PL183352B1 - Modulatory ciężaru ciała, odpowiednie kwasy nukleinowe i białka i ich zastosowanie diagnostyczne i lecznicze - Google Patents

Modulatory ciężaru ciała, odpowiednie kwasy nukleinowe i białka i ich zastosowanie diagnostyczne i lecznicze

Info

Publication number
PL183352B1
PL183352B1 PL95319021A PL31902195A PL183352B1 PL 183352 B1 PL183352 B1 PL 183352B1 PL 95319021 A PL95319021 A PL 95319021A PL 31902195 A PL31902195 A PL 31902195A PL 183352 B1 PL183352 B1 PL 183352B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
histidine
seq
sequence
serine
Prior art date
Application number
PL95319021A
Other languages
English (en)
Other versions
PL319021A1 (en
Inventor
Jeffrey M. Friedman
Yiying Zhang
Ricardo Proenca
Margherita Maffei
Jeffrey L. Halaas
Ketan Gajiwala
Stephen K. Burley
Original Assignee
Univ Rockefeller
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/292,345 external-priority patent/US6001968A/en
Priority claimed from US08/438,431 external-priority patent/US6429290B1/en
Application filed by Univ Rockefeller filed Critical Univ Rockefeller
Publication of PL319021A1 publication Critical patent/PL319021A1/xx
Publication of PL183352B1 publication Critical patent/PL183352B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

1 . Polipeptyd otylosci (OB), rekombinowany albo syntetyzowany chemicznie albo jego pochodna, zawierajacy od okolo 145 do okolo 167 aminokwasów, zdolny do modulowania ciezaru ciala zwierzecia, albo jego odmiany alleltczne albo analogi, w tym fragmenty, wykazujace te sam a aktywnosc biologiczna, albo fragmenty immunogenne, znam ienny tym, ze obejmuje sekwencje aminokwasowa o Identyfikatorach Sekw. Nr 2 , 4 , 5 albo 6, albo ich odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty. 2. Immunogenny fragment polipeptydu OB wybrany z grupy obejmujacej: V al-P ro-Ile-G ln-L ys-V al-G ln-A sp-A sp-T hr-L ys-T hr-L eu-Ile-L ys-T hr (Identyfikator Sekw. Nr 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (Identyfikator Sekw. Nr 19); Scr-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Tbr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 20) i Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (Identyfikator Sekw. Nr 21); 3 Analog ludzkiego polipeptydu OB wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jeden lub wiele aminokwasów wybranych z grupy obejmujacej aminokwasy w pozycji 53, 71, 85, 89, 92, 9 8 , 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 i 166 (wedlug numeracji Identyfikatora Sekw. N r 4 ) podstawionych jest innym aminokwasem. 9. Polipeptyd OB wedlug zastrz. 1 albo 3, albo 6, znam ienny tym, ze wybrany jest z grupy polipeptydów: (a) pozbawionych reszt od 1 do 21, i (b) polipeptydów z punktu (a) majacych metionine w pozycji 21; albo majacych sekwencje glicyna-seryna-histydyna-metionma(Identyfikator Sekw. Nr 38) w pozycji od 18 do 2 1; albo majacych sekwencje metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-se- ryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-histydyna-metiontna (Identyfikator Sekw. Nr 98) w pozycji od 1 do 21. 75 Kompozycja farmaceutyczna do obnizenia ciezaru ciala zwierzecia, zawierajaca substancje czynna i nosnik dopuszczalny farmceutycznie, znam ienna tym, ze jako substancje czynna zastosowano polipeptyd OB wedlug zastrz. I albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19. 83. Kompozycja kosmetyczna poprawiajaca wyglad ciala, do zmniejszania ciezaru ciala osobnika, zawierajaca substancje czynna i dopuszczalny nosnik, znamienna tym, ze jako substancje czynna zastosowano polipeptyd OB wedlug zastrz. I albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie kontrolowania ciężaru ciała ssaków, w tym zwierząt i człowieka oraz zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych, do których te modulatory mogą być zastosowane.
Otyłość, określa jako nadmierna ilość tłuszczu w stosunku do beztłuszczowego ciężaru ciała, związana jest z poważną zachorowalnościąpsychologicznąi somatyczną, w tym nadciśnieniem, podwyższonym poziomem lipidów krwi i cukrzycą insulino-niezależną (NIDDM) albo
183 352 typu II. W USA żyje 6-10 milionów ludzi z NIDDM w tym 18% w populacji powyżej 65 roku życia (Harris i in., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)). Około 45% mężczyzn i 70% kobiet z NIDDM jest otyłych, a ich cukrzyca ulega zasadniczej poprawie albo wyleczeniu przez zmniejszenie ciężaru ciała (Harris, Diabetes Care 14(3):639-648 (1991)). Jak to opisano niżej, zarówno otyłość jak i NIDDM są w znacznym stopniu dziedziczne, chociaż geny predysponujące nie zostały zidentyfikowane. Podłoże genetyczne tych pokrewnych metabolicznie chorób jest istotnym, choć słabo poznanym problemem.
Asymilacja, magazynowanie i wykorzystywanie energii z substancji odżywczych stanowi złożony układ homeostatyczny kluczowy dla życia metazoa. U ssaków lądowych magazynowanie tkance tłuszczowej znacznych ilości energii, w postaci trój glicerydów jest kluczowe dla przeżycia w okresach pozbawienia żywności. Potrzeba utrzymywania stałego poziomu zasobów energii wymaga utrzymania równowagi pomiędzy poborem i wydatkiem energii. Jednakże, mechanizmy molekularne regulujące balans energetyczny pozostają niewyjaśnione. Izolacj a cząsteczek przewodzących informacj ę dotyczącą odżywiania i kontroluj ące równowagę energetyczną są kluczowe w poznaniu regulacji ciężaru ciała w stanie zdrowia i choroby.
Otłuszczenie jest w znacznym stopniu determinowane genetycznie. Badanie stopnia zgodności pomiędzy ciężarem ciała i otłuszczaniem pomiędzy bliźniętami jedno- i dwujajowymi i dziećmi adoptowanymi oraz ich biologicznymi rodzicami wskazuje, że dziedziczność otyłości (0,4-0,8) przekracza wielkością innych cech uważanych za wykazujące dziedziczenie takich jak schizofrenia, alkoholizm i miażdżyca (Stunkard i in., N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)). Opisywane sąrównież podobieństwa w tempie wydatku energetycznego (Bogardus i in., Diabetes, 35:1-5 (1986)). Badania genetyczne w populacjach ograniczonych geograficznie wskazują na względnie małą liczbę genów odpowiadającą za 30-50% zmienność składu ciała (Moll i in., Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255 (1991)). Jednakże, żaden z genów odpowiedzialnych za otyłość w publikacji ogólnej nie został zmapowany genetycznie w określonym miejscu chromosomalnym.
Modele gryzoni obejmująsiedem mutacji jednogenowych. Najintensywniej badaną mysią mutacją otyłości są geny ob (otyłość) i db (cukrzyca). Istniejące na tym samym podłożu szczepowym OB i db po wodują fenotypy nierozróżnialne metabolicznie i behawioralnie, co wskazuje, że geny te mogą działać na tym samym szlaku fizjologicznym (Coleman i in., Diabetologia 14:141-148(1987)). Myszy homozy gotyczne pod względem obu mutacj i są hiperfagiczne i hipometaboliczne, co prowadzi do fenotypu otyłości, zauważalnego w pierwszym miesiącu życia. Waga tych zwierząt stabilizuje się na poziomie 60-70 g (w porównaniu z 30-35 g dla myszy kontrolnych). Zwierzęta ob i db wykazują liczne inne zmiany hormonalne i metaboliczne co czyni trudnym identyfikację pierwotnego defektu spowodowanego mutacją (Bray i in., Am. j. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)). Każde z modeli otyłości gryzoni związany jest ze zmianami w metabolizmie węglowodanów, przypominającymi cukrzycę typu II u ludzi. W pewnych przypadkach, ciężkość cukrzycy zależy częściowo od szczepu stanowiącego podłoże (Leiter, Endocrinology 124:912-922 (1989)). Zarówno w przypadku ob jak i db kongeniczne myszy C57BL/Ks rozwijają ciężką cukrzycę z całkowitą martwicą komórek β i atrofią wysepek, powoduj ącą względną insulinopenię. W przeciwieństwie, kongeniczne myszy ob i db C57BL/6J rozwijają przejściową cukrzycę insulinoodpomą, kompensowaną ewentualnie przez hipertrofię komórek β przypominając ludzką cukrzycę typu II.
Fenotyp myszy ob i db przypomina otyłość ludzką w sposób inny niż rozwój cukrzycy zmutowane myszy jedzą więcej i zużywają mniej energii niż robią to myszy kontrolne o normalnym ciężarze (podobnie jak otyli ludzie). Fenotyp ten przypomina zachowanie obserwowane u zwierząt z uszkodzeniami podwzgórza brzuszno-przyśrodkowego, co wskazuje, że obie mutacje mogą zakłócić zdolność do prawidłowej integracji i odpowiedzi na sygnały dotyczące odżywiania w ośrodkowym układzie nerwowym. Dowody na tą hipotezę pochodzą z doświadczeń parabiozy (Coleman, Diabetologia 9:294-298 (1973)) sugerujących, że u myszy ob brak krążącego czynnika sytości oraz, że myszy ob są oporne na wpływ czynnika ob (prawdopodobnie z powodu defektu receptora ob). Doświadczenia te prowadzą do wniosku, że otyłość tych zmutowanych
183 352 myszy może wynikać z różnych defektów w części doprowadzającej pętli i/lub ośrodka integrującego postulowanego mechanizmu sprzężenia zwrotnego kontroli budowy ciała.
Stosując markery molekularne i genetyki klasycznej, zmapowano geny ob i db, odpowiednio, na ramię krótsze chromosomu 6 i środek chromosomu 4 (Bahary i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Fredman i in., Genomics 11:1054-1062 (1991)). W obu przypadkach, mutacje mapowały się na regiony mysiego genomu synteniczne z ludzkimi, co wskazuje, że jeżeli istnieją ludzkie homologi ob i db, będą się one mapowały, odpowiednio, na ludzkie chromosomy 7qi Ip. Defekty w genie db mogąpowodować otyłość u innych ssaków: w krzyżówkach genetycznych pomiędzy szczurami fa/fa Zuckera i szczurami +/+ szczepu Brown Norway, mutacja fa (szczurzy chromosom 5) jest flankowana przez te same loci co u myszy db (Truett i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806-7809 (1991)).
Z powodu licznych czynników, które wydająsię wpływać na ciężar ciała, nie było możliwe określenie, który czynnik, zaś w szczególności, który mechanizm homeostatyczny jest przede wszystkim odpowiedzialny za ciężar ciała. Tak więc, podstawowym problemem leżącym u podstaw niniejszego wynalazku było zapewnienie modulatorów ciężaru ciała, które umożliwiałoby kontrolowanie otłuszczenia i ilości tłuszczu u ssaków.
Nawiązując do niniejszego wynalazku, problem kontrolowania otłuszczenia ilości tłuszczu u zwierząt, zwłaszcza ssaków, został rozwiązany przez dostarczenie polipeptydów otyłości (OB) i cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących te polipeptydy jak to ujawniono poniżej. Niniej szy wynalazek dostarcza po raz pierwszy izolowanych polipeptydów skutecznych w modulowaniu, tj. kontrolowaniu i regulowaniu ciężaru ciała i otłuszczenia, jak również sekwencji kwasu nukleinowego kodujących te polipeptydy, które nie tylko umożliwiają rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydów OB, ale same też sąskuteczne w modulowaniu ciężaru ciała.
Polipeptydy otyłości (OB) według wynalazku obejmują od około 145 do około 167 aminokwasów, sązdolne do modulowania ciężaru ciała u zwierząt, a zwłaszcza u ssaków, i obejmują odmiany alleliczne albo analogi, włącznie z ich fragmentami wykazującymi tą samą aktywność biologiczną. Polipeptydy mogą być wytworzone metodami rekombinacyjnymi albo syntezą chemiczną. Korzystnie polipeptydy obejmują polipeptydy o sekwencjach aminokwasowych o Identyfikatorach Sekw. 2,4,5 i 6 albo ich odmiany alleliczne albo analogi, w tym ich fragmenty.
Immunogenne fragmenty polipeptydów OB według wynalazku obejmują: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 18); Leu-His-Pro-Ue-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (Identyfikator Sekw. Nr 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 20) i Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-val-Ser-Pro-Glu-Cys (Identyfikator Sekw. Nr 21).
Analogi ludzkich polipeptydów OB obejmują polipeptydy o ludzkich sekwencjach aminokwasowych o Identyfikatorach Sekw. Nr 4 i 6, w których jeden lub więcej aminokwasów o numerze 53, 71,85,89,92,98,110,118,121,122,126,127,128,129,132,139,157,159,163 i 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest innym aminokwasem takim jak różniące się aminokwasy mysiego polipeptydu OB jak to podano w Identyfikatorze Sekw. Nr 2, albo alaniną. Analogi takie obejmują również takie polipeptydy w których: (a) reszta serynowa w pozycji 53 podstawiona została glicyną, alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną (b) reszta serynowa w pozycji 98 podstawiona została glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną i (c) reszta argininowa w pozycji 92 podstawiona została asparaginą lizyną histydyną glutaminą kwasem glutaminowym, kwasem asparaginowym, seryną treoniną metioniną albo cysteiną. Analog polipeptydu OB według wynalazku wykazuje 84 procentową albo wyższą homologię z sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową ludzkiego polipeptydu OB według Identyfikatorów Sekw. Nr 2, 4, 5 albo 6.
Dodatkowe analogi ludzkiego polipeptydu OB według wynalazku mają sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 4 i 6, i mają: (a) jedną lub więcej reszt kwasu asparaginowego podstawionych jest kwasem glutaminowym, (b) jedną lub więcej reszt izoleucynowych podstawionych leucyną (c) jedną lub wiele reszt glicynowych albo walinowych jest podstawio
183 352 nych alaniną, (d) jedną lub więcej reszt argininowych podstawionych jest histydyną (e) jedną lub więcej reszt tyrozynowych albo fenyloalaninowych jest podstawionych tryptofanem, (f) jedną lub więcej reszt od 121 do 128(wedługnumeracjiIdentyfikatoraSekw.Nr4)podstawionych glicyną albo alaninąi (g) jedną lub więcej reszt w pozycji od 54 do 60 albo od 118 do 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych lizyną, kwasem glutaminowym, cysteiną albo proliną.
Korzystne okrojone analogi ludzkiego polipeptydu OB według wynalazku obejmują takie, w których (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4): (a) jedna lub więcej reszt w pozycji od 121 do 128 zostało usuniętych, (b) reszty 1-116 zostały usunięte, (c) reszty 1 -21 oraz od 54 do 167 zostały usunięte, (d) reszty 1 -60 i od 117 do 167 zostały usunięte, (e) reszty 1 -60 zostały usunięte, (f) reszty 1-53 zostały usunięte, i (g) analog części (a) w którym usunięte zostały reszty od 1 do 21. Polipeptydy OB i analogi polipeptydów OB według wynalazku, pozbawione 21 aminokwasowej sekwencji sygnałowej (np. aminokwasów od 1 do 21 Identyfikatora Sekw. Nr 4) mogąna swymkońcuNmieć (1) metioninę, (2) sekwencjęglicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38), (3) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolinaarginina-glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98), (4) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowyalanina (Identyfikator Sekw. Nr 26), (5) sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27), (6) sekwencję leucyna-kwas glutaminowylizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28), (7) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicynaleucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) i (8) sekwencję glicyna-seryna-prolina.
Pochodne polipeptydu OB według wynalazku mają przyłączoną jedną łub wiele chemicznych reszt, w tym rozpuszczalne w wodzie polimery takie jak poliglikol propylenowy. Pochodne derywatyzowane poliglikolem propylenowym mogą być mono-, di-, tri- albo tetrapegyłowane, np. pegylowane na końcu N. Korzystnie pochodne polipeptydów ob według wynalazku, pegylowane na końcu N, obejmuję polipeptydy OB obejmujące reszty aminokwasowe od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4 albo reszty od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6, ewentualnie zawierające (pegylowaną) metioninę w pozycji 21.
Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego dostarczone przez niniejszy wynalazek kodują polipeptyd OB, odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty jak to opisano wyżej. Dostarczone są zwłaszcza cząsteczki DNA do zastosowania w ekspresji polipeptydu OB, wykazującego aktywność biologiczną modulowania ciężaru ciała ssaka, wybranego z grupy obejmującej: (a) cząsteczki DNA pokazane jako Identyfikator Sekw. Nr 1 i Identyfikator Sekw. Nr 3 albo ich fragmentów; (b) cząsteczki DNA hybrydyzujące z cząsteczkami DNA określonymi wyżej w (a) albo hybrydyzujące z ich fragmentami; i (c) cząsteczki DNA kodujące sekwencje aminokwasowe kodowane przez którąkolwiek z wyżej wymienionych cząsteczek DNA. Przykładami takich cząsteczek są cząsteczki ludzkiego genomowego DNA o Identyfikatorze Sekw. Nr 22 i 24.
Korzystnie cząsteczki DNA według wynalazku kodują polipeptydy po sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako: (a) Identyfikator Sekw. Nr 2; (b) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 2; (c) Identyfikator Sek. Nr 4; (d) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4; (e) Identyfikator Sekw. Nr 5; (f) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 5 i (g) Identyfikator Sekw. Nr 6; i (h) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6, jak również polipeptydy posiadające aminokwasy końca N albo sekwencje aminokwasowe jak to pokazano wyżej. Dla celów demonstracji, korzystne cząsteczki DNA mają sekwencję podaną jako białko o sekwencji Identyfikatora Sekw. Nr 3 zaś w szczególności sekwencję podaną jako sekwencja aminokwasów od 22 do 167.
Dostarczone są również znakowane w sposób możliwy do wykrycia cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku, i obejmują
183 352 cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z regionem nie kodującym kwasu nukleinowego OB, który to region wybrany jest z grupy intronu, nie kodującego regionu 5'oraz nie kodującego regionu 3'. Niniejszy wynalazek dostarcza starterów oligonukleotydowych do amplifikacji ludzkiego genomowego DNA kodującego polipeptyd ob tak jak oligonukleotydy pokazane jako Identyfikatory Sekw. Nr 29 do Nr 32.
Wektory dostarczone przez niniejszy wynalazek obejmują cząsteczkę DNA według wynalazku jako to opisano wyżej i korzystnie mają postać wektora ekspresyjnego obejmującego cząsteczkę DNA połączoną funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję. Komórki jednokomórkowego gospodarza są transformowane albo transfekowane cząsteczkami DNA według wynalazku albo wektorem jak to opisano wyżej. Korzystnie komórki gospodarza według wynalazku obejmująbakterie, drożdże, komórki ssacze, komórki roślinne, komórki owadzie i komórki ludzkie w hodowli. Przykładowo, takie komórki gospodarza są wybrane z grupy obejmującej komórki E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, drożdży, CHO, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 i Sf9. Korzystne komórki drożdży obejmują Sacharomyces, Pichia, Candida, Hansenula i Torulopsis. Dostarczone są również komórki ssaków zawierające sekwencje DNA kodujące polipeptyd ob i zmodyfikowane in vitro w sposób umożliwiający wyższą ekspresję polipeptydu ob metodą zjawiska rekombinacji homologicznej polegającego na wprowadzeniu sekwencji regulujących ekspresję w pobliżu sekwencji kodującej polipeptyd ob. Sekwencja regulująca ekspresję może być sekwencją regulującą ekspresję polipeptydu ob albo nie, albo może być zastąpiona zmutowanąsekwencjąregulatorowąpolipeptydu ob w komórce.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania polipeptydu ob obejmującego: (a) hodowanie komórki jak to opisano wyżej w warunkach zapewniających ekspresję polipeptydu ob', i (b) odzyskiwania ekspresjonowanego polipeptydu ob. Procedurze tej mogą towarzyszyć etapy: (c) oczyszczania chromatograficznego polipeptydu na kolumnie chelatującej Ni; i (d) oczyszczania polipeptydu filtracją żelową. W korzystnym wykonaniu, po etapie (c) i przed etapem (d) metoda obejmuje chromatografię polipeptydu ob na kolumnie silnego wymiennika anionowego. Niniejszy wynalazek dostarcza również znakowanych i nie znakowanych przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych swoistych wobec polipeptydów ob według wynalazku i nieśmiertelnych linii komórkowych wytwarzających przeciwciało monoklonalne według wynalazku. Wytwarzanie przeciwciał według wynalazku obejmuje: (a) koniugację polipeptydu ob z białkiem nośnikowym; (b) immunizowanie zwierzęcia koniugatem fragmentu polipeptydu OB z białkiem nośnikowym według etapu (a) zmieszanym z adiuwantem; i (c) pozyskiwanie przeciwciał od immunizowanego zwierzęcia.
Wynalazek dostarcza sposobów do mierzenia obecności polipeptydu OB w próbce, obejmującego: (a) doprowadzenie do kontaktu próbki podejrzewanej o obecność polipeptydu OB z przeciwciałem (korzystnie związanym z podłożem stałym), które swoiście wiąże polipeptyd OB w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksów obejmujących przeciwciało i polipeptyd OB; i (b) wykrywanie tworzenia kompleksów obejmujących przeciwciało i polipeptyd ob w próbce, przy czym wykrycie tworzenia kompleksów wskazuje na obecność polipeptydu OB w próbce. Nawiązując, dostarczone są sposoby in vitro badania poziomu polipeptydu OB w próbce biologicznej obejmujące: (a) wykrywanie tworzenia kompleksów w próbce biologicznej, w oparciu o sposoby opisane wyżej; i (b) określanie ilości wytworzonych kompleksów, która odpowiada poziomowi polipeptydu OB w próbce biologicznej. Przy wykrywaniu albo diagnozowaniu obecności choroby związanej z podwyższonym albo zmniejszonym poziomem polipeptydu OB według wynalazku, wykonywane jest powyższe badanie zaś stwierdzony poziom jest porównywany z poziomem polipeptydu OB stwierdzanym u normalnego osobnika albo osobnika badanego wcześniej. Zwiększenie poziomu polipeptydu OB w porównaniu z normalnymi albo poprzednimi poziomami wskazuje na chorobę związaną z podwyższonym poziomem polipeptydu OB, zaś obniżenie poziomu polipeptydu OB w porównaniu z poziomem normalnym wskazuje na chorobę związaną z obniżeniem poziomu polipeptydu OB. Nawiązując, dostarczono sposobów in vitro monitorowania leczenia chorób związanych z podwyższonym albo obniżo
183 352 nym, poziomem polipeptydu OB u osobników ssaczych, obejmujących badanie, jak to opisano wyżej, poziomów OB w szeregu próbek biologicznych uzyskanych w różnych punktach czasu od osobnika ssaczego poddawanego leczeniu.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku, obejmująpolipeptyd OB jak to opisano wyżej, wraz z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie, i są przydatne w sposobach leczniczych zmniejszania ciężaru ciała zwierzęcia. Oprócz tego, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku, do zastosowania w sposobach leczniczych zwiększania ciężaru ciała zwierzęcia, zawierają antagonistę polipeptydu OB, korzystnie wybranego z grupy obejmującej przeciwciało wiążące i neutralizujące aktywność polipeptydu OB, fragment polipeptydu ob wiążący, ale nie aktywujący receptor polipeptydu OB i antagonistę drobnocząsteczkowego polipeptydu OB. Niniejszy wynalazek dostarcza również odpowiedniej kompozycji kosmetycznej poprawiającej wygląd ciała, do zmniejszania albo zwiększania ciężaru ciała osobnika, która jest przydatna w procesach kosmetycznych poprawiających wygląd ciała osobnika. Takie kompozycje kosmetyczne podawane są osobnikowi w ilości odpowiedniej do modulowania ciężaru ciała osobnika na odpowiednim poziomie.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania gramocząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, jak również cząsteczek anty sensownego kwasu nukleinowego zdolnych do hybrydyzacji z kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd OB według wynalazku, do wytwarzania lekarstwa do (np. w terapii genowej) modyfikowania ciężaru ciała zwierzęcia. Dostarczono również zastosowania polipeptydu OB albo antagonisty według wynalazku do wytwarzania lekarstwa do modyfikowania ciężaru ciała zwierzęcia. Lekarstwa opracowane w ten sposób, mogą być zastosowane do modyfikowania ciężaru ciała ssaka w leczeniu chorób wybranych z grupy obejmującej cukrzycę, podwyższone ciśnienie krwi i podwyższony cholesterol oraz jako część leczenia skojarzonego z lekami do leczenia tych chorób. Leki takie mogą być zastosowane w sposobach leczenia obejmujących układy do podawania dożylnego, dotętniczego, dootrzewnowego domięśniowego, podskórnego, donosowego, doustnego albo dopłucnego. Przedstawione tu dane pokazują, że polipeptydy OB według wynalazku w swej postaci wydzielane są głównie przez adipocyty ssaków i że działają jako hormony.
Przykłady przedstawione tu pokazują że polipeptyd OB, zwany inaczej Teptyną’, krąży w osoczu myszy, szczura i człowieka. Leptynajest nieobecna w osoczu myszy ob/ob i jest obecna w stężeniu dziesięciokrotnie wyższym w osoczu myszy db/db, i dwudziestokrotnie wyższym w osoczu szczurówfa/fa. Co najważniejsze, codzienne zastrzyki rekombinowanej leptyny dramatycznie zmniejszają ciężar ciała myszy ob/ob, znacznie wpływają na ciężar ciała myszy typu dzikiego i nie wywierają wpływu na myszy db/db.
W dalszym aspekcie, polipeptyd ob z jednego gatunku jest biologicznie czynny w innym gatunku. W szczególności, ludzki polipeptyd OB jest czynny u myszy.
W pierwszym rzędzie, modulatory według niniejszego wynalazku obejmują cząsteczki kwasu nukleinowego, w tym cząsteczki rekombinowanego DNA (np. cDNA albo wektory zawierające cDNA albo izolowany genomowy DNA) albo klonowane geny (tj. izolowany genomowy DNA) albo ich zdegenerowane odmiany, kodujące polipeptydy, które same służą jako modulatory do kontrolowania ciężaru jak to dalej określono, albo ich zakonserwowane odmiany albo fragmenty, szczególnie fragmenty pozbawione peptydu sygnałowego (określane tu inaczej jako polipetydy dojrzałego OB), które to polipeptydy mająsekwencję aminokwasowąjak pokazana na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 2), figurze 3 (Identyfikator Sekw. Nr 4), figurze 5 (Identyfikator Sekw. Nr 5) i figurze 6 (Identyfikator Sekw. Nr 6). W szczególnych wykonaniach, dostarczone są sekwencje aminokwasowe dla dwóch odmian mysich i ludzkich polipeptydów ob. Oba polipeptydy są spotykane w postaci pozbawionej glutaminy w pozycji 49, co może wynikać z anomalii składania mRNA. Polipeptydy OB z różnych gatunków mogą wykazywać znacznąhomologię; jak to pokazano na figurze 4, w przypadku mysiego i ludzkiego polipeptydu OB wynoszącą ponad 80%.
Cząsteczki kwasu nukleinowego, cząsteczki rekombinowanego DNA albo klonowane geny mogąmieć sekwencję nukleotydowąalbo być komplementarne z sekwencjami kodującymi
183 352
DNA jak pokazane na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), i figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3). W szczególności, takie cząsteczki DNA mogą być cDNA albo genomowym DNA izolowanym z chromosomu. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą odpowiadać sekwencjom flankującym 5' albo 3' sekwencji DNA albo intronowego DNA. Nawiązując, niniejszy wynalazek dotyczy również identyfikacji kwasu nukleinowego mającego sekwencję nukleotydową wybraną spośród sekwencji figur od 1 A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), i figur od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3) i odmian zdegenerowanych, odmian allelicznych i podobnych cząsteczek. Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może być DNA albo RNA, w tym ich odmianami syntetycznymi zawierającymi wiązania fosforanowe albo analogi wiązań fosforanowych np. tiofosforanowe. Rozważane są tu zarówno sekwencje jednojak i dwuniciowe.
Niniejszy wynalazek dostarcza również cząsteczek kwasu nukleinowego do zastosowania jako sondy molekularne albo jako startery do amplifikacji reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), tj. syntetyczne i naturalne oligonukleotydy mające sekwencję odpowiadającą części sekwencji pokazanych na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3) oraz figurach od 20A do C (Identyfikatory Sekw. Nr 22 i Nr 24) albo sekwencje flankujące 5' i 3' sekwencje kodujące albo sekwencje intronowe genomowego DNA. W szczególności, wynalazek rozważa cząsteczki kwasu nukleinowego posiadające co najmniej 10 nukleotydów, których sekwencja kwasu nukleinowego odpowiada sekwencji nukleotydowej o tej samej liczbie nukleotydów w sekwencjach nukleotydowych pokazanych na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3) oraz figurach od 20A do C (Identyfikatory Sekw. Nr 22 i Nr 24) albo sekwencjach do nich komplementarnych. Bardziej korzystnie, sekwencje kwasu nukleinowego zawierające najmniej 15 nukleotydów zaś jeszcze korzystnie co najmniej 20 nukleotydów. W jednym z wykonań wynalazku, w którym oligonukleotyd jest sondą znakowaną w sposób umożliwiający wykrywanie, np. radioizotopem (takim jak 32P) albo enzymem.
W dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza wektora do klonowania, obejmującego kwasy nukleinowe według wynalazku, kodujące polipeptyd ob; oraz wektory ekspresyjne bakteryjne, owadzie i ssacze, obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, kodujące polipeptyd ob, funkcjonalnie związany z sekwencją kontrolującą ekspresję. Nawiązując, wynalazek dalej dotyczy komórki gospodarza, takiej jak komórka bakteryjna, komórka drożdży, komórka owada albo komórka ssaka i odpowiednio, zastosowania wyżej wymienionego konstruktu do wytwarzania modulatorów według wynalazku. W jeszcze dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał wiążących polipeptyd ob. Przeciwciała takie mogą być wywołane przeciwko polipeptydowi pełnej długości albo jego fragmentom antygenowym. W jednym z aspektów, przeciwciała takie hamują czynność (tj. modulowanie ciężaru ciała i zawartości tłuszczu) polipeptydu ob. W innym aspekcie, przeciwciała mogą być zastosowane w celu określenia poziomu krążącego polipeptydu ob w osoczu albo surowicy. W jeszcze innym aspekcie, przeciwciała swoiste wobec regionu, szczególnie przeciwciała monoklonalne mogą być zastosowane jako sondy budowy polipeptydu OB.
Wszystkie z powyższych materiałów rozważane są jako modulatory ciężaru ciała i zawartości tłuszczu oraz jako takie mogą być zastosowane w wielu kontekstach. Szczególnie, wynalazek rozważa zarówno zastosowania diagnostyczne jak i terapeutyczne, jak również pewne zastosowania gospodarcze, możliwe do zastosowania dzięki zdefiniowanym tu modulatorom, obejmującym zarówno cząsteczki kwasu nukleinowego jak i peptydy. Ponadto, modulowanie ciężaru ciała prowadzi do pewnych terapeutycznych implikacji i korzyści, dzięki którym stan otyłości albo, przeciwnie, kocheksji, może być leczony przez podawanie jednego lub wielu modulatorów według niniejszego wynalazku.
Tak więc, zaproponowano sposób modulowania ciężaru ciała ssaka polegający na kontrolowaniu ekspresji białka kodowanego przez kwas nukleinowy o sekwencji nukleotydowej wybranej spośród przedstawionych na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3 ) albo ich odmian zdegenerowanych albo allelicznych.
183 352
Kontrola ta może być sprawowana przez wprowadzenie rzeczonych nukleotydów metodami terapii genowej do komórek tłuszczowych pacjenta albo gospodarza, w celu kontrolowania albo zmniejszania otyłości. I przeciwnie, wytwarzanie i podawanie antagonistów nukleotydów, takich jak cząsteczki antysensowne, będzie wskazane i wykonywane w przypadku gdy występująi są leczone stany obejmujące nadmierną utratę ciężaru, takie jak anoreksja, rak czy AIDS. Konstrukty takie, w celu wywołania takich zmian, powinny być wprowadzane w sposób analogiczny do nukleotydów, bezpośrednio do komórek tłuszczowych.
Odpowiednio, białka określone przez figury od 1A do, 3,5 i 6 (Identyfikatory Sekw. Nr 1, Nr 4, Nr 5 i Nr 6), ich zakonserwowane odmiany, fragmenty czynne i poznane drobne cząsteczki, mogą być przygotowywane do bezpośredniego podawania w celach leczniczych, w celu wywołania zmniejszenia albo kontrolowania nadmiernej ilości tłuszczu w organizmie albo wzrostu ciężaru. Nawiązując, przeciwciała albo inni antagoniści wymienionych substancji białkowych, takich jak ich fragmenty, mogą być wytwarzane i podawane podobnie, w celu wywołania efektu przeciwnego. Nawiązując, wynalazek jest korzystnie skierowany na kompozycję farmaceutyczną obejmującą polipeptyd OB według wynalazku albo przeciwnie, jego antagonistę w mieszaninie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem albo zaróbką. Dodatkowo, polipeptyd OB według wynalazku, może być podawany dla swych efektów kosmetycznych, np. poprawy wyglądu ciała przez zmniejszenie odkładania tłuszczu. Polipeptyd OB może być stosowany dla swych efektów kosmetycznych niezależnie albo w połączeniu z innymi strategiami kosmetycznymi, np. chirurgią.
Zastosowanie diagnostyczne nukleotydów i odpowiednich peptydów rozciągająsię na zastosowanie kwasów nukleinowych w celu identyfikacji innych mutacji ich odmian allelicznych, w celu opracowania repertuaru czynnych substancji nukleotydowych przydatnych w zastosowaniach zarówno diagnostycznych jak i terapeutycznych. W szczególności, zarówno mutacje homozygotyczne jak i heterozygotyczne rzeczonych nukleotydów mogą być zidentyfikowane co może być wykorzystane do bardziej precyzyjnego określenia stanu pacjenta, w celu określenia ryzyka związanego z otyłością osobnika. Konkretnie, mutacje heterozygotyczne są uważane za związane z umiarkowaną otyłością podczas gdy mutacje homozygotyczne mogą być związane z bardziej zaznaczoną albo ciężką otyłością. Badanie odpowiedniego DNA może być przeprowadzone z użyciem wspomnianych materiałów jako wskazówek, w celu ulepszenia dokładnej prognozy długoterminowej konkretnych tendencji, tak by można było określić zmiany w diecie albo innych nawykach, albo w celu kierowania interwencj i terapeutycznej, w celu poprawy tych stanów.
Przydatność diagnostyczna niniejszego wynalazku rozszerza się o sposoby mierzenia obecność i ilości modulatorów według wynalazku, w próbkach komórek albo wyciągów (czy próbek) biologicznych pobranych od badanego osobnika, tak, że mogą być zmierzone zarówno ilości kwasów nukleinowych (genomowego DNA albo mRNA) i/łub poziomy białka w tych próbkach. Zakładając, że zwiększona aktywność nukleotydu albo obecność powstałego białka odzwierciedla zdolność osobnika do hamowania otyłości, lekarz oglądający takie wyniki badania osobnika otyłego może określić czy czynnik inny niż zaburzenie obecności czy aktywności nukleotydów według wynalazku jest przyczyną stanu otyłości. I odwrotnie, obniżony poziom nukleotydu i/lub ekspresjonowanego białka wskazuj e, że poziom ten musi być podwyższony w celu leczenia stanu otyłości i powinien być wdrożony odpowiedni schemat leczenia.
Dalej, nukleotydy odkryte i przedstawione na figurach od 1A do E i 2A do B przedstawiają cDNA, który, jak to określono pokrótce wyżej, jest przydatny w mierzeniu odpowiedniego RNA. Podobnie, rekombinowany materiał białkowy odpowiadający polipeptydom na figurach od 1A do E i 3, może być wytworzony i odpowiednio znakowany do zastosowania, przykładowo, w testach radioimmunologicznych do, przykładowo, mierzenia poziomu w tkance tłuszczowej i/lub w osoczu białka OB, albo do wykrywania obecności i poziomu receptora białka OB w tkankach takich jak podwzgórze.
Dalej, niniejszy wynalazek rozważa nie tylko identyfikację nukleotydów i odpowiadających im białek, ale i badanie receptorów w tym materiale. W tym kontekście, polipeptydy na figurach od 1A do E, 3, 5 i/lub 6, mogą być wytworzone i zastosowane do przesiewania od
183 352 powiedniej biblioteki ekspresyjnej albo w połączeniu z ligandem, mogą być zastosowane do poszukiwania małych cząsteczek, które mogą posiadać aktywność modulatorów.
Jeszcze dalej, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych obejmujących ich pewne modulatory, korzystnie polipeptydy, których sekwencje przedstawione sąjako Identyfikator Sekw. Nr 2, Identyfikator Sekw. Nr 4, Identyfikator Sekw. Nr 5 i Identyfikator Sekw. Nr 6, ich przeciwciała, odpowiednie modulatory drobnocząsteczkowe albo ich antagoniści, albo ich aktywne fragmenty przygotowane jako postacie dawkowania do różnych sposobów podawania, gdy takie leczenie jest odpowiednie. Postacie te zawierają nośniki dopuszczalne farmaceutycznie albo inne adiuwanty, o ile to konieczne, i mogą być wytwarzane w efektownym zakresie dawek możliwym do określenia przez klinicystę albo innego lekarza.
Nawiązując, podstawowym celem -wynalazku jest dostarczenie modulatorów ciężaru ciała jak to tu określono, w postaci oczyszczonej, wykazujących szczególne właściwości i aktywności związane z kontrolowaniem i zmianą otłuszczenia i zawartości tłuszczu w organizmie ssaków.
Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie sposobów wykrywania i pomiaru modulatorów kontrolujących ciężar, takich jak wymienione uprzednio, jako sposób efektywnej diagnozy i monitorowania stanów patologicznych, w których zmiana poziomu tych modulatorów jest lub może być cechą charakterystyczną. Jeszcze dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu i związanego z nim układu testowego do przesiewania substancji takich jak leki, czynniki itp., które sąpotencjalnie efektywne w naśladowaniu albo hamowaniu aktywności modulatorów według wynalazku, w organizmach ssaków.
Jeszcze dalszym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu leczenia ssaków, w celu kontrolowania ciężaru ciała i zawartości tłuszczu u ssaków, i/lub leczenia pewnych stanów patologicznych w których cechą charakterystyczną jest nienormalne zmniejszenie albo zwiększenie ciężaru ciała.
Jeszcze dalszym celem wynalazku jest wytworzenie konstruktów genetycznych do zastosowania w protokołach terapii genowej i/lub kompozycjach farmaceutycznych porównywalnych sposobów leczenia, obejmujących albo opartych na jednym lub wielu modulatorach, składowych wiązania albo czynnikach, które mogą kontrolować ich wytwarzanie albo mogą naśladować albo działać przeciwstawnie do ich aktywności. Inne cele i zalety staną się oczywiste dla specjalistów po przeczytaniu niniejszego opisu, poprzedzanych przez opis poniższych rysunków.
Figura 1 (od A do E) przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (Identyfikator Sekw. Nr 1) i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. Nr 2) uzyskaną z mysiego cDNA OB. Sekwencja liderowa 5' długości 39 par zasad, poprzedza przewidywaną otwartą ramkę odczytu o 167 aminokwasach, i sekwencję nie ulegającą translacji 3'wielkości około 3,7 kb. (W uprzednio zgłoszonym zgłoszeniu nr 08/347,563 z dnia 30 listopada 1994 i nr 08/438,431 z dnia 10 maja 1995, dodatkowe 58 zasad nie ulęgającej translacji sekwencji 5'okazało się być artefaktem klonowania. Artefakt ten nie został umieszczony w regionie kodującym, nie ulegającym translacji regionie 5'długości 39 par zasad przedstawionym na figurze 1 czy regionie nie kodującym 3' tego genu). Pokazano całość około 2500 par zasad nie ulęgającej translacji sekwencji 3'. Analiza przewidzianej sekwencji aminokwasowej wizualnie i programem komputerowym SigSeą wskazuje na obecność sekwencji sygnałowej (podkreślona). Zaobserwowano mikroheterogenność cDNA, objawiającą się tym, że około 70% cDNA miało kodon glutaminy w pozycji 49 zaś 30% nie miało (patrz figury 5 i 6, wyżej). Aminokwas ten podkreślono, jak również podkreślono argininę zmutowaną u myszy ob/ob C57BL/6j (myszy U).
Figura 2 (A i B) pokazuje sekwencję nukleotydową(Identyfikator Sekw. Nr 3) uzyskaną z cDNA ludzkiego OB. Nukleotydy są numerowane od 1 do701 z miejscem startu w pozycj i nukleotydowej 46 i miejscem przerwania w pozycji nukleotydowej 550.
Figura 3 przedstawia wywnioskowaną sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. Nr 4) uzyskaną dla genu ludzkiego OB odpowiednio do sekwencji kwasu nukleinowego na figurze 2 A i B. Aminokwasy numerowane są od 1 do 167. Miejsce odcięcia sekwencji sygnałowej położone
183 352 jest po aminokwasie nr 21 (Ala) tak, że białko dojrzałe ciągnie się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 167 (Cys).
Figura 4 przedstawia porównanie pomiędzy wywnioskowanymi sekwencjami aminokwasowymi: mysią (Identyfikator Sekw. Nr 2) i ludzką (Identyfikator Sekw. Nr 4). Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa ludzkiego OB jest wysoce homologiczna z mysią sekwencją. Zmiany konserwatywne zaznaczono kreskami zaś nie konserwatywne gwiazdkami. Zmienny kodon glutaminy zaznaczono podkreśleniem, podobnie jak położenie mutacji nonsensownej u myszy ob/ob C57BL/6J (1J). Ogólnie, występuje 84% identyczność na poziomie aminokwasowym, jakkolwiek stwierdzono tylko sześć podstawień pomiędzy waliną w pozycji 22 (bezpośrednio poniżej sekwencji sygnałowej) i cysteiną w pozycji 117.
Figura 5 przedstawia sekwencję aminokwasowąpełnej długości (Identyfikator Sekw. Nr 5) uzyskaną dla genu mysiego OB jak to pokazano na figurze 3, ale pozbawionego glutaminy w pozycji 49. Aminokwasy numerowe są od 1 do 166. Miejsce odcięcia sekwencji sygnałowej położone jest po aminokwasie 21 (Ala) (a więc, przed delecjąglutaminy w pozycji 49) tak, że dojrzałe białko ciągnie się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 166 (Cys).
Figura 6 przedstawia domniemaną sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. Nr 6) uzyskaną dla genu ludzkiego OB jak to pokazano na figurze 4, ale pozbawionego glutaminy w pozycji 49. Aminokwasy numerowe są od 1 do 166. Miejsce odcięcia sekwencji sygnałowej położone jest po aminokwasie 21 (Ala) (a więc, przed delecją glutaminy 49) tak, że dojrzałe białko ciągnie się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 166 (Cys).
Figura 7. (A) Mapa fizyczna położenia ob na chromosomie mysim i mapy klonowania YAC i Pl. „M i N” odpowiadająmiejscom restrukcyjnym Muli i Notl. Liczby odpowiadająpojedynczym zwierzętom które były rekombinowane w regionie ob po zliczonych 1606 mej ozach. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl 3 i Cpa dotyczą położeń w regionie ob z którymi wiążą się sondy DNA. YAC wyizolowano przy użyciu sond D6Rckl3 i Pax-4, zaś końce uzyskano stosując metodę „vectorette PCR” i/lub „ratowania końców plazmidu” i zastosowano do izolowania nowych YAC. (B) Powstała wstawka YAC. Jedna z tych wstawek YAC, Y902A0925, była chimeryczna. Każda z sond zastosowanych do genotypowania zwierząt rekombinowanych zaznaczona została nawiasami. (6) Odpowiada YAC 107; (5) odpowiada Ml 6(+) (albo Ml 6(pLUS)); (4) odpowiada adu(+); (3) odpowiada aać/(pICL); (2) odpowiada 53(pICL) i (1) odpowiada 53(+). (C) Wstawka Pl klonów bakteriofaga Pl izolowanych wybranymi sondami końców YAC. Gen ob izolowano w izolowanym klonie Pl stosując koniec dystalny YAC YB6S2F112 (koniec (4)) (zwany inaczej adiĄ+)).
Figura 8 przedstawia fotografię zabarwionych bromkiem etydyny 192 niezależnych izolatów z czterech doświadczeń typu „exon trapping”, które amplifikowano PCR i charakteryzowano.
Figura 9 jest fotografią zabarwionych bromkiem etydyny klonów amplifikowanych PCR, podejrzewanych o to, że zawierająob. Każdy z 7 klonów, które nie zawierały artefaktu ponownie amplifikowano stosując PCR i poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym w TBE i barwiono bromkiem etydyny. Znacznikami wielkości (najbardziej z lewej, ścieżka nie numerowana) są dostępne w handlu „1 kB ladder”. Ścieżka 1 - klon 1D12, zawierający „sekwencję HI V”. Ścieżka 2 - klon 1F1, nowy klon poza regionem ob. Ścieżka 3 - klon 1H3. Ścieżka 4 - klon 2B2, identyczny z 1F1. Ścieżka 5 - klon 2G7, zawierający egzon ob. Ścieżka 6 - klon 2G11, identyczny z 1F1. Ścieżka 7 - klon 2H1, nie zawierający wstawki.
Figura 10 przedstawia sekwencję klonu 2G7 (Identyfikator Sekw. Nr 7), obejmującąegzon kodujący część genu OB. Sekwencje starterów zastosowane do amplifikacji tego egzonu zaznaczono na figurze ramkami (Identyfikator Sekw. Nr 8 i 9).
Figura 11 (A) analiza mRNA metodą odwrotnej transkrypcji-PCR, z różnych tkanek tej samej myszy z użyciem starterów 2G7 i starterów aktyny. Reakcję RT-PCR wykonywano stosując 100 ng całkowitego RNA poddanego transkrypcji ze starterem oligo dT do syntezy pierwszej nici cDNA. Amplifikację PCR wykonywano przez 35 cykli denaturacji w 94°C przez 1'; hybrydyzacji w 55°Ć przez Γ i wydłużania w 72°C przez 2 minuty z 1 sekundowym samowydłużaniem przy każdym cyklu. Produkty RT-PCR rozdzielano na 2% żelu z agarozy
183 352 o niskiej temperaturze topnienia w lx buforze TBE. (B) Badanie metodą northem biot mRNA z różnych narządów myszy z użyciem sondy 2G7 znakowanej PCR. 10 pg całkowitego RN A z każdej z tkanek poddano elektroforezie na żelu agarozowym z formaldehydem. Sondę hybrydyzowano w 65°C w Rapid Hybe (Amersham). Sygnały autoradiograficzne były widoczne po godzinie ekspozycji; pokazane doświadczenie było wynikiem ekspozycji 24-godzinnej.
Figura 12 (A) barwienie bromkiem ety dyny reakcji RT-PCRz RN A komórek tłuszczowych (tkanka tłuszczowa biała) z każdego z wymienionych szczepów myszy. Całkowity RN A (100 ng) dla każdej próbki poddano odwrotnej transkrypcji stosując oligo dT i odwrotną transkryptazę, zaś powstały jednoniciowy cDNA amplifikowano PCR z użyciem starterów 2G7 (prążki dolne) i starterów aktyny (prążki górne). W tej samej reakcji PCR zastosowano startery 2G7 i aktyny. Produkty rozdzielono na 1 % żelu agarozowym w TBE. (B) Analiza metodąnorthem biot odpowiednio do (A). 10 pg RNA komórek tłuszczowych (tkanka tłuszczowa biała) z każdego ze szczepów poddano elektroforezie i sondowano sondą2G7 znakowania w PCR, jak na figurze 11B, wyżej. W RNA białej tkanki tłuszczowej ze szczepu C57BL/6J ob/ob (U) obserwowano, w porównaniu ze zdrowym rodzeństwem, około 20-krotny wzrost poziomu mRNA 2G7. W doświadczeniu RT-PCRjak i metodąnorthem, nie występował zauważalny sygnał RNA 2G7 od myszy SM/Ckc_+Dacob2J/ob2J (2 J) nawet po 2-tygodniowej ekspozycji. Pokazano autoradiogram po 24godzinnej ekspozycji.
Figura 13 pokazuje analizę metodą northem biot dodatkowych zwierząt 2J i zwierząt kontrolnych, potwierdzającą brak mRNA ob u zwierząt 2J. Analiza metodąnorthem została wykonana jak na figurach 11 i 12. W tym przypadku, RNA kontrolnym był ap2, transkrypt swoisty dla tkanki tłuszczowej. Nie było istotnej zmienności w różnych gęstościach prążków ap2.
Figura 14 porównuje sekwencję DNA myszy C57BL/6J (normalnych) z sekwencjąDNA myszy C57BL/6J ob/ob (1J) w regionie mutacji punktowej prowadzącej do wprowadzenia przedwczesnego kodonu stop (mutacja nonsensowna) z cDNA zmutowanego szczepu. Myszy ob/ob mają mutację C->T, która zmienia resztę argininy w pozycji 105. Ta zmiana zasady pokazana jest na wyniku z automatycznego sekwenatora DNA. RT-PCR wykonano z użyciem RNA z białej tkanki tłuszczowej obu szczepów (+/+ i ob/ob) stosując startery z nie ulegających translacji regionów 5' i 3'. Produkty PCR oczyszczano na żelu i sekwenjonowano bezpośrednio ręcznie albo stosując automatyczny sekwensator Applied Biosystems, Inc. 373A, ze starterami wzdłuż obu nici całej sekwencji kodującej.
Figura 15 (A) badanie metodą Southern biot genomowego DNA z każdego z wymienionych szczepów myszy. Około 5 pg DNA (uzyskanego z genomowego DNA otrzymanego z wątroby, nerki albo śledziony) trawiono restrykcyjnie wskazanym enzymem restrykcyjnym. DNA poddawano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym w TBE i sondowano 2G7 znakowanym w PCR. Trawienie restrykcyjne Bglll wykazało zwiększenie wielkości fragmentu Bglll wielkości około 9 kB (największego) W DNA SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J (2J). RELP nie był wykrywalny przy zastosowaniu innego enzymu. Wstępne mapowanie restiykcyjne genomowego DNA wskazało, że polimorficzne miejsce Bglll znajduje się około 7 kB powyżej miejsca początku transkrypcji. Żaden z badanych enzymów nie pokazywał miejsca startu mRNA. (B) Segregacja polimorfizmu Bglll w szczepie SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J, Sześć otyłych i pięć szczupłych myszy potomnych z tego samego pokolenia koizogenicznych kolonii SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J (2 J) genotypowano przez ocenę polimorfizmu Bglll jak to pokazano w (A) wszystkie fenotypowo otyłe myszy były homozygotyczne pod względem dużych alleli polimorficznego fragmentu Bglll. DNA w „kontrolnej” ścieżce przygotowano z nie spokrewnionych myszy SM/Ckc-+Dac+/+, hodowanych oddzielnie od kolonii SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J.
Figura 16 jest badaniem metodą Southern biot genomowego DNA trawionego EcoRI z wymienionych gatunków, przy zastosowaniu cDNA OB jako sondy (tj. zoo biot). Sygnały hybrydyzacyjne były wykrywalne w każdej próbce kręgowców, nawet po hybrydyzacji w warunkach umiarkowanej surowości. DNA kota w tym doświadczeniu był nieco zdegradowany. DNA cięty restrykcyjnie poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym w TBE i przeniesiono na membranę immobilon w celu sondowania. Filtry hybrydyzowano w 65°C i płukano dwukrot
183 352 nie po 20 minut w 2x SSC/0,2% SDS w 65°C po czym eksponowano na nie filmy Kodak XOMAT (Rochester, N.Y.) przez 3 dni.
Figura 17 pokazuje region klonowania ekspresyjnego wektora pET-15b (Novagen) (Identyfikator Sekw. Nr 11 i 12).
Figura 18 przedstawia analizę eluatu z kolumny żywicy wiążącej His (Ni) na rekombinowane dojrzałe białko fuzyjne ob ze znacznikiem His 9 A) i dojrzałe ludzkie białko fuzyjne OB ze znacznikiem His (B). Bakterie transformowano, odpowiednio, wektorami pETM9 i pETH14. Po indukcji 1 mM IPTG w warunkach optymalnych, transformowane bakterie były zdolne do wytwarzania 100-300 pg/ml białka fuzyjnego OB, głównie jako ciałka wtrętowe. Ciałka wtrętowe rozpuszczano 6M chlorowodorkiem guanidyny albo mocznikiem, zaś białko fuzyjne (obecne w nadsączu z lizy) nakładano na kolumnę z żywicy wiążącej His (Ni) w 10 ml 1 x buforu do wiązania, z mocznikiem. Kolumnę eluowano stopniowo porcjami po 5 ml 20 μΜ, 60 μΜ i 300 μΜ imidazolu zaś na koniec buforem „zdzierającym”. Porcje analizowano na obecność fuzji polipeptydu OB na 15% żelu akrylamidowym. Każda ze ścieżek zawierała ekwiwalent 100 μΐ ekstraktu bakterii.
Figura 19 (A) translacja in vitro RNA OB. cDNA ludzkiego OB wklonowano do wektora pGEM. Plazmid linearyzowano i syntetyzowano nić plus RNA stosując polimerazę Sp6. RNA syntetyzowany in vitro poddawano translacji w obecności lub pod nieobecność błon mikrosomalnych trzustki psa. Po translacji in vitro, widoczny był główny produkt translacji wielkości około 18 kDa. Dodatek błon mikrosomalnych do reakcji prowadził do obecności drugiego produktu translacji mniejszego o około 2 kDa od głównego produktu translacji. Wielkość produktu translacji RNA IL-Ια, pozbawionego sekwencji sygnałowej, była nie zmieniona przez dodanie błon mikrosomalnych. Dane te wskazują na obecność funkcjonalnej sekwencji sygnałowej. (B) Translacja in vitro w obecności i pod nieobecność proteinazy K. Traktowanie proteazą powodowało całkowitą proteolizę głównego produktu translacji o wielkości 19/8 kDa, podczas gdy poddana obróbce postać 16 kDa pozostawała nietknięta. Rozpuszczanie mikrosomów 0,1% Tritonem-Xl 00 czyniło postać poddaną obróbce wrażliwą na proteolizę. Wyniki te wskazują że produkt ulegał translacji do światła mikrosomów.
Figura 20 (od A do E) sekwencja genu ludzkiego OB (Identyfikator Sekw. Nr 22 i 24). (F) Schemat genu mysiego OB. (G) Schemat ludzkiego genu OB. Zarówno w (F) jak i (G), podkreślono kodony start i stop. Nie ma dowodów na homologię pierwszego intronu ludzkiego genu z pierwszym intronem genu mysiego, ale jej obecności nie można wykluczyć.
Figura 21 przedstawia schemat jednej ze strategii klonowania zastosowanej w celu uzyskania rekombinacyjnej ekspresji OB w drożdżach Pichia. (A) Wektor ekspresyjny OB z sekwencją sygnałową czynnika cc (B) Schemat struktury rekombinowanego białka fuzyjnego, obejmującego sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. Nr 26), pokazujący miejsce Xhol i prawdopodobne miejsce cięcia ΚΕΧ-2 i STE-13 oraz nadmiar N-końcowych aminokwasów po cięciu ΚΕΧ-2 (Identyfikator Sekw. Nr 27). (C) Alternatywna strategia wytwarzania dojrzałego OB obejmuje wytwarzanie konstruktu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej miejscu cięcia Xhol i miejscu cięcia ΚΕΧ-2 bezpośrednio powyżej sekwencji dojrzałego polipeptydu ob (Identyfikator Sekw. Nr 28).
Figura 22. Alternatywna strategia ekspresji w Pichia. (A) Wektor ekspesyjny fuzji OB ze znacznikiem His, zaadoptowany z układu ekspresyjnego pET pod kontrolą sekwencji sygnałowej czynnika a (Identyfikator Sekw. Nr 33). (B) Schemat budowy rekombinowanego białka fuzyjnego OB zawierającego znacznik His, które obejmuje sekwencję sygnałową czynnika a, prawdopodobne miejsce cięcia ΚΕΧ-2 i STE-13, znacznik His i miejsce cięcia trombiny, które powinno dać OB z trzema dodatkowymi aminokwasami N-końcowymi.
Figura 23 (A) Analiza PAGE ekspresji mysiego OB (obu postaci mikroheterogennych, tj. zawierającej i pozbawionej Gin 49) w transformowanych drożdżach Pichia. Oczekiwany prążek wielkości około 16 kDa jest widzialny w płynie hodowlanym transformowanych drożdży (ścieżka druga i trzecia) ale nie w płynie hodowlanym z drożdży nie transformowanych (ścieżka pierwsza). (B) Analiza PAGE częściowo oczyszczonego rekombinowanego polipeptydu OB na
183 352 karboksymetylocelulozie, słabym wymienniku kationowym. Prążek wielkości około 16 kDa jest wyraźnie widoczny we frakcjach 3 i 4 z kolumny, które eluowano 250 mm NaCl. Ścieżka 1 nałożona próbka; ścieżka 2 - eluent; ścieżki od 3 do 5 - frakcje eluowane 250 mM NaCl.
Figura 24 pokazuje, że białko OB krąży w osoczu myszy (A) immunoprecypitat z krwi mysiej. 0,5 ml osocza mysiego sklarowania na nie koniugowanej sepharozie i inkubowano przez noc z oczyszczonym immunologicznie przeciwciałem przeciwko OB skoniugowanym z perełkami sepharozy 4B. Immunoprecypitat rozdzielono na 15% żelu SDS-PAGE, przeniesiono i poddano badaniu metodą western biot z przeciwciałem przeciwko OB. Białko migrowało z ciężarem cząsteczkowym rzędu 16 kDa, w tym samym położeniu co oczyszczone dojrzałe mysie białko ob ekspresjonowane w drożdżach. Białko było nieobecne w osoczu myszy C57BL/6J ob/ob i zwiększało się około 10-krotnie w osoczu myszy C57B1/6J db/db w porównaniu z myszami typu dzikiego. Sugeruje się, że myszy db nadmiernie ekspresjonująbiałko OB, wtórnie do odporności na jego wpływ. (B) podwyższony poziom OB u otyłych szczurów. Szczur otyły jest taki w wyniku recesywnej mutacji w chromosomie 5. Dane genetyczne wskazują na defekt w tym samym zmutowanym genie co mysz db. Osocza od szczurów otyłych i szczupłego rodzeństwa poddano immunoprecypitacji i badaniu metodą western biot. U zwierząt zmutowanych obserwuje się dwudziestokrotny wzrost krążącego OB. (C) Określanie ilościowe białka OB w osoczu myszy. Zwiększające się ilości rekombinowanego białka mysiego dodawano do 100 μΐ osocza od myszy ob i immunoprecypitowano. Intensywność sygnału w badaniu western biot porównywana była z intensywnością 100 μΐ osocza od myszy dzikich. Obserwowano liniowe zwiększanie intensywności sygnału wraz ze zwiększaniem ilości dodawanego rekombinowanego białka, co świadczyło o tym, że immunoprecypitację wykonywano w warunkach nadmiaru przeciwciał. Podobne sygnały obserwowano w próbce surowicy typu dzikiego i próbce z 2 ng białka rekombinowanego co wskazuje, że poziom krążący u myszy wynosi około 20 ng/ml. (D) białko OB w ekstraktach tkanki tłuszczowej. Ekstrakty cykloplazmatyczne mysiej tkanki tłuszczowej wytworzono z myszy db i typu dzikiego. Badanie metodą western biot wykazało, że zwiększony poziom białka 16 kDa w ekstraktach wytworzonych z myszy db.
