BG64710B1 - Модулатори на телесното тегло, съответните нуклеинови киселини и протеини и тяхното приложение в диагностиката и терапията - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до регулацията на телесното тегло на животните, включително бозайниците и човека, по-специално до материали, посочени като модулатори на теглото, и до възможностите за приложението на такива модулатори в диагностиката и терапията. Изобретението се отнася до откриването и охарактеризирането на нуклеотидни последователности и на протеини, за които се предполага, чесе експресират от такива нуклеотиди или техни варианти, проявяващи способността да участват в регулацията на телесното тегло на бозайници. Нуклеотидните последователности представляват гените, съответстващи на мишия или човешкия ОВ ген,за който се счита, че изпълнява ключова роля в регулацията на телесното тегло и при затлъстяването. По предварителни данни полипептидният продукт на посочения ген функциониракато хормон. Изобретението се отнася също до приложението на молекули нуклеинови киселини като сонди или праймери за амплификация чрез полимеразна верижна реакция (ПВР), т.е. синтетични или природни олигонуклеотиди, до клониращ вектор, който съдържа нуклеиновите киселини съгласно изобретението до експресионен вектор в бактерии или в клетки на насекоми или на бозайници и до вектор, който съдържа нуклеиновите киселини, функционално свързани с последователност, контролираща експресията. Изобретението се отнася още до бактериална клетка или клетка на бозайник, трансфектирана или трансформирана с подходящ експресионен вектор, съответно до приложението на по

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до контрол на телесното тегло на бозайници, включително това на животните и човека и по-специално с вещества, идентифицирани като модулатори на телесното тегло и с диагностичното и терапевтично приложение, което биха имали тези модулатори.

Предшестващо състояние на техниката

Затлъстяването, определено като излишък на телесни мазнини спрямо останалата телесна маса, е свързано с важна психологическа и медицинска заболеваемост, включваща хипертония, повишено липидно съдържание в кръвта и Тип II или инсулин независим захарен диабет (NIDDM). В САЩ има 6 до 10 милиона болни с NIDDM, включително 18% от населението на 25 възраст 65 години [Harris et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)]. Около 45% от мъжете и 70% от жените с NIDDM са затлъстели и техният диабет значително се подобрява или елиминира с намаление на телесното тегло [Harris, Diabetes Care, 14(3): 639-648 (1991)]. Както е описано по-долу, затлъстяването и NIDDM са силно наследствено обусловени, въпреки че не са идентифицирани гени, които определят предразположението. Молекулно генетичните основи на тези метаболитно обусловени заболявания са важен, слабо проучен проблем.

Асимилацията, натрупването и оползотворяването енергията на хранителните вещества съставляват една комплексна централна хомеос- 40 тазна система за преживяване на metazoa. За сухоземните бозайници, натрупаните в мастната тъкан големи количества метаболитно гориво под формата на три-глицериди е решаващо за преживяване периодите на гладуване. Необходимост- 45 та да се поддържа определено ниво на енергийни запаси без непрекъснати промени на големината и формата на организма изисква постигането на баланс между поглъщане и разход на енергия. Молекулните механизми, които регулират енергийния баланс, обаче, остават да бъдат изяснени. Изолирането на молекули, които пренасят хранителна информация и контролират енергийния баланс биха били съществени за разбиране регулацията на телесното тегло при здраве и болест.

Степента на затлъстяване на отделния индивид е значително наследствено определена. Изследвания върху зависимостта между телес10 но тегло и затлъстяване при еднояйчни и двуяйчни близнаци или между осиновени и техните биологични родители подсказват, че онаследяването на затлъстяването (0.4-0.8) надминава много други черти обикновено считани че имат 15 значителен наследствен компонент, като шизофрения, алкохолизъм и атеросклероза [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 332:1483-1487 (1990)]. Съобщени са също данни за фамилни прилики на нивото на енергетичен разход [Bogardus et al., 20 Diabetes, 35:1-5 (1986)]. Генетичен анализ при гео-графски разграничени популации указва, че относително малък брой гени вероятно определят 30-50% от вариациите в състава на тялото [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255 (1991)]. Никой от тези гени, отговорни за затлъстяването в общата популация, не е генетично картирал на определен хромозомен локус.

Модели на затлъстяване у гризачи включват седем видимо единични генни мутации. Най30 интензивно изучаваните мутации на мишо затлъстяване са гените ob (obese) и db (diabetes). Когато са налице на базата на една и съща генетична линия, ob и db определят неразличими метаболитни и поведенчески фенотипове, което на35 сочва, че тези гени вероятно функционират по едни и същи физиологични пътища [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Миши xoмозиготи за всяка от мутациите са хиперфагични и хипометаболитни, което води до фенотип на затлъстяване, който е доловим на едномесечна възраст. Теглото на тези животни има тенденция да се стабилизира на 60-70 g (в сравнение с 30-35 g при контролните мишки), ob и db животните манифестират извънредно много други хормонални и метаболитни отклонения, което затруднява идентифицирането на първичния дефект, характерен за мута-цията [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr. 50 : 891-902 (1989)].

Всеки от моделите на затлъстяване у гри50 зачи се придружава от промени във въглехид2 ратния метаболизъм, наподобяващи тези на диабет Тип II при човека. В някои случаи, тежестта на диабета зависи отчасти от съответната миша линия [Leiter, Endocrinology, 124:912-922 (1989)]. Конгенните ob и dbb C57BL/Ks мишки развиват тежък диабет с крайна клетъчна некроза и атрофия на островчетата, което води до относителна инсулинопения. Обратно, конгенните C57BL/6J ob и db мишки развиват преходен инсулин-резистентен диабет, който евентуално се компенсира от β-клетъчна хипертрофия наподобявайки човешкия Тип II диабет.

Фенотипът на ob и bd мишките наподобява човешкото затлъстяване по начин, различен от развитието на диабета - мутантните мишки се хранят повече и разходват по-малко енергия от мършавите контроли (както е при затлъстелите хора). Този фенотип е много подобен на наблюдавания при животните с лезии на вентромедаалния хипоталамус, което указва, че е възможно двете мутации да интерферират със способността централната нервна система правилно да интегрира или да отговаря на хранителната информация. Като подкрепа на тази хипотеза са резултатите от експерименти с парабиоза. [Coleman, Diabetologia, 9:294-298 (1973)], което указва, че ob мишките имат дефицит на циркулиращ фактор на ситостта и че db мишките са резистентни на действието на ob фактора (възможно е поради дефект на ob рецептор). Тези експерименти са довели до заключението, че затлъстяването на тези мутантни мишки вероятно е резултат на различни дефекти в една аферентна верига и/или в интегративен център на постулирания обратен механизъм, който контролира състава на тялото. Използвайки молекулни и класически генетични маркери, ob и db гените са картирали съответно на проксималната част на хромозома 6 и средната част на хромозома 4, [Bahaiy et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 87: 8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. И в двата случая, мутациите са картирани в области на мишия геном, които са синтенни с човешките, което подсказва, че ако има човешки хомолози на ob и db, е възможно те да бъдат картирани съответно в човешките хромозоми 7q и 1р. Дефекти в db гена могат да предизвикат затлъстяване в други видове бозайници: у генетични кръстоски между Zucker fa/fa плъхове и Brown Norway +/+ плъхове, fa мутацията, (плъша хромозома 5) е фланкирана от същия локус, който фланкира db при мишката [Truett et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)].

Поради огромния брой фактори, които изглежда влияят на телесното тегло, не е било възможно да се предскаже кои фактори и по-точно кой хомеостатичен механизъм е първично определящ телесното тегло. Така основният проблем, който лежи в основата на настоящето изобретение е да се получат модулатори на телесното тегло, които позволяват да бъдат контролирани затлъстяването и мастното съдържание при бозайници.

Техническа същност на изобретението

Съгласно настоящото изобретение, проблемът за контрол на затлъстяването и мастното съдържание на животните и в частност на бозайници, е разрешен чрез предоставяне на полипептиди на затлъстяването (ОВ) и молекули нуклеинови киселини, кодиращи тези полипептида както е разкрито тук. Настоящото изобретение предоставя за пръв път, изолирани полипептиди, които се използват за модулиране, т.е. за контрол и регулация на телесното тегло и затлъстяването, както и нуклеотидаи последователности, кодиращи такива полипептида, които позволяват не само рекомбинантно получаване на ОВ полипептиди, но те самите също така се използуват за модулиране на телесното тегло.

Полипептидите на затлъстяването (ОВ) в на-стоящото изобретение имат около 145 до около 167 аминокиселини, способни да модулират телесното тегло у животно и в частност у бозайник и включват алелни варианти или техни аналози, включително фрагменти от тях, притежаващи същата биологична активност. Полипептидите могат да бъд ат получени чрез рекомбинантни или химични синтетични метода. Понастоящем предпочитаните ОВ полипептиди включват тези притежаващи аминокиселинната последователност на SEQ ID NOS: 2, 4, 5 или 6, или техни алелни варианти или аналози, включително фрагменти.

Имуногенни фрагменти на ОВ полипептидите на изобретението включват: Val-Pro-Ile-GlnLys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-LysThr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-SerLeu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr3

Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO: 20); и Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-GluCys (SEQ ID NO: 21).

Човешки OB полипетидни аналози включват тези притежаващи човешките аминокиселинни последователности на SEQ ID NOS: 4 и 6, където една или повече от аминокиселините 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126,127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 и 166 (съответно на номерирането на SEQ ID NO: 4) е заместена с друга аминокиселина, като например дивергентната аминокиселина на съответното място в мишия ob полипептид представена в SEQ ID NO: 2, или един аланин. Такива аналози включват също последователности, в които: (а) сериновият остатък в позиция 53 е заместен с глицин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин; (Ь) сериновият остатък на позиция 93 е заместен с глицин, аланин, валин, цистеин, метионин или треонин и (с) аргининовият остатък, на позиция 92 е заместен с аспаргин, лизин, хистидин, глутамин, глутаминова киселина, аспаргинова киселина, серин, треонин, метионин или цистеин. Съгласно изобретението един ОВ полипетиден аналог има предпочитано 83% или повече аминокиселинна последователност хомоложна на човешкия ОВ полипетид, представен в SEQ ID NO: 2,4, 5 или 6.

Съгласно изобретението допълнителни човешки ОВ полипептидни аналози съдържат аминокиселинната последователност на SEQ ID NOS:4 и 6 и имат: а) един или повече остатъци на аспаргинова киселина заместени с глутаминова киселина; Ь) един или повече изолевцинови остатъци заместени с левцин; с) един или повече глицинови или валинови остатъци заместени с аланин; d) един или повече аргининови остатъци заместени с хистидин; е) един или повече тирозинови или фенилаланинови остатъци заместени с триптофан; f) един или повече остатъци от 121 до 128 (в съответствие с номерирането на SEQ ID NO: 4) заместени с глицин или аланин; и g) един или повече остатъци в позиция 54 до 60 или 118 до 166 (съответно на номера на SEQ ID NO: 4) заместени с лизин, глутаминова киселина, цистин или пролин.

Понастоящем предпочитани човешки скъсени ОВ полипептидни аналози, съгласно изобретението включват тези, в които (в съответствие с номерирането на SEQ ID NO: 4): а) един или повече остатъци в позиции 121 до 128 са отстранени; Ь) остатъци 1-116 са отстранени; с) остатъците 1-21 и 54 до 167 са отстранени; е) остатъците 1-60 и 117 до 167 са отстранени; е) остатъците 1-60 са отстранени; f) остатъците 1-53 са отстранени; и g) един аналог на (а) където остатъците 1-21 са отстранени. ОВ полипептидите и ob полипептидните аналози на това изобретение, при които липсва “сигналната” последователност от 21 аминокиселини (т.е. аминокиселините от 1 до 21 на SEQ ID N0:4) могат да имат N-терминална аминокиселина или аминокиселинна последователност като (1) метионин, (2) последователност ппщин-серин-хистидин-метионин (SEQ ID NO: 38), (3) последователност метионин-глицин-серин-серин-хистидин-хистидин-хистидинхистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-хистидин-метионин (SEQ ID N0:93) (4) последователност левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин-глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин (SEQ ID NO: 26), (5) последователност глутаминова киселина-аланиншутаминова киселина-аланин (SEQ ID NO: 27), (6) последователност левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин (SEQ ID N0:28), (7) последователност метионин-серин-серин-хистидинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролинаргинин-ппщин-серин-пролин (SEQ IDNO: 99), и (8) последователност глицин-серин-пролин. Производни на един ОВ полипептид съгласно изобретението имат един или повече закачени химични компоненти, включващи водно-разтворими полимери като полиетиленгликол. Дериватизирани производни с полиетиленгликол могат да бъдат моно-, ди-, три- или тетрасвързани с полиетиленгликол напр. N-крайни моно-производни на полипептидите с полиетиленгликол (пегилирани полипептиди). Предпочитаните N-терминално монопегилирани деривати на ob полипептидите от изобретението включват ОВ полипептиди съдържащи аминокиселините остатъци от 22 до 167 на SEQ ID NO: 4 или остатъците от 22 до 166 на SEQ ID NO: 6, евентуално притежаващи един (пегилиран) метионин в позиция 21.

Изолирана молекула нуклеинова киселина получена с настоящето изобретение кодира един ОВ полипептид, алелен вариант или аналог, включително фрагменти, както са описани погоре. Специално се предлагат ДНК молекули, за да бъдат използвани за експресията на един ОВ полипептид, който притежава биологична активност да модулира телесното тегло при бозайници. Те са подбрани от групата съставена от: а) ДНК молекули представени в SEQ ID NOS: 1 и 3 фрагменти от тях; Ь) ДНК молекули, които хибридизират с ДНК молекулите описани в (а) или вместо тях хибридизируеми техни фрагменти; и (с) ДНК молекули, които кодират експресията на аминокиселинната последователност кодирана от всяка една от ДНК молекули в а) и Ь). Пример за такива молекули е човешката геномна ДНК молекула на SEQ ID NOS: 22 и 24.

Предпочитаните ДНК молекули съгласно изобретението кодират полипептид съдържащ аминокиселинна последователност както в: а) SEQ ID NO: 2 b) аминокиселините от 22 до 167 на SEQ ID NO: 2; с) SEQ ID NO: 4; d) аминокиселините от 22 до 167 на SEQ ID N0:4; е) SEQ ГО N0:5; f) аминокиселините от 22 до 166 на SEQ ГО N0: 5; и g) SEQ ГО N0: 6; h) аминокиселините от 22 до 166 на SEQ ID NO: 6, както и полипептиди, които имат N-крайна аминокиселина или аминокиселинна последователност като гореупоменатите. Като пример, предпочитаната ДНК молекула има последователността представена като белтък кодиращата последователност на SEQ ID N0: 3 и в частност има последователност представена, като последователността кодираща аминокиселините от 22 до 167.

Изобретението предлага също откриваеми белязани молекули нуклеинови киселини, способни да хибридизират с ДНК молекулата, предмет на изобретението. Такива, белязани молекули включват нуклеинови киселини, способни да хибридизират с некодиращата област на една ОВ нуклеинова киселина, която некодираща област е подбрана от група, състояща се от интрон, 5’-некодираща област и 3’-некодирахца област. Настоящото изобретение осигурява също олигонуклеотидни праймери за амплифициране на човешката геномна ДНК, кодираща ОВ полипептид, като олигонуклеотидите съдържащи се в SEQ ГО NOS:29 до 32.

Векторите предоставени с изобретението съдържат ДНК молекула, съгласно изобретението, както е описано по-горе и предпочитано представляват експресионен вектор, в който ДНК мо лекулата, е функционално свързана с последователност конт-ролираща експресията. Едноклетъчните гостоприемници, съгласно изобретението са трансформирани или трансфектирани с ДНК молекули на изобретението или с вектор както е описано по-горе. Предпочитани клетки гостоприемници са бактерии, дрожди, клетки от бозайници, растителни клетки, клетки от насекоми и човешки клетки в тъканна култура. Например, такива клетки гостоприемници се подбират от групата състояща се от E.coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожди, CHO, Rl.l, BW, L-N, C0S1, C0S7, BSC1, BSC40, BMT10 и Sf9 клетки. Понастоящем предпочитаните дрожди-гостоприемници включват Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula и Torulopsis. Предоставени са също клетки от бозайници съдържащи ob полипептид-кодираща ДНК последователност, която е модифицирана in vitro така, че да позволява по-висока експресия на ob полипептид посредством хомоложна рекомбинация, състояща се от вмъкване на регулираща експресията последователност във функционална близост до последователността кодираща ob полипептида. Последователността регулираща експресията може да бъде или да не бъде тази, която регулира ob полипептидната експресия и може да замества мутантна ob полипептид регулираща последователност в клетката.

Настоящото изобретение предлага методи за получаване на ob полипептид включващи: а) култивиране на клетка както бе описано по-горе в условия, които осигуряват експресията на ob полипептида и Ь) отделяне на експресирания ob полипептид. Тази процедура може да бъде придружена също от етапите: с) хроматография на полипептида върху Ni-хелатна колона и d) пречистване на полипептида чрез гел филтрация. В предпочитания вариант след етап (с) и преди етап (d) методът включва хроматография на ob полипептида върху силна катионнообменна колона.

Настоящото изобретение осигурява също белязани и небелязани моноклонални и поликлонални антитела, специфични за ob полипептидите на изобретението и обезсмъртени клетъчни линии, които произвеждат моноклоналното антитяло на изобретението. Изготвянето на антитялото на изобретението включва: а) конюгиране на ob полипептид с белтък-носител; Ь) имунизиране на животно-гостоприемник с конюгата ОВ полипептиден фрагмент-белгьчен носител от етап (а) смесен с адювант; с) получаване на антитялото от имунизираното животно-гостоприемник.

Изобретението осигурява методи за измерване наличието на ОВ полипептид в проба, включващи: а) инкубиране на проба, за която се предполага, че съдържа ОВ полипептид с антитяло (за предпочитане свързано с твърда фаза), което се свързва специфично с ОВ полипептида в условия, които позволяват образуването на реакционни комплекси, съдържащи антитялото и ОВ полипетида; и Ь) откриване образуването на реакционни комплекси, съдържащи антитялото и ОВ полипептида в пробата, където откриването на реакционните комплекси сочи присъствие в пробата на ОВ полипептид. Съответно са предложени in vitro методи за определяне нивото на ОВ полипептида в биологична проба включващи: а) откриване формирането на реакционни комплекси в биологична проба в съответствие с метода отбелязан по-горе; и Ь) определяне количеството на формираните реакционни комплекси, което количество на реакционните комплекси съответства на нивото на ОВ полипептида в биологичната проба. Когато се открие или диагностицира заболяване свързано с повишено или намалено ниво на ОВ полипептид съгласно изобретението, прави се едно отчитане както е описано по-горе и установеното ниво се сравнява с нивото на ОВ полипептида в нормални индивиди или преди време в изследвания индивид. Повишено ниво на ОВ полипептида в сравнение с нормалните стойности или с предишните нива показва заболяване, свързано с повишени нива на ОВ полипептида, а понижено ниво на ОВ полипептида в сравнение с нормалните нива показва заболяване, свързано с понижено ниво на ОВ полипептида. Съответно предложени са in vitro методи за мониториране на лечението на заболяване свързано с повишено или понижено ниво на ОВ полипептида у бозайници. Както е описано по-горе, методите включват измерване нивото на ОВ полипептида в серия от биологични проби получени в различни периоди от време от бозайници подложени на такова терапевтично лечение.

Фармацевтичните препарати съгласно изобретението включват ОВ полипептид както е описано по-горе, заедно с един фармацевтично приемлив носител и се прилагат при терапевтичните методи за намаление телесното тегло на животни. Освен това фармацевтичните препарати на изобретението предвидени за лечебно приложение за повишаване телесното тегло на животни, включват антагонист на ОВ полипептида. Антагонистът е подбран от групата състояща се от антитяло, което се свързва и неутрализира активността на ОВ полипептида, от един фрагмент на ob полипептида, който се свързва, но не активира ОВ полипептидния рецептор и от една малка молекула антагонист на ОВ полипептида. Настоящото изобретение предлага също козметични препарати, подобряващи външния вид на тялото, за намаление или увеличение на телесното тегло на индивида. Козметични препарати се прилагат в дози достатъчни да модулират телесното тегло до желаното ниво.

Настоящото изобретение е насочено също така към използуване на нуклеиновата киселина на изобретението, както и антисенс молекули нуклеинова киселина, способна да хибридизира с нуклеинова киселина кодираща ОВ полипептид съгласно изобретението, за производство на медикаменти (напр. за генна терапия) за промяна на телесното тегло на животни. Също предложена е възможност-та един ОВ полипептид или антагонист съгласно изобретението да се използва за производство на медикаменти за промяна телесното тегло на животни. Така получени медикаменти могат да бъдат прилагани за промяна телесното тегло на бозайници при третиране на заболяване подбрано от група, състояща се от диабет, високо кръвно налягане и високо съдържание на холестерол и също като част от комбинирана терапия с медикамент за третиране на такива заболявания. Такива медикаменти могат да бъдат прилагани при терапевтични методи, включващи системи за приложение: интравенозна, интраартериална, интраперитонеална, интрамускулна, подкожна, назална, орална или белодробна.

Данните, представени тук показват, че ОВ полипептидите на изобретението в тяхната форма се секретират първично от адипоцитите на бозайници и че полипептидите функционират като хормони.

Примерите тук демонстрират, че ОВ полипептидът, алтернативно тук наречен “лептин”, циркулира в плазмата на мишка, плъх и човек. Лептин отсъствува в плазмата на ob/ob мишки и е налице в десеторно по-високи концентрации в плазма от db/db мишки и 20 пъти по-високи концентрации у fa/fa плъхове. Особено важно е, че ежедневни инжекции на рекомбинантен лептин драматично намаляват телесната маса на ob/ob мишки, значително променят телесното тегло на див тип мишки и нямат ефект върху db/db мишки.

В един по-нататъшен аспект, ОВ полипептидът от един вид е биологично активен в други животински видове. В частност, човешкият ОБ полипептид е активен при мишки.

Преди всичко, модулаторите на настоящето изобретение представляват молекули нуклеинова киселина, включително рекомбинантни ДНК молекули (напр. кДНК или вектор съдържащ кДНК или изолирана геномна ДНК) или клонирани гени (напр. изолирана геномна ДНК), или техни дегенерирали варианти, които кодират самите полипетиди служещи като модулатори за контрол на теглото както е дефинирано по-долу, или консервативни варианти или фрагменти от тях, в частност фрагменти, които нямат сигналния пептид (алтернативно назоваван тук като зрял ОВ полипептид). Тези полипептиди притежават аминокиселинните последователности, посочени по-нататък във фигура 1А до Е (SEQ ID NO:

2), фигура 3 (SEQ ID NO: 4), фигура 5 (SEQ ID NO: 5) и фигура 6 (SEQ ID NO: 6). В специфични изпълнения се предлагат амино-киселинни последователности за два варианта от миши и човешки ob полипептиди. И двата полипептида са открити във форма с липсващ глутамин в позиция 49, което може да е резултат на аномалия в снаждането на mRNA. ОВ полипептидите от различни видове могат да бъдат високо хомоложни; както е показано на фигура 4, мишият и човешкият ОВ полипептиди са хомоложни в повече от 80%.

Молекулите нуклеинова киселина, рекомбинантните ДНК молекули или клонираните гени могат да имат нуклеотидните последователности или да бъдат комплементарни на ДНК кодиращите по-следователности показани на фигура 1А до Е (SEQ ID N0:1) и фигура 2А и В (SEQ ID N0:3). По-конкретно, такива ДНК молекули могат да бъдат кДНК или геномна ДНК изолирана от хромозома. Молекулите нуклеинова киселина на изобретението могат също да съответстват на 5 ’ и 3 ’ фланкиращите последователности на ДНК и интронните ДНК последовател ности. Настоящото изобретение е свързано също така с идентификацията на една нуклеинова киселина имаща нуклеотидна последователност подбрана от последователностите от фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1) и фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3) както и дегенерирани варианти, алелни варианти и подобни родствени молекули.

Една молекула нуклеинова киселина на изобретението може да бъде ДНК или РНК, включително техни синтетични варианти съдържащи фосфатни връзки или техни аналози - например тиофосфатни връзки. Те могат да бъдат едноверижни или двуверижни последователности.

Настоящото изобретение освен това осигурява молекули нуклеинови киселини за ползуване като молекулни сонди или като праймери за амплификация с полимеразна верижна реакция (PCR) т.е. синтетични или естествени олигонуклеотиди с по-следователност съответна на частта от последователностите показани на Фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1), фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3) и фигура 20А до С (SEQ ID NO: 22 и 24); или 5’ и 3’ фланкиращите по-следователности на кодиращите последователности; или интронните последователности на геномната ДНК. По-конкретно, изобретението предвижда молекула нуклеинова киселина, която има най-малко 10 нуклеотида и тя съответствува на нуклеотидна последователност със същия брой нуклеотиди в нуклеотидните последователности на фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1), фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3) и фигура 20А до С (SEQ ID N0: 22) или последователност комплементарна на тях. Предпочитано е по-следователностга, на молекулата нуклеинова киселина да има поне 15 нуклеотида. Най-добре е последователността на нуклеиновата киселина да има поне 20 нуклеотида. В едно изпълнение на изобретението, в което олигонуклеотидът е сонда, олигонуклеотидьт е белязан напр. с един радионуклид (³²Р), или с ензим.

В по-нататъшен аспект, настоящето изобретение осигурява един клониращ вектор, който съдържа нуклеиновите киселини на изобретението, кодиращи ОВ полипептида; и един експресионен вектор-бактериален, от насекоми или от бозайници, който съдържа молекулите нуклеинова киселина на изобретението кодиращи ob полипетида, функционално свързани с последователност контролираща експресията. В съответ ствие с това, изобретението по-нататък се отнася до клетка гостоприемник, като например бактериална клетка, клетка от дрожди, от насекоми или клетка от бозайници, трансфектирана или трансформирана с подходящ експресионен вектор и до използуване на гореспоменатите конструкти при изготвяне модулаторите на изобретението. В друг аспект, настоящото изобретение има връзка с антитела, които се свързват с ОВ полипептида. Такива антитела могат да бъдат генерирани срещу цялата дължина на полипептида или антигенни фрагменти от него. От една страна, такива антитела инхибират функционалната (т.е. телесно тегло и модулиране състава на мазнините) активност на ob полипептида. От друга страна, антителата могат да бъдат използвани за определяне нивото на циркулиращия ob полипептид в плазмата или серума. В друг аспект, регионално-специфични антитела и в частност моноклонални антитела, могат да бъдат използвани като сонди за ОВ полипептидната структура.

Всички гореспоменати материали трябва да бъдат разглеждани като модулатори на телесното тегло и състава на мазнините и като такива могат да бъдат използувани в различни случаи. По-точно, изобретението предвижда диагностични и терапевтични приложения, както и някои приложения в земеделието, всички зависими от използване на дефинираните тук модулатори, включващи молекули нуклеинова киселина и пептиди. Освен това, модулирането на телесното тегло определя специфични терапевтични приложения и подобрения. В случаите когато или затлъстяване или обратно кахексия представляват нежелателни телесни особености, те могат да бъдат лекувани чрез въвеждане на един или повече от модулаторите на настоящето изобретение.

Така, предложен е метод за модулиране телесното тегло на бозайник, който включва контролиране експресията на белтък кодиран от нуклеинова киселина, която има нуклеотидна последователност подбрана от последователността на Фигура. 1А до Е (SEQ ID NO: 1), от последователността на Фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3) и дегенерат и алелни варианти от тях. Такъв контрол може да бъде осъществен чрез въвеждане на въпросните нуклеотида посредством генна терапия в мастните клетки на пациента или гостоприемника, за да контролират или редуцират затлъстяването. Обратно, изготвянето и прилагането на антагонисти на нуклеотидате, такива като антисенз молекули, ще бъде индицирано и проведено в случаите където условията включват ексцесивна загуба на тегло, като anorexia nervosa, рак или е налице СПИН и е в процес на лечение. Такива конструкти могат да бъдат въведени по подобен начин, директно в мастните клетки за да повлияят такива промени.

Съответно, белтъците определени във фигура 1А до Е, 3,5 и 6 (SEQ ГО NO: 1, SEQ ГО NO: 4, SEQ ГО NO: 5 и SEQ ID NO:), и техни консервативни варианти, активни фрагменти и сродни малки молекули могат да бъдат определени за директно въвеждане за терапевтични цели, за да редуцират или контролират ексцесивната телесна мазнина ида нарастването на теглото. Съответно, антитела, ида други антагонисти на посочените белтъчни материали, такива като фрагменти от тях, могат да бъдат изготвени и по подобен начин въведени, за да се постигне обратният ефект. В съответствие с това, изобретението е насочено преимуществено към фармацевтичен препарат, включващ един ОВ полипептид на изобретението ида алтернативно един негов антагонист, в една смес с фармацевтично приемлив носител или ексципиент.

В допълнение, ОВ полипептидът на изобретението може да бъде въвеждан поради неговите козметични ефекти, напр. за подобрение вида на тялото чрез намаление на мастните депа. ОВ полипептидът може да бъде използуван независимо или в комбинация с други козметични средства, напр. хирургични метода.

Диагностичното приложение на дадените нуклеотиди и съответните пептиди се разширяват за използване на нуклеиновите киселини за идентифициране на мутации на техни алелни варианти, така че да се развие един набор от активни нуклеотидни материали полезни за диагностични и терапевтични цели. В частност и хомозиготни и хетерозиготни мутации на въпросните нуклеотида могат да бъдат идентифицирани, което би могло да бъде постулирано за попрецизно определяне състоянието на пациентите, за определяне на рисковия потенциал на индивидите с оглед затлъстяване. По-специално, хетерозиготните мутации понастоящем се разглеждат като свързани с леко до средно тежко затлъстяване, докато хомозиготните мутации са свързани с по-изразено до тежко затлъстяване. Съответно ДНК тестиране може да бъде проведено, като се използват споменатите уточнени материали като репери, за улесняване на точна дългосрочна прогноза на индивидуалните тенденции, така че да може да се предпишат промени в диетата или други персонални навици или да се насочи терапевтична интервенция, за да се променят тези условия.

Диагностичната полза на настоящето изобретение се разширява и като методи за измерване наличието и нивото на модулаторите на изобретението в проби от клетки или биологични екстракти взети от обектите за изследване, така че да могат да се определят нуклеиновите киселини (геномна ДНК или мРНК) и/или нивото на белтък в тези проби за изследване. Като се има предвид, че повишената активност на нуклеотида и наличието на съответния белтък отразяват способността на индивида да потиска затлъстяването, лекарят обобщавайки тези резултати за един индивид със затлъстяване, ще може да определи, че причина за затлъстяването е фактор, различен от дисфункция по отношение наличието и активността на нуклеотидите на настоящето изобретение. Обратно, понижените нива на нуклеотида и/или експресирания белтък ще подскажат че тези нива трябва да бъдат повишени за третиране на това затлъстяване и ще бъде осъществен подходящ терапевтичен режим.

Освен това, откритите нуклеотиди и представените във фигура 1А до Е и 2А и В представляват кДНК, която както бе отбелязано накратко по-горе, може да бъде използувана за определяне на съответна РНК. Подобно на това, рекомбинантен белтъчен материал, съответствуващ на полипептидите във фигура 1А до Е и 3 може да бъде получен и подходящо белязан за използуване, например при радиоимунни определения, за измерване маста и/или плазмените нива на ОВ белтък, или за откриване наличието и нивото на рецептор за ОВ в тъкани като хипоталамуса.

По-нататък, настоящото изобретение осъществява не само идентифициране на нуклеотиди и съответни белтъци, но и откриването на рецептори за такива материали. В този смисъл, полипетидите на фигура 1А до Е, 3,5 и/или 6 могат да бъдат изготвени и използувани за скриниране на съответна експресионна библиотека за изолиране на активни рецептори. След това рецепторът може да бъде клониран, и рецепторът - сам или свързан с лиганд може да бъде използуван за скриниране на малки молекули, които могат да притежават активност подобна на тези модулатори.

По-нататък, настоящото изобретение е свързано с фармацевтичния състав, който включва някои от тези модулатори, предимно полипептидите, чиито последователности са представени в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, техните антитела, съответна малка молекула техни агонисти или антагонисти или активни фрагменти, получени във форми за различни начини на въвеждане. Такива форми ще включват фармацевтично приемливи носители, или други адюванти, които са необходими и биха могли да бъдат изготвени в ефективни граници на дозировка определени от клинициста или лекаря за всеки случай.

В съответствие с това, основен предмет на настоящото изобретение е да предостави модулатори на телесното тегло, както е дефинирано тук, в пречистена форма, които проявяват известни характеристики и активности свързани с контрола на промените при затлъстяване и мастното съдържание при бозайници.

Един по-нататъшен предмет на настоящето изобретение е да предложи методи за откриване и измерване модулаторите на контрола на теглото както е изложено по-долу, като средство за ефективна диагноза и мониториране на патологичните условия, където варирането в нивото на такива модулатори е или би могло да представлява характерна особеност.

Един по-нататъшен предмет на настоящото изобретение е да предложи метод и съответна опитна система за скриниране на вещества, такива като лекарствени препарати, агенти и подобни, които потенциално биха могли да наподобяват или да инхибират активността на модулаторите на изобретението при бозайници.

Един по-нататъшен предмет на настоящето изобретение е да предложи метод за третиране на бозайници с цел да се контролира телесното тегло и мастното съдържание при бозайници и/или за третиране на някои патологични състояния, за които е характерно абнормно намаление или увеличение на телесното тегло.

Друг предмет на настоящето изобретение е създаването на гении конструкта за приложе9 ние в генетичните терапевтични протоколи и/или за фармацевтични препарати за такъв вид терапевтични методи, които включват или са базирани на един или повече от модулаторите, на свързващите ги рецептори или агенти, които биха могли да контролират тяхната продукция или да наподобяват или антагонизират тяхната активност.

Други обекти и предимства ще станат очевидни за специалистите от прегледа на следващите по-долу описания на приложените фигури.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 (А до Е) представя нуклеотидната последователност на нуклеиновата киселина (SEQ ID NO: 1) и изведената от нея, съответствуваща й аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 2) на мишата ОВ кДНК. Едно 5’ начало от 39 базови двойки (Ьр) е последвано от една предсказана отворена рамка за четене на 167 аминокиселини и една 3-нетранслирана последователност приблизително от 3.7 Ьр. (В предшестваща заявка, Сериен № 09/347,563 представена на 30 ноември 1994 и Сериен № 08/ 438,431, представена на 10 май 1995 беше открита една допълнителна 58-базова 5’-некодираща последователност, която бе определена впоследствие като артефакт на клонирането. Този артефакт няма отношение към кодиращата област, към 39 базовата 5’-некодираща област представена понастоящем във фигура 1 или към 3’-некодиращата област на гена). Представени са общо около 2500 базови двойки от 3’-нетранслираната последователност. Анализът на предсказаната белтъчна последователност посредством наблюдение и с помощта на SegSeq компютърна програма показва наличието на една сигнална последователност (подчертана). Микрохетерогенността на кДНК е изразена в това, че при приблизително 70% от кДНК 49-ия кодон кодира глутамин, а 30% не кодира (вж. по-долу фигури 5 и 6). Тази аминокиселина е подчертана, както и аргининовият кодон, който е мутирал в C57BL/6J ob/ob мишки (1J мишки).

Фигура 2 (А и В) представя последователност-та на нуклеиновата киселина (SEQ ID NO: 3) на човешката ОВ кДНК. Нуклеотитидите са номерирани от 1 до 701 с място на началото на транслацията при нуклеотид 46 и край при нуклеотид 550.

Фигура 3 представя пълната аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 4) изведена от човешкия ОВ ген съответствуващ на нуклеотидната последователност на фигура 2А и В. Аминокиселините са номерирани от 1 до 167. Мястото на скъсване на една сигнална последователност е разположено след аминокиселина 21 (Ala) така че зрелият белтък се простира от аминокиселина 22 (Val) до аминокиселина 167 (Cys).

Фигура 4 представя сравнение между мишата (SEQ ID NO: 2) и човешката (SEQ ID NO:

4) аминокиселинни последователности, изведени от съответните нуклеотидни последователности. Последователността на човешката ОВ аминокиселинна последователност е високо хомоложна с тази на мишата. Консервативните промени са отбелязани с чертички, а неконсервативните промени с една звездичка. Променливият глутаминов кодон е подчертан, както и мястото на безсмислената мутация при C57BL/6J оЬ/ оЬ (1J) мишките. Общо, идентичността на аминокиселинно ниво е 85%, въпреки че са открити само 8 замествания между валин при кодон 22 (непосредствено след сигналната последователност) и цистеин на позиция 117.

Фигура 5 представя пълната дължина на аминокиселинната последователност (SEQ ID NO: 5) изведена от мишия ОВ ген както е показано на фигура 3, но липсва глутамин на позиция 49. Аминокиселините са номерирани от 1 до 166. Мястото на скъсване на сигналната последователност е локализирано след аминокиселина 21 (Ala) (и преди делецията на глутамин 49) така че зрелият белтък се простира от аминокиселина 22 (Val) до аминокиселина 166 (Cys).

Фигура 6 представя пълната дължина на аминокиселинната последователност (SEQ ID NO: 6) изведена от човешкия ОВ ген, както е показано на фигура 4, но липсва глутамин на позиция 49. Аминокиселините са номерирани от 1 до 166. Мястото на скъсване на сигналната последователност е локализирано след аминокиселина 21 (Ala) (преди делецията на глутамин 49) така че зрелият белтък се разполага от аминокиселина 22 (Val) до аминокиселина 166 (Cys).

Фигура 7 (А) физическа карта за разположението на оЬ в мишата хромозома и YAC и Р1 клониращите карти. “М и N” съответствуват на рестрикционните места на Mull и Notl. Циф рите съответствуват на номерата на отделните животни, които са били рекомбинантни в областта на ob в изследваните 1606 мейози. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl3 и Сра означават места в областта на ob гена, които хибридизират с ДНК сондите. YACs са изолирани при използуване на D6Rckl3 и Рах-4 като сонди и краищата са възстановявани с помощта на vectorette PCR и/или освободен плазмиден край и са използувани отново за изолиране на нови YACs. (В) Полученият YAC contig. Един от YACs в този contig, Y902A0925, беше химерен. Всяка от сондите използвана за генотипиране на рекомбинантните животни е указана в скоби. (6) съответствува на YAC 107; (5) съответствува на М16(+) (или на M16(pLUS)); (4) съответствува на adu(+); (3) съответствува на aad(pICL); (2) съответствува на 53(pICL); и (1( съответствува на 53(+). (С) Р1 contig от клонове в бактериофаг Р1, изолирани със сонди с подбрани YAC краища. ОВ генът е изолиран в един Р1 клон, изолиран с помощта на дисталния край на YAC YB6S2F12 (край (4)) (алтернативно назоваван тук adu(+)).

Фигура 8 представя фотография на оцветени с етидиев бромид 192 независими изолати от експеримент на захващане на четвъртия екзон, които бяха амплифицирани с PCR и характеризирани.

Фигура 9 е фотография на оцветени с етидиев бромид амплифицирани с PCR клонове, за които се предполага, че съдържат ob. Всеки от 7-те клона, който не съдържа артефакта, е реамплифициран с PCR и подложен на електрофореа в 1% агарозен гел в ТВЕ и оцветен с етидиев бромид. Маркерите за определяне размера на фрагментите (пътеката най-вляво, която не е номерирана) са търговски достъпните “ 1 kB ladder”. Пътека 1 — клон 1D12, съдържащ една ’HIV последователност”. Пътека 2 — клон 1F1, един нов клон извън ob областта. Пътека 3 — клон 1НЗ. Пътека4 — клон 2В2, който е идентичен с 1F1. Пътека 5 —клон 2G7, който съдържа един ob екзон. Пътека 6 — клон 2G11, който е идентичен с IF 1. Пътека 7 — клон 2Н1, който не съдържа insert.

Фигура 10 представя последователността на клона 2G7 (SEQ ID NO: 7), който включва един кодиращ екзон за част от ОВ гена. Последователностите на праймерите, използвани за амплифициране на този екзон, са заградени във фи гурата (SEQ ID NO: 8 и 9).

Фигура 11 (А) Анализ с обратна транскрипция и PCR (RT-PCR) на мРНК от различни тъкани на една и съща мишка с 2G7 праймери и с акгинови праймери. RT-PCR е проведен с помощта на 100 ng тотална РНК обратно транскрибирана с олиго-dT като праймер за синтез на първата верига кДНК. Амплификацията с PCR е извършена за 35 цикъла с денатурация при 94°С за 1 min; хибридизация при 55°С за 1 min; и удължаване при 72°С за 2 min с 1 min повторно автоудължаване на цикъл. Продуктите от RTPCR са разделяни в 2% нискотопим агарозен гел и електрофорезата е протичала в 1х ТВЕ буфер.

(В) РНК-блот хибридизация (Northerm blot) на мРНК от различни органи на мишка като е използувана 2G7 сонда белязана чрез PCR. 10 gg тотална РНК от всяка тъкан са подлагани на електрофореза във формамид-агарозен гел. Сондата е хибридизирана при 65° в Rapid Hybe (Amersham). Авторадиографските сигнали са визуализирани след едночасова експонация. Представеният експеримент е резултат на 24-часова експонация.

Фигура 12 (А) Оцветена с етидиев бромид кДНК, продукт RT-PCR от РНК изолирана от мастни клетки (бяла мастна тъкан) от всяка от упоменатите миши линии. Тотална РНК (100 ng) за всяка проба бе обратно транскрибирана посредством олиго dT и обратна транскриптаза и получената едноверижна кДНК беше амплифицирана с PCR с 2G7 праймери (долните ивици) или акгинови праймери (горните ивици). Както 2G7, така и актиновите праймери бяха включени в една и съща полемеразна верижна реакция. Продуктите са подлагани на електрофореза в 1% агарозен ТВЕ гел. (В) Northern анализ съответно на (А). 1 Ogg РНК от мастни клетки, (бяла мастна тъкан) от всяка от указаните линии беше фракцио-нирана чрез електрофореза и хибридизирана с 2G7 сонди, белязани чрез PCR както във Фигура 11В, по-горе. Установеното приблизително 20-кратно увеличение на нивото на 2G7 мРНК в РНК от бяла маст-на тъкан от линията C57BL/6J ob/ob (1J), в сравнение с потомството в мършаво котило. И в двата експеримента RTPCR и Northern анализа нямаше доловими сигнали в 2G7 РНК от SM/Ckc' + оЬ^и/оЬ^и (2J) мишки дори след двуседмична експонация. Представена е 24-часова експонация. Същият филтър е хибридизиран с актинова сонда (дол11 ната част на панела).

Фигура 13 представя Northern анализ на допълнителни 2 J животни и контролни животни, което потвърждава отсъствието на ob мРНК в 2J животните. Northern анализът е проведен както на фигура 11 и 12. В този случай, контролната РНК беше ар2, един транскрипт специфичен за мастната тъкан. Различната плътност на ар2 ивиците е без значение.

Фигура 14 сравнява ДНК последователността на C57BL/6J мишки (нормални) и C57BL/ 6J ob/ob (1J) мишки в областта на точковата мутация, която води до въвеждане на един преждевременен завършващ кодон (безсмислена мутация) в кДНК на мутантната линия. Мишките ob/ob имат една С-Т мутация, която променя аргининовия остатък на позиция 105. Тази базова замяна е представена като резултат на автоматичния ДНК секвенатор. RT-PCR е извършена с РНК от бяла мастна тъкан на двете линии (+/+ и ab/ab) като са използвани праймери от 5’ и 3’ нетраслираните участъци. Продуктите на PCR са гелно пречистени и директно секвенирани; мануално и с помощта на Applied Biosystems, Inc. 373А автоматизиран секвенатор с праймери за двете вериги на кодиращата последователност.

Фигура 15 (А) ДНК-блот хибридизация (Southern blot) на геномна ДНК от всяка една от изброените миши линии. Приблизително 5 μg ДНК (произхождаща от геномна ДНК получена от черен дроб, бъбрек или слезка) беше рестрикционно хидролизирана с указаната рестриктаза. След това ДНК бе подложена на електрофореза в 1% агарозен-ТВЕ гел и хибридизирана с 2G7 сонда белязана чрез PCR. Хидролизата с рестриктазата Bglll показа увеличаване размера на най-дългия Bglll фрагмент (около 9 кВ) в SM/ Ckc'^+Dac оЬ^л/оЬ²1 (2J) ДНК. Полиморфизъм в дължината на рестрикционните фрагменти (ПДРФ, RFLPs) не бе открит. RFLPs не бяха откриваеми с никой друг рестрикционен ензим. Предварително рестрикционно картиране на геномната ДНК показва, че полиморфното Bglll място е около 7 кВ преди 5’-началото на транскрипцията. Никой от другите изпитвани ензими не прехвърля началото на мРНК. (В) Сегрегация на Bglll полиморфизъм в линията SM/Ckc^+Dac ob^/ob²². Генотипизирани са шест потомства със затлъстяване и 5 с измършавяване от една и съща генерация на коизогенната колония SM/Ckc' ^+Dac ob^2J/ob^2J (2J) чрез отчитане на Bgin полиморфизма както е представено в (А). Всички фенотипно тлъсти животни бяха хомозиготни по дългия алел на полиморфния Bglll фрагмент. ДНК в “контролната” пътека беше получена от една неродствена SM/Ckc'^+Dac+/+ мишка, получена отделно от колонията SM/Ckc’^+Dac ob^/ob²².

Фигура 16 е Southern blot от EcoRI третирана геномна ДНК от изброените видове. Като сонда е използвана една ОВ кДНК (т. е. един зоо блот). Хибридизационни сигнали бяха открити в проби от всички гръбначни, дори при умерена строгост на хибридизацията. Котешката ДНК в този експеримент бе леко разградена. Третираната с рестриктаза ДНК беше подложена на електрофореза в 1% агарозен ТВЕ гел и прехвърлена за хибридизация на имобилон-мембрана. Филтърът беше хибридизиран при 65°С и пропит с 2х SSC/0.2% SDS при 65° два пъти по 20 min и експониран 3 дни на Kodak (Rochester, N.Y.) Х-ОМАТ филм.

Фигура 17 представя експресионния клониращ участък на вектора pET-15b (Novagen) (SEQ ID NOS: 11 и 12).

Фигура 18 представя анализ на елюат от колона със свързваща хистидин смола (Hisbinding resin) (Ni) за свързване на зрелия миши ob с един His-tag (А) и свързване на зрелия човешки ОВ с His-tag (В). Бактериите бяха трансформирани съответно с векторите рЕТМ9 и рЕТН14. След индукция с 1 mM IPTG при оптимални условия, трансформираните бактерии бяха способни да произвеждат 100-300 μg/ml от ОВ-слетия белтък, главно във включващи телца. Включващите телца бяха солюбилизирани с 6М гуанидин-HCl или урея и слетият белтък (намиращ се в супернатантата на лизата) се нанасяше на колона от His-свьрзваща смола (Ni) в 10 ml lx свързващ буфер с урея. Колоната бе елюирана стъпаловидно с количества от по 5 ml, 20 μΜ, 60 μΜ и 300 μΜ имидазол и накрая само с буфер (stripe buffer). Фракциите бяха анализирани за наличие на ОВ слят полипептид в 15% акриламиден гел. Всяка пътека съдържа количество еквивалентно на 100 ml бактериален екстракт.

Фигура 19 (A) In vitro транслация на ОВ РНК. Човешка ОВ кДНК е субклонирана в pGEM вектор. Плазмидьт бе линеаризиран и + верига РНК е синтезирана с помощта на Sp6 полимераза. Синтезираната in vitro РНК бе тран12 слирана в присъствие или отсъствие на кучешки панкреатични микрозомни мембрани. След in vitro транслацията бе наблюдаван един приблизително 18 kD транслационен продукт. Добавянето на микрозомни мембрани към реакцията води до поява на втори транслационен продукт с около 2 kD по-малък от първичния транслационен продукт. Размерът на транслационния продукт на интерлевкин-1 а РНК, в която сигнална последователност не е кодирана, не се променяше след добавянето на микрозомни мембрани. Тези данни показват наличието на функционална сигнална последователност. (В) In vitro транслация в присъствие или отсъствие на протеиназа К. Протеазното третиране води до пълна протеолиза на първичния 18 kD транслационен продукт, докато процесираната 16 kD форма остава незасегната. Пермеабилизирането на микрозомите чрез третиране с 0.1% Тритон-Х-100 прави процесираната форма чувствителна на протеазно третиране. Тези резултати показват, че продуктът е транслиран в лумена на микрозомата.

Фигура 20 (А до Е) Последователност на човешкия ОВ ген (SEQ ID NOS:22 и 24). (F) Схематична диаграма на мишия ОВ ген. (G) Схематична диаграма на човешкия ОВ ген. Както в (F) така и в (G), началните и завършващите кодони са подчертани. Няма данни за първи интрон в човешкия ген, хомо-ложен на мишия първи интрон, но неговото съществуване не може да бъде изключено.

Фигура 21 представя схематично изображение на една от клониращите стратегии, приложени за постигане рекомбинантна експресия на ОВ в дрожди от рода Pichia yeast. (А) Експресионен вектор на ОВ със сигнална последователност на половия α-фактор. (В) Схематично изображение на структурата на рекомбинантния слят белтък, включващ аминокиселинната последователност (SEQ ГО NO: 26), показващо Xhol мястото и възможните КЕХ-2 и STE-13 места на скъсване и N-крайните допълнителни аминокиселини, които остават след разграждане с КЕХ2 (SEQ ГО NO: 27). (С) Една алтернативна стратегия за получаване на зрял ОВ включва изготвянето на конструкт с аминокиселинна последователност, съответствуваща на Xhol мястото на скъсване и едно КЕХ-2 място на скъсване, разположено непосредствено преди полипептидната последователност на зрелия ob (SEQ ГО NO:

28).

Фигура 22 Алтернативна експресионна стратегия при Pichia. (А). Експерсионен вектор на едно ОВ сливане с един His-tag от рЕТ експресионната система поставена под контрола, на сигналната по-следователност на половия афактор (SEQ ГО NO: 33). (В) Схематично изображение на структурата на рекомбинантния Histag съдържащ ОВ слят продукт, който включва сигналната последователност на половия а-фактор, предполагаеми КЕХ-2 и STE-13 места на скъсване, самият His-tag и мястото на скъсване от тромбина. Този слят полипептид ще произведе един ОВ с три допълнителни N-крайни аминокиселинни остатъци.

Фигура 23 (A) PAGE анализ на експресията на мишия ОВ (и двете микрохетерогенни форми, т. е. със и без Gin 49) в трансформирани дрожди Pichia. Очакваната фракция от около 16 kD се открива в културалната течност на трансформираната дрождева култура (втора и трета пътека), но не и в течност от нетрансформирани дрожди (първа пътека). (В) PAGE анализ на рекомбинантен ОВ полипептид частично пречистен на карбоксиметил целулоза, един слаб катионообменник. Добре личи една ивица около 16 kD във фракция 3 и 4 на колоната, която е елюирана с 250 mM NaCl. Пътека 1 — нанесена проба, пътека 2— преминала проба, пътека 3-5—фракции елюирани с 250 mM NaCl.

