ES2289759T3 - Procedimientos de diagnostico y terapeuticos relacionados con la regulacion de la movilizacion de la energia con proteina ob y anticuerpos ob. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN AGONISTAS DEL OB -R Y PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO DE CUADROS TALES COMO EL SINDROME DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMICA. UN LIGANDO ADECUADO AGONISTA DEL OB - R ES LA PROTEINA OB HUMANA RECOMBINANTE, CONOCIDA TAMBIEN COMO LECTINA. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE LA OBESIDAD Y LA RESISTENCIA AL OB. SE INCLUYEN IGUALMENTE PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO Y KITS RELACIONADOS CON ESTAS CONDICIONES.

Description

Procedimientos de diagnóstico y terapéuticos relacionados con la regulación de la movilización de la energía con proteína OB y anticuerpos OB'.

Referencia a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos S.N. 60/018.972, presentada el 4 de Junio de 1996.

Derechos del Gobierno

Esta invención fue realizada con apoyo del Gobierno de los Estados Unidos, National Institutes of Health, Beca DK20043; el Gobierno de los Estados Unidos tiene algunos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

El gen de la obesidad en seres humanos, ratas y ratones codifica una proteína hormonal que tiene un marco de lectura abierto de 167 restos de aminoácidos de longitud, denominado leptina, conocido también como proteína OB o el producto de gen ob. La eliminación de la secuencia señal da como resultado una proteína madura segregada de 16 kilodalton que tiene 146 restos de aminoácidos de longitud.

La proteína OB se produce principalmente por los adipocitos del tejido adiposo blanco (WAT). La proteína OB se segrega directamente en el espacio extracelular y viaja a través de la corriente sanguínea. La proteína OB afecta a las células de los órganos diana mediante el enlace de la proteína del receptor OB, OB-R, que se encuentra sobre la superficie extracelular de la membrana plasmática de las células diana. El enlace de la proteína OB con OB-R activa la cascada intracelular del segundo mensajero del sistema JAK-STAT, que se caracteriza por la activación de los receptores tipo I de la citoquina.

La proteína OB se produce en los adipocitos en proporción a la masa de grasa almacenada, proporcionando por tanto una señal hormonal para un circuito de retroalimentación lipostático que está mediado por el receptor de OB. Aunque las proteínas OB de diferentes especies muestran una estrecha similaridad en sus secuencias, las secuencias de las proteínas OB no son demasiado similares a otros tipos de proteínas. Por ejemplo, se ha informado que la secuencia del gen ob humano y su homólogo en ratón (85% de identidad de la secuencia) no tienen similaridad en la secuencia con otras proteínas activas de estructura conocida (DIFrancesco, V, y col., Protein Topology Recognition from Secondary Structure Sequences: Application of the Hidden Markov Models to Alpha Class Proteins, J. Mol. Biol, 267; 446-463 (1997) en la página 457).

Aunque la proteína OB está compuesta de una única cadena de péptido, se requiere un puente disulfuro intracadena entre la cisteína 96 y la cisteína 146 tanto para estabilizar la conformación de la molécula como para conferir actividad biológica in vivo (Rock, F. L., y col, The Leptin Haemopoietic Cytokine Fold is Stabilized by an Intrachain Disulfide Bond, Horm. Metab. Res. 28: 849-852 (1996)). Se cree que debe mantenerse la geometría especial de las hélices principales A y D con el fin de asociarse a un receptor conservado en la molécula del receptor, un requerimiento que produce una similaridad estructural entre las proteínas OB y las citoquinas, a la luz de la baja conservación de la secuencia (Id en la 651).

Un modelo animal de la obesidad humana aceptado y satisfactorio es el del ratón genéticamente obeso que soporta la mutación recesiva de la obesidad (ob/ob). El modelo de ratón no reproduce únicamente el estado de obesidad humana, sino que desarrolla también la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, conocida también como diabetes mellitus Tipo II). Se han descrito los genes homólogos de la obesidad en ratón, rata y ser humano.

El ratón es también un modelo ampliamente aceptado y satisfactorio de sepsis, shock séptico y síndrome sistémico de respuesta inflamatoria (SIRS), un término que describe el síndrome clínico de la sepsis sin tener en cuenta su causa. Los modelos simples, que implican una gran dosis de bolo de lipopolisacáridos (LPS) administrada a ratones y usando la mortalidad como la variable principal de salida, resultan muy adecuados para los estudios farmacológicos preliminares de nuevos fármacos u otros agentes terapéuticos (Fink, M. P. y Heard, S. O., Laboratory Models of Sepsis and Septic Shock, J. Surg. Res. 49: 186-196, 1990, en las 188-189).

Se han clonado ambos genes ob (Zhang, Y., y col; Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue, Nature 372: 425-432 (1994); con Nº de acceso U18812, SEC DE ID Nº 1) y su receptor (Tartaglia, L. A., y col., Identification and expression cloning of a Leptin Receptor, Cell 83: 1263-1271 (1995); Chen, H., y col., Evidence that the Diabetes Gene Encodes the Leptin Receptor: Identification of a Mutation in the Leptin Receptor Gene in ob/ob Mice Cell 84: 491-495 (1996)); con Nº de acceso U46135, SEC DE ID Nº 2). Las versiones más cortas del receptor OB, denominadas las formas OB-Ra, Ob-Rc y OB-Re, se producen mediante ayustamiento alternativo del ARNm de OB-R (Lee, G. H., y col. Nature 379: 632-635 (1996)). El receptor OB de longitud completa se denomina la forma OB-Rb.

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La actividad neural en las regiones específicas del sistema nervioso central (SNC), tales como el hipotálamo, controla los procesos relacionados con la ingesta de alimento y el gasto de energía. La clonación del gen de la proteína OB y el gen del receptor OB y la localización de la expresión del receptor OB en el hipotálamo ha proporcionado una evidencia de apoyo a este respecto, así como sugiere posibles mecanismos para relacionar la ingesta de comida con las reservas almacenadas de grasa. La proteína OB es producida por los adipocitos en proporción a la masa de grasa almacenada y, por tanto, actúa como señal para un circuito de control lipostático. Esta señal lipostática se transduce a las células diana mediante el receptor OB, OB-R en el SNC, dando como resultado cambios en la actividad neural que regulan la ingesta de alimento y el índice metabólico.

El desarreglo metabólico es una importante característica de la respuesta del huésped a la enfermedad aguda denominada respuesta de fase aguda que caracteriza dolencias tales como la sepsis y el shock séptico (Kushner, I. Ann. N. Y. Acad. Sci. 389: 39-48 (1982). La hipotermia es una respuesta metabólica que puede ser un factor de pronóstico clínico pertinente en un síndrome sistémico de respuesta inflamatoria en seres humanos (brevet, F., y col. Crit. Care Med. 22: 533-534 (1994)).