Figura 25 pokazuje, że białko OB krąży w różnych poziomach w ludzkich osoczach. (A) Badanie western biot ludzkiego osocza. Próbki osocza uzyskano od sześciu szczupłych ochotników. Immunoprecypitacja i badanie western biot wykazało obecność immunoaktywnego białka 16 kDa, identycznego pod względem wielkości z rekombinowanym białkiem ludzkim wielkości 146 aminokwasów, ekspresjonowanym w drożdżach. Zmienne poziomy białka obserwowano w każdej z sześciu próbek. (B) ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny) na ludzkie ob. Płytki do mikromiareczkowania opłaszczono oczyszczonym immunologicznie przeciwciałem przeciwko ludzkiemu OB. Znane ilości białka rekombinowanego dodawano do płytek i wykrywano stosując oczyszczone immunologicznie biotynowane przeciwciała przeciwko ob. Absorbencję przy 414 nm, wykreślano w stosunku do znanych stężeń OB dających krzywą wzorcową. Powstała krzywa standardowa pokazywała, że test jest zdolny do wykrycia 1 ng/ml lub więcej ludzkiego białka OB. (C) Określanie ilościowe białka OB w osoczu ludzkim. Test ELISA wykonywano stosując po 100 pl osocza od sześciu szczupłych ochotników i standardy zastosowane w panelu B. Poziomy białka OB wahały się od 2 ng/ml u HP1 do 15 ng/ml u HP6. Dane te korelują z danymi z badania western biot w panelu A.
Figura 26 pokazuje, że białko OB tworzy wewnątrz- i między cząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe. (A) badanie western biot w warunkach redukujących i nie redukujących. Badanie western biot osoczy mysich i ludzkich powtarzano z i bez dodatku czynników redukujących w buforze do próbek. Gdy β-merkaptoetanol pominięto w buforze do próbek, immunoprecypitaty z osocza db migrowały z domniemanym ciężarem cząsteczkowym 16 kDa i 32 kDa. Dodanie β-merkaptoetanolu prowadziło do zniknięcia cząstki 32 kDa (patrz figura 24). Wynik ten jest powtarzany gdy białko mysie jest ekspresjonowane w drożdżach Pichia pastoris. W tym wypadku, mysie białko OB migrowało jako dimer. W warunkach redukujących oczyszczone rekombinowane białko mysie migrowało z domniemanym ciężarem cząsteczkowym równym 16 kDa, wskazując, że postać 32 kDa jest wynikiem jednego lub dwóch międzycząsteczkowych wiązań
183 352 dwusiarczkowych. Ludzkie białko ekspresjonowane in vivo oraz z Pichiapastoris migrowało z ciężarem cząsteczkowym 16 kDa zarówno w warunkach.redukujących jak i nie redukujących (dane nie pokazane). (B) Ludzkie białko ekspresjonowane w drożdżach zawiera międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe. Białka wydzielane posiadały ich prawidłową konformację gdy były ekspresjonowane w układzie ekspresyjnym Pichia pastoris. Dojrzałe białko ludzkie wielkości 146 aminokwasów, było ekspresjonowane w Pichiapastoris i oczyszczane z pożywki drożdżowej w dwuetapowym protokole oczyszczania obejmującym IMAĆ i filtrację żelową. Oczyszczone białko rekombinowane poddawane było spektrometrii masowej przed i po rozszczepieniu bromkiem cyjanogenu. Bromek cyjanogenu przecinał na końcu karboksylowym reszty metioninowej. Ciężar cząsteczkowy rekombinowanego białka drożdżowego wynosił 16,024 ±3 Da (obliczony ciężar cząsteczkowy = 16,024 Da). Bromek cyjanu ciął po trzech resztach metioninowych w sekwencji białka w pozycjach aminokwasowych 75, 89 i 157. Fragment po reakcji z bromkiem cyjanogenu o zmierzonym ciężarze cząsteczkowym 8435,6 Da odpowiadał aminokwasom 90-157 i 158-167 połączonych wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy Cys-117 i Cys-167 (obliczony ciężar cząsteczkowy = 8434,5 Da). N.D. = nie wykryto.
Figura 27 przedstawia wytwarzanie aktywnego biologicznie białka rekombinowanego. Sekwencję nukleotydowąodpowiadającą dojrzałemu mysiemu białku OB o 145 aminokwasach, wklonowano do wektora ekspresyjnego pET 15b. Wektor ten wprowadzał ciąg polihistydyny (znacznik His) powyżej klonowanej sekwencji, co umożliwiało wydajne oczyszczanie przy zastosowaniu układu Immobilized Metal Affmity Chromatography (IMAĆ). Rekombinowane białko bakteryjne po lizie bakterii grupowało się początkowo w nierozpuszczalnej frakcji błonowej. Frakcję błonową rozpuszczano chlorowodorkiem guanidyny i wprowadzano do kolumny IMAĆ. Białko eluowano stopniowo przez zwiększanie stężenia imidazolu, co pokazano. Eluowane białko ponownie fałdowano i traktowano trombiną w celu usunięcia znacznika His, jak to opisano niżej. Uzysk końcowy białka rozpuszczalnego wynosił 45 ng/ml hodowli bakterii.
Figura 28 pokazuje biologiczne skutki białka OB. Przebieg czasowy przyjmowania pożywienia (panele A-C) i ciężaru ciała (panele D-F). Grupy po 10 zwierząt otrzymywały codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe białka OB w dawce 5 mg/kg/dzień (wypełnione kwadraty), codzienne wstrzyknięcia PBS (wypełnione kółka) lub nie otrzymywały żadnego leczenia (wypełnione trójkąty). Grupy leczone obejmowały myszy C57BL/6J ob/ob (panele A i D), C57BL/Ks db/db (panele B i E) i myszy CBA/J +/+ (panele C i F). Przyjmowanie pożywienia mierzono codziennie zaś ciężar ciała rejestrowano, jak to zaznaczono, w odstępach trzy-cztero dniowych (skala ciężaru ciała jest różna dla myszy typu dzikiego w stosunku do myszy ob i db). Przyjmowanie pożywienia przez myszy ob otrzymujące białko było zmniejszone po pierwszym wstrzyknięciu i utrzymywało się po czterech dniach na poziomie około 40% obserwowanego w grupie leczonej pozornie (p< 0,001). Ciężar ciała tych zwierząt zmniejszał się przeciętnie o 1,3 g/dzień i ustalił się po trzech tygodniach na poziomie 60% ciężaru wyjściowego (p <0,0001). Nie wykazano żadnego wpływu białka na myszy db. Niewielki ale znaczący wpływ na ciężar ciała obserwowano u myszy CBA/J w dwóch wczesnych punktach czasu (p <0,02). Błąd standardowy każdego pomiaru przedstawiono jako słupek zaś istotność statystyczną tych wyników pokazano na tabeli 1.
Figura 29 pokazuje wyniki sparowanego karmienia myszy ob. (A) Grupa czterech myszy C57BL/6J karmiona była ilościąpożywienia równa konsumowanej przez grupę myszy ob otrzymujących rekombinowane białko. Utrata ciężaru u obu grup była obliczana po pięciu, ośmiu i dwunastu dniach. Myszy o ograniczanym dostępie do pożywienia traciły ciężar mniej (słupek kreskowany) niż myszy ob otrzymujące białko (słupek pełny) (p <0,02). Wynik ten wskazuje, że wpływ białka OB na utratę ciężaru jest wynikiem zarówno wpływu na przyjmowanie pożywienia jak i wpływem na wydatek energii. (B) Fotografia leczonych myszy ob. Pokazano dwie myszy C57BL/6J ob/ob. Mysz po lewej otrzymywała PBS i ważyła 65 gramów, co stanowiło ciężar wyjściowy. Mysz po prawej otrzymywała codzienne wstrzyknięcia rekombinowanego białka OB. Ciężar wyjściowy tego zwierzęcia wynosił również 65 g, zaś po trzech leczeniach wynosił 38 gramów. (C) wątroby z myszy ob traktowanych i nie traktowanych. Pokazane są wątroby od leczonych i nie leczonych myszy C57BL/6J. Wątroba od myszy otrzymującej PBS ma
183 352 wygląd makroskopowy wątroby stłuszczałej i waży 5,04 g. Wątroba od myszy otrzymującej białko rekombinowane ma wygląd normalny i waży 2,23 g.
Figura 30 pokazuje hybrydyzację in situ w tkance tłuszczowej ob. RNA ob sensowny i antysensowny znakowano in vitro stosując polimerazę Sp6 i T7 oraz digoksygeninę. Znakowane RNA hybrydyzowano z zatopionymi w parafinie skrawkami tkanki tłuszczowej z poduszeczek tłuszczowych najądrzy ośmiotygodniowych myszy C57BL/Ks (oznaczone typ dziki) i C57BL/Ks db/db (oznaczone db}. Na Figurze, kropelki tłuszczu widoczne są jako niezabarwione wokuale wewnątrz komórek. Cytoplazma stanowi cienki rąbek na obwodzie komórek i jest nieodróżnialna od błony komórkowej. Hybrydyzację z wszystkimi adipocytami w polu widzenia wykrywano w skrawkach typu dzikiego wyłącznie z sondą antysensowną zaś znacznie zwiększony poziom obserwowany był w skrawkach tkanki od zwierząt db/db.
Figura 31 pokazuje, że RNA OB ulega ekspresji w adiopocytach in vivo i in vitro. Całkowity RNA (10 pg) z kilku różnych źródeł poddano elektroforezie, przeniesiono na membrany i hybrydyzowano z sondą ob. Najpierw, w celu oczyszczenia adiopocytów wykorzystano różnicę w ciężarze komórek po trawieniu kolagenazą. RNA dla OB był obecny wyłącznie we frakcji adipocytów. Ścieżka S pokazuje frakcję zrębu i naczyń zaś ścieżka A pokazuje frakcję adiopocytów. Oprócz tego, RNA dla OB nie ulegał ekspresji w niezróżnicowanej linii preadipocytów 3T3-442 w ścieżce U. Zróżnicowane adipocyty z tej linii komórkowej ekspresjonowały wyraźne poziomy mRNA OB (ścieżka D).
Figura 32 pokazuje, że RNA dla OB ulega ekspresji we wszystkich miejscach odkładania tkanki tłuszczowej. Wszystkie z badanych miejsc tkanki tłuszczowej ekspresjonowały RNA dla ob. Pachwinowe poduszeczki tłuszczowe ekspresjonowały nieco niższy poziom RNA, ale poziom sygnału był zmienny w różnych doświadczeniach. (Figura 31 A) Ścieżki: poduszeczki tłuszczowe (1) najądrzy, (2) pachwinowe, (3) brzuszne, (4) przymaciczne. Tkanka tłuszczowa brązowa ekspresjono wała niskie poziomy RNA dla OB. (Figura 3 IB) Poziom ekspresji OB w tkance tłuszczowej brązowej był niezmieniony u zwierząt hodowanych w 4°C przez tydzień podczas gdy ilość RNA dla UCP, swoistego dla tkanki tłuszczowej brązowej, możliwej do indukowania zimnem, zwiększyła się pięciokrotnie.
Figura 33 przedstawia ekspresję RNA dla OB u myszy db/db oraz myszy traktowanych aurotioglukozą. Całkowity RNA z poduszeczek tłuszczowych przymacicznych myszy db/db i traktowanych aurotioglukozą(GTG) poddawano elektroforezie i badaniu metodą northern biot. GTG podawano w pojedynczej dawce, co jak wiadomo, powoduje otyłość przez wywoływanie uszkodzenia podwzgórza. (A) Jednomiesięczne samice CBA traktowano GTG (0,2 mg/g), powodując zwiększenie ciężaru>20g, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (<5 g). (B) Hybrydyzacja sondy OB z RNA od myszy db/db i traktowanych GTG wykazała dwudziestokrotny wzrost ilości RNA dla ob w stosunku do RNA kontrolnego (aktyna albo GAPDH).
Figura 34 przedstawia analizę metodą northern biot ludzkiego RNA. 10 mg całkowitego RNA z ludzkiej tkanki tłuszczowej (FAT, panel A) i 2 mg poliA+ RNA z innych tkanek ludzkich (panel B) hybrydyzowano w badaniu northern biot z ludzkimi sondami: ob albo β-aktyny, jak to zaznaczono. W całkowitym RNA z tkanki tłuszczowej obserwowano wyraźny sygnał wielkości około 4,5 kb. Hybrydyzacja z poliA+ RNA wykazała wykrywalne sygnały w sercu (HE) i łożysku (PL), podczas gdy nie stwierdzono RNA OB w mózgu (BR), płucach (LU), wątrobie (LI), mięśniach szkieletowych (SM), nerce (KI) i trzustce (PA). W każdym wypadku, zaznaczono długość ekspozycji autoradiogramu. Należy zaznaczyć, że nieznane jest pochodzenie prążków o mniejszej wielkości obserwowanych w RNA łożyska (np. alternatywne składanie, degradacja RNA).
Figura 35 przedstawia wstawkę YAC zawierającą ludzki gen OB i 8 znaczników mikrosatelitamych. Przedstawiono mapę regionu chromosomu 7 zawierającego gen ludzkiego OB, w oparciu o YAC, z uwzględnieniem zawartych STS, wywnioskowaną przez program SEGMAP/version 3.29 (Green i in., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)). Na górze wymieniono 19 unikalnie uporządkowanych STS (patrz tabela 3). 8 STS swoistych dla mikrosatelitów zaznaczono gwiazdkami (patrz, tabela 4). Zaznaczono również STS odpowiadające genom Pax4 i OB,
183 352 jak również przewidywane położenia centromeru (CEN) i telomeru (TEL) względem wstawki. Każdy z 43 klonów YAC oznaczony jest jako poziomy słupek, z nazwą podaną po lewej, zaś oznaczona wielkość YAC (w kb, co zmierzono elektroforezą na żelu w zmiennym polu elektrycznym) podana jest w nawiasie. Obecność STS w YAC zaznaczona jest zaciemnionym kółkiem w odpowiedniej pozycji. Gdy STS odpowiada końcowi wstawki YAC, naokoło odpowiedniego kółka umieszczono kwadrat, zarówno na górze (w pobliżu nazwy STS) jak i na końcu YAC, z którego został uzyskany. Dla pięciu YAC na dole (poniżej poziomej przerywanej linii), nie wykryto (przez badanie pojedynczych YAC przy użyciu testu PCR swoistego dla STS, przynajmniej dwukrotnie) 1 albo więcej STS, które jak oczekiwano, są obecne w (w oparciu o ustalony porządek STS), i te są zaznaczone jako puste kółka w odpowiednich pozycjach. Większość YAC izolowano z biblioteki uzyskanej z komórek hybrydowych ludzko-chomiczych (Green i in., Genomics 25:170-183 (1995)), jak zaznaczono ich oryginalnymi nazwami. Pozostałe YAC izolowano z bibliotek całkowitego ludzkiego genomowego DNA, zaś ich oryginalne położenia w bibliotece podano w tabeli 3. Ramki umieszczono wokół nazw trzech YAC (yWSS691, yWSS999 i yWSS2935), które znaleziono dzięki analizie FISH podczas mapowania 7q31.3. Wstawkę przedstawiono w jej postaci „nieprzetworzonej”, gdzie nie stosowano wielkości YAC do ustalenia nakładek klonów albo odstępów pomiędzy STS, a więc wszystkie STS są przedstawione w równych odstępach. W postaci „przetworzonej”, gdzie zastosowano wielkości YAC do oceny względnych odległości oddzielających sąsiadujące STS jak również wielkość nakładek klonu, całkowita wielkość wstawki obejmuje, jak się wydaje, ponad 2 Mb.
Niniejszy wynalazek dotyczy objaśnienia i wykrycia białka, określanego tu jako polipeptyd ob albo leptyna, kwasów nukleinowych kodujących białko, w tym jego zdegenerowane odmiany, np. zawierające optymalne kodony dla ekspresji w konkretnym układzie ekspresyjnym, które to białko wykazuje zdolność do współuczestnictwa w kontrolowaniu ciężaru ciała ssaka. Kwasy nukleinowe w tym celu przedstawiają sekwencje kodujące odpowiadające mysiemu i ludzkiemu polipeptydowi OB, który jak się postuluje odgrywa krytyczną rolę w regulacji ciężaru ciała i otłuszczenia. Dane przedstawione tu wskazują, że polipeptyd będący produktem kwasu nukleinowego według wynalazku wydzielany jest przez komórki które go ekspresjonują, oraz, że polipeptyd działa jako hormon. Dodatkowe dane doświadczalne pokazują, że polipeptyd OB jest bardzo efektywny w leczeniu otyłości u myszy obarczonej mutacją w genie ob. Oprócz tego, duże dawki w bolusie albo umiarkowane ciągłe dawkowanie polipeptydu OB powodują zmniejszenie ciężaru normalnych myszy (typu dzikiego).
Oprócz tego, zamieszczone przykłady pokazują, że polipeptyd OB, zwany tu inaczej „leptyną”, krąży w osoczu myszy, szczurów i ludzi. Leptyna jest nieobecna w osoczu myszy ob/ob i jest obecna w stężeniu dziesięciokrotnie wyższym w osoczu myszy db/db, i dwudziestokrotnie wyższym w osoczu szczurówfa/fa. Co najważniejsze, codzienne zastrzyki rekombinowanej leptyny dramatycznie zmniejszają ciężar ciała myszy ob/ob, znacznie wpływają na ciężar ciała myszy typu dzikiego i nie wywierają wpływu na myszy db/db.
W dalszym aspekcie, polipeptyd ob z jednego gatunku jest biologicznie czynny w innym gatunku. W szczególności, ludzki polipeptyd OB jest czynny u myszy.
W najważniejszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy identyfikacji substancji działających jako modulatory ciężaru ciała ssaków. W szczególności, wynalazek dotyczy izolacji, oczyszczania i sekwencjonowania konkretnych kwasów nukleinowych odpowiadających genowi OB albo jego regionowi kodującemu u myszy i ludzi, jak również odpowiednich polipeptydów ekspresjonowanych przez te kwasy nukleinowe. Wynalazek obejmuje więc odkrycie kwasów nukleinowych o sekwencjach nukleotydowych pokazanych na figurach od 1 A do E (Identyfikator Sekw. Nr. 1) i figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3) i odmian zdegenerowanych, odmian allelicznych albo ich fragmentów, wykazujących aktywność modulowania ciężaru ciała i otłuszczenia. Pokrewieństwo niniejszych kwasów nukleinowych z genem OB świadczy o ich znaczącym wpływie na takie stany jak otyłość, jak również inne choroby i zaburzenia gdzie czynnikiem głównym jest nienormalny ciężar ciała. Wynalazek rozciąga się na białka ekspresjonowane przez kwasy nukleinowe według wynalazku, zaś w szczególności na białka przed
183 352 stawione na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 2), figurze 3 (Identyfikator Sekw. Nr 4), figurze 5 (Identyfikator Sekw. Nr 5) i figurze 6 (Identyfikator Sekw. Nr 6), jak również na zakonserwowane odmiany, fragmenty czynne i pokrewne niewielkie cząsteczki.
Jak to dyskutowano wcześniej, peptydowe modulatory ciężaru ciała albo substancje wiążąceje albo inne ligandy albo czynniki wykazujące działanie naśladujące albo antagonizm albo kontrolujące ich wytwarzanie, mogą być włączone do kompozycji farmaceutycznych, z odpowiednim nośnikiem oraz w ilości efektywnej do podawania różnymi sposobami pacjentowi doznającemu nienormalnych fluktuacji ciężaru ciała albo otłuszczenia, pojedynczo albo jako część niekorzystnych stanów takich jak rak albo AIDS, do ich leczenia. Mogą być wykorzystane liczne techniki podawania, w tym podawanie doustne, donosowe i inne postacie podawania przezśluzówkowego, techniki pozajelitowe takie jak wstrzyknięcia podskórne, dożylne i dootrzewnowe, oraz kateteiyzację itp. Przeciętna ilość czynników albo ich podjednostek może być różna zaś w szczególności powinna opierać się na zaleceniach i wskazaniach wykształconego lekarza albo weterynarza.
Zgodnie z powyższym, może być wytworzony układ testowy, do przeszukiwania potencjalnych leków przydatnych w naśladowaniu albo działaniu przeciwstawnym do aktywności modulatora ciężaru ciała. Modulator ciężaru ciała może być wprowadzony do układu testowego, zaś ewentualny lek może być również wprowadzony do powstałej hodowli komórkowej, po czym hodowla może być badana przez obserwację zmian w aktywności komórek, na skutek dodania ewentualnego leku samego, albo na skutek dodanej ilości znanego modulatora ciężaru.
Jak stwierdzono wcześniej, klonowanie molekularne genu OB, doprowadziło do identyfikacji klasy substancji działających na poziomie molekularnym w sposób modulujący ciężar ciała ssaka. Odkrycie modulatorów według wynalazku ma istotne implikacje dla diagnostyki i leczenia zaburzeń odżywiania, w tym, choć nie wyłącznie otyłości, utraty ciężaru ciała z powodu raka oraz leczenia chorób związanych z otyłością takich jak nadciśnienie, choroby serca i cukrzyca typu II. Oprócz tego istnieją potencjalne zastosowania gospodarcze produktu genowego, w przypadkach gdy istnieje konieczność modulowania ciężaru ciała zwierząt domowych. Na koniec, ponieważ jeden lub wiele modulatorów według wynalazku są cząsteczkami wydzielanymi, mogą być zastosowane biochemicznie do izolowania ich receptorów z użyciem technologii klonowania ekspresyjnego. Poniższa dyskusja, szczególnie odnosząca się do genu OB, znajduje zastosowanie w przypadku klasy modulatorów, które stanowią część niniejszego wynalazku i jest w ten sposób zgodna z zakresem interpretacji.
Jak zaznaczono wyżej, aktywność funkcjonalna polipeptydu OB może być badana transgenicznie. W tym celu, może być zastosowany model myszy transgenicznej. Gen ob może być zastosowany do badań komplementacyjnych z użyciem myszy transgenicznych. Przy użyciu izolowanego genu ob mogą być konstruowane wektory transgeniczne, w tym wektory wirusowe albo klony kosmidowe (albo klony fagowe) odpowiadające locus typu dzikiego potencjalnego genu. Kosmidy mogą być wprowadzane do organizmu myszy transgenicznych przez zastosowanie opublikowanych procedur (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)). Konstrukty są wprowadzane do zapłodnionych jaj uzyskanych ze skrzyżowania potomstwa FI krzyżówki międzyszczepowej C57BL/6J ob/obxDBA. Krzyżówki te wymagajązastosowania przeszczepu jajnika C57BL/6J ob/ob w celu wyhodowania zwierząt FI. Myszy DBA/2J stosuje się w celu wprowadzenia koloru, ponieważ posiadają one kolor inny niż agouti co jest istotne w przypadku przeszczepów jajnika. Genotyp w loci ob kosmidów zwierząt transgenicznych może być określony przez typowanie zwierząt ściśle powiązanymi RFLP albo mikrosatelitami flankującymi mutację oraz, które są polimorficzne pomiędzy szczepami macierzystymi. Komplementację można wykazać, gdy konkretny konstrukt czyni genetycznie otyłe zwierzęta F2 (co określono analizą RELP) szczupłymi i bez cukrzycy. Pod tym warunkiem, końcowy dowód komplementacji wymaga aby zwierzęta ob/ob albo db/db niosące transgen były skrzyżowane ze zwierzętami z przeszczepem jajnika ob/ob albo db/db. W tej krzyżówce, wszystkie zwierzęta N2, które nie niosą transgenu, powinny być otyłe i mieć cukrzycę oporną na insulinę, podczas gdy niosące
183 352 transgen powinny być szczupłe i mieć normalny poziom glukozy i insuliny w osoczu. W sensie genetycznym, transgen działa jako supresor mutacji.
Alternatywnie, geny OB mogą być badane przez analizę ich wpływu fenotypowego gdy ulegająekspresji antysensownej u zwierząt typu dzikiego. W tym podejściu, hamowana jest ekspresja allelu typu dzikiego, co prowadzi do fenotypu mutanta. Tworzenie dupleksów RNA · RNA (sensantysens) zapobiega normalnemu używaniu mRNA, prowadząc do częściowej lub całkowitej eliminacji efektu genu typu dzikiego. Technika ta została zastosowana do zahamowania syntezy TK w hodowli komórkowej i stworzenia fenotypu Kruppel u Drosophila, oraz mutacj i Shiverer u myszy (Izant i in., Celi 36:1007-1015 (1984); Green i in., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki i in., Science 241-593-595 (1988)). Istotną zaletą niniejszego podejścia jest to, że jedynie niewielka część musi ulec ekspresji aby wydajnie hamować ekspresję całego pokrewnego mRNA. Transgen antysensowny powinien zostać umieszczony pod kontrolą swego własnego promotora albo innego promotora czynnego w odpowiednim rodzaju komórek, powyżej miejsca poliadenylacji SV40. Ten transgen może być zastosowany do wytwarzania myszy transgenicznych. Myszy transgeniczne są krzyżowane również ze zwierzętami z przeszczepionymi jajnikami w celu zbadania czy heterozygoty ob są bardziej podatne na wpływ konstruktu antysensownego.
W dalszym sensie, wyjaśnienie biochemicznych funkcji produktu genu OB (polipeptydu OB albo białka) jest przy damę do identyfikacji agonistów i antagonistów drobnocząsteczkowych wpływających na te czynności. Różne określenia zastosowane w niniejszym opisie zostaną zdefiniowane przykładowo, poniżej. Określenie „modulator ciężaru ciała”, „modulator”, „modulatory” i wszelkie odmiany nie wymienione szczególnie, mogą być zastosowane wymiennie, oraz jak to zastosowano w całym opisie i zastrzeżeniach dotyczą w jednym sensie zarówno nukleotydów jak i substancji białkowych, w tym zawierających pojedyncze jak i liczne białka. Bardziej szczegółowo, wymienione wcześniej określenia rozciągają się na nukleotydy oraz DNA o sekwencjach opisanych tu i przedstawionych na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1), i figurach od 2A do B (Identyfikator Sekw. Nr 3). Podobnie, białka mające sekwencje aminokwasowe opisane tu i przedstawione na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 2), figurze 3 (Identyfikator Sekw. Nr 4) są szczególnie rozważane, podobnie jak profile aktywności podane w odniesieniu do wszystkich substancji zarówno tu jak i w zastrzeżeniach. Nawiązując, nukleotydy wykazujące aktywności zasadniczo zamienne albo zmienione są również rozważane, włącznie z analogami i odmianami allelicznymi zasadniczo homologicznymi. Podobnie, białka wykazujące właściwości zasadniczo zamienne albo zmienione, w tym białka umyślnie zmienione, jak np. przez kierowaną mutagenezę albo przypadkowo przez mutację w organizmie gospodarza, wytwarzającego modulatory, są również rozważane.
Kompozycja zawierająca „A” (gdzie ,A” oznacza pojedyncze białko, cząsteczkę DNA, wektor, rekombinowaną komórkę gospodarza itp.) jest zasadniczo wolna od „B” (gdzie „B” oznacza jedno lub wiele zanieczyszczających białek, cząsteczek DNA, wektorów itp. z wyłączeniem postaci racemicznych A) gdy przynajmniej około 75% wagowo białka, DNA, wektora (zależnie od kategorii do której należą„A” i „B”) w kompozycji stanowi A. Korzystnie, „A” stanowi przynajmniej około 90% wagi kompozycji A+B, jeszcze korzystniej przynajmniej około 99% wagi Jest również korzystne, żeby kompozycja, zasadniczo wolna od zanieczyszczeń zawierała wyłącznie gatunek o tym samym ciężarze cząsteczkowym, wykazujący aktywność albo charakterystykę interesującego gatunku.
Określenie „białko” odnoszące się do polipeptydów występujących naturalnie, oraz „polipeptyd” stosowane są tu zamiennie w odniesieniu do produktu genu ob i jego odmian. Określeniem „białko dojrzałe” albo „polipeptyd dojrzały” odnosi się szczególnie do produktu genu OB z usuniętą sekwencją sygnałową (albo składnikiem białka fuzyjnego).
Jak zaznaczono wyżej, szczególnych wykonaniach polipeptydy ob według wynalazku obejmujątakie o sekwencjach aminokwasowych podanych tu np. w Identyfikatorach Sekw. Nr 2, 4, 5, 6 itd., w tym polipetydów ob zmodyfikowanych podstawieniami w aminokwasach konserwatywnych, jak również biologicznie czynnych fragmentów, analogów i ich pochodnych.
183 352
Określenie „biologicznie czynne” w znaczeniu tu użytym oznacza swoisty efekt polipeptydu, w tym, choć nie wyłącznie swoiste wiązanie np. z receptorem, przeciwciałem albo inną cząsteczką rozpoznającą; aktywację szlaku przekazywania sygnału na poziomie cząsteczkowym; i/lub indukcję (albo zahamowanie przez antagonistę) efektów fizjologicznych wywoływanych przez natywny polipeptyd ob in vivo. Polipeptydy OB, w tym fragmenty, analogi i pochodne, mogą być wytworzone syntetycznie, np. stosując dobrze znane techniki syntezy peptydowej na podłożu stałym albo w fazie płynnej. Korzystnie, stosowane są techniki syntezy na podłożu stałym. Alternatywnie, polipeptydy OB według wynalazku mogą być wytwarzane z użyciem dobrze znanych technik inżynierii genetycznej, jak to opisano niżej. W jeszcze innym wykonaniu, polipeptydy OB mogą być oczyszczane np. przez oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne, z płynów ustrojowych, takich jak, choć nie ograniczonych do osocza, surowicy albo moczu, korzystnie ludzkiego osocza, surowicy albo moczu, jeszcze korzystniej od osoby, która nadmiernie ekspresjonuje polipeptyd, takiej jak osoba otyła cierpiąca z powodu mutacji w receptorze OB albo z powodu otyłości będącej skutkiem mutacji Jatty.
W konkretnym wykonaniu, niniejszy wynalazek rozważa, że naturalnie występujące fragmenty polipeptydu OB mogą być istotne. Sekwencja peptydowa obejmuje liczne miejsca będące celem cięcia proteolitycznego np. reszty argininowe. Istnieje możliwość, że polipeptyd pełnej długości może być cięty w jednym lub wielu miejscach, tworząc fragmenty biologicznie czynne. Takie fragmenty biologicznie czynne mogą działać agonistycznie albo antagonistycznie w stosunku do aktywności funkcjonalnej polipetydu OB redukującej ciężar ciała.
Niniejszy wynalazek szczególnie rozważa analogi peptydu OB, które charakteryzują się aktywnością biologicznąpolipeptydu OB, np. wiązaniem ze swoistą składową wiązania peptydu ob, taką jak receptor OB. W jednym z wykonań, analog działa agonistycznie z aktywnością OB, tj. działa podobnie do peptydu ob. Korzystnie, agonista OB jest bardziej efektywny niż białko natywne. Przykładowo, analog agonistyczny OB może wiązać się z receptorem OB z wyższym powinowactwem, albo wykazywać dłuższy okres półtrwania in vivo albo jedno i drugie. Niemniej jednak, agonistyczne analogi peptydu OB, które są mniej aktywne niż białko natywne są również rozważane. W innym wykonaniu analog antagonizuje aktywność OB. Przykładowo, analog OB, któiy wiąże się z receptorem OB ale nie wywołuje przekazywania sygnału, może hamować kompetycyjnie wiązanie natywnego OB z jego receptorem, zmniejszając w ten sposób aktywność OB in vivo. Taki antagonistyczny analog OB może również wykazywać właściwości inne niż peptyd ob, np. dłuższy (albo krótszy) okres półtrwania in vivo, większe (albo mniejsze) powinowactwo do receptora OB albo jedno i drugie.
W jednym wykonaniu, analog peptydu OB jest peptydem OB zmodyfikowanym przez podstawienie aminokwasów w pozycji polipeptydu, które nie są istotne dla struktury albo funkcji. Przykładowo, ponieważ wiadomo, że ludzki peptyd OB jest biologicznie czynny u myszy podstawienie aminokwasów różniących się w sekwencji ludzkiej w porównaniu z sekwencją mysią powinno dać przydatny analog peptydu OB. Przykładowo, reszta serynowa w pozycji 53 albo pozycji 98, albo w jednej i drugiej (w peptydzie nie obrobionym przedstawionym na figurze 4) sekwencji ludzkiej, może być podstawiona, np. glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną. Podobnie arginina w pozycji 92 (figura 4) może być podstawiona np. asparaginą lizyną histydyną glutaminą kwasem glutaminowym, kwasem asparaginowym, seryną treoniną metioniną albo cysteiną. Nawiązując wciąż do figury 4, inne aminokwasy ludzkiego peptydu OB wydają się możliwe do podstawienia, np. histydyną w pozycji 118, tryptofan w pozycji 121, alanina w pozycji 122, kwas glutaminowy w pozycji 126, treoniną w pozycji 127, leucyna w pozycji 128, glicyna w pozycji 132, glicyna w pozycji 139, tryptofan w pozycji 159 i glicyna w pozycji 166. W innym wykonaniu, istnieje możliwość podstawienia jednej lub wielu reszt od 121 do 128 (jak pokazano na figurze 4), np. glicynami albo alaninami, albo podstawienia niektórych reszt z wyjątkiem seryny w pozycji 123 i leucyny w pozycji 125.
W innym wykonaniu, analog polipeptydu OB, korzystnie ludzkiego polipeptydu OB jest w postaci okrojonej polipeptydu. Przykładowo, jak już wykazano, glutamina w pozycji 49 nie jest
183 352 istotna, a więc może ulec delecji z peptydu. Podobnie, jest możliwe usunięcie kilku albo wszystkich reszt aminokwasowych różniących się w pozycjach od 121 do 128. Oprócz tego, wynalazek rozważa dostarczenie analogu OB posiadającego minimalną sekwencję aminokwasową niezbędną do aktywności biologicznej. Może to być łatwo sprawdzone, np. przez badanie aktywności fragmentów OB na zdolność do wiązania się ze swoistym dla OB przeciwciałem,, hamowania aktywności natywnego polipeptydu OB albo działania agonistycznego z natywnym polipeptydem OB. W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza okrojonego polipeptydu OB składającego się z pętlowatej struktury utworzonej przez wiązania dwusiaręzkowe pomiędzy cysternami 117 i 167 (jak to pokazano na figurze 4). W innym wykonaniu, okrojony analog odpowiada aminokwasem od reszty 22 (następującej po domniemanym miejscu odcięcia peptydu sygnałowego) do 53 (aminokwasu bezpośrednio poprzedzającego giętki region pętli wykryty przez ograniczonąproteolizę i badanie spektrometiiąmasowąpolipeptydu OB; patrz Cohen i in., Protein Science 4:1088 (1995)). W innym wykonaniu okrojony analog odpowiada aminokwasom od reszty 61 (reszty następującej bezpośrednio po regionie giętkiej pętli, wykrytym jak wyżej) do aminokwasu 116 (reszty poprzedzającej bezpośrednio pierwszą resztę cysternową). W jeszcze innym wykonaniu, okrojony analog odpowiada aminokwasom od reszty 61 do reszty aminokwasowej 167.
Ponadto, może być podstawiona jedna lub wiele reszt domniemanej giętkiej pętli pomiędzy resztami od 54 do 60. Przykładowo, jedna lub wiele reszt może być podstawionych lizyną kwasem glutaminowym albo cysteiną (korzystnie lizyną) w celu sieciowania, np. w postać polimeru, ponieważ struktury giętkiej pętli są korzystnymi miejscami derywatyzacji białka. Altematwnie, reszty giętkiej pętli mogą być podstawione resztami aminokwasowymi, które są bardziej oporne na proteolizę ale mogą zachować giętką strukturę, np. jedna lub wiele prolin. W jeszcze innym wykonaniu, rozważane są podstawienia innymi resztami aminokwasowymi, które mogą być dalej derywatyzowane czyniąc je bardziej odpornymi na degradację np. proteolityczną.
Jest oczywiste dla specjalistów, że poważne wielkości fragmentów sąprzybliźone, oraz że od jednego do pięciu aminokwasów może być wprowadzone albo usunięte na każdym z końców albo wewnątrz polipeptydu albo jego fragmentu, wymienionych okrojonych analogów, z wyjątkiem analogów pętli dwusiarczkowej, gdzie reszty cysternowe muszą być zachowane.
Stwierdzono, że 50% zawartości mysiego peptydu OB stanowią helisy a, zaś ludzki polipeptyd OB zawiera 60% struktur helis a, co stwierdzono w badaniach dichroizmu kołowego polipeptydu rekombinowanego w warunkach niemal fizjologicznych. Nawiązując, w innym wykonaniu reszty aminokwasowe mogąbyć podstawione resztami tworzącymi analogi polipeptydu OB wykazującymi zwiększoną skłonność do tworzenia, albo tworzącymi bardziej stabilne struktury helis cc Przykładowo, struktury helisasąpreferowane, gdy w natywnym polipeptydzie OB wprowadzone zostaną Glu, Ala, Leu, His, Trp w miejscu innych reszt aminokwasowych. Korzystnie, są stosowane podstawienia konserwatywne np. podstawienie kwasu asparaginowego w pozycji 29, 30, 44, 61, 76, 100 i/lub 106 (według figury 4) kwasem glutaminowym (Glu); podstawienie izoleucyn(y) leucyną podstawienie glicyny albo waliny, albo innego różniącego się aminokwasu alaniną (np. seryny w pozycji 53 ludzkiego polipeptydu OB alaniną), podstawienie argininy albo lizyny histydyną i podstawienie tyrozyny i/lub fenyloalaniny tryptofanem. Zwiększenie stopnia, albo co ważniejsze stabilności struktur helis a, może dać analog OB o wyższej aktywności, zwiększonym powinowactwie wiązania albo dłuższym okresie półtrwania. W konkretnym wykonaniu, zwiększony jest potencjał tworzenia helisy w części polipeptydu OB, odpowiadającej resztom aminokwasowym od 22 do 53. W innym wykonaniu, zwiększony jest potencjał tworzenia helisy w strukturze pętli dwusiarczkowej odpowiadającej aminokwasom od 117 do 167. Również, rozważane są analogi OB posiadające zwiększony potencjał tworzenia helis aalbo stabilności w jednej lub wielu powyższych domenach. W dalszym wykonaniu, wytwarzane są okrojone analogi polipetydu OB zawierające reszty aminokwasowe tworzące strukturę, np. tworzące helisę, w celu kompensacji pozbawienia fragmentów polipetydu stabilnej struktury.
183 352
Analogi takie jak fragmenty, mogąbyć wytwarzane przykładowo, przez trawienie pepsyną substancji peptydowej modulatora ciężaru. Inne analogi, takie jak muteiny, mogąbyć wytwarzane standardową kierowaną mutagenezą sekwencji kodującej peptyd modulatora ciężaru. Analogi wykazujące „aktywność modulatora ciężaru” takie jak drobne cząsteczki działające jak promotory albo inhibitory, mogąbyć identyfikowane znanymi testami in vivo i in vitro.
Analogi drobnocząsteczkowe i peptydomimetyki polipeptydu OB. Struktura polipeptydu ob, korzystnie ludzkiego polipeptydu OB, może być analizowana różnymi znanymi sposobami. Sekwencja białka może być charakteryzowana analiząhydrofilowości (np. Hopp i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)). Profil hydrofilowości może być zastosowany do identyfikacji hydrofobowych i hydrofitowych obszarów polipeptydu OB, które mogą wskazywać regiony zamknięte wewnątrz pofałdowanego polipeptydu i regiony dostępne na zewnątrz polipeptydu. Oprócz tego, może być wykonana analiza struktury drugorzędowej (np. Chou i in., Biochem., 13:222 (1974)) w celu identyfikacji regionów polipeptydu OB zapewniających pewne drugorzędowe struktury. Manipulowanie domniemaną albo określoną strukturą, w tym przewidywanie struktury drugorzędowej może być wykonane przy użyciu dostępnego oprogramowania komputerowego. Przez zapewnienie powszechnego źródła rekombinowanego polipeptydu OB, niniejszy wynalazek umożliwia ilościowe badanie strukturalne polipeptydu. W szczególności, dostarczono wystarczającą ilość materiału do badania jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), analiz spektroskopowych w podczerwieni (IR), Ramana i nadfiolecie (UV) a zwłaszcza dichroizmu kołowego (CD). Szczególnie NMR zapewnia doskonałą analizę struktury cząsteczek w roztworze, co bardziej przypomina ich środowisko naturalne (Marion i in., Biochim. Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar iin., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimura i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1681-1685 (1980)). Inne sposoby analizy strukturalnej mogą być również zastosowane. Obejmują one, choć nie są ograniczone do krystalografii rentgenowskiej (Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)).
W jeszcze dalszym wykonaniu, analog polipeptydu OB może być badany w celu określenia czy oddziałuje on krzyżowo z przeciwciałem swoistym wobec natywnego polipeptydu OB albo jego pewnymi fragmentami. Stopień aktywności krzyżowej dostarcza informacji o homologii strukturalnej albo podobieństwie białek, albo o dostępności regionów odpowiadających częściom polipeptydu, które zastosowano do wywołania przeciwciał.
Znane są różne techniki przesiewania analogów polipeptydów. Dostępne są różne biblioteki chemiczne. Nawiązując, niniejszy wynalazek rozważa takie biblioteki, np. biblioteki syntetycznych związków wytworzonych przez lata badań, biblioteki związków naturalnych i biblioteki kombinatoryjne, jak to opisano szczegółowo niżej, do poszukiwania analogów polipeptydu OB. W jednym wykonaniu, wynalazek roztważa przesiewanie takich bibliotek w poszukiwaniu związków wiążących się z przeciwciałami przeciwko polipeptydowi OB, korzystnie przeciwciałami przeciwko ludzkiemu polipeptydowi OB. W innym aspekcie, gdy zostanie zidentyfikowany receptor OB (patrz niżej), może być zastosowana dowolna znana technika przesiewania w celu poszukiwania agonisty albo antagonisty receptora OB. Niniejszy wynalazek roztważa przesiewanie w kierunku ligandów drobnocząsteczkowych albo analogów ligandów i związków naśladujących, jak również przesiewanie w kierunku naturalnych ligandów wiążących się z receptorem OB i działających agonistycznie albo antagonistycznie in vivo.
Znajomość struktury pierwszorzędowej receptora oraz podobieństwo sekwencji z białkami o znanej ftinkcji, może dostarczyć przesłanek dla agonistów albo antagonistów białka. Identyfikacja i przesiewanie antagonistów jest dalej ułatwiane przez określenie cech strukturalnych białka, np. stosując krystalografie rentgenowską, dyfrakcje neutronów, spektrometrie jądrowego rezonansu magnetycznego i inne techniki określania struktury. Techniki te służą racjonalnemu opracowaniu albo identyfikacji agonistów albo antagonistów.
Inne podejście wykorzystuje rekombinowane bakteriofagi w celu wytworzenia wielkich bibliotek. Stosując „metodę fagową” (Scott i in., Science 249:386-390 (1990); Cwirla i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); Devlin i in., Science 249:404-406 (1990)) można wytworzyć wielkie biblioteki (106-108 cząstek chemicznych). Inne podejście stosuje przede
183 352 wszystkim metody chemiczne, przykładowo metodę Geysena (Geysen i in., Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen i in., J. Immunologie Method 102:259-274 (1987) oraz ostatnia metoda Fedora i in., Science 251:767-773 (1991)). Furka i in., 14th International Congress of Biochemistry, vol. 5, skrót nr FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991)); Houghton (patent USA nr 4,631,211, przyznany w grudniu 1986) i Rutter i in., (patent USA nr 5,010,175, przyznany 23 kwietnia 1991) opisują sposoby wytwarzania mieszaniny peptydów, którą można wykorzystać do poszukiwania agonistów albo antagonistów.
W innym aspekcie, syntetyczne biblioteki (Needels i in., Preoc. NatL Acad. Sci. USA 980:10700-10704 (1993); Lam i in., międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 92/00252) i podobne mogą być zastosowane do przesiewania w kierunku ligandów receptora OB, według wynalazku. Przy użyciu takich bibliotek, antagoniści receptora mogą być wykryci przy użyciu komórek ekspresjonujących receptor, bez klonowania go.
Alternatywnie, mogą być wykonywane testy wiązania rozpuszczalnego ligandu z komórkami ekspresjonującymi rekombinowane postacie domeny wiążącej ligand receptora OB. Rozpuszczalne ligandy mogą być dostarczone jako polipeptydy OB rekombinowane albo syntetyczne.
Przesiewanie może być wykonane przy użyciu rekombinowanych komórek ekspresjonujących receptor OB, albo inaczej, przy użyciu oczyszczonego białka receptora, np. wytworzonego rekombinacyjnie jak to opisano wyżej. Przykładowo, zdolność znakowanego, rozpuszczalnego albo solubilizowanego receptora OB obejmującego część cząsteczki wiążącąligand, do wiązania ligandu, może być zastosowana do przesiewania bibliotek, jak to opisano w powyższych odnośnikach.
Pochodne polipeptydu OB
Ogólnie, niniejsze białko (w znaczeniu tu zastosowanym określenie „białko” obejmuje „polipeptyd” o ile nie zaznaczono inaczej) może być derywatyzowane przez przyłączanie jednej lub wielu cząsteczek chemicznych do cząstki białka. Pochodne modyfikowane chemicznie mogą być dalej stosowane do podawania dotętniczego, dootrzewnowego, domięśniowego, podskórnego, dożylnego, doustnego, donosowego, doodbytniczego, podpoliczkowego, podjęzykowego, dopłucnego, miejscowego, przezskómego i innych. Modyfikacja chemiczna białka biologicznie czynnego zapewnia jak stwierdzono w pewnych warunkach dodatkowe zalety, takie jak zwiększenie stabilności i czasu krążenia terapeutycznego białka oraz zmniejszenie immunogenności (patrz, patent USA nr 4,179,337, Davis i in., przyznany 18 grudnia 1979; patrz również, Abuchowski i in., „Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, w Enzymes as Drugs, str. 367-383, wyd. Holcenberg i Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY, (1981); artykuł przeglądowy opisujący modyfikacje białka i białka fuzyjne Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10(1992)).
Cząsteczki chemiczne do derywatyzacji
Cząsteczki chemiczne odpowiednie do derywatyzacji mogą być wybrane spośród rozpuszczalnych w wodzie polimerów. Wybrany polimer powinien być rozpuszczalny w wodzie, tak aby białko związane z nim nie precypitowało w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne. Korzystnie, do zastosowań terapeutycznych produktu końcowego, polimer powinien być dopuszczalny farmaceutycznie. Specjalista potrafi wybrać pożądany polimer w oparciu o uwzględnienie czy koniugat polimeru z białkiem będzie stosowany terapeutycznie, a jeżeli tak to w oparciu o pożądaną dawkę, czas krążenia, oporność naproteolizę i inne. Dla niniejszych białek i peptydów można to ocenić stosując dostarczone tu testy.
Cząstki polimerów
Polimer rozpuszczalny w wodzie może być wybrany z grupy obejmującej, przykładowo, poliglikol etylenowy, kopolimery glikolu etylenowego/glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, polialkohol winylowy, polipirolidon winylowy, poli-l,3-dioksolan, poli-l,3,6-trioksan, kopolimer etylenu/bezwodnika maleinowego, poliaminokwasy (homopolimery albo losowe kopolimery) i dekstran albo polipirolidon (n-winylowy)poliglikol etylenowy, homopolimery poliglikolu propylenowego, kopolimery politlenku propylenu/tlenku etylenu,
183 352 polioksyetylowane poliole oraz polialkohol winylowy. Z powodu swej stabilności w wodzie korzystny może być poliglikol etylenowy aldehydu propionówego.
Polimery mogą mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i być rozgałęzione albo nie. Dla poliglikolu etylenowego, korzystny ciężar cząsteczkowy wynosi od około 2 kDa do około 100 kDa (określenie „około” wskazuje, że w preparacie poliglikolu etylenowego niektóre z cząsteczek mogą być większe albo mniejsze niż na to wskazuje ciężar cząsteczkowy) z powodu łatwości wytwarzania i posługiwania się nim. Mogą być stosowane inne wielkości, zależnie od pożądanego profilu terapeutycznego (np. pożądanej długości trwania uwalniania przedłużonego, ewentualnego wpływu na czynność biologiczną łatwości posługiwania się, stopnia antygenowości lub jej braku i innych znanych efektów poliglikolu etylenowego wywieranych na białko albo jego analog).
Stosunek polimeru do białka
Liczna cząsteczek przyłączanego polimeru może być różna, zaś specjalista może ocenić jej wpływ na funkcję. Możliwa jest monoderywatyzacja, albo di-, tri-, tetra- lub więcej kombinacji derywatyzacji, jedną lub różnymi cząstkami chemicznymi (np. polimerami, takimi jak poliglikole etylenowe o różnych ciężarach). Proporcja cząsteczek polimeru na cząsteczkę białka (albo peptydu) może być różna, w zależności od ich stężenia w mieszaninie reakcyjnej. Ogólnie, optymalny stosunek (w sensie wydajności reakcji, gdy nie ma nadmiaru nieprzereagowanego białka albo polimeru) może być określona takimi czynnikami jak pożądany stopień derywatyzacji (np. mono-, di-, tri-, itd.), ciężaru cząsteczkowego wybranego polimeru, tego czy polimer jest rozgałęziony czy nie, oraz warunkami reakcji.
Przyłączanie cząstki chemicznej do białka
Cząstki poliglikolu etylenowego (albo inne cząstki chemiczne) powinny być przyłączone do białka z uwzględnieniem wpływu na domeny funkcjonalne albo antygenowe białka. Istnieje wiele dostępnych specjalistom sposobów przyłączania np. EP 0 401 384 (wiązanie PEG z G-CSF). Patrz również, Maik i in., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (pegylacja GM-CSF z użyciem chlorku trezylu). Przykładowo, poliglikol etylenowy może być wiązany kowalencyjnie z resztami aminokwasowymi przez grupy funkcyjne, takie jak wolne grupy aminowe albo karboksylowe. Grupami funkcyjnymi są takie, z którymi można związać aktywny poliglikol propylenowy. Reszty aminokwasowe posiadające wolną grupę aminową mogą obejmować reszty lizynowe oraz N-końcowe reszty aminokwasowe, zaś posiadające wolną grupę karboksylową obejmująreszty kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego i aminokwasy C-końcowe. Jako grupy funkcyjne do przyłączania cząsteczek poliglikolu etylenowego mogą służyć grupy sulfhydrylowe. Do zastosowań terapeutycznych, korzystne jest przyłączanie do grup aminowych takich.jak N-końcowe albo lizynowe. Powinno się unikać przyłączania do reszt istotnych dla wiązania się z receptorem, jeżeli wiązanie się receptorem jest pożądane.
Białka zmodyfikowane chemicznie na końcu N
Białka zmodyfikowane chemicznie na końcu N mogą być szczególnie pożądane. Stosując poliglikol etylenowy jako przykład, możliwe jest wybranie spośród licznych cząsteczek poliglikolu etylenowego (w zależności od ciężaru cząsteczkowego, rozgałęzienia itp.) proporcji cząsteczek poliglikolu etylenowego do cząsteczek białka (albo peptydu) w mieszaninie reakcyjnej, rodzaju reakcji pegylacji, która ma być wykonana oraz sposobu uzyskania białka pegylowanego swoiście na końcu-N. Sposobem uzyskania preparatu pegylowanego na końcu N (tj. oddzielenia tej cząstki, jeżeli to konieczne, od innych cząstek monopegylowanych), może polegać na oczyszczaniu materiału pegylowanego na końcu N z populacji pegylowanych cząsteczek białka. Wybiórcza modyfikacja chemiczna końca N może być uzyskana przez alkilację redukcyjną, która wykorzystuje różną aktywność różnych rodzajów pierwszorzędowych grup aminowych (lizynowych w stosunku do N-końcowych) dostępnych do derywatyzacji w konkretnym białku. W odpowiednich warunkach reakcji, może być uzyskana zasadniczo wybiórcza derywatyzacja białka na końcu N-polimerem zawierającym grupy karbonylowe. Przykładowo, możliwa jest wybiórcza pegylacja N-końcowa białka przez wykonywanie reakcji w pH umożliwiającym wykorzystanie różnic pKa pomiędzy grupami ε-aminowymi reszt lizynowych i grupami α-aminowymi reszt
183 352
N-końcowych białka. Przez takie wybiórcze derywatyzowanie kontrolowane jest przyłączanie polimeru rozpuszczalnego w wodzie do białka: koniugacja polimeru zachodzi głównie na końcu N białka bez znaczącej modyfikacji innych grup funkcyjnych takich jak boczna grupa aminowa lizyny. Stosując alkilacje redukcyjną, polimer rozpuszczalny w wodzie może być typu opisanego wyżej, i powinien mieć pojedynczą grupę aldehydową do wiązania z białkiem. Może być zastosowany poliglikol etylenowy aldehydu propionowego, zawierający pojedynczą grupę aldehydową.
Kwasy nukleinowe związane z polipeptydem OB
Jak to zaznaczono wyżej, niniejszy wynalazek dotyczy kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy ob, jak również pokrewnych genomowych sekwencji nie kodujących 5', 3'oraz intronów genu OB. Tak więc, zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być zastosowane znane metody biologii molekularnej, mikrobiologii i techniki rekombinacji DNA. Techniki takie są opisane w pełni w literaturze. Patrz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); wyd. Glover, DNA Clonoing: A Practical Approach, tom I i Π, MRL Press, Ltd., Oxford, UK (1985); wyd. Gait, Oligonukleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames i in., wyd., Nucleic Acids Hybridisation, Springer-Verlag (1985); Hames i in., wyd., Transcription andTranslation, Oxford University Press (1984); wyd. Freshney, Animal Celi Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). Szczególnie przydatne w niniejszym wynalazku są strategie izolacji, klonowania, sekwencjonowania, analizy i charakteryzowania genu albo kwasu nukleinowego oparte na znanej technice reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
„Replikon” oznacza dowolny element genetyczny (np. plazmid, chromosom, wirus), który działa jako autonomiczna jednostka replikacji DNA in vivo, tj. zdolna do replikacji pod swoją własną kontrolą.
„Wektor” oznacza replikon, taki jak plazmid, fag albo kosmid, do którego może być przyłączony segment innego DNA tak by doprowadzić do replikacji przyłączonego segmentu. ,,Kaseta” oznacza segment DNA, który może być włączony do wektora w pewnym miejscu restrykcyjnym. Segment DNA koduje interesujący polipeptyd zaś kaseta i miejsce restrykcyjne są zaprojektowane tak aby zapewnić wprowadzenie kasety w odpowiedniej ramce odczytu do transkrypcji i translacji.
„Heterologiczny” DNA dotyczy DNA które nie jest normalnie spotkane w komórce, albo w miejscu chromosomalnym komórki. Korzystnie, heterologiczny DNA obejmuje gen obcy dla komórki. Komórkę „transfekuje” się egzogennym albo heterologicznym DNA, gdy taki DNA wprowadza się do komórki. Komórka jest „transformowana” przez egzogenny albo heterologiczny DNA gdy transfekujący DNA wywołuje zmianę fenotypową. Korzystnie, transformujący DNA powinien zostać integrowany (związany kowalencyjnie) do chromosomalnego DNA tworzącego genom komórki. „Klon” jest populacją komórek uzyskanych z pojedynczej komórki albo wspólnego przodka przez mitozę.
„Cząsteczka kwasu nukleinowego” dotyczy polimerycznej postaci estru fosforanu rybonukleozydów (adenozyny, guanozyny, urydyny albo cytydyny; „cząsteczki RNA”) albo dezoksyrybonukleozydów (dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksytymidyny albo dezoksycytydyny; „cząsteczki DNA”) w postaci jednoniciowej albo dwuniciowej helisy. Możliwe sądwuniciowe helisy DNA-DNA, DNA-RNA albo RNA-RNA. Określenie cząsteczka kwasu nukleinowego, zaś w szczególności cząsteczka DNA albo RNA, dotyczy wyłącznie piewszorzędowej i drugorzędowej struktury cząsteczki i nie ogranicza się do postaci trzeciorzędowych i czwartorzędowych. Tak więc, określenie to obejmuje dwuniciowy DNA spotykany, przede wszystkim w liniowych i kolistych cząsteczkach DNA (np. fragmentach restrykcyjnych) plazmidach i chromosomach. W dyskusji o strukturze poszczególnych dwuniciowych cząsteczek DNA, sekwencje mogą być opisane tu według normalnej konwencji z podaniem sekwencji w kierunku 5' do 3', wzdłuż nie ulegającej transkrypcji nici DNA (tj. nici
183 352 mającej sekwencje homologiczną do mRNA). „Rekombinowana cząsteczka DNA” oznacza cząsteczkę DNA, która ulega manipulacjom metodami biologii molekularnej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego „hybrydyzuje” z ińną cząsteczką kwasu nukleinowego, jak cDNA, genomowy DNA albo RNA, gdy jednoniciowa postać cząsteczki kwasu nukleinowego może przyłączać się do innej cząsteczki kwasu nukleinowego w odpowiednich warunkach temperatury i siły jonowej roztworu (patrz, Sambrook i in., 1989, wyżej). Warunki temperatury i siły jonowej określają „surowość” hybrydyzacji. Do wstępnego przesiewania w kierunku homologicznym kwasów nukleinowych, można zastosować niską surowość warunków hybrydyzacji, odpowiadaj ącąTm równej 55°C, np. 5xSSC, 0,1% SDS, 0,25% mleka bez formamidu albo 30% formamidu, 5xSSC, 0,5% SDS). Warunki umiarkowanej surowości hybrydyzacji odpowiadająwyższej Tm, np. 40% formamidu, 5x albo 6xSSC. Warunki hybrydyzacji wysokiej surowości odpowiadająnajwyższej Tm, np. 50% formamidu, 5x albo 6x SSC. Hybrydyzacja wymaga aby dwie cząsteczki kwasu nukleinowego posiadały sekwencje komplementarne, jakkolwiek zależnie od surowości hybrydyzacji możliwe są niezgodności między zasadami. Odpowiednia surowość do hybrydyzacji kwasów nukleinowych zależy od długości kwasów nukleinowych i stopnia komplementamości, dobrze znanych zmiennych. Im większy stopień podobieństwa albo homologii pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi, tym większa wartość Tm dla hybryd kwasów nukleinowych zawierających te sekwencje. Względna stabilność (odpowiadająca wyższej Tm) hybrydyzacji kwasu nukleinowego zmniejsza się wraz z szeregiem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Dla hybryd dłuższych niż 100 nukleotydów, uzyskano równanie do obliczania Tm (patrz Sambrook i in, 1989, wyżej, 9.50-0.51). Dla hybrydyzacji krótszych kwasów nukleinowych, tj. oligonukleotydów, położenie niezgodności staje się ważniejsze, zaś długość oligonukleotydów określa swoistość (patrz, Sambrook i in., 1989, 11.7-11.8). Korzystnie, minimalna długość hybrydyzującego kwasu nukleinowego wynosi przynajmniej około 10 nukleotydów; korzystniej przynajmniej około 15 nukleotydów; najkorzystniej przynajmniej około 20 nukleotydów. „Rekombinacja homologiczna” dotyczy wprowadzania sekwencji obcego DNA wektora do chromosomu. Korzystnie, wektor kieruje się do swoistego miejsca w chromosomie do rekombinacji homologicznej. Do swoistej rekombinacji homologicznej, wektor powinien zawierać wystarczająco długie regiony homologii z sekwencjami chromosomu w celu umożliwienia wiązania komplementarnego i włączenia wektora do chromosomu. Dłuższe regiony homologii i większy stopień podobieństwa sekwencji może zwiększyć wydajność rekombinacji homologicznej.
