kopolimerek, karboxi-metil-cellulóz, dextrán, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon) és poliprolin [Abuchowski et al., (1981), fent; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4, 185-189 (1982)]. Egyéb használható
HU 223 563 Bl polimerek a poli-l,3-dioxolán és poli-l,3,6-tioxocane. Gyógyszerészeti felhasználásra előnyben részesítjük a fent jelzettek szerint a polietilénglikol-részeket.
A fehérje (vagy származék) elengedésének helye lehet a gyomor, a vékonybél (duodenum, jejunum vagy ileum) vagy a vastagbél. A szakember rendelkezik olyan hozzáférhető formulázószerekkel, amelyek a gyomorban még nem oldódnak fel, az anyagot a duodenumban vagy valahol a vékonybélben engedik el. Az elengedés előnyösen elkerüli a gyomor környezetének károsítóhatásait, vagy a fehéqe (vagy származék) megvédésével, vagy a biológiailag aktív anyagnak a gyomor környezetén túli, úgymint a vékonybélben történő elengedésével.
Teljes gyomorrezisztencia biztosítására nélkülözhetetlen legalább pH 5,0-ig áthatolhatatlan bevonás. Példák a gyakoribb enterális bevonatként használt inért összetevőkre, cellulóz-acetát-trimellitát (CAT), (hidroxi-propil)-metil-cellulóz-ftalát (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinil-acetát-ftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, cellulóz-acetát-ftalát (CAP), Eudragit L, Eudragit S és Shellac. Ezek a bevonószerek kevert filmként alkalmazhatók.
Bevonószer vagy bevonószerek keveréke olyan tablettákon is használható, amelyeket nem szándékozunk védeni a gyomor ellen. Ezek közé tartoznak a cukorbevonatok vagy a tabletta könnyebb lenyelését biztosító bevonatok. Kapszulák kemény héjból (úgymint zselatinból) állhatnak száraz gyógyszerek, azaz porok bevitelére; folyékony formákhoz lágyzselatin-héjat használhatunk. Az ostyák héjanyaga lehet vastag keményítő vagy más ehető papír. Pirulák, szögletes pasztillák, öntött tabletták vagy por tabletták esetében nedves tömörítőtechnikákat alkalmazhatunk.
A gyógyszerek magukban foglalhatják több finom részecskének, körülbelül 1 mm részecskeméretű granulátum vagy pellet formájában történő formulázását. Az anyagnak kapszulás beadásra történő elkészítése történhet porként, gyengén összenyomott dugóként vagy éppen tablettaként. A gyógyszer sajtolással készíthető el.
Színezékeket és illatanyagokat szintén tartalmazhatnak. Például a fehérje (vagy származék) elkészíthető (úgymint liposzómával vagy mikroszférás bezárással) és azután bekerülhet egy ehető termékbe, úgymint színezékeket és illatanyagokat tartalmazó hűtött italba.
A gyógyszer hígítható vagy térfogata növelhető inért anyaggal. Ezek a hígítószerek magukban foglalhatnak szénhidrátokat, különösen mannitot, α-laktózt, laktózanhidridet, cellulózt, szacharózt, módosított dextránokat és keményítőt. Bizonyos szervetlen sók szintén használhatók töltőanyagként, ezek közé tartozik a kalciumtrifoszfát, magnézium-karbonát és nátrium-klorid. Néhány kereskedelmileg beszerezhető hígítószer a FastFlo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress és Avicell.
Szilárd adagolási formánál szétmállást segítőket tehetünk a gyógyszerkészítménybe. Szétmállasztóként használt anyagok közé tartozik - de korlátozást nem jelent - a keményítő, beleértve a kereskedelemben kapható, keményítőn alapuló mállasztószert az Explotabot. Nátriumkeményítő-glikolát, Amberlite, nátrium-karboxi-metil-cellulóz, természetes szivacs és bentonit mind használható. A szétmállasztók egy másik formáját képezik az oldhatatlan kationcserélő gyanták. Porított gumik használhatók mállasztóként és kötőanyagként, és ezek közé a porított gumik közé tartozhatnak agar, Karaya vagy tragacanth. Alginsav és annak nátriumsója szintén használható mállasztószerként.
Kötőanyagok használhatók a gyógyszerkészítmény összetartására kemény tablettát képezve és beleértve olyan természetes eredetű anyagokat, mint az akácia, tragacanth, keményítő és zselatin. Mások metil-cellulózt (MC), etil-cellulózt (EC) és (karboxi-metil)-cellulózt (CMC) tartalmaznak. Poli(vinil-pirrolidon) (PVP) és (hidroxi-propil)-metil-cellulóz (HPMC) egyaránt használható alkoholos oldatban a gyógyszer granulálására.
Antifrikciós ágens beletartozhat a gyógyszer elkészítésébe a letapadás elkerülésére a formulázási folyamat alatt. Zsírozóanyagok alkalmazhatók a gyógyszer és az öntőforma fala közötti rétegként, és ezek magukban foglalhatnak - de nem korlátozódnak ezekre sztearinsavat, beleértve ennek magnézium- és kalciumsóit, poli(tetrafluor-etilén)-t (PTFE), folyékony paraffint, növényi olajokat és viaszokat. Alkalmazhatók oldható zsírozószerek is, úgymint nátrium-lauril-szulfát, magnézium-lauril-szulfát, különböző molekulatömegű polietilénglikol és Carbowax 4000 és 6000.
Síkosítók, amelyek megjavíthatják a drog áramlási sajátságait a formulázás során, és segíthetik az átrendeződést a sajtolás alatt, szintén használhatók. A síkosítók közé tartoznak, keményítő, talkum, pirogén szilícium-dioxid és hidratált sziliko-aluminát.
A gyógyszer vizes közegben történő feloldódásának elősegítésére felületaktív anyagot adhatunk nedvesítőszerként. Felületaktív anyagok közé tartozhatnak anionos detergensek, úgymint nátrium-lauril-szulfát, dioktil-nátrium-szulfoszukcinát és dioktil-nátrium-szulfonát. Használhatók kationos detergensek, és közéjük tartozhat a benzalkónium-klorid vagy benzetómium-klorid. A formulázásban felületaktív anyagként használható potenciális nemionos detergensek listája a következő: lauromacrogol 400, polioxil 40-sztearát, poli-oxi-etilén hidrogénezett ricinusolaj 10, 50 és 60, glicerin-monosztearát, poliszorbát 40, 60, 65 és 80, szacharóz zsírsav-észter, metil-cellulóz és (karboxi-metil)-cellulóz. Ezek a felületaktív anyagok jelen lehetnek a fehérjét vagy származékát tartalmazó gyógyszerkészítményben egymagukban vagy különböző arányú keverékben.
Olyan adalékok, amelyek fokozzák a fehérje (vagy származéka) felvételét, például a zsírsavak, olajsavak, linolsav és linolénsav.
Szükség lehet ellenőrzötten elengedő készítményre. A gyógyszer beépíthető egy inért mátrixba, amely lehetővé teszi elengedését diffúzióval vagy kilúgozómechanizmussal, azaz gumikkal. Lassan lebomló mátrixok szintén beépíthetők a készítménybe. E gyógyszer ellenőrzött elengedésének egy másik formája az Oros gyógyszerrendszeren (Alza Corp.) alapuló módszer, azaz a gyógyszert egy féligáteresztő (szemipermeábilis) membránba zárjuk be, amely lehetővé teszi víz belépését, és a gyógyszert egy kis nyíláson át kinyomja az oz32
HU 223 563 Bl motikus hatásoknak köszönhetően. Néhány enterális bevonat szintén késleltetett elengedési hatáson alapul.
A készítményhez egyéb bevonatok is használhatók. Ezek közé tartoznak különböző olyan cukrok, amelyeket bevonóedényzetben alkalmazni lehet. A terápiás szer szintén adható filmbevonatú tablettában; az ebben az esetben alkalmazott anyagokat 2 csoportra osztjuk. Az elsőbe tartoznak a nem enterális anyagok és magukban foglalják a metil-cellulózt, etil-cellulózt, (hidroxi-etil)-cellulózt, metil-(hidroxi-etil)-cellulózt, (hidroxi-propil)-cellulózt, (hidroxi-propil)-metil-cellulózt, nátrium-(karboxi-metil)-cellulózt, providont és polietilénglikolokat. A második csoport olyan enterális anyagokból áll, amelyek gyakran fíálsav-észterek.
Anyagok keveréke alkalmazható az optimális filmbevonathoz. A filmbevonás kivitelezhető bevonóedényzetben vagy fluid ágyban, vagy sajtolásos bevonással.
Tüdőn keresztül (pulmonálisan) történő bevitel
Szintén idetartozik a találmány szerinti fehérjének (vagy származékainak) pulmonális bevitele. A fehérjét (vagy származékát) az emlős tüdejébe visszük be, mialatt az belélegződve és a tüdőhám bélését átjárva bekerül a véráramba. Ugyanerről, más anyagokkal történt tudósítások [Adjei et al., Pharmaceutical Research 7 (6), 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63, 135-144 (1990) (leuprolid-acetát); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 73 (suppl. 5) 143-146 (1989) (endotelin-1); Hubbard et al., Annals of Internál Medicine 3 (3), 206-212 (1989) (αΐ-antitripszin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84, 1145-1146 (1989) (αΐ-proteináz); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado (March 1990) (rekombináns humán növekedési hormon); Debs et al., J. Immunoi. 140, 3482-3488 (1988) és Platz et al., U.S.P. 5,284,656 számú szabadalmi irat (granulocitakolónia-stimuláló faktor). A találmány gyakorlati megvalósításának tárgyát képezi terápiás termékek pulmonális bevitelére tervezett eszközök széles választéka, beleértve - de korlátozást nem jelentve - ködképzőket, adagolásmérővel felszerelt inhalátorokat és porinhalálókat, amelyek mind ismerősek a szakember számára.
Néhány specifikus példa kereskedelemben kapható, a találmány gyakorlatához megfelelő készülékekre az Ultravent (nebulizer) ködképző (Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri); az Acom II ködképző (Marquest Medical Products, Englewood, Colorado); a Ventolin adagolásmérővel felszerelt inhalátor (Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina) és a Spinhaler porinhaláló (Fisons Corp,, Bedford, Massachusetts).
Minden ilyen készülékhez a fehéije (vagy származéka) eloszlatásához megfelelő formulázásokra van szükség. Tipikusan minden formulázás az alkalmazott készülék típusára specifikus, és magában foglalhatja megfelelő hajtóanyagok használatát a terápiában általában szokásos hígítószereken, adjuvánsokon és/vagy hordozókon felül. Liposzómák, mikrokapszulák vagy mikroszférák, zárványkomplexek vagy hordozók más típusainak alkalmazása szintén idetartozik. Kémiailag módosított fehéije is készíthető különböző formulákban a kémiai módosítás vagy az alkalmazott készülék típusától függően.
A ködképzővel, gőzsugárral vagy ultrahanggal történő alkalmazásra megfelelő készítmények jellemzően vízben oldott fehérjét (vagy származékot) tartalmaznak biológiailag aktív fehérjére számítva ml-enként körülbelül 0,1-25 mg mennyiségben. A készítmény tartalmazhat puffért és egyszerű cukrot is (például a fehérje stabilizálására és az ozmózisnyomás szabályozására). A ködképző készítmény tartalmazhat felületaktív anyagot is a fehérjefelület indukálta aggregációjának csökkentésére vagy megelőzésére, amelyet az aeroszolképződésnél az oldat atomizációja idéz elő.
Az adagolásmérővel felszerelt inhalátorkészülékben felhasználásra kerülő készítmények a fehérjét (vagy származékát) általában felületaktív anyag segítségével hajtóanyagban szuszpendált, finoman eloszlatott por formájában tartalmazzák. A hajtóanyag bármilyen erre a célra szokásos anyag lehet, úgymint klórozottfluorozott szénhidrogén vagy szénhidrogén, beleértve triklór-fluor-metánt, diklór-difluor-metánt, diklór-tetrafluor-etanolt, 1,1,1,2-tetrafluor-etánt vagy ezek kombinációját. Megfelelő felületaktív anyagok közé tartozik a szorbitán-trioleát és szójalecitin. Olajsav is hasznos lehet felületaktív anyagként.
Porinhalátor-készülékből történő eloszlatásra szánt készítmények a fehérjét (vagy származékát) tartalmazó, finoman eloszlatott port tartalmaznak, és tartalmazhatnak még töltelékanyagot, úgymint laktózt, szorbitot, szacharózt vagy mannitot olyan mennyiségben, amely megkönnyíti a pornak a készülékből történő eloszlatását (például a készítmény 50-90 tömeg%-ában). A fehérjét (vagy származékát) legelőnyösebben olyan részecske formájában kell elkészíteni, amelynek átlagos részecskemérete kisebb mint 10 pm (vagy mikron) - legelőnyösebben 0,5-5 pm - a disztális tüdőbe történő leghatékonyabb bevitel érdekében.
Orron keresztül (nazálisán) történő bevitel
A fehérje (vagy származék) orron keresztül történő bevitele szintén a találmány tárgyát képezi. A nazális szállítás lehetővé teszi a fehérje közvetlen átvitelét a véráramba a terápiás terméknek az orrba történő beadását követően anélkül, hogy szükség lenne a terméknek a tüdőbe történő lerakására. Nazális bevitelre formulázott készítmények közé tartoznak a dextránt vagy ciklodextránt tartalmazók.
Kezelési módszerek, gyógyszerkészítési módszerek
A találmánynak egy még további vonatkozásában kezelési módszereket és gyógyszer készítését nyújtjuk. A jelen származékok beadásával könnyített vagy modulált állapotokat fent jeleztük.
Adagolások
Minden fent említett molekulára, ahogy további tanulmányokat végzünk, információ kerül napvilágra a különböző betegek különböző állapotainak kezelésére szolgáló megfelelő adagolást illetően, és a szakmában jártas dolgozó figyelembe véve a terápiás összefüggést, a befogadó (recipiens) életkorát és általános egészségi állapotát, képes megállapítani a megfelelő adagolást. Általában injekcióhoz vagy infúzióhoz az adagolás bio33
HU 223 563 Bl lógiailag aktív fehérjéből (a tömeget a kémiai módosítás nélküli fehérjére magára számítjuk) testtömeg-kgonként 0,01 pg és 10 mg között mozog. Az adagolási menetrend változhat az alkalmazott fehérje vagy származék keringési felezési idejétől függően akár nagy dózisú tablettaként, akár folyamatos infúzióval visszük be a polipeptidet és az alkalmazott készítményt.
Beadás egyéb vegyületekkel
Elhízással összefüggő terápia céljára a jelen fehérje (vagy származékok) beadható(k) egy vagy több olyan gyógyszerészeti készítménnyel összekapcsolva, amelyek az elhízás egyéb klinikai komplikációinak kezelésére szolgálnak, úgymint cukorbaj (például inzulin), magas vérnyomás, magas koleszterinszint és egyéb, az elhízottsággal velejáró ártalmas állapotok kezelésére. Egyéb étvágycsökkentők - például amfetaminok szintén együttesen beadhatók. A beadás történhet egyidejűleg (például a jelen fehérje és inzulin keverékének beadása) vagy egymásután.
Nukleinsavon alapuló terápiás kezelés
Az OB gén bevezethető humán zsírsejtekbe elhízottság elleni génterápia kifejtése céljából. Az ilyen terápiától a testtömeg csökkenését várjuk. Ezzel ellentétben, antiszenz szerkezeteknek humán zsírsejtekbe történő bevezetése csökkenteni fogja az aktív OB polipeptid szintjét, és testi kövérség növekedése jósolható.
Egy megvalósítási formában az OB polipeptidet kódoló gént virális vektorban in vivő visszük be. Ilyen vektorok közé tartozik legyengített vagy hibás DNS-vírus, úgymint - korlátozást nem jelentve - a herpes simplex vírus (HSV), papillomavírus, Epstein-Barrvírus (EBV), adenovírus, adeno-associated vírus (AAV) és hasonlók. Előnyben részesítünk olyan hibás vírusokat, amelyekből teljesen vagy majdnem teljesen hiányoznak a virális gének. A hibás vírus nem fertőző a sejtbe jutást követően. Hibásvírus-vektorok használata a sejtekbe, specifikus lokalizált területre történő beadást tesz lehetővé anélkül, hogy aggódnunk kellene a vektornak más sejteket történő fertőzése miatt. Tehát a zsírszövet specifikusan megcélozható. Példák az egyes vektorokra - de nem korlátozódnak ezekre - a hibás herpeszvírus 1 (HSV1) vektor [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2, 320-330 (1991)], legyengített adenovírus-vektor, úgymint a Stratford-Perricaudet és munkatársai által leírt vektor [J. Clin. Invest. 90, 626-630 (1992)] és hibás adeno-associated vírusvektor [Samulski et al., J. Virol. 61, 3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828 (1989)].
Egy másik megvalósítási formában a gén retrovírusvektorba vihető be, például a következő publikációkban leírtak szerint [Anderson et al., U.S.P. 5,399,346 számú szabadalmi irat; Mann et al., Cell 33, 153 (1983); Temin et al., U.S.P. 4,650,764 és Temin et al., U.S.P. 4,980,289 számú szabadalmi iratok; Markowitz et al., J. Virol. 62, 1120 (1988); Temin et al., U.S.P. 5,124,263 számú szabadalmi irat; Dougherty et al., WO 95/07358 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés és Kuo et al., Blood 82, 845 (1993)].
Más lehetőségként a vektor bevihető in vivő lipofekcióval. Az elmúlt évtizedben megnövekedett a liposzómák alkalmazása nukleinsavak in vitro történő bezárására és transzfekciójára. A liposzóma közvetítette transzfekcióval szembeni nehézségek és veszélyek korlátozására tervezett szintetikus kation lipidek alkalmazhatók markert kódoló gén in vivő transzfekciójára szolgáló liposzómák elkészítésére [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8027-8031 (1988)]. Kation lipidek felhasználása elősegítheti negatív töltésű nukleinsavak kapszulába zárását, és segítheti a fúziót negatív töltésű, sejtmembránokkal [Felgner et al., Science 337, 387-388 (1989)]. Lipofekció alkalmazása exogén gének specifikus szervekbe történő in vivő bevitelére bizonyos gyakorlati előnyökkel jár. Liposzómáknak specifikus sejtekbe történő molekuláris célba juttatása képviseli az előnyök egy területét. Világos, hogy a transzfekciónak egyes sejttípusokba való irányítása különösen előnyös lehet celluláris heterogenitással rendelkező szövetben, úgymint pankreászban (hasnyálmirigyben), májban, vesében és agyban. Lipidek célba juttatáshoz egyéb molekulákkal kémiailag kapcsolhatók (lásd Mackey et al., 1988, fent). Célba juttatandó peptidek, például hormonok vagy neurotranszmitterek és fehérjék - úgymint antitestek vagy nem peptidmolekulák kémiailag kapcsolhatók a liposzómákhoz.
A vektor in vivő bevezetése csupasz DNS-plazmidként is lehetséges. Génterápia céljára csupasz DNS-vektorok bevezethetők a kívánt gazdasejtekbe a szakmában ismert módszerekkel, például transzfekcióval, elektroporációval, mikroinjektálással, transzdukcióval, sejtfúzióval, DEAE-dextránnal, kalcium-foszfát-precipitációval, génágyú használatával vagy DNSvektor-transzporter alkalmazásával [lásd például, Wu et al., J. Bioi. Chem. 267, 963-967 (1992); Wu et al., J. Bioi. Chem. 263, 14 621-14 624 (1988); Hartmut et al., 2,012,311 számú nyilvánosságra hozott kanadai szabadalmi bejelentés (benyújtva 1990. március 15-én)].
Mezőgazdasági alkalmazások
Az OB gén háziállatokból is izolálható, és ilyenformán megkapható a megfelelő OB polipeptid. Egy specifikus megvalósítási formában (lent), a rágcsáló OB génből származó próbát hibridizáljuk nagyszámú állatfajból származó, megfelelő homológ kódolószekvenciákkal. A humán terápiáknál taglaltak szerint, szintén készíthetők rekombináns fehérjék és beadhatók háziállatoknak. A polipeptid beadása végrehajtható soványabb étkezési állatok - úgymint húsmarha, -sertés, -baromfi, -birka stb. - előállítása céljából. Előnyösen autológ OB polipeptidet adunk be, jóllehet a találmány tárgykörébe antiautológ polipeptidek beadása ugyanúgy beletartozik. Mivel az OB polipeptid körülbelül 160 aminosavmaradékból áll, nem lehet erősen immunogén. Tehát nem autológ polipeptidek beadása nem eredményezhet immunválaszt.
Másképpen, a klónozott gén bevitele transzgén háziállatokba lehetővé teszi a testtömeg és kövérség potenciális csökkentését az OB gén túlzott kifejezésével. Ennek legegyszerűbb elérési módja OB transzgén
HU 223 563 Bl célbajuttatása zsírba a saját vagy zsírspecifikus promoter alkalmazásával.
Ezzel ellentétben, más körülmények között - úgymint Köbe hús vagy hizlalt liba májához zsírmáj kifejlesztésére - kívánatos lehet a testtömeg emelése. Ez együtt járhat antiszenz OB transzgénnek a zsírba történő bejuttatásával vagy gén knock out technológia alkalmazásával. Más lehetőségként, ahol a testtömeg zsírszázalékának növelésére van szükség, beadható az OB polipeptid inhibitora vagy antagonistája. Ilyen inhibitorok vagy antagonisták közé tartoznak - de korlátozást nem jelentenek - a polipeptiddel reaktív antitestek, és a polipeptid olyan fragmentumai, amelyek kötődnek az OB receptorhoz, de nem aktiválják azt, azaz öő-polipeptid-antagomsták.
Kozmetikai alkalmazások
Az OB polipeptid jelentős értéket képvisel kozmetikai felhasználásra az egészségügyi előnyökön túl. Különösen, mivel a találmány szerinti OB polipeptidek, beleértve ezek származékait és agonista analógjait, felhasználhatók a zsírsejtlerakódás arányának és mennyiségének modulálására állatban, felhasználhatók olyan csúnya zsírszövet - például zsírlerakódások a hason, csípőkön, combokon, nyakon és állón - csökkentésére, amely nem szükségszerűen elhízott állapotnak megfelelő mennyiség, azonban visszaveti az egyén megjelenésének értékét. A zsírcsökkentő hatás részben a csökkent étvágynak, azaz az élelmiszer-bevitel csökkenésének, részben az alapmetabolizmus növekedésének tudható be, vagy mindkettőnek. Ilyenformán tehát a jelen OB polipeptid vagy származékai, vagy agonista analógjai felhasználhatók az alanynak zsírszövetlerakódásokban kozmetikai változások végrehajtására történő beadásra, akár a zsírlerakódás modulálása, akár az étvágy csökkentése révén, vagy mindkettővel.
Ezenkívül a jelen készítmények és módszerek alkalmazhatók összekapcsolva különböző eljárásokkal, úgymint az egész test átfogó megváltoztatására tervezett kozmetikai sebészettel (például zsírleszívással vagy a testtömeg csökkentésére tervezett, zsírszövetet lecsapoló vagy leválasztó lézersebészettel), gyakorlatokkal (különösen futással és tömegtréninggel), alacsony zsírtartalmú diétával, hipnózissal, biofeedback-kel, az utak példái szerint megkísérelhető a zsírszövet arányának csökkentése és a test megjelenésének javítása.
Ezek szerint a találmány tárgyát képezi olyan kozmetikai zsírszövet-modulálási módszer egy alanyban, amely tartalmazza zsírmoduláló mennyiségű OB polipeptidnek vagy származékának, vagy agonista analógjának a beadását olyan alany számára, amely átfogó testi megjelenés javítása céljából kozmetikai zsírszövet-modulációt kíván. Különleges vonatkozásban a zsírszövet-moduláció zsírszövetcsökkentést jelent.
Egy további megvalósítási formában a találmány tárgyát olyan kozmetikai zsírszövetvesztés végrehajtására szolgáló módszer képezi, amely testi megjelenés megváltoztatására szolgáló eljárást kombináltan tartalmaz zsirmoduláló mennyiségű OB polipeptid vagy származéka, vagy agonista analógja beadásával olyan alany számára, amely átfogó testi megjelenés javítása céljából kozmetikai zsírszövet-modulációt kíván.
Az OB receptor
Az OB faktor kis molekulájú agonistáinak és antagonistáinak kifejlesztése nagyban megkönnyítette receptorának izolálását. Ez elvégezhető aktív OB polipeptid előállításával és expressziós könyvtár standard módszer szerinti screenelésére történő felhasználásával. Az expressziós könyvtárban receptorkötés tesztelhető bakteriális vagy emlős-expressziósvektorok alkalmazásával készített rekombináns polipeptid beadásával, és megfigyelve a rekombináns polipeptidnek rövid ideig tartó és folyamatos beadásával az expressziós könyvtárat tartalmazó sejtekre gyakorolt hatását, vagy az OB polipeptidnek a sejtekhez való közvetlen kötődése kimutatásával.
A jelenlegi feltételezés szerint, hogy az OB receptor valószínűleg a hipotalamuszban és talán a májban helyezkedik el, cDNS-könyvtárakat előnyösen ezekből a szövetekből állítunk össze standard expressziós klónozóvektorokban. Ezeket a cDNS-klónokat ezt követően COS-sejtekbe, mint pool-okba visszük be és a kapott transzformátumokat aktív ligandumokkal screeneljük az OB receptort kifejező COS-sejtekre. A pozitív kiónokat azután oly módon izolálhatjuk hogy visszanyerjük a klónozott receptort. A klónozott receptor az OB ligandummal (feltételezve, hogy ez egy hormon) összekapcsolva felhasználható OB kis molekulájú modulátorainak screenelésére szolgáló nélkülözhetetlen komponensek kifejlesztésére.
A találmány szerint hasznosítandó különleges assay-rendszer receptorassay-ként ismert. Egy receptormeghatározási rendszerben (assay-ben) a meghatározandó anyag megfelelően jelölve van, és azután bizonyos celluláris tesztkolóniákat beoltunk mind jelölt, mind jelöletlen anyaggal, amelyet követően kötési vizsgálatokat vezetünk a jelölt anyag sejtreceptorokhoz való kötődése mértékének meghatározására. Ezen az úton megállapíthatók az anyagok közötti affinitásbeli különbségek.
Eszerint a tömegmodulátor tisztított mennyisége radioaktívan jelölhető és kombinálható például vele szembeni antitestekkel vagy egyéb inhibitorokkal, amely után kötődési kísérleteket hajtunk végre. Ezután olyan oldatokat készítünk, amelyek különböző mennyiségben tartalmaznak jelölt és jelöletlen, nem kombinálódott tömegmodulátort, és ezután beoltjuk a sejtmintákat és inkubáljuk azokat. Az eredményül kapott egysejtrétegeket azután mossuk, oldhatóvá tesszük és gamma-számlálóban olyan hosszú ideig számláljuk, hogy az idő elegendő legyen <5% standard hiba eléréséhez. Ezeket az adatokat azután Scatchard-analízisnek vetjük alá, amely után az anyag aktivitására vonatkozóan megfigyelések és következtetések vonhatók le. Az előzőek bár kísérletesen, de szemléltetik azt a módot, ahogyan a receptorassay kivitelezhető és hasznosítható olyan esetekben, ahol a meghatározott anyag celluláris kötődési képessége szolgálhat megkülönböztető sajátságként. A receptorassay viszont különösen hasznos lesz a jelen modulátorokra specifikus receptorok - úgymint a db receptor - azonosításában.
HU 223 563 Β1
Egy további meghatározás, amely a találmány tárgyát képezi és aszerint hasznosítható „cisz/transz” assay-ként ismert. Röviden, ez a meghatározás két genetikai szerkezetet alkalmaz, amelyek közül az egyik tipikusan egy olyan plazmid, amely megfelelő sejtvonalba beültetve folyamatosan kifejezi az illető receptort, és a második egy olyan plazmid, amely riportert, úgymint luciferázt fejez ki receptor/ligandum komplex kontrollja alatt. Tehát például ha szükséges egy vegyületnek egy receptorligandumaként történő értékelése, a plazmidok egyike lesz az a szerkezet, amely a receptor kifejeződését eredményezi a kiválasztott sejtvonalban, míg a második plazmid a luciferáz génhez kapcsolt olyan promoterrel rendelkezik, amelyben inszertálva van az illető receptorra a válasz elem. Amennyiben a tesztelt vegyület a receptorra nézve agonista, a ligandum komplexet képez a receptorral, és az eredményül kapott komplex kötődni fog a válaszelemmel, és kiváltja a luciferáz gén transzkripcióját. Az eredményezett kemilumineszcenciát azután fotometriásan méijük, és a válaszgörbéket megkapva összehasonlítjuk azokat ismert ligandumok görbéivel. Az előzőekben leírt eljárást részleteiben az U.S.P. 4,981,784 számú szabadalmi irat és a PCT WO88/03168 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés íija le, amelyre hivatkozunk.
Amint OB receptor gén szekvenciát kifejező rekombinánst azonosítunk, a rekombináns OB receptor vizsgálható. Ezt az OB receptor fizikai és funkcionális sajátságain alapuló meghatározásokkal - beleértve az OB receptor radioaktív jelölését követő gélelektroforézissel, immunassay-vel, ligandumkötéssel stb. történő analízist
- érhetjük el. Továbbá előállíthatunk az OB receptorral szembeni antitesteket, a fentiekben leírtak szerint.
Az OB receptor szerkezete a szakmában ismert különböző módszerekkel vizsgálható. Előnyösen a különböző domének szerkezetét, különösen az OB-kötő helyet vizsgáljuk. Szerkezeti analízis végezhető más ismert fehérjékkel - különösen hormon- és fehérjereceptorokkal
- való szekvenciahasonlóság azonosításával. A hasonlóság (vagy homológia) foka nyújthat alapot az OB receptor vagy doménje szerkezetének és működésének előrejelzésére. Egy specifikus megvalósítási formában szekvencia-összehasonlítások végezhetők GenBankban található szekvenciákkal, például a FASTA és FASTP programok alkalmazásával [Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)].
A fehérjeszekvencia tovább jellemezhető hidrofiljelleg-analízissel (például Hopp et al., 1981, fent). A hidrofiljelleg-profil felhasználható az OB receptorfehérje hidrofób és hidrofil régióinak azonosítására, amelyek viszont citoplazmán kívüli, membránkötő és citoplazmán belüli régiókat jelezhetnek.
Másodlagos szerkezeti analízis (például Chou et al., 1974, fent) is végezhető az OB receptor olyan régióinak azonosítására, amelyek specifikus másodlagos szerkezeteket vesznek föl.
Manipuláció, transzláció és másodlagosszerkezetelőrejelzés ugyanúgy, mint nyílt leolvasási keret előrejelzése és feltérképezése elvégezhető a szakmában hozzáférhető számítógépes programok alkalmazásával.
Bőséges mennyiségű rekombináns OB polipeptidforrás és OB receptor (azaz a db géntermék) izolálására kedvező feltételek biztosításával a találmány képes az OB polipeptid és az OB receptor vagy doménjei aktív konformációjának kvantitatív szerkezeti meghatározására. Különösen elegendő anyagot biztosít mag-mágnesesrezonancia (NMR), infravörös (IR), Rámán és ultraibolya (UV), különösen cirkuláris dikroizmus (CD), spektroszkópiai analízis számára. Különösen az NMR-vizsgálat nyújt hathatós szerkezeti analízist oldatban levő molekulákra, amely szorosabban közelíti azok természetes környezetét (Marion et al., 1983; Bar et al., 1985; Kimura et al., 1980, fent). A szerkezeti analízis egyéb módszerei szintén alkalmazhatók. Ezek közé tartozik - de korlátozást nem jelent - a röntgenkristallográfia (Engstom 1974, fent).
Még előnyösebben tanulmányozhatók OB polipeptid és OB receptor együttes kristályai. Együttes kristályok analízise részletes információt nyújt a kötődésről, amely viszont agonista és antagonista ligandum ésszerű megtervezését teszi lehetővé. Számítógépes modellezés is alkalmazható, különösen NMR vagy röntgenkristallográfia módszerével kapcsolatban [Fletterick et al., eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications is Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].
A találmány szerinti OB receptort kódoló gén azonosítása és izolálása a receptor kifejeződését nagyobb mennyiségben biztosítja, mint ahogyan az természetes forrásokból vagy olyan indikátor sejtekben izolálható, amelyeket speciálisan állítottunk elő a sejtek transzfekciója vagy transzformációja utáni receptoraktivitás jelzésére. Ezek szerint az OB polipeptid szerkezetén alapuló agonisták és antagonisták ésszerű tervezésén felül a találmány tárgyát OB receptor specifikus ligandumainak azonosítására szolgáló, a szakmában ismert különböző screenelési assay-ket alkalmazó alternatív módszer képezi.
A találmány jobban megérthető a következő példákra történő utalásokkal, amelyeket a találmány példaszerű bemutatására szánunk, és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását.
Példák
A következők körvonalazzák a genetikai anyag azonosítására a találmányban példaszerűen alkalmazott módszert. Ez a törekvés négy szekvenciális lépést foglal magában: A) genetikai térképezést, B) fizikai térképezést, C) jelöltgén-izolációt és D) mutáció kimutatását. Annak megerősítését követően, hogy a rágcsáló gént alanyban izoláltuk (D lépés), a homológ humán gént kerestük, és mind a rágcsáló-, mind a humán géneket és feltételezett fehérjéket jellemeztük. A lépéseket részletesebben az alábbiakban foglaljuk össze.
A) Genetikai térképezés
Az ob mutációt genetikai keresztezésekben szegregáltuk és standard kötési analízist alkalmaztunk a mutáció RFLP-khez (restriction fragment length
HU 223 563 Bl polymorphisms=restrikciós fragmentum hossz polimorfizmusok) viszonyított helyének meghatározására. Ezek az adatok az OB gént körülbelül 5 cM távolságban a 6. proximális egérkromoszómán helyezik el. (5 cM a genetikai távolság mérése, megfelel 100 állatra vonatkoztatott 5 látszólagos genetikai crossover-nek.) Összesen 771 informatív meiózist hoztunk létre és használtunk fel genetikai térképezésre (Friedman et al., 1991, fent). Az OB-re vonatkozóan feltérképezett genetikai lókuszokat már korábban mind közzétették. A két legközelebbi leírt RFLP-t karboxi-peptidázhól és met onkogénből származó próbákkal definiálták.