Фигура 24 показва, че ОВ белтъкът циркулира в мишата плазма. (А) Имунопреципитации от миша кръв, 0.5 ml миша плазма бе предварително избистрена с несвързана сефароза и инкубирана за една нощ с имунопречистени анти-ОВ антитела свързани със сефароза 4В. Имунопреципитатьт бе фракциониран на 15% SDSPAGE гел, прехвърлен на мембрана и бе проведен имуноблотинг с анти-ОВ антитяло. Белтъкът мигрира съответно на молекулно тегло от около 16 kD до същото място както зрелия миши ob белтък експресиран в дрождите. Белтъкът отсъствуваше в плазма от C57BL/6J ab/ob мишки и нарастваше 10-кратно в плазма от C57BLB/Ks db/db мишки сродни с дивия тип мишки. Предположено бе, че db мишките свръхпродуцират ОВ белтък вторично, поради резистентност към неговото действие. (В) Повишени нива на ОВ в тлъсти плъхове. Тлъстият плъх е затлъстял в ре13 зултат на рецесивна мутация в плъшата хромозома 5. Генетични данни подсказват генетичен дефект в същия ген, който е мутирал в db мишките. Плазма от тлъсти плъхове и мършави котила беше имунопреципитирана и подложена на Western blot. Наблюдавано бе 20-кратно нарастване нивото на циркулиращия ОВ в мутантни животни. (С) Количествено определение на ОВ белтък в миша плазма. Нарастващи количества от рекомбинантен миши белтък са прибавяни към 100 λ плазма от ob мишки и са имунопреципитирани. Интензитетът на сигнала в имуноблотовете беше сравняван с този от 100 λ плазма от див тип мишки. Наблюдавано бе линейно нарастване интензитета на сигнала с нарастване количествата на рекомбинантния белтък, което показва, че имунопреципитациите са извършени в условия на излишък на антитяло. Подобни сигнали бяха наблюдавани в проби плазма от див тип и проба с 2 ng рекомбинантен белтък, което показва, че циркулиращото ниво в мишата плазма е около 20 ng/ml. (D) ОВ белтък в екстракти от мастна тъкан. Цитоплазмени екстракти от миша мастна тъкан са изолирани от db и див тип мишки. Имуноблотовете показват повишени нива на 16 kD белтък в екстрактите получени от db мишки.

Фигура 25 показва, че ОВ белтъкът циркулира в променливи нива в човешката плазма.

(A) Имуноблотове от човешка плазма. Проби от плазма са получени от 6 мършави доброволци. Имунопреципитация и Western blot разкриха наличието на един имунореактивен 16 kD белтък, идентичен по размери с един рекомбинантен човешки белтък от 146 аминокиселини експресиран в дрожди. Променливи количества белтък бяха наблюдавани във всяка от шестте проби.

(B) Ензим свързана имунопроба (ЕСИП-ELISA) за човешки ob. Микротитрационни платки бяха покрити с имунопречистени анти-човешки ОВ антитела. Известни количества от рекомбинантния белтък се прибавяха в платките и се определяха с помощта на имунопречистени биотинилирани анти-ob антитела. За получаване на стандарт-на крива абсорбцията при 414 шп бе отчитана при известни концентрации от ОВ. Получената стандартна крива показа, че методът може да открива най-малко 1 ng/ml човешки ОВ белтък. (С) Количествено определяне на ОВ белтък в човешка плазма. Проведено е имуноопределение с

ELISA като са използувани 100 λ плазма от шест мършави доброволци и стандартите използвани в (В). Нивата на ОВ белтъка варираха в границите от 2 ng/ml в НР1 до 15 ng/ml у НР6. Тези данни корелират с данните от имуноблотинга в раздел (А).

Фигура 26 показва, че ОВ белтъкът образува между- или вътремолекулни дисулфидни връзки. (А) Имуноблотинг при редуциращи и нередуциращи условия. Имуноблотове от миша и човешка плазма бяха повтаряни със и без добавка на редуциращи агенти към буфера на пробата. Когато от буфера на пробата се премахне β-меркаптоетанол, имунопреципитатите от db плазма мигрират с видима молекулна маса 16 kD и 32 kD. Добавянето на β-меркаптоетанол към буфера води до изчезване на 32 kD компонента (вж. фиг. 24). Този резултат се повтаря когато мишият белтък се експресира в дрождите, Pichia pastoris. В този случай, мишият ОВ белтък мигрира до мястото на димера. При редуциращи условия, пречистеният рекомбинантен миши белтък мигрира с видимо молекулно тегло 16 kD, което показва, че молекулната форма 32 kD е резултат на една или две междумолекулни дисулфидни връзки. Човешкият белтък експресиран in vivo и в Pichia pastoris мигрира с молекулна маса 16 kD при редуциращи и нередуциращи условия, данните не са представени. (В) Човешкият белтък експресиран в дрожди съдържа една вътремолекулна дисулфидна връзка. Секретираните белтъци обикновено приемат точната си конформация когато се експресират в експресионната система на Pichia pastoris. Съдържащият 146 аминокиселини зрял човешки белтък бе експресиран в Pichia pastoris и пречистен от дрождената хранителна среда чрез двуетапен протокол за пречистване, включващ IMAC и гелфилтрация. Пречистеният рекомбинантен белтък бе подложен на мас-спектрометрия преди и след разкъсване с цианогенбромид. Цианогенбромидът къса при карбоксилния край на метиониновиге остатъци. Молекулната маса на рекомбинантния дрождев белтък бе 16,024 ± 3 Da (изчислена молекулна маса 16,024 Da). Цианогенбромидът къса след трите метионина в белтъчната последователност при аминокиселини 75,89 и 157. Цианогенбромидният фрагмент с измерена маса

8435.6 Da съответствува на аминокиселините 90157 и 158-167 свързани с една дисулфидна връз ка между cys-117 и cys-167 (изчислена молекулна маса = 8434.5 Da). N.D. = не е определяно.

Фигура 27 изобразява препарат от биоактивен рекомбинантен белтък. Нуклеотидната последователност съответствуваща на 145-аминокиселиния зрял миши ОВ белтък беше клонирана в експресионения вектор рЕТ 15Ь. Този рЕТ вектор включва един полихистидинов тракт (Histag) разположен преди клонираната последователност, което позволява ефективно пречистване с помощта на имобилизиран метал-афинитетна хроматография (IMAC). След бактериален лизис рекомбинантният бактериален белтък първоначално се отделя в мембранната фракция. Мембранната фракция е солюбилизирана с гуанидинНС1 и нанесена на IMAC колона. Белтъкът бе елюиран стъпаловидно с нарастващи концентрации от имидазол както е показано. Елюираният белтък беше ренатуриран и третиран с тромбин за премахване на His-tag, както е описано подолу. Крайният добив от разтворим белтък беше 45 ng/ml от бактериалната култура.

Фигура 28 представя биологичните ефекти на ОВ белтъка. Крива на приетата храна (раздел А-С) и на телесното тегло във времето (раздел D-F). Групи от десет животни получаваха ежедневно интраперитонеални инжекции от ОВ белтък в доза 5 mg/kg дневно (плътни квадратчета), или инжекции с PBS (плътни кръгчета) или не бяха третирани (плътни триъгълничета). Третираните групи включваха С57В1/6J ob/ob мишки (панели А и D), C57B1/Ks db/db мишки (панели В и Е) и CBA/J+/+ мишки (панели С и F). Приеманата от мишките храна бе измервана всеки ден и телесното тегло бе отчитано на три до петдневни интервали както е указано. (Скалата за телесното тегло в грамове е различна за дивия тип мишки спрямо мишките ob и db). Приетата храна от ob мишките, които получават белтък, спада след първата инжекция и се стабилизира след четвъртия ден на ниво приблизително 40% от това на лъжливо инжектираната група (р < .001). Теглото на тези животни намаляваше с около 1.3 g/ден и се стабилизира след три седмици до ниво приблизително 60% от началното тегло (р <.0001). Ефект от белтъка при db мишките не бе проявен. Слаб, но достоверен ефект върху телесното тегло бе наблюдаван при CBA/J мишките при два ранни срока от време (р < .02). Стандартната грешка на всяко измер ване е изразена с черта и статистическата достоверност на тези резултати е показана на таблица 1.

Фигура 29 представя резултатите от чифтно хранене на ob мишки. (А) Група от четири С57В1/6J ob/ob мишки беше хранена с количество храна равно на това, консумирано от групата ob мишки, получаващи рекомбинантен белтък. Загубата на тегло за двете групи бе изчислена след пет, осем и дванадесет дни. Мишките с ограничено хранене (защрихована колонка) губят по-малко тегло отколкото ob мишките, получаващи белтък (плътна колона) (р < .02). Този резултат показва, че намаляващият теглото ефект на ОВ белтъка е резултат на ефекта и на двата фактора - приемане на храна и енергетичен разход. (В) Фотография на третирана ob мишка. Показани са две C57B1/6J ob/ob мишки. Мишката отляво е получавала PBS и тежи 65 g, което беше началното тегло. Мишката отдясно е получавала ежедневни инжекции с рекомбинантен ОВ белтък. Началното тегло на това животно беше 65 g и теглото след триседмично третиране с белтък беше 38 g. (С) Черен дроб от третирани и нетретирани ob мишки. Показани са черни дробове от третирани и нетретирани С57В1/6J ob/ob мишки. Черният дроб от мишки получавали PBS има общият вид на мастен черен дроб и тежи 5.04 g. Черният дроб от мишки, получавали рекомбинантен ob белтък, има нормален вид и тежи 2.23 g.

Фигура 30 представя in situ хибридизация на ob с мастна тъкан. Сенз и антисенз ob РНК бяха белязани in vitro с помощта на Sp6 и Т7 полимераза и дигоксигенин. Белязаните РНК бяха хибридизирани с включени в парафин срези от мастна тъкан от епидидимни мастни възглавнички на осемседмични C57B1/Ks мишки (отбелязани като див тип) и C57B1/Ks db/db мишки (отбелязани като db). На фигурата липидните капчици се появяват като неоцветени вакуоли в клетките. Цитоплазмата е тънка ивица в периферията на клетките и е неразличима от клетъчната мембрана. Хибридизация с всички адипоцити в полето се открива при срезите от дивия тип само когато е използвана антисенз сонда. В тъканни срези от db/db животни нивата на хибридизация са силно увеличени.

Фигура 31 показва, че ОВ РНК се експресира в адипоцити in vivo и in vitro. Тотална РНК (10 pg) от няколко различни източници беше електрофорезирана, прехвърлена на мембрана и хибридизирана с ob сонда. Първоначално за пречистване на адипоцитите бяха използувани разлики в плаващата плътност на клетките след хидролиза с колагеназа. ОВ РНК бе открита само в адипоцитната фракция. Пътека S показва стромоваскуларната фракция и А показва адипоцитната фракция. В допълнение, ОВ РНК не беше експресирана в недиференцираните ЗТЗ-442 преадипоцитни клетки пътека U. Диференцира-ните адипоцити от тези клетъчни линии експресират ясно откриваеми нива на ОВ мРНК (пътека D).

Фигура 32 показва, че ОВ РНК се експресира във всички депа на мастна тъкан. Всички тестирани депа на мастна тъкан експресираха ob РНК. Ингвиналната мастна възглавничка експресира малко по-ниски нива РНК, въпреки че има разлики в силата на сигналите в различните експерименти (фигура 31 А). Пътеки (1) епидидимна, (2) ингвинална, (3) коремна, (4) параметриални мастни възглавнички. Кафявата мастна тъкан също експресира ниско ниво ОВ РНК (Фигура 31В). Нивото на ОВ експресията в кафявата мастна тъкан е непроменено при животни, отглеждани при 4°С в продължение на една седмица, докато изобилието на специфичната за кафявата мастна тъкан UCP РНК, известна, че е студоиндуцируема, нараства петкратно.

Фигура 33 изобразява експресията на ОВ РНК у db/db мишки и мишки, третирани със злато тиоглюкоза (GTG). Тоталната РНК от параметриалните мастни възглавнички на GTG и db/ db третираните мишки беше електрофорезирана и използувана за Northern blot. GTG въведена като единична доза е известно, че предизвиква затлъстяване, като индуцира специфични хипоталамични лезии. (А) Едномесечни СВА женски мишки бяха третирани с GTG (0.2 mg/g), при което се получава нарастване с > 20 g у третираните животни в сравнение с контролните животни (< 5 g). (В) Хибридизация на една ОВ сонда с РНК от ob/ob и GTG третирани мишки показва 20-кратно нарастване на изобилието от ob РНК в сравнение с контролната РНК (актин или GAPDH).

Фигура 34 представя Northern blot, анализ на човешка РНК. РНК-блотовете, съдържащи 10 mg тотална РНК от човешка мастна тъкан (FAT, панел А) и 2 mg поли-А+ РНК от други човешки тъкани (панел В) бяха хибридизирани с човешки ob или човешки β-актин сонди както е указано при тотална РНК от мастна тъкан бе наблюдаван силен сигнал на място около 4.5 kb. Хибридизация на поли А+ -РНК разкрива доловими сигнали в сърце (НЕ) и плацента (PL), докато ОВ РНК не беше открита в мозък (BR), бял дроб (LU), черен дроб (LI), скелетна мускулатура (SM), бъбрек (KI) и панкреас (РА). При всеки случай е указана продължителността на авторадиографската експонация. Като забележка, произходът на по-нискомолекулните ивици, наблюдавани в плацентарната РНК (напр. алтернативно снаждане, разграждане на РНК), остава неизвестен.

Фигура 35 представя YAC contig, съдържащ човешкия ОВ ген и 8 микросателитни маркери. Изобразена е картата на областта от хромозома 7, съдържаща човешкия ОВ ген, базираща се на съдържанието на YAC-STS. Картата е съставена чрез SWGMAP/Version 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)]. Деветнадесетте уникално подредени STSs (вж. Таблица 3) са изброени по-горе. Осемте специфични микросателитни STSs са посочени със звездичка (вж. Таблица 4). Посочени са и STSs съответствуващи на гените Рах4 и ОВ, както и предсказаното разположение на центромера (CEN) и на 7 q теломера (TEL) спрямо contig. Всеки от 43-те YAC клона е представен с хоризонтална черта, с името дадено отляво и големината на YAC (в kb, измерени чрез гелна електрофореза в пулсиращо поле) е дадена в скоби. Наличието на един STS в един YAC е посочено на съответното място със запълнено кръгче. Когато STS съответствува на инсерирания край на един YAC, съответното кръгче е оградено в квадратче, и двете по протежение на най-горната черта (близо до името на STS) и в края на YAC, от когото произлизат. При 5 YACs в долната част на фигурата (под прекъснатата хоризонтална линия), 1 или повече STS(s) очаквани да са налице (въз основа на определения STS порядък) не бяха открити (установено чрез двукратно тестиране на отделните YACs със съответни STS-специфични PCR). Тези STS са представени на съответните места с празни кръгчета. Повечето от YACs последователностите са изолирани от библиотека произхождаща от хибридна клетка човек-хамстер [Green et al., Genomics, 25: 170-183 (1995)], c техните оригинални имена, както е указано. Оста налите YACs последователности са изолирани от тотални човешки геномни библиотеки и местоположенията на тяхната оригинална библиотека са дадени на Таблица 3. Имената на 3 YACs (yWSS691, WSS999 и yWSS2935) са заградени в боксове. С FISH анализ бе намерено, че тези YACs се картират към 7q31.3. Контигът е представен в неговата “неизчислена” форма, при която размерите на YAC не се използуват за определяне припокриването на клоновете или за разстоянията между STSs и следователно всички STSs са разположени на еднакво разстояние. При “изчислена” форма, където размерите на YAC се използуват за определяне на относителното разстояние между съседните STSs както и степента на припокриване на клоновете, тоталният YAC contig изглежда се про стара точно върху 2 Mb.

Подробно описание на изобретението

Настоящето изобретение се отнася до откриването и характеризирането на един белтък, наречен тук ob белтък или лептин, до нуклеиновите киселини, които кодират този белтък, включително техни дегенерирани варианти. Това включва например оптимални кодони за експресия в специална експресионна система, с която белтъкът проявява способността си да участвува в контрола на телесното тегло у бозайници. Нуклеиновите киселини предмет на изобретението представляват кодиращи последователности съответстващи на мишия и човешкия ОВ полипептид, за който е постулирано, че играе решаваща роля при регулация на телесното тегло и затлъстяването. Представените тук данни показват; че полипептидният продукт на една нуклеинова киселина-обект на изобретението, се секретаря от клетките, които го експресират, и че полипептидът функционира като хормон. Допълнителни експериментални данни показват, че ОВ полипептидът е много ефективен при третиране на затлъстяване у мишки, носещи мутация на ob гена. Освен това, високи bolus дози или умерени многократни дози от ОВ полипептид предизвикват намаление на теглото в нормални (див тип) мишки.

В допълнение, представените тук примери показват, че ОВ полипетидьт, алтернативно назоваван тук “лептин”, циркулира в плазмата на мишки, плъхове и човека. Лептин отсъства в плазмата на ob/ob мишки, налице е в 10-кратно по-високи концентрации в плазмата на db/db мишки и в 20-кратно по-високи концентрации у fa/fa плъхове. Най-значимото е, че ежедневни инжекции с рекомбинантен лептин драматично намаляват телесната маса на ob/ob мишки, значително променят телесното тегло на див тип мишки и нямат ефект върху db/db мишки.

В един по-нататъшен аспект, ОВ полипептидът от един вид е биологично активен при друг вид. По-специално, човешкият ОВ полипептид е активен при мишки.

В своя първоначален вид настоящото изобретение е насочено към идентифициране на вещества, които функционират като модулатори на теглото при бозайници. По-конкретно изобретението се отнася до изолиране, пречистване и секвениране на някои нуклеинови киселини, които съответствуват на ОВ гена или на неговата кодираща област при мишки и при хора, както и съответните полипептиди, експресирани от тези нуклеинови киселини. Изобретението включва откриването на нуклеинови киселини с нуклеотидни последователности представени по-долу във фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1) и фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3) и техни дегенерирани варианта, алели и фрагмента всички притежаващи активност за модулиране телесното тегло и затлъстяването. Съответствието на тези нуклеинови киселини с ОВ гена предвижда тяхното значимо въздействие при затлъстяване, както и при други заболявания и дисфунк-ции, където абнормните промени на телесното тегло са допринасящ фактор. Изобретението обхваща белтъците експресирани от нуклеиновите киселини на изобретението и в частност белтъците представени подолу на Фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 2), фигура 3 (SEQ ID NO: 4), Фигура 5 (SEQ ID NO: 5) и фигура 6 (SEQ ID NO: 6), както и консервативни варианти, активни фрагменти и сродни малки молекули.

Както бе обсъждано по-горе, модулаторните пептиди контролиращи теглото, техните рецептори, други лиганди или агенти-агонисти или антагониста спрямо тях, или контролиращи тяхната продукция, могат да бъдат изготвени като фармацевтични препарати с подходящ носител. Ефектът им е достатъчно силен за въвеждане по различни начини за лечение на пациенти с аб17 нормни промени в телесното тегло или затлъстяване като самостоятелно заболяване или като част от противоположно болестно състояние като рак или СПИН. Могат да бъдат прилагани различни техники за въвеждане, между които перорално, назално и други форми на трансмукозно въвеждане, парентерални техники като подкожни, интравенозни и интраперитонеални инжекции, катетеризации и други. Средните количества от признатите фактори или техни субединици могат да варират и в частност трябва да се базират на препоръките и предписанията на квалифицирани лекари или ветеринарни лекари.

В съответствие с по-горното, може да бъде изготвена опитна система за скриниране на потенциални лекарствени препарати способни да наподобяват или да антагонизират модулатора на теглото. Модулаторът на теглото може да бъде въведен в тестираща система и проспекгивният препарат може също да бъде въведен в клетъчна култура. Културата може да бъде изпитана впоследствие, за да се открият някакви промени в активността на клетките, дължащи се на прибавянето на възможния лекарствен препарат или на действието на прибавени количества от известния модулатор на теглото.

Както бе отбелязано по-горе, молекулното клониране на описания тук ОВ ген доведе до идентифицирането на един клас вещества, които действуват на молекулно ниво за модулиране телесното тегло при бозайници. Откритието на модулаторите, предмет на изобретението, има важни приложения за диагнозата и лечението на смущения в храненето, включващи, но не ограничаващи се до затлъстяване, загуба на тегло, свързано с раково заболяване и лечение на заболявания, свързани със затлъстяване като хипертония, сърдечни заболявания и Тип II диабет. Като допълнение, съществуват възможни приложения на генния продукт в земеделието, в случаи когато е желателно модулирането на телесното тегло на домашни животни. Накрая, поради това че един или повече от модулаторите - предмет на изобретението са секреторни молекули, те могат да бъдат използвани биохимично за изолиране на техните рецептори, използвайки експресионна клонираща технология. Дискусията, която следва, се отнася конкретно до ОВ гена, но е общо приложима към класа модулатори, които обхващат една част от на-стоящото изобретение и следователно трябва да бъде в съответствие с такъв обсег на интерпретация.

Както бе отбелязано по-горе, функционалната активност на ОВ полипептида може да бъде оценена трансгенетично. В това отношение като модел може да бъде използвана трансгенна мишка. Генът ob може да бъде използван в комплементационни изследвания с трансгенни мишки. Трансгенни вектори, включително вирусни вектори или космидни клонове (или фагови клонове) съответстващи на локуса на дивия тип на гена-кандидат, могат да бъдат конструирани, като се използва изолиран ob ген. Космидите могат да бъдат въведени в трансгенните мишки, като се използват публикувани процедури [Jaenisch, Science, 240: 1468-1474 (1988)]. Конструктите се въвеждат в оплодени яйцеклетки, произхождащи от кръстоска между F1 потомство на C57BL/6J ob/ob X DBA кръстоска. Тези кръстоски изискват използването на овариални трансплантати от C57BL/6J ob/ob за да се създадат F1 животни. Като противоположна линия са използувани DBA/2 J мишки тъй като цветът на козината им е неагути, което е важно когато се използват овариални трансплантати. Генотипът на ob локусите в космидните трансгенни животни може да бъде определен чрез типизиране на животните с тясно скачен полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти (ПДРФRFLPs) или по микросателитите, които фланкират мутацията и които са полиморфни между двете родителски линии. Комплементация ще се прояви, когато даден конструкг превръща едно генетично затлъстяло F2 животно, определено чрез ПДРФ-анализ, в мършаво и недиабетично. При тези условия крайното доказателство за комплементация ще изисква ob/ob или db/db животните, носещи трансгена, да бъдат съчетани с ob/ob или овариалните трансплантанти. При това кръстосване, всички N2 жи-вотни, които не притежават трансгена ще бъдат тлъсти и инсулин-резистентни, докато тези, които носят трансгена, ще бъдат мършави и ще имат нормални концентрации на глюкоза и инсулин в плазмата. В генетичен смисъл, трансгенът действа като супресорна мутация.

Алтернативно, ОВ гените могат да бъдат тестирани чрез изследване на техния фенотипен ефект, когато се експресират в антисенз ориентация в див тип животни. При този подход, екс18 пресията на алела див тип е потисната, което води до мутантен фенотип. Образуването на РНКРНК дуплекси антисенз-сенз предотвратява нормалното функциониране на мРНК, което води до частично или пълно елиминиране на ефекта на дивия тип ген. Тази техника е използвана за инхибиране синтеза на тимидинкиназата в тъканна култура и за получаване на фенотипове на Kruppel мутацията в Drosophila, и на Shiverer мутацията в мишки (Izant et al., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569597 (1986); Katsuki et al., Science, 241: 593-585 (1888). Важно предимство на този подход е, че за ефективно инхибиране на цялата сродна мРНК е необходимо да се експресира в антисенз-ориентация само малка част от гена. Антисенз-трансгенът може да бъде поставен под контрола на собствения си промотор или на друг промотор, експресиран в съответния клетъчен вид и разположен преди мястото на SV40 poly А. Този трансген ще бъде използван за създаване на трансгенни мишки. Трансгенните мишки могат да бъдат също съчетани с овариални трансплантанти, за да се провери дали ob хетерозиготите са почувствителни към въздействието на антисенз конструкта.

В широк смисъл, изясняването на биохимичната функция на продукта на ОВ гена (ОВ полипептид или белтък) е полезно за идентифицирането на малки молекули агонисти и антагонисти, които повлияват тази активност.

Различните термини, използувани в тази спецификация, са дефинирани тук по-долу. Например:

Терминът “модулатор на телесното тегло”, “модулатор”, “модулатори” и всякакви други варианти, които не са специално изброени, могат да бъдат използвани взаимнозаменяемо и както са използувани в настоящото изобртение. Патентните претенции се отнасят еднакво и за нуклеотидните последователности и за белтъчния материал, като последният включва и прости и сложни белтъци. По-конкретно, споменатите термини се разширяват и за нуклеотидите и за ДНК, имащи последователностите, описани тук и представени на Фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1) и фигура 2А и В (SEQ ID NO: 3). Подобно на това, включени са също така и белтъците с описаните тук аминокиселинни последователности и представени на Фигура 1А до Е (SEQ ID NO:) и Фи гура 3 (SEQ ID NO: 4) са също така допълнени, както и профила на описаните активности по отношение на всички материали тук и в претенциите. Съответно, обхванати са и нуклеотидите проявяващи значителна еквивалентна или променена активност, като са включени съществени хомоложни аналози и алелни варианти. Подобно на това, включени са и белтъците, проявяващи значителна еквивалентна или променена активност, включително насочено модифицираните белтъци, като например чрез мястоспецифична мутагенеза или изменените случайно чрез мутации в гостоприемниците, които продуцират модулаторите.

Препарат включващ А” (където “А” е отделен белтък, ДНК молекула, вектор, рекомбинантна клетка гостоприемник и т. н.) е съществено свободен от “В” (където “В” включва един или повече контаминиращи белтъци, ДНК молекули, вектори и т.н., но изключва рацемични форми на А), когато поне около 75% от теглото на белтъците, ДНК, векторите (в зависимост от вида на съставките, към които принадлежат А и В) в препарата е “А”. Предпочита се в състава “А” да обхваща поне около 90% като тегло от А+В видовете, а най-предпочитано поне 99% от теглото. Предпочита се също така съставът, който е съществено чист от примеси, да съдържа видове само с едно и също молекулно тегло, които имат активност или характеристики на видовете, които са от интерес.

ОВ полипептиди

Термините “белтък”, който се отнася за естествено срещащите се полипептиди и “полипептид” се използуват тук взаимозаменяемо по отношение продукта на ob гена и неговите варианти. Терминът “зрял белтък” или “зрял полипептид” се отнася специално за продукт на ОВ гена, в който сигналната последователност (или партньор ако се отнася до слят белтък) са били отстранени.

Както бе отбелязано по-горе, специфичните изпълнения на ob полипептидите на изобретението включват тези с представените тук аминокиселинни последователности, например SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6 и т. н. Те включват ob полипептид модифицирал с консервативни амино-киселинни замествания, както и биологично активни фрагменти, аналози и техни деривати. Терминът “биологично активен” се използува тук по отношение специфичния ефект на полипептида, включително, но не ограничаващо се до специфично свързване, напр. за рецептор, антитяло или друга разпознаваща молекула; активиране на сигнални пътища за предаване на молекулно ниво; и/или индукция на (или инхибиране с антагонисти) на физиологични въздействия, осъществявани посредством нативния ob полипептид in vivo. ОВ полипептиди, включително техни фрагменти, аналози и деривати могат да бъдат получени синтетично, напр. с добре известните техники на твърдофазна пептидна синтеза или синтеза в течна среда. Предпочита се използване техниките за синтеза на твърда фаза. Алтернативно, ОВ полипептидите на изобретението мога да бъдат получени с добре известните техники на генното инженерство, както се описва подолу. В едно друго изпълнение, ОВ полипептидът може да бъде пречистен, напр. чрез имуноафинитетно пречистване от една телесна течност, като плазма, без да се ограничава само до нея, серум или урина и за предпочитане от обект, който свръхекспресира полипептида, като например затлъстял индивид, страдащ от мутация на ОВ рецептора или от затлъстяване свързано с мутация съответстваща на на “fatty”.

Фрагменти на ОВ полипептида

В едно специално изпълнение, настоящото изобретение предвижда, че естествено срещащите се фрагменти от ОВ полипептида имат важно значение. Пептидната последователност включва известен брой места, които често са прицел за протеолитично скъсване, напр. аргининови остатъци. Възможно е цялата дължина на полипептида да бъде скъсана на едно или повече такива места, за да образува биологично активни фрагменти. Такива биологично активни фрагменти могат да агонизират или да антагонизират функционалната активност на ОВ полипептида да намалява телесното тегло.

Аналози на ОВ полипептида

Настоящото изобретение специално предвижда получаването на аналози на ОВ полипетида, които се характеризират с това, че имат биологичната активност на ОВ полипептида, напр. способността да се свързват със специфичен партньор на ob пептид, като ОВ рецептора. В едно изпълнение, аналогът усилва ОВ активността, т.е. той действа подобно на ob полипептида. Предпочитано, ОВ агонистьт е по-ефективен от колкото природния белък. Например, един ОВ агонист аналог може да се свързва с по-висок афинитет с ОВ рецептора или може да проявява по-дълъг полуживот in vivo или да проявява и двата ефекта. Независимо от това, ОВ пептидните аналози агонисти, които са по-слабо ефективни от природния белтък, са също включени. В едно друго изпълнение, аналогът антагонизира ОВ активността. Например, ОВ аналог, който се свързва с ОВ рецептора, но не индуцира сигнално предаване, може да инхибира конкурентно свързването на природния ОВ с рецептора и така да понижава ОВ активността in vivo. Такъв ОВ аналог антагонист може да проявява и свойства различни от тези на ob пептида, напр. по-дълъг (или по-къс) полуживот in vivo, по-силен (или послаб) афинитет към ОВ рецептора или и двете свойства.

В едно изпълнение, аналог на ОВ пептида е ОВ пептид модифициран чрез заместване на аминокиселини на позиции, които не са съществени за структурата и функцията. Например, тъй като е известно, че човешкият ОВ пептид, е биологично активен в мишка, заместването в човешката последователност на аминокиселинни остатъци, които в мишата аминокиселинна последователност са различни, би могло да даде полезни аналози на ОВ пептида. Например, сериновият остатък в позиция 53 или позиция 98, или и в двете позиции (в представената на фигура 4 непроцесирана аминокиселинна последователност) от човек, могат да бъдат заместени, напр. с глицин, аланин, валии, цистеин, метионин или треонин. Подобно на това, аргининовият остатък на позиция 92 (фигура 4) може да бъде заместен с аспаргин, лизин, хистидин, глутамин, глутаминова киселина, аспаргинова киселина, серин, треонин, метионин или цистеин. Отнесени пак към Фигура 4, други аминокиселини в човешкия ОВ пептид, които изглежда, че са податливи на заместване са хистидин в позиция 118, триптофан в позиция 121, аланин в позиция 122, глутаминова киселина в позиция 126, треонин в позиция 127, левцин в позиция 128, глицин в позиция 132, глицин в позиция 139, триптофан в позиция 159 и глицин в позиция 166. В друго изпълнение, би могло да стане заместване на един или повече остатъци от 121 до 128 (както е представено на Фигура 4), напр. с глицинови или аланинови остатъци или да бъдат заместени някои от остатъците, с изключение на серин в позиция 123 или левцин в позиция 125.

В друго изпълнение, един аналог на ОВ полипептида, за предпочитане човешкият ОВ полипептид е една скъсена форма на полипептида. Например, демонстрирано е, че глутаминът при остатък 49 не е съществен и може да отпадне от пептида. Подобно на това, би било възможно да отпаднат някои или всички дивергирали аминокиселинни остатъци в позиции 121-128. Като допълнение, изобретението предвижда получаване на ОВ аналог притежаващ минималната аминокиселинна последователност, необходима за да има биологична активност. Това може лесно да се определи, напр. чрез тестиране способността на ОВ фрагментите да се свързват с ОВ специфични антитела, да инхибират активността на природния ОВ полипептид или да усилват активността на природния ОВ пептид. В едно изпълнение, изобретението предлага един скъсен ОВ полипептид, състоящ се от примковата структура, образувана чрез дисулфидна връзка между цистеновите остатъци 117 и 167 (както е показано на фигура 4). В друго изпълнение, скъсеният аналог съответства на аминокиселините от остатък 22 (разположен след предполагаемото място на скъсване на сигналния пептид) до 53 (аминокиселинния остатък, който непосредствено предшествува една област на подвижна примка, открита чрез ограничена протеолиза, последвана от мас спектрометричен анализ на ОВ полипептида; вж. Cohen et al., Protein Science, 4: 1088 (1995). В друго изпълнение, скъсеният аналог съответства на аминокиселините от остатък 61 (остатъкът непосредствено след областта на подвижната примка, определен чрез ограничена протеолиза/мас спектрометричен анализ на ОВ полипептида) до аминокиселинен остатък 116 (остатъкът предшествуван! първия цистеинов остатък). В друго изпълнение, скъсеният аналог съответства на аминокиселините от остатък 61 до аминокиселинен остатък 167.

По-нататък, заместени са един или повече от остатъците на предполагаемата подвижна примка при остатък 54 до 60. Например, един или повече от остатъците могат да бъдат заместени с лизин, глутаминова киселина или цистеин (за предпочитане лизин) с оглед на кръстосано свързване, т.е. за един полимер, тъй като подвижните примкови структури са предпочитани места за създаване разнообразие на белтък. Алтернативно, остатъците в позициите при подвижната примка могат да бъдат заместени с аминокиселинни остатъци, които са по-резистентни на протеолиза, но запазват една подвижна структура, напр, един или повече пролини. В друго изпълнение е предвидено заместване с аминокисединни остатъци, които могат по-нататък да бъдат разнообразени, за да се увеличи устойчивостта им срещу деградация, например срещу протеолиза.

Всеки подготвен специалист в тази област ще може да оцени, че размерите на гореспоменатите фрагменти са приблизителни и че една до пет аминокиселини могат да бъдат включени или да отпаднат от всеки един или и от двата края или от вътрешността на полипептида или на фрагменти от него, или от изброените скъсени аналози, с това изключение, че в аналозите с примка от дисулфидна връзка, цистеиновите остатъци трябва да бъдат запазени.

Установено е, че мишия ОВ пептид съдържа 50% α-спирала, а човешкият ОВ полипептид съдържа около 60% алфа-спирала, доказано чрез кръгов дихроизъм на рекомбинантните пептиди при близки до физиологичните условия. В съответствие с това, в друго изпълнение, аминокиселинните остатъци могат да бъдат заместени с други остатъци, така че да образуват аналози на ОВ полипептид, които проявяват повишена склонност за формиране или които образуват по-стабилни а-спирални структури. Например, аспирална структура ще бъде предпочитана, ако глугамин, аланин, левцин, хистидин, триптофан бъдат въведени като заместители за аминокиселинните остатъци в природния ОВ полипептид. Предпочитано, използвани са консервативни аминокиселинни замествания, напр. замествайки аспаргинова киселина при остатък(ци) 29,30, 44, 61, 76, 100 и/или 106 (както е представено на фигура 4) с глутаминова киселина(и) (Glu); замествайки изолевцин(и) с левцин; замествайки глицин или валии или която и да е дивергирала аминокиселина, с аланин (напр. серин в позиция 53 на човешкия ОВ полипептид с аланин), замествайки аргинин или лизин с хистидин и замествайки тирозин и/или фенилаланин с триптофан. Повишавайки степента, или по-важно, стабилността, на α-спиралната структура, би се получил един ОВ аналог с повишена актив но ст, с повишен афинитет на свързване или с по-дълъг полуживот. В едно специфично изпълнение е повишен потенциалът за формиране на спирала в частта от 08 полипептида, отговаряща на аминокиселинните остатъци от 22 до 53. В друго изпълнение е повишена способността за образуване на спирала или стабилността на аминокиселинните остатъци 61-116. В още едно друго изпълнение е повишен потенциалът за формиране на спирала на дисулфидната примкова структура, съответствуваща на аминокиселините 117 до 167. Също така са предвидени ОВ аналози, съдържащи повишен α-спирален потенциал или повишена стабилност в повече от един от гореспоменатите домени. В едно по-нататъшно изпълнение са създадени скъсени ОВ полипептидни аналози, които включват структурообразуващи напр., спиралообразуващи аминокиселини, които компенсират по-голямата тенденция на полипептидните фрагменти да губят стабилната структура.

Могат да бъдат получени аналози като фрагменти, например чрез хидролиза с пепсин на белтъчния материал модулатор на теглото. Други аналози, като мутеините, могат да бъдат получени чрез стандартна мястонасочена мутагенеза в кодиращите последователности на пептида-модулатор на теглото. Аналози, които проявяват “активност модулираща теглото”, такива като малки молекули, функциониращи като промотори или инхибитори, биха могли да бъдат идентифицирани с познати in vivo и/или in vitro методи.

Нискомолекулни аналози и пептидомиметици на ОВ полипептида

Структурата на ob полипептида, предпочитано човешкият ОВ полипептид, може да бъде анализирана с различни методи, известни в тази област. Белтъчната последователност може да бъде характеризирана с анализ на хидрофилностга [Hopp et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. Един профил на хидрофилностга може да бъде използван за идентифициране хидрофобните и хидрофилните области на ОВ полипептида, което може да покаже области скрити във вътрешността на нагънатия полипептид и достъпни области по външната страна на полипептида. В допълнение, може да се извърши анализ и на вторичната структура [Chou et al., Biochem., 13: 222 (1974)] за идентифициране на области на ОВ полипептида, които приемат специфична вторична структура. Манипулации на предполагаемата или на определената структура, включително предвиждане на вторична структура, могат да бъдат направени с помощта на компютърни софтуерни програми, каквито има на разположение.

Като предоставя богат източник на рекомбинантен ОВ полипептид, настоящото изобретение прави възможно количественото определение структурата на полипептида. По-конкретно, предоставен е достатъчно материал за ядреномагнитен резонанс (ЯМР-NMR), инфрачервен (IR), Раман и ултравиолетов (UV) анализ и специално кръгов дихроизъм (CD), спектроскопски анализ. По-конкретно, ЯМР осигурява много мощен структурен анализ на молекули в разтвор, което по-непосредствено приближава до тяхната естествена среда [Mariaon et al., Biochim. Biophys. Res. Comm., 113: 967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985): Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1681-1685 (1980)]. Могат да бъдат използвани и други методи за структурен анализ. Те включват, но не се ограничават само до рентгеноструктурен анализ [Engstorm Biochem. Exp. Biol., 11: 7-13 (1974)].

В едно по-нататъшно изпълнение, един аналог на ОВ полипептида може да бъде тестиран, за да се определи дали реагира кръстосано с антитяло специфично за природния ОВ полипептид или специфични фрагменти от него. Степента на крос-реактивност дава информация за структурната хомология или подобие на белтъци или за достъпността на области, съответстващи на части от полипептида, които са използувани за генериране на антитела специфични за фрагмента.

Скриниране за ОВ аналози

Известни са различни техники за скриниране на аналози на полипептиди. Съществуват различни набори от химикали. В съответствие с това, настоящото изобретение предвижда скриниране на такива библиотеки, например на библиотеки от синтетични съединения, получени след дългогодишни изс-ледвания, библиотеки от природни съединения и комбинирани библиотеки, както са описани в големи подробности подолу, за аналози на ОВ полипептида. В едно изпълнение, изобретението предвижда скриниране на такива библиотеки за съединения, които се свързват с анти-ОВ полипептидни антитела, предпочитано анти-човешки оЬ полипеп-тидни антитела. В друг аспект, след като се идентифицира ОВ рецептор (вж. по-долу), може да бъде използван с всякаква известна техника за скриниране на агониста и антагониста на ОВ рецептора. Настоящото изобретение предвижда скрининг за малки молекули лиганди или аналози на лиганди и такива, които ги наподобяват, както и скрининг за природни лиганди, които се свързват за и агонизират или антагонизират активния ОВ рецептор in vivo.

Познания за първичната последователност на рецептора и сходството на тази последователност с белтъци с известна функция може да даде начално указание за агониста или антагониста на този белтък. Идентифицирането и скринирането на антагониста е улеснено по-нататък чрез определяне структурните особености на белтъка, напр. с помощта на рентгенова кристалография, неутронна дифракция, ядрено-магнитен резонанс, спектрометрия и други техники за структурен анализ. Тези техники допринасят за рационалния дизайн или за идентификацията на агониста и антагониста.

Друг подход използва рекомбинантен бактериофаг за получаване на големи библиотеки. Използвайки “фаговия метод” [Scott et al., Science, 249: 386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Delvin et al., Science, 249: 404-406 (1990)], могат да бъдат конструирани много големи библиотеки (10⁶-10⁸ химични единици). Друг подход използва главно химични методи, примери за които са методът на Geysen [Geysen et al., Molecular Immunology, 23: 708-715 (1986); Geysen et al., J. Immonologic Method, 102:259-274 (1987)] и методът на Fodor et al., Science, 251: 767-773 (1991). Furka et al., 14-th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487493 (1991)]; Houghton (US 4,631,211; и Rutter et al., (US 5, 010, 175) описват методи за получаване на смес от пептиди, които могат да бъдат тестарани за агониста и антагониста.

В друг аспект, синтетични библиотеки [Needels et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 90: 10700-10704 (1993); WO 1992/000252, всеки от които е включен тук като пълен текст чрез цитат] и подобни могат да бъдат използувани за скриниране лиганди на 0В рецептора, в съответствие с настоящото изобретение. С такива библиотеки могат да бъдат откривани рецепторни антагониста, като се използват клетки, които експресират рецептора без в действителност да се клонира ОВ рецептора.

Алтернативно, могат да бъдат проведени изследвания за свързване на разтворим лиганд с клетки, които експресират рекомбинантни форми на домена, свързващ ОВ рецепторния лиганд. Разтворими лиганди могат да бъдат получени директно като рекомбинантен или синтетичен ОВ полипептид.

Скриниране може да се извърши с рекомбинантни клетки, които експресират ОВ рецептор, или алтернативно, с помощта на пречистен рецепторен белтък, напр. получен чрез рекомбинантна техника както бе описано по-горе. Например, способността на белязан разтворим или разтворен ОВ рецептор, който съдържа лигандсвързващата част на молекулата да свързва лиганда може да бъде използувана за скриниране на библиотеки, както е описано в по-горния цитат

Производни на ОВ полипептидите

Общо, даден белтък (тук терминът “белтък” включва и “полипептид” освен ако не е посочено друго) може да бъде дериватазиран, чрез присъединяване на една или повече химични групи към белтъчната част. Химично модифицираните деривати могат след това да бъдат изготвени за интраартериално, интраперитонеално, интрамускулно, подкожно, интравенозно, орално, назално, ректално, букално, сублингвално, белодробно, локално, трансдермално или друг начин на въвеждане. Установено е, че химичните модификации на биологично активните белтъци дават допълнителни предимства при известни условия, като повишаване стабилността и времето на циркулация на терапевтичния белтък и понижение на имуногенността. Вж. US 4, 179, 337. За обзор вж. Abouchowski et al., “Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, в Enzymes as Drugs, pp . 367-383, Holcenberg and Roberts, eds., WileyInterscience, New York, NY, (1981). Обзорна статия, описваща белтъчни модификации и слети белтъци е Francis, Focus on Growth Factors, 3:410 (1992).

Химични групи за дериватазация

Химичните групи, подходящи за дерива тизация, могат да бъдат подбирани измежду водно-разтворимите полимери. Избраният полимер трябва да бъда водно-разтворим, така че белтъкът, за който е закачен, да не преципитира във водна среда, каквато е физиологичната среда. Предпочитано, за лечебна употреба на крайния продукт полимерът трябва да бъде фармацевтично приемлив. Специалистът в тази област ще може да подбере желания полимер, базирайки се на условия като например дали полимер/белтьчният конюгат ще бъде използван за терапевтични цели и ако това е така, за желаната дозировка, време на циркулация, резистентност на протеолиза и други съображения. За представените белтъци и пептиди това може да бъде уточнено, като се използват представени тук тестове.

Полимерни молекули

Водно-разтворимият полимер може да бъде избран от група, състояща се например от полиетилен гликол, кополимери на етилен гликолполиетилен гликол, карбоксиметилцелулоза, декстран, поливинил алкохол, поливинил пиролидон, поли-1,3-диоксан, поли-1,3,6-триоксан, юополимер на етилен/малеинов анхидрид, по лиаминокиселини (хомополимери или случайни полимери) и декстран или поли(п-винил пиролидон) полиетилен гликол, пропропилен гликол хомополимери, полипропилен оксид/етилен оксид кополимери, полиоксиетилирани полиоли и поливинил алкохол. Полиетиленгликол пропионалдехид би имал предимство в производството, поради неговата стабилност във вода.

Полимерът може да има всякакво молекулно тегло и може да бъде разклонен или неразклонен. За полиетилен гликол, предпочитаното молекулно тегло е между 2 kDa и около 100 kDa (терминът “около” означава, че в препаратите на полиетилен гликол някои молекули ще са по-тежки, а други по-малко, отколкото е обявеното молекулно тегло за удобство при работа и производство). Могат да бъдат използвани и други критерии, в зависимост от желания терапевтичен профил (напр. времетраене на поддържаното освобождаване, ефектите, ако има такива, върху биологичната активност, удобствата при боравене, степента или липсата на антигенност и други познати ефекти на полиетиленгликола върху един терапевтичен белтък или негов аналог.

Отношение полимер/белтьк

Броят на така присъединените полимерни молекули може да варира и специалистът в тази област би могъл да определи ефекта върху функцията. Може да се получи моно-дериват или ди-, три-, тетра- или други комбинации на дериватизация, с една и съща или с различни химични групи (напр. полимери като полиетиленгликоли с различно молекулно тегло). Съотношението на полимерните молекули спрямо белтъчните (или пептидните) молекули ще варира, както ще варира и тяхната концентрация в реакционната смес. Общо взето, оптималното отношение (по отношение ефективност на реакцията в смисъл да няма излишък на нереагирал белтък или полимер) ще бъде определено от фактори като желаната степен на дериватизация (напр. моно-, ди-, три- и т.н.), молекулното тегло на избрания полимер, по това дали полимерът е разклонен или неразклонен, по условията на реакцията.

Присъединяване на химичната група към белтъка

Молекулите полиетиленгликол (или други химични групи) трябва да бъдат прикачени за белтъка, като се вземе под съображение ефекта им върху функционалните или антигенните домени на белтъка. Специалистите в тази област разполагат с известен брой методи за присъединяване, напр. ЕР 0 401 384 тук включен чрез цитат (свързване на PEG за G-CSF). Вж. също Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028-1035 (1992) (съобщаващи за свързване с полиетиленгликол на GM-CSF), с помощта на трезил хлорид). Напр. полиетиленгликол може да се свърже ковалентно чрез аминокиселинни остатъци посредством реактивна група, като свободна амино- или карбоксилна група. Реактивни групи са тези, към които може да се свърже една активирана полиетиленгликолова молекула. Аминокиселините остьтъци със свободна аминогрупа могат да включват лизинови остатъци и N-крайните аминокиселинни остатъци, тези със свободна карбоксилна група могат да включват остатъци от аспаргинова киселина, глуталинова киселина и С-терминален аминокиселинен остатък. Сулфохидрилни групи могат също да бъдат използвани като реактивни групи за присъединяване на полиетиленгпиколови молекула(и). Предпочитано за терапевтични цели е присъединяването към аминогрупа, като например, присъединяването към N-терминалния край или лизинова група.

Присъединяването към остатъци важни за свързването с рецептор трябва да бъде избягвано, рецепторното свързване е желателно.

N-крайно химически модифицирани белтъци

Може да е необходим специфично N-крайно химически модифициран белтък. Използвайки полиетиленгликол като илюстрация на представените препарати, възможно е измежду различни полиетиленгликолови молекули (по молекулно тегло, разк-лонение и т. н. I) да бъдат подбрани съотношението на полиетиленгликоловите молекули към белтъчните (или пептидни) молекули в реакционната смес; реакцията, чрез която се извършва свързването с полиетиленгликол и метода за получаване на избран N-крайно свързан с полиетиленгликол белтък. Методът за получаване на N-крайно свързани с полиетиленгликол препарати (т. е. отделяне на тази част от други моно-производни на полиетиленгликол белтъци, ако това е необходимо) може да бъде чрез пречистване на N-крайно свързания с полиетиленгликол материал от една популация от свързани с полиетиленгликол белтъчни молекули. Селективна N-крайна химическа модификация може да бъде осъществена чрез редукционно алкилиране, което използва диференциалната реактивност на различните типове първични аминогрупи (лизин вместо N-края), които могат да бъдат дериватизирани в даден белтък. При подходящи условия на реакция се постига значителна селективна дериватизация на белтъка при N-края с полимер съдържащ карбонилна група. Например, възможно е белтъкът да бъде селективно N-терминално свързан с полиетиленгликол чрез извършване на реакцията при pH, позволяващо да се ползва предимството на рК, разликите между ε-групите на лизиновите остатъци и тази на α-аминогрупата на N-крайния остатък на белтъка. При такова селективно дериватизационно присъединяване на един водноразтворим полимер за белтък се контролират следните условия: свързването с полимера се извършва преимуществено на N-края на белтъка и няма значими модификации на другите реактивни групи, като напр. аминогрупите на страничната верига на лизина. Използвайки редукционно алкилиране, водно-разтворимият полимер може да бъде от описания по-горе тип и трябва да има един единствен реактивен алдехид за свързване с бел тъка. Може да бъде използван полиетиленгликол пропионалдехид, съдържащ един единичен реактивен алдехид.

Нуклеинови киселини, свързани с ОВ полипептида

Както бе отбелязано по-горе, настоящото изобретение е насочено към нуклеинови киселини, кодиращи ob полипептиди, както и свързаните с тях геномни некодиращи последователности 5 ’-, 3 ’- и интрони на ОВ гена. Така, в съответствие с настоящото изобретение, може да бъдат използвани конвенционалните методи на молекулярната биология, микробиология и рекомбинангните ДНК техники. Такиватехникисаподробно обяснени в литературата. Вж. напр. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Secon Edition, Cold Sring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I и П, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer Verlag (1985); Hames et al., eds. Transription and Translation, Oxford University Press (1984)]; Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986)]; Perbal, A practical guide to molecular cloning, Wiley, New York (1984). От особено значение за настоящото изобретение са стратегиите за изолиране, клониране, секвениране, анализиране и характеризиране на ген или нуклеинова киселина, базиращи се на добре известната техника на полимеразна верижна реакция (PCR).

“Репликон” е всеки генетичен елемент (напр. плазмид, хромозома, вирус), който фунционира като автономна единица на ДНК репликацията in vivo, т.е. способен на репликация под собствен контрол.

“Вектор” е репликон, като напр. плазмид, фаг или космид, за когото може да бъде прикачен друг сегмент ДНК, така че да осъществява репликацията на прикачения сегмент.

“Касета” се отнася до сегмент от ДНК, който може да бъде вмъкнат във вектор на специфични рестрикционни места. Сегментът ДНК кодира даден интересуващ ни полипептид, а касетата и рестрикционните места са замислени така, че да се осигури вмъкването на касетата в правилна рамка за прочитане на транскрипцията итранслацията.

“Хетероложна” ДНК се отнася за ДНК, която изкуствено е внесена и разположена в клетката или на дадено място в хромозомата на клетката. Предпочитано, хетероложната ДНК включва ген, който е чужд за клетката.

Една клетка е “трансфектирана” с екзогенна или хетероложна ДНК, когато такава ДНК е вкарана вътре в клетката. Една клетка е “трансформирана” с екзогенна или хетероложна ДНК, когато трансфекгираната ДНК води до фенотипна промяна. Предпочитано, трансформиращата ДНК трябва да бъде интегрирана (ковалентно свързана) с хромозомната ДНК, която изгражда генома на клетката.

Един “клон” е популация от клетки, произлизащи чрез митоза от една клетка или общ предшест-веник чрез митоза.

“Молекула нуклеинова киселина” се отнася до фосфодиестерната полимерна форма на рибонуклеозидите (аденозин, гуанозин, уридин и цитидин; “РНК молекули”) или дезоксирибонуклеозидите (дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин или дезоксицитидин; “ДНК молекули”) в едноверижна форма или двуверижна спирала. Възможни са двуверижни ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК спирали. Терминът молекула нуклеинова киселина и в частност ДНК или РЕ1К молекула, се отнася само до първичната и вторичната структура на молекулата и не се ограничава в никоя от конкретните терциерни и кватернерни форми. Така този термин включва двойно-верижна ДНК, намираща се inter alia като линеарни или циркуларни ДНК молекули (напр. рестрикционни фрагменти), плазмиди и хромозоми. Разглеждайки структурата на дадени двойноверижни ДНК молекули, последователностите могат да бъдат описани тук в съответствие с възприе-тото съгласие да се представя само последователността в посока от 5’ към 3’ по дължината на нетранскрибираната верига ДНК (т.е. веригата с последователност хомоложна на мРНК). “Рекомбинантна ДНК молекула” е ДНК молекула, която е претърпяла молекулно биологична манипулация.