“Sekwencja kodująca” DNA oznacza dwuniciową sekwencję DNA, która ulega transkrypcji i translacji do odpowiedniego polipeptydu w komórce in vitro i in vivo, gdy znajduje się pod kontrolą odpowiedniej sekwencji regulacyjnej. Brzegi sekwencji kodującej określone są przez kodon start na końcu 5' (aminowym) i kodon stop na końcu 3'(karboksylowym). Sekwencja kodująca może zawierać, choć nie jest ograniczona do sekwencji prokariotycznych, cDNA z mRNA eukariotycznego, sekwencji genomowego DNA z DNA eukariuotycznego (np. ssaków) albo syntetycznych sekwencji DNA. Jeżeli sekwencjakodującaprzeznaczona jest do ekspresji w komórce eukariotycznej, na końcu 3' sekwencji kodującej umieszczony jest sygnał poliadenylacji i sekwencja przerywająca transkrypcję.
Izolacja sekwencji kodującej OB i sekwencji flankujących
Kwasy nukleinowe rozważane przez niniejszy wynalazek rozciągają się, jak to zaznaczono, na inne kwasy nukleinowe, kodujące ekspresję polipeptydów takich jak pokazane na figurach od 1A do D (Identyfikator Sekw. Nr 2), figurze 3 (Identyfikator Sekw. Nr 4), figurze 5 (Identyfikator Sekw. Nr 5) i figurze 6 (Identyfikator Sekw. Nr 6). Nawiązując, o ile wyizolowano i sekwencjonowano DNA swoisty wobec genu ob, dowolna komórka zwierzęca może potencjalnie służyć jako źródło kwasu nukleinowego do klonowania molekularnego genu kodującego peptydy według wynalazku. DNA może być otrzymywany standardowymi procedurami, znanymi w dziedzinie klonowania DNA (np. z „biblioteki” DNA), przez syntezę chemiczną przez klonowanie cDNA albo przez klonowanie genomowego DNA, albo jego fragmentów, oczyszczonych z pożądanej komórki (patrz, Sambrook i in., 1989, wyżej; Glover, 1985, wyżej). Klony uzyska
183 352 ne z genomowego DNA mogą zawierać sekwencje regulacyjne i regionu DNA intronów, oprócz sekwencji kodujących; klony uzyskane z cDNA nie zawierają sekwencji intronowych. Niezależnie od źródła, geny powinny być klonowane molekularnie dó odpowiedniego wektora w celu namnożenia genu.
W klonowaniu molekularnym genu z genomowego DNA, genomowy DNA może być amplifikowany z użyciem starterów wybranych z sekwencji cDNA. Alternatywnie mogą być wytworzone fragmenty DNA, spośród których niektóre kodują pożądany gen. DNA może być cięty w pewnych miejscach przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Można również zastosować DNAzę w obecności manganu w celu pocięcia DNA na fragmenty, albo DNA może zostać porozrywany fizycznie przez przykładowo, sonikację. Liniowe fragmenty DNA mogą być następnie rozdzielane pod względem wielkości standardowymi technikami, włącznie z elektroforezą na żelu agarozowym albo poliakrylamidowym i chromatografią kolumnową.
Gdy zostaną wytworzone fragmenty DNA, identyfikacja swoistego fragmentu DNA, zawierającego gen ob albo przypominającego ob, może być osiągnięta wieloma sposobami. Przykładowo, jeżeli jest dostępna, i może być oczyszczona i znakowana, pewna ilość części genu ob albo przypominającego ob albo jego RNA, albo jego fragment, wytworzone fragmenty DNA mogą być przesiewane hybrydyzacją kwasu nukleinowego przy użyciu znakowanej sondy (Benton i in., Science 196:180 (1977); Grunstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961 (1975)). Niniejszy wynalazek dostarcza takich sond kwasu nukleinowego, które mogą być wygodnie wytwarzane z ujawnionych tu swoistych sekwencji, np. sonda hybrydyzująca, o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej przynajmniej 10 nukleotydom, korzystnie 15 nykleotydom sekwencji przedstawionej na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1) i figurach 2 A i B (Identyfikator Sekw. Nr 3). Korzystnie, fragment wybrany jest tak, że jest wysoce unikalny dla modulatora peptydowego według wynalazku. Takie fragmenty DNA o zasadniczej homologii z sondą będą hybrydyzowały. Jak zanaczonó wyżej, im wyższy stopień homologii, tym bardziej surowe warunki hybrydyzacji mogąbyć zastosowane. Wjednym wykonaniu, stosowane są warunki hybrydyzacji w niskiej surowości w celu identyfikacji homologicznego modulatora peptydowego. Jednakże, w korzystnym aspekcie i jak doświadczalnie wykazano, kwas nukleinowy kodujący modulator peptydowy według wynalazku będzie hybrydyzował z kwasem nukleinowym o sekwencji przedstawionej na figurach od 1A do E (Identyfikator Sekw. Nr 1) i figurach 2A i B (Identyfikator Sekw. Nr 3) albo ich hybrydyzującym fragmentem w warunkach umiarkowanej surowości; korzystniej będzie hybrydyzował w warunkach wysokiej surowości.
Alternatywnie, obecność genu może być wykryta testem opartym na fizycznych, chemicznych albo immunologicznych właściwościach ich ekspresjonowanego produktu. Przykładowo, klony cDNA albo klony DNA, które hybrydyzują/wybierająodpowiednie mRNA, mogąbyć wybrane pod kątem wytwarzania białka, które np. wykazuje podobną albo identyczną migrację elektroforetyczną, zachowanie podczas ogniskowania izoelektrycznego, mapę trawienia proteolitycznego, aktywność fosfatazy tyrozynowej albo właściwości antygenowe jak znane dla niniejszego modulatora peptydowego przykładowo, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogąbyć korzystnie zastosowane do przesiewania peptydów w kierunku homologów albo modulatorów z innych źródeł.
Gen kodujący peptyd modulatora według wynalazku, może być zidentyfikowany przez selekcję mRNA tj. przez hybrydyzację kwasu nukleinowego i translację in vivo. W tej procederze, stosuje się fragmenty w celu izolowania komplementarnych mRNA przez hybrydyzację. Takie fragmenty DNA mogą stanowić wartościowy modulator DNA. Analiza immunoprecypitacją albo testy funkcjonalne (np. aktywności fosfatazy tyrozynowej) produktu translacji in vitro, izolowanych mRNA, identyfikuje mRNA a stąd fragmenty komplementarnego DNA, zawierającego pożądane sekwencje. Oprócz tego, swoiste mRNA mogą być selekcjonowane przez adsorpcję na polisomach izolowanych z komórek, immobilizowanych przeciwciałem swoiście skierowanym przeciwko peptydowi modulatora.
Znakowany radioaktywnie cDNA peptydu modulatora może być syntetyzowany przy użyciu wybranego mRNA (z adsorbowanych polisomów) jako matrycy. Znakowany radioaktywnie
183 352 mRNA albo cDNA może być następnie zastosowany jako sonda w celu identyfikacji homologicznych fragmentów DNA peptydu modulatora, wśród innych fragmentów genomowego DNA.
Jak wspomniano wyżej, sekwencje DNA kodujące peptydy modulujące ciężar, jak to ujawniono, mogąbyć wytwarzane syntetycznie zamiast klonowania. Sekwencja DNA może być zaprojektowana z odpowiednimi kodonami dla sekwencji aminokwasowej peptydu modulującego ciężar ogólnie, należy wybrać korzystne kodony dla zamierzonego gospodarza, jeżeli sekwencja będzie stosowana do ekspresji. Kompletna sekwencja jest łączona z nakładających się oligonukleotydów, wytworzonych standardowymi sposobami i łączonymi w kompletną sekwencję kodującą. Patrz, np. Edge, Naturę 292:756 (1981); Nambair i in., Science 223:1299 (1984); Jay i in., J. biol. chem., 259:6311 (1984).
Syntetyczne sekwencje DNA umożliwiają wygodną konstrukcję genów ekspresjonujących analogi modulatorów ciężaru, jak to opisano wyżej. Alternatywnie, DNA kodujący analogi może być wytworzony przez kierowaną mutagenezę natywnych genów OB albo cDNA, albo analogi mogąbyć wytwarzane bezpośrednio stosując konwencjonalną syntezę polipeptydową.
Ogólna metoda kierowanego wprowadzania nienaturalnych aminokwasów do białek została opisana w Noren i in., Science 244:182-188 (1989). Metoda ta może być zastosowana w celu wytwarzania analogów polipeptydu ob z nienaturalnymi aminokwasami.
Nie kodujące kwasy nukleinowe
Niniejszy wynalazek rozciąga się na wytwarzanie nukleotydów antysensownych i rybozymów, które mogą być zastosowane w celu zakłócania białek modulatora ciężaru na poziomie translacji. Podejście to wykorzystuje antysensowny kwas nukleinowy i rybozymy do blokowania translacji swoistego mRNA, przez maskowanie mRNA antysensownym kwasem nukleinowym, albo przez cięcie go rybozymem.
Antysensowne kwasy nukleinowe są cząsteczkami DNA albo RNA, które są komplementarne do przynajmniej części swoistej cząsteczki mRNA (patrz, Weintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289-295 (1988). W komórce hybrydyzują one z mRNA, tworząc cząsteczkę dwuniciową. Komórka nie może przeprowadzić translacji mRNA będącego w kompleksie dwuniciowym. Stąd, antysensowny kwas nukleinowy interferuje z ekspresjąmRNA do białka. Oligomery o długości rzędu 15 nukleotydów oraz cząsteczki hybrydyzujące z kodonem startu AUG są szczególnie efektywne, ponieważ są łatwe do syntezy i sprawiająmniej problemów niż dłuższe cząsteczki przy wprowadzaniu ich do komórek wytwarzających peptyd modulujący ciężar. Metody antysensowne zastosowano do zahamowania ekspresji wielu genów in vitro (Marcus-Sekura, 1988 wyżej; Hombor i in., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)).
Rybozymy są cząsteczkami RNA posiadającymi zdolność swoistego cięcia innych jednoniciowych cząsteczek RNA w sposób przypominający endonukleazy restrykcyjne DNA. Rybozymy odkryto na skutek obserwacji, że pewne mRNA mają zdolność wycinania swoistych własnych intronów. Przez modyfikowanie sekwencji nukleotydowej tych RNA, stało się możliwe zaprojektowanie cząsteczek rozpoznających swoiste sekwencje nukleotydowe w cząsteczce RNA i przecinających je (Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)). Ponieważ są one swoiste dla sekwencji, inaktywowane są wyłącznie mRNA ze szczególną sekwencją. Zidentyfikowano dwa rodzaje rybozymów, typu Tetrahymena i typu „młotka”. Rybozymy typu Tetrahymena rozpoznają sekwencje czterech zasad, podczas gdy typ „młotka” rozpoznaje sekwencje od jedenastu do osiemnastu zasad.
Im dłuższa sekwencja rozpoznająca, tym większe prawdopodobieństwo, że występuje wyłącznie w docelowym rodzaju mRNA. Stąd, rybozymy typu „młotka” są korzystniejsze niż typu Tetrahymena do inaktywacji swoistych gatunków mRNA zaś osiemnastozasadowa sekwencja rozpoznająca jest korzystniejsza niż krótsze sekwencje rozpoznające.
Sekwencje DNA opisane tu mogąbyć więc zastosowane do wytwarzania cząsteczek antysensownych przeciwko, i rybozymów tnących mRNA dla białek modulatorów ciężaru oraz ich ligandów, hamując ekspresję genu ob i prowadząc do zwiększenia ciężaru ciała i otłuszczenia.
W innym wykonaniu, dostarczone są przez niniejszy wynalazek krótkie sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do nici kodujących i komplementarnych kwasu nukleinowego
183 352
OB albo do regionów nie kodujących 5', 3' albo wewnętrznych (intronowych) genu OB. Takie kwasy nukleinowe są przydatne jako sondy, bądź to jako bezpośrednio znakowane sondy oligonukleotydowe, albo jako startery do reakcji łańcuchowej polimerazy, do badania obecności mutacji w genie ob albo poziomu ekspresji mRNA OB. Korzystnie nie kodujący kwas nukleinowy według wynalazku pochodzi z ludzkiego genu OB.
W szczególnym wykonaniu, nie kodujący kwas nukleoinowy zapewnia rekombinację homologiczną służącą do integracji możliwego do amplifikacji genu i/lub innych sekwencji regulatorowych w pobliżu genu OB, np. w celu zapewnienia wyższego poziomu ekspresji polipeptydu OB, albo w celu przezwyciężenia mutacji w sekwencjach regulacyjnych genu ob, uniemożliwiając prawidłowy poziom ekspresji polipeptydu OB (patrz, międzynarodowa publikacja patentowa WO 91/06666, opublikowana 16 maja 1991, Skoultchi; międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 91/09955, opublikowana 11 lipca 1991, Chappel; patrz również, międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 90/14092, opublikowana 29 listopada 1990, Kucherlapati i Campbell).
Wytwarzanie polipeptydu OB: ekspresja i synteza
Sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację są sekwencjami regulacyjnymi DNA, takimi jak promotory, wzmacniacze, terminatory itp., zapewniające ekspresję sekwencji kodujących w komórkach gospodarza. W komórkach eukariotycznych sekwencajmi kontrolnymi są sygnały poliadenylacji. Sekwencja kodująca znajduje się „pod kontrolą” sekwencji kontrolujących transkrypcję i translację w komórce, gdy polimeraza RNA poddaje transkrypcji sekwencję kodującą na mRNA, który następnie ulega składaniu i translacji na białko kodowane przez sekwencję kodującą.
„Sekwencja sygnałowa” włączona jest na początku sekwencji kodującej białka, które ma ulec ekspresji na powierzchni komórki. Sekwencja ta koduj e peptyd sygnałowy, w kierunku końca N dojrzałego poliepetydu, który kieruje translokacją polipeptydu w komórce gospodarza. Określenie „sekwencja sygnałowa translokacji” jest tu również stosowana w odniesieniu do tego rodzaju sekwencji sygnałowej. Sekwencje sygnałowe translokacji spotykane są w połączeniu z wieloma białkami natywnymi u eukariota i prokariota, i są często funkcjonalne w obu rodzajach organizmów.
Sekwencja DNA jest „połączona funkcjonalnie” z sekwencją kontrolującą ekspresję gdy sekwencja kontrolująca ekspresję kontroluje i reguluje transkrypcję i translację sekwencji DNA. Określenie „połączona funkcjonalnie” oznacza posiadanie sygnału startu (np. ATG) na początku sekwencji DNA, która ma ulec ekspresji, i utrzymanie prawidłowej ramki odczytu w celu umożliwienia ekspresj i sekwencj i DNA pod kontrolą sekwencj i kontrolującej ekspresję i wytwarzanie pożądanego produktu kodowanego przez sekwencję DNA. Jeżeli gen, który ma być włączony do rekombinowanej cząsteczki DNA, nie zawiera odpowiedniego sygnału startu, taki sygnał startu może być wprowadzony powyżej (50 ramki odczytu genu.
„Sekwencja promotora” oznacza region regulacyjny DNA zdolny do wiązania polimerazy RNA w komórce i rozpoczynania transkrypcji w kierunku w dół (kierunek do 30 sekwencji kodującej. W celu określenia niniejszego wynalazku, sekwencja promotora otoczona jest na swym końcu 3'miejscem rozpoczęcia transkrypcji i ciągnie się w górę (w kierunku 50 obejmując minimalną liczbę zasad albo elementów, konieczną do zapoczątkowania transkrypcji na poziomie wyższym niż tło. W sekwencji promotora spotyka się miejsce rozpoczęcia transkrypcji (korzystnie określone, przykładowo, przez mapowanie nukleaząS 1), jak również domeny wiążące białka (sekwencje zgodności) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA.
Inną cechą wynalazku jest ekspresja ujawnionych tu sekwencji DNA. Jak wiadomo, sekwencje DNA mogą ulegać ekspresji przez związanie ich funkcjonalne z sekwencją kontrolującą ekspresję w odpowiednim wektorze ekspresyjnym i zastosowanie takiego wektora ekspresyjnego w celu transformacji odpowiedniego jednokomórkowego gospodarza. Takie funkcjonalne związanie sekwencji DNA według wynalazku z sekwencją kontrolującą ekspresję, obejmuje, oczywiście, jeżeli nie część sekwencji DNA to dostarczenie kodonu startu, ATG, w odpowiedniej ramce odczytu powyżej sekwencji DNA.
183 352
Do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku, możliwe jest zastosowanie wielu kombinacji gospodarz/wektor ekspresyjny. Przydatne wektory ekspresyjne, przykładowo, mogą się składać z segmentów sekwencji DNA chromosomalnego, nie chromosomalnego i syntetycznego. Odpowiednie wektory obejmująpochodne SV40 i znane plazmidy bakteryjne, np. plazmidy E. coli: col El, pCRl, pBR322, pMB9, pUC albo pochodne plazmidu pUC jak np. wektory pGEX, pET, pmal-c, pFLAG itp., oraz ich pochodne, plazmidy takie jak RP4; DNA fagowe, np. liczne pochodne fagaX, np. NM989 i inne fagowe DNA, np. Μ13 i nitkowate jednoniciowe DNA fagowe; plazmidy drożdżowe takie jak 2μ i jego pochodne; wektory przydatne w komórkach eukariotycznych, takie jak wektory przydatne w komórkach owadzich i albo ssaczych; wektory uzyskane z kombinacj i DNA plaazmidowych i fagowych, takie jak plazmidy zmodyfikowane w sposób wykorzystujący fagowy DNA albo inne sekwencje kontrolujące ekspresję; i tym podobne. W korzystnym wykonaniu, ekspresja ob jest uzyskiwana na drożdżach metylotroficznych np. Pichia pastoris (patrz, np. międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 90/03431, opublikowana 5 kwietnia 1990, Brierley i in.; międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 90/10697, opublikowana 20 września 1990, Siegel i in.). W szczególnym wykonaniu, poniżej, wektor ekspresyjny jest zaprojektowany do ekspresji ob pod kontrolą sekwencji sygnałowej czynnika a.
Każda z liczb sekwencji kontrolujących ekspresję - sekwencji kontrolujących ekspresję sekwencji DNA połączonych z nimi funkcjonalnie - może być zastosowana do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. Takie przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują, przykładowo, wczesne albo późne promotory SV40, CMV, krowianki, polyoma albo adenowirusa, układ lac, układ trp, układ TAC, układ TRC, układ LTR, główne regiony operatora i promotora faga λ, regiony kontrolne białka otoczkowego fd, promotor kinazy glicerolo-3-fosforanu albo innych enzymów glikolitycznych, promotory fosfatazy kwaśnej (np. Pho5), promotor ΑΟΧ 1 drożdży metylotroficznych, promotory czynnika a drożdży i inne sekwencje znane z kontrolowania ekspresji genów komórek prokariotycznych albo eukariotycznych albo ich wirusów i ich różne kombinacje.
Różnorodne komórki gospodarzy jednokomórkowych są również przydatne do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. Gospodarze ci mogą obejmować dobrze znanych gospodarzy eukariotycznych i prokariotycznych, takich jak szczepy E. coli, Pseudomonas Bacillus, Streptomyces, grzyby takie jak drożdże (Saccharomyces i drożdże metylotroficzne takie jak Pichia, Candida, Hansenula i Torulopsis); oraz komórki zwierzęce takie jak CHO, R1.1, B-W i L-M; komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (np. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 i BMT10); komórki owadzie (np. Sf9) i ludzkie oraz roślinne komórki w hodowli tkankowej.
Należy rozumieć, że nie wszystkie wektory, sekwencje kontrolujące ekspresję i gospodarze będą również funkcjonalnie dobrze ekspresjonować sekwencje DNA według wynalazku. Również, nie wszyscy gospodarze będą równie dobrze działać z tymi samymi układami ekspresyjnymi. Jednakże, specjalista jest w stanie dobrać odpowiednie wektory, sekwencje kontrolujące ekspresję i gospodarzy, bez niepotrzebnego eksperymentowania, w celu uzyskania pożądanej ekspresji bez oddalania się od zakresu wynalazku. Przykładowo, wybierając wektor należy wziąć pod uwagę gospodarza, ponieważ wektor musi w nim działać. Należy również rozważyć liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania liczby kopii oraz ekspresję innych białek kodowanych przez wektor takich jak znaczniki oporności na antybiotyki.
Przy wyborze sekwencji kontrolujących ekspresję, rozważne są liczne czynniki. Obejmują one, przykładowo, względną moc układu, możliwość jego kontrolowania i zgodność z konkretnymi sekwencjami DNA albo genami, które mają być ekspresjonowane, szczególnie w odniesieniu do potencjalnych struktur drugorzędowych. Odpowiedni gospodarze mogą być wybrani ze względu na np. ich zgodność z wybranym wektorem, ich charakterystykę wydzielania, ich zdolność do prawidłowego fałdowania białek i ich wymagania fermentacyjne, jak również toksyczność produktu kodowanego przez ekspresjonowane sekwencje DNA dla gospodarza oraz łatwość oczyszczania produktu ekspresji.
Uwzględniając te i inne czynniki, specjalista będzie zdolny do konstruowania licznych kombinacji wektor/sekwencja kontrolująca ekspresję/gospodarz, które będą ekspresjonować sek
183 352 wencje DNA według wynalazku podczas fermentacji albo w hodowli komórek zwierzęcych na wielką skalę.
W szczególnym wykonaniu, może ulegać ekspresji białko fuzyjne OB. Białko fuzyjne OB obejmuje przynajmniej funkcjonalnie czynny fragment białka nie będącego OB połączony wiązaniem peptydowym z przynajmniej funkcjonalnie czynnym fragmentem polipeptydu OB. Sekwencje nie będące ob mogą się znajdować na końcu aminowym albo karboksylowym sekwencji OB. Korzystniej, dla stabilizacji ekspresji proteolitycznej nieczynnego białka fuzyjnego OB, cześć nie-OB białka fuzyjnego jest połączona z końcem aminowym białka OB wiązaniem peptydowym. Rekombinowana cząsteczka DNA kodująca takie białko fuzyjne obejmuje sekwencję kodującą przynajmniej funkcjonalnie czynny fragment białka nie będącego OB połączoną w jednej ramce odczytu z sekwencją kodującą OB, i korzystnie koduje miejsce ciecia dla swoistej proteazy, np. trombiny albo czynnika Xa, korzystnie w miejscu połączenia OB-nie-OB. W konkretnym wykonaniu, białko fuzyjne ekspresjonowane jest w Escherichia coli albo P pas tor is.
W konkretnym wykonaniu, poniżej, wytwarzane są wektory ekspresjonujące mysie i ludzkie geny ob, bez lub z kodonem gln-49, w układzie ekspresyjnym bakteryjnym i drożdżowym (Pichia) jako białko fuzyjne. Gen ob wytwarzany jest z miejscem cięcia endonukleazy, np. z użyciem PCR i nowego startera. Jest pożądane potwierdzenie sekwencji wytworzonej przez PCR, ponieważ w tej technice istnieje wyższe prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji punktowej. Stosowany jest plazmid zawierający znacznik histydynowy (znacznik His) i miejsce cięcia proteolitycznego. Obecność histydyny umożliwia wybiórczą izolację białek rekombinowanych na kolumnie chelatującej Ni albo oczyszczanie przez powinowactwo. Miejsce cięcia proteolitycznego, w konkretnym wykonaniu, poniżej, miejsce cięcia trombiny, jest zaprojektowane w ten sposób, że cięcie proteazą np. trombiną uwalnia dojrzały (pozbawiony sekwencji sygnałowej) polipeptyd OB pełnej długości.
W innym aspekcie, może być zastosowany wektor pGEX (Smith i in., Gene 67:31-40 (1988)). Wektor ten poddaje fuzji cDNA transferazy-S glutationu Schistosoma japonicum z interesującą sekwencją. Białka bakteryjne są zbierane zaś białka rekombinowane mogą być szybko oczyszczone na kolumnie ze zredukowanym glutationem. Nośnik GST może być następnie odcięty z białka fuzyjnego przez trawienie swoistą dla miejsca proteazą. Po odcięciu, nośnik i nie przecięte białko mogąbyć usunięte przez absorpcję na agarozie z glutationem. Trudności z tym układem występują czasami gdy kodowane białko jest nierozpuszczalne w roztworach wodnych.
Ekspresja białka rekombinowanego w układach bakteryjnych może powodować nieprawidłowe fałdowanie ekspresjonowanego białka, wymagające ponownego fałdowania. Rekombinowane białko może być ponownie fałdowane przed lub po cięciu, tworząc funkcjonalnie czynny polipeptyd OB. Polipeptyd OB może być ponownie fałdowany w etapach obejmujących (i) inkubację białka w buforze denaturującym, zawierającym czynnik redukujący, a następnie (ii) inkubację białka w buforze zawierającym czynnik utleniający, zaś korzystnie również zawierającym czynnik stabilizujący białko albo czynnik chaotropowy albo jeden i drugi.
Odpowiednie pary czynników redox (redukujące/utleniające) obejmują, choć nie wyłącznie, zredukowany glutation/disiarczek glutationu, cystynę/cysteinę, cystaminę/cysteaminę oraz 2-merkaptoetanol/2-hydroksyetylosiarczek. W konkretnym aspekcie, białko fuzyjne może być solubilizowane w czynniku denaturującym, takim jak mocznik, przed wymianą na bufor redukujący. W korzystnym wykonaniu, przed wymianą na bufor redukujący, białko jest również oczyszczane, np. przez chromatografię jonowymienną albo chelatującą Ni. Czynniki denaturujące obejmują choć nie wyłącznie mocznik albo chlorowodorek guanidyny. Białko rekombinowane jest rozcieńczane przynajmniej około 10-krotnie, korzystnie 100-krotnie, w buforze utleniającym, zawierającym czynnik utleniający, taki jak, choć nie ograniczony do 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0,1 mM EDTA, 0,15 MNaCl, 0,3 M utleniony glutation. Białko fuzyjne jest następnie inkubowane przez od około 1 do około 24 godzin, korzystnie od około 2 do około 16 godzin, w temperaturze pokojowej w buforze utleniającym. Bufor utleniający może zawierać czynnik stabilizujący białko, np. cukier, alkohol albo siarczan amonu. Bufor utleniający może
183 352 dalej zawierać czynnik chaotropowy w niskim stężeniu, w celu destabilizacji nieprawidłowych oddziaływań międzycząsteczkowych i poprawiania prawidłowego fałdowania. Odpowiednie czynniki chaotropowe obejmują choć nie są ograniczone do detergentu, poliolu, L-argininy, chlorowodorku guanidyny i poliglikolu etylenowego (PEG). Istotne jest zastosowanie odpowiednio niskiego stężenia czynnika chaotropowego, w celu uniknięcia denaturacji białka. Ponownie fałdowane białko może być zatężane co najmniej 10-krotnie, korzystnie do ilości w jakiej zostało rozpuszczone w buforze utleniającym.
Proces fermentacji bakteryjnej może również spowodować powstanie preparatu białka, zawierającego niedopuszczalne ilości endotoksyn. Stąd wynalazek uwzględnia całkowite usuwanie tych endotoksyn, np. przez zastosowanie przeciwciał swoistych wobec endotoksyn albo innych cząsteczek wiążących endotoksynę. Obecność endotoksyn może być stwierdzona standardowymi technikami, takimi jak zastosowanie odczynników Ε-ΤΟΧΑΊΈ (Sigma, St. Louis, Missouri) albo testów biologicznych.
Oprócz konkretnych przykładów, niniejszy wynalazek uwzględnia w celu ekspresjonowania białka ob zastosowanie układów ekspresyjnych bakulowirusowych, ssaczych i drożdżowych. Przykładowo, w układach ekspresyjnych bakulowirusowych mogą być zastosowane wektory transferowe nie fuzyjne, takie jak, choć nie ograniczone do pVL941 (miejsce klonowania BamHI; Summers), pVL1393 (miejsca klonowania BamHI, Smal, Xbal, EcoRI, Notl, XmalΠ, Bglll i Pstl; Invitrogen), pVL 1392 (miejsca klonowania Bglll, Pstl, Notl, XmaIII, EcoRI, xbal, Smal i BamHI; Summers i Invitrogen) oraz pBlueBacIII (miejsca klonowania BamHI, Bglll, Pstl, Ncol i Hindlll; z możliwością przesiewania rekombinacji białe/niebieskie; Invitrogen) oraz wektory transferowe fuzyjne, takie jak, choć nie ograniczone do pAc700 (miejsca klonowania BamHI i KpnI, w których miejsce BamHI rozpoczyna się kodonem startu; Summers), pAc701 ipAc701 (takie same jak pAc700, ale o innych ramkach odczytu), pAc360 (miejsce klonowania BamHI, 36 zasad poniżej kodonu startu poliedryny; Invitrogen (195)), oraz pBlueBicHisA, B i C 9 trzy różne ramki odczytu, z miejscami klonowania BamHI, Bglll, Pstl, Ncol i Hindlll, peptyd N-końcowy w celu oczyszczania ProBond, i przesiewanie rekombinacji biało/niebieskie, Invitrogen.
Wektory ekspresyjne ssacze, uwzględniane do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują wektory z indukowalnym promotorem takim jak promotor reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), np. dowolny wektor ekspresyjny DHFR albo wektor współamplifikujacy DHFR/metotrekasat, taki jak pED (miejsca klonowania Pstl, Sali, Sbal, Smal i EcoRI, ekspresjonujący zarówno klonowany gen jak i DHFR; patrz, Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12(1991)). Alternatywnie, może być zastosowany wektor współamplifikujący syntetazę glutaminy/sulfoksyminę metioniny, taki jak pEE 14 (miejsca klonowania Hindlll, Xbal, Smal, Sbal, EcoRI i Bell, ekspresj onujący syntetazę glutaminy i klonowany gen; Celltech). W innym wykonaniu, może być zastosowany wektor kierujący episomalną ekspresją pod kontrolą wirusa Epsteina-Barr (EBV) taki jak pREP4 (miejsca klonowania BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, PvuII i KpnI, konstytutywny promotor RSV-LTR, znacznik selekcyjny higromycyny; Invitrogen), pCEP4 (miejsca klonowania BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Pvul i KpnI, konstytutywny gen pośredni hCMV, znacznik selekcyjny higromycyny; Invitrogen), pMEP4 (miejsca klonowania KpnI, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHI, indukowalny promotor genu metalotioneiny Ila, znacznik selekcyjny higromycyny; Invitrogen), pREP8 (miejsca klonowania BamHI, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll i KpnI, promotor RS V-LTR, znacznik selekcyjny histidynolu; Invitrogen), pREP9 (miejsca klonowania KpnI, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil i BamHI, promotor RSV-LTR, znacznik selekcyjny G418; Invitrogen) i pEBVHis (promotor RSV-LTR, znacznik selekcyjny higromycyny, N-końcowy peptyd umożliwiający oczyszczanie na żywicy ProBond i odcinany enterokinazą Invitrogen). Ssacze wektory umożliwiające selekcję, do zastosowania w wynalazku, obejmują pRc/CMV (miejsca klonowania Hindlll, BstXI, Notl, Sbal i Apal, selekcja G418; lnvitrogen), pRc/RSV (miejsca klonowania Hindlll, Spel, BstXI, Notl, Xbal, selekcja G418; Invitrogen) i inne. Ssacze wektory ekspresyjne wirusa krowianki (patrz, Kaufman, 1991, wyżej) do zastosowania w wynalazku obejmują choć nie sąogra
183 352 niczone do pSCll (miejsce klonowania Smal, selekcja TK- i β-gal), pMJ601 (miejsca klonowania Sali, Smal, AfII, Narl, BspMII, BamHI, Apal, Nhel, SacII, KpnI i Hindlll, selekcja TK- i β-gal) oraz pTKgptFIS (EcoRI, Pstl, Sali, AccI, Hindll, Sbal, BamHI i Hpa, selekcja TK albo XPRT).
Układy ekspresyjne drożdżowe mogąbyć również zastosowane w wynalazku, w celu ekspresji polipeptydu OB. Przykładowo, według wynalazku mogąbyć zastosowane, żeby wymienić tylko dwa, wektor nie fuzyjny pYES2 (miejsca klonowania Xbal, SphI, Shol, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI i Hindlll; Invitrogen) albo wektor fuzyjny pYESHisA, B, C (miejsca klonowania Xbal, SphI, Shol, Notl, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI i Hindlll, N-końcowy peptyd umożliwiający oczyszczanie na żywicy ProBond i odcinany enterokinazą; Invitrogen). Jest dalej zamierzone, aby analogi peptydu modulującego ciężar mogły być wytwarzane z sekwencji nukleotydowych uzyskanych w zakresie niniejszego wynalazku.
Oprócz rekombinacyjnej ekspresji polipeptydu OB, niniejszy wynalazek przewiduje i w pełni umożliwia wytwarzanie polipeptydu OB, albo jego fragmentów, w oparciu o dobrze znane i wysoko rozwinięte techniki syntezy peptydowej na podłożu stałym. Wynalazek uwzględnia zastosowanie popularnych strategii grup ochronnych Boc i Fmoc, jak również innych, do wytwarzania polipeptydu ob albo jego fragmentów. Różne techniki fałdowania i utleniania łańcuchów bocznych cysteiny w celu wytwarzania wiązań dwusiarczkowych są znane w stanie techniki.
Przeciwciała przeciwko polipeptydowi OB
Według wynalazku, polipeptyd OB wytwarzany rekombinacyjnie albo syntezą chemiczną oraz jego fragmenty albo inne pochodne czy analogi, w tym białka fuzyjne, może być zastosowany j ako immunogen w celu wywołania przeciwciał rozpoznaj ących polipeptyd OB. Przeciwciała takie obejmują choć nie są ograniczone do poliklonalnych, monoklonalnych, chimerycznych, jednołańcuchowych, fragmentów Fab oraz bibliotek ekspresyjnych Fab.
Cząsteczka jest „antygenowa”, gdy jest zdolna do swoistego oddziaływania z cząsteczką układu odpornościowego rozpoznającą antygen, takąjak immunoglobulina (przeciwciało) albo receptor limfocyta T. Polipeptyd immunogenny zawiera co najmniej około 5 aminokwasów, zaś korzystnie co najmniej około 10 aminokwasów. Część antygenowa cząsteczki może być fragmentem immunodominującym dla rozpoznawania przez przeciwciała albo receptor limfocyta T, albo może być fragmentem zastosowanym do wywołania przeciwciał przeciwko cząsteczce przez koniugację do immunizacji fragmentu antygenowego z cząsteczką nośnika. Cząsteczka antygenowa nie musi być sama immunogenna, tj. zdolna do wywołania odpowiedzi odpornościowej bez nośnika. „Przeciwciało” jest dowolną immunoglobuliną obejmującą przeciwciała oraz ich fragmenty, wiążącą swoisty epitop. Określenie obejmuje przeciwciała poliklonalne, monoklonalne i chimeryczne, przy czym to ostatnie opisane szczegółowo w patentach USA nr 4,816,397 i 4,816,567, jak również fragmenty przeciwciał wiążące antygen, w tym'fragmenty Fab, Fiab^ i F(v) (z przeciwciałami jednołańcuchowymi włącznie). Nawiązując, określenie „cząsteczka przeciwciała” w różnych formach gramatycznych, w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zarówno całe cząsteczki immunoglobuliny jak i immunologicznie czynny fragment cząsteczki immunoglobuliny zawierający miejsce wiążące przeciwciała. „Miejsce wiążące przeciwciała” stanowi strukturalny fragment cząsteczki przeciwciała, zbudowany z regionów zmiennych i hiperzmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego, wiążący swoiście antygen.
Przykładowymi cząsteczkami przeciwciała są całe cząsteczki immunoglobuliny, zasadniczo całe cząsteczki immunoglobuliny i te fragmenty cząsteczki immunoglobuliny, które zawierają paratop, w tym fragmenty Fab, Fab', Fiab^ i F(v), które to fragmenty są korzystne do zastosowania w opisach tu sposobach leczenia.
Fragmenty Fab, Fiab^ cząsteczki przeciwciała wytwarzane są przez proteolityczne działanie, odpowiednio, papainy albo pepsyny, na zasadniczo całe cząsteczki przeciwciał, dobrze znanymi sposobami. Przykładowo, patrz patent USA nr 4,342,566, Theofilopolous i in. Fragmenty Fab' przeciwciała są również dobrze znane i wytwarzane z fragmentów Fiab^ przez redukcję wiązania dwusiarczkowego łączącego dwa fragmenty łańcuchów ciężkich, przy użyciu
183 352 merkaptoetanolu a następnie alkilacji powstałego merkaptanu białka odczynnikiem takim jak np. jodoacetamid. Przeciwciało zawierające całe cząsteczki przeciwciał jest korzystne.
Określenie „przeciwciało monoklonalne” dotyczy przeciwciała zawierającego tylko jeden rodzaj miejsc wiążących przeciwciała, zdolny do oddziaływania immunologicznego z konkretnym antygenem. Przeciwciało monoklonalne wykazuje zwykle powinowactwo jednego wiązania z antygenem, z którym oddziaływuje immunologicznie. Przeciwciało monoklonalne może więc zawierać cząsteczkę przeciwciała wykazującą liczne miejsca wiązania antygenu, z których każde jest swoiste immunologicznie wobec innego antygenu: np. przeciwciało monoklonalne o podwójnej swoistości (chimeryczne).
Określenie „adiuwant” dotyczy związku albo mieszaniny, wzmagającej odpowiedź odpornościową na antygen. Adiuwant może działać jako postać do powolnego uwalniania antygenu w tkance oraz jako aktywator układu odpornościowego, który nieswoiście wzmaga odpowiedź odpornościową (Hood i in., Immunology, str. 384, wyd. II, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Califomia (1984)). Często, pierwotna ekspozycja na sam antygen, pod nieobecność adiuwantu, nie wywołuje odpowiedzi odpornościowej humoralnej lub komórkowej. Adiuwanty obejmują, choć nie są ograniczone do kompletnego adiuwantu Freunda, niekompletnego adiuwantu Freunda, saponiny, żeli mineralnych takich jak wodorotlenek glinu, substancji powierzchniowo czynnych takich jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe albo węglowodorowe, hemocyjanin skorupiaka „keyhole limpet”, dinitrofenolu i adiuwantów potencjalnie przydatnych u ludzi takich jak BCG (bacille Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum. Korzystnie, adiuwant jest dopuszczalny farmaceutycznie.
Możliwe do zastosowania, w wytwarzaniu przeciwciał poliklonalnych przeciwko polipeptydowi OB albo jego fragmentom, pochodnym albo analogom, sąróżne znane procedury. Do wytwarzania przeciwciał, różne zwierzęta mogą być immunizowane przez wstrzykiwanie polipeptydu OB albo jego pochodnej (np. fragmentu albo białka fuzyjnego), w tym, choć nie wyłącznie króliki, myszy, szczury, kozy itp. W jednym wykonaniu, polipeptyd OB albo jego fragment może być koniugowany z nośnikiem immunogennym, np. albuminą surowicy bydlęcej (BSA) albo hemocyjanina„keyhole limpet” (KLH). W celu zwiększenia odpowiedzi odpornościowej mogą być zastosowane różne adiuwanty, zależnie od gatunku gospodarza, w tym, choć nie wyłącznie adiuwant Freunda (kompletny albo niekompletny), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaniny ,keyhole limpet”, dinitrofenol oraz adiuwanty potencjalnie przydatne u ludzi takie jak BCG (bacille Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum.
Do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko polipeptydowi OB, albo jego fragmentom, analogom albo pochodnym, może być zastosowana dowolna technika zapewniająca wytwarzanie cząsteczek przeciwciał przez ustalone linie komórkowe w hodowli. Obejmująone, choć nie są ograniczone do techniki hybrydoma opracowanej oryginalnie przez Kohlera i in., Naturę 256:495-497 (1975), jak również techniki trioma, techniki hybrydoma ludzkiego limfocyta B (Kozbor i in., Immunology Today 4:72 (1983)) oraz techniki hybrydoma-EB V w celu wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, AlanR. Liss, Inc., (1985)). Nieśmiertelne linie komórkowe wytwarzające przeciwciała mogą być wytworzone techniką inną niż fuzja, taką jak bezpośrednia transformacja limfocytów B onkogennym DNA, albo transfekcja wirusem Epsteina-Barr. Patrz, np. M. Schreier i in., „Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling i in.,,,Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981); Kennett i in., „Monoclonal Antibodies” (1980); patrz również patent USA nr 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,427,500; 4,491,632 i 4,493,890.
W dodatkowym wykonaniu, przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane przez zwierzęta „germ free”, przy użyciu najnowszej technologii (PCT/US90/02545). Nawiązując do wynalazku, mogą być stosowane ludzkie przeciwciała i mogą być one uzyskiwane przy użyciu ludzkich hybrydoma (Cote i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983)) albo przez
183 352 transformowanie ludzkich limfocytów TB wirusem EBV in vitro (Cole i in., 1985, wyżej). W rzeczywistości, według wynalazku, mogą być zastosowane techniki opracowane w celu wytwarzania „przeciwciał chimerycznych” (Morrisom in., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neuberger i in., Naturę 312:604-608 (1984); Takeda i in., Naturę 314:452-454 (1985)) przez składanie genów mysiej cząsteczki przeciwciała przeciwko polipeptydowi ob z genami ludzkiej cząsteczki przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej; przeciwciała takie znajdują się w zakresie niniejszego wynalazku. Takie ludzkie albo humanizowane przeciwciała chimeryczne są korzystne do zastosowania w leczeniu chorób albo zaburzeń ludzkich (opisanych niżej), ponieważ ludzkie albo humanizowane przeciwciała w przeciwieństwie do przeciwciał ksenogenicznych, nie powinny wywoływać odpowiedzi odpornościowej, w szczególności odpowiedzi alergicznej.
Nawiązując do wynalazku, techniki opisane w celu wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (patent USA nr 4,946,778) mogą być zaadaptowane do wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych swoistych wobec polipeptydu OB. Dodatkowe wykonanie wynalazku wykorzystuje techniki opisane do konstruowania bibliotek ekspresyjnych Fab (Huse i in., Science 246:1275-1281 (1989)) w celu umożliwienia szybkiego i łatwego identyfikowania monoklonalnych fragmentów Fab o pożądanej swoistości wobec polipeptydu ob albo jego pochodnych albo analogów.
Fragmenty przeciwciał zawierających swoistość idiotypowącząsteczek przeciwciał mogą być wytworzone znanymi sposobami. Przykładowo, fragmenty takie obejmują, choć nie są ograniczone do fragmentu Fiab^, który może być wytworzony przez trawienia pepsyną cząsteczki przeciwciała, fragmentów Fab', które mogą być wytworzone przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentu F^b^, oraz fragmenty Fab, które mogą być wytworzone przez działanie na przeciwciało papainą i czynnikiem redukującym.
Przy wytwarzaniu przeciwciał, przesiewanie w kierunku pożądanego przeciwciała może być osiągnięte znanymi technikami, np. testem radioimmunologicznym, ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny), testami immunologicznymi „kanapkowymi”, testami immunoradiometrycznymi (z użyciem znaczników w postaci np. złota koloidalnego, enzymów albo radioizotopu), badaniem metodą western biot, reakcjami precypitacji, testami aglutynacji (np. testy aglutynacji żelowej, testy hemaglutynacji), testami aktywacji dopełniacza, testami immunofluorescencyjnymi, testami z białkiem A oraz testami immunoelektroforetycznymi itp. W jednym wykonaniu, przeciwciało wiążące jest wykrywane przez wykrywanie znacznika na przeciwciele pierwotnym. W innym wykonaniu przeciwciało pierwotne wykrywane jest przez wykrywanie wiązania przeciwciała wtórnego albo reagentu z przeciwciałem pierwotnym. W dalszym wykonaniu znakowane jest przeciwciało wtórne. Znanych jest wiele sposobów wykrywania wiązania, w testach immunologicznych i mieszczą się one w zakresie niniejszego wynalazku. Przykładowo, w celu selekcji przeciwciał rozpoznających swoisty epitop na polipeptydzie OB, można badać wytworzone hybrydoma na wytwarzanie produktu wiążącego fragment polipeptydu OB zawierającego ten epitop. W celu selekcji przeciwciał swoistych wobec polipeptydu OB od konkretnego gatunku zwierząt, możnaje wybrać na podstawie wiązania pozytywnego polipeptydem OB ekspresjonowanym przez albo izolowanym z komórek zwierzęcia tego gatunku. Powyższe przeciwciała mogą być zastosowane w znanych sposobach dotyczących lokalizacji i aktywności polipeptydu OB, np. w badaniu western biot, obrazowaniu polipeptydu OB in situ, mierzeniu jego poziomu w odpowiednich próbkach biologicznych itp.
W konkretnym wykonaniu, mogą być wytworzone przeciwciała, które działają agonistycznie albo antagonistycznie wobec polipeptydu OB. Przeciwciała takie mogą być badane w testach identyfikacji ligandów, opisanych poniżej.
W konkretnym wykonaniu, opracowano przeciwciała przez immunizowanie królików peptydem syntetycznym wywnioskowanym na podstawie sekwencji białka albo białkami rekombinowanymi wytworzonymi przez bakteryjne wektory ekspresyjne. Wyboru peptydów syntetycznych dokonano po dokładnej analizie przewidywanej struktury białka, jak to opisano wyżej. Konkretnie, wybrano sekwencje peptydowepomiędzy domniemanymi miejscami cięcia. Peptydy syntetyczne koniugowano z nośnikiem takim jak hemocyjaninąKLH albo BSA stosując
183 352 karbodiimid i stosowano w adiuwancie Freunda do immunizacji królików. W celu wytwarzania białka rekombinowanego, może być zastosowany wektor pGEX (Smith i in., 1988, wyżej). Alternatywnie, w celu wytworzenia białka fuzyjnego, można zastosować wyłącznie domeny hydrofitowe. Ekspresjonowane białko może być wytwarzane w dużej ilości i w adiuwancie Freunda służyć do immunizowania królików. W innym konkretnym wykonaniu, rekombinowany polipeptyd OB służy do immunizowania kur, zaś kurze przeciwciało przeciwko OB izolowane są z żółtka j aj, przez np. oczyszczanie przez powinowactwo na kolumnach OB. Korzystnie, kury używane do immunizacji trzymane są w warunkach wolnych od swoistych patogenów (SPF).
W innym wykonaniu, przeciwciała przeciwko leptynie wywołane sąu myszy ob/ob, u których brak jest krążącego białka OB, a wiec jak się oczekuje są one zdolne do wytwarzania przeciwciał przeciwko polipeptydowi OB, ponieważ nie tolerują one polipeptydu, oraz u myszy typu dzikiego. Splenocyty obu grup myszy mogąbyć poddawane fuzji z komórkami szpiczaka w celu wytwarzania hybrydoma wytwarzających przeciwciała monoklonalne.
W jeszcze innym wykonaniu, rekombinowany polipeptyd OB stosowany jest do immunizacji królików zaś przeciwciała poliklonalne są oczyszczane immunologicznie przed dalszym użyciem. Oczyszczone przeciwciała są szczególnie przydatne do testów pół-ilościowych, szczególnie do wykrywania obecności polipeptydu OB krążącego w surowicy albo osoczu.
Panele przeciwciał monoklonalnych wywołanych przeciwko peptydom modulującym mogąbyć przesiewane w kierunku różnych właściwości; tj. izotypu, epitopu, powinowactwa itp. Szczególnie interesujące są przeciwciała monoklonalne neutralizujące aktywność peptydów modulatora. Takie przeciwciała monoklonalne mogąbyć łatwo zidentyfikowane w testach aktywności modulatorów ciężaru. Przeciwciała o wysokim powinowactwie są również przydatne jeżeli jest możliwe oczyszczanie przez powinowactwo immunoligiczne modulatora natywnego albo rekombinowanego.
Korzystnie, przeciwciało przeciwko modulatorowi stosowane w metodach diagnostycznych i terapeutycznych według wynalazku, jest przeciwciałem poliklonalnym oczyszczonym przez powinowactwo. Korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym (mAb). Oprócz tego, jest korzystne dla stosowanych tu cząsteczek przeciwciała przeciwko modulatorowi aby były one w postaci fragmentów całych cząsteczek przeciwciał Fab, Fab', F(ab^ albo F(v).
Implikacje diagnostyczne
Niniejszy wynalazek dotyczy również wielu zastosowań diagnostycznych, w tym sposobów wykrywania obecności stanów i/lub bodźców wpływających na nienormalność ciężaru ciała i otłuszczenia, przez odniesienie do ich zdolności do wywołania aktywności w których pośredniczą niniejsze modulatory ciężaru. Jak wspomniano wcześniej, peptydy modulujące ciężaru mogąbyć zastosowane do wytwarzania przeciwciał przeciwko sobie różnymi znanymi technikami, po czym przeciwciała takie mogąbyć izolowane i wykorzystywane do testów na obecność konkretnej aktywności transkrypcyjnej w podejrzanych komórkach docelowych. Alternatywnie, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być zastosowane do diagnostyki.
Środki diagnostyczne oparte na przeciwciałach
Jak sugerowano wcześniej, sposób diagnostyczny przydatny w niniejszym wynalazku obejmuje badanie próbki komórkowej albo ośrodka przy użyciu testu obejmującego skuteczną ilość antagonisty białka modulującego, takiego jak przeciwciało przeciwko modulatorowi, korzystnie przeciwciała poliklonalnego oczyszczonego przez powinowactwo, zaś korzystnie przeciwciała monoklonalnego. Oprócz tego, korzystne jest aby zastosowane tu cząsteczki przeciwciała przeciwko modulatorowi były w postaci fragmentów całych cząsteczek przeciwciał jak Fab, Fab', F^ab^ albo F(v).
Jak to uprzednio dyskutowano, pacjenci którzy mogą odnieść korzyść z tego sposobu obejmują cierpiących z powodu raka, AIDS, otyłości albo innych stanów gdzie nienormalny ciężar ciała stanowi czynnik albo jest cechą choroby. Znane są dobrze sposoby izolowania modulatora i indukowania przeciwciał przeciwko modulatorowi oraz w celu określenia i optymalizacji zdolności przeciwciał przeciwko modulatorowi w celu wspomagania badania komórek docelowych.
183 352
Przeciwciała obejmujące przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, oraz leki modulujące wytwarzanie albo czynność modulatorów ciężaru i innych czynników rozpoznających i/lub ich podjednostek mogą mieć szczególne zastosowanie diagnostyczne i mogą przykładowo, być wykorzystywane w celu wykrywania i/lub mierzenia stanów gdzie nienormalność ciężaru ciała może się rozwinąć lub istnieje. Przykładowo, modulatory peptydowe albo ich fragmenty czynne, mogą być zastosowane do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych w wielu pożywkach komórkowych, znanymi technikami, takimi jak technika hybrydoma wykorzystująca, przykładowo, fuzję limfocytów śledzionowych myszy i komórek szpiczaka. Techniki te są opisane szczegółowo poniżej. Podobnie, drobne cząsteczki naśladujące albo działające antagonistycznie wobec aktywności czynników rozpoznających według wynalazku, mogą być wykrywane albo syntetyzowane i stosowane w protokołach diagnostycznych i/lub terapeutycznych.
Obecność modulatorów ciężaru w komórkach może być wykryta zwykłymi procedurami immunologicznymi stosowanymi w takich oznaczeniach. Znanych jest wiele przydatnych procedur. Trzy szczególnie przydatne procedury wykorzystują czynnik rozpoznający znakowany znacznikiem możliwym do wykrycia, przeciwciało Ab] znakowane znacznikiem możliwym do wykrycia albo przeciwciało Ab2 znakowane znacznikiem możliwym do wykrycia. Procedury mogą być opisane poniższymi równaniami, w których gwiazdka oznacza, że cząsteczka jest znakowana, zaś „WM” oznacza modulator ciężaru:
A. WM* + Ab] = WM*Abj
B. WM + Abj* = WMAb]*
C. WM + Ab] + Ab2* = Ab}WMAb2*
Procedury i ich zastosowanie są znane specjalistom i mogą być zastosowane w zakresie wynalazku. Procedura „współzawodnictwa”, procedura A, jest opisana w patencie USA nr 3,654,090 i 3,850,752. Procedura B jest reprezentatywna dla dobrze znanych testów kompetycyjnych. Procedura C jest procedurą „kanapkową” opisana w patencie USA nr RE 31,006 i 4,016,043. Znane są jeszcze inne procedury jak „procedura podwójnego przeciwciała” i „DASP”.
W każdym wypadku, modulatory ciężaru tworzą kompleksy z jednym lub wieloma przeciwciałami albo składowymi wiązania zaś jeden ze składników kompleksu jest znakowany znacznikiem umożliwiającym wykrycie. Fakt, że tworzy się kompleksy oraz jeżeli to konieczne, jego ilość, może być wykrywany znanymi sposobami odpowiednimi do wykrywania znaczników. Jak widać z powyższego, charakterystyczną właściwością Ab2 jest to, że reaguje z Ab]. Spowodowane jest to tym, że Ab] wywołane w jednym z gatunków ssaków zastosowano w innym z gatunków jako antygen w celu wywołania przeciwciała Ab2. Przykładowo, Ab2 może być wywołane u kozy stosując królicze przeciwciało jako antygen. Ab2 może więc być przeciwciałem kozim przeciw-króliczym. Dla celów tego opisu i zastrzeżeń, Ab] będzie określane jako przeciwciało pierwotne albo skierowane przeciwko modulatorowi ciężaru, zaś Ab2 określane będzie jako przeciwciało wtórne albo skierowane przeciwko Ab].
Znaczniki używane najczęściej w tych badaniach są pierwiastkami promieniotwórczymi, enzymami, odczynnikiem chemicznym który fluoryzuje po ekspozycji na światło ultrafioletowe itp.
Znanych jest wiele substancji fluoryzujących i mogą być one zastosowane jako znaczniki. Obejmują one, przykładowo fluoresceinę, rodaminę i auraminę. Szczególną substancją wykrywającą jest przeciwciało kozie przeciw-królicze koniugowane z fluoresceiną przez izotiocyjanian. Modulatory ciężaru albo ich składowe wiązania mogą być również znakowane pierwiastkiem radioaktywnym albo enzymem. Znacznik radioaktywny może być wykryty dowolną znaną obecnie procedurą. Korzystnie izotopy mogą być wybrane spośród 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1,51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, l31I oraz 186Re.
Znaczniki enzymatyczne są podobnie użyteczne, i mogą być wykrywane dowolną współczesną techniką kolorymetryczną, spektrofotometryczną, fluorospektrofotometryczną amperometrycznąalbo gazometryczną. Enzymy sąkoniugowane z wybranącząsteczkąprzez reakcję z cząsteczkami łączącymi takimi jak karbodiimidy, diizocyjaniany, glutaraldehyd i itp. Znanych jest wiele enzymów, które mogą być wykorzystane w tych procedurach. Korzystne są
183 352 peroksydaza, β-glukuronidaza, β-D-glukozydaza, β-D-galaktozydaza, ureaza, oksydaza glukozy i fosfataza alkaliczna. Jako przykłady ujawnienia alternatywnych materiałów i metod znakowania można przytoczyć patenty USA 3,654,090; 3,850,752 i 4,016,043.
W dalszym wykonaniu wynalazku, mogą być wytworzone zestawy testowe odpowiednie do stosowania przez specjalistę, w celu określania obecności lub braku określonej aktywności transkrypcyjnej albo określonej zdolności do aktywności transkrypcyjnej w podejrzewanych komórkach docelowych. Zgodnie z dyskutowanymi powyżej technikami badania, jedna klasa tych zestawów powinna zawierać przynajmniej znakowany modulator ciężaru albo jego składową wiązania, np. przeciwciało swoiste dla niego, oraz instrukcje, zależnie od wybranej metody np. „kompetytywnej”, „kanapkowej”, „DASP” itp. Zestawy mogązawierać również reagenty dodatkowe takie jak bufory, stabilizatory itp.
Nawiązując, zestaw testowy może być wytwarzany w celu wykazania obecności albo zdolności komórek do określonej aktywności transkrypcyjnej, zawierając:
a) określoną ilość przynajmniej jednego znakowanego, immunologicznie aktywnego składnika uzyskanego przez bezpośrednie albo pośrednie przyłączenie niniejszego modulatora ciężaru albo swoistej składowej wiązania, ze znacznikiem możliwym do wykrycia;
b) inny reagent; i
c) instrukcje do zastosowania wspomnianego zestawu.
Konkretnie, zestaw diagnostyczny może zawierać:
a) znaną ilość modulatora ciężaru jak to opisano wyżej (albo składowej wiązania) związaną z podłożem stałym tworząc immunosorbent, albo altemtaywnie, związaną z odpowiednim znacznikiem albo ogólnie takimi produktami końcowymi itd. (albo ich składowymi wiązania);
b) jeśli to konieczne inne składniki, i
c) instrukcje do zastosowania wspomnianego zestawu.