A fent leírt kísérletek genetikai eredménye nem volt megfelelő az ob klónozásához, leginkább azért, mert a genetikai markerek egyike sem volt szoros kötésben. A szükséges közelségben kötött RFLP-k azonosítása céljából további próbákat izoláltunk és kiterjesztettük a genetikai keresztezést. A kromoszómamikrodisszekcióként ismert módszert alkalmaztuk random DNSdarabok izolálására a 6. proximális egérkromoszómából [Bahary et al., Mammalian Genome 4, 511-515 (1993)]. Egyedi klónozott próbákat teszteltünk ob-hez történő szoros kötődésre. Ezen tanulmányok alapján egy próbát, D6Rckl3-at - psd3-ként is nevezve - választottunk ki további analízisre O2?-hez való genetikai közelségének köszönhetően. Ezt a próbát használtuk interspecifikus és interszubspecifikus keresztezések 835 ob utódjának genotipizálására, amely azt jelezte, hogy D6Rckl3 nem rekombináns mind a 835 állatban, ahogyan azt Bahary és munkatársai leírták. Fizikai térképezés során új polimorf markert azonosítottunk az YAC53A6-ból származó kozmid szubklónból. Ezt az új markert a D6Rckl3 és az OB gén között helyeztük el, és a további intraspecifikus intercrossból és backcrossból származó 771 informatív meiózis genotipizálására használtuk fel. Egyetlen állatot, a 167. számút azonosítottunk, amely ob és D6Rck39 közötti rekombináns crossover-t hordozott. Ezek a tanulmányok azt jelezték, hogy D6Rck39/D6Rckl3 körülbelül 0,06 cM távolságban van οό-tól. Egy további próbát, 75ax4-et azonosítottunk, amely 0,12 cM közelségben volt oó-tól. Pax4 két állatban volt rekombináns, a 111. és 420. számúakban. Pax4 egy pszeudogén, amelyet Gruss és munkatársai korábban már feltérképeztek a 6. proximális egérkromoszómán [Genomics 77, 424-434 (1991)]. Erre alapozva meghatároztuk, hogy az OB gén a Pax4 és D6Rckl3 közötti 0,2 cM távolságon belül helyezkedik el. Ez a közbeékelt DNS klónozására és OB izolálására tett erőfeszítésekhez vezetett.
B) Fizikai térképezés
Az ebben a szakaszban levő DNS klónozását mesterséges élesztőkromoszómák (yeast artificial chromosomes = YACs) felhasználásával végeztük, amely viszonylag új klónozóvektor, amely lehetővé teszi összefüggő DNS hosszú kiterjedéseinek, gyakran több mint 1 millió bázispárhossznak a klónozását.
Mesterséges élesztőkromoszómákat izoláltunk D6Rckl3 és Pax4 felhasználásával. Ezt tisztított DNSpróbák elkészítésével és azoknak a megfelelő YAC-k izolálására történő felhasználásával végeztük. Ezeket az YAC-ket (8., 16., 107. és 24.) izoláltuk, és kezdetlegesen jellemeztük, és az eredményül kapott analízis alapján azt a következtetést vontuk le, hogy a 16. YAC a legmesszebbre kiterjedő, azaz az ob-hez legközelebbi YAC. A 16. YAC kulcsvégét azután helyrehoztuk, és megállapítottuk, hogy ez a vég közelebb van ob-hez, mint Pax4-hez. Ezt a véget 16M(+)-nak neveztük el. Azért vontuk le ezt a következtetést, mert megmutattuk, hogy ez a próba nem rekombináns a 420. számú állatban (ahogyan Pox4 igen). Ezt a véget szekvenáltuk és PCR assay kifejlesztéséhez használtuk föl. Ezt a PCR assay-t alkalmaztuk YAC-könyvtár screenelésére. Négy pozitív kiónt izoláltunk. Ezen YAC-k ezt követő jellemzése végfelszabadítással, restrikciós térképezéssel, pulzáló gélelektroforézissel és a genetikai keresztezésekkel történő Southem-blottal azt a megállapítást hozta, hogy két YAC adu és aad kritikus az ezt követő tanulmányokhoz. YAC aad 550 kb, nem kiméra legmesszebbre kiterjedő YAC. Ilyenformán ennek az YAC-nek a távoli végét aűí7(pICL)-t használtuk föl a fizikai térkép teljessé tételére. YAC adu 370 kb, nem kiméra YAC, és ennek távoli végéről aí/«(+)-ról megállapítottuk, hogy nem rekombináns a 111. és 167. számú állatokat felölelő genetikai keresztezések minden ob utódjában, azt sugallva, hogy az OB gén jelen lehet ebben az YAC-ben.
Erre a két végre, aa<7(pICL)-re és adu(+)-ra PCR assay-t fejlesztettünk ki, és használtunk föl több YAC és Pl klón izolálására a fizikai térképezés folytatásához. Az ezzel az erőfeszítéssel izolált fontos Pl kiónok közé tartoznak a 498., 499. és 500. /aaí/(pICL)-ből származó próba alkalmazásával izolált] és a 322., 323. és 324. /«(/«(+)-ból származó próbával izolált] kiónok.
Közben D6Rckl3-mal izolált YAC-ket (53A6, 25A8, 25A9, 25A10) jellemeztünk. Ezek a vizsgálatok megállapították, hogy 53A6 terjed ki legtovábbi közelségben aadYAC irányában. Az 53A6 és aad közötti nyílás méretét körülbelül 70 kb-nak állapítottuk meg. Az 53A6, 53(pICL) kulcsvégét azután felhasználtuk három hozzáférhető YAC-könyvtár és egy Pl könyvtár screenelésére. Kritikus Pl kiónt, a 325. izoláltuk. Ez a Pl klón átfedett a fent leírtak szerint aa<7(pICL)-vel izolált Pl kiónnal, és ilyenformán az 53(pICL) és aaí/(pICL) közötti rés bezárásaként szolgált. Eredményként a körülbelül 2,5 millió bázispár hosszúságú, YAC-ket és Pl kiónokat tartalmazó teljes összefüggő részt és az áthidaló 7’űx4, 16M(+), adu(+), aaí7(pICL), 53(pICL), D6Rck39 és D6Rckl3 részeket klónoztuk. A 111. és 167. számú állatokban látható rekombináció helyeinek óvatos térképezésével azt a következtetést vontuk le, hogy OB a 400 kb köztes szakaszban helyezkedik el. Az OB gén izolálásához működő DNS-forrás biztosítására, ezt a nem rekombinációs régiót takaró, körülbelül 500 kb-t izoláltuk összesen 24 Pl kiónban. Ezeket a Pl kiónokat - beleértve 322. és 323. számút, amelyeket később használható kiónoknak találtunk exon befogásra (exon trapping) használtuk föl. A kromoszóma OB-t hordozó részének fizikai térképét mutatja a 7A. ábra. 7B. ábra mutatja az YAC összefüggő részt. 7C. ábra szemlélteti a Pl összefüggő részt.
HU 223 563 Β1
C) A jelölt gének izolálása
Ebben a köztes szakaszban a gének izolálására használt módszer exonbefogás volt. Ez a módszer kereskedelemben kapható vektort használ föl exon DNS (azaz kódolószekvenciák) azonosítására, a tesztszerkezetbe bevitt genomiális DNS-ben funkcionális splice akceptor és donorszekvenciákra történő szelektálással. Az ezekből a Pl kiónokból származó DNS-t szaporítottuk és az exonbefogó vektorba szubklónoztuk. Ezek a kiónok a Bluescript vektorba klónozott rövid inszertumok voltak. Minden egyes kiónt PCR-rel amplifikáltunk az inszertumot szegélyező plazmid szekvenciáknak megfelelő PCR-primerekkel. A PCR amplifikálást közvetlenül a plazmidot hordozó baktériumokban végeztük el. A reakciókat Biomek robotban indítottuk el. A PCR termékeket 1%-os agarózgélen etídium-bromidot tartalmazó TBE-pufferben elektroforézisnek vetettük alá. Az exonbefogó technikát módosítottuk a szennyező E. coli DNS-nek a Pl ki ónokból történő eltávolítása és a fölöslegben levő, a vélhetően befogott exonok 80-90%-át meghaladó mesterséges exonok kiszűrése céljából. Az exonbefogó vektor HIV-szekvenciákat tartalmaz; ezeknek a vektor szekvenciáknak rövid szegmense megfelel ennek a mesterséges képződménynek.
Az exonbefogó kísérletet különböző Pl kiónok felhasználásával végeztük el. Az exonbefogási termékeket azután PCR-rel amplifikáltuk, szelektáltuk és szekvenáltuk. A feltételezett „exonok” szekvenciáit összehasonlítottuk a GenBankból származókkal Blast számítógépes program alkalmazásával. Körülbelül 15 exont választottunk ki további RT-PCR-rel, Northem-analízissel és zoo blottal megfelelő RNS vagy konzervatív szekvenciák jelenlétére történő vizsgálatokhoz. A 15 feltételezett exonból hétről, a 325-2, 323-8, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 és 2G7 jelűekről találtuk azt, hogy RNS-transzkriptumot kódolnak. A 325-2 egy here (testis) specifikus gén; a 323-8 és 323-9 jelű valószínűleg két ugyanabból - főleg az agyban és a vesében kifejeződő - génből származó exon. 1H3 és 322-5 két alacsony szintű agytranszkriptumot képvisel. D1-F7 egy előzőekben klónozott génből - inozin-monofoszfát dehidrogenáz (IMPDH) génből - származó exon, amely mindenütt előforduló expressziós mintával rendelkezik. Ezeknek a géneknek egyike sem tűnt OB-t kódolónak. 2G7-et, amely az OB exon, az alábbiakban tovább taglaljuk.
Az OB gén exonbefogásának három sikertelen erőfeszítése után egy másik próbálkozást végeztünk DNS összegyűjtésével minden Pl-bői, a kritikus OB régióból. Ebbe tartozó Pl-ek a következők voltak: 258., 259.,
322., 323., 324., 325., 498., 499., 500., 653., 654 és egyebek. Azután a 258., 260., 322., 498. és 499. Pl kiónokat szubklónoztuk az exonbefogó vektorba, és azt követően néhány lemezt készítettünk olyan bakteriális kiónokkal, amelyeknek mindegyike hordozott feltételezett exont. Körülbelül 192, vélhetően Önjelölteket reprezentáló kiónt kaptunk. A fentiekben említettek szerint, egységes mesterséges képződményt figyeltünk meg, sok izolátum két, a vektorból származó befogott exont tartalmazott. Tehát kiónokat azonosítottunk méretük szerint és azon tény alapján, hogy az ennek a mesterséges képződménynek megfelelő DNS-próbák hibridizáltak a megfelelő sávokkal a Southem-blot-gélen. Ezen az úton 192-ből 185 kiónt zártunk ki a további értékelésből. A mesterséges képződmények kizárása egyedül a méret alapján nem volt lehetséges, mivel ez végül 05-nek megfelelő exon kizárásához vezethetett volna.
Tehát a 192 exonból összesen 7 ex ont választottunk ki további tanulmányozásra. Templátokat készítettünk a hét exon szekvenálására, és elvégeztük a szekvenálást. A hét exonra kapott szekvenciákat analizáltuk, és azt találtuk, hogy hét azonos és egy nyilvánvalóan mesterséges képződmény. Egyedül az 1D12 tartalmazta a „HIV-szekvenciát”, azaz a mesterséges képződmény sávját. A következő három exon maradt további analízishez: IFI, 2G7 és 1H3. 1 FI -et elvetettük, mivel az a kritikus régión kívül esett. Mind az 1H3, mind a 2G7 számára PCR-primereket szelektáltunk és szintetizáltunk.
A 2G7 exon szekvenciáját meghatároztuk, és a
10. ábrán mutatjuk be (7. számú szekvencia). 2G7 számára PCR-primereket szelektáltunk és szintetizáltunk. A PCR-primereknek megfelelő szekvenciarészeket aláhúztuk. Az alkalmazott primerek a következők voltak: 5’ CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm=60,0 °C) (8. számú szekvencia)
3’ CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm=60,0°C) (9. számú szekvencia)
Ezek a primerek megsokszorozták a genomiális DNS-t a következő körülmények között: 25-30 ciklus 55 °C-on, annealing 2 percig, 72 °C-on meghosszabbítás 2 percig, 94 °C-on denaturálás 1 percig standard PCR pufferben. Ezeket a primereket használtuk jelzett próba létrehozására is, beleértve 32P-dCTP-t a PCR reakcióban a hideg dCTP mennyiségének megfelelő csökkentésével.
RT-PCR-t végeztünk különböző szöveti RNS-eken, és azt találtuk, hogy 2G7 a vizsgált szövetek közül kizárólag fehér zsírban fejeződött ki (11A. ábra). Ezután 32P-vel jelölt 2G7-et hibridizáltunk szöveti RNS-ek Northem-blotjaival (11B. ábra), és kimutattuk, hogy ennek RNS-e zsírszövetben magas szinten fejeződött ki, de minden egyéb szövetben vagy nem, vagy nagyon alacsony szinten fejeződött ki (ahol a szignálok a szövetpreparátumok zsírszennyeződésének eredményei lehetnek). A felsorolt szövetek mindegyike teljes RNSének 10 pg-ját elektroforézisnek vetettük alá formaldehidet tartalmazó agarózgélen. A próbát a blottal 65 °Con, standard hibridizációs pufferben hibridizáltuk, Rapid Hybe (Amersham). Az RNS mérete körülbelül
4,9 kb volt. Ennél a pontnál 2G7-et OB-xq nézve látható jelölt génnek tekintettük, és tovább analizáltuk.
D) Mutáció kimutatása
Annak megerősítése érdekében, hogy 2G7 kódolja az OB gént, szükséges volt e gén DNS-szekvenciája RNS-kifejeződésének szintjeiben levő eltérések bemutatása, mutáns és vad típusú állatokban összehasonlítva. Az ob gén két elkülönített mutációja állt rendelkezésre a vizsgálathoz, C57BL/6J ob/ob (1J) és Ckc/Smj ob/ob
HU 223 563 Bl (2J). Ezekre a továbbiakban 1 J-ként és 2J-ként hivatkozunk külön-külön. (A tanulmányozott egértörzsekre utalva informális nomenklatúrát alkalmazunk. A találmány leírása során és az ábrákon végig C57BL/6J megfelel C57BL/6J +/+; CKC/smj megfelel SM/Ckc+Dac. +/+·, CKC/smj ob/ob megfelel SM/Ckc-+Űacob2J/ob2J jelöléseknek). RNS-t preparáltunk ÍJ, 2J és kontrollállatokból izolált zsírszövetből. Minden egyes minta teljes RNS-ét DN-ázzal kezeltük és azután reverz transzkripciónak vetettük alá oligo-dT primer és reverz transzkriptáz alkalmazásával. Az eredményül kapott egyszálú cDNS-t azután PCR-rel amplifikáltuk vagy a 2G7 primerekkel (a körülményeket fent mutatjuk) az alsó szálhoz, vagy kereskedelemben kapható aktinprimerekkel a felső szálhoz. Az RT-PCR termékeket etídium-bromiddal festett, 1% agaróz-TBE-gélen fúttattuk (12A. ábra). RT-PCR alkalmazásával azt találtuk, hogy míg 2G7 mRNS az ÍJ és az összes többi kontrollállatban kifejeződött, teljesen hiányzott 2J egérből. Nem mutattunk ki jelet 30 ciklus amplifikálás után. Ez a kísérlet közvetlen bizonyítékát adta annak, hogy 2G7 megfelelt az OB génből származó exonnak.
Mivel a 2J mutáció viszonylag új keletű és koizogén törzsként tartjuk fenn, ez az eredmény volt az első elérhető bizonyíték, amely jelezte, hogy 2G7 az OB génből való exon. A mutáció valószínűleg a promoterrégióban helyezkedik el, amely az mRNS-szintézis teljes megszakításához vezet. Szignál jelenléte 1J egérben ebben az RT-PCR kísérletben azt sugallta, hogy ÍJ olyan pontmutációt hordozhat, amely nem eredményez nagy változást az RNS-minta méretében. Ezenfelül 2G7 mRNS további négy 2J állatból hiányzott, amikor RT-PCR-rel teszteltük.
Ezt az eredményt Northem-blottal erősítettük meg (12B. ábra). A törzsek mindegyikéből (C57BL/6J, CKC/smj és 2J) zsírsejt-RNS-t preparáltunk. Ezen RNS-ek 10 pg-ját futtattuk és blotot végeztünk. A blotot PCR-rel jelölt - az anyag amplifikálásával, azaz all. ábrán levő sávval, 32P-dCTP-t alkalmazva a PCR reakcióban - 2G7 próbával teszteltük. Aktin képezte a feltöltött RNS-mennyiség kontrollját. Az aktinszignál a minták mindegyikében majdnem hasonló. Az OB szignál hiányzik az agyból, mivel az mRNS zsírsejtekre specifikus.
A Northem-analízis eredményei megerősítik, hogy 2G7 specifikus RNS hiányzik 2J egerekből. Az ob RNS hiányzik CKC/smj ob/ob egerekből, mivel ebben az elhízott mutáns törzsben a gén szétszakadt, úgy hogy RNS nem termelődött. Ezenfelül a 2G7 RNSszintje U-ben körülbelül 10-20-szorosára növekedett ugyanúgy, mint a db/db zsír. Ezek az eredmények összeférnek azzal a hipotézissel, hogy OB vagy keringő hormont kódol, vagy a zsírsejtekből jövő, testtömeget moduláló szignál létrehozásáért felelős. Ezek az eredmények alátámasztották azt a következtetést, hogy 2G7 az OB gén, és előre jelezték, hogy ÍJ egerek pontmutációval, esetleg érés előtti transzlációs terminációhoz vezető nonszenz mutációval rendelkeznek.
Ezeket a Northem-analízis-eredményeket megismételtük négy különböző 2J állatból származó zsírsejt-RNS-készítmény felhasználásával (13. ábra). Ebben az assay-ben ap2 zsírspecifikus transzkriptum, amelyet kontrollként használtunk körülbelül ugyanúgy, mint aktint a 12B. ábrán. Nincs szignifikancia az ap2 sávok különböző denzitásai között. ap2-t megjelöltük PCR-primereket tervezve a közzétett ap2 szekvenciából. A zsírsejt-RNS-ek RT-PCR termékeit azután újra megjelöltük, ugyanazt a PCR jelölésre szolgáló eljárást alkalmazva. Ez az analízis mutatja OB mRNS jelenlétét normál homozigóta vagy heterozigóta állatokban, és hiányát 2J mutáns állatokban.
A mutációt azonosítottuk ÍJ egerekben. A mutáció egy C—>T báziscsere, amely arginint egy látszólagos, érés előtti stopkodonra cserél a 108. helyzetű aminosavnál, és minden látszat az ÍJ mutációt indokolja (14. ábra) az ob mRNS magas szintű kifejeződése ellenére (lásd a 12. és 13. ábrákat, C57BL/6J ob/ob vonalakat).
Még újabban, Southem-blotot alkalmaztunk annak a következtetésnek a levonásához, hogy a 2J mutáció az OB 5’ végén bekövetkezett kimutatható DNSváltozásnak az eredménye, amely úgy tűnik, teljesen megszünteti az RNS kifejeződését. E lehetséges átrendeződés pontos természetének a felderítése még várat magára.
A CKC/smj (SM/Ckc-+Doc) és C57BL/6J egerekből származó DNS genomiális Southem-blotját végeztük el négy különböző restrikciós endonukleáz felhasználásával annak kiderítésére, vajon a mutáns ob egyedi fragmentum mintázatot eredményez-e (15A. ábra). Körülbelül 10 pg DNS-t (máj, vese vagy lép genomiális DNS-éből származót) emésztettünk a jelzett restrikciós enzimekkel. A DNS-t ezután 1%-os agaróz-TBE-gélben elektroforézisnek vetettük alá. A DNS-t immobilonmembránra vittük át, és a PCR-rel jelölt 2G7 próbával hibridizáltuk. A kulcssáv a CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+Dac-ob2J/ob2J) DNS Bglll emésztéséből származó legfelső sáv. Ez a sáv nagyobb molekulatömeggel rendelkezik, mint a többi törzsben levők, jelezve a mutációt ebben a törzsben.
A 15B. ábra egy ob2J!+x. ob2J! keresztezés utódaiból származó genomiális DNS Bglll emésztésének Southem-blotját mutatja. Néhány DNS csak felső sávval rendelkezik, néhány csak alsó sávval és néhány tartalmazza mindkét sávot. A csak felső sávval rendelkező állatok alloelhízottak, azaz ob2J/ob2J típusúak. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a 15A. ábrán bemutatott polimorfizmus (azaz mutáció) genetikai értelemben szegregálódik.
1. példa: cDNS-klónozás és OB szekvencia meghatározása
A megjelölt 2G7 próba alkalmazásával összesen 50, rágcsálózsírsejt Lgtl 1 cDNS-könyvtárból (Clonetech 5’-STRETCH cDNS Swiss egerek -- ML3005b - tesztikuláris zsírpárnáiból) származó egér-cDNS-klónt, és 30 kereszthibridizáló, humán zsírsejt XgtlO cDNSkönyvtárból (Clonetech 5’-STRETCH cDNS HL1108a - hasból) származó humán cDNS-klónt izoláltunk. Könyvtárscreenelést végeztünk a plakkliftelj árast alkalmazva. A plakkliftből származó szűrőket autoklávmódszerrel denaturáltuk. A szűrőket két példányban hib39
HU 223 563 Β1 ridizáltuk a PCR-rel jelölt 2G7 próbával (Rapid Hybe puffer, egy éjszakán át 65 °C-on). 2-4 órás előhibridizáció után a szűrőket 2 χ SSC, 2% SDS-ben kétszer 30 percig 65 °C-on mostuk, és röntgenfilmnek tettük ki azokat. A kétszeres pozitívakat plakktisztítással tisztítottuk meg. Plakktisztított fágot PCR-rel megsokszoroztunk kereskedelemben kapható vektorprimerek, például XgtlO és Xgtll felhasználásával. Az eredményül kapott PCR termékek minden fágra megfeleltek a cDNS-inszertumnak, mindkét végen kismennyiségű vektorszekvenciával. A sávokat géltisztításnak vetettük alá, és szekvenáltuk ABI automata szekvenáló és a DNS-polimeráz-próbához való vektorprimerek felhasználásával.
A nyers szekvenálási adatokat azután manuálisan megvizsgáltuk bázisról bázisra a számítógépes program félreértéseinek kijavítása céljából. Amint hozzáférhetővé vált a helyes szekvencia, a megszintetizáltuk a downstream primereket, és felhasználtuk azokat a szekvenálás folytatására. Ilyen kísérleteket ismételtünk addig, amíg minden elérhető cDNS-klónt megszekvenáltunk és összefüggő résszé szintetizáltunk. Eddig körülbelül 3000 bázispárt állítottunk össze az mRNS 5’ végéről. A cDNSklónok egyike kiterjedt az mRNS 5’ végéig, mivel szekvenciája azonos volt a zsírszövet-RNS 5’ RACE termékének szekvenciájával (nem mutatunk adatokat).
A szekvenciaadatok feltárták, hogy 167 aminosavból álló nyílt leolvasási keret van (1. ábra). Kozák transzlációs iniciációs konszenzusszekvencia volt jelen adenozinmaradékkal három bázis távolságra az ATGtől upstream. cDNS két osztályát találtuk, amelyek abban különböznek, hogy tartalmaznak vagy nem egy egyedüli glutaminkodont. Ez a maradék a 2G7 exon splice akceptorához közvetlenül 3’ helyzetben található. Mivel a glutamin CAG kodonja magában foglal egy lehetséges AG splice akceptor szekvenciát, úgy tűnik, hogy a splice akceptor helyen csúszás van látszólagos 3 bázispár delécióval a cDNS subsetjében, ahogyan azt az alábbiakban megmutatjuk.
gin ser val ag CAG TCG GTA (glutaminnal) f (17. számú szekvencia) (splice akceptor hely) ser val ag CAG TCG GTA (glutamin nélkül)
T (splice akceptor hely)
Az „ag” a fenti szekvenciában megfelel a feltételezett intronszekvenciának a glutaminkodontól upstream, és AG a vélt alternatív splice hely. Ez a glutaminmaradék a molekulának nagyon konzervatív régiójában helyezkedik el, és fontossága a biológiai aktivitásban még ismeretlen.
Feltételezett N-terminális szignálszekvenciát mutattunk ki, amelynek a szignálhasítási helyét karboxiterminális alaninmaradéknak jósoljuk a 21. helyzetben. Ezt a feltételezett szignálszekvenciát megerősítettük a Heijne-féle módszerre alkalmazott számítógépes algoritmussal. E technika alkalmazásával a legvalószínűbb szignálszekvenciát azonosítottuk a polipeptid kódolórégiójában, az 1-23. aminosavaknak megfelelően, melynek szekvenciája:
MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA T VP (10. számú szekvencia) ahol a nyíl a feltételezett szignálszekvencia-hasítási helyet jelöli. Az aminosavszekvencia maradéka nagymértékben hidrofil volt, és nem rendelkezett az Nterminális szignálszekvenciától eltérő, említésre méltó szerkezeti motívummal vagy membránáthidaló doménekkel. Az előre jelzett elkészült fehéqében nem találtunk kimondottan konszenzusszekvenciákat Nkapcsolt glikozilezéshez vagy fehérjehasítást jelző kétbázisú aminosavszekvenciákat (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, p. 177-223, C. V. Seriver et al., eds., McGraw-Hill, New York). Az adatokon alapuló kutatás Blast és Block programok alkalmazásával nem azonosított homológ szekvenciákat.
Humán zsírszövet-RNS-t analizáltunk Northemblottal, az egér ob génhez hasonló méretű RNS-fajtákat mutattunk ki. cDNS-klónok szekvenálása és analízise azt bizonyította, hogy humán OB szintén 167 aminosavból álló polipeptidet kódol (2A., 2B. és 3. ábra). Emberben is cDNS két osztályát - három bázispár delécióval vagy anélkül - találtuk (6. ábra). Az egér és humán OB gének erősen homológok az előre jelzett kódolórégióban, de csak 30%-os a homológia a hozzáférhető 3’ és 5’ nem transziáit régiókban. N-terminális szignálszekvencia a humán OB polipeptidben is jelen volt. A humán és az egér OB polipeptid összehasonlítása azt mutatta, hogy a két molekula aminosavszintjében mindösszesen 83% azonosság van (4. ábra). A két faj érett fehérjéinek N-terminálisai még magasabb homológiát mutatnak, az N-terminális 100 aminosavmaradék között csak hat konzervatív és három nem konzervatív aminosavszubsztitúcióval.
Genomiális DNS-t izoláltunk egérből, patkányból, nyúlból, mezei egérből, macskából, tehénből, birkából, sertésből, emberből, csirkéből, angolnából és Drosophilából, és restrikciósán emésztettük £coRI-gyel. Az emésztési termékeket elektroforézisnek vetettük alá 1%-os agaróz-TBE-gélen. A DNS-t azután immobilonmembránra vittük át, és PCR-rel jelölt 2G7 próbával teszteltük. A szűrőt 65 °C-on hibridizáltuk, és 2xSSC, 0,2% SDS-ben 65 °C-on kétszer 20 percig mostuk, azaz két puffercsere volt. Ezek az adatok azt jelzik, hogy OB konzervatív a gerincesek körében (16. ábra). Ebben a vonatkozásban megjegyezzük, hogy az angolna DNS-ében 2+ szignál van; az angolna egy hal.
Összefoglalva, elérhető bizonyítékok azt sugallják, hogy a testtömeg és a kövérség fiziológiai kontroll alatt áll. Hét évvel ezelőtt kezdődtek erőfeszítések e rendszer két kulcsvegyületének, az OB és DB géneknek az azonosítására. Az ebben a példában bemutatottak szerint az OB gént most azonosítottuk, mint zsírspecifikus gént, amely kulcsszerepet játszik a testtömeg szabályozásában. Ennek a génnek a terméke - amely legvalószínűbben egy kiválasztott hormon - fontos alkalmazásokat nyer majd a táplálkozási rendellenességek diagnózisában és kezelésében emberben és állatokban.
2. példa: OB kifejezése baktériumokban
OB-t kódoló mind rágcsáló-, mind humán cDNS-t klónoztunk pET-15b expressziós vektorba (Novagen).
HU 223 563 Bl
Ez a vektor T7 promotert tartalmaz lac operátorral összekapcsolva, és hisztidintoldalékot (His-tag) és trombin hasítási helyet - a kódolószekvencia inszerciós helyétől közvetlenül upstream - tartalmazó fúziós fehérjét fejez ki (17. ábra) (11. és 12. számú szekvenciavázlatok).
Az egér- és humán cDNS-eket úgy módosítottuk, hogy a szignálszekvencia végén levő alanint Ndel hellyé változtattuk, így egy szeparált szekvencia lett a 3’ régióban. Az Ndel hely inszercióját PCR alkalmazásával, új primerekkel végeztük:
Mnde-5’ (rágcsáló-5’ primer):
CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (13. számú szekvencia)
Mnde-3’ (rágcsáló-3’ primer):
TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (14. számú szekvencia)
Hnde-5’(humán-5’ primer):
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (15. számú szekvencia)
Hnde-3’ (humán-3’ primer):
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (16. számú szekvencia)
A primerek középen 6 bázispár mismatch-ot (hibás párosodási) tartalmaznak, amely Ndel restrikciós helyeket visz be a PCR fragmentum mindegyik végére. Az egér- vagy humán cDNS-t hordozó fágokat amplifíkáltunk PCR-rel ezen primerek alkalmazásával. A PCR terméket Adel-gyel emésztettük, és géltisztításnak vetettük alá 1%-os, alacsony olvadáspontú agarózgélen. A géltisztított sávokat a pET vektorba szubklónoztuk. Az eredményül kapott plazmidokat szekvenáltuk, hogy megbizonyosodjunk, mutációk nem kerültek be a klónozás PCR amplifikációs lépésében. Olyan humán és rágcsáló-cDNSszerkezeteket készítettünk, amelyek kódolják és amelyekből hiányzik a 49. helyzetű glutamin. Különösen, vagy a humán vagy az egér OB kódolószekvenciát, mínusz szignálszekvenciát tartalmazó és His-toldalékkal fuzionált pET-15b szerkezeteket készítettünk PCR klónozómódszer alkalmazásával. A szerkezeteket szekvenáltuk, hogy megbizonyosodjunk, szekvenciahibák nem kerültek be az OB gén kódolórégiójába a PCR amplifikációs lépésben.
Két eredményezett plazmidszerkezetet, pETM9-et és pETH14-et választottunk ki baktérium-expressziósgazdaszervezet transzformálására. 1 mM IPTG-vel optimális körülmények között történő indukcióval a transzformált baktériumok 100-300 pg/ml fúziós OB termelésére voltak képesek. Az OB fúziós fehérje fő részét a zárványtestekben találtuk. 6M guanidin-hidro5 kloriddal vagy karbamiddal történő oldhatóvá tétel után a fúziós fehérjét His-kötő (Ni-kelát) gyantát tartalmazó oszlopon tisztítottuk. Az OB fúziós fehérje oszlopon történő tisztításának körülményeit (beleértve kötődést, mosást és eluálást) kísérletesen határoztuk meg. Az OB fúziós fehérje hozzákötődik a gyantához 5 mM imidazol/6M guanidin-HCl mellett, és 20 mM imidazol/6M guanidin-HCl koncentrációig kötve marad. A fehérje eluálható a gyantáról 60 mM imidazol/6M guanidin-HCl mellett (18A. és 18B. ábrák).
A tisztított humán és egér OB fúziós fehérjét egyaránt tovább dializáltuk PBS-ben a guanidin-HCl eltávolítására a preparátumból, azután poliklonális antitestek termeltetésére használtuk föl.
A fúziós fehérjetermékek biológiai aktivitásának vizsgálata céljából a tisztított fehérje számára újrahajtogatási körülményeket teszteltünk és fejlesztettünk. Ez magában foglalta a fúziós fehérje kezdeti dialízisét 1 M guanidinoldatban, amelyet 0,4 M argininoldattal történő hígítás követett. A His-toldalékot eltávolítottuk a fu25 ziós fehérjéről mielőtt meghatároztuk a biológiai funkciót. A toldalék eltávolítását a fúziós fehérjének humán méhlepényből származó trombinnal történő kezelésével értük el.
Ezenkívül humán és egér OB gén kódolószekven30 ciákat mínusz a szignálszekvenciát, egyenként mindegyiket, pET-12c vektorba inszertáltuk PCR klónozómódszer alkalmazásával. Ezek a szerkezetek irányítani tudják a szintetizált OB fúziós fehérjéket a baktériumgazdasejt periplazmás terébe. A periplazmás térből ki35 nyert OB fúziós fehérjének már csak egy egyszerű gélszűrésre lehet szüksége, hogy megtisztítsuk egyéb gazdaszervezet-fehéijéktól, és ne denaturálódjon az eljárás során.
3. példa: Az OBpolipeptiddel szembeni antitestek készítése
A rekombináns fehérjének poliklonális antitestek termeltetésére történő felhasználásán felül, a levezetett rágcsáló OB szekvenciából négy peptidszekvencia együttesét azonosítottuk immunogenitás plot szoftver alkalmazásával (GCG Package). A négy karboxiterminális peptidfragmentum a következő:
(18. számú szekvencia):
Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (19. számú szekvencia):
Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (20. számú szekvencia):
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (21. számú szekvencia):
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys
Ezeket a peptideket konjugáltuk KLH-hoz és a peptid-KLH konjugátumokat használtuk föl nyulak immunizálására standard technikákat alkalmazva. Minden 60 egyes pepiidre specifikus poliklonális antiszérumokat nyertünk a nyulakból.
HU 223 563 Bl
4. példa: OB polipeptid in vitro transzlokációja
Annak érdekében, hogy megerősítsük funkcionális szignálszekvencia jelenlétét, a teljes nyílt leolvasási keretet tartalmazó humán cDNS-t a pGEM vektorba szubklónoztuk. Ebben a kísérletben csak a humán cDNS-t használtuk föl, mivel nem nyertünk ki használható egérszubklónokat. Humán ob RNS pozitív szálat írtunk át Sp6 polimeráz alkalmazásával, és felhasználtuk azt in vitro transzlációs reakcióban kutyapankreász-mikroszómásmembránokkal és anélkül. Az elsődleges transzlációs termék körülbelül 18 kD látszólagos molekulatömeggel vándorolt, amely megegyezik azzal, amelyet a cDNS-szekvenciával előre jeleztünk. A mikroszómás membránok kizárása a reakcióból körülbelül 5-szörösen gátolta a transzláció átfogó hatékonyságát. Mindazonáltal a membránkészítmény jelenlétében az OB elsődleges terméknek körülbelül 50-70%-a csonkolt volt körülbelül 2 kD-nal, azt sugallva, hogy a szignálszekvencia működőképes (19A. ábra). Az interleukin- laRNS elsődleges transzlációs termékének - amely nem kódol szignálszekvenciát - mérete változatlan maradt amikor mikroszómás membránok voltak a reakcióban. Annak megerősítése érdekében, hogy az OB fehérje transzlokációja megtörtént, az in vitro transzlációs termékeket Proteinase-K-val kezeltük. A proteázos kezelés a 18 kD elsődleges transzlációs termék teljes proteolízisét eredményezte, míg a 16 kD elkészült formát nem befolyásolta az enzimes kezelés jelezve, hogy annak transzlokációja a mikroszómák lumenébe megtörtént (19B. ábra). Ezek az adatok összeegyeztethetők azzal a hipotézissel, hogy OB kiválasztott molekula.