Една молекула нуклеинова киселина е “способна да хибридизира” с друга молекула нуклеинова киселина, като кДНК, геномна ДНК или РНК, когато едноверижна форма на молекулата нуклеинова киселина може да се свърже с друга молекула нуклеинова киселина при подходящи условия на температура и йонна сила на разтвора (вж. Sambrook et al., 1889, по-горе). Условията на температура и йонна сила определят “строгостта” на хибридизацията. За предварително скриниране на хомоложни нуклеинови киселини могат да бъдат използвани условия на ниска строгост на хибридизацията, съответствуваща на Тт 55°С, напр. 5х SSC, 0.1% SDS, 0.25% мляко и без формамид; или 30% формамид, 5х SSC, 0.5% SDS. Условия за умерена строгост на хибридизацията съответстват на повисока Тт, напр. 40% формамид с 5х или 6х SSC. Условия на висока строгост на хибридизацията съответстват на най-висок Тт, напр. 50% формамид с 5х или 6х SSC. Хибридизацията изисква двете нуклеинови киселини да съдържат комплементарни последователности, въпреки че в зависимост от строгостта на хибридизацията, могат да се получат несдвоени участъци между базите. Подходящата строгост за хибридизация на нуклеинови киселини зависи от дължината на нуклеиновите киселини и степента на комплементарност между двете взаимодействащи си вериги, добре известни променливи в тази област. Колкото по-висока е степента на сходство или хомологията между двете нуклеотидни последователности, толкова по-висока е стойността на Тт за хибриди на нуклеинови киселини, притежаващи тези последователности. Относителната стабилност (съответствуваща на повисоко Тт) на хибридите на нуклеинови киселини намалява в следния ред: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. За хибриди с дължина по-голяма от 100 нуклеоти-нуклеотида, са изведени уравнения за изчисляване на Тт (вж. Sambrook et al., 1989, по-горе, 9.50-0.51). За хибридизация на по-къси нуклеинови киселини, т.е. олигонуклеотиди, мястото на несдвоените участъци става по-важно и дължината на олигонуклеотида определя неговата специфичност (вж. Sambrook et al., 1989, по-горе, 11.7-11.8). За предпочитане е минималната дължина на една нуклеинова киселина, за да може да хибридизира, да бъде поне около 10 нуклеотида; по-добре е да бъде поне около 15 нуклеотида; най-добре е дължината да бъде поне около 20 нуклеотида.

“Хомоложна рекомбинация” се отнася за вмъкване на чужда ДНК последователност на даден вектор в една хромозома. Предпочита се, векторът да се нацелва на специфично хромозомно място за хомоложна рекомбинация. За специфична хомоложна рекомбинация, векторът трябва да съдържа достатъчно дълги участъци, хомоложни спрямо последователностите на хромозомата, което създава възможност за комплементарно сдвояване и включване на вектора в хромозомата. По-дългите хомоложни участъци и по-високата степен на сходство на последователността биха могли да повишат ефективността на хомоложната рекомбинация.

ДНК “кодираща последователност” е двойноверижна ДНК последователност, която се транскрибира и транслира в един полипептид в клетката in vitro или in vivo, когато е поставена под контрола на съответни регулаторни последователности. Границите на кодиращата последователност се определят от начален кодон на 5 ’ (амино) края и завършващ транслацията кодон на 3’ (карбоксилния) край. Една кодираща последователност може да включва, но не се ограничава до, прокариотни последователности, кДНК от еукариотна мРНК, последователности на геномна ДНК от еукариотна (напр. от бозайници) ДНК и дори синтетични ДНК последователности. Ако кодиращата последователност е предвидена за експресия в еукариотна клетка, обикновено в 3 ’ края на кодиращата последователност трябва да се разположат сигнал за полиаденилиране и последователност за завършване на транскрипцията.

Изолиране на ОВ кодираща и фланкиращи последователности

Нуклеиновите киселини, разглеждани в настоящото изобретение, както бе указано погоре, обхващат нуклеинови киселини, които кодират експресия на пептиди като тези, представени по-нататък на Фигура 1А до D (SEQ ID NO:

2), Фигура 3 (SEQ ID NO: 4), Фигура 5 (SEQ ID NO: 5) и фигура 6 (SEQ ID NO: 6). В съответствие c това, когато специфична ДНК е изолирана и секвенирана във връзка с ob гена, всяка животинска клетка потенциално може да служи като източник на нуклеинова киселина за молекулно клониране на ген кодиращ пептидите на изобретението. ДНК може да бъде получена чрез известните на специалиста стандартни процедури от клонирана ДНК (напр. от една ДНК “библиотека”), чрез химична синтеза, чрез клониране на кДНК или чрез клониране на геномна ДНК или на фрагменти от тях, пречистени от съответ ните клетки (вж. напр. Sambrook et al., 1989, погоре; (Glover, 1985, по-горе). Клонове, произхождащи от геномна ДНК могат да притежават регулаторни и интронни ДНК участъци в допълнение на кодиращите участъци; клонове, произхождащи от кДНК, няма да съдържат интронни последователности. Независимо от това какъв е източникът, генът трябва да бъде молекулно клониран в подходящ вектор за намножаване на гена.

При молекулно клониране на ген от геномна ДНК, геномната ДНК може да бъде амплифицирана, като се използват праймери подбрани от последователностите на кДНК. Алтернативно, генерирани са ДНК фрагменти, някои от които ще кодират желания ген. ДНК може да бъде накъсвана на специфични места с различни рестрикционни ензими. Също може да бъде използвана ДН-аза в присъствието на манган за фрагментиране на ДНК или ДНК може физически да бъде накъсана, например чрез ултразвуково третиране. Линеарните ДНК фрагменти след това могат да бъдат разделени според големината им чрез стандартни техники, включително, но не само, с агарозна и акриламидна електрофореа и колонна хроматография.

Веднъж генерирани ДНК фрагментите, идентифицирането на ДНК фрагмент съдържащ желания ob или ob-подобен ген може да бъде извършено по няколко начина. Например, ако разполагаме с известно количество от част от ob или ob-подобния ген, или специфична за него РНК, или техен фрагмент, които могат да бъдат пречистени и белязани, генерираните ДНК фрагменти могат да бъдат скринирани чрез хибридизация на нуклеиновата киселина с белязана сонда. [Benton et al., Science, 196:180 (1970); Grunstein et al., roc. Natal. Acad. Sci., USA, 72: 3961 (1975)]. Настоящото изобретение предлага такива сонди нуклеинови киселини, които могат да бъдат изготвени по конвенционалните методи от посочените тук специфични последователности, напр. сонда способна да хибридизира, притежаваща нуклеотидна последователност, съответстваща на един поне -10, за предпочитане от 15-нуклеотиден фрагмент с първична структура, представена на Фигура 1А до Е (SEQ ID NO: 1) или Фигура 2 А и В (SEQ ID NO: 3). Предпочитано избран е нуклеотиден фрагмент, който е високо уникален спрямо модулаторните пептиди на изобретението. Ще хибридизират тези ДНК фрагменти, които имат съществена хомология със сондата. Както бе отбелязано по-горе, колкото е по-висока степента на хомология, толкова по строги условия на хибридизация могат да бъдат използвани. В едно изпълнение са използвани условия на ниска строгост на хибридизацията за идентифициране един хомоложен модулаторен пептид. Обаче, в предпочитателен аспект, и както тук е експериментално показано, нуклеинова киселина, кодираща един модулаторен пептид на изобретението, ще хибридизира с нуклеинова киселина, притежаваща нуклеотидна последователност както е представено на фигура 1А до Е (SEQIDNO: 1)илифигура2АиВ(8Е()1ОМО:

3) или техен фрагмент способен да хибридизира, при умерено строги условия; за предпочитане той ще хибридизира при висока строгост на условията.

Алтернативно, наличието на ген може да бъде открито с опити, базиращи се на физичните, химичните или имунологичните свойства на експресирания от него продукт. Например, могат да бъдат подбрани такива кДНК клонове или ДНК клонове, или чрез хибридизация, съответните им мРНКи, които произвеждат белтък, който напр. има сходна или идентична елекгрофоретична подвижност, поведение при електрично фокусиране, картиране след протеолигична хидролиза, тирозин-фосфатазна активност или антигенни свойства, както това е известно за представените модулаторни пептиди. Напр. антителата на настоящото изобретение могат удобно да бъдат използвани за скриниране на хомолози на модулаторни пептиди от други източници.

Един ген кодиращ модулаторен пептид на изобретението може да бъде идентифициран също чрез мРНК селекция, т.е. с помощта на хибридизация на нуклеинови киселини, последвана от in vitro транслация. При тази процедура, фрагментите се използват за изолиране на комплементарна мРНК чрез хибридизация. Такива ДНК фрагменти могат да представляват пречистена модулаторна ДНК. Имунопреципитационен анализ или функционални проби (напр. тирозинфосфатазна активност) на продуктите от in vitro транслацията на изолираните мРНКи ще идентифицират мРНК, а следователно и комплементарните ДНК фрагменти, които съдържат желаните последователности. Като допълнение, могат да бъдат подбрани специфични мРНКи чрез адсорбция на изолирани от клетки полизоми към имобилизирани антитела, специфично насочени срещу модулаторния пептид.

Радиоактивно белязана кДНК на модулаторния пептид може да бъде синтезирана, като се използва като матрица съответната селекционирана мРНК (от адсорбираните полизоми). Радиоактивно белязаните мРНК или кДНК могат да бъдат използ-вани като сонди за идентифициране на ДНК фрагменти, хомоложни на модулаторния пептид измежду други фрагменти на геномната ДНК.

Както бе споменато по-горе, ДНК последователност кодираща модулаторни пептиди на телесното тегло, предмет на изобретението, може да бъде получена синтетично вместо да бъде клонирана. ДНК последователността, може да бъде планирана със съответните кодони за аминокиселините последователности на пептида модулатор на телесното тегло. Общо, ако последователността ще се използва за експресия, следва да бъдат подбрани предпочитани кодони от предвидения гостоприемник. Пълната последователност се сглобява от припокриващи се олигонуклеотиди, изготвени със стандартни методи и събрани в една пълна кодираща последователност. Вж. напр. Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).

Синтетичните ДНК последователности позволяват удобно конструиране на гени, които да експресират аналози на модулатора на теглото, както е описано по-горе. Алтернативно, ДНК кодиращи аналози могат да бъдат получени чрез мястонасочена мутагенеза на природни ОВ гени или кДНКи, и аналозите могат да бъдат директно изготвяни с помощта на конвенционалната полипептидна синтеза.

Един общ метод за място-специфично включване в белтъци на несрещащи се в природата аминокиселини е описан от Noren et al., Science, 244: 182-188 (1989). Този метод може да бъде използван за създаване на аналози на ob полипетида с не природни аминокиселини.

Некодиращи нуклеинови киселини

Настоящото изобретение се разширява за получаване на антисенз-нуклеотиди и рибозими, които могат да бъдат използувани да интерферират на транслационно ниво с експресията на модулиращите теглото белтъци. Този подход из28 ползува антисенз-нуклеинова киселина и рибозими за блокиране на транслацията на специфични мРНК, чрез маскиране на тази мРНК с антисенз-нуклеиновата киселина или чрез скъсването и с рибозим.

Антисенз нуклеиновите киселини са ДНК или РНК молекули, които са комплементарни поне на една част от специфичната молекула мРНК (вж. Weintraub, Sci. Am., 262: 40-46 (1990); Markus-Sekura, Anal. Biochem., 172: 289-295 (1988)]. В клетката те хибридизират c тази мРНК, като образуват двойноверижна молекула. Клетката не траслира мРНК свързана в тази двойноверижна структура. Следователно, антисенз-нуклеиновите киселини интерферират с експресията на мРНК в белтък. Олигомери от около петнадесет нуклеотида и молекули, които хибридизират с иницииращия кодон AUG, ще бъдат особено ефективни, тъй като те са лесни за синтезиране и изглежда поставят по-малко проблеми, отколкото по-дългите молекули, когато бъдат въведени в клетките, продуциращи модулаторния пептид на теглото. Антисенз-методи са използвани за потискане експресията на много гени in vitro [Marcus-Sekura, 1988 по-горе; Hambor et al., J. Exp. Med., 168: 1237-1245 (1988)].

Рибозимите са РНК молекули, които могат да скъсват специфично други едноверижни РНК молекули по начин в известна степен аналогичен на ДНК рестрикционните ендонуклеази. Рибозимите бяха открити чрез наблюдения, че някои мРНК имат способността да изрязват собствените си интрони. Чрез модифициране на нуклеотидната последователност на тези РНКи, изследователите имаха възможността да манипулират инженерно молекули, които разпознават специфични нуклеотидни последователности в дадена РНК молекула и да я скъсат [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030-3034 (1988)]. Тъй като те са специфични по отношение последователността, само мРНКи със специфични последователности могат да бъдат инактивирани.

Изследователи са идентифицирали два типа рибозими, Tetrahymena-тип и “hammerhead”тип. Tetrahymena-тип рибозимите разпознават последователности от четири бази, докато “hammerhead’’-типът разпознава единадесет до осемнадесет базови последователности. Колкото е по-дълга разпознаващата последователност, толкова е по-възможно да се открива изключи телно в прицелните мРНК видове. Следователно, за инактивиране на специфични мРНК видове, hammerhead-тип рибозимите са за предпочитане през Tetrahymena-типа рибозимите и осемнадесетбазовите разпознаващи последователности са, за предпочитане пред по-късите разпознаващи последователности.

ДНК последователностите, описани тук, могат да бъдат използувани за получаване на антисенз-молекули срещу съответните мРНКи, за модулаторните белтъци на телесното тегло и техни лиганди, както и за получаване на рибозими, които късат същите мРНКи, като по този начин инхибират експресията на ob гена и водят до нарастване телесното тегло и затлъстяване.

В друго изпълнение, с настоящото изобретение са получени къси олигонуклеотиди комплементарни на кодиращата и на комплементарната вериги на ОВ нуклеиновата киселина или спрямо некодиращите области на ОВ гена, разположени 5’, 3’, или вътрешно (в интроните) спрямо кодиращата област. Такива нуклеинови киселини са полезни като сонди, било като директно белязани олигонуклеотидни сонди - било като праймери за PCR, за оценяване наличието на мутации в ob гена или нивото на експресия на ОВ мРНК. Предпочита се, некодиращите нуклеинови киселини на изобретението да са от човешки ОВ ген.

В едно специфично изпълнение, некодиращите нуклеинови киселини предоставят възможност за хомоложна рекомбинация за интеграция на един амплифицируем ген и/или на други регулаторни последователности в близост с ОВ гена, напр. за получаване на по-високи нива на експресия на ОВ полипептида или за преодоляване на мутация в регулаторните последователности на ob гена, което пречи на истинските нива на експрсия на ОВ полипептида (WO1991/ 006666, WO1991/009955, WO1990/014092.

Получаване на ОВ олипептид: експресия исинтез

Транскрипционни и транслационни контролни последователности са ДНК регулаторни последователности, като промотори, енхансери, терминатори и подобни, които осигуряват експресията на една кодираща последователност в клетката гостоприемник. В еукариотните клетки, сигналите за полиаденилиране представляват контролни последователности.

Една кодираща последователност е “под контрола” на транскрипционни и транслационни регулаторни последователности в клетката, когато РНК полимеразата транскрибира кодиращата последователност в мРНК, която след това е транс-РНК снадена и транслирана в белтък, кодиран от кодиращата последователност.

Една “сигнална последователност” е включена в началото на кодиращата последователност на един белтък, който трябва да бъде експресиран на повърхността на клетката. Тази последователност кодира сигнален пептид, N-краен спрямо зрелия полипептид, който насочва клетката да транслокира полипептида. Терминът “транслокационна сигнална последователност” също се използва тук за означаване на този вид сигнална последователност. Транслокационни сигнални последователности могат да бъдат открити в разнообразни природни белтъци в еукариотите и прокариотите и често те са функционални и в двата типа организми.

Една ДНК последователност е “функционално свързана” с контролна последователност на експресията, когато контролната последователност на експресията контролира и регулира транскрипцията и транслацията на тази ДНК последователно ст. Терминът “функционално свързан” включва наличието на подходящ начален сигнал (напр. ATG) преди ДНК последователността, която трябва да бъде експресирана, и подържането на правилната рамка на четене, за да се осигури експресията на ДНК последователността, която е под контрола на контролната последователност на експресията и получаването на желания продукт, кодиран от ДНК последователността. Ако генът, който желаем да включим в рекомбинантната ДНК молекула, не съдържа подходящ стартов сигнал, такъв стартов сигнал може да бъде вмъкнат преди (5’) и в рамката за четене на този ген.

Една “промоторна последователност” е ДНК регулаторен участък, способен да свързва РНК полимеразата в една клетка и да инициира транскрипция, разположена след него (в 3 ’ направление) кодираща последователност. С цел да се дефинира настоящото изобретение, промоторната последователност е свързана на своя 3 ’ край с мястото на начало на транскрипцията и се простира нагоре (в 5’ посока), за да включи минималния брой бази или елементи, необходими за иницииране на транскрипция на нива доловими над основните. В обхвата на промоторната последователност може да се открие място за начало на транскрипцията (удобно може да бъде определено например, чрез картиране с S нуклеаза), както и белтък-свързващи домени (consensus последователности), отговорни за свързване на РНК полимераза.

Друг аспект на това изобретение е експресията на ДНК последователностите, показани тук. Както е добре известно на специалистите, ДНК последователностите могат да бъдат експресирани чрез функционалното им свързване с контролна последователност на експресията в подходящ експресионен вектор и този вектор да бъде използван за трансформация на подходящ едноклетъчен гостоприемник.

Такова оперативно свързване на ДНК последователността на изобретението с контролна последователност на експресията, разбира се включва, ако не е вече част от ДНК последователността, поставянето преди кодиращата последователност на един иницииращ кодон, ATG, в правилна рамка на четене.

За експресиране на ДНК последователностите на изобретението могат да бъдат използувани множество комбинации - гостоприемник/експресионен вектор. Полезни експресионни вектори, например, могат да съдържат сегменти от хромозомни, нехромозомни и синтетични ДНК последователности. Подходящи вектори включват производни на S V40 и известни бактериални плазмиди, напр. E.coli плазмидите, col Е1. pCRl, pBR322, рМВ9, pUC или производни на pUC плазмида, напр. pGEX вектори, рЕТ вектори, pmal-c, pFLAG и др. и техни производни, плазмиди като RP4, фагни ДНКи, напр. множество производни на фаг λ, напр. ΝΜ989, и друга фагна ДНК, напр. Μ13 и нишковидната едноверижна фагна ДНК; дрождеви плазмиди като 2 μ плазмид и техни производни; вектори използваеми в еукариотни клетки, вектори използувани при клетки на насекоми или клетки на бозайници; вектори, получени от комбинации на плазмиди и фагови ДНКи, като плазмиди, които са модифицирани за използване на фагова ДНК или други контролни последователности на експресията; и подобни. В едно предпочитано изпълнение, експресията на ob се постига в метилотрофни дрожди, напр. дрождите Pichia pastoris WO 1990/

003431, WO 1990/010697. В едно специфично изпълнение, по-долу, един експресионен вектор е инженерно манипулиран за експресия на ob под контрола на сигналната последователност на половия α-фактор. Всяка от голямото разнообразие контролни последователности на експресията - последователности, които контролират експресията на функционално свързаната с тях ДНК последователност, могат да бъдат използувани в тези вектори за експресия на ДНК последователностите на това изобретение. Такива полезни контролни последователности на експресията включват, например, ранните или късни промотори на SV40, CMV, vaccinia polyoma или adenovirus, 1ас-системата, trp-системата, ТАС-системата, TRC-системата, LTR-системата, главният операторен и промоторен участък на фага λ, контролните области на белтъка на fd-фаговата обвивка, промотора на 3-фосфоглицераткиназата или на други гликолитични ензими, промоторите за киселата фосфагаза (напр. Pho5), АОХ-1промотора на метилотрофните дрожди, промоторите на дрождевите полови α-фактори и други последователности, за които е известно, че контролират експресията на гени на прокариотни и еукариотни клетки или на техни вируси и различни техни комбинации. При експресията на ДНК последователностите на изобретението се използва също голямо разнообразие от едноклетъчни клетки-госгоприемници. Тези гостоприемници могат да включват известни еукариотни и прокариотни гостоприемници, като щамове от Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; гъби като дрожди (Saccharomyces и метилотрофни дрожди като Pichia, Candida, Hansenula и Torulopsis); и животински клетки като СНО, Rl. 1, В-W и LM клетки, бъбречни клетки от африканска зелена маймуна (напр. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 и ВМТ10), клетки от насекоми (Hanp.Sf9) и човешки и растителни клетки в тъканни култури.

Разбираемо е, че не всички вектори, контролни последователности на експресията и гостоприемници ще функционират еднакво добре, за да експресират ДНК последователностите на изобретението. Нито пък всички гостоприемници ще функционират еднакво добре с една и съща експресионна система. Специалистът в тази област обаче ще може да подбере подходящите вектори, контролните последователности на екс пресията и гостоприемниците, без прекомерно експериментиране, за да осъществи желаната експресия, без да се отклонява от обсега на това изобретение. Например, при избора на вектор, гостоприемникът трябва да бъде взет предвид, тъй като векторът трябва да функционира в него. Трябва да бъдат взети предвид също броят на копията на вектора, способността този брой да бъде контролиран, както и експресията на всички други белтъци, кодирани от вектора, като напр. антибиотични маркери.

При подбора на контролната последователност на експресията, трябва да бъдат взети под внимание различни фактори. Те включват, например, относителната сила на системата, възможността да бъде контролирана, съвместимостта й с конкретната ДНК последователност или ген, които подлежат на експресия и по-специално с оглед възможните вторични структури. Подходящи едноклетъчни гостоприемници следва да бъдат подбирани с оглед например, на тяхната съвместимост с избрания вектор, техните секреционни характеристики, способността им да нагъват точно белтъците и техните изисквания за ферментация, както и с токсичността върху гостоприемника на продукта, кодиран от ДНК последователностите, които трябва да се експресират и лекотата, с която експресионните продукти могат да бъдат пречистени.

Разглеждайки тези и други фактори, специалистът ще може да конструира различни комбинации от вектор/контролна последователност на експресията/гостоприемник, които ще експресират ДНК последователностите на изобретението при ферментация или в мащабни животински култури.

В едно специфично изпълнение, може да бъде експресиран слят ОВ белтък. Един слят ОВ белтък съдържа поне една функционално активна част от един не-ОВ белтък, свързана чрез пептидна връзка поне за една активна функционална част от ОВ полипептида. Не-ob последователностите могат да бъдат разположени към аминоили карбокси-краищата на ОВ последователностите. По-предпочитано, за стабилна експресия на един протеолитично неактивен слят ОВ белтък, частта на слетия не-ОВ белтък да е свързана чрез пептидна връзка с амино-края на ОВ белтъка. Една рекомбинантна ДНК молекула е кодираща такъв слят белтък, съдържа последователност, кодираща поне една функционално активна част от един не-ОВ белтък, свързан в рамка с ОВ кодиращата последователност и предпочитано кодира едно място за скъсване от специфична протеаза, напр. тромбин или фактор Ха, предпочитано на мястото на свързване на ОВ-не-ОВ. В едно специфично изпълнение, слетият белтък се експресира в Escherichia coili или в P.pastoris.

В едно специфично изпълнение, вж. подолу, са изготвени вектори за експресиране на миши и човешки ob гени като слети белтъци със или без кодон за gin-49, в бактериална експресионна система и експресионна система от дрожди (Pichia). Генът ob е приготвен да съдържа едно място на скъсване с ендонуклеаза, напр. с помощта на PCR и нови праймери. Желателно е последователностите, генерирани с помощта на PCR да бъдат проверявани и потвърждавани, тъй като възможността за получаване на точкова мутация при този метод е по-голяма. Използуван е плазмид съдържащ хистидин tag (Histag) и място за скъсване протеолитично. Наличието на хистидин прави възможно рекомбинантните белтъци да бъдат селективно изолирани върху Ni-хелатна колона или чрез афинитетно пречистване. В едно специфично изпълнение, вж. по-долу, мястото на протеолитично скъсване, това е мястото на скъсване на тромбина, е инженерно манипулирано така, че третирането с протеаза, напр. тромбин, да освобождава цялата дължина на зрелия ОВ полипептид (т. е. без сигналната последователност).

В друг аспект, pGEX векторът [Smith et al., Gene 67:31-40 (1988) може да бъде използван. Този вектор слива глутатион S-трансферазната (GST) кДНК на Schistosoma japonicum, с интересуващата ни последователност. Бактериалните белтъци са събирани и рекомбинантните белтъци могат да бъдат бързо пречистени на афинитетна колона с редуциран глутатион. GST носителят може впоследствие да бъде откъснат от слетите белтъци чрез хидролиза със специфични по отношение на мястото на действие протеази. След скъсването, носителят и слетият белтък, който не е претърпял скъсване, могат да бъдат отделени чрез абсорбция на глутатион-агароза. Трудности със системата възникват понякога, когато кодираният белтък е неразтворим във водни разтвори.

Експресията на рекомбинантни белтъци в бактериални системи може да предизвика неправилно нагъване на експресирания белтък, което изисква повторно нагъване. Рекомбинантният белтък може да бъде отново нагънат преди или след скъсване, за да образува функционално активен ОВ белтък. ОЬ полипептидът може да бъде нагънат отново на етапи с (i) инкубиране на белтъка в денатуриращ буфер, който съдържа редуциращ агент и след това (й) инкубиране на белтъка в буфер, съдържащ окисляващ агент, а предпочитано още и белтьк-стабилизиращ агент или хаотропен агент, или и двата. Подходящи редокс (редуциращ/окисляващ) агенти включват, но не се ограничават до, редуциран глутатион/ шутатиондисулфид.цистин/цистеин, цистамин/ цистеамин и 2-меркаптоетанол/2-хидроксиетилдисулфид. В един специален аспект, слетият белтък може да бъде разтворен в денатурант, като напр. урея, преди да бъде прехвърлен в редуциращия буфер. В едно предпочитано изпълнение, белтъкът също е пречистван, напр. с йонообменник или Ni-хелатна хроматография, преди да бъде прехвърлен в редуциращия буфер. Денатуриращите агенти включват, но не се ограничават само до урея и гуанидин-HCl. Рекомбинантният белтък след това се разрежда поне 10-кратно, за предпочитане 100-кратно, в окисляващ буфер, който съдържа окисляващ агент, като напр. (но без да се ограничава само до него) 0,1 М TrisНС1, pH 8.0, ImM EDTA, 0.15 М NaCl, 0.3 М окислен глутатион. Слетият белтък след това се инкубира за около 1 до 24 h, за предпочитане около 2 до около 16 h, на стайна температура с окисляващ буфер. Окисляващият буфер може да съдържа стабилизиращ белтъка, агент, напр. захар, алкохол или амониев сулфат. Окисляващият буфер може освен това да съдържа един хаотропен агент в ниска концентрация, за да дестабилизира неточните междумолекулни взаимодействия и така да улеснява правилното нагъване. Подходящите хаотропни агенти включват, но не се ограничават до един детергент, един полиол, L-аргинин, гуанидин-HCl и полиетиленгликол (PEG). Важно е да се използува достатъчно ниска концентрация от хаотропния агент, за да се избегне денатурацията на белтъка. Отново нагънатият белтък може да бъде концентриран най-малко около 10-кратно, за предпочитане до количеството, до което е бил разреден в окисляващия буфер.

Процесите на бактериална ферментация могат също да доведат до получаване на рекомбинантен белтък, който съдържа неприемливи количества енодотоксини. Следователно, изобретението предвижда отстраняване на такива ендотоксини, напр. с помощта на ендотоксин-специфични антитела или ендотоксин-свързващи молекули. Наличието на ендотоксини може да бъде определено със стандартни техники, такива като използуващите Е-ТОХАТЕ Reagmts (Sigma, StLouis, Missouri) или c биотестове. В допълнение на специфичния пример, изобретателите предвиждат за експресиране на ob белтък, използването на baculovirus, на експресионни системи от бозайници и дрожди. Например, в експресионни системи от baculovirus, могат да се използуват както неслети пренасящи вектори, такива като, но не ограничаващи се до, pVL941 (BamHI клониращо място; Summers), PV 1393 (BamHI, Smal, Xbal, EcoRI, Notl, Xmalll, BglII и Pstl, клониращи места; (Invitrogen), pVL1392 (Bglll, stl, Notl, Xmalll, EcoRI, Xbal, Smal и BamHI клониращи места, Summers и Invitrogen) и pBlue BacIII (BamHI, Bglll, Pstl, Ncol и Hindlll клониращо място, c възможност за синьо/бял скрининг; (Invitrogen), така и слети пренасящи вектори, такива като, но не ограничаващи се до, рАс700(ВатН1 и ΚρηΙ клониращо място, в които разпознаващото място за BamHI започва с иницииращия кодон; Summers), рАс701 и рАс702 (също както рАс700, с различни рамки за четене), рАсЗбО (BamHI клониращо място на 36 базови двойки след един полихедрин иницииращ кодон; Invitrogen (195) и pBlueBacHisA,B,C (три различни рамки за прочит, с ВатН 1, Bglll, Pstl, Ncol и Hind III клониращо място, един N-краен пептид за пречистване с ProBond и синьо/бял рекомбинантен скрининг на плаките; Invitrogen (220).

Експресионни вектори от бозайници, предвидени да бъдат използувани от изобретението, включват вектори с индуцируеми промотори, като промотора за дихидрофолатредуктаза (DHFR), напр. всеки експресионен вектор с един DHFR експресионен вектор или един DHFR/ метотрексат коамплифициращ вектор, като напр. pED (Pstl, Sall, Sbal, Smal и EciRl клониращо място, като векторът експресира както клонирания ген, така и DHFR; вж. Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Алтернатив но,един глутамин-синтетаза/метионин сулфоксимин коамплифициращ вектор, като ЕЕ14 (НпкПП, Xbal, Smal, Sbal, EcoRI и Bell) клониращо място, в който векторът експресира глутаминсинтетаза и клонирания ген; Celltech). В друго изпълнение, може да бъде използван един вектор, който насочва епизомалната експресия под контрола на Epstein Barr Virus (EBV) като pREP4 (BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, PvuII и Kpnl клониращо място, конститутивен RSV-LTR промотор, хигромицин-селективен маркер; Invitrogen) , рСЕР4 (BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindlH, Nhel, PvuII и Kpnl клониращо място, конституитивен hCMV ранен ген, хигромицин-селективен маркер; Invitrogen), рМЕР4 (KnI, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHI, BamHI клониращо място, индуцируем промотор за металотионеин Па гена, селективен маркер за хигромицин; Invitrogen), pREP8 (BamI, Xhol, Notl, Hindlll, Nhel и Kpnl клониращо място, RSV-LTR промотор, селективен маркер за хистидинол; Invitrogen), pREP9 (Kpnl, Nhel, HindlH, Notl, Xhol, Sfil и BamHI клониращо място, RSVLTR промотор, G418 избираем маркер; Invitrogen) и pEBVHis (RSV-LTR промотор, избираем маркер за хигромицин, N-терминален белтък пречистваем с ProBond смола и скъсван с ентерокиназа; Invitrogen). Селективни експресионни вектори от бозайници за ползуване от изобретението включва pRc/CMV (HindlH, BstXI, Notl, Sbal и Apal, клониращо място, G418 селекция; Invitrogen), pRc/RSV (HindlH, Spel, BstXI Notl, Xbal клониращо място, G418 селекция; Invitrogen) и други. Vaccinia virus експресионни вектори от бозайници (вж. Kaufman, 1991, по-горе) за употреба съгласно изобретението) включват, но не се ограничават до pSCl 1 (Smal клониращо място, ТК- и β-гал селекция), pMJ601 (SaH, Smal, AfH, Narl, BspMII, BamHI, Aal, Nhel, SacH, Kpnl и Hindlll клониращо място; ТК- и β-гал селекция) и pTKgptFIS (EcoRI, Pstl, SaH, AccI, Hindll, Sbal, BamHI и Нра, клониращо място, ТК или XPRT селекция).

Експресионни системи от дрожди също така могат да бъдат използувани съгласно изобретението за експресиране на ОВ полипептид. Например, неслетият pYES2 вектор (Xbal, SphI, Shol, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, Kpnl и HindHI клониращо място; Invitrogen) или слетият вектор (pYESHisA,B, С Xbal, SphI, Shol,

Notl, BstXI, EcoRl, BamHl, SacI, Kpnl и Hindlll клониращо място, N-терминален пептид пречистен с ProBond смола и скъсан с ентерокиназа; Invitrogen), да се упоменат точно две, могат да бъдат използувани съгласно изобретението,

По-нататък се предвижда аналозите на модулаторния пептид на телесното тегло да бъдат изготвени от нуклеотидни последователности, получени в рамките на настоящото изобретение.

В допълнение на рекомбинантната експресия на ОВ полипептида, настоящето изобретение предвижда и прави напълно възможно получаването на ОВ полипептид или негови фрагменти, като се използуват добре известните високо развити техники на пептидна синтеза върху твърда фаза. Изобретението предвижда за изготвяне на ob полипептид или негови фрагменти, да бъдат използувани както популярните Вос и Fmoc, така и други стратегии протектиращи групите. Известни са различни техники за повторно нагъване и окисляване на цистеиновите сулфхидрилни групи за образуване на дисулфидни връзки.

Антитела спрямо ОВ полипептид

Съгласно изобретението, ОВ полипептид получен рекомбинантно или чрез химична синтеза и негови фрагменти или други деривати или аналози, включително слети белтъци, могат да бъдат използувани като имуногени за генериране на антитела, които разпознават ОВ полипептида. Такива антитела включват, но не се ограничават до поликлонални, моноклонални, химерни, едноверижни, Fab фрагменти и Fab експресионна библиотека.

Една молекула е “антигенна” когато е способна да взаимодейства специфично с една антиген-разпознаваща молекула на имунната система, като един имуноглобулин (антитяло) или Т клетъчен антиген рецептор. Един антигенен полипептид съдържа най-малко 5, а за предпочитане поне около 10 аминокиселини. Една антигенна част от молекула може да бъде тази част, която е имунодоминантна за антитялото или за разпознаване от Т клетъчния рецептор, или може да бъде използувана като част от комплекс, способен да генерира антитяло срещу молекулата, като за имунизацията, тази антигенна част се свързва с една молекула носител. Молекула, която е антигенна, не е необходимо самата тя да бъде имуногенна, т. е. способна да предизвика имунен отговор ако не е свързана с носител .

Едно “антитяло” е всеки имуноглобулин, включващ антитела и техни фрагменти, който се свързва със специфичен епитоп. Терминът обхваща попиклонални, моноклонални и химерни антитела. Последните са описани в по-големи подробности в US 4,816,397 и 4,816,567, както и антиген-свързващи части от антителата, включващи Fab, F(ab’)z и F(v) (включително антитела от единична верига). В съответствие с това, фразата “молекула антитяло” използувана тук в различни граматични форми предвижда както една интактна имуноглобулинова молекула, така и една имунологично активна част от една имуноглобулинова молекула, съдържаща свързващото място на антитялото. Едно “свързващо място на антитялото” е тази структурна част от молекулата на антитялото, състояща се от вариращи и хиперварирагци области на тежката и леката верига, която специфично свързва антигена.

Типични молекули антитела са интактни имуноглобулинови молекули и тези части на имуноглобулиновата молекула, които съдържат паратопа, включително тези части известни като Fab, Fab’, F(ab’)₂ и F(v), които части са предпочитани за използуване при описаните тук терапевтични методи.

Fab и F(ab’)₂ частите на молекулите на антитялото се получават чрез протеолитично третиране с папаин и пепсин, на интактни молекули на антитялото с добре известни методи. Вж. например US 4,342,566. Fab’ частите на молекулата на антитялото са също добре известни и се получават от F(ab’)₂ частите, с последваща редукция (напр. с β-меркаптоетанол) на дисулфидните връзки свързващи двете тежки вериги и след това цилклиране на получения белтъчен меркаптан с реактив като йодоацетамид. В изобретението се предпочита антитяло съдържащо интактни молекули на антитялото.

Фразата “моноклонално антитяло” и нейните различни граматични форми се отнася до антитяло, което притежава само един вид свързващо място, способно да реагира имунно с определен антиген. По този начин едно моноклонално антитяло по правило проявява единична свързваща активност, за който и да е антиген, с който то имунореагира. Следователно едно моноклонално антитяло може да бъде молекула антитяло, която има множество свързващи места на антитялото, всяка имуноспеифична за разли чен антиген; напр. едно биспецифично (химерно) моноклонално антитяло.

Терминът “адювант” се отнася до едно съединение или смес, които усилват имунния отговор срещу антигена. Един адювант може да служи като тъканно депо, което бавно освобождава антигена и също като активатор на лимфоидната система, който неспецифично усилва имунния отговор [Hood et al., Immunology, p. 384, Second Ed.,Benjamin/Cummmges, Menlo Park, California (1984)]. Често, един първичен сигнал само с антигена, в отсъствие на адювант, може да не предизвика хуморален или клетъчен имунен отговор. Адювантите включват, но не се ограничават до, пълния адювант на Freund, непълния адювант на Freund сапонин, минерални гелове като алуминиев хидроксид, повърхностно активни вещества като лизолецитин, плуронови полиоли, полианиони, пептиди, маслени или хидрокарбонови емулсии, keyhole limpet хемоцианини динитрофенол и потенциално използваеми адюванти при човека като BCG (bacille Calmette-Guerin) и Corynebacterium paruum. Предпочитано, адювантът е фармацевтично приемлив.

Различни процедури, известни в тази област, могат да бъдат използувани за получаване на поликлонални антитела спрямо ОВ полипептида или негови фрагменти, производни, или аналози. За получаване на антитяло, могат да бъдат имунизирани чрез инжектиране на ОВ полипетид или негов дериват (напр. фрагмент или слят белтък), различни животински гостоприемници, включително, но не ограничено, само до зайци, мишки, плъхове, овци, кози и др. В едно изпълнение, ОВ полипептидът или негов фрагмент могат да бъдат конюгирани с един имуногенен носител, напр..говежди серумалбумин (BSA) или Keyhole limpet hemocyanin (KLH). Могат да бъдат използувани различни адюванти за повишаване на имунологичния отговор, в зависимост от вида на гостоприемника, включително, но не ограничаващи се до адюванта на Freund (пълен или непълен), минерални гелове, като алуминиев хидроксид, повърхностно активни вещества като лизолецитин, плуронови полиоли, полианиони, маслени емулсии, keyhole limpet hemocyanins, динитрофенол и потенциално използваеми човешки адюванти като BCG(bacille CalmetteGuerin) Corynebacterium paruum.

За получаване на моноклонални антитела насочени спрямо ОВ полипептида или негов фрагмент, аналог или дериват, може да бъде използувана всякаква техника, която допринася за продуцирането на молекули на антитялото от трайни клетъчни линии. Такива техники включват, но не се ограничават до, хибридомната техника, оригинално развита от Kohler et al., Nature, 256:485-497 (1975), както и триоматехниката, човешката В-клетьчна хибридомна техника [Kozbor et al., Immunology Tody, 4:72 (1983)] и EBV- хибридомната техника за получаване на човешки моноклонални антитела [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Обезсмъртени, продуциращи антитела клетъчни линии могат да бъдат създадени с техники различни от клетъчното сливане, като например директната трансформация на В лимфоцити с онкогенна ДНК или трансфекция с Epstein-Barr вирус. Вж. напр. М. Schreier et al., “Hybridoma Techniques”(1980);Hammerling et al., “Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas” (1981); Kennet et al., “Monoclonal Anribodies” (1980); вж. също US 4,341,761; US 4,399,121; US 4,427,783; US 4,444,887; US 4,451,570; US 4,466,917; US 4,466,917; US 4, 472, 500; US 4, 491, 632 и US 4,493,890.

В едно допълнително изпълнение на изобретението, моноклонални антитела могат да бъдат продуцирани в аксенични (свободни от микроорганизми) животни използвайки нови технологии (PCT/US1990/ 002545). Съгласно изобретението, човешки антитела могат да бъдат използувани и те могат да бъдат получени с помощта на човешки хибродоми [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983) или чрез трансформиране на човешки В клетки с ЕВ V вирус in vitro (Cole et al., 1985, по-горе). Съгласно изобретението могат да бъдат използувани техники създадени за получаване на “химерни аниTena”[Morrison et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neurberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Taxeda et al., Nature, 314:452-454 (1985) чрез снаждане на гени от молекула мишо антитяло специфично за един ob полипептид, с гени от молекула човешко антитяло с подходяща биологична активност; такива антитела са в обсега на настоящето изобретение.

Такива човешки или хуманизирани химерни антитела се предпочитат за приложение при болести или смущения у човека (както е описано по-долу), тъй като е много по-малко вероятно човешките или хуманизираните антитела, отколкото ксеногенните антитела да индуцират имунен отговор, в частност алергичен отговор.

Съгласно изобретението, техниките, описани за получаване на едноверижни антитела (US 4,946,778) могат да бъдат адаптирани за получаване на ОВ полипептид-специфични едноверижни антитела. Едно допълнително изпълнение на изобретението използува описаните техники за конструиране на Fab експресионни библиотеки [Huse et al., Science 246.1275-1281 (1981)], което позволява бърза и лесна идентификация на моноклонални Fab фрагменти с желаната специфичност за един оЬ полипептид или негови деривати или аналози.

Фрагменти от антитела, които съдържат идиотипа на молекулата антитяло, могат да бъдат генерирани с познатите техники. Например, такива фрагменти включват, но не се ограничават до: F(ab’)₂ фрагмент, който може да бъде получен с пепсинова хидролиза на молекулата-антитяло; Fab фрагменти, които могат да бъдат генерирани чрез редукция на дисулфидни мостове на F(ab’)₂ фрагменти и Fab фрагменти, които могат да бъдат генерирани чрез третиране на молекулата-антитяло с папаин и един редуциращ агент.

При продуциране на антитела, може да бъде извършен скрининг на желано антитяло с известните в тази област техники, напр. радиоимуно определяне, ELISA (ензим-свързана имуносорбентна проба), имунопроби тип “сандвич”, имунорадиометрични проби, гел дифузионни преципитационни реакции, имунодифузионни проби, in situ, имунопроби (напр. с помощта на колоидално злато, ензимно, или радиоизотопно бележене), имуноблотинг, преципитационни реакции, аглутинационни проби (напр. гелаглутинационни проби, хемоаглутинационни проби), комплемент-свързващи проби, имунофлуоресцентни проби, протеин А проби и имуноелектрофореза и т.н. В едно изпълнение, свързването на антитялото се открива чрез доказване на белег в първичното антитяло. В друго изпълнение, първичното антитяло се открива чрез доказване свързването на едно вторично антитяло или реагент с първичното антитяло. В едно следващо изпълнение, вторичното антитяло е белязано. Известни са много начини в тази област за от криване свързването в едно имуноизследване и те са в обсега на настоящето изобретение. Например, за да се подберат антитела, които разпознават специфичен епитоп на един ОВ полипептид, могат да бъдат изследвани генерирани хибридоми за продукт, който да свързва фрагмент от ОВ полипептида съдържащ този епитоп. Антитяло, специфично срещу ОВ полипептид от определен животински вид, може да се селекционира на базата на положително свързване с ОВ полипептид експресиран от или изолиран от клетки на този животински вид.

Горепосочените антитела могат да бъдат използувани в известни за тази област методи, свързани с локализацията и активността на ОВ полипептида, напр. Western blotting, визуализиране на ОВ полипетида in situ, измерване на неговите нива в съответни физиологични проби и т.н.

В едно специфично изпълнение, могат да бъдат получени антитела, които агонизират или антагонизират активността на ОВ полипептида. Такива антитела могат да бъдат тестирани с помощта на описаните по-долу проби за идентифициране на лиганди.

В едно специфично изпълнение, бяха изготвени антитела чрез имунизиране на зайци със синтетични пептиди с първична структура, изведена от аминокиселинната последователност на белтъка, или с рекомбинантни белтъци получени с бактериални експресионни вектори. Изборът на синтетични пептиди е направен след внимателен анализ на първичната структура на белтъка, както е описано по-горе. По-конкретно, избират се пептидни последователности между предполагаеми места на скъсване. Синтетични пептиди се свързват с носител като напр. KLH хемоцианин или BSA с помощта на карбодиимид и се прилагат в адювант на Freund за имунизиране на зайци. За изготвяне на рекомбинантен белтък може да бъде използуван векторът pGEX, който да експресира полипептида (Smith et al., 1988, по-горе). Алтернативно, за генериране на слетия белтък, могат да бъдат използувани само хидрофилни домени. Експресираният белтък следва да бъде получен в достатъчно количество и да се използува за имунизиране на зайци с адюванта на Freund.

В друго специфично изпълнение, рекомбинантният ОВ полипептид е използуван за иму низиране на пилета и пилешките анти-ОВ антитела са изолирани от яйчен жълтък, напр. с афинитетно пречистване на една ОВ-колона. Предпочита се използуваните за имунизация пилета да се отглеждат в специфични, аксенични условия (SPF).

В друго изпълнение, антитела спрямо лептин са получавани в ob/ob мишки, в които няма циркулиращ ОВ полипептид и поради това се очаква да са способни да генерират анти-ОВ полипетиден отговор, тъй като те няма да бъдат толерирани спрямо полипептида и мишки див тип. Клетки от слезка от двете групи мишки могат да бъдат слети с миеломни клетки за изготвяне на хибридоми от моноклонални алгитела.

В друго изпълнение, рекомбинантен ОВ полипептид е използуван за имунизиране на зайци и поликлоналните антитела са имунопречистени преди по-нататъшна употреба. За пречистване на антитела особено полезни са полуколичествените проби, по-специално за откриване наличието на циркулиращ ОВ полипептид в серума или в плазмата.

Групи от моноклонални антитела, получени срещу модулаторни пептиди, могат да бъдат скринирани по отношение на различни качества; т.е. изотип, епитоп, афинитет и др. От особен интерес са моноклоналните антитела, които неутрализират активността на модулаторните пептиди. Такива моноклонални антитела могат лесно да бъдат идентифицирани чрез проби за активност на модулаторите на теглото. Високоакгивни антитела се използуват също когато е възможно имуноафинитетно пречистване на природен или рекомбинантен модулатор.

Предпочитано, антимодулаторното антитяло, използвано в диагностичните и терапевтичните методи на това изобретение е афинитетно пречистено поликлонално антитяло. Още по за предпочитане е, антитялото да бъде моноклонално (mAb). В допълнение, за предпочитане е молекулите антимодулаторно антитяло използувани тук да бъдат във формата на Fab, Fab’ F(ab’)₂ или F(v) части от целите молекули антитяло.

Диагностични приложения

Настоящото изобретение се отнася също до различни диагностични приложения, включително методи за откриване наличието на състояния и/или стимули, които влияят върху от отклонения на телесното тегло или затлъстяване, отнасящи се до тяхната способност да предизвикват активности, които са осъществявани с настоящите модулатори на теглото. Както бе споменато по-рано, пептидните модулатори на теглото могат да бъдат използувани за получаване на антитела спрямо тях чрез различни известни техники и впоследствие такива антитела могат да бъдат изолирани и използувани като тестове за наличие на специална транскрипционна активност в предполагаеми прицелни клетки. Алтернативно, нуклеиновите киселини на изобретението могат да бъдат използувани в диагностиката.

Диагностики, базирани на антитела.

Както бе предположено по-рано, един диагностичен метод, използуван в настоящето изобретение, включва изследване на клетъчна проба или среда с помощта на тест включващ ефективно количество от един антагонист на белтъчния модулатор, като напр. едно антимодулаторно антитяло, за предпочитане едно афинитетно-пречиетено поликлонално антитяло, и найпредпочитано едно mAb. В допълнение, предпочитателно се молекулите антимодулаторно антитяло използувани тук да бъдат във формата на Fab, Fab’, F(ab’)₂ или F(v) части от целите молекули на антитялото. Както бе вече дискутирано, пациенти, които могат да бъдат благоприятно повлияни от този метод са и тези страдащи от рак, СПИН, затлъстяване или други състояния, при които абнормното телесно тегло е признак или фактор. Добре известни в тази област са методи за изолиране на модулатор, за индуциране на антимодулаторни антитела и за определяне и оптимизиране способността на антимодулаторните антитела да участвуват при изпитване на прицелните клетки.

Известно диагностично приложение могат да намерят също така и антитела от двата вида - поликлонални и моноклонални антитела и препарати, които модулират продукцията или активността на модулаторите контролиращи теглото и други разпознаващи фактори и/или техни субединици. Те могат например, да се използват за откриване и/или измерване състоянията, при които има ненормално телесно тегло или е възможно да се развие такова. Например, модулаторните пептиди или техни активни фрагменти могат да бъдат използувани за получаване на моноклонални и поликлонални антитела спрямо тях в различни клетъчни среди, с известни техники, като хибридомната техника използуваща например слети миши лимфоцити от слезка и миеломни клетки. Тези техники са описани в подробности по-долу. Възможно е да бъдат открити или синтезирани малки молекули, които имитират или антагонизират активностга(тите) на факторите разпознаващи рецептора на изобретението и да бъдат използувани в диагностични и/или терапевтични протоколи.

Наличието на модулатори на теглото в клетките може да се потвърди с обикновени имунологични методи, приложими за такива определения. Известни са няколко приложими процедури. Три такива процедури, които са особено полезни, използуват било фактора, разпознаващ рецептора, белязан с доловим белег, било антитяло ЛЬ₁ белязано с доловим белег, или антитяло АЬ₂ белязано с доловим белег. Процедурите могат да бъдат обобщени със следващите уравнения, където звездичката указва, че частицата е белязана, a “WM” означава модулатор на теглото.

A. WM* + Ab] = WM*Ab*

B. WM+ Ab,*- WMAbl*

C. WM+ Ab, + Ab*₂ = Ab₍ WMAb₂*

Процедурите и тяхното приложение са напълно известни на специалистите в тази област и съответно могат да бъдат използувани в обсега на настоящето изобретение. “Конкурентна” процедура, Процедура А, е описана US 3,654,090 и US 3,850,752. Процедура В е представителна за добре известните техники на базата на конкурентна проба. Процедура С, тип “сандвич” е описана в US 31,006 и US 4,016,0453. Известни са и други процедури като “двойно антитяло” или “DASP” процедурата.

Във всеки случай, модулаторите на изобретението образуват комплекси с едно или повече антитела или свързващи партньори и един член на комплекса е белязан с доловим белег. Фактът, че се е образувал комплекс, а ако е било желателно и неговите количества могат да бъдат определяни с известните методи, приложими за откриване на белег.

От горепосоченото се вижда, че характерно свойство на АЬ₂ е, че то ще реагира с АЬ_Г Това е така, защото ЛЬ], което е създадено в даден вид бозайник, е използувано в друг животински вид като антиген за образуване на антитялото АЬ₂. Например, АЬ₂ може да бъде създа дено в кози, като се използуват заешки антитела като антигени. Следователно АЬ₂ще бъде антизаешко антитяло създадено в кози. За целите на това описание и претенции, АЬ] ще бъде отбелязвано като първично или антитяло спрямо антимодулатора на теглото, а АЬ₂ ще бъде отбелязвано като вторично или анти-Ab, антитяло.

Най-често в тези проучвания, като белег са използувани радиоактивни елементи, ензими, химични съединения, които флуоресцират когато се изложат на ултравиолетови лъчи и др.