Existe la necesidad de al menos un marcador de la enfermedad del síndrome sistémico de respuesta inflamatoria (SIRS) y las dolencias relacionadas. A partir de ahora en el presente documento, se usa el término SIRS para denotar sepsis, shock séptico, síndrome de sepsis, y las dolencias relacionadas. Los marcadores de la enfermedad tienen numerosas funciones. En este caso, podría ser útil un marcador de SIRS para predecir el desarrollo de SIRS, que identifique a los pacientes con SIRS, que prediga la remisión, que ayude a la pauta y dirigiendo las intervenciones terapéuticas, y determinando la patogénesis de SIRS en los pacientes (Parsons, P. E. y Moss, M. Early Detection and Markers of Sepsis, Clinics in Chest Medicine 17:199-212 (1996)).

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de un ligando agonista de OB-R para la fabricación de medicamentos, tal como se reivindica en la reivindicación 1.

Entre los ligandos agonistas de OB-R adecuados se incluyen la proteína OB recombinante, los análogos conformacionales del péptido de la proteína OB humana que comprenden las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos, y los péptidos relacionados con OB. Un ligando agonista de OB-R preferido es la proteína OB humana recombinante.

Los anticuerpos de la proteína OB son útiles en forma de un kit y procedimiento de ensayo para detectar el nivel de proteína OB en un paciente. El nivel de proteína OB en un paciente es un marcador de la enfermedad que es útil para predecir el desarrollo de una dolencia, identificar pacientes con la dolencia, predecir la remisión de la dolencia, ayudar a la pauta y dirigir las intervenciones terapéuticas, y determinar la patogénesis de la dolencia en los pacientes. Las dolencias en las que el nivel de proteína OB es un marcador útil son el SIRS y las dolencias relacionadas, tales como la sepsis y el shock séptico.

Breve resumen de los dibujos

En los dibujos

La Figura 1 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la ribonucleasa (RNasa) que muestra la expresión del receptor QB total (QB-R_{(t)}) en pulmón, riñón e hígado a las 0, 4, 8 ó 24 horas, a los 2 (D_{2}), 3 (D_{3}) o 5 (D_{5}) días después de la inyección intravenosa de 5 \mug por gramo de peso corporal, así como un estudio dosis-respuesta que muestra los efectos relativos sobre el hígado de la inyección de 0,05, 0,5 o 5 \mug de LPS por gramo de peso corporal;

La Figura 2 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra la expresión de OB-Rb en hígado normal (banda 1) y el hígado tratado con LPS a las 24 horas (banda 2) y en el hipotálamo normal de control (banda 3) y en ratones ob/ob (banda 4), en comparación con OB-R_{(m)} que representa la mezcla de las formas OB-R parcialmente protegidas por las sondas de nucleótidos designadas;

La Figura 4 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra la expresión de QB-Rc en un hígado normal (banda 1) y en hígado tratado con LPS a las 24 horas (banda 2), y en el hipotálamo normal de control (banda 3) y en ratones ob/ob (banda 4) en comparación con OB-R_{(m)} que representa la mezcla de las formas OB-R parcialmente protegidas por las sondas de nucleótidos designadas;

La Figura 5 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra la expresión de OB-R en hígado de ratón 24 horas después de la inyección de IL-\beta (2,5 \mug por ratón), TNF-\alpha (10 \mug por ratón) e IL-1\beta (5 \mug por ratón);

La Figura 6 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra los niveles del ARNm de OB-R en el córtex cerebral, el hipotálamo y en el tallo cerebral en diversos momentos después de la inyección de LPS (5 \mug por gramo de peso corporal);

La Figura 7 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra la expresión del ARNm de OB en la glándula adrenal (Adr) y en el tejido adiposo blanco (WAT) en diversos momentos después de la inyección de LPS (5 \mug por gramo de peso corporal);

La Figura 8 es una representación gráfica del esquema de construcción para el vector pETM1 a partir de un vector comercialmente disponible;

La Figura 9 es una representación gráfica de la ganancia de peso inducida por una inyección de antisuero anti-OB en ratones C57BL/6 a los que se les proporcionaron inyecciones diarias de antisuero anti-OB (antiOB) de suero preinmune de conejo (control) y cuyos pesos corporales se midieron 12 horas después, en el que los datos se expresan como promedio \pm el error estándar del promedio (S.E.M.), N = 8;

La Figura 10 es una representación gráfica del curso del tiempo de supervivencia de los ratones que recibieron una inyección de LPS (5 \mug por gramo de peso corporal) tras el pretratamiento con antisuero de proteína anti-OB (anti-OB, N = 16), suero preinmune de conejo (control, N = 16), o uno de los otros tres antisueros de conejo no relacionados (anti-X, N = 9; 3 tratados con cada antisuero);

La Figura 11 es una representación gráfica del curso del tiempo de supervivencia de los ratones que se trataron con proteína OB (mOB), N = 16) o vehículo (control, N-18) tras una inyección de LPS (10 \mug por gramo de peso corpo-
ral);

La Figura 12 es una representación gráfica del curso del tiempo de cambio en la temperatura corporal de los ratones que habían recibido una inyección de LPS (6 \mug por gramo de peso corporal) tras el pretratamiento con antisuero de proteína anti-OB (anti-OB, N = 16, excepto en que* cuando N < 16 debido a la mortalidad) o al suero preinmune de conejo (control, N = 16), se expresan los datos en forma de promedio \pm S.E.M.;

La Figura 13 es una representación gráfica del curso del tiempo de cambio en la temperatura corporal de los ratones que fueron tratados con la proteína OB (mOB, N = 16) o el vehículo, excepto en que* cuando N < 16 debido a la mortalidad) tras una inyección de LPS (10 \mug por gramo de peso corporal), se expresan los datos como promedio \pm S.E.M;

La Figura 14 es una representación gráfica del curso del tiempo de cambio en el peso corporal (porcentaje de peso corporal inicial) de los ratones que habían recibido una inyección de LPS (6 \mug por gramo de peso corporal tras el pretratamiento con antisuero de proteína anti-OB (anti-OB, N = 16) o suero preinmune de conejo (control, N-16, excepto en que* cuando N < 16 debido a la mortalidad), se expresan los datos como promedio \pm S.E.M;

La Figura 15 es una representación gráfica del curso del tiempo de cambio en el peso corporal (porcentaje de peso corporal inicial) de los ratones que fueron tratados con la proteína OB (mOB, N = 16) o el vehículo (control, N-16, excepto en que* cuando N < 16 debido a la mortalidad) tras una inyección de LPS (10 \mug por gramo de peso corporal), se expresan los datos como promedio \pm S.E.M.; y

La Figura 16 es una representación de un autoradiograma que muestra los resultados de un ensayo de protección de la RNasa que muestra la expresión de los ARNm de INOS, IL-1\alpha, IL-1\beta y TNF-\alpha.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Se ha encontrado que las sustancias que inician o median SIRS, por ejemplo, LPS y diversas citoquinas, inducen el aumento de la expresión de OB-R en el hígado y otros tejidos periféricos. De esta manera, la ocupación y activación de OB-R por un ligando agonista tal como la proteína OB recombinante, los péptidos relacionados con OB o el análogo conformacional del péptido de la proteína OB humana que comprende las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos que sirven como un mecanismo homeostático protector en las dolencias del síndrome sistémico de respuesta inflamatoria tales como el shock endotóxico, la sepsis y el shock séptico. Un ligando agonista de OB-R preferido es la proteína OB recombinante. Las dosis humanas terapéuticas adecuadas de la proteína OB recombinante están comprendidas entre aproximadamente 1 microgramo por kilogramo de peso corporal y aproximadamente 50 microgramos por kilogramo de peso corporal. Una dosis humana terapéutica preferible es de aproximadamente 10 microgramos por kilogramo de peso corporal.