W dalszej odmianie, zestaw testowy, działający na zasadach według określonego protokołu (np. „kompetecyjny”, „kanapkowy”, „podwójne przeciwciało” itp.), może być wytwarzany i stosowany w celach określonych wyżej, obejmując:
a) znakowany składnik, którym uzyskano sprzęgnięcie modulatora ciężaru z wykrywalnym znacznikiem;
b) jeden lub wiele dodatkowych reagentów immunochemicznych z których przynajmniej jeden jest ligandem albo ligandem unieruchomionym, wybranym z grupy obejmującej:
i) ligand zdolny do wiązania się ze znakowanym składnikiem (a);
(ii) ligand zdolny do wiązania się ze składową wiązania znakowanego składnika (a);
(iii) ligand zdolny do wiązania się z przynajmniej jednym składnikiem (a), który ma zostać oznaczony;i (iv) ligand zdolny do wiązania się z przynajmniej jedną składową wiązania przynajmniej jednego składnika, który ma zostać oznaczony; i
c) instrukcje do zastosowania wspomnianego protokołu w celu wykrycia i/lub oznaczenia jednego lub wielu składników reakcji immunochemicznej pomiędzy modulatorem ciężaru i swoista składową wiązania.
Środki diagnostyczne oparte na kwasach nukleinowych
Jak pokazano w przykładach, poniżej, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być zastosowane w celu wykrywania defektów związanych z defektami w polipeptydzie OB, powodujących fenotyp otyłości. Przykładowo, sondy z kwasu nukleinowego (np. w analizie northem biot albo RT-PCR) mogą być zastosowane, w celu stwierdzenia, czy fenotyp otyłości jest związany z brakiem ekspresji mRNA OB, albo ekspresją nieczynnego mRNA OB, np. jak u myszy db/db (gdzie niedobór spowodowany jest brakiem receptora OB) albo gdzie mutacja powoduje powstanie mRNA nie ulegającego transkrypcji. Ponadto techniki diagnostyczne oparte na kwasach nukleinowych według wynalazku, mogą być zastosowane w połączeniu z technikami opartymi na przeciwciałach.
183 352
Ludzkie klony cDNA, które ostatnio wyizolowano, zostały zsekwencjonowane jak to tu przedstawiono. Pomogło to w określeniu całkowitej sekwencji ludzkiego genu (patrz, figury od 20 A do C; Identyfikator Sekw. Nr 22). Sekwencje DNA iiitronów ludzkiego genu OB zostały uzyskane (figura 20), i zastosowane do wytworzenia starterów PCR w celu amplifikacji PCR sekwencji kodującej genu OB z ludzkiego DNA genomowego, w celu identyfikacji mutacji albo odmian allelicznych genu OB, zgodnie z protokołami opisanymi szczegółowo wcześniej. Swoiste startery PCR do amplifikacji ludzkiego genomowego DNA zostały opisane w konkretnym przykładzie, niżej.
Niniejsza hipoteza głosi, że mutacja heterozygotyczna w genie ob powinna być związana z łagodną/umiarkowaną otyłościąpodczas gdy mutacja homozygotyczna powinna być związana z kilkoma testami diagnostycznymi na otyłość, opartymi na sekwencji DNA. Jeżeli jest ona prawdziwa, powinna umożliwić wykrycie ludzi u których istnieje ryzyko rozwoju otyłości i czyni możliwym zastosowanie leków i/lub zmianę stylu życia zanim rozwinie się w pełni zwiększony ciężar ciała. Alternatywnie, obecność mikrosatelitów segregujących wraz z postaciami zmutowanymi ludzkiego OB czyni możliwym zastosowanie w diagnostyce. W tym celu mogą być zastosowane różne startery PCR, w tym oparte na sekwencji nukleotydowei dostarczonej przez figurę 20 od A do C.
Gen OB może być również przydatny diagnostycznie do mierzenia kodowanego przez niego RNA i białka w zaburzeniach odżywiania. Istotne by było sprawdzenie, w konkretnych zaburzeniach odżywiania, czy RNA dla OB i/lub kodowane przezeń białko ulega regulacji ujemnej albo nie jest regulowane. Tak więc, jeżeli osoba otyła ma podwyższony poziom OB, oznaczałoby to, że problem istnieje poniżej OB, jeżeli OB jest obniżone, oznaczałoby to, że nieprawidłowo obniżony poziom OB może powodować otyłość (niezależnie czy defekt występuje w genie OB). I przeciwnie, jeżeli pacjent cierpiący na raka albo AIDS, traci na wadze i ma podwyższony poziom OB, może to oznaczać, że nieprawidłowo wysoka ekspresja OB jest odpowiedzialna za utratę wagi.
Klonowany ludzki cDNA znalazłby zastosowanie do mierzenia poziomów ludzkiego RNA dla OB. Oprócz tego, rekombinowane ludzkie białka mogą być wytworzone i zastosowane do opracowania testów immunologicznych umożliwiających pomiar poziomu białka OB w tkance tłuszczowej i prawdopodobnie w osoczu.
Implikacje terapeutyczne
Polipeptydy, kwasy nukleinowe oraz przeciwciała według wynalazku mają wielki potencjał terapeutyczny. Korzystnie, terapeutycznie skuteczne ilości tych czynników są podawane w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku, rozcieńczalniku albo zaróbce.
Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” dotyczy związków chemicznych albo kompozycji, które są tolerowane fizjologicznie i nie wywołują zwykle po podaniu ludziom reakcji alergicznych ani podobnie niepożądanych takich jak zaburzenia żołądkowe, zawroty głowy itp. Korzystnie, w znaczeniu tu użytym określenie „dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza zatwierdzony przez agencję rządową stanową albo federalną albo wymieniony przez U.S. Pharmacopeia albo inna uznana farmakopeę, do stosowania u zwierząt, w szczególności u ludzi. Określenie „nośnik” dotyczy rozcieńczalnika, adiuwantu, zarobki albo ośrodka, w którym podawany jest związek. Takie nośniki farmaceutyczne mogą być sterylnymi płynami takimi jak woda i oleje, w tym pochodzące z nafty, zwierząt, roślin lub syntetyczne, takie jak olej arachidowy, sojowy, mineralny, sezamowy itp. Woda albo roztwory soli oraz roztwory wodne dekstrozy albo glicerolu są korzystnie stosowane jako nośniki, szczególnie do roztworów do wstrzykiwań. Odpowiednie nośniki farmaceutyczne opisane są w Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd 18, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).
Określenie „ilość skuteczna terapeutycznie” w znaczeniu tu użytym oznacza ilość wystarczającądo zmniejszenia klinicznie znaczącego deficytu aktywności, czynności i odpowiedzi gospodarza o co najmniej około 15%, korzystnie o co najmniej około 50%, jeszcze korzystniej przynajmniej o około 90%. Alternatywnie, ilość skuteczna terapeutycznie jest wystarczająca do spowodowania istotnej poprawy stanu klinicznego pacjenta. Podawanie rekombinowanego poli
183 352 peptydu OB powoduje utratę ciężaru, w szczególności zmniejszenie tkanki tłuszczowej. Polipeptyd OB może być wytwarzany przez zastosowanie standardowych bakteryjnych i/lub ssaczych wektorów ekspresyjnych, syntetycznie, albo przez oczyszczanie z osocza albo surowicy, jak to szczegółowo opisano wcześniej. Alternatywnie, zwiększona ekspresja natywnego polipeptydu OB może być spowodowana techniką rekombinacji homologicznej jak to opisano wyżej.
Zmniejszenie aktywności polipeptydu OB (przez opracowanie antagonistów, inhibitorów, zastosowanie przeciwciał neutralizujących albo cząsteczek antysensowych) powinno spowodować przyrost ciężaru ciała co może być pożądane do leczenia utraty wagi na skutek raka, AIDS albo anoreksji. Modulacja aktywności OB może być przydatne do zmniejszania ciężaru ciała (przez zwiększenie aktywności) albo zwiększenie ciężaru ciała (przez zmniejszenie jego aktywności).
Leczenie oparte na polipeptydzie
W najprostszej analizie, gen OB określa ciężar ciała u ssaków, w szczególności myszy i ludzi. Produkt genu OB i, odpowiednio cząsteczki pokrewne wydają się stanowić cześć szlaku przekazywania sygnału, przez który tkanka tłuszczowa komunikuje się z mózgiem i innymi narządami. Uważa się, że polipeptyd OB jest cząsteczką sygnałową tj. hormonem. Polipeptyd OB albo jego funkcjonalnie czynny fragment albo jego antagonista może być podawany doustnie albo pozajelitowo, korzystnie pozajelitowo. Ponieważ homeostaza metaboliczna jest procesem ciągłym, korzystne jest podawanie polipeptydu ob z uwalnianiem kontrolowanym. Przykładowo, polipeptyd może być podawany przy użyciu infuzji dożylnej, wszczepialnej pompy osmotycznej, plastra przezskómego, liposomów albo innych sposobów podawania. W jednym wykonaniu, może być zastosowana pompa (Langer i in., wyd., Medical Applications of controlled Release, CRC Press, Boca Raton, Florida 91974); Sefton CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald i in., Surgety 88:507 (1980); Saudek i in., New Engl. J. Med., 321:574 (1989)). W innym wykonaniu, mogą być zastosowane materiały polimerowe (Langer, 1974, wyżej; Sefton, 1987, wyżej; Smolen i in., wyd., controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger i in., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); patrz również Levy i in., Science 228:190 (1985); During i in., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard i in., J. Neurosurg., 71:105 (1989)). W jeszcze innym wykonaniu, układ uwalniający w sposób kontrolowany może być umieszczony w pobliżu celu terapeutycznego tj. mózgu, wymagając w ten sposób tylko frakcji dawki układowej (patrz, np. Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, str. 115-138 (1984)). Inne układy kontrolowanego uwalniania dyskutowane są w przeglądowej pracy Langer i in., Science 249:1527-1533 (1990). W innym wykonaniu, związek terapeutyczny może być dostarczony w pęcherzykach, konkretnie w liposomach (patrz, Langer, 1990, wyżej); Treat i in., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease, Lopez-Bemstein i Fidler (wyd.), Liss, New York, str. 353-365, Lopez-Bemstein, tamże, str. 317-327; patrz ogólnie tamże).
W dalszym aspekcie komórki rekombinowane transformowane genem OB i ekspresjonujące znaczne poziomy polipeptydu, mogą być wszczepiane osobnikowi wymagającemu polipeptydu ob. Korzystnie, w celu uniknięcia odrzucenia, wszczepiane są komórki autologiczne transformowane OB; alternatywnie dostępna jest technologia ochrony nie autologicznych komórek wytwarzających rozpuszczalne czynniki, w matrycy polimerowej zapobiegającej rozpoznaniu immunologicznemu i odrzuceniu.
Polipeptyd OB może być dostarczany dożylnie, dotętniczo, dootrzewnowo, domięśniowo albo podskórnie. Alternatywnie, polipeptyd OB, odpowiedni spreparowany, może być podawany donosowo albo doustnie. Stałe dostarczanie OB może być zapewnione przez dostarczanie dawki skutecznej terapeutycznie (tj. dawki odpowiedniej do wywołania zmian metabolicznych u osobnika) w stosownych odstępach np. codziennie, co 12 godzin. Parametry te zależą od ciężkości stanu choroby, innych czynników jak modyfikacja diety, która jest stosowana, ciężaru, wieku, i płci osobnika i innych kryteriów, które mogą być łatwo określone przez specjalistę według zasad dobrej praktyki klinicznej.
183 352
Kompozycje farmaceutyczne
W jeszcze innym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczone są kompozycje farmaceutyczne. Kompozycje te mogą być do podawania przez wstrzyknięcie, podanie doustne, dophicne, donosowe, albo w innej postaci. Ogólnie, w zakresie niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczne ilości białka albo produktów pochodnych według wynalazku wraz z dopuszczalnymi farmaceutycznie rozcieńczalnikami, konserwantami, solubilizatorami, emulgatorami, adiuwantami i/lub innymi nośnikami. Kompozycje takie obejmują rozcieńczalniki o różnej zawartości bufora (np. Tris-HCl, octan, fosforan), pH o sile jonowej; dodatki takie jak detergenty i środki solubilizujące (np. Tween 80, polisorbate 80), przeciwutleniacze (np. kwas askorbinowy, pirosiarczyn sodu), konserwanty (Tiomersal, alkohol benzylowy) i substancje wypełniające (np. laktoza, mannit); możliwe jest również włączenie substancji dd konkretnych preparatów związków polimerowych takich jak polikwas mlekowy, polikwas glikolowy itp., albo do liposomów. Może być również zastosowany kwas hialuronowy. Kompozycje takie mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, tempo uwalniania in vivo oraz tempo oczyszczania in vivo niniejszych białek i pochodnych. Patrz, np. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) str. 1435-1712. Kompozycje mogąbyć wytwarzane w postaci płynnej, albo jako suchy proszek, taki jak postać liofilizowana.
Podawanie doustne
W zastosowaniu wynalazku uwzględnione są doustne postacie dawkowania, opisane ogólnie w Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) w rozdziale 89. Stałe postacie dawkowania obejmujątabletki, kapsułki, pigułki, kołaczyki i tabletki podjęzykowe, opłatki i peletki. Do wytwarzania niniejszych kompozycji może być zastosowane kapsułkowanie w liposomach albo proteinoidach (np. mikrosferach proteinoidowych opisanych w patencie USA nr 4,925,673). Może być zastosowane kapsułkowanie w liposomach zaś liposomy mogąbyć derywatyzowane różnymi polimerami (np. patent USA nr 5,013,556). Opis możliwych postaci dawkowania dla leków podany jest w Marschall, Modem Pharmaceuticals, rozdz. 10, wyd. Banker i Rhodes, (1979). Ogólnie, postać powinna zawierać białko (albo białko zmodyfikowane chemicznie) i obojętne składniki umożliwiające ochronę przed środowiskiem żołądka, i uwalniające biologicznie czynny składnik w jelitach.
Szczególnie uwzględnione są doustne postacie dawkowania powyższych białek derywaty zowanych. Białka mogąbyć chemicznie modyfikowane tak aby skuteczne było podawanie doustne. Ogólnie, rozważana jest chemiczna modyfikacja polegająca na przyłączeniu do cząsteczki białka (albo peptydu) co najmniej jednej cząstki, która umożliwia (a) zahamowanie proteolizy; i (b) wychwyt do krwiobiegu z żołądka albo jelit. Pożądane jest również podniesienie ogólnej stabilności białka oraz zwiększenie czasu krążenia w organizmie. Przykłady takich cząsteczek obejmują: poliglikol etylenowy, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, polialkohol winylowy, poliwinylopirolidon i poliprołine. Abuchowski i in., (1981) wyżej; Newmark i in., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Innymi polimerami możliwymi do zastosowania są poli-l,3-dioksolan oraz poli-l,3,6-tioksokan. Korzystne do zastosowania farmaceutycznego, jak to zaznaczono wyżej, są cząsteczki poliglikolu etylenowego.
Dla białek (albo pochodnych) miejscem uwalniania może być żołądek, jelito cienkie (dwunastnica, jelito czcze albo kręte) albo jelito grube. Specjalista posiada dostępne postacie, które nie rozpuszczają się w żołądku, ale uwalniają substancję czynna w dwunastnicy albo gdzie indziej w jelicie. Korzystnie, uwalnianie unika szkodliwego wpływy środowiska żołądka, przez ochronę białka (albo pochodnej) albo przez uwalnianie materiału biologicznie czynnego poza środowiskiem żołądka, np. w jelicie.
Dla zapewnienia całkowitej oporności na środowisko żołądka, kluczowa jest powłoka nieprzepuszczalna w pH co najmniej 5,0. Przykładami bardziej powszechnych obojętnych składników stosowanych w jako powłoczki jelitowe są trimellitan octanu celulozy (CAT), ftalan hydroksypropylometylocelulozy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalanooctan poliwinylo183 352 wy (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalanooctan celulowy (CAP), Eudragit L, Eudragit S i Schellac. Powłoczki te mogąbyć stosowane jako warstwa mieszana.
Powłoczka albo mieszanina powłoczek może być stosowana również na tabletkach, nie przeznaczonych do ochrony przed środowiskiem żołądka. Obejmują one powłoczki cukrowe albo powłoczki ułatwiające połykanie tabletki. Kapsułki mogą obejmować twardą osłonkę (jak np. z żelatyny) do dostarczania suchego leku tj. proszku; zaś dla postaci płynnych może być stosowana miękka osłonka żelatynowa. Materiał osłonki opłatków może być grubą skrobią albo innym jadalnym papierem. W przypadku pigułek, tabletek podjęzykowych, tabletek proszkowych, mogąbyć zastosowane techniki spajania na mokro. Środek terapeutyczny może być w postaci farmaceutycznej jako drobne cząstki jak granulki albo peletki o wielkości około 1 mm. Postać materiału do podawania w kapsułkach może być również proszkiem, lekko sprasowanych zbitek a nawet tabletek. Te środki terapeutyczne mogąbyć wytwarzane przez sprasowanie.
Dodane mogą być środki barwiące i zapachowe. Przykładowo, białko (albo pochodna) może być przygotowywane (jak przy kapsułkowaniu w liposomach albo mikrosferach), a następnie zamykane w produkcie spożywczym, takim jak chłodzone napoje zawierające środki barwiące i zapachowe.
Środek terapeutyczny może być rozcieńczany albo może być zwiększana jego objętość przy użyciu obojętnego materiału. Rozcieńczalniki takie obejmują węglowodany, zwłaszcza mannitol, α-laktoza, laktoza bezwodna, celuloza, sacharoza, zmodyfikowany dekstran i skrobia. Jako wypełniacze mogąbyć stosowane niektóre sole nieorganiczne w tym fosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Dostępne w handlu są również rozcieńczalniki takie jak Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress i Avicell.
Do stałej postaci dawkowania środka terapeutycznego mogąbyć włączane substancje rozsadzające. Substancje stosowane jako środki rozsadzające obejmują, choć nie są ograniczone do skrobi, w tym opartej na skrobi substancji rozsadzającej Explotab, dostępnej w handlu. Może być również zastosowana sól sodowa glikolanu skrobi, Amberlite, sól sodowa karboaksymetylocelulozy, ultramylopektyna, alginian sodu, żelatyna, skórka pomarańczowa, kwaśna karboksymetyloceluloza, naturalna gąbka albo bentonit. Inną postacią substancji rozsadzającej są nierozpuszczalne żywice kationowymienne. Jako substancje rozsadzające i wiążące mogąbyć zastosowane sproszkowane gumy, obejmujące agar, Karaya albo tragakant. Kwas alginowy albo jego sól sodowa są również przydatne jako substancje rozsadzające.
Substancje wiążące mogąbyć zastosowane w celu utrzymywania środka terapeutycznego razem i wytworzenia twardej tabletki, obejmując substancje z produktów naturalnych takich jak akacja, tragakant, skrobia i żelatyna. Inne obejmują metylocelulozę (MC), etylocelulozę (EC) i karboksymetylocelulozę (CMC). Polipirołidon winylowy (PVP) i hydroksypropylometyloceluloza (HPMC) mogąbyć zastosowane w roztworach alkoholowych w celu spajania-środków terapeutycznych.
Środek poślizgowy może być dodany do postaci środka terapeutycznego w celu zapobieżenia sklejaniu podczas procesu przygotowywania. Środki poślizgowe mogą być stosowane jako warstwa pomiędzy środkiem terapeutycznym a ścianąpanewki, i obejmują one, choć nie są ograniczone do kwasu stearynowego w tym soli wapniowych i magnezowych, politetrafluoroetylenu (PTEE), parafiny ciekłej, olejów roślinnych i wosków. Mogą być również stosowane rozpuszczalne środki poślizgowe takie jak laurylosiarczan sodowy, laurylosiarczan magnezowy i poliglikol etylenowy o różnych ciężarach cząsteczkowych i Carbowax 4000 i 6000.
Środki poślizgowe, które mogą poprawiać właściwości płynne podczas wytwarzania postaci farmaceutycznej oraz podczas sprasowywania, mogąbyć również dodawane. Obejmują one skrobię, talk, krzemionkę pirogennąi uwodniony glinokrzemian. W celu polepszenia rozpuszczania środka terapeutycznego w środowisku wodnym, może być dodawany surfaktant jako środek zwilżający. Surfaktanty takie obejmują detergenty anionowe takie jak laurylosiarczan sodowy, dioktylosiarczan sodowy i dioktylosulfonian sodowy. Mogąbyć stosowane detergenty kationowe obejmujące chlorek benzalkoniowy albo chlorek benzetomiowy. Lista potencjalnych detergentów niejonowych, które mogąbyć włączone do postaci leku jako surfaktanty obejmuje
183 352 laurylomacrogol 400, stearynian polioksylu 40, uwodorniony olej rycynowy polietoksylowany 10, 50 i 60, monostearynian glicerolu, polisorbitan 40, 60, 65 i 80, estry sacharozy i kwasów tłuszczowych, metyloceluloza i karboksymetyloceluloza. Surfaktanty te mogą być obecne w postaci farmaceutycznej leku pojedynczo albo jako mieszanina w różnych proporcjach. Dodatkami, które potencjalnie zwiększają wychwyt białka (albo pochodnej) sąnp. kwasy tłuszczowe jak kwas oleinowy, linolowy i linolenowy.
Pożądane mogąbyć postacie o przedłużonym uwalnianiu. Lek może być zamknięty w obojętnej matrycy umożliwiającej uwalnianie przez dyfuzję albo ługowanie. Do postaci mogą być również włączone matryce powoli degradujące. Inną postacią powolnego uwalniania leku jest sposób oparty na układzie terapeutycznym Oroś (Alza Corp.) gdzie lek jest zamknięty w półprzepuszczalnej membranie umożliwiaj ącej wnikanie wody i wypychanie leku przez pojedynczy niewielki otwór na skutek efektu osmotycznego. Niektóre powłoczki jelitowe wykazują również' efekt spowolnionego uwalniania.
W postaci leku mogąbyć również zastosowane inne powłoczki. Obejmująone różne cukry, które mogąbyć dodawane do drażownicy. Środek terapeutyczny może być również podawany w tabletkach powlekanych; w tym wypadku stosuje się substancje, które można podzielić na dwie grupy. Pierwsze z nich są materiałami nie jelitowymi i obejmują metylocelulozę, etylocelulozę, hydroksyetylocelulozę, metylohydroksyetylocelulozę, hydroksypropylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, karboksymetylocelulozę sodu, providon i poliglikole etylenowe. Drugą grupę stanowią materiały jelitowe, będące zwykle estrami kwasu ftalowego.
W celu zapewnienia optymalngo pokrycia może być zastosowana mieszanina materiałów. Powlekanie może być przeprowadzone w drażownicy albo w żłożu fluidalnym albo przez powlekanie podczas sprasowywania.
Dostarczanie dopłucne
Uwzględnione jest również podawanie dopłucne niniejszych białek (albo ich pochodnych). Białko (albo pochodna) jest dostarczane do płuc ssaka przez wdychanie go i przenika przez wyściółkę nabłonka płuc do krwiobiegu. Doniesienia na ten temat znajdująsię w Adjei i in., Pharmaceutical Research 7(6):565-569 (1990); Adjei i in., Int. J. Pharm. 63:135-144 (1990) (octan leuprolidu); Braquet i in., J. Cardiovasc. Pharm. 13(supl. 5):143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard i in., Ann. Int. Med., 3(3):206-212(1989) (al -antytrypsyna); Smith i in., Aerosolisation of Proteins, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado (marzec 1990) (rekombinowany ludzki hormon wzrostu); Debs i in., J. Immunol. 140:3482-3488 (1988) i Platz i in., patent USA nr 5,284,656 (G-CSF). Uwzględnione są w zastosowaniu wynalazku liczne urządzenia mechaniczne przeznaczone do podawania dopłucnego produktów terapeutycznych, w tym nebulizatory, inhalatoiy dozujące i inhalatory proszkowe, znane specjalistom.
Niektórymi spośród dostępnych w handlu urządzeń do wykonywania wynalazku są nebulizator Ultravent, wytwarzany przez Mallinocrodt Inc., St. Louis, Missouri; nebulizator Acom II, wytwarzany przez Marquest Medical Products Inc., Englewood, Colorado; inhalator dozujący Ventolin, wytwarzany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i inhalator proszkowy Spinhaler, wytwarzany przez Fisons Corp., Bendford, Massachusetts.
Wszystkie te urządzenia wymagają zastosowania postaci leku odpowiedniej do dawkowania białka (albo pochodnej). Zwykle, każda z postaci jest specyficzna dla rodzaju zastosowanego urządzenia i może obejmować zastosowania odpowiedniego materiału rozpylającego, oprócz zwykłych rozcieńczalników, adiuwantów i/lub nośników przydatnych w leczeniu. Rozważne jest również zastosowanie liposomów, mikrokapsułek albo mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych albo innych rodzajów nośników. Białko zmodyfikowane chemicznie może być również przygotowywane w różnych postaciach farmaceutycznych zależnie od rodzaju modyfikacji chemicznej albo rodzaju zastosowanego urządzenia. Postacie odpowiednie do zastosowania w neubulizatorze, typu dyszowego albo ultradźwiękowego, zwykle obejmują białko (albo pochodną) rozpuszczone w wodzie w stężeniu od około 0,1 do około 25 mg biologicznie czynnego białka na mililitr roztworu. Postać leku może również zawierać bufor oraz cukier prosty (np. w celu stabilizacji białka i regulacji ciśnienia osmotycznego). Postaci do nebulizatora mogą również zawierać
183 352 surfaktant, w celu zmniejszenia albo eliminacji agregacji białka spowodowanego rozbijaniem roztworu na aerozol.
Postacie do zastosowania w inhalatorach dozujących generalnie zawierają rozdrobniony proszek zawierający białko (albo pochodną) zawieszony w substancji rozpylającej dzięki surfaktantowi. Substancja rozpylająca może być dowolną standardową substancją stosowaną w tym celu, taką jak całkowicie podstawiany chlorofluorowęglowodór, hydrochlorofluorowęglowodór, hydrofluorowęglowodór albo węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan albo ich kombinacje. Odpowiednie surfaktanty obejmują trójoleinian sorbitolu i lecytynę sojową. Kwas oleinowy może również służyć jako surfaktant. Postacie farmaceutyczne do dawkowania z inhalatora proszkowego obejmująrozdrobniony proszek zawierający białko (albo pochodną) i mogą również zawierać środek wypełniający taki jak laktoza, sorbitol, sacharoza albo mannitol w ilości ułatwiającej rozpraszanie proszku z urządzenia, np. 50 do 90% wagowych postaci, w celu skutecznego dostarczania do płuc, białko (albo pochodna) powinno korzystnie być przygotowane w postaci rozdrobnionej o przeciętnej wielkości cząsteczki mniejszej niż 10 pm (albo mikronów), korzystnie od 0,5 do 5 pm.
Podawanie donosowe
Podawanie donosowe białka (albo pochodnej) jest również uwzględnione. Podawanie donosowe umożliwia przenikanie białka do krwiobiegu bezpośrednio po podaniu produktu terapeutycznego do nosa, bez potrzeby odkładania produktu w płucach. Postacie farmaceutyczne do podawania donosowego zawierają dekstran albo cyklodekstran.
Sposoby leczenia, sposoby wytwarzania leku
Wjeszcze innym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczone są sposoby leczenia i wytwarzania leku. Stany łagodzone albo modulowane przez podanie niniejszych pochodnych opisano wyżej.
Dawkowanie
Dla wszystkich powyższych cząsteczek, jak wykazały dalsze badania, uzyskano informację dotyczącą prawidłowego dawkowania dla leczenia różnych stanów u różnych pacjentów, zaś specjalista, uwzględniając kontekst terapeutyczny, wiek i stan ogólny pacjenta, może określić odpowiednią dawkę. Ogólnie, do wstrzykiwania albo infuzji, dawkowanie wynosi pomiędzy 0,01 pg biologicznie czynnego białka/kg ciężaru ciała (biorąc pod uwagę masę samego białka, bez modyfikacji chemicznych), a 10 pg/kg (w oparciu o te dane). Schemat dawkowania może być różny, zależnie od okresu półtrwania białka albo jego pochodnej w krążeniu, niezależnie od zastosowanej postaci leku, oraz tego czy podano bolus czy infuzję ciągłą.
Podawanie z innymi związkami
W leczeniu związanym z otyłością można podawać niniejsze białko (albo jego pochodne) w skojarzeniu z jednym lub wieloma kompozycjami farmaceutycznymi stosowanymi do leczenia innych powikłań klinicznych otyłości, takich jak stosowane do leczenia cukrzycy (np. insulina), wysokiego ciśnienia krwi, wysokiego poziomu cholesterolu i innych niekorzystnych stanów związanych z otyłością. Mogą być również podawane inne środki hamujące łaknienie np. amfetaminy. Podawanie może być równoczesne (przykładowo, podawanie mieszaniny niniejszego białka i insuliny) albo może być osobne.
Leczenie środkami terapeutycznymi opartymi na kwasach nukleinowych
Gen OB może być wprowadzany do ludzkich komórek tłuszczowych w celu opracowania terapii genowej otyłości. Terapia taka powinna zmniejszać ciężar ciała. I przeciwnie, wprowadzanie konstruktów antysensownych do ludzkich komórek tłuszczowych powinno zmniejszać poziom aktywnego polipeptydu OB i spowodować zwiększenie otłuszczenia ciała.
Wjednym wykonaniu, gen kodujący polipeptyd OB wprowadzanyjest in vivo w wektorze wirusowym. Wektory takie obejmują atenuowane albo defektywne wirusy DNA, takie jak, choć nie ograniczone do wirusa opryszczki (HSV), wirusa brodawczaków, wirusa Epsteina-Barr (EBV), adenowirusa, wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) itp. Wirusy defektywne, które są całkowicie albo niemal całkowicie pozbawione genów wirusowych są korzystne. Wirus defektywny nie jest zakaźny po wprowadzeniu do komórki. Zastosowanie wektorów wirusa
183 352 defektywnego umożliwia podawanie do komórek w konkretnym, określonym miejscu, bez obaw, że wektor może zakazić inne komórki. Tak więc, możliwe jest swoiste kierowanie do tkanki tłuszczowej. Przykłady konkretnych wektorów obejmują, choć nie są ograniczone do wektorów defektywnych wirusów opryszczki 1 (HSV1) (Kaplitt i in., Molec. Celi. Neurosci., 2:320-330 (1991)), atenuowanych wektorów adenowirusowych, takichjak wektor opisanyprzez Stratford-Perricaudet i in., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992) oraz wektor defektywnego wirusa towarzyszącego adenowirusom (Samulski i in., J. ViroL, 61:3096-3101 (1987); Samulski i in., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)).
W innym wykonaniu, gen może być wprowadzany w wektorze retrowirusowym, np. jak to opisano w Anderson i in., patent USA nr 5,399,346; Temin i in., patent USA nr 4,980,289; Markowitz i in., J. Virol., 62;1120 (1988); Temin i in., patent USA nr 5,124,263; międzynarodowa publikacja patentowi nr WO 95/07358, opublikowana 16 marca 1995; przez Dougherty i in., oraz Kuo i in., Blood 82:845 (1993).
Alternatywnie, wektor może być wprowadzany in vivo lipofekcją. W ciągu ostatniej dekady wzrasta zastosowanie liposomów do kapsułkowania i transfekcji kwasów nukleinowych in vitro. Syntetyczne lipidy kationowe opracowane w celu ograniczenia niebezpieczeństw i trudności związanych z transfekcjąza pomocąliposomów, mogą być zastosowane do wytwarzania liposomów do transfekcji in vivo genu kodującego znacznik (Felgner i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417(1987); Mackeyiin.,Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 85:8027-8031 (1988)). Zastosowanie lipidów kationowych może ułatwić kapsułkowanie ujemnie naładowanych kwasów nukleinowych, jak również ułatwić zlanie się z ujemnie naładowanymi błonami komórkowymi (Felgneriin., Science 337:387-388 (1989)). Zastosowanie lipofekcj i w celu wprowadzania egzogennych genów do konkretnych narządów in vivo ma pewne praktyczne zalety. Kierowanie molekularne liposomów do pewnych komórek stanowi jeden obszar korzyści. Oczywiste jest, że kierowanie transfekcji do konkretnych rodzajów komórek powinno być szczególnie korzystne w tkankach heterogennych komórkowo, takichjak trzustka, wątroba, nerka i mózg. Lipidy mogą być sprzęgane chemicznie z innymi cząsteczkami w celu kierowania (patrz Mackey i in., 1988, wyżej). Peptydy kierujące, np. hormony albo neuroprzekaźniki oraz białka takie jak przeciwciała albo cząsteczki nie peptydowe mogą być wiązane z liposomami chemicznie. Jest również możliwe wprowadzenie wektorów in vivo jako nagich plazmidowych DNA. Nagie wektory DNA do terapii genowej mogą być wprowadzane do wybranych komórek gospodarza sposobami znanymi w technice., np. przez transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, transdukcję, fuzję komórkową, dekstran DEAE, precypitację fosforanem wapnia, zastosowaniem wstrzeliwania genów albo transporterów wektorów DNA (patrz, np. Wu i in., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu i in., J. biol. Chem., 263:14621 -14624 (1988); Hartmut i in., kanadyjskie zgłoszenie patentowe nr 2,012,311, zgłoszone 15 marca 1990).
Zastosowania gospodarcze
Gen OB może być również izolowany od zwierząt domowych i dzięki niemu mogą być uzyskiwane odpowiednie polipeptydy OB. W konkretnym przykładzie, poniżej, sonda uzyskana z mysiego genu OB hybrydyzuje z odpowiednią homologiczną sekwencjąkodującąod wielu gatunków zwierząt. Jak to dyskutowano w przypadku leczenia ludzi, rekombinowane białka mogą być wytwarzane i podawane zwierzętom domowym. Podawanie polipeptydu może być zastosowane w celu hodowania szczuplejszych zwierząt rzeźnych takichjak cielęta, świnie, drób, owce, itp. Korzystnie, podawany jest autologiczny polipeptyd OB, jednakże wynalazek uwzględnia również podawanie przeciwciała przeciwko polipeptydowi autologicznemu. Mimo iż polipeptyd OB obejmuje około 160 reszt aminokwasowych, może on nie być bardzo immunogenny. Tak więc, podawanie polipeptydu nie autologicznego może nie powodować odpowiedzi odpornościowej. Alternatywnie, wprowadzenie klonowanych genów do transgenicznych zwierząt domowych powinno umożliwić potencjalne zmniejszenie ciężaru ciała i otłuszczenia przez nadekspresję transgenu OB. Najprostszym sposobem osiągnięcia tego jest kierowanie transgenu OB do tkanki tłuszczowej stosując jego własny albo inny swoisty dla tkanki tłuszczowej promotor.
183 352
Przeciwnie, zwiększenie zawartości tłuszczu w organizmie może być pożądane w innych okolicznościach takich jak opracowanie wołowiny Kobe czy tłustych wątróbek w celu wykonaniafoie gros. Może to być osiągnięte przez kierowanie transgenu antysensownego OB do tkanki tłuszczowej albo przez zastosowanie technologii knockoutu genu. Alternatywnie, gdy pożądane jest zwiększenie ciężaru ciała przez zawartość tłuszczu, może być podawany inhibitor albo antagonista polipeptydu OB. Inhibitory takie albo antagoniści obejmują choć nie są ograniczeni do przeciwciał swoiście reagujących z polipeptydem i fragmenty polipeptydu, które wiążą ale nie aktywują receptora OB, tj. antagoniści polipeptydu OB.
Implikacje kosmetyczne
Polipeptyd OB stanowi znaczną wartość w zastosowaniu kosmetycznym, oprócz zalet zdrowotnych. W szczególności, ponieważ polipeptydy OB według wynalazku, w tym pochodne i analogi o aktywności agonistów, są przydatne w modulowaniu tempa i ilości odkładania tłuszczu w komórce zwierzęcej, są one przydatne do redukcji niekorzystnie wyglądającej tkanki tłuszczowej, np. odkładającej się na brzuchu, biodrach, udach, szyi i policzkach, niekoniecznie stanowiącej o otyłości, ale niekorzystnie wpływającej na wygląd osobnika. Efekt zmniejszenia ilości tłuszczu może być osiągnięty jak się uważa, częściowo, przez zmniejszenie apetytu, tj. zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia, przez zwiększenie podstawowej przemiany materii, albo jedno i drugie. Tak więc, niniejszy polipeptyd OB albo jego pochodne albo agonistyczne analogi, są przydatne do podawania osobnikowi w celu wywołania zmian kosmetycznych w odkładającej się tkance tłuszczowej, przez modulowanie odkładania tłuszczu, zmniejszanie apetytu albo jedno i drugie. Oprócz tego, niniejsze kompozycje i sposoby mogąbyć zastosowane w połączeniu z różnymi procedurami, takimi jak chirurgia kosmetyczna, przeznaczona do zmieniania ogólnego wyglądu ciała (np. liposukcja albo chirurgia laserowa przeznaczona do odessania albo zniszczenia tkanki tłuszczowej), ćwiczenia (zwłaszcza biegnie i trening siłowy), dieta ubogotłuszczowa, hipnozą biologiczne sprzężenie zwrotne, jako przykłady sposobów prób podejmowanych w celu zmniejszenia odsetka tkanki tłuszczowej i poprawy wyglądu ciała.
Nawiązując, niniejszy wynalazek dotyczy sposobów wywoływania modulacji kosmetycznej tkanki tłuszczowej u osobnika, przez podawanie ilości modulującej tkankę tłuszczowąpolipeptydu OB, albo jego pochodnej albo analoga agonistycznego, osobnikowi, który potrzebuje modulacji kosmetycznej tkanki tłuszczowej w celu poprawy wyglądu ciała. W szczególnym aspekcie, modulacja tkanki tłuszczowej jest następstwem zmniejszenia apetytu. Korzystnie, modulacja tkanki tłuszczowej zachodzi przez zmniej szenie tkanki tłuszczowej. W dalszym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu wywoływania kosmetycznej utraty tkanki tłuszczowej, obejmującypołączonąprocedurę zmiany wyglądu ciała z podawaniem ilości modulującej tkankę tłuszczową polipeptydu OB, albo pochodnej albo agonisty, osobnikowi wymagającemu kosmetycznej modulacji tkanki tłuszczowej w celu poprawy ogólnego wyglądu ciała.
Receptor OB
Opracowanie drobnocząsteczkowych agonistów i antagonistów czynnika OB byłoby znacznie ułatwione dzięki izolacji jego receptora. Może to być osiągnięte przez wytwarzanie aktywnego polipeptydu OB i zastosowanie do przesiewania biblioteki ekspresyjnej stosując standardową metodykę. Wiązanie receptora w bibliotece ekspresyjnej może być wykrywane przez podanie rekombinowanego polipeptydu wytworzonego dzięki bakteryjnym albo ssaczym wektorem ekspresyjnym, i obserwowanie wpływu krótkotrwałego i ciągłego podawania rekombinowanego polipeptydu na komórki biblioteki ekspresyjnej albo przez bezpośrednie wykrywanie wiązania polipeptydu OB z komórkami. Ponieważ, jak obecnie się uważa, receptor OB występuje raczej w podwzgórzu i prawdopodobnie w wątrobie, korzystnie tworzy się biblioteki cDNA z tych narządów w standardowych wektorach klonowania ekspresyjnego. Te klony cDNA powinny być następnie wprowadzane do komórek COS jako pule, zaś powstałe transformanty powinny być przesiewane aktywnym ligandem w celu wykrycia komórek COS ekspresjonujących receptor OB. Klony pozytywne mogąbyć następnie izolowane w celu odzyskania klonowanego receptora. Klonowany receptor powinien być zastosowany wraz z ligandem OB (zakładając, że jest hor
183 352 monem) do opracowania niezbędnych składników do przesiewania w poszukiwaniu drobnocząsteczkowych modulatorów OB.
Konkretny układ testowy, który może być wykorzystywany zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest znanym testem receptorowym. W teście receptorowym badany materiał jest odpowiednio znakowany zaś konkretne testowe kolonie komórkowe są traktowane pewną ilością zarówno znakowanego jak i nie znakowanego materiału po czym przeprowadza się badanie wiązania w celu określenia siły z jaką materiał znakowany wiąże się z receptorem komórkowym. W ten sposób mogąbyć ocenione różnice w powinowactwie pomiędzy badanymi materiałami.
Nawiązując, oczyszczona porcja modulatora ciężaru może być znakowana radioaktywnie i łączona, przykładowo, z przeciwciałami albo innymi inhibitorami, po czym przeprowadza się badania wiązania. Następnie przygotowuje się roztwory zawierające różne ilości znakowanego i nie znakowanego modulatora ciężaru po czym próbki komórek traktuje się nimi i inkubuje. Powstałe jednowarstwy komórkowe przemywa się, solubilizuje i liczy w liczniku gamma przez okres czasu odpowiedni do uzyskania błędu standardowego mniejszego niż 5%. Dane te następnie poddaje się analizie Scatchardapo czym obserwacje i wnioski dotyczące materiału mogąbyć wykreślane. Podczas gdy powyższe należy traktować przykładowo, obrazuje to sposób w który może być wykonywany i wykorzystywany test receptorowy, w przypadku gdy zdolność wiązania komórkowego badanego materiału może służyć jako charakterystyka różnicująca. Z kolei, test receptorowy jest szczególnie przydatny w identyfikacji swoistych receptorów niniejszego modulatora, takich jak receptor db.
Dalszy test przydatny i uwzględniany według niniejszego wynalazku, jest testem znanym jako test „cis/trans”. Pokrótce, test ten wykorzystuje dwa konstrukty genetyczne, jeden z nich jest zwykłym plazmidem ekspresjonujacym szczególny receptor w sposób ciągły, gdy transfekowany jest do odpowiedniego rodzaju komórek, drugi jest plazmidem ekspresjonującym reporter, taki jak luzyferaza, pod kontrolą kompleksu ligand /receptor. Tak więc, gdy przykładowo, jest pożądane badanie związku jako ligandu konkretnego receptora, jeden z plazmidów będzie konstruktorem powodującym ekspresję receptora w wybranej linii komórkowej, podczas gdy drugi plazmid powinien posiadać promotor związany z genem lucyferazy w którym jest wprowadzony element reagujący na konkretny receptor. Jeżeli badany związek jest agonistą receptora, ligand zwiąże się z receptorem, zaś powstały kompleks zwiąże się z elementem reagującym i zapoczątkuje transkrypcję genu lucyferazy. Powstała chemiluminescencja może być mierzona fotometrycznie, zaś krzywe odpowiedzi na dawkę są uzyskiwane i porównywane z krzywymi znanych ligandów. Powyższy protokół opisanyjest szczegółowo w patencie USA nr 4,981,784 i międzynarodowej publikacji PCT nr WO 88/03168.
Gdy zostanie zidentyfikowany rekombinant ekspresjonujący sekwencję genu receptora OB, można analizować rekombinowany receptor OB. Uzyskiwane jest to w teście opartym na fizycznych i czynnościowych właściwościach receptora OB, w tym znakowaniu radioaktywnym receptora, a następnie analizą przez elektroforezę na żelu, testy immunologiczne, wiązanie ligandu itp. Ponadto, mogąbyć wytwarzane przeciwciała przeciwko receptorowi ob, jak to opisano wyżej.
Struktura receptora OB może być analizowana różnymi znanymi sposobami. Korzystnie, może być badana struktura różnych domen, szczególnie miejsca wiązania OB. Analiza strukturalna może być wykonywana przez identyfikację podobieństwa sekwencji z innymi znanymi białkami, szczególnie receptorami hormonów i białek. Stopień podobnieństwa (albo homologii) może dostarczyć podstaw do przewidywania struktuiy i funkcji receptora OB albo jego domen. W konkretnym wykonaniu, porównanie sekwencji może być wykonane z sekwencjami z GenBank, stosując np. programy FASTA i FASTP (Pearson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)).
Sekwencja białka może być dalej charakteryzowana przez analizę hydrofilowości (np. Hopp i in., 1981, wyżej). Profil hydrofilowości może być zastosowany w celu identyfikacji regionów hydrofilowych i hydrofobowych białka receptora OB, co z kolei może wskazywać na regiony zewnątrzcytoplazmatyczne, błonowe i wewnątrzcytoplazmatyczne. Analiza stru183 352 ktury drugorzędowej (np. Cou i in., 1874, wyżej) może być również wykonywana, w celu identyfikacji regionów receptora OB posiadających pewne struktury drugorzędowe.
Manipulacja, translacja i przewidywanie struktury drugorzędowej, jak również przewidywanie i wykreślanie otwartych ramek odczytu może być również wykonywane znanym oprogramowaniem komputerowym.
Przez dostarczenie powszechnego źródła rekombinowanego polipeptydu OB oraz możliwości izolowania receptora OB (np. produktu genowego db), niniejszy wynalazek umożliwia ilościowe określenie strukturalne aktywnej konformacji polipeptydu OB i receptora OB albo ich domen. W szczególności, dostarczona jest wystarczająca ilość materiału do badania jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), analiz spektroskopowych w podczerwieni (IR), Ramana i nadfiolecie (UV) a zwłaszcza dichroizmu kołowego (CD). Szczególnie NMR zapewnia doskonałą analizę struktury cząsteczek w roztworze, co bardziej przypomina ich środowisko naturalne (Marion i in., Biochim. Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar i in., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimurai in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1681-1685 (1980)). Inne sposoby analizy strukturalnej mogą być również zastosowane. Obejmująone, choć nie są ograniczone do krystalografii rentgenowskiej (Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)).
Konkretnie, może być badana współkrystalizacjapolipeptydu OB i receptora OB. Analiza współkryształów dostarcza szczegółowej informacji o wiązaniu, co z kolei umożliwia racjonalne projektowanie agonistów i antagonistów ligandu. Może być również stosowane modelowanie komputerowe, zwłaszcza w połączeniu z metodami NMR i rentgenowskimi (Flatterick i in., wyd., Computer Graphics and Molecular Modeling, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)).
Identyfikacja i izolacja genu kodującego receptor OB według wynalazku dostarcza ilości większych niż możliwe do izolacji ze źródeł naturalnych, albo w komórkach wskaźnikowych, które zostały specjalnie zaprojektowane do wskazywania aktywności receptora ekspresjonowanego po transfekcji albo transformacji komórek. Nawiązując, oprócz racjonalnego projektowania agonistów i antagonistów w oparciu o strukturę polipeptydu OB, niniejszy wynalazek uwzględnia alternatywny sposób identyfikacji swoistych ligandów receptora OB przy zastosowaniu różnych znanych testów przesiewowych. Wynalazek może być lepiej zrozumiany w odniesieniu do poniższych przykładów, które w zamierzeniu obrazują wynalazek bez ograniczania go.
Przykłady
Poniżej opisano w zarysach sposoby zastosowane do identyfikacji materiału genetycznego, które są przykładowe dla niniejszego wynalazku. Ten cel obejmuje cztery kolejne etapy: A) mapowanie genetyczne, B) mapowanie fizyczne, C) izolacja potencjalnego genu i D) wykrywanie mutacji. Poniżej, potwierdzono, że mysi gen będący przedmiotem poszukiwań został wyizolowany (etap D), poszukiwano homologicznego genu ludzkiego, i zarówno gen mysi jak i ludzki oraz domniemane białka zostały scharakteiyzowane. Etapy podsumowano szczegółowo poniżej.
A. Mapowanie genetyczne
Mutację ob segregowano przez krzyżówki genetyczne, po czym zastosowano standardową analizę powiązań w celu umiejscowienia mutacji względem RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych). Dane te umiejscowiły gen OB z dokładnością ~5 cM na ramieniu krótszym mysiego chromosomu 6 (5 cM oznacza obszar genetyczny odpowiadający 5 rekombinacjom na 100 zwierząt). Wywołano 771 mejoz i zastosowano do dalszego mapowania genetycznego (Friedman i in., 1991, wyżej). Loci genetyczne mapowane względem OB były uprzednio opublikowane. Dwa najbliższe opisane RFLP określone były sondami uzyskanymi z genów carboxypeptidase i met.
Rozdzielczość genetyczna doświadczeń opisanych wyżej była nieadekwatna do klonu ob, głównie ze względu na to, że żaden ze znaczników genetycznych nie był w ścisłym powiązaniu. W celu identyfikacji odpowiednio powiązanych RFLP wyizolowano dodatkowe sondy i rozszerzono krzyżowanie genetyczne. W celu wyizolowania losowych fragmentów DNA z ramienia krótszego mysiego chromosomu 6, zastosowano metodę znanąjako „chromosome microdissec
183 352 tion” (Bahary i in., Mammalian Genome 4:511-515 (1993)). Sondy klonowane indywidualnie badano na ścisłość powiązań z ob. Na podstawie tych badań jedną z sond, D6Rckl3, określoną również jako psd3, wybrano do dalszych analiz dzięki jej genetycznej bliskości z OB. Sondę tą zastosowano do genotypowania 835 potomków ob z krzyżówek międzyswoistych i międzysubswoistych, co wykazało, że D6Rckl3 nie jest rekombinująca we wszystkich 835 zwierzętach, jak to opisano w Bahary i in. W trakcie mapowania fizycznego, zidentyfikowano nowy znacznik polimorficzny w klonie kosmidowym uzyskanym z YAC 53A6. ten nowy znacznik umiejscowiono pomiędzy DóRckl 3 i genem OB, i zastosowano do genotypowania dodatkowych 771 mejoz z wewnętrznie swoistych krzyżówek międzyszczepowych i krzyżówek wstecznych. Stwierdzono, że jedno ze zwierząt, #167, posiada rekombinację pomiędzy ob i D6Rck39. Te badania wykazały, że D6Rck39/D6RcK13 znajduje się -0,06 cM od ob. Zidentyfikowano dodatkową sondę, Pax4, w odległości 0,12 cM proksymalnie od ob. Pax4 był zrekombinowany u dwóch zwierząt; #111 i #420. Par# jest pseudogenem zmapowanym uprzednio na ramieniu krótszym mysiego chromosomu 6 przez Gruss i in. (Gruss i in., Genomics 11:424-434 (1991)). Na tej podstawie określono, że gen OB znajduje się na obszarze -0,2 cM pomiędzy Pax4 i DóRckl3. Doprowadziło to do próby sklonowania tego DNA w celu wyizolowania OB.
B. Mapowanie fizyczne
Klonowanie DNA na tym obszarze wykonano stosując sztuczne chromosomy drożdźowe (YAC), względnie nowy wektor klonowanią umożliwiający klonowanie długich odcinków ciągłego DNA, o długości zwykle przekraczającej milion par zasad. Sztuczne chromosomy drożdżowe wyizolowano stosując DóRckl3 i Pax4. Uzyskano to przez wytworzenie oczyszczonych sond DNA i zastosowanie ich do izolacji odpowiednich YAC. YAC te (#8, #16, #107 i #24) wyizolowano i wstępnie scharakteryzowano, i na podstawie analiz określono, że YAC 16 sięgał najdalej dystalnie, tj. najbliżej ob. Następnie uzyskano jeden z końców YAC#16 i stwierdzono, że jest ob bliżej ob niż Pax4. Koniec ten nazwano 16M(+). Wniosek ten wysnuto na podstawie tego, że sonda ta nie była zrekombinowana u zwierzęcia #420 (w przeciwieństwie do Pax4). Koniec ten sekwencjonowano i zastosowano do opracowania testu PCR. Test ten zastosowano do przesiewania biblioteki YAC. Wyizolowano cztery klony pozytywne. Kolejne charakteryzowanie tych YAC metodą „end-rescuing”, mapowaniem restrykcyjnym, elektroforeząw zmiennym polu elektrycznym i metodą Southern biot z krzyżówkami genetycznymi wykazało, że dwa z tych YAC, adu i aad są kluczowe dla dalszych badań. YAC ααί/jest niechimerycznym YAC wielkości 550 kB, rozciągającym się najdalej dystalnie. Stąd, koniec dystalny tego YAC, aad(p\C\fi zastosowano do dokończenia mapy fizycznej. YAC adu jest niechimerycznym YAC wielkości 370 kb, którego koniec dystalny, adu(+), nie był rekombinowany u wszystkich potomków ob w krzyżówkach genetycznych ze zwierzętami #111 i #167 włącznie, co sugeruje, że gen OB jest obecny w tym YAC.
Opracowano test PCR dla tych obu końców, adu(+) i aaJ(pIĆL), w celu wyizolowania więcej klonów YAC i P1 w celu kontynuacji mapowania fizycznego. Ważne klony P1, wyizolowane tym sposobem obejmowały 498,499,500 (wyizolowane sondą uzyskaną z aaJ(pICL)) oraz 322, 323 i 324 (stosując sondę z adu(+y). W międzyczasie, scharakteryzowano YAC wyizolowane przez DóRckl3 (53A6, 25A8, 25A9 i 25A10). Badania te określiły, że 53A6 rozciąga się najdalej proksymalnie w kierunku YAC aad. Wielkość odstępu pomiędzy 53A6 i aad, określono na -70 kB. Kluczowy koniec 53A6, 53(pICL) zastosowano do przesiewania trzech dostępnych bibliotek YAC i biblioteki P1. Wyizolowano krytyczny klon P1,325. Klon ten nakładał się na klony P1 wyizolowany przez aaJ(pICL) jak to opisano wyżej, stąd służył do wypełnienia odstępu pomiędzy 53(pICL) i aaa^pICL). W wyniku sklonowano całą wstawkę zawierającąklony YAC i PI, długości -2,5 milionów par zasad, i zawierającą Pax4, 16M(+), adu(+), aad(plCLfi 53(pICL), D6Rck39 i DóRckl3. Przez dokładne mapowanie miejsc rekombinacji stwierdzonej u zwierząt #111 i #167 stwierdzono, że OB jest położony na obszarze 400 kB. W celu zapewnienia źródła roboczego DNA do izolacji genu OB, z 24 klonów PI wyizolowano około 500 kB pokrywających ten nierekombinowany region. Te klony P1, włącznie z 322 i 323, które jak stwierdzono później były przydatne, zastosowano w metodzie „exon trapping”. Mapę fizyczną części chromosomu
183 352 niosącego OB pokazano na figurze 7A. Figura 7B pokazuje wstawkę YAC. Figura 7C pokazuje wstawkę PI.
C. Izolacja potencjalnych genów
Sposób zastosowany do izolowania genów na tym obszarze określany jest jako „exon trapping”. Sposób ten stosuje dostępny w handlu wektor w celu identyfikacji DNA egzonów (tj. sekwencji kodujących), przez selekcję funkcjonalnych sekwencji akceptorów i donorów składania w genomowym DNA wprowadzonym do konstruktu testowego. DNA z tych klonów P1 namnażano i klonowano do wektora „exon trapping”. Klony te były krótkimi wstawkami klonowymi w wektorze Bluescript. Każdy z klonów amplifikowano przez PCR starterami PCR odpowiadającymi sekwencjom plazmidowym flankującym wstawkę. Amplifikację DNA przeprowadzano bezpośrednio na bakteriach niosących plazmid. Reakcję nastawiono stosując robota Biomek. Produkt PCR poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym w buforze TBE zawierającym bromek etydyny. Technikę „exon trapping” zmodyfikowano w celu eliminacji zanieczyszczającego DNA E. coli z klonów P1, oraz w celu przesiewania licznych egzonów artefaktowych, których liczba przekraczała 80-90% domniemanych wychwyconych egzonów. Wektor „exon trapping” zawierał sekwencje HIV; krótki segment tej sekwencji wektora odpowiadał temu artefaktowi. Doświadczenie poszukiwania egzonów wykonano stosując różne klony PI. Produkty poszukiwania egzonów amplifikowano przez PCR, selekcjonowano i sekwencjonowano. Sekwencje domniemanych „egzonów” porównywano z sekwencjami w GenBank, stosując program komputerowy Blast. Wyselekcjonowano około piętnaście egzonów do dalszego badania przez RT-PCR, analizą metodą northem i zoo biot, na obecność odpowiedniego RNA albo sekwencji zakonserwowanych. Siedem spośród piętnastu egzonów. 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 i 2G7, kodowało transkrypt RNA. 325-2 jest genem swoistym dla jądra; 323-8 i 323-9 są raczej dwoma egzonami tego samego genu ulegającego ekspresji w mózgu i nerce. IH31322-5 stanowią dwa słabo ekspresjonowane transkrypty mózgowe. D1-F7 jest egzonem uprzednio sklonowanego genu, dehydrogenazy monofosforanu inozyny IMPHD), o wzorcu powszechnej ekspresji. Żaden z tych genów nie kodował jak się wydaje OB. 2G7, będący egzonem OB jest dyskutowany szczegółowo poniżej.
Po trzech nieudanych próbach znalezienia egzonu genu OB, spróbowano innego podejścia polegającego na pulowaniu DNA z wszystkich PI krytycznego regionu OB. Zastosowane PI obejmowały: 258,259,322,323,324,325,498,499,500,653,654 i inne. Następnie PI 258,260, 322,498 i 499 wklonowano do wektora „exon trapping”, i wykonano kilka płytek z klonami bakterii, z których każda zawierała domniemany egzon. Uzyskano około 192 klony stanowiące potencjalnie domniemany OB. Jak zaznaczono wyżej, obserwowano stały artefakt, polegający na tym, ze wiele izolatów zawierało dwa schwytane egzony pochodzące z wektora. Tak więc, klony identyfikowano zarówno na podstawie wielkości oraz faktu, że hybrydyzacja z sondą DNA odpowiadająca temu artefaktowi występowała z odpowiednimi prążkami w badaniu metodą Southern biot. W ten sposób 185 spośród 192 klonów wyłączono z dalszego badania. Wykluczenie artefaktów tylko na podstawie wielkości nie było możliwe, ponieważ mogło doprowadzić do wykluczenia egzonu odpowiadającego OB.
Tak więc, spośród 192 klonów, siedem klonów wybrano do dalszych badań. Wykonano matryce do sekwencjonowania siedmiu egzonów, po czym wykonano sekwencjonowanie. Sekwencje siedmiu egzonów analizowano i stwierdzono, że siedem z nich jest identycznych, zaś jeden jest prawdopodobnie artefaktem. Konkretnie, klon 1D12 zawierał sekwencję HIV, tj. prążek będący artefaktem. Pozostawiło to trzy egzony do dalszego badania: lFl,2G7i 1H3. 1F1 wyeliminowano ponieważ mapował poza regionem krytycznym. Wyselekcjonowano i syntetyzowano startery PCR do 1H3 i 2G7.
Określono sekwencję egzonu napodstawie 2G7, jak to pokazano na figurze 10 (Identyfikator Sekw. Nr 7), wyselekcjonowano i syntetyzowano startery dla 2G7. Części sekwencji odpowiadające starterom PCR podkreślono. Zastosowano startery:
5'CCAGGGCAGGAAAATGTG (Identyfikator Sekw. Nr 8) (Tm=60,0°C) 3'CATCCTGGACTTTCTGGATAGG (Identyfikator Sekw. Nr 9) (Tm=60,0°C).