Познати са известен брой флуоресциращи съединения, които могат да бъдат използувани като белег. Към тях спадат например флуоресцеин, родамин и ауламин. Специален материал за откриване получен от кози е антизаешко антитяло, свързано с флуоресцеин посредством изотиоцианат.

Модулаторите на теглото или техните свързващи партньори могат също да бъдат белязани с радиоактивен елемент или с ензим. Радиоактивният белег може да бъде открит с всеки от рутинно прилаганите процедури за измерване на радиоактивността. Предпочитаният изотоп може да бъде подбран от Ή, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S, “Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Со, “Co, ⁵⁹,Fe, “Ύ, ^l251,¹³1 и ^,86Re.

Ензимни белези също се използуват. Те могат да бъдат откривани с всеки от използуваните понастоящем, колориметрични, спектрофотометрични, флуороспекгрофотометрични, амперометрични и газометрични техники. Ензимът се свързва с подбрана частица чрез реакция с образуване на мостове между такива молекули като карбодиимиди, тиоцианати, глутаралдехид и подобни. Известни са много ензими, които могат да бъдат използувани при тези процедури. Предпочитани са пероксидаза, β-глюкуронидаза, βD-глюкозидаза, З-О-галакгозидаза, уреаза, ппокозо оксидаза плюс пероксидаза и алкална фосфатаза. (US 3, 645, 090; US 3,850, 752; и US 4, 016,043 описват примери на откриване на различно белязани материали и методи).

В едно по-нататъшно изпълнение на настоящето изобретение, могат да бъдат изготвени тестови китове за ползуване от специалисти медици при определяне наличието или отсъствието на предварително зададена транскрипционна активност или предварително зададена способност за транскрипционна активност в предполагаеми прицелни клетки. В съответствие с обсъжданите по-горе техники за тестиране, даден клас от такива китове ще съдържа поне белязания модулатор на теглото или неговия свързващ партньор, например специфично за него антитяло и разбира се указания, в зависимост от избрания метод, напр. “конкурентен”, “сандвич”, “DASP” и подобни. Тези китове могат да съдържат също така допълнителни реактиви като буфери, стабилизатори и други.

В съответствие с това, може да бъде изготвен тест-кит за демонстриране наличието или способността на клетките за предопределена транскрипционна активност, включващ:

(а) Определено количество от поне един белязан имунохимично реактивен компонент, получен чрез директното или индиректното присъединяване към настоящия модулатор на теглото или към негов специфичен свързващ партньор на някакъв определяем белег;

(б) други реактиви; и (в) указания за ползуване на посочения кит.

По-специално, диагностичният тест-кит трябва да съдържа:

(а) известно количество от модулатора на теглото както е описано по-горе (или свързващ партньор) обикновено свързан с твърда фаза, за да образува имуносорбент или алтернативно, свързан с подходящ свободен край tag или множество такива крайни продукти и т.н. (или техни свързващи партньори) един от всеки.

В един следващ вариант, тест-китьт може да бъде изготвен и използуван за целите, указани по-горе, като функционира в съответствие с предвидения протокол (напр. “конкурентен”, “сандвич”, “двойно антитяло” и др.) и включва:

(a) белязан компонент, получен чрез свързване модулаторът на теглото с откриваем белег;

(b) един или повече допълнителни имунохимични реагенти, от които поне един реагент е лиганд или е имобилизиран лиганд, който лиганд е подбран от група състояща се от:

(i) лиганд, способен да се свързва с белязания компонент (а);

(ii) лиганд, способен да се свързва с един свързващ партньор на белязания компонент(а);

(iii) лиганд, способен да се свързва с поне един от компонентите), които ще бъдат определяни; и (iv) лиганд способен да се свързва с поне един от свързващите партньори на поне един от компонент (ите), които ще бъдат определяни; и (с) указания за изпълнение на протокол за откриване и/или определяне на един или повече компоненти на една имунохимична реакция между модулатора на теглото и негов специфичен свързващ партньор.

Диагностични възможности, базиращи се на нуклеинови киселини

Както е показано по-долу в примерите, нуклеиновите киселини на изобретението могат да бъдат използувани за откриване на дефекти свързани с дефекти на ОВ полипептида, които водят до затлъстели фенотипове. Например, сонди от нуклеинови киселини (напр. за Northern анализ или RT-PCR анализ) могат да бъдат използувани за да се определи дали един затлъстял фенотип е свързан с липса на експресия на ОВ мРНК или експресия на нефункционална ОВ мРНК, напр. както е при db/db мишките (където дефицитът е резултат на липса на ОВ рецептор) или където една мутация води до нетранскрибируема мРНК. Освен това, диагностичните техники базиращи се на изобретението могат да бъдат използувани заедно с техники използуващи антитяло, за да развият по-нататък едно молекулно разбиране на фенотиповете на затлъстяването или анорексията.

Човешки кДНК клонове, изолирани в последните години бяха секвенирани както е посочено тук. Това улеснява определението на цялата последователност на човешкия ген (вж. фигура 2ОА до С; SEQ ID N0:22). Получени бяха ДНК последователности от ингрони на човешки ОВ ген (фигура 20) и те бяха използувани за изготвяне на PCR праймери за амплифициране с PCR на кодиращата последователност на ОВ гена от човешка геномна ДНК, така че да бъдат идентифицирани мутации или алелни варианти на ОВ гена. Това бе изпълнено в съответствие с протоколите, които са подробно описани по-рано в настоящия текст. В отделен пример по-долу са описани специфични PCR праймери за амплифициране на човешки геномен ОВ.

Настоящата хипотеза предполага, че хетерозиготни мутации в ob гена ще са свързани с леко/средно тежко затлъстяване. Няколко базиращи се на ДНК последователност диагностични тестове за затлъстяване могат да се базират на хомозиготни мутации. Ако това е вярно, то ще даде възможност за уточняване на хора с риск за развитие на затлъстяване и ще направи възможно приложението на лекарствена терапия и/или промени в начина на живот преди да се развие повишеното телесно тегло.

Алтернативно, наличието на микросателити, скачени с мутантни форми на човешкия ОВ ген, могат да бъдат използувани за диагностика. В това отношение могат да бъдат използувани различни PCR праймери, включително тези базиращи се на нуклеотидна последователност представена във фигура 20А до С.

ОЬ генът може също да бъде използуван диагностично за измерване кодираната от него РНК и белтък при смущения в храненето. Важно е да се знае, при определено хранително заболяване, дали ОВ РНК и/или кодираният от нея белтък е положително или отрицателно регулиран? Така ако в един затлъстял индивид нивото на ОВ е повишено, това означава, че проблемът е след ОВ, докато ако ОВ е намален, изглежда, че несъответно ниски нива на ОВ могат да са причината за затлъстяване (независимо от това дали дефектът е в ОВ гена или не е). Обратно, ако у един раково болен или болен от СПИН пациент, които губят тегло, се открият повишени нива на ОВ, тогава може да се заключи, че несъответно високата експресия на ОВ е причина за загубата на тегло.

Клонираната човешка кДНК може да бъде използувана за определяне нивата на човешката ОВ РНК. В допълнение, може да бъде получен рекомбинантен човешки белтък, който да бъде използуван за създаване на имунотестове, с които да се определят мазнини и вероятно плазменото ниво на ОВ белтъка,

Терапевтични приложения

Полипептидите, нуклеиновите киселини и антителата на изобретението имат значителен терапевтичен потенциал. Предпочитано ефективно терапевтично количество от такъв агент се въвежда чрез фармацевтично подходящ носител, разтворител или ексципиет.

Фразата “фармацевтично приемлив” се отнася до молекулните съставки, които са физиологично поносими и обикновено не предизвикват алергични или подобни неблагоприятни реакции, като стомашни смущения, световъртеж и подобни, когато се въвеждат у хора. Предпочи тателно, както е използван тук, терминът “фармацевтично приемлив” означава да е утвърден от контролна агенция на федералното или щатското управление или включен в списъка на US Pharmacopeia или други признати фармакопеи за прилагане на животни и в частност на хора. Терминът “носител” се отнася за разредител, адювант, ексципиент или вехикулум, с които се въвежда веществото. Такива фармацевтични носители могат да бъдат стерилни течности, като вода или масла, включително такива получени от петрол, животни, растения или със синтетичен произход, като фъстъчено масло, соево масло, минерално масло, сусамено масло и подобни. Като носители предпочитано се използуват вода или солеви разтвори, водни разтвори на декстрози и глицерол, специално за инжекционни разтвори. Подходящи носители са описани в Martin, Remington’s Pharmaceutical Scienses, 18^th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Фразата “терапевтично ефективно количество” тук се използува, за да се означи количество достатъчно да намали най-малко около 15%, за предпочитане поне 50%, по-добре 90% и най-предпочитано да предотврати един клинично съществен дефицит на активност, функция и отговор на гостоприемника. Алтернативно, терапевтично ефективно количество е това, което е достатъчно да подобри едно съществено клинично състояние на гостоприемника.

Въвеждането на рекомбинантен ОВ полипептид води до загуба на тегло и в частност намаляване на мастната тъкан. ОВ полипептид може да бъде получен с използуване на стандартни експресионни вектори от бактерии и/или бозайници, по синтетичен път или с пречистване от плазма или серум, както бе подробно представено по-рано. Алтернативно, повишена експресия на нативен ОВ полипептид може да бъде индуцирана чрез хомоложни рекомбинантни техники, както е описано по-горе.

Редуцирането активността на ОВ полипептида (чрез създаване на антагонисти, инхибитори, използуване на неутрализиращи антитела или антисенз-молекули) ще предизвика нарастване на теглото, което е желателно при третиране на загуба на телесно тегло при раково заболяване, СПИН или anorexia nervosa. Модулацията на ОВ активността може да се използува за намаляване на телесното тегло (чрез повишение на него вата активност) или за нарастване на теглото (чрез понижение на неговата активност.

Терапевтично приложение, основано на полипептида

При най-простия анализ, ОВ генът определя телесното тегло у бозайници и в частност при мишката и човека.

Продуктът на ОВ гена и съответно, сродни молекули изглежда, че са част от сигнални пътища, чрез които мастната тъкан комуникира с мозъка и други органи. Предполага се, че самият ОВ полипептид е сигнална молекула, т. е. един хормон.

ОВ полипетидът или негов функционално активен фрагмент, или негов антагонист, могат да бъдат въведени орално или парентерално, за предпочитане парентерално. Тъй като метаболитната хомеостаза е един непрекъснат процес, предпочита се контролираното въвеждане на ob полипептида. Например, полипептндът може да бъде въведен с венозна инфузия, с имплантабилна осмотична помпа с трансдермален пластир, с липозоми или други методи на въвеждане. В едно изпълнение, се използва помпа [. Langer et al., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Press, Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. В друго изпълнение се използват полимерни материали [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen et al., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev.Macromol. Chem., 23:61 (1983); в също Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:315 (1984); Howard et al., J.Neurosurg., 71:105, (1989)]. И в едно друго изпълнение, една система с контролирано освобождаване може да бъде поставена в близост до терапевтичния таргет, т.е. мозъка, така че за терапевтичен ефект е нужна само част от системната доза [вж. Hanp.Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115138 (1984)]. Други системи c контролирано освобождаване са обсъдени в обзора на Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). В друго изпълнение, лекарството може да бъде доставено в едно мехурче, в частност липозома (вж. Langer, 1990, по-горе). Treat et al., in Liposome in the

Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBerestain and Fidler (eds), Liss, New York, pp.353365 (1989)]] Lopez-Berestain, ibid., pp. 317-327; вж. Общо ibid).

В един следващ аспект, рекомбинантни клетки, които са трансформирани с ОВ гени и експресират високи нива от полипептида, могат да бъдат трансплантирани в индивид, нуждаещ се от ob полипептида. Препоръчително, за да се избегне отхвърляне, се трансплантират трансформирани с ОВ автоложни клетки; алтернативно, има на разположение технология за защита на неавтоложни клетки, които продуцират разтворими фактори в един полимерен матрикс, което предотвратява имунното разпознаване и отхвърляне.

ОВ полипептндът може да бъде доставен чрез интравенозно, интрартериално, интраперитонеално, интрамускулно или подкожно въвеждане. Алтернативно, подходящо изготвен, ОВ полипептидът, може да бъде въвеждан назално или орално. Постоянна доставка на ОВ може да бъде осигурена, чрез внасяне на терапевтично ефективна доза (т. е. доза, способна да индуцира метаболитни промени в даден индивид) на необходими интервали, напр. ежедневно, на всеки 12 h и пр. Тези параметри ще зависят от тежестта на заболяването, което подлежи на лечение, други въздействия, които се осъществяват като промени в диетата, теглото, възрастта, пола на индивида и др. критерии, които могат да бъдат определени от специалиста в съответствие със стандартната медицинска практика.

Фармацевтичен състав

Друг аспект на настоящето изобретение е предоставянето на фармацевтични препарати от продуктите на изобретението. Такива фармацевтични препарати могат да бъдат във форми за инжектиране, за орално, пулмонално, назално или други форми на приложение. Общо изобретението обхваща фармацевтични препарати, съдържащи ефективни количества белтък или продукти-деривати на изобретението заедно с фармацевтично приемливи разредители, предпазители, разтворители, емулгатори, адюванти и/или носители. Такива съставки включват разредители с различно буферно съдържание (напр. ТрисНС1, ацетат, фосфат), pH и йонна сила; добавки като детергенти и разтварящи агенти (напр. Tween 80, Polysorbate 80), антиоксиданти (напр.

аскорбинова киселина, натриев метабисулфит), предпазители (напр. Thimersol, бензил алкохол) и пълнители (напр. лактоза, манитол); включване на материала в подходящи препарати на полимерни съединения като полимлечна киселина, полигликолова киселина и др. или в липозоми. Може да бъде използувана и хилауронова киселина. Такива съставки следва да повлияват физичното състояние, стабилността, скоростта, на освобождаване in vivo, скоростта на елиминиране in vivo на белтъците и техни деривати. Вж. напр. Martin, Remington’s Pharmaceutical Scienes, 18 th Ed. (1990, Mark Publishing Co., Easton, PA 18042) стр. 1435-1712, на цитираното ръководство. Препаратът може да бъде изготвен в течна форма или да бъде като сух прах, като лиофилизирана форма.

Орално въвеждане

Тук са предвидени за приложение твърди орални форми, които общо са описани в Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) в глава 49, която е включена тук като цитат. Твърдите форми на дозировка включват таблетки, капсули, пилюли, вулинки, таблетки за смучене. Също могат да бъдат използувани липозомно или протеноидно капсулиране за изготвяне на препаратите (като например, протеноидни микросфери съобщени в US 4,925,673. Може да бъде използувано липозомно капсулиране и липозомите могат да бъдат дериватизирани с различни полимери (US 5,013, 556). Описание на възможните твърди форми на дозировка за терапията е дадено от Marshall, in Modem Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed., (1979), включено тук като цитат. Общо съставът (на лечебния препарат) ще включва белтъка (или химически модифицирания белтък) и инертни съставки, които правят възможно предпазването от стомашното съдържимо и освобождаване на биологично активния материал в червата.

Специално предвидени са и форми за орално приложение на горните дериватизирани белтъци. Белтъкът може да бъде химически модифициран, така че оралното въвеждане на деривата да е ефикасно. Общо, предвидените химични модификации са присъединяване на поне една съставка към самата белтъчна (или пептидна) молекула, където споменатата съставка позволява: (а) инхибиране на протеолизата на белтъ ка; и (Ь) навлизане в кръвния ток през стомаха или червата. Също е желателно повишението на общата стабилност на белтъка и удължаване на циркулационното време в тялото. Примери за такива съставки(части) включват: полиетиленгликол, кополимери на етиленгликол и пропиленгликол, карбоксиметил целулоза, декстран, поливинилалкохол, поливинил пиролидон и полипролин. Abuchowski et al., 1981, по-горе; Newmark et al., J.Appl. Biochem., 4:185-189, (1982). Други полимери, които могат да бъдат използувани са поли-1,3-диоксалан и поли-1,3,6-тиоксокан. За предпочитане, при фармацевтично приложение, както бе указано по-горе, са полиетиленгликоловите съставки.

Мястото за освобождаване на белтъка (или деривата) може да бъде стомаха, тънките черва (дуоденум, йеюнумили илеум) или дебелите черва. Специалистът в тази област има на разположение комбинации, които не се разтварят в стомаха и се освобождават в дуоденума или на друго място в червата. Предпочитано, освобождаването трябва да избягва разрушителното действие на стомашното съдържимо чрез протекция на белтъка (или деривата) или чрез освобождаване на биологично активния материал след стомаха, в червата.

За да се осигури пълна устойчивост спрямо стомашното съдържимо, съществено е да е налице обвивка непроницаема, поне до pH 5.0. Примери за най-често използуваните инертни съставки, които се използуват като ентеропокрития са целулозоацетат тримелитат (CAT), хидроксипропилметилцелулозо фталат (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинил ацетат фталат (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, целулозоацетат фталат (CAP), Eudragit L Eudragit S и Shellac. Тези покрития могат да се използуват като смесени покрития.

Покритие или смес от покрития могат да бъдат използувани също и при таблетки, при които не е предвидена протекция от стомаха. Това може да включва захарни покрития или покрития, които улесняват поглъщането на таблетката. Капсулите следва да имат твърда капсулна обвивка (като желатин) за въвеждане на сухото лекарство, т.е. прах; за течните форми може да бъде използувана мека капсулна обвивка. Материалът за обвивка на вулинки може да бъде дебела скорбяла или друга ядлива хартия. За пилюли, таблетки със захарно покритие, формувани таблетки или таблетки за раздробяване могат да бъдат използувани влажни техники за уплътняване.

Лекарството може да бъде включено в комбинация като фини микрочастици във формата на гранули или пелети с големина на частиците около 1 mm. Комбинацията на материала за капсулно въвеждане може също да бъде като прах, леко пресовани тампони и дори като таблетки. Лекарството може да бъде изготвено чрез пресоване.

Оцветители и ароматизиращи агенти могат да бъдат включени. Например, белтъкът (или дериватът) може да бъде капсулиран в липозоми или микросфери и по-нататък включен в един ядивен продукт, като охладена напитка, съдържаща оцветители и ароматизатори.

Възможно е да се разреди или увеличи обемът на лекарството с инертен материал. Тези разредители могат да включват въглехидрати, специално манитол, а-лактоза, безводна лактоза, целулоза, захароза, модифицирани декстрани и скорбяла. Някои неорганични соли също могат да бъдат използувани като пълнители, включващи калциев трифосфат, магнезиев карбонат и натриев хлорид. Някои търговско достъпни разредители са Fas-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell.

В комбинацията на твърдата лекарствена форма могат да бъдат включени дезинтегранти. Материали, използувани като дезинтегранти включват, но не се ограничават до скорбяла и други, включително търговската форма на дезинтегранта Explotab базираща се на скорбяла. Могат да бъдат използувани натриев скорбелен гликолат, Амберлит, натрий-карбоксиметилцелулоза, ултрамилопектин, натриев алгинат, желатин, портокалова кора, кисела карбоксиметилцелулоза, природен сюнгер и бентонит. Друга форма на дезинтегранти са неразтворимите катионообменни смоли. Праховидни смоли могат да бъдат използувани като дезинтегранти и като свързващи средства и такива са праховидните смоли като агар, Кагауа или трагаканта. Като дезинтегранти се използуват също алгинова киселина и нейната натриева сол.

Свързващи вещества могат да бъдат използувани, за да задържат лекарственото вещество при оформяне на твърда таблетка. Те включват природни продукти като акация, трагаканта, скорбяла и желатин. Други включват метилцелулоза (МС) етилцелулоза (ЕС) и карбоксиметилцелулоза (СМС). Поливинил пиролидон (PVP) и хидроксипропилметилцелулоза (НРМС) могат да бъдат използувани в алкохолни разтвори, за да бъде гранулиран лекарственият, агент.

При изготвяне на лекарствения препарат може да бъде включен и един антифрикционен агент, за да се избегне слепването при процеса на изготвяне на препарата. Могат да бъдат използвани лубриканти под формата на слой между лекарственото вещество и матрицата. Като такива могат да бъдат използвани, без да се ограничават само до тях, стеаринова киселина, включително нейните магнезиеви и калциеви соли, политетрафлуороетилен (РТЕЕ), течен парафин, растителни масла и восъци. Могат да бъдат използувани и разтворими смазващи вещества, като натриев лаурилсулфат, магнезиев лаурилсулфат, полиетилениликол с различни молекулни тегла и Carbowax 4000 и 6000.

Могат да се добавят вещества, които да подобрят течливостта на агента при изготвяне на препарата и да подпомогнат пренареждането при компресията. Такива вещества могат да бъдат скорбяла, талк, pyrogenic silica и хидратиран силикоалуминат.

За да се подпомогне разтварянето на лекарството във водната среда, може да бъде добавено повърхностно активно покритие (сърфактант), като овлажняващ агент. Сърфакгантите могат да включват анионни детергенти като натриев лаурилсулфат, диоктил натриев сулфосукцинат и диоктил натриев сулфонат. Могат да се използват катионни детергенти като бензалкониев хлорид или бензетомиев хлорид. В списъка на потенциално възможните нейонни детергенти, които могат да бъдат включени при изготвяне на препарата като повърхностно активни вещества, са лауромакрогел 400, полиоксил 40 стеарат, хидрогенирана с полиоксиетилен боброва мас 10, 50 и 60, глицерол моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, захарозно мастнокиселинен естер, метилцелулоза и карбоксиметилцелулоза. Тези повърхностно активни вещества могат да участвуват в изготвяне на белтъчния препарат или негов дериват самостоятелно или като смес в различни съотношения.

Добавки, които потенциално могат да повишат поемането на белтъка (или деривата) са например мастните киселини-олеинова, линолова и линоленова киселини.

Могат да бъдат желателни препарати с контролирано освобождаване. Лечебната съставка може да бъде включена в инертен носител, който позволява освобождаването й чрез дифузия или чрез пропускащ механизъм, т. е. смоли. В препарата могат да бъдат включени също така бавно разграждащи се носители. Друга форма за контролирано освобождаване на това лекарство може да се осъществи с метод базиран на терапевтичната система Oroz (Alza Corp.), например агентът се затваря в полупропусклива мембрана, която позволява навлизането на вода и избутва агента навън през единичен малък отвор, дължащ се на осмотични ефекти. Ефект на забавено освобождаване имат някои ентеропокрития.

В технологичната рецептура могат да бъдат използувани и други покрития. Такива са различни захари, които могат да се нанасят в блюдо за покритие. Лекарственият агент може да се даде и във формата на филм-таблетки; материалите, използувани за тази цел се разделят на две групи. Първата група са не-ентеро материали и включват метил целулоза, хидроксипролил целулоза, хидроксипропилметил целулоза, натрий карбоксиметил целулоза, провидон и полиетиленгликол. Втората група се състои от ентероматериали, които обикновено са естери на фталовата киселина.

Може да бъде използувана смес от материали, за да се получи оптимално филмово покритие. Филмовото покритие може да се извърши в блюдо за нанасяне на покритието или в течна баня или чрез компресионно нанасяне.

Белодробно въвеждане

В патента е предвидено и белодробно въвеждане на белтъка, предмет на изобретението (или негов дериват). Белтъкът (или неговият дериват) достигат до белите дробове на бозайник при вдишване и преминават през белодробния епител в кръвния ток. Други съобщения относно този проблем включват Adjei et al., Pharmaceutica Research, 7(6): 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135144 (1990) (леупролид ацетат) Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl.5): 143-146 (1898) (ендотелин-l); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3 (3): 206-212 (1989) (αΐ-антитрпсин) Smith et al., J.Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989), (αΐ-протеиназа); Oswein et al., “Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Deliery II, Keystone, Colorado, (March 1990) peкомбинантен човешки соматотропин); Debs et al., J. Immunol., 140: 3482-3488 (1988), US 5, 284,656 (фактор, стимулиращ образуването на левкоцити). За приложение в практиката изобретението предвижда широк спектър от механични устройства, устроени за белодробно въвеждане на лекарствения продукт. Те включват, но не се ограничават само до: пулверизатори, инхалатори, приспособени да дозират, и разпрашващи инхалатори. Всички те са известни на специалистите.

Някои специфични примери за търговски достъпни устройства, подходящи за практиката на това изобретение са Ultravent nebulizer, произвеждан от Mallinckrodt, Inc., StLouis. Missouri; Acorn II nebulizer, произвеждан от Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin metered dose inhaler, произвеждан от Glaxo Inc., Research Trangle Park, North Carolina; и Spinhaler powder inhaler, произвеждан от Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Всички тези устройства изискват използуването на препаративни процедури подходящи за разпределяне на белтъка (или дериват). Обикновено, всеки препарат е специфичен за вида устройство, което се употребява и трябва да включва подходящ материал за размесване на съставките като допълнение към обикновените разредители, адюванти и/или носители, използувани в терапията. Предвидено е също използуването на липозоми, микрокапсули или микросфери, абсорбиращи комплекси или други видове носители. Химически модифицираният белтък би могъл да бъде получен като различни препарати в зависимост от типа химична модификация или вида на използуваното устройство.

Препарати, които са подходящи за приложение с пулверизатор, било с жигльор или с ултразвук, обикновено съдържат белтък (или дериват) разтворен във вода с концентрация около 0.1 до 25 mg биологично активен белтък на 1 ml разтвор. Препаратът може също да съдържа буфер и някаква проста захар (т.е. за стабилизиране на белтъка и регулация на осмотичното налягане). Препаратът за разпръскване може да съ държа също и повърхностно активно вещество (сърфактант), за да се намали или предотврати възникването на агрегация на белтъка, предизвикана от атомизирането на разтвора при образуване на аерозола.

Препарати за прилагане с аерозолов-дозатор, обикновено съдържат фино разпределен прах съдържащ белтъка (или деривата) суспендиран в един пропелант с помощта на сърфактант. Пропелантът може да бъде всеки стандартен, материал, използуван за тази цел, като хлорфлуоровъглерод, хидрохлорофлуоровъглерод хидрофлуоровъглерод или въглеводород, включително трихлорофлуорометан, дихидрофлуорометан, дихлоротетрафлуороетанол и 1,1,1,2-тетрафлуороетан или техни комбинации. Подходящи сърфактанти са сорбитан триолеат и соев лецитин. Като сърфактант може да се използува и олеинова киселина.

Препарати за пръскане с прахов инхалатор следва да включват фин сух прах, съдържащ белтък (или дериват) а също и някакъв пълнител, като лактоза, сорбитол, захароза или манитол в количества, които улесняват разпръсването на праха с устройството, например 50 до 90% от теглото на препарата. Белтъкът (или дериватът) е най-добре да бъде изготвен за праховидна форма със средна големина на частиците по-малко от 10 pm, (или микрони), най-предпочитано 0.5 до 5 pm, за най-ефективно въвеждане до дисталните части на белите дробове.

Назално въвеждане

Предвидено е също и назално въвеждане на белтъка (или деривата). Назалното въвеждане позволява белтъкът да премине директно в кръвния ток след въвеждане на лекарствения продукт в носа, без да е необходимо продуктът да се доставя в белите дробове. Препаратите за назално приложение включват тези с декстран или циклодекстран.

Методи за третиране, методи за изготвяне на лекарствения препарат

В един друг аспект на настоящето изобретение са предоставени методи за третиране и производство на лекарствения препарат. По-горе са посочени условията, които улесняват или модулират въвеждането на представените деривати.

Дозировка

Тъй като се провеждат и по-нататъшни изследвания върху продукта на изобретението, ин формацията относно дозировката за лечение на различни състояния при различни пациенти ще нараства и специалистът, обсъждайки терапевтичния подход, възрастта и общото състояние на пациента, ще може да определи точната дозировка. Общо, за инжекции или инфузии, дозировката трябва да бъде между 0.1 pm от биологично активния белтък/Kg телесно тегло, (като се изчислява само масата на белтъка, без химичните модификации) и 10 mg/Kg (на същата база). Схемата на дозировка може да варира в зависимост от циркулационния полуживот на използувания белтък или дериват, от това дали полипептидът се въвежда като болус доза или чрез продължителна инфузия, и от вида на използвания препарат.

Въвеждане с други съединения

За лечение на затлъстяване, белтъкът (или деривати) може да се прилага в съчетание с един или повече лекарствени препарати, използувани за лечение на други клинични усложнения при затлъстяването, като диабет (например инсулин), хипертония, високо съдържание на холестерол и други усложнения на затлъстяването. Също могат да бъдат едновременно прилагани други препарати потискащи апетита, като например амфетамини. Съчетаното приложение може да бъде симултанно (например, въвеждане на смес от белтъка на изобретението и инсулин) или поотделно.

Лечение базиращо се на нуклеинова киселина

ОВ генът може да бъде въведен в човешки мастни клетки за осъществяване на генна терапия при затлъстяване. Може да се очаква, че такава терапия ще намали телесното тегло. Обратно, въвеждането на антисенз конструкти в човешки мастни клетки би редуцирало нивото на активния ОВ полипептид и би предвидило увеличение на телесното затлъстяване.

В едно изпълнение, генът кодиращ един ОВ полипептид е въведен in vivo чрез вирусен вектор. Такива вектори включват атенюирани или дефектни ДНК вируси като, но не само, вируса на херпес симплекс (HSV), папилома вируса, Epstein Barr вируса (EBV), аденовирус, адено-асоцииран вирус (AAV) и подобни. Предпочитани са дефектни вируси, при които вирусните гени са загубили напълно или почти напълно са делетирани. Дефектният вирус е неинфекти45 вен след въвеждане в клетки. Използуването на дефектни вирусни вектори позволява въвеждането им в клетки на специфично, локализирано място, без да се безпокоим, че векторът може да инфектира други клетки. Така, мастната тъкан може специфично да бъде атакувана. Примерите за конкретни вектори включват, но не се ограничават до дефектен херпес вирус 1 (HSV1) вектор [Kaplitt et al., Molec. Cell Neurosci, 2:320330 (1991)], един атенюиран аденовирусен вектор, какъвто е векторът описан от Stratforderrcaudet et al., J.Clin. Invest., 90:626-630 (1982) h един дефектен адено-асоцииран вирусен вектор (Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J.Virol., 63:3822-3828 (1989)].

В друго изпълнение, генът може да бъде вкаран в ретровирусен вектор, например както е описано в US 5,399,346; Mann etal., Cell, 33:153 (1983); Temin et al., US 4, 650, 764; US 4, 980, 289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); US 5,124,263; WO 1995/007358,; и Kuo et al., Blood, 82:845 (1993).

Алтернативно, векторът може да бъде въведен in vivo чрез липофекция. През изминалото десетилетие бе отбелязано нарастващо приложение на липозоми за капсулиране и трансфектиране на нуклеинови киселини in vitro. За да се ограничат трудностите и опасностите, които се срещат при трансфекция чрез липозоми, за приготвяне на липозоми могат да бъдат използувани синтетични катионни липиди, както е в случая с in vivo трансфекция с един маркерен ген [Feigner et al., Proc. Ntal. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); вж. Mackey etal. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Използването на катионни липиди може да улесни капсулирането на отрицателно натоварени нуклеинови киселини и също да улесни сливането с отрицателно заредени клетъчни мембрани [Feigner et al., Science, 337:387-388 (1989)]. Използуването на липофекция за въвеждане на екзогенни гени в определени органи in vivo има някои практически предимства. Молекулното прицелване на липозомите към определени клетки е едно преимущество. Очевидно е, че насочването на трансфекцията към определени клетъчни типове, ще бъде особено предимство за тъкан с клетъчна хетерогенност, като например панкреас, черен дроб, бъбрек и мозък. За да бъдат специализирано насочени, липидите трябва да бъдат химически свързани с други молекули (вж. Mackey et al., 1988, по-горе). Прицелни пептиди, например хормони или невротрансмитери и белтъци като антитела или непептидни молекули могат да бъдат свързани химически с липозоми.

Възможно е също векторът да бъде въведен in vivo като гол ДНК плазмид. Голи ДНК вектори за генна терапия могат да бъдат въведени в определени клетки-гостоприемници чрез известните методи като например трансфекция, електропорация, микроинжектиране, трансдукция, клетъчно сливане чрез DEAE декстран, чрез копреципитация с калциев фосфат, с помощта на метални микропрожектили или на ДНК-вектор преносител (вж. напр. Wu et al., J.Biol.Chem., 267:963-967 (1992); Wuetal., J. Biol. Chem., 263: 14621-14624 (1988); CA 2 2, 012,311.

Приложение в животновъдството

OB генът може да бъде изолиран също от домашни животни и да бъде получен съответният ОВ полипептид. В един специфичен пример, по-долу, сондата получена от мишия ОВ ген хибридизира със съответни хомоложни кодиращи последователности от голям брой животински видове. Както бе обсъдено за различните начини на лечение при човека, могат да бъдат получени рекомбинантни белтъци и те да бъдат въвеждани у домашни животни. Въвеждането на полипептида може да бъде практикувано за производство на месо от по-мършави животни, като говеждо, свинско, пилешко, овчо и др. Предпочита се да се въвежда автоложен ОВ полипептид, въпреки че изобретението предвижда въвеждането и на чуждероден полипептид. Тъй като ОВ полипептидът се състои от около 160 аминокиселинни остатъци, той не би бил силно имуногенен. Така, въвеждането на чуждероден полипептид няма да води до имунен отговор.

Алтернативно, въвеждането на клонирани гени в трансгенни домашни животни ще даде възможност да бъде намалено телесното тегло и затлъстяването чрез свръхекспресиране на ОВ трансгена. Най-простият начин за постигане на това би било да се насочи един ОВ трансген към мастната тъкан, като се използува неговия собствен промотор или промотор специфичен за мастните клетки.

Обратно, увеличаването на телесните мазнини може да бъде желателно при други условия като например за получаване на Kobe beef или мазен черен дроб за да се приготви чернодробен пастет. Това, може да бъде изпълнено чрез насочване на антисенз-ОВ трансген към мастната тъкан или с помощта на технология на генно нокаутиране. Алтернативно, когато е желателно нарастване на телесното тегло за сметка на процента на мазнините, може да бъде въведен инхибитор или антагонист на ОВ полипептида. Такива инхибитори или антагонисти включват, но не се ограничават до антитела, реагиращи с полипептида и фрагменти на полипептида, които се свързват, но не активират ОВ-рецептора, т.е. антагонисти на ОВ полипептида.

Приложения в козметиката

Освен благоприятните ефекти върху здравословното състояние, ОВ полипептидът има значителна стойност и в козметиката. По-специално, тъй като ОВ полипептидът на изобретението, включително негови деривати и аналози-агонисти са полезни за модулиране степента и количеството на натрупване на мастни клетки у животното, те са полезни за намаляване загрозяващата мастна тъкан, например отлагане на мазнини в коремната област, ханша, бедрата, шията и брадичката, което не се оценява задължително като състояние на затлъстяване, но независимо от това ощетява външния вид. Ефектът на намаляване на мазнините се постига, поне отчасти чрез намаление на апетита, т.е, намаление поемането на храна, повишаване на основната обмяна или и двете. Така, настоящият ОВ полипептид или негови деривати и аналози-агонисти са подходящи за въвеждане у даден индивид, за постигане на козметични промени в мастнотьканните депа, било чрез модулиране на мастното отлагане, намаляване на апетита или и на двете.

В допълнение, представените препарати и методи могат да се използуват заедно с различни процедури, като козметични операции, предназначени да променят цялостния външен вид (например липосукция или лазерна хирургия, предназначена да намали телесната маса чрез аспириране или отлепване на мастна тъкан), упражнения (по-специално бягане, вдигане на тежести), бедна на мазнини диета, хипноза, биообратна връзка, като примери за начините, чрез които би могло да се направи опит за намаляване процента на мастната тъкан и подобрението на външния вид.

В съответствие с това, настоящето изоб ретение е свързано с метод за козметично модулиране на мастната тъкан, който включва въвеждане на ОВ полипептид, негов дериват или аналог-агонист в количество модулиращо мазнините на индивид, който желае чрез промяна на мастната тъкан да подобри външния си вид. В един по-специален аспект, модулирането на количеството на мастната тъкан е последствие от потискането на апетита. Предпочитано, модулирането на мастната тъкан е намаление на мастната тъкан.

В едно по-нататъшно изпълнение, изобретението се отнася до метод за повлияване загубата на козметична мастна тъкан. Метод ът включва процедура за промяна на външния вид чрез въвеждане на модулиращо мазнините количество от един ОВ полипептид, негов дериват или аналог-агонист, в индивид желаещ промяна на козметичната мастна тъкан за подобряване на цялостния външен вид.

ОВ рецептор

Създаването на нискомолекулни агонисти и антагонисти на ОВ фактора ще бъде много улеснено от изолирането на неговия рецептор. Това може да бъде осъществено чрез изготвянето на активен ОВ полипептид, който да бъде използван за скриниране на експресионна библиотека, като се използува стандартна методология. Рецепторното свързване и експресионната библиотека могат да бъдат тестирани чрез въвеждане на рекомбинантен полипептид, получен с помощта на експресионни вектори от бактерии или бозайници и наблюдение ефектите при краткотрайно и продължително въвеждане на рекомбинантния полипептид в клетките на експресионната библиотека, или чрез директно определяне свързването на ОВ полипептида с клетките.

Тъй като понастоящем се счита, че ОВ рецепторът е възможно да е локализиран в хипоталамуса и може би в черния дроб, предпочитано би било да се конструират кДНК библиотеки от тези тъкани в стандартни клониращи експресионни векгори.Тези кДНК клонове след това ще бъдат въведени в COS клетки и получените трансформанти ще бъдат скринирани с активен лиганд за идентифициране на COS клетките, които експресират ОВ рецептора. Клонираният рецептор би могъл да бъде използуван заедно с ОВ лиганда (ако се приеме, че той е хормон), за получаване на компонентите необходими за скри ниране на нискомолекулните модулатори на ОВ.

Една специална тест-система за определение, която се използува в съответствие с настоящето изобретение е известна като рецепторна проба. За рецепторната проба, материалът, който трябва да бъде проверен се бележки по съответен начин и няколко клетъчни тест колонии се инокулират с определено количество от белязания и небелязан материал. След това се извършват изследвания за определяне степента на свързване на белязания материал с клетъчните рецептори. По този начин могат да бъдат уточнени разликите в афинитета между различните проби материал. В съответствие с това, определено количество пречистен модулатор на теглото може да бъде радиоактивно белязан и да бъде свързан например с едно антитяло или други негови инхибитори, след което да бъдат проведени свързващи определения. Могат да бъдат изготвени разтвори съдържащи различни количества белязан и небелязан несвързан модулатор на теглото и след това клетъчни проби да бъдат инокулирани и инкубирани. Получените клетъчни монослоеве след това се измиват, лизират и отчитат в гама-брояч при стандартна грешка на отчитането < 5%. Тези данни впоследствие се подлагат на Scatchard анализ, след което могат да се направят заключения относно активността на материала. Тъй като представеното по-горе е пример, то илюстрира подхода, с който може да бъде изпълнена една рецепторна проба, в случаите, когато клетъчната свързваща способност на изследвания материал може да служи като разграничаваща характеристика. Обратно, рецепторната проба може да бъде особено полезна за идентифициране на специфични рецептори на модулаторите на изобретението, като например рецептора db.

Друга проба, която може да бъде полезна и е предвидена в съответствие с изобретението е известна като “cis/trans” проба. Накратко, тази проба използува два генни конструкта, единият от които е плазмид, който когато е трансфектиран в съответен клетъчен вид експресира постоянно интересуващия ни рецептор. Другият конструкт е плазмид, който експресира един рецептор като например луцифераза под контрола на един рецептор/лиганд комплекс. Така, например ако е необходимо да се оцени дали едно съединение е лиганд за даден рецептор, един от плаз мидите следва да бъде конструкт, който експресира рецептора в избраната клетъчна линия, докато вторият плазпид трябва да притежава промотор, скачен към луциферазния ген, в който е вмъкната ДНК последователност реагираща на рецептора. Ако изследваното съединение е агонист на рецептора, лигандът ще се свърже с рецептора и полученият комплекс ще се свърже с реагиращата ДНК последователност и ще инициира транскрипция на луциферазния ген. След това получената хемилуми-несценция се измерва фотометрично и така се получават дозозависими криви, които се сравняват с такива за известни лиганди. Този протокол е описан подробно в US 4, 981, 784 и WO 1988/003168.

Рекомбинантният ОВ рецептор може да бъде анализиран след като бъде идентифициран рекомбинантьт експресиращ последователността на гена, кодиращ ОВ-рецептора. Това се постига с проби основани на физичните или функционални свойства на ОВ рецептора, включващи радиоактивно белязане на рецептора, последвано от анализ с гелна електрофореза, имунопроба, свързване на лиганд и др. Освен това, могат да бъдат генерирани антитела спрямо ob рецептора, както бе описано по-горе.

Структурата на ОВ рецептора може да бъде анализирана с различни известни методи. Предпочитано се анализира структурата на различните домени, по-специално на ОВ свързващото място. Структурен анализ може да бъде направен чрез установяване степента на подобие на последователността с други известни белтъци и в частност хормонални и белтъчни рецептори. Степента на подобие (или хомологияга) може да се използува като база за предсказване структурата и функцията на ОВ рецептора, или на негов домен. В едно специфично изпълнение, могат да бъдат направени сравнения на последователността с последователности в генната банка GenBank, като се използуват например програмите FASTA или FASTP [Pearson et al., Proc. Nat 1. Acad., Sci. USA 85:2444-2448 (1988)].

Белтъчната последователност може освен това да бъде характеризирана допълнително чрез анализ на хидрофилността (напр. Hopp et al., 1981, по-горе). Хидрофилният профил може да бъде използуван за идентифициране на хидрофобните и хидрофилните области на ОВ рецепторния белтък, което от своя страна може да оз начи екстрацито-плазмени, мембранно свързани и интрацитоплазмени области на рецептора.

Може да бъде направен също анализ на вторичната структура (напр. Chou et al., 1974, по-горе) за идентифициране на области от ОВ рецептора, които се приемат за специфични вторични структури.

С помощта на специализирани компютърни софтуерни програми, каквито има на разположение, могат да бъдат извършени модулиране, транслация, предсказване на вторична структура и отворена рамка за четене, както и графично представяне на данните.

Предоставяйки богат източник на рекомбинантен ОВ полипептид и възможността да се изолира ОВ рецептора (т.е. продукта на db гена), настоящото изобретение прави възможно количественото структурно определение на активната конформация на ОВ полипептида и ОВ рецептора или на техни домени. По-специално, предоставен е достатъчно материал за ядрено магнитен резонанс (ЯМР), за инфрачервен (IR), Раман ултравиолетов (UV), спекгроскопски анализи и специално кръгов дихроизъм (CD). В частност ЯМР осигурява много мощен структурен анализ на молекули в разтвор, което по-силно наподобява тяхната естествена среда (Marion et al., 1983, по-горе: Bar et al., 1985, по-горе; Kimura et al., 1980, по-горе). Могат да бъдат използувани и други методи за структурен анализ. Те включват, но не се ограничават до рентгенова кристалография (Engstrom, 1974, по-горе).

Предпочитано, могат да бъдат изучавани ко-кристали на ОВ полипептида и на ОВ рецептора. Анализът на ко-кристали предоставя детайлна информация относно свързването, което от своя страна допринася за по-рационален дизайн на лиганди-агонисти и антагонисти. Също може да бъде използувано компютърно моделиране и по-специално във връзка с ЯМР или рентгеновите методи [Fletterick et al., eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Commuication in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].

Идентифицирането и изолирането на гена кодиращ ОВ рецептора, предмет на изобретението, създава възможност за експресия на рецептора в по-големи количества отколкото могат да бъдат изолирани от природни източници, или в клетки-индикатори, които са специално инженерно манипулирани, за да показват активността на рецептор, експресиран след трансфекция или трансформация на тези клетки. Съответно, в допълнение на рационалния дизайн на агонисти и антагонисти базиращи се на структурата на ОВ полипептида, настоящото изобретение предвижда един алтернативен метод за идентифициране на специфични лигаиди на ОВ рецептора, като се използуват различни известни тестове за скриниране.

Изобретението би могло да бъде по-добре разбрано с помощта на следващите примери, които са представителни за изобретението, но не го ограничават.

Примерни изпълнения

Следващите примери очертават метода, използван за идентифициране на генетичния материал, който е представителен за настоящето изобретение. Процедурата включва четири последователни етапа: А) Генно картиране, Б) Физично картиране, В) Изолиране на гена-кандидат и Г) Откриване на мутация. След потвърждение, че мишият ген, който е предмет на изобретението, е изолиран (етап Г), бе потърсен хомоложният човешки ген, и двата - мишият и човешкият гени и предполагаемите белтъци бяха характеризирани. Етапите са обобщени в по-големи подробности, по-долу.

А. Генно картиране

Мутацията ob беше отделена в генетични кръстоски и стандартният анализ за скаченост бе използуван, за да се определи мястото на мутацията спрямо полиморфизма по дължината на рестрикционния фрагмент (RFLPs). Тези данни локализираха ОВ генът в един интервал от 5 сантиморгана (сМ) в проксималната част на мишата хромозома 6. (5 сМ е мярка за генетично разстояние съответствуващо на 5 установими прекръстосвания на 100 животни). Общо бяха получени 771 информативни мейози, които бяха използувани за последващото генетично картиране (Friedman et al., 1991, по-горе). Всички генетични локуси, които бяха картирани по отношение на ОВ бяха предварително публикувани. Двата най-близко скачени RFLPs бяха установени чрез сонди получени от локусите съдържащи гените на карбоксипептидазата и онкогенни гени.

Разрешителните възможности на генетичните експерименти, описани по-горе бяха неадекватни за да се клонира ob, главно защото нито един от генетичните маркери не беше тясно скачен с ob гена. За да се идентифицират необходимите близко скачени RFLPs, бяха изолирани допълнителни сонди и генетичното кръстосване бе разширено. Методът известен като хромозомна микродисекция бе използуван за да бъдат изолирани произволни фрагменти ДНК от проксималната част на миша хромозома 6 [Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 511-515 (1993)]. Индивидуални клонирани сонди бяха тестирани за тясна скаченост с ob. На базата на тези изследвания една сонда, D6Rck13 наречена също psd3 беше избрана за по-нататъшен анализ поради нейната генетична близост с ОВ. Тази сонда беше използувана за генотипиране на потомството 835 ob, получено от интерсубспецифични кръстоски. Генотипирането показа, че както е съобщено от Bahary et al., във всички 835 животни D6Rck13 не е рекомбинант. В хода на физичното картиране беше идентифициран един нов полиморфен маркер от един космиден субклон произлизащ от YAC 53А6. Този нов маркер беше локализиран между D6Rck13 ob гена и беше използуван за генотипиране на допълнителни 771 информативни мейози от интерспецифични вътрешни кръстоски и възрастни кръстоски. Идентифицирано беше едно единствено животно, # 167, с рекомбинационен кросинговер между ob и D6Rck39. Тези проучвания показаха, че D6Rck 39/ D6Rck13 е разположен на разстояние 0.06 сМ от ob. Идентифицирана беше една допълнителна сонда., Рах4, разположена 12сМ проксимално спрямо ob. Рах4 беше рекомбинантна в две животни; #111 и #420. Рах4 е псевдоген, който беше преди това картиран в проксималната част на мишата хромозома 6 от Gruss и сътр. [Gruss et al., Genomics 11:424-434 (1991)]. Въз основа на тези данни беше установено, че ОВ генът е разположен в интервала от ~0.2 сМ между Рах4 и D6Rck13. Това доведе до усилия да се клонира ДНК в този интервал като етап в изолирането на гена ОВ.

В. Физично картиране

Клонирането на ДНК в този интервал наложи използуването на изкуствени дрождеви хромозоми (YACs), един относително нов клониращ вектор, който позволява да се клонират дълги непрекъснати участъци ДНК, често с дължина повече от един милион базови двойки.

Изкуствени хромозоми от дрожди бяха изолирани с помощта на D6Rck13 и Рах4. Това бе осъществено чрез изготвянето на пречистени ДНК сонди и използуването им за изолиране на съответните YACs. Тези УАСз #8, #16, (#107 и #24) бяха изолирани и частично характеризирани и въз основа на резултата от анализите бе направено заключението, че YAC16 е YAC, който се простира още по-дистално, т.е. най-близо до ob. След това бе изолиран ключовият край на YAC#16 и бе установено, че този край е по-близо до ob отколкото Рах4. Този край бе наречен 16М(+).Това заключение беше направено, тъй като беше показано, че тази сонда не е рекомбинантна в животно #420 (както беше Рах4). Този край беше секвениран и използуван за PCR анализ. PCR пробата беше използувана за скриниране на YAC библиотека. Изолирани бяха четири положителни клона. Последващото характеризиране на тези Y ACs чрез метода на крайно-спасяване, рестрикционно картиране, електрофореза в пулсиращо поле и Southern blot с генетични кръстоски установи, че два от тези YACs, adu и aad са критични за последващи проучвания. YАС aad е един 550 кВ нехимерен YAC, който се простира най-далече дистално. Поради това дисталният край на този YAC, aad(pICL) беше използуван, за да се завърши тази физична карта. YAC adu и е 370кЬ нехимерен YAC и бе установено, че неговият дистален край adu (+), е нерекомбинанген в цялото ob поколение на генетичните кръстоски, включително животните #111 и #167, което подсказва, че ОВ генът би могъл да се намира в този YAC.

Разработен беше PCR тест за тези два краища, aad(pICL) и adu(+) и той беше използуван за изолиране на повече YACs и Р1 клонове за продължение на физичното картиране. Важните Р1 клонове, изолирани по този начин включваха 498,499,500 (изолирани със сонда произлизаща от aacd(pLCL) и 322,323 и 324 (с помощта на сонда от adu (+)).

Междувременно бяха характеризирани YACs изолирани с D6Rck 13 (53А6,25 А8,25А9, 25А10). Тези изследвания установиха, че 53А6 се простира, още по-проксимално към aad YAC. Определен бе размерът на разстоянието между 53А6 и aad е -70 кВ. След това бе използуван ключовият край на 53А6,53(pICL) за скриниране на три Y АС бибилиотеки и на една Р1 библиотека, с които разполагахме. Изолиран беше един критичен Р1 клон, 325. Този Р1 клон се припокриваше с Р1 клоновете, изолирани с aad(pICL), както бе описано по-горе и следователно послужи за да затвори празнината между 53(pICL) и aad(pICL). В резултат на това бе клонирана цялата непрекъсната последователност, съдържаща YACs и Р1 клоновете, с дължина от ~2.5 милиони базови двойки, обхващащ Рах4,16М (+), adu(adu+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 и D6Rск13. Чрез внимателно картиране на местата на рекомбинация в животни #111 и #167, беше направено заключението, че ОВ е разположена в един 400 кВ интервал. За да се получи работен източник на ДНК за изолиране на ОВ гена, бяха изолирани ДНК последователности с обща дължина 500кВ покриващи тази нерекомбинантна област в общо 24 Р1 клона. Тези Р1 клонове, включително 322 и 323, които по-късно бе намерено, че са полезни клонове, бяха използувани за екзонно захващане.

Физическата карта на частта от хромозомата, носеща ОВ е представена на Фигура 7А. Фигура 7В представя YAC contig. Фигура 7С представя Pl contig.

С. Изолиране на кандидат гени

За изолиране на гени, разположени в този интервал, беше използуван методът на захващане на екзон. Този метод използува един търговски достъпен вектор за идентифициране на екзонна ДНК (т.е. кодиращите последователности). Подбират се функционални акцепторни и донорни последователности за снаждане в геномна ДНК внесена в тест конструкг. ДНК от тези Р1 клонове беше намножена и субклонирана в екзонзахващащия вектор. Тези клонове представляваха къси инсерти клонирани в Bluescript вектор. Всеки клон беше аплифициран с полимеразна верижна реакция с PCR праймери, съответстващи на плазмидните последователности, които фланкират инсерта. PCR амплификацията беше изпълнена директно в бактериите, които носят плазмида. Реакциите бяха проведени в Biomek robot. Продуктите на реакцията бяха подложени на електрофореза в 1% агарозен гел в ТВЕ буфер, съдържащ етидиев бромид. Техниката на захващане на екзон беше модифицирана така, че да се елиминират примеси от E.coli ДНК от

Р1 клоновете и да се скринират разнообразните артефактни екзони, които превишават с 80-90% възможните захванати кодони. Екзон захващащият вектор включваше HIV последователности; къс сегмент от тези последователности съответствуваше на този артефакт.