Mientras la regulación de la homeostasis de energía es esencialmente una función del SNC, la ingesta de alimento y la mayoría del gasto de energía tienen lugar en órganos periféricos tales como el hígado. Se ha encontrado que la proteína OB y el receptor OB tienen una implicación funcional en la homeostasis de la energía periférica. De manera general, la enfermedad y el trauma crítico pueden alterar drásticamente el metabolismo, cambiando la expresión del receptor OB en respuesta al estrés patológico. Se ha demostrado ahora que la expresión de OB-R en el hígado y otros órganos periféricos, pero no en el sistema nervioso central, está inducida por la inyección intravenosa que produce el shock endotóxico de las citoquinas, tales como, IL-1\beta, TNF-\alpha e IL-B, así como los agentes que inducen la citoquina tales como LPS, en ratones, un modelo animal aceptado de SIRS y las dolencias relacionadas, la proteína OB, los anticuerpos de la proteína OB, y los inductores de la expresión de OB-R son útiles para la diagnosis y el tratamiento de dolencias tales como la sepsis, el síndrome sistémico de respuesta inflamatoria, la caquexia y la anorexia.

La administración de la proteína OB recombinante de ratón en ratones, seguida por la inducción de OB-R con una dosis normalmente letal de LPS confiere resistencia completa a LPS, dando como resultado la supervivencia. Los ratones tratados con OB mantienen una temperatura corporal más alta y muestran fuertes pérdidas de peso en contraste con sus homólogos de control. Por otra parte, la administración in vivo de antisuero OB, estimuló los efectos opuestos mediante el bloqueo de los procesos mediados por OB, estimulando por tanto la ingesta de alimento postprandial, lo que conduce a una rápida ganancia de peso. Sin embargo, la coadministración de LPS con un segundo tratamiento in vivo con antisuero OB, dio como resultado una mortalidad del 100% en comparación con los animales tratados con antisuero control.

La proteína OB, en la mediación de las respuestas del huésped a la endotoxenemia inducida por LPSm, ejerce su efecto protector principalmente mediante la iniciación de la movilización de energía y la producción de calor en condiciones críticas, el efecto de las cuales es proporcional al nivel de proteína OB en la sangre. Mediante la alteración de los niveles de proteína OB se altera de manera correspondiente la cantidad de energía movilizada para resistir los estímulos inducidos por los agentes inflamatorios efectuando por tanto la respuesta inflamatoria definitiva.

Por tanto, a la vista de las propiedades fisiológicas recientemente descubiertas de la proteína OB y los anticuerpos de OB en la regulación de la movilización y el consumo de energía, la presente invención describe los usos diagnósticos y terapéuticos de la proteína OB humana recombinante y los anticuerpos de la anterior tal como se describe en las reivindicaciones.

Aplicaciones en diagnóstico

Los anticuerpos de OB son útiles para detectar la cantidad de OB presente en la muestra tomada de un paciente. La invención proporciona el uso de un anticuerpo capaz de enlazar con la proteína OB para la fabricación de una composición para detectar una respuesta inflamatoria sistémica en un paciente. Una forma de realización para diagnóstico preferida es el uso de los anticuerpos de OB para detectar la cantidad de OB presente en una muestra de sangre tomada de un paciente que presenta una dolencia SIRS tal como sepsis, shock séptico, y similares. La determinación de los niveles de OB es útil en los síndromes sistémicos de respuesta inflamatoria (SIRS) que se caracterizan por un agudo incremento en los mediadores inflamatorios, tales como IL-1\beta, II-6, TNF, LPS y similares. Se señalan tales dolencias en los pacientes preoperatorios sometidos a ayuno, en pacientes con lesiones agudas tales como quemaduras o trauma, en pacientes con SIRS, o con infecciones bacterianas en curso o aquellos que reciben TNF-\alpha para el tratamiento de tumores y en personas que padecen de hipotermia.

Aunque existe una pequeña similaridad de secuencia entre las proteínas OB y otras moléculas, la conformación tridimensional de la molécula de proteína OB es análoga a la de diversas citoquinas helicoidales de cadena larga: cuatro regiones alfa hélice principal, A-D, conectadas por bucles cortos y regiones hélice secundaria (Zhang, F., y col, Crystal Structure of the obese protein leptin-E1DD, Nature 387: 206-209 (1997)).

Tal como se usa en el presente documento, un análogo conformacional de la proteína OB es una molécula que tiene sustancialmente las mismas características conformacionales en su estructura tridimensional que las que se requieren para la activación del receptor OB. Entre los ejemplos de dichas características conformacionales se incluyen la conformación de la hélice principal A, la conformación de la hélice principal D y el enlace disulfuro que mantiene la relación geométrica entre las hélices principales A y D. De esta manera, las sustituciones de aminoácidos que conservan las características conformacionales de la molécula, por ejemplo, en las regiones bucle que conectan las hélices principales, podrían producir análogos conformacionales de la proteína OB.

Se ha demostrado que los péptidos derivados de la región de la proteína OB procedentes de los restos de aminoácidos 106 a 140, tan cortos como aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, son efectivos en la mimetización de la acción de la proteína OB recombinante de longitud completa (Grasso, P., y col., In vivo Effects of Leptin-Related Synthetic Peptides on Body Weight and Food Intake in Female ob/ob Mice: Localization of Leptin Activity to Domains Between Amino Acid Residues 106 - 140, Endocrinology 138: 1413-1418 (1997)). Tal como se usa en el presente documento, "péptidos relacionados con OB" se refiere a los péptidos naturales o sintéticos derivados de la región de la proteína OB desde aproximadamente el residuo de aminoácido 106 a aproximadamente el residuo de aminoácido 140 e incluye las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos.

El término "anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales se usa en el presente documento para referirse a las moléculas de inmunoglobulina y a las porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, las moléculas que contienen un emplazamiento de combinación con el anticuerpo o paratopo. Las moléculas de anticuerpo de ejemplo son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas, y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, que incluyen aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab' y F(ab')_{2}. Una composición de anticuerpo de la presente invención se caracteriza porque contiene las moléculas de anticuerpo que inmunoreaccionan con la proteína OB o porciones de la misma.