183 352
Startery te amplifikowały genomowy DNA w poniższych warunkach PCR: 25-30 cykli po 2'przyłączania w 55°C, 27 wydłużania w 72°C i 1' denaturacji w 94°C w standardowym buforze do PCR. Startery te zastosowano również w celu wytworzenia znakowanej sondy przez włączenie do reakcji PCR 32P-dCTP z odpowiednim zmniejszeniem ilości nieznakowanego dCTP. RT-PCR wykonywano na RNA wielu tkanek i stwierdzono, że 2G7 wśród badanych tkanek ulega ekspresji wyłącznie w białej tkance tłuszczowej (fig. 11 A). Następnie, 2G7 znakowany 32P hybrydyzowano z tkankowymi RNA w badaniu metodąnorthem biot (figura 1 IB) i wykazano, że jego RNA ulega znacznej ekspresji w tkance tłuszczowej, ale nie ulega wcale albo w niiewielkim stopniu w innych tkankach (gdzie sygnał może być wynikiem zanieczyszczenia tkanek tłuszczem). 10 pg całkowitego RNA z każdej z badanych tkanek poddano elektroforezie na żelu agarozowym z formaldehydem. Sondę hybrydyzowano z membraną w 65°C w standardowym buforze hybrydyzacyjnym Rapid Hybe (Amersham). Wielkość RNA wynosiła około4,9 kB. Od tego momentu uznano 2G7 za istotnego kandydata genu OB i badano go dalej.
D. Wykrywanie mutacji
W celu potwierdzenia, że 2G7 koduje gen OB, było konieczne wykazanie różnicy w poziomie ekspresji RNA o sekwencji DNA tego genu u zwierząt zmutowanych w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Dostępne były dwie osobne mutacje genu ob, C57B1/6J ob/ob (1J) i Ckc/Smj ob/ob (2J). Określane one będą dalej jako, odpowiednio, 1J and 2 J (w odniesieniu do badanych szczepów zwierząt zastosowano nieformalną nomenklaturę. W opisie oraz w rysunkach C57B1/6J dotyczy C57B1/6J +/+; Ckc/smj dotyczy SM/Ckc-+Dac-+/+; CKC/smj ob/ob dotyczy (SM/Ckc-+Dac- ob^/ob^j. RNA wyizolowano z tkanki tłuszczowej pobranej od zwierząt 1J, 2J i kontrolnych. Całkowity RNA dla każdej próbki traktowano DNaząi poddawano odwrotnej transkrypcji stosując oligo-dT jako starter i odwrotną transkryptazę. Powstały jednoniciowy cDNA amplifikowano PCR ze starterami 2G7 (warunki pokazane wyżej) uzyskując dolny prążek albo z dostępnymi w handlu starterami aktyny, uzyskując górny prążek. Produkty RT-PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny, w buforze TBE (figura 12A). Stosując RT-PCR odkryto, że o ile mRNA 2G7 ulega ekspresji w U i wszystkich myszach kontrolnych, nie było go w ogóle u myszy 2J. Nie wykrywano sygnału nawet po 30 cyklach amplifikacji. Doświadczenie to dowiodło w sposób bezpośredni, że 2G7 odpowiada egzonowi genu OB.
O ile mutacja 2J jest względnie nowa i utrzymywana jako szczep koizogeniczny, wynik ten był pierwszym dostępnym dowodem wskazującym, że 2G7 jest egzonem genu OB. Mutacja jest raczej położona w regionie promotora, co prowadzi do całkowitego braku syntezy mRNA. Obecność sygnału u myszy U w tym doświadczeniu RT-PCR wskazuje, że U może nieść mutację, która nie powoduje dużej zmiany w wielkości próbki RNA. Oprócz tego, mRNA 2G7 było nieobecne w badaniu RT-PCR czterech dodatkowych zwierząt 2J.
Wyniki potwierdzono badaniem metodą northem biot (figura 12B). RNA komórek tłuszczowych wyizolowano od każdego ze szczepów (C57B1/6J, CKC/smj i 2J). 10 pg tych RNA rozdzielono na żelu i przeniesiono na membranę. Membranę sondowano sondą 2G7 znakowana w PCR, przez amplifikację materiału, tj. prążka, na figurze 11 stosując 32P-dCTP w reakcji PCR. Aktyna stanowiła kontrolę ilości stosowanego RNA. Sygnał aktyny jest prawie równy we wszystkich próbkach. Sygnał OB jest nieobecny w mózgu, ponieważ mRNA jest swoiste dla tkanki tłuszczowej. Wyniki analizy metodąnorthem potwierdziły, ze RNA swoisty dla 2G7 jest nieobecny u myszy 2J. RNA ob jest nieobecny u myszy CKC/smj ob/ob, ponieważ w tym zmutowanym szczepie gen jest uszkodzony w taki sposób, że nie powstaje RNA. Oprócz tego, poziom RNA 2G7 był zwiększony ~ 10-20 razy w tkance tłuszczowej 1J jak również db/db. Wyniki te są zgodne z hipotezą że OB koduje hormon krążący albo jest odpowiedzialne za powstawanie sygnału z komórek tłuszczowych, modulującego ciężar ciała. Wyniki te potwierdzająwniosek, że 2G7 jest genem OB i pozwalają przewidzieć, że myszy U mająmutację punktową prawdopodobnie mutację nonsensowną prowadzącą do przedwczesnego przerwania translacji.
Te wyniki badania metodą northem, powtórzono stosując preparat RNA komórek tłuszczowych od czterech różnych zwierząt 2J (figura 13). W tym teście, ap2 jest transkryptem swoistym dla tkanki tłuszczowej, który zastosowano jako kontrolę, podobnie jak aktynę na
183 352 figurze 12B. Nie było istotnych różnic pomiędzy gęstościąprążków ap2. ap2 znakowano starterami PCR zaprojektowanymi w oparciu o opublikowaną sekwencję ap2. Produkty RT-PCR RNA komórek tłuszczowych były ponownie znakowane stosując ten sam protokół do znakowania przez PCR. Analiza ta pokazuje obecność mRNA OB u normalnych zwierząt homozygotycznych albo heterozygotycznych i brak u zmutowanych zwierząt 2J. Zidentyfikowano mutację u myszy U. Mutacją była zmiana C na T, powodująca zmianę argininy na przedwczesny kodon stop, w pozycji aminokwasowej 108, co najprawdopodobniej odpowiadało za mutację U (figura 14) mimo ob/ob wysokiego poziomu ekspresji mRNA ob (patrz, figury 12 i 13, ścieżki oznaczone C57BL/6J ob/ob.
Ostatnio, zastosowano badanie metodą Southema w celu ustalenia, że mutacja 2J jest wynikiem wykrywalnej zmiany DNA na końcu 5' OB, co wydaje się całkowicie uniemożliwiać powstawanie mRNA. Dokładna natura prawdopodobnej rearanżacji pozostaje do wyjaśnienia.
Badanie genomowego DNA od myszy CKC/smj (SM/Ckc-+Dac) i C57B1/6J, przy zastosowaniu czterech różnych endonukleaz restrykcyjnych wykonano w celu określenia czy mutacja ob powoduje unikalny wzorzec fragmentów (figura 15 A). Około 10 pg DNA (uzyskanego z genomowego DNA wyizolowanego z wątroby, nerki i śledziony) trawiono wskazanym enzymem restrykcyjnym. DNA poddano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym w TBE. DNA przeniesiono na membrany imobilon i hybrydyzowano z sondą 2G7 znakowana przez PCR. Kluczowym prążkiem jest najwyższy prążek w trawieniu BgUI DNA od myszy CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+Dac- ob2ilob2i). Prążek ten ma większy ciężar cząsteczkowy niż w innych szczepach wskazując na mutację w tym szczepie. Figura 15B pokazuje badanie metodąSouthema trawienia BgUI genomowego DNA od potomstwa krzyżówki ob21/+ x ob^H. Niektóre z tych DNA wykazują wyłącznie górny prążek, niektóre tylko dolny zaś niektóre mają oba prążki. Zwierzęta tylko z górnym prążkiem były allogenicznie otyłej, tj. ob2ilob2i. Dane te pokazują, że polimorfizm (tj. mutacja) pokazany na fig. 15A segreguje w sensie genetycznym.
Przykład 1: klonowanie cDNA i określanie sekwencji OB
Stosując znakowanąPCR sondę 2G7, wyizolowano pięćdziesiąt klonów mysiego cDNA z biblioteki cDNA mysich komórek tłuszczowych wZgtl 1 (Clontech 5-STRETCH cDNA z poduszeczki tłuszczowej jądra myszy Swiss, #ML3005b) i trzydzieści krzyżowo hybrydyzujących klonów ludzkiego cDNA z biblioteki cDNA ludzkich komórek tłuszczowych w Żgtl 0 (Clontech 5'-STRETCH cDNA z brzucha, #HL1108a). Przesiewanie biblioteki wykonywano stosując procedurę odcisku łysinek. Filtry z odciśniętymi łysinkami denaturowano stosując metodę autoklawowania. Filtry hybrydyzowano w powtórzeniach, ze znakowana przez PCR Sondą 2G7 (bufor Rapid Hybe, 65°C przez noc). Po 2-4 godzinach prehybiydyzacji, filtry płukano w 2xSSC, 2%SDS, dwa razy po 30 minut w 65°C i eksponowano na nie film rentgenowski. Pozytywne powtórzenie oczyszczano z łysinek. Faga oczyszczonego z łysinek amplifikowano stosując dostępne w handlu startery do wektora, np. do XgtlO i Xgtl 1. Powstałe produkty PCR odpowiadały wstawce cDNA dla każdego faga, z małym dodatkiem sekwencji wektora na obu końcach. Prążki oczyszczono na żelu i sekwencjonowano stosując automatyczny sekwenator ABI i startery do wektora.
Surowe dane z sekwencjonowania były badane ręcznie zasada po zasadzie w celu skorygowania błędów z programu komputerowego. Jak tylko stała się dostępna prawidłowa sekwencja, zsyntetyzowano startery poniżej i zastosowano je do dalszego sekwencjonowania. Doświadczenia takie powtarzano dopóki każdy z dostępnych klonów cDNA nie został zsekwencjonowany i zsyntetyzowany we wstawce. Do tej pory, skomplikowano -3000 par zasad z końca 5'mRNA. Jeden z klonów cDNA ciągnął się w kierunku 5'mRNA, ponieważ jego sekwencja była identyczna z sekwencją produktu SJfACE RNA tkanki tłuszczowej (dane nie pokazane). Dane z sekwencjonowania wykazały, że istnieje otwarta ramka odczytu wielkości 167 aminokwasów (figura 1). Sekwencja zgodności Kozaka dla początku translacji z resztą adenozyny trzy zasady powyżej ATG była obecna. Stwierdzono dwie klasy cDNA, różniące się obecnością albo brakiem pojedynczego kodonu glutaminy. Reszta ta była stwierdzona w pozycji bezpośrednio 3'od akceptora składania egzonu 2G7. Ponieważ kodon glutaminy CAG obejmuje sekwencję prawdopodobne
183 352 go akceptora składania AG, wydaje się, że występuje „poślizg” w miejscu akceptorowym składania, połączony z delecją 3 par zasad, w pewnej klasie cDNA jak to pokazano niżej.
gin ser val ag CAG TCG GTA (z glutaminą) (Identyfikator Sekw. Nr 17)
T (miejsce akceptorowe składania) ser val ag CAG TCG GTA (bez glutaminy)
T (miejsce akceptorowe składania) „ag” w sekwencji odpowiada prawdopodobnej sekwencji powyżej kodonu glutaminy, zaś AG jest prawdopodobnym miejscem alternatywnego składania. Ta reszta glutaminy jest położona w wysoce konserwatywnym regionie cząsteczki, zaś jej znaczenia dla aktywności biologicznej nie jest jeszcze znane. Wykryto domniemaną N-końcową sekwencję sygnałową której miej sce odcięcia sygnału wydaje się być w kierunku karboksylowym od reszty alaniny w pozycji aminokwasowej 21. Ta domniemana sekwencja sygnałowa została potwierdzona przez zastosowanie algorytmu komputerowego metodą von Heijne. Stosując tą technikę, najbardziej prawdopodobna sekwencja sygnałowa została zidentyfikowana w regionie kodującym polipeptyd odpowiadającym aminokwasom od 1 do 23, o sekwencji: MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA T VP (Identyfikator Sekw. Nr 10) w której strzałka oznacza miejsce cięcia domniemanej sekwencji sygnałowej. Reszta sekwencji była w większości hydrofitowa i nie miała żadnych strukturalnych motywów albo motywów błonowych, innych niż N-końcowa sekwencja sygnałowa. Konkretnie, nie stwierdzono sekwencji zgodności glikozylacji n-końcowej albo dwuzasadowych sekwencji aminokwasowych wskazujących na miejsce cięcia białka podczas obróbki przewidywanego białka (Sabatini i in., The metabolic basis for inherited diseasa, str. 177-223, C. V. Scriver i in., wyd. McGraw-Hill, New York. Przeszukiwanie bazy danych stosując programy Blast i Błock nie wykazało żadnych sekwencji homologicznych. RN A ludzkiej tkanki tłuszczowej był badany metodąnorthem biot, wykryto gatunek RNA o podobnej wielkości co mysi gen ob. Sekwencjonowanie i analiza klonów cDNA wykazała, że ludzkie OB również koduje polipeptydo 167 aminokwasach (figura2A i B oraz figura 3). Dwie klasy cDNA, z lub bez delecji trzech zasad, stwierdzono również u człowieka (figura 6). Mysi i ludzki gen OB były wysoce homologiczne w zakresie przewidywanego regionu kodującego, ale wykazywały tylko 30% homologii w dostępnych regionach 3' i 5' nie ulegających translacji. N-końcowa sekwencja sygnałowa była również obecna w ludzkim polipeptydzie OB. Porównanie mysiej i ludzkiej sekwencji polipeptydowej wykazało, ze obie cząsteczki wykazują ogólnie 84% podobieństwo na poziomie aminokwasowym (figura 4). Końce N dojrzałych białek obu gatunków wykazywały jeszcze wyższą homologię, posiadając tylko cztery konserwatywne i trzy nie konserwatywne podstawienia aminokwasów w 100 resztach aminokwasowych końca N. DNA genomowy wyizolowano od myszy, szczura, królika, nornicy, kota, krowy, owcy, świni, człowieka, kury, węgorza i muszki owocowej, i trawiono restrykcyjnie EcoRI. Trawienia poddano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym w TBE. DNA przeniesiono na membranę imobilion i sondowano sondą 2G7 znakowaną w PCR. Filtry hybrydyzowano w 65°C i płukano w 2xSSC, 0,2% SDS w 65°C dwukrotnie po 20 minut, tj. z dwoma zmianami bufora. Dane wskazują że OB jest zakonserwowane wśród kręgowców (figura 16). Warte odnotowania jest istnienie sygnału 2+ w DNA węgorza, który jest rybą.
Podsumowując, dostępne dowody sugerują że ciężar ciała i otłuszczenie, są pod kontrolą fizjologiczną. Siedem lat temu podjęto wysiłki w kierunku identyfikacji dwóch kluczowych składowych tego układu: genów OB i DB. Jak pokazano w tym przykładzie, gen OB został obecnie zidentyfikowany jako swoisty dla tkanki tłuszczowej gen, odgrywający kluczową rolę w regulowaniu ciężaru ciała. Produkt tego genu, który najprawdopodobniej jest wydzielanym hormonom, będzie mieć istotne implikacje dla diagnozy i leczenia zaburzeń odżywiania u ludzi i zwierząt.
183 352
Przykład 2: ekspresja OB w bakteriach
Mysi jak również ludzki cDNA kodujący ob klonowano do wektora ekspresyjnego pET-15b (Novagen). Wektor ten zawiera promotor T7 w połączeniu z operatorem lac, i ekspresjonuje białko fuzyjne zawierające znacznik histydynowy (znacznik His) oraz miejsce cięcia trombiny bezpośrednio powyżej miejsca wprowadzenia sekwencji kodującej (figura 17) (Identyfikator Sekw. Nr 11 i 12).
Mysie i ludzkie cDNA zmodyfikowano tak, że alanina na końcu sekwencji sygnałowej została zamieniona na miejsce Ndel, jako osobna sekwencja w regionie 3'. Wprowadzenie miejsca Ndel uzyskano stosując PCR z nowymi starterami;
Mnde-5' (mysi starter 5j (Identyfikator Sekw. Nr 13) CTTATGTTCATATGGTGCCGATCCAGAAAGTC
Mnde-3' (mysi starter 3*) (Identyfikator Sekw. Nr 14) TCCCTCTACATATGTCTTGGGAGCCTGGTGGC
Hnde-5' (ludzki starter 5j (Identyfikator Sekw. Nr 15) TCTATGTCCATATGGTGCCGATCCAAAAAGTC
Hnde-3' (ludzki starter 3) (Identyfikator Sekw. Nr 16) TTCCTTCCCATATGGTACTCCTTGCAGGAAGA
Startery zawierały w środku 6-zasadową niezgodność wprowadzającą miejsca restrykcyjne Ndel na każdym z końców fragmentu PCR. Faga niosącego cDNA mysi lub ludzki amplikowano przez PCR przy użyciu tych starterów. Produkt PCR trawiono Ndel i oczyszczono na 1 % żelu z agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Oczyszczone prążki klonowano do wektora pET. Powstałe plazmidy sekwencjonowano w celu upewnienia się, że podczas etapu amplifikacji PCR nie wprowadzono mutacji. Wytworzono konstrukty dla ludzkiego i mysiego cDNA kodujące i niekodujące glutaminy 49. W szczególności, konstrukty pETl 5b zawierające ludzką albo mysią sekwencję kodującą OB, pozbawioną sekwencji sygnałowej i poddaną fuzji ze znacznikiem His, wytworzono stosując metodę klonowania PCR. Konstrukty sekwencjonowano w celu upewnienia się, że podczas etapu amplifikacji PCR nie wprowadzono mutacji do regionu kodującego gen OB.
Do transformowania bakteryjnego gospodarza ekspresyjnego wyselekcjonowano dwa powstałe konstrukty plazmidowe pETM9 i pETH14. Po indukcji 1 mM IPTG w warunkach optymalnych, transformowane bakterie były zdolne do wytwarzania 100-300 pg fuzji OB na mililitr. Większość białka fuzyjnego OB stwierdzano w ciałkach wtrętowych. Po solubilizacji 6M chlorowodorkiem guanidyny albo mocznikiem, białko fuzyjne oczyszczano na kolumnie wiążącej His (chelatacja Ni). Warunki oczyszczania na kolumnie białka fuzyjnego OB (obejmującego wiązanie, przemywanie i elucję) dobrano doświadczalnie. Białko fuzyjne OB wiązało się z żywicą w 5 mM imidazolu/6 M chlorowodorku guanidyny i pozostawało związane do 20 mM imidazolu/6 M chlorowodorku guanidyny. Białko było eluowane przez 60 mM imidazol/6 M chlorowodorek guanidyny (figura 18 A, B). Zarówno oczyszczone ludzkie jak i mysie białko fuzyjne OB było dalej dializowane w PBS w celu usunięcia chlorowodorku guanidyny z preparatu, a następnie zastosowane w celu wywołania przeciwciał poliklonalnych.
W celu zbadania aktywności biologicznej białka fuzyjnego, badano i ulepszano warunki fałdowania oczyszczonego białka. Obejmowało to początkową dializę białka fuzyjnego w 1 M roztworze guanidyny, a następnie rozcieńczanie 0,4 M roztworem argininy. Znacznik His usuwano z białka fuzyjnego przed badaniem aktywności biologicznej. Usuwanie znacznika uzyskano przez trawienie białka fuzyjnego ludzkątrombinąłożyskową. Oprócz tego, sekwencje kodujące ludzkiego i mysiego genu OB pozbawione sekwencji sygnałowej wprowadzano do wektora pET 12c stosując metodę klonowania PCR. Konstrukty te mogły bezpośrednio syntetyzować białko fuzyjne OB do przestrzeni peryplazmatycznej komórki bakteryjnego gospodarza. Białko fuzyjne OB odzyskiwane z przestrzeni peryplazmatycznej w celu oczyszczenia z innych białek gospodarza, może wymagać jedynie prostej filtracji żelowej i nie wymaga denaturacji podczas tego procesu.
Przykład 3: wytwarzanie przeciwciał przeciwko polipeptydowi OB
Oprócz zastosowania białka rekombinowanego do wyłowywania przeciwciał poliklonalnych, zidentyfikowano zestaw czterech sekwencji peptydowych z wywnioskowanej sekwencji
183 352 mysiego OB, stosując oprogramowanie badające immunogenność (pakiet GCG). Cztery fragmenty peptydowe końca karboksylowego miały sekwencje;
(Identyfikator Sekw. Nr 18):
Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr, (Identyfikator Sekw. Nr 19):
Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala, (Identyfikator Sekw. Nr 20):
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp i (Identyfikator Sekw. Nr 21):
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln- Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys.
Peptydy te koniugowano z KLH, zaś koniugaty peptydów z KLH zastosowano do immunizacji królików sposobami standardowymi. Surowice poliklonalne swoiste wobec każdego z peptydów wyizolowano od królików.
Przykład 4: translokacja in vitro polipeptydu OB
W celu potwierdzenia obecności funkcjonalnej sekwencji sygnałowej, ludzi cDNA obejmuj ący całą otwartą ramkę odczytu wklonowano do wektora pGEM. W tym doświadczeniu wykorzystano jedynie ludzki cDNA ponieważ nie uzyskano odpowiednich klonów mysich. Nić (+) RB A dla ludzkiego ob poddano transkrypcji z użyciem polimerazy Sp6 i zastosowano w reakcji translacji in vitro z lub bez błon mikrosomalnych trzustki psa. Pierwotny produkt translacji migrował z ciężarem cząsteczkowym ~ 18 kDa, co było zgodne z przewidywaniami na podstawie sekwencji cDNA. Włączenie błon mikrosomalnych do reakcji hamowało całkowitą efektywność translacji ~ 5-krotnie. Oprócz tego, około 50-70% pierwotnego produktu translacji było skrócone o około 2 kDa w obecności preparatu błon, wskazując, że sekwencja sygnałowa jest fimkcjonalna (figura 19A). Wielkość pierwotnego produktu translacji RNA interleukiny la, nie kodującej sekwencji sygnałowej, była bez zmian gdy błony mikrosomalne dodano do reakcji. W celu potwierdzenia, że translokacja białka OB miała miejsce, produkt translacji in vitro trawiono proteinaząK. Trwawienie proteaząpowodowało całkowitą pro teolizę pierwotnego produktu translacji wielkości 18 kDa, podczas gdy obrobiona postać 16 kDa pozostała nietknięta działaniem enzymu, co wskazywało, że została ona translokowana do światła mikrosomów (figura 19B). Dane te są zgodne z hipotezą że OB jest białkiem wydzielniczym. Po odcięciu sekwencji sygnałowej, pozostają dwie reszty nasuwające podejrzenie, że cząsteczka zawiera wiązanie dwusiarczkowe charakterystyczne dla innych polipeptydów wydzielniczych (Shen i in., Science 224:168-171(1984)).
Przykład 5: charakteryzowanie genu OB
W celu ustalenia zależności pomiędzy otyłością i zmianami genetycznymi w genie OB u ludzi, określono sekwencję ludzkiego genu OB (figura od 20 A do C) (Identyfikator Sekw. Nr 22 i, 24). W celu przesiewania ludzkiej biblioteki PI zastosowano startery swoiste dla ludzkiej sekwencji kodującej. Uzyskano trzy różne kolory PI, namnożono i amplifikowano przez PCR stosując startery flankujące miejsce składania pomiędzy pierwszym i drugim egzonem. Cały region intronu, około 2 kb, amplifikowano i częściowo sekwencjonowano (patrz figura 20A; jak to zaznaczono w Identyfikatorach Sekw. Nr 22 i 24).
Struktura genowa ludzkiego i mysiego genu była charakteryzowana z użyciem testu PCR i innych technik standardowych. Mysi gen OB, jak stwierdzono, zawiera trzy egzony, z których drugi i trzeci wchodzaw skład sekwencji kodującej (Figura 20D). Region kodujący ludzkiego genu OB posiada tą sama strukturę; jednakże gen ludzki pozbawiony jest egzonu i intronu 5' 9 figura 20E).
Wytworzono 2 zestawy starterów pochodzących z sekwencji intronowych genu ludzkiego (figura od20A doc). Startery miały sekwencje (Fi R oznacza, odpowiednio, startery naprzód i wstecz):
HOB IgF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (Indetyfikator Sekw. Nr 29)
HOB IgR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 30) HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 31) HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 32) Próbki DNA uzyskano z różych źródeł zaś zestawy starterów stosowano do amplifikacji ludzkiego genomowego DNA od ludzi z ciężką otyłością. Produkty PCR rozdzielono na żelu z aga183 352 rozy o niskiej temperaturze topnienia, prążki wycięto i trawiono agarazą. Sekwencje uzyskano stosując sekwenator DNA ABI373A i zestaw Taq dideoxy terminator kit (ABI, Perkin-Elmer). Do tej pory stwierdzono jedną mutację punktowąw genie ob pacjenta. Mutacja ta występowała w pierwszym egzonie i nie wywoływała zmiany sekwencji aminokwasowej. Wstępne dane wskazują że w pierwszym egzonie innego pacjenta może być wprowadzona sekwencja.
Różne sposoby automatycznego sekwncjonowania stosujące Sequenase zamiast polimerazy DNA Taq mogąbyć zastosowane w celu łatwiejszego sekwencjonowania w poszukiwaniu mutacji.
Przykład 6: ekspresja OB w drożdżach
Po klonowaniu pozycyjnym OB, stało się istotne wyjaśnienie mechanizmu fizjologicznego, dzięki któremu białko OB zmniejsza ilość przyjmowanego pożywienia oraz ciężar ciała. Pierwszym etapem w tym celu było wytwarzanie rekombinacyjne funkcjonalnego białka w układzie ekspresyjnym. Oprócz udanego bakteryjnego układu ekspresyjnego, wybrano również drożdżowy układ ekspresyjny. Ekspresja w drożdżach ma kilka cennych zalet dla ekspresji OB. Najbardziej istotną jest prawdopodobieństwo wytwarzania biologicznie czynnego białka eukariotycznego. Polipeptyd OB jest wydzielany przez komórki ssaków. Wydzielanie białek jest bardzo podobne u wszystkich eukariotów, co oznacza że mechanizm wydzielniczy drożdży jest bardziej podobny do ssaczego niż mechanizm bakteryjny. Konkretnie, modyfikacja białka OB obserwowana w komórkach ssaczych najprawdopodobniej będzie obecna podczas ekspresji przez układ wydzielniczy drożdży. Oprócz tego, fałdowanie białka następuje podczas przechodzenia przez mechanizm wydzielniczy tak więc, wydzielane przez mechanizm wydzielniczy drożdży białko ob będzie najprawdopodobniej prawidłowo pofałdowanym białkiem o natywnej aktywności biologicznej. Jest to istotne dla OB, ponieważ dwie reszty cysteinowe mogą tworzyć mostek dwusiarczkowy. W przeciwieństwie do szlaku wydzielniczego, redukujące środowisko cytoplazmy komórek zapobiega tworzeniu mostków dwusiarczkowych; stąd istotne jest dla OB przechodzenie przez szlak wydzielniczy w celu wytworzenia się mostków dwusiarczkowych in vivo. Inne zalety wynikająz łatwości i szybkości manipulacji drożdżami, dostępności wektorów i szczepów oraz dużemu doświadczeniu w technologii rekombinacyjnej drożdży.
Układ ekspresyjny Pichia pastoris wybrano z kilku powodów:
(1) ma wyższy poziom ekspresji białek heterologicznych niż inne układy drożdżowe takie jak 5. cerevisiae, (2) glikozylacja białek w P pastoris bardziej przypomina układ ssaczy niż S. cerevisiae, (jakkolwiek nie wykryto miejsc kozylacji w miejscach nierozpoznanych), (3)Ppstoris wydziela natywnie niewiele białek, stąd jest korzystna w oczyszczaniu ekspresjonowanych obcych białek; i (4) dostępne są w handlu wektory i szczepy drożdży (Invitrogen). Dwie strategie wytwarzania drożdżowych wektorów ekspresyjnych pokazano na figurze 21 i 22.
Wybrano wektor pPIC. 9. Wektor ten zawiera miejsce klonowania tuż poniżej sekwencji kodującej prepro czynnik ot, kierującej białko kodowane przez gen klonowany w miejscu klonowania, na szlak sekrecyjny. Inną istotną cechą wektora jest gen HIS4 umożliwiający selekcję pobierania wektora, przy użyciu auksotroficznego szczepu hodowanego na pożywce pozbawionej histydyny i transformacji drożdży wektorem. Strategia klonowania wyglądała następująco: amplifikowano przez PCR cDNA OB stosując starter 5' zawierający na swym końcu 3' sekwencję komplementarną do sekwencji OB poprzedzającej bezpośrednio przewidywane miejsce odcięcia peptydu liderowego, zaś na swym końcu 5' sekwencję komplementarną do sekwencji 3' czynnika a w wektorze. Starter 5' zawierał również miej sce Xhol, Starter 3' zawierał na swym końcu 3' sekwencje komplementarną do ostatnich kilku aminokwasów OB i miejsce EcoRI na swym końcu 5'.
Po amplifikacji PCR, produkt trawiono Xhol i EcoRI i klonowano do podobnie traktowanego wektorapPIC.9. Po klonowaniu mysich i luidzkich cDNA, z lub bez glutaminy 49, izolowano pojedyncze klony dla wszystkich czterech konstruktorów i sekwencjonowano w celu sprawdzenia czy konstrukty sklonowano w poprawnej orientacji, w ramce i czy nie zawierają mutacji z etapu amplifikacji PCR. Po identyfikacji klonów o poprawnej sekwencji, transformowano je do szczepu GS115 P. pastoris, auksotrofa histydyny.
Dla dwóch mysich konstruktów OB, transformowane klony drożdży przesiewano w kierunku ekspresji białka. Jako dowód, że transformowane drożdże zawierająOB, wykonywano test metodą DNA dot-blot i test hybrydyzacji kolonii, które to testy wykazały sekwencję OB w dróż
183 352 dżach transformowanych ale nie w drożdżach nietransformowanych. Ponadto, transformowane drożdże wydzielały białko 16 kDa do pożywki, podczas gdy drożdże nietransformowane nie wydzielały białka o tej wielkości (figura 23 A). Była to przewidziana wielkość OB. Pojedyncze klony obu konstruktów mysich ekspresj ono wały silnie OB i obecnie opracowywana jest strategia oczyszczania w celu oczyszczenia OB do homogenności. Jednąze strategii jest oczyszczanie OB na kolumnie kationowymiennej (figura 23B); wstępne dane sugerują, że korzystna może być silna żywica kationowymienna. Jednakże, po chromatografii kationowymiennej okazało się, że produkt ob został stracony. Wskazuje to na obecność proteazy w próbce.
Jednąze strategii w celu przezwyciężenia tego problemu jest wytworzenie fuzji ob ze znacznikiem His do ekspresji w drożdżach (figura 22). Dalsze badanie wykazało, że OB bez znacznika His, wiąże się ściśle z kolumną chelatująca Ni. Oczyszczanie OB przez chelatacjęNi, a następnie filtrację żelową, dało produkt o czystość wystarczającej do badania spektrometrią masową. Badanie spektrometrią masową potwierdziło, że ciężar cząsteczkowy ekspresj onowanego białka jest identyczny z oczekiwanym, co silnie potwierdza pomyślaną ekspresję OB w Pichia.
Jednakże, protokół oczyszczania przez chelatację Ni/-filtrację żelową, nie daje białka o wystarczającej czystości. Oprócz tego obecne są substancje drobnocząsteczkowe. Nie wydaje się aby aktywność proteolityczna eluowała z objętością próżną kolumny chelatującej Ni. Nawiązując, zaplanowano trzyetapowy proces oczyszczania: chelatacja Ni, wymiana jonowa (usuwająca zanieczyszczenia drobnocząsteczkowe) i filtracja żelowa. Poziom ekspresji określony na podstawie barwienia błękitem Coomassie żeli SDS-PAGE osiągał około 10 mg/1 gdy drożdże były hodowane w butelkach wytrząsanych. Poziomy te zwiększą się, jak się oczekuje, w naczyniach fermentacyjnych, i proces zapoczątkowania fermentacji mającej na celu uzyskanie znacznych ilości białka jest już prawie zakończony. Odnośnie ludzich konstruktorów OB, transformowane klony drożdży zawierające znaczną liczbę kopii genu OB zostały zidentyfikowane i jak się oczekuje będą one ekspresjonować białko OB. Gdy zostaną uzyskane przeciwciała przeciwko OB, zostaną one zastosowane w celu potwierdzenia identyczności wydzielanego białka 16 kDa.
Przykład 7: silna ekspresja peptydu fuzyjnego OB w bakteriach
Wytwarzanie roztworów do zamrażania:
Do każdej z dwóch porcji po 4 ml sterylizowanej pożywki M9ZB bez źródła węgla dodano 40 μΐ roztworu dekstrozy (0,4 g/ml, sterylizowany przez filtrowanie), 10 μΐ roztworu ampicyliny (200 mg/ml) i 5 μΐ roztworu chloramfenikolu (34 mg/ml, w etanolu). Do ich inokulacji zastosowano pojedyncze kolonie E. Coli z klonowanymi, mysim i luidzkim DNA dla OBI w wektorze pET-14b Novagen. Probówki inkubowano przez noc w 37°C. 0,5 ml całonocnej hodowli zastosowano do inokulacji 50 ml pożywki M9ZB z dekstrozą ampicyliną i chloramfenikolem. Inkubowano je w 30°C mierząc okresowo absorbancję przy długości fali 600 nm (A600). Przy Α^ο rzędu 1-1,2, zmieszano 125 μΐ porcję hodowli z 25 μΐ 60% gliceryny, w 2 ml probówce eppendorf, szybko zanurzono w ciekłym azocie i przechowywano w - 80°C.
Hodowla komórek:
ml pożywki M9ZB z 0,5 ml 40% dekstrozy, 125 μΐ roztworu ampicyliny i 50 μΐ roztworu chloramfenikolu, inokulowano 1 ml zamrożonego roztworu i inkubowano w 30°C. Przy A600 rzędu 1-1,2, zastosowano 10 ml tego roztworu do inokulacji każdej z czterech 2-litrowych butelek z 500 ml pożywki M9ZB z dekstrozą ampicyliną i chloramfenikolem. Inkubowano je w 30°C do A6oo równej 1-1,2 kiedy to indukowano bakterie IPTG w stężeniu końcowym równym 0,5 M. Hodowle inkubowano przez noc. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 obr./minutę przez 20 minut. Układ ekspresyjny pozwolił uzyskać rekombinowany polipeptyd OB jako znaczny odsetek białka całkowitego:; rzędu gramów na litr hodowli E. coli.
Liza komórek i zawieszanie ciałek wtrętowych:
Pastę komórkową zawieszano w minimalnej objętości 20 mM HE-PES, pH7,2,10% gliceryny, 0,1 M KC1,5 mM MgCl2,1 % aprotyniny, 1 mM PMSF, 5 pg/ml leupeptyny i 50 pg/ml DNAazy I. Zawiesinę zamrażano i rozmrażano trzykrotnie stosując ciekły azot i ciepłą wodę. Rozerwane komórki odwirowano przy 18000 obr./min., przez 30 minut i zawieszono w 20 mM HEPES, pH 7,5,
183 352
0,1 Μ NaCl. Zawisinę sonikowano i dodano Triton X100 w stężeniu końcowym 2%. Odwirowano przy 18000 obr./min., przez 15 minut. Po dwóch dodatkowych takich cyklach, dodano jeszcze trzy cykle bez Triton'u X100. Na koniec, osad zawieszono przez sonikację w 6 M GdHCl (chlorowodorek guanidyny), 20 mM HEPES, pH 7,5 po czym odwirowano. Do dalszego oczyszczania stosowano nadsącz.
Białko OB oczyszczano w stanie niepofałdowanym przez chromatografię powinowactwa z unieruchomionym metalem (IMAĆ). Roztwór wprowadzono do 40 cm kolumny Pharmacia Fast Flow Sepharose. Naładowanej 5 objętościami kolumny 50 mM NiSO4 i zrównoważonej 6 M GdHCl, 20 mM HEPES, pH 7.5. Kolumnę przepłukano 6 M GdHCl, 30 mM imidazolem, 20 mM HEPES, pH 7,5. Na koniec, białko eluowano tym samym buforem zawierającym 0,2 M imidazol. Niepofałdowane białko 6 M GdNCl przechowywano w 4°C po dodaniu octanu sodu (NaAc) do 10 mM i pH ustalonego na 4,5 przez dodanie kwasu octowego.
Ponowne fałdowanie i oczyszczanie białka:
M roztwór GdHCl zawierający 100 mg białka traktowano 67 μΐ 1 M ditiotreitolu (DTT) i rozcieńczano do około 67 ml 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4,5. Pozostawiano z mieszaniem w temperaturze pokojowej przez około godziny. Następnie rozcieńczano do 41 w 20% glicerynie, 2,5 mM CaCl2, 20 mM Tris, pH 8,4 mieszając. Po odpowiednim wymieszaniu, roztwór pozostawiano w temperaturze pokojowej przez około 8 godzin bez dalszego mieszania. Następnie dodawano 2000 jednostek oczyszczonej trombiny bydlęcej (thrombostat, produkt Parke-Davis) i roztwór pozostawiano z delikatnym mieszaniem. Po 2,5 godziny dodawano ponownie 2000jednostek trombiny i kontynuowano odcinanie znacznika histydynowego przez dalsze 3 godziny. Cięcie trombiną zatrzymywano przez dodanie PMSF w stężeniu końcowym 0,1 mM. Roztwór filtrowano i przechowywano w 4°C.
Cięte białko dalej oczyszczano na tej samej kolumnie IMAĆ co opisana wyżej, równoważnej 1 M KC1,20% gliceryna, 20 mM HEPES, pH 8,4. Po wprowadzeniu roztworu białka, płukano ją tym samym buforem i eluowano cięte białko 1 M KC1, 20% gliceryną, 40 mM imidazolem, 20 mM HEPES, pH 8,4. Nie cięte białko eluowało z 0,2 M imidazolem.
Oczyszczone cięte białko zatężano, traktowano 50-100 mM EDTA, 10 mM żelazicyjankiem potasu (w celu dokończenia utleniania) i filtrowano na żelu superdex w kolumnie 75 16/60. Uzysk, przy zastosowaniu tej procedury wynosił 50% peptydu wyjściowego.
Po oczyszczeniu, ekspresjonowane białko było charakteryzowane kilkoma sposobami. Charakteryzacja fizyczna obejmowała badanie dynamicznego rozpraszania światła, w celu określenia homogenności struktury i określenia poprawności fałdowania. Dane z rozpraszania światła wskazują, że ludzki polipeptyd OB jest ekspresjonowany głównie albo wyłącznie jako monomer, podczas gdy mysi polipeptyd OB występuje w postaci dimeru jak i monomeru.
Badania z reagentem Ellmana i analiza spektrometrią masową potwierdziła, że reszty cysternowe tworzą mostek dwusiarczkowy w białku. Tą utlenioną postać polipeptydu podawano myszom, jak to opisano niżej i wykazanojego aktywność biologiczną. W celu określenia przybliżonej geometrii strukturalnej białka zastosowano badanie dichroizmu kołowego. Widma CD w buforze fizjologicznym (pH około 8, siła jonowa niemal fizjologiczna) wskazują, że ludzki polipeptyd OB niemal 60% struktury posiada w postaci helis ai 40% w postaci struktury losowej spirali. Mysi polipeptyd OB obejmuje 50% struktury w postaci helis a i 50% losowej spirali, w oparciu o badanie CD. W celu identyfikacji fragmentów polipeptydu OB dostępnych proteolizie zastosowano spektrometrię masową wykonaną po ograniczonej proteolizie (Cohen i in., 1995, wyżej). Analiza ta wykazała obecność struktury giętkiej pętli w pozycji aminokwasowej od 54 do 60 (jak to zaznaczono na figurze 4). Jest prawdopodobne, że giętka pętla łączy dwie domeny o określonej strukturze drugorzędowej, np. helisy cc
Co ważne, jak wykazano w poniższych przykładach, aktywność biologiczna oczyszczonego białka badana była przez podawanie białka zarówno szczupłym jak i otyłym gryzoniom przez pompę osmotyczną (np. Pompa osmotyczna ALZET, Alza Coiporation, Pało Alto, CA), albo w co
183 352 dziennej dawce pojedynczej i.p. przez okres co najmniej dwóch tygodni i obserwowano wpływ na zachowania żywieniowe i ciężar ciała.
Przykład 8: wpływ polipetydu OB (leptyny) na zmniejszenie ciężaru
Produkt genowy mysiego locus OB odgrywa istotną rolę w regulowaniu ciężaru ciała. Niniejszy przykład pozwolił ustalić, że białko OB krąży w osoczu myszy, szczura i człowieka. Postać krążąca u wszystkich trzech gatunków ma w badaniu SDS-PAGE identyczny ciężar cząsteczkowy z wywnioskowaną sekwencją polipeptydową bez sekwencji sygnałowej, co świadczy, że in vivo białko nie ulega obróbce po odcięciu peptydu sygnałowego. Białko OB było nieobecne w osoczu myszy C57BL/6J ob/ob i obecne w dziesięciokrotnie wyższym stężeniu w osoczu myszy db/db i dwudziestokrotnie wyższym w osoczu szczurów fa/fa, w porównaniu z kontrolą. Wskazuje to, że otyłe mutanty zwierzęce są oporne na wpływ OB. W grupie sześciu ludzkich szczupłych osobników występowała siedmiokrotna różnica poziomu białka OB w osoczu. Codzienne wstrzyknięcia rekombinowanego mysiego białka OB dramatycznie zmniejszały ciężar ciała myszy ob/ob, miały znaczący wpływ na ciężar ciała myszy typu dzikiego ale nie wywierały wpływu na myszy db/db. Dane te wskazują na to, że produkt genowy locus OB wywiera działanie endokrynne na regulacje ciężaru ciała.
Materiały i metody
Króliki immunizowano rekombinowanym białkiem w adiuwancie Freunda (HRP, Inc.). Oczyszczone immunologicznie przeciwciała przeciwko mysiemu OB wytworzono przez przepuszczenie surowicy odpornościowej przez kolumnę z sepharozy 4B sprzęgniętej z białkiem rekombinowanym jak to opisano (Harlow i in., Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Immunoprecypitację mysiego osocza przeprowadzono w następujący sposób: 0,5 ml osocza myszy, szczura albo człowieka, zawierającej około 2,5 mM EDTA sklarowano niekoniugowanąsepharozą4B w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z wytrząsaniem. Sepharozę usunięto przez odwirowanie i dodano 50 ml 50% sepharozy ze sprzęgniętym przeciwciałem oczyszczonym przez powinowactwo, w ilości 1 mg/ml sepharozy. Dodano 0,5 ml buforu 2xRIPA, co dało końcowe stężenia 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,100 mM NaCl, 1% NP-40,0,1% SDS, 0,5% dezoksycholan sodu i 0,025% azydek sodu. Reakcję przeprowadzono w 4°C przez noc z ciągłym wytrząsaniem. Sepharozę sprzęgniętąz przeciwciałem przemywano 8-krotnie stosując bufor RIPA, trzykrotnie w PBS i rozdzielono na 15% SDS-PAGE. Białka przeniesiono na nitrocelulozę i wykonano badanie metodą western biot z użyciem oczyszczonego immunologicznie biotynowego przeciwciała przeciwko białku rekombinowanemu. jako wtórne przeciwciało zastosowano koniugat streptawidyna-HRP, zaś do wykrywania zastosowano ECL.
W celu określenia ilościowego OB w surowicy mysiej, do 100 λ osocza C57BL/6J ob/ob dodawano wzrastające ilości fałdowanego rekombinowanego mysiego białka OB (0,01,0,1,0,5, 2,0, 15,0 ng) i inkubowano w 4°C przez 3 godziny z przeciwciałem sprzęgniętym z sepharozą-białkiem A. Po intensywnym płukaniu buforem A (bufor 10 mM fosforan sodu, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% TritonX-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) próbki zawieszano w buforze do próbek, rozdzielano na 15% SDS-PAGE i przenoszono na membranę nitrocelulozową. Wykonano badanie metodą western biot stosując oczyszczone immunologicznie biotynowane przeciwciało przeciwko końcowi aminowemu jako przeciwciało pierwotne i streptawidynę-HRP jako przeciwciało wtórne, i wykrywano wiązanie przez ECL. Przez homogenizację tkanki tłuszczowej w buforze NDS (10 mM Tris, pH 7,5,10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0,15 M spermina, 0,5 mM spermidyna, 14 mM β-merkaptoetanol, 0,5 M EGTA, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40) i homogenizację w urządzeniu polytron i w moździerzu, wytwarzano ekstrakty cytoplazmatyczne, po czym usuwano jądra przez odwirowanie przy 700 g.
Immunoprecypitację wykonywano jak to opisano wyżej, z takim wyjątkiem, że stosowano przeciwciała przeciwko ludzkiemu OB. Do testu ELISA, 100 ml roztworu oczyszczonego immunologicznie przeciwciała przeciwko ludzkiemu OB w stężeniu 1 mg/ml rozpuszczono w PBS buforowanym boranem i nałożono na płytki do mikromiareczkowania (Cominig nr kat. 2595) w 4°C przez noc. Płytki płukano 4-krotnie roztworem soli buforowanym boranem, zawierającym
183 352
0,05% Tween 20 po czym usuwano nadmiar płynu. Płytki blokowano przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy użyciu 240 μΐ/studzienkę roztworu soli buforowanego boranem zawierającego 0,3% żelatynę, po czym płukano i suszono. W pojedynczych studzienkach inkubowano przez noc w 4°C znane ilości fałdowanego ludzkiego białka OB, albo próbki surowicy w objętości 100 ml. Po płukaniu płytki inkubowano ze 100 ml biotynowanego oczyszczonego immunologicznie przeciwciała przeciw-ludzkiego (0,1 mg/ml w roztworze żelatyny buforowanym boranem) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, do płytek dodawano peroksydazę chrzanową (HRP)-streptawidynę (0,1 mg/ml w buforze boranowym, 0,3% żelatynie). Roztwór substratu HRP (ABTS, 0,3 mg/ml i H202,0,01 % kwas cytrynowy) zastosowano do wykrywania i mierzono OD przy długości fali 414 nm w celu mierzenia wiązania przeciwciała.
Sekwencje kodujące mysiego i ludzkiego genu OB amplifikowano przez PCR z plazmidu zawierającego sekwencje cDNA OB, i klonowano do plazmidu pPIC.9 (Invitrogen).
Ludzki starter 5'miał sekwencję:
5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG3' (Identyfikator Sekw. Nr 34), zaś starter 3' miał sekwencję: 5'GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC3' (Identyfikator Sekw. Nr 35). Mysi starter 5'miał sekwencję: 5OTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG3' (Identyfikator Sekw. Nr 36), zaś starter 3'miał sekwencję: 5'GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC3'(Identyfikator Sekw. Nr 37). Starter 5'mysi i ludzki zawierał miejsce Xhol na końcu 5'i sekwencje kodujące co najmniej ostatnie 4 aminokwasy sekwencji sygnałowej czynnika o, obecnej w wektorze pPIC.9. Wektor ten kierował wydzielaniem produktów genów ekspresjonowanych heterologicznie, z komórek do pożywki hodowlanej. Starter 5'zawierał również pierwsze 19 nukleotydów otwartej ramki odczytu genu OB po miejscu odcinania sekwencji sygnałowej, przed alaniną w pozycji aminokwasowej 21. Starter 3' zawierał miejsce EcoRI na swym końcu 5', z których bezpośrednio następowała sekwencja komplementarna do domniemanego kodonu stop OB. Zastosowano następujące warunki PCR: denaturacja przez 1 minutę w 94°C, przyłączanie przez minutę w 55°C i wydłużanie przez 2,5 minuty w 72°C. W celu ograniczenia liczby mutacji wywołanych przez PCR, zastosowano małą liczbę cykli PCR (15) i bezbłędną polimerazę Pfu (Stratagene). Produkty PCR trawiono Xhol i EcoRI i klonowano do podobnie trawionego wektora pPIC.9. Wszystkie konstrukty sekwencjonowano w celu upewnienia się o braku mutacji wywołanych PCR. Klony transformowano do Pichiapastoris (His-) metodą sferoplastu i selekcjonowano na pożywce bez histydyny. Około 200 mysich i ludzkich klonów przesiewano pod kątem dużej liczby kopii w teście hybrydyzacji kolonii. Klony o dużej liczbie kopii badano następnie pod kątem ekspresji OB, początkowo przez barwienie Coomassie, wykazujące obecność nowego białka 16 kDa obecnego w pożywce transformowanych drożdży. Potwierdzono przy użyciu przeciwciała wywołanego przeciwko białku OB ekspresjonowanemu w bakteriach, że prążek 16 kDa jest białkiem OB. Rekombinowane białko oczyszczano dwuetapową metodą oczyszczania opisaną niżej. Spektrometrię masową i traktowanie bromkiem cyjanogenu wykonano jak to opisano w Beavis i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6873-6877 (1990).
Całą sekwencję kodującą mysiego i luidzkiego genu OB, w kierunku końca C od sekwencji sygnałowej, wklonowano do wektora ekspresyjnego pET 15b (Novagen) i ekspresjonowano wE. coli [BL21 (DE3)plYsS] stosując układ polimerazy RNA T7 (Studieri in.,Meth. Enzymol., 185:80-89 (1990)). Komórki namnożono w 30°C do absorbancji równej 0,7 przy długości fali 595 nm, i indukowane 0,5 M IPTG przez noc zebrano przez odwirowanie z małą prędkością. Przez trzy cykle zamrażania i odmrażania wykonano lizę po czym wykonano trawienie DNA stosując DNAzę I. Ekstrakcję błon wykonano przez sonikację i solubilizację w detergencie, po czym osad ciałek wtrętowych rozpuszczono 6 M chlorowodorkiem guanidyny, 20 mM HEPES, pH 8,4. Rekombinowane białka OB oczyszczano w warunkach denaturujących przez IMAĆ stosując kolumnę powinowactwa jonów Ni i płukanie zwiększającymi się stężeniami imidazolu.
183 352
Oczyszczone, denaturowane białko OB przechowywano w 6 M chlorowodorku guanidyny, 10 mM octanie sodu (NaAc, pH 5, i redukowano 1 mM DTT w temperaturze pokojowej przez godzinę. Denaturację wykonano przez rozcieńczenie zredukowanego białka w 20% glicerynie, 5 mM CaCl2,5 mMNaAc, pH 5, przez mieszanie i inkubację w temperaturze pokojowej przez 8-12 godzin. Po denaturacji pH ustalono na 8,4 przez dodanie Tris do 10 mM, po czym usunięto znacznik heksa-histydynowy przez trawienie trombiną. Przecięte, renaturowane białko oczyszczono ponownie przez IMAĆ w celu oddzielenia produktu od trombiny i nieprzeciętego białka fuzyjnego. Przecięte, renaturowane białko eluowało z kolumny powinowactwa jonu Ni przy stężeniu 40 mM imidazolu, podczas gdy trombiną nie była zatrzymana, a białko nie przecięte eluowało przy 0,2 mM imidazolu. Produkt zatężano, traktowano 100 mM EDTA ii 10 mM żelazicyjankiem potasu i dalej oczyszczano przez filtrację żelową na kolumnie Pharmacia superdex 75 16/60.
Przeprowadzono test Ellmana, tak jak to opisano (Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)). Odczynnik Ellmana wytworzono przez rozpuszczenie 39,6 mg kwasu 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowego) (DTNB) w 10 ml 0,05 M fosforanu, pH 8. Krzywą kalibracyjną wykonano w zakresie stężeń od 10 do 120 mM wolnego sulfhydrylu (stosując 1 mM roztwór wyjściowy zredukowanego DTT) przy 412 nm. Każdy test był wykonywany z użyciem 0,02 ml odczynnika Ellmana w objętości końcowej 0,5 ml. Zmierzony współczynnik ekstynkcji wynosił 12974 M^cm’1 dla wolnych grup sulfhydrylowych (współczynnik korelacji 0,99987) co stanowi 5% uprzednio opisanej wartości 13600 Mlcm''. 50 ml czystego, filtrowanego na żelu białka w stężeniu 2 mg/ml, odpowiadające prawdopodobnie stężeniu wolnego sulfhydrylu 24 mM w stężeniu końcowym, poddano testowi Ellmana. Powstały roztwór dawał A412 równą około 0,02, sugerując że dwie reszty cysternowe w białku są w stanie utlenionym tworząc cystynę albo, że wolne grupy sulfhydrylowe sącałkowcie ukryte w niedostępnym rdzeniu pofałdowanego białka. Identyczne wyniki otrzymano przez przeprowadzenie tego samego testu na białku niepofałdowanym w obecności 6 M chlorowodorku guanidyny.
Myszy trzymano osobno w warunkach wolnych od patogenów i zaadaptowano do diety zawierającej 35% (wag./wag.) laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9% (wag./wag.) mieszanki budyniu z tapioki (General Foods) i 59,1% wody, o zawartości energii równej 1,30 kcal/g. Karmę sterylizowano przez autoklawowanie i pakowano do 60 mm szalek plastikowych, zamkniętych od góry 100 mm szalkami Petriego. Tapioka zapewniała pożywieniu mazistą konsystencję, uniemożliwiając zwierzętom rozsypywanie pożywienia po klatce. 100 mm pokrywki zatrzymywały niewielką ilość pożywienia rozsypanego przez zwierzęta. Świeżą szalkę umieszczano w klatce codziennie rano zaś szalkę z poprzedniego dnia zabierano i ważono. Różnica w ciężarze zapewniała pomiar dziennej konsumpcji pożywienia. Wpływ rekombinowanego białka na przyjmowanie pożywienia i ciężar ciała mierzono na trzech szczepach myszy: C57B1/6J ob/ob, C57B1/Ks db/db i CBA/J +/+, zakupionych w Jackson Laboratory. Trzydzieści myszy z każdego szczepu podzielono na grupy po 10. Jedna grupa z każdego szczepu otrzymywała codzienne iniekcje dootrzewnowe (i.p.) pofałdowanego bakteryjnego białka ob w dawce 5 mg/kg/dzień w 300 μΐ PBS. Druga grupa otrzymywała wstrzyknięcia i. p. tej samej objętości PBS. Ta grupa otrzymywała wstrzyknięcia dializatu PBS rekombinowanego białka. PBS oczyszczano z endotoksyny stosując kolumnę Acticlean ΕΤΟΧ. Trzecia grupa nie otrzymywała żadnych iniekcji. Przyjmowanie pożywienia rejestrowano codziennie jak również regularnie mierzono ciężar ciała w ciągu 3,5 tygodnia badania. W doświadczeniu żywienia parami, przyjmowanie pożywienia przez osobną grupę myszy ob było dobrane na podstawie dziennego spożycia przez myszy ob otrzymujące białko.
Wyniki
Białko OB krąży w osoczu myszy, szczurów i ludzi.
Rekombinowane mysie i ludzkie białko OB wytworzone przy użyciu bakteryjnego wektora ekspresyjnego pET15b (Novagen) i klonowane w Pichiapastoris, drożdżowym układzie ekspresyjnym wydzielającym rekombinowane białka do pożywki. Białko ob ekspresjonowane w drożdżach obejmowało 146 aminokwasów końca karboksylowego w stosunku do sekwencji sygnałowej. Króliki immunizowano białkiem bakteryjnym (HRP, Inc.). Przeciwciała oczyszcza
183 352 no immunologicznie (Research Genetics) i stosowano do immunoprecypitacji i badań western biot białka z osocza i tkanki tłuszczowej.
Białko OB z osocza mysiego migrowało w SDS-PAGE z ciężarem cząsteczkowym 16 kDa. Ruchliwość elektroforetyczna jest identyczna z rekombinowanym białkiem OB wydzielonym przez drożdże po usunięciu sekwencji sygnałowej (figura 24A). Białko nie było wykrywane w osoczu myszy C57B1/6J ob/ob, posiadających mutację nonsensownąw kodonie 105. Żadna z kilku różnych surowic odpornościowych nie wykrywała okrojonego polipeptydu o 105 resztach, przewidywanych przez sekwencję cDNA.
Obserwowano dziesięciokrotnie podwyższony poziom krążącego białka u myszy db/db, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (figura 24A). Immunoprecypitacja osocza szczurów typu dzikiego i fa/fa wykazała 20-krotnie zwiększenie poziomu białka OB u szczurów zmutowanych w porównaniu z typem dzikim (figura 24B). Mutacja db powodowała otyły fenotyp identyczny z obserwowanym u myszy ob (Bahary i in., 1990, wyżej). Szczury fatty są otyłe w wyniku mutacji recesywnej w genie homologicznym z db (Truett i in., 1991, wyżej) w celu ilościowego zbadania poziomu OB w mysim osoczu, do surowicy dodawano rosnące stężenia rekombinowanego białka i immunoprecypitowano (figura 24C). Obserwowano liniowy wzrost intensywności sygnału w badaniu western biot wraz ze zwiększeniem ilości rekombinowanego białka. Porównanie intensywności sygnału białka natywnego w mysim osoczu ze standardem wkazywała, że poziom krążącego białka OB u myszy typu dzikiego wynosi około 20 ng/mL Te dane wskazują, że immunoprecypitacje i badanie western biot wykonywane były w warunkach nadmiaru przeciwciał. Podwyższony poziom białka OB obserwowano również w ekstraktach białkowych z tkanki tłuszczowej od myszy db/db w porównaniu z kontrolą (figura 24D). Jak oczekiwano po białku wydzielniczym, białko z tkanki tłuszczowej frakcjonowało z fiakcjąbłon (dane nie pokazane).
Osocze od sześciu szczupłych osób, o wskaźniku ciężaru ciała (BMI) poniżej 25 (BMI=ciężar/wzrost2) immunoprecypitowano stosując przeciwciało, oczyszczone immunologicznie, przeciwko ludzkiemu białku. Materiał immunoprecypitowany migrował z ruchliwościąelektroforetyczną identyczną co obserwowana dla białka ludzkiego o 146 aminokwasach, ekspresjonowanego przez drożdże. Intensywność sygnału różniła się znacznie wśród sześciu próbek (figura 25 A). Densytometria autoradiogramów wykazała przynajmniej 5-krotną różnicę pomiędzy osobnikami HP1 i HP6, z pośrednimi różnicami u innych osobników. Przy użyciu przeciwciała oczyszczonego immunologicznie i fałdowanego białka bakteryjnego jako standard, opracowano immunosorpcyjny test enzymatyczny (ELISA) (patrz niżej). Powstałą krzywą standardową pokazano na figurze 25B. Stosując ten test stwierdzono, że poziom białka OB w sześciu ludzkich próbkach osocza waha się od 2 do 15 ng/ml (figura 25C). Poziom białka OB w osoczu HP6 był poza zakresem liniowym testu immunologicznego i wynosił >15 ng/ml. Te różnice ilościowe korelowały z obserwowanymi w badaniu western biot.