A szignálszekvencia lehasadása után két ciszteinmaradék marad az előre jelzett fehérjén belül, emelve annak lehetőségét, hogy a molekula egyéb kiválasztott polipeptidek diszulfidkötést tartalmazó sajátságával rendelkezik [Shen et al., Science 224, 168-171 (1984)].
5. példa: Az OB gén jellemzése
Emberben az elhízottság és az OB génben bekövetkező genetikai változások közötti összefüggés megállapítására, meghatároztuk a humán OB gén szekvenciáját (20A-C. ábra) (22. és 24. számú szekvenciavázlatok). A humán kódolószekvenciából származó specifikus primereket alkalmaztunk humán P1 könyvtár screenelésére. Három különböző Pl kiónt kaptunk, elszaporítottuk és PCR-rel amplifikáltuk az első és második kódolóexon közötti splicing helyet szegélyező primerek felhasználásával. A teljes intronrégiót - körülbelül 2 kb - amplifikáltuk és részlegesen szekvenáltuk (20A. ábra; és ahogyan jeleztük, 22. és 24. számú szekvenciavázlatok).
A rágcsáló- és a humán gének szerkezetét egyaránt jellemeztük PCR assay-k és egyéb standard technikák alkalmazásával. Az egér OB génnél azt találtuk, hogy három exont tartalmaz, amelyek közül a második és a harmadik számít a kódolószekvenciának (20D. ábra). A humán OB gén kódolórégiója ugyanezen a szerkezeten osztozik; a humán génből azonban hiányzik az 5’ exon és intron (20E. ábra).
A humán gén intronszekvenciáiból létrehozott primerekből két készletet készítettünk (20A-C. ábrák).
A primerek szekvenciái a következők (F előre mutatót (forward) és R visszafelé mutatót (reverse) jelent): HOB lgF 5’-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3’ (29. számú szekvencia)
HOB IgR 5’-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3’ (30. számú szekvencia)
HOB 2gF 5’-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3’ (31. számú szekvencia)
HOB 2gR 5’-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3’ (32. számú szekvencia)
DNS-mintákat nyertünk ki különböző forrásokból, és ezeket a primer készleteket alkalmaztuk súlyosan elhízott emberek genomiális DNS-ének amplifikálására. A PCR termékeket alacsony olvadáspontú agarózgélen futtattuk, a sávokat kivágtuk és agarázzal emésztettük. A szekvenciákat az ABI 373A DNS-szekvenáló és Taq dedezoxi terminációs kit (ABI, Perkin-Elmer) alkalmazásával kaptuk meg. Betegmintából származó ob génben eddig egy pontmutációt mutattunk ki. Ez a mutáció az első exonban van, és nem változtatja meg az aminosavszekvenciát. Korábbi adatok azt jelzik, hogy inszerciós szekvencia lehet jelen egy másik beteg első exonjában. Egy eltérő szekvenálási módszer - amely Taq DNS polimeráz helyett Sequenase-t használ - alkalmazható sokkal könnyebben leolvasható szekvenciák nyerésére, mutációk kimutatására.
6. példa: OB kifejezése élesztőben
Az OB helyzeti klónozását követően fontossá vált annak a fiziológiai mechanizmusnak a feltárása, amellyel az OB fehérje az élelmiszer-felvételt és a testtömeget csökkenti. Ebben az irányban az első lépés funkcionális fehérjerekombináns előállítása volt expressziós rendszer felhasználásával. A sikeres bakteriális expressziós rendszeren felül élesztő-expressziósrendszert is szelektáltunk. Élesztőben történő kifejezés számos vonzó jellegzetességgel rendelkezik OB kifejezésére. A legfontosabb az, hogy biológiailag aktív eukariótafehérjék megfelelőbben termelődnek. Az OB polipeptidet emlőssejtek választják ki. A fehérjekiválasztás minden eukariótában nagyon hasonló, amely azt jelenti, hogy az élesztő szekréciós apparátusa sokkal jobban hasonlít az emlős kiválasztási útvonalára, mint amennyire a bakteriális szekréció hasonlíthat. Különösen az emlőssejtekben látható OB fehérjemódosulások megfigyelhetők az élesztő-szekréciósrendszeren keresztül történő kifejeződésnél is. Ezenfelül a fehérje hajtogatása a szekréciós apparátuson történő áthaladáskor történik meg, és ilyenformán «6-nek az élesztő szekréciós apparátusán keresztül történő szállítódása során valószínűleg megfelelően hajtogatott, natív biológiai aktivitással rendelkező fehérjét kapunk. Ez lényeges az OB szempontjából, mivel a két ciszteinmaradék diszulfidhidat képezhet. A szekréciós útvonalakkal ellentétben a sejt citoplazmájának redukálókömyezete megakadályozza diszulfídhidak képződését; és ilyenformán a diszulfidkötés in vivő kialakulásához elengedhetetlenül szükséges OB áthaladása a szekréciós útvonalon. Egyéb előnyöket jelent az élesztő könnyű és gyors manipulálhatósága, vektorok és törzsek hozzá42
HU 223 563 Β1 férhetősége és az óriási tapasztalat az élesztő-rekombinánstechnológiában.
Pichia pastoris expressziós rendszert választottunk négy oknál fogva: 1. magasabb szintű heterológ fehérjekifejeződést eredményez, mint más élesztőrendszerek, úgymint S. cerevisiae; 2. a fehérje glikozilezése sokkal jobban hasonlít az emlősrendszerhez P. pastorisban, mint 5. cerevisiae-ben (jóllehet a glikozilezési helyeket nem mutattuk ki oú-ben számítógépes keresés alkalmazásával, még megmaradt a fel nem ismert helyeken történő glikozilezés lehetősége); 3. P. pastoris természetes körülmények között nagyon kevés fehérjét választ ki, tehát a kifejezett idegen fehérje általában egyenesen tisztítható; és 4. a vektorok és élesztőtörzsek kereskedelemben hozzáférhetők (az Invitrogentől). Élesztő-expressziósvektorok létrehozására két stratégiát mutatunk be a 21. és 22. ábrákon.
A választott vektor pPIC.9. Ez a vektor klónozóhelyet tartalmaz az α-párosítófaktor pre-pro kódolószekvenciájától downstream, amely a klónozóhelyre klónozott gén által kódolt, kiválasztandó fehérjét a szekréciós útvonalra irányítja. A vektor másik fontos jellemzője a HISA gén, amely az élesztőnek a vektorral történt transzformációját követően szelekciót tesz lehetővé a vektor felvételére, hisztidinhiányos táptalajon elszaporított, auxotróf élesztőtörzset használva. A klónozóstratégia a következő volt: OB cDNS PCR amplifikációja olyan 5’ primerrel, amely a 3’ végén az előre jelzett vezetőpeptid hasítási helyet éppen követő, Oő-vel komplementer szekvenciát tartalmaz, és legnagyobb 5’ végén a vektor α-párosítófaktor szekvenciájának 3’ végével komplementer szekvenciát tartalmaz. Az 5’ primer Xhoí helyet is tartalmaz. A 3’ prímért úgy terveztük meg, hogy 3’ végén az OB utolsó néhány aminosavjával komplementer szekvenciát és 5’ végén egy £coRI helyet tartalmazzon. PCR amplifikációt követően a PCR terméket ATioI-gyel és EcoRI-gyel emésztettük és hasonlóan emésztett pPIC.9-be klónoztuk. Az egér és a humán OB cDNS mindegyik 49. helyzetű glutaminnal és anélkül - klónozását követően mind a négy szerkezetre egyedi kiónokat izoláltunk, és szekvenáltuk azokat annak igazolására, hogy a szerkezetek helyes orientációban és keretben kiónozottak, és nem tartalmaztak a PCR amplifikációs lépésből eredő mutációkat. A kiónoknak a helyes szekvenciával való azonosítását követően P. pastoris GS115 hisztidin auxotróf törzsbe transzformáltuk azokat.
A két egér OB szerkezettel transzformált élesztőkiónokat fehérjekifejeződésre screeneltük. Annak bizonyítására, hogy a transzformált élesztő OB-t tartalmaz, DNS dót biot assay-t és kolóniahibridizációs assay-t végeztünk, amelyek közül mindkettő OB szekvenciát mutatott a transzformált élesztőben, a nem transzformált élesztőben azonban nem. Továbbá, a transzformált élesztő kiválasztott egy 16 kD fehérjét a tápoldatba, míg a nem transzformált élesztő nem választott ki ilyen méretű fehérjét (23 A. ábra). Ez az OB előre jelzett mérete. Mindkét egérszerkezetre nézve olyan egyedi kiónokat azonosítottunk, amelyek az OB magas szintű kifejezői, és jelenleg tisztítási stratégia kifejlesztése folyik az ob homogénné történő megtisztítására. Az egyik stratégia az O/?-nek kationcserélő oszlopon történő tisztítására irányul (23B. ábra); előzetes adatok azt sugallják, hogy erős kationcserélő hasznos lehet. A kationcserélő kromatográfia után azonban elvész a feltételezett ob termék. Ez a mintában proteáz jelenlétét jelzi.
Felülkerekedni ezen a problémán egy stratégia obHis-toldalék fúzió előkészítése élesztőben történő kifejezésre (22. ábra). További értékelés megmutatta, hogy His-toldalék nélküli OB szorosan kötődik Ni-kelátoszlophoz. Az OB polipeptid tisztítása Ni-kelációval, amelyet gélszűrés követett, tömegspektrometriás analízishez kielégítően tiszta terméket eredményezett. Tömegspektrometria megerősíti a kifejezett fehérjének a várt molekulatömeggel azonos molekulatömegét, amely komolyan megerősíti, hogy OB sikeresen kifejeződött Pichiában.
A Ni-keláció/gélszűrés tisztítási eljárás azonban nem eredményez kielégítően tiszta formában levő OB polipeptidet. További kis molekulák vannak jelen. Úgy tűnik, hogy a proteolitikus aktivitás a Ni-kelátoszlopról az üres térfogatba eluál. Ezek szerint háromlépéses tisztítási folyamatot tervezünk: Ni-keláció, amelyet kationcsere követ (amely eltünteti a kis molekulájú szennyezőket), amelyet gélszűrés követ.
A kifejeződési szint becslése az SDS-PAGE gélek Coomassie blue festésével körülbelül 10 mg/1 mennyiséget mutatott ki az élesztőt rázott lombikban szaporítva. Ezeket a szinteket várakozásunk szerint növeljük fermentációs berendezésekben, és azzal a reménnyel kezdeményezünk fermentációt, hogy a fehérjének nagyobb mennyiségeit kapjuk. A humán OB szerkezetekre vonatkozóan az OB gén nagyszámú másolatát tartalmazó transzformált élesztőkiónokat azonosítottunk, és ezektől az OB fehérje kifejeződését várjuk. Amint antitesteket fejlesztünk, ezeket felhasználjuk a kiválasztott 16 kD fehérje azonosságának megerősítésére.
7. példa: OB fúziós pepiid magas szintű kifejeződése baktériumokban Fagyasztott törzsoldatok készítése:
Sterilezett, szénforrás nélküli M9ZB tápoldat mindkét 4 ml-es részletéhez 40 μΐ dextróztörzsoldatot (0,4 g/ml, szűréssel sterilezve), 10 μΐ ampicillintörzsoldatot (200 mg/ml) és 5 μΐ klóramfenikol-törzsoldatot (34 mg/ml etanolban) adtunk. Ennek beoltására Novagen pET-14b vektorban egér és humán OB DNSsel klónozott E. coli egyedi kolóniát használtunk. A csöveket 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk.
Az egyéjszakás tenyészetek 0,5 ml-ét használtuk föl 50 ml, dextrózt, ampicillint és klóramfenikolt tartalmazó M9ZB tápoldatok beoltásához. Ezeket 30 °C-on inkubáltuk, és az abszorbanciát 600 nm-en (A600) periodikusan nyomon követtük. Körülbelül 1-1,2 A600 értéknél a tenyészet 175 μΐ-es részleteit 25 μΐ 60%-os glicerinnel kevertük össze 2 ml-es Eppendorf-csövekben, hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és -80 °C-on tároltuk.
Tenyésztés:
0,5 ml 40%-os dextrózt, 125 μΐ ampicillin-törzsoldatot és 50 μΐ klóramfenikol-törzsoldatot tartalmazó,
HU 223 563 Bl ml M9ZB tápoldatot oltottunk be 1 ml fagyasztott törzzsel és 30 °C-on inkubáltuk. 1-1,2 A600 értéknél ennek a tenyészetnek 10 ml-ét használtuk négy - dextrózt, ampicillint és klóramfenikolt tartalmazó M9ZB tápoldat 500 ml-ét tartalmazó - 2 literes lombik mindegyikének beoltásához. Ezeket 30 °C-on addig inkubáltuk, amíg körülbelül 1-1,2 A600 értéket indukáltunk 0,5 ml IPTG végső koncentrációval. A tenyészeteket egy éjszakán át inkubáltuk. A sejteket 4000 rpm mellett 20 percig tartó centrifugálással nyertük ki. Ez az expressziós rendszer rekombináns OB polipeptidet eredményezett a teljes fehérje meglehetősen magas százalékában; g/1 E. coli nagyságrendben.
Sejtlízis és zárványtestek újraszuszpendálása:
Sejtmasszát újraszuszpendáltunk 20 mM HEPES, pH 7,2, 10% glicerin, 0,1 M KC1, 5 mM MgCl2, 1% aprotinin, 1 mM PMSF, 5 pg/ml leupeptin és 50 pg/ml DNáz I keverékének minimális térfogatában. A szuszpenziót háromszor fagyasztottuk-olvasztottuk folyékony nitrogént és langyos vizet használva. A lizált sejteket 18 000 rpm mellett 30 percig centrifugáltuk, és 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl keverékében újraszuszpendáltuk. A szuszpenziót szonifikáltuk és Triton XlOO-at adtunk hozzá 2% végső koncentrációig. Ezt centrifugáltuk 18 000 rpm mellett 15 percig. Két ilyen ciklus után három ciklus Triton-mentes mosást adtunk. Végül a pelletet szonifikálással feloldottuk 6 M guanidin-hidroklorid, 20 mM HEPES, pH 7,5 keverékében, amelyet centrifugálás követett. A felülúszót további tisztításhoz használtuk föl.
Az OB fehérjét a nem hajtogatott állapotban, rögzített fémion-affínitáskromatográfíával (immobilized metál ion affinity chromatography=IMAC) tisztítottuk. Az oldatot 40 ml-es, 5 oszlop térfogat 50 mM NiSO4-tal feltöltött, és 6 M guanidin-hidroklorid, 20 mM HEPES, pH 7,5 keverékében ekvilibrált Pharmacia kelátképző, gyors áramlású sepharose oszlopra vittük fel. Az oszlopot 6 M guanidin-hidroklorid, 30 mM imidazol, 20 mM HEPES, pH 7,5 keverékével mostuk. Végül a fehérjét 0,2 M imidazolt tartalmazó, ugyanazon pufferrel eluáltuk. A nem hajtogatott fehérjét - miután 10 mM-ig nátrium-acetátot (NaAc) adtunk hozzá és a pH-ját ecetsavval körülbelül 4,5-re állítottuk be - 6 M guanidin-hidrokloridban tároltuk 4 °C-on.
A fehérje újrahajtogatása és tisztítása:
100 mg fehérjét tartalmazó 6 M guanidin-hidroklorid-oldatot 67 pl 1 M ditiotreitollal (DTT) kezeltünk és hígítottuk körülbelül 67 ml-re 6 M guanidin-hidroklorid, 10 mM NaAc, pH 4,5 keverékével. Hagytuk szobahőmérsékleten keveredni körülbelül egy órán át. Ezután 20%-os glicerin, 2,5 mM CaCl2, 20 mM Tris, pH
8,4 puffer 41-jébe hígítottuk keverés közben. Megfelelő keveredés után az oldatot szobahőmérsékleten hagytuk körülbelül 8 órán keresztül, további keverés nélkül. Ezután tisztított marhatrombin (Thrombostatból, Parke-Davis-termék) 2000 egységét adtuk hozzá, és az oldatot gyengéd keveréssel magára hagytuk. 2,5 óra után újra adtunk 2000 egység trombint és folytattuk a hisztidintoldalék lehasítását még további 3 órán át. A trombinhasítást megakasztottuk PMSF 0,1 mM végső koncentrációban történő hozzáadásával. Az oldatot leszűrtük és 4 °C-on tároltuk.
A lehasított fehéqét tovább tisztítottuk 1 M KC1, 20% glicerin, 20 mM HEPES, pH 8,4 pufferrel ekvilibrált, ugyanazon IMAC oszlopon, mint fent. A fehéqeoldat feltöltése után ugyanazzal a pufferrel mostuk és a hasított fehérjét 1 M KC1, 20% glicerin, 40 mM imidazol, 20 mM HEPES, pH 8,4 keverékével eluáltuk. Nem hasított, fehérje 0,2 M imidazolnál eluált.
A tisztított, hasított fehérjét koncentráltuk, 50-100 mM EDTA, 10 mM kálium-ferricianid (nem teljes oxidáció teljessé tételére) keverékével kezeltük, és superdex 75 16/60 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá. Ezen eljárás alkalmazásával kapott hozamok megközelítették a kiindulási peptid 50%-át.
Amint megtisztítottuk, a kifejezett fehérjét jellemeztük néhány módszerrel. Fizikai jellemzés magában foglal dinamikus fényszórást a szerkezet homogenitásának meghatározására és alkalmazzuk a megfelelő hajtogatottság mérésére. Fényszórási adatok jelzik, hogy a humán OB polipeptid túlnyomórészt vagy kizárólag monomerként fejeződik ki, míg a rágcsáló OB polipeptid megtalálható dimer formában ugyanúgy, mint monomerként.
Ellman-féle reagenssel végzett assay-k és tömegspektroszkópiai analízis megerősítik, hogy a ciszteinmaradékok diszulfidkötést alkotnak a fehérjében. A polipeptidnek ezt az oxidált alakját adtuk be egereknek a lentebb leírtak szerint, és szemléltettük a biológiai aktivitást.
Cirkuláris dikroizmust alkalmaztunk a fehérje szerkezeti geometriájának durva meghatározására. A CDspektrum fiziológiás pufferben (pH közelítőleg 8, körülbelül fiziológiás ionerősség) azt jelzi, hogy a humán OB polipeptid körülbelül 60%-ban α-helikális szerkezettel és 40%-ban random orsószerkezettel rendelkezik. A rágcsáló OB polipeptidnél 50%-ban a-helikális szerkezetet és 50%-ban random orsószerkezetet találtunk CD-spektroszkópiával.
Korlátozott proteolízist - amelyet tömegspektrometria (Cohen et al., 1995, fent) követett - alkalmaztunk az OB polipeptid proteolízishez elérhető részeinek azonosítására. Ez az analízis kimutatta flexibilis loop (hurok) szerkezet jelenlétét az 54-60. aminosavmaradékok között (4. ábra). Valószínű, hogy ez a flexibilis loop a definiált másodlagos szerkezet, például a-hélix két doménjét köt össze.
Fontos volt, ahogyan azt a következő példákban megmutatjuk, a tisztított fehérje biológiai aktivitásának meghatározása; a fehérjét beadtuk mind sovány, mind elhízott rágcsálóknak egy ozmotikus pumpán keresztül (például ALZETT ozmotikus pumpa az Alza Corp.-től, Palo Alto, CA) vagy napi tablettaadagokban ip. legalább kéthetes perióduson keresztül, és megfigyeltük a táplálkozási viselkedésre és a testtömegre gyakorolt hatásokat.
8. példa: Az OB polipeptid (leptin) tömegcsökkentő hatásai
Az egér OB lókusz génterméke fontos szerepet játszik a testtömeg szabályozásában. A jelen példa megállapítja, hogy az OB fehérje az egér-, patkány- és hu44
HU 223 563 Bl mán plazmában kering. A keringő forma mind a három fajban azonos molekulatömeggel rendelkezik - SDSPAGE-vel meghatározva a levezetett, szignálszekvencia nélküli polipeptidszekvenciára - azt sugallva, hogy a fehérje in vivő nem változik a szignálszekvencia lehasadása után. Az OB fehérje nem volt jelen C57BL/6J ob/ob egerek plazmájában, és 10-szeresen magasabb koncentrációkban fordult elő db/db egerek plazmájában, és 20-szorosan magasabb szinten fa/fa patkányok plazmájában a kontrollokhoz viszonyítva. Feltételez- 10 zük, hogy ezek az elhízott mutáns állatok rezisztensek az OB hatásaira. Hat sovány humán alanyból álló csoporton belül az OB fehérje plazmaszintjeiben 7-szeres eltérések voltak. A rekombináns egér OB fehérje napi injekciói drámaian csökkentették ob/ob egerek testtö- 15 megét, szignifikáns hatásuk volt vad típusú egerek testtömegére, de db/db egerekre nem volt hatásuk. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az OB lókusz génterméke endokrin funkcióval bír a testtömeg szabályozásában.
Anyagok és módszerek
Nyulakat immunizáltunk rekombináns fehérjével Freund-féle adjuvánsban (HRP, Inc.). Immuntisztított antiegér OB antitesteket készítettünk antiszérumnak a rekombináns fehérjével konjugált sepharose 4B oszlo- 25 pon történő átvezetésével [Harlow et al., Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Egérplazmaimmunprecipitációt végeztünk a következők szerint:
0,5 ml, egérből, patkányból és emberből származó, kö- 30 rülbelül 2,5 mM EDTA-t tartalmazó plazmát előtisztítottunk nem konjugált sepharose 4B-vel szobahőmérsékleten, 2 órás rázatással. A sepharose-t pörgetéssel eltávolítottuk és 50 ml, 1 mg affintisztított antitest/ml csomagolt sepharose koncentrációjú antitestkonjugált sepharose 50%-os összefolyót adtunk hozzá. 0,5 ml 2xRIPA puffért adtunk végső kötődési körülmények beállítására a következők szerint: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Nadezoxikolát és 0,025% Na-azid. A reakciót egy éj- 40 szakán át végeztük 4 °C-on rázatással. Az antitest-konjugált sepharose együttest 8-szor mostuk RIPA-puffer felhasználásával, amelyet háromszori öblítés PBS-sel, és 15%-os SDS-PAGE-n történő futtatás követett.
A fehérjéket nitrocellulózra vittük át és Westem-blotot 45 végeztünk a rekombináns fehérjével szembeni, biotinezett immuntisztitott antitesttel. Az alkalmazott második antitest HRP-sztreptavidin volt, és ECL-t használtunk detektálásra.
Az OB mennyiségének meghatározására egérszérumban, az újrahajtogatott rekombináns egér OB fehérje növekvő mennyiségeit (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) adtuk 100 λ C57BL/6J ob/ob plazmához, és 3 óráig 5 4 °C-on inkubáltuk a protein A sepharose-zal konjugált antitesttel. Puffer A-val (10 mM nátrium-foszfát-puffer, pH 7,4; 100 mM NaCl; 1% Triton-X-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) történt erőteljes mosás után a mintákat mintapufferben újraszuszpendáltuk, felvittük 15%-os SDS-PAGE-re és azután nitrocellulózmembránra vittük át. Westem-blotot végeztünk immuntisztított, biotinezett antiaminoterminus antitest, mint első antitest és HRP-sztreptavidin, mint második antitest alkalmazásával, amelyet ECL detektálás követett.
Citoplazmaextraktumokat készítettünk zsírszövetnek NDS-pufferben (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0,15 mM spermin, 0,5 mM spermidin, 14 mM β-merkapto-etanol, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40) politronnal és dounce-szal 20 történő homogenizálásával, és a sejtmagok eltávolítását 700 g mellett történő centrifugálással végeztük.
Immunprecipitációkat végeztünk a fentiek szerint azzal az eltéréssel, hogy immuntisztított antihumán OB antitesteket használtunk. ELISA-hoz 1 mg/ml immuntisztított antihumán OB antitest 100 ml-ét oldottuk fel boráttal pufferolt PBS-oldatban, és egy éjszakára mikrotiter (Corning kát. szám. 2595.) lemezekre vittük fel 4 °C-on. A lemezeket azután 0,05% Tween 20-at tartalmazó Naborát-oldattal 4-szer mostuk, és a folyadék fölöslegét eltávolítottuk. A lemezeket szobahőmérsékleten 2 óráig tartó inkubációval, üregenként 240 ml, 0,3% zselatint tartalmazó Na-borát-pufferrel blokkoltuk, és utána mostuk és szárítottuk. Egyes üregekben vagy ismert mennyiségű újrahajtogatott humán OB fehéije vagy plazmamin35 ták 100 ml-ét inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. A lemezek mosása után 100 ml biotinezett, immuntisztított antihumán antitesttel (0,1 mg/ml zselatinos, borátpufferes oldatban) inkubáltuk 4 órán át szobahőmérsékleten. Mosás után torma-peroxidázhoz (HRP=horse radish peroxidase) kötött sztreptavidint (HRP-sztreptavidint) adtunk a lemezekhez (0,1 mg/ml borátpufferben, 0,3% zselatin). HRP-szubsztrát-oldatot (0,3 mg/ml ABTS és 0,01% hidrogén-peroxid citromsavban) használtunk azután detektáláshoz, és 414 nm-en mértük az OD-t az antitestkötődés kvantitatív meghatározása céljából.
Az egér és humán OB gén kódolószekvenciáit PCR-rel amplifikáltuk OB cDNS-szekvenciákat tartalmazó plazmidokból és a pPIC.9 plazmidba (Invitrogen) szubklónoztuk. Az alkalmazott humán 5 ’ primer ’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3 ’ (34. számú szekvencia) és a 3’ primer ’ GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3 ’ (35. számú szekvencia).
Egérhez az 5’ primer
5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3’ (36. számú szekvencia) és a 3’ primer
5’ GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3 ’ (37. számú szekvencia).
HU 223 563 Β1
Mind az egér, mind a humán 5’ primer tartalmaz Xhol helyet az 5’ végen, és a pPIC.9 vektorban jelen levő α-párosítófaktor szignálszekvencia 4 utolsó aminosavaját kódoló szekvenciát. Ez a vektor irányítja heterológ módon kifejezett géntermékek kiválasztódását a sejtből a tápoldatba. Az 5’ primer tartalmazza az OB gén nyílt leolvasási keretének a szignálszekvencia hasítási hely utáni első 19 nukleotidját is a 21. aminosavhelyzetű alanin előtt. A 3’ primer 5’ végén tartalmaz egy £coRI helyet, amelyet közvetlenül a vélt OB stopkodonnal komplementer szekvenciák követnek. A PCR körülményei a következők voltak: denaturálás 1 percig 94 °C-on, annealing 1 percig 55 °C-on és kiterjesztés 2,5 percig 72 °C-on. Alacsony ciklusú (15 ciklus) PCR-t és a korrektor polimeráz PFU-t (Stratagene) alkalmaztuk a PCR által létrehozott mutációk számának korlátozása céljából. A PCR termékeket XTroI-gyel és £coRI-gyel emésztettük és hasonlóan emésztett pPIC.9 vektorba klónoztuk. Minden szerkezetet szekvenáltunk mindkét szálon, hogy megbizonyosodjunk PCR által keltett mutációk hiányáról. A kiónokat Pichia pastoris (His ) törzsbe transzformáltuk a szferoplasztmódszerrel és hisztidinhiányos táptalajon szelektáltuk. Körülbelül 200 egér- és humán kiónt screeneltünk magas számú másolat integrációjára kolóniahibridizáló assay-vel. A magas másolatszámú kiónokat azután OB kifejeződésre vizsgáltuk, kezdetben Coomassie festéssel kimutatva új 16 kD fehérje jelenlétét a transzformált élesztő tápoldatában. A 16 kD sávot Oő-ként erősítettük meg a bakteriálisán kifejezett OB fehérjével szemben termeltetett antitestek felhasználásával. A rekombináns fehérjéket lentebb leírt, kétlépéses tisztítási módszerrel tisztítottuk. Tömegspektrometriát és bróm-ciános kezelést végeztünk a Beavis és munkatársai által leírtak szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6873-6877 (1990).
Az egér és humán OB géneknek a szignálszekvenciával C-terminális teljes kódolószekvenciáját szubklónoztuk a pET-15b expressziós vektorba (Novagen) és kifejeztük Escherichia colban [BL21(DE3)plYsS] a T7 RNS-polimeráz-rendszer alkalmazásával [Studier et al., Meth. Enzymology 185, 80-89 (1990)]. Az 595 nm-en mért 0,7 abszorbancia eléréséig egy éjszakán át 30 °C-on szaporított, és 0,5 mM izopropilb-Dtiogalakto-piranoziddal indukált sejteket alacsony fordulatszámú centrifugálással összegyűjtöttük. Lízist végeztünk három ciklusban történő fagyasztásfelengedéssel és DNáz I-gyel emésztettük a DNS-t. Membránextrakciót végeztünk szonifikálással és detergenssel történő oldhatóvá tétellel, és a végső zárványtestpelletet 6 M guanidin-hidroklorid, 20 mM HEPES, pH 8,4 keverékében oldottuk fel. Rekombináns OB fehérjéket tisztítottunk denaturálókörülmények között IMAC-kal, Ni-ion affinitás oszlopot alkalmazva és imidazol növekvő mennyiségeivel mosva. A tisztított, denaturált fehéijét azután 6 M guanidin-hidroklorid és 10 mM NaAc (pH 5) keverékében tároltuk, és 1 mM DTT felhasználásával szobahőmérsékleten 1 órán át redukáltuk. A renaturálást a redukált fehérjének 20%-os glicerin, 5 mM CaCl2, 5 mM NaAc, pH 5 keverékében történő hígításával, keverésével és szobahőmérsékleten 8-12 órán át tartó inkubációjával végeztük el. A renaturálás után a pH-ját 8,4-re állítottuk be Tris 10 mM-ig történő hozzáadásával és trombinhasítással eltávolítottuk a hexa-hisztidintoldalékot. A hasított, renaturált fehérjét újratisztítottuk IMAC-kal a terméknek trombintól és el nem hasadt fúziós fehérjéktől való elválasztása céljából. A hasított, renaturált fehérje a Ni-ion affinitás oszlopról 40 mM imidazolnál eluál, míg trombin nem marad vissza és a nem hasított fúziós fehérje 0,2 mM imidazolnál eluál. A terméket ezután koncentráltuk, 100 mM EDTA-val és 10 mM kálium-ferricianiddal kezeltük, és tovább tisztítottuk gélszűréssel Pharmacia superdex 75 16/60 oszlopot alkalmazva.
Ellman-assay-t végeztünk [Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77 (1959)]. Ellman-féle reagenst készítettünk 39,6 mg 5,5’-ditio-bisz(2-nitro-benzoesav) (DTNB)-nak 10 ml 0,05 M foszfátpufferben (pH 8) történő oldásával. Kalibrációs görbét készítettünk
10-120 mM szabad szulfhidrilkoncentrációtartományban (redukált DTT 1 mM törzsoldatát használva) 412 nm-en. Minden assay-t 0,02 ml Ellman-féle reagens és összesen 0,5 ml reakciókeverék felhasználásával végeztünk el. A mért extinkciós koefficiens szabad szulfhidrilcsoportra 12 974 M~' cm-1 volt (korrelációs koefficiens 0,99987), amely a korábban közölt 13 600 M”1 cm 1 értékhez képest 5%-os eltérésen belül van.
mg/ml tiszta gélszűrt fehérje 50 ml-ét - amely a végső reakciókeverékben körülbelül 24 mM lehetséges szabad szulfhidrilkoncentrációnak felel meg - Ellmanassay-nek vetettük alá. Az eredményül kapott oldat körülbelül 0,02 A4]2 értéket adott, azt sugallva, hogy a fehérjében levő két ciszteinmaradék oxidált állapotban, cisztin formában van, vagy a szabad szulfhidrilcsoportok teljesen le vannak fedve a hajtogatott fehérje hozzáférhetetlen magjában. Azonos eredményeket kaptunk ugyanezen assay-nek nem hajtogatott fehérjén történő elvégzése során 6 M guanidin-HCl jelenlétében.
Az egereket egyesével, patogénmentes környezetben ketrecben tartottuk, és a következőket tartalmazó diétához szoktattuk hozzá őket: 35% (tömeg/tömeg) Laboratory Rodent Diet (laboratóriumi rágcsálódiéta) 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9% (tömeg/tömeg) tápiókapuding-keverék (General Foods) és 59,1% víz, amelynek az energiatartalma 1,30 kcal/g volt. A táplálékot autoklávban sterileztük és 60 mm-es műanyag edényekbe csomagoltuk, amelyeket 100 mm-es Petri-csészék tetejére erősítettünk. A tápióka a táplálékot pasztaállagúvá teszi, így az állatnak nehéz az élelmet szétszórnia a ketrecben. A 100 mm-es fedél visszatartja az állat által kilötyögtetett kevés élelmet. Minden reggel friss élelmet tartalmazó edényt tettünk a ketrecbe, és az előző napi edényt eltávolítottuk és lemértük. A tömegben mutatkozó eltérés nyújtotta a napi élelemfogyasztás mérését. A rekombináns fehérje táplálékfelvételre és testtömegre kifejtett hatásait a következő három egértörzsben mértük: C57BL/6J ob/ob, C57BL/Ks db/db és CBA/J +/+, amelyeket a Jackson Laboratóriumtól szereztünk be. Minden törzsből 30 egeret osztottunk be 10-es csopor46
HU 223 563 Bl tokba. Minden törzsből egy csoport napi intraperitoneális (ip.) injekciókat kapott az újrahajtogatott bakteriális ob fehérjéből 5 mg/g/nap adagban 300 μΐ PBS-ben. A második csoport ugyanazon mennyiségű PBS ip. injekciókat kapott. Ezek a kontroliegerek a rekombináns fehérje PBS dializátumának injekcióit kapták. A PBS-t Acticlean ETOX oszlop segítségével endotoxintól megtisztítottuk. Az állatok harmadik csoportja nem kapott injekciókat. Az élelemfelvételt naponta feljegyeztük és testtömegméréseket egy 3,5 hetet átfogó időszakon belül rendszeres időközökben jegyeztünk fel. A páros etetési kísérlethez ob egerek szeparált csoportjának élelemfelvételét illesztettük napi alapon ahhoz, amit fehérjét kapott ob egerek fogyasztottak.