Una composición de anticuerpo de la presente invención está normalmente producida mediante la inmunización de un mamífero con un inóculo de la proteína OB o algún fragmento de la proteína OB, sólo o en combinación con un adyuvante adecuado tal como el adyuvante de Freund, e induce en el mamífero por tanto, las moléculas de anticuerpo que tienen la inmunoespecificidad apropiada. A continuación se recogen las moléculas de anticuerpo procedentes del mamífero y se aíslan en la extensión deseada mediante técnicas bien conocidas tales como, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad. Se puede usar, inter alia la composición de anticuerpo producida de esta manera en los procedimientos y sistemas para diagnóstico de la presente invención o en la preparación de las composiciones terapéuticas de la presente invención.

Se pueden usar también con la presente invención las composiciones de anticuerpos monoclonales. Una composición de anticuerpo monoclonal contiene, dentro de los límites detectables únicamente una especie de emplazamiento de combinación del anticuerpo capaz de enlazar de manera efectiva con la proteína OB. De esta manera, una composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención muestra normalmente una afinidad de enlace única por la proteína OB incluso aunque esta pueda contener anticuerpos capaces de enlazar otras proteínas diferentes a la proteína OB. Los anticuerpos monoclonales preferidos son aquellos que enlazan con porciones de la proteína OB que se necesitan para la activación del receptor OB, tales como la hélice A, la hélice D, o las regiones de la proteína OB que mantienen las posiciones relativas de las hélices A y D que se requieren para la activación del receptor OB. Se han descrito los anticuerpos monoclonales frente a la proteína OB y se ha discutido su preparación en (Tsuruo, Y, y col, Horm. Metab. Res. 28: 753-755 (1996). Se suministran también los anticuerpos monoclonales por los vendedores a petición del cliente (por ejemplo, Alpha Diagnostic Internacional, Inc, San Antonio, TX). Los anticuerpos anti-OB policlonales purificados están comercialmente disponibles de diversas fuentes (R&D Systems, Minneapolis, MN; Research Diagnostics, Inc., Flanders, N.J.; Linco Research, Inc, St. Charles, MO; Affinity BioReagents, Inc., Goklen, CO).

Se lleva a cabo la determinación de los niveles de OB con los anticuerpos de OB mediante procedimientos de ensayo, entre los que se incluyen ELISA, radioinmunoensayo (RIA), análisis Western blot, y similares, que son familiares para una persona normalmente experta en la técnica. A continuación se comparan los niveles de proteína OB determinados con los niveles normales para determinar el estado del paciente, por ejemplo, en ayunas, en momentos del día, índice de masa corporal (BMI), acondicionamiento aeróbico, sexo, etc. Por ejemplo, el intervalo normal encontrado para varones delgados a las 8 a.m fue de 12,0 \pm 4,4 ng/ml (Sinha, M. K., y col., Nocturnal Rise of Leptin in Lean, Obese, and Non-insulin-dependent Diabetes Mellitus Subjects, J. Clin. Invest. 97: 1344-1347 (1998). Véase también Horn, R. y col., Radioimmunoassay for the detection of leptin in human serum. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 104; 454-458 (1996); McGregor, G. P., y col., Radioimmunological measurement of leptin in Plasma of Obese and Diabetic Human Subjects, Endocrinology 137: 1501-1504 (1996), Se ha encontrado recientemente que la proteína OB está presente en la circulación en ambas formas, enlazada y libre, y que la relación de las dos formas es diferente en sujetos delgados y obesos (Sinha, M. K., y col., Evidence of Free and Bound Leptin in Human Circulation, Studies in Lean and Obese Subjects and During Short-Term Fasting, J. Clin. Invest. 98: 1277-1282 (1996)). La relación de formas libres y enlazadas con la actividad biológica de la proteína OB puede considerarse en el contexto de los ensayos con la proteína OB.

En una forma de realización alternativa, se llevaron a cabo numerosos ensayos inmunohistoquímicos del receptor OB-R sobre materiales de biopsia de tejidos usando protocolos estándar. Una biopsia de tejido preferido es una biopsia de hígado.

Aplicaciones terapéuticas

Las aplicaciones de la presente invención incluyen el uso de un ligando frente a OB-R para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una dolencia de un síndrome sistémico de respuesta inflamatoria (SIRS), en el que el ligando frente a OB-R es tal como se enumera en la reivindicación 1. Entre los ligandos agonistas de OB-R adecuados se incluyen la proteína OB recombinante, el análogo conformacional del péptido de la proteína OB humana que comprende las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos y los péptidos relacionados con OB tal como se enumera en la reivindicación 1. Un ligando agonista de OB-R preferido es la proteína OB humana recombinante. Un intervalo de dosificación adecuado para la proteína OB humana recombinante está comprendido entre aproximadamente 1 microgramo por kilogramo de peso corporal y aproximadamente 50 microgramos por kilogramo de peso corporal. Se usan los péptidos relacionados con OB en un intervalo de dosificación comprendido entre aproximadamente 0,1 microgramos por kilogramo de peso corporal y aproximadamente 5 microgramos por kilogramo de peso corporal, ajustando la dosificación para tener en cuenta las diferencias en potencia y la solubilidad reconocidas por la técnica (Grasso, P. y col., (1987)).

El modo de administración puede ser la infusión intravenosa durante un período extendido de tiempo o una inyección intravenosa o subcutánea única. Se puede administrar la dosis diaria como una dosis única o dividida en múltiples dosis proporcionadas a intervalos durante el día.

En una forma de realización adicional, la invención proporciona el uso de un ligando agonista de OB-R para la fabricación de un medicamento para reducir los efectos tóxicos de las citoquinas terapéuticas, tal como se enumera en la reivindicación 5. Por ejemplo, para contrarrestar los efectos secundarios tóxicos posibles de los inductores de la expresión de OB-R tales como las citoquinas terapéuticas, se administran tales sustancias en combinación con los ligandos agonistas de OB-R. Es útil la administración de dichas composiciones para las dolencias en las que se administran normalmente las citoquinas con un objetivo terapéutico tal como el tratamiento de un tumor, con el fin de proporcionar protección efectiva mediante los ligandos agonistas de OB-R de los efectos secundarios metabólicos indeseados. La sobre regulación de OB-R permite mediar el efecto terapéutico completo mediante los ligandos agonistas de OB-R tales como la proteína OB. Un intervalo de dosificación adecuado para la proteína OB recombinante humana está comprendido entre aproximadamente 1 microgramo por kilogramo de peso corporal y aproximadamente 50 microgramos por kilogramo de peso corporal.