Wstępne dane sugerują że leptyna może krążyć, przynajmniej częściowo, w kompleksie z innym białkiem albo białkami. Konkluzja ta oparta jest na heterogennosci krzywej miareczkowania surowic w porównaniu z rekombinowanym standardem. Analiza dużych ilości leptyny oczyszczonej immunologicznie na kolumnie z króliczymi przeciwciałami przeciwko OB przez filtrację żelową HPLC, w warunkach denaturujących i nie denaturujących, ze śledzeniem ELISA i SDS-PAGE sugeruje, że polipeptyd OB zachowuje się jak kompleks o dużym ciężarze cząsteczkowym. Jednakże, te dane pozostają danymi wstępnymi: jak do tej pory nie scharakteryzowano ewentualnego białka wiążacego OB.
Cechy strukturalne białka OB
Ponieważ białko OB posiada reszty cystynowe, może tworzyć śród- albo międzycząsteczkowe mostki dwusiarczkowe w utleniających warunkach in vivo. Powtórzono badanie metodą western biot, z dodatkiem lub bez czynnika redukującego w buforze próbki. W obu warunkach białko OB surowicy ludzkiej migrowało jako monomer (dane nie pokazane). W warunkach nie redukujących, białko immunoprecypitowane z surowicy myszy db wykrywano w położeniu zgodnym z monomerem o ciężarze 16 kDa, jak i dimerem o ciężarze 32 kDa (figura 26A). Cząsteczka o wyższym ciężarze cząsteczkowym znikła w warunkach redukujących, wskazując, że frak
183 352 cja mysiego OB krąży jako gatunek o wyższym ciężarze cząsteczkowym na skutek tworzenia międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych. Około 80% mysiego OB krąży jako białko 16 kDa i 20% jako postać 32 kDa.
Te same postacie cząsteczkowe gdy białka mysie i luidzkie ekspresjonowane w Pichiapastoris (Abrams i in., Immunol. Rev., 15-24 (1992)). W tych badaniach, sekwencję DNA odpowiadaj ąca dojrzałemu białku OB o 146 aminokwasach klonowano poniżej sekwencj i sygnałowej drożdżowego czynnika a w wektorze pPIC. 9 (Invitrogen). Białko OB oczyszczano z pożywki drożdży szczepów ekspresjonujących białka mysie i ludzkie, i poddawano elektroforezie w warunkach redukujących i nie redukujących (figura 26A). Białko mysie ekspresjonowane było w drożdżach głównie jako dimer w warunkach nie redukujących, a wyłącznie jako monomer w obecności czynnika redukującego. Rekombinowane białko ludzkie migrowało w pozycji monomeru w obu warunkach (dane nie pokazane).
Oczyszczone ludzkie białko ekspresjonowane przez Pichiapastoris miało ciężar cząsteczkowy 16024±3 Da jak określono spektrometrią masową 1990 (Beavis, 1990, wyżej). Wartość ta jest zgodna z obliczoną na podstawie sekwencji aminokwasowej białka zawierającego pojedynczy wewnątrzcząsteczkowy mostek dwusiarczkowy (16024 da). Analizą desporpcyjną spektrometrią masową wspomaganą laserem (MALDI-MS) produktu ciętego bromkiem cyjanogenu białka, wskazuje, że cysteiny 117 i 167 są połączone przez wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe (figura 26B). Bromek cyjanogenu tnie w kierunku karboksylowym od reszt metioninowych.
Wytwarzanie i charakteryzacja biologiczna czynnego białka rekombinowanego
Mysie białko OB ekspresjonowano w E. Coli z plazmidu pET15b jako nierozpuszczalne białko z 20-aminokwasowym N-końcowym znacznikiem heksa-histydynowym zawierającym miejsce cięcia trombiny. Bakteryjne ciałka wtrętowe solubilizowano chlorowodorkiem guanidyny i oczyszczano w warunkach denaturujących stosując chromatografię powinowactwa do unieruchomionego jonu metalu (IMAĆ) (figura 27). Oczyszczone, denaturowane białko fuzyjne redukowano, rozcieńczano i umożliwiano fałdowanie w roztworze wodnym w temperaturze pokojowej. Po cięciu trombiną renaturowane mysie białko OB zawierające cztery dodatkowe reszty na końcu N (Gly-Ser-His-Met, Identyfikator Sekw. Nr 38) ponownie oczyszczano przez IMAĆ do homogenności> 98%, co oceniono SDS-PAGE i spektrometrią masową. Desorpcyjna spektrometria masowa wspomagana laserem pozwoliła obliczyć ciężar na 16414±3 Da (ciężar przewidziany = 16415 Da). Zarówno denaturującejak i nie denaturujące żele SDS-PAGE wykazywały pojedynczy gatunek cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym rzędu 16 kDa (dane nie pokazane).
Badanie dynamiczne rozpraszania światła, z użyciem urządzenia DP801 Molecular Size Detector (Protein Solutions, Inc.), wykazało, że renaturowane mysie białko OB było w większości monomeryczne z pewną ilością agregatów wyższego rzędu. Białko traktowano EDTA i utleniano chemicznie. Gatunki o wyższym ciężarze cząsteczkowym usunięto przez filtrację żelową. Dalsze badanie tą samą metodą wykazało, że oczyszczone, renaturowane rekombinowane mysie białko OB było jednocząsteczkowe. Po dializie wobec roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) endotoksynę usunięto stosując kolumnę Acticlean ΕΤΟΧ (Sterogene Bioseparations, Inc.). Końcowy uzysk białka wyniósł 45 mg/1.
Badanie Ellmana wykonano na oczyszczonym, renaturowanym rekombinowanym mysim białku OB w celu określenia jego stanu utlenienia (Ellman, 1959, wyżej). Zarówno renaturowane białko jak i białko rozfałdowane przez 6 M chlorowodorek Guanidyny wykazywało <0,5% zawartość wolnych grup sulfhydrylowych, dowodząc, że monomeryczny produkt zawiera wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe. Potwierdzono to spektrometrią masową produktu ciętego bromkiem cyjanogenu fałdowanego białka bakteryjnego (dane nie pokazane).
183 352
Aktywność biologiczna białka OB
Oczyszczone, renaturowane rekombinowane mysie białko OB podawano w codziennych wstrzyknięciach dootrzewnowych w dawce 5 mg/kg/dzień grupom po 10 myszy C57B1/6J ob/ob (w wieku 16 tygodni), C57B1. Ks db/db (w wieku 12 tygodni) i CB A/J +/+ (w wieku 8 tygodni). Równa liczba zwierząt otrzymywała PBS jako codzienne zastrzyki. PBS zastosowany do kontroli pochodził z dializatu po równoważeniu białka. Dziesięć dodatkowych zwierząt z trzech szczepów myszy nie otrzymywało wstrzyknięć. Przyjmowanie pożywienia przez pojedyncze zwierzęta śledzono codziennie zaś ciężar zwierząt rejestrowano co trzy-cztery dni. Skumulowane dane przyjmowania pożywienia i ciężaru ciała z każdej z 9 grup myszy pokazano na figurach od 28A do F, zaś istności statystyczne danych pokazano na tabeli 1. Przyjmowanie pożywienia przez myszy C57B1/6J ob/ob, którym podawano białko było znacznie zmniejszone po pierwszych wstrzyknięciach i zmniejszało się ciągle do piątego dnia, kiedy to stabilizowało się na poziomie równym około 40% ilości przyjmowanej przez zwierzęta otrzymujące PBS (p <0,001). Pozornie nastrzykiwane zwierzęta nie traciły ciężaru w ciągu trzeh tygodni badania. Myszy C57Bl/sJ ob/ob otrzymujące białko traciły około 10% ciężaru ciała po 5 dniach (p<0,001). Zwierzęta te traciły na wadze w ciągu trzech tygodni leczenia, kiedy to ciężar zwierząt ob otrzymujących białko zmniejszał się do około 60% ich początkowego ciężaru ciała (p<0,0001). Osobne grupy myszy ob były karmione w parach z myszami ob otrzymującymi białko. Dane na figurze 29B pokazują że żywione parami zwierzęta traciły na wadze znacznie mniej niz zwierzęta otrzymujące białko rekombinowane (p <0,02). Fotografia dwóch myszy, z których jedna otrzymywała zastrzyki z białka zaś drugaPBS, pokazuje dużą różnicę w wyglądzie wynikaj ącą z leczenia białkiem (figura 29B). W celu dalszej oceny wpływu białka, wykonano sekcję dwóch myszy z każdej z grup. Pobieżna ocena myszy ob otrzymującej białko wykazała dramatyczne zmniejszenia tkanki tłuszczowej jak również wielkości wątroby. Ciężar wątroby myszy db i typu dzikiego był niezmieniony po leczeniu. Wątroby myszy ob otrzymujących wstrzyknięcia PBS ważyły 5,04 i 5,02 grama, w stosunku do 2,23 i 2,03 grama u zwierząt otrzymujących białko rekombinowane. W przeciwieństwie do bladego i tłustego wyglądu wątroby myszy ob, wątroba myszy ob otrzymującej białko nabrała ciemnego koloru charakterystycznego dla wątroby normalnej (figura 29C). Badanie histologiczne wątroby wykazało, że zwirzęta nie leczone mają stłuszczałą wątrobę, co ulegało znacznej poprawie u zwierząt leczonych białkiem (dane nie pokazane).
W przeciwieństwie do myszy ob, nie było istotnych zmian w ciężarze ciała albo ilości przyjmowanego pożywienia u myszy C57B 1/Ks db/db otrzymujących białko, w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą nośnik (figura 28A do F, tabela 1). Wszystkie trzy grupy myszy db/db traciły od 2 do 5 gramów podczas okresu leczenia. Średni poziom glukozy myszy db był mierzony glukometrem i wynosił >500 mg/dl u wszystkich zwierząt wskazując, że zwierzęta te rozwinęły cukrzycę wtórną do otyłości. Wstrzyknięcia myszom db przerwano po dwóch tygodniach.
U myszy typu dzikiego występowało niewielkie choć znaczące zmniejszenie ciężaru ciała, po podaniu rekombinowanego białka ob (figura 28 A-F, tabela 1). Po pięciu dniach wstrzykiwania, leczone myszy traciły średnio 0,5 grama podczas gdy myszy kontrolne przybierały na wadze 0,4 grama (p <0,02). W dwóch kolejnych punktach czasowych zwierzęta otrzymujące białko ważyły znacząco mniej niż myszy otrzymujące PBS. Istotność zmiany ciężaru zmniejszała się później. Ilość przyjmowanego pożywienia u zwierząt otrzymujących białko nie różniła się w sposób istotny od zwierząt kontrolnych. Wstrzyknięcia PBS miały niewielki ale znaczący wpływ na ilość przyjmowanego pożywienia i ciężar ciała myszy ob, db i typu dzikiego w porównaniu z myszami nie otrzymującymi wstrzyknięć (p < 0,05).
183 352
Tabela 1
Grapa Grupa leczona Zmiany ęiężara
dni n średnia odchylenie standartowe P
ob/ob nośnik białkowy 1-5 10 9 -6.38000000 -0.14444444 0.47628190 0.24444444 <0.001
nośnik białkowy 1-12 10 9 -14.4500000 0.98888889 0.70793126 0.38058597 <0.001
nośnik białkowy 1-27 6 5 -24.28333333 4.30000000 0.69924563 0.79874902 <0.0001
db/db nośnik białkowy 1-5 10 10 -1.47000000 -2.00000000 0.36939891 0.23142073 0.240
nośnik białkowy 1-12 10 10 -3.75000000 -4.19000000 0.77348418 0.34655447 0.610
CBA/J nośnik białkowy 1-5 10 10 -0.48000000 0.38000000 0.17876117 0.2148901 5 0.006
nośnik białkowy 1-12 10 10 -0.12000000 1.20000000 0.45748103 0.18378732 0.015
nośnik białkowy 1-27 5 6 1.98000000 2.23333333 0.48723711 0.20763215 <0.0651
Dyskusja
Działanie endokrynne produktu białkowego locus OB po raz pierwszy zasugerował Coleman, który wykazał, że ciężar ciała myszy ob/ob zmniejszał się w układzie parabiotycznym z myszą normalną albo db (Coleman i in., 1987, wyżej). Wyniki przedstawione powyżej wspierają tą hipotezę przez wykazanie, że białko OB krąży w krwiobiegu oraz, że wstrzyknięcia rekombinowanego białka zmniejszają ciężar ciała. Ciężar cząsteczkowy produktu genowego, kodowanego przez gen OB wynosi około 16 kDa, co jest równe sekwencji 146 aminokwasów w kierunku końca karboksylowego od sekwencji syngałowej. Rekombinowane białko OB nie jest modyfikowane podczas ekspresji wPichiapastoris. Ekspresja genów ssaczych w Pichia zwykle powoduje powstanie prawidłowej struktury białka (Cregg i in., Bio/Technology 11:905-914 (1993)). Ten wynik sugeruje, że białko OB nie jest glikozylowane i nie jest obrabiane potranslacyjnie in vivo. Dane nie wykluczają możliwości, że sbiałko OB jest związane nie kowalencyjnie ze sobą albo z innymi białkami osocza albo tkanki tłuszczowej. Jakkolwiek nie można wykluczyć proteolitycznego cięcia białka, nie stwierdzono postaci o mniejszym ciężarze czsąteczkowym białka OB, żadną z surowic odpornościowych, w tym przeciwciał przeciwko czterem peptydom. Białko OB ma dwie reszty cysteinowe i krąży u ludzi jako monomer, zaś u myszy jako monomer i dimer. Wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe typowe dla białek wydzielniczych stwierdzono w ludzkim białku ekspresjonowanym przez Pichiapastoris, sugerując, że prawdopodobnie występuje również in vivo. Jest to potwierdzone aktywnościąbiologicznąrekombinowanego białka bateryjnego, które posiada wewnątrzcząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe. Mysie białko OB spotykane jest w osoczu jako monomer albo jako dimer. Monomer i dimer jest obserwowany gdy mysie białko OB ekspresjonowane jest w drożdżach, wskazując, że skłonność mysiego białka do tworzenia dimerów wynika ź różnic w sekwencji pierwszorzędowej w porównaniu z sekwencją ludzką. O ile wiadomo, że monomer jest biologicznie czynny, aktywność dimeru jest nieznana.
Wpływ białka OB na ilość przyjmowanego pożywienia i ciężar ciała myszy ob jest dramatyczny. Po trzech tygodniach leczenia, myszy ob otrzymujące codzienne zastrzyki białka ręko
183 352 mbinowanego tracą 40% swego ciężaru i spożywają 40% pożywienia zwierząt kontrolnych. Ponadto ciężar ciała leczonych myszy ob nie ustalił się do czasu przerwania doświadczenia. Wyniki doświadczenia karmienia parami wskazują że utrata ciężaru jest wynikiem wpływu na zarówno przyjmowanie pożywienia jak i na zużywanie energii. Tak więc, w osobnej grupie myszy ob, których podaż kalorii została ograniczona do ilości przyjmowanej przez myszy ob otrzymujące białko, tracą na wadze znacznie mniej niż zwierzęta otrzymujące białko. Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia u myszy ob/ob do poziomu niższego niż u myszy typu dzikiego, w ciągu dnia otrzymania białka OB, wskazuje, że sąone szczególnie wrażliwe na jego wpływ. W rzeczywistości, receptor OB może u tych zwierząt być regulowany dodatnio. Przyjmowanie pożywienia przez leczone myszy ob staje się względnie stałe po pięciu dniach leczenia. Jeżeli jest to wynikiem osiągnięcia przez białko stanu równowagi dynamicznej, oznacza to, że ma ono względnie długi okres półtrwania (The Pharmacological Basis of Therapeutics, str. 19-45, Goodman i Gilman, wyd., Pergamon Press, New York (1990)).
Wniosek ten jest zgodny z danymi uzyskanymi z doświadczeń parabiotycznych (Coleman i in., 1978, wyżej; Weigle, Int. J. Obesity 12:567-578 (1988)).
Wpływ białka rekombinowanego na ciężar ciała myszy typu dzikiego był niewielki ale istotny statystycznie podczas dwóch pierwszych tygodni badania. Podczas gdy różnica w ciężarze pomiędzy myszami typu dzikiego otrzymującymi białko, w stosunku do otrzymujących PBS, była utrzymywana przez czas dłuższy, istotność statystyczna danych znacznie się zmniej szala po trzech tygodniach. Wczesna utrata ciężaru nie może być przypisana różnicy w ilości przyjmowanego pożywienia. Prawdopodobnie, pomiar ilości przyjmowanego pożywienia nie był dość precyzyjny aby wykryć zmniejszenie powodujące jednogramową różnicę ciężaru podczas doświadczenia. Te obserwacje różnią się od wyników poprzednich doświadczeń, w których gryzonie typu dzikiego łączono parabiotycznie z myszami db, szczurami fa, szczurami z uszkodzeniami podwzgórza i szczurami, u których otyłość wywołano dietą wysokokaloryczną (Coleman i in., 1978, wyżej; Harris i in., 1987, wyżej; Harris i in., Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats”, w Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman wyd., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Harvey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)). W każdym wypadku, zwierzęta typu dzikiego stawały się anorektyczne i bardzo traciły na wadze. Ponieważ poziom białka OB j est podwyższony u myszy db i szczurów fa zaś poziom RNA OB jest podwyższony u myszy z uszkodzeniem podwzgórza, wydaje się, że myszy typu dzikiego mogą odpowiadać na OB gdy krąży ono w odpowiednio dużym stężeniu. Opisane tu wyniki są zgodne z możliwością że poziom podawanego białka był poniżej poziomu endogennego, prowadząc do ustaleniąsię równowagi ciężaru ciała na nieco niższym poziomie. Oznaczenie poziomu krążącego białka OB u myszy leczonych powinno rozwiązać ten problem. Podczas gdy test immunologiczny dla białka mysiego nie jest obecnie dostępny, immunoprecypitację świadczą że poziom krążącego białka OB nie był zbytnio podwyższony u myszy typu dzikiego otrzymujących białko.
Mniejszy wpływ białka na myszy typu dzikiego i brak odpowiedzi u myszy db nie wydaje się być spowodowane działaniem nieswoistym albo niepożądanym. Wszystkie myszy db straciły nieco na wadze podczas okresu leczenia, niezależnie od tego czy otrzymywały czy nie białko ob. Zwierzęta db były istotnie hiperglikemiczne i utrata ciężaru wydaje się być spowodowana cukrzycą a nie protokołem doświadczalnym. Myszy C57B 1/Ks db/db często rozwijają cukrzycę i zaczynają tracić na wadze gdy są w wieku zwierząt stosowanych w doświadczeniu (Coleman i in., 1978, wyżej). Myszy C57B1/6J ob/ob w podobnym wieku nie rozwijają znaczącej hiperglikemii. Te różnice fenotypowe są jak się uważa, wynikiem różnic genetycznych pomiędzy szczepami obarczonymi mutacjami (C57B1/6J i C57B1/Ks) (Coleman i in., 1978, wyżej).
Niemożność wykrycia okrojonego białka wielkości 105 aminokwasów, przewidzianego na podstawie sekwencji cDNA genu OB myszy C57B1/6J ob/ob sugeruje, że zmuntowane białko jest degradowane albo nie powstaje. Jednakże, nie można wykluczyć możliwości, że surowice odpornościowe zastosowane do wykrycia okrojonego białka nie wykrywają go. Obserwowany dziesięciokrotnie wyższy poziom białka ob u myszy db w porównaniu z myszami typu dzikiego
183 352 sugeruje, że białko ob ulega nadmiernemu wytwarzaniu gdy istnieje oporność na jego działanie. Dane te korelują z badaniami nad mRNA OB. Jak wspomniano, poprzednie doświadczenia wykazały, że mutacje genów db myszy i fa szczurów, które mapują się na homologiczne regiony chromosomalne, powodują nadmierne wytwarzanie czynnika osoczowego obniżającego ciężar ciała (Truett i in., 1991, wyżej; Coleman, 1978, wyżej; Harvey, 1959, wyżej). W obu przypadkach sugerowano, że zmutowane zwierzęta sąopome na działanie białka OB. Ta możliwość potwierdzona jest obserwacją że białko OB nie ma wpływu na ciężar ciała i ilość przyjmowanego pożywienia, gdy podawane jest myszom db.
Otyłość u ludzi może być związana z podwyższonym poziomem białka OB w osoczu osobników, którzy są względnie niewrażliwi na hormon. Z drugiej strony, zmniejszona ekspresja OB może również prowadzić do otyłości w przypadku gdy stwierdzane są „normalne” (tj. Nieprawidłowo niskie) poziomy białka. Tak więc, poziom białka OB w osoczu człowieka może być znacznikiem różnych postaci otyłości. W małej grupie szczupłych osobników z BMI <25, można było wykryć niskie, nanogramowe poziomy białka OB, stosując ELISA. Co istotne, stwierdzono różne stężenia, co sugeruje, że poziom ekspresji i/lub wrażliwości na białko może odgrywać rolę w określeniu ciężaru ciała. Nie jest znane miejsce działania białka OB. Białko wpływa na ilość przyjmowanego pożywienia jak również na wydatek energii, wynik zgodny z badaniami klinicznymi wskazującymi, że regulacja obu układów reguluje ciężar ciała (Leibel i in., n. Engl. J. Med., 332;621 -628 (1995); Keesey i in.,, ,Metabolic defence of body weight set-point”, Association for Research in Nervous and Mental Disease, str. 87-96, Stunkard i Stellar, wyd., Raven Press, New York. (1984)). Podwzgórze znajduje się raczej poniżej OB w szlaku kontrolującym ciężar ciała, jakkolwiek, możliwy jest wpływ bezpośredni na różne narządy.
Przykład 9: podwyższona ekspresja RNA OB w adipocytach myszy z uszkodzeniem podwzgórza oraz mutacjami w locus db
Produkt genowy ostatni sklonowanego mysiego genu otyłości (OB) odgrywa istotną rolę w regulacji ciężaru tkanki tłuszczowej. RNA OB ulega swoistej ekspresji w mysich adipocytach in vivo w każdym z kilku miejsc odkładania tłuszczu, w tym w tkance tłuszczowej brązowej. Jest on również ekspresjonowany w hodowanych preadipocytach 3T3-442A, które pobudzono do różnicowania. Myszy z uszkodzeniami podwzgórza, j ak również mysie mutanty w locus db, ekspresjonujądwudziestokrotnie wyższy poziom RNA dla OB w tkance tłuszczowej. Te wyniki sugerują że zarówno mysi gen db, jak i podwzgórze, znajdują się poniżej genu OB w szlaku regulującym ciężar tkanki tłuszczowej, i są zgodne z poprzednimi doświadczeniami sugerującymi, że locus db koduje receptor dla OB. U myszy db/db oraz mających uszkodzenia podwzgórza, ilościowe różnice w poziomie ekspresji RNA dla OB korelują z zawartością lipidów w adipocytach. Cząsteczki regulujące poziom ekspresji genu OB w adipocytach wydają się· odgrywać istotną rolę w określaniu ciężaru ciała, podobnie jak cząsteczki pośredniczące w działaniu OB w jego miejscu działania.
Materiały i metody
Hybrydyzacja in situ
Biała tkanka tłuszczowa z identycznych okolic brzucha myszy typu dzikiego (wf), i db, poddana była równoczesnej obróbce według zmodyfikowanej metody opisanej przez Richardsona i in., Growth, Development and Aging 56:149-157 (1992). Pokrótce, tkanki utrwalano w roztworze Bouin'a przez 2 godziny w 4°C. Odwadniano je przez traktowanie szeregiem rosnących stężeń etanolu od 10% do 100%, po 5 minut w każdym w 4°C. Dalsze inkubacje tkanek w ksylenie (1 godzinę) i parafinie (2 godziny) przeprowadzano w 65°C. Zatopione tkanki tłuszczowe wt i db/db cięto i zabezpieczano w tych samych warunkach. Skrawki podgrzewano w 65°C przez godzinę i traktowano ksylenem i szeregiem rozcieńczeń etanolu od 100% do 50%, po 3 minuty w każdym w temperaturze pokojowej. Antysensowną sondę RNA dla genu OB wytworzono przez transkrypcję in vitro linearyzowanej sekwencji kodującej genu OB powyżej promotora polimerazy RNA Sp6. Hybiydyzację insitu przeprowadzono dokładnie według Schaeren-Wiemers i in., Histochemistry 100:431-440 (1993).
Preparacja RNA i hodowla komórek
Całkowity RNA i badanie metodą northem biot wykonywano jak opisano. Komórki zrębu naczyniowego i adipocyty preparowano w oparciu o metodę RodBella, zaś RNA z obu frakcji ekstrahowano według sposobu Dani i in., Mol. Celi. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell
183 352
J. Biol. Chem., 239:375-380 (19). Po klonowaniu, komórki 3T3-F442 hodowano w pożywce Eagle a w modyfikacji Dulbecco zawierającej 10% surowicę płodową bydlęcą (określonej jako pożywka standardowa) (Dani i in., Molecular biology techniąues in the study of adipocyte differentiation, Obesity in Europę vol 88, str. 371-376 Bjomtop i Rossner, wyd., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)). W momencie osiągnięcia zlewności, komórki traktowano pożywką standardową z dodatkiem 2 nM trójjodotyroniny (T3) i 17 nM insuliny. Dwanaście dni później RNA ekstrahowano jak wyżej.
Traktowanie aurotioglukozą (Gold Thiglucose - GTG)
Samicom myszy CBA/J w wieku dwóch miesięcy podano pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe aurotioglukozy (Sigma nr kat. A0632) w dawce 0,2 mg/g w roztworze soli. Zwierzęta kontrolne otrzymały sól fizjologiczną. Myszy zważono w miesięc po wstrzyknięciu. RNA tkanki tłuszczowej izolowano od tych zwierząt, które przybrały na wadze ponad dwadzieścia gramów po podaniu GTG.
Wyniki
Jak ostatnio odkryto, gen OB ulega ekspresji w tkance tłuszczowej (Zhang i in., Naturę 372:425 (1994)). Ponieważ tkanka tłuszczowa składa się z wielu typów komórek, w tym adipocytów, preadipocytów, fibroblastów i komórek naczyń, wykonano badanie hybrydyzacji in situ na skrawkach poduszeczek tłuszczowych nadjądrza zwierząt normalnych, stosując sondy RNA OB sensowne i antysensowne (Richardson i in., 1992, wyżej; Wasserman, „The concept offat organ” w Rodahl, Issekutz „Fat as a tissue”, str. 22-92, McGraw-Hill, New York (1964)). Przy zastosowaniu sondy antysensownej, sygnał pozytywny widoczny był we wszystkich adipocytach w skrawku (figura 30 - oznaczone wt). Nie obserwowano sygnału gdy sondę antysensowną hybiydyzowano ze skrawkami mózgu (dane nie pokazane). Hybrydyzacja sondy antysensowenej ze skrawkami tkanki tłuszczowej myszy C57B1/KS db/db dawała znacznie silniejszy sygnał, potwierdzając swoistą dla adipocytów ekspresję RNA OB i dowodząc znacznego zwiększenia poziomu RNA OB na adipocyt u tych zwierząt (figura 30 - oznaczone db/db). Myszy zmutowane w locus db są bardzo otyłe jako część zespołu identycznego feno typowo z obserwowanym u myszy C57B1/6J ob/ob (Bahary i in., 1992, wyżej).
RNA OB nie był syntetyzowany przez komórki zrębu tkanki tłuszczowej oddzielonej od adipocytów. Jak oczekiwano, komórki frakcji adipocytów ekspresj ono wały RNA dla OB w badaniu metodąnorthem biot (figura 31). Te same wyniki uzyskano stosując RT-PCR (dane nie pokazane). Dane te wspierają wniosek, że wyłącznie adipocyty ekspresj onują gen OB. Dane z hodowanych adipocytów potwierdzają ten wniosek. W badaniach tych, komórki 3T3-F442A hodowano stosując warunki prowadzące do gromadzenia tłuszczu, jako części programu komórkowego prowadzącego do różnicowania w adipocyty. RNA OB nie był ekspresjonowany w komórkach rosnących wykładniczo, ani w rosnących zlewnie preadipocytach 3T3-F442A, ekspresjonujących znaczniki wczesne, podczas gdy różnicowanie tych komórek w adipocyty prowadziło do ekspresji wykrywalnych ilości RNA OB (figura 31) (Dani i in., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989)). Poziom RNA OB jest niezwykle wrażliwy na warunki hodowli, ponieważ nie obserwowano sygnału w późnych, przerośniętych komórkach nie eksponowanych na insulinę.
Badania hybrydyzacyjne wykazały, że RNA OB ulega ekspresji in vivo w pewnych miejscach gromadzenia tłuszczu obejmujących poduszeczki tłuszczowe nadjądrzy, przymaciczne, brzuszne, okołonerkowe i pachwinowe (figura 32A). Dokładny poziom ekspresji w każdym z miejsc gromadzenia był nieco zmienny, przy czym tkanka tłuszczowa pachwinowa i przymaciczna ekspresjono wała niski poziom RNA OB. RNA OB jest również wykrywalny w tkance tłuszczowej brązowej, jakkolwiek poziom ekspresji jest około 50-krotnie niższy w tkance tłuszczowej brązowej niż w innych mniejscach gromadzenia tłuszczu. Te różnice ilościowe korelują ściśle z uprzednio opisywanymi różnicami wielkości pomiędzy komórkami różnych miejsc gromadzenia tłuszczu. (Johnson i in., J. Lipid Res., 13:2-11 (1972)). Ekspozycja na niską temperaturę nie wpływa na ilość RNA OB w tłuszczu brązowym (Figura 32B). W tym doświadczeniu, poziom RNA białka UCP (uncoupling protein) zwiększał się w tkance tłuszczowej brązowej po ekpozycji na niską temperaturę, podczas gdy poziom RNA OB nie zmieniał się (Jacobsson i in., J. Biol. Chem., 260; 16250-16254 (1985)). W sumie, dane te potwierdzają, że wszystkie adipocyty są zdolne do wytwarzania RNA OB i demonstrują różny poziom ekspresji
183 352 w różnych miejscach odkładania tłuszczu. Dane te wspierająmożliwość, że poziom kodowanego białka koreluje z całkowitą ilością tkanki tłuszczowej..
Zmierzono poziomy RNA OB u myszy db/db oraz myszy z uszkodzeniami podwzgórza. Uszkodzenia podwzgórza brzusznoprzyśrodkowego (VMH) powodują otyłość jako część zespołu przypominającego obserwowany u myszy ob/ob i db/db (Bray i in., Metabolism 24:99-117 (1975)). Doświadczenia parabiotyczne sugerują, że uszkodzenia tepowodująnadekspresję kriopochodnego czynnika hamującego przyjmowanie pożywienia i zmniejszenia ciężaru ciała (Hervey, 1959, wyżej). Podobne wyniki rejestrowano gdy myszy zmutowane w locus db łączono parabiotycznie z myszami normalnymi, wskazując, że receptor OB może być kodowany w locus db (Coleman i in., 1978, wyżej). Tak więc otyłość wynikająca z uszkodzeń VMH i mutacji db może być wynikiem oporności na wpływ białko OB. Jeżeli tak, to można przewidywać wtórne zwiększenie poziomu RNA OB w tkance tłuszczowej.
Uszkodzenia podwzgórza wywołano u samic myszy CBA przez zastosowanie aurotioglukozy (GTG) (Debonis i in., Fed. Proc. 36:143-147 (1977)). Działanie to powodowało swoiste uszkodzenie podwzgórza, głównie podzgórza brzuszno-przyśrodkowego (VMF), z następującym potem rozwojem otyłości w ciągu kilku tygodni. Zwykle, pojedyncze dootrzewnowe wstrzyknięcie GTG w dawce 0,2 mg/g ciężaru ciała powoduje rozwój otyłości w ciągu czterech tygodni. Jednomiesięczne samice myszy CBA/J (20-25 gramów) traktowano GTG i następujący po tym przyrost ciężaru ciała myszy traktowanych i kontrolnych w tabeli 2. RNA tkanki tłuszczowej izolowano od myszy db/db i myszy traktowanych GTG, które przybrały na wadze > 20 g. Badanie metodą northem biot wykazało dwudziestokrotny wzrost poziomu RNA OB u dwumiesięcznych myszy db/db i myszy traktowanych GTG w porównaniu ze zwierzętami normalnymi (figura 33).
Tabela 2
Przyrost ciężaru ciała u myszy traktowanych aurotioglukozą
Kontrola (n=41) GTG (n=93)
<10g 41,(100%) 4, (4%)
10-20g 0, (0%) 15,(16%)
>20 g 0, (0%) 74, (80%)
Dwumiesięczne samice CBA/J traktowano aurotioglukozą (GTG). Aurotioglukozę (Sigma A0632) podawano dootrzewnowe w roztworze soli w dawce 2,0 mg/g. Ciężar ciała myszy kontrolnych i traktowanych mierzono przed i po miesiącu od podania. Zwierzęta trzymano w klatkach po pięć i żywiono ad libitum. Przyrost ciężaru ciała pokazano w tabeli 2. Zwierzęta o przyroście ciężaru ciała powyżej 20 gramów w miesiąc po podaniu wybrano do dalszych badań.
Dyskusja
Produkt mysiego genu OB krąży w osoczu myszy i ludzi gdzie może działać regulująco na wielkość tkanki tłuszczowej. Dalsze badania nad regulacja ekspresji i mechanizmem działania OB będą miały ważne implikacje dla zrozumienia szlaków fizjologicznych regulujących ciężar ciała.
Niniejszy przykład pokazuje, że produkt genu OB ulega ekspresji wyłącznie w adipocytach w miejscach gromadzenia tkanki tłuszczowej. Wynik ten zgodny z możliwością że produkt białkowy genu OB koreluje z zasobami tłuszczu w organizmie. Ponadto, RNA dla OB ulega regulacji dodatniej dwudziestokrotnie u myszy db i myszy z uszkodzeniami podwzgórza. U tych zwierząt wzrost poziomu RNA OM na komórkę wydaje się być jeszcze większy niż dwudziestokrotny ponieważ wielkość adipocyta zwiększa się około pięciokrotnie u tych zwierząt (patrz figura 30) (Debons i in., 1977, wyżej). Dane te umieszczają gen db i podwzgórze poniżej OB w szlaku kontrolującym ciężar ciała i są zgodne z hipotezą że receptor OB jest kodowany przez locus db (Coleman i in., Diabetologia 14:141-148 (1978)). Klonowanie molekularne receptora OB i/lub genu db powinno rozwiązać ten problem. Podwyższenie poziomu RNA OB w myszy db/db i traktowanych GTG również sugeruje nie autonomiczne funkcjonowanie produktu genu OB w komórkach tłuszczowych (Ashwell i in., Proc. R. Soc. Lond., 195:343-353 (1977); Ashwell i in., Diabetologia 15:465-470). Tak więc, jeżeli kodowane białko działa bezpośrednio na komórki
183 352 tłuszczowe hamując wzrost i różnicowanie, nadekspresja genu OB typu dzikiego u myszy traktowanych GTG powinna spowodować szczupły fenotyp. Najbardziej prawdopodobnym wytłumaczeniem tych danych jest działanie białka OB jako cząsteczki sygnału endokrynnego, wydzielonej przez adipocyty i działającej bezpośrednio albo pośrednio na podwzgórze. Bezpośredni wpływ na podwzgórze wymagałoby, żeby występował mechanizm umożliwiający przechodzenie produktu genu OB przez barierę krew/mózg. Mechanizmy obejmujące narząd okołokomorowy i/lub swoiste przenośniki mogą umożliwić dostęp do mózgu cząsteczek tej wielkości co kodowana przez gen OB (Johnson i in., FASEB J. 7:678-686 (1983); Baura i in., J. Clin. Invest., 92:1824-1830(1993), Pardridge, Endocrine Reviews 7:314-330(1986)). Jednakże, ta hipoteza musi być rozważana z uwagą dopóki nie zostanązidentyfikowane czynniki dzięki którym białko może przechodzić przez granicę krew mózg. Ponadto, muszą być zbadane ewentualne efekty na inne narządy docelowe.
Sygnały komórki tłuszczowych odpowiedzialne za ilościową zmienność w poziomie ekspresji genu OB nie są dotąd znane, ale muszą korelować z różnicami w wielkości adipocyta. Adipocyty myszy db/db sąpięciokrotnie większe niż adipocyty myszy normalnych, z wielkością rzędu 1,0 pg tłuszczu/komórkę (Johnson i in., 1972, wyżej). Poprzednie dowody wskazywały, że zawartość lipidów w komórce tłuszczowej i/lub wielkość są ważnymi parametrami w określeniu ciężaru ciała (Faust i in., Am. J. Physiol., 235:279-286 (1987); Faust i in., Science 197:393-396 (1977)). Możliwe, że każda komórka tłuszczowa ekspresjonuje niski poziom RNA OB, który następnie zwiększa się proporcjonalnie do wielkości komórki. Jest również możliwe, że wielkość komórki nie jest znaczącym parametrem, ale koreluje raczej z sygnałem wewnątrzkomórkowym, który zwiększa ekspresję genu OB w adipocytach myszy db/db i myszy z uszkodzeniami VMH. W każdym wypadku, składniki szlaku przekazywania sygnału regulujące syntezę RNA OB wydają się być istotne dla określania ciężaru ciała. Wpływy genetyczne i środowiskowe, zmniejszające poziom ekspresji OB powinny wpływać na zwiększenie ciężaru ciała, tak jak zmniejszająca się wrażliwość naa kodowane białko. Swoiste cząsteczki, które regulują poziom ekspresji genu OB nie są znane, i oczekują określenia poziomu kontroli genu, który prowadzi do ilościowej zmienności w poziomie RNA OB, i określenia elementów regulacyjnych genu OB. Identyfikacja cząsteczek regulujących ekspresję genu OB w adipocytach, oraz pośredniczących w efektach wywoływanych przez białko w jego miejscu(ach) działanią powinno bardzo pomóc nasze zrozumienie mechanizmów fizjologicznych regulujących ciężar ciała.
Przykład 10: wzorzec ekspresji RNA i mapowanie na fizyczne, cytogenetyczne i genetyczne mapy chromosomu 7
RNA OB ulega silnej ekspresji w ludzkiej tkance tłuszczowej i znacznie słabszej w łożysku i sercu. Ludzki gen ob mapuje się na duży sztuczny chromosom drożdżowy (YAC) uzyskany z chromosomu 7q31.3. Oprócz potwierdzenia względnego położenia genu w oparciu o mysio-ludzkie mapowanie porównawcze, badanie to zidentyfikowało 8 ustalonych znaczników mikrosatelitarnych w fizycznej bliskości z ludzkim genem OB. Ponieważ mutacje w mysim genie OB mogąspowodować zespół, który blisko przypomina chorobliwą otyłość u ludzi, te znaczniki genetyczne stanowią ważne narzędzia do badania roli genu OB we wrodzonych postaciach otyłości ludzkiej.
Materiały i metody
Analiza metodą northem biot
Całkowity RNA preparowano z tkanki tłuszczzowej stosując metodę Chirgwina i in., Biochem., 18:5294-5299 (1979). Badanie northem, znakowanie radioaktywne i hybrydyzacje wykonano jak to opisano (Zhang i in., 1994, wyżej). Badanie northem poliA+RNA (ludzki MTN, ludzki MTNII i ludzki płodowy MTNII) uzyskano z Clontech (Pało Alto, CA), podobnie jak startery PCR zastosowane do wytworzenia znakowanej radioaktywnie sondy-ludzkiej aktyny.
Opracowanie STS
Testy PCR swoiste dla znakowanego miejsca opracowano i optymalizowano zasadniczo, jak to opisano (Green i in., PCR Methods Applic., 1991; Green i in., Genomics 11:548-564 (1991); Green „Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome specyfic tagged sites” w Methods in Molecular Genetics, vol., I, Gene and Chromosome Analysis (Part A), str 192-210, wyd. Adolph, Academic Press Inc., San Diego (1993); Green i in., Hum. Molec. Genet., 3:489-501 (1994). Każdy STS nazwano używając przedrostka „sWSS” i unikalnego numeru. Szczegóły o 19 STS opisanych tu dostarczono w tabeli 3, z informacjami dodatkowymi (np. wa
183 352 runki PCR, kompletnej sekwencji DNA) dostępnej w GenBank i/lub Genome Data Base (GDB). Dla STS swoistych dla mikrosatelitów, startery oligonuleotydowe zastosowane w testach PCR (tabela 3) odpowiadały albo zastosowanym w genotypowaniu (tabela 4) albo zaprojektowanym (głównie przez program OSP) (Hillier i in., PCR Meth. Applic., 1:124-128 (1991)) stosując sekwencję DNA dostępną w GenBank. Tabela 3 przedstawia STS we wstawkach YAC zawierających ludzki gen OB
Tabela 3
Nazwa STS Skrót Locus Źródło Startery PCR Wielkość (bp) SEQ ID NO: GDB ID NO.
,WSS1734 D7S2185 YAC End CAAGACAAATGAGATAAGG AGAGTTACAGCTTTACAG 72 39 40 G00-455-235
,WSS494 D7S2016 Lambda Clone CTAAACACCTTTCCATTCC TTATATTCACTTl1CCCCTCTC 112 41 42 G00-334-404
sWSS883 UT528 D7S1498 Genetic Marker TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 490 43 44 G00-455-262
,WSS2359 AFMa065Z G9 D7S1873 Genetic Marker AGTGTTGTGTTTCTCCTG 142 45 46 G00-455-247
sWSS2336 AFMal25w hl D7S1874 Genetic Marker GGTGTTACGTTTAGTTAC GGAATAATGAGAGAAGATTG 112 47 48 G00-455-244
sWSS1218 AFM309yfl D7S680 Genetic Marker GCTCAACTGACAGAAAAC GACTATGTAAAAGAAATGCC 154 49 50 G00-307-733
,WSS1402 DTS1916 YAC End AAAGGGCTTCTAATCTAC CCTTCCAACTTCTTTGAC 137 51 52 G00-344-044
sWSS999 D7S1674 YAC Insert TAACCCCTTTCTGTTC TTGCATAATAGTCACACCC 105 53 54 G00-334-839
sWSS1751 D7S2186 YAC End CCAAAATCAGAATTGTCAGAAAG AAACCGAAGTTCAGATACAG 186 55 56 G00-455-238
sWSSl 174 AFM218 χΠΟ D7S514 Genetic Marker AATATCTGACATTGGCAC TTAGACCTGAGAAAAGAG 144 57 58 G00-307-700
,WSS2061 D7S2184 YAC End GTTGCACAATACAAAATCC CTTCCATTAGTGTCTTATAG 200 59 60 G00455-24
sWSS2588 D7S2187 YAC End ATCACTACACACCTAATC CCATTCTACATTTCCACC 117 61 62 G00-455-253
sWSS808 Pax-4 ΡΑΧ4 Gene GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC 15 63 64 G00-455-259
,WSS1392 AFM206 xcl D7S635 Genetic Marker CTCAGGTATGTCTTTATC TGTCTCTGCATTCTTTTC 75 65 66 G00-307-815
5WSS1148 AFM199 xhl2 DtS504 Genetic Marker GACACATACAAACACAAG ATTGAGTTGAGTGTGTAGTAG 60 67 68 G00-307-652
sWSSl 529 D7S1943 YAC End CAGGGATTTCTAATTGTC AAAAGATGGAGGCTTTTG 116 G00-334-119
sWSS2619 OB OB Gene CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA 106 G00-455-256
,WSS404 D7S1956 Lambda Clone ACCAGGGTCAATACAAAG TAATGTGTCCTTCTTGCC 122 73 74 300-334-251
,WSS2367 \FMa345 wc9 D7S1875 Genetic Marker CAATCCTGGCTTCATTTG AAGGTGGGTAGGATGCTA | 81 75 76 300-455-250
183 352
Wymieniono 7 STS swoistych dla chromosomu 19 mapowanych na wstawkę YAC zawierającą ludzki gen OB (figura 35). W każdym wypadku podano oznaczoną nazwę „sWSS”, odpowiedni skrót, nazwa locus nadana w GDB, źródło STS, sekwencję starterów PCR, wielkość STS i numer identyfikacyjny GDB. Źródłami STS były: „Koniec YAC” (izolowany koniec wstawki YAC) (Green, 1993, wyżej), „Klon lambda” (losowy klon lambda swoisty dla chromosomu 7 (Green i in., 1991, wyżej; Green, 1993, wyżej), „Znacznik genetyczny” (znacznik mikrosatelitamy, patrz tabela 2) (Green i in., 1994, wyżej), „Wstawka YAC” (losowy segment ze wstawki YAC), i „Gen” (STS swoisty dla genu). Należy zauważyć, że niektóre STS swoiste dla znaczników genetycznych, zastosowane do Identyfikacji YAC (podane w tabeli), pochodzą często z zastosowanych do wykonywania badań typowania (tabela 4) ponieważ wykrycie YAC zawierającego znacznik genetyczny nie wymaga amplifikacji miejsca polimorficznego. Wszystkie zaznaczone testy PCR wykorzystują temperaturę przyłączania 55°C, z wyjątkiem sWSS494, sWSS8883, sWSS1529 i sWSS2619 (gdzie zastosowano 50°C), sWSS999 i sWSSl 174 (60°C) i sWSS808 (gdzie stosowano 65°C). Dodatkowe szczegóły dotyczące testów PCR swoistych dla STS dostępne są w GDB. Wymieniono 8 znaczników mikrosatelitamychy mapujących się na wstawkę YAC zawierającą ludzki gen OB (figura 35). W każdym wypadku podano oznaczoną nazwę (zaznaczona w tabeli 3 jako skrót), rodzaj motywu mikrosatelity (tetranukleotyd-, powtórzenie „Tetra” albo powtórzenie (CA)n), nazwa locus nadana w GDB, sekwencję starterów PCR wykorzystywanych do genotypowania i numer identyfikacyjny GDB.
Tabela 4
Mikrosatellite markers in the YAC contig containing the human ob gene.
Nazwa Locus Primers SEQ ID NO: GDB ID No.
UT528 Tetra. D7S1498 TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 77 78 GOO-312-446
AFMaO65zg9 (CA)n D7S1873 AGCTTCAAGACTTTNAGCCT GGTCAGCAGCACTGTGATT 79 80 G00-437-253
AFMal25whl (CA)n D7S1874 TCACCTTGAGATTCCATCC AACACCGTGGTCTTATCAAA 81 82 G00-437-263
ĄFM309yfl0 (CA)n D7S680 CATCCAAGTTGGCAGTTTTT AGATGCTGAATTCCCAGACA 83 84 G00-200-283
AFM218xfl0 (CA)„ D7S514 TGGGCAACACAGCAAA TGCAGTTAGTGCCAATGTCA 85 86 G00-188-404
AFM206xcl (CA)n D7S635 CCAGGCCATGTGGAAC AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT 87 88 G00-199-240
AFM199xhl2 (CA)n D7S504 TCTGATTGCCTGGCTGC GCGCGTGTGTATGTGAG 89 90 G00-188-280
AFMa345wc9 (CA)„ D7S1875 AGCTCTTGGCAAACTCACAT GCCTAAGGGAATGAGAGACA 91 92 G00-437-259
Ludzki STS swoisty dla genu OB (sWSS2619) zaprojektowano stosując sekwencję DNA uzyskaną z nie ulegającego translacji regionu 3' cDNA. Ludzki STS swoisty wobec genu Pax4 (sWSS808) opracowano stosując tą samą strategię. Startery oligonukleotydowe swoiste wobec mysiego genu Pax4 (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (Identyfikator Sekw. Nr 63) i (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (Identyfikator Sekw. Nr 93) (Walther i in., 1991, Genomics 11:424-434) zastosowano do amplifikacji fragmentu 204 bp z ludzkiego genomowego DNA (mającego ta samą wielkość co produkt uzyskany z mysiego genomowego DNA). Ten test PCR
183 352 nie był odpowiedni do identyfikacji odpowiednich YAC, ponieważ produkt o podobnej wielkości (200 bp) był również amplifikowany z drożdżowego DNA· Jednakże, analiza sekwencji DNA produktu PCR wytworzonego z ludzkiego DNA wykazała podstawienia w 20 pozycjach wśród 156 analizowanych zasad (dane nie pokazane). Stosując tą sekwencję swoistą dla ludzi, zaprojektowano nowy starter (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (Identyfikator Sekw. Nr 64) i zastosowano z pierwszym z wymienionych starterów mysich swoistych dla Pax4 (patrz tabela 3). Powstały swoisty dla ludzkiego Pax4 test PCR nie amplifikował odpowiedniego produktu z drożdżowego DNA, tak więc został zastosowany do identyfikacji odpowiednich YAC.
Identyfikacja YAC przez przesiewanie oparte na PCR
Większość z YAC przedstawionych na figurze 35 uzyskano z kolekcji klonów wysokowzbogaconych w DNA ludzkiego chromosomu 7 („źródło YAC chromosomu 7”) (Green i in., 1995, wyżej), przesiewając w oparciu o PCR (Green i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1213-1217 (1990)). W kilku przypadkach, bazując na tej strategii (Green i in., 1995, wyżej), wyizolowano klony, przesiewając PCR dostępne ludzkie genomowe biblioteki YAC skonstruowane w CEPH (Dausset i in., Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4256-4260 (1990)) albo ICI (Anand i in., Nuci. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand i in., Nuci. Acids Res., 18:1951-1956 (1990)). Każdy z YAC nazwano stosując przedrostek „sWSS” i unikalny numer.
Wyniki i dyskusja
Badanie ekspresji tkankowej ludzkiego genu OB analizą northem biot wykazało, że RNA OB ulega silnej ekspresji w tkance tłuszczowej i znacznie słabszej w łożysku i sercy (figura 34). Wielkość RNA (około 4,5 kb) była równoważna u człowieka i myszy, jak również występował on w tych samych tkankach. W badaniach tych, obserwowano 5-krotnie silniejszy sygnał w 10 pg całkowitego RNA tkanki tłuszczowej niż w 2 pg poliA+RNA łożyskowego. Pięciokrotnie słabszy sygnał obserwowano w poliA+RNA serca w porównaniu z łożyskiem. Oceniono, że poziom RNA OB w łożysku jest 250-krotnie niższy niż w tkance tłuszczowej. W doświadczeniu nie stwierdzono RNA OB w żadnej z analizowanych tkanek obejmujących mózg, płuca, wątrobę, mięśnie szkieletowe, nerkę i trzustkę. Dodatkowe doświadczenia nie wykazały RNA w śledzionie, grasicy, gruczole sterczowym, jądrach, jajniku, jelicie cienkim, okrężnicy, leukocytach krwi obwodowej, ani w mózgu, wątrobie i nerce płodowej (dane nie pokazane). Możliwe jest, że OB ulega ekspresji w niewykrywalnej ilości (stosując northem biot) w tych tkankach, albo ulega w tkankach, których nie badano. Obserwowany wzorzec ekspresji różni się nieco u ludzi w porównaniu z myszami, u których OB wykrywane jesty niemal wyłącznie w tkance tłuszczowej.
Porównawcze mapowanie regionu genu OB w genomie myszy i ludzi.
Mysi gen OB położony jest na ramieniu krótszym chromosmu 6 w regionie homologicznym z częścią ludzkiego chromosomu 7q. Geny w tym segmencie obejmują (od końca bliższego do dalszego) protoonkogem Met, regulator przewodnictwa błonowego cysticfibrosis (Cfłr), sparowany gen 4 zawierający kasetę (Pax4), OB i Carboxypeptidase A (CpA) (Zhang i in., 1994; Friedman i in., 1991). U myszy, mapowanie genetyczne zastosowano w celu wykazania, że Pax4 jest ściśle związany z ob (Walther i in., 1991; Zhang, i in., 1994). Odległość fizyczna pomiędzy OB i Pax4 wynosi około 1 miliona par zasad (1 Mb) (Zhang i in., 1994, wyżej). W oparciu o porównawcze mapowanie oczekiwano, że ludzki gen OB rezyduje pomiędzy Pax4 i CPA na chromosomie 7q. Ponadto, ponieważ ludzki CFTR (Heng i in., Celi. Genet., 62:108-109 (1993) i Pax4 (Tamurai in., Cytogenet. Celi Genet., 66:132-134 (1994) zmapowano fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) na, odpowiednio, 7q31.3 i 7q32, oczekiwano, że najbardziej prawdopodobna pozycja ludzkiego genu OB powinna się znajdować na styku 7q31.3 i 7q32.
Przykład 11: ludzki polipeptyd OB jest aktywny biologicznie u myszy
Grupy po 10 myszy ob/ob traktowano wstrzyknięciami i. p. 10 pq/g/dzień rekombinowanego (bakteryjnego) ludzkiego i mysiego polipeptydu OB albo solą fizjologiczną. Po czterech dniach, grupa otrzymująca sól, przybrała na wadze 0,3 g. Grupa otrzymująca mysi OB straciła na wadze 3,2 g. Grupa otrzymująca ludzki OB straciła 2 g (p < 0,01 w porównaniu z grupą kon
183 352 trolną). Grupy te badano również pod względem ilości przyjmowanego pożywienia. Dane te pokazano w tabeli 5; dane ciężaru ciała pokazano w tabeli 6.
Tabela 5
Dzienna ilość przyjmowanego pożywienia (g) leczonych myszy ob/ob (wartość±SD).
Leczenie Dzień 0 Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 5 Dzień 6 Dzień 7
roztwór soli 13.4 ±2.6 12.8 12.8 13.1 14.0 12.3 12.4 8.3
mysie OB 14.9 3.7 4.4 5.1 8.9 8.1 8.7 3.5
ludzkie OB 14.3 10.3 8.7 7.0 8.9 5.3 3.8 13.0
Tabela 6
Ciężar ciała i zmiany ciężaru ciała u leczonych myszy ob/ob (wartość±SD).
Leczenie Ciężar ciała (dzień 0) Ciężar ciała (dzień 4) Procentowa zmiana (od dnia 0 do 40 Ciężar ciała (dzień 6) Procentowa zmiana (od dnia 0 do 6
roztwór soli 39.9±1.8 40.7±.1.6 0.8±0.5 41.1±2.2 1.2±1.1
mysie OB 39.5±2.1 36.2±2.0 -3.3±1.2 36.3±2.2 -3.1±1.2
ludzkie OB 39.5±2.0 37.6±1.7 -2.0±1.0 36.1±1.3 -3.5±1.3
Dane te pokazują że ludzki OB jest biologicznie czynny u myszy.
Przykład 12: duża dawka OB ma wpływ na myszy typu dzikiego
Myszy typu dzikiego (C57B1/6J +/?) traktowano codziennymi wstrzyknięciami i. p. 10 pg/g/dzień rekombinowanego mysiego OB i mierzono ciężar ciała co cztery dni. Wyniki pokazano w tabeli 7.
Tabela 7
Ciężar ciała (g) zwykłych myszy otrzymujących OB
Leczenie Dzień 0 Dzień 4 Dzień 8 Dzień 12 Dzień 16
roztwór soli 22.6±1.4 22.2±1.2 22.5±1.3 23 22.5
mysie OB 22.4 20.6±1.5 20.8±1.3 20.8 21.8
Dane te pokazują że OB wpływa na ciężar ciała myszy typu dzikiego jak również na otyłe myszy (pb/ob), jednakże w mniejszym stopniu.
Przykład 13: polipeptyd OB podawany we wlewie ciągłym przez pompę infuzyjną
Przykład pokazuje, że ciągły wlew polipeptydu OB powoduje utratę ciężaru ciała myszy normalnych. Normalne (nie otyłe) myszy traktowane mysim polipeptydem OB podawanym przez pompę osmotyczną. Dawka 0,5 g białka/kg/dzień powodowała 4,62% utratę (±1,34%) wagi podstawowej po 16 dniach infuzji.
Materiały i metody
Zwierzęta
W tym przykładzie zastosowano myszy typu dzikiego (+/+) C57B1/6. Myszy trzymano osobno, w humanitarnych warunkach. Wiek myszy na początku badania wynosił 8 tygodni, a ich ciężar ciała był ustabilizowany. Dla każdej kohorty zastosowano po 10 myszy (nośnik w stosunku do białka).
Karmienie i mierzenie ciężaru
Myszom podawano rozdrobnione pożywienie dla myszy (PMI Feeds, Inc.) w karmnikach (Allentown Caging and Equipment), które umożliwiały dokładny i czuły pomiar ilości przyjmowanego pożywienia w stosunku do normalnych metod. Ciężar mierzono o tej samej porze codziennie (godzina 14.00) przez 6 dni. Ciężar ciała przed infuzją uznawano jak podstawowy.
183 352
Klonowanie mysiego DNA OB
Klonowanie mysiego DNA OB do ekspresji w E. coli wykonano jak niżej. Sekwencja DNA na podstawie sekwencji opublikowanej w Zhang i in., 1994, wyżej; Przykład 1, wyżej, poddano odwrotnej translacji stosując optymalne dla E. coli kodony. Skrajnymi miejscami klonowanie były Xbal i BamHI. Wzmacniacz wiążący rybosom i silne miejsce wiązania rybosomu włączono na początku regionu kodującego. Dwuniciową sekwencję DNA syntetyzowano standardowymi technikami. Prawidłowe klony potwierdzono przez wykazanie ekspresji białka rekombinowanego i obecności prawidłowej sekwencji DNA OB w plazmidzie rezydującym. Sekwencja aminokwasowa (i sekwencja DNA) przedstawiona jest poniżej:
TCTAGAirTGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT 9 - +---------+---------+ ---------+---------+---------+ g
AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA
Μ V P I Q K V TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA 69 - +---------+---------+---------+---------+---------+128
AGTCCTGCTGTGGTITTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT
QDDTKTLIKTIVTRINDISHCACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA 129 - +---------+---------+---------+---------+---------+188
GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT
TQSVSAKQRVTGLDFIPGLH CCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC 189 - +---------+---------+---------+---------+---------+ 248
GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG
PILSLSKMDQTLAVYQQVLT CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT 249 - +---------+---------+---------+---------+---------+ 308
GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA slpsqnvlqiandlenlrdlGCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA □ Π 9 _____________________+_________+ - -- -- -- -- 4+ cgacgtggacgaccgtaagaggtttaggacgagggacggcgtctggagtccagaagtctt lhllafskscslpqtsglqk accggaatccctggacggggtcctggaagcatccctgtacagcaccgaagttgttgctct . __-_______________________+4Zo o ζ q _ 4. - - - - + + - - * ~ ____ tggccttagggacctgccccaggaccttcgtagggacatgtcgtggcttcaacaacgaga pesldgvleaslystevval gtcccgtctgcagggttcccttcaggacatccttcagcagctggacgtttctccggaatg 425 cagggcagacgtcccaagggaagtcctgtaggaagtcgtcgacctgcaaagaggccttac srlqgslqdilqqldvspec TTAATGGATCC 489 -+--------AATTACCTAGG
183 352
Wektor ekspresyjny i szczep gospodarza
Plazmidowym wektorem ekspresyjnym zastosowanym do wytwarzania białka był pCFM1656 (ATCC 69576). Powyższy DNA ligowano do wektora ekspresyjnego pCFM1656, który linearyzowano Xbal i BamHI, po czym transformowano do szczepu E. coli FM5. Komórki E. coli FM5 uzyskano z Amgen Inc., ThousendOaks, CA, ze szczepu K-12 (Bachmann i in., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976) i zawierał on zintegrowany gen represora faga lambda clg57 (Sussman i in., C. R. Acad. Sci., 254:1517-1579 (1962)). Wytwarzanie wektora, transformację komórek i selekcję kolonii wykonano standardowymi technikami np. Sambrook i in., 1989, wyżej. Komórki hodowano na pożywce LB.