Екзон захващащият експеримент беше извършен с използуване на различни ?! клонове. След това продуктите от екзонното захващане бяха амплифицирани с PCR, селекционирани и секвенирани. Последователностите на предполагаемите “екзони” бяха сравнявани с тези в Genebank с помощта на компютърната програма Blast. Подбрани бяха около петнадесет екзона за по-нататъшно изследване с RT-PCR, Northern анализ и zoo bolt; за наличието на съответни РНК или консервирани последователности. Намерено бе, че седем от петнадесетте предполагаеми екзони, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, IH3 и 2G7, кодират РНК транскрипт. 325-2 е един ген специфичен в тестис; 323-8 и 323-9 са вероятно два екзона от същия ген експресирани главно в мозък и бъбрек. IH3 и 322-5 представят два редки мозъчни транскрипти. D1-F7 е екзон от по-рано клониран ген, инозитол монофосфат дехидрогеназал (IMPDH), който се експресира повсеместно. Изглежда, че никой от тези гени не кодира ОВ. 2G7, който е ОВ екзон, е обсъден по-долу.

След три неуспешни опита ОВ генът да се залови чрез екзонно захващане, беше направен друг опит чрез обединяване ДНК от всички P_tклонове на критичната ОВ област. Те включват Pj- клоновете: 258,259, 322, 323, 324, 325,498, 499, 500, 653, 654 и други.

След това Р1-клоновете 258, 260, 322, 498 и 499 бяха субклонирани в екзон захващащия вектор, след което бяха изготвени няколко платки с бактериални клонове, всеки от които съдържаше някакъв предполагаем екзон. Получени бяха приблизително 192 клонове представляващи предполагаеми ОВ кандидати. Както бе отбелязано по-горе, наблюдаван бе един съществен артефакт, а именно, че много от изолатите съдържаха два захванати екзона, произлизащи от вектора. Така клоновете бяха идентифицирани по тяхната големина и по факта, че с ДНК сондите съответствуващи на този артефакт, хибридизират със съответните ивици на Southern блот. По този начин клоновете 185 и 192 бяха изключени от по-нататъшна оценка. Изключва нето на артефактите на базата само на големината не бе възможно, тъй като това би могло накрая да доведе до изключване на екзона съответствуващ на ОВ.

Така, от 192 екзона за по-нататъшно проучване бяха подбрани общо седем екзона. Изготвени бяха матрици за секвениране на седемте екзона и секвенирането бе проведено. Последователностите за седемте екзона бяха анализирани и беше открито, че седемте са идентични и един е видимо артефакт. По-специално, клон 1D12 съдържаше “HIV последователността”, т.е. артефактната ивица. Това остави три екзона за понататъшен анализ: 1F1,2G7 и 1НЗ. 1F1 беше елиминиран, тъй като той се картира извън критичната област. PCR праймери за 1НЗ и 2G7 бяха подбрани и синтезирани.

Определена беше последователността на екзона на 2G7 и тя е представена на фигура 10 (SEQ IDN0:7). PCR праймери за 2G7 бяха подбрани и синтезирани. Частите от последователността съответствуващи на PCR праймерите са подчертани. Използувани бяха следните праймери:

5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Тт = 60.0°С) (SEQ ID N0:8)

3, ’CAT CCT GGA СГГ TCT GGA TAG G (Tm 0.0°C) (SEQ ID N0:9)

Тези праймери амплифицират геномната ДНК при следните условия на PCR: 25-30 цикъла, за хибридизиране при 55°С за 2 min; удължаване за 3 min при 72°С, денатурация при 94°С за 1 min в стандартен буфер за PCR. Тези праймери бяха използувани също така и за създаване на белязани сонди чрез включване на ³²P-dCTP в PCR реакцията със съответното намаление на количеството на студения dCTP.

RT-PCR беше проведена с РНКи от различни тъкани и беше направено заключението, че измежду всички изследвани тъкани, 2G7 се експресира изключително в бялата мастна тъкан, измежду всички изследвани тъкани (фигура 11 А). След това ³²Р-белязан 2G7 беше хибридизиран с помощта на Northern blot с тъканни РНКи (фигура 11 В) и бе показано, че неговата РНК се експресира във висока степен в мастната тъкан, но не се експресира или се експресира много слабо в другите тъкани (където сигналите могат да се дължат на примеси от мазнини в тъканните препарати). Десет gg тотална РНК от всяка от изброените тъкани беше подложена на електрофореза в агарозен гел с формалдехид. Сондата беше хибридизирана с блота при 65°С в стандартен хибридизационен буфер, Rapid Hybe (Amersham). Големината на РНК беше приблизително 4.9кВ. На този етап от изследването, клонът 2G7 беше разглеждан като надежден кандидат-ген за ОВ и бе анализиран по-нататък.

D. Откриване на мутация

За да потвърдим, че 2G7 кодира ОВ гена, беше необходимо да се покажат разлики в нивото на РНК-експресия на ДНК последователностите на този ген в мутант в сравнение с експресията в див тип животни. За проучването бяха на разположение две различни мутации на оЬ гена, C57BL/60 ob/ob (1J) и Скс/Smj ob/ob (2J). Понататък те ще бъдат означавани съответно като 1J и 2J. (Използувана е неофициална номенклатура за означаване на изследваните миши линии. Чрез тази спецификация и скиците ще се разбере, че C57BL/6J се отнася за C57BL/6J +/+; СКС/ smj се отнася за SM/Ckc-^+d“ ^+/+; CKC/smj ob/ob се отнася за SM/Скс -^+d,k· - ob^2J/ob^2J). РНК бе получена от мастна тъкан, изолирана от 1 J, 2 J и контролни животни. Тотална РНК за всяка проба бе третирана с ДН-аза и след това е обратно транскрибирана с помощта на олиго-дТ като праймер и обратна транскриптаза. Получената едноверижна кДНК след това бе амплифицирана с PCR с 2G7 праймери (условия показани погоре) за долната ивица или с търговски достъпни актинови праймери за горната ивица. Продуктите на RT-PCR бяха подложени на електро-фореза в 1% агарозен ТВЕ гел, оцветен с етидиев бромид (фигура 12А) . С помощта на RT-PCR беше намерено, че докато 2G7 мРНК се експресира в II и във всички други контролни мишки, тя напълно отсъствува в 2J мишките. Сигнал не беше открит след 30 цикъла на амплификация. Този експеримент дава пряко доказателство, че 2G7 съответствува на един екзон от ОВ гена.

Тъй като 2J мутацията е относително нова и се подържа в една коизогенна линия, този резултат бе първото доказателство, показващо, че 2G7 е един екзон от ОВ гена. Изглежда, че мутацията е разположена в промоторната област, което води до тотално прекратяване на РНК синтезата. Наличието на сигнал в 1J мишките при този RT-PCR експеримент, насочва, че 1J би могъл да носи една точкова мутация, което не води до груба промяна в големината на РНК пробите. В допълнение, 2G7 мРНК отсъствуваше, когато се тестира с RT-PCR от четири допълнителни 2 J животни.

Резултатът беше потвърден с Northern blot (фигура 12В). Получена беше РНК от мастни клетки от всяка една от линиите (C57BL/6J, 1J, CKC/smj и 2J). Десет pg от тези РНКи бяха подложени на електрофореза и блотинг. Блотьт беше хибридизиран с 2G7 сонда, която беше белязана с PCR, чрез амплифициране на материала. Това е ивицата във фигура lie помощта на ³²РdCTP в PCR реакцията. Актинът е контрола за нанесеното количество РНК. Акгиновият сигнал е много подобен във всички проби. ОВ сигналът отсъствува в мозъка, тъй като мРНК е специфична за мастните клетки.

Резултатите от Northern анализа потвърждават, че 2G7 специфичната РНК отсъствува в 2J мишките, ob РНК отсъствува в CKC/smj ob/ ob мишките тъй като при тази тлъста мутантна линия генът е раздробен, така че не се синтезира РНК. В допълнение, нивото на 2G7 РНК нараства ~10-20 пъти в мастната тъкан у 1J както и у db/db. Тези резултати са в съответствие с хипотезата, че ОВ или кодира циркулиращ хормон или е отговорен за генерирането на сигнал от мастните клетки, който модулира телесното тегло. Тези резултати подкрепят заключението, че 2G7 е ОВ генът и предсказват, че 1J мишките имат точкова мутация, вероятно безсмислена мутация, която води до преждевременно завършване на транслацията.

Резултатите от Northern анализа бяха повторени с помощта на препарати РНК от мастни клетки от четири различни 2J животни (фигура 13). При тази проба, ар2 е мастно-специфичен транскрипт, който беше използуван за контрола подобно на актина във фигура 12В. Вариациите в плътността на ар2 ивицата не са достоверни. ар2 беше белязан чрез проектиране на PCR праймери от публикуваната ар2 последователност. RT-PCR продуктите от РНК на мастните клетки след това бяха повторно белязани, като беше използуван същият протокол за PCR белязане. Този анализ показва наличието на ОВ мРНК в нормални хомозиготни или хетерозиготни животни и отсъствието й на 2 J мугантни животни.

Мутацията беше идентифицирана в 1J мишки. Мутацията е една промяна на С в Т, ко ето води до замяната на един аргннин в един очевидно преждевременен стоп кодон при аминокиселина 108. По всичко изглежда, че тя е причина за 1J мутацията ( фигура 14) независимо от високото ниво на експресия на ob мРНК (вж. фигури 12 и 13, C57BL/6J ob/ob пътеки).

Съвсем наскоро бяха използвани Southern blots, за да бъде направено заключението, че 2J мутацията е резултат на доловима ДНК промяна в 5' края на ОВ, което изглежда, че напълно премахва РНК експресията. Точният характер на това възможно пренареждане остава да бъде изясняван.

Направен бе един геномен Southern blot на ДНК от CKC/smj (SM/Ckc-+) и C57BL/6J мишки като бяха използувани 4 различни рестрикционни ендонуклеази, с цел да се определи дали мутантният ob дава уникален образ на рестрикционните фрагменти (фигура 15 А). Приблизително 10 pg ДНК (получена от геномна ДНК на черен дроб, бъбрек или слезка) бяха хидролизирани с посочените рестрикционни ензими. ДНК беше след това електрофорезирана в 1% агарозен ТВЕ гел. ДНК беше прехвърлена на imobilon мембрана и беше хибридизирана с PCR-белязана 2G7 сонда. Ключовата ивица е най-горната ивица в Bglll хидролизата за CKC/smj ob/ob (SM/ Ckc ^+Dbc ob^/ob²³) ДНК.

Тази ивица има по-високо молекулно тегло отколкото в другата линия, което говори за мутация в тази линия.

Фигура 15В е един Southern blot на Bgin хидролизат на геномна ДНК от потомството на една оЬ^и/+ х оЬ^у/+ кръстоска. Някои от ДНКите имат само горната ивица, други само долната, а някои имат и двете ивици. Животните, които имат само горна ивица, са тлъсти хомозиготи (alloтлъсти), т. е. ob^ob²³. Тези данни показват, че полиморфизмът (т. е. мутацията) показан на Фигура 15 А се сегрегира съгласно законите на генетиката.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1: Клониране на кДНК и определяне последователността на ОВ

С помощта на белязана 2G7 PCR сонда бяха изолирани общо петдесет клона миша кДНК от Xgt 11 кДНК библиотека от миша мастна клетKa(Clonetech 5’-Stretch cDNA from testicular fat pads of Swiss mice, #ML3005b) и тридесет човешки кДНК клона от XgtlO кДНК библиотека от човешки мастни клетки (Clonetech 5’-Stretch cDNA from abdomen # HL 1108a). Човешките клонове хибридизират кръстосано с мишата кДНК. Библиотеките бяха скринирани с помощта на реплика от плаки. Филтрите на репликата от плаките бяха денатурирани чрез автоклавиране. Филтрите (по два броя за всяка проба) бяха хибридизирани с PCR-белязана 2G7 сонда (Rapid Hybe Buffer, 65°С, за една нощ). След 2-4 h прехибридизация, филтрите бяха пропити в 2х SSC, 2% SDS, 2 пъти по 30 min при 65°С и експонирани на рентгенови филми. Двойно позитивните проби бяха пречистени от единични плаки. Пречистените от единични плаки фаги бяха амплифицирани с PCR, при използуване на търговски достъпни праймери за вектори, например XgtlO и Xgtl 1. Получените PCR-продукти съответствуваха на кДНК инсерта за всеки фаг с малко количество векторна последователност на двата края. Ивиците бяха гелно пречистени и секвенирани с помощта на ABI автоматизиран секвенатор и векторните праймери за да се провери ДНК полимеразата.

Суровите данни от секвенирането бяха впоследствие ръчно проверени база след база, за да се поправят погрешно разбраните от програмата. След като бе получена правилната последователност праймери за следващата последователност бяха синтезирани и използувани за продължение на секвенирането. Такива експерименти бяха повтаряни докато бяха секвенирани всички кДНК клоновете и данните бяха съчетани в една непрекъсната обща последователност (contig). Понастоящем са подредени в около 3000 базови двойки от 5' края на мРНК. Един от кДНК клоновете се простира до 5' края на мРНК, тъй като неговата последователност беше идентична с тази на 5' RACE продукта от РНК на мастна тъкан (данните не са представени).

Данните за последователността разкриват, че има една отворена рамка за четене на 167 аминокиселини (фигура 1). Установено бе наличието на Kozak инициираща транслацията консенсус последователност, която притежава един аденозинов остатък три бази преди ATG. Открити бяха два класа кДНК, различаващи се по присъствието или липсата на един единствен глутаминов кодон. Този остатък е открит в позиция непосредствено 3' до акцепторното място на снаждане на 2G7 екзон. Тъй като CAG кодонът на глутамина включва една възможна AG снаждаща акцепторна последователност, възможно е да има едно приплъзване на мястото на снаждащия акцептор с една очевидна делеция на 3 базови двойки в една субфракция от кДНК, както е показано по-долу:

gin ser val

Ag CAG TCG GTA (c глутамин)( SEQ, ID N0:17) (място на снаждащия акцептор) ser val

Ag CAG TCG GTA (без глутамин) (място на снаждащия акцептор)

В горните последователности “ag” съответствува на предполагаемата интронна последователност, преди глутаминовия кодон, a AG е предполагаемото алтернативно място на снаждане. Този глутаминов остатък е разположен в една силно консервативна област на молекулата и неговото значение за биологичната активност все още не е известно.

Открита беше една предполагаема N-терминална сигнална последователност, чието сигнално място на късане е предсказано, че е карбоксилният край на аланиновия остатък в аминокиселинна позиция 21. Тази предполагаема сигнална последователност беше потвърдена с прилагането на компютърен алгоритъм към метода на von Heijne. С помощта на тази техника беше идентифицирана най-вероятната сигнална последователност в полипептид кодиращата област, съответствуваща на аминокиселините 1-23, която има последователността:

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA ! VP (SEQ ID N0:10) в която стрелката указва мястото на късане на предполагаемата сигнална последователност. Остатъкът от аминокиселинната последователност беше силно хидрофилна и нямаше никакви забележими структурни мотиви или трансмембранни домени, различни от N-крайната сигнална последователност. По-специално, ние не открихме консенсус последователности за Nсвързано гликозилиране или дибазични аминокиселинни последователности, показателни за късане на белтък в предсказания процесиран белтък (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, pp. 177-223, C.V. Scriver et al. Eds., McGraw-Hill, New York). Проверка на база дан ни с помощта на Blast и Block програми не откри никакви хомоложни последователности.

Човешка РНК от мастна тъкан беше анализирана с Nothem blots и бяха открити РНК видове с големина подобна на мишия ob ген. Секвениране и анализ на кДНК клонове установиха, че човешкият ОВ също кодира един 167 аминокиселииен пептид (фигура 2А и В и фигура

3) . Намерени бяха у човека, три класа кДНК, със или без три липсващи базови двойки (фигура 6). Мишият и човешкият ОВ гени бяха високо хомоложни в предсказаната кодираща област, но имаха само 30% хомоложност в 3’ и 5’ нетранслираните области. Налице беше също една N-терминална сигнална последователност в човешкия ОВ полипептид. Сравнение на човешката и мишата ОВ полипептидни последователности показва, че двете молекули имат общо 83% идентичност на аминокиселинно ниво (фигура

4) . N-терминалните краища на зрелите белтъци и от двата вида имат дори по-висока хомология, със шест консервативни и три неконсервативни аминокиселинни замествания между N-крайните 100 аминокиселинни остатъци.

Изолирана беше геномна ДНК от мишка, плъх, заек, полевка, котка, крава, овца, свиня, човек, пилета, змиорка и Drosophila и беше хидролизирана с рестриктазата EcoRl. Хидролизатът беше електрофорезиран в 1% агаразен ТВ Е гел. След това ДНК беше прехвърлена на имобилонова мембрана и хибридизирана с PCR-белязана 2G7 сонда. Филтърът беше хибридизиран при 65°С и промит с 2х SSC,0.2% SDS при 65°С двукратно по за 20 min всяко промиване, т.е. имаше три смени на буфера. Тези данни показват, че ОВ е косервиран при гръбначни (фигура 16). Забележете във връзка с това,че има един 2+ сигнал в ДНК от змиорка; змиорката е риба.

Като обобщение, данните с които разполагаме насочват,че телесното тегло и затлъстяването са физиологично контролируеми. Преди седем години бяха направени усилия за започване идентификацията на два от ключовите компоненти на системата: ОВ и ОВ гените. Както е показано в този пример, ОВ генът беше идентифициран като мастно специфичен ген, който има ключова роля при регулацията на телесното тегло. Продуктът на този ген, който най-вероятно е секретиран хормон, ще има важни приложения за диагнозата н лечението на хранителните заболявания у човека и животните.

Пример 2: Експресия на ОВ в бактерии

Миши и човешки кДНКи кодиращи ob бяха клонирани в рЕТ-15Ь експресионен вектор (Novagen). Векторът съдържа един Т7 промотор свързан с един lac оператор и експресира един слят белтък съдържащ хистидин tag (His-tag) и едно тромбин късащо място непосредствено преди мястото на инсерция на кодиращата последователност (фигура 17) (SEQ ID NOS: 11 и 12).

Мишата и човешката кДНКи бяха модифицирани така че аланинът на края на сигналната последователност беше обърнат в едно Nedl място, както беше една отделена последователност в 3’ областта. Вмъкването на Ndel мястото беше осъществено с PCR с нововъведени праймери:

Mnde-5' (миши праймер на 5'-място)

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAO ТС (SEQ ID N0:13).

Mnde-З' (миши праймер на З-място)

ТСССТСТАСА TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID N0: 14)

Hnde-5' (човешки праймер на 5'-място)

TCTATGTCCA TATGGTGCCG

ATCCAAAAAG TC(SEQIDN0:15)

Hhde-З' (човешки парймер на 3'-място)

ТТССТТССА TATGGTACTC

CTTGCAGGAA GA (SEQ ID N0:16) Праймерите съдържат един несдвоен участък от 6 базови двойки в средата, който внася Ndel рестрикционни места на всеки от краищата на PCR фрагмента, фаги носещи миша или човешка кДНК бяха амплифицирани с PCR като бяха използувани тези праймери. PCR продуктът беше хидролизиран с Ndel и гелно пречистен в 1% гел от агароза с ниска точка на топене. Пречистените в гел ивици бяха субклонирани в рЕТ вектор. Получените плазмиди бяха секвенирани, за сигурност, че не са вкарани мутации по време на PCR амплификацията при клонирането. Изготвени бяха конструкти от човешка и миша кДНК, които кодират и които са загубили глутамин в позиция

49. По-специално, с PCR клониращ метод, бяха направени рЕТ 15Ь конструкти, съдържащи човешката или мишата ОВ кодираща последователност, без сигналната последователност, слети с един His-tag. Конструктите бяха секвенирани, за сигурност, че не са въведени грешки в последователността в кодиращата област на ОВ гена на етапа PCR амплификация.

Два от получените плазмидни конструкти, рЕТМ9 и рЕТН14, бяха избрани за трансформация на бактериален експресионен гостоприемник. След въвеждане на ImM IPTG при оптимални условия, трансформираните бактерии бяха способни да произвеждат 100-300 pg/ml от ОВ слетия белтък. Голямата част, от ОВ слетия белтък беше открита във включеното тяло. След разтваряне с 6М гуанидин-HCl или урея, слетият белтък беше пречистен през His-свързваща колона (Ni-хелатна).

Експериментално бяха определени условията за пречистване през колоната на ОВ слетия белтък (включващи свързване, промиване и елюиране). ОВ слетият белтък се свързва със смолата при 5 тМ имидазол/бМ гуанидин-HCl и остава свързан до 20 тМ имидазол/бМ гуанидин (Фигура 18А,В). И двата пречистени слети ОВ белтъка - човешки и миши, по-нататък бяха диализирани в PBS за отстраняване на гуанидинHCl от препаратите, след което бяха използувани за получаване на поликлонални антитела.

За тестиране биологичната активност на слетите белтъчни продукти, бяха тестирани и създадени условия за правилно нагъване на пречистения белтък. Това включва начална диализа на слетия билтък в 1М гуанидин-HCl, последвана от разреждане с 0.4 М аргининов разтвор. Histag беше отстраняван от слетите белтъци преди изпробване на биологичната активност. Отстраняването на tag беше постигано чрез третиране на слетия белтък с тромбин от човешка плацента.

В допълнение, човешка и миша ОВ ген кодиращи последователности без сигналната последователности бяха вкарвани в рЕТ 12с вектор с помощта на PCR клониращ метод. Тези конструкти могат да насочват синтезираните ОВ слети белтъци в периплазменото пространство на бактериалната клетка гостоприемник. ОВ слетият белтък, изолиран от периплазменото пространство, се нуждае само от проста гелна филтрация, за да бъде пречистен от други белтъци на гостоприемника и не се денатурира при такава процедура на пречистване.

Пример 3: Получаване на антитела спрямо ОВ полипептида

Като допълнение към ползуването на рекомбинантен белтък за създаване на поликлонал ни антитела, беше идентифициран един набор от четири пептидни последователности от изведената миша ОВ последователност, като беше използувана компютърна програма за имуногенност (GCG Package). Четирите карбоксилни крайни фрагменти са:

(SEQIDN0:18):

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-ThrLys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr.

(SEQ ID N0: 19):

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-MetAsp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID N0:20)

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-SerGly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID N0:21):

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Тези пептиди бяха конюгирани с KLH и пептид-KLH конюгатите бяха използувани за имунизиране на зайци със стандартни техники. Поликлонални антисеруми, специфични за всеки пептид, бяха получавани от зайците.

Пример 4: In Vitro транс локация на един ОВ полипептид

За потвърждаване наличието на функционална сигнална последователност, човешка кДНК, включваща цялата отворена рамка за четене, беше субклонирана в pGEM вектор. В този опит беше използувана само човешката кДНК, тъй като не бяха получени подходящи миши субклонове. Положителната верига ob РНК беше транскрибирана с помощта на SP6 полимераза и беше използувана за една реакция на in vitro транслация със и без микрозомни мембрани от кучешки панкреас. Първичният транслационен продукт мигрира с видимо молекулно тегло ~18 kD, което е в съответствие с това предсказано от кДНК последователността. Включването на микрозомни мембрани в реакцията инхибира общата ефективност на транслацията ~5-кратно. Независимо от това, приблизително 50-70% от първичния ОВ транслационен продукт беше скъсен на около 2 kD в присъствие на мембранни препарати, което подсказва, че сигналната последователност е функционираща (фигура 19А), Големината на първичния транслационен продукт на интерлевкин-1 РНК, който не кодира сигнална последователност, беше непроменена, когато в реакцията бяха включени микрозомни мембра56 ни. За да бъде потвърдено наличието на транслокация на ОВ белтъка, продуктите от in vitro транслацията бяха третирани с протеиназа-К. Протеазното третиране води до пълна протеолиза на първичния 18 kD транслационен продукт, докато 16 kD процесираната форма не беше засегната от ензимното третиране, което показва, че тя е транслокирана в лумена на микрозомите (фигура 19В). Тези данни са в съответствие с хипотезата, че ОВ е секретирана молекула.

След скъсване на сигналната последователност, в предсказания белтък следва да останат два цистеинови остатъка, което говори за възможността молекулата да съдържа дисулфиден мост, характерен за други секретирани полипептиди [Shen et al., Science, 224:168-171 (1984)].

Пример 5: Характеризиране на ОВ гена С)

За да бъде установена връзката между затлъстяване и генетични промени в ОВ гена при човека, беше определена последователността на човешкия ОВ ген (фигура 2ОА до (SEQ ID NOS:22 и 23).Използувани бяха специфични праймери от човешката кодираща последователност, за да бъде скринирана човешка Р₍ библиотека. Получени бяха три различни Р] клона, които бяха намножени и амплифицирани с PCR, като бяха използувани праймери фланкиращи мястото на снаждане между първия и втория кодиращи екзони. Цялата ингронна област, около 2 кЬ, беше амплифицирана и частично секвенирана (вж. фигура 20 А; и както е указано в SEQ ID N0:22 и 24).

Генната структура на мишия и човешкия гени беше характеризирана с помощта на PCR и други стандартни техники. Установено бе, че мишият ОВ ген се състои от 3 екзона, вторият и третият от които са за сметка на кодиращата последователност (фигура 20D). Кодиращата област на човешкия ОВ ген има същата структура, обаче в човешкия ген липсват един 5' екзон и интрон (фигура 20Е).

Получени бяха два набора от праймери генерирани от интронните последователности на човешкия ген (фигура 20А до С). Последователностите на праймерите са представени по-долу (F и R съответствуват респективно на напред и назад):

НОВ lgF5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID N0: 29)

НОВ lgR5'-GACTATCTGGGTCCAGCC3' (SEQ ID N0:30)

HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT3' (SEQ ID N0:31)

HOB2gR 5<TTCAAnXIOGAGATAOCIGG3’ (SEQ ID N0:32)

Получени бяха ДНК сонди от различни източници и тези набори от праймери бяха използвани за амплификация на геномна ДНК от тежко затлъстели индивиди. PCR продуктите бяха електрофорезирани в агарозен гел с ниска точка на топене, ивиците бяха изрязвани и хидролизирани с агараза. Първичните структури бяха определяни с помощта на ABI373 DNA секвенатор и Taq dideoxy terminator kit (ABI, Perkin-Elmer). До момента е открита една точкова мутация в един ob ген от проба на пациент. Тази мутация е в първия екзон и не нарушава аминокиселинната последователност. Предварителни данни показват, че вероятно има една вмъкната последователност в първия екзон на друг пациент. Може да бъде използуван и друг автоматизиран метод за секвениране с помощта на секвеназа вместо на Taq ДНК полимераза, за постигане по-лесно разчитане на последователностите за откриване на мутация.

Пример 6. Експресия на ОВ в дрожди

След позиционното клониране на ОВ особено важно се оказва откриването на физиологичния механизъм, чрез който ОВ белтъкът намалява приемането на храна и телесното тегло. Първият етап в тази посока бе да се получи по рекомбинантен път, с помощта на експресионна система, един функционален белтък. Освен успешната бактериална експресионна система, беше подбрана и експресионна система от дрожди. Експресията в дрожди има няколко атрактивни особености за експресиране на ОВ. Найважната е по-голямата вероятност да се получат биологично активни еукариотни белтъци. ОВ полипептидът се секретира от клетки на бозайници. Белтъчната секреция е много подобна при всички еукариоти, което означава, че секреторният апарат при дрожди е по-близък до секреторните пътища при бозайници, отколкото биха били секреторните пътища при бактерии. В частност, белтъчните модификации на ОВ наблюдавани в клетките на бозайници, е възможно да се наблюдават и при експресията чрез секретариата система на дрождите. Като допълнение, белтъчното нагъване се извършва при преминаване през секреторния апарат, така че освобождавайки ob през секреторния апарат на дрождите е възможно да се получава един точно нагънат белтък с нативна биологична активност. Това е важно за ОВ, тъй като двата цистеинови остатъка могат да образуват дисулфиден мост. За разлика от секреторните пътища, редуциращата среда на клетъчната цитоплазма предотвратява образуването на дисулфидни мостове и следователно от съществено значение е ОВ да преминава през секреторен път, за да се образува in vivo дисулфидна връзка. Други предимства са свързани с лекотата и бързината на манипулиране на дрождите, наличието на вектори и линии и богатия опит с рекомбинантната технология при дрождите.

Избрана беше експресионна система на Pichia pastoris паради следните четири основания: (1) наличието на по-високи нива на хетероложна белтъчна експресия в сравнение с други системи от дрожди като S.cerevisiae; (2) белтъчното гликозилиране е по-близко до това на системите от бозайници при Р. pastoris, отколкото при S.cerevisiae (въпреки че не са открити места за гликозилиране в ob при компютърна проверка, все още остава възможността за гликозилиране на неразпознати места); (3) Р. pastoris секретира много малко нативни белтъци, поради което се пристъпва напрало към пречистване на експресирания чужд белтък; и (4) има търговски достъпни вектори и линии (от Invitrogen). На фигури 21 и 22 са показани две стратегии за генериране на експресионни вектори от дрожди.

Избран беше векторът рР1С.9. Този вектор съдържа клониращо място точно след препро-кодиращата последователност, която насочва белтъка, кодиран от гена клониран в клониращото място на половия α-фактор, да бъде секретиран чрез секреторния път. Друга важна особеност на вектора е един HIS4 ген, който позволява клетките включили вектора, да бъдат селекционирани чрез използуване на ауксотрофна линия от дрожди, растящи в хистидин-дефицитна среда. Клониращата стратегия беше следната: PCR амплифицира ОВ кДНК като се използва 5'праймер съдържащ на своя 3' край последователност, комплементарна на ОВ последователността, точно след предсказаното място за късане на водещия пептид, а самият 5'-край съдържа последователност комплементарна на 3' края на секвенцията на половия α-фактор във вектора. 5'-праймерът съдържа също Xhol място. Беше предвидено 3'-праймерът да има на своя 3' край последователност комплементарна на последните няколко аминокиселини на ОВ и едно EcoRI място на своя 5' край. След PCR амплификация, PCR продуктът беше хидролизиран с Xhol и EcoRI и клониран в хидролизиран рР1С.9 по същия начин вектор. След клониране на миша и човешка кДНКи, всяка със и без глугамин при кодон 49, бяха изолирани индивидуални клонове за всичките четири конструкта и бяха секвенирани за проверка, че конструктите са клонирани в правилна ориентация и рамка и не съдържат мутации от етапа на PCR амплификацията. След идентифициране на клоновете с правилна последователност, те бяха трансформирани в Р. pastoris щам GS 115, който е хистидинов ауксотроф.

Трансформирани клонове от дрожди бяха скринирани за белтъчна експресия на двата миши ОВ конструкта. Като доказателство, че трансформираните дрожди съдържат ОВ, беше извършена ДНК dot-blot проба и проба за колонийна хибридизация, като и двете проби показаха ОВ последователност в трансформираните дрожди, но не в нетрансформираните. Освен това трансформираните дрожди секретарят един 16 kD белтък в културалната среда, докато нетрансформираните не секретират белтък с такава големина (фигура 23А). Това е предсказаната големина на ОВ. Идентифицирани бяха отделни клонове от двата миши конструкта, с високо ниво на експресия на ОВ и беше създадена стратегия за пречистване на ob до хомогеност. Една от стратегиите бе пречистване на ОВ с катионообменна колона (фигура. 23В) . Предварителни данни указват, че за целта би бил полезен силен катионен обменник. Обаче след катионообменна хроматография се губи предполагаемият ob продукт. Това показва наличието на протеаза в пробата.

Една стратегия за преодоляване на този проблем е да се изготвят ob-His-tag сливания за експресия в дрожди (фигура 22). По-нататъшна преценка показа, че ОВ без His-tag свързва здраво за колона, от Ni-хелат. Пречистването на ОВ полипептида с Ni-хелат, последвано от гел филтрация, предоставя продукт със задоволителна чистота за мас-спектрален анализ. Мас-спектралният анализ потвърждава, че молекулното тегло на експресирания белтък е идентично с очакваното молекулно тегло, което убедително потвърждава, че ОВ е успешно експресиран в Pichia.

Обаче процедурата за пречистване с Niхелат/гел филтрация не осигурява ОВ полипептид в задоволително чиста форма. Налице са допълнителни малки молекули. Изглежда, че протеолитичната активност се елюира от Ni-хелатната колона в празния обем. В съответствие с това беше планиран един три-стъпален процес на пречистване: Ni-хелат; последван от катионен обмен (който елиминира примесите от малки молекули) и след това гел филтрация.

Определянето на нивото на експресия чрез оцветяване с Coomassie blue на SDS-PAGE телове показва приблизително 10 mg/Ι когато дрождите са култивирани в съдове с разклащане. Тези нива се очаква да се повишават при култивиране във ферментатори и ние сме готови да започнем ферментация с надеждата да получим поголеми количества белтък. Относно човешките ОВ конструкти, бяха идентифицирани трансформирани клонове дрожди, съдържащи висок брой копия на ОВ гена, които се очаква да експресират ОВ белтък. Когато бъдат получени антитела, те ще бъдат използувани за потвърждаване идентичността на секретирания 16 kD белтък.

Пример 7. Високо ниво на експресия на ОВ слят пептид в бактерии

Приготвяне на замразени изходни култури

Към всеки от два аликвота по 4 ml стерилизирана M9ZB среда без източника на въглерод, бяха прибавени 40 μΐ основен разтвор от декстроза (0.4 ml, стерилизиран с филтруване), 10 μΐ ампицилин основен разтвор (200 mg/ml) и 5 μΐ основен разтвор на хлорамфеникол (34 mg/ ml в етанол). За инокулиране на всеки от горните аликвоти бяха използвани една единична колония от Е. coli с клонирана миша и една с човешка ОВ1 ДНК в Novagen рЕТ-14Ь вектор. Епруветките бяха инкубирани при 37°С за една нощ.

0.5 ml от инкубираните за една нощ култури бяха използвани за инокулиране на 50 ml M9ZB среда с декстроза, ампицилин и хлорамфеникол. Последните бяха инкубирани при 30°С, като периодично бе отчитана абсорбцията при 600 пт (А^о). При достигане А^ около 1 -1.2 се взи маха количества по 175 μΐ от културата и се смесваха с 25 μΐ 60% глицерол в 2 ml епендорфови епруветки, мигновено се замразяваха в течен азот и се съхраняваха при -80°С.

Растеж на културите ml среда M9ZB с 0.5 ml 40% декстроза, 125 μΐ ампицилин основен разтвор и 50 μΐ основен разтвор на хлорамфеникол бяха инокулирани с 1 ml от замразените изходни култури се инкубираха при 30°С. При А^ 1-1.2, се използваха 10 ml от културата за инокулиране на всеки от четири 2-литрови съда с 500 ml среда M9ZB с декстроза, ампицилин и хлорамфеникол .Тези съдове се инкубираха при 30°С до получаване на Α^θθ около 1-1.2 с крайна концентрация 0.5 mM IPTG. Културите бяха инкубирани за една нощ. Клетките бяха събирани чрез центрофугиране при 4000 o6./min за 20 min. Тази експресионна система произвежда един рекомбинантен ОВ полипептид в значително висок, процент тотален белтък; от порядъка на g/Ι от E.coli културата.

Клетъчен лизис и ресуспендиране на включващите телца:

Клетъчната маса беше ресуспендирана в минимален обем 20 mM HEPES, pH 7.2, 10% глицерол, 0.1 М КС1, 5 mM MgCl₂, 1% апротинин, 1 mM PMSF, 5 μg/ml леупептин и 50 μg/ml ДН-аза I. Тази суспенсия беше замразявана и размразявана три пъти с използване на течен азот и умерено топла вода. Лизираните клетки бяха центрофугирани при 18.000 o6./min за 30 min и ресуспендиранн в 20 mM HEPES, pH 7,5,0.1 М NaCl. Суспенсията беше третирана с ултразвук и беше прибавен Triton-X-100 до крайна концентрация 2%. Така третираната суспенсия беше центрофугирана при 18,000 o6./min за 15 min. След още два такива цикъла, бяха направени три цикъла, на промиване със среда без Triton-X100. Накрая утайката беше разтваряна в 6М GdHCl (гуанидин-HCl) 1 20 mM HEPES, pH 7.5 чрез третиране с ултразвук и след това центрофугиране. Настоящата течност беше използвана за следващо пречистване.

ОВ белтъкът беше пречистван в ненагьнато състояние чрез афинитетна хроматография с имобилизиран метален йон (IMAC). Разтворът беше нанасян върху една 40 ml колона Pharmacia хелатна бързо протичаща сефароза, заредена с 5 колонни обема 50 mM NiSO₄ и уравновесена с

6М GdHCl, 20 mM HEPES, pH 7.5. Накрая белтъкът беше елюиран със същия буфер, съдържащ 0.2 М имидазол. Разгънатият белтък в 6 М GdHCl беше съхраняван при 4°С след добавка на натриев ацетат (NaAc) до 10 тМ и нагласяне на pH до около 4.5 с оцетна киселина.

Нагъване и пречистване на белтъка:

6М GdHCl разтвор, съдържащ 100 mg белтък беше третиран с 67 μΐ 1М дитиотреитол (DTT) и беше разреден до около 67 ml с 6М GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4.5. Разтворът бе оставен на постоянно разбъркване за около 1 h. След това при постоянно разбъркване беше разреден в 41 20% глицерол, 2.5 тМ СаС1₂, 20 тМ Tris, pH 8.4 буфер. След пълно смесване, разтворът беше оставен на стайна температура за около 8 h без по-нататъшно разбъркване. След това бяха добавени 2000 единици пречистен говежди тромбин (от тромбостат, продукт на Parke-Davis) и разтворът беше оставен на леко разбъркване. След 2.5 h бяха добавени отново 2000 единици тромбин и хидролизата на хистидин-tag беше продължена за още 3 h. Късането с тромбин беше преустановено с прибавяне на PMSF до крайна концентрация 0.1 тМ. Разтворът беше филтруван и съхраняван при 4°С.

Накъсаният белтък беше впоследствие пречистен на същата IMAC колона както по-горе, уравновесена в IM КС1, 20% глицерол, 20 тМ HEPES, pH 8.4. След нанасяне на белтъчния разтвор, колоната беше промита със същия буфер и накъсаният белтък беше елюиран с IM КС1, 20% глицерол, 40 тМ имидазол, 20 тМ HEPES, pH 8.4. Ненакъсаният белтък бе елюиран с 0.2 М имидазол.

Пречистеният накъсан белтък беше концентриран, третиран с 50-100 mM EDTA, 10 тМ калиев ферицианид (за завършване на непълното окисление) и беше проведена гел филтрация на 16/60 колона от superdex 75. Добивът при прилагане на тази процедура бе около 50% от началния пептид.

След като беше пречистен, експресираният белтък беше характеризиран с няколко метода, физическата характеристика включваше динамично светоразсейване за определяне хомогенността на структурата и бе използвано като критерий за правилното нагъване. Данните от светоразсейването показват, че човешкият ОВ полипептид се експресира преимуществено или изключително като мономер, докато мишият ОВ полипептид може да бъде открит и като димер и като мономер.

Проби с реактив на Ellman и мас-спекгроскопски анализ потвърждават, че цистеиновите остатъци образуват дисулфидна връзка в белтъка. Тази окислена форма на полипептида беше въведена в мишки, както е описано по-долу и прояви биологична активност.

Използван беше кръгов дихроизъм за грубо определяне на структурната геометрия на белтъка. CD спектри във физиологичен буфер (pH около 8, приблизително физиологична йонна сила) показват, че човешкият ОВ полипептид има около 60% α-спирална структура и около 40% структура на кълбо. Установено бе с CD спектроскопия, че мишият ОВ полипептид има около 50% α-спирална структура и 50% структура на случайно кълбо. Ограничена протеолиза, последвана от мас спектрометрия (Cohen et al., 1995, по-горе) бяха използвани за идентифициране на части от ОВ полипептида, които са податливи на протеолиза. Този анализ показа наличието на подвижна примкова структура от аминокиселинните остатъци 54 до 60 (както е изобразено на фигура 4). Възможно е тази подвижна примка да свързва два домена на дефинираната двумерна структура, например а-спирала.

От значение е, както е показано в следващите примери, че биоакгивността на пречистения белтък беше определяна след въвеждане на белтъка както на мършави, така и на тлъсти гризачи с помощта на осмотична помпа (например ALZET осмотична помпа от Alza Corporation, Palo Alto, СА) или с ежедневни болус дози интраперитонеално в продължение поне на две седмици и бяха наблюдавани ефектите върху хранителното поведение и телесното тегло.

Пример 8. Ефекти на ОВ полипептида (Лептин) за намаляване на теглото

Генният продукт на мишия ОВ локус играе важна роля за регулиране на телесното тегло. Настоящият пример установява, че ОВ белтъкът циркулира в мишата, плъшата и човешката плазма. Циркулиращата форма и в трите вида има еднакво молекулно тегло с SDS-PAGE за извлечената полипептидна последователност без сигналната последователност. 0В белтъкът отсъства в плазма от C57/B16J ob/ob мишки и се открива в десетократно по-високи концентрации в плазмата на db/db мишки и в двадесетократно по-висока концентрация в плазмата на fa/fa плъхове в сравнение с контролните животни. Предположено бе, че тези затлъстели животински мутанти са резистентни на действието на ОВ. Налице бяха седемкратни разлики в нивата на плазмения ОВ белтък в една група мършави човешки индивиди. Ежедневни инжекции с рекомбинантния миши ОВ белтък драматично намаляват телесната маса в ob/ob мишки, имат значителен ефект върху телесното тегло в дивия тип мишки, но нямат ефект при db/db мишки. Тези данни подсказват, че генният продукт на ОВ локуса изпълнява ендокринна функция за регулиране на телесното тегло.

Материали и методи

Имунизирани бяха зайци с рекомбинантен белтък в адювант на Freund (HRP, Inc.). Изготвени бяха имунопречистени анти-миши ОВ антитела, конюгирани чрез пропускане на антисерума през колона със сефароза 4В свързана с рекомбинантния белтък, както е описано [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ress, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Проведена беше имунопреципитация на мишата плазма както следва: 0.5 ml плазма от мишка, плъх и човек, съдържаща приблизително 2.5 mM EDTA беше избистрена с несвързана сефароза-4В на стайна температура с разклащане за 2 h. Сефарозата. беше отстранявана чрез кратко центрофугиране и бяха добавени 50 ml от 50% суспенсия от антитяло-свързана сефароза, съдържаща афинитетно пречистено антитяло в концентрация 1 mg/ml сефароза в колоната. Добавен беше 0.5 ml 2 х RIPA буфер за създаване на крайни условия за свързване както следва: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 тМ NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% натриев дезоксихолат и 0.025% натриев азид. Реакцията протичаше за една нощ при 4°С с разклащане. Антитялосвързаната сефароза беше промивана 8 пъти с RIPA буфер, последвано от изплакване три пъти с PBS и беше електрофорезирана в 15% SDS-PAGE. Белтъците бяха прехвърляни на нитроцелулозен филтър и беше проведен имуноблот с биотинилирано имунопречистено антитяло срещу рекомбинантния белтък. Използваното второ антитяло беше HRP-стрептавидин и за детектиране беше използвана ECL.

За определяне количеството ОВ в мишия серум бяха добавени нарастващи количества от нагънат рекомбинантен миши ОВ белтък (0.01, 0.1, 0.5,2.0, 15.0 ng) към 100 λ от C57BL/6J оЬ/ ob плазма и бяха инкубирани при 4°С за 3 h с антитяло конюгирано с протеин-А сефароза. След обилно промиване с буфер А (10 тМ натриев фосфатен буфер, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 5 тМ EDTA, 1 тМ PMSF), пробите бяха ресуспендирани в sample буфер, нанесени на 15% SDS-PAGE и прехвърлени на нитроцелулозна мембрана. Направен беше имуноблот с имунопречистено биотинилирано антитяло срещу амино-края на ОВ белтъка като първично антитяло и HRP-стрептавидин като вторично антитяло, последван от ECL детектиране.

Изготвени бяха цитоплазмени препарати чрез хомогенизиране на мастна тъкан в NDS буфер (10 mM Tris, pH 7.5, 10 тМ NaCl, 60 тМ ICCI, 0.15 тМ спермин, 0.5 тМ спермидин, 14 тМ β-меркаптоетанол, 0.5 m EGTA, 0.5% NP40) с политрон и Dounce хомогенизатор. Ядрата бяха отделяни след центрофугиране при 700 g.

Имунопреципитацията беше изпълнена, както е описано по-горе с тази разлика, че бяха използвани имунопречистени античовешки ОВ антитела. За ELISA, 100 ml разтвор, съдържащ 1 mg/ml имунопречистено античовешко ОВ антитяло бяха разтваряни в PBS в боратен буфер и бяха нанасяни на микротитрационни платки (Coming cat. #2595) за една нощ при 4°С. След това платките бяха измивани 4 пъти с борат PBS, съдържащ 0.05% Tween 20 и излишната течност беше отстранявана. Платките бяха фиксирани чрез инкубиране за 2 h на стайна температура с 240 μΐ на ямка борат-PBS буфер, съдържащ 0.3% желатин и след това бяха промивани и сушени. Известни количества от един нагънат ОВ белтък или проби от плазма в 100 μΐ обем бяха инкубирани в отделни ямки за една нощ при 4°С. След промиване, платките бяха инкубирани със 100 μΐ биотинилирано имунопречистено античовешко антитяло (0,1 mg/ml в желатинборатен буфер) за 4 h на стайна темперазура. След промиване в платките беше добавяна пероксидаза (НКР)-стрептавидин (0.1 mg/ml в боратен буфер, 0.3% желатин). След това разтворът на HRP субстрата (ABTS, 0.3 mg/ml и Н₂О₂, 0.01% лимонена киселина) беше използван за откриване на свързаното антитяло и измерване на оптичната плътност при 414 шп за количествено определяне на свързването на антитялото.

Кодиращите последователности на мишия и човешкия ОВ ген бяха амплифицирани чрез PCR от плазмида, съдържащи ОВ кДНК последователности и субклонирани в рР1С.9 плазмид (Invitrogen). Използваният човешки 5' праймер беше:

5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCA TCCAAAAAGTCCAAG 3 ’ (SEQ ГО N0:34) а 3' праймерът беше ’ GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCT GAGGTC 3’ (SEQ ГО N0: 35)

За мишка 5' праймерът беше

5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTA TCCAGAAAGTCCAGG 3’ (SEQ ГО NO: 36) а 3’ праймерът беше

5’ GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGC TAACARC 3’ (SEQ ГО N0: 37).

5’ праймерът за мишка и човек съдържа едно Xhol място на 5’ края и кодиращата последователност за последните 4 аминокиселини на сигналната последователност на половия а-фактор, намираща се в рР1С.9 вектора. Този вектор насочва секрецията на хетероложно експресирани гени от клетката в средата за култивиране. 5’ PCR праймерът също включва първите 19 нуклеотида на отворената рамка за четене след мястото на късане на сигналната последователност на ОВ гена, преда аланина в аминокиселинна позиция 21. 3' праймерът съдържа едно EcoRI място в своя 5 ’ край, което непосредствено е последвано от комплементарни последователности на предполагаемия ОВ стоп кодон. Условията за PCR са следните: денатуриране при 94°C за 1 min, сдвояване за 1 min при 55°С и удължаване за 2.5 min при 72°С. PCR в 15 цикъла и коригиращата грешките PFU ДНК полимераза (Stratagene) бяха използвани за ограничаване броя на генерираните при PCR мутации. Продуктите от PCR бяха хидролизирани с Xhol и EcoRI и клонирани в хидролизиран по същия начин вектор рР1С.9. Секвенирани бяха и двете вериги на всички конструкги, за да се осигури липсата на всякакви генерирани с PCR мутации. Клоновете бяха трансформирани в Pichia pastoris (His) с помощта на сферопластен метод и бяха селекционирани в дефицитна на хистидин среда. Приблизително 200 миши и човешки клонове бяха скринирани чрез теста на колонийната хибридизация, за да се открият клонове с висок брой копия. Такива клонове след това бяха тестирани за ОВ експресия, най-напред чрез оцветяване с Coomassie, показващо наличието на един нов 16 kD белтък в средата за култивиране на трансформираните дрожди. Потвърдено беше, че 16 kD ивицата е ОВ, като бяха използвани антитела срещу бактериално експресирания ОВ белтък. Рекомбинантните белтъци бяха пречистени чрез двустъпален метод за пречистване, описан по-долу. Приложени бяха мас спектрометрия и цианогенбромидно третиране както е описано от Beavis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990).

Пълната OB кодираща последователност на мишия и човешкия ОВ гени разположени Скрайни спрямо сигналната последователност, бяха субклонирани в рЕТ15Ь експресионен вектор (Novagen) и свръхекспресирани в Escherichia coli [BL21 (DE3) plYsS], като е използвана системата на Т7 РНК полимераза [Studier et al., Meth. Enzymology, 185:80-89)]. Клетките бяха култивирани при 30°С до абсорбция 0.7 при 595 nm и бяха индуцирани с 0.5 тМ изопропил-ЗГО-тиогалактопиранозид за една нощ, след което бяха събирани с нискооборотно центрофугиране. Клетките бяха лизирани чрез три цикъла замразяване и размразяване и хидролиза с ДНаза I. Мембранната екстракция бе изпълнена след третиране с ултразвук и разтваряне с детергент. Крайната утайка, съдържаща включващите телца беше разтваряна в 6М гуанидин-НС1,20 тМ HEPES, pH 8.4. Рекомбинантните ОВ белтъци бяха пречистени при денатуриращи условия с IMAC, използвайки Ni-йон афинитетна колона и промиване с нарастващи количества имидазол. Пречистеният денатуриран ОВ белтък след това беше съхраняван в 6М гуанидин-НС1, 10 тМ NaAc, pH 5 и редуциран с 1 тМ DTT на стайна температура за 1 h. Денатурацията беше извършена чрез разреждане на редуцирания белтък в 20% глицерал, 5 mM СаС1₂, 5 тМ NaAc, pH 5 при смесване и инкубиране на стайна температура за 8-12 h. След денатурацията, pH беше нагласяно до 8.4 чрез добавяне на Tris до 10 тМ и хексахистидин tag беше отстраняван чрез скъсване с тромбин. Срязаният, ренатуриран белтък беше повторно пречистен с IMAC, за да се отдели от тромбина и от несрязалия слят белтък. Срязаният, ренатуриран белтък се елюира от Ni-йон афинитетната колона при 40 тМ имидазол, до като тромбинът не се задържа на колоната, а несрязаният слят белтък се елюира с 0.2 тМ имидазол. След това продуктът беше концентриран, третиран с 10 mM EDTA и 10 тМ калиев ферицианид и пречистен по-нататък чрез гел филтрация с Pharmacia superdex 75 колона 16/60.

Пробата на Ellman’s беше изпълнена както е описано от Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77 (1959). Реактивът на Ellman беше изготвен като 36.8 mg 5,5’-дитио-бис-(2-нитробензоена киселина) (DTNB) бяха разтворени в 10 ml 0.05 М фосфат, pH 8. Калибровьчна крива беше направена в концентрационни граници 10-120 тМ свободен сулфхидрил (използвайки 1 тМ основен разтвор от редуциран DTT) при 412 nm. Всеки тест беше извършен при използване на 0.02 ml реагент на Ellman и общо количество на реакционната смес 0.5 ml. Измереният екстинкционен коефициент беше 12974 М’¹ сит* за свободна сулфхидрилна група (корелационен коефициент 0.99987), което е в границите на 5% от предварително съобщената стойност 13600 М·' cm¹.