Se ha encontrado que la proteína OB es un importante factor de defensa del huésped frente al estrés de la endotoxina. No se produjo el efecto protector de la proteína OB frente a la endotoxina suprimiendo la expresión de los mediadores inflamatorios principales, ya que los niveles de ARNm de IL-1\alpha, IL-1\beta, TN-\alpha, e INOS, en el pulmón y el bazo fueron similares en todos los ratones tratados con LPS con respecto a las manipulaciones experimentales (Figura 16). Una comparación de los cuatro grupos de ratones reveló correlaciones sorprendentes entre la proteína OB disponible, la supervivencia frente al shock de la endotoxina (Figuras 10 y 11), el mantenimiento de la temperatura corporal (Figuras 12 y 13) y la pérdida de peso corporal (Figuras 14 y 15).

Los ratones tratados con anti-OB Ab mostraron la menor pérdida de peso corporal y tuvieron la hipotermia más intensa incluso con una dosis relativamente baja de LPS. Inversamente, los ratones tratados con OB tuvieron también una mayor pérdida de peso que cualquiera informada en la bibliografía (16% en las primeras 24 horas, en comparación con un promedio del 10% informado por los otros grupos). Los ratones en estos ensayos fueron emparejados por edad, sexo y peso, alimentados con la misma dieta, y, por tanto, deberían tener un almacenamiento de energía muy similar. Las diferentes respuestas a la endotoxemia fueron similares debido a las diferencias en la movilización y disipación de la energía metabólica, que, a la vez, se atribuyeron a la manipulación experimental de de los niveles de proteína OB en circulación.

Cuando se varía el nivel de proteína OB en circulación, se altera de manera correspondiente la energía movilizada para resistir el estímulo de la endotoxina y se afecta el resultado de la respuesta del huésped al estrés de la endotoxina, los ratones ob/ob, que carecen de proteína OB debido a una mutación en el gen ob resultaron ser muy sensibles al ataque de LPS: una dosis tan baja como 2 \mug por gramo de peso corporal produjo una rápida caída de la temperatura corporal y la muerte.

Los resultados sugieren también la existencia de dos rutas de termogénesis y termostasis. El tratamiento con anti-OB Ab per se no produjo hipotermia en ratones normales, sugiriendo que la termostasis bajo condiciones no patológicas era ampliamente independiente de la proteína OB. Sin embargo, cuando se proporciona LPS, los ratones tratados con anti-OB Ab desarrollaron una intensa hipotermia, indicando que la termogénesis en respuesta a la endotoxemia llegó a ser dependiente de la proteína OB. Un corolario de este modelo es que los defectos genéticos que afectan la ruta OB/OB-R tendrán una respuesta hipotérmica severa a la endotoxina. Por tanto, los ratones ob/ob que transportan una mutación en el gen OB-R respondieron a una dosis baja de inyección de LPS de una manera muy similar a la vista en los ratones ob/ob (no se muestran los datos), a pesar del incremento de nivel de la expresión de OB.

Ejemplo 1 Inducción de la expresión de OB-R mediante la administración de LPS

La inyección de LPS y citoquinas, sustancias que se asocian con la sepsis, el shock séptico o el SIRS produce un aumento en la expresión del receptor OB en los órganos periféricos tales como el hígado, pero no en el cerebro.

La inyección intravenosa de los lipopolisacáridos (LPS), IL-1\beta, TNF-\alpha e IL-6 induce la expresión del receptor OB en el hígado y otros órganos periféricos, pero no en el sistema nervioso central (SNC). Para investigar el significado funcional del incremento de la expresión de OB-R se usó un antisuero anti-OB para neutralizar la proteína OB endógena en ratones antes de la inyección de LPS. La neutralización de la proteína OB conduce a una intensa hipotermia, pérdida insignificante de peso corporal y la muerte en respuesta a una dosis, por otra parte no letal, de LPS. A la inversa, los ratones a los que se administró proteína OB recombinante de ratón llegaron a ser más resistentes a LPS y sobrevivieron a una dosis por otra parte letal. Los ratones tratados con proteína OB mantuvieron una temperatura corporal relativamente alta y mostraron una fuerte pérdida de peso. Estos resultados sugieren que la proteína puede promover la movilización de la energía para compensar el incremento del consumo de energía en la endotoxemia, y que la ruta OB/OB-R pueda jugar un importante papel en las respuestas críticas del huésped al estrés inflamato-
rio.

Procedimientos

De manera general, se usaron las técnicas estándar o las modificaciones publicadas; véase, generalmente, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)- Se inyectaron ratones CB57BL/6, de 5-8 semanas de edad y 17-20 g de peso por vía intravenosa con LPS (5 \mug por gramo de peso corporal, List Biological Laboratory, Campbell, CA), IL-1\beta (R&D Systems, Minneapolis, MN), IL-6 (2,5 \mug, Pharmingen, San Diego, CA), o TNF-\alpha (una donación de Genentech, San Francisco, CA). Se sacrificaron los animales a las 0, 4, 8 ó 24 horas, o a los 2, 3 ó 5 días después de la inyección.

Se diseccionaron tejidos procedentes de diversos órganos, entre los que se incluyen el cerebro, hígado y riñón y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se preparó el ARN total a partir de los tejidos congelados por un procedimiento de etapa líquida (Chomczynski, P. & Sacchi, N., Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction, Analytical Biochemistry 162: 158-159 (1987).

Se llevaron a cabo los ensayos de protección de la RNasa tal como se ha descrito anteriormente (FENG, L., y col., Alternative Splicing of the NC1 Domain of the Human \alpha3(IV) Collagen Gene J. Biol. Chem. 269: 2342-2348 (1994); Xia, Y., y col., LPS-induced MCP-1, IL-1\beta, y TNF-\alpha mRNA Expression in Isolated Erythrocyte-Perfused Rat Kidney, Am. J. Physiol. 264: F774-F780 (1993). Se usó una alícuota de diez microgramos del ARN total combinado procedente de tres ratones tratados de manera similar para cada muestra en el ensayo de protección de la RNasa. Se disolvieron las muestras combinadas almacenadas en 10 \mul de formaldehído al 80%, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM y ácido piperazina-N,N'-bis(2-etanosulfónico) 40 mM, se calentaron a 85 grados Celsius durante 5 minutos. A continuación se hibridó cada muestra de diez microgramos con aproximadamente 1 x 10^{5} cpm (cuentas por minuto) de la ribosonda de sentido contrario marcada con [^{32}P]UTP apropiada a 55 grados Celsius durante al menos 10 horas. A continuación se digirió el ARN no hibridado con 50 unidades/ml de RNasa T1 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) y 24 \mug/ml de RNasa A a 30 grados Celsius durante una hora. A continuación se digirió la RNasa con 625 \mug/ml de proteinasa K (Boehringer Mannheim. Indianápolis, IN) durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Tras la extracción con fenol-cloroformo y precipitación con acetato de sodio-etanol, el ARN híbrido protegido en gel de poliacrilamida al 10% se desnaturalizó y se sometió a electroforesis. Se transfirieron los geles a papel de filtro 3M Whatman, se secaron y se expusieron a película Kodak X-Omat. Se desarrolló el autoradiograma resultante en un procesador Kodak X-Omat y se usó únicamente para la selección cuantitativa.

Se cuantificó la radioactividad debida a la hibridación de las secuencias diana con ribosondas marcadas con ^{32}P mediante el escaneo de los geles en un sistema de escaneo radioanalítico AMBIS (AMBIS Systems, San Diego, CA).

Se subclonó una sonda de ADNc de OB-Rb (desde la base 2548 a la base 2835 de OB-Rb, Gen-Bank^{TM}, con Nº de Acceso U46135) a partir de OB-Rb de ratón de longitud completa. Se clonó el ADNc de ratón de longitud completa para la forma larga de OB-R (Ob-Rb) a partir de una biblioteca de ADNc de hipotálamo de ratón (Stratagene, La Jolla, CA) y se verificó la secuencia frente a la de U46135.

Se clonó el ADNc de ratón de longitud completa para la forma corta de OB-R (OB-Ra) a partir de una biblioteca de ADNc de pulmón de ratón (Stratagene, La Jolla, CA). Se usó una sonda de 224 pb que incluyó desde la base 1250 a la base 1474 (tal como se indica en la secuencia de OB-Rb) de OB-Ra para el ensayo de protección de la RNasa. Se usó este fragmento, que comprende una secuencia que está compartida por todas las variantes de OB-Ra como una sonda para el nivel total de OB-R (OBR_{(t)}).

Se analizó la expresión de otras formas del ARNm de OB-R usando las sondas selectivas de las diferentes formas respectivas de OB-R. Las sondas designadas proporcionan protección completa a sus formas OB-R correspondientes y la protección parcial para otras formas OB-R. Se usó como control una sonda derivada de L32 (33-126, Gen-Bank^{TM} con Nº de Acceso XO6483), un gen doméstico que codifica la proteína ribosómica.

Se clonaron las sondas OB-Rc y OB-Re mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) del ARN total de hígado de ratones C57BL/6 tratados con LPS. Se conocen en la técnica los protocolos RT-PCR (por ejemplo, páginas 15-13 - 15-15 de Ausebel, F. M., y col., Short Protocols in molecular Biology, 2ª Edición, John Wiley and Sons, Nueva Cork, (1992)).

Un protocolo adecuado para RT-PCR es una modificación del descrito anteriormente (Feng, L., y col., J. Biol. Chem. 259: 2342-2348, 1994). Se relacionan en la Tabla 1 a continuación los cebadores usados en la RT-PCR. Se sintetizaron los oligonucleótidos cebadores usando un sintetizador ABI modelo 380B (Applied BioSystems, Foster City, Ca).

TABLA 1 Cebadores PCR

	Secuencia
OB-Rc de sentido directo	5'-GCTATCGACAAGCAGCAGAAT-3'	(SEC DE ID Nº 8)
OB-Rc de sentido contrario	5'-TGAACACAACAACATAAAGCCC-3'	(SEC DE ID Nº 9)
OB-Re de sentido directo	5'-TGTTATATCTGGTTATTATTGAATGG-3'	(SEC DE ID Nº 10)
OB-Re de sentido contrario	5'-CATTAAATGATTTATTATCAGAATTGC-3'	(SEC DE ID Nº 11)

Se llevó a cabo la síntesis de la primera cadena del ADNc usando ARN total procedente de hígado de los ratones CB7BL/6 tratados con LPS y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia de murina con un cebador hexanucleótido aleatorizado, ditiotreitol 10 mM, 1mM de cada uno de los dNTP, con 200 unidades de transcriptasa inversa. Se calentó cada mezcla de reacción a 95 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación se llevó a cabo la PCR con alícuotas separadas de la mezcla de reacción con los cebadores apropiados durante 35 ciclos, usando 60 grados Celsius para el templado.

Se escindieron los segmentos de ADNc usados para generar ribosondas mediante las endonucleasas de restricción apropiadas y se subclonaron en el emplazamiento de clonación múltiple de un vector de transcripción estándar. Los vectores de transcripción adecuados incluyen un vector escogido a partir de las series PGEM (Promega, Madison, WI). Se sintetizaron las ribosondas de cadena única marcadas usando los protocolos de transcripción in vitro estándar, proporcionados aquellos por el fabricante u otros protocolos estándar (por ejemplo, Ausebel, F. M., y col., páginas 4-18 - 4-21) con la RNA polimerasa del bacteriófago apropiado (por ejemplo, SP6 o T7. Las ribosondas contenían regiones correspondientes al poliligante del vector de manera adicional a la región que corresponde a la secuencia diana, y de esta manera, fueron más largas que las bandas protegidas. Se usó a lo largo del estudio como control el gen L32 ribosómico de ratón, un gen "doméstico" expresado de manera constitutiva.

Resultados

Cuando se administró LPS a los ratones C57BL/6 se detectó una fuerte inducción de la expresión total de OB-R (OB-R_{(t)}) en numerosos órganos periféricos (Figura 1), pero no en diversas áreas del sistema nervioso central, tales como el hipotálamo, que se sabe que expresan el OB-R (comparar la Figura 1 y la Figura 6). El incremento de la expresión de OB-R fue más importante en el hígado, el emplazamiento principal de la regulación metabólica. El incremento de la expresión del ARNm de OB-R en el hígado fue dependiente de la dosis de LPS y alcanzó el pico entre las 24 y las 48 horas después de la inyección de LPS (Figura 1).

De manera inesperada, los ensayos de protección de la RNasa usando sondas específicas para las formas alternativamente ayustadas del ARNm de OB-R revelaron que se indujo también la forma larga, OB-Rb, en el hígado hasta un nivel comparable al encontrado en el hipotálamo de ratón ob/ob y mayor que la del hipotálamo del ratón control delgado (Figura 2). Sin embargo, la mayoría del OB-R hepático fueron las formas OB-Ra, OB-Rc (Figura 3) y OB-Re (Figura 4). Fue indetectable la expresión de OB-Rd en el hígado (no se muestran los datos).

De manera adicional a LPS, se indujo la expresión de OB-R mediante las citoquinas IL-6, IL-1\alpha y TNF-\alpha (Figura 5). Al contrario que un informe reciente (12), no se encontró incremento detectable en la expresión de OB en el tejido adiposo blanco en los ratones tratados con LPS, pero se detectó una inducción distinta de la expresión del ARNm de OB en la glándula adrenal (Figura 4). No se encontró la expresión del ARNm de OB en el cerebro, corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo, músculo, estómago, duodeno, íleon, o colon de los ratones tratados con LPS (no se muestran los datos).

Ejemplo 2 Producción de proteína OB recombinante

Se expresó la proteína OB recombinante en E. coli usando un vector de expresión procariota y se extrajo de los cuerpos de inclusión. Se conocen en la técnica y también son adecuados para la expresión de la proteína OB otros sistemas de vectores y células huésped que incluyen células eucariotas. Véase, de manera general, Ausubel, F. M., y col., Short Protocols in Molecular Biology, 2ª Ed., páginas 16-1 a 16-89.