Podawanie białka albo nośnika
Rekombinowany polipeptyd mysi OB zastosowano w niniejszych doświadczeniach, ogólnie, w stężeniu 0,9 mg/ml w roztworze soli buforowanym fosforanem, pH 7.4. Sekwencja aminokwasowa (i sekwencja DNA) podana została wyżej. Białko albo nośnik (roztwór soli buforowany fosforanem, pH 7,4) podawano przez pompę osmotyczną. Pompy osmotyczne Alzet (Alza, Pało Alto, CA, model 1007D) umieszczono chirurgicznie w kieszonce podskórnej w okolicy międzyłopatkowej. Pompy kalibrowano tak, by dostarczały 0,5 ml roztworu białka na godzinę, tak by uzyskać dawkę 0,5 mg białka/kg/dzień. Zwierzętom kontrolnym podawano roztwór soli buforowany fosforanem, (pH 7,4) w takiej samej pompie Alzet.
Proces fermentacji
W celu wytwarzania białka zastosowano trzyetapowy proces znany jako proces „fedbatch”. Skład pożywki podano niżej.
Wsad
Źródło azotu i fosforasnu sterylizowano (przez podniesienie temperatury do 122°C przez 35 minut, 18-20 psi) w naczyniu fermentacyjnym (Biolafitte, 12 litrów pojemności). Po schłodzeniu aseptycznie dodano źródło węgla, magnezu, witamin i metali śladowych. Po całonocnej hodowli (16 godzin lub dłużej), do fermentatora dodano wyżej wytworzonych bakterii wytwarzających mysie białko w objętości 500 ml (w pożywce LB).
Pożywka I
Po uzyskaniu OD600 4,0-6,0 do hodowli dodano Pożywki I. Glukozę dodawano w ilości ograniczającej w celu kontrolowania tempa wzrostu (μ). Automatyczny układ (tzw. „Distributive Control System”) zaprogramowano w celu utrzymania tempa wzrostu na poziomie 0,15 generacji/godzinę.
Pożywka II.
Po osiągnięciu OD 30, temperaturę pomału podnoszono do 42°C i zmieniono pożywkę na Pożywkę II, opisanąniżej. Fermentację podtrzymywano przez 10 godzin pobierając próbki co 2 godziny. Po 10 godzinach, zawartość fermentatora schłodzono poniżej 20°C i zebrano przez odwirowanie.
Skład pożywek:
Wsad: 10 g/1 5,25 g/1 3,5 g/ł 4,0 g/1 5,0 g/1 L0 g/1 2,0 ml/1 2,0 ml/1 1,0 m/1 ekstrakt drożdżowy (NH4)2SO4
K2HPO4
KH2PO4 glukoza
MgSO4 7H2O roztwór witamin roztwór metali śladowych środek przeciwpieniący P2000
183 352
Pożywka I:
g/1 Bacto-trypton g/1 ekstrakt drożdżowy
450 g/1 glukoza
8,75 g/1 MgSO4 7H2O ml/1 roztwór witamin ml/1 roztw/ór metali śladowych
Pożywka II:
200 g/1 Bacto-trypton
100 g/1 ekstrakt drożdżowy
110 g/1 glukoza
Roztwór witamin (wsad, Pożywka I): 0,5 g biotyny, 0,4 g kwasu foliowego i 4,2 g ryboflawiny, rozpuszczono w 450 ml H2O i 3 ml 10 N NaOH, po czym doprowadzono do 500 ml H20.14gpiiydoksynyi61 g niacyny rozpuszczono w 150mlH2Oi50ml 10 NNaOH i doprowadzono do 250 ml H20.54 g kwasu pantotenowego rozpuszczono w 200 ml H2O i doprowadzono do 250 ml H2O. Trzy roztwory połączono i doprowadzono do 10 1 H2O.
Roztwór metali śladowych (Wsad, Pożywka I):
chlorek żelaza (FeCl3 6 H2O) 27 g/1
chlorek cynku (ZnCl2 4 H2O) 2 g/1
chlorek kobaltu (CoCl2 6 H2O) 2 g/1
molibdenian sodu (NaMoO4 2 H2O) 2 g/1
chlorek wapnia (CaCl2 2 H2O) 1 g/i
siarczan miedzi (CuSO4 5 H2O) 1,9 g/1
kwas bomy (H3BO3) 0,5 g/1
cytrynian sodu 73,5 g/I
Proces oczyszczania mysiego polipeptydu OB
Oczyszczanie osiągnięto w następujących etapach (o ile nie zaznaczono inaczej wszystkie etapy przeprowadzano w 4°C):
I. Maź komórkowa. Komórki zawieszono w 5 objętościach 7 mM EDTA, pH 7,0. Komórki w EDTA rozbijano dalej przez dwukrotne przepuszczenie przez urządzenie microfluidizer. Rozbite komórki odwirowano przy 4200 obr/min. przez godzinę, w wirówce Beckman JB-6 z rotorem J5-4.2.
2. Płukanie 1-sze ciałek wtrętowych. Nadsącz z powyższego usunięto, zaś osad zawieszono w 5 objętościach 7 mM EDTA, pH 7,0 i homogenizowano. Mieszaninę tę odwirowano jak w 1.
3. Płukanie 2-gie ciałek wtrętowych. Nadsącz z powyższego usunięto, zaś osad zawieszono w 10 objętościach 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT i 1% dezoksycholanie i homogenizowano. Mieszaninę te odwirowano jak w 1.
4. Płukanie 3-cie ciałek wtrętowych. Nadsącz z powyższego usunięto, zaś osad zawieszono w 10 objętościach wody destylowanej i homogenizowano. Mieszaninę te odwirowano jak w 1.
5. Fałdowanie. Białko w osadzie fałdowano w 10 mM HEPES, pH 8,5,1% sarkozynie sodu (N-laurylosarkozyna) w temperaturze pokojowej. Po 60 minutach roztwór zadano 60 mM siarczanem miedzi i mieszano przez noc.
6. Usuwanie sarkozyny. Mieszaninę fałdującą rozcieńczono 5-krotnie 10 mM Tris, pH 7,5 i odwirowano jak w 1. Nadsącz zebrano i mieszano z żywicąDowex 1 -X4,20-50 mesh, w postaci chlorku (0,066% całkowitej objętości fałdującej). Mieszaninę wprowadzono do kolumny i zbierano eluent. Usunięcie sarkozyny potwierdzono HPLC.
7. Percypitacja kwasem. Eluent zebrano i doprowadzono do pH 5,5 i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
183 352
Mieszaninę odwirowano jak w 1.
8. Chromatografia kationowymienna. pH nadsączu z poprzedniego etapu doprowadzono do 4,2, i wprowadzono do kolumny CM Sepharose Fast Flow. Zastosowano dwadzieścia objętości kolumny gradientu soli od 20 mM NaOAc, pH 4,2 0 M Naci do 1,0 M NaCl.
9. Chromatografia HIC. Pulę o szczytowej frakcji (stwierdzonej analizą w UV) z poprzedniego etapu doprowadzono do 0,2 M siarczanu amonu. Wykonano gradient odwrotny stężenia soli o objętości 20 objętości kolumny od 5 mM NaOAc, pH 4,2,0,4 M siarczanu amonu do 0 M siarczanu amonu. Materiał zatężono i poddano diafiltracji w PBS.
Wyniki
Podane niżej wartości stanowią procent (%) różnic w ciężarze podstawowym myszy C57B1/6 (8 tygodniowych)
Tabela 8
Utrata ciężaru w trakcie ciągłego wlewu.
Czas (dni) Nośnik (PBS) Rekombinowany polipeptyd OB
dni 1-2 3.24 ± 1.13 1.68 ± 1.4
dni 3-4 4.3 ±0.97 -2.12 ± 0.79
dni 5-6 4.64 ±0.96 -4.62 ± 1.3
Jak widać pod koniec 6 dnia schematu ciągłego wlewu, zwierzęta otrzymujące polipeptyd OB straciły ponad 4% ciężaru ciała, w porównaniu z poziomem podstawowym. Jest to zasadniczo szybka utrata ciężaru w porównaniu z podawaniem dootrzewnowym (i. p.). Utrata ciężaru 2,6-3,0% obserwowana była po 32-dniowym okresie wstrzykiwania, u myszy typu dzikiego (normalnych), gdy podawano codzienne wstrzyknięcia i. p. rekombinowanego polipeptydu OB w dawce 10 mg/kg, i nigdy nie przekroczyła 4% (dane nie pokazane). Niniejsze dane wskazują że ciągła infuzja 20-krotnie niższej dawki (0,5 mg/kg w stosunku do 10 mg/kg) powoduje większą utratę ciężaru ciała w krótszym czasie.
Wyniki różniły się istotnie statystycznie, np. -4,62% z p< 0.0001., np. -4,62% zp< 0.0001.
Przykład 14: klonowanie i ekspresja rekombinowanego ludzkiego polipeptydu OB Ten przykład dostarcza sposobu wytwarzania rekombinowanego ludzkiej wersji polipeptydu OB. Ludzki DNA OB skonstruowano w oparciu o mysi DNA OB, jak w Przykładzie 13, przez zastąpienie regionu pomiędzy miejscami Mlul i BamHI dwuniciowym DNA (wytworzonego z oligonukleotydów syntetycznych) w którym zaprojektowano 20 zastąpień kodonów. DNA wprowadzono do wektora pCFM 1656 (ATCC Nr 69576) w taki sam sposób jak rekombinowane mysie białko, jak to opisano wyżej.
DNA rekombinowanego ludzkiego met OB (dwuniciowy) i sekwencja aminokwasowa (Identyfikator Sekw. Nr 96 i 97)
183 352
CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ go
GTATACCA.TCGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAA
MVPIQKVQDDTKTLIKTIV ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC 61 - ----+ ----- ----- -------- + -- -- -- - .4---- - — - -4.---------4. 120
TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG
TRINDISHTQSVSSKQRVTG CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG 121 ---4.------- μ - - — - 4.-- - -4 ------4 ------4- 180
GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC
LDFIPGLHPILTLSKMDQTL GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG
AVYQQILTSMPSRNVLQISN GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG 241 --------- +---------+ ---------+---------+---------+---------+ 300
CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC
DLENLRDLLHYLAFSKSCHL CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT 3 01--------- + — - -- ----4----------4------— - 4.---------4----------4- 3 60
GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA
PWASGLETLDSLGGVLEASG TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG 3 61 -------4---- - - 4. -4 — ----4 -4 - - - - ----4- 420
ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC
YSTEVVALSRLQGSLQDMLW CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC 421 ---------+---------+---------+---- 454
GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG
QLDLSPGC*
Fermentacja
Fermentację komórek gospodarza wytwarzającego rekombinowany ludzki polipeptyd OB osiągnięto w warunkach i kompozycjach jak to opisano dla rekombinowanego mysiego materiału. Wyniki analizowano pod kątem uzysku (g/litr), oczyszczania wstępnego rekombinowanego ludzkiego materiału OB (i niewielkich ilości białek bakteryjnych) i skorelowano w celu analizy ekspresji bakteryjnej.
183 352
Tabela 9
Analiza ekspresji ludzkiego polipeptydu OB.
Punkt czasowy OD (600 nm) uzysk (g/1) ekspresja (mg/OD-1)
ind. + 2 godz. 47 1.91 41
ind. + 4 godz. 79 9.48 120
ind. + 6 godz. 95 13.01 137
ind. + 8 godz. 94 13.24 141
ind. + 10 godz. 98 14.65 149
Skróty:
Ind. + - godz. oznacza liczbę godzin po indukcji ekspresji białek, jak to opisano w przykładzie 13 dla rekombinowanego materiału mysiego z użyciem pCFM1656.
O. D. - gęstość optyczna, mierzona spektrofotometrycznie w miligramach na jednostkę O. D. na litr. mg/OD-1 - wyrażenie dotyczące mg białka na jednostkę O. D. na litr.
Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego polipeptydu ob
Rekombinowane białko ludzkie może być oczyszczane podobnie jak sposób zastosowany do oczyszczania białka mysiego w przykładzie 13, wyżej. Do wytwarzania ludzkiego polipeptydu OB w etapie 8 pH nadsączu ustala się na 5,0, i nakłada na kolumnę CM Sepharose Fast Flow. Gradien soli w objętości 20 objętości kolumny wytwarza się od 20 mM NaOAc, pH 5,5 0 M NaCl do ), 5 M NaCl. Etap 9 wykonuje się przez rozcieńczenie puli z CM Sephadex Fast Flow czterokrotnie wodą destylowaną i ustala siępH na 7,5. Mieszaninę tązadaje się 0,7 M siarczanem amonu. Gradient odwrotny o objętości 20 objętości kolumny wytwarza się od 5 mM NaOAc, pH 5,5 0,2 M siarczanu amonu do 0 M siarczanu amonu. Poza tym, etapy są identyczne.
Przykład 15: badanie odpowiedzi na dawkę
Dodatkowe badanie pokazuje istnienie odpowiedzi na dawkę przy ciągłym podawaniu białka OB. W tym badaniu, myszom typu dzikiego (nie otyłym, myszy CD-I ważące 35-40 g) podawano rekombinowane mysie białko OB, stosując sposób podobny do opisanego w przykładach 13 i 14. Uzyskano następujące wyniki (w % utraty podstawowego ciężaru ciała, mierzonej, w.):
Tabela 10
Odpowiedź na dawkę przy ciągłym podawaniu.
Dawka Czas % Redukcji ciężaru ciała
0.03 mg/kg/dzień dzień 1 3.5%
1 mg/kg/dzień dzień 2 7.5 %
1 mg/kg/dzień dzień 3 14%
Jak widać, zwiększenie dawki od 0,03 mg/kg/dzień do 1 mg/kg/dzień zwiększało utratę ciężaru ciała od 3,5% do 7,5%. Należy zauważyć, że w dniu 14 dawka 1 mg/kg/dzień wywołała 14% utratę ciężaru ciała.
Przykład 16: wpływ leptyny na skład ciała myszy ob/ob
16-tygodniowe myszy C57B1/6J ob/ob traktowano dawką5 μ/g/dzień leptyny, nośnika albo nic nie podawano przez 33 dni. W drugim doświadczeniu, 7 tygodniowe myszy ob/ob traktowano dawką 10 pg/g/dzień leptyny, nośnika albo nic nie podawano przez 12 dni. Myszy zabito i badano ciężar ciała, skład ciała, poziom insuliny i glukozy. Wyniki przedstawiono w tabeli 11.
183 352
Tabela 11
Ciężar ciała, kompozycja, poziom insuliny i glukozy u myszy leczonych.
Grupa leczona 16 Tygodniowe myszy, 5 pg/g/ dzień leptyny 7 Tygodniowe myszy, 10 pg/g/dzień leptyny
leczenia mysia leptyna nośnik kontrola ludzka leptyna mysia leptyna nośnik
całkowity ciężar ciała 31.90*2.8 64.10*4.5 67.50*4.5 31.00*1.3 33.40*2.4 42.70*1.5
tłuszcz całkowity (g) % 9.10*1.7 28.40*3.4 38.30*4.0 59.70*2.1 40.87*6.1 60.34*3.7
beztłuszczowa masa całkowita (g) % 6.80*1.0 21.30*1.7 7.60*0.4 11.90*1.2 7.73*0.5 11.57*1.6
woda całkowita (g) % 16.00*0.8 50.30*4.2 18.20*0.7 28.40*1.0 18.90*1.0 28.10*2.2
insulina (UlU/ml) <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 <2.0
glukoza (mg/dl) 170.0*20.9 337*30.3 317.5*51.0 258.3*26.8 320.0*44.0 798.0*152.1
Dane dotyczące kompozycji ciała pokazują wpływ leptyny na trzy przedziały ciała: ciężar tłuszczu, beztłuszczowy ciężar ciała i ciężar wody. Dane wskazują że leptyna znacznie zmniejsza ciężar tłuszczu i wykazuje marginalny wpływ na beztłuszczowy ciężar ciała. Jednakże, wpływ na beztłuszczowy ciężar ciała. Jednakże, wpływ na beztłuszczowy ciężar ciała nie był istotny statystycznie.
Porównanie poziomów glukozy i insuliny u myszy leczonych leptyną i kontrolnych pokazuje, że leptyna zmniejsza ilość cukru we krwi i poziom insuliny, łagodząc objawy cukrzycy.
Przykład 17: wpływ dużej dawki leptyny na myszy typu dzikiego
Szczupłe kontrolne myszy ob/ob (C57B1/6J +/?) nastrzykiwano codziennie i.p. 10 μ/g mysiej leptyny albo nośnika (PBS) i mierzono ciężar ciała i ilość przyjmowanego pożywienia w ciągu dwóch tygodni. Występowało zanczne zmniejszenie ciężaru ciała od 4 dnia i istotne zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia w ciągu pierwszego tygodnia. Jednakże, po tygodniu, ilości przyjmowanego pożywienia stały się identyczne w obu grupach myszy. Zwierzęta zabijano pod koniec drugiego tygodnia i badano kompozycję ciała. Wyniki badania pokazano na tabeli 12. Wyniki pokazują zmniejszenie ilości tłuszczu w ciele zwierząt otrzymujących leptynę w porównaniu ze zwierzętami otrzymującymi PBS.
Tabela 12
Kompozycja ciała i ciężar myszy typu dzikiego (+/?)
Grupa C57B1/6J Ciężar ciała Tk. tłuszczowa całkowita % Beztłuszczowy ciężar ciała % Woda całkowita %
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Białko 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 17.3 20.5 16.9 18.3 17.7 18.7 15.7 16.4 16.5 14.9 0.30 2.39 0.34 0.84 0.44 2.56 0.37 0.29 0.83 1.71 % 11.65% 1.99% 4.62 % 2.51 % 13.72 % 2.38 % 1.79% 5.05 % 5.00 5,41 4.76 5.16 4.96 4.84 4.53 4.51 4.67 28.93 % 26.40% 28.19% 28.17% 28.00 % 25.86 % 28.83 % 27.48 % 28.29 % 12.00 12.70 11.80 12.30 12.30 11.30 10.80 11.60 11.00 10.40 69.36 % 61.95% 69.82 % 67.21 % 69.49 % 60.43 % 68.79 % 70.73 % 66.67 % 69.80 %
Avg. Std. Dev. 17.3 1.6 0.93 0.90 5.04 % 4.52 % 4.87 0.30 27.79 % 1.05% 11.62 0.74 67.43 % 3.52 %
183 352 cd. tabeli 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9
11 18.8 1.30 6.93 % 5.00 26.58 % 12.50 66.49 %
12 17.6 2.17 12.34% 4.53 25.73 % 10.90 61.93 %
13 18.0 2.29 12.74% 4.61 25.59 % 11.10 61.67 %
14 19.6 3.79 19.34% 4.61 23.52 % 11.20 57.14 %
Nośnik 15 18.6 2.35 12.65% 4.75 25.52 % 11.50 61.83 %
16 17.3 1.96 11.32% 4.54 26.25 % 10.80 62.43 %
17 19.3 1.38 7.12% 5.02 26.04 % 12.90 66.84 %
18 20.6 4.16 20.19% 4.94 23.98 % 11.50 55.83 %
19 20 17.7 19.5 1.08 6.13% 4.72 26.64 % 11.90 12.30 67.23 % 63.08 %
Avg. Std. 18.7 2,28 12.09% 4.75 25.54 % 11.66 62.45 %
Dev. 1.1 1.07 5.08 % 0.20 1.10% 0.72 3.83 %
Drugie doświadczenie pokazuje wpływ dwukrotnego w ciągu dnia podawania zastrzyków i. p. 12,5 pg/g mysiej leptyny myszom typu dzikiego C57B1/6J +/?. Występowało istotne zmniejszenie ciężaru ciała i ilości przyjmowanego pożywienia związane z dwukrotnym w ciągu dnia podawaniem leptyny. W tym doświadczeniu, zwierzęta umieszczono w komorach metabolicznych. Pożywienie składało się ze sproszkowanego pożywienia Purina #5001. Różniło się ono od stosowanego w poprzednich doświadczeniach, które składało się z pożywienia hodowanego, tapioki i wody. Tak więc, pożywienie stosowane w komorach metabolicznych miało wyższą wartość energetyczną, co wyjaśnia różnice w spożywanej ilości w porównaniu z pożywieniem zawierającym wodę.
Wynalazek może być wykonywany w innych postaciach bez oddalania się od jego ducha i charakterystyki. Niniejsze ujawnienie należy więc rozważać jako ilustratywne, a nie ograniczające, zaś jego zakres wskazany jest przez dołączone Zastrzeżenia Patentowe, a wszystkie nasuwające się odmiany w rozumieniu i zakresie są nimi również objęte.
Wynalazek w postaci zastrzeganej jest możliwy zgodnie z powyższym opisem i dostępnymi materiałami wyjściowymi i literaturą. Mimo to jednak, zgłaszający zdeponował 9 sierpnia 1995, w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvill, MD 20852-1178, USA zgodnie z Traktatem Budapeskim depozyt do celów wynalazku: E. coli HI4 niosący plazmid pETH14, i E. coli M9 niosący plazmid pETM2.
Literatura
Bahary et. al., Genomics, 11:33-47 (1991).
Bahary et. al., Genomics, 13:761-769 (1992).
Bahary et.al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991).
Blank et. al., Mammalian Genome, I:s51-s78 (1991).
Bogardus et. al., Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100-115 (1991).
Friedman et. al., Mammalian Genome, 1:130-144 (1991).
Harris, FASEBJ., 4:3310-3318 (1990).
Jacobowitz et.al., N. Engl. J. Med. 315:96-100 (1986).
Kessey, in Obesity, pp. 144-166, Stunkard ed., Philadelphia, W. B. Sauders Co. (1980).
Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22 (1986).
Leibel eta/.,”Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity”, in Genetic Yariation andNutrition, pp. 90-101.1, Simopoulos andChilds eds., S. Karger, Basel (1990)
Siegel et. al., Cytogenet. Celi Genet., 61(3):184-185 (1992).
183 352
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 99 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Klaubner & Jackson (B) ULICA: 411 Hackensack Avenue (C) MIASTO: Hackensack (D) STAN: New Jersey (E) PAńSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY: 07601 (v) POSTAĆ AKCEPTOWALNA DLA KOMPUTERA:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln rei.#1.0, wer. 1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGłOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/483,211 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 7 czerwca 1995 (C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/438,431 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 10 maja 1995 (C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/347,563 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 30 listopada 1994 (C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/292,345 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 17 sierpnia 1994 (C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:
(A) NAZWIZKO: Jackson Esq., David A.
(B) Nr REJESTRACYJNY: 26,742 (C) Nr SPRAWY: 600-1-087 PCT (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: 201 487-5800 (B) TELEFAKS: 201 343-1684 (C) TELEKS: 133521
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2793 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (A) OPIS: cDNA mysiego ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: mysz (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 57..560 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1
GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA
ATG Met 1 TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC Ser TAT Tyr 15 CTG Leu
Cys Trp Arg Pro 5 Leu Cys Arg Phe Leu 10 Trp Leu Trp
TCT TAT GTT CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA
Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys
20 25 30
ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT
Gin Ser Val Ser Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
GGG CTT CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA
Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala
65 70 75 80
104
152
200
243
296
183 352
GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344
Val Tyr Gin Gin Val 85 Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin
90 95
ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC. CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392
Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala
100 105 110
TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440
Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro
115 120 125
GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488
Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val
130 135 140
GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG 536
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin
145 150 155 160
TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG C 3CCACCAGGC TCCCAAGA 588
Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys ★
165
ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC 64 8
ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA 708
CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG 768
AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG 828
TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA 888
GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA 948
GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT 1008
TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCUTITT CAGGCTTTGG 10bU
GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG 1128
CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG 1188
TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG 1248
ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA 1308
AGCAGATGAA TTTTGTĆAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG 13 68
TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT 1428
TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG 1488
ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA 1548
183 352
AAGCTACAGG CCTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACATTTGA 1608
GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTTGAT 1668
CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA 1728
TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCATTCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT 1788
GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT 1848
GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG 1908
CTTGGG'iTi'r TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT 1968
GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT 2028
CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG 2088
TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG 2148
GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA 2208
GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TATTGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC 2268
CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA 2328
TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTG GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA 2388
TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA CATGAAGTTC 2448
ΑΊΤΓΑΤΑΤΤΤ CATAATACCG TATAGACACT GCTTGAAGTG TAGTTTTATA CAGTGTTTTA 2508
AATAACGTTG TATGCATGAA ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA 2568
CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT 2628
AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC 2688
TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTTTTGTG 2748
GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC 2793
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 168 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: mysi polipeptyd ob
183 352 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW
Nr
Met 1 Cys Trp Arg Pro 5 Leu Cys Arg Phe Leu 10 Trp Leu Trp Ser Tyr 15 Leu
Ser Tyr Val Gin 20 Ala Val Pro Ile Gin 25 Lys Val Gin Asp Asp 30 Thr Lys
Thr Leu Ile 35 Lys Thr Ile Val Thr 40 Arg Ile Asn Asp Ile 45 Ser His Thr
Gin Ser 50 Val Ser Ala Lys Gin 55 Arg Val Thr Gly Leu 60 Asp Phe Ile Pro
Gly 65 Leu His Pro Ile Leu 70 Ser Leu Ser Lys Met 75 Asp Gin Thr Leu Ala 80
Val Tyr Gin Gin Val 85 Leu Thr Ser Leu Pro 90 Ser Gin Asn Val Leu 95 Gin
Ile Ala Asn Asp 100 Leu Glu Asn Leu Arg 105 Asp Leu Leu His Leu 110 Leu Ala
Phe Ser Lys 115 Ser Cys Ser Leu Pro 120 Gin Thr Ser Gly Leu 125 Gin Lys Pro
Glu Ser 130 Leu Asp Gly Val Leu 135 Glu Ala Ser Leu Tyr 140 Ser Thr Glu Val
Val 145 Ala Leu Ser Arg Leu 150 Gin Gly Ser Leu Gin 155 Asp Ile Leu Gin Gin 160
Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys ★
165 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 700 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (A) OPIS: cDNA ludzkiego ob, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek
183 352 (ίχ) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 46..546 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 3.
NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG54
Met His Trp 1
GGA ACC CTG TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC102
Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe TyrVal
1015
CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC150
Gin Ala Val Pró Ile Gin Lys Val Giń Asp Asp Thr Lys Thr LeuIle
25 3035
AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC198
Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val
4550
TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC246
Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His
6065
CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA294
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin
7580
CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC342
Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile Ser Asn
9095
GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG390
Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe SerLys
100 105 110115
AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG438
Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp SerLeu
120 125130
GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG486
Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val AlaLeu
135 140145
AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC534
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu AspLeu
150 155160
AGC CCT GGG TGC TGAGGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT Ser Pro Gly Cys
165
585
183 352
TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCA.GGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC 645
CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG 700 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 167 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: polipeptyd ludzkiego ob (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 4
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 1015
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 2530
Thr Leu Ile 35 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
40 45
Gin Ser Val 50 Ser Ser Lys Gin Lys Val 55 Thr Gly Leu Asp 60 Phe Ile Pro
Gly 65 Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser 70 Lys Met Asp Gin 75 Thr Leu Ala 80
Val Tyr Gin Gin Ile 85 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn 90 Val Ile 95 Gin
Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala
100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu
115 120125
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135140
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 145 150 155160
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 166 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: Mysi polipeptyd ob pozbawiony Gin w pozycji 49 (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 5
Met Cys 1 Trp Arg Pro 5 Leu Cys Arg Phe Leu Trp 10 Leu Trp Ser 15 Leu
Ser Tyr Val Gin 20 Ala Val Pro Ile Gin 25 Lys Val Gin Asp Asp 30 Thr Lys
Thr Leu Ile Lys 35 Thr Ile Val Thr 40 Arg Ile Asn Asp Ile 45 Ser His Thr
Ser Val 50 Ser Ala Lys Gin Arg Val 55 Thr Gly Leu Asp 60 Phe Ile Pro Gly
Leu His 65 Pro Ile Leu Ser 70 Leu Ser Lys Met Asp 75 Gin Thr Leu Ala Val 80
Tyr Gin Gin Val Leu 85 Thr Ser Leu Pro Ser Gin 90 Asn Val Leu Gin 95 Ile
Ala Asn Asp Leu 100 Glu Asn Leu Arg Asp 105 Leu Leu His Leu Leu 110 Ala Phe
Ser Lys Ser Cys 115 Ser Leu Pro Gin 120 Thr Ser Gly Leu Gin 125 Lys Pro Glu
Ser Leu 130 Asp Gly Val Leu Glu Ala 135 Ser Leu Tyr Ser 140 Thr Glu Val Val
Ala Leu 145 Ser Arg Leu Gin 150 Gly Ser Leu Gin Asp 155 Ile Leu Gin Gin Leu 160
Asp Val Ser Pro Glu Cys
165
100
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 167 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: ludzki polipeptyd ob pozbawiony Gin w pozycji 4 9 (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 6
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu
1015
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys
2530
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 4045
Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly
5560
Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val
70 7580
Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile
9095
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe
100 105110
Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp
115 120125
Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val
130 135140
Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu
145 150 155160
Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165
183 352
101 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 175 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (A) OPIS: egzon (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr? GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC60
NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG120
ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG175 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) (B) (C) (D)
DŁUGOŚĆ: 18 par zasad RODZAJ: kwas nukleinowy NICIOWOŚĆ: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter 5' PCR dla egzonu 2G7 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 8
CCAGGGCAGG AAAATGTG
102
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter 3' PCR dla egzonu 2G7 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 9
CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: domniemana N-końcowa sekwencja peptydowa (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 10
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu i 5 10 15
Ser Tyr Val Gin Ala Val Pro 20
183 352
103 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 287 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (plazmid) (A) OPIS: wektor ekspresyjny pET-15b (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: promotor T7 (B) POŁOŻENIE: 20..37 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: operator lac (B) POŁOŻENIE: 39..64 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 108..243 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: znacznik His (B) POŁOŻENIE: 123..137 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce cięcia trombiny (B) POŁOŻENIE: 184..196 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 11
AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA
TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC
Met Gly Ser
AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC His 10 AGC Ser AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC Gly AGC Ser
Ser His 5 His His His His Ser Gly Leu Val 15 Pro Arg
CAT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG
His 20 Met Leu Glu Asp Pro 25 Ala Ala Asn Lys Ala Arg 30 Lys Glu Ala Glu 35
TTG Leu GCT Ala GCT Ala GCC Ala ACC Thr 40 GCT Ala GAG Glu CAA Gin TAA ★ CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT
116
164
212
263
AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG
287
104
183 3S2 (2)· INFORMACJA. DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 45 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS:
(ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 12
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 1015
Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys 20 2530
Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gin
3540 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: mysi starter 5' (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 13
CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 14 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: mysi starter 3' (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 14
TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC
183 352
105 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: ludzki starter 5' (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 15
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 16 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: ludzki starter 3' (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 16
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 11 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (A) OPIS: miejsce akceptorowe składania w ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce akceptorowe składania (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 17
ACCACTGGGT A
106
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nt: 18 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: fragment peptydu ob (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 18
Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 15 10 15 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: fragment peptydu ob (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 19
Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 15 10 15 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: fragment peptydu ob (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 20
Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu 15 10 15
Ser Leu Asp
183 352
107 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 21 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: fragment peptydu ob (v) RODZAJ FRAGMENTU: koniec karboksylowy (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 21
Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val 15 10 15
Ser Pro Glu Cys 20
108
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 22 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 414 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójną (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (A) OPIS: część ludzkiego genu ob obejmująca nie kodującą sekwencję powyżej pierwszego kodonu, sekwencję kodującą pierwszego kodonu i region 5' pierwszego intronu (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 38..181 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: region 5' pierwszego intronu (B) POŁOŻENIE; 182..414 (ix) CECHA;
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja nie kodująca 5' ludzkiego genu ob, z której powstał starter HOB IgF (B) POŁOŻENIE: 11..28 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja intronowa ludzkiego genu ob, z której powstał- starter HOB IgR (B) POŁOŻENIE: 241..260 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 22
GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55
Met His Trp Gly Thr Leu
5
TGC GGA TTC Phe TTG TGG CTT Leu TGG Trp CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG Val 103
Cys Gly Leu 10 Trp Pro Tyr 15 Leu Phe Tyr Val Gin 20 Ala
CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT 151
Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile
25 30 35
GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201
Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
40 45
CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261
AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321
TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381
GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414
183 352
109 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 23 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 48 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: fragment N-końcowy ludzkiego białka ob kodowany przez pierwszy egzon (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: mysz człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 23
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 1015
Phe Tyr Val Gin Ala Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 2530
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 4045 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 24 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 801 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (A) OPIS: część ludzkiego genu ob obejmująca region 3' pierwszego intronu, sekwencję kodującą drugiego egzonu i nie kodującą sekwencję 3' (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (Vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 291..648 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: 5' pierwszego intronu (B) POŁOŻENIE: 1..290 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja intronowa ludzkiego genu ob HOB, z której powstał starter HOB 2gF (B) POŁOŻENIE: 250..269 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: nie kodująca sekwencja 3' ludzkiego genu ob, z której powstał starter HOB 2gR (B) POŁOŻENIE: 707..728
110
183 352 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW.. Nr 24
CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA Gin Ser 1
GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu 5 1015
CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTCTAC
His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala ValTyr
2530
CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC. GTG ATC CAA ATATCC
Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin IleSer
40 4550
AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTCTCT
Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala PheSer
6065
AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GACAGC
Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu AspSer
7580
CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTGGCC
Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val ValAla
9095
CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTGGAC
Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin LeuAsp
100 105110
CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA Leu Ser Pro Gly Cys 115
GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC
TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG
120
180
240
296
344
392
440
488
536
584
632
688
748
801
183 352
111 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 25 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 119 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: część C-końcowa ludzkiego białka ob, na przez drugi egzon kodowa(ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 25
Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile 15 Pro
1 5 10
Gly Leu His Pro Ile 20 Leu Thr Leu Ser Lys 25 Met Asp Gin Thr 30 Leu Ala
Val Tyr Gin 35 Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro 40 Ser Arg Asn 45 Val Ile Gin
Ile Ser Asn 50 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp 55 Leu Leu 60 His Val Leu Ala
Phe Ser Lys 65 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala 70 Ser Gly 75 Leu Glu Thr Leu 80
Asp Ser Leu Gly Gly 85 Val Leu Glu Ala Ser 90 Gly Tyr Ser Thr Glu 95 Val
Val Ala Leu Ser Arg 100 Leu Gin Gly Ser Leu 105 Gin Asp Met Leu 110 Trp Gin
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 26 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: drożdże Pichia (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 26
Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 1 5
112
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 27 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: drożdże Pichia (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 27
Glu Ala Glu Ala 1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 28 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: drożdże Pichia (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 28 Leu Glu Lys Arg (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 2 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter HOB lgF otrzymany z nie kodującej sekwencji 5' ludzkiego genu ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 29
CCCAAGAAGC CCATCCTG
183 352
113 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 30 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter HOB IgR otrzymany z sekwencji pierwszego intronu ludzkiego genu ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 30
GACTATCTGG GTCCAGTGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 31 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter HOB 2gF otrzymany z sekwencji pierwszego intronu ludzkiego genu ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 31
CCACATGCTG AGCACTTGTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 32 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter HOB 2gR otrzymany z nie kodującej sekwencji 3' ludzkiego genu ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak
114
183 352 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 32 CTTCAATCCT GGAGATACCT GG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 33 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: kołowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (A) OPIS:miejsce klonowania pPIC.9 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 33
CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G 51 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 34 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: sarter 5' PCR do amplifikacji sekwencji cDNA ludzkiegi ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 34
GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 35 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter 3' PCR do amplifikowania sekwencji cDNA ludzkiego ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 35
GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C
183 352
115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 36 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter 5' do amplifikowania mysiej sekwencj i cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 36
GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 37 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter 3' do amplifikowania mysiej sekwenc j i cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: tak (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 37
GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C 31 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 38 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: tetrapeptyd końca N renaturowanego mysiego białka ob po cięciu trombiną (Vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: mysz (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 38
Gly Ser His Met
116
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 39 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1734 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 39
CAAGACAAAT GAGATAAGG 19 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 40 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1734 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 40
AGAGTTACAG CTTTACAG 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 41 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS494 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie
183 352
117 (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 41
CTAAACACCT TTCCATTCC 19 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 42 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS494 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 42
TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 43 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS883 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 43
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG
118
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 4 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS883 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 44
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 45 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS2359 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 45
AGTGTTGTGT TTCTCCTG
183 352
119 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 46 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2359 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 46
AAAGGGGATG TGATAAGTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 47 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2336 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 47
GGTGTTACGT TTAGTTAC
120
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr:. 48 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2336 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 48
GGAATAATGA GAGAAGATTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 4 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS1218 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 49
GCTCAACTGA CAGAAAAC
183 352
121 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 50 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1218 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 50
GACTATGTAA AAGAAATGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 51 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1402 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 51 aaagggcttc taatctac
122
183 352 (2) INFORMACJA. DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 52 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1402 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 52
CCTTCCAACT TCTTTGAC 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 53 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS999 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 53
TAAACCCCCT TTCTGTTC
183 352
123 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 54 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS999 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (Vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 54
TTGCATAATA GTCACACCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 55 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1751 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 55
CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG
183 352
124 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 56 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1751 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 56
AAACCGAAGT TCAGATACAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 57 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1174 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 57
AATATCTGAC ATTGGCAC
183 352
125 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 58 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1174 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 58
TTAGACCTGA GAAAAGAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 59 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2061 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 59
GTTGCACAAT ACAAAATCC
126
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 60 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2061 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 60
CTTCCATTAG TGTCTTATAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 61 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2588 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 61
ATCACTACAC ACCTAATC
183 352
127 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 62 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2588 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 62
CCATTCTACA TTTCCACC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 63 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS808 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 63
GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA
128
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 64 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS808 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 64
TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 65 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1392 do PCR, miejscowo swo.isty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 65
CTCAGGTATG TCTTTATC
183 352
129 (2) INFORMACJA. DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 66 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1392 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 66
TGTCTCTGCA TTCTTTTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 67 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS1148 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 67
GACACATACA AACACAAG
130
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 68 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1148 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 68
ATTGAGTTGA GTGTAGTAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 69 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1529 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 69
CAGGGATTTC TAATTGTC
183 352
131 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 70 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS1529 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencj ą (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 70
AAAAGATGGA GGCTTTTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 71 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2619 do PCR, miejscowo swo-isty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 71
CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G
132
183 352 (2) INFORMACJĄ DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 72 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS2619 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 72
TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 73 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS404 do PCR, miejscowo swoisty /znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr
ACCAGGGTCA atacaaag
183 352
133 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 74 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter sWSS404 do PCR, miejscowo swoisty/ znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 74
TAATGTGTCC TTCTTGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 75 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS2367 do PCR, miejscowo swo.isty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 75
CAATCCTGGC TTCATTTG
134
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 7 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter SWSS2367 do PCR, miejscowo swoisty/znakowany sekwencją (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 76
AAGGTGGGTA GGATGCTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 77 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik UT528 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 77
TGCAGTAAGC TGTGATTGAG
183 352
135 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 78 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik UT528 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 78
GTGCAGCTTT AATTGTGAGC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 7 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMaO65zg9 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 79
AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT
183 352
136 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 80 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMa065zg9 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 80
GGTCAGCAGC ACTGTGATT 19 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 81 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMal25whl (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 81
TCACCTTGAG ATTCCATCC 19
183 352
137 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 82 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMal25whl (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 82 AACACCGTGG TCTTATCAAA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 8 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM309yfl0 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 83
CATCCAAGTT GGCAGTTTTT
138
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 8 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM309yfl0 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 84
AGATGCTGAA TTCCCAGACA 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 8 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM218xflO (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 85
TGGGCAACAC AGCAAA
183 352
139 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 8 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM218xflO (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 86
TGCAGTTAGT GCCAATGTCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 87 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM206xcl (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 87
CCAGGCCATG TGGAAC
140
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 88 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM201xcl (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 88 AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 89 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM199xhl2 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 89
TCTGATTGCT GGCTGC
183 352
141 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 90 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFM199xhl2 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 90
GCGCGTGTGT ATGTGAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 91 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMa345wc9 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 91
AGCTCTTGGC AAACTCACAT
142
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 92 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: znacznik AFMa345wc9 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 92 GCCTAAGGGA ATGAGACACA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 93 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (starter) (A) OPIS: starter do mysiego genu Pax4 (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: człowiek (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 93
GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG
183 352
143 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 94 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 491 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (A) OPIS: Re kombinowany mysi met ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE:
(A) ORGANIZM: mysz (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 41..478 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 94
TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG 55
Met 1 Val Pro Ile Gin 5
AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT 103
Lys Val Gin Asp Asp 10 Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 15 Ile Val Thr 20 Arg
ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GTT 151
Ile Asn Asp Ile Ser 25 His Thr Gin Ser Val Ser Ala 30 Lys Gin 35 Arg Val
ACC GGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC TTG TCC 199
Thr Gly Leu Asp Phe 40 Ile Pro Gly Leu His Pro Ile 45 Leu 50 Ser Leu Ser
AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG 247
Lys Met Asp Gin Thr 55 Leu Ala Val Tyr Gin Gin Val 60 65 Leu Thr Ser Leu
CCG TCC CAG AAC GTT CTT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC 295
Pro Ser Gin Asn Val 70 Leu Gin Ile Ala Asn Asp Leu 75 80 Glu Asn Leu Arg 85
GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343
Asp Leu Leu His Leu 90 Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 95 Ser Leu Pro 100 Gin
ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA 391
Thr Ser Gly Leu Gin 105 Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 110 Val Leu 115 Glu Ala
TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439
Ser Leu Tyr Ser Thr 120 Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 125 Leu 130 Gin Gly Ser
CTT CAG GAC ATC CTT Leu Gin Asp Ile Leu CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG Gin Gin Leu Asp Val Ser Pro GAA Glu TGT Cys TAATGGA 488
135 140 145
TCC
491
144
183 352 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 95 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 146 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: Rekombinowane mysie białko met ob (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 95
Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 15 10is
Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 2530
Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 4045
Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 5560
Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile Ala Asn Asp 65 70 7580
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 9095
Cys>. Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp
100 105110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120125
Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser 130 135140
Pro Glu Cys 145 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 96 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 454 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (A) OPIS: Rekombinowany ludzki met ob (iii) HIPOTETYCZNY: nie (vi) ANTYSENS: nie (vi) POCHODZENIE: (A) ORGANIZM: człowiek (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 4..444 (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 96
183 352
145
CAT ATG GTA CCG ATC CAG AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT 48
Met Val 1 Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile
5 10 15
AAA ACG ATC GTT ACG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTG 96
Lys Thr Ile Val Thr 20 Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 25 Gin Ser Val 30
AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC 144
Ser Ser Lys Gin 35 Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Tle Pro 40 Gly Leu His 45
CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192
Pro Ile Leu 50 Thr Leu Ser Lys Met 55 Asp Gin Thr Leu Ala 60 Val Tyr Gin
CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC 240
Gin Ile Leu 65 Thr Ser Met Pro Ser 70 Arg Asn Val Leu Gin 75 Ile Ser Asn
GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA 288
Asp 80 Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu 85 Leu His Val Leu Ala 90 Phe Ser Lys 95
TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336
Ser Cys His Leu Pro 100 Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 105 Asp Ser Leu 110
GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG 384
Gly Gly Val Leu 115 Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 120 Val Ala Leu 125
TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG 432
Ser TCT Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 130 135 140 CCG GGT TGT TAATGGATCC Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Leu Asp Leu Nr: 97 454
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 147 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (A) OPIS: Rekombinowane ludzkie białko met ob (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 97
146
183 352
Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 15 1015
Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 2530
Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 4045
Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 5560
Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gin Ile Ser AsnAsp
70 7580
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser LysSer
9095
Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105HO
Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120125
Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser
130 135140
Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACJA. DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 98 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: N-końcowy znacznik His (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 98 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 99 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (A) OPIS: N-końcowy znacznik His (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 99
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15
Arg Gly Ser Pro 20
183 352
GGATCCCTGCTCCAGCA6CTGCAAG6TGCAA6AAGAA6AAGATCCCAGG6AGGAAAATGTG 61 M-C 2
CTGGAGACCCCTGTGTCGGTTCCTGTGGdTTGGTCCTATCTGTCTTATGTTCAAGCAGT121
W R P L C R F L W L W S Y L S __Y V Q A V22
GCCTATCCAGAAAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACCATTGTCACCAGGAT181
PIQKVQDDTKTLIKTIVTRI42
CAATGACATTTCACACACGCAGTCGGTATCCGCCAAGCAGAGGGTCACTGGCTTGGACTT241
NDISHTQSVSAKQRVTGLDF62
CATTCCTGGGCTTCACCCCATTCTGAGTTTGTCCAAGATGGACCAGACTCTGGCAGTCTA301
I PGLHPILSLSKMDQTLAVY82
TCAACAGGTCCTCACCAGCCTGCCTTCCCAAAATGTGCTGCAGATAGCCAATGACCTGGA361
QQVLTSLPSQNVLQIANDLE102
GAATCTCCGAGACCTCCTCCATCTGCTGGCCTTCTCCAAGAGCTGCTCCCTGCCTCAGAC421
NLRDLLHLLAFSKSCSLPOT122
CAGTGGCCTGCAGAAGCCAGAGAGCCTGGATGGCGTCCTGGAAGCCTCACTCTACTCCAC481
SGLQKPESLDGVLEASLYST142
FIG. 1A
183 352
AGAGGTGGTGGCTTTGAGCAGGCTGCAGGGCTCTCTGCAGGACATTCTTCAACAGTTGGA 541
EVVALSRLQGSLQDILQQLD 162
TGTTAGCCCTGAATGCTGAAGTTTCAAAGGCCACCAGGCTCCCAAGAATCATGTAGAGGG 601
V S P E C * 167
AAGAAACCTTGGCTTCCAGGGGTCTTCAGGAGAAGAGAGCCATGTGCACACATCCATCAT 661
TCATTTCTCTCCCTCCTGTAGACCACCCATCCAAAGGCATGACTCCACAATGCTTGACTC 721
AAGTTATCCACACAACTTCATGAGCACAAGGAGGGGCCAGCCTGCAGAGGGGACTCTCAC 781
CTAGTTCTTCAGCAAGTAGAGATAAGAGCCATCCCATCCCCTCCATGTCCCACCTGCTCC 841
GGGTACATGTTCCTCCGTGGGTACACGCTTCGCTGCGGCCCAGGAGAGGTGAGGTAGGGA 901
TGGGTAGAGCCTTTGGGCTGTCTCAGAGTCTTTGGGAGCACCGTGAAGGCTGCATCCACA 961
CACAGCTGGAAACTCCCAAGCAGCACACGATGGAAGCACTTATTTATTTATTCTGCATTC 1021
TATTTTGGATGGATCTGAAGCAAGGCATCAGCTTTTTCAGGCTTTGGGGGTCAGCCAGGA 1081
TGAGGAAGGCTCCTGGGGTGCTGCTTTCAATCCTATTGATGGGTCTGCCCGAGGCAAACC 1141
FIG. 1B
183 352
TAATTTnGAGTGACTGGAAGGAAGGTTGGGATCTTCCAAACAAGAGTCTATGCAGGTAG 1201
CGCTCAAGATTGACCTCTGGTGACTGGTTTTGTTTCTATTGTGACTGACTCTATCCAAAC 1261
ACGTTTGCAGCGGCATTGCCGGGAGCATAGGCTAGGTTATTATCAAAAGCAGATGAATTT 1321
TGTCAAGTGTAATATGTATCTATGTGCACCTGAGGGTAGAGGATGTGTTAGAGGGAGGGT 1381
GAAGGATCCGGAAGTGTTCTCTGAATTACATATGTGTGGTAGGCTTTTCTGAAAGGGTGA 1441
GGCATTTTCTTACCTCTGTGGCCACATAGTGTGGCTTTGTGAAAAGGACAAAGGAGTTGA 1501
CTCTTTCCGGAACATTTGGAGTGTACCAGGCACCCTTGGAGGGGCTAAAGCTACAGGCCT 1561
TTTGTTGGCATATTGCTGAGCTCAGGGAGTGAGGGCCCCACATTTGAGACAGTGAGCCCC 1621
AAGAAAAGGGTCCCTGGTGTAGATCTCCAAGGTTGTCCAGGGTTGATCTCACAATGCGTT 1681
TCTTAAGCAGGTAGACGTTTGCATGCCAATATGTGGTTCTCATCTGATTGGTTCATCCAA 1741
AGTAGAACCCTGTCTCCCACCCAnCTGTGGGGAGTTTTGTTCCAGTGGGAATGAGAAAT 1801
CACTTAGCAGATGGTCCTGAGCCCTGGGCCAGCACTGCTGAGGAAGTGCCAGGGCCCCAG 1861
FIG. 1C
183 352
GCCAGGCTGCCAGAATTGCCCnCGGGCTGGAGGATGAACAAAGGGGCTTGGGTTTTTCC 1921
ATCACCCCTGCACCCTATGTCACCATCAAACTGGGGGGCAGATCAGTGAGAGGACACTTG 1981
ATGGAAAGCAATACACTTTAAGACTGAGCACAGTTTCGTGCTCAGCTCTGTCTGGTGCTG 2041
TGAGCTAGAGAAGCTCACCACATACATATAAAAATCAGAGGCTCATGTCCCTGTGGTTAG 2101
ACCCTACTCGCGGCGGTGTACTCCACCACAGCAGCACCGCACCGCTGGAAGTACAGTGCT 2161
GTCTTCAACAGGTGTGAAAGAACCTGAGCTGAGGGTGACAGTGCCCAGGGGAACCCTGCT 2221
TGCAGTCTAnGCATTTACATACCGCATTTCAGGGCACATTAGCATCCACTCCTATGGTA 2281
GCACACTGnGACAATAGGACAAGGGATAGGGGTTGACTATCCCTTATCCAAAATGCnG 2341
GGACTAGAAGAGTTTTGGATTTTAGAGTCTTTTCAGGCATAGGTATATTTGAGTATATAT 2401
AAAATGAGATATCTTGGGGATGGGGCCCAAGTATAAACATGAAGTTCATTTATATTTCAT 2461
AATACCGTATAGACACTGCTTGAAGTGTAGTTTTATACAGTGTTTTAAATAACGTTGTAT 2521
GCATGAAAGACGTTTTTACAGCATGAACCTGTCTACTCATGCCAGCACTCAAAAACCTTG 2581
FIG. 1D
GGGTTTTGGAGCAGTTTGGATCTTGGGTTTTCTGTTAAGAGATGGTTAGCTTATACCTAA 2641
AACCATAATGGCAAACAGGCTGCAGGACCAGACTGGATCCTCAGCCCTGAAGTGTGCCCT 2701
TCCAGCCAGGTCATACCCTGTGGAGGTGAGCGGGATCAGGTTTTGTGGTGCTAAGAGAGG 2761
AGTTGGAGGTAGATTTTGGAGGATCTGAGGGC 2821
FIG. 1E
183 352
___G—GTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCA---TCCTGGGAA GGAAAATGCA 50
TTGGGGAACC CTGTGCGGAF TCHGTGGCI IIGGCCCIAI CIIIICIAIG 100
TCCAAGCTGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG ATGACACCAA AACCCTCATC 150
AAGACAATTG TCACCAGGAT CAATGACATT TCACACACGC AGTCAGTCTC 200
CTCCAAACAG AAAGTCACCG GTTTGGACTT CATTCCTGGG CTCCACCCCA 250
TCCTGACCTT ATCCAAGATG GACCAGACAC TGGCAGTCTA CCAACAGATC 300
CTCACCAGTA TGCCTTCCAG AAACGTGATC CAAATATCCA ACGACCTGGA 350
GAACCTCCGG GATCTTCTTC ACGTGCTGGC CTTCTCTAAG AGCTGCCACT 400
TGCCCTGGGC CAGTGGCCTG GAGACCTTGG ACAGCCTGGG GGGTGTCCTG 450
GAAGCTTCAG GCTACTCCAC AGAGGTGGTG GCCCTGAGCA GGCTGCAGGG 500
GTCTCTGCAG GACATGCTGT GGCAGCTGGA CCTCAGCCCT GGGTGCTGAG 550
FIG. 2A
183 352
GCCTTGAAGG TCACTCTTCC TGCAAGGACT -ACGTTAAGG GAAGGAACTC 600
TGGTTTCCAG GTATCTCCAG GATTGAAGAG CATTGCATGG ACACCCCTTA 650
TCCAGGACTC TGTCAATTTC CCTGACTCCT CTAAGCCACT CTTCCAAAGG 700
FIG. 2B

Claims (91)

1. Polipeptyd otyłości (OB), rekombinowany albo syntetyzowany chemicznie albo jego pochodna, zawierający od około 145 do około 167 aminokwasów, zdolny do modulowania ciężaru ciała zwierzęcia, albo jego odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty, wykazujące tę samą aktywność biologiczną albo fragmenty immunogenne, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowąo Identyfikatorach Sekw. Nr 2,4,5 albo 6, albo ich odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty.
2. Immunogenny fragment polipeptydu OB wybrany z grupy obejmującej:
Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 18);
Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (Identyfikator Sekw. Nr 19);
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser^-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 20) i
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (Identyfikator Sekw. Nr 21);
3. Analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 1, znamienny tym, że jeden lub wiele aminokwasów wybranych z grupy obejmującej aminokwasy w pozycji 53, 71, 85, 89, 92, 98, 110,118,121,122,126,127,128,129,132,139,157,159,163 i 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest innym aminokwasem.
4. Analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 3, znamienny tym, że podstawienie obejmuje różniący się aminokwas mysiego polipeptydu OB jak podany w Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
5. Analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 3, w którym aminokwasem podstawionym jest alanina.
6. Analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 3, znamienny tym, że wybrany jest z grupy polipeptydów w których:
(a) reszta serynowa w pozycji 53 podstawiona została glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną (b) reszta serynowa w pozycji 98 podstawiona została glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną i (c) reszta argininowa w pozycji 92 podstawiona została asparaginą lizyną histydyną glutaminą kwasem glutaminowym, kwasem asparaginowym, seryną treoniną metioniną albo cysteiną.
7. Analog polipeptydu OB według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje 84% albo wyższą homologię sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową ludzkiego polipeptydu OB, podaną w Identyfikatorach Sekw. Nr 2,4, 5 albo 6.
8. Analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy polipeptydów w których:
(a) jedna lub więcej reszt kwasu asparaginowego podstawionych jest kwasem glutaminowym;
(b) jedna lub więcej reszt izoleucynowych podstawionych jest leucyną (c) jedna lub więcej reszt glicynowych albo walinowych jest podstawionych alaniną (d) jedna lub więcej reszt argininowych podstawionych jest histydyną (e) jedna lub więcej reszt tyrozynowych albo fenyloalaninowych jest podstawionych tryptofanem;
(fjjedna lub więcej reszt od 121 do 128 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest glicyną albo alaniną i
183 352 (g) jedna lub więcej reszt w pozycji od 54 do 60 albo od 118 do 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest lizyną, kwasem glutaminowym, cysteiną albo proliną.
9. Polipeptyd OB według zastrz. 1 albo 3, albo 6, znamienny tym, że wybrany jest z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z punktu (a) mających metioninę w pozycj i 21; albo maj ących sekwencj ę glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38) w pozycji od 18 do 21; albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98) w pozycji od 1 do 21.
10. Polipeptyd OB według zastrz. 1 albo 3, albo 6, znamienny tym, że wybrany jest z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z punktu (a) mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizynaarginina-kwas glutaminiowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26) w pozycjach od 14 do 21: albo mających sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-h is tydyna-histy dyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) w pozycjach od 2 do 21, albo mających sekwencję glicyna-serynaprolina w pozycjach od 18 do 21.
11. Polipeptyd OB według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że wybrany jest z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z części (a) mających metioninę w pozycji 21 albo mających sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38) w pozycji od 18 do 21; albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seiyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna -seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98) w pozycji od 1 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy --alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26) w pozycjach od 14 do 21; albo mających sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seiyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) w pozycjach od 2 do 21, albo mających sekwencję glicyna-seryna-prolina w pozycjach od 18 do 21.
12. Okrojony analog ludzkiego polipeptydu OB według zastrz. 2, znamienny tym, że wybrany jest z grupy (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) obejmującej polipeptydy w których:
(a) jedna lub więcej reszt w pozycji od 121 do 128 zostało usuniętych, (b) reszty 1-116 zostały usunięte, (c) reszty 1-21 oraz od 54 do 167 zostały usunięte, (d) reszty 1-60 i od 117 do 167 zostały usunięte, (e) reszty 1 -60 zostały usunięte, (f) reszty 1-53 zostały usunięte, oraz obejmującej (g) analog polipeptydu z punktu (a) w którym usunięte zostały reszty od 1 do 21,
183 352 (h) analog polipeptydu z punktu (a) do (g) mający na swym końcu N aminokwas albo sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) metioninę, (2) sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38), (3) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicy na-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98) (4) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alaninakwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26), (5) sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27), (6) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28), (7) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicynaseryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) i (8) sekwencję glicyna-seryna-prolina.
13. Pochodna polipeptydu OB według zastrz. 1, znamienna tym, że ma przy łączoną jedną lub wiele cząstek chemicznych.
14. Pochodna według zastrz. 13, znamienna tym, że cząsteczką chemiczną jest rozpuszczalny w wodzie polimer.
15. Pochodna według zastrz. 14, znamienna tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest poliglikol etylenowy.