За пробата на Ellman бяха използвани 50 ml от 2 mg/ml пречистен с гел филтрация белтък, съответстващ на концентрация на свободни сулфхидрилни групи от порядъка на 24 тМ в крайната реакционна смес. Полученият разтвор дава А₄₁₂ около 0.02, което подсказва, че двата цистеинови остатъка в белтъка са в окислено състояние, образувайки цистин или че техните свободни сулфхидрилни групи са напълно екранирани в недостъпната сърцевина на нагънатия белтък. Идентични резултати бяха получени, когато същата проба бе направена с разгънат белтък в присъствието на 6М гуанидин-НС1.

Мишките бяха отглеждани поотделно в клетки, в свободна от патогени среда и бяха привикнати към диета, съдържаща 35% (тегпо/тегло) Laboratoty Rodent Diet 5001 (РМР Feeds, Inc.), 5.9% (тегло/тегло) смес пудинг от тапиока (general Foods) и 59.1% вода, която има енергетично съдържание 1.30 kcal/gm. Диетата беше стерилизирана чрез автоклавиране и пакетирана в 60 mm пластмасови съдчета, които бяха фиксирани върху капачета на 100 mm петриеви съдчета. Тапиоката придава на диетата консистенция на тесто и затруднява разпръсването на храната в клетката. 100 mm похлупак събира малкото количество разпръсната от животното храна. Всяка сутрин в кафеза бе поставяна паничка с прясна храна и паничката от предишния ден е изваждана и претегляна. Разликата в теглото бе мярка за дневната консумация на храна. Ефектът на рекомбинантния белтък върху поемането на храна и телесното тегло беше отчитан в три линии мишки: C57BL/6J ob/ob, C57BL/Ks db/db и CBA/J +/+, доставени от Jackson Laboratories. По 30 мишки от всяка линия бяха разпределяни в три групи по 10. Една група от всяка линия получаваше ежедневно интраперитонеални (i.p.) инжекции с ренатуриран бактериален ob белтък в доза 5 mg/g/дневно в 300 μΐ PBS. Втора група получаваше i.p. инжекции със същия обем PBS. Тези контролни мишки получаваха инжекции с PBS диализат на рекомбинантния белтък. PBS беше изчистен от ендотоксин с помощта на Acticlean EYOX колона. Трета група животни не бяха инжектирани. Поемането на храна беше отчитано всеки ден, а телесното тегло бе измервано редовно в продължение на 3.5 седмици. За чифтовия хранителен експеримент, поемането на храна от отделна група ob мишки беше съпоставяно ежедневно спрямо консумацията от ob мишките получаващи ОВ белтък.

Резултат

ОВ белтъкът циркулира в плазмата на мишка, плъх и човека

Рекомбинантен миши и човешки ОВ белтък беше изготвен с помощта на бактериалния експресионен вектор pET15b (Novagen) и чрез клониране в Pichia pastoris, една експресионна система от дрожди, която секретира рекомбинантните белтъци директно в средата за култивиране. Белтъкът ob експресиран в дрожди включва 146-те аминокиселини разположени след карбоксикрая на сигналната последователност. Имунизирани бяха зайци с бактериални белтъци (HRP.Inc.). Антителата бяха имунопречистени (Research Genetics) и използвани за имунопреципитация и имуноблот на белтък от плазма и от мастна тъкан.

ОВ белтъкът от миша плазма мигрира в SDS-PAGE съответно на молекулно тегло 16 kD. Електрофоретичната подвижност е идентична с тази на рекомбинантния ОВ белтък, секретиран от дрожди след отстраняване на сигналната последователност (фигура 24А). Този белтък не беше открит в плазма от C57BL/6J ob/ob мишки, които имат една безмислена мутация при кодон 105. Опитите да се идентифицира скъсената ве рита от 105 остатъка чрез използване на няколко различни антисеруми останаха безрезултатни.

Наблюдавано беше 10-кратно увеличение нивото на циркулиращия белтък при db/db мишки спрямо контролните животни (фигура 24А). Имунопреципитация на плазма от див тип и fa/fa плъхове установява 20-кратно нарастване нивото на ОВ белтъка в мутантния плъх в сравнение с дивия тип (фигура 24А). Мутацията db води до затлъстял фенотип, идентичен на този, наблюдаван при ob мишките (Bahary et al., 1990, погоре). Плъховете fatty са тлъсти в резултат на рецесивна мутация в гена, който е хомоложен на db (Truett et al., 1991, по-горе). За да бъде определено количествено нивото на ОВ в мишата плазма, бяха прибавяни нарастващи количества рекомбинантен белтък към серума и бяха имунопреципитирани (фигура 24С). Наблюдавано бе линейно нарастване на интензитета на сигнала на имуноблота с нарастване количеството на рекомбинантния белтък. Сравнението интензитета на сигнала на нативния белтък в мишата плазма със стандартите показва, че нивото на циркулиращия ОВ белтък в мишки див тип е около 20 mg/ml. Тези данни показват, че имунопреципитациите и имуноблотинга са направени при условия на излишък на антитяло. Наблюдавани бяха също повишени нива на ОВ белтък в белтъчни екстракти от мастна тъкан на db/db мишки спрямо контролите (фигура 24D). Както може да се очаква за един секретиран белтък, белтъкът от мастната тъкан се фракционира с непречистената мембранна фракция (данните не са представени).

Проби от плазма на шест мършави индивида с Body Mass Index, по-малък от 25 (BMI = тегло/височина²) бяха имунопреципитирани с имунопречистени антитела срещу човешки белтък. Имунопреципитираният материал мигрира с електроподвижност, идентична с тази, наблюдавана за белтъка включващ 146 аминокиселини, експресиран в дрожди. Интензитетът на сигналите варира значително при шестте проби (фигура 25 А). Дензитометрията на авторадиографиите разкрива около 5-кратна разлика в нивата при индивидите НР1 и НР6 и междинни нива у останалите индивиди. Направена беше ензим свързана имунопроба (ELISA) с помощта на имунопречистено антитяло и ренатуриран бактериален белтък като стандарт (вж. по-долу). Получената стандартна крива е представена на фи гура 25В. Прилагайки това определяне са установени плазмени нива за ОВ белтъка в шестте проби от човешка плазма, вариращи между 215 mg/ml (фигура 25С). Нивото на ОВ белтъка в плазмата на НР6 беше извън линейната област на имуноопределението и е > 15 ng/ml. Тези количествени разлики са в съответствие с наблюдаваните на имуноблотинга.

Предварителни данни подсказват, че лептинът може да циркулира поне отчасти свързан с друг белтък или белтъци. Това заключение се базира на хетерогенността на вида на титрационната крива за серум, сравнена с рекомбинантния стандарт. Анализът на големи количества лептин, имунопречистен чрез HPLC гел филтрация върху колона от заешки анти-ОВ при денатуриращи и неденатуриращи условия, с мониториране с ELISA и SDS-PAGE, насочват, че ОВ полипептидът се отнася като високомолекулен комплекс. Тези данни обаче остават като предварителни, ОВ свързващият белтък, ако съществува, трябва да бъде характеризиран.

Структурни особености на ОВ белтъка

Тъй като ОВ белтъкът притежава два цистеинови остатъка, той би могъл да образува или интра- или интермолекулни дисулфидни връзки при условия на окисление in vivo. Повторени бяха имуноблотове със и без добавката на редуциращи агенти към sample буфера. И при двата вида условия, ОВ белтъкът в човешкия серум мигрира като мономер (данните не са представени). При нередуциращи условия беше открит имунопреципитиран белтък в серум на db мишки на места, съответстващи както на мономер от 16 kD, така и на димер от около 32 kD (фигура 26А). Фракцията с по-високо молекулно тегло изчезва при редуциращи условия, което подсказва, че част от мишия ОВ циркулира като видове с по-високо молекулно тегло поради образуване на междумолекулна дисулфидна връзка. Около 80% от мишия ОВ циркулира като приблизително 16 kD белтък и 20% като приблизително 32 kD форма.

Същите молекулни форми се наблюдават, когато мишият и човешкият белтък се експресират в Pichia pastoris [Abrams et al., Immunol. Rev.:

5-24 (1992)]. При тези изследвания, ДНК последователността, съответстваща на зрелия ОВ белтък, съдържащ 146 аминокиселини, беше клонирана в рР1С.9 вектор (Invitrogen) след сиг налната последователност на половия а-фактор от дрожди. ОВ белтъкът беше пречистен от средата за култивиране на щамове дрожди експресиращи мишия и човешкия белтъци и беше електрофорезиран при редуциращи и нередуциращи условия (фигура 26 А). Мишият белтък се експресираше в дрожди главно като димер при нередуциращи условия и само като мономер в присъствието на редуциращи агенти. Рекомбинантният човешки белтък мигрираше до позицията на мономер и при двата вида условия (данните не са представени).

Пречистеният човешки белтък, експресиран в Pichia, има молекулна маса 16,024 ± 3 Da, определена с мас-спектрометрия (Beavis, 1990, по-горе). Тази стойност е в съответствие с масата изчислена от аминокиселинната последователност на белтъка, съдържащ един единичен вътремолекулен дисулфиден мост (16,024 Da). Matrix-assisted laser desorption спектрометричен анализ на белтъчни продукти скъсани с цианогенбромид показва, че цистеиновите остатъци на 117 и 167 са свързани чрез вътремолекулен дисулфиден мост (фигура 26В). Цианогенбромидът къса карбокси-края до метионинови остатъци.

Получаване и характеризиране на биологично активен рекомбинантен белтък

Мишият ОВ белтък беше експресиран в

Е. coli от един рЕТ 15Ь плазмид като неразтворим слят белтък с един остатък 20, N-краен хекса-хистидин tag, съдържащ едно тромбин скъсващо място. Бактериалните включващи телца бяха разтваряни с гуанидин-HCl и пречистени при денатуриращи условия чрез афинитетна хроматография с имобилизиран метален йон (IMAC) (фигура 27). Пречистеният денатуриран слят белтък беше редуциран, разреден и оставен да се ренатурира във воден разтвор на стайна температура. След скъсване с тромбин, ренатурираният миши ОВ белтък, съдържащ четири допълнителни N-крайни остатъци (Gly-Ser-His-Met; (SEQ ID NO: 38) беше отново пречистен с IMAC до >98% хомогенност, отчетена със SDS-PAGE и мас-спектрометрия. Matrix-assisted laser desorption мас-спектрометрията показва измерена маса 16,414 ± Da (предполагаема маса = 16,415 Da). Както редуциращите, така и нередуциращите SDS-PAGE гелове показват само един вид молекулни с молекулно тегло 16 kD (данните не са представени).

Изследването на динамичното светоразсейване, с използване на DP801 Molecular Size Detector (Protein Solutions, Inc.) показа, че ренатурираният миши ОВ белтък е главно мономерен с известно количество агрегати от по-висок порядък. Белтъкът беше третиран с EDTA и беше окислен химически. След това с гел филтрация бяха отстранени по-тежките молекулни видове. Следващото изследване на динамичното светоразсейване потвърди, че пречистеният ренатуриран рекомбинантен миши ОВ белтък е монодисперсен. Бактериалните токсини бяха отстранени с помощта на Acticlean ЕТОХ колона (Sterogene Bioseparations, Inc.) след диализа срещу PBS. Крайният добив на белтък беше 45 mg/1.

Тестът на Ellman беше направен с пречистен ренатуриран рекомбинантен миши ОВ белтък за определяне неговото състояние по отношение на окисление (Ellman, 1959, по-горе). И двата - ренатурираният и разгънатият с 6М гуанидин-HCl белтък съдържат <0.5% свободни сулфхидрилни групи, което показва, че мономерният продукт съдържа една вътремолекулна дисулфидна връзка. Това беше потвърдено с мас спектрометрия на скъсаните с цианогенбромид продукти от повторно нагънатия бактериален белтък (данните не са представени).

Биологична активност на ОВ белтъка. Пречистеният ренатуриран рекомбинантен миши ОВ белтък беше въвеждан като ежедневна интраперитонеална инжекция от 5 mg/kg/дневно на групи от по 10 мишки C57BL/6J ob/ob (възраст 16 седмици), C57B1/Ks db/db (възраст 12 седмици), и CBA/J +/+ (възраст 8 седмици). Равен брой животни получаваха ежедневно инжекция с PBS. PBS, използван за контролните инжекции, бе взиман от диализата след еквилибрирането на белтъка. Допълнително по 10 животни от трите миши линии не бяха инжектирани. Приемането на храна от всяко животно бе отчитано ежедневно, а теглото на животните бе измервано на интервали от 3 до 4 дни. Обобщените резултати от приемането на храната и телесното тегло за всяко животно от деветте групи мишки са представени на фигура 28 А до F, а статистическата достоверност на данните е показана на таблица 1. Приемането на храна от С57В1/6J ob/ob мишките инжектирани с белтък значимо намалява след първата инжекция и продължава да намалява до

5-ия ден, когато се стабилизира на ниво прибли65 зително 40% от количеството храна поемана от инжектираните с PBS животни (р<.001). Инжектираните с контролен разтвор ОВ мишки не губят телесно тегло в продължение на 3-седмичния период на изследването. Телесното тегло на мишките C57BL/6J ob/ob, които получават белтък, намалява с около 10% от телесното си тегло след 5-дневно третиране (р<.001). Тези животни продължават да губят от теглото си през 3-седмичния период на третиране, като накрая на периода теглото на ob животните получаващи белтък е намаляло с около 60% от началното тегло (р<.0001). Отделна група ob мишки бяха чифтно хранени с ob мишки получаващи белтък. Данните във фигура 29В показват, че чифтно хранените мишки имат значително по-малка загуба на тегло, отколкото животните получаващи рекомбинантен белтък (р<.02). Снимка на две мишки получаващи инжекции с белтък или с вехикулум илюстрира голямата разлика във вида им в резултат на белтъчното третиране (фигура 29В). За по-нататъшно уточняване ефекта на белтъка, бяха направени аутопсии на две мишки от всяка от групите. Общият оглед на ob мишките получаващи белтък показа драматично намаление на телесните мазнини, както и на големината на черния дроб. Теглата на черния дроб на db и дивия тип мишки бяха непроменени след третирането. Теглата на черния дроб на ob мишки получаващи инжекции с PBS бяха 5.04-5.02 g сравнени с 2.23 и 2.03 g при животните получавали рекомбинантен белтък. За разлика от бледия мастен черен дроб характерен за ob мишките, черният дроб на ob мишките получавали белтък добива по-тъмен цвят, характерен за нормалния черен дроб (фигура 29С). Хистологични срези от черен дроб показват, че нетретираните животни имат мастен черен дроб, който има значително подобрен вид при третираните с белтък животни (данните не са представени).

За разлика от ob мишките, при C57BL/Ks db/db мишките получавали белтък няма достоверни разлики на телесното тегло и приемането на храна в сравнение с контролната група получавала вехикулум (фигура 28А до F, таблица 1). И трите групи db/db мишки са загубили между 2-5 g по време на периода на третиране. Средното ниво на гпюкоза в кръвта на db мишки измерено с глюкометьр беше >500 mg/dl при всички мишки, което показва, че тези животни са развили вторичен диабет от затлъстяването. Инжекциите на db мишките бяха прекъснати след две седмици.

При дивия тип мишки беше установено малко, но достоверно намаление на телесното тегло след въвеждане на рекомбинантния ob белтък (фигура 28A-F, таблица 1). След петдневно инжектиране на белтък, третираните мишки загубват около 0.5 g, докато контролните мишки увеличават теглото си с 0.4 g (р<.02). При два следващи интервала от време, животните получавали белтък имат значително по-малко телесно тегло, отколкото мишките получавали ежедневно инжекции с PBS. Достоверността на промените в теглото намалява в по-късните периоди. Приемането на храна от животните, които губят телесно тегло, не се различава съществено от това на контролните животни. Инжекциите с PBS имат слаб, но достоверен ефект върху приемането на храна и телесното тегло при ob, db и дивия тип мишки спрямо мишките, които не са инжектирани (р<.05).

Таблица 1.

Хяаотао Група.	ПРОМЯНА НА ТЕГЛОТО	Р
Тратвраж*	Ст. грашха
група	Двв	п	ср*дао
оЪ/оЬ	сйлтък «•хжжулуж	1-5	Ю Р	-5. 38000000 —О. 14444-144	О. 4758190 0. 2444444	<О. 001
	бедтъм жФХякулу·	4-12	1О - Р	14. 45000000 О. 98888880	О. 70793125 О. 38058597	<о, ОО1
	0«ЛТЪЖ жехжжулжж	1—27	ч 5	-24. 28338383 О 4. 80000000	. 59924553 0. 79874902	<О. ΟΟΟί
db/db	вахмжулуж	1-5	ю 1О	-1. 47000000 -2. ОООООООО	О. 35989891 О. 23142073	О . 240
	(ЙДТЪК жжхжжулуж	1-12	ю ю	-3. 75000000 -4. 19000000	О. 77348418 О.34505447	О. 510
CBA/J	0«л*гъх •хжжулум	1-5	ю 1О	—О. 48000000 О. 38000000	О. 17875117 0. 21489015	О. 005
	жехжжулуж		to 1О	-О. 12000000 1. 20000000	О. 45748103 Ο.18378782	О. 015
	сйлтък ж«хжжулум		9	1. 96000000 2. 25333333	О. 48723711 О. 20753215	<О. 501

Обсъждане

Ендокринна функция на белтъчния продукт на ОВ локуса бе предположена за пръв път от Coleman, който е показал, че телесното тегло на ob/ob мишките намалява след парабиотично свързване с нормални или db мишки (Coleman et al., 1978, по-горе). Резултатите, представени по-горе, подкрепят такава хипотеза, показвайки, че ОВ белтъкът циркулира в кръвния ток и че рекомбинантният белтък намалява телесното тегло. Молекулното тегло на генния продукт кодиран от ОВ гена е около 16 kD, което е равно на последователността от 146 аминокиселини, разположени след карбокси-края на сигналната последователност. Рекомбинантният ОВ белтък не е модифициран, когато се експресира в Pichia pastoris. Експресията на гени от бозайници в Pichia води до образуване на правилна белтъчна структура [Cregg et al., Bio/Technology, 11:905914 (1993)]. Тези данни насочват, че ОВ белтъкът не е гликолизиран и не е постранслационно процесиран in vivo. Данните не изключват въз30 можността ОВ белтъкът да бъде нековалентно свързан за самия себе си или за други белтъци в плазмата или мастната тъкан. Въпреки че не е изключено протеолитично скъсване на белтъка, не бяха открити нискомолекулни форми на ОВ белтъка с никой от използваните антисеруми, включително и четири антипептидни антитела.

ОВ белтъкът има два цистеинови остатъка и циркулира като мономер у човека и като мономер и димер у мишката. Когато човешкият белтък е експресиран в Pichia pastori, се открива една вътремолекулна връзка типична за секретираните молекули, което подсказва, че е възможно тя да съществува и in vivo. Това се подкрепя и от биологичната активност на рекомбинантния бактериален белтък, който има една вътремолекулна дисулфидна връзка. Мишият ОВ белтък може да бъде открит в плазмата като мономер и като димер. Мономери и димери са наблюдавани и когато миши ОВ белтък е експресиран в дрожди, което показва, че склонността на мишия белтък да образува димер е резултат на различия в първичната последователност спрямо човешкия белтък. Известно е, че мономерът има биологична активност, докато функционалната активност на димера е неясна.

Ефектът на ОВ белтъка върху приемането на храна и телесното тегло при ob мишките е драматичен. След третиране в продължение на три седмици, ob мишките получавали ежедневно инжекция с рекомбинантен белтък, губят 40% от телесното тегло и са консумирали 40% повече храна от контролните животни. Освен това, теглото на третираните ob мишки не беше още стабилизирано по време на приключване на експеримента. Резултатите от експеримента с чифтното хранене показват, че загубата на теглото е резултат на ефектите и на приемане на храна и на разход на енергия. Така, отделна група от ob мишки, при които приемане на калории беше ограничено до това на ob мишките получаващи белтък, загубваха значително по-малко от теглото, отколкото животните получавали белтък. Редуцираното поемане на храна от ob/ob мишките до ниво по-ниско от това на дивия тип мишки, което настъпва един ден след поемането на ОВ белтък, показва, че те са особено чувствителни на неговото действие. Възможно е ОВ рецепторът да има възходяща регулация при тези животни. Приемането на храна от третираните ob мишки остава относително постоянно след петдневно третиране. Ако това е резултат на постигане постоянно стабилно ниво на белтъка, то би могло да се предполага, че белтъкът има относително дълъг полуживот. [The Pharmacological Basis of Therapeutics, pp. 19-45, Goodman and Gilman, eds., Pergamon Press, New York, (1990)]. Това заключение е в съответствие с данните от парабиотичните експерименти [Coleman et al., 1978, по-горе; Weigle, Int. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].

Ефектът на рекомбинантния белтък върху телесното тегло на мишки див тип беше слаб, но статистически достоверен през първите две седмици от проучването. Докато разликите в теглата на мишките див тип, получавали белтък спрямо тези получавали PBS бяха изразени в по-късните периоди от време, то статистическата достоверност на данните силно намалява след третата седмица от третирането. Ранната загуба на тегло не може да бъде отдадена на разлики в приемането на храна. Вероятно измерването на прие тата храна не е достатъчно прецизно, за да открие намаление от 1 g разлика в телесното тегло по време на третирането. Тези наблюдения се различават от резултатите, получени в предишни експерименти, при които гризачи див тип парабиотично са свързвани с ob мишки, fa плъхове, плъхове с хипоталамични лезии и плъхове, затлъстели чрез висококалорична диета [Coleman et al., 1978, по-горе; Harris et al., 1987, по-горе; Harris et al., “Physiological and metabolic changes inparabotic artners of obese rats”, in Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Harvey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. Във всички случаи, дивия тип животни стават анорексични и губят голяма част от теглото. Тъй като нивата на ОВ белтъка са повишени при db мишките и fa плъховете и нивото на ОВ РНК е повишено при мишките с хипоталамични лезии, възможно е мишките див тип да са в състояние да реагират на ОВ, когато циркулира в плазмата в достатъчно висока концентрация. Представените данни в това изобретение са в съответствие с възможността нивата на въведения белтък да са били под ендогенните нива, което води до уравновесяване при едно леко понижено телесно тегло. Количествени определения на циркулиращите нива ОВ белтък в третираните животни ще разреши този проблем. Тъй като не разполагаме с имунотест за мишия белтък, имунопреципитациите подсказаха, че нивата на циркулиращия ОВ белтък не са съществено повишени при мишки див тип получаващи белтъка.

По-слабият ефект на белтъка върху мишки див тип и отсъствието на отговор у db мишките прави малко вероятно третирането да има неспецифични или нежелани ефекти. Всички db мишки загубват малко от теглото си по време на третирането, независимо от това дали получават или не получават ob белтък, db животните бяха подчертано хипергликемични и загубата на тегло е възможно да бъде резултат на диабета, а не на експерименталния протокол. C57BL/Ks db/db мишките често развиват диабет и започват да губят малко от теглото си в сравнение с използваните в това изследване животни (Coleman et al., 1978, по-горе). C57BL/6J ob/ob мишките на същата възраст не развиват значима хипергликемия. Тези фенотипни разлики се предполага, че са резултат на генетични различия в линиите (C57BL/6J спрямо C57BL/Ks) носещи мутациите (Coleman et al., 1978, по-горе).

Фактът, че не се открива скъсеният 105 аминокиселинен белтък, предсказан от кДНК последователността на ОВ гена в C57BL/6J оЬ/ оЬ мишките, подсказва, че мутантният белтък е или деградиран или не е транслиран. Не може обаче да се изключи възможността използваният антисерум да не открива този скъсен белтък. Наблюдаваното 10-кратно увеличение нивата на оЬ белтъка у db мишки в сравнение с мишките див тип, подсказва, че оЬ белтъкът е свръхпродуциран когато има резистентност към ефектите му. Тези данни корелират с проучвания върху ОВ мРНК. Както беше споменато, предварителни експерименти показаха, че мутации на мишия db и на плъшия fa гени, които се картират в хомоложни хромозомни области, водят до свръхпродукция на един плазмен фактор, който потиска телесното тегло (Truett et al., 1991, по-горе; Coleman, 1978, по-горе; Harvey, 1959, по-горе). И в двата случая беше предположено, че мутантните животни са резистентни на ефектите на ОВ белтъка. Тази възможност беше потвърдена от наблюдението, че ОВ белтъкът няма ефект върху телесното тегло и поемането на храна, когато е приложен на db мишки.

Затлъстяването при човека може да бъде свързано с повишени нива на ОВ белтък в плазмата на индивиди, които са относително резистентни на хормона. От друга страна, намалената експресия на ОВ може да доведе до затлъстяване, при който случай “нормални” (т.е. несъответно ниски) нива на белтъка могат да бъдат установени. Така, нивата на ОВ белтъка в човешката плазма могат да бъдат маркер за различни форми на затлъстяване. В една малка група от мършави индивиди с BMI < 25, се откриват с ELISA ниски нива от нанограми циркулиращ ОВ белтък. Достоверно вариращи концентрации бяха отбелязани, което подсказва, че нивото на експресия и/или чувствителността към белтъка могат да играят роля за определяне на телесното тегло.

Мястото на действие на ОВ белтъка е неизвестно. Белтъкът повлиява поемането на храна и разхода на енергия, едно откритие, което е в съответствие с клинични проучвания, показващи, че отклонение и в двете системи действат на регулацията на телесното тегло [Leibel et al.,

N. Engl. J. Med., 332:621-628 (1995); Keesey et al., “Metabolic defense of the body weight setpoint”, in Association for Research in Nervous and mental Disease, pp. 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York (1984)]. Изглежда, че хипоталамусът е по-долу от ОВ по пътя, който контролира телесното тегло, въпреки че са възможни преки въздействия върху различни органи.

Пример 9. Повишена експресия на ОВ РНК в адипоцити на мишки с увреждания на хипоталамуса и с мутации в db локуса

Генният продукт на наскоро клонирания миши ген на затлъстяването (ОВ) играе важна роля при регулиране количеството на мастната тъкан. ОВ РНК се експресира специфично от мишите адипоцити in vivo във всяко от няколкото различни депа на мастни клетки, включително в кафявата мастна тъкан. Тя се експресира също в култивирани ЗТЗ-442А преадипоцитни клетки, които са индуцирани към диференцировка. Мишки с лезии на хипоталамуса, както и мишки мутантни в db локуса, експресират 20-кратно повисоко ниво на ОВ РНК в мастната тъкан. Тези данни насочват, че както db гена, така и хипоталамуса са по-надолу от пътя на ОВ гена, който регулира количеството мастна тъкан и са в съответствие с предишни експерименти насочващи, че db локуса кодира ОВ рецептора. При db/db и мишките с лезии, количествените разлики в нивото на експресията на ОВ РНК корелират с липидното съдържание на адипоцитните. Възможно е молекулите, които регулират нивото на експресия на ОВ гена в адипоцитите да играят важна роля при определяне на телесното тегло, както молекулите, които предават ефекта на ОВ на мястото на неговото действие.

Материали и методи

In situ хибридизация

Бяла мастна тъкан от идентични коремни области на мишки див тип (wt) и db мишки е обработвана едновременно по метода, описан от Richardson et al., Growth, Development & Aging, 56:149-157 (1992). Накратко, тъканите бяха фиксирани в разтвор на Bouin за 2 h при 4°С. След това те бяха дехидратирани чрез пренасяне в етанол с нарастващи концентрации от 10 до 100%, във всяка по 5 min при 4°С. След това тъканите бяха инкубирани в ксилол (1 h) и парафин (2 h) при 65°С. Изготвени бяха тьканни срези от вклю чените в парафин wt и db/db късчета мастна тъкан и бяха поставени на предметни стъкла при същите условия. Срезите бяха загрявани при 65°С за 1 h и се третираха с ксилол и серия от различни разреждания на етанол от 100% до 50% р всяко по 3 min на стайна температура. Синтезирана бе една антисенз-РНК сонда на ОВ гена чрез in vitro транскрипция на линеаризирана последователност на ОВ гена преди промотора на Sp6 РНК полимераза. In situ хибридизацията бе извършена по Schaeren-Wiemers et al., Histochemistry, 100: 431-440 (1993).

Получаване на РНК и клетъчно култивиране

Тотална РНК и Northern blots са правени както беше описано. Съдови клетки от строма и адипоцити бяха приготвяни по Rodbell, а РНК от двете фракции бе изолирана по Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem., 239:375-380 (19). След субклониране, 3T3-F442 клетките са култивирани в Dulbecco’s modified Eagle medium, съдържаща 10% телешки фетален серум (означена като стандартна среда) [Dani et al., “Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation”, in Obesity in Europe vol. 88, pp. 371-376, Bjomtorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. При конфлуентност, клетките са третирани в стандартна среда с добавка 2 пМ трийодотиронин (ТЗ) и 17 пМ инсулин. След дванадесет дни, РНК бе изолирана както е описано по-горе.

Третиране със злато тио-ппокоза (GTG)

Двумесечни женски CBA/J мишки са третирани с еднократна интраперитонеална инжекция на ауротиоглюкоза (Sigma Catalog No. А0632) в доза 0.2 mg/g във физиологичен разтвор. Контролните животни са инжектирани с физиологичен разтвор. Мишките са претеглени един месец след третирането. РНК от мастна тъкан е изолирана от тези третирани животни, чието телесно тегло е нараснало с повече от 20 g след третирането с GTG.

Резултата

Наскоро беше установено, че ОВ генът се експресира в мастната тъкан [Zhand et al., Nature, 372:425-432 (1994)]. Тъй като мастната тъкан е изградена от много клетъчни видове, включително адипоцити, преадипоцити, фибробласти и съдови клетки, беше направена in situ хибридизация на срез и от епидидимни мастни възглавнички на нормални животни със сенз и антисенз ОВ рибосонди [Richardson et al., 1992, по-горе; Wasserman, “The concept of the fat organ” in Rodohal, Issekutz, fat as a tissue”, pp. 22-92, McGraw Hill, New York (1964)]. Когато e използвана антисенз сонда, позитивни сигнали бяха открити във всички адипоцити на среза (фигура 30 - белязан Wt). Не са отбелязани сигнали при хибридизация на антисенз сонда със срези от мозък (данните не са представени). Хибридизацията с антисенз сонда на срези от мастна тъкан на C57BL/Ks db/db мишки беше силно повишена, потвърждавайки специфичната експресия на ОВ РНК в адипоцитите и демонстрирайки силно повишение нивото на ОВ РНК в единичен адипоцит в тези животни (фигура 30 - белязани db/db). Миши мутанти в db локуса са масивно затлъстели като част от един синдром, който е фенотипно идентичен с този наблюдаван при C57BL/6J ob/ob мишките (Bahary et al., 1990, погоре).

Не се установи синтез на ОВ РНК в клетки на стромата на мастната тъкан, отделени от адипоцитите. Както можеше да се очаква, клетките в адипоцитната фракция експресират ОВ РНК, показано с Northern blots (фигура 31). Същият резултат беше получен с RT-PCR (данните не са представени). Тези данни подкрепят заключението, че само адипоцитите експресират ОВ гена. Данни от адипоцити в култура потвърждават това заключение. При тези изследвания, ЗТЗF442D клетките бяха култивирани при условия, които водят до натрупване на липидни, като част от клетъчна програма водеща до диференцировка в адипоцити. ОВ РНК не беше експресирана при експоненциалния растеж на клетките, нито при конфлуентни 3T3-F442A преадипоцити, които експресират ранни маркери, докато диференцировката на тези клетки в адипоцити води до експресия на доловими нива от ОВ РНК (фигура 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989). Нивото на OB РНК е изключително зависимо от условията на култивиране, тъй като сигналът не беше открит в по-стари, пост-конфлуентни клетки, които не са третирани с инсулин.

Проучвания с хибридизация показаха, че ОВ РНК се експресира in vivo в няколко различни мастни депа, включващи епидидимните, параметриалниге, коремните, периреналните и инг виналните мастни възглавнички (фигура 32А). Нивото на експресия в различните мастни депа варира. Най-ниско ниво на ОВ РНК експресията е открито в ингвиналната и параметриалната мастна тъкан. ОВ РНК се експресира и в кафявата 5 мастна тъкан, въпреки че нивото на експресия е около 50-кратно по-ниско в кафявата мастна тъкан в сравнение с другите мастни депа. Тези количествени разлики слабо корелират с предишни данни за разлики в големината на клетките на различните мастноклетьчни депа [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:2-11 (1972)]. Количеството на OB РНК в кафявата мастна тъкан не се повлиява от излагане на студ (фигура 32В). В този експеримент, нивото на несвързващата белтък РНК (UCP) в кафявата мастна тъкан нараства след студово третиране, докато нивото на ob РНК не се променя [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260: 16250-16254 (1985)]. В съвкупност тези данни потвърждават схващането, че всички адипоцити са способни да произвеждат ОВ РНК и показват променливо ниво на експресия в различните мастни депа. Тези данни подкрепят възможността нивото на кодирания белтък да корелира с общата маса на мастната тъкан.

Измервани бяха нивата на ОВ РНК в db/ db мишки и мишки с лезии на хипоталамуса. Лезиите на вентромедиалния хипоталамус (VMH) водят до затлъстяване като част от синдром наподобяващ този при ob/ob и db/db мишки [Bray et al., Metabolism, 24:99-117 (1975)]. Експерименти c парабиоза подсказват, че такива лезии водят до свръхекспресия на един циркулиращ в кръвта фактор, който потиска приемането на храна и телесното тегло (Hervey, 1959, по-горе). Подобни резултати са отбелязани когато мутантни мишки в db локуса са свързани чрез парабиоза с нормални мишки, което насочва, че е възможно ОВ рецепторът да се кодира в db локуса (Coleman et al., 1978, по-горе). Така затлъстяването, което се получава от VMH лезии и db мутации е възможно да бъде резултат на резистентност към ефектите на ОВ белтъка. Ако това е така, може да се очаква вторично нарастване нивата на ОВ РНК в мастната тъкан.

Хипоталамични лезии бяха индуцирани у женски СВА мишки с помощта на ауротиоглюкоза (GTG) [Debons et al., Fed. Proc., 36:143147 (1977)]. Това третиране води до специфични хипоталамични лезии, главно във вентромедиалния хипоталамус (VMH), с последващо развитие на затлъстяване в продължение на няколко седмици. Обикновено една единствена интраперитонеална инжекция на GTG в доза 0.2 mg/g телесно тегло води до развитие на затлъстяване за един период от четири седмици. Едномесечни женски СВА/J мишки (20-25 g) бяха третирани с GTG и бе показано последващото нарастване на телесното тегло на третираните и контролни животни (таблица 2). РНК от мастна тъкан бе изолирана от db/db мишки и от тези третирани с GTG, които бяха наддали >20 g. С Northern blots бе установено 2О-кратно нарастване нивото на ОВ РНК в двумесечни db/db и GTG третирани мишки в сравнение с контролните животни (фигура 33).

Таблица 2.

Нарастване на телесното тегло при третирани с ауротиоглюкоза мишки

		контроли ( η = 41)	GTG (η = 33)
< 10	g	41, (100Z)	4, (4Z)
10g-20g		0, (0%)	15, (16X)
> 20	g	0, (0Z)	74, (80Z)

Двумесечни женски CBA/J мишки бяха третирани с ауротиоппокоза (GTG). Ауротиоглюкозата (Sigma А0632) бе въвеждана интраперитонеално във физиологичен разтвор при доза 2.0 mg/g. Телесното тегло на контролните и инжектираните животни бе отчитано преди и един месец след инжектирането. Животните бяха отглеждани по 5 в клетка и бяха хранени ad libitum. Нарастването на телесното тегло един месец след инжектирането е представено на таблица 2. Животните с нарастване на тегпото повече от 20 g за един месец след инжекцията бяха селекционирани и използвани за следващи проучвания.

Обсъждане

Генният продукт на мишия ОВ ген циркулира в мишата и човешката плазма, където би могъл да действа като регулатор на количеството мастна тъкан. По-нататъшните изследвания върху регулацията на експресията и механизма на действие на ОВ биха имали важно значение за разбиране физиологичните пътища за регулация на телесното тегло.

Настоящият пример показва, че продуктът на ОВ гена се експресира изключително от адипоцитите във всички депа на мастна тъкан. Този резултат е в съответствие с възможността белтъчният продукт на ОВ гена да корелира с липидните депа на тялото. Освен това ОВ РНК се увеличава 20 пъти у db мишки и мишки с хипоталамични лезии. При тези животни, действителното нарастване нивото на ОВ РНК на единица клетка е вероятно по-високо от 20 пъти, тъй като големината на адипоцитната клетка нараства около 5 пъти при тези животни (вж. фигура 30) (Debons et al., 1977, по-горе). Тези данни поставят db гена и хипоталамуса след ОВ на пътя, който контролира телесното тегло и са в съответствие с хипотезата, че ОВ рецепторът се кодира в db локуса [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Молекулното клониране на ОВ рецептора и/или на db гена ще разреши този проблем. Повишеното ниво на ОВ РНК у db/db и GTG-третирани мишки също насочва за една не автономна извънклетъчна функция на продукта на ОВ гена в мастните клетки [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond., 195:343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15:465-470]. Така, ако кодираният белтък действа директно върху мастните клетки, като инхибира растежа и диференцировката, то свръхекспресията на дивия тип ОВ ген в

GTG-третираните мишки, би довел до мършав фенотип.

Най-предпазливото обяснение на тези данни е, че ОВ белтъкът функционира като една ендокринна сигнална молекула, която се секретира от адипоцитите и действа пряко или непряко на хипоталамуса. Директното действие върху хипоталамуса би изисквало съществуването на механизми, които да позволят преминаването на продукта на ОВ гена през кръвно-мозъчната бариера. Механизми, включващи циркумвентрикуларния орган и/или специфични преносители биха разрешили достъпа на молекула с големина сходна с тази кодирана от ОВ гена [Johnson et al., FASEB J„ 7:678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92:1824-1830 (1993); Ardridge, Endocrine Reviews, 7:314-330 (1986)]. Тази хипотеза обаче би трябвало да бъде разглеждана предпазливо, докато не бъде идентифициран начинът, по който белтъкът може да преминава кръвно-мозъчната бариера. Освен това необходимо е да се преценят възможните ефекти върху други прицелни органи.

Сигналите в мастните клетки, които определят количествените вариации в нивото на експресия на ОВ гена, все още не са известни, но те корелират с разлики в големината на адипоцитната клетка. Адипоцитите от db/db мишките са 5 пъти по-големи от тези на нормалните мишки, с големина на клетката от около 1 gg липид/ клетка (Johnson et al., 1972, по-горе). Предишни данни показаха, че липидното съдържание на мастната клетка и/или големината са важен параметър за определяне на телесното тегло [Faust et al., Am. J. Physiol., 235:279-286 (1978); Faust et al., Science, 197:393-396 (1977)]. Възможно e всяка мастна клетка да експресира едно ниско ниво на ОВ РНК, което нараства по-нататък пропорционално на големината на клетката. Възможно е също, клетъчната големина да не е чувствителният параметър, а просто да корелира с вътреклетъчния сигнал, който повишава експресията на ОВ гена в адипоцитите от db/db и VMH-увредените мишки. Във всеки случай, компонентите пътя на предаване на сигнала, регулиращ синтезата на ОВ РНК, са вероятно важни за определяне на телесното тегло. Генетично повлияване както и сигнали от околната среда, които намаляват нивото на експресия на ОВ ще действат така, че да повишават телесното тегло, както биха и въз действия, които намаляват чувствителността към кодирания белтък. Специфичните молекули, които регулират нивото на експресия на ОВ гена, са все още неизвестни. Очаква се да се определят нивото на генен контрол, който води до количествени промени в нивото на ОВ РНК, както и да се идентифицират регулаторните елементи на ОВ гена. Идентифицирането на молекули, които регулират експресията на ОВ гена в адипоцитите и тези, които посредничат за ефектите на кодирания белтък на мястото (местата) на неговото действие, ще допринесат за разширяване на нашето разбиране за физиологичните механизми, регулиращи телесното тегло.

Пример 10. Характер на експресията на РНК и картиране върху физическата, цитогенетичната и генетичната карта на хромозома 7

ОВ РНК се експресира във висока степен в човешката мастна тъкан и в значително по-ниски нива в плацентата и сърцето. Човешкият ОВ ген е разположен в една изкуствена дрождена хромозома (Y), съдържаща един голям контиг от последователности от човешкия хромозомен сегмент 7q31.3. Освен че потвърждава относителната локализация на гена, базирана на данните от сравнителното картиране при мишката и човека, настоящото изобретение идентифицира 8 установени микросателитни маркери в тясна физическа близост с човешкия ОВ ген. Тъй като мутации в мишия ОВ могат да предизвикат един синдром, който силно наподобява болестно затлъстяване у човека, тези генетични маркери представляват важни средства за изучаване възможната роля на ОВ гена при наследствените форми на човешко затлъстяване.

Материали и методи Northern blot анализ

Тотална РНК бе изолирана от мастна тъкан по метода на Chirgwin et al., Biochem.,

18:5294-5299 (1979). Northern blots, белязане c радиоактивни предшественици и хибридизацията бяха извършвани, както е описано (Zhang et al., 1994, по-горе). Northern blots на полиА⁺ РНК (човешка MTN, човешка MTN II и човешка фетална MTN П) бяха получени от Clonetech (Palo Alto, СА) от същата фирма бяха и PCR праймерите, използвани за генериране на радиоактивно белязана човешка актинова сонда.

STS развитие

Sequence tagged-site (8Т8)-специфични PCR тестове бяха разработени и оптимизирани, както е описано [Green et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11:548-584 (1991); Green, “Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites”, in Methods in Molecular Genetics vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A), pp. 191 -210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:498-501 (1994)]. Всеки STS е наименован c помощта на представката “sWSS”, последвана от уникален номер. Подробности за 19 STSs, представени в изобретението са дадени в таблица 3, с допълнителна информация (напр. условия на PCR реакцията, пълна ДНК последователност), която е на разположение в GenBank и/ или в Genome Data Base (GDB). За микросателит-специфичните STSs, олигонуклеотидните праймери, използвани при PCR тестовете (таблица 3) съответстват на тези, използвани за генотипен анализ (таблица 4) или на тези, които се проектират (най-често с компютърна програма OSP) [Hillier et al., PCR Methods Applic., 1:124128 (1991), като е използвана ДНК последователността, която е на разположение в GenBank. Таблица 3 илюстрира STSs в YAC контиг, съдържащ човешкия ОВ ген.

т

X X

▼

υ « >· d

Ό 'β r* 0$

3

ТайлниаЗ: продължение

Представени са деветнадесетте STS, специфични за хромозома 7 картирали в YAC контиг на изкуствената дродева хромозома, съдържаща човешкия ОВ ген (фигура 35). Във всеки случай са указани обозначеното със “sWSS” име, съответното име, GDB-означеното име на локуса, източникът на STS, последователностите на PCR праймерите, големина на STS идентификационният номер на GDB. Източниците за STSs са както следва: “YAC End” (изолиран края на инсерта в YAC) (Green, 1993, по-горе); “Lambda Clone” (случаен хромозома 7-специфичен ламбда клон) (Green et al., 1991, по-горе; Green, 1993, по-горе), “Genetic Marker” (микросателитен маркер, вж. таблица 2) (Green et al., 1994, по-горе), “YAC Insert” (случаен сегмент от инсерта в YAC) и “Gene” (ген-специфичен STS). Да се има предвид, че за някои генетични маркер-специфични STSs, PCR праймерите, използвани за идентифициране на YACs (предста5 вени в тази таблица) са различни от тези, използвани за извършване на генотипния анализ (таблица 4), тъй като откриването на YACs съдържащи генетичен маркер, не изисква амплификация на самия полиморфен тракт. Всички от посоче1 о ните PCR проби използват температура за сдвояване 55°С, с изключение за sWSS494, sWSS883, sWSS1529 и sWSS2619 (които използват 50°С), sWSS99 и SWSS1174 (които използват 60°С) и sWSS808 (които използват 65°С). Допълнител15 ни подробности относно STS-специфичните PCR проби има на разположение в GDB.

Тадлица 4

Мнкросателитни маркери YAC-коитяг сълъожаж човешкия ob ген

SEQ ID

Име на маркера.	Тип	Локус	Цраймери	НО.	ЙРВ U? Не.
UTS28	Tetra.	D7S1498	TGCAGTAAGCTGTGATTGAG	77	G00-312-446
			GTGCAGCTTTAATTGTGAGC	78
AFM*O65zg9	(СА).	D7SI873	AGCTTCAAGACTTTNAGCCT	79	GOO-437-253
			GGTCAGCAGCACTGTGATT	10
AFMalMwhl	(СА).	D7SI874	TCACCTTGAGATTCCATCC	81	GOO-437-263
			AACACCGTGGTCTTATCAAA	82
АРМЗО9уЛО	(СА).	D7S680	CATCCAAGTTGGCAGTTTTT	83	GO0-2OO-283
			AGATGCTGAATTCCCAGACA	84
AFM2l8xflO	(СА).	D7S5I4	TGGGCAACACAGCAAA	85	GOO-188-404
			TGCAGTTAGTGCCAATGTCA	86
AFM206xcl	(СА).	D7S635	CCAOGCCATGTGGAАС	87	GOO-I99-240
			AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT	88
AFM199xhl2	(СА).	D7S504	TCTGATTGCTGGCTGC	89	G00-188-210
			GCGCGTGTGTATGTGAG	90
AFMa345wc9	(СА).	D7S1875	AGCTCTTGGCAAACTCACAT	91	GOO-437-259
			OCCTAAGGGAATGAGACACA	92

Представени са осемте микросателитни маркери картирани до YAC contig съдържащ човешкия ОВ ген (фигура 35). Във всеки случай, са указани името на маркера (означено като alias таблица 3), типът на микросателитния мотив (тетрануклеотид-“ТеЦа” повтор или (СА)п повтор), името на локуса, означено съгласно GDB, последователностите на праймерите, използван за

PCR-генотипен анализ, и GDB идентификационния номер. Допълнителни подробности относно PCR пробата и полиморфизма са на разположение в GDB.

Човешкият ОВ-специфичен STS (sWSS2619) беше планиран с помощта на ДНК последователност, получена от 3'-нетранслираната област на кДНК. Човешкият Рах-4-специфичен STS (sWSS808) беше получен със следната стратегия. Използвани бяха олигонуклеотидни праймери специфични за мишия Рах4 ген (GGCTGTGTGA GCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO: 63) и (GGGA GCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID NO: 93) [Walter et al., 1991,Genomics 11:424-434(1991)] за амплифициране на един 204 6д фрагмент от човешка геномна ДНК (продуктът имаше същата големина, както тази на генерирания от мишата геномна ДНК). Тази PCR проба не беше подходяща за идентифициране на съответните YACs, тъй като един продукт с подобна големина (200 6д) беше също амплифициран с ДНК от дрожди. Анализът на ДНК последователността на PCR продукта генериран от човешка ДНК, обаче разкри замествания на 20 позиции измежду анализираните 156 бази (данните не са представени). Използвайки тази човешка специфична последователност, беше планиран един нов праймер (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID N0: 66) и той беше използван заедно с първия от горепосочените миши Рах4-специфични праймери (вж. таблица 3). Разработеният по този начин PCR-тест, специфичен за човешки Рах4 не амплифицира значим продукт от ДНК на дрожди и следователно беше използван за идентифициране на съответните YACs.

Идентифициране на YACs с базиран на PCR скрининг

Повечето от представените на фигура 35 YACs бяха получени от една колекция от клонове силно обогатени на ДНК от човешката хромозома 7 (the “chromosome 7 YAC resource”) (Green et al., 1995, по-горе) c помощта на базирана на PCR стратегия за скриниране [Green et al., 1995, по-горе; Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1213-1217 (1990)]. В няколко случая, клоновете бяха изолирани с базиран на PCR скрининг (Green et al., 1990, по-горе) на наличните библиотеки от човешки геномен YAC конструирани при СЕРН [Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4256-4269 (1990)] или ICI [Anand et al., Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res., 18:19511956 (1990)]. Всеки YAC е именуван c помощта на представката “yWSS”, последвана от уникален номер.

Резултати и обсъждане

Изследванията на тъканната експресия на човешкия ОВ ген с Northern blot анализ разкриват, че ОВ РНК се експресира във висока степен в човешката мастна тъкан и в по-малка степен в плацентата и сърцето (фигура 34). Големината на РНК (около 4.5 kb) е еквивалентна при човека и мишката, както и във всяка от тъканите, които я експресират. При тези проучвания бяха наблюдавани 5-кратно по-силни сигнали в 10 gg тотална РНК от мастна тъкан, отколкото в 2 gg полиА⁺ РНК от плацента. Сигналът за полиА⁺ от сърце беше 5-кратно по-слаб от този за плацента. Нивото на ОВ РНК в плацентата беше 250 пъти по-ниско отколкото в мастната тъкан. При този експеримент, ОВ РНК не беше открита в никоя друга от изследваните тъкани, включително мозък, бял дроб, черен дроб, скелетна мускулатура, бъбреци и панкреас. Допълнителни експерименти не откриха ОВ РНК в слезка, тимус, простата, тестис, яйчник, тънко черво, дебело черво, левкоцити в периферната кръв, както и във фетален мозък, черен дроб или бъбреци (данните не са представени). Възможно е, ОВ да се експресира в недоловими (с Northern blot анализ) количества в изброените тъкани или в други неизследвани тъкани. Характерът на експресията наблюдаван при човека се различава в известна степен от този при мишката, където ОВ РНК се открива почти изключително в мастната тъкан.

Сравнително картиране на областта на ОВ гена в мишия и в човешкия геном.

Мишият ОВ ген е разположен в проксималната част на хромозома 6 в област хомоложна на една част от човешката хромозома 7q. Гените в този сегмент включват (от проксимално към дистално): протоонкогенът Met, регулаторът на муковисцидозната трансмембранна проводимост (Cftr), чифтният box-съдържащ ген 4 (Рах4), ОВ и карбоксипептидаза А (Сра) Zhang et al., 1994, по-горе; Friedman et al., 1991, погоре). При мишката, генетичното картиране беше използвано, за да покаже, че Рах4 е тясно скачен с ob [Walther et al., 1991, по-горе; Zhsng et al., 1994, по-горе]. Намерено бе, че физичното разстояние между ОВ и Рах4 е около една мегабаза двойки (Mb) (Zhang et al., 1994, погоре). Ha базата на тези сравнителни картиращи изследвания се очакваше, че човешкият ОВ ген ще бъде разположен между Рах4 и СРА на хромозома 7q. По-нататък, тъй като човешкият

CFTR [Heng et al., Cell Genet., 62:108-109 (1993)] и Pax4 [Tamura et al., Cytogenet. Cell Genet., 66:132-134 (1994)] бяха картирани c помощта на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) в съответно 7q31.3 и 7q32, най-вероятната цитогенетична позиция на човешкия ОВ ген би била в съседство с границата между 7q31.3-q32.

Картиране на ОВ гена на човешката хромозома 7

Използван беше един STS (sWSS2619), който амплифицира един малък сегмент от 3’нетранслираната област на човешкия ОВ ген за скриниране на една колекция от YAC клонове, които са силно обогатени на ДНК от човешка хромозома 7 (Green et al., 1995а, Genomics 25:170-183) и бяха идентифицирани 9 YACs (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 и yWSS5004). За да се потвърди, че тези YACs съдържат автентичен човешки ОВ ген, направени бяха два допълнителни експеримента. Първо, всеки от YACs беше тестиран с втори човешки ОВ-специфичен PCR тест и беше намерено, че всичките са положителни (данните не са представени). Второ, дрождена ДНК от всеки клон беше хидролизирана с EcoRI и анализирана със Southern blot-хибридизация като беше използвана човешка ОВ сонда от кДНК. При всички случаи беше наблюдавана една единична хибридизационна ивица и тази ивица беше със същата големина в YACs и в Pl клона известен, че съдържа човешкия ОВ ген (данните не са представени).

С помощта на компютърна програма SEGMAP (Green and Green, 1991, по-горе) и други базирани на YAC данни за STS-съдьржанието, които ние бяхме получили за присъствието на STS за хромозома 7 (Green et al., 1991, погоре; Green et al., 1994, по-горе, Green et al., 1995, по-горе), беше открито, че човешкият ОВ ген е разположен в YAC contig изобразен на фигура 35. По-специално, този contig се състои от 43 припокриващи се YACs и 19 уникално подредени STSs. Подробности относно всеки от 19-те StSs са дадени на таблица 3. В допълнение на ОВ-специфичния STS, контигът съдържа и един STS (sWSS808), специфичен за човешкия Рах4 ген (Tamura et al., 1994, по-горе; Stapelton et al., 1993, Nature Genet. 3:292-298), 7 STSs получени от YACs, специфични за хромозома 7,2 STS получени от хромозома 7 специфични ламбда клонове и особено важно, 8 микросателит-специфични STSs. Допълнителни подробности за тези 8 генетични маркери, включително последователностите на праймерите, използвани за генотипен анализ, са представени на таблица 2. Като забележка, има излишна, базираща се на YAC връзка, (т.е. има 2 или повече YACs всеки един свързан със съседен чифт от STSs), които силно допринасят за относителното подреждане на STSs представени на фигура 35.

Както е изобразено на фигура 35 предсказаната ориентация на човешкия ОВ-съдържащ YAC contig е такава, че sWSS1734 е STS разположен най-близо до центромерата (т.е. най-близо до CFTR), докато sWSS2367 е най-близо разположен до теломерата (т.е. най-близо до СРА). Тази ориентация се базира предимно на сравнителни данни за картиране, които поставят Рах4 проксимално, а ОВ дистално в съществуващия синтенен блок в мишата и човешката ДНК (Zhang et al., 1994, по-горе). ОВ генът се картира близо до теломерния край на contig, базирайки се на разположението на ОВ специфичния STS (SWSS2619).

Докато изобразеният на фигура 35 contig е изведен чрез SEGMAP без да са взимани предвид размерите на YAC (при което STS са представени на равни разстояния един от друг), подобен анализ на данните чрез SEGMAP, съобразен с размерите на YAC, показва, че общият размер на областта покрита от contig е точно над 2 Mb (данните не са представени). Така, докато всичките 8 от микросателит-специфични STSs (таблица 4) се съдържат в един геномен интервал, заемащ грубо 2 Mb, като най-близките до теломерния край на contig (sWSS 1392, sWSS 1148 и sWSS2367) са особено близо до самия ОВ ген (може би на един интервал от около 500 kb). В действителност, всичките 3 от последните STSs са налице в поне един от човешките ОВ-съдържащи YACs, Като забележка, интервалът между човешкия Рах4 (sWSS808) и ob (sWSS2619) е определен на около 400 kb, докато съгласно предвижданията тази област следваше да заема около 1 Mb при мишката (Zhang et al., 1994, погоре). Накрая, 3 от YACs в contig (yWSS691, yWSS999 и yWSS2935) също бяха анализирани с FISH и беше намерено, че всеки хибридизира изключително с 7q31.3. Един от тези YACs ните резултати общо са в съответствие с предишно цитогенетично определяне на човешкия Рах4 в 7q32 (Tamura et al., 1994, по-горе). Базирайки се на тези данни, човешкият ОВ ген може да бъде отнесен към цитогенетичната ивица 7q31.3. 5

Пример 11. Човешкият ОВ полипептид е биологично активен при мишки

Групи от 10 ob/ob мишки бяха третирани чрез i.p. инжектиране с 10 gg/g/flHeBHO рекомбинантен (бактериален) човешки и миши ОВ по- 10 липептид или с физиологичен разтвор. След четири дни групата, получавала физиологичен разтвор, бе наддала 0.3 g. Групата, получавала миши ОВ, е загубила 3.2 g. Групата, получавала човешки ОВ, бе загубила 2 g (р<.01 в сравнение с контролите с физиологичен разтвор). Тези групи бяха тестирани и за приемане на храна. Данните за приемане на храна са представени на таблица 5; данните за телесното тегло са представени на таблица 6.

Таблица 5

Дневен прием на храна (g) от третирани ob/ob мишки Сстойностстанд. откл.5

Трет арове	Деа О	Деа 1	Деа 2	Деа 3	Дек 4 Деа 3 Деа d	Деа 7
·»». р-р	13. 4 -2. «3	12. а	12. В	13. 1	14. О 12. 3 12. 4 В.	. 9
наш ов	14. Р	3. 7	4. 4	9. 1	В. 9 8. 1 8. 7	9. 5
чоаевпсм ов	14. 3	1О. 3	8. 7	7. О	8. Р 3. 3 3. 8	13. о

Таблица б

Телесно тегло и промени на теглото при третирани ob/ob мишки Сстойност - станд.отклЗ

Третроае	Тел.тегло <дем о)	Тел.тегло <Дем 4>	Процеат аро.жма <Деа о	Тел. тегло Процевт
(Дом Р> 4>	Проаяао. <Деа o-d>
•»s . р-р	39. 9-1. 8	40. ?-1. 9	О. 8-0. 5	41. 1-2. 2	1. 2-1. 1
вакса ОВ	♦ зр. 5-г. ι	3<S. 2*2. О	♦ -а. з-ι. ζ	3d. 3—2. 2	-3. 1-1. 2
човешки 03	♦ ЗР. 5*2. О	37. 0^1. 7	-2. 0-1. О	3d. i-ι. з	-3. 5-1. 3

Тези данни показват, че човешкият ОВ е биологично активен при мишки.

Пример 12. Единична висока доза ОВ повлиява мишки див тип

Мишки див тип (С5 7В16 J +/?) бяха трети рани с 10 gg/g/weBHO i.p. рекомбинантен миши ОВ и всеки четвърти ден беше измервано телесното тегло. Резултатите са представени на таблица 7.

Таблица 7

Телесна маса CgJ на нормални мишки, които са получавали ОВ
Третарове	Деа Ο Деа 4	Деа е	Де·	12 деа id
	22. 0—1. 4 22. 2-1. 2	* 22. 5-1. 9	29	22. 5
Маша ов	22. 4-1. 5 20. 5	•к....... 20. 6-1- 9	го. а	21.

Тези данни демонстрират, че ОВ повлиява телесната маса на мишки див тип както и тлъсти (ob/ob) мишки, макар и в по-малка степен.

Пример 13. ОВ полипептид въведен с продължителна инфузия с помпа

Този пример демонстрира, че продължителната инфузия на ОВ полипептида води до загуба на тегло при нормални мишки. На нормални (не тлъсти) мишки мишият ob полипептид е въвеждан с помощта на инфузия с осмотична помпа. Дозировка от 0.5 mg белтьк/kg телесно тегло/дневно води до загуба от 4,2% (+/-1.34%) от изходното тегло на 6-ия ден от инфузията.

Материали и методи

Животни

В този пример са използвани мишки див тип (+/+) С57В16. Мишките бяха отглеждани поединично в клетка и бяха при нормални условия. В началната точка на експеримента, мишките бяха 8-седмични със стабилизирано тегло. Десет мишки бяха използвани за всяка група (вехикулум срещу белтък).

Измерване приемането на храна и на телесното тегло

На мишките бе давана основна храна за гризачи (PMI Feeds, Inc.) в хранилки за праховидна храна (Allentown Caging and Equipment), което позволяваше по-точно и по-чувствително измерване количеството на поетата храна отколкото при използване на обикновени блокчета храна. Теглото беше измервано по едно и също време всеки ден (2:00 р.т.) за един период от 6 дни. Телесното тегло в деня преди инфузията беше определено като изходно тегло.

Клониране на миша ОВ ДНК

Клонирането на миша ОВ ДНК за експресия в Е. coli беше осъществено както следва. ДНК последователността, изведена въз основа на публикуваната пептидна последователност, представена в (Zhang et al., 1994, по-горе, т.е. пример 1, по-горе) беше транслирана обратно като бяха използвани кодони оптимални за Е. coli. Крайните клониращи места бяха Xbal до BamHI. Преди кодиращата област бяха включени енхенсер за свързвани с рибозомата и едно силно рибозомно-свързващо място. Двойноверижната ДНК последователност беше синтезирана с помощта на стандартни техники. Коректността на клоновете беше потвърдена като беше доказана експресията на рекомбинантния белтък и наличието на правилна OB-ДНК последователност в присъстващия плазмид. Аминокиселинната последователност (и съответната ДНК последователност) са както следва:

Рекомбинантна миша met ОВ (двойноверижна) ДНК и аминокиселинна последователност. (SEQ ID NO: 94 и 95):

TCTAGATTTGAGTTTTAACTrTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT .+- ------ ..4......-.--+---..-.--+------.-- + --- ...---+-------- 68

AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA

Μ V Ρ I Q K V TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGtOTATCAACGACATCAGTCA

6Β -+---------+---------+---------+---------+---------+-------- 128 Аетсс1хк1хл«птпхк5ААтгААТГ1ТОС1аа<^т(юсхат.Аотгаст^^

QDDTKTLIKTIVTRINDISHCACCCASTCGOTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCQGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA

129 -+-..-.----+--.------+--------.+---------+-----.---+-------- 188 GTGGGTCAGCCAQAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAQACGT

TQSVSAKQRVTGLDFI P G I> H CCCGATCCTAAGCTTtHXXAAAATGGACCAGACCCTGGCrGlAI^CJ^CAGCTGTTAAC

GGGCTAGGATTCGAACAGGTTrTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAAITG

PILSbSKMDQTLAVYQQVbTCTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAfiAACCTTCGCGACCT

249 -+--.------+----..---+-.---jQg

GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCrGGA

SLP SQNVLQIAHDLBNLRDL .

GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGAjCCTCAGGTCITCAGAA

309 - +.........+.........+.........+.........♦.........+........ 368

CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGqCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT

LHLLAFSKSCSLPQTSGLQK10

369 428

TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGQCTTCAACAACGAGA

P E S LDGVL EASLYSTEVVAL·GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTGAGGACATCCTTCACCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG

429 ........... *.........+.........+.........*........488

CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC SRLQGSLQDILQQLDVSPBCTTAATGGATCC

489 ............

AATTACCTAGG

Експресионен вектор и щам гостоприемник

Използваният плазмиден експресионен вектор за получаване на белтък беше pCFM1656, American Type Culture Collection (АТСС) Accession No. 69576. Горната ДНК (SEQ ID NO: 94) беше лигирана в експресионния вектор pCFM1656, който беше линеаризиран с Xbal и BamHI, и трансформиран в Е. coli щам гостоприемник, FM5. Е. coli FM5 клетките бяха получени от Amagen Inc., Thousand Oaks, СА от Е. coli К-12 щам [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976)]. Те съдържат интегрирания репресорен ген на ламбда фага, cl₈₅₇ [Sussman et al., C.R. Acad. Sci„ 254: 1517-1579 (1962)]. Получаването на вектора, клетъчната трансформация и селекцията на колонии бяха извършени със стандартни методи напр. Sambrook et al., 1989, по-горе. Клетките гостоприемници бяха култивирани в LB среда.

Въвеждане на белтък или вехикулум

За тези експерименти е използван рекомбинантен миши ОВ полипептид, общо при концентрация от около 0.9 mg/ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор, pH 7.4. Използваната аминокиселинна последователност (и ДНК последователност) са представени непосредствено по-горе. Белтъкът или вехикулумът (фос фатно буфериран физиологичен разтвор, pH 7.4) бяха въведени чрез инфузия с осмотична помпа. Осмотични минипомпи Alzet (Alza, Palo Alto, СА, model no. 1007D) бяха поставени оперативно на всяка мишка в един подкожен джоб в областта под лопатката. Помпите бяха калибрирани така, че да въвеждат 0.5 ml белтък в разтвор на час за една дозировка от 0.5 mg белтък/kg тегло/ден. Контролните животни бяха инфузирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (pH 7.4) с помощта на осмотична минипомпа Alzet

Ферментационен процес. За получаване на. белтъка беше приложен един триетапен ферментационен протокол, известен като процес на хранителната партида. Съставът на средите е представен по-долу.

Партида. Един източник на азот и на фосфат беше стерилизиран (чрез повишаване на температурата до 122°С за 35 min, 18-20 psi) във ферментационния съд (Biolafitte, капацитет 121). След охлаждане, стерилно бяха добавяни източници на въглерод, магнезий, витамини и микроелементи. Във ферментора бе добавена нощна култура (18 h или повече) от описаните по-горе бактерии-продуценти на рекомбинантен белтък (500 ml култура в LB-бульон).

Хранителна добавка I. След достигане на оптическа плътност между 4.0-6.0 OD^ към културите бе поставяна хранителна добавка I. Глюкозата бе добавяна до ограничено ниво с цел да се контролира скоростта на растеж (μ). Автоматизирана система (наречена Distributive Control System) беше програмирана да контролира скоростта на растеж при 0.15 генерации на час'¹.

Хранителна добавка П. Когато оптическата плътност OD достигне 30 OD₂₆₀, температурата беше леко повишавана до 42°С и хранителната добавка беше заменяна с хранителна добавка II, описана по-долу. След това беше оставяна ферментацията да протича за 10 h, като бяха взима5 ни проби на всеки 2 h. След 10 h, съдържанието на ферментатора беше охлаждано до под 20°С и събирано чрез центрофугиране.

Състав на средите:

Начална партида:

Хранителна добавка I

Хранителна добавка II

10 g/Ι екстракт от дрожди
5,25 g/1	(NH4)SO4
3,5 g/1	κ,ηρο.
4.0 g/1	KHjPO,
5,0 g/1	глюкоза
1,0 g/1	MgSO4 ♦ 7H2O
2,0ml/l	разтвор на витамини
2,0ml/l	разтвор на микроелементи
l,0ml/l	Р2000 Antifoam
50 g/1	Бакто-триптон
50 g/1	екстракт от дрожди
450 g/1	глюкоза
8,75 g/1	MgSO/HjO
10ml/l	разтвор на витамини
10ml/l	разтвор на микроелементи
200 g/1	Бакто-триптон
100 g/1	екстракт от дрожди
110g/l	глюкоза

Разтвор на витамини (Опаковка, Хранителна добавка I): 0.5 g биотин, 0.4 g фолиева кна и 4.2 g рибофлавин бяха разтворени в 450 ml Н₂О и 3 ml 10N NaOH и доведени до обем 500 ml с Н₂О. 14 g пиридоксин-HCl и 61 g ниацин бяха разтворени в 150 ml и 50 ml 1 ON NaOH и доведени до обем 250 ml с HjO. 54 g пантотенова к-на бяха разтворени в 200 ml HjO и доведени до обем 250 ml. Трите разтвора бяха обединени и доведени до краен общ обем 101.

Разтвор на микроелементи. (Изходна партида Хранителна добавка I):

Ферихлорид (FeCl₃.6HjO): 27 g/1

Цинков хлорид (ZnCl₂.4H₂O): 2 g/1 Кобалтов хлорид (CoCl^HjO): 2 g/1 Натриев молибдат (NaMoO₄.2H₂O): 2 g/1 Калциев хлорид (CaCl₂.2HjO): 1 g/1 Меден сулфат (CuSO₄.5H₂O): 1.9 g/1

Борна к-на (Н₃ВО₃): 0.5 g/1

Манганов хлорид (МпС1₂.4Н₂О): 1.6 g/1 Натриев цитрат дихидрат: 73.5 g/1

Процес на пречистване на мишия ОВ полипептид

Пречистването беше извършено на следните етапи (ако не е специално указано, следващите етапи са извършени при 4°С):

1. Клетъчна паста. Клетъчната маса от Е. coli беше суспендирана в 5-кратен обем на 7 mM EDTA, pH 7.0. Клетките в разтвора на EDTA бяха по-нататък разрушени чрез двукратно прекарване през микрофлуидизатор. Разрушените клетки бяха центрофугирани при 4200 об/min за 1 h в Beckman JB-6 центрофуга с J5-4.2 ротор.

2. Промиване на включващите телца #1. Супернатантата от по-горе беше отстранена и утайката беше ресуспендирана с 5-кратен обем mM EDTA, pH 7.0 и хомогенизирана. Тази смес беше центрофугирана както при етап 1.

3. Промиване на включващите телца #2. Супернатантата от по-горе беше отстранена и утайката беше ресуспендирана в 10-кратен обем от 20 mM Tris, pH 8.5, 10 тМ DTT и 1% деоксихолат и хомогенизирана. Сместа беше центрофугирана, както при етап 1.

4. Промиване на включващите телца #3. Супернатантата от по-горе беше отстранена и утайката беше ресуспендирана в 10-кратен обем на дестилирана вода и хомогенизирана. Тази смес беше центрофугирана както при етап 1.

5. Повторно нагъване (ренатуриране). Утайката беше нагъната повторно с 15 обема 10 mM HEPES, pH 8.5, 1% натриев саркозин (Nlauryl sarcosine) на стайна температура. След 60 min разтворът беше доведен до 60 тМ меден сулфат и след това беше разбъркван за една нощ.

6. Отстраняване на саркозина. Повторно нагънатата смес беше разредена с 5 обема 10 mM Tris буфер, pH 7.5 и центрофугирана както в т.1. Супернатантата беше събрана и смесена при разклащане за 1 h с Dowex 1 -х4,20-50 mesh, хлоридна форма (до 0.066% общ обем на разредената повторно нагъната смес). Тази смес бе-

Загуба на тег ше нанесена на колона и елюатът беше събран. Отстраняването на саркозина беше потвърдено cHPLC.

7. Киселинно утаяване. Елюатът от предишния етап беше събран, pH беше доведено до pH 5.5 и инкубиран за 30 min на стайна температура. Тази смес беше центрофугирана, както в т.1.

8. Катионообменна хроматография. pH на супернатантата от предишния етап беше нагласено до pH 4.2 и тя беше нанесена на СМ Sepharose Fast Flow. Двадесет обема на колоната от солевия градиент бяха използвани при 20 mM NaOAC, pH 4.2, 0,0 М до 1.0 М NaCl.

9. HIC хроматография. Обединените фракции от пика след CM Sepharose (определени с ултравиолетов анализ) от предишния етап бяха доведени до 0.2 М амониев сулфат. Напразен беше един обратен солеви градиент равен на 20 обема на колоната при 5 mM NaOAc, pH 4.2 с 0.4 М до 0,0 М амониев сулфат. Този материал беше концентриран и диафилтруван в PBS.

Резултати

Представените по-долу разлики са процент (%) от изходното тегло при C57B16J мишки (8седмични).

при постоянна инфузия ар* мм iarri дмм ι-ζ

Дии 3“<

Лмм 5-<5

Вмхмкулуи <P8S>

8. Z41. 18

4. 8 ♦Z-. 97

4. 04 *Z-. 90

Рмк оя 0rnoxt«r ов иоляпоптвд

1, 0β 1. 4

-2. 12 *Ζ- . 79

-4. 02 *Ζ- 1. 3

Както се вижда, в края на режима, на 6дневна постоянна инфузия, животните получавали ОВ полипептид загубват повече от 4% от телесното си тегло в сравнение с изходното. Това е значително по-бърза загуба на тегло, отколкото бе наблюдавана при i.p. инжектираните. Наблюдавана беше загуба на теглото от само 2.63.0% на края на 32-дневния инжекционен период при див тип мишки с ежедневни i.p. инжек45 ции на рекомбинантен миши ОВ полипептид при доза 10 mg/kg. Загуба повече от 4% не бе наблюдавана, по което и да е време на схемата на третиране (данните не са представени). Представените данни показват, че с постоянна инфузия, 20-кратно по-ниска дозировка (0.5 mg/kg вместо 10 mg/kg) постига по-голяма загуба на тегло за един по-къс период от време.

Представените резултати са статистичес ки достоверни, напр. -4.62% с р<.0001.

Пример 14. Клониране и експресия на един рекомбинантен човешки ОВ полипептиден аналог

Този пример предоставя компоненти и методи за получаване на една аналогична рекомбинантна човешка версия на ОВ полипептид.

Човешката версия на ОВ ДНК беше конструирана от мишата ОВ ДНК както в пример 13, по-горе, чрез заместване на областта между Mlul и BamHI местата с двойноверижна ДНК (изградена от синтетични олигонуклеотиди), в която са предвидени 20 замествания на кодони. Кодоните за аргинин в позиция 35 и за левцин в позиция 74 при зрялата миша матрица не бяха 5 променени. Mlul мястото е показано под плътната линия в последователността по-долу. Тази ДНК беше включена в pCFM 1656 вектор (АТСС Accession No. 69576) по същия начин както при рекомбинантния миши белтък както е описано 10 по-горе.

Рекомбинантна човешка met ОВ ДНК (двойноверижна) и аминокиселинна последователност на човешки ОВ полипептид (SEQ ID NOS: 96 и 97)

CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT

- .- . ... . - + - -----.--+- ...-...-+..---. 60

GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAQTCCTGCTGTGGTTTTGGAA.TTAATTTTGCTAGCAA

MVPIQKVQODTKTblKTIV

ACOCGTATCAACGACATCAffrCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC

61.........+--- ......+ ..-.-..--+.-----..-+--..-.--.+ 120

TGCGCATAGTTGCTGTA3TCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCQ

TRISDISHTQSVSSKQRVTG

121-----.---+-.--—.-+---- — ....... iao

GACCTGAASTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC LDFIpaLHP ILTLSKMDQTL· GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC

181 .............................+.......-· +......... 240

CGACATATGGTCGTCIAGAATTGGAGQTACGGCAGGGCAirrGCAAGAAGTCTAGAGJaTG

AVYQQILTSMPSRNVLQISN GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG

241 ........- +------..- + ....-...-+-.-....-- + --.------+--..-...-+ 3QQ

CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC DLBNLRDLLHVLAFSKSCHL CCATGGGCTTCAGGTCrrGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT

301--------- +-----..--+.- -.--+.. -._-+-.-... +-.-------+ 360

GOTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGT»GGCCA

PWASGLSTLDSLGGVLBASG TACAGOCCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG

361 --------·+---------+---------+---------+---------+-------.-+ 420

YSTBVVALSRLQGSLQD MLW

CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC

421......... + ---- 454

GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG

QLDLSPGC*

Ферментация

Ферментацията на горепосочените клетки гостоприемници продуценти на рекомбинантен човешки ОВ полипептид беше проведена при условия и компоненти, както е описано по-горе, за рекомбинантния миши материал. Резултатите са анализирани за добив (g/Ι) на предварително пречистен рекомбинантен човешки ОВ материал (и малки количества бактериален белтък) и са съпоставени за анализиране на бактериалната 5 експресия.

Таблица 9

Анализ на експресията на човешкия ОВ полипептид

П«рмод ОТ WfXNt·	OD <4 βοοηπ»	Aodui <gZL>	<mgZOI>*b>
Инд. +	гчоса.	4?	1. 91	41
Инд. *	4 часа	7»	9. 48	120
Ижд. *	а часа	PS	13. О1	187
ИМЛ. *	В часа	94	13. 24	141
Имл. *	1О часа	яе	14. <30	149

Пречистване на рекомбинантен човешки ob полипептид

Рекомбинантният човешки белтък може да бъде пречистен с методи, подобни на тези използвани за пречистване на рекомбинантния миши белтък, както е в пример 13, по-горе. За получаване на рекомбинантен човешки ОВ полепептид, етап 8 беше извършен, като pH на супернатантата от етап 7 беше нагласено на pH 5.0 и тя беше нанесена на бързо протичаща СМ Sepharose колона. Пропуснат е 20 обема на колоната солеви градиент в 20 mM NaOAC, pH 5.5, ОМ до 0.5 М NaCl. Етап 9 беше изпълнен, като CM Sepharose пул беше разреден 4-кратно с вода и pH беше доведено до 7.5. Тази смес беше доведена до 0,7 М амониев сулфат. Проведен бе обратен солеви градиент с 20 обема на колоната 5 mM NaOAc, pH 5.5, 0.2 М до 0.0 М амониев сулфат. Другите етапи бяха идентични.

Пример 15. Проучвания на доза зависимост

Едно допълнително проучване показа, че има доза зависимост при постоянното въвеждане на ОВ белтък. При това изследване на мишки (незатлъстели див тип, CD-1 мишки, с тегло 3540 g) е въвеждан рекомбинантен миши ОВ белтък с помощта на методи, подобни на тези в пример 12 и 13. Резултатите бяха както следва (% загуба на телесно тегло спрямо изходното, измервано както е описано по-горе).

Таблица 10: Доза зависимост при постоянно въвеждане
	Доза	Време	Ά намаление на телесното тегло
0.03	mg/kg/e”®®”0	Ден е	3.5 Н
1	mg/ug/дневно	Ден 2	7.5 %
1	ag/kg/дневно	Ден 4	14 У.

Както се вижда, увеличението на дозата от 0,03 mg/kg/дневно на 1 mg/kg/дневно повишава загубата на телесно тегло от 3,5 до 7,5%. Трябва също да се отбележи, че на 4-ия ден дозата от 1 mg/kg/дневно води до 14% намаление на телесното тегло.

Пример 16. Ефекти на лептин върху телесния състав на ob/ob мишки

C57B1/6J ob/ob 16-седмични мишки бяха третирани с 5 gg/g/zmeBHO миши лептин, с вехикулум или не бяха третирани в продължение на 33 дни. В един втори експеримент, 7-седмични ob/ob мишки бяха третирани с 10 pg/g/jmeBHO 5 човешки лептин, миши лептин или вехикулум за 12 дни. Мишките бяха убивани и бяха измервани телесното тегло, телесния състав, нивото на инсулин и глюкоза. Данните от тези експерименти са представени на таблица 11.

Данните за телесния състав демонстрират ефект на лептин на три компартмента на тялото: количество на мазнините, количество на мършавата телесна маса и водна маса. Данните показват, че лептинът значително намалява телесните 5 мазнини и има ограничен ефект върху постната телесна маса. Обаче ефектите на постната телесна маса не бяха статистически достоверни.

Сравнението на нивата на инсулин и глюкоза при третираните с лептин и контролните (нетретирани) мишки показват, че лептинът намалява нивата на кръвната захар и на инсулин и по този начин подобрява показателите при диабет.

Пример 17. Ефект на високи дози лептин върху мишки див тип

Мършави контроли от ob/ob (С57В1/6J +/?) бяха инжектирани един път дневно i.p. с 10 pg/g миши лептин или вехикулум (PBS). Телесното тегло и приемането на храна бяха измервани през следващите две седмици. Установено е значително намаление на телесното тегло от 4-ия ден нататък и значително намаление на приемането на храна през първата седмица. След една седмица обаче, нивата на приемането на храна стават неразличими при двете групи мишки. Животните бяха убивани на края на втората седмица и бе определян телесният състав. Резултатите от анализа на телесния състав са представени на таблица 12. Данните показват намаление на телесните мазнини на животните, получаващи лептин в сравнение с животните, получаващи PBS.

Телесен състав и телесно тегло на мишки див тип C+ZT3

* § tn	d* - σ*' г* ο* ό οβ а чз с»	* 5 n . <rt 5 «	— oe^rooeoejo	5s Λ 09 S ri
еооооооооо Ог^ооспспспоофот ci ri U гч c4 — d — - 6	s; — O	OQCOOOOOOO vi *· (Ν η « Φ »H $ n N0-~~Or<-U(4	s s — o
ПОСТНА ТЕЛЕСНА МАСА * |	<noo>t^Qva<nooo> O' e — O 00 oo <4 oo'dooooooviMrfM C4fM(SPIf4(N<Mn(4	£* o r· U	********* ootnosN«4«rt*eoe Vir-V1/I»1(4 0 0;>0 'dviiririvi'd'ori'd NrtNriNNMfNN	* * Й 2 a-
Ο— ΌΌ'Λ^Γί-Γ* ΟνΓ-’-ΦοΟ^ΠΌ	« 8 e d	Ом--»ЛТГ(Ч*(Ч 01П\С\ОГ^«ПОО\Г<·	rf o
МАЗНИНА %	*****£*** — ~ “ -Ч- СЧ J2	UR « IN o *n <X ”T		«* δ g 2 Ή
O О''*'*5'ОГ'О'П ηηηοονίΛΜΜΜ ONoddciddo	88 o d	Or-'O'O'O'OOOOM M - N и O. ri 7®. — сч ei tn ri — — » rf	SB (4 —
ТЕЛЕСНО ТЕГЛО	СПи1ОчГ>Г^С*;Г*^*ПО; Ь cj 4) « Г Ю Ki 42 4J	(Π φ r* ~	Ю \O Ο Ό Ю η η r* η «r*oddooi^ddr*d	~ 1 09 I
C57B1/6J	-ΝΠ'ίνΐ'ΟΓ'οοσ»® •	i* 4 8 u	—•ΠΠΊ-'η'βΡ'ΟΟΟ'Ο	Sb «< 1 1 u 1
< с 33 а.	X A h 4 Φ Ш	κ λ X φ tn

Друг експеримент показа ефектите на i.p. инжектиране два пъти дневно на 12,5 g/g миши лептин на С57В1/6J мишки див тип. Има значително намаление на телесното тегло и приемането на храна, свързани с двукратно дневно инжектиране на полипептида. За този експеримент животните бяха поставени в метаболитни камери. Храната представляваше стрита Purina #5001 диета. Тази диета се различава от по-предишни експерименти, при които използваната диета се състоеше от хранителна диета, тапиока и вода. Така храната, използвана в метаболитните камери, имаше по-високо калорично съдържание, което обяснява защо количеството консумирана храна се различава от това при животните на водосъдържаща диета.

Следва, лист на цитатите, свързани с представеното по-горе и специално с експерименталните процедури и обсъжданията.

Bahary et al., Genomics, 11:33-47 (1991)

Bahary et al., Genomics, 13:761-769 (1992) Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991)

Blank et al., Mammalian Genome, 1 :s51 -s78 (1991)

Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100-115 (1991)

Friedman et al., Mammalian Genome, 1:130144 (1991)

Harris, Faseb J., 4:3310-3318 (1990)

Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315:96100 (1986)

Kessey, in Obesity, pp. 144-166, Stunkard ed., Philadelphia, W.B. Sauders Co. (1980)

Kessy et al., Ann. Rev. Psychol., 37: 109133.22 (1986)

Leibel et al., “Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity”, in Genetic Variation and Nutrition, pp. 90-101.1, Simopoulos and Childs eds., S. Krager, Basel (1990)

Siegel etal., Cytogenet. Cell Genet. 61 (30): 184-185 (1992)

Това изобретение може да бъде изпълнено в други форми или да бъде проведено по друг начин, без да се изхожда от принципите или същностните му характеристики. То следователно трябва да се разглежда във всичките си аспекти като илюстративно, а не ограничаващо, като обхватът на изобретението е указан в приложените претенции и всички промени, които попадат в смисъла и обсега на съответствие следва да бъдат включени в него.

В това описание са цитирани различни съобщения, всяко от които е включено тук с пълни библиографски данни.

Изобретението, съгласно претенциите, е разрешено в съответствие с горната спецификация и утвърдено с леснодостъпни указания и изходни материали. Независимо от това, заявителите са направили на 9 август 1995 г. следните депозити в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 208521178, USA в съответствие c предписанията на Будапещенския договор за международно признаване на депозита на микроорганизми за целите на патентната процедура: Е. coli Н14 съдържащ плазмид рЕТН14, ключов номер 69880; и Е. coli М9 съдържащ плазмид рЕТМ9, ключов номер 69879.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА

С1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛ: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: МОДУЛАТОРИ НА ТЕЛЕСНОТО ТЕГЛО, СЪОТВЕТНИТЕ НУКЛЕИНОВИ КИСЕЛИНИ И ПРОТЕИНИ И ТЯХНОТО ПРИЛОЖЕНИЕ В ДИАГНОСТИКАТА И ТЕРАПИЯТА (iii) НОМЕР НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 99 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕСАНТ: Klauber & Jackson (B) УЛИЦА: 411 Hackensack Avenue <С) ГРАД-. Hackensack (0) ШАТ: New Jersey (E) СТРАНА: USA (F) КОД: 07601 (V) ФОРМА ЗА ЧЕТЕНЕ НА КОМПЮГЕР:

(A) СРЕДЕН ТИП: Floppy disk (B) КОМПЮГЕР: IBM PC compatible (C) ОПЕРИРАЩА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) СОФТУЕР: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (vi) ДАННИ ЗА СЕГАШНАТА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА:

(B) ДАТА НА ПРЕДСТАВЯНЕ:

(C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ДАННИ ЗА ПРЕДШЕСТВУВАЩА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/483,211 (B) ДАТА НА ПРЕДСТАВЯНЕ: 7 юни 1995 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ (vii) ДАННИ ЗА ПРЕДШЕСТВУВАЩА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/438,431 (B) ДАТА НА ПРЕДСТАВЯНЕ: 1О май 1995 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(Vii) ДАННИ ЗА ПРЕДШЕСТВУВАЩА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/347,563 (B) ДАТА НА ПРЕДСТАВЯНЕ: 30 ноември 1994 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ДАННИ ЗА ПРЕДШЕСТВУВАЩА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/292,345 (B) ДАТА НА ПРЕДСТАВЯНЕ: 17 август 1994 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(viii) АДВОКАТ/АГЕНТ ИНФОРМАЦИЯ:

(А) ИМЕ: Jackson Esq., David A.

ςβ) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 26,742 (С) НОМЕР ЗА СПРАВКА/СПИСЪК: 600-1-087 РСТ (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: 201 487-5800 (B) ТЕЛЕФАКС: 201 343-1684 (C) ТЕЛЕКС: 133521

С23 Информация за SEQ ID N0:1:

(i) Характеристика на последователността:

< А) Дължина: 2793 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК СгеномнаЗ (А) Описание: миша оЬ кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (vi) Източник:

(А) Организъм: Мишка (ix) Особености:

(A) Наименование/ключ : CDS (B) Локалиация: 57..560 (xi) Описание на последователностите: SEQ ID N0:1:

GGATCCCTGC TCCAGCAGCT' GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA 56

ATG Met 1

TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT

TGG Trp

TCC Ser

TAT Tyr 15

CTG Leu

104

Cys Trp

Arg Pro 5

Leu Cys

Arg

Phe

Leu 10

Trp

Leu

ТСТ

TAT

GTT

CAA

GCA

GTG

CCT

ATC

CAG

AAA

GTC

CAG

GAT

GAC

ACC

AAA

152

Ser

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

Xie

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

20

25

30

ACC

CTC

ATC

AAG

ACC

ATT

GTC

ACC

AGG

ATC

AAT

GAC

ATT

TCA

CAC

ACG

200

Thr

Leu

lie

Lys

Thr

Xie

Val

Thr

Arg

Xie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

35

40

45

CAG

TCG

GTA

TCC

GCC

AAG

CAG

AGG

GTC

ACT

GGC

TTG

GAC

TTC

ATT

CCT

248

Gin

Ser

Val

Ser

Ala

Lye

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

50

55

60

GGG

CTT

CAC

CCC

ATT

CTG

AGT

TTG

TCC

AAG

ATG

GAC

CAG

ACT

CTG

GCA

296

Gly

Leu

His

Pro

lie

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

£5

70

75

80

GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344

Val Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin

90 95

ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC392

He Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu LeuAla

100 105HO

TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA440

Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin LysPro

115 - 120125

GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG488

Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr GluVal

130 135140

GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG536

Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu GinGin

145 150 155160

TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA588

Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys *

165

ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC648

ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA708

CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG766

AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG828

TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA888

GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA948

GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT1008

TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT CAGGCTTTGG1068

GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT СААТССТАТГ GATGGGTCTG1128

CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG1188

TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG1248

ACTCTATCCA AACACGTITO CAQCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA1308

AGCAGATGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG1368

TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT1428

TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG1488

ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA1548

AAGCTACAGG	CCTTTTGTTG	GCATATTGCT	GAGCTCAGGG	AGTGAGGGCC	CCACATTTGA	1608
GACAGTGAGC	CCCAAGAAAA	GGGTCCCTGG	TGTAGATCTC	CAAGGTTGTC	CAGGGTTGAT	1668
CTCACAATGC	GTTTCTTAAG	CAGGTAGACG	TTTGCATGCC	AATATGTGGT	TCTCATCTGA	1728
TTGGTTCATC	CAAAGTAGAA	CCCTGTCTCC	CACCCATTCT	GTGGGGAGTT	TTGTTCCAGT	1788
GGGAATGAGA	AATCACTTAG	CAGATGGTCC	TGAGCCCTGG	GCCAGCACTG	CTGAGGAAGT	1848
GCCAGGGCCC	CAGGCCAGGC	TCCCAGAATT	GCCCTTCGGG	CTGGAGGATG	AACAAAGGGG	1908
CTTGGGTTTT	ТССДТСАССС	CTGCACCCTA	TGTCACCATC	AAACTGGGGG	GCAGATCAGT	1968
GAGAGGACAC	TTGATGGAAA	GCAATACACT	TTAAGACTGA	GCACAGTTTC	GTGCTCAGCT	2028
CTGTCTGGTG	CTGTGAGCTA	GAGAAGCTCA	CCACATACAT	ATAAAAATCA	GAGGCTCATG	20B8
TCCCTGTGGT	TAGACCCTAC	TCGCGGCGGT	GTACTCCACC	ACAGCAGCAC	CGCACCGCTG	2148
iAAGTACAGT	GCTGTCTTCA	ACAGGTGTGA	AAGAACCTGA	GCTGAGGGTG	ACAGTGCCCA	2208
GGGGAACCCT	GCTTGCAGTC	TATTGCATTT	ACATACCGCA	TTTCAGGGCA	CATTAGCATC	2268
CACTCCTATG	GTAGCACACT	GTTGACAATA	GGACAAGGGA	TAGGGGTTGA	CTATCCCTTA	2328
TCCAAAATGC	TTGGGACTAG	AAGAGTTTTC	GATTTTAGAG	TCTTTTCAGG	CATAGGTATA	2388
TTTGAGTATA	TATAAAATGA	GATATCTTGG	GGATGGGGCC	CAAGTATAAA	CATGAAGTTC	2448
АТТТАТАТГТ	CATAATACCG	TATAGACACT	GCTTGAAGTG	TAGTTTTATA	CAGTGTTTTA	2508
AATAACGTTG	TATGCATGAA	AGACGTTTTT	ACAGCATGAA	CCTGTCTACT	CATGCCAGCA	2568
CTCAAAAACC	TTGGGGTTTT	GGAGCAGTTT	GGATCTTGGG	TTTTCTGTTA	agagatggtt	2628
AGCTTATACC	TAAAACCATA	ATGGCAAACA	GGCTGCAGGA	CCAGACTGGA	TCCTCAGCCC	2688
TGAAGTGTGC	CCTTCCAGCC	AGGTCATACC	CTGTGGAGGT	GAGCGGGATC	AGGTTTTGTG	2748
GTGCTAAGAG	AGGAGTTGGA	GGTAGATTTT	GGAGGATCTG	AGGGC		2793

(2) Информация за SEQ ID N0:2;

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 168 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: Линейна (ii) Молекулен тип: протеин (А) Описание: Миши оЬ полипептид (χί) Описание на последователността; SEQ ID NO: 2:

Mee Cys 1

Trp Arg

Pro Leu Cya Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu

S

10

15

Ser

Tyr

val

Gin 20

Ala

Val

Pro

lie

Gin 25

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

lie 3S

Lys

Thr

Zle

Val

Thr 40

Arg

Xie

Asn

Asp

Xie 45

Ser

His

Thr

Gin

Ser SO

Val

Ser

Ala

Lys

Gin 55

Arg

Val

Thr

Gly

Leu 60

Asp

Phe

Xie

Pro

Gly 65

Leu

Hia

Pro

He

Leu 70

Ser

Leu

Ser

Lys

Mee 75

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala 80

Val

Tyr

Gin

Gin

Val 85

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro 90

Ser

Gin

Asn

Val

Leu 95

Gin

Xie

Ala

Asn

Asp 100

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 105

Asp

Leu

Leu

His

Leu 110

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys 115

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro 120

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu 125

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser 130

Leu

Asp

Gly

Val

Leu 135

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr 140

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Xie

Leu

Gin

Gin

145	150	155	160
Leu Asp Val Ser Pro	Glu Cys *
165	•

(2) Информация за SEQ ID N0:3

(i)	Характеристика на последователността : (A) Дължина: 700 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: кДНК (А) Описание: Човешка ob кДНК където N представлява
който и да	е нуклеотид
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек

(IX) Особености :

<A) Ипе/ключ: CDS < В) Локализация : 46 . . . 546 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0: 3:

NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG Met His Trp 1

GGA Gly

ACC CTG TGC

GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT

TTC TAT GTC

102

Thr 5

Leu Cys

Gly

Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr

Leu

Phe

Tyr Val

10

15

CAA

GCT

GTG

CCC

ATC

CAA

AAA

GTC

CAA

GAT

GAC

ACC

AAA

ACC

CTC

ATC

150

Gin

Ala

Val

Pro

Xie

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

He

20

25

30

35

AAG

ACA

ATT

GTC

ACC

AGG

ATC

AAT

GAC

ATT

TCA

CAC

ACG

CAG

TCA

GTC

198

Lys

Thr

Xie

Val

Thr

Arg

Xie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

40

45

50

TCC

TCC

AAA

CAG

AAA

GTC

ACC

GGT

TTG

GAC

TTC

ATT

CCT

GGG

CTC

CAC

246

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

Gly

Leu

His

55

60

65

CCC

ATC

CTG

ACC

TTA

TCC

AAG

ATG

GAC

CAG

ACA

CTG

GCA

GTC

TAC

CAA

294

Pro

Xie

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

70

75

80

CAG

ATC

CTC

ACC

AGT

ATG

CCT

TCC

AGA

AAC

GTG

ATC

CAA

ATA

TCC

AAC

342

Gin

Xie

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Xie

Gin

Xie

Ser

Asn

85

90

95

GAC

CTG

GAG

AAC

CTC

CGG

GAT

CTT

CTT

CAC

GTG

CTG

GCC

TTC

TCT

AAG

390

Asp

Leu

Glu

Asn

I*eu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

100

105

110

115

AGC

TGC

CAC

TTG

CCC

TGG

GCC

AGT

GGC

CTG

GAG

ACC

TTG

GAC

AGC

CTG

438

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

120

125

130

GGG

GGT

GTC

CTG

GAA

GCT

TCA

GGC

TAC

TCC

ACA

GAG

GTG

GTG

GCC

CTG

486

Gly Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

135

140

145

AGC

AGG

CTG

CAG

GGG

TCT

CTG

CAG

GAC

ATG

CTG

TGG

CAG

CTG

GAC

CTC

534

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

150

155

160

AGC CCT GGG TGC TGAGGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT 585

Ser Pro Gly Cys

165

TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG (2) Информация за SEQ ID N0:4:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина 167 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна (i ί) Молекулен тип: протеин (А) Описание: Човешки ob полипептид (vi) Източник: Човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:4:

645

700

Met 1

His Trp Gly

Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu

5

10

15

Phe

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

Xie

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

Xie

Lys

Thr

lie

Val

Thr

Arg

Xie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

35

40

45

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

50

55

60

Gly

Leu

His

Pro

Xie

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

70

75

80

Val

Tyr

Gin

Gin

Xie

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Xie

Gin

85

90

95

Xie

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

100

105

110

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

l«eu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

115

120

125

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

130

135

140

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin Asp

Met

Leu

Trp

Glu

145

150

155

160

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

165 (2) Информация за SEQ ID N0:5:

(ί) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 166 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна ( i i) Молекулен тип: протеин (А) Описание: Миши ob полипептид с липсващ Gin в позиция 49.

(vi) Източник:

(А) Организъм: мишка (ΚΪ) Описание на последователността: SEQ ID N0: 5:

Het 1

Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr

Leu

5

10

15

Ser

T/r

Val

Gin

Ala

Val

Pro

lie

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

He

Lys

Thr

Xie

Val

Thr

Arg

Zle

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

35

40

45

Ser

Val

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

Gly

50

55

60

Leu

His

Pro

Xie

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Mec

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Gin

Gin

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

Xie

85

«

90

95

Ala

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Leu

Leu

Ala

Phe

100

105

110

Ser

Lys

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

Glu

115

120

125

Ser

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

130

135

140

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Xie

Leu

Gin

Gin

Leu

145

150

1S5

160

Asp

Val

Ser

Pro

Glu

Cys

165 (2) Информация a SEQ ID N0:6:

(i)	Характеристика на последователността: ( A) Дължина: 167 аминокиселини ( В) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: протеин (А) Описание: Човешки ob полипептид с липсвмкФ1п »

позиция 49

(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността:SEQ ID N0:6:

Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu

X

5

10

15

Phe

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

Xie

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

lie

Lys

Thr

Xie

Val

Thr

Arg

Xie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

35

40

45

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

Gly

50

55

60

Leu

His

Pro

Xie

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Gin

Gin

Xie

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Xie

Gin

Xie

85

90

95

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

100

105

110

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

I«eu

Glu

Thr

Leu

Asp

115

120

125

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

.

130

135

140

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

145	150	155	160
Asp Leu Ser	Pro Gly Cys 165

(2) Информация за SEQ ID NO:7:

(i) Характеристика на последователността:

( A ) Дължина : i 75 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Сгеномна} (А) Описание: екзон 2G7 (iii) Хипотетична; не (iv) Антисенз: не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:7:

GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC

NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG

ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG (2) Информация за SEQ ID N0:8:

(i) Описание на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Списание: PCR 5' праймер за екзон 2G7 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:8:

CCAGGGCAGG AAAATGTG 18 (2) Информация за SEQ ID N0:9:

(i) Характеристика на последователността :

(A) Дължина: 22 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (0) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (1i) Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: PCR 3' праймер за екзон 2G7 (iii) Хипотетична: не ( IV / ΑΗΤΗΟί5Ή-3 * ДЗ.

(xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: Si:

CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 22 (2) Информация за SEQ ID N0:10:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина : 23 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина ( D ) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: пептид (А) Описание: предполагаем N-терминален сигнален пептид (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:10:

Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu

5 1O 15

Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro (2) Информация за SEQ ID N0:11:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 287 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: кръгова (ii) Молекулен тип: ДНК СплазмидЗ (А) Описание: рЕТ-15Ь експресйонен вектор (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (ix) Особености:

(A) Име/ключ: Т7 промотор (B) Локализация : 20....37 (ix) Особености:

(A) Име^ключ: lac оператор (B) Локализация : 39...64

100 (ΪΧ) Особености :

(A) Име/ключ: CDS (B) Локализация: 108...243

(. ix ) Особености :

(А) Име/ключ: His-Tag ( В) Локализация: 123 ...137 ( ix) Особености:

(A) Име/ключ: Място на скъсване от тромбин (B) Локализация: 184-196 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:11

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG

GAATTGTGAG CGGATAACAA

ТТССССТСТА САААТААТТТ TGTTEAACTT TAAGAAGGAG АТАТАСС ATG GGC AGC

Met 1

Gly Ser

AGC

CAT

CAT

CAT

CAT

CAT

CAC

AGC

AGC

GGC

CTG

GTG

CCG

CGC

GGC

AGC

Ser

His

His

His

His

His

His

Ser

Ser

Gly

Leu

Val

Pro

Arg

Gly

Ser

5

10

15

CAT

ATG

CTC

GAG

GAT

CCC

GCT

GCT

AAC

AAA

GCC

CGA

AAG

GAA

GCT

GAG

His

Met

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala

Ala

Asn

Lys

Ala

Arg

Lys

Glu

Ala

Glu

20

25

30

35

TTG

GCT

GCT

GCC

ACC

GCT

GAG

CAA

TAA

CTA

G CATAACCCCT TGGGGCCTCT

Leu

Ala

Ala

Ala

Thr

Ala

Glu

Gin

♦

116

164

212

263

AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG

287 (2) Информация за SEQ ID N0: 12:

Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 45 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна

Ъ.

(ii)

Молекулен тип: протеин (xi)

Описание на последователността:

Met Gly Ser Ser His	His His His His His Ser Ser Gly Leu 10
1	5
Arg	Gly	Ser	His	Met	Leu	Glu	Asp	Pro	Ala	Ala Asn Lys	Ala
			20					25			30
Glu	Ala	Glu	Leu	Ala	Ala	Ala	Thr	Ala	Glu	Gin
		35					40

Arg Lya

Val Pro

101 <;£*.) Информация за S2Q ID НО: 13:

(i) Характеристика на последавателността:

(A) Дължина: 32 базови двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология; линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер) (А) Описание: Миши 5' праймер (i i i) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:13:

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG ТС

С22- Информация за SEQ ID N0:14:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина : 32 базови двойки (B) Нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер) (А) Описание: Миши 3' праймер <iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:14:

ТСССТСТАСА TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC 32 <'23 Информация за SEQ ID N0:15:

(i) Характеристика на последавателността: ( А) Дължина: 32 баови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (1i) Молекулен тип: ДНК С праймер) ( А ) Описание: човешки 5' праймер

102

( iii ,

> X ипотет 'лмна.: He

( iv ) Антисенз: He (xi) Списание на последователността: SEQ ID N0:15:

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32

C2J Информация за SEQ ID N0:16:

( i)	Характеристика на последователността : (A) Дължина: 32 базови двойки (Б) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
< ii)	Молекулен тип: ДНК С праймерj (А) Описание: човешки 3' праймер
(iii)	Хипотетична: Не
( iv)	Антисенз: Да
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:16:

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA 32 (22 Информация за SEQ ID N0:17:

(i)	Характеристика на последователността : (A) Дължина: 11 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: кДНК (А) Описание: акцепторно място за снаждане в ob
( iii)	Хипотетична : Не
( iv)	Антисенз: Не
(. ix)	Особености: (А) Име/ключ: акцепторно място за снаждане
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:17:

AGCAGTCGGT A 11

103

Информация за SEQ ID N0:13:

(1) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 16 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (C) Топология: неизвестна ( i 1) Молекулен тип .· пептид (А) Описание : ob пептиден фрагмент (·/) Тип на фрагмента: вътрешен (v i ) Източник:

(А) Организъм: Миши (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:18:

Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr

IO 15

Информация за SEQ ID N0:19:

(i) Характеристика на последователността :

(A) Дължина: 15 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (C) Топология: неизвестна ( i i ) Молекулен тип: пептид (А) Описание: ob пептиден фрагмент (ν) Тип фрагмент: вътрешен (vi) Източник:

(A) Организъм: мишка (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:18:

Leu His Pro lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 15 IO 15

C<2) Информация за SEQ ID N0:20:

( i) Характеристика на последователността:

( A) Дължина: 19 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (C) Топология: неизвестна (ii) Молекулен тип: пептид (А) Описание: ob пептиден фрагмент (ν) Тип фрагмент: вътрешен

104 (vi) Източник:

<.А) Организъя: Мишка (xi) Описание на поепедоватепността: SEQ ID N0:20:

Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin The Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu

IO 15

Ser Leu Asp

C2! Информация за SEQ ID N0: 21:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (C) Топология: неизвестна (ii) Молекулен тип: пептид (А) Описание: ob пептиден фрагмент (ν) Тип фрагмент: карбоксилен край (ν i) Източник:

(А) Организъм: миши (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:21:

Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Val

IO 15

Ser Pro Glu Cys

C23 Информация за SEQ ID N0:22:

(i) Характеристика на последователността.:

(A) Дължина: 414 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна ( i i ) Молекулен тип : ДНК С геномна!

(А) Описание: Част от човешкия ob ген включваща некодираща последователност преди първия екзон, кодиращата последователност на първия екзон и 5' област на първия интрон (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (vi) Източник:

(А) Организъм: Човек

105 (ix)

Особености:

(A) Име/ключ: CDS (B) Локализация : 38. . .181 ( ix)

Особености :

(A) Име/ключ: 5 област на първия интрон (B) Локализация: 182 ... 414 (ix)

Особености :

(A) Име/ключ: 5' некодираща последователност на човешкия ob ген,'от който се генерира НОВ lgF ДНК праймер (B) Локализация: 11...28 (ΪΧ) Особености:

(A) Име/ключ: интронна последователност на човешкия ob ген, откойто се генерира НОВ lgR праймера (B) Локализация: 241...260 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:22:

GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG Met His Trp Gly Thr Leu 1

TGC GGA TTC TTG TGG

CTT Leu

TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG

Cys Gly Phe

Leu 10

Trp

Trp

Pro

Tyr Leu 15

Phe Tyr Val

Gin Ala 20

Val

CCC

ATC

CAA

AAA

GTC

CAA

GAT

GAC

ACC

AAA

ACC

CTC

ATC

AAG

ACA

ATT

Pro

He

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

He

Lys

Thr

lie

25

30

35

GTC

ACC

AGG

ATC

AAT

GAC

ATT

TCA

CAC

ACG

GTAAGGAGAG TATGCGGGGA

Val

Thr

Arg

lie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

40

45

GCACTGGACC

GCTCCTAGTG

CAAAGTAGAA

CTGCAGCCAG

CCCAGCACTG

103

151

201

AAGAAACATT

TATTGAACGC

CTCCTGAATG

CCAGGCACCT

ACTGGAAGCT

CAGATAGTCC

GAGAAGGATT •TTGGATAGCA

CAGGGCTCCA

CTCTTTCTGG

TTGTTTCTTN

TGGCCCCCTC

TGCCTGCTGA

GATNCCAGGG

GTTAGNGGTT

CTTAATTCCT

AAA

261

321

381

414 (2) Информация за SEQ ID N0: 23:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 48 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна

106

ί. 1 i } Молекулен тип : протеин

Описание: N-крайна част от ob белтък кодиран от първия екзон

Cxi) Описание на последователността: SEQ ID N0:23 :

Met 1	His	Trp	Gly	Thr 5	Leu	Cys	Gly
Phe	Tyr	Val	Gin 20	Ala	Val	Pro	lie
Thr	Leu	lie 35	Lys	Thr	lie	Val	Thr 40

Phe	Leu IO	Trp	Leu	Trp	Pro	Tyr 15	Leu
Gin	Lys	Val	Gin	Asp	Asp	Thr	Lys
25					30
Arg	He	Asp	Asp	He	Ser	His	Thr
				45

(2) Информация за SEQ ID N0: 24 ( х ) Характеристика на последователността:

(А) Дължина: 801 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Сгеномна} (А) Описание: част от човешкия ob ген включваща 3'областта от първия интрон, кодиращата област от втория екзон, и 3'-некодиращата последователност.

(iii) Хипотетична: не (i ν) Антисенз: не

(. v i ) Източник:

(А) Организъм: човек (ix) Особености:

(A) Наименование/ключ ·. CDS (B) Локализация: 291.. 648 (ix) Особености:

(A) Наименование/ключ: 3'- на първия интрон (B) Локализация: 1 .. 290 (хх) Особености:

(A) Наименоеание/ключ: интронна последователност от човешкия ob ген НОВ, от която е синтезиран НОВ 2gF праймера (B) Локализация: 250..269 (хх) Особености:

(A) Наименование/ключ: 3'-некодираща последователност на човешкия ob ген, от която е синтезиран HOB 2gR ДНК праймер (B) Локализация: 707..728

107 (xi) Описание на последователността:

SEQ ID N0:24:

CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG

CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT

GGGAAGTGGA GGGAACGGAT

GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG

120

CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC

AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG

180

AAGGAGACAG

CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG

GCTCTGAGAG

240

CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296

Gin Ser

GTC TCC TCC

AAA Lys

CAG AAA Gin Lys

GTC Val

ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG

CTC Leu

344

Val

Ser

Ser 5

Thr Gly 10

Leu Asp

Phe

Xie Pro 15

Gly

CAC

CCC

ATC

CTG

ACC

TTA

TCC

AAG

ATG

GAC

CAG

ACA

CTG

GCA

GTC

TAC

392

His

Pro

lie

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

20

25

30

CAA

CAG

ATC

CTC

ACC

AGT

ATG

CCT

TCC

AGA

AAC

GTG

ATC

CAA

ATA

TCC

440

Gin

Gin

Xie

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Xie

Gin

Xie

Ser

35

40

45

50

AAC

GAC

CTG

GAG

AAC

CTC

CGG

GAT

CTT

CTT

CAC

GTG

CTG

GCC

TTC

TCT

488

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

55

60

65

AAG

AGC

TGC

CAC

TTG

CCC

TGG

GCC

AGT

GGC

CTG

GAG

ACC

TTG

GAC

AGC

536

Lys

Ser

cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

70

75 t

80

CTG

GGG

GGT

GTC

CTG

GAA

GCT

TCA

GGC

TAC

TCC

ACA

GAG

GTG

GTG

GCC

584

Leu

Gly Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

B5

90

95

CTG

AGC

AGG

CTG

CAG

GGG

TCT

CTG

CAG

GAC

ATG

CTG

TGG

CAG

CTG

GAC

632

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu Asp

100 IOS 110

CTC AGC CCT GGG TGC T

Leu Ser Pro Gly Cys 115

GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA

688

GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC

CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC

748

TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC АСТСТГССАА AGG

801

108 <'2} Информация за SEQ ID N0:25 :

<i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 119 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина < D) Топология: линейна (1i) Молекулен тип: протеин (А) Описание: С-крайна част от човешкия оЬ белтък кодиран от втория екзон (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:25

Gin 1

Ser

Val

Ser

Ser 5

Lys

Gin

Lys

Val

Thr IO

Gly

Leu

Asp

Phe

He 15

Pro

Gly

Leu

His

Pro 20

lie

Leu

Thr

Leu

Ser 25

Lys

Met

Asp

Gin

Thr 30

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin 35

Gin

He

Leu

Thr

Ser 40

Met

Pro

Ser

Arg

Asp 45

Val

lie

Gin

He

Ser 50

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp 55

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu ao

His

Val

Leu

Ala

Phe tss

Ser

Lys

Ser

Cys

His 70

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser 75

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu 80

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly B5

Val

Leu

Glu

Ala

Ser PO

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu 05

Val

Val

Ala

Leu

Ser 1OO

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser 105

Leu

Gin

Asp

Met

Leu no

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

115 (2) Информация за SEQ ID N0:26 :

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 8 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: неизвестна
(ii)	Молекулен тип: пептид
(V)	Тип фрагмент: вътрешен
(vi)	Източник: (А) Организъм: pichia дрожди

109 (xi) Описание на последователността: SEQ ID HG23

Leu Glu Lys Arg Glu Alu. Glu Ala rs (2) Информация за SEQ ID HO: 27:

(i) Характеристика на последователността :

(A) Дължина: 4 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: неизвестна (ii) Молекулен тип: пептид (V) Тип фрагмент: вътрешен (vi) Източник:

(А) Организъм: pichia дрожди (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:27

Glu Ala Glu Ala (2) Информация за SEQ ID N0:28 :

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 4 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: неизвестна (i i) Молекулен тип: пептид (ν) Тип фрагмент .· вътрешен (vi) Източник:

(А) Организъм: pichia дрожди (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:28

Leu Glu Lys Arg (2) Информация за SEQ ID N0:29 :

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижностедноверижна (D) Топология: линейна

110

< ϋ)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: НОВ IgF ДНК праймер синтезиран от 5 ~

некодиращата последователност на човешкия ob ген

< iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(xi)	Описание на последователността: SES ID N0:23

CCCAAGAAGC CCATCCTG 13 (2) Информация за SEQ ID N0:30 :

;i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна ( D ) Топология: линейна ( i i) Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: НОВ lgR ДНК праймер синтезиран от първата интронна последователност на човешкия ob ген (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: да (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:30 GACTATCTGG GTCCAGTGCC (2) Информация за SEQ ID N0:31 :

¢1) Характеристика на последователността·.

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: НОВ 2gF ДНК праймер синтезиран от първата интронна последователност на човешкия ob ген (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0: 31:

CCACATGCTG AGCACTTGTT

111 (2) Информация за SEQ ID N0:32 ( Ij Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 22 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер?

(А) Описание: НОВ 2gR ДНК праймер синтезиран от 3'-некодиращата последователност на човешкия ob ген (iii) Xипотетична: не (iv) Антисенз; да (xi) Описание ’на последователността SEQ ID N0:32

СТТСААТССТ GGAGATACCT GG 22 (2) Информация за SEQ ID N0: 33:

( i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 51 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: кръгова С циркулярна?

(i i) Молекулен тип: ДНК (А) Описание: pPIC.9 клониращо място (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (xi) Списание на последователността: SEQ ID N0:33 :

CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G 61 (2) Информация за SEQ ID N0:34 :

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 40 базови двойки (B) Тип: нуклеиновакиселина

С С) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер?

(A) PCR 5'-праймер за амплифициране на човешката ob кДНК лос ледователност (iii) Хипотетична: не

112 (iv) Антисенз: не (xi) Описание на последователността: SEQ ID NG: 34:

GTATGTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG 40 (2) Информация за SEQ ID N0:35 :

/ 4 \ λ 7	Характеристика на последователността : 'A) Дължина: 31 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Берижност: едноверижна ( D ) Топология линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймерЗ (A) PCR 3'-праймер за амплифициране на човешка ob ДНК

поеледователност

( i i i )	Хипотетична : не
( iv)	Антисенз: да
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0: 35:

CGCCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C 31 (2) Информация за SEQ ID N0:36 :

<i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 40 базови двойки (B) Тип: нуклеиновакиселина (C) Берижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ϋ)	Молекулен тип: ДНК СпраймерЗ (A) PCR 5'-праймер за амплифициране на миша ob кДНК

последователност

( iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(xi)	Описание на последователността SEQ ID N0: 36:

GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40

113 (2) Информация .за SEQ ID NO: 37

( i)	Характеристика на последователността: < А) Дължина: 31 базови двойки (B) Тип: нуклеиновакиселина (C) Верижност: едноверижна ( D ) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер? (A) PCR 3'-праймер за амплифициране на миша ob кДНК

пое лецоват е.пнсст

(iii)	хипотетична: не
( iv)	Антисенз: да
(xi )	Описание на последователността: SEQ ID N0:37 :

GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT С 31 (2) Информация за SEQ ID N0:38 :

( i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 4 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: протеин (А) Описание: тетрапептид на N-края на ренатуриран миши

ob белтък след скъсване с тромбин

(vi)	Източник : (А) Организъм: мишка
(xi )	Описание на последователността: SEQ ID N0:38 :
Gly 1	Ser His Met

(2) Информация за SEQ ID N0:39 :

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина; 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер? (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1734 (iii) Хипотетична: не

114

(iv;	Антисенз · не
(vi ;	Източник: (А) Организъм: човек
(xi )	Описание на последователността: SEQ ID N0: 39:

CAAGACAAAT GAGATAAGG (2) Информация за SEQ ID N0:40:

( i )	Характеристика на последователността: (A) Дължина; 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1734

( iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi )	Описание на последователността: SEQ ID N0:40:

AGAGTTACAG CTTTACAG IS (2) Информация за SEQ ID N0:41·.

Ci)	Характеристика на последователността: (А) Дължина: 19 базови двойки ( В ) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS494

< iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз .· не
(vi)	Източник: ( А ) Организъм ·. човек
(xi)	Описание на последователността; SEQ ID N0:41:

CTAAACACCT TTCCATTCC 1»

115 (2) Информация за SEQ ID N0:42:

(i) Характеристика на последователността:

(А) дължина: 32 базови двойки (В} Тип: нуклеинова киселина (С) Верижност: едноверижна ( D ) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS494 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:42:

ТТАТАТТСАС ТТТТССССТС ТС 22 (2) Информация за SEQ ID N0:43:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS883 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:43:

TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20

(.2) Информация за SEQ ID N0:44:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

116

X I-)

Молекулен тил: ДНК Спраймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер JWSS883

(111/	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек

(xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:44:

GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20 (2) Информация за SEQ ID N0:45:

<i)	Характеристика непоследователността: (A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Вержиност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип .· ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2359

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността SES ID N0:45:

AGTGTTGTGT TTCTTCTG 18 (2) Информация за SEQ ID N0:46:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Вержиност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНк С праймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2359

( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
( vi ;	Източник: ( А) Организъм: човек

117 ςχΐ) Описание на последователността: SEQ ID NG;46;

AAAGGGGATG TGATAAGTG (2) Информация за SEQ ID N0:47:

( i )	Характеристика на последователността : < A) Дължина : 18 базови двойки (β ) Тип ·. нуклеинова киселина ( С ) Верижност: едноверижна ( D ) Топология: линейна
ι i)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2336

< X XX >	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:47:

GGTGTTACGT TTAGTTAC IS (2) Информация за SEQ ID N0:48:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( i i)	Молекулен тип: ДНК С праймер.} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2336

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:48:

GGAATAATGA GAGAAGATTG 20

118 (2) Информация за SEQ ID NC:43:

(i) Характеристика на поепедователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина ( С ) Еерижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1218 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:49:

GCTCAACTGA CAGAAAAC 13 (2) Информация за SEQ ID N0:50:

(i) Характеристика на последователността;

(A) Дължина; 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1218 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:50:

GACTATGTAA AAGAAATGCC 30 (2) Информация за SEQ ID N0:51:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

119 (ii) Молекули тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWS31402

(iii)	Хипотетична : не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:51:

AAAGGGCTTC ТААТСТАС 18 (2) Информация за SEQ ID N0:52:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1402

( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
( vi )	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността; SEQ ID N0:52:

ССТТССААСТ TCTTTGAC 18 (2) Информация за SEQ ID N0:53:

(i)	Характеристика на последователността: (А) Дължина: 18 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: последователност специфична за вися-

щия край на PCR праймера sWSS999

(iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
( vi )	Източник: (А) Организъм: човек

120 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:53:

ТАААСССССТ TTCTGTTC IS ;2) Информация за SEQ ID N0:54:

(i)	Характеристика на последователността: ( A ) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип; нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер? (А) Описание .· последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS999

(iii)	Хипотетична: не
< iv)	Антисенз: не
<vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:54:

TTGCATAATA GTCACACCC 19 (2) Информация за SEQ ID N0:55:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 22 базови двойки (B) Нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ϋ>	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1751

(iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
<vi)	Източник: < А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:55:

CCAAAATCAG AATTGTCAGA 22

121 (2) Информация за SEQ ID NO: 5b:

( i) Характеристика на последователността:

( A ) Дължина: 20 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (С) Верижност: едноверижна (В) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер?

(А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1751 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:56:

AAACCGAAGT TCAGATACAG 20 (2) Информация за SEQ ID N0:57:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер?

(А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1174 (iii) Хипотетична: не (iν) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:57:

AATATCTGAC ATTGGCAC 18 (2) Информация за SEQ ID N0:58:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна < D) Топология: линейна

122 (ii) Мопекутен тъп: ДНК гпрайг»р2<

(А) Описание: последователност специфична за край на PCR п^займер sWSS1174 (iii) Хипотетична: на (iv) Антисенз: ме (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:58:

TTAGACCTGA GAAAAGAG (2) Информация за SEQ ID N0:59:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип.· нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за край на PCR праймер sWSS2061 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:59

GTTGCACAAT АСААААТСС (2) Информация за SEQ ID N0:60:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за край на PCR праймер sWSS2061 (i1i) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (vi) Източник:

(А) Организъм: човек висящия висящия висящия

123 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:60;

CTTCCATTAG TGTCTTATAG 20 (2) Информация за SEQID NO:SI:

< i )	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2538

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:61:

ATCACTACAC ACCTAATC 18 (2) Информация за SEQ ID N0:62:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология; линейна
< ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2588

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:62:

CCATTCTACA TTTCCACC 18

124 (2) Информация за SEQ ID N0:63:

(1)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 24 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер! (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS808

(iii)	X ипот ет ична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:63:

CGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA 24 (2) Информация за SEQ ID NO:64:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 23 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ϋ)	Молекулен тип: ДНК Спраймер! (А) Охписание ·. последователност специфична а висящия
край на PCR	праймер sWSS808
( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:64:

TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC 23 (2) Информация за SEQ ID N0:65:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

125 ζ i i ; Молекулен тип : ДНК ··.' праймер (А) Списание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер SWSS1392 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (V Ϊ ) Източник:

( А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:65:

CTCAGGTATG ТСТТТАТС 13 (2) Информация за SEQ ID N0:66:

(i) Характеристика на последователността:

(А) Дължина: 18 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (С) Верижност: едноверижна < D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1392 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:66:

TGTCTCTCTGCA ТТСТТТТС 18 (2) Информация за SEQ ID N0:67:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна ( i i) Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS1148 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не

126

(, v 1;	ИЗТОЧНИК : (А) Организъм: човек
Cxi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:67 :

GACACATACA AACACAAG

Информация за SEQ ID NG :68:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 13 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (. С ) Верижност : едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК СпраймерЗ (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1148

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:68:

ATTGAGTTGA GTGTAGTAG 19 <2} Информация за SEQ ID N0:69:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 1S базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ϋ)	Молекулен тип: ДНК С праймерЗ (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS1529

(iii)	Хипотетична: не
(iv )	Антисенз: не
(vi )	Източник: (. А ) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:69:

CAGGGATTTC TAATTGTG 18

127 (2) Информация за SEQ ID N0:70:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина ( С ) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер?

(А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер SWSS1529 (iii) Хипотетичнане (iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:70:

AAAAGATGGA GGCTTTTG 18 (2) Информация за SEQ ID N0:71:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 21 базови двойки (B) Молекулен тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер?

(А) Описание: последователност специфична за висящия край на PCR праймер sWSS2619 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:71:

CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G 21 (2) Информация за SEQ ID N0:72:

(i) Характеристика на последователността (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК Спраймер?

128 (А) Описание: последователност специфична за висящия на PCR праймер. sW5S2619 (2) край (2) край ( iii ) ( iv) (vi (xi)

Хипотетична.:

Антисенз: не не

Източник:

(А) Организъм: човек

Описание на последователността: SEE ID NG :72:

TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA

Информация за SEE ID N0:73:

(i) Характеристика на последовагтелността:

(A) (B) (0) (D)

Дължина: 18 базови двойки Тип: нуклеинова киселина Верижност: Топология:

едноверижна линейна (ii) Молекулен тип:

(А) Опис ание: на PCR праймер sWSS404

ДНК Cпраймер} последователност специфична за висящия (iii) (iv) (vi) (xi )

Хипотетична: не

Антисенз: не

Източник:

(А) Организъм: човек

Описание на последователността: SEE ID N0:73:

ACCAGGGCA ATACAAAG

Информация за SEE ID N0:74:

(i) Характеристика на последователността: Дължина: 18 базови двойки Тип: нуклеинова киселина Верижност: Топология:

(A) (B) (C) (D) едноверижна линейна (i i) Молекулен тип:

(А) Описание:

на PCR праймер sWSS404 (iii) ( iv)

ДНК Спраймер} последователност специфична за висящия

Хипотетична: не

Антисенз: не

Източник:

(А) Организъм: човек

TAATGTGTCC TTCTTGCC (vi) (xi )

Описание на пос.педователнсгтта· SEE ID N0:74:

129 (2) Информация за SEQ ID N0:75:

(i)	Характеристика на последователността; (A) Дължина: IS базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна ( D ) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер} (А) Описание: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2367

( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източинк: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:75:

CAATCCTGGC TTCATTTG 18 (2) Информация за SEQ ID N0:76:

<i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 18 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина < С) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ϋ)	Молекулен тип: ДНК Спраймер} (А) Описоние: последователност специфична за висящия

край на PCR праймер sWSS2367

(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: ( А ) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:76:

AAGGTGGGTA GGATGCTA 18

130 (2) Информация за SEQ ID NG :77:

k 1 }	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (С} Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ID	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер UT528
( iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID NG :77:

TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20 (2) Информация за SEQ ID N0:78:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер UT528
(iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз : не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:78

GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20 (2} Информация за SEQ ID N0:79:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

131

Молекулен тип: ДНИ Спраймер?

	(А) Описание: Маркер AFKdO852gS
( А 1 i )	липотетична: не
< iv)	.Антисенз : не
(Vi;	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:79:

AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT 2G (2) Информация за SEQ ID N0:30:

<i)	Характеристика на последователността : (A) Дължина: 19 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер AFMaO65sg9
( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: 3EG ID N0:80:

GGTCAGCAGC ACTGTGATT IS ¢2) Информация за SEQ ID N0:81:

(i)	Характеристика на последователността: ( A) Дължина : 19 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК Спраймер? (А) Описание: Маркер AFMal25whl
( iii)	Хипотетична: не
( iv;	Антисенз: не
(vi)	Източник: ( А ) Организъм: човек

132 (Xi) Описание на последователността: SEQ ID NG :81:

(2) Информация за SEQ ID SO :82:

< i) Характеристика на последователността :

( A ) Дължина : 20 базови двойки (β; Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (iI) Молекулен тип: ДНК С праймер?

<А) Описание: Маркер AFM а12 5 w h1 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (V i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:82:

AACACCGTGG ТСТТАТСААА (2) Информация за SEQ ID N0:83:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: ДНК С праймер?

(А) Описание: Маркер AFMa309yfl0 (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: човек (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:83:

CATCCAAGTT GGCAGTTTTT

133

(.2) Информация за SEQ ID N0:84:

( i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина : <50 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер AFMa308yfl0
iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi;	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:84:

AGATGCTGAA TTCCCAGACA 20 (2) Информация за SEQ ID N0:85:

Ci)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 16 базовидвойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер AFM218xflO
(iii)	Хипотетична: не
< iv)	Антисенз: не
( vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:85:

TGGGCAACAC AGCAAA 16 (2) Информация за SEQ ID N0:86:

( i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

134 (ii) (Молекулен тип·. ДНК Спраймер!

(А) Описание-. Маркер AFM218xflO

( iii)	Xипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:86:

TGCAGTTAGT GCCAATGTCA 20 <2) Информация за SEQ ID N0:87:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 16 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност- едноверижна (D) Топология: линейна
( ϋ)	Молекулен тип: ДНК Спраймер! (А) Описание: Маркер AFM208xcl
(iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:87:

CCAGGCCATG TGGAAC 16 (2) Информация за SEQ ID NO :83:

(i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина : 20 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер! (А) Описание: Маркер AFM206xcl
( iii)	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек

135 (xi) Описание на псследователностт-s: SEQ ID N0:88:

A kJ 1 1’-·1 UJkTU i -^U (2) Информация за SEQ ID N0:89:

( i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 16 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Берижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( 1 i )	Молекулен тип: ДНК Спраймер? (А) Описание: Маркер AFM 199x1112
< i i i )	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А ) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:89:

TCTGATTGCT GGCTGC 16 (2) Информация за SEQ ID NO: 90:

( i)	Характеристика на последователността: (A) Дължина: 17 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Берижност: едноверижна (D) Топология: линейна
(ii)	Молекулен тип: ДНК С праймер? (А) Описание: Маркер AFM199xhl2
(iii)	Хипотетична: не
( iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:90:

GCGCGTGTGT ATGTGAG 17

136

(.2) Инфор	>нация oa SEQ ID N0:21:
< i )	Характеристика на последователността : (A) Дължина : 20 базови двойки < 3) Тип; нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
ill/	Молекулен тип: ДНК Спраймер) (А) Описание: Маркер AFMa345wc9
ί X i i)	Хипотетична: не
( i v)	Антисенз: не
(vi)	Източиник: (А) Организъм: човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:91:

AGCTCTTGGC AAACTCACAT 20 (2) Информация за SEQ ID N0:92:

( i)	Характеристика на последователността : (A) Дължина: 20 базови двойки ( В) Тип: нуклеинова киселина <С) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна
( ϋ)	Молекулен тип: ДНК С праймер) (А) Описание: Маркер AFMa345wc9
·; iii )	Хипотетична: не
(iv)	Антисенз: не
(vi)	Източник: (А) Организъм:човек
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:92:

GCCTAAGGGA ATGAGACACA 20 (2) Информация за SEQ ID N0:93:

(i)	Характеристика на последователността: (А) Дължина; 24 базови двойки (В} Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна

137 ( i i ) Молекулен тип : ДНК С прайнерЗ (А) Описание: праймер за мишия Рах4 ген (iii) Хипотетична: не ( iv) Антисенз: не (v i) Източник:

(А) Организъм: мишка (ΧΪ) Описание на последователността: SEQ ID N0:93:

CGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG 24 (2) Информация за SEQ ID N0:94:

(i) Характеристика на последователността :

(A) Дължина: 491 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (А) Описание: Рекомбинантен миши met ob (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не

(vi)	Източник: (A ) Организъм: мишка
(ix)	Особености : (A) Наиненование/ключ: CDS (В ) Локализация: 41... 478
(xi)	Описание на последователността: SEQ ID N0:94:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG Met Val Pro Xie Gin 1 5

AAA Lys

GTT CAG GAC GAC ACC

AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT

103

Val Gin Asp

Asp Thr 10

Lys Thr

Leu

Xie Lys 15

Thr

lie

Val Thr Arg 20

ATC

AAC

GAC

ATC

AGT

CAC

ACC

CAG

TCG

GTC

TCC

GCT

AAA

CAG

CGT

GTT

151

Xie

Asn

Asp

lie

Ser

His

Thr

Gin

Sar

Val

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

25

30

35

138

ACC GGT Thr Gly

CTG GAC Leu Asp 40

TTC Phe

ATC CCG GGT CTG CAC

CCG ATC CTA AGC TTG TCC

199

lie

Pro

Gly Leu 45

His

Pro

He Leu Ser 50

Leu

Ser

AAA

ATG

GAC

CAG

ACC

CTG

GCT

GTA

TAC

CAG

CAG

GTG

TTA

ACC

TCC

CTG

247

Lys

Mee

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

T/r

Gin

Gin

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

55

60

65

CCG

TCC

CAG

AAC

GTT

CTT

CAG

ATC

GCT

AAC

GAC

CTC

GAG

AAC

CTT

CGC

295

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

He

Ala

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

70

75

80

85

GAC

CTG

CTG

CAC

CTG

CTG

GCA

TTC

TCC

AAA

TCC

TGC

TCC

CTG

CCG

CAG

343

Asp

Leu

Leu

His

Leu

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin

90

95

100

ACC

TCA

GGT

CTT

CAG

AAA

CCG

GAA

TCC

CTG

GAC

GGG

GTC

CTG

GAA

GCA

391

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

105

110

115

TCC

CTG

TAC

AGC

ACC

GAA

GIT

GTT

GCT

CTG

TCC

CGT

CTG

CAG

GGT

TCC

439

Ser

Leu

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

120

125

130

CTT

CAG

GAC

ATC

CTT

CAG

CAG

CTG

GAC

GTT

TCT

CCG

GAA

TGT

TAATGGA

488

Leu

Gin

Asp

He

Leu

Gin

Gin

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Glu

Cys

135 140 145

TCC

491 (2) Информация за SEQ ID N0:95:

Ci)

Характеристика на последователността :

(A) Дължина: 146 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна

(ii) Молекулен тип: протеин (A) Описоние: Рекомбинантен миши me t (xi) Описание на последователността: SEQ

Mee

Val

Pro

lie Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

He

1

5

10

15

Thr

Не

Val

Thr Arg

He

Asn

Asp

He

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

20

25

30

Ala

Lys

Gin

Arg Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

He

Pro

Gly

Leu

His

35

40

45

He

Leu

Ser

Leu Ser

Lys

Mee

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

50

55

60

ID N0:95:

Lys

Ser

Pro

Gin ob протеин

139

Val 65

I>eu

Thr

Ser

Leu

Pro 70

Ser

Gin

Asn

Val

Leu 75

Gin

Xie

Ala

Asn

Asp 80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

Leu

His

Leu 90

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys 95

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro 100

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu 105

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser 110

Leu

Asp

Gly

Val

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

Val

Val 125

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 130

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 135

Asp

He

Leu

Gin

Gin 140

Leu

Asp

Val

Ser

Pro Glu Cys

145 (2) Информация за SEQ ID N0:96:

(i) Характеристика на последователността: (A) Дължина: 454 базови двойки ( В ) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: ДНК (А) Описание: рекомбинантен човешки met ob (iii) Хипотетична: не (iv) Антисенз: не (V i) Източник:

(А) Организъм: човек (ix) Особености:

(A) Наименование/ ключ: CDS (B) Локализация: 4...444 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:96:

CAT ATG

GTA Val

CCG ATC CAG AAA GTT

CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT

Net 1

Pro

Xie Gin 5

Lys

Val

Gin Asp Asp 10

Thr

Lys Thr

Leu

lie 15

AAA

ACG

ATC

GTT

ACG

CGT

ATC

AAC

GAC

ATC

AGT

CAC

ACC

CAG

TCG

GTG

Lys

Thr

Xie

Val

Thr

Arg

lie

Asn

Asp

Xie

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

20

25

30

AGC

TCT

AAA

CAG

CGT

GTT

ACA

GGC

CTG

GAC

TTC

ATC

CCG

GGT

CTG

CAC

Ser

Ser

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Xie

Pro

Gly

Leu

His

35

40

45

144

140

CCG ATC CTG

ACC TTG TCC Thr Leu Ser

AAA Lys

ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin

192

Pro

He

Leu 50

55

60

CAG

ATC

TTA

ACC

TCC

ATG

CCG

TCC

CGT

AAC

GTT

CTT

CAG

ATC

TCT

AAC

240

Gin

lie

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Leu

Gin

He

Ser

Asn

65

70

75

GAC

CTC

GAG

AAC

CTT

CGC

GAC

CTG

CTG

CAC

GTG

CTG

GCA

TTC

TCC

AAA

288

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

80

. 85

90

95

TCC

TGC

CAC

CTG

CCA

TGG

GCT

TCA

GGT

CTT

GAG

ACT

CTG

GAC

TCT

CTG

336

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

100

105

110

GGC

GGG

GTC

CTG

GAA

GCA

TCC

GGT

TAC

AGC

ACC

GAA

GTT

GTT

GCT

CTG

384

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

115

120

125

TCC

CGT

CTG

CAG

GGT

TCC

CTT

CAG

GAC

ATG

CTT

TGG

CAG

CTG

GAC

CTG

432

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

130

135

140

TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC 454

Ser Pro Gly Cys

145 (2) Информация за SEQ ID N0:97:

(i) Характеристика на последователността:

(А) Дължина: 147 аминокиселини ( В ) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: протеин (А) Описоние: Рекомбинантен човешки ob протеин (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:97:

Met 1

Val

Pro

He

Gin 5

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

He 15

Lys

Thr

Zle

Val

Thr 20

Arg

Xie

Asn

Asp

He 25

Ser

His

Thr

Gin

Ser 30

Val

Ser

Ser

Lys

Gin 35

Arg

Val

Thr

Gly

Leu 40

Asp

Phe

He

Pro

Gly 45

Leu

His

Pro

He

Leu 50

Thr

Leu

Ser

Lya

Met 55

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala 60

Val

Tyr

Gin

Gin

He 65

Leu

Thr

Ser

Met

Pro 70

Ser

Arg

Asn

Val

Leu 75

Gin

He

Ser

Asn

Asp 80

141

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

85

90

95

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

100

105

110

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser

115

120

125

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

130

135

140

Pro Gly Сув

145 (2) Информация за SEQ ID NO: 98:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 21 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: пептид (у) Тип фрагмент: №краен His-tag (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:98:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

IO 19

Arg Gly Ser His Met zo (2) Информация за SEQ ID N0: 99:

(i) Характеристика на последователността :

(A) Дължина 20 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Топология: линейна (i i) Молекулен тип: пептид (у) Тип фрагмент: N-краен His-tag (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:99:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

Claims (76)

1. Патентни претенции

   1. Полипептид на затлъстяването (ОВ-полипептид) от около 145 до около 167 аминокиселини, способен да модулира телесното тегло на животно, или негови алелни варианти, или аналози, включително техни фрагменти, притежаващи същата биологична активност.
2. 2. OB-полипептид съгласно претенция 1, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 2, 4, 5 или 6 или техни алелни варианти или аналози, включително и техни фрагменти.
3. 3. Имуногенен фрагмент на един ОВ-полипептид съгласно претенция 1 или 2.
4. 4. Имуногенен фрагмент на един ОВ-полипептид, избран от група, състояща се от:

   Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-ThrLys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18);

   Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-MetAsp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19);

   Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-SerGly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20) и

   Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21).
5. 5. Човешки OB полипептиден аналог съгласно претенция 2, където една или повече аминокиселини, подбрани от група, състояща се от аминокиселини 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157,159,163 и 166 (съответно на номерирането на SEQ ID NO: 4) е заместена с друга аминокиселина.
6. 6. Човешки ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 5, където заместването е с различната аминокиселина на мишия ОВ полипептид, както е представено в SEQ ID NO: 2.
7. 7. Човешки ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 5, където заместването е с един аланин.
8. 8. Човешки ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 5, избран от групата, състояща се от полипептиди, където:

   (a) сериновият остатък в позиция 53 е заместен с глицин, аланин, валии, цистеин, метионин или треонин.

   (b) сериновият остатък в позиция 98 е заместен с глицин, аланин, валин, цистеин, метио- нин или треонин; и (с) аргининовият остатък в позиция 92 е заместен с аспаргин, лизин, хистидин, глутамин, глутаминова киселина, аспаргинова киселина, серин, треонин, метионин или цистеин.
9. 9. ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 2, притежаващ 83% или повече хомоложност на аминокиселинната последователност спрямо човешката аминокиселинна последователност на ОВ полипептида, представена в SEQ ID NO: 2,4, 5 или 6.
10. 10. Човешки ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 2, подбран от групата, състояща се от полипептиди, където:

    (a) един или повече остатъци на аспаргинова киселина е заместен с глутаминова киселина;

    (b) един или повече изолевцинови остатъци е заместен с левцин;

    (c) един или повече глицинови или валинови остатъци е заместен с аланин;

    (d) един или повече аргининови остатъци е заместен с хистидин;

    (e) един или повече тирозинови или фенилаланинови остатъци е заместен с триптофан;

    (f) един или повече от остатъците от 121 до 128 (съответно на номерирането на SEQ ID NO: 4) е заместен с глицин или аланин; и (g) един или повече остатъци в позиции 54 до 60 или 118 до 166 (съответно на номера на SEQ ID NO: 4) е заместен с лизин, глутаминова киселина, цистеин или пролин.
11. 11. ОВ полипептид съгласно всяка от претенции 1, 2, 3, 5, 6 или 9, подбран от групата, състояща се от полипептиди:

    (a) с липсващи остатъци от I до 21; и (b) полипептиди на подчаст (а), притежаващи метионин в позиция 21, или притежаващи глицин-с ерин-хистидин-метионин последователност SEQ ID NO: 38 в позиции 18 до 21, или притежаващи една метионин-глицин-серин-серин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистндин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ID NO: 98) в позиции 1 до 21.
12. 12. ОВ полипептид съгласно всяка от претенции 1, 2, 3, 5, 6 или 9, подбран от групата, състояща се от полипептиди:

    (а) с липсващи остатъци от 1 до 21; и

    143 (b) полипептиди на подчаст (а), имащи една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргининглутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 26) в позиции 14 до 21, или притежаващи една глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 27) в позиция 18 до 21, или притежаващи една левцин-Елутаминова киселина-лизин-аргинин последователност (SEQ ID NO: 28) в позиции 18 до 21, или притежаващи една метионин-глицин-серин-серин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицинлевцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серинпролин последователност (SEQ ID NO: 99) в позиции 2 до 21, или притежаващи една глицинсерин-пролин последователност в позиции 18 до 21.
13. 13. ОВ полипептид съгласно всяка от претенции 7,8,9 или 10, подбран от групата, състояща се от полипептиди:

    (a) с липсващи остатъци 1 до 21; и (b) полипептиди от подчаст (а), притежаващи метионин в позиция 21 или притежаващи една глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ID NO: 38) в позиции 18 до 21, или имащи една метионин-глицин-серин-серинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-пгицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ID NO: 98) в позиции 1 до 21, или имащи една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин-глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 26) в позиции 14 до 21, или притежаващи една глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 27) в позиции 18 до 21, или притежаващи една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин последователност (SEQ ID NO: 28) в позиции 18 до 21, или притежаващи една метионин-глицин-серин-серин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролин последователност (SEQ ID NO: 99) в позиции 2 до 21, или притежаващи една глицин-серин-пролин последователност в позиции 18 до 21.
14. 14. Човешки скъсен ОВ полипептиден аналог съгласно претенция 2, подбран от групата (съответно на номерацията на SEQ ID NO: 4), състояща се от полипептиди, където:

    (a) един или повече остатъци в позиции 121 до 128 липсват;

    (b) остатъци 1-116 липсват;

    (c) остатъци 1-21 и 54 до 167 липсват;

    (d) остатъци 1-60 и 117 до 167 липсват;

    (e) остатъци 1-60 липсват;

    (f) остатъци 1 -53 липсват;

    (g) един аналог от подчаст (а), в който остатъци 1-21 липсват; и (h) един аналог от подчаст (а) до (g), притежаващ една N-терминална аминокиселина или аминокиселинна последователност, подбрана от група, състояща се от:

    (1) метионин, (2) една глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ID NO: 38), (3) една метионин-глицин-серин-серинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ID NO: 98), (4) една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин-глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 26), (5) една глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 27), (6) една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин последователност (SEQ ID NO: 28), (7) една метионин-глицин-серин-серинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролин последователност (SEQ ID NO: 99), и (8) една глицин-серин-пролин последователност.
15. 15. Рекомбинантен ОВ полипептид съгласно всяка от претенции от 1 до 14.
16. 16. Химически синтезиран ОВ полипептид съгласно всяка от претенции от 1 до 14.
17. 17. Дериват на ОВ полипептид съгласно всяка от претенции от 1 до 16, към който са закачени една или повече химически групи.
18. 18. Дериват съгласно претенция 17, в който химичната група е водноразтворим полимер.
19. 19. Дериват съгласно претенция 18, в който водноразтворимият полимер е полиетиленгликол.

    144
20. 20. Дериват съгласно претенция 19, който е моно-, ди, три- или тетра пегилиран.
21. 21. Дериват съгласно претенция 20, който е N-крайно монопегилиран.
22. 22. Дериват съгласно претенция 21, който е ОВ полипептид, съдържащ аминокиселинните остатъци 22 до 167 от SEQ ID NO: 4 или остатъците 22 до 166 от SEQ ID NO: 6.
23. 23. Дериват съгласно претенция 21, който е ОВ полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на остатъци 22 до 167 от SEQ ID NO: 4, или остатъци 22 до 166 от SEQ ID NO: 6 и притежаващ метионин в позиция 21.
24. 24. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща ОВ полипептид съгласно всяка от претенции 1 до 6, 9 или 11.
25. 25. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща ОВ полипептид съгласно всяка от претенции 7, 8, 10, 12, 13 или 14.
26. 26. ДНК молекула, която може да се използва за осигурена експресия на ОВ полипептид, притежаващ биологичната активност да модулира телесното тегло у бозайници, като ДНК е подбрана от групата, състояща се от:

    (a) ДНК молекули, представени в SEQ ID NO: 1 и 3 или техни фрагменти, (b) ДНК молекули, които хибридизират с ДНК молекули, дефинирани в (а) или техни фрагменти, способни да хибридизират; и (c) ДНК молекули, които кодират експресията на аминокиселинната последователност, кодирана от всяка от представените по-горе ДНК молекули.
27. 27. ДНК молекула съгласно претенция 26, която е човешката геномна ДНК молекула, със SEQ ID NO: 22 и 24.
28. 28. ДНК молекула съгласно претенция 24, кодираща полипептид, притежаващ аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от аминокиселинните последователности, представени в:

    (a) SEQ ГО NO: 2;

    (b) аминокиселини 22 до 167 на SEQ ГО N0: 2;

    (c) SEQ ГО NO: 4;

    (d) аминокиселини 22 до 167 на SEQ ГО N0:4;

    (e) SEQ ГО NO: 5;

    (0 аминокиселини 22 до 166 на SEQ ГО N0:5;

    (g) SEQ ГО N0: 6;

    (h) аминокиселини 22 до 166 на SEQ ID NO: 6; и (i) аминокиселинните последователности на подчаст (b), (d), (0 или (h), притежаващи една N-крайна аминокиселина или аминокиселинна последователност, подбрани от групата, състояща се от:

    (1) метионин, (2) една глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ГО NO: 38), и (3) една метионин-глицин-серин-серинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-хистидин-метионин последователност (SEQ ГО NO: 98).
29. 29. ДНК молекула съгласно претенция 28, кодираща една аминокиселина на подчаст (Ь), (d), (f) или Qi), притежаваща една N-крайна аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от:

    (1) една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин-глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ID NO: 26), (2) една глутаминова киселина-аланин-глутаминова киселина-аланин последователност (SEQ ГО NO: 27), (3) една левцин-глутаминова киселина-лизин-аргинин последователност (SEQ ГО N0:28), (4) една метионин-глицин-серин-серинхистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-хистидин-серин-серин-глицин-левцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серин-пролин последователност (SEQ ID N0: 99), и (5) една глицин-серин-пролин последователност.
30. 30. ДНК молекула съгласно претенция 24, характеризираща се с последователността, представена като белтък, кодираща последователност на SEQ ГО NO: 3.
31. 31. ДНК молекула съгласно претенция 24, характеризираща се с последователността, представена като последователността, кодираща аминокиселини 22 до 167 на SEQ ГО NO: 3.
32. 32. Доловимо белязана молекула нуклеинова киселина, която хибридизира с която и да е ДНК молекула съгласно всяка една от претенции от 24 до 31.
33. 33. Нуклеинова киселина, която хибриди

    145 зира с една декодираща област на ОВ нуклеинова киселина, чиято декодираща област е подбрана от групата, състояща се от един интрон, една 5' декодираща област и една 3‘ декодираща област.
34. 34. Олигонуклеотиден праймер за амплифициране на човешка геномна ДНК кодираща ОВ полипептид.
35. 35. Олигонуклеотид съгласно претенция 32, който е подбран от групата, състояща се от:

    НОВ lgF 5’-CCCAAGAAGCCCATCCTG3’ (SEQ ID NO: 29);

    HOB lgR 5’-GACTATCTGGGTCCAGT GCC-3’ (SEQ ID NO: 30);

    HOB 2gF 5’-CCACATGCTGAGCACTT GTT-3’ (SEQ ID NO: 31); и

    HOB 2gR 5’-CTTCAATCCTGGAGATAC CTGG-3’ (SEQ ID NO: 32).
36. 36. Вектор, характеризиращ се c ДНК молекула съгласно всяка от претенции от 24 до 31.
37. 37. Експресионен вектор, характеризиращ се с ДНК молекула съгласно всяка от претенции 24, 26, 30 и 31, функционално свързан с една контролна експресионна последователност.
38. 38. Експресионен вектор, характеризиращ се с ДНК молекула съгласно претенция 27 или 29, функционално свързан с една контролна експресионна последователност.
39. 39. Експресионен вектор, характеризиращ се с ДНК молекула съгласно претенция 25, функционално свързан с една контролна експресионна последователност.
40. 40. Едноклетъчен гостоприемник, трансформиран или трансфектиран с ДНК молекула от претенция 24 или 25, или експресионен вектор съгласно всяка една от претенции от 36 до 39.
41. 41. Едноклетъчен гостоприемник съгласно претенция 40, който е подбран от групата, състояща се от бактерии, дрожди, клетки от бозайници, растителни клетки, клетки от насекоми и човешки клетки в клетъчна култура.
42. 42. Едноклетъчен гостоприемник съгласно претенция 40, който е подбран от групата, състояща се от Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожди, СНО, Rl.l, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 и Sf9 клетки.
43. 43. Едноклетъчен гостоприемник съгласно претенция 40, който е подбран от групата, състояща се от Saccharomyces, Pichia, Candida,

    Hansenula и Torulopsis.
44. 44. Клетка от бозайник, съдържаща кодираща ОВ полипептид ДНК последователност, която е модифицирана in vitro за по-висока експресия на ОВ полипептид с помощта на хомоложна рекомбинация, състояща се във вмъкване на регулаторна експресионна последователност във функционална близост с последователността, кодираща ОВ полипептида.
45. 45. Клетка съгласно претенция 44, където регулаторната експресионна последователност е регулаторна експресионна последователност на ОВ полипептида и хомоложната рекомбинация замества една регулаторна експресионна последователност на мутантен ОВ полипептид.
46. 46. Клетка съгласно претенция 45, където вмъкнатата регулаторна експресионна последователност де е регулаторна последователност на ОВ полипептид.
47. 47. Метод за получаване на ОВ полипептид, характеризиращ се с:

    (a) култивиране на клетка съгласно претенции 40 до 46, при условия, допринасящи за експресията на ОВ полипептида; и (b) получаване на експресирания ОВ полипептид.
48. 48. Метод съгласно претенция 47, където клетката е бактерия или дрожди.
49. 49. Метод съгласно претенция 47 или 48, който обхваща:

    (c) хроматография на ОВ полипептида на Ni-хелатна колона;

    (d) пречистване на ОВ полипептида с гел филтрация.
50. 50. Метод съгласно претенция 49, характеризиращ се по-нататък след етап (с) и преди етап (d) с хроматография на ОВ полипептида на силна катионообменна колона.
51. 51. Специфично антитяло спрямо ОВ полипептида, съгласно претенции от 1 до 16 или получено по метод, съгласно претенции от 47 до

    50.
52. 52. Антитяло съгласно претенция 51, което е моноклонално или поликлонално антитяло.
53. 53. Антитяло съгласно претенция 52, което е белязано с доловим белег.
54. 54. Обезсмъртена клетъчна линия, която продуцира моноклонално антитяло, съгласно претенция 52.
55. 55. Метод за получаване на антитяло спе

    146 цифично спрямо ОВ полипептида, характеризиращо се с:

    (a) свързване на един ОВ полипептид съгласно претенции 1 до 16 или получено по метод на претенции 47 до 50 с един белтък носител;

    (b) имунизиране на животно с конюгат от ОВ полипептиден фрагмент-белтък носител от етап (а), примесен с адювант; и (c) получаване на антитяло от имунизираното животно.
56. 56. Метод за измерване наличието на ОВ полипептид в проба, характеризиращ се с:

    (a) свързване на проба, за която се предполага, че съдържа ОВ полипептид, с антитяло, което се свързва специфично с ОВ полипептида при условия, благоприятстващи формирането на реакционни комплекси, характеризиращи се с антитяло и ОВ полипептид; и (b) откриване образуването на реакционни комплекси, характеризиращи се с антитяло и ОВ полипептид в пробата, където откриването на формираните реакционни комплекси указва наличието на ОВ полипептид в пробата.
57. 57. Метод съгласно претенция 56, при който антитялото е свързано с твърда фаза.
58. 58. Метод in vitro за определяне нивото на ОВ полипептида в биологична проба, характеризиращ се с:

    (a) откриване формирането на реакционни комплекси в биологична проба, съгласно претенция 56 или 57; и (b) определяне количеството на формираните реакционни комплекси, което количество реакционни комплекси съответства на нивото на ОВ полипептида в биологичната проба.
59. 59. Метод in vitro за откриване или диагностициране наличието на заболяване, свързано с повишени или намалени нива на ОВ полипептид в бозайници, характеризиращ се с:

    (a) определяне нивото на ОВ полипептида в биологична проба в бозайник, съгласно претенция 58; и (b) сравнение нивото, определено в етап (а) с нивото на ОВ полипептида в нормални индивиди или в индивида в по-ранен период, където повишеното ниво на ОВ полипептид в сравнение с нормалните нива показва заболяване, свързано с повишени нива на ОВ полипептид, а пониженото ниво на ОВ полипептид в сравнение с нормалните нива показва заболяване, свърза но с понижени нива на ОВ полипептид.
60. 60. Метод in vitro за проследяване на лечението на заболяване, свързано с повишени или понижени нива на ОВ полипептид в серии от биологични проби, получени в различни периоди от време от бозайник, подложен на лечение за заболяване, свързано с повишени или понижени нива на ОВ полипептид, съгласно метода на претенция 58.
61. 61. Фармацевтичен препарат, съдържащ ОВ полипептид, съгласно всяка от претенции от 1 до 16 или получен с процедурите на претенции 47 до 50 и един фармацевтично приемлив носител.
62. 62. Фармацевтичен препарат съгласно претенция 61 за намаляване на телесното тегло на животно.
63. 63. Фармацевтичен препарат за повишаване на телесното тегло на животно, характеризиращ се с един антагонист на ОВ полипептида, съгласно претенция от 1 до 16, или получен съгласно процедурата на претенции от 47 до 50 и един фармацевтично приемлив носител.
64. 64. Фармацевтичен препарат съгласно претенция 63, където антагонистът е подбран от групата, състояща се от едно антитяло, което се свързва със и неутрализира активността на ОВ полипептида, един фрагмент на ОВ полипептида, който се свързва, но не активира ОВ полипептидния рецептор и една малка молекула антагонист на ОВ полипептида.
65. 65. Козметичен препарат, подобряващ външния вид на тялото, за намаление на телесното тегло на индивида, характеризиращ се с ОВ полипептид, съгласно всяка от претенциите от 1 до 16 или получен по процедурата на претенции 47 до 50 и един приемлив носител.
66. 66. Козметичен'препарат, подобряващ външния вид, за повишаване на телесното тегло на индивида, характеризиращ се с един антагонист на ОВ полипептида, съгласно всяка от претенциите от 1 до 16 или получен по процедурата на претенции 47 до 50 и един приемлив носител.
67. 67. Козметичен препарат съгласно претенция 66, където антагонистът е подбран от групата, състояща се от антитяло, което се свързва за и неутрализира активността на ОВ полипептида, от един фрагмент на ОВ полипептида, който се свързва, но не активира ОВ полипептидния рецептор и една малка молекула антагонист на ОВ полипептида.

    147
68. 68. Използване на препарата, съгласно ко- ято и да е от претенциите от 64 до 67, за производство на лекарствено средство за модулиране на телесното тегло на индивида до желаното ниво. 5
69. 69. Използване на антисенс молекула нуклеинова киселина, способна да хибридизира с нуклеинова киселина кодираща ОВ полипептид, съгласно претенция от 1 до 4 или 9 за производство на медикамент за модифициране телесното тегло на бозайник.
70. 70. Използване на молекула нуклеинова киселина, кодираща ОВ полипептид съгласно всяка от претенциите от 1 до 16 или получена по процедура на претенции от 47 до 50 за производство на медикамент за генна терапия за модифициране на телесното тегло на животно.
71. 71. Използване на ОВ полипептид съгласно претенции от 1 до 16 или получаване по метод на претенции от 47 до 50 за производство на медикамент за модифициране на телесното тегло на животно.
72. 72. Използване на ОВ полипептид съгласно всяка от претенциите от 1 до 16 или получен по метод от претенции от 47 до 50 за производство на медикамент за модифициране на телесното тегло на бозайник при лечение на заболяване, подбрано от групата, състояща се от диабет, високо кръвно налягане и повишено ниво на холестерол.
73. 73. Използване на ОВ полипептид съгласно всяка от претенциите от 1 до 16 или получен по метод от претенции от 47 до 50 за производство на медикамент за модифициране на телесното тегло на бозайник, за използване в комбинация с медикамент за лечение на диабет, на високо кръвно налягане и повишен холестерол.
74. 74. Използване на антагонист на ОВ полипептид съгласно претенции от 1 до 16 или получен по метод от претенции от 47 до 50 за производство на медикамент за повишаване на телесното тегло на животно.
75. 75. Използването съгласно претенция 74, където антагонистът е подбран от групата, състояща се от едно антитяло, което се свързва и неутрализира активността на ОВ полипептида, един фрагмент на ОВ полипептида, който се свързва, но не активира ОВ полипептидния рецептор и една малка молекула антагонист на ОВ полипептида.
76. 76. Използването съгласно всяка от претенциите от 71 до 75 за производство на медикамент за интравенозно, интраартериално, интраперитонеално, интрамускулно, подкожно, назално, орално или белодробно въвеждане.