Se clonó la región de codificación del ADNc de OB de ratón (65-619, Gen-Bank^{TM} con Nº de Acceso Nº U18812) mediante la RT-PCR del ARN total del tejido adiposo blanco de C57BL/6. Se subclonó la región de codificación en el vector de expresión, pETM1 (FENA, L, y col., J. Biol. Chem. 269: 2342-2348, 1994), para expresar una proteína OB recombinante de ratón etiquetada HIs. Se ilustra en la Figura 8 la construcción de pETM1 a partir del vector pET-11a comercialmente disponible (Novagen, Madison, WI).

Después que se indujo la expresión de la proteína OB, se cosecharon las bacterias y se extrajeron los cuerpos de inclusión con un tampón que contenía urea 6M. Se cargó el extracto en una columna de afinidad NI-NTA (Quiagen, Chatsworth, CA) y se llevó a cabo el procedimiento de purificación tal como se ha descrito anteriormente (FENG, y col. (1994)). Se replegó la proteína en la columna añadiendo tampón de replegado que contenía CaCl_{2} 5 mM / Tris 20 mM / NaCl 0,2 M con un gradiente de urea de 4 M - 0,5 M a una velocidad de aproximadamente 0,5 ml / minuto. Tras el replegado, la proteína se eluyó con imidazol 80 mM / CaCl_{2} 5 mM / Tris 20 mM / NaCl 0,2 M / urea 0,5 mM y a continuación se dializó frente a una solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aumentaron los anticuerpos policlonales inmunizando un conejo con la OB recombinante de ratón y adyuvante de Freund usando los procedimientos estándar. Se usó antisuero en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 3 Efectos de los anticuerpos anti-OB sobre el metabolismo

La administración intravenosa de anticuerpos dirigidos contra la proteína OB se opone de manera efectiva a los efectos de la proteína OB endógena.

Se produjo la proteína OB recombinante de ratón en un sistema de expresión de E. coli tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, y se usó para generar anticuerpo anti-OB policlonal de conejo. El anticuerpo, cuando se inyectó por vía intravenosa en ratones, estimuló la ingesta de alimento, conduciendo a una rápida ganancia de peso, y de esta manera fue efectivo en el bloqueo de la función de la proteína OB. En la Figura 9 se muestran los resultados.

Se alojaron ratones C57BL/6 hembra, de 6-8 semanas de edad y entre 15-17 g de peso en grupos de cuatro por jaula y se adaptaron a un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 horas (luz desde las 6.00 a las 18:00). Se proporcionó a los ratones una inyección intravenosa diaria de 0,2 ml de antisuero anti-OB o suero preinmune de conejo ("vehículo") a las 10 p.m. tras su ingesta de alimento en la fase de oscuridad inicial. Se midió su peso corporal a las 10 a.m. del día siguiente.

Se ilustra en la Figura 9 la ganancia de peso inducida por el antisuero anti-OB. Se expresan los datos como promedio \pm S.E.M. (N = 8). Mientras que el peso del grupo control permaneció esencialmente constante durante la semana, el grupo tratado con anti-OB mostró un incremento de peso en la primera pesada que continuó durante el período completo del estudio.

Ejemplo 4 Efectos de los anticuerpos anti-OB y la proteína OB recombinante sobre la respuesta al shock endotóxico

El hecho de que las variantes OB-R inducidas en el hígado fueran formas predominantemente cortas despierta la cuestión de la relevancia funcional de la expresión de la OB-R hepática. OB-Rb es la forma principal expresada en el hipotálamo, mientras que el plexo coroideo expresa únicamente OB-Ra. Que la mutación en ratones db/db afecte a OB-Rb, pero no a OB-Ra, sugiere que OB-Rb es crucial para regular la ingesta de alimento y OB-Ra puede actuar como un transportador de la proteína OB. De acuerdo con esto, la importante expresión de OB-R en el hígado podría iniciar la transducción de la señal intracelular o, de manera alternativa, mediar en la aclaración de la proteína OB. Encontramos que la administración de anticuerpo anti-OB neutralizante (Ab) o proteína OB en ratones tratados con LPS, distinguió entre las dos alternativas.

Se usaron para este estudio ratones C57BL/6 macho de 5-8 semanas de edad y entre 17 y 21 g de peso corporal. Para el tratamiento antisuero, se proporcionó a los ratones una inyección i.v. de 200 \mul de antisuero de conejo. A continuación se coinyectó LPS en una dosis de 6 \mug por gramo de peso corporal con una segunda dosis de anticuerpos anti-OB a los ratones pretratados. Se disolvió el LPS en el antisuero en una concentración de 0,8 mg/ml y se inyectó por vía intravenosa 4 horas después del tratamiento inicial de antisuero. Se eliminó la alimentación de las jaulas de ratón durante el período de pretratamiento de 4 horas para evitar cualquier diferencia en la ingesta de alimento resultante de la hiperfagia inducida por el antisuero anti-OB, y se volvió a poner tras la inyección de LPS.

Aunque esta dosis de LPS no fue letal para los ratones C57BL/6 tratados con suero preinmune de conejo, todos los ratones en el grupo tratado con anti-OB Ab murieron dentro de las 40 horas. La Figura 10 ilustra los resultados de los tres grupos de ratones, aquellos pretratados con antisuero anti-OB (anti-OB, N = 16), suero preinmune de conejo control, (N = 16) o los otros tres antisueros de conejo no relacionados ("Anti-X", N = 3 para cada antisuero). Este efecto sensibilizante del LPS fue específico para anti-OB AB, debido a que sobrevivieron todos los ratones tratados de manera similar con los otros tres anticuerpos no relacionados ("Anti-X") (Figura 10).

En comparación, los ratones tratados con proteína OB (5 \mug por gramo de peso corporal mOB, N = 16) fueron capaces de sobrevivir a dosis mayores de LPS (10 \mug por gramo de peso corporal) que fueron fatales para el grupo control de ratones que recibieron sólo el vehículo (control, N = 16). Se prepararon la proteína OB de ratón y el LPS en solución salina a una concentración de 0,5 mg/ml y 1 mg/ml, de manera respectiva, y se inyectaron por vía intravenosa en los ratones. Se inyectó una solución vehículo usada para la diálisis de la proteína OB en los ratones control. Para eliminar cualquier efecto circadiano, se llevaron a cabo todos los experimentos en diferentes días a las mismas horas. Se examinaron los ratones a intervalos de 4 horas después de la inyección de LPS durante las primeras 24 horas, y se monitorizó la supervivencia durante 7 días tras la inyección de LPS. En la Figura 11 se muestran los resultados. La dosis de LPS mató a todos los ratones en el grupo control dentro de las 24 horas. Sin embargo, en el grupo experimental, el tratamiento con proteína OB confirió resistencia completa a los ratones a esta dosis de endotoxina- Los ratones tratados con OB mostraron síntomas notablemente menos severos de endotoxemia, permaneciendo alertas y receptivos a los toques y otras manipulaciones, y una recuperación rápida.

Se monitorizaron los efectos de la proteína OB y los anticuerpos anti-OB sobre la temperatura corporal en los mismos grupos de ratones. Se realizaron las medidas de las temperaturas centrales corporales mediante la inserción de una sonda termistor (Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio) en el colon, 1,5 cm más allá del recto. Se llevaron a cabo las medidas del peso corporal en una balanza digital portátil (Ohaus, Florham Park, NJ).

Los ratones que recibieron anticuerpos anti-OB, que murieron en último extremo, mostraron temperaturas corporales más bajas (Figura 12) y menor pérdida de peso (Figura 14) que la del grupo control correspondiente que sobrevivió. Inversamente, los ratones que recibieron proteína OB, y que sobrevivieron al shock endotóxico, mostraron temperaturas corporales mayores (Figura 13) y más pérdida de peso (Figura 15) que las del grupo control correspondiente que sucumbió.

Aunque la administración de la proteína OB y los anticuerpos anti-OB tuvo efectos significativos sobre la supervivencia, el peso corporal y la temperatura corporal, existió un pequeño efecto sobre la expresión de los ARNm de iNOS, IL-1\alpha, IL-1\beta, y TNF-\alpha en el pulmón y el bazo (Figura 16) Se trataron los ratones tal como se ha descrito anteriormente (Figuras 10-15).

Se llevaron a cabo los ensayos de protección de la RNasa tal como se han descrito en el Ejemplo 1. Cada muestra fue de 5 \mug de ARN total y se usó para cada muestra en el ensayo de protección de la RNasa. Se produjeron las ribosondas tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 basándose en los siguientes fragmentos de ADNc: IL-1\alpha (desde la base 172 a la base 366, con Nº de Acceso X01450, SEC DE ID Nº 3), IL-1\beta (desde la base 500 a la base 671, con Nº de Acceso M15131, SEC DE ID Nº 4), TNF-\alpha (desde la base 428 a la base 557, con Nº de Acceso M11731, SEC DE ID Nº 5), INOS de ratón (desde la base 2404 a la base 2698, con Nº de Acceso M92649, SEC DE ID Nº 6), y L32 (desde la base 33 a la base 126, con Nº de Acceso X064383, SEC DE ID Nº 7).

Se observó un cambio relativamente pequeño en el modelo de expresión de estos marcadores (Figura 16) sugiriendo que estas acciones protectoras de las proteínas OB son directas y no indirectas y mediadas por estas citoquinas.

Se pretende que las anteriores sean ilustrativas de la presente invención, pero no limitantes. Se pueden efectuar numerosas variaciones y modificaciones de la presente invención sin apartarse del alcance de la invención, tal como se define mediante las reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Fang, Lili Chen, Sizhong Xia, Yiyang

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICOS PARA REGULAR LA MOVILIZACIÓN DE ENERGÍA CON LA PROTEÍNA OB Y LOS ANTICUERPOS OB.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Olson & Hierl, Ltd.

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(B)

CALLE: North Wacked Drive nº 20, planta 36

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(C)

CIUDAD: Chicago

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(D)

ESTADO: IL

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

ZIP: 60606

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentin Modelo 1.0, Versión nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-JUN-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US/918.972

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-JUN-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Olson, Arne M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 30.203

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE EXPEDIENTE/DE REFERENCIA: TSRI540.1PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 312-580-1180

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 312-580-1189

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2793 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mus musculus

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 1:

1

2

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 2

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

LONGITUD: 3862 pares de bases

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(F)

TIPO: ácido nucleico

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(G)

TIPO DE CADENA: doble

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(H)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 2:

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100

3

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 3

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

LONGITUD: 1974 pares de bases

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(J)

TIPO: ácido nucleico

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(K)

TIPO DE CADENA: doble

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(L)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 3:

5

6

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(M)

LONGITUD: 1339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(N)

TIPO: ácido nucleico

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(O)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(P)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 5

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(Q)

LONGITUD: 1629 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(R)

TIPO: ácido nucleico

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(S)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(T)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(U)

LONGITUD: 4110 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(V)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(W)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(X)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 6:

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(Y)

LONGITUD: 465 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(Z)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(AA)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(BB)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

ORGANISMO: Rattus norvergicus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(CC)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(DD)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(EE)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(FF)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTATCGACA AGCAGCAGAA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(GG)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(HH)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(II)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(JJ)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAACACAAC AACATAAAGC CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(KK)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(LL)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(MM)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(NN)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(J)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTTATATCT GGTTATTATT GAATGG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(OO)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(PP)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(QQ)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(RR)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DE SENTIDO CONTRARIO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(K)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC. DE ID. Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTAAATGA TTTATTATCA GAATTGC

\hfill

27

Claims (8)

1. El uso de un ligando agonista de OB-R para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una dolencia de síndrome sistémico de respuesta inflamatoria (SIRS), en el que dicho ligando agonista de OB-R se selecciona entre:

proteína OB humana recombinante;

un análogo conformacional de péptido de la proteína OB humana que comprende las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos; o

un derivado de péptido de la región de la proteína OB entre el residuo de aminoácido 106 y el residuo de aminoácido 140, que incluye de manera opcional las sustituciones conservativas de los aminoácidos.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando agonista de OB-R es la proteína OB humana recombinante para la administración en una cantidad comprendida entre 1 microgramo por kilogramo de peso corporal y 50 microgramos por kilogramo de peso corporal.

3. El uso de la reivindicación 1 en el que el ligando agonista de OB-R es un derivado de péptido de la región de la proteína OB desde el residuo de aminoácido 106 al residuo de aminoácido 140, que incluye de manera opcional las sustituciones conservativas de los aminoácidos.

4. El uso de la reivindicación 1 en el que la dolencia SIRS es la sepsis.

5. El uso de un ligando agonista de OB-R en la fabricación de un medicamento para reducir los efectos tóxicos de las citoquinas terapéuticas, en el que dicho ligando agonista de OB-R se selecciona entre:

proteína OB humana recombinante;

un análogo conformacional de péptido de la proteína OB humana que comprende las sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos; o

un derivado de péptido de la región de la proteína OB entre el residuo de aminoácido 106 y el residuo de aminoácido 140, que incluye de manera opcional las sustituciones conservativas de los aminoácidos.

6. El uso de la reivindicación 5 en el que el ligando agonista de OB-R es la proteína OB humana recombinante.

7. El uso de la reivindicación 6 en el que la cantidad de proteína OB humana recombinante por dosis es 1 microgramo por kilogramo de peso corporal a 50 microgramos por kilogramo de peso corporal.

8. El uso de un anticuerpo capaz de enlazar con la proteína OB para la fabricación de una composición para la detección de una respuesta inflamatoria sistémica en un paciente.