Eredmények
Az OB fehérje az egér-, patkány- és humán plazmában kering
Rekombináns egér és humán OB fehérjét készítettünk pET-15b bakteriális expressziós vektor (Novagen) felhasználásával és Pichia pastoris élesztő-expressziósrendszerbe klónozva, amely a rekombináns fehérjéket közvetlenül a szaporító tápoldatba választja ki. Az élesztőben kifejezett ob fehérje 146 aminosavat tartalmaz a szignálszekvencia karboxiterminálisához kapcsolódva. Nyulakat immunizáltunk a bakteriális fehérjékkel (HRP, Inc.). Az antitesteket immuntisztításnak (Research Genetics) vetettük alá, és felhasználtuk azokat plazmából és zsírszövetből származó fehérje immunprecipitációjához és Westem-blotjához.
Az egérplazmából származó OB fehérje 16 kD látszólagos molekulatömeggel vándorol SDS-PAGE-vel. Az elektroforetikus mobilitás azonos az élesztő által, a szignálszekvencia lehasadása után kiválasztott rekombináns OB fehérjével (24A. ábra). A fehérjét nem mutattuk ki C57BL/6J ob/ob egerek - amelyek a 105. kodonon nonszenz mutációval rendelkeznek - plazmájában. Több különböző antiszérum nem azonosította a cDNS-szekvencia által előre jelzett, csonkolt 105 maradékból álló polipeptidláncot.
A keringő fehérje szintjének 10-szeres növekedését tapasztaltuk db/db egerekben a kontrollállatokhoz viszonyítva (24A. ábra). Vad típusú és fa/fa patkányokból származó plazma-immunprecipitációjánál a mutáns patkány OB fehérjeszintjében 20-szoros növekedést mutattunk ki a vad típussal összehasonlítva (24B. ábra). A db mutáció ugyanolyan elhízott fenotípust eredményez, mint amelyet ob egereknél látni (Bahary et al., 1990, fent), fa (fatty=zsíros) patkányok elhízottak a Jó-vel homológ gén recessziv mutációja következtében (Truett at al., 1991, fent). Az OB szint mennyiségének meghatározására egérplazmában, rekombináns fehérje növekvő mennyiségeit adtuk a szérumhoz és immunprecipitációt végeztünk (24C. ábra). A szignálintenzitásban Westem-bloton a rekombináns fehérje növekvő mennyiségeivel lineáris növekedés volt megfigyelhető. Az egérplazmában levő natív fehérje és a standardok szignálintenzitásának összevetése azt jelezte, hogy a keringő OB fehérje szintje vad típusú egerekben körülbelül 20 ng/ml. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az immunprecipitációt és Westem-blotokat antitestfölösleg körülményei között végeztük. Az OB fehérje megnövekedett szintjeit figyeltük meg db/db egerekből származó zsírszövet fehérjeextraktumaiban is a kontrolihoz viszonyítva (24D. ábra). Ahogyan azt kiválasztott fehérjénél elvártuk, a zsírszövetből származó fehérje a durva membránfrakcióval ffakcionálódott (nem mutatunk adatot).
Hat sovány emberi alanyból - amelyeknek a testtömegindexe kevesebb mint 25 (body mass index =BMI=tömeg/magasság2) - vett plazmamintákat immunprecipitációnak vetettünk alá a humán fehérjével szembeni immuntisztított antitestek felhasználásával. Az immunprecipitált anyag azonos elektroforetikus mobilitással vándorolt, mint amelyet az élesztőben kifejezett, 146 aminosavból álló humán fehérjénél láttunk. A szignálok intenzitása szignifikánsan változott a hat minta körében (25A. ábra). Az autoradiográf denzitometriája körülbelül 5-szörös eltérést mutatott ki a HP1 és HP6 egyének szintjeiben, a többi alanynál tapasztalt köztes szintekkel. ELISA-t fejlesztettünk ki immuntisztított antitest és az újrahajtogatott bakteriális fehérje mint standard alkalmazásával (lásd lentebb). Az eredményül kapott standard görbét a 25B. ábrán mutatjuk be. Ezen assay alkalmazásával a plazma OB fehérjeszintjei a hat humán plazmamintában 2-15 ng/ml között váltakoztak (25C. ábra). HP6 plazmájában levő OB fehérjeszint kilógott az immunoassay lineáris tartományából és > 15 ng/ml volt. Ezek a kvantitatív különbségek jól egyeztek a Westem-blotnál megfigyeltekkel.
Korábbi adatok azt sugallják, hogy a leptin legalább részben, egyéb fehérjével vagy fehérjékkel komplexben keringhet. Ezt a következtetést a szérumból kapott titrálási görbe alakjának heterogenitására alapozzuk rekombináns standarddal összehasonlítva. Nagy mennyiségű, nyúl anti-O5 oszlopon immuntisztított leptin analízise gélszűréses HPLC-vel denaturáló- és nem denaturálókörülmények között, ELISA és SDS-PAGE nyomon követéssel azt sugallta, hogy az OB polipeptid nagy molekulájú komplexhez hasonlóan viselkedik. Ezek az adatok azonban előzetesek maradnak; az OB kötő fehérjét, ha egyáltalán valamit, már jellemeztük.
Az OB fehérje szerkezeti jellemzői
Mivel az OB fehérje két ciszteinmaradékkal rendelkezik, alakíthat molekulán belüli és molekulák közötti diszulfidkötéseket in vivő oxidálókörülmények között. Westem-blotot ismételtünk meg a mintapufferhez redukálóágens hozzáadásával vagy anélkül. Az OB protein a humán szérumban mindkét esetben monomerként vándorolt (nem mutatunk adatokat). Nem redukáló körülmények között db egér szérumából immunprecipitált fehérjét mutattunk ki mind a 16 kD monomerrel, mind körülbelül 32 kD dimerrel megegyező helyzetben (26A. ábra). A nagyobb molekulatömegű rész redukálókörülmények között eltűnt, azt valószínűsítve, hogy egér OB egy frakciója - intermolekuláris diszulfidkötés képzésével - nagy molekulatömegű változatként kering. Egér 05-nek körülbelül 80%-a kering a körülbelül 16 kD fehérje formájában és 20% a körülbelül 32 kD formában.
HU 223 563 Β1
Ugyanezeket a molekuláris formákat látjuk, ha az egér- és humán fehérjéket Pichia pastorisban fejezzük ki [Abrams et al., Immunoi. Rév.: 5-24 (1992)]. Ezekben a vizsgálatokban a 146 aminosavból álló érett OB fehérjének megfelelő DNS-szekvenciát klónoztuk az élesztő α-párosítófaktor szignálszekvenciájához downstream a pPIC.9 vektorba (Invitrogen). Az OB fehérjét megtisztítottuk az egér- és humán fehérjéket kifejező törzsek élesztőtápoldatától, és redukáló- és nem redukálókörülmények között elektroforézisnek vetettük alá (26A. ábra). Az egérfehérje az élesztőben nagyrészt dimer formában fejeződött ki nem redukáló körülmények között és csak redukálóágensek jelenlétében monomerként. A rekombináns humán fehérje mindkét esetben a monomer helyzetének megfelelő helyre vándorolt (adatokat nem mutatunk).
A Pichia-ban kifejezett, tisztított humán fehérje 16 024±3 D molekulatömeggel rendelkezett, tömegspektrometriával meghatározva (Beavis, 1991, fent). Ez az érték megegyezik a molekulán belül egy diszulfidhidat tartalmazó fehérje aminosavszekvenciájából kiszámított tömeggel (16 024 D). A fehérje bróm-ciános hasítási termékeinek mátrixszal támogatott lézer deszorpciós tömegspektrometriás analízise azt jelzi, hogy a 117. és 167. helyzetű tiszteinek kapcsolódnak össze molekulán belüli diszulfidkötéssel (26B. ábra). A bróm-cián metioninmaradékok karboxivége mentén hasít.
Bioaktív rekombináns fehérje készítése és jellemzése
Egér OB fehérjét fejeztünk ki E. coliban pET-15b plazmidból oldhatatlan fúziós fehérjeként, 20 maradékból álló, trombin hasítási helyet tartalmazó N-terminális hexa-hisztidin-toldalékkal. A baktérium-zárványtesteket guanidin-hidrokloriddal oldhatóvá tettük, és denaturálókörülmények között, rögzített fémion-affinitáskromatográfra (IMAC) alkalmazásával tisztítottuk (27. ábra). A tisztított, denaturált fúziós fehérjét redukáltuk, hígítottuk és hagytuk újrahajtogatódni vizes oldatban, szobahőmérsékleten. Trombinhasítást követően a renaturált, négy további N-terminális maradékot (Gly-Ser-His-Met; 38. számú szekvencia) tartalmazó egér OB fehérjét újra tisztítottuk IMAC-kal, SDSPAGE-vel és tömegspektrometriával meghatározott > 98%-os homogenitásig. Mátrixszal támogatott lézerdeszorpciós tömegspektrometria 16414±3 D molekulatömeget adott (előre jelzett tömeg: 16415 D). A redukáló és nem redukáló SDS-PAGE gélek egyaránt egyedüli molekulafajtát mutattak 16 kD látszólagos molekulatömeggel (nem mutatunk adatokat).
DP801 Molecular Size Detector (molekulaméretdetektor) (Protein Solutions Inc.) alkalmazásával végzett dinamikus fényszórás azt mutatta, hogy a renaturált egér OB fehérje nagyrészt monomer volt, néhány magasabb rendű aggregátummal. A fehérjét EDTAval kezeltük és kémiailag oxidáltuk. Azután a nagyobb molekulatömegű változatokat gélszűréssel eltávolítottuk. További fényszórásos vizsgálat megerősítette, hogy a tisztított, renaturált rekombináns egér OB fehérje monodiszperz. Foszfátpufferes sóoldattal (PBS) szembeni dialízist követően Acticlean ETOX oszlopon (Sterogene Bioseparations Inc.) eltávolítottuk a bakteriális endotoxint. A fehérje végső hozama 45 mg/1 volt.
Ellman-féle assay-t végeztünk a tisztított, renaturált rekombináns egér OB fehérjén, oxidációs állapotának kiderítésére (Ellman, 1959, fent). Mind a renaturált fehérje, mind a nem hajtogatott 6 M guanidin-HCl-es fehérje <0,5% szabad szulfhidriltartalmat mutatott szemléltetve, hogy a monomer termék molekulán belüli diszulfidkötést tartalmaz. Ezt erősítette meg az újrahajtogatott bakteriális fehérje bróm-ciános hasítási termékeinek tömegspektrometriás vizsgálata (adatokat nem mutatunk).
Az OB fehérje bioaktivitása
A tisztított, renaturált rekombináns egér OB fehérjét 5 mg/kg/nap napi intraperitoneális injekciók formájában adtuk be C57BL/6J ob/ob (16 hetes), C57BL/K.S db/db (12 hetes) és CBA/J +/+ (8 hetes) egerekből álló 10-es csoportoknak. Azonos számú állat kapott napi PBS-injekciót. A kontrollinjekeiéként használt PBS a fehérje ekvilibrálása utáni dializátumból származott. Tíz további állat a három egértörzsből nem kapott injekciókat. Az egyes állatok élelemfelvételét naponta nyomon követtük, és az állatok testtömegét három- vagy négynapos időközökben jegyeztük fel. Az élelemfelvétel- és testtömegadatok összesített eredményeit az egerek mind a 9 csoportjára a 28A-F. ábrákon, és az adatok statisztikai szignifikanciáját az 1. táblázatban mutatjuk be. A fehérjével injektált C57BL/6J ob/ob egerek élelemfelvétele szignifikánsan csökkent az első injekció után, és a csökkenés folytatódott az 5. napig, amikor a PBS-injekciókat kapott állatok szintjének körülbelül 40%-án stabilizálódott (p <0,001). A hamis injekciókat kapott OB egerek nem vesztettek a tömegükből a háromhetes vizsgálati periódus alatt. A fehérjét kapott C57BL/6J ob/ob egerek testtömegüknek körülbelül 10%-át vesztették el 5 nap alatt (p <0,001). Ezeknél az állatoknál folytatódott a tömegvesztés a háromhetes kezelés alatt, amelynek a végpontjában a fehérjét kapott ob állatok tömege átlagosan kezdeti tömegük 60%-ára csökkent (p <0,0001). OB egerek elkülönített csoportját párban etettük fehérjét kapott OB egerekkel. A 29B. ábra adatai mutatják, hogy a párban etetett egerek szignifikánsan kevesebb tömeget veszítettek, mint a rekombináns fehérjét kapott állatok (p <0,02). Két, vagy fehérjevagy hordozóinjekciót kapott egér fotóján mutatjuk be a megjelenésben óriási különbséget, amelyet a fehérjekezelés eredményezett (29B. ábra). A fehérje további hatásainak kiderítésére minden csoportból két egér autopsia-ját (boncolását) végeztük el. A fehérjét kapott ob egerek alapos megfigyelése drámai csökkenést derített föl a testzsírban ugyanúgy, mint a máj méretében. A db és vad típusú egerek májának tömege változatlan maradt a kezelés során. A PBS-injekciókat kapott ob egerek mája 5,04 és 5,02 grammot nyomott, összehasonlítva a rekombináns fehérjét kapott állatok 2,23 és 2,03 g-jával. Az ob egerek halvány, zsíros jellegű májával ellentétben a fehérjét kapott ob egerekből származó májak a normálmáj sötétebb jellegű színével rendelkeztek (29C. ábra). A máj hisztológiai szekciói
HU 223 563 Bl azt jelezték, hogy a kezeletlen állatoknak zsírmájuk volt, amely a fehérjével kezelt állatokban szemlátomást javult (nem mutatunk adatokat).
Az ob egerekkel ellentétben a C57BL/Ks db/db egerek testtömegében vagy élelemfelvételében nem voltak szignifikáns különbségek a fehérjét kapott egerek és a hordozót kapott kontrollcsoport között (28A-F., 1. táblázat). A db/db egerek mind a három csoportja 2-5 g-ot vesztett a kezelési periódus alatt. A db egerek glükométerrel mért átlagos vércukorszintje minden egérben >500 mg/dl volt, jelezve, hogy ezekben az állatokban a cukorbaj (diabetes) az elhízáshoz képest másodlagosan fejlődött ki. A db egerek injekciózását két hét után befejeztük.
Vad típusú egerekben kicsi, de szignifikáns csökkenés következett be a testtömegben a rekombináns ob feltétje beadása után (28A-F., 1. táblázat). A fehérjeinjektálás után 5 nappal a kezelt egerek átlagosan 0,5 g-ot veszítettek, míg a kontrollegerek 0,4 g-mal gyarapodtak (p <0,02). Két egymást követő időpontban a fehérjét kapott állatok szignifikánsan kevesebbet nyomtak, mint a napi PBS-injekciókat kapott egerek. A tömegváltozás szignifikanciáját a későbbi időpontokra redukáltuk. A tömeget vesztett állatoknál az élelemfelvétel nem tért el szignifikánsan a kontroll állatokétól. A PBS-injekciók kicsi, de szignifikáns hatást gyakoroltak az élelemfelvételre és testtömegre ob, db és vad típusú egerekben az injekciókat nem kapott egerekkel összehasonlítva (p <0,05).
1. táblázat
Állatcsoport Kezeléscsoport Testtömegváltozás
nap n középarány std. hiba P
ob/ob fehéij ehordozó 1-5 10 9 -6,38000000 0,47628190 0,24444444 <0,001
fehérjehordozó 1-12 10 9 -14,45000000 0,98888889 0,70793126 0,38058597 <0,001
fehéij ehordozó 1-27 6 5 -24,28333333 4,30000000 0,69924563 0,79874902 <0,0001
db/db fehéij ehordozó 1-5 10 10 -1,47000000 -2,00000000 0,36939891 0,23142073 0,240
fehérjehordozó 1-12 10 10 -3,75000000 -4,19000000 0,77348418 0,34655447 0,610
CBA/J fehérjehordozó 1-5 10 10 -0,48000000 0,38000000 0,17876117 0,21489015 0,006
fehérjehordozó 1-12 10 10 -0,12000000 1,20000000 0,45748103 0,18378732 0,015
fehérjehordozó 1-27 5 6 1,98000000 2,23333333 0,48723711 0,20763215 <0,651
Diszkusszió
Az OB lókusz fehérje termékének először Coleman feltételezett endokrin funkciót, aki megmutatta, hogy ob/ob egerek testtömege csökkent db vagy normálegerekkel való parabiotikus egyesítés után (Coleman et al., 1978, fent). A fent bemutatott eredmények alátámasztják ezt a hipotézist megmutatva, hogy az OB fehérje a véráramban kering, és hogy rekombináns fehérjeinjekciók csökkentik a testtömeget. Az OB gén által kódolt géntermék molekulatömege körülbelül 16 kD, amely egyenértékű a szignálszekvenciával karboxiterminális 146 aminosavszekvenciával. A rekombináns OB fehérje nem módosul, ha Pichia pastorisban fejeződik ki. Emlősgének kifejezése Pichia-ban általában a helyes fehérjeszerkezet kialakulását eredményezi [Cregg et al., Bio/Technology 11, 905-914 (1993)]. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy az OB fehérje nem glikozilezett és in vivő nem poszttranszlációsan alakul ki. Az adatok nem zárják ki annak lehetőségét, hogy az OB fehérje önmagával vagy más fehérjékkel nem kovalensen kötődik a plazmában vagy zsírszövetben. Jóllehet a fehérje proteolitikus hasítását nem zártuk ki, az
OB fehérjének alacsonyabb molekulatömegű alakjait nem mutattuk ki egyik alkalmazott antiszérummal sem, beleértve négy antipeptid antitestet.
Az OB fehérje két ciszteinmaradékkal rendelkezik és emberben monomerként, és egérben monomerként és dimerként kering. A kiválasztott molekulákra jellemző molekulán belüli diszulfidkötést találtunk, ha a humán fehérjét Pichia pastorisban fejeztük ki, azt sugallva, hogy in vivő is valószínűleg jelen van. Ezt támasztja alá a molekulán belüli diszulfidkötéssel rendelkező, rekombináns bakteriális fehérje bioaktivitása. Az egér OB fehérje monomerként és dimerként található a plazmában. A monomer és dimer akkor látható, ha az egér OB fehérje élesztőben fejeződik ki, mutatva, hogy az egérfehérje dimert képző hajlama a humánhoz képest az elsődleges szekvenciában levő különbségek eredménye. Miközben világos, hogy a monomer bioaktivitással rendelkezik, a dimer funkcionális aktivitása ismeretlen.
Az OB fehérje hatása az élelemfelvételre és testtömegre ob egerekben drámai. Háromhetes kezelés után a rekombináns fehérjéből napi injekciókat kapott ob egerek tömegüknek 40%-át elvesztették és a kontrollál49
HU 223 563 Β1 latok által fogyasztott élelemnek 40%-át fogyasztották. Továbbá a kezelt ob egerek tömege még nem egyenlítődött ki a vizsgálat időtartama alatt. A páretetési kísérletek azt jelzik, hogy a tömegvesztés az élelemfelvételre és energiakifejtésre gyakorolt hatásnak egyaránt eredménye. Ilyenformán ob egerek elkülönített csoportja - amelyeknek kalóriabevitelét visszafogtuk a fehérjét kapott ob egerekhez képest - szignifikánsan kevesebb tömeget veszített, mint a fehérjét kapott állatok. Az élelemfelvételnek ob/ob egerekben a vad típusúaknál alacsonyabb szintre történő csökkenése már az OB fehérje beadás napján azt jelzi, hogy ezek különösen érzékenyek annak hatásaira. Eközben az OB receptor túlszabályozott lehet ezekben az állatokban. Kezelt ob egerek élelemfelvétele viszonylag állandóvá vált ötnapos kezelés után. Ha ez a steady State szintet elért fehérjének az eredménye, feltételezhető, hogy a fehérje hosszú felezési idővel rendelkezik [The Pharmacological Basis of Therapeutics p. 19-45, Goodman and Gilman, eds., Pergamon Press, New York (1990)]. Ez a következtetés megegyezik a parabiózis-kísérletek adataival [Coleman et al., 1978, fent; Weigle, Int. J. Obesity 12, 567-578(1988)].
A rekombináns fehérjének vad típusú egerek testtömegére gyakorolt hatásai kicsik voltak, de statisztikailag szignifikánsak a vizsgálat első két hete alatt. Míg a vad típusú, fehérjét kapott és PBS-t kapott egerek tömegében mutatkozó különbség későbbi időpontokban is fennmaradt, az adatok statisztikai szignifikanciája csökkent három hét után. A korai tömegvesztést nem tudtuk az élelemfelvételben mutatkozó különbség számlájára írni. Feltételezhetően az élelemfelvétel mérése nem volt elég pontos a testtömegben 1 gramm különbséget eredményező csökkenés kimutatására a kezelés során. Ezek a megfigyelések eltérnek az előző kísérletek eredményeitől, amelyekben vad típusú rágcsálók parabiotikus egyesüléssel csatlakoztak db egerekhez, fa patkányokhoz, hipotalamuszsérülésekkel rendelkező patkányokhoz és magas kalóriájú diétával elhízottá tett patkányokhoz [Coleman et al., 1978, fent; Harris et al., 1987, fent; Harris et al., „Physiological and metabolic changes in parabiotic partnere of obese rats”, in Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol. 145, 336-352 (1959)]. A vad típusú állatok minden esetben anorektikussá (étvágytalanná) váltak, és tömegüknek jelentős mennyiségét elveszítették. Amint az OB fehérje szintjei megemelkednek db egerekben és fa patkányokban és az OB RNS-szintjét megemeljük hipotalamuszsérüléseket hordozó egerekben, valószínű, hogy a vad típusú egerek válaszolni tudnak OB-re, ha az plazmájukban elég magas szinten kering. Az itt közzétett felfedezések megegyeznek azzal az eshetőséggel, hogy a beadott fehérje szintjei az endogén szint alatt voltak, kissé alacsonyabb testtömeg kiegyenlítődéséhez vezetve. A keringő OB fehérje szintjeinek meghatározását a kezelt egerekben megoldja ez a bejelentés. Miközben az egérfehérje immunológiai meghatározása még nem hozzáférhető, immunprecipitációk azt sugallják, hogy a keringő OB fehérje szintjei nem emelkedtek lényegesen a fehéijét kapott vad típusú egerekben.
A fehérjének vad típusú egerekre gyakorolt kisebb hatása és a válasz hiánya db egerekben kétségessé teszi, hogy a kezelés nem specifikus vagy averzív hatásokkal rendelkezik. A db egerek mindegyike elveszítette tömegének kis mennyiségét a kezelési periódus alatt, függetlenül attól kapta-e vagy sem az ob fehérjét. A db egerek jelentős mértékben hiperglükémiások voltak, és valószínűleg a cukorbaj következményeként veszítettek tömegükből, és nem a kísérleti eljárás eredményeként. C57BL/Ks db/db egerekben gyakran fejlődik ki cukorbaj, és az ebben a vizsgálatban felhasznált állatok életkorában kismértékű tömegvesztés kezdődik el (Coleman et al., 1978, fent). Hasonló korú C57BL/6J ob/ob egerekben nem fejlődik ki szignifikáns hiperglükémia. Ezeket a fenotípusos különbségeket a mutációkat hordozó törzsek genetikai eltéréseinek (C57BL/6J szemben C57BL/Ks-sel) tulajdonítjuk (Coleman et al., 1978, fent).
Az OB gén cDNS-szekvenciája által előre jelzett, csonkolt, 105 aminosavból álló fehérje kimutatásának kudarca C57BL/6J ob/ob egerekben azt sugallja, hogy a mutáns fehérje vagy degradálódott, vagy nem transzlálódott. Az sem zárható ki azonban, hogy a használt antiszérum nem mutatja ki ezt a csonkolt fehérjét. A db egerek ob fehérjeszintjében megfigyelt 10-szeres emelkedés a vad típushoz képest azt sugallja, hogy az ob fehérje fölöslegben termelődik, ha hatásaira rezisztencia áll fenn. Ezek az adatok egyeznek az OB mRNSsel végzett vizsgálatokkal. Ahogyan említettük, korábbi kísérletek megmutatták, hogy a db egér- és fa patkánygének mutációi - amelyek homológ kromoszómarégiókkal térképeződnek - egy olyan plazmafaktor túltermelését idézik elő, amely visszaszorítja a testtömeget (Truett et al., 1991, fent; Coleman et al., 1978, fent; Hervey, 1959, fent). Mindkét esetben azt valószínűsítettük, hogy a mutáns állatok rezisztensek az OB fehérje hatásaira. Ezt az eshetőséget megerősítette az a megfigyelés, hogy az OB fehéije nincs hatással a testtömegre vagy élelemfelvételre, ha db egereknek adjuk be.
Emberekben az elhízás kapcsolatban lehet az OB fehérje megnövekedett szintjeivel a plazmában olyan egyéneknél, amelyek relatíve válaszképtelenek a hormonra. Másrészt OB csökkent kifejeződése szintén elhízáshoz vezethet, amely esetben a fehérjének „normális” (azaz alkalmatlanul alacsony) szintjei találhatók. Ilyenformán az OB fehérje szintjei a humán plazmában az elhízás különböző formáit jelezhetik. Sovány alanyok (BMI<25) kis csoportjában alacsony nanogramm-mennyiségű keringő OB fehérje mutatható ki ELISA-val. Szignifikánsan változó koncentrációkat jegyeztünk fel azt sugallva, hogy a fehérjekifejeződés és/vagy a fehérjére való érzékenység szintje meghatározó szerepet játszhat a testtömeg alakulásában.
Az OB fehérje működésének helye ismeretlen. A fehérje befolyásolja mind az élelemfelvételt, mind az energiakifejtést, a felfedezés egybecseng klinikai vizsgálatokkal jelezve, hogy mindkét rendszerben bekövetkező módosulások szerepet játszanak a testtömeg szabá50
HU 223 563 Bl lyozásában [Leibei et al., N. Engl. J. Med. 332, 621-628 (1995); Keesey et al., „Metabolic defense of the body weight set-point”, in: Associatdon fór Research in Nervous and Mentái Disease p. 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York (1984)]. A hipotalamusz valószínűleg az OB-hez képest downstream található a testtömeget ellenőrző biokémiai útvonalon, bár lehetségesek különböző szervekre kifejtett közvetlen hatások.
9. példa: OB RNS megnövekedett kifejeződése hipotalamuszsérüléseket és a db lökuszon mutációkat tartalmazó egerek zsírsejtjeiben A jelenleg klónozott egérelhízottság-gén (OB) génterméke fontos szerepet játszik a zsírszövet tömegének szabályozásában. OB RNS-t specifikusan egéradipociták (zsírsejtek) fejeznek ki in vivő a számos különböző zsírsejtraktár mindegyikében, beleértve a barna zsírt. Szintén kifejeződik differenciálódásra indukált tenyésztett 3T3-442A előzsírsejtekben. A hipotalamuszban sérüléseket hordozó egerek ugyanúgy, mint a db lókuszon mutánsak, 20-szorosan magasabb szinten fejezik ki az OB RNS-t zsírszövetben. Ezek az adatok azt valószínűsítik, hogy mind a db gén, mind a hipotalamusz az OB génhez képest downstream helyezkedik el azon a biokémiai útvonalon, amely a zsírszövet tömegét szabályozza, és ez egybevág azokkal az előzetes kísérletekkel, amelyek azt sugallják, hogy a db lókusz kódolja az OB receptort. A db/db és sérült hipotalamuszú egerekben az OB RNS kifejeződésében levő mennyiségi különbségek jó egyezést mutattak a zsírsejtek lipidtartalmával. Az OB gén zsírsejtekben való kifejeződési szintjét szabályozó molekulák valószínűleg ugyanúgy fontos szerepet játszanak a testtömeg meghatározásában, mint azok a molekulák, amelyek az OB hatásait közvetítik a működés helyére.
Anyagok és módszerek
In situ hibridizáció
Vad típusú (wt=wild type) és db egerek azonos hasi régióiból vett fehérzsír-szöveteket készítettünk el egyidejűleg a Richardson és munkatársai által [Growth, Development & Aging 56, 149-157 (1992)] leírt, módosított módszer szerint. Röviden, a szöveteket Bouinféle oldatban 2 órán át 4 °C-on fixáltuk. Ezeket azután etanol növekvő koncentrációinak sorozatával 10-100%, mindegyikkel 5 percig, 4 °C-on - vízmentesítettük. A szövetek további inkubálását xilollal (1 óra) és paraffinnal (2 óra) 65 °C-on végeztük. A beágyazott wt és db/db zsírszöveteket részekre osztottuk, és később ugyanolyan körülmények között montíroztuk. Az egyes részeket 65 °C-on tartottuk 1 órán át, és kezeltük xilollal és etanol 100—50%-ig terjedő sorozat hígításaival, mindegyiket 3 percig szobahőmérsékleten. OB génnek egy antiszenz RNS-próbáját szintetizáltuk az upstream Sp6 RNS-polimeráz-promotert tartalmazó, linearizált OB gén kódolószekvenciájának in vitro transzkripciójával. In situ hibridizációt végeztünk pontosan Schaeren-Wiemers és munkatársai szerint [Histochemistry 100, 431-440 (1993)].
RNS-preparálás és sejtkultúra
Teljes RNS-t és Northem-blotot készítettünk a leírtak szerint. Stromális vaszkuláris sejteket és zsírsejteket készítettünk elő Rodbell szerint, és mindkét frakcióból RNS-t preparáltunk Dani és munkatársai szerint [Rodbell, J. Bioi. Chem. 239, 375-380 (19); Dani et al., Mól. Cell. Endocrinol. 63, 199-208 (1989)]. Szubklónozás után 3T3-F442 sejteket szaporítottunk Dulbeccoféle Eagle-tápoldatban, amely 10% borjúmagzatszérumot tartalmazott (standard tápoldatként definiált) [Dani et al., „Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation”, in: Obesity in Europe vol. 88, p. 371-376, Bjomtorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. Összefüggő tenyészet kialakulásakor a sejteket 2 nM trijodo-trioninnal (T3) és 17 nM inzulinnal kiegészített standard tápoldatban kezeltük. Tizenkét nappal később RNS-t preparáltunk a fentiek szerint.
Arany-tioglükózos (gold thioglucose = GTG) kezelés
Két hónapos nőstény CBA/J egereket kezeltünk arany-tioglükóz (Sigma A0632. kát. szám) egyszeri intraperitoneális injekciójával 0,2 mg/g adagban, normálsóoldatban. Kontrollállatokat normálsóoldattal oltottunk be. Az egereket a kezelés után egy hónappal megmértük. Zsírszövet-RNS-t izoláltunk azokból a kezelt állatokból, amelyeknek a tömege több mint 20 g-ot növekedett a GTG-kezelés után.
Eredmények
Nemrég megtalálták az OB gén kifejeződését zsírszövetben [Zhang et al., Natúré 372, 425 -432 (1994)]. A zsírszövet sokféle sejttípusból áll, beleértve a zsírsejteket, előzsírsejteket, fibroblasztokat és vaszkuláris sejteket, in situ hibridizációt végeztünk normálállatokból származó epididymalis (mellékherékhez tartozó) zsírpárnák részeivel szenz és antiszenz OB ribopróbákkal [Richardson et al., 1992, fent; Wasserman, „The concept of the fát organ” in: Rodahl, Issekutz, „Fát as a tissue” p. 22-92, Mcgraw Hill, NY (1964)]. Az antiszenz próba alkalmazásával pozitív szignálokat tudtunk kimutatni a szekcióban levő összes zsírsejtben (30. ábra, jelzett wt). Nem észleltünk szignálokat, amikor az antiszenz próba agyi szekciókkal hibridizált (nem mutatunk adatokat). Az antiszenz próba hibridizációja C57BL/Ks db/db egerekből származó zsírszövetszekciókkal nagymértékben megnövekedett, megerősítve az OB RNS zsírsejt specifikus kifejeződését, és szemléltetve az OB RNS szintjének nagymértékű növekedését ezen állatok zsírsejtjeiben (30. ábra, jelzett db/db). A db lókuszon mutáns egerek erősen elhízottak annak a szindrómának részeként, amely fenotípusosan a C57BL/6J ob/ob egereknél láthatóval azonos (Bahary et al., 1990, fent).
OB RNS nem szintetizálódott a zsírszövet zsírsejtektől elválasztott stromális sejtjeiben. Ahogyan vártuk, a zsírsejtfrakció sejtjei kifejezték az OB RNS-t Northem-blottal (31. ábra). Ugyanezt az eredményt kaptuk RT-PCR alkalmazásával (nem mutatunk adatokat). Ezek az adatok alátámasztják azt a következtetést, hogy csak az adipociták (zsírsejtek) fejezik ki az OB gént. Zsírsejttenyészetekből kapott adatok megerő51
HU 223 563 Bl sítik ezt a következtetést. Ezekben a vizsgálatokban 3T3-F442A sejteket tenyésztettünk olyan körülmények között, amelyek a zsírsejtekké történő differenciálódás celluláris programjának részeként lipidakkumulációhoz vezettek. OB RNS nem fejeződött ki sem exponenciálisan szaporodó sejtekben, sem egybefüggő 3T3-F442A előzsírsejtekben, amelyek kifejeznek korai markereket, míg ezeknek a sejteknek zsírsejtekké történő differenciálódása detektálható szintű OB RNS kifejeződéséhez vezetett (31. ábra) [Dani et al., J. Bioi. Chem. 264, 10 119-10 125 (1989)]. Az OB RNS szintje rendkívül érzékeny a tenyésztési körülményekre, így nem figyeltünk meg üzenetet késői, egybefolyás utáni, inzulinnak ki nem tett sejteknél.
A hibridizációs vizsgálatok megmutatták, hogy OB RNS in vivő számos különböző zsírraktárban kifejeződik, beleértve az epididymális (mellékherékhez tartozó), parametriális (kötőszöveti), abdominális (hasi), perirenális (vese körüli) és inguinalis (lágyéki) zsírpárnákat (32A. ábra). A kifejeződés pontos szintje a raktárak mindegyikében némiképp változó volt, a lágyéki és kötőszöveti zsír alacsonyabb szinteken fejezte ki az OB RNS-t. OB RNS bamazsír-szövetben is kifejeződik, bár a kifejeződés szintje barna zsírban az egyéb zsírszövetekhez képest körülbelül 50-szer alacsonyabb. Ezek a mennyiségi különbségek lazán egyeznek az előzőekben említett, a különböző zsírsejtraktárak sejtjeinek mérete közötti különbségekkel [Johnson et al., J. Lipid Rés. 13, 2-11 (1972)]. Az OB RNS mennyiségét barna zsírban nem befolyásolja a hidegnek történő kitétel (32B. ábra). Ebben a kísérletben a nem kapcsolt fehérje (UCP=uncoupling protein) RNS megnövekedett barna zsírban hidegnek történő kitétel után, míg az OB RNS szintje nem változott [Jacobsson et al., J. Bioi. Chem. 260, 16 250-16 254 (1985)]. Összességében ezek az adatok megerősítik, hogy minden zsírsejt képes OB RNS kifejezésére, és szemléltetik a kifejeződés eltérő szintjeit különböző zsírraktárakban. Ezek az adatok alátámasztják azt a lehetőséget, hogy a kódolt fehérje szintje összefüggésben van a teljes zsírszövet tömegével.
Az OB RNS szintjeit mértük db/db egerekben és sérült hipotalamuszú egerekben. A ventromediális hipotalamuszban (VMH) levő sérülések elhízást eredményeznek az ob/ob és db/db egerekben láthatóhoz hasonló szindróma részeként [Bray et al., Metabolism 24, 99-117 (1975)]. Parabióziskísérletek azt sugallják, hogy az ilyen sérülések egy olyan, véráramból eredő faktor túltermelődését eredményezik, amely visszaszorítja az élelemfelvételt és a testtömeget (Hervey, 1959, fent). Hasonló eredményeket kaptunk, ha a db lókuszon mutáns egereket normális egerekkel tartottunk parabiózisban, valószínűsítve, hogy az OB receptort a db lókusz kódolhatja (Coleman et al., 1978, fent). Tehát a VMH sérüléseiből eredő elhízottság és a db mutáció az OB fehérje hatásaival szembeni rezisztencia eredménye lehet. Ha így van, a zsírszövet OB RNS szintjeiben egy másodlagos növekedés előre jelezhető.
Hipotalamuszsérüléseket indukáltunk nőstény CBA egerekben arany-tioglükóz (GTG) vegyszert alkalmazva [Debons et al., Fed. Proc. 36, 143-147 (1977)]. Ez a kezelés specifikus hipotalamuszsérüléseket eredményez, leginkább a ventromediális hipotalamuszban (VMH-ban), ezt követően néhány héten belül elhízás kialakulásával. 0,2 mg GTG/g testtömeg egyszeri intraperitoneális injekcióval általában négy héten belül elhízás kifejlődését eredményezi. Egy hónapos nőstény CBA/J egereket (20-25 g) kezeltünk GTGvel és a kezelt és kontrollállatok ezt követő tömeggyarapodását mutatjuk be a 2. táblázatban. ZsírszövetRNS-t preparáltunk db/db egerekből és azokból a GTG-vel kezelt állatokból, amelyek több mint 20 g-ot gyarapodtak. Northem-blot 20-szoros növekedést mutatott ki két hónapos db/db és GTG-vel kezelt egerek OB RNS szintjeiben normálállatokkal összehasonlítva (33. ábra).
2. táblázat
Testtömeg-gyarapodás GTG-vel kezelt egerekben
kontroll (n=41) GTG (n - 93)
<10g 10g-20g >20 g 41 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 4 (4%) 15(16%) 74 (80%)
Két hónapos nőstény CBA/J egereket kezeltünk arany-tioglükózzal (GTG-vel). Arany-tioglükózt (Sigma A0632) adtunk intraperitoneálisan normálsóoldatban, 0,2 mg/g adagban. A kontroll- és injekciót kapott állatok testtömegét feljegyeztük az injekció beadása előtt és egy hónappal utána. Az állatokat ötösével tartottuk egy ketrecben és ad. libitum (tetszés szerint) etettük. Az injekciót követő egy hónap után 20 g-nál nagyobb testtömeg-gyarapodást mutató állatokat további vizsgálathoz választottuk ki.
Diszkusszió
Az egér OB gén génterméke egér- és humán plazmában kering, ahol valószínűleg a zsírszövet tömegének szabályozásában működik közre. Az OB kifejeződés és működési mechanizmus szabályozásának további vizsgálatai fontos alkalmazásokat nyernek ahhoz, hogy megértsük azokat a fiziológiai folyamatokat, amelyek a testtömeget szabályozzák.
A jelen példa megmutatja, hogy az OB géntermék minden zsírszövetraktárban kizárólag zsírsejtekben fejeződik ki. Ez az eredmény megegyezik azzal a lehetőséggel, hogy az OB gén fehéije terméke összefüggésben áll a test lipidraktáraival. Továbbá OB RNS 20-szorosan túlszabályozott db egerekben és hipotalamuszsérüléseket hordozó egerekben. Ezekben az állatokban az OB RNS szintjében bekövetkező aktuális növekedés sejtenként 20-szorosnál valószínűleg még nagyobb, mivel a zsírsejtméret ezekben az állatokban körülbelül 5szörösére nőtt (lásd a 30. ábrát) (Debons et al., 1977, fent). Ezek az adatok a db gént és a hipotalamuszt az OR-hez képest downstream helyezik el azon az útvonalon, amely a testtömeget ellenőrzi, és egybevágnak azzal a hipotézissel, hogy az OB receptor kódolása a db lókuszon történik [Coleman et al., Diabetologia 14,
HU 223 563 Bl
141-148 1978)]. Az OB receptor és/vagy a db gén molekuláris klónozását megoldja ez a bejelentés. Az OB RNS szintjének növekedése db/db és GTG-vel kezelt egerekben szintén nem sejtautonóm funkciót sugall az OB géntermék esetében zsírsejtekben [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond. 195, 343-353 (1977); Ashwell et. al., Diabetologia 15, 465-470], Tehát ha a kódolt fehérje közvetlenül működne zsírsejtekben a növekedés vagy differenciálódás gátlásában, a vad típusú OB gén túlzott kifejeződése CTC-vel kezelt egerekben sovány fenotípust eredményezne.
Ezeknek az adatoknak a legvisszafogottabb magyarázata, hogy az OB fehérje endokrin szignál molekulaként működik, amelyet zsírsejtek választanak ki, és közvetlenül vagy közvetve hat a hipotalamuszra. A hipotalamuszra gyakorolt közvetlen hatásokhoz szükség lenne egy olyan mechanizmus létezésére, amely lehetővé teszi az OB génterméknek a vér-agy gáton történő átjutását. Mechanizmusok, beleértve a cirkumventrikuláris szervet és/vagy specifikus transzportereket, lehetővé tudnák tenni az agyba történő belépést egy olyan méretű molekula számára, mint amilyent az OB gén kódol [Johnson et al., FASEB J. 7, 678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest. 92, 1824-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews 7, 314-330 (1986)]. Ezt a hipotézist azonban óvatosan kell kezelni egészen addig, amíg meg nem határoztuk annak a módját, ahogyan a fehérje átjuthat a vér-agy gáton. Továbbá egyéb célszervekre gyakorolt lehetséges hatásait szükséges értékelni.
A zsírsejtszignál(ok) - amely felelős az OB gén kifejeződési szintjének mennyiségi változásaiért - még nem ismert, de összefüggésben van a zsírsejtek méretének eltéréseivel, db/db egerekből származó zsírsejtek ötször akkorák, mint azok, amelyek normálegerekből származnak, méretük körülbelül 1,0 pg lipid/sejt (Johnson et al., 1972, fent). Korábbi értékelés azt jelezte, hogy zsírsejt-lipidtartalom és/vagy -méret fontos paraméter a testtömeg meghatározásában [Faust et al., Am. J. Physiol. 235, 279-286 (1978); Faust et al., Science 197, 393-396 (1977)]. Lehet, hogy mindegyik zsírsejt alacsony szinten fejez ki OB RNS-t, amely tovább növekszik a sejt méretével arányosan. Az is lehet, hogy nem a sejt mérete az érzékelt paraméter, csupán összefüggésben áll az intracelluláris szignállal, amely megnöveli az OB gén kifejeződését db/db és VMHsérülést hordozó egerek zsírsejtjeiben. Mindenesetre az OB RNS szintézisét szabályozó szignál transzdukciós útvonalkomponensei valószínűleg fontosak a testtömeg meghatározásában. Olyan genetikai és környezeti behatások, amelyek csökkentik az OB kifejeződés szintjét, működhetnek testtömegnövelőként, mint ahogyan olyan befolyásoló tényezők, amelyek csökkentik a kódolt fehérjével szembeni érzékenységet. Az OB gén kifejeződési szintjét szabályozó specifikus molekulák egyelőre még ismeretlenek, és várat magára a gén kontrollszintjének (szintjeinek) meghatározása, amely az OB RNS-szint mennyiségi különbségeihez vezet, és az OB gén szabályozóelemeinek vizsgálata. Az OB gén zsírsejtekben történő kifejeződését szabályozó, és a kódolt fehéije hatásait közvetítő molekulák és ezek működési helyé(i)nek azonosítása nagyban elősegíti majd a testtömeg-szabályozás mechanizmusának megértését.
10. példa: RNS-kifejeződési minták és térképezés a
7. kromoszóma fiziológiai, citogenetikai és genetikai térképein
OB RNS magas szinten fejeződik ki humán zsírszövetben, és lényegesen alacsonyabb szinten méhlepényben és szívben. A humán OB gént egy nagy mesterséges élesztőkromoszóma (YAC) összefüggő szerkezetbe (contig) tervezzük, amely a 7q31.3 kromoszómából származik. A gén relatív elhelyezkedésének — egérhumán összehasonlító térképezésen alapuló - megerősítésén felül, ez a vizsgálat 8 létesített mikroszatellitmarkert azonosított a humán OB génnel szoros fizikai közelségben. Mivel az egér Oő-ben előforduló mutációk olyan szindrómát eredményezhetnek, amely közel hasonló az emberi kóros elhízottsághoz, ezek a genetikai markerek fontos eszközt jelentenek az OB gén lehetséges szerepének tanulmányozásához a humán elhízottság öröklött formáiban.
Anyagok és módszerek
Northern-blot-analizis
Teljes RNS-t preparáltunk zsírszövetből Chirgwin és munkatársainak módszere szerint [Biochem 18, 5294-5299 (1979)]. Northem-blot-analíziseket, radioaktív jelzést és hibridizációkat végeztünk (Zhang et al., 1994, fent). PolyA+ RNS Northem-blotokat (humán MTN, humán MTN II és humán magzati MTN II) CLONETECH-től szereztünk be, ahogyan PCR-primereket is, amelyeket a radioaktívan jelölt humán aktinpróba előállításához használtunk fel.
STS-kifejlesztés
Szekvenciatoldalék-helyekre (STS = sequencetagged site) specifikus PCR assay-ket fejlesztettünk ki és elvégeztük a nélkülözhetetlen optimalizálást [Green et al.,. PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics 11, 548-564 (1991); Green, „Physical mapping of humán chromosomes: generation of chromosomespecific sequence-tagged sites”, in: Methods in Molecular Genetics vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A) p. 192-210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hűm. Mól. Génét. 3, 489-501 (1994)]. Minden STS-t az ’sWSS’ előtagot követő egyedi szám alkalmazásával neveztünk el. Az itt említett 19 STS-ről részleteket mutatunk a 3. táblázatban, további információk (például PCR reakciókörülmények, teljes DNS-szekvencia) elérhetők a GenBanknál és/vagy a Genome Data Base-nél (GDB). A mikroszatellitspecifikus STS-ekhez a PCR assay-ben alkalmazott oligonukleotidprimerek (3. táblázat) vagy azoknak feleltek meg, amelyeket a genotípus-analízishez (4. táblázat) használtunk, vagy amelyeket a GenBankban hozzáférhető DNS-szekvencia alkalmazásával terveztünk meg (leggyakrabban OSP számítógépes program segítségével) [Hillier et al., PCR Methods Applic. 1, 124-128 (1991)]. A 3. táblázat szemlélteti a humán OB gént tartalmazó YAC összefüggő szerkezetben levő STS-eket.
HU 223 563 Β1
3. táblázat
STS- név Alias Lókusz Forrás PCR- primerek Mé- ret (bp) Szek- ven- cia száma GDB- azonosító
sWSSl 734 D7S2185 YAC vég CAAGACAAATGAGATAAGG AGAGTTACAGCTTTACAG 72 39 40 G00-455-235
sWSS494 D7S2016 lambda klón CTAAACACCTTTCCATTCC TTATATTCACTTTTCCCCTCTC 112 41 42 G00-334-404
sWSS883 UT528 D7S1498 gén. marker TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 490 43 44 G00-455-262
sWSS2359 AFMaO65zg9 D7S1873 gén. marker AGTGTTGTGTTTCTCCTG AAAGGGGATGTGATAAGTG 142 45 46 G00-455-247
sWSS2336 AFMal25whl D7S1874 gén. marker GGTGTTACGTTTAGTTAC GGAATAATGAGAGAAGATTG 112 47 48 G00-45 5-244
sWSS1218 AFM309yfl D7S680 gén. marker GCTCAACTGACAGAAAAC GACTATGTAAAAGAAATGCC 154 49 50 GOO-307-733
sWSSl 402 D7S1916 YAC-vég AAAGGGCTTCTAATCTAC CCTTCCAACTTCTTTGAC 137 51 52 GOO-344-044
sWSS999 D7S1674 YAC-inszer- tum TAAACCCCCTTTCTGTTC TTGCATAATAGTCACACCC 105 53 54 G00-334-839
sWSSl 751 D7S2186 YAC-vég CCAAAATCAGAATTGTCAGAAG AAACCGAAGTTCAGATACAG 186 55 56 G00-455-238
sWSSl 174 AFM218xflO D7S514 gén. marker AATATCTGACATTGGCAG TTAGACCTGAGAAAAGAG 144 57 58 G00-307-700
sWSS2061 D7S2184 YAC vég GTTGCACAATACAAAATCC CTTCCATTAGTGTCTTATAG 200 59 60 G00-455-241
sWSS2588 D7S2187 YAC vég ATCACTACACACCTAATC CCATTCTACATTTCCACC 117 61 62 G00-455-253
sWSS808 Pax4 PAX4 gén GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC 153 63 64 G00-455-259
sWSSl 392 AFM206xcl D7S635 gén. marker CTCAGGTATGTCTTTATC TGTCTCTGCATTCTTTTC 75 65 66 G00-307-815
sWSSl 148 AFM199xhl2 D7S504 gén. marker GACACATACAAACACAAG ATTGAGTTGAGTGTAGTAG 60 67 68 G00-307-652
sWSSl 529 D7S1943 YAC vég CAGGGATTTCTAATTGTC AAAAGATGGAGGCTTTTG 116 69 70 G00-334-119
SWSS2619 OB OB gén CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA 106 71 72 G00-455-256
sWSS404 D7S1956 lambda-klón ACCAGGGTCAATACAAAG TAATGTGTCCTTCTTGCC 122 73 74 G00-334-251
SWSS2367 AFMa345wc9 D7S1875 gén. marker CAATCCTGGCTTCATTTG AAGGTGGGTAGGATGCTA 81 75 76 G00-455-250
A humán OB gént tartalmazó YAC összefüggő szerkezetbe betervezett, 7. kromoszómára specifikus 19 STS-t (35. ábra) soroljuk fel. Minden esetben az 50 ’sWSS’ elnevezést, releváns aliast, GDB-re utaló lókusznevet, STS-forrást, PCR-primer szekvenciákat, STS-méretet és a GDB-azonosító számot tüntetjük fel.
Az STS-források a következők: ’YAC-vég’ (YAC izolált inszertumvég) (Green, 1993, fent), ’lambda-klón’ 55 (7. kromoszómára specifikus random lambda-klón) (Green et al., 1991, fent; Green, 1993, fent), 'genetikai marker’ (mikroszatellitmarker, lásd a 4. táblázatot) (Green et al., 1994, fent), ’YAC-inszertum’ (YAC-inszertum randomszegmense) és ’gén’ (génspecifikus 60
STS). Megjegyezzük, hogy néhány genetikai markerre specifikus STS-hez az YAC-k azonosítására használt PCR-primerek (ebben a táblázatban felsorolt) eltérnek azoktól, amelyeket a genotípus-analízishez használunk (4. táblázat), mivel genetikai markert tartalmazó YAC-k kimutatásához nem szükséges magának a polimorf traktusnak az amplifikálása. Az előforduló összes PCR assay-nél 55 °C-os annealing hőmérsékletet használtunk, kivéve az sWSS494, sWSS883, sWSS1529 és sWSS2619 (amelyeknél 50 °C), sWSS999 és sWSSl 174 (amelyeknél 60 °C) és sWSS8O8 (amelynél 65 °C). Az STS-specifikus PCR assay-kre vonatkozó további részletek hozzáférhetők GDB-ben.
HU 223 563 Bl
4. táblázat
Mikroszatellitmarkerek a humán ob gént tartalmazó YAC összefüggő szerkezetben
Markernév Típus Lókusz PCR-primerek Szekvencia száma GDB-azonosító
UT528 Tetra D7S1498 TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 77 78 G00-312-446
AFMa065zg9 (CA)n D7S1873 AGCTTCAAGACTTTNAGCCT GGTCAGCAGCACTGTGATT 79 80 G00-437-253
AFMal25whl (CA)„ D7S1874 TCACCTTGAGATTCCATCC AACACCGTGGTCTTATCAAA 81 82 G00-437-263
AFM309yfl0 (CA)n D7S680 CATCCAAGTTGGCAGTTTTT AGATGCTGAATTCCCAGACA 83 84 G00-200-283
AFM218xflO (CA)„ D7S514 TGGGCAACACAGCAAA TGCAGTTAGTGCCAATGTCA 85 86 G00-188-404
AFM206xcl (CA)n D7S635 CCAGGCCATGTGGAAC AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT 87 88 G00-199-240
AFM199xhl2 (CA)n D7S504 TCTGATTGCTGGCTGC GCGCGTGTGTATGTGAG 89 90 G00-188-280
AFMa345wc9 (CA)„ D7S1875 AGCTCTTGGCAAACTCACAT GCCTAAGGGAATGAGACACA 91 92 G00-437-259
A humán OB gént tartalmazó YAC összefüggő szerkezetbe tervezett 8 mikroszatellitmarkert (35. ábra) soroljuk fel. Minden esetben a markemevet (a 3. táblázatban állásként jelezve), a mikroszatellitmotívum típusát (tetranukleotid-’Tetra’ ismétlés vagy (CA)n ismétlés), GDB-re utaló lókusznevet, PCR-en alapuló genotípusanalízishez használt primer szekvenciákat és a GDBazonosító számot tüntetjük fel. A PCR assay-kre és polimorfizmusra vonatkozó további részletek hozzáférhetők GDB-ben.
A humán OB-specifíkus STS-t (sWSS2619) a cDNS 3’ nem transziáit régiójából kapott DNS-szekvencia felhasználásával terveztük meg. A humán Pax4-specifikus STS-t (sWSS808) a következő stratégia alkalmazásával fejlesztettük ki. Az egér Pax4 génre specifikus oligonukleotid primereket (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (63. számú szekvencia) és (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (93. számú szekvencia) [Walther et al., Genomics 11, 424-434 (1991)] alkalmaztunk a humán genomiális DNS-ből származó 204 bp fragmentum (amely ugyanolyan méretű termék volt, mint amelyet egér genomiális DNSből hoztunk létre) amplifikálására. Ez a PCR assay nem volt alkalmas megfelelő YAC-k azonosítására, mivel egy hasonló méretű (200 bp) terméket az élesztő-DNSből is amplifikáltunk. A humán DNS-ből létrehozott PCR termék DNS-szekvencia-analízise azonban az analizált 156 bázis körében 20 helynél derített fel szubsztitúciókat (adatokat nem mutatunk). Felhasználva ezt a humánspecifikus szekvenciát, új prímért (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (64. számú szekvencia) terveztünk, és a fenti egér Eox4-specifikus primerek közül az elsővel alkalmaztuk (lásd a 3. táblázatot). Az eredményül kapott humán Pax4 specifikus PCR assay nem amplifikált szignifikáns terméket élesztő-DNS-ből, és így megfelelő YAC-k azonosítására használtuk föl.
YAC-k azonosítása PCR-en alapuló screeneléssel
A 35. ábrán bemutatott YAC-k legtöbbjét a humán 7. kromoszóma DNS-re feldúsított kiónok gyűjteményéből (az ’YAC 7. kromoszómaforrás’-ból) származtattuk (Green et al., 1995, fent) PCR-en alapuló screenelési stratégiával [Green et al., 1995, fent; Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1213-1217 (1990)]. Néhány esetben kiónokat izoláltunk elérhető, CEPH-nál [Dausset et al., Behring Inst. Mitt. 91, 13-20 (1992); Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4256-4260 (1990)] vagy ICI-nél [Anand et al., Nucl. Acids Rés. 17, 3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Rés. 18, 1951-1956 (1990)] összeállított, teljes humán genomiális YACkönyvtárak PCR-en alapuló screenelésével (Green et al., 1990, fent). Minden egyes YAC-t az ’yWSS’ előtaggal és azt követő egyedi számozással neveztünk el.
Eredmények és diszkusszió
A humán OB gén szöveti kifejeződésének vizsgálata Northem-blot-analízissel felderítette, hogy OB RNS magas szinten fejeződik ki humán zsírszövetben, és sokkal alacsonyabb szinteken méhlepényben és szívben (34. ábra). Az RNS mérete (körülbelül 4,5 kb) egyforma volt emberben és egérben ugyanúgy, mint a kifejező szövetek mindegyikében. Ezekben a vizsgálatokban 5-szörösen magasabb szignálokat tapasztaltunk teljes zsírszövet-RNS 10 pg-jában, mint 2 pg méhlepény polyA+ RNS-ben. 5-ször kisebb szignált láttunk szív polyA+ RNS-ben a méhlepényhez viszonyítva. Becsülhetően az OB RNS szintje körülbelül 250-szer alacsonyabb méhlepényben, mint zsírszövetben. Ebben a kísérletben nem mutattunk ki OB RNS-t semmilyen más analizált szövetben, beleértve agyat, tüdőt, májat, vázizmot, vesét és pankreászt. További kísérletek nem derítettek föl OB RNS-t lépben, timuszban, prosztatában, mellékherében, petefészekben, vékonybélben, vastagbélben, perifériásvér-leukocitákban vagy magzati agyban, májban vagy vesékben (adatokat nem mutatunk).
HU 223 563 Β1
Lehetséges, hogy OB - Northem-blot-analízissel - ki nem mutatható szinten fejeződik ki ez utóbbi szövetekben vagy egyéb, nem vizsgált szövetekben. A megfigyelt kifejeződési minta emberben valamelyest különbözik az egértől, amelyben OB RNS-t szinte kizárólag zsírszövetben mutattunk ki.
Az egér- és humán genomban található OB génrégió összehasonlító térképezése Az egér OB gén proximálisan a 6. kromoszómán helyezkedik el egy olyan régióban, amely homológ a humán 7q kromoszóma egy részével. Az e szegmensen belüli gének magukban foglalják (közelitől a távoli felé): a Met protoonkogént, a cisztikus fibrózis transzmembrán konduktanciaszabályozót (Cftr), 4. gént tartalmazó páros boxot (Pax4), OB-t és karboxi-peptidáz A-t (Cpa) (Zhang et al., 1994, fent; Friedman et al., 1991, fent). Az egérben genetikai térképezést alkalmaztunk annak kimutatására, hogy Pax4 szorosan kapcsolódik 05-hez (Walther et al., 1991, fent; Zhang et al., 1994, fent). A fizikai távolságot OB és Pax4 között körülbelül 1 Mb-nak találtuk (Zhang et al., 1994, fent). Ezekre az összehasonlító térképezési vizsgálatokra alapozva azt vártuk, hogy a humán OB gén Pax4 és CPA között fog elhelyezkedni a humán 7q kromoszómán. Továbbá, mivel humán CFTR-t [Heng et al., Cell Génét. 62, 108-109 (1993)] és Pox4-et [Tamura et al., Cytogenet. Cell Génét. 66, 132-134 (1994)] fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) egyenként a 7q31,3 és 7q32 helyekre térképeztük, a humán 05 gén legvalószínűbb citogenetikai helyzete a 7q31,3-7q32 határ tájékán lenne. Az OB gén térképezése a humán 7. kromoszómán
A humán 05 gén 3’ nem transziáit régiójának kis szegmensét amplifikáló STS-t (sWSS2619) használtunk összegyűjtött, humán 7. kromoszóma DNS-re feldúsított YAC-klónok screenelésére [Green et al., Genomics 25, 170-183 (1995)], és 9 YAC-t (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 és yWSS5004) azonosítottunk. Annak igazolására, hogy ezek az YAC-k tartalmazzák az autentikus humán 05 gént, két további kísérletet végeztünk. Először, az YAC-k mindegyikét egy második humán Oő-specifikus PCR assay-vel teszteltük, és mindegyiket pozitívnak találtuk (adatokat nem mutatunk). Másodszor, mindegyik klónból élesztő-DNS-t emésztettünk £coRI-gyel és analizáltuk géltranszfer-hibridizációval, humán 05 cDNS-származék-próbát alkalmazva. Minden esetben egyedüli hibridizációs sáv volt látható; és ez a sáv azonos méretű volt YAC-kben és Pl kiónban, amelyről ismert, hogy tartalmazza a humán 05 gént (adatokat nem mutatunk).
A SEGMAP számítógépes programot használva (Green et al., 1991, fent) és egyéb YAC-n alapuló STStartalom-adatokat, amelyeket a 7. kromoszómára hoztunk létre (Green et al., 1991, fent; Green et al., 1994, fent; Green et al., 1995, fent) a humán 05 gént megtaláltuk a 35. ábrán bemutatott YAC összefüggő szerkezeten belül. Specifikusan ez az összefüggő szerkezet 43 egymást átfedő YAC-ből és 19 egyedülállóan rendezett STS-ből áll. A 19 STS mindegyikéről részleteket nyújtunk a 3. táblázatban. Az 05-specifikus STS-en felül az összefüggő szerkezet szintén tartalmaz a humán Pax4 génre specifikus STS-t (sWSS808) [Tamura et al., 1994, fent; Stapleton et al., Natúré Génét. 3, 292-298 (1993)], a 7. kromoszómára specifikus YAC-kből származó 7 STS-t, a 7. kromoszómára specifikus lambdaklónból származó 2 STS-t és fontos, 8 mikroszatellitspecifikus STS-t. További részleteket erről a 8 genetikai markenői, beleértve a genotípus-analízishez használt primerek szekvenciáit, a 4. táblázatban nyújtunk. Érdemes megjegyezni, redundáns YAC-n alapuló összekapcsolódás van az összefüggő szerkezet mentén (azaz 2 vagy több YAC kapcsolódik minden szomszédos STS-párral), erős támasztékot kölcsönözve a 35. ábrán bemutatott STS relatív sorrendnek.
Ahogyan a 35. ábrán bemutatjuk, a humán 05 gént tartalmazó YAC összefüggő szerkezet előre jelzett orientációja olyan, hogy sWSS1734 a centromer-fő STS (azaz CFTR-hez legközelebb eső), míg sWSS2367 a telomer-fő STS (azaz CPA-hoz legközelebb eső). Ez az orientáció túlnyomórészt összehasonlító térképezési adatokon alapul, amely Pux4-et proximálisan és OB-t disztálisan helyezi el az egér- és humán DNS-ben jelen levő szintetikus blokkon belül (Zhang et al., 1994, fent). Az 05 gén az összefüggő szerkezet telomer végének közelében helyezkedik el az 05-specifikus STS (sWSS2619) elhelyezkedésére alapozva.
Míg a 35. ábrán bemutatott összefüggő szerkezetet SEGMAP alkalmazásával az YAC-méretekre való tekintet nélkül vezettük le (ezért vannak az STS-ek egyenlő távolságra egymástól), az adatok hasonló analízise SEGMAP-pel, amely számolt az YAC-méretekkel, azt jelezte, hogy az összefüggő szerkezet által lefedett régió teljes mérete éppen 2 Mb fölött van (adatokat nem mutatunk). Tehát amíg mind a 8 mikroszatellitspecifikus STS (4. táblázat) a durván 2 Mb-pt átfogó genomiális térközben található, az összefüggő szerkezet telomer végéhez legközelebbi három (sWSS1392, sWSS1148 és sWSS2367) különösen közel van magához az 05 génhez (talán körülbelül 500 kb kis távolságon belül). Valójában mindhárom utóbbi STS jelen van a humán OB-t tartalmazó YAC-k legalább egyikében. Érdemes megjegyezni, hogy a humán Pax4 (sWSS808) és 05 (sWSS2619) közötti távolságot körülbelüli 400 kb-ra becsüljük, míg ezt a régiót átfogóan körülbelül 1 Mb-ra jelezték előre egérben (Zhang et al., 1994, fent). Végül, az összefüggő szerkezeten belüli 3 YAC-t (yWSS691, yWSS999 és yWSS2935) FISH-módszerrel analizáltuk, és mindegyiknél azt találtuk, hogy kizárólag 7q31,3-mai hibridizál. Ezeknek az YAC-knek egyike (yWSS691) az OB-specifikus STS-t, míg a másik két klón a Pax4-specifikus STS-t tartalmazza. Az utóbbi eredmények általánosan egyeznek a humán Pax4 korábbi 7q32-re történő citogenetikai kijelölésével (Tamura et al., 1994, fent). Ezekre az adatokra alapozva a humán 05 gén helye a 7q31,3 citogenetikus sávban jelölhető ki.
11. példa: Humán OB polipeptid egerekben biológiailag aktív ob/ob egérből álló csoportokat kezeltünk rekombináns (bakteriális) humán és rágcsáló 05 polipeptid
HU 223 563 Β1 vagy sóoldat 10 pg/g napi ip. injekciójával. Négy nap után a sóoldatot kapott csoport 0,3 g-ot gyarapodott. A rágcsáló OB-t kapott csoport 3,2 g-ot fogyott. A humán OB-t kapott csoport 2 g-ot veszített (p <0,01 a sóoldatos kontrolihoz viszonyítva). Ezeket a csoportokat élelemfelvételre is teszteltük. Az élelemfelvételre vonatkozó adatokat az 5. táblázatban mutatjuk be; a testtömegre vonatkozó adatok a 6. táblázatban láthatók.
5. táblázat
Kezelt ob/ob egerek élelemfelvétele naponta (g) (érték±sd.)
Kezelés 0. nap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 5. nap 6. nap 7. nap
Sóoldat 13,4±2,6 12,8 12,8 13,1 14,0 12,3 12,4 8,3
Rágcsáló OB 14,9 3,7 4,4 5,1 8,9 8,1 8,7 3,5
Humán OB 14,3 10,3 8,7 7,0 8,9 5,3 3,8 13,0
6. táblázat
Testtömeg és testtömegváltozás kezelt ob/ob egerekben (érték±sd.)
Kezelés Testtömeg (0. nap) Testtömeg (4. nap) % változás (0-4. nap) Testtömeg (6. nap) % változás (0-6. nap)
Sóoldat 39,9±1,8 40,7±l,6 0,8±0,5 41,1 ±2,2 1,2±1,1
Rágcsáló CB 39,5±2,1 36,2±2,0 —3,3±1,2 36,3 ±2,2 —3,I±I,2
Humán OB 39,5±2,0 37,6±1,7 -2,0±l,0 36,1±1,3 -3,5±1,3
Ezek az adatok szemléltetik, hogy humán OB bioló- Vad típusú egereket (C57B16J +/?) kezeltünk regiailag aktív egerekben. 25 kombináns rágcsáló OB 10 pg/g/nap ip. injekcióival, és minden negyedik napon megmértük a testtömeget. Az
12. példa: Nagy dózisú OB befolyásolja a vad eredményeket a 7. táblázatban adjuk közre.
típusú egereket
7. táblázat
OB-t kapott normálegerek testtömege (g)
Kezelés 0. nap 4. nap 8. nap 12. nap === 16. nap
Sóoldat 22,6±1,4 22,2 ±1,2 22,5 ±1,3 23 22,5
Rágcsáló OB 22,4±1,5 20,6±l,5 20,8±l,3 20,8 21,8 |
Ezek az adatok szemléltetik, hogy OB ugyanúgy befolyásolja vad típusú egerek testtömegét, mint az elhízottakét (ob/ob), jóllehet sokkal kisebb mértékben.
13. példa: OB polipeptid beadása folyamatos pumpás infúzióval
Ez a példa szemlélteti, hogy OB polipeptid folyamatos infúziója normálegerekben tömegvesztést eredményez. Normál- (nem elhízott) egereknek adtunk be 45 rágcsáló OB polipeptidet ozmotikus pumpás infúzióval. 0,5 mg fehérje/kg testtömeg/nap adagolás 4,62% (±1,34%) fogyást eredményezett az alapvonaltömeghez képest az infúzió 6. napjára.
Anyagok és módszerek
Vad típusú (+/+) C57B16 egereket használtunk ebben a kísérletben. Az egereket egyedül és kíméletes körülmények között tartottuk. Az egerek életkora a kezdeti időpontban 8 hét volt, és az állatok stabilizálódott tömeggel rendelkeztek. Minden csoportban (hordozó, fehérjével szemben) tíz egeret alkalmaztunk.
Etetés és tömegmérés
Az egereknek alap-rágcsálóeledelt (PMI Feeds,
Inc.) adtunk por alakú élelemhez való etetőben 60 (Allentown Caging and Equipment), amely az élelemfelvétel pontosabb és érzékenyebb mérését tette lehetővé, mint szabályos blokketetés alkalmazása. A tömeget 40 mindennap ugyanabban az időben mértük (délután 2kor) 6 napon keresztül. Az infúzió előtti napon mért testtömeget definiáltuk alapvonaltömegként.
Rágcsáló OB DNS klónozása A rágcsáló OB DNS klónozását E. coliban történő kifejeződéshez a következők szerint végeztük. A közzétett peptidszekvenciából - amelyet Zhang és munkatársai (1994, fent az 1. példában) publikáltak - levezetett DNS-szekvenciát reverz transzlációnak vetettük 50 alá megfelelő E. coli kodonok alkalmazásával. A terminális klónozóhelyek ΑδαΙ-től BamHl-ig terjedtek. Riboszomális kötésfokozót és erős riboszomális kötőhelyet tartalmaztak a kódolórégió előtt. A kettős DNS-szekvenciát standard technikák alkalmazásával 55 szintetizáltuk. A rekombináns fehérje kifejeződésének szemléltetésével megerősítettük a helyes kiónokat és a helyes OB DNS-szekvencia jelenlétét az állandó plazmidban. Az aminosavszekvencia (és DNS-szekvencia) a következő:
HU 223 563 Bl
Rekombináns rágcsáló met OB (kettős szálú) DNS- és aminosavszekvencia (94. és 95. számú szekvenciák)
TCTAGATTTGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT
-+---------+---------+----------+---------+---------+-------AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA
Μ V P I Q K V
TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA
AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT
QDDTKTLIKTIVTRINDISH
CACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA — 3--------------- —
GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT
TQSVSAKQRVTGLDFIPGLH
CCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC — + —---------1-----------1 — — ——-f-~ — — _ —— ______ --------GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG PILSLSKMDQTLAVYQQVLT CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT -+---------+---------+---------3-—--------+---------+-------GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA
SLPSQNVLQIANDLENLRDL
GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA
CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT
LHLLAFSKSCSLPQTSGLQK
ACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT
TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA
PESLDGVLEASLYSTEVVAL
GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG —3------------1------------1-----------)-----------1------------1--------CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC
SRLQGSLQDILQQLDVSPEC
TTAATGGATCC
--1__ —------ - ---AATTACCTAGG
HU 223 563 Bl
Expressziós vektor és gazdaszervezet
A fehérje előállításához használt plazmid-expressziósvektor a pCFM1656 volt (American Type Culture Collection (ATCC), 69576. letéti szám). A fenti DNS-t az Xbal-gyel és Ra/nHI-gyel linearizált pCFM1656 expressziós vektorba ligái tűk, és E. coli FM5 gazdatörzsbe transzformáltuk. Az E. coli FM5 sejtek az Amgen Inc.-tól (Thousand Oaks, CA) E. coli K-12 törzsből származtak [Bachmann et al., Bacteriol. Rév. 40, 116-167 (1976)] és tartalmazták a cl857 integrált lambda-fág represszor gént [Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254, 1517-1579 (1962)]. A vektorelőállítást, sejttranszformációt és kolóniaszelekciót standard módszerek szerint végeztük (például Sambrook et al., 1989, fent). A gazdasejteket LB-tápoldatban szaporítottuk.
A fehérje vagy hordozó beadása
Rekombináns rágcsáló OB polipeptidet használtunk föl a jelen kísérletekhez, általában körülbelül 0,9 mg/ml foszfátpufferes sóoldatban, pH 7,4. A felhasznált aminosavszekvenciát (és DNS-szekvenciát) fentebb tettük közzé. Fehérjét vagy hordozót (foszfátpufferes sóoldat, pH 7,4) adtunk be ozmotikus pumpás infúzióval. Alzet ozmotikus minipumpákat (Alza, Palo Alto, CA; 1007D modell) helyeztünk be sebészetileg minden egyes egérbe, bőr alatti (subcután) zsebbe a lapocka alatti (subscapuláris) területen. A pumpákat 0,5 ml fehérjeoldat/óra adagolásra kalibráltuk, naponta testtömeg-kg-onként 0,5 mg fehérje beadásához. Kontrollállatoknak foszfátpufferes sóoldat (pH 7,4) infúziót adtunk Alzet ozmotikus minipumpán keresztül.
Fermentációs eljárás
A fehérje előállítására háromfázisú, fed-batcheljárásként ismert technikát alkalmaztunk. A tápoldatösszetételeket alább adjuk meg.
Szakaszos tenyésztés (Batch)
Nitrogén- és foszfátforrást sterileztünk (a hőmérsékletnek 35 percig 122 °C-ra történő emelésével, 18-20 psi) a fermentációs edényzetben (Biolafitte, 12 lit. kapacitás). Lehűtéskor szén-, magnézium-, vitamin- és nyomelemfonást adtunk hozzá aszeptikus körülmények között. A fenti, rekombináns rágcsálófehérjét termelő baktérium egy éj szakás tenyészetének (16 órás vagy több) 500 ml-ét adtuk a fermentorba.
I. rátáplálás (Feed 1)
4,0-6,0 OD600 elérésekor a tenyészethez Feed I tápoldatot adtunk. A glükózt limitáló arányban adtuk a növekedési sebesség (μ) kontrollálása céljából. Egy automata ellenőrző rendszert programoztunk (Distributive Control System) a növekedési sebesség 0,15 generáció/óra értéken tartására.
II. rátáplálás (Feed II)
Amikor az OD elérte a 30 értéket, a hőmérsékletet lassan 42 °C-ra emeltük, és a rátáplálást, az alábbiakban leírt Feed ΙΙ-re cseréltük. A fermentációt ezután még 10 órán át folytattuk 2 órás mintavételekkel. 10 óra eltelte után a fermentor tartalmát 20 °C alá hűtöttük le, és a sejteket centrifiigálással kinyertük.
Tápoldat-összetételek Szakaszos tenyésztés:
g/1 élesztőkivonat
5,25 g/1 ammónium-szulfát
3,5 g/1 dikálium-hidrogén-foszfát
4,0 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát
5,0 g/1 glükóz
1,0 g/1 magnézium-szulfát x 7 víz
2,0 ml/1 vitaminoldat
2,0 ml/1 nyomelemoldat
1,0 ml/1 P2000 habzásgátló
I. rátáplálás:
g/1 Bacto-tripton g/1 élesztőkivonat
450 g/1 glükóz
8,75 g/1 magnézium-szulfát x 7 víz ml/1 vitaminoldat ml/1 nyomelemoldat
II. rátáplálás:
200 g/1 Bacto-tripton
100 g/1 élesztőkivonat
110 g/1 glükóz
Vitaminoldat összetétele (Szakaszos tenyésztés, I. rátáplálás): 0,5 g biotint, 0,4 g fólsavat és 4,2 g riboflavint oldottunk föl 450 ml víz és 3 ml 10 M NaOH elegyében, és 500 ml-re töltöttük föl vízzel. 14 g piridoxin-hidrokloridot és 61 g niacint oldottunk 150 ml víz és 50 ml 10 M NaOH keverékében, és 250 ml-re töltöttük föl vízzel. 54 g pantoténsavat oldottunk föl 200 ml vízben, és 250 ml-re egészítettük ki. A három oldatot elegyítettük, és 10 liter össztérfogatra egészítettük ki.
Nyomelemoldat (Szakaszos tenyésztés, I. rátáplálás):
27 g/1 ferri-klorid x 6 víz,
2 g/1 cink-kloridx4 víz
2 g/1 kobalt(II)-klorid x 6 víz
2 g/1 nátrium-molibdenát x 2 víz
1 g/1 kalcium-klorid x 2 víz
1,9 g/1 réz-szulfát x 5 víz
0,5 g/1 bórsav
1,6 g/1 mangán-klorid x 4 víz
73,5 g/1 nátrium-citrát x 2 víz
Rágcsáló OB polipeptid tisztítási folyamata A tisztítást a következő lépésekkel valósítottuk meg (a következő lépéseket ha másképpen nem jelezzük, 4 °C-on végeztük):
1. Sejtmassza. E. coli sejtmasszát szuszpendáltunk 5szörös térfogatú 7 mM EDTA-ban, pH 7,0. Az EDTA-ban levő sejteket tovább roncsoltuk mikrofluidizálón történő kétszeri átvezetéssel. A szétroncsolt sejteket 4,2k rpm mellett Beckman JB-6 centrifugában, J5-4,2 rotorral 1 órán keresztül centrifugáltuk.
2. Zárványtestek 1. mosása. A fenti felülúszót eltávolítottuk és a pelletet 5-szörös térfogatú 7 mM EDTA-ban, pH 7,0 újraszuszpendáltuk és homogenizáltuk. Ezt a keveréket az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáltuk.
HU 223 563 Bl
3. Zárványtestek 2. mosása. A fenti felülúszót eltávolítottuk és a pelletet 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT és 1% dezoxikolát keverékének 10-szeres térfogatában újraszuszpendáltuk és homogenizáltuk. Ezt a keveréket az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáltuk.
4. Zárványtestek 3. mosása. A fenti felülúszót eltávolítottuk és a pelletet 10-szeres térfogatú desztillált vízben újraszuszpendáltuk és homogenizáltuk. Ezt a keveréket az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáltuk.
5. Újrahajtogatás. A pelletet 15 térfogat 10 mM HEPES pH 8,5, 1% nátrium-szarkozin (N-lauril-szarkozin) keverékével szobahőmérsékleten újrahajtogattuk. 60 perc után az oldatot réz-szulfátra nézve 60 mM-ra készítettük el, és azután egy éjszakán át kevertettük.
6. Szarkozin eltávolítása. Az újrahajtogatásra használt oldatot 5 térfogat 10 mM Tris-pufferrel (pH 7,5) hígítottuk, és az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük és rázogatással 20-50 szem, klorid formában levő Dowex 1-X4 gyantával (a hígított újrahajtogató keverék teljes térfogatának 0,066%-án) kevertük 1 órán keresztül. Ezt a keveréket oszlopra öntöttük és összegyűjtöttük az eluátumot. A szarkozin eltávolítását HPLC-vel állapítottuk meg.
7. Savas kicsapás. Az előző lépés eluátumát összegyűjtöttük és a pH-t 5,5-re állítottuk be, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezt a keveréket az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáltuk.
8. Kationcserélő kromatográfia. Az előző lépés felülúszójának pH-ját 4,2-re állítottuk és CM Sepharose gyors áramlású (Fást Flow) oszlopra töltöttük fel. 20 oszloptérfogat sógradienst alkalmaztunk, 20 mM NaOAc-ban (pH 4,2) 0-10 M NaCl-dal.
9. HlC-kromatográfia. A fenti lépésből a CM Sepharose csúcsfrakciók (UV-analízissel megállapított) összességét ammónium-szulfátra nézve 0,2 M-ra állítottuk be. 20 oszloptérfogat fordított (reverz) sógradienst végeztünk 5 mM NaOAc-ban (pH 4,2) 0,4-0 M ammónium-szulfáttal. Ezt az anyagot koncentráltuk és PBS-be diaszűrtük.
Eredmények
Az alábbiakban bemutatjuk a C57B16J egerek (8 hetes) tömegének az alapvonaltömegtől való %-os eltérését:
8. táblázat
Tömegvesztés folyamatos infúzió hatására
Idő (napok) Hordozó (PBS) Rekombináns OB polipeptid
1-2. 3,24±1,13 1,68±1,4
3-4. 4,3 ±0,97 -2,12±0,79
5-6. 4,64±0,96 -4,62±1,3
Ahogyan látható, a 6 napos folyamatos infúzió végére az OB polipeptidet kapott állatok testtömegüknek - az alapvonalhoz képest - több mint 4%-át veszítették el. Ez lényegesen gyorsabb tömegvesztés, mint amelyet az intraperitoneális (ip.) injekcióknál figyeltünk meg. Csupán 2,6-3,0% tömegvesztést tapasztaltunk a 32 napos injekciós periódus végén vad típusú (normál) egerekben - amelyek napi ip. injekciók formájában, 10 mg/kg adagban kaptak rekombináns rágcsáló OB polipeptidet - és ez egyszer sem haladta meg a 4%-ot az adagolási menetrend során (adatokat nem mutatunk). Az adatok azt jelzik, hogy folyamatos fúzióval 20-szor alacsonyabb dózissal (0,5 mg/kg a 10 mg/kg adaggal szemben) nagyobb tömegvesztést érünk el rövidebb idő alatt.
Az itt látható eredmények statisztikailag szignifikánsak, például -4,62%-nálp <0,0001.
14. példa: Rekombináns humán OB analóg klónozása és kifejezése
Ez a példa készítményeket és módszereket nyújt az OB polipeptid rekombináns humán változata analógjának elkészítéséhez.
Az OB DNS humán változatát a rágcsáló OB DNSből készítettük el a 13. példában leírtak szerint, az Miül és BamHI helyek közötti régiónak olyan kettős szálú DNS-sel (szintetikus oligonukleotidokból készítve) történő kicserélésével, amelybe 20 kodon szubsztitúciót terveztünk be. Az arginin kodonját az érett egérfehéije
35. helyzetében és leucin kodonját az érett egérfehéije
74. helyzetében nem változtattuk meg. Az Miül helyet a lenti szekvenciában a vonal alatt mutatjuk meg. Ezt a DNS-t vittük be a pCFM1656 vektorba (ATCC 69 576) és ugyanolyan módon fejeztük ki, mint a rekombináns rágcsálófehérjét, a fent leírtak szerint.
HU 223 563 Bl
Rekombináns humán met OB (kettős szálú) DNS és aminosavszekvencia (96. és 97. számú szekvencia)
CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT
------— +-----— — -)-------— 1—-----------1-----------j.
GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAA
MVPIQKVQDDTKTLIKTIV
ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC
TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG
TRINDISHTQSVSSKQRVTG
CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG
GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC
LDFIPGLHPILTLSKMDQTL
GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC
CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG AVYQQILTSMPSRNVLQISN GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG ---------+_,--------+---------+---------+---------+,---------+
CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC
DLENLRDLLHVLAFSKSCHL
CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT
GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA
PWASGLETLDSLGGVLEASG
TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG
ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC
YSTEVVALSRLQGSLQDMLW
CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC
GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG
QLDLSPGC*
HU 223 563 Bl
Fermentáció
A fenti gazdasejtek fermentációját végeztük el rekombináns humán OB polipeptid előállítása céljából, a rekombináns rágcsálóanyag esetében fent leírt körülményeket és készítményeket alkalmazva. Az eredmé- 5 nyékét kielemeztük hozamra (g/1), a rekombináns humán OB anyag előtisztítására (és kis mennyiségben jelen levő bakteriális fehérjére), és összefüggésbe hoztuk a bakteriális kifejeződés analízisével:
9. táblázat
Humán OB polipeptid kifejeződésének analízise
Időpont (óra) OD (600 nm) Hozam (g/1) Kifejeződés (mg/OD χ 1)
2 47 1,91 41
4 79 9,48 120
6 95 13,01 137
8 94 13,24 141
10 98 14,65 149
A 20 oszloptérfogat fordított (reverz) sógradienst 5 mM NaOAc-ban (pH 5,5), 0,2-0 M ammónium-szulfáttal végeztük. Egyébként a fenti lépések azonosak voltak.
75. példa : Adagolásra adott válasz (dose response) vizsgálatok
További vizsgálat megmutatta, hogy az OB fehérje folyamatos beadására adagolási válasz lépett föl. Ebben a vizsgálatban vad típusú egereknek (nem elhízott, 10 35-40 g CD-I egereknek) rekombináns rágcsáló OB fehérjét adtunk be a 12. és 13. példákban alkalmazotthoz hasonló módszerek felhasználásával. Az eredmények a következőképpen alakultak (%-os tömegvesztés az alapvonalhoz képest, a fentiek szerint mérve):
10. táblázat
Adagolásra adott válaszok folyamatos beadásnál
Adag Idő %-os csökkenés a testtömegben
0,03 mg/kg/nap 2 nap 3,5%
1 mg/kg/nap 2 nap 7,5%
1 mg/kg/nap 4 nap 14%
Megjegyzések: az időpontok a fehérjekifejeződés indukciójától számított időt jelentik, a 13. példában a p CFM1656 felhasználásával kifejezett rekombináns rág- 25 csálóanyagnál leírtak szerint; OD=spektrofotometriásán mért optikai denzitás (OD egység/lit.); kifejeződés=mg fehérje/OD egység χ lit.
A rekombináns humán OB polipeptid tisztítása Rekombináns humán fehérje hasonló módszerekkel 30 tisztítható, mint amelyeket a rekombináns rágcsálófehérje tisztításánál használtunk a 13. példában, fent. Rekombináns humán OB polipeptid elkészítéséhez a 8. lépést a 7. lépésből kapott felülúszó pH-jának 5,0-re állításával, és ennek CM Sepharose gyors áramlású oszlop- 35 ra történő felvitelével végeztük. A 20 oszloptérfogat sógradienst 20 mM NaOAc-ban (pH 5,5), 0-0,5 M NaCl-dal végeztük. A 9. lépést úgy végeztük, hogy a CM Sepharose-ról összegyűjtött eluátumot 4-szeresére hígítottuk vízzel és a pH-t 7,5-re állítottuk. Ezt a keveréket állítottuk be ammónium-szulfátra nézve 0,7 M-ra.
Ahogyan az látható, az adag 0,03 mg/kg/nap értékről 1 mg/kg/nap értékre történő növelése a testtömegvesztést 3,5%-ról 7,5%-ra növelte. Az is figyelemre méltó, hogy a 4. napon az 1 mg/kg/nap adag 14%-os csökkenést okozott a testtömegben.
16. példa: Leptin hatásai ob/ob egerek testének összetételére hetes C57BL/6J ob/ob egereket kezeltünk 5 pg/g/nap rágcsálóleptinnel, hordozóval vagy nem kaptak kezelést, 33 napon keresztül. Egy második kísérletben 7 hetes ob/ob egereket kezeltünk 10 pg/g/nap humán leptinnel, rágcsálóleptinnel vagy hordozóval 12 napon keresztül. Az egereket feláldoztuk és értékeltük a teljes testtömeget, testösszetételt, inzulinszintet és 40 glükózszintet. Az ezekből a kísérletekből származó adatokat all. táblázatban tesszük közzé.
77. táblázat
Testtömeg, összetétel, inzulinszint és glükózszint kezelt egerekben
Kezelési csoport 16 hetes egerek, 5 pg/g/nap leptin 7 hetes egerek, 10 pg/g/nap leptin
kezelés rágcsálóleptin hordozó kontroll humán leptin rágcsálóleptin hordozó
Teljes testtömeg 31,90+2,8 64,10+4,5 67,50+6,2 31,00+1,3 33,40+2,4 42,70+1,5
Teljes zsír (g)% 9,10+1,7 28,40+3,4 38,30+4,0 59,70+2,1 40,87+6,1 60,34+3,7
Teljes sovány tömeg (g)% 6,80+1,0 21,30+1,7 7,60+0,4 11,90+1,2 7,73+0,5 11,57+1,6
Teljes víz (g)% 16,00+0,8 50,30+4,2 18,20+0,7 28,40+1,0 18,90+1,0 28,10+2,2
Inzulin (nemz. egység/ml) <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 21,4
Glükóz (mg/dl) 170,0+20,9 337+30,3 317,5+51,0 258,3+26,8 320,0+44,0 789,0+152,1
HU 223 563 Bl
A testösszetétel-adatok mutatják leptinnek a test három elkülönülő részére - zsírtömegre, sovány testtömegre és vízmennyiségre - kifejtett hatását. Az adatok jelzik, hogy leptin szignifikánsan csökkenti a test zsírtömegét, és csekély hatása van a sovány testtömegre. A sovány testtömegre kifejtett hatások azonban statisztikailag nem szignifikánsak.
Az inzulin- és glükózszintek összehasonlítása leptinnel kezelt és kontroll- (kezeletlen) egerekben azt jelzi, hogy leptin csökkenti a vércukor és inzulin szintjét, és ilyenformán javítja a cukorbaj ezen jelzőit.
17. példa: Leptin nagymértékű hatása vad típusú egerekre
Az ob/ob egerek sovány kontrolijait (C57BL/6J +/?) naponta injekcióztuk ip. 10 pg/g rágcsálóleptinnel vagy hordozóval (PBS), és megmértük a testtömeget és élelemfelvételt a következő két hét során. Szignifikáns csökkenés következett be a testtömegben a 4. naptól kezdve és szignifikáns csökkenés az élelemfelvételben az első héten. Egy hét után azonban az élelem10 felvétel szintjei megkülönböztethetetlenné váltak az egerek két csoportja között. Az állatokat a két hét elteltével feláldoztuk, és meghatároztuk test-összetételüket. A testösszetétel-analízis eredményeit a 12. táblázatban mutatjuk be. Az adatok a leptint kapott állatok testzsír15 jában csökkenést mutatnak, ellentétben a PBS-t kapott állatokkal.
12. táblázat
Testösszetétel és testtömeg vad típusú (+/?) egerekben
Csoport C57B1/6J Testtömeg Teljes zsír % Teljes sovány testtömeg % Teljes víz %
Fehéije 1 17,3 0,30 1,71% 5,00 28,93% 12,00 69,36%
2 20,5 2,39 11,65% 5,41 26,40% 12,70 61,95%
3 16,9 0,34 1,99% 4,76 28,19% 11,80 69,82%
4 18,3 0,84 4,62% 5,16 28,17% 12,30 67,21%
5 17,7 0,44 2,51% 4,96 28,00% 12,30 69,49%
6 18,7 2,56 13,72% 4,84 25,86% 11,30 60,43%
7 15,7 0,37 2,38% 4,53 28,83% 10,80 68,79%
8 16,4 0,29 1,79% 4,51 27,48% 11,60 70,73%
9 10 16,5 14,9 0,83 5,05% 4,67 28,29% 11,00 10,40 66,67% 69,80%
Átlagos 17,3 0,93 5,04% 4,87 27,79% 11,62 67,43%
standard eltérés 1,6 0,90 4,52% 0,30 1,05% 0,74 3,52%
Hordozó 11 18,8 1,30 6,93% 5,00 26,58% 12,50 66,49%
12 17,6 2,17 12,34% 4,53 25,73% 10,90 61,93%
13 18,0 2,29 12,74% 4,61 25,59% 11,10 61,67%
14 19,6 3,79 19,34% 4,61 23,52% 11,20 57,14%
15 18,6 2,35 12,65% 4,75 25,52% 11,50 61,83%
16 17,3 1,96 11,32% 4,54 26,25% 10,80 62,43%
17 19,3 1,38 7,12% 5,02 26,04% 12,90 66,84%
18 20,6 4,16 20,19% 4,94 23,98% 11,50 55,83%
19 20 17,7 19,5 1,08 6,13% 4,72 26,64% 11,90 12,30 67,23% 63,08%
Átlagos 18,7 2,28 12,09% 4,75 25,54% 11,66 62,45%
standard eltérés 1,1 1,07 5,08% 0,20 1,10% 0,72 3,83%
Egy második kísérlet rágcsálóleptin 12,5 pg/g napi kétszeri ip. injekciójának hatását mutatja vad típusú C57B1/6J egerekre. Szignifikáns csökkenés következett be a testtömegben és élelemfelvételben a polipeptid napi kétszeri injekciójával összefüggésben. Ehhez a kísérlethez az állatokat metabolikus kamrába helyeztük. Az élelem por alakú Purina 5001 állateledelből állt. Ez a táplálék eltért a korábbi kísérletektől, amelyekben állateledelt, tápiókát és vizet használtunk fel. θθ
Tehát a metabolikus kamrákban felhasznált élelem magasabb kalóriaértékű volt, amely megmagyarázza, miért tér el az elfogyasztott élelem mennyisége azokétól az állatokétól, amelyeket a vizet tartalmazó diétán tartottunk.
A következő felsorolás azokat a referenciákat tartalmazza, amelyek a fenti közleményre és különösen a kísérleti eljárásokra és diszkussziókra vonatkoznak. Bahary et al., Genomics 11, 33-47 (1991),
HU 223 563 Bl
Bahary et al., Genomics 13, 761-769 (1992),
Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991),
Blank et al., Mammalian Genome 1, 51-78 (1991), Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences 630, 100-115 (1991),
Friedman et al., Mammalian Genome 1, 130-144 (1991),
Harris, FASEB J. 4, 3310-3318 (1990),
Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med. 315, 96-100 (1986), Kessey, in Obesity p. 144-166, Stunkard ed., Philadelphia, W. B. Sauders Co. (1980),
Kessey et al., Ann. Rév. Psychol. 37, 109-133.22 (1986),
Leibei et al., „Genetic variadon and nutrition in obesity : Approaches to the molecular genetics of obesity”, in: Genetic Variation and Nutrition p. 90-101.1, Simopoulos and Childs eds., S. Karger, Basel (1990), Siegel et al., Cytogenet. Cell Génét. 61 (3), 184-185 (1992).
Ez a találmány testet ölthet más formákban vagy megvalósítható más utakon anélkül, hogy eltávolodnánk ennek szellemétől vagy lényegi jellemzőitől. A jelen közzététel ilyenformán minden vonatkozásában szemléltetőnek és nem korlátozónak tekintendő, a találmány oltalmi körét a hozzáfűzött igénypontokkal jelez5 zük, és ebben szándékunk szerint benne foglaltatik minden, az egyenértékűség értelmén és határán belül történő változtatás.
Különböző referenciákat idézünk e leírás során, amelyeknek mindegyikét teljes egészében beépítettük ide referenciaként.
Az igénypontokban megfogalmazott találmány összhangban van a fenti leírással, és gyorsan elérhető referenciákkal és kiindulási anyagokkal. Mindazonáltal, 1995. augusztus 9-én a következő letétbe helyezé15 seket tettük az amerikai törzsgyűjteményben (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20 852-1178, USA) a mikroorganizmusok szabadalmi eljárások céljaira történő letétbe helyezésének nemzetközi elismerésén alapuló buda20 pesti egyezmény követelményeinek megfelelően: pETH14 plazmidot tartalmazó E. coli Hl4, letéti szám 69 880; és pETM9 plazmidot tartalmazó E. coli M9, letéti szám 69 879.
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE
AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2793 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (A) LEÍRÁS: rágcsáló ob cDNS (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 57...560 (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA 56
ATG TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG 104
Me t Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu
10 15
HU 223 563 Bl
TCT Ser TAT Tyr GTT Va 1 CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA 152
Gin 20 Al a Va 1 Pro Ile Gin 25 Lys Va 1 Gin As p As p 30 Thr Ly s
ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG 200
Thr Leu Ile 35 Ly s Thr Ile Va 1 Thr 40 Arg Ile Asn Asp Ile 45 Ser Hi s Thr
CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT 248
Gin Ser 50 Val Ser Al a Lys Gin 55 Arg Val Thr Gly Leu 60 As p Phe Ile Pro
GGG CTT CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA 296
Gly 65 Le u Hi s Pro Ile Leu 70 Ser Leu Ser Ly s Me t 75 Asp Gin Thr Leu Al a 80
GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344
Val Tyr Gin Gin Va 1 85 Leu Thr Ser Leu Pro 90 Ser Gin As n Va 1 Leu 95 Gin
ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392
Ile Al a Asn As p 100 Le u Glu Asn Leu Arg 105 Asp Leu Leu Hi s Leu 110 Leu Al a
TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440
Phe Ser Lys 115 Ser Cy s Ser Leu Pro 120 Gin Thr Ser Gly Leu 125 Gin Ly s Pro
GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488
Glu Ser 130 Leu Asp Gly Val Leu 135 Glu Al a Ser Le u Tyr 140 Ser Thr Glu Va 1
GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG 536
Val Al a Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin As p Ile Leu G1 n Gin
145 150 155 160
TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys * 165 588
ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC 648
ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA 708
CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG 768
AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG 828
TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA 888
GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA 948
GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT 1008
TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT CAGGCTTTGG 1068
GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG 1128
CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG 1188
HU 223 563 Β1
TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG 1248
ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA 1308
AGCAGATGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG 1368
TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT 1428
TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG 1488
ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA 1548
AAGCTACAGG CCTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACATTTGA 1608
GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTTGAT 1668
CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA 1728
TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCATTCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT 1788
GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT 1848
GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG 1908
CTTGGGTTTT TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT 1968
GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT 2028
CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG 2088
TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG 2148
GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA 2208
GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TATTGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC 2268
CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA 2328
TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTG GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA 2388
TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA CATGAAGTTC 2448
ATTTATATTT CATAATACCG TATAGACACT GCTTGAAGTG TAGTTTTATA CAGTGTTTTA 2508
AATAACGTTG TATGCATGAA AGACGTTTTT ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA 2568
CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT 2628
AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC 2688
TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTTTTGTG 2748
GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC 2793
HU 223 563 Β1
A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 168 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: rágcsáló ob polipeptid (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Cys Trp Arg Pro 5 Leu Cys Arg Phe Leu 10 Trp Leu Trp Ser Tyr 15 Leu
Ser Tyr Val Gin Al a Va 1 Pro I 1 e Gin Lys Val Gin As p As p Thr Ly s
20 25 30
Thr Le u Ile Ly s Thr Ile Va 1 Thr Arg Ile As n As p I 1 e Ser Hi s Thr
35 40 45
Gin Ser Va 1 Ser Alá Ly s Gin Arg Val Thr Gly Leu As p Phe I le Pro
50 55 60
Gly Leu Hi s Pro Ile Leu Ser Le u Ser Lys Me t Asp Gin Thr Leu Al a
65 70 75 80
Val Tyr Gin Gin Va 1 Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin
85 90 95
Ile Al a Asn Asp Leu Glu Asn Le u Arg Asp Le u Leu Hi s Leu Le u Al a
100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cy s Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Le u Gin Lys Pro
115 120 125
Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Gl u Al a Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val
130 135 140
Val Al a Le u Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin As p I 1 e Leu Gin Gin
145 150 155 160
Leu Asp Va 1 Ser Pro Glu Cys *
165
A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 700bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (A) LEÍRÁS: humán ob cDNS, ahol N bármely nukleotidot jelenthet (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Β1 (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 46...546 (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG 5 4
Me t H i s T r p 1
GGA Gly ACC Thr 5 CTG TGC GGA TTC Phe TTG Leu 10 TGG Trp CTT Leu TGG Trp CCC Pr o TAT Tyr 15 CTT Leu TTC Phe TAT Tyr GTC Val 102
Leu Cy s Gly
CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 150
Gin 20 Alá Val Pro I le Gin 25 Ly s Va 1 Gin As p As p 30 Thr Ly s Thr Leu I le 35
AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC 198
Ly s Thr I le Val Thr 40 Arg I le As n As p I le 45 Ser Hi s Thr Gin Ser 50 Val
TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC 246
Ser Ser Ly s Gin 55 Ly s Va 1 Thr Gly Le u 60 As p Phe I le Pro Gly 65 Leu Hi s
ccc ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA 294
Pro I le Leu 70 Thr Leu Ser Ly s Me t 75 Asp Gin Thr Leu Al a 80 Va 1 Tyr G1 n
CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 342
Gin I le 85 Leu Thr Ser Me t Pro 90 Ser Arg As n Va 1 I le 95 G1 n I le Ser As n
GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG 390
Asp 100 Leu Glu As n Leu Arg 105 As p Leu Le u Hi s Val 110 Leu Al a Phe Ser Ly s 115
AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG 438
Ser Cy s Hi s Leu Pro 120 Trp Al a Ser Gly Leu 125 Glu Thr Leu Asp Ser 130 Leu
GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 486
Gly Gly Va 1 Leu 135 Glu Al a Ser Gly Tyr 140 Ser Thr G1 u Va 1 Va 1 145 Al a Leu
AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 534
Ser Arg Leu 150 Gin Gly Ser Leu Gin 155 As p Me t Leu Trp Gin 160 Leu As p Leu
AGC CCT GGG TGC TGAGGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT 585
Ser Pro Gly Cys
165
TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC 645
CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG 700
HU 223 563 Bl
A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 167 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: humán ob polipeptid (vi) EREDETI FORRÁS: humán (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Hi s Trp Gly Thr 5 Leu Cy s Gly Phe Leu 10 Trp Leu Trp Pro Tyr 15 Leu
Phe Tyr Va 1 Gin Al a Val Pro Ile Gin Ly s Va 1 Gin As p As p Thr Ly s
20 25 30
Thr Leu Ile Ly s Thr Ile Val Thr Arg Ile As n Asp I 1 e Ser Hi s Thr
35 40 45
Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Ly s Val Thr Gly Leu As p Phe I 1 e Pro
50 55 60
Gly Leu Hi s Pro Ile Leu Thr Leu Ser Ly s Me t Asp Gin Thr Leu Al a
65 70 75 80
Va 1 Tyr Gin Gin I 1 e Leu Thr Ser Me t Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin
85 90 95
Ile Ser Asn As p Leu Glu Asn Le u Arg As p Leu Leu Hi s Va 1 Leu Alá
100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cy s Hi s Leu Pro Trp Al a Ser Gly Leu Glu Thr Leu
115 120 125
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Al a Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Va 1
130 135 140
Val Al a Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin As p Me t Le u Trp Gin
145 150 155 160
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165
AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 166 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: rágcsáló ob polipeptid, amelyből a 49. helyzetben hiányzik a Gin (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló
HU 223 563 Β1 (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Cy s Trp Arg Pro 5 Leu Cy s Arg Phe Leu 10 Trp Leu Trp Ser Tyr 15 Leu
Ser Tyr Val Gin Al a Val Pro Ile Gin Ly s Va 1 Gin As p Asp Thr Lys
20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile As n As p Ile Ser Hi s Thr
35 40 45
Ser Va 1 Ser Al a Ly s Gin Arg Va 1 Thr Gly Le u Asp Phe 11 e Pro Gly
50 55 60
Leu Hi s Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Me t Asp Gin Thr Leu Al a Val
65 70 75 80
Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin I 1 e
85 90 95
Al a Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg As p Leu Leu Hi s Leu Leu Al a Phe
100 105 110
Ser Ly s Ser Cy s Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Ly s Pro Glu
115 120 125
Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Al a Ser Leu Tyr Ser Thr G1 u Va 1 Va 1
130 135 140
Al a Leu Ser Arg Le u Gin Gly Ser Leu Gin As p Ile Leu Gin Gin Leu
145 150 155 160
As p Va 1 Ser Pro Glu Cy s
165
A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 167 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) Leírás: humán ob polipeptid, amelyből 49. helyzetben hiányzik a Gin (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Hi s Trp Gly Thr 5 Leu Cy s Gly Phe Leu 10 Trp Leu Trp Pro Tyr 15 Leu
Phe Tyr Val Gin 20 Al a Va 1 Pro Ile Gin 25 Ly s Va 1 Gin As p As p 30 Thr Ly s
Thr Leu Ile 35 Ly s Thr Ile Val Thr 40 Arg Ile Asn Asp Ile 45 Ser Hi s Thr
HU 223 563 Β1
Ser Va 1 50 Ser Ser Ly s Gin Ly s 55 Val Thr Gly Leu As p 60 Phe Ile Pro Gly
Leu 65 Hi s Pro Ile Leu Thr 70 Leu Ser Ly s Me t As p 75 Gin Thr Leu Alá Val 80
Tyr Gin Gin Ile Leu 85 Thr Ser Me t Pro Ser 90 Arg Asn Val Ile Gin 95 Ile
Ser Asn Asp Leu 100 Glu Asn Leu Arg Asp 105 Leu Leu Hi s Va 1 Leu 110 Alá Phe
Ser Ly s Ser 115 Cys Hi s Leu Pro Trp 120 Al a Ser Gly Leu Glu 125 Thr Leu Asp
Ser Le u 130 Gly Gly Val Le u Glu 135 Al a Ser Gly Tyr Ser 140 Thr Glu Val Val
Al a 145 Leu Ser Arg Leu Gin 150 Gly Ser Leu Gin As p 155 Me t Leu Trp Gin Leu 160
As p Leu Ser Pro Gly Cys
165
A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 175 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (A) LEÍRÁS: 2G7 exon (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC
NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG
ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG
120
175
A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 5 ’ primer a 2G7 exonhoz
HU 223 563 Bl (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAGGGCAGG AAAATGTG 18
A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 3’ primer a 2G7 exonhoz (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 22
A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (A) LEÍRÁS: vélt (putativ) N-terminális szignálpeptid (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 15 10 15
Ser Tyr Val Gin Alá Val Pro 20
A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 287 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: cirkuláris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (plazmid) (A) LEÍRÁS : pET-15b expressziós vektor (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: T7 promoter (B) HELYZET: 20...37 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: lac operátor (B) HELYZET: 39...64 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 108...243 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: His-Tag (B) HELYZET: 123...137 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: trombin hasítási hely (B) HELYZET: 184...196 (xi) All. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA 60
TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC 116
Me t Gly Ser
AGC CAT CAT CAT CAT Hi s CAT Hi s CAC Hi s 10 AGC AGC GGC Gly CTG Leu GTG Val 15 CCG Pro CGC Arg GGC Gly AGC Ser 164
Ser Hi s 5 Hi s Hi s Ser Ser
CAT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG 212
Hi s Me t Leu Glu As p Pro Al a Al a Asn Ly s Al a Arg Ly s Glu Al a Glu
20 25 30 35
TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT 263
Le u Al a Al a Al a Thr Al a Glu Gin *
AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG 287
A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 45 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15
HU 223 563 Bl
Arg G1 y Ser Hi s 20 Me t Leu Glu Asp Pro 25 Al a Alá Asn Lys Alá Arg Lys 30
Glu Al a Glu Leu Al a Al a Al a Thr Al a Glu Gin
35 40
A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: rágcsáló 5’ primer (iii) FELTÉTELEZETT : nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC 32
A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: rágcsáló 3’ primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC 32
A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: humán 5’ primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem
HU 223 563 B1 (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32
A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: humán 3 ’ primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA 32
A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (A) LEÍRÁS: betoldásfogadó hely (splice acceptor site) ob-ban (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: betoldásfogadó hely (splice acceptor site) (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCAGTCGGT A 11
A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (A) LEÍRÁS: ob peptidfragmentum
HU 223 563 Bl (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (A) LEÍRÁS: ob peptidfragmentum (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (A) LEÍRÁS: ob peptidfragmentum (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Leu Asp
HU 223 563 Bl
A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (A) LEÍRÁS: ob peptidffagmentum (v) FRAGMENTUM TÍPUS: karboxiterminális (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val 15 10 15
Ser Pro Glu Cys 20
A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 414 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (A) LEÍRÁS: a humán ob génnek az első exontól az átírással ellentétes irányban (5’-felé) eső nemkódoló szekvenciát, az első exont kódolószekvenciát és az első intron 5’ régióját tartalmazó része (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 38...181 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: az első intron 5’ régiója (B) HELYZET: 182...414 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: a humán ob gén 5’ nemkódoló szekvenciája, amelyből a HOB lgF DNS-primert generáltuk (B) HELYZET: 11...28 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: a humán ob gén intronszekvenciája, amelyből a HOB IgR prímért generáltuk (B) HELYZET: 241...260
HU 223 563 Bl (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 5 5 Met His Trp Gly Thr Leu
5
TGC GGA TTC TTG TGG Trp CTT Leu TGG Trp CCC TAT CTT Leu TTC Phe TAT Tyr GTC Va 1 CAA GCT GTG Va 1
Cy s Gly Phe Leu 10 Pro Tyr 15 Gin 20 Al a
CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT
Pro Ile Gin Lys Va 1 Gin As p As p Thr Ly s Thr Leu Ile Ly s Thr Ile
25 30 35
GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG ' TATGCGGGGA
Val Thr Arg Ile Asn As p Ile Ser Hi s Thr
45
CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261
AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321
TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381
GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414
A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 48 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: a humán ob proteinnek az első exon által kódolt N-terminális része (xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Hi s Trp Gly Thr 5 Leu Cy s Gly Phe Leu 10 Trp Leu Trp Pr o Tyr 15 Leu
Phe Tyr Va I Gin Alá Val Pro I 1 e Gin Ly s Va 1 Gin Asp As p Thr Ly s
20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Va 1 Thr Arg Ile As n As p Ile Ser Hi s Thr
35 40 45
A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 801 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (A) LEÍRÁS: a humán ob génnek az első intron 3’ régióját, a második exont kódoló szekvenciát és a 3’ nemkódoló szekvenciát tartalmazó része
HU 223 563 Β1 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 291...648 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: az első intron 3’ része (B) HELYZET: 1...290 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: humán ob gén (HOB) intronszekvenciája, amelyből a HOB 2gF prímért generáltuk (B) HELYZET: 250...269 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: a humán ob gén (HOB) 3’ nemkódoló szekvenciája, amelyből a HOB 2gR DNS-primert generáltuk (B) HELYZET: 707...728 (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT 60
GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120
CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180
AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240
CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA Gin Ser 296
GTC Va 1 TCC Ser TCC AAA CAG G1 n AAA Ly s GTC Va 1 ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC 344
Ser 5 Ly s Thr 10 Gly Leu As p Phe I le 15 Pro Gly Leu
CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC 392
Hi s Pro I le Leu Thr Leu Ser Ly s Me t As p Gin Thr Leu Al a Val Tyr
20 25 30
CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC 440
Gin Gin I le Leu Thr Ser Me t Pro Ser Arg Asn Val I le Gin I le Ser
35 40 45 50
AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT 488
Asn As p Leu Glu Asn Leu Arg As p Leu Leu Hi s Val Leu Al a Phe Ser
55 60 65
AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC 536
Ly s Ser Cy s Hi s Leu Pro Trp Al a Ser Gly Leu Glu Thr Leu As p Ser
70 75 80
HU 223 563 Bl
CTG GGG GGT Gly 85 GTC Va 1 CTG Leu GAA GCT TCA GGC TAC Tyr TCC Ser ACA Thr GAG Glu 95 GTG Val GTG Val GCC Al a 584
Leu Gly Glu Al a Ser 90 Gly
CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632
Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin As p Me t Leu Trp Gin Leu Asp
100 105 110
CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA 688
Leu Ser Pro Gly Cys
115
GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC 748
TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801
A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 119 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: a humán ob proteinnek a második exon által kódolt C-terminális része (xi) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Ser Val Ser Ser Ly s Gin Ly s Val Thr Gly Leu As p Phe Ile Pr 0
1 5 10 15
Gly Leu Hi s Pro Ile Leu Thr Leu Ser Ly s Me t As p Gin Thr Leu Al a
20 25 30
Va 1 Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Me t Pro Ser Arg Asn Va 1 Ile G1 n
35 40 45
Ile Ser Asn As p Leu Glu Asn Leu Arg As p Leu Leu Hi s Va 1 Leu Al a
50 55 60
Phe Ser Ly s Ser Cy s Hi s Leu Pro Trp Alá Ser Gly Leu Glu Thr Le u
65 70 75 8 0
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Al a Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Va 1
85 90 95
Val Al a Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Le u Gin As p Me t Leu Trp G1 n
100 105 110
Leu As p Leu Ser Pro Gly Cys
115
A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen
HU 223 563 Bl (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: pichiaélesztő (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Glu Lys Arg Glu Alá Glu Alá 1 5
A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: pichia élesztő (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu Alá Glu Alá
A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENTUM TÍPUS: belső (internál) (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: pichia élesztő (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Glu Lys Arg 1
A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 223 563 Β1 (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: a humán ob gén (HOB) 5’ nemkódoló szekvenciájából generált HOB lgF DNS-primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCAAGAAGC CCATCCTG 18
A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: a humán ob gén (HOB) első intronszekvenciájából generált HOB IgR DNS-primer (iii) FELTÉTELEZETT : nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACTATCTGG GTCCAGTGCC 20
A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: a humán ob gén (HOB) első intronszekvenciájából generált HOB 2gF DNS-primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCACATGCTG AGCACTTGTT 20
A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 223 563 Bl (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: a humán ob gén (HOB) 3’ nemkódoló szekvenciájából generált HOB 2gR DNS-primer (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTCAATCCT GGAGATACCT GG 22
A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 51 bázispár (B) TÍPUS : nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: cirkuláris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (A) LEÍRÁS: pPIC.9 klónozóhely (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G 51
A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 40 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 5’ primer a humán ob cDNS-szekvencia amplifikálásához (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG 40
A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 223 563 Bl (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 3’ primer a humán ob cDNS-szekvencia amplifikálásához (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C 31
A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 40 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 5’ primer rágcsáló ob cDNS-szekvencia amplifikálásához (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (xi) A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40
A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) PCR 3’ primer rágcsáló ob cDNS-szekvencia amplifikálásához (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C 31
A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 223 563 Bl (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: renaturált rágcsáló ob protein N-terminálisán trombinhasítás után levő tetrapeptid (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Ser His Met
A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1734 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAAGACAAAT GAGATAAGG 19
A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1734 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGAGTTACAG CTTTACAG 18
HU 223 563 Β1
A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS494 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAAACACCT TTCCATTCC 1 9
A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS494 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC 22
A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS883 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20
A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS883 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20
A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS : szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2359 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGTGTTGTGT TTCTCCTG 1 8
HU 223 563 Β1
A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2359 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAGGGGATG TGATAAGTG 1 9
A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2336 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTGTTACGT TTAGTTAC 1 8
A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2336 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGAATAATGA GAGAAGATTG 20
A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1218 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCTCAACTGA CAGAAAAC 18
AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS 1218 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACTATGTAA AAGAAATGCC 20
HU 223 563 Β1
AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1402 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAGGGCTTC TAATCTAC 18
AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1402 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCTTCCAACT TCTTTGAC 1 8
AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS999 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TAAACCCCCT TTCTGTTC 1 8
AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS999 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET : humán (xi) AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGCATAATA GTCACACCC 19
AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 22bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSSl 751 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG 22
HU 223 563 Β1
AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSSl751 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAACCGAAGT TCAGATACAG 20
AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSSl 174 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATATCTGAC ATTGGCAC 18
AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSSl 174 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTAGACCTGA GAAAAGAG 18
AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS : DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2061 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS :
(A) SZERVEZET: humán (xi) AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTTGCACAAT ACAAAATCC 19
A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2061 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTCCATTAG TGTCTTATAG 2 0
HU 223 563 Β1
A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2588 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATCACTACAC ACCTAATC 18
A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS : szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2588 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATTCTACA TTTCCACC 18
A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS808 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Β1 (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA 24
A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS808 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC 23
A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS : DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1392 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCAGGTATG TCTTTATC 18
HU 223 563 Bl
A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1392 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGTCTCTGCA TTCTTTTC 18
A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS 1148 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACACATACA AACACAAG 18
A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSSl 148 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTGAGTTGA GTGTAGTAG 19
A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1529 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGGATTTC TAATTGTC 18
A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS1529 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAAGATGGA GGCTTTTG 18
HU 223 563 Bl
A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifíkus PCR-primer sWSS2619 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET : humán (xi) A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G 21
A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifíkus PCR-primer sWSS2619 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA 20
A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ : 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS404 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
HU 223 563 Β1 (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACCAGGGTCA ATACAAAG 18
A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS404 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TAATGTGTCC TTCTTGCC 1 8
A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2367 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAATCCTGGC TTCATTTG 1 8
HU 223 563 Bl
A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: szekvenciatoldalék helyspecifikus PCR-primer sWSS2367 (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGGTGGGTA GGATGCTA 18
A 77. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: UT528 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 77. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20
A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: UT528 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
100
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20
A 79. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFMa065zg9 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 79. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT 20
A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFMa065zg9 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTCAGCAGC ACTGTGATT 19
101
HU 223 563 Β1
A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS : DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFMal25whl marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCACCTTGAG ATTCCATCC 19
A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A)LEÍRÁS: AFMal25whl marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACACCGTGG TCTTATCAAA 20
A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM309yfl0 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
102
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCCAAGTT GGCAGTTTTT 20
A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A)LEÍRÁS: AFM309yfl0marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGATGCTGAA TTCCCAGACA 20
A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM218xflO marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGGGCAACAC AGCAAA 1 6
103
HU 223 563 Bl
A 86. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM218xfl0 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 86. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCAGTTAGT GCCAATGTCA 20
A 87. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM206xc 1 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 87. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAGGCCATG TGGAAC 1 6
A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A)LEÍRÁS: AFM206xcl marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
104
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT 20
A 89. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM199xhl2 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 89. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTGATTGCT GGCTGC 1 6
A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 17 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFM199xhl2 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCGTGTGT ATGTGAG 17
105
HU 223 563 Bl
A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFMa345wc9 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTCTTGGC AAACTCACAT 20
A 92. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: AFMa345wc9 marker (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (xi) A 92. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCCTAAGGGA ATGAGACACA 20
A 93. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (primer) (A) LEÍRÁS: primer az egér Pax4 génhez (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem
106
HU 223 563 Bl (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (xi) A 93. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG 24
A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 491 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (A) LEÍRÁS: rekombináns rágcsáló met ob (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: rágcsáló (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 41...478 (xi) A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG Gin 5 55
Me t 1 Val Pro Ile
AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT 103
Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Va 1 Thr Arg
10 15 20
ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GTT 151
Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser Alá Ly s G1 n Arg Va 1
25 30 35
ACC GGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC TTG TCC 199
Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser
40 45 50
AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG 247
Lys Met Asp Gin Thr Leu Alá Val Tyr Gin Gin Va1 Leu Thr Ser Leu
55 60 65
CCG TCC CAG AAC GTT CTT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC 295
Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile Alá Asn Asp Leu Glu As n Leu Arg
70 75 80 85
GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343
Asp Leu Leu His Leu Leu Alá Phe Ser Lys Ser Cys Ser Le u Pro Gin
90 95 100
107
HU 223 563 Β1
ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA Pro Glu TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA Glu GCA Al a 391
Thr Ser Gly Leu 105 Gin Ly s Ser 110 Leu As p Gly Val Le u 115
TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439
Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Va 1 Va 1 Al a Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser
120 125 130
CTT CAG GAC ATC CTT CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG GAA TGT TAATGGA 488
Leu Gin Asp I le Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser Pro G1 u Cy s
135 140 145
491
TCC
A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: protein
(A) LEÍRÁS: rekombináns rágcsáló met ob protein
(xi) A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Val Pro I le Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu I le Lys
15 10 15
Thr I le Val Thr Arg I le Asn Asp I le Ser His Thr Gin Ser Val Ser
20 25 30
Alá Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe I le Pro Gly Leu His Pro
35 40 45
I le Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Alá Val Tyr Gin Gin
50 55 60
Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin I le Alá Asn Asp
65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Alá Phe Ser Lys Ser
85 90 95
Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp
100 105 110
Gly Val Leu Glu Alá Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Alá Leu Ser
115 120 125
Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp I le Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser
130 135 140
Pro Glu Cys
145
108
HU 223 563 Β1
A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 454 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (A) LEÍRÁS: rekombináns humán met ob (iii) FELTÉTELEZETT: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: humán (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 4...444 (xi) A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAT ATG Me t 1 GTA Va 1 CCG Pro ATC Ile CAG Gin 5 AAA Ly s GTT Va 1 CAG G1 n GAC As p GAC As p 10 ACC Thr AAA Ly s ACC Thr TTA Leu ATT Ile 15 48
AAA ACG ATC GTT ACG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTG 96
Ly s Thr Ile Val Thr 20 Arg Ile Asn Asp Ile 25 Ser Hi s Thr Gin Ser 30 Val
AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC 144
Ser Ser Ly s Gin 35 Arg Val Thr Gly Leu 40 Asp Phe Ile Pro Gly 45 Leu Hi s
CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192
Pro I 1 e Leu 50 Thr Leu Ser Ly s Me t 55 As p Gin Thr Leu Al a 60 Va 1 Tyr Gin
CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC 240
Gin Ile 65 Leu Thr Ser Me t Pro 70 Ser Arg Asn Va 1 Leu 75 Gin I 1 e Ser As n
GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA 288
As p 80 Leu Glu Asn Leu Arg 85 Asp Leu Leu Hi s Va 1 90 Leu Al a Phe Ser Ly s 95
TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336
Ser Cy s His Leu Pro 100 Trp Al a Ser Gly Leu 105 Glu Thr Leu As p Ser 110 Leu
GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG 384
Gly Gly Va 1 Leu 115 Glu Al a Ser Gly Tyr 120 Ser Thr Glu Va 1 Va 1 125 Al a Leu
TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG 432
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin As p Me t Leu Trp Gin Leu Asp Leu
130 135 140
109
HU 223 563 B1
TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC Ser Pro Gly Cys
145
454
A 97. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 147 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (A) LEÍRÁS: rekombináns humán met ob protein (xi) A 97. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Va 1 Pro I le Gin 5 Ly s Va 1 Gin As p As p 10 Thr Ly s Thr Leu I le 15 Ly s
Thr I 1 e Val Thr 20 Arg I le Asn As p I le 25 Ser Hi s Thr Gin Ser 30 Va 1 Ser
Ser Ly s G1 n 35 Arg Va 1 Thr Gly Le u 40 As p Phe I le Pro Gly 45 Leu Hi s Pro
I le Leu 50 Thr Leu Ser Ly s Me t 55 As p Gin Thr Leu Al a 60 Va 1 Tyr Gin Gin
I le 65 Leu Thr Ser Me t Pro 70 Ser Arg Asn Val Leu 75 Gin I le Ser Asn As p 80
Leu Glu Asn Leu Arg 85 As p Leu Leu Hi s Va 1 90 Leu Al a Phe Ser Ly s 95 Ser
Cy s Hi s Leu Pro 100 Trp Al a Ser Gly Leu 105 Glu Thr Leu Asp Ser 110 Leu Gly
Gly Va 1 Leu 115 Glu Al a Ser Gly Ty r 120 Ser Thr Glu Va 1 Val 125 Al a Leu Ser
Arg Le u 130 Gin Gly Ser Leu Gin 135 As p Me t Leu Trp Gin 140 Leu As p Leu Ser
Pro Gly Cys 145
A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENTUM TÍPUS: N-terminális His-tag (xi) A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
110
HU 223 563 Β1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15
Arg Gly Ser His Met 20
A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENTUM TÍPUS: N-terminális His-toldalék (xi) A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15
Arg Gly Ser Pro

Claims (34)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy izolált OB (elhízottság) polipeptid, amely testtömeg modulálására képes emlősökben, és 2. számú, 4. számú, 5. számú vagy 6. számú szekvencia kö- 35 rülbelül 145-167 aminosavából álló aminosavszekvenciát tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti OB polipeptid, amelyhez egy vagy több kémiai csoport kapcsolódik.
  3. 3. Egy OB polipeptidanalóg, amely emlősök testtö- 40 megének modulálására képes, és 83%-ban vagy ennél nagyobb mértékben homológ a 4. számú vagy 6. számú szekvenciában bemutatott OB polipeptid aminosavszekvenciájával.
  4. 4. Egy 1. igénypont szerinti OB polipeptid immunogén fragmentuma, amely
    Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-ThrLeu-Ile-Lys-Thr (18. számú szekvencia);
    Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-GlnThr-Leu-Ala (19. számú szekvencia);
    Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-LeuGln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (20. számú szekvencia);
    Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-GlnGln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (21. számú szekvencia).
  5. 5. Egy humán OB polipeptidanalóg, amely emlősök testtömegének modulálására képes, és amelyben a 4. 60 számú szekvencia számozása szerint az 53., 56., 71.,
    85., 89., 92., 95., 98., 110., 118., 121., 126., 127., 128.,
    129., 157., 159., 163. és 166. aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosav helyettesít.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti humán OB polipeptidanalóg, amelyben az egér OB polipeptid divergens aminosavával történik a helyettesítés, amint azt a 2. számú és 5. számú szekvenciában bemutatjuk.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti humán OB polipeptidanalóg, amelyben alaninnal történik helyettesítés.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti humán OB polipeptidanalóg, amelyet olyan polipeptidek közül választunk ki, amelyekben (a) az 53. helyzetű szerinmaradék glicinnel, alaninnal, 45 valinnal, ciszteinnel, metioninnal vagy treoninnal helyettesített;
    (b) a 98. helyzetű szerinmaradék glicinnel, alaninnal, valinnal, ciszteinnel, metioninnal vagy treoninnal helyettesített; és
    50 (c) a 92. helyzetű argininmaradék aszparaginnal, lizinnel, hisztidinnel, glutaminnal, glutaminsavval, aszparaginsavval, szerinnel, treoninnal, metioninnal vagy ciszteinnel helyettesített.
  9. 9. Egy humán OB polipeptidanalóg, amely testtö55 meg modulálására képes emlősökben, és olyan 4. számú vagy 6. számú aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben (a) egy vagy több aszparaginsavmaradékot glutaminsav helyettesít;
    (b) egy vagy több izoleucinmaradékot leucin helyettesít;
    111
    HU 223 563 Β1 (c) egy vagy több glicin- vagy valinmaradékot alanin helyettesít;
    (d) egy vagy több argininmaradékot hisztidin helyettesít;
    (e) egy vagy több tirozin- vagy fenil-alanin-maradékot triptofán helyettesít;
    (f) a 121-128-ig terjedő szakaszban (a 4. számú szekvencia számozása szerint) egy vagy több maradékot glicin vagy alanin helyettesít; és (g) a 54-60-ig vagy 118-166-ig terjedő szakaszban (a
    4. számú szekvencia számozása szerint) egy vagy több aminosavmaradékot lizin, glutaminsav, cisztein vagy prolin helyettesít.
  10. 10. Az 1., 2., 5. vagy 6. igénypont szerinti OB polipeptid, amelyet olyan polipeptidek közül választunk ki, melyekben (a) az 1 - 21. maradékok deletáltak; és (b) az (a) pont szerinti polipeptidek továbbá tartalmaznak egy leucin-glutaminsav-lizin-arginin-glutaminsavalanin-glutaminsav-alanin-szekvenciát (26. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán; vagy egy glutaminsav-alanin-glutaminsav-alanin-szekvenciát (27. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán; vagy egy leucin-glutaminsav-lizin-arginin-szekvenciát (28. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán; vagy metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-szerin-szerin-glicinleucin-valin-prolin-arginin-glicin-szerin-prolin-szekvenciát (99. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán; vagy egy glicin-szerin-prolin-szekvenciát közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán.
  11. 11. Az 1., 3., 5. vagy 6. igénypontok bármelyike szerinti OB polipeptid, amelyet olyan polipeptidek közül választunk ki, melyekben (a) az 1-21. maradékok deletáltak, hogy érett polipeptidet kapjunk, és (b) az (a) pont szerinti polipeptidek tartalmaznak továbbá egy metioninmaradékot közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy egy glicin-szerin-hisztidin-metionin-szekvenciát (38. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-szerin-szeringlicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-szerinhisztidin-metionin-szekvenciát (98. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán.
  12. 12. A 3., 7., 8. vagy 9. igénypontok bármelyike szerinti OB polipeptid, amelyet olyan polipeptidek közül választunk ki, melyekben (a) az 1-21. maradékok deletáltak, hogy érett polipeptidet kapjunk, és (b) az (a) pont szerinti polipeptidek tartalmaznak továbbá egy metioninmaradékot közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy glicin-szerin-hisztidin-metionin-szekvenciát (3 8. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid Nterminálisán, vagy metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-szerin-szeringlicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-szerinhisztidin-metionin-szekvenciát (98. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy leucin-glutaminsav-lizin-arginin-glutaminsav- alanin-glutaminsav-alanin-szekvenciát (26. számú szekvencia) a 14-21. helyzetben, vagy glutaminsav-alaninglutaminsav-alanin-szekvenciát (27. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy leucin-glutaminsav-lizin-arginin-szekvenciát (28. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid Nterminálisán, vagy metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-szerin-szeringlicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-szerin-prolinszekvenciát (99. számú szekvencia) közvetlenül az érett polipeptid N-terminálisán, vagy glicin-szerin-prolin-szekvenciát a 19-21. helyzetben.
  13. 13. Egy OB polipeptid csonkolt analóg, amely emlősökben testtömeg modulálására képes, és olyan 2., 4.,
    5. vagy 6. számú aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben (a 4. számú szekvencia számozása szerint) (a) a 121-128. helyzetekben egy vagy több aminosav maradék deletált; vagy (b) a 1-116. maradékok deletáltak; vagy (c) az 1-21. és 54-167. maradékok deletáltak; vagy (d) az 1-60. és 117-167. maradékok deletáltak; vagy (e) az 1-60. maradékok deletáltak; vagy (f) az 1-53. maradékok deletáltak; vagy (g) egy (a) pont szerinti alegység analógja, melyben az 1 - 21. maradékok deletáltak; vagy (h) egy (a)-(g) alegység analógja, melyben az N-terminális aminosav vagy aminosavszekvencia az alábbiak egyike:
    (1) metionin, (2) glicin-szerin-hisztidin-metionin-szekvencia (38. számú szekvencia), (3) metionin-glic in-szerin-szerin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidinszerin-szerin-glicin-leucin-valin-prolin- argininglicin-szerin-hisztidin-metionin-szekvencia (98. számú szekvencia), (4) leucin-glutaminsav-lizin-arginin-glutaminsavalanin-glutaminsav-alanin-szekvencia (26. számú szekvencia), (5) glutaminsav-alanin-glutaminsav-alanin-szekvencia (27. számú szekvencia), (6) leucin-glutaminsav-lizin-arginin-szekvencia (28. számú szekvencia), (7) metionin-glicin-szerin-szerin-hisztidinhisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidin-hisztidinszerin-szerin-glicin-leucin-valin-prolin- argininglicin-szerin- prolin-szekvencia (99. számú szekvencia) és
    112
    HU 223 563 Bl (8) glicin-szerin-prolin-szekvencia.
  14. 14. Izolált nukleinsavmolekula, amely egy, 1-13. igénypontok bármelyike szerinti OB polipeptidet kódol.
  15. 15. Izolált DNS-molekula emlősökben testtömegmoduláló biológiai aktivitással rendelkező OB polipeptid expresszi ójának biztosítására, amely az alábbi DNS-molekulák egyike:
    (a) a 3. számú szekvenciában bemutatott DNS-molekula;
    (b) az (a) pontban definiált DNS-molekulával szigorú körülmények között hibridizáló DNS-molekula; vagy (c) az előző DNS-molekulák által kódolt aminosavszekvencia expresszióját kódoló DNS-molekulák.
  16. 16. Egy 14. igénypont szerinti nukleinsavmolekulával szigorú körülmények között hibridizáló, detektálhatóan jelzett nukleinsavmolekula.
  17. 17. Egy 15. igénypont szerinti DNS-molekulával szigorú körülmények között hibridizáló, detektálhatóan jelzett nukleinsavmolekula.
  18. 18. Egy, 1-13. igénypontok bármelyike szerinti OB polipeptidre specifikus antitest vagy antigénkötő fragmense.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti antitest, amely egy detektálható jelzéssel van ellátva.
  20. 20. Vektor, amely egy, 14. vagy 15. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
  21. 21. Expressziós vektor, amely egy, 14. vagy 15. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmaz egy expressziós szabályozószekvenciával működőképesen összekapcsolva.
  22. 22. Gazdasejt, amely egy, 14. vagy 15. igénypont szerinti DNS-molekulával vagy egy, 20. vagy 21. igénypont szerinti vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti gazdasejt, amely baktériumsejt, élesztősejt, emlőssejt, növényi sejt, rovarsejt vagy szövettenyészetben tenyészthető humán sejt.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti gazdasejt, amely E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, élesztő-, CHO-, Rl.l, B-W, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 vagy Sf9 sejt.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti gazdasejt, ahol az élesztő Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula vagy Torulopsis.
  26. 26. Eljárás OB polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy, 22-25. igénypontok bármelyike szerinti sejtet tenyésztünk az OB polipeptid expresszióját biztosító körülmények között, és (b) a kifejeződött OB polipeptidet kinyerjük.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktérium- vagy élesztősejtet tenyésztünk.
  28. 28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további (c) lépésben az OB polipeptidet Ni-kelát-oszlopon kromatografáljuk és (d) lépésben gélszűréssel tisztítjuk.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (c) lépés után és a (d) lépés előtt az OB polipeptidet erős kationcserélő gyantán kromatografáljuk.
  30. 30. Egy OB polipeptidet kódoló humán genomiális DNS amplifikálásra szolgáló oligonukleotidprimer, amely az alábbi szekvenciák egyikével rendelkezik: HOB lgF 5’-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3’ (29. számú szekvencia);
    HOB IgR 5’-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3’ (30. számú szekvencia);
    HOB 2gF 5’-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3’ (31. számú szekvencia);
    HOB 2gR 5’-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3’ (32. számú szekvencia).
  31. 31. Gyógyszerkészítmény emlősök testtömegének csökkentésére, amely hatóanyagként egy, 1-13. igénypontok bármelyike szerinti OB polipeptidet és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
  32. 32. Eljárás egy OB polipeptid jelenlétének kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy (a) a mintát egy, 18. vagy 19. igénypont szerinti antitesttel hozzuk érintkezésbe az antitestet és az OB polipeptidet tartalmazó reakciókomplex létrejöttét biztosító körülmények között, és (b) kimutatjuk az antitestet és OB polipeptidet tartalmazó reakciókomplex kialakulását a mintában, ami az OB polipeptid jelenlétét jelzi a mintában.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy szilárd hordozóhoz van kötve.
  34. 34. In vitro eljárás OB polipeptid szintjének kiértékelésére biológiai mintában, azzal jellemezve, hogy (a) a 32. vagy 33. igénypont szerinti módszerrel kimutatjuk a reakciókomplex kialakulását egy biológiai mintában, és (b) kiértékeljük a képződött reakciókomplex mennyiségét, ami megfelel a biológiai mintában lévő OB polipeptid szintjének.
HU9901249A 1994-08-17 1995-08-17 Testtömeg modulátorok, megfelelő nukleinsavak és proteinek, és ezek diagnosztikai és gyógyászati felhasználása HU223563B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/292,345 US6001968A (en) 1994-08-17 1994-08-17 OB polypeptides, modified forms and compositions
US08/347,563 US5935810A (en) 1994-08-17 1994-11-30 Mammalian ob polypeptides capable of modulating body weight, corresponding nucleic acids, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US08/438,431 US6429290B1 (en) 1994-08-17 1995-05-10 OB polypeptides, modified forms and derivatives
US08/483,211 US6309853B1 (en) 1994-08-17 1995-06-07 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
PCT/US1995/010479 WO1996005309A2 (en) 1994-08-17 1995-08-17 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT78052A HUT78052A (hu) 1999-07-28
HU223563B1 true HU223563B1 (hu) 2004-09-28

Family

ID=27501568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901249A HU223563B1 (hu) 1994-08-17 1995-08-17 Testtömeg modulátorok, megfelelő nukleinsavak és proteinek, és ezek diagnosztikai és gyógyászati felhasználása

Country Status (32)

Country Link
US (1) US6309853B1 (hu)
EP (1) EP0777732B1 (hu)
JP (1) JP3479080B2 (hu)
CN (1) CN1162978B (hu)
AP (1) AP815A (hu)
BG (1) BG64710B1 (hu)
BR (1) BR9508596A (hu)
CA (1) CA2195955C (hu)
CZ (1) CZ295018B6 (hu)
DE (2) DE777732T1 (hu)
EE (1) EE04377B1 (hu)
ES (1) ES2108663T3 (hu)
FI (1) FI121709B (hu)
GB (1) GB2292382B (hu)
GE (1) GEP20022701B (hu)
GR (1) GR970300021T1 (hu)
HK (1) HK1001495A1 (hu)
HU (1) HU223563B1 (hu)
IL (2) IL114987A (hu)
IS (1) IS4416A (hu)
LV (1) LV11868B (hu)
MD (1) MD2311G2 (hu)
MX (1) MX9701200A (hu)
NO (2) NO323847B1 (hu)
NZ (1) NZ291689A (hu)
OA (1) OA10596A (hu)
PL (1) PL183352B1 (hu)
RO (1) RO121036B1 (hu)
SI (1) SI9520090A (hu)
SK (1) SK287191B6 (hu)
TR (1) TR199501021A2 (hu)
WO (1) WO1996005309A2 (hu)

Families Citing this family (334)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310034B1 (en) 1993-05-21 2001-10-30 Ut-Battelle, Llc Agouti polypeptide compositions
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
US5827734A (en) * 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
US5858967A (en) * 1995-01-20 1999-01-12 University Of Washington Appetite supression factor and related methods
US5605886A (en) * 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU4766196A (en) * 1995-01-31 1996-08-21 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) * 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) * 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) * 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) * 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) * 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) * 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) * 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) * 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0736599A3 (en) * 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
WO1996031192A1 (de) * 1995-04-07 1996-10-10 Kuyus-Stiftung Kosmetische zusammensetzung zur behandlung von cellulite
US5614379A (en) * 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
US5840517A (en) * 1995-04-26 1998-11-24 Eli Lilly And Company Process for preparing obesity protein analogs
GB9509164D0 (en) 1995-05-05 1995-06-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
DE741187T1 (de) * 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
CA2218529A1 (en) * 1995-05-08 1996-11-14 Chiron Corporation Nucleic acids for treating obesity
CA2221303A1 (en) * 1995-05-19 1996-11-21 Dennis Paul Smith Obesity gene product
US6395509B1 (en) 1995-05-26 2002-05-28 Eli Lilly And Company DNA encoding Rhesus ob protein
WO1996037517A1 (en) * 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
CA2223433C (en) 1995-06-07 2003-11-18 Amgen Inc. Ob protein compositions and methods
GB9511935D0 (en) * 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
AU6284896A (en) * 1995-06-22 1997-01-22 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
EP0759441A3 (en) * 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
ZA965346B (en) * 1995-06-30 1997-12-24 Lilly Co Eli Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions.