16. Pochodna według zastrz. 15, znamienna tym, że jest mono- di-, tri- albo tetrapegylowana.
17. Pochodna według zastrz. 16, znamienna tym, że jest monopegylowana na końcu N.
18. Pochodna według zastrz. 17, znamienna tym, że polipeptyd OB obejmuje reszty aminokwasowe od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4 albo reszty od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6.
19. Pochodna według zastrz. 17, znamienna tym, że peptyd OB obejmuje reszty aminokwasowe od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4 albo reszty od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6 i mająca metioninę w pozycji 21.
20. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd otyłości OB, rekombinowany albo syntetyzowany chemicznie albo jego pochodną zawierający od około 145 do około 167 aminokwasów, zdolny do modulowania ciężaru ciała zwierzęcia, albo jego odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty, wykazujące tę samą aktywność biologiczną, albo fragmenty immunogenne, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową o Identyfikatorach Sekw. Nr 2,4, 5 albo 6, albo ich odmiany alleliczne albo analogi, w tym fragmenty.
21. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że koduje immunogenny fragment polipeptydu OB wybrany z grupy obejmującej:
Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 18);
Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (Identyfikator Sekw. Nr 19);
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 20) i
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (Identyfikator Sekw. Nr 21);
22. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że koduje analog ludzkiego polipeptydu OB, w którym jeden lub wiele aminokwasów wybranych z grupy obejmującej aminokwasy w pozycji 53, 71, 85, 89, 92, 98, 110,118, 121, 122,126, 127, 128,129,132,139,157,159,163 i 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest innym aminokwasem.
183 352
23. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 22, znamienna tym, że koduje analog ludzkiego polipeptydu OB, w którym podstawienie obejmuje różniący się aminokwas mysiego polipeptydu OB jak podany w Identyfikatorze Sekw. Nr 2.
24. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 22, znamienna tym, że koduje analog ludzkiego polipeptydu OB, w którym aminokwasem podstawiającym jest alanina.
25. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 22, znamienna tym, że koduje analog ludzkiego polipeptydu OB w wybrany z grupy polipeptydów, w których:
(a) reszta serynowa w pozycji 53 podstawiona została glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną (b) reszta serynowa w pozycji 98 podstawiona została glicyną alaniną waliną cysteiną metioniną albo treoniną i (c) reszta aigininowa w pozycji 92 podstawiona została asparaginą lizyną histydyną glutaminą kwasem glutaminowym, kwasem asparaginowym, seryną treoniną metioninąalbo cysteiną.
26. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20 albo 22 albo 25, znamienna tym, że koduje polipeptyd OB wybrany z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z punktu (a) mających metioninę w pozycji 21; albo mających sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38) w pozycji od 18 do 21; albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna -seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98) w pozycji od 1 do 21.
27. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że koduje polipeptyd OB wybrany z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z części (a) mających metioninę w pozycji 21 albo mających sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38) w pozycji od 18 do 21: albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-wallina-prolina-arginina-glicyna -seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98) w pozycji od 1 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alanina- kwas glutamino wy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26) w pozycjach od 14 do 21, albo mających sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28) w pozycjach od 18 ¢0 21, albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-serynaglicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) w pozycjach od 2 do 21, albo mających sekwencję glicyna-seryna-prolina w pozycjach od 18 do 21.
28. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że koduje analog polipeptydu OB wykazujący 84% albo wyższą homologię sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową ludzkiego polipeptydu OB, podaną w Identyfikatorze Sekw. Nr 2, 4, 5 albo 6.
29. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że koduje analog ludzkiego polipeptydu OB, który jest wybrany z grupy polipeptydów w których:
(a) jedna lub więcej reszt kwasu asparaginowego podstawionych jest kwasem glutaminowym;
(b) jedna lub więcej reszt izoleucynowych podstawionych jest leucyną (c) jedna lub więcej reszt glicynowych albo walinowych jest podstawionych alaniną (d) jedna lub więcej reszt argininowych podstawionych jest histydyną (e) jedna lub więcej reszt tyrozynowych albo fenyloalaninowych jest podstawionych tryptofanem;
(f) jedna lub więcej reszt od 121 do 128 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest glicyną albo alaniną i
183 352 (g) jedna lub więcej reszt w pozycji od 54 do 60 albo od 118 do 166 (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) podstawionych jest lizyną, kwasem glutaminowym, cysteiną albo proliną.
30. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20 albo 22 albo 25, znamienna tym, że koduje polipeptyd OB wybrany z grupy polipeptydów:
(a) pozbawionych reszt od 1 do 21; i (b) polipeptydów z punktu (a) mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizynaarginina-kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26) w pozycjach od 14 do 21; albo mających sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28) w pozycjach od 18 do 21, albo mających sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-hi s ty dy n a-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-argi- nina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) w pozycjach od 2 do 21, albo mających sekwencję glicyna-seryna-prolina w pozycjach od 18 do 21.
31. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 21, znamienna tym, że koduje okrojony analog ludzkiego polipeptydu OB określony w zastrz. 2, który wybrany jest z grupy (według numeracji Identyfikatora Sekw. Nr 4) obejmującej polipeptydy w których:
(a) jedna lub więcej reszt w pozycji od 121 do 128 zostało usuniętych, (b) reszty 1-116 zostały usunięte, (c) reszty 1-21 oraz od 54 do 167 zostały usunięte, (d) reszty 1-60 i od 117 do 167 zostały usunięte, (e) reszty 1-60 zostały usunięte, (f) reszty 1-53 zostały usunięte, oraz obejmującej (g) analog polipeptydu z punktu (a) w którym usunięte zostały reszty od 1 do 21, (h) analog polipeptydu z punktu (a) do (g) mający na swym końcu N aminokwas albo sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) metioninę, (2) sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38), (3) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicynaseryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98), (4) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alaninakwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26), (5) sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27), (6) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28), (7) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-seryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) i (8) sekwencję glicyna-seryna-prolina.
32. Cząsteczka DNA do zastosowania w zapewnianiu ekspresji polipeptydu OB, mającego aktywność biologiczną modulowania ciężaru ciała ssaka, znamienna tym, że została wybrana z grupy obejmującej:
(a) cząsteczki DNA pokazane jako Identyfikator Sekw. Nr 1 i Nr 3 albo ich fragmenty;
(b) cząsteczki DNA hybrydyzujące z cząsteczkami DNA określonymi wyżej w (a) albo hybrydyzujące z ich fragmentami; i (c) cząsteczki DNA kodujące ekspresję sekwencji aminokwasowych kodowanych przez którąkolwiek z wyżej wymienionych cząsteczek DNA.
33. Cząsteczka DNA według zastrz. 32, znamienna tym, że jest cząsteczką ludzkiego genomowego DNA o Identyfikatorze Sekw. Nr 22 i Nr 24.
183 352
34. Cząsteczka DNA według zastrz. 32, znamienna tym, że koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej sekwencje aminokwasowe podane jako:
(a) Identyfikator Sekw. Nr 2;
(b) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 2;
(c) Identyfikator Sek. Nr 4;
(d) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4;
(e) Identyfikator Sekw. Nr 5;
(f) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 5 i (g) Identyfikator Sekw. Nr 6; i (h) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6, (i) sekwencje aminokwasowe z punktu (b), (d), (f) albo (h) mające na końcu N aminokwas albo sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) metioninę, (2) sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38), (3) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicyna-serynahistydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98).
35. Cząsteczka DNA według zastrz. 34, znamienna tym, że koduje sekwencje aminokwasowe z punktu (b), (d), (f) albo (h) mające na końcu N sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alaninakwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26), (2) sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27), (3) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28), (4) sekwencj ę metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicynaseryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) i (5) sekwencję glicyna-seryna-prolina.
36. Cząsteczka DNA według zastrz. 32, znamienna tym, że obejmuje sekwencję podaną jako kodująca białko sekwencja o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
37. Cząsteczka DNA według zastrz. 32, znamienna tym, że obejmuje sekwencję podaną jako kodująca aminokwasy od 22 do 167 sekwencja o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
38. Cząsteczka kwasu nukleinowego znakowana w sposób możliwy do wykrycia, znamienna tym, że jest zdolna do hybrydyzacji z cząsteczką DNA według jednego z zastrz. od 24 do 31.
39. Kwas nukleinowy zdolny o hybrydyzacji z regionem nie kodującym kwasu nukleinowego OB, znamienny tym, że region niekodujący jest wybrany z grupy obejmującej intron, region nie kodujący 5' albo region nie kodujący 3'.
40. Starter oligonukleotydowy do amplifikacji ludzkiego genomowego DNA kodującego polipeptyd OB, znamienny tym, że został wybrany z grupy obejmującej:
HOB IgF 5'CCCAAGAAGCCCATCCTG-3'(Identyfikator Sekw. Nr 29)
HOB IgR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3'(Identyfikator Sekw. Nr 30)
HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 31)
HOB 2gR 5-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 32)
41. Wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę DNA wybraną z grupy obejmującej:
(a) cząsteczki DNA pokazane jako Identyfikator Sekw. Nr 1 i Nr 3 albo ich fragmenty7;
(b) cząsteczki DNA hybrydyzujące z cząsteczkami DNA określonymi wyżej w (a) albo hybrydyzujące z ich fragmentami; i
183 352 (c) cząsteczki DNA kodujące ekspresję sekwencji aminokwasowych kodowanych przez którąkolwiek z wyżej wymienionych cząsteczek DNA, ewęntualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
42. Wektor ekspresyjny według zastrz. 41, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA będącej cząsteczką ludzkiego genomowego DNA o Identyfikatorze Sekw. Nr 22 i Nr 24, ewentualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
43. Wektor ekspresyjny według zastrz. 41, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej sekwencje aminokwasowe podane jako:
(a) Identyfikator Sekw. Nr 2, (b) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 2;
(c) Identyfikator Sekw. Nr 4;
(d) aminokwasy od 22 do 167 Identyfikatora Sekw. Nr 4;
(e) Identyfikator Sekw. Nr 5;
(f) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 5 i (g) Identyfikator Sekw. Nr 6; i (h) aminokwasy od 22 do 166 Identyfikatora Sekw. Nr 6, (i) sekwencje aminokwasowe z punktu (b), (d), (f) albo (h) mające na końcu N aminokwas albo sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) metioninę, (2) sekwencję glicyna-seryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 38), (3) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicynaseryna-histydyna-metionina (Identyfikator Sekw. Nr 98), ewentualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
44. Wektor ekspresyjny według zastrz. 43, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę kodującą sekwencje aminokwasowe z punktu (b), (d), (f) albo (h) mające na końcu N sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
(1) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina-kwas glutaminowy-alaninakwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 26), (2) sekwencję kwas glutaminowy-alanina-kwas glutaminowy-alanina (Identyfikator Sekw. Nr 27), (3) sekwencję leucyna-kwas glutaminowy-lizyna-arginina (Identyfikator Sekw. Nr 28), (4) sekwencję metionina-glicyna-seryna-seryna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-histydyna-seryna-seryna-glicyna-leucyna-walina-prolina-arginina-glicynaseryna-prolina (Identyfikator Sekw. Nr 99) i (5) sekwencję glicyna-seryna-prolina, ewentualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
45. Wektor ekspresyjny według zastrz. 41, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę obejmującą sekwencję podaną jako kodująca białko sekwencja o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, ewentualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
46. Wektor ekspresyjny według zastrz. 41, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę obejmującą sekwencję podanąjako kodująca aminokwasy od 22 do 167 sekwencja o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, ewentualnie połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
47. Jednokomórkowy gospodarz transformowany albo transfekowany cząsteczką DNA według zastrz. 20 albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31.
48. Jednokomórkowy gospodarz transformowany albo transfekowany wektorem według zastrz. 41 albo 42, albo 43, albo 44, albo 45, albo 46.
49. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 47, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej bakterie, drożdże, komórki ssaków, komórki roślin, komórki owadów oraz komórki ludzkie w hodowli tkankowej.
183 352
50. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 47, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej komórki E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, drożdży, CHO, Rl.l, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 i Sf9.
51. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 47, znamienny tym, że stanowią go drożdże wybrane z grupy obejmującej Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula i Tondopsis.
52. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 48, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej bakterie, drożdże, komórki ssaków, komórki roślin, komórki owadów oraz komórki ludzkie w hodowli tkankowej.
53. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 48, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej komórki E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, drożdży, CHO, Rl.l, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 i S©.
54. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 48, znamienny tym, że stanowiągo drożdże wybrane z grupy obejmującej Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula i Torulopsis.
55. Komórka ssacza zawierająca sekwencję DNA kodującąpolipeptyd OB i zmodyfikowana in vitro w celu umożliwienia silnej ekspresji polipeptydu OB metodami rekombinacji homologicznej, obejmującej wprowadzenie sekwencji regulującej ekspresję w funkcjonalną bliskość z sekwencją kodującą polipeptyd OB.
56. Komórka według zastrz. 55, znamienna tym, że sekwencja regulująca ekspresję jest sekwencją regulując ekspresję polipeptydu OB, zaś zjawisko rekombinacji homologicznej zastępuje zmutowaną sekwencję regulującą ekspresję polipeptydu OB.
57. Komórka według zastrz. 56, znamienna tym, że sekwencja regulująca ekspresję nie jest sekwencją regulującą ekspresję polipeptydu OB.
58. Sposób wytwarzania polipeptydu OB, znamienny tym, że obejmuje:
(a) hodowanie komórki według któregokolwiek z zastrz. od 40 do 46, w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydu OB; i (b) odzyskiwanie ekspresjonowanego polipeptydu OB.
59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że komórka jest bakterią albo komórką drożdży.
60. Sposób według zastrz. 58 albo 59, znamienny tym, że dalej obejmuje:
(c) chromatografię polipeptydu OB na kolumnie chelatującej Ni; i (d) oczyszczanie polipeptydu OB przez filtrację żelową.
61. Sposób według zastrz. 60, dalej obejmujący po etapie (c) i przed etapem (d) chromatografię polipeptydu OB na kolumnie silnej żywicy kationowymiennej.
62. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
63. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
64. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 10, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
65. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 11, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
66. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 58 albo 59, albo 61, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
67. Przeciwciało swoiste dla polipeptydu OB według zastrz. 60, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym, poliklonalnym albo jest znakowane w sposób umożliwiający wykrycie.
183 352
68. Nieśmiertelna linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało monoklonalne według zastrz. 62, albo 63, albo 64, albo 65, albo 66, albo 67, albo. 68.
69. Sposób wytwarzania przeciwciała swoistego wobec polipeptydu OB, znamienny tym, że obejmuje;
(a) koniugowanie polipeptydu OB z białkiem nośnikowym;
(b) immunizowanie zwierzęcia koniugatem fragmentu polipeptydu z białkiem nośnikowym według etapu (a) zmieszanym z adiuwantem; i (c) pozyskiwanie przeciwciał od immunizowanego zwierzęcia.
70. Sposób mierzenia obecności polipeptydu OB w próbce, znamienny tym, że obejmuje, (a) doprowadzenie do kontaktu próbki podejrzewanej o zawartość polipeptydu OB z przeciwciałem, które wiąże swoiście polipeptyd OB w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksów obejmujących przeciwciało i polipeptyd OB; i (b) wykrywanie tworzenia kompleksów reakcji obejmujących przeciwciało i polipeptyd OB w próbce, przy czym wykrycie tworzenia kompleksów świadczy o obecności polipeptydu OB w próbce.
71. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że przeciwciało związane jest podłożem stałym.
72. Sposób in vitro badania poziomu polipeptydu OB w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje:
(a) wykrywanie tworzenia kompleksów w próbce biologicznej, sposobem według zastrz. 70 albo 71; i (b) badanie ilości powstałych kompleksów, która odpowiada poziomowi polipeptydu w próbce biologicznej.
73. Sposób in vitro wykrywania albo diagnozowania istnienia choroby związanej z podwyższonym albo obniżonym poziomem polipeptydu OB u osobnika ssaczego, znamienny tym, że obejmuje:
(a) badanie poziomu polipeptydu OB w próbce biologicznej od osobnika ssaczego, według zastrz. 72; i (b) porównanie poziomu wykrytego w etapie (a) z poziomem polipeptydu OB obecnym u normalnego osobnika albo u tego samego osobnika wcześniej, przy czym podwyższony poziom polipeptydu OB w porównaniu z poziomem normalnym wskazuje na chorobę związaną z podwyższonym poziomem polipeptydu OB, zaś obniżony poziom polipeptydu OB w porównaniu z poziomem normalnym wskazuje na chorobę związaną z obniżonym poziomem polipeptydu OB.
74. Sposób in vitro monitorowania leczenia choroby związanej z podwyższonym albo obniżonym poziomem polipeptydu OB u ssaczego osobnika, obejmujący badanie poziomów polipeptydu OB w szeregu próbek biologicznych uzyskanych w różnych punktach czasowych od osobnika ssaczego poddawanego leczeniu choroby związanej z podwyższonym albo obniżonym poziomem polipeptydu OB, sposobem według zastrz. 72.
75. Kompozycja farmaceutyczna do obniżenia ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano polipeptyd OB według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19.
76. Kompozycja farmaceutyczna do obniżenia ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano polipeptyd OB według zastrz. 9.
77. Kompozycja farmaceutyczna do obniżania ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano polipeptyd OB według zastrz. 10.
78. Kompozycja farmaceutyczna do obniżania ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano polipeptyd OB według zastrz. 11.
183 352
79. Kompozycja farmaceutyczna do obniżania ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB wytworzony sposobem według zastrz. 58 albo 59, albo 61.
80. Kompozycja farmaceutyczna do obniżania ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB wytworzony sposobem według zastrz. 60.
81. Kompozycja farmaceutyczna do zwiększenia ciężaru ciała zwierzęcia, zawierająca substancję czynną i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano antagonistę polipeptyd OB.
82. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 81, znamienna tym, że antagonista jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało, które wiąże i neutralizuje aktywność polipeptydu OB, fragment polipeptydu OB, który wiąże się z, ale nie aktywuje receptora polipeptydu OB, i antagonistę drobnocząsteczkowego polipeptydu OB.
83. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19.
84. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB według zastrz. 9.
85. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowanopolipeptyd OB według zastrz. 10.
86. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano polipeptyd OB według zastrz. 11.
87. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB wytworzony sposobem według zastrz. 58 albo 59, albo 61.
88. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zmniejszania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązastosowano polipeptyd OB wytworzony sposobem według zastrz. 60.
89. Kompozycja kosmetyczna poprawiająca wygląd ciała, do zwiększania ciężaru ciała osobnika, zawierająca substancję czynną i dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zastosowano antagonistę polipeptydu OB.
90. Kompozycja kosmetyczna według zastrz. 89, znamienna tym, że antagonista jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało, które wiąże i neutralizuje aktywność polipeptydu OB, fragment polipeptydu OB, który wiąże się z, ale nie aktywuje receptora polipeptydu OB, i antagonistę drobnocząsteczkowego polipeptydu OB.
91. Proces kosmetyczny poprawiający wygląd ciała osobnika, znamienny tym, że podaje się kompozycję kosmetyczną zawierającą polipeptyd OB albo antagonistę polipeptydu OB, w ilość skutecznej w modulowaniu ciężaru ciała osobnika do pożądanego poziomu.
PL95319021A 1994-08-17 1995-08-17 Modulatory ciężaru ciała, odpowiednie kwasy nukleinowe i białka i ich zastosowanie diagnostyczne i lecznicze PL183352B1 (pl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/292,345 US6001968A (en) 1994-08-17 1994-08-17 OB polypeptides, modified forms and compositions
US08/347,563 US5935810A (en) 1994-08-17 1994-11-30 Mammalian ob polypeptides capable of modulating body weight, corresponding nucleic acids, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US08/438,431 US6429290B1 (en) 1994-08-17 1995-05-10 OB polypeptides, modified forms and derivatives
US08/483,211 US6309853B1 (en) 1994-08-17 1995-06-07 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
PCT/US1995/010479 WO1996005309A2 (en) 1994-08-17 1995-08-17 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL319021A1 PL319021A1 (en) 1997-07-21
PL183352B1 true PL183352B1 (pl) 2002-06-28

Family

ID=27501568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95319021A PL183352B1 (pl) 1994-08-17 1995-08-17 Modulatory ciężaru ciała, odpowiednie kwasy nukleinowe i białka i ich zastosowanie diagnostyczne i lecznicze

Country Status (32)

Country Link
US (1) US6309853B1 (pl)
EP (1) EP0777732B1 (pl)
JP (1) JP3479080B2 (pl)
CN (1) CN1162978B (pl)
AP (1) AP815A (pl)
BG (1) BG64710B1 (pl)
BR (1) BR9508596A (pl)
CA (1) CA2195955C (pl)
CZ (1) CZ295018B6 (pl)
DE (2) DE777732T1 (pl)
EE (1) EE04377B1 (pl)
ES (1) ES2108663T3 (pl)
FI (1) FI121709B (pl)
GB (1) GB2292382B (pl)
GE (1) GEP20022701B (pl)
GR (1) GR970300021T1 (pl)
HK (1) HK1001495A1 (pl)
HU (1) HU223563B1 (pl)
IL (2) IL114987A (pl)
IS (1) IS4416A (pl)
LV (1) LV11868B (pl)
MD (1) MD2311G2 (pl)
MX (1) MX9701200A (pl)
NO (2) NO323847B1 (pl)
NZ (1) NZ291689A (pl)
OA (1) OA10596A (pl)
PL (1) PL183352B1 (pl)
RO (1) RO121036B1 (pl)
SI (1) SI9520090A (pl)
SK (1) SK287191B6 (pl)
TR (1) TR199501021A2 (pl)
WO (1) WO1996005309A2 (pl)

Families Citing this family (334)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310034B1 (en) 1993-05-21 2001-10-30 Ut-Battelle, Llc Agouti polypeptide compositions
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
US5827734A (en) * 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
US5858967A (en) * 1995-01-20 1999-01-12 University Of Washington Appetite supression factor and related methods
US5605886A (en) * 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU4766196A (en) * 1995-01-31 1996-08-21 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) * 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) * 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) * 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) * 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) * 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) * 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) * 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) * 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) * 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
EP0736599A3 (en) * 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
WO1996031192A1 (de) * 1995-04-07 1996-10-10 Kuyus-Stiftung Kosmetische zusammensetzung zur behandlung von cellulite
US5614379A (en) * 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
US5840517A (en) * 1995-04-26 1998-11-24 Eli Lilly And Company Process for preparing obesity protein analogs
GB9509164D0 (en) 1995-05-05 1995-06-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
DE741187T1 (de) * 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
CA2218529A1 (en) * 1995-05-08 1996-11-14 Chiron Corporation Nucleic acids for treating obesity
CA2221303A1 (en) * 1995-05-19 1996-11-21 Dennis Paul Smith Obesity gene product
US6395509B1 (en) 1995-05-26 2002-05-28 Eli Lilly And Company DNA encoding Rhesus ob protein
WO1996037517A1 (en) * 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
CA2223433C (en) 1995-06-07 2003-11-18 Amgen Inc. Ob protein compositions and methods
GB9511935D0 (en) * 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
AU6284896A (en) * 1995-06-22 1997-01-22 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
EP0759441A3 (en) * 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
ZA965346B (en) * 1995-06-30 1997-12-24 Lilly Co Eli Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions.
PL324284A1 (en) * 1995-06-30 1998-05-11 Lilly Co Eli Methods of treating diabetes
ATE259650T1 (de) * 1995-08-17 2004-03-15 Amgen Inc Verfahren zur verringerung und zur erhaltung von verringerten blutspiegeln von lipiden mittels zubereitungen von ob-proteinen
EP0764722A2 (en) * 1995-09-19 1997-03-26 Eli Lilly And Company DNA encoding primate leptins as medicinal proteins
WO1997016550A1 (en) * 1995-11-02 1997-05-09 Bristol-Myers Squibb Company Polypeptide fragments derived from the obese gene product
US20030040467A1 (en) 1998-06-15 2003-02-27 Mary Ann Pelleymounter Ig/ob fusions and uses thereof.
CA2358862A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Amgen Inc. Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US6225446B1 (en) 1995-12-06 2001-05-01 Schering Corporation Mutational variants of mammalian proteins
AU1406497A (en) * 1995-12-06 1997-06-27 Schering Corporation Mutational variants of mammalian ob gene proteins
US6369027B1 (en) * 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US7632922B1 (en) 1995-12-22 2009-12-15 Amgen, Inc. Osteoprotegerin
IL124831A0 (en) * 1995-12-27 1999-01-26 Genentech Inc Ob protein derivatives having prolonged half-life
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US20050019325A1 (en) 1996-01-08 2005-01-27 Carter Paul J. WSX receptor agonist antibodies
US6541604B1 (en) 1996-01-08 2003-04-01 Genentech, Inc. Leptin receptor having a WSX motif
US7074397B1 (en) 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
US6087129A (en) 1996-01-19 2000-07-11 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US6110707A (en) * 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
WO1997026916A1 (en) * 1996-01-25 1997-07-31 Eli Lilly And Company Obesity protein analog compounds and formulations thereof
JP2000513564A (ja) * 1996-03-01 2000-10-17 アムジエン・インコーポレーテツド イヌｏｂタンパク質組成物及び方法
CA2250570A1 (en) * 1996-03-26 1997-10-02 Eli Lilly And Company Formulations of ob protein
AU2810497A (en) * 1996-04-19 1997-11-12 University Of Washington Methods for inducing bone formation
US6007998A (en) * 1996-04-22 1999-12-28 Merck & Co., Inc. Leptin assay
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
AU743161B2 (en) * 1996-06-04 2002-01-17 Scripps Research Institute, The Diagnostic and therapeutic methods related to regulating energy mobilization with OB protein and OB antibodies
WO1997046585A2 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Smithkline Beecham P.L.C. Fragments of leptin (ob protein)
JP2002514904A (ja) * 1996-06-20 2002-05-21 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 肥満に対する遺伝子治療
WO1997048419A1 (en) * 1996-06-20 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6630346B1 (en) * 1996-06-20 2003-10-07 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6001816A (en) * 1996-06-20 1999-12-14 Merck & Co., Inc. Gene therapy for leptin deficiency
US5869037A (en) * 1996-06-26 1999-02-09 Cornell Research Foundation, Inc. Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes
US6277592B1 (en) * 1996-07-31 2001-08-21 Purina Mills, Inc. Porcine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof
US20020110857A1 (en) * 1996-07-31 2002-08-15 Spurlock Michael E. Bovine leptin protein, antisense and antibody
EP1001768A1 (en) * 1996-08-30 2000-05-24 Amgen Inc. Methods of increasing sensitivity of an individual to ob protein by upregulating ob protein receptor
ID21861A (id) * 1996-09-20 1999-08-05 Hoechst Ag Penggunaan antagonis leptin untuk pengobatan daya tahan terhadap insulin dalam diabetes tipe ii
SE520392C2 (sv) * 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
AU4582597A (en) * 1996-10-11 1998-05-11 Eli Lilly And Company Therapeutic proteins
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
NL1004559C2 (nl) * 1996-11-18 1998-05-19 Unilife Boter.
AU5654998A (en) * 1996-12-06 1998-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Muteins of obese protein
EP1007648A4 (en) * 1996-12-20 2003-01-15 Lilly Co Eli ANTI-OBESITY PROTEINS
CA2217698A1 (en) * 1996-12-20 1998-06-20 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
BR9713755A (pt) * 1996-12-20 2000-02-01 Amgen Inc Proteìna, proteìna de fusão, sequência de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, processo para produzir uma proteìna, composição farmacêutica, e processo de tratamento de um distúrbio.
ES2321162T3 (es) * 1997-04-15 2009-06-03 Csir Compuestos y composiciones farmaceuticas que tienen actividad supresora del apetito.
US20020019352A1 (en) * 1997-04-17 2002-02-14 David N. Brems Stable, active, human ob protein compositions and methods
AU2951797A (en) * 1997-06-06 1998-12-21 Smithkline Beecham Plc Use of leptin antagonists for the treatment of diabetes
US6017876A (en) 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US5866547A (en) 1998-01-20 1999-02-02 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of neuroendocrine regulation of affective disorders
EP0950417A3 (en) 1998-02-23 2000-02-23 Pfizer Products Inc. Treatment of skeletal disorders
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
EP0996727B1 (en) * 1998-08-12 2003-01-08 Medical Research Council Gene conferring obese phenotype
US7208572B2 (en) 1998-08-21 2007-04-24 Albany Medical College Leptin-related peptides
US6777388B1 (en) 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
US7056504B1 (en) 1998-08-27 2006-06-06 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II
WO2000012726A2 (en) * 1998-08-27 2000-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase i and ii
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) † 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU773891C (en) 1998-10-23 2005-02-17 Kirin-Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
JP2002533124A (ja) 1998-12-31 2002-10-08 カイロン コーポレイション Ｈｉｖポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成
JP2002534962A (ja) * 1999-01-07 2002-10-22 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としての抗肥満症タンパク質の発現および輸送
CA2359840C (en) * 1999-02-12 2012-10-23 Amgen Inc. Glycosylated leptin compositions and related methods
AU3910000A (en) * 1999-03-22 2000-10-09 Zymogenetics Inc. Improved methods for producing proteins in transformed (pichia)
US20050272652A1 (en) 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
CA2370539C (en) * 1999-04-23 2009-01-06 Massachusetts Institute Of Technology System and method for notating polymers
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
US8106098B2 (en) 1999-08-09 2012-01-31 The General Hospital Corporation Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer
GB2396815B (en) * 1999-10-27 2004-09-08 Phytopharm Plc A composition comprising a pregnenone derivative and an NSAID
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU4351201A (en) * 2000-03-08 2001-09-17 Massachusetts Inst Technology Heparinase iii and uses thereof
ES2260219T3 (es) 2000-04-21 2006-11-01 Amgen Inc. Derivados de peptidos apo-ai/aii.
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB2363985B (en) * 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use
US6443013B1 (en) * 2000-08-04 2002-09-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Rotary test fixture
EP1319183B1 (en) 2000-09-12 2009-03-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to low molecular weight heparin
WO2002032406A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides
US7054758B2 (en) 2001-01-30 2006-05-30 Sciona Limited Computer-assisted means for assessing lifestyle risk factors
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
PT1366067E (pt) 2001-03-07 2012-11-29 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteínas contendo uma unidade de anticorpo de isotipo híbrido
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
MXPA03009924A (es) 2001-05-03 2004-01-29 Merck Patent Gmbh Anticuerpo recombinante especifico de tumor y uso del mismo.
IL158719A0 (en) 2001-05-11 2004-05-12 Amgen Inc Peptides and related molecules that bind to tall-1
US20030124196A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Susan Weinbach Pulsatile release compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
US20030083286A1 (en) * 2001-08-22 2003-05-01 Ching-Leou Teng Bioadhesive compositions and methods for enhanced intestinal drug absorption
DE10145553B4 (de) * 2001-09-16 2006-06-08 Gene Architects Ag Nukleinsäure für einen Klonierungsvektor
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
ES2418954T3 (es) 2001-10-22 2013-08-19 Amgen, Inc. Uso de la leptina para el tratamiento de la lipoatrofia humana y método para determinar la predisposición a dicho tratamiento
WO2003039454A2 (en) 2001-10-23 2003-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
ES2381025T3 (es) 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
AU2003209227A1 (en) 2002-01-14 2003-07-30 The General Hospital Corporation Biodegradable polyketal polymers and methods for their formation and use
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
CA2387003A1 (en) * 2002-05-21 2003-11-21 984012 Alberta Ltd. Method for improving efficiencies in livestock production
WO2004009774A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Amgen Inc. Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biogradable polymer
US8030459B2 (en) 2002-07-19 2011-10-04 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
CA2496795C (en) 2002-08-28 2014-06-03 Paul B. Burton Compositions and methods for treating cardiovascular disease
WO2004055056A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
EP2336298B1 (en) 2003-06-27 2016-02-17 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue and methods of making and using the same
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
EP1648935A2 (en) 2003-07-25 2006-04-26 Amgen Inc. Antagonists and agonists of ldcam and methods of use
JP4585186B2 (ja) * 2003-07-31 2010-11-24 杏林製薬株式会社 肥満、糖尿病及び脂質代謝異常の新規な予防又は治療剤
JP5537763B2 (ja) 2003-09-05 2014-07-02 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 放出システムとしてのポリアセタール薬物抱合体
CA2543322A1 (en) 2003-10-21 2005-05-12 Sention, Inc. Carbamoyl esters that inhibit cholinesterase and release pharmacologically active agents
DE10352510A1 (de) * 2003-11-07 2005-06-23 Forschungsinstitut Für Die Biologie Landwirtschaftlicher Nutztiere Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Körpermasse und des Fettansatzes
AU2004313245B2 (en) 2003-12-30 2011-04-14 Durect Corporation Polymeric implants, preferably containing a mixture of PEG and PLG, for controlled release of active agents, preferably a GNRH
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
EP2417980A1 (en) 2004-02-11 2012-02-15 Amylin Pharmaceuticals Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
JP2008505928A (ja) 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
US20090233986A1 (en) * 2004-07-27 2009-09-17 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
CA2580265A1 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Comentis, Inc. Amino-containing compounds which inhibit memapsin 2 beta-secretase activity and methods of use thereof
KR101441026B1 (ko) 2004-09-24 2014-10-01 메소블라스트, 아이엔씨. 증폭된 다능성 간엽 전구세포 자손 및 이의 용도
ES2645012T3 (es) 2004-09-24 2017-12-01 Mesoblast, Inc. Método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de las células precursoras mesenquimales (MPC)
EP1814590B2 (en) 2004-11-01 2013-12-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of obesity and related disorders
US8394765B2 (en) 2004-11-01 2013-03-12 Amylin Pharmaceuticals Llc Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents
EP1812038A1 (en) 2004-11-18 2007-08-01 VIB vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
US7307142B2 (en) * 2004-11-26 2007-12-11 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Leptin antagonists
DK1835924T3 (da) 2004-12-23 2013-11-04 Ethicon Inc Behandling af parkinsons sygdom og beslægtede sygdomme under anvendelse af postpartum opnåede celler
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US8404637B2 (en) 2005-02-11 2013-03-26 Amylin Pharmaceuticals, Llc GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
CA2604291A1 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Comentis, Inc. Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
AU2006235211B2 (en) 2005-04-12 2010-10-14 Mesoblast, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
EP1922336B1 (en) 2005-08-11 2012-11-21 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
BRPI0614649A2 (pt) 2005-08-11 2011-04-12 Amylin Pharmaceuticals Inc polipeptìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US8227408B2 (en) * 2005-09-07 2012-07-24 Neurotez, Inc. Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology
CA2626082C (en) 2005-10-13 2017-04-11 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
WO2007070870A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Ethicon, Inc. Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
EP2476432B1 (en) 2006-03-07 2015-08-19 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
WO2007136752A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Glycofi, Inc. Erythropoietin compositions
ES2376396T3 (es) 2006-06-26 2012-03-13 Amgen Inc. Método para tratar aterosclerosis.
WO2008005457A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Sunesis Pharmaceuticals Pyridinonyl pdk1 inhibitors
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
US7820623B2 (en) 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
HUE032743T2 (en) 2006-11-22 2017-10-30 Clinical Res Ass Llc A method for treating Down syndrome, fragilis X syndrome and autism
JP5591691B2 (ja) 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
CA2691531C (en) 2007-06-22 2016-11-01 Board Of Regents,The University Of Texas System Formation of stable submicron peptide or protein particles by thin film freezing
SI2489731T1 (sl) 2007-07-26 2014-12-31 Amgen Inc. Patent Operations, M/S 28-2-C Modificirani encimi lecitin-holesterol aciltransferaze
JP5055432B2 (ja) 2007-09-24 2012-10-24 コメンティス，インコーポレーテッド 治療のためのβ−セクレターゼ阻害剤としての（３−ヒドロキシ−４−アミノブタン−２−イル）−３−（２−チアゾール−２−イル−ピロリジン−１−カルボニル）ベンズアミド誘導体及び関連する化合物
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
JP5622720B2 (ja) * 2008-05-21 2014-11-12 ニューロテスインコーポレイテッド 神経原繊維変化に関連する進行性認知障害の治療方法
MX2010012593A (es) 2008-05-23 2011-03-04 Nat Jewish Health Metodos para el tratamiento de lesion asociada con exposicion a especie alcalina.
WO2009149379A2 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Regents Of The University Of Michigan Use of leptin for the treatment of fatty liver diseases and conditions
EP2307456B1 (en) 2008-06-27 2014-10-15 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
CN102264728B (zh) 2008-09-15 2015-02-04 加利福尼亚大学董事会 用于调节ire1、src和abl活性的方法和组合物
CA2738064C (en) 2008-10-15 2013-03-19 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
CN106880596A (zh) 2008-10-15 2017-06-23 精达制药公司 高浓缩药物颗粒、制剂、混悬剂及其应用
KR20120024529A (ko) * 2008-11-04 2012-03-14 니콜라오스 테자프시디스 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법
PA8853201A1 (es) 2008-12-10 2010-07-27 Mersana Therapeutics Inc Formulaciones farmaceuticas de conjugados de camtotecina-polimero biocompatibles biodegradables
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
JP5518893B2 (ja) 2008-12-19 2014-06-11 アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー 肺ならびに肺の疾患および障害の治療
BRPI0923177A2 (pt) 2008-12-19 2020-08-25 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc usos de composições para tratar dor neuropática e espacidade, as referidas composições, e kit
CA2748314C (en) 2009-02-03 2018-10-02 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
PL2411504T3 (pl) 2009-03-26 2017-10-31 Depuy Synthes Products Inc Komórki ludzkiej tkanki pępowinowej jako terapia choroby Alzheimera
EP2416797A4 (en) 2009-04-10 2013-04-24 Amylin Pharmaceuticals Llc AMYLINAGONIST COMPOUNDS FOR OXYGEN ANIMAL MICE
SG176922A1 (en) 2009-06-19 2012-01-30 Medimmune Llc Protease variants
BR112012003637A2 (pt) 2009-08-17 2017-04-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center "compostos de ligação de proteína de choque térmico, composições, e métodos para preparar e usar os mesmos"
WO2011029043A1 (en) 2009-09-04 2011-03-10 Biogen Idec Ma Inc. Heteroaryl btk inhibitors
EP3461824B1 (en) 2009-09-04 2021-08-25 Biogen MA Inc. Bruton's tyrosine kinase inhibitors
IL295518B2 (en) 2009-10-06 2023-11-01 Millennium Pharm Inc Heterocyclic compounds used as PDK1 inhibitors
JP2013510088A (ja) 2009-11-05 2013-03-21 ブラウン ユニバーシティ ｍＴＯＲのシグナル伝達の増強を処置する方法
US20110136728A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-09 Patricia Grasso Methods of increasing bone formation using leptin-related peptides
PT2509940E (pt) 2009-12-10 2015-09-24 Univ Califórnia Agentes de ligação a amiloide
NZ603156A (en) 2010-03-30 2014-10-31 Verseon Corp Multisubstituted aromatic compounds as inhibitors of thrombin
CN101812450B (zh) * 2010-04-28 2012-01-11 中国农业大学 辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物
CA2813038C (en) 2010-09-28 2021-12-28 Amylin Pharmaceuticals, Llc Highly soluble leptins
WO2012058645A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Biogen Idec Ma Inc. Heterocyclic tyrosine kinase inhibitors
KR101935068B1 (ko) 2011-02-14 2019-01-03 알러간, 인코포레이티드 비마토프로스트 조성물의 에스테르 유도체 및 방법
AU2012255759B2 (en) 2011-05-17 2017-08-10 Principia Biopharma, Inc. Kinase inhibitors
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
US20130178379A1 (en) * 2011-06-15 2013-07-11 Nse Products, Inc. Identifying Markers of Caloric Restriction and Caloric Restriction Mimetics
WO2013009539A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity
KR101851925B1 (ko) 2011-08-10 2018-04-26 디퍼이 신테스 프로덕츠, 인코포레이티드 제대 조직―유래 세포를 사용한 말초 혈관 질환의 치료
JP6342805B2 (ja) 2011-09-02 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびその用途
WO2013063492A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Novel compositions and methods for treating cancer
MX362198B (es) 2011-12-23 2019-01-08 Depuy Synthes Products Llc Deteccion de celulas derivadas de tejido de cordon umbilical humano.
CN104379563B (zh) 2012-04-10 2018-12-21 加利福尼亚大学董事会 用于治疗癌症的组合物和方法
AR091273A1 (es) 2012-06-08 2015-01-21 Biogen Idec Inc Inhibidores de pirimidinil tirosina quinasa
WO2013185082A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
CA2913736A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Compounds and methods of treating cancer
KR102304111B1 (ko) 2012-08-27 2021-09-23 알레간 인코포레이티드 베타-클로로시클로펜탄의 친수성 에스테르 전구약물의 이용에 의한 감소된 중심 각막 비후
US9090595B2 (en) 2012-08-27 2015-07-28 Allergan, Inc. Reduced central corneal thickening by use of hydrophilic ester prodrugs of beta-chlorocyclopentanes
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
MX2015003874A (es) 2012-09-26 2015-12-16 Univ California Modulacion de ire1.
EP2900230B1 (en) 2012-09-27 2018-08-15 The Children's Medical Center Corporation Compounds for the treatment of obesity and methods of use thereof
US9364462B2 (en) 2012-10-30 2016-06-14 The Regents Of The University Of California Alpha-1-adrenergic receptor agonist therapy
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
WO2014124143A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
CA2903827C (en) 2013-03-14 2021-08-10 Stefan Oscarson Thiosaccharide mucolytic agents
US9227978B2 (en) 2013-03-15 2016-01-05 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of Kras G12C
BR112015022340A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Verseon Corp método para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio relacionado à calicreína em um sujeito, composto, e, composição farmacêutica
ES2837628T3 (es) 2013-03-15 2021-07-01 Celgene Corp Linfocitos T modificados
ES2687958T3 (es) 2013-03-15 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Fosfonato diésteres de nucleósido acíclico
JP2016513647A (ja) 2013-03-15 2016-05-16 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ レプチン生産を増進するビマトプロスト
CN105209440B (zh) 2013-03-15 2019-07-23 维颂公司 作为凝血酶抑制剂的卤代吡唑
AU2014290202B2 (en) 2013-07-15 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds and methods for treating cancer, neurological disorders, ethanol withdrawal, anxiety, depression, and neuropathic pain
LT3035926T (lt) 2013-08-19 2020-11-25 The Regents Of The University Of California Junginiai ir būdai, skirti epileptinio sutrikimo gydymui
WO2015031799A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Scintillator nanocrystal-containing compositions and methods for their use
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
ES2709976T3 (es) 2013-11-26 2019-04-22 Childrens Medical Ct Corp Compuestos para el tratamiento de la obesidad y procedimientos de uso de los mismos
TWI675833B (zh) 2013-12-11 2019-11-01 美商百健Ｍａ公司 布魯頓氏（ｂｒｕｔｏｎ’ｓ）酪胺酸激酶之聯芳基抑制劑
EP3080122B1 (en) 2013-12-11 2018-10-31 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
KR102325454B1 (ko) 2013-12-23 2021-11-16 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 방사성표지화를 위한 방법 및 시약
CA2939569A1 (en) 2014-02-20 2015-11-19 Allergan, Inc. Reduced central corneal thickening by use of hydrophilic ester prodrugs of beta-chlorocyclopentanes
WO2015153933A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 The Children's Medical Center Corporation Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof
CA2948621A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Hsp70 modulators and methods for making and using the same
WO2016004383A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 City Of Hope Tumor-selective ctla-4 antagonists
JP2017524365A (ja) 2014-08-12 2017-08-31 アントフロゲネシス コーポレーション リンパ節のｂ細胞領域、皮膚、または腸管にホーミングするように操作されたｃａｒ−ｔ細胞
JP6708329B2 (ja) 2014-09-15 2020-06-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ヌクレオチド類似体
AU2015317522A1 (en) 2014-09-17 2017-03-23 Verseon Corporation Pyrazolyl-substituted pyridone compounds as serine protease inhibitors
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
ES2826443T3 (es) 2014-09-25 2021-05-18 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas mutantes KRAS G12C
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
AU2015327817B2 (en) 2014-10-02 2020-04-23 Allergan, Inc. Ester prodrugs of gamma-lactams and their use
WO2016115275A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 City Of Hope Ctla4-binding protein peptide-linker masks
CA3204599A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 The Regents Of The University Of California 5ht agonists for treating disorders
MX2017011000A (es) 2015-02-27 2017-10-20 Verseon Corp Compuestos de pirazol sustituidos como inhibidores de serina proteasa.
JP2018508513A (ja) 2015-02-27 2018-03-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 軟骨若返りを可能とする小分子
EP3280708B1 (en) 2015-04-10 2021-09-01 Araxes Pharma LLC Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10428064B2 (en) 2015-04-15 2019-10-01 Araxes Pharma Llc Fused-tricyclic inhibitors of KRAS and methods of use thereof
AU2016247858B2 (en) 2015-04-17 2020-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. PLK4 inhibitors
EP3307732A1 (en) 2015-06-10 2018-04-18 Biogen MA Inc. Forms and compositions of biaryl inhibitors of bruton's tyrosine kinase
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
CN105132566A (zh) * 2015-09-21 2015-12-09 上海中优生物高科技有限责任公司 毒素堆积型肥胖基因个体化干预饮品的制备方法及其系统
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356359B1 (en) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10875842B2 (en) 2015-09-28 2020-12-29 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356351A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356354A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356349A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017062971A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Neurona Therapeutics Inc. Neural precursor cell populations and uses thereof
JP2018533939A (ja) 2015-10-19 2018-11-22 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法
ES2820770T3 (es) 2015-10-23 2021-04-22 Sunesis Pharmaceuticals Inc Inhibidores de PDK1 heterocíclicos para uso para tratar cáncer
AU2016342375B2 (en) 2015-10-23 2022-03-17 Erx Pharmaceuticals Inc Analogs of celastrol
WO2017087528A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Araxes Pharma Llc 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
US11084795B2 (en) 2015-12-24 2021-08-10 The Regents Of The University Of California CFTR regulators and methods of use thereof
EP4019501A1 (en) 2015-12-24 2022-06-29 The Regents of the University of California Cftr regulators and methods of use thereof
US11834675B2 (en) 2015-12-30 2023-12-05 Celgene Corporation T lymphocyte production methods and t lymphocytes produced thereby
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
TW201737943A (zh) 2016-04-25 2017-11-01 弗瑪治療公司 使用fasn抑制劑之方法
US20210323913A1 (en) 2016-04-29 2021-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Sigma receptor binders
HUE056320T2 (hu) 2016-05-12 2022-02-28 Anacor Pharmaceuticals Inc L-valin amid benzoxaborol származékok parazita betegségek kezelésére
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
SG11201900515PA (en) 2016-07-21 2019-02-27 Biogen Ma Inc Succinate forms and compositions of bruton's tyrosine kinase inhibitors
US11584780B2 (en) 2016-07-26 2023-02-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Adeno-associated virus capsid proteins
US11542261B2 (en) 2016-08-17 2023-01-03 Children's Hospital Medical Center Substituted Imidazo[1,2-a]-pyridines as IRAK 1/4 and FLT3 inhibitors
US11254667B2 (en) 2016-08-17 2022-02-22 Children's Hospital Medical Center Substituted imidazo[1,2-A]pyridines as IRAK 1/4 and flt3 inhibitors
BR112019004715A2 (pt) 2016-09-12 2019-07-16 Aegerion Pharmaceuticals Inc métodos para detectar anticorpos neutralizantes anti-leptina
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
CN110312711A (zh) 2016-10-07 2019-10-08 亚瑞克西斯制药公司 作为ras抑制剂的杂环化合物及其使用方法
JP7100028B2 (ja) 2016-10-20 2022-07-12 セルジーン コーポレイション セレブロン系のヘテロ二量体化可能なキメラ抗原受容体
KR20190095355A (ko) 2016-12-15 2019-08-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2018140514A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
JP7327802B2 (ja) 2017-01-26 2023-08-16 アラクセス ファーマ エルエルシー 縮合ヘテロ－ヘテロ二環式化合物およびその使用方法
EP3573954A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
EP3573964A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
AU2018271990A1 (en) 2017-05-25 2019-12-12 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of KRAS
TW201906832A (zh) 2017-05-25 2019-02-16 美商亞瑞克西斯製藥公司 用於癌症治療之化合物及其使用方法
EP3630747A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Araxes Pharma LLC Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
CN107385020A (zh) * 2017-06-23 2017-11-24 西安医学院 瘦素在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用
WO2019070917A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 The Schepens Eye Research Institute, Inc. COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING THE DEGENERATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM AND METHODS USING SAME
WO2019074962A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Syros Pharmaceuticals, Inc. PYRROLOTRIAZINE COMPOUNDS AND METHODS FOR INHIBITING TAM KINASES
AU2019209470A1 (en) 2018-01-16 2020-08-13 Syros Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)
EP3765459A1 (en) 2018-03-13 2021-01-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Substituted imidazopyridines as inhibitors of plasma kallikrein and uses thereof
US11739345B2 (en) 2018-05-09 2023-08-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
EP3983533A4 (en) 2019-06-14 2023-07-12 Children's Hospital Medical Center RATIONAL THERAPEUTIC TARGETING OF ONCOGENIC IMMUNESIGNALING STATES IN MYELOID MALIGNS VIA THE UBIQUITIN CONJUGATION ENZYME UBE2N
CN114728962A (zh) 2019-09-18 2022-07-08 武田药品工业有限公司 血浆激肽释放酶抑制剂及其用途
US11370803B2 (en) 2019-09-18 2022-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heteroaryl plasma kallikrein inhibitors
WO2021211938A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Solid forms of inhibitors of plasma kallikrein
JP2023522331A (ja) 2020-04-17 2023-05-30 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインの阻害剤の形態及び組成物
JP2024516073A (ja) 2021-03-17 2024-04-12 武田薬品工業株式会社 血漿カリクレインのヘテロアリール阻害剤
CN117396473A (zh) 2021-03-17 2024-01-12 武田药品工业株式会社 血浆激肽释放酶的咪唑并吡啶基抑制剂
WO2022197756A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Plasma kallikrein inhibitors
EP4308229A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Inhibitors of plasma kallikrein
US20240199613A1 (en) 2021-03-17 2024-06-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Polycyclic inhibitors of plasma kallikrein
IL309653A (en) 2021-08-06 2024-02-01 Celgene Corp Composition and methods for selective degradation of transgenic proteins
WO2024040241A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Viracta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations, processes for preparation, and methods of use
WO2024059186A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited N-((isoquinolin-6-yl)methyl)-1h-pyrazole-4-carboxamid derivatives as plasma kallikrein inhibitors for the treatment of hereditary angioedema

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE31006E (en) 1968-09-24 1982-08-03 Akzona Incorporated Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
US3654090A (en) 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US3650090A (en) 1970-06-19 1972-03-21 Phillips Petroleum Co Analysis of gaseous mixtures
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4491632A (en) 1979-10-22 1985-01-01 The Massachusetts General Hospital Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
EP0043718B1 (en) 1980-07-07 1984-11-28 National Research Development Corporation Improvements in or relating to cell lines
US4341761A (en) 1980-07-25 1982-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
US4466917A (en) 1981-02-12 1984-08-21 New York University Malaria vaccine
US4493890A (en) 1981-03-23 1985-01-15 Miles Laboratories, Inc. Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays
US4451570A (en) 1981-03-26 1984-05-29 The Regents Of The University Of California Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line
US4399121A (en) 1981-11-04 1983-08-16 Miles Laboratories, Inc. Iodothyronine immunogens and antibodies
US4427783A (en) 1981-12-14 1984-01-24 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay of thymosin α1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
CH671155A5 (pl) 1986-08-18 1989-08-15 Clinical Technologies Ass
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
DE68929566D1 (de) 1988-05-13 2010-01-28 Amgen Inc Verfahren zur Isolierung und Reinigung von G-CSF
WO1990003431A1 (en) 1988-09-26 1990-04-05 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Mixed feed recombinant yeast fermentation
US5102789A (en) 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5098833A (en) 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
WO1990014092A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Cell Genesys, Inc. Single-strand site-directed modification of mammalian genes in vivo
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ATE174058T1 (de) 1989-11-06 1998-12-15 Cell Genesys Inc Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
RU2128227C1 (ru) 1989-12-22 1999-03-27 Апплайд Резеч Системз АРС Холдинг Н.В. (NL) (Антильские острова) Способ активации транскрипционно-молчащего гена
US5139749A (en) 1990-06-22 1992-08-18 Tas, Inc. Fluidized calcining process
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
ZA924674B (en) 1991-07-02 1993-04-28 Imclone Systems Inc Cysteine depleted il-6 mutein
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0566410A3 (en) 1992-04-17 1994-08-24 Sankyo Co Derivatives of adipogenesis inhibitory factor, their preparation and their use
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
WO1994000558A1 (en) * 1992-06-19 1994-01-06 Joslin Diabetes Center, Inc. DIABETOGENE rad: A TYPE II DIABETES SPECIFIC GENE
ATE350386T1 (de) 1992-11-13 2007-01-15 Immunex Corp Elk ligand, ein cytokin
US5574018A (en) 1994-07-29 1996-11-12 Amgen Inc. Conjugates of vitamin B12 and proteins
US5643748A (en) 1994-09-14 1997-07-01 Progenitor, Inc. HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US5827734A (en) 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
AU4766196A (en) 1995-01-31 1996-08-21 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5532336A (en) 1995-01-31 1996-07-02 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5580954A (en) 1995-01-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594104A (en) 1995-01-31 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5605886A (en) 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569744A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567678A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563244A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5521283A (en) 1995-01-31 1996-05-28 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563245A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5525705A (en) 1995-01-31 1996-06-11 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5563243A (en) 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5567803A (en) 1995-01-31 1996-10-22 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5594101A (en) 1995-03-03 1997-01-14 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
JPH08333394A (ja) 1995-04-03 1996-12-17 Takeda Chem Ind Ltd ラット肥満遺伝子、その遺伝子産物およびその製造法
EP0736599A3 (en) 1995-04-03 1996-12-11 Takeda Chemical Industries Ltd The rat obesity gene, its gene product and its production
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5614379A (en) 1995-04-26 1997-03-25 Eli Lilly And Company Process for preparing anti-obesity protein
DE741187T1 (de) 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
CA2221303A1 (en) 1995-05-19 1996-11-21 Dennis Paul Smith Obesity gene product
WO1996037517A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Eli Lilly And Company Rhesus ob protein and dna
PL324284A1 (en) 1995-06-30 1998-05-11 Lilly Co Eli Methods of treating diabetes
EP0759441A3 (en) 1995-06-30 1999-06-30 Eli Lilly And Company Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions
EP0764722A2 (en) 1995-09-19 1997-03-26 Eli Lilly And Company DNA encoding primate leptins as medicinal proteins
US5698389A (en) 1995-11-16 1997-12-16 Tularik, Inc. Transcriptional promoter of the murine obesity gene
JP2000505078A (ja) 1996-01-19 2000-04-25 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 肥満症タンパク質製剤
WO1997026013A1 (en) 1996-01-19 1997-07-24 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
EP0784979A3 (en) 1996-01-19 1999-03-03 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
EP0784982A3 (en) 1996-01-19 1999-08-18 Eli Lilly And Company Obesity protein formulations
CA2250570A1 (en) 1996-03-26 1997-10-02 Eli Lilly And Company Formulations of ob protein

Also Published As

Publication number Publication date
SK287191B6 (sk) 2010-02-08
EE9700030A (et) 1997-08-15
LV11868B (en) 1998-01-20
OA10596A (en) 2002-06-26
NO970683D0 (no) 1997-02-14
WO1996005309A2 (en) 1996-02-22
IS4416A (is) 1997-01-17
IL162093A0 (en) 2005-11-20
DE777732T1 (de) 1998-01-29
PL319021A1 (en) 1997-07-21
RO121036B1 (ro) 2006-11-30
MD2311F2 (en) 2003-11-30
GR970300021T1 (en) 1997-07-30
CN1162978A (zh) 1997-10-22
TR199501021A2 (tr) 1996-06-21
EP0777732B1 (en) 2011-09-28
BG101228A (en) 1997-09-30
HK1001495A1 (en) 1998-06-19
JP3479080B2 (ja) 2003-12-15
AP815A (en) 2000-03-10
IL114987A (en) 2004-07-25
GB2292382A (en) 1996-02-21
BR9508596A (pt) 1997-10-21
IL114987A0 (en) 1995-12-08
CA2195955A1 (en) 1996-02-22
SK22197A3 (en) 1998-02-04
FI970656A (fi) 1997-02-17
HUT78052A (hu) 1999-07-28
GB9516947D0 (en) 1995-10-18
GB2292382B (en) 1997-07-16
CZ46097A3 (en) 1997-11-12
WO1996005309A3 (en) 1996-03-21
NZ291689A (en) 2000-01-28
CA2195955C (en) 2012-03-13
GEP20022701B (en) 2002-05-27
ES2108663T1 (es) 1998-01-01
MD970100A (en) 1998-04-30
HU223563B1 (hu) 2004-09-28
MX9701200A (es) 1998-05-31
CN1162978B (zh) 2010-06-16
NO326376B1 (no) 2008-11-17
SI9520090A (sl) 1998-08-31
DE19531931A1 (de) 1996-03-07
ES2108663T3 (es) 2012-02-17
EE04377B1 (et) 2004-10-15
FI970656A0 (fi) 1997-02-17
NO20065287L (no) 1997-04-16
CZ295018B6 (cs) 2005-05-18
JPH09506264A (ja) 1997-06-24
EP0777732A1 (en) 1997-06-11
NO323847B1 (no) 2007-07-09
FI121709B (fi) 2011-03-15
LV11868A (lv) 1997-10-20
BG64710B1 (bg) 2005-12-30
US6309853B1 (en) 2001-10-30
AP9700919A0 (en) 1997-01-31
NO970683L (no) 1997-04-16
MD2311G2 (ro) 2004-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6309853B1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6124439A (en) OB polypeptide antibodies and method of making
US8173793B2 (en) Nucleic acids encoding modulators of body weight
US6048837A (en) OB polypeptides as modulators of body weight
US20040213763A1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6429290B1 (en) OB polypeptides, modified forms and derivatives
US6350730B1 (en) OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
RU2273645C9 (ru) Полипептид ожирения (ов)(варианты), его аналог (варианты) и слитый белок (варианты), изолированная молекула нуклеиновой кислоты, молекула днк, рекомбинантный вектор клонирования, рекомбинантный вектор экспрессии, фармацевтическая композиция, моноклональное и поликлональное антитело
JP3985007B2 (ja) 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途
US6124448A (en) Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US7612171B2 (en) DB, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
AU738966B2 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
KR100584177B1 (ko) 체중 변조물질,상응하는 핵산 및 단백질,및 이들의 진단 및 치료학적 용도
US6821945B1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7619079B2 (en) Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof