CN1408724A - 新的睾丸功能相关蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人和小鼠的新型睾丸功能相关蛋白RabJ(Rab protein with J domain)。本发明还提供编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。还公开了编码这种新型睾丸功能相关蛋白RabJ的多核苷酸的用途以及hRabJ的基本生化性质。本发明还涉及该分子在细胞内的定位以及其在睾丸生精过程中的作用。

Description

新的睾丸功能相关蛋白及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码睾丸功能相关蛋白RabJ(一种细胞内吞调控蛋白)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的与睾丸生精和个体发育有关的新型Rab蛋白。

背景技术

近年来，蛋白转运逐渐引起了众多科学家的注意，这涉及到生命的本质，与细胞物质更新、感受外界刺激、细胞内外物质的转运和信息的交流密切相关。外环境蛋白的摄取、转移、代谢和细胞自身合成蛋白的分泌、修饰、定位是一个严格调控的过程。在分子水平上，目前认为一个Rab基因家族在其中起者非常关键的作用。

Rab基因是一个从属于Ras超家族的具有GTP酶活性的小分子量蛋白。在基因水平上，该家族的一个特点是具有多种异构体，基因序列长短不一，功能也各有不同；在蛋白水平上，该家族的分子都有磷酸/镁离子结合序列和GTP结合的功能域，有的甚至还有磷酸化的修饰位点；在生化活性上，其典型的特征是能够与GTP结合，而且自身又具有缓慢GTP水解活性，脱磷酸后形成GDP-Rab的存在形式，而且随着GTP-Rab向GDP-Rab的转换，该蛋白也从膜结合形式转变为胞浆存在形式；在细胞水平上，该家族蛋白的一个显著特点是都定位于特定的细胞器或亚细胞膜性结构上，而且负责某一个特定的蛋白转运步骤；在生物学功能上，目前认为Rab家族在囊泡的形成、定向锚着和融合等蛋白转运的关键步骤中起着主要的调控作用。虽然Rab在调控蛋白转运的过程中意义重大，但该功能仍需要相关调控蛋白的作用，例如GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)、GDP解离抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)、鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor，GEF)等分子都促进或抑制Rab的生物学行为。目前，该家族的成员已经达到了近40多个(包括其各自的异构体)。

对Rab基因的研究主要集中在基础生命科学领域，发现了许多Rab分子在特定蛋白转运过程中的作用。例如Rab1a、Rab1b、Rab2定位于内质网和高尔基体并且介导二者之间的物质转运；Rab6、Rab8、Rab12与高尔基体相关，介导不同高尔基部位之间的物质转运。作为细胞与外界环境之间交流的始发事件，与内吞相关的Rab也已经发现。例如，Rab4a定位于早期内吞体，介导早期内吞体的膜成分会到胞膜；Rab9定位于晚期内吞体，介导囊泡向高耳基体的转运。(Neuron，1993，Vol.11，789-799)。虽然研究集中在基础医学领域，然而亦有报道显示Rab基因在病理或生理情况下的临床潜在意义。例如人们发现Rab36与小儿神经系统恶性杆状肿瘤相关(Biochemical and BiophysicalResearch communications，1999，254，594-600)，Rab37表现为肥大细胞特异性分布，提示其与过敏反应、哮喘、炎症之间有联系(FEBS Letters，2000，470 61-64)；Rab5a可能与中性粒细胞的颗粒分泌相关，提示其在非特异性抗感染免疫中的潜在意义(Experimental CelResearch，1996，227，367-373)；Rab18在组织胺刺激以后表达上调，提示其在炎症中的作用(FEBS Letters 2000，466，148-154.)。另外研究显示Rab蛋白在激素(胰岛素、生长因子等)、神经肽、神经递质的合成及分泌中有重要的作用。

睾丸是保证人类生命延续的基因库的所在地，其功能的正常发挥对于物种的遗传和延续至关重要。然而睾丸又是一个非常敏感和脆弱的器官，温度的升高、创伤、化学物质的作用等环境因素对于其功能影响深远，因此睾丸必须具有强大而且特殊的防护机制来保证自身功能的稳定。在诸多的保护机制中，一种行之有效的方法就是热休克蛋白(Heatshock protein)的快速合成及其所介导的自身合成(de novo synthesis)、阻止蛋白聚集和变性、促进保护修复相关基因的合成、保护mRNA减慢降解速率等功能发挥保护和促进修复的功能。(Annu.Rev.Genet.1988，22 631-677)在热休克蛋白家族中引人注目的一对可发生相互作用的分子便是DnaK/Hsp70家族分子和DnaJ/Hsp40家族分子之间所构成的伴侣分子对。DnaJ/Hsp40分子是DnaK/Hsp70的辅助分子，通过J功能域与DnaK/Hsp70的羧基端及中间部分结合，从而发挥其功能。J功能域是所有DnaJ/Hsp40家族分子所共有的，是DnaJ/Hsp40的特征性功能域。(Trends Biochem.Sci.1994，19 176-181；Curr.Biol.1999，9，R305-308)。

Rab基因调控的异常将引起多个系统的多种疾病，如哮喘、糖尿病、炎症、肿瘤、神经精神异常等多种疾病。因此Rab基因的发现将具有重要的意义，而一个在睾丸组织中优势表达的可以与热休克蛋白发生作用的Rab蛋白的发现将更有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的睾丸功能相关蛋白-RabJ蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。本发明的RabJ蛋白是一种Rab GTP酶和DnaJ/Hsp40同源分子。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的RabJ多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述RabJ多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中25-843位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1787位的序列；(c)具有SEQ ID NO：3中1-822位的序列；(d)具有SEQ ID NO：3中1-1091位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有RabJ蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达RabJ蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有RabJ蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的RabJ多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1000个或更多个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗RabJ多肽活性的化合物，以及抑制RabJ多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是RabJ多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在RabJ蛋白的方法，它包括：将样品与RabJ蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RabJ蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与RabJ多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进RabJ多肽活性的激动剂，或者筛选抑制RabJ多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的RabJ蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的RabJ多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗睾丸炎症、肿瘤、创伤，男性不育和发育异常等生殖系统疾病和其他多种疾病。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本

发明范围。

图1是本发明的人RabJ的cDNA序列，其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写字母表示。

图2是本发明的人和小鼠RabJ蛋白的全长氨基酸序列。

图3是本发明的人RabJ蛋白与Rab蛋白和DnaJ/Hsp40蛋白的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人RabJ，下方序列是Rab家族的蛋白或DnaJ/Hsp40蛋白。相同的氨基酸在两个序列之间用黑体标出，相似的氨基酸用灰体标出。

图4是本发明的hRabJ生化特性分析。

图5是本发明的兔源多抗的特异性鉴定和RabJ蛋白表达谱分析；

图6是本发明的RabJ在任何小鼠睾丸组织中分布的免疫组化分析；

图7是本发明的RabJ在细胞内的定位研究，pnm表示后核膜(post nucleamembrane)。

图8是本发明所发现的RabJ与Hsc70家族分子的相互作用。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，克隆了一个新的Rab基因-RabJ的核苷酸、蛋白序列以及其结构特征的分析：利用原核表达载体表达纯化了蛋白并研究了其基本的生化性质；经过制备兔源多克隆抗体，用Northern印迹、Western印迹、细胞内蛋白荧光标记和免疫组化等技术证明RabJ是优势表达在睾丸组织的新型Rab蛋白；利用绿色荧光蛋白融合载体以及稳定表达RabJ的293细胞株研究了其胞内定位；利用免疫共沉淀技术说明了RabJ与Hsc70分子间的相互作用。

在本发明中，术语“RabJ蛋白”、“RabJ多肽”或“睾丸功能相关蛋白RabJ”可互换使用，都指具有睾丸功能相关蛋白RabJ氨基酸序列(SEQ ID NO：2或4)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的睾丸功能相关蛋白RabJ。在本发明中hRabJ指人源的RabJ分子，而mRabJ指小鼠源的hRabJ的同源物。研究提示，RabJ可能参与睾丸的热防护和其他对机体不利因素的防护；可能可以用于生殖功能异常和睾丸疾病，如肿瘤、创伤、发育异常等的诊断和治疗；而且可能对于某些蛋白转运异常疾病的诊断和治疗也极有意义。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的RabJ蛋白或多肽”是指RabJ多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RabJ蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。RabJ多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括RabJ多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然RabJ多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“RabJ多肽”指具有RabJ多肽活性的SEQ ID NO.2或4序列的多肽。该术语还包括具有与RabJ多肽相同功能的、SEQ ID NO.2或4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RabJ多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RabJ DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RabJ多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RabJ多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RabJ多肽的可溶性片段。通常，该片段具有RabJ多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供RabJ多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然RabJ多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“RabJ多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                     表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。对于人RabJ而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于小鼠RabJ而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体；而“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：4的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码RabJ的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2或4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RabJ蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人RabJ核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RabJ蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RabJ多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码RabJ多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人RabJ多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人RabJ编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的RabJ多肽或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗RabJ蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗RabJ蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组RabJ多肽筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RabJ多肽功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人RabJ DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人RabJ基因产物或片段。较佳地，指那些能与人RabJ基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RabJ多肽的分子，也包括那些并不影响RabJ多肽功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人RabJ基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人RabJ基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RabJ多肽或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断RabJ多肽功能的抗体以及不影响RabJ多肽功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人RabJ基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人RabJ基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗RabJ多肽的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的RabJ多肽。此外，与RabJ多肽结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与RabJ多肽相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断RabJ多肽的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如RabJ多肽高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭RabJ多肽阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用RabJ多肽或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RabJ蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于炎症、肿瘤、神经系统，呼吸系统，内分泌系统和心血管疾病等多种疾病的治疗。在使用本发明RabJ蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RabJ多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的RabJ蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

RabJ多肽的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于RabJ蛋白的无表达或异常/无活性的RabJ蛋白的表达所致的细胞内吞、分泌或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的RabJ蛋白，以抑制内源性的RabJ蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将RabJ基因转移至细胞内。构建携带RabJ基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人RabJ基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人RabJ mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与RabJ多肽结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对RabJ多肽分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测RabJ多肽水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的RabJ多肽水平，可以用作解释RabJ多肽在各种疾病中的重要性和用于诊断RabJ蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在RabJ蛋白的方法是利用RabJ蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与RabJ蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RabJ蛋白。

RabJ蛋白的多聚核苷酸可用于RabJ蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，RabJ蛋白的多聚核苷酸可用于检测RabJ蛋白的表达与否或在疾病状态下RabJ蛋白的异常表达。如RabJ DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断RabJ蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用RabJ蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测RabJ蛋白的转录产物。

检测RabJ基因的突变也可用于诊断RabJ蛋白相关的疾病。RabJ蛋白突变的形式包括与正常野生型RabJ DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明RabJ蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1和图1A所示，它包含的多核苷酸序列全长为1787个碱基，其开放读框位于25-843位，编码全长为273个氨基酸的RabJ多肽(SEQ ID NO：2和图2)。该RabJ蛋白氨基端属于蛋白转运调控蛋白Rab家族分子，与Rab4和Rab5氨基酸序列高度同源，一致性可高达40％，相似性则可达60％；该蛋白的羧基端与DnaJ/Hsp40家族分子Hsj、CSP、Msj等分子同源(图3)。RabJ蛋白也包含三个GTP结合基序，三个磷酸/Mg2+结合基序和一个保守的J功能域。

Northern印迹分析表明在组织中优势表达于睾丸组织，在卵巢、脑、骨骼肌、心脏等仅有微弱表达，而在其他组织无表达。已进行的研究提示，RabJ可能为调控蛋白转运的蛋白，介导蛋白的跨核转运及内吞；也可能通过与Hsc70(heat shock cognate 70)的相互作用调控Hsc70介导的多种功能；或者作为Rab所要转运蛋白和Hsc70分子间的桥梁，介导Hsc70的跨核转运及其与Hsc70分子间的相互作用。因此，RabJ蛋白或其相关的拮抗剂、激动剂等可为诊断和治疗睾丸炎症和肿瘤，男性不育和发育障碍及其他蛋白转运相关疾病提供帮助，并可能直接为睾丸炎症、肿瘤、创伤及男性不育及发育障碍提供新的治疗途径，在男性避孕中可能具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人和小鼠RabJ cDNA的克隆

用Trizol(Gibco公司)提取人树突状细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptII克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO：1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQID NO：2所示)。此蛋白质被命名为人睾丸功能相关蛋白hRabJ(human Rab protein with Jdomain)，其编码基因命名为人睾丸功能相关基因hRabJ。序列SEQ ID NO：1A全长为1787bp，包括24的5′端非编码区和316bp的3′端非编码区，编码含273个氨基酸的多肽。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量约为30.7kD。BLAST分析表明其与已知基因不同，氨基端与人Rab4和Rab5氨基酸序列高度同源，一致性达45％，相似性达60％(图3A)，属于蛋白转运调控蛋白Rab家族分子；另外在该蛋白的羧基端与DnaJ/Hsp40蛋白的J功能域同源(图3B)。此外，在RabJ蛋白中也包含三个GTP结合基序，三个磷酸/Mg2+结合基序，这也进一步提示它可能参与蛋白转运的调控。

接着，以小鼠睾丸cDNA为模板，根据hRabJ两端序列设计引物，克隆并测序了小鼠的RabJ同源物mRabJ。该基因全长1091bp(SEQ ID NO：3和图1B)，编码274个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：4)，与hRabJ在蛋白水平有95％的同源性。也含有三个GTP结合基序，三个磷酸/Mg2+结合基序和一个约70个残基组成的保守性J功能域(图2)。

实施例2：用RT-PCR方法克隆人和小鼠RabJ的编码序列

用Trizol(Gibco公司)提取处于对数生长期HeLa细胞总RNA，取6mg细胞总RNA与0.5μgOligo-dT_12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μlddH₂O进行稀释。PCR扩增所用的引物如下：有义引物 5′CGGGATCCAATGGAGGCCAACATGCCGA 3′(SEQ ID NO：5)，反义引物5′GCGGTACCGACTACTTGATGTTTTTCAG 3′(SEQ ID NO：6)。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(TakaraInc.)，扩增参数为94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQID NO：1所示的编码区序列完全相同。

用相同的RT-PCR方法获得mRabJ编码序列，其中所用引物相同，只是模板采用小鼠睾丸cDNA而已。

实施例3人RabJ重组表达

在该实施例中，以实施例2中的人PCR扩增产物为模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人RabJ DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′端寡核苷酸引物序列为：

5′CGGGATCCGAGGCCAACATGCCGAAGCG(SEQ ID NO：7)

该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；

3′端引物序列为：

5′CGGGATCCTCACTTGATGTTTTTCAGGAGGG(SEQ ID NO：8)该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人RabJ的DNA序列。

将获得的PCR产物纯化后经BamH I酶切再与质粒pUC18按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的人RabJ cDNA BamH I酶切片段克隆至表达载体pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成载体pGEX-2T-RabJ，然后转化入DH5α。阳性克隆用PstI酶切鉴定插入方向，酶切产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了完整的RabJ编码序列。

挑表达RabJ的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.BraunLabsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到RabJ多肽。

用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端10个氨基酸与SEQ ID NO：2所示的N-端10个氨基酸残基完全相同。

实施例4 GST-hRabJ的生化性质分析

按照如下方法进行GTP结合实验和阻断实验：用10μg GST-hRabJ融合蛋白，10μg GST或10μg BSA作SDS-PAGE后，将蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，然后将膜在含5％BSA、100mM NaCl、0.5mM MgCl₂、50mM Tris.HCl(pH7.5)、20μ Ciα-³²P-GTP的溶液中(Buffer A)于4℃孵育过夜，然后用该缓冲液充分洗涤后，做放射自显影。另外，10μg GST-hRabJ融合蛋白或10μg GST或10μg BSA分别与25nM α-³²P-GTP溶于以下缓冲系统(Buffer B)；50mM Tris-HCl，2mM EDTA，1mM DTT，5mM MgCl₂，pH8.0。总体积为50μl。于30℃作用不同的时间，在各个时间点，取5μl溶于45μl冰冷的上述液体(不含α-³²P-GTP)中，快速用G 50 microspin-colomn除去未结合的游离α-³²P-GTP，然后溶于950μl预冷的Tris缓冲系统中，用于放射活性测定。从其中取3μl点样于硝酸纤维素膜上，作放射自显影。在缓冲液中加入100μM的GTP、GDP、GTPγS、ATP，然后于30℃结合1小时，G 50 microspin-colomn除去游离α-³²P-GTP后，加入950μl冰冷的缓冲液中以中止结合并用于放射活性测定。然后取3μl点样于硝酸纤维素膜上，做放射自显影(图4)。

GTP酶活性分析按下述方法进行：25μg GST-hRabJ融合蛋白与25nMγ-³²P-GTP溶于50μl以下缓冲系统(Buffer C)；50mM Tris.HCl，2mM EDTA，1mM DTT，5mMMgCl₂，pH8.0。在30℃作用30min后，用G 50 microspin-colomn迅速去除游离γ-³²P-GTP。取5μl溶于995μl冰冷的缓冲液中。然后将MgCl₂浓度提高到10mM，继续在30℃孵育，在不同的时间点取出5μl，加入995μl冰冷的缓冲液以中止酶活性，滤过0.2μm的硝酸纤维素滤膜，然后用1ml冰冷缓冲液洗四次，然后用1ml 2M甲酸核苷酸解离，并且用于放射活性测定。(图4)

结果表明，hRabJ具有GTP酶活性。

实施例5：RabJ的Northern印迹分析

按如下常规方法进行Northern印迹：待检滤膜置于10ml经68℃预热的杂交液，在杂交炉(Bellco)中于68℃预杂交30分钟；将标记好的cDNA探针于95～100℃变性2～5分钟，置冰上迅速冷却后加入杂交液(cDNA探针终浓度为2～10ng/ml或1～2×10⁶cpm/ml)，充分混匀，于68℃杂交2小时。杂交结束后，滤膜用2×SSC、0.05％SDS室温淋洗数次，继振荡冲洗30～40分钟，其间更换洗液数次。随后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振荡冲洗20～40分钟。最后滤膜用塑料保鲜膜包裹，于-70℃曝光X线胶片24～48小时。

Northern印迹杂交结果显示：hRabJ和mRabJ均优势表达于睾丸组织。在人脑和卵巢中和小鼠的心脏、脑、骨骼肌组织中有微弱表达。然而在细胞系中RabJ的表达广泛，为弱表达(图未示出)。

实施例6：抗人RabJ抗体的产生

将实施例3中获得的重组蛋白人RabJ用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人RabJ基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。而且利用Protein A亲和层析，纯化所得多抗用于蛋白水平的检测。

实施例7：RabJ蛋白的组织和细胞分布。

利用实施例6中所得抗体进行常规Western印迹分析人和小鼠的多种组织和细胞系中RabJ的表达。首先充分裂解组织或细胞，行SDS-PAGE电泳，然后转膜，先后用RabJ多抗和HRP-标记的抗兔二抗结合，最后用化学发光底物显色。(图5)

结果表明，hRabJ存在睾丸组织和一些细胞中。

实施例8：RabJ在睾丸组织中的免疫组织化学检测

把新鲜的人和小鼠的睾丸标本动存于液氮中，切片前一天冻于-80℃。采用冷冻切片。切片和染色过程主要遵照DAKO的说明书进行。简单的程序如下：首先待切片干燥后，用丙酮于室温固定10min，在空气中使其完全自然干燥脱水；接着用过氧化物酶阻断剂室温作用5min，消除内原性过氧化物酶对结果的干扰；然后用试剂盒内的一抗稀释液稀释一抗，并在4℃与切片共同作用过夜。PBS充分洗涤后滴上二抗溶液，室温作用30min。洗涤后，滴上底物-苏木精孵育5min，然后洗去；将切片用血红素复染，清水洗后于37mM的氨水中浸数下，并在清水中继续漂洗5min。然后封片观察。(图6)

如图6所示，图6A(10×)，6B(10×)，6C(100×)和6D(100×)为使用正常兔IgG的阴性对照，图6E(10×)，6F(10×)，6G(20×)、6H(20×)、6I(100×)和6J(100×)是用hRabJ多克隆抗体染色。图6A、C、E、G和I为人样品，图6B、D、F、H、J为小鼠样品。结果表明，RabJ在睾丸中优势表达。

实施例9：RabJ的亚细胞定位

用hRabJ-pcDNA3.1载体瞬时转染293细胞，48h后转入100ml培养瓶。利用pcDNA3.1载体中的新霉素筛选位点，在900μg/ml浓度G418存在下持续筛选4-5周。然后Western检测hRabJ的表达，并能够稳定传代。

hRabJ的分步裂解和蛋白定量：收集培养的hRabJ-293细胞，在含1mM PMSF的PBS中洗两次后，重悬于10mMTris.HCl，pH7.4，0.25M蔗糖，1mM MgCl₂，5mM CaCl₂，1mMPMSSF，1mM Na₃VO₄中。放冰上30min，然后在冰上用球型细胞匀浆器上下匀浆10次，800g离心15min，收集沉淀(胞核部分)。上清继续以100,000g 4℃离心1h。然后，将上清收集(胞浆可溶性部分)，用同样的缓冲液，把沉淀(胞浆模性成份)洗两遍，用适当体积的缓冲液重悬。蛋白定量用Bradford法。

免疫荧光标记：转染前24小时将2HeLa细胞铺板与6孔板中，每孔中放入一多聚赖氨酸处理的盖玻片。在GFP、hRabJ-cGFP、nGFP-hRabJ和hRabJ-pcDNA3.1载体瞬时转染后48h，将玻片取出，PBS中洗一遍后，用4％多聚甲醛室温固定10min。然后用PBS充分漂洗。加入50mM NH₄Cl(溶于PBS，pH7.6)淬灭15min后，用PBS-BSA-Saponin溶液(pH7.6的PBS，2mg/ml BSA，0.05％Saponin)洗两遍，每次5min。将一抗稀释于PBS-BSA-Saponin溶液中，然后滴加于盖玻片上，4℃结合8h。用PBS-BSA-Saponin溶液洗三次后，加入稀释于PBS-BSA-Saponin溶液中的Oregan green 488标记的抗兔二抗，37℃结合1h。用PBS-BSA-Saponin溶液洗三次后，用90％的甘油封片，共聚焦显微镜观察。(图7A和7B)

图7A表明，亚细胞组份定位表明hRabJ在细胞核和细胞质都存在。图7B中，A、B、C和D所是用GFP、hRabJ-GFP、GFP-hRabJ和hRabJ-pcDNA3.1载体瞬时转染的HeLa细胞，E是用hRabJ抗体检测的hRabJ-293细胞，F是用mRabJ-pcDNA3.1载体转染的NIH3T3细胞。结果表明，hRabJ存在于核膜和细胞器上。

实施例10：RabJ与Hsc70间的相互作用

在100mm的培养皿中，用hRabJ-pcDNA3.1载体瞬时转染HeLa细胞和293细胞48h后或直接用hRabJ-293细胞在100mm培养皿至长满后，收集细胞。用PBS洗一遍，重悬于1.5ml 50mMTris.HCI，pH8.0，2mM EDTA，1mM DTT，1mMPMSF，1mM Na₃VO₄的溶液中，冰上孵育30min后，用小超声探头冰上破碎细胞，直至液体澄清。然后13,000g离心15min，收集上清，弃去沉淀。用BCA蛋白定量试剂盒对上清进行定量。取含250μg总蛋白的上清，加入抗hRabJ的抗体(100μg/ml)，4℃振荡结合6h。然后加入平衡的蛋白A珠子，再振荡结合8h。然后用冰冷的裂解缓冲液洗三次，吸去上清，加入50μl2×SDS上样缓冲液，然后用Hsc70和Hsp40抗体分别作Western印迹检测。(图8)

结果表明，RabJ与Hsc70有相互作用(结合)，并且参与Hsc70的跨膜转运。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                       序列表<110>第二军医大学免疫学研究所<120>新的睾丸功能相关蛋白及其用途<130>014471<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1787<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(25)..(843)<400>1caagcttatg catgcggccg ctga atg gag gcc aac atg ccg aag cgg aag    51

                       Met Glu Ala Asn Met Pro Lys Arg Lys

                       1               5gag ccc ggc agg tct ctc cgc atc aaa gtc atc tcc atg ggc aac gcc   99Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala10                  15                  20                  25gaa gtg ggg aaa agc tgt att ata aag cga tac tgt gag aaa aga ttc   147Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile Ile Lys Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe

            30                  35                  40gtg tct aaa tac ctg gca aca att gga att gac tat gga gtc aca aag   195Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys

        45                  50                  55gta cac gtc aga gac aga gaa atc aaa gtt aac atc ttt gat atg gct   243Val His Val Arg Asp Arg Glu Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala

    60                  65                  70gga cat ccc ttc ttc tat gag gtt cga aat gag ttt tac aag gac aca   291Gly His Pro Phe Phe Tyr Glu Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr

75                  80                  85cag ggt gtg ata ctg gtc tat gat gtt ggg cag aaa gac tcc ttt gac   339Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr Asp Val Gly Gln Lys Asp Ser Phe Asp90                  95                  100                 105gcc ctt gat gcg tgg ctg gca gaa atg aag caa gag ctt gga cct cat   387Ala Leu Asp Ala Trp Leu Ala Glu Met Lys Gln Glu Leu Gly Pro His

            110                 115                 120gga aac atg gaa aat att ata ttt gta gtt tgt gcc aac aag att gat    435Gly Asn Met Glu Asn Ile Ile Phe Val Val Cys Ala Asn Lys Ile Asp

        125                 130                 135tgt acc aaa cat cgc tgt gta gat gaa agt gaa gga cgt ctt tgg gct    483Cys Thr Lys His Arg Cys Val Asp Glu Ser Glu Gly Arg Leu Trp Ala

    140                 145                 150gaa agc aaa ggg ttc ctg tac ttt gaa act tca gca caa act gga gaa    531Glu Ser Lys Gly Phe Leu Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Gln Thr Gly Glu

155                 160                 165ggc att aat gag atg ttc cag acc ttt tat ata tcc ata gtt gat tta    579Gly Ile Asn Glu Met Phe Gln Thr Phe Tyr Ile Ser Ile Val Asp Leu170                 175                 180                 185tgt gaa aat ggc ggg aaa cgc cct acc acc aat agc agt gct agt ttc    627Cys Glu Asn Gly Gly Lys Arg Pro Thr Thr Asn Ser Ser Ala Ser Phe

            190                 195                 200acc aaa gaa caa gca gat gcc att cgc aga att cga aat agt aaa gac    675Thr Lys Glu Gln Ala Asp Ala Ile Arg Arg Ile Arg Asn Ser Lys Asp

        205                 210                 215agt tgg gac atg ctg gga gtc aaa cct ggg gcc tca agg gat gaa gtc    723Ser Trp Asp Met Leu Gly Val Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp Glu Val

    220                 225                 230aat aaa gcg tat cgg aaa ctt gct gtg ctt ctt cac cct gac aaa tgt    771Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys

235                 240                 245gta gca cct ggc agt gaa gat gcc ttc aaa gca gtt gtg aat gct cgg    819Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala Arg250                 255                 260                 265aca gcc ctc ctg aaa aac atc aag tagaaagtac agaaaaaagc cacatgtggg    873Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile Lys

            270actcaaatgc aaacagactt tccctagagg tgaaataacc aacgtggagt tttccttccc   933agaatctcac tgctcttttc attcatgtgt tgtcatttgt atatcagtaa ttcaggtacc   993catttcatag acattttact gagaaatgac ctgcatttgt atgaagtgaa ctgagcgtca   1053caccctgtac ttcatttcat atttctagat aattctgaat ttttttctca ttcgtcagct   1113ctgtaattat agtatcactt agacatttca cttggggaaa tccacaaggt tcctggaggg   1173agggaagaga ggacaagagg accctttcac tttttctttt ttacggaatt catcatcaga   1233gaagaaaata acaaaaatgg aagcaaacaa catcagaacc cctgtaagtt tggtgtgacc    1293ttacagacaa gttgctgctt ttacaatgag ttccttaggt ggtattttaa cccatcgatc    1353tataatgatg actcttggca gccctttggg agtttgtaaa atgaggtgat acagttctga    1413attgagcatt cctttatgat attcactctg ttcctcttct gcagccacca gtgggagaga    1473caagccagtc ctaagagaaa aggtggtggc agccacaaat tctaggtaca ctggctgctg    1533cctatcctgt ccctggatct gaggcctttc ccttgccata gaaatggttg ctggtagcag    1593tagagagcac tgtgcacctg ggaatgagga atcaggcccc aagacagaag tacttggagg    1653agccagctgc agtagtatcc gcctgtagtc ccagctactc aggaggctga gacaggagga    1713ttgcttaagc ccaggagctc aagtcccacc tgggcaacat agtaagatct tgtctcttaa    1773aaaaaaaaaa aaaa                                                      1787<210>   2<211>   273<212>   PRT<213>   Homo sapiens<400>   2Met Glu Ala Asn Met Pro Lys Arg Lys Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg1               5                   10                  15Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile

        20                  25                  30Ile Lys Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr

    35                  40                  45Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys Val His Val Arg Asp Arg Glu

50                  55                  60Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala Gly His Pro Phe Phe Tyr Glu65                  70                  75                  80Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr

            85                  90                  95Asp Val Gly Gln Lys Asp Ser Phe Asp Ala Leu Asp Ala Trp Leu Ala

        100                 105                 110Glu Met Lys Gln Glu Leu Gly Pro His Gly Asn Met Glu Asn Ile Ile

    115                 120                 125Phe Val Val Cys Ala Asn Lys Ile Asp Cys Thr Lys His Arg Cys Val

130                 135                 140Asp Glu Ser Glu Gly Arg Leu Trp Ala Glu Ser Lys Gly Phe Leu Tyr145                 150                 155                 160Phe Glu Thr Ser Ala Gln Thr Gly Glu Gly Ile Asn Glu Met Phe Gln

            165                 170                 175Thr Phe Tyr Ile Ser Ile Val Asp Leu Cys Glu Asn Gly Gly Lys Arg

        180                 185                 190Pro Thr Thr Asn Ser Ser Ala Ser Phe Thr Lys Glu Gln Ala Asp Ala

    195                 200                 205Ile Arg Arg Ile Arg Asn Ser Lys Asp Ser Trp Asp Met Leu Gly Val

210                 215                 220Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp Glu Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu225                 230                 235                 240Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp

            245                 250                 255Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile

        260                 265                 270Lys<210>  3<211>  1091<212>  DNA<213>  小鼠<220><221>  CDS<222>  (1)..(822)<400>  3atg gag gcc tac atg ccg aag agg aag gag ccc gcc aag tcc ctc cgc    48Met Glu Ala Tyr Met Pro Lys Arg Lys Glu Pro Ala Lys Ser Leu Arg1               5                   10                  15atc aaa gtc atc tcc atg ggc aac gcc gaa gtg ggg aaa agc tgt att    96Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile

        20                  25                  30ata gag cgc tac tgt gag aag aga ttt gtg ttt aaa tac ctg gca acc    144Ile Glu Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe Val Phe Lys Tyr Leu Ala Thr

    35                  40                  45atc ggg att gac tat gga gtc aca gag gtc caa gtc aga gac aga gag    192Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Glu Val Gln Val Arg Asp Arg Glu

50                  55                  60atc aaa gtt aac atc ttt gac atg gct gga cat ccc ttc ttc ttt gag    240Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala Gly His Pro Phe Phe Phe Glu65                  70                  75                  80gtc cga aat gag ttt tac aag gac aca caa ggt gtg ata cta gtc tat    288Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr

            85                  90                  95gat gtt gga cag aaa gac tca ttt gat gcc ctt gat tcg tgg ctg gca    336Asp Val Gly Gln Lys Asp Ser Phe Asp Ala Leu Asp Ser Trp Leu Ala

        100                 105                 110gag atg aag cag gag ctt ggg cct cac ggg aac atg gac aac att gtc    384Glu Met Lys Gln Glu Leu Gly Pro His Gly Asn Met Asp Asn Ile Val

    115                 120                 125ttt gtt gtt tgt gcc aac aag atc gac tgc tcc aaa cac cgc tgc atc    432Phe Val Val Cys Ala Asn Lys Ile Asp Cys Ser Lys His Arg Cys Ile

130                 135                 140gat gaa agt gag ggg cgt ctc tgg gct gaa agc aaa ggg ttc ctg tac    480Asp Glu Ser Glu Gly Arg Leu Trp Ala Glu Ser Lys Gly Phe Leu Tyr145                 150                 155                 160ttt gaa aca tca gca caa act gga gag gga atc aac gag atg ttc cag    528Phe Glu Thr Ser Ala Gln Thr Gly Glu Gly Ile Asn Glu Met Phe Gln

            165                 170                 175acc ttt tac ttg tcc ata gtt gac ttg tgt gaa aat ggc ggg aag cgt    576Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Val Asp Leu Cys Glu Asn Gly Gly Lys Arg

        180                 185                 190cct act gca agt agc agt gct agt ttc acc aaa gaa caa gca gac act    624Pro Thr Ala Ser Ser Ser Ala Ser Phe Thr Lys Glu Gln Ala Asp Thr

    195                 200                 205att cgc aga atc cga aat agt aag gac agc tgg gag atg cta gga gtc    672Ile Arg Arg Ile Arg Asn Ser Lys Asp Ser Trp Glu Met Leu Gly Val

210                 215                 220aga cct gga gcc tca agg gag gaa gtt aat aag gcc tac cgg aag ctg    720Arg Pro Gly Ala Ser Arg Glu Glu Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu225                 230                 235                 240gct gtg ctg ctt cac ccg gac aag tgt gta gca cca ggc agt gaa gat    768Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp

            245                 250                 255gcc ttc aaa gca gtt gtg aat gcc cgg aca gcc ctc ctg aaa aac atc    816Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile

        260                 265                 270aag tgg tagaaagaca gagggattgc catttgaagc taggaagcaa ggagccagca       872Lys Trptatcgcctct agcaatgaca gtgatccctt ccaggtcagc tcagtaggtt ctctcatgct    932gcctcccatg gagctaagtc cccagcgttt ttgtaaacct tttgaagatg aatttagttg    992caaaatcaag ctaagcaatt tccacttcag gctttgcaag caaagagcta ttgctccttc    1052tcatcctggt gctgagcaca gttttagacc tggttagtg                           1091<210>  4<211>  274<212>  PRT<213>  小鼠<400>  4Met Glu Ala Tyr Met Pro Lys Arg Lys Glu Pro Ala Lys Ser Leu Arg1               5                   10                  15Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile

        20                  25                  30Ile Glu Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe Val Phe Lys Tyr Leu Ala Thr

    35                  40                  45Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Glu Val Gln Val Arg Asp Arg Glu

50                  55                  60Ile Lys Val Asn Ile Phe Asp Met Ala Gly His ProPhe Phe Phe Glu65                  70                  75                 80Val Arg Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr

            85                  90                  95Asp Val Gly Gln Lys Asp Ser Phe Asp Ala Leu Asp Ser Trp Leu Ala

        100                 105                 110Glu Met Lys Gln Glu Leu Gly Pro His Gly Asn Met Asp Asn Ile Val

    115                 120                 125Phe Val Val Cys Ala Asn Lys Ile Asp Cys Ser Lys His Arg Cys Ile

130                 135                 140Asp Glu Ser Glu Gly Arg Leu Trp Ala Glu Ser Lys Gly Phe Leu Tyr145                 150                 155                 160Phe Glu Thr Ser Ala Gln Thr Gly Glu Gly Ile Asn Glu Met Phe Gln

            165                 170                 175Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Val Asp Leu Cys Glu Asn Gly Gly Lys Arg

        180                 185                 190Pro Thr Ala Ser Ser Ser Ala Ser Phe Thr Lys Glu Gln Ala Asp Thr

    195                 200                 205Ile Arg Arg Ile Arg Asn Ser Lys Asp Ser Trp Glu Met Leu Gly Val

210                 215                 220Arg Pro Gly Ala Ser Arg Glu Glu Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu225                 230                 235                 240Ala Val Leu Leu His Pro Asp Lys Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp

            245                 250                  255Ala Phe Lys Ala Val Val Asn Ala Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile

        260                 265                 270Lys Trp<210>  5<211>  28<212>  DNA<213>  引物<400>  5cgggatccaa tggaggccaa catgccga                                   28<210>  6<211>  28<212>  DNA<213>  引物<400>  6gcggtaccga ctacttgatg tttttcag                                   28<210>  7<211>  28<212>  DNA<213>  引物<400>  7cgggatccga ggccaacatg ccgaagcg                                   28<210>  8<211>  28<212>  DNA<213>  引物<400>  8cgggatcctc acttgatgtt tttcaggg                                   28

Claims (10)

1.一种分离的RabJ多肽，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2或4所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中25-843位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1787位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：3中1-822位的序列；

(d)具有SEQ ID NO：3中1-1091位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种具有RabJ蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达RabJ蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有RabJ蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的RabJ蛋白特异性结合的抗体。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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