PL324284A1 (en) * 1995-06-30 1998-05-11 Lilly Co Eli Methods of treating diabetes
ATE259650T1 (de) * 1995-08-17 2004-03-15 Amgen Inc Verfahren zur verringerung und zur erhaltung von verringerten blutspiegeln von lipiden mittels zubereitungen von ob-proteinen
EP0764722A2 (en) * 1995-09-19 1997-03-26 Eli Lilly And Company DNA encoding primate leptins as medicinal proteins
WO1997016550A1 (en) * 1995-11-02 1997-05-09 Bristol-Myers Squibb Company Polypeptide fragments derived from the obese gene product
US20030040467A1 (en) 1998-06-15 2003-02-27 Mary Ann Pelleymounter Ig/ob fusions and uses thereof.
CA2358862A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Amgen Inc. Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US6225446B1 (en) 1995-12-06 2001-05-01 Schering Corporation Mutational variants of mammalian proteins
AU1406497A (en) * 1995-12-06 1997-06-27 Schering Corporation Mutational variants of mammalian ob gene proteins
US6369027B1 (en) * 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US7632922B1 (en) 1995-12-22 2009-12-15 Amgen, Inc. Osteoprotegerin
IL124831A0 (en) * 1995-12-27 1999-01-26 Genentech Inc Ob protein derivatives having prolonged half-life
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US20050019325A1 (en) 1996-01-08 2005-01-27 Carter Paul J. WSX receptor agonist antibodies
US6541604B1 (en) 1996-01-08 2003-04-01 Genentech, Inc. Leptin receptor having a WSX motif
US7074397B1 (en) 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
US6087129A (en) 1996-01-19 2000-07-11 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US6110707A (en) * 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
WO1997026916A1 (en) * 1996-01-25 1997-07-31 Eli Lilly And Company Obesity protein analog compounds and formulations thereof
JP2000513564A (ja) * 1996-03-01 2000-10-17 アムジエン・インコーポレーテツド イヌｏｂタンパク質組成物及び方法
CA2250570A1 (en) * 1996-03-26 1997-10-02 Eli Lilly And Company Formulations of ob protein
AU2810497A (en) * 1996-04-19 1997-11-12 University Of Washington Methods for inducing bone formation
US6007998A (en) * 1996-04-22 1999-12-28 Merck & Co., Inc. Leptin assay
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
AU743161B2 (en) * 1996-06-04 2002-01-17 Scripps Research Institute, The Diagnostic and therapeutic methods related to regulating energy mobilization with OB protein and OB antibodies
WO1997046585A2 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Smithkline Beecham P.L.C. Fragments of leptin (ob protein)
JP2002514904A (ja) * 1996-06-20 2002-05-21 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 肥満に対する遺伝子治療
WO1997048419A1 (en) * 1996-06-20 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6630346B1 (en) * 1996-06-20 2003-10-07 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6001816A (en) * 1996-06-20 1999-12-14 Merck & Co., Inc. Gene therapy for leptin deficiency
US5869037A (en) * 1996-06-26 1999-02-09 Cornell Research Foundation, Inc. Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes
US6277592B1 (en) * 1996-07-31 2001-08-21 Purina Mills, Inc. Porcine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof
US20020110857A1 (en) * 1996-07-31 2002-08-15 Spurlock Michael E. Bovine leptin protein, antisense and antibody
EP1001768A1 (en) * 1996-08-30 2000-05-24 Amgen Inc. Methods of increasing sensitivity of an individual to ob protein by upregulating ob protein receptor
ID21861A (id) * 1996-09-20 1999-08-05 Hoechst Ag Penggunaan antagonis leptin untuk pengobatan daya tahan terhadap insulin dalam diabetes tipe ii
SE520392C2 (sv) * 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
AU4582597A (en) * 1996-10-11 1998-05-11 Eli Lilly And Company Therapeutic proteins
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
NL1004559C2 (nl) * 1996-11-18 1998-05-19 Unilife Boter.
AU5654998A (en) * 1996-12-06 1998-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Muteins of obese protein
EP1007648A4 (en) * 1996-12-20 2003-01-15 Lilly Co Eli ANTI-OBESITY PROTEINS
CA2217698A1 (en) * 1996-12-20 1998-06-20 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
BR9713755A (pt) * 1996-12-20 2000-02-01 Amgen Inc Proteìna, proteìna de fusão, sequência de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, processo para produzir uma proteìna, composição farmacêutica, e processo de tratamento de um distúrbio.
ES2321162T3 (es) * 1997-04-15 2009-06-03 Csir Compuestos y composiciones farmaceuticas que tienen actividad supresora del apetito.
US20020019352A1 (en) * 1997-04-17 2002-02-14 David N. Brems Stable, active, human ob protein compositions and methods
AU2951797A (en) * 1997-06-06 1998-12-21 Smithkline Beecham Plc Use of leptin antagonists for the treatment of diabetes
US6017876A (en) 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US5866547A (en) 1998-01-20 1999-02-02 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of neuroendocrine regulation of affective disorders
EP0950417A3 (en) 1998-02-23 2000-02-23 Pfizer Products Inc. Treatment of skeletal disorders
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
EP0996727B1 (en) * 1998-08-12 2003-01-08 Medical Research Council Gene conferring obese phenotype
US7208572B2 (en) 1998-08-21 2007-04-24 Albany Medical College Leptin-related peptides
US6777388B1 (en) 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
US7056504B1 (en) 1998-08-27 2006-06-06 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II
WO2000012726A2 (en) * 1998-08-27 2000-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase i and ii
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) † 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU773891C (en) 1998-10-23 2005-02-17 Kirin-Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
JP2002533124A (ja) 1998-12-31 2002-10-08 カイロン コーポレイション Ｈｉｖポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成
JP2002534962A (ja) * 1999-01-07 2002-10-22 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としての抗肥満症タンパク質の発現および輸送
CA2359840C (en) * 1999-02-12 2012-10-23 Amgen Inc. Glycosylated leptin compositions and related methods
AU3910000A (en) * 1999-03-22 2000-10-09 Zymogenetics Inc. Improved methods for producing proteins in transformed (pichia)
US20050272652A1 (en) 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
CA2370539C (en) * 1999-04-23 2009-01-06 Massachusetts Institute Of Technology System and method for notating polymers
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
US8106098B2 (en) 1999-08-09 2012-01-31 The General Hospital Corporation Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer
GB2396815B (en) * 1999-10-27 2004-09-08 Phytopharm Plc A composition comprising a pregnenone derivative and an NSAID
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU4351201A (en) * 2000-03-08 2001-09-17 Massachusetts Inst Technology Heparinase iii and uses thereof
ES2260219T3 (es) 2000-04-21 2006-11-01 Amgen Inc. Derivados de peptidos apo-ai/aii.
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB2363985B (en) * 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use
US6443013B1 (en) * 2000-08-04 2002-09-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Rotary test fixture
EP1319183B1 (en) 2000-09-12 2009-03-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to low molecular weight heparin
WO2002032406A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides
US7054758B2 (en) 2001-01-30 2006-05-30 Sciona Limited Computer-assisted means for assessing lifestyle risk factors
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
PT1366067E (pt) 2001-03-07 2012-11-29 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteínas contendo uma unidade de anticorpo de isotipo híbrido
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
MXPA03009924A (es) 2001-05-03 2004-01-29 Merck Patent Gmbh Anticuerpo recombinante especifico de tumor y uso del mismo.
IL158719A0 (en) 2001-05-11 2004-05-12 Amgen Inc Peptides and related molecules that bind to tall-1
US20030124196A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Susan Weinbach Pulsatile release compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
US20030083286A1 (en) * 2001-08-22 2003-05-01 Ching-Leou Teng Bioadhesive compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
DE10145553B4 (de) * 2001-09-16 2006-06-08 Gene Architects Ag Nukleinsäure für einen Klonierungsvektor
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
ES2418954T3 (es) 2001-10-22 2013-08-19 Amgen, Inc. Uso de la leptina para el tratamiento de la lipoatrofia humana y método para determinar la predisposición a dicho tratamiento
WO2003039454A2 (en) 2001-10-23 2003-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
ES2381025T3 (es) 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
AU2003209227A1 (en) 2002-01-14 2003-07-30 The General Hospital Corporation Biodegradable polyketal polymers and methods for their formation and use
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
CA2387003A1 (en) * 2002-05-21 2003-11-21 984012 Alberta Ltd. Method for improving efficiencies in livestock production
WO2004009774A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Amgen Inc. Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biogradable polymer
US8030459B2 (en) 2002-07-19 2011-10-04 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
CA2496795C (en) 2002-08-28 2014-06-03 Paul B. Burton Compositions and methods for treating cardiovascular disease
WO2004055056A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
EP2336298B1 (en) 2003-06-27 2016-02-17 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue and methods of making and using the same
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
EP1648935A2 (en) 2003-07-25 2006-04-26 Amgen Inc. Antagonists and agonists of ldcam and methods of use
JP4585186B2 (ja) * 2003-07-31 2010-11-24 杏林製薬株式会社 肥満、糖尿病及び脂質代謝異常の新規な予防又は治療剤
JP5537763B2 (ja) 2003-09-05 2014-07-02 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 放出システムとしてのポリアセタール薬物抱合体
CA2543322A1 (en) 2003-10-21 2005-05-12 Sention, Inc. Carbamoyl esters that inhibit cholinesterase and release pharmacologically active agents
DE10352510A1 (de) * 2003-11-07 2005-06-23 Forschungsinstitut Für Die Biologie Landwirtschaftlicher Nutztiere Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes
AU2004313245B2 (en) 2003-12-30 2011-04-14 Durect Corporation Polymeric implants, preferably containing a mixture of PEG and PLG, for controlled release of active agents, preferably a GNRH
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
EP2417980A1 (en) 2004-02-11 2012-02-15 Amylin Pharmaceuticals Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
JP2008505928A (ja) 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
US20090233986A1 (en) * 2004-07-27 2009-09-17 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
CA2580265A1 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Comentis, Inc. Amino-containing compounds which inhibit memapsin 2 beta-secretase activity and methods of use thereof
KR101441026B1 (ko) 2004-09-24 2014-10-01 메소블라스트, 아이엔씨. 증폭된 다능성 간엽 전구세포 자손 및 이의 용도
ES2645012T3 (es) 2004-09-24 2017-12-01 Mesoblast, Inc. Método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de las células precursoras mesenquimales (MPC)
EP1814590B2 (en) 2004-11-01 2013-12-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of obesity and related disorders
US8394765B2 (en) 2004-11-01 2013-03-12 Amylin Pharmaceuticals Llc Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents
EP1812038A1 (en) 2004-11-18 2007-08-01 VIB vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
US7307142B2 (en) * 2004-11-26 2007-12-11 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Leptin antagonists
DK1835924T3 (da) 2004-12-23 2013-11-04 Ethicon Inc Behandling af parkinsons sygdom og beslægtede sygdomme under anvendelse af postpartum opnåede celler
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US8404637B2 (en) 2005-02-11 2013-03-26 Amylin Pharmaceuticals, Llc GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
CA2604291A1 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Comentis, Inc. Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
AU2006235211B2 (en) 2005-04-12 2010-10-14 Mesoblast, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
EP1922336B1 (en) 2005-08-11 2012-11-21 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
BRPI0614649A2 (pt) 2005-08-11 2011-04-12 Amylin Pharmaceuticals Inc polipeptìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US8227408B2 (en) * 2005-09-07 2012-07-24 Neurotez, Inc. Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology
CA2626082C (en) 2005-10-13 2017-04-11 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
WO2007070870A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Ethicon, Inc. Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
EP2476432B1 (en) 2006-03-07 2015-08-19 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
WO2007136752A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Glycofi, Inc. Erythropoietin compositions
ES2376396T3 (es) 2006-06-26 2012-03-13 Amgen Inc. Método para tratar aterosclerosis.
WO2008005457A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Sunesis Pharmaceuticals Pyridinonyl pdk1 inhibitors
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
US7820623B2 (en) 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
HUE032743T2 (hu) 2006-11-22 2017-10-30 Clinical Res Ass Llc Eljárás Down-szindróma, fragilis X-szindróma és autizmus kezelésére
JP5591691B2 (ja) 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
CA2691531C (en) 2007-06-22 2016-11-01 Board Of Regents,The University Of Texas System Formation of stable submicron peptide or protein particles by thin film freezing
SI2489731T1 (sl) 2007-07-26 2014-12-31 Amgen Inc. Patent Operations, M/S 28-2-C Modificirani encimi lecitin-holesterol aciltransferaze
JP5055432B2 (ja) 2007-09-24 2012-10-24 コメンティス，インコーポレーテッド 治療のためのβ−セクレターゼ阻害剤としての（３−ヒドロキシ−４−アミノブタン−２−イル）−３−（２−チアゾール−２−イル−ピロリジン−１−カルボニル）ベンズアミド誘導体及び関連する化合物
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
JP5622720B2 (ja) * 2008-05-21 2014-11-12 ニューロテスインコーポレイテッド 神経原繊維変化に関連する進行性認知障害の治療方法
MX2010012593A (es) 2008-05-23 2011-03-04 Nat Jewish Health Metodos para el tratamiento de lesion asociada con exposicion a especie alcalina.
WO2009149379A2 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Regents Of The University Of Michigan Use of leptin for the treatment of fatty liver diseases and conditions
EP2307456B1 (en) 2008-06-27 2014-10-15 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
CN102264728B (zh) 2008-09-15 2015-02-04 加利福尼亚大学董事会 用于调节ire1、src和abl活性的方法和组合物
CA2738064C (en) 2008-10-15 2013-03-19 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
CN106880596A (zh) 2008-10-15 2017-06-23 精达制药公司 高浓缩药物颗粒、制剂、混悬剂及其应用
KR20120024529A (ko) * 2008-11-04 2012-03-14 니콜라오스 테자프시디스 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법
PA8853201A1 (es) 2008-12-10 2010-07-27 Mersana Therapeutics Inc Formulaciones farmaceuticas de conjugados de camtotecina-polimero biocompatibles biodegradables
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
JP5518893B2 (ja) 2008-12-19 2014-06-11 アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー 肺ならびに肺の疾患および障害の治療
BRPI0923177A2 (pt) 2008-12-19 2020-08-25 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc usos de composições para tratar dor neuropática e espacidade, as referidas composições, e kit
CA2748314C (en) 2009-02-03 2018-10-02 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
PL2411504T3 (pl) 2009-03-26 2017-10-31 Depuy Synthes Products Inc Komórki ludzkiej tkanki pępowinowej jako terapia choroby Alzheimera
EP2416797A4 (en) 2009-04-10 2013-04-24 Amylin Pharmaceuticals Llc AMYLINAGONIST COMPOUNDS FOR OXYGEN ANIMAL MICE
SG176922A1 (en) 2009-06-19 2012-01-30 Medimmune Llc Protease variants
BR112012003637A2 (pt) 2009-08-17 2017-04-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center "compostos de ligação de proteína de choque térmico, composições, e métodos para preparar e usar os mesmos"
WO2011029043A1 (en) 2009-09-04 2011-03-10 Biogen Idec Ma Inc. Heteroaryl btk inhibitors
EP3461824B1 (en) 2009-09-04 2021-08-25 Biogen MA Inc. Bruton's tyrosine kinase inhibitors
IL295518B2 (en) 2009-10-06 2023-11-01 Millennium Pharm Inc Heterocyclic compounds used as PDK1 inhibitors
JP2013510088A (ja) 2009-11-05 2013-03-21 ブラウン ユニバーシティ ｍＴＯＲのシグナル伝達の増強を処置する方法
US20110136728A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-09 Patricia Grasso Methods of increasing bone formation using leptin-related peptides
PT2509940E (pt) 2009-12-10 2015-09-24 Univ Califórnia Agentes de ligação a amiloide
NZ603156A (en) 2010-03-30 2014-10-31 Verseon Corp Multisubstituted aromatic compounds as inhibitors of thrombin
CN101812450B (zh) * 2010-04-28 2012-01-11 中国农业大学 辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物
CA2813038C (en) 2010-09-28 2021-12-28 Amylin Pharmaceuticals, Llc Highly soluble leptins
WO2012058645A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Biogen Idec Ma Inc. Heterocyclic tyrosine kinase inhibitors
KR101935068B1 (ko) 2011-02-14 2019-01-03 알러간, 인코포레이티드 비마토프로스트 조성물의 에스테르 유도체 및 방법
AU2012255759B2 (en) 2011-05-17 2017-08-10 Principia Biopharma, Inc. Kinase inhibitors
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
US20130178379A1 (en) * 2011-06-15 2013-07-11 Nse Products, Inc. Identifying Markers of Caloric Restriction and Caloric Restriction Mimetics
WO2013009539A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity
KR101851925B1 (ko) 2011-08-10 2018-04-26 디퍼이 신테스 프로덕츠, 인코포레이티드 제대 조직―유래 세포를 사용한 말초 혈관 질환의 치료
JP6342805B2 (ja) 2011-09-02 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびその用途
WO2013063492A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Novel compositions and methods for treating cancer
MX362198B (es) 2011-12-23 2019-01-08 Depuy Synthes Products Llc Deteccion de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano.
CN104379563B (zh) 2012-04-10 2018-12-21 加利福尼亚大学董事会 用于治疗癌症的组合物和方法
AR091273A1 (es) 2012-06-08 2015-01-21 Biogen Idec Inc Inhibidores de pirimidinil tirosina quinasa
WO2013185082A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
CA2913736A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Compounds and methods of treating cancer
KR102304111B1 (ko) 2012-08-27 2021-09-23 알레간 인코포레이티드 베타-클로로시클로펜탄의 친수성 에스테르 전구약물의 이용에 의한 감소된 중심 각막 비후
US9090595B2 (en) 2012-08-27 2015-07-28 Allergan, Inc. Reduced central corneal thickening by use of hydrophilic ester prodrugs of beta-chlorocyclopentanes
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
MX2015003874A (es) 2012-09-26 2015-12-16 Univ California Modulacion de ire1.
EP2900230B1 (en) 2012-09-27 2018-08-15 The Children's Medical Center Corporation Compounds for the treatment of obesity and methods of use thereof
US9364462B2 (en) 2012-10-30 2016-06-14 The Regents Of The University Of California Alpha-1-adrenergic receptor agonist therapy
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
WO2014124143A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
CA2903827C (en) 2013-03-14 2021-08-10 Stefan Oscarson Thiosaccharide mucolytic agents
US9227978B2 (en) 2013-03-15 2016-01-05 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of Kras G12C
BR112015022340A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Verseon Corp método para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio relacionado à calicreína em um sujeito, composto, e, composição farmacêutica
ES2837628T3 (es) 2013-03-15 2021-07-01 Celgene Corp Linfocitos T modificados
ES2687958T3 (es) 2013-03-15 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Fosfonato diésteres de nucleósido acíclico
JP2016513647A (ja) 2013-03-15 2016-05-16 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ レプチン生産を増進するビマトプロスト
CN105209440B (zh) 2013-03-15 2019-07-23 维颂公司 作为凝血酶抑制剂的卤代吡唑
AU2014290202B2 (en) 2013-07-15 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds and methods for treating cancer, neurological disorders, ethanol withdrawal, anxiety, depression, and neuropathic pain
LT3035926T (lt) 2013-08-19 2020-11-25 The Regents Of The University Of California Junginiai ir būdai, skirti epileptinio sutrikimo gydymui
WO2015031799A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Scintillator nanocrystal-containing compositions and methods for their use
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
ES2709976T3 (es) 2013-11-26 2019-04-22 Childrens Medical Ct Corp Compuestos para el tratamiento de la obesidad y procedimientos de uso de los mismos
TWI675833B (zh) 2013-12-11 2019-11-01 美商百健Ｍａ公司 布魯頓氏（ｂｒｕｔｏｎ’ｓ）酪胺酸激酶之聯芳基抑制劑
EP3080122B1 (en) 2013-12-11 2018-10-31 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
KR102325454B1 (ko) 2013-12-23 2021-11-16 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 방사성표지화를 위한 방법 및 시약
CA2939569A1 (en) 2014-02-20 2015-11-19 Allergan, Inc. Reduced central corneal thickening by use of hydrophilic ester prodrugs of beta-chlorocyclopentanes
WO2015153933A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 The Children's Medical Center Corporation Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof
CA2948621A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Hsp70 modulators and methods for making and using the same
WO2016004383A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 City Of Hope Tumor-selective ctla-4 antagonists
JP2017524365A (ja) 2014-08-12 2017-08-31 アントフロゲネシス コーポレーション リンパ節のｂ細胞領域、皮膚、または腸管にホーミングするように操作されたｃａｒ−ｔ細胞
JP6708329B2 (ja) 2014-09-15 2020-06-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ヌクレオチド類似体
AU2015317522A1 (en) 2014-09-17 2017-03-23 Verseon Corporation Pyrazolyl-substituted pyridone compounds as serine protease inhibitors
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
ES2826443T3 (es) 2014-09-25 2021-05-18 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas mutantes KRAS G12C
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
AU2015327817B2 (en) 2014-10-02 2020-04-23 Allergan, Inc. Ester prodrugs of gamma-lactams and their use
WO2016115275A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 City Of Hope Ctla4-binding protein peptide-linker masks
CA3204599A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 The Regents Of The University Of California 5ht agonists for treating disorders
MX2017011000A (es) 2015-02-27 2017-10-20 Verseon Corp Compuestos de pirazol sustituidos como inhibidores de serina proteasa.
JP2018508513A (ja) 2015-02-27 2018-03-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 軟骨若返りを可能とする小分子
EP3280708B1 (en) 2015-04-10 2021-09-01 Araxes Pharma LLC Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10428064B2 (en) 2015-04-15 2019-10-01 Araxes Pharma Llc Fused-tricyclic inhibitors of KRAS and methods of use thereof
AU2016247858B2 (en) 2015-04-17 2020-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. PLK4 inhibitors
EP3307732A1 (en) 2015-06-10 2018-04-18 Biogen MA Inc. Forms and compositions of biaryl inhibitors of bruton's tyrosine kinase
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
CN105132566A (zh) * 2015-09-21 2015-12-09 上海中优生物高科技有限责任公司 毒素堆积型肥胖基因个体化干预饮品的制备方法及其系统
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356359B1 (en) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10875842B2 (en) 2015-09-28 2020-12-29 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356351A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356354A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356349A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017062971A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Neurona Therapeutics Inc. Neural precursor cell populations and uses thereof
JP2018533939A (ja) 2015-10-19 2018-11-22 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法
ES2820770T3 (es) 2015-10-23 2021-04-22 Sunesis Pharmaceuticals Inc Inhibidores de PDK1 heterocíclicos para uso para tratar cáncer
AU2016342375B2 (en) 2015-10-23 2022-03-17 Erx Pharmaceuticals Inc Analogs of celastrol
WO2017087528A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Araxes Pharma Llc 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
US11084795B2 (en) 2015-12-24 2021-08-10 The Regents Of The University Of California CFTR regulators and methods of use thereof
EP4019501A1 (en) 2015-12-24 2022-06-29 The Regents of the University of California Cftr regulators and methods of use thereof
US11834675B2 (en) 2015-12-30 2023-12-05 Celgene Corporation T lymphocyte production methods and t lymphocytes produced thereby
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
TW201737943A (zh) 2016-04-25 2017-11-01 弗瑪治療公司 使用fasn抑制劑之方法
US20210323913A1 (en) 2016-04-29 2021-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Sigma receptor binders
HUE056320T2 (hu) 2016-05-12 2022-02-28 Anacor Pharmaceuticals Inc L-valin amid benzoxaborol származékok parazita betegségek kezelésére
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
SG11201900515PA (en) 2016-07-21 2019-02-27 Biogen Ma Inc Succinate forms and compositions of bruton's tyrosine kinase inhibitors
US11584780B2 (en) 2016-07-26 2023-02-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Adeno-associated virus capsid proteins
US11542261B2 (en) 2016-08-17 2023-01-03 Children's Hospital Medical Center Substituted Imidazo[1,2-a]-pyridines as IRAK 1/4 and FLT3 inhibitors
US11254667B2 (en) 2016-08-17 2022-02-22 Children's Hospital Medical Center Substituted imidazo[1,2-A]pyridines as IRAK 1/4 and flt3 inhibitors
BR112019004715A2 (pt) 2016-09-12 2019-07-16 Aegerion Pharmaceuticals Inc métodos para detectar anticorpos neutralizantes anti-leptina
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
CN110312711A (zh) 2016-10-07 2019-10-08 亚瑞克西斯制药公司 作为ras抑制剂的杂环化合物及其使用方法
JP7100028B2 (ja) 2016-10-20 2022-07-12 セルジーン コーポレイション セレブロン系のヘテロ二量体化可能なキメラ抗原受容体
KR20190095355A (ko) 2016-12-15 2019-08-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2018140514A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
JP7327802B2 (ja) 2017-01-26 2023-08-16 アラクセス ファーマ エルエルシー 縮合ヘテロ－ヘテロ二環式化合物およびその使用方法
EP3573954A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
EP3573964A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
AU2018271990A1 (en) 2017-05-25 2019-12-12 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of KRAS
TW201906832A (zh) 2017-05-25 2019-02-16 美商亞瑞克西斯製藥公司 用於癌症治療之化合物及其使用方法
EP3630747A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Araxes Pharma LLC Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
CN107385020A (zh) * 2017-06-23 2017-11-24 西安医学院 瘦素在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用
WO2019070917A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 The Schepens Eye Research Institute, Inc. COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING THE DEGENERATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM AND METHODS USING SAME
WO2019074962A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Syros Pharmaceuticals, Inc. PYRROLOTRIAZINE COMPOUNDS AND METHODS FOR INHIBITING TAM KINASES
AU2019209470A1 (en) 2018-01-16 2020-08-13 Syros Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)
EP3765459A1 (en) 2018-03-13 2021-01-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Substituted imidazopyridines as inhibitors of plasma kallikrein and uses thereof
US11739345B2 (en) 2018-05-09 2023-08-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
EP3983533A4 (en) 2019-06-14 2023-07-12 Children's Hospital Medical Center RATIONAL THERAPEUTIC TARGETING OF ONCOGENIC IMMUNESIGNALING STATES IN MYELOID MALIGNS VIA THE UBIQUITIN CONJUGATION ENZYME UBE2N
CN114728962A (zh) 2019-09-18 2022-07-08 武田药品工业有限公司 血浆激肽释放酶抑制剂及其用途
US11370803B2 (en) 2019-09-18 2022-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heteroaryl plasma kallikrein inhibitors
WO2021211938A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Solid forms of inhibitors of plasma kallikrein
JP2023522331A (ja) 2020-04-17 2023-05-30 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインの阻害剤の形態及び組成物
JP2024516073A (ja) 2021-03-17 2024-04-12 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインのヘテロアリール阻害剤
CN117396473A (zh) 2021-03-17 2024-01-12 武田药品工业株式会社 血浆激肽释放酶的咪唑并吡啶基抑制剂
WO2022197756A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Plasma kallikrein inhibitors
EP4308229A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Inhibitors of plasma kallikrein
US20240199613A1 (en) 2021-03-17 2024-06-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Polycyclic inhibitors of plasma kallikrein
IL309653A (en) 2021-08-06 2024-02-01 Celgene Corp Composition and methods for selective degradation of transgenic proteins
WO2024040241A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Viracta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations, processes for preparation, and methods of use
WO2024059186A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited N-((isoquinolin-6-yl)methyl)-1h-pyrazole-4-carboxamid derivatives as plasma kallikrein inhibitors for the treatment of hereditary angioedema

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE31006E (en) 1968-09-24 1982-08-03 Akzona Incorporated Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
US3654090A (en) 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US3650090A (en) 1970-06-19 1972-03-21 Phillips Petroleum Co Analysis of gaseous mixtures
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4491632A (en) 1979-10-22 1985-01-01 The Massachusetts General Hospital Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
EP0043718B1 (en) 1980-07-07 1984-11-28 National Research Development Corporation Improvements in or relating to cell lines
US4341761A (en) 1980-07-25 1982-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
US4466917A (en) 1981-02-12 1984-08-21 New York University Malaria vaccine
US4493890A (en) 1981-03-23 1985-01-15 Miles Laboratories, Inc. Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays
US4451570A (en) 1981-03-26 1984-05-29 The Regents Of The University Of California Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line
US4399121A (en) 1981-11-04 1983-08-16 Miles Laboratories, Inc. Iodothyronine immunogens and antibodies
US4427783A (en) 1981-12-14 1984-01-24 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay of thymosin α1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
CH671155A5 (hu) 1986-08-18 1989-08-15 Clinical Technologies Ass
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
DE68929566D1 (de) 1988-05-13 2010-01-28 Amgen Inc Verfahren zur Isolierung und Reinigung von G-CSF
WO1990003431A1 (en) 1988-09-26 1990-04-05 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Mixed feed recombinant yeast fermentation
US5102789A (en) 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5098833A (en) 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
WO1990014092A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Cell Genesys, Inc. Single-strand site-directed modification of mammalian genes in vivo
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ATE174058T1 (de) 1989-11-06 1998-12-15 Cell Genesys Inc Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
RU2128227C1 (ru) 1989-12-22 1999-03-27 Апплайд Резеч Системз АРС Холдинг Н.В. (NL) (Антильские острова) Способ активации транскрипционно-молчащего гена
US5139749A (en) 1990-06-22 1992-08-18 Tas, Inc. Fluidized calcining process
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
ZA924674B (en) 1991-07-02 1993-04-28 Imclone Systems Inc Cysteine depleted il-6 mutein
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0566410A3 (en) 1992-04-17 1994-08-24 Sankyo Co Derivatives of adipogenesis inhibitory factor, their preparation and their use
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
WO1994000558A1 (en) * 1992-06-19 1994-01-06 Joslin Diabetes Center, Inc. DIABETOGENE rad: A TYPE II DIABETES SPECIFIC GENE
ATE350386T1 (de) 1992-11-13 2007-01-15 Immunex Corp Elk ligand, ein cytokin
US5574018A (en) 1994-07-29 1996-11-12 Amgen Inc. Conjugates of vitamin B12 and proteins
US5643748A (en) 1994-09-14 1997-07-01 Progenitor, Inc. HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US5827734A (en) 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
AU4766196A (en) 1995-01-31 1996-08-21 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5532336A (en) 1995-01-31 1996-07-02 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5605886A (en) 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569744A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5521283A (en) 1995-01-31 1996-05-28 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5525705A (en) 1995-01-31 1996-06-11 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
JPH08333394A (ja) 1995-04-03 1996-12-17 Takeda Chem Ind Ltd ラット肥満遺伝子、その遺伝子産物およびその製造法
EP0736599A3 (en) 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5614379A (en) 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
DE741187T1 (de) 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
CA2221303A1 (en) 1995-05-19 1996-11-21 Dennis Paul Smith Obesity gene product
WO1996037517A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
PL324284A1 (en) 1995-06-30 1998-05-11 Lilly Co Eli Methods of treating diabetes
EP0759441A3 (en) 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
EP0764722A2 (en) 1995-09-19 1997-03-26 Eli Lilly And Company DNA encoding primate leptins as medicinal proteins
US5698389A (en) 1995-11-16 1997-12-16 Tularik, Inc. Transcriptional promoter of the murine obesity gene
JP2000505078A (ja) 1996-01-19 2000-04-25 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症タンパク質製剤
WO1997026013A1 (en) 1996-01-19 1997-07-24 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
EP0784979A3 (en) 1996-01-19 1999-03-03 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
EP0784982A3 (en) 1996-01-19 1999-08-18 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
CA2250570A1 (en) 1996-03-26 1997-10-02 Eli Lilly And Company Formulations of ob protein

Also Published As

Publication number Publication date
SK287191B6 (sk) 2010-02-08
EE9700030A (et) 1997-08-15
LV11868B (en) 1998-01-20
OA10596A (en) 2002-06-26
NO970683D0 (no) 1997-02-14
WO1996005309A2 (en) 1996-02-22
IS4416A (is) 1997-01-17
IL162093A0 (en) 2005-11-20
DE777732T1 (de) 1998-01-29
PL183352B1 (pl) 2002-06-28
PL319021A1 (en) 1997-07-21
RO121036B1 (ro) 2006-11-30
MD2311F2 (en) 2003-11-30
GR970300021T1 (en) 1997-07-30
CN1162978A (zh) 1997-10-22
TR199501021A2 (tr) 1996-06-21
EP0777732B1 (en) 2011-09-28
BG101228A (en) 1997-09-30
HK1001495A1 (en) 1998-06-19
JP3479080B2 (ja) 2003-12-15
AP815A (en) 2000-03-10
IL114987A (en) 2004-07-25
GB2292382A (en) 1996-02-21
BR9508596A (pt) 1997-10-21
IL114987A0 (en) 1995-12-08
CA2195955A1 (en) 1996-02-22
SK22197A3 (en) 1998-02-04
FI970656A (fi) 1997-02-17
HUT78052A (hu) 1999-07-28
GB9516947D0 (en) 1995-10-18
GB2292382B (en) 1997-07-16
CZ46097A3 (en) 1997-11-12
WO1996005309A3 (en) 1996-03-21
NZ291689A (en) 2000-01-28
CA2195955C (en) 2012-03-13
GEP20022701B (en) 2002-05-27
ES2108663T1 (es) 1998-01-01
MD970100A (en) 1998-04-30
MX9701200A (es) 1998-05-31
CN1162978B (zh) 2010-06-16
NO326376B1 (no) 2008-11-17
SI9520090A (sl) 1998-08-31
DE19531931A1 (de) 1996-03-07
ES2108663T3 (es) 2012-02-17
EE04377B1 (et) 2004-10-15
FI970656A0 (fi) 1997-02-17
NO20065287L (no) 1997-04-16
CZ295018B6 (cs) 2005-05-18
JPH09506264A (ja) 1997-06-24
EP0777732A1 (en) 1997-06-11
NO323847B1 (no) 2007-07-09
FI121709B (fi) 2011-03-15
LV11868A (lv) 1997-10-20
BG64710B1 (bg) 2005-12-30
US6309853B1 (en) 2001-10-30
AP9700919A0 (en) 1997-01-31
NO970683L (no) 1997-04-16
MD2311G2 (ro) 2004-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0777732B1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6124439A (en) OB polypeptide antibodies and method of making
US8173793B2 (en) Nucleic acids encoding modulators of body weight
US6048837A (en) OB polypeptides as modulators of body weight
US6429290B1 (en) OB polypeptides, modified forms and derivatives
US20040213763A1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6350730B1 (en) OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
JP3985007B2 (ja) 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途
US6124448A (en) Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US7612171B2 (en) DB, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
KR100584177B1 (ko) 체중 변조물질,상응하는 핵산 및 단백질,및 이들의 진단 및 치료학적 용도
AU738966B2 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7619079B2 (en) Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20040723