CN1299830A - 新的人热休克蛋白、其编码序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的人热休克蛋白－树突状细胞衍生热休克蛋白－70(Dendritic cell derived heat shockprotein 70,简称为“D－HSP70”)、编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。本发明还公开了编码这种新的D－HSP70的多核苷酸的用途以及抗此蛋白分子的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了新的人D－HSP70在肿瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、烧伤、抗感染、不育症、Beheet′s综合症等疾病中的治疗作用。

Description

新的人热休克蛋白、其编码序列及其用途

本发明属于生物技术和医学领域。涉及新的编码人热休克蛋白-树突状细胞衍生热休克蛋白-70(Dendritic cell derived heat shock protein 70，简称为“D-HSP70”)的多核苷酸及其编码的多肽。以及针对多肽的单克隆抗体。本发明还涉及人D-HSP70蛋白及其抗体的制备和在肿瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、烧伤、抗感染、不育症、Beheet′s综合症等疾病中的作用。

热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一类在生物进化中高度保守，广泛存在于原核及真核生物一类蛋白质，是生物细胞在受热或者其它理化因素(如细菌，病毒感染，缺氧，缺血)等应激反应中所产生的热休克反应的诱导产物(Gilby etal.Mol Brain Res,1997,48:87)。用以增强自身细胞的保护作用，使之免受应激因子的损害。

按照分子量HSP可以分为四类：Hsp90家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族。不同的家族具有序列进化上的特点。不同家族的HSPs具有下列共同特点：HSP90和HSP70蛋白质结构在进化上具有高度保守性，小分子量的HSPs则显示出属特异性；机体不同组织含有HSP90,HSP70及其异构体的量不同，如哺乳动物脑中这些蛋白的含量相应高于肝脏；HSP90,HSP70在热休克时迅速从胞浆转移到细胞核，并结合成为细胞骨架中不溶性组分，恢复期溶解并返回胞浆，而小分子量HSPs在热休克期聚集在核周，恢复期逐渐分解。3个不同家族的HSPs又具有各自的生理和病理意义，其中Hsp70家族是HSP中最保守和最主要的一类。在大多数生物中含量较多，在应激后生成最为显著的一类，也是最受关注、研究最为深入的一类HSP(Sharp et al.Trends Neurosci 1999；22:97)。

HSP70家族包括HSP68、72、73、75、78等多种蛋白，它们具有相同的酸性等电点和相似的胰蛋白酶肽谱。人Hsp70和果蝇Hsp70有73％同源性，和大肠杆菌的dnak蛋白有50％同源性。而HSP70(包括HSP72和HSP73)被认为是这一家族中的主要成员。人类HSP70及其相关基因被定位于第6、14、21等对染色体上，HSP7O具有高度的保守性，N端具有ATP结合区和ATPase活性，比羧基端具有更高的保守性，与不同生物HSP70所共有的生化特性有关。

研究表明，HSP70作为分子伴侣，能够提高细胞对应激原耐受性，诱导抗肿瘤、病毒特异性免疫反应，目前在抗肿瘤及病毒感染、抗炎性反应、缺血后脑损伤、自身免疫性疾病的治疗中等方面具有重要作用。HSP在生理及病理方面的主要有以下作用：

(1)分子伴侣作用

HSP70是目前发现的主要伴侣蛋白之一，能与蛋白分子结合，保护新合成的蛋白分子的恰当构型，防止在正确的多聚体形成前，蛋白亚单位不恰当的折叠和聚焦。伴侣蛋白分子在细胞内转运、跨膜，并参与蛋白质的折叠、伸展及多聚复合体的组装；当蛋白质受损变性时，能促使其恢复或加速其降解和消除，能重新激活某些酶的作用，以维护细胞的功能和生存。HSP7O具有帮助蛋白质完成细胞内转移的功能。HSP70能够和一些细胞中的蛋白质结合。并帮助这些蛋白质穿过内质网腔或线粒体膜，其解离过程需要ATP参与。细胞内有很多蛋白合成后和HSP70暂时结合，以保证其适宜的结构状态，当蛋白质的胞内转移完成后，蛋白质与HSP70解离，形成其最终的形态。

(2)提高细胞对应激原的耐受性

(3)参与机体免疫

HSP在免疫方面发挥着重要作用，参与抗原加工递呈，参与抗肿瘤免疫与抗感染免疫，并且与自身免疫性疾病关系密切。

(a)抗肿瘤免疫

近年来的研究发现，应用肿瘤细胞来源的HSP与肿瘤抗原性多肽形成的复合物，可诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。Srivastava等发现，巨噬细胞表面有HSP受体，HSP-多肽复合物可以通过HSP受体而被巨噬细胞摄入胞内，加工处理后，与MHC分子形成复合物，在共刺激分子的协同作用下，激活CD4+及CD8+T细胞，并分泌多种细胞因子辅助应答。另外，有证据表明，肿瘤细胞可通过HSP-多肽复合物直接激活γδT细胞和NK细胞。应用肿瘤组织的HSP-多肽复合物作为肿瘤疫苗，打破了MHC的限制，可使机体获得特异性的抗肿瘤免疫，因而具有良好的前景(Menor et al.Semin Oncol 1998 25:654)。

(b)自身免疫性疾病

HSP在自身免疫性疾病的发生与治疗中起双向作用。一方面某些HSP的位点可能与自身细胞的抗原高度同源(如口腔黏膜抗原)，而来源HSP的多肽可以特异性地激活Tγδ细胞(如Behcet′s综合症)，这可能是导致Behcet′s综合症的一个重要原因；另一方面，对于HSP位点的T细胞又可以在风湿性关节炎模型中起保护作用。

(4)缺乏性脑损伤后HSP对细胞的保护作用。

正常脑组织HSP70 mRNA及蛋白含量极少。局灶及脑缺血后，受损细胞内的变性蛋白可诱导HSP70表达。HSP70可作为细胞或组织遭受可逆性缺血损害的分子生物学标志。HSP70可以对通过抑止神经元的调亡而对神经元起保护作用。

(5)在神经性疾病中的作用

HSP70与癫痫的关系已被越来越多的文献报道。受损脑组织中的神经细胞有明显HSP70表达。多数学者认为癫痫发作模型中HSP70表达对因过度兴奋导致受损的神经元具有保护作用。

(6)在精子形成中的作用：

精子的形成需要HSP70-2的辅助，剔除HSP70-2基因的雄性小鼠丧失生育能力。

综上所述，HSP在(1)肿瘤的治疗；(2)抗感染及炎性反应；(3)治疗某些自身免疫性疾病(如Beheet′s病、关节炎、自身免疫性内耳病)；(4)治疗某些神经性疾病，如癫痫、脑缺血；(5)男性不育：(6)抗器官移植排斥反应等方面具有广阔的应用前景。因此，本领域迫切需要开发新的热休克蛋白。

本发明的目的是提供一种新的人热休克蛋白D-HSP70蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的D-HSP70多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO:2或3氨基酸序列的多肽。更佳地，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述人D-HSP70多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO:1中54-1583位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-1757位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人D-HSP70蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人D-HSP70蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人D-HSP70蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人D-HSP70多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-1757个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人D-HSP70多肽活性的化合物，以及抑制人D-HSP70多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人D-HSP70多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在D-HSP70蛋白的方法，它包括：将样品与D-HSP70蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在D-HSP70蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人D-HSP70多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人D-HSP70多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人D-HSP70多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人D-HSP70蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人D-HSP70多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、烧伤、抗感染、不育症、Beheet′s综合症等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明的人D-HSP70的cDNA序列，其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写字母表示。

图2是本发明的人D-HSP70蛋白的全长氨基酸序列。

图3是本发明的人D-HSP70蛋白与小鼠热休克蛋白HSP70nst的氨基酸序列同源性比较图。下方序列是人D-HSP70，上方序列是小鼠HSP70nst蛋白。相同的氨基酸在两个序列之间用“｜”标出，相似的氨基酸用“：”或“.”标出。

图4是本发明的人D-HSP70蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲线图。

在本发明中，术语“D-HSP70蛋白”、“D-HSP70多肽”或“热休克蛋白D-HSP70”可互换使用，都指具有人热休克蛋白D-HSP70氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的热休克蛋白D-HSP70。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的D-HSP70蛋白或多肽”是指D-HSP70多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化D-HSP70蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。D-HSP70多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人D-HSP70蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人D-HSP70蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(ⅰ)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人D-HSP70多肽”指具有人D-HSP70蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人D-HSP70蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人D-HSP70蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人D-HSP70 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人D-HSP70多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人D-HSP70多肽或其片段的融合蛋白(例如，融合于6His以便纯化，比如SEQ ID NO:3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人D-HSP70多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人D-HSP70多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人D-HSP70蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人D-HSP70多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人D-HSP70蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                 表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸所编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码D-HSP70蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人D-HSP70核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或D-HSP70蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Scienee,1984；224:1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的D-HSP70多肽。一般来说有以下步骤：

(1)．用本发明的编码人D-HSP70多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)．在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)．从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人D-HSP70多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人D-HSP70编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人D-HSP70蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗D-HSP70蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗D-HSP70蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人D-HSP70蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人D-HSP70蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人D-HSP70 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人D-HSP70基因产物或片段。较佳地，指那些能与人D-HSP70基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人D-HSP70蛋白的分子，也包括那些并不影响人D-HSP70蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人D-HSP70基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人D-HSP70基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人D-HSP70蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人D-HSP70蛋白功能的抗体以及不影响人D-HSP70蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人D-HSP70基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人D-HSP70基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人D-HSP70蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人D-HSP70蛋白。此外，与人D-HSP70蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人D-HSP70蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人D-HSP70蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人D-HSP70蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人D-HSP70蛋白阳性的细胞(例如淋巴结细胞等)。

多克隆抗体的生产可用人D-HSP70蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与D-HSP70蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、烧伤、抗感染、不育症、Beheet′s综合症方面的治疗。在使用本发明D-HSP70蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明D-HSP70多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的D-HSP70蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1O微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人D-HSP70蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于D-HSP70蛋白的无表达或异常/无活性的D-HSP70蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的D-HSP70蛋白，以抑制内源性的D-HSP70蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将D-HSP70基因转移至细胞内。构建携带D-HSP70基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人D-HSP70基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人D-HSP70 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人D-HSP70蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人D-HSP70蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人D-HSP70蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人D-HSP70蛋白水平，可以用作解释人D-HSP70蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断D-HSP70蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在D-HSP70蛋白的方法是利用D-HSP70蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与D-HSP70蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在D-HSP70蛋白。

D-HSP70蛋白的多聚核苷酸可用于D-HSP70蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，D-HSP70蛋白的多聚核苷酸可用于检测D-HSP70蛋白的表达与否或在疾病状态下D-HSP70蛋白的异常表达。如D-HSP70 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断D-HSP70蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用D-HSP70蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测D-HSP70蛋白的转录产物。

检测D-HSP70基因的突变也可用于诊断D-HSP70蛋白相关的疾病。D-HSP70蛋白突变的形式包括与正常野生型D-HSP70 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northem印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明D-HSP70蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的或用RT-PCR法获得，其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1757个碱基，其开放读框位于54-1583位，编码全长为509个氨基酸的人D-HSP70蛋白(SEQ ID NO:2)。本发明的D-HSP70蛋白可为治疗肿瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、烧伤、抗感染、不育症、Beheet′s综合症等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.人D-HSP70蛋白cDNA的克隆

用Trizol(Gibco公司)提取人树突状细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆SBBI的DNA序列为新的cDNA。对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO:2所示)。此蛋白质被命名为人D-HSP70蛋白，其编码基因命名为人D-HSP70蛋白基因。

D-HSP70的cDNA序列如SEQ ID NO:1和图1所示，全长为1757bp，包括53bp的5′端非编码区和174bp的3′端非编码区，编码含509氨基酸的多肽(SEQ IDNO:2和图2)。

根据GCG软件分析，D-HSP70理论分子量约为55kD，等电点为5.27，包含2个糖基化位点，1个HSP70家族基序，7个PKC磷酸化位点，1个真核半胱氨酸蛋白酶位点，具有典型的HSP70家族蛋白的特点。

BLAST分析表明其与已知基因不同，这种分子的蛋白产物与小鼠HSP-70 nst高度同源，具有90.3％的一致性和93.5％的相似性(图3)。由于HSP家族分子在不同种属间具有较高的同源性，这表明本发明的D-HSP70蛋白是人的热休克蛋白70家族中的新成员，命名为树突状细胞衍生热休克蛋白-70(Dendritic cellderived heat shock protein 70，简称为“D-HSP70”)。

如图4所示，对D-HSP70蛋白进行的Kyte-doolitte疏水性分析表明，D-HSP70是一胞内蛋白。

实施例2：用RT-PCR方法克隆人D-HSP70蛋白的编码序列

用Trizol(Gibco公司)提取处于对数生长期前髓白血病细胞株HL-60细胞总RNA，取6mg细胞总RNA与0.5μg Oligo-dT₁₂-₁₈混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH₂O进行稀释。PCR扩增D-HSP70所用的引物如下：引物#561:5′-CTGTTGCTGT TGGGGGACCC-3′(SEQ ID NO:4)，引物#426:5′-ACAGTTCATTGAAAAAGTATT-3′(SEQ ID NO:5)。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和lU ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为94℃30秒、54℃30秒、72℃45秒，25个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。产物片段纯化后直接克隆至pGEM-T载体(Promega)。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO:1所示的1-1682bp完全相同。

实施例3：D-HSP70 Northern印迹分析

按如下方法进行Northern印迹分析：待检滤膜置于10ml经68℃预热的杂交液，在杂交炉(Bellco)中于68℃预杂交30分钟；将标记好的cDNA探针(是否要描述一下)于95～100℃变性2～5分钟，置冰上迅速冷却后加入杂交液(cDNA探针终浓度为2～10ng/ml或1～2×10⁶cpm/ml)，充分混匀，于68℃杂交2小时。杂交结束后，滤膜用2×SSC、0.05％SDS室温淋洗数次，继振荡冲洗30～40分钟，其间更换洗液数次。随后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振荡冲洗20～40分钟。最后滤膜用塑料保鲜膜包裹，于-70℃曝光X线胶片24～48小时。

Northern印迹杂交结果显示：在肾、肾上腺、心脏、骨骼肌、肝和胰腺、胎盘、睾丸、卵巢、外周血白细胞、结肠、脑、脾、胸腺、小肠、前列腺和肺等组织中均有表达。这表明，D-HSP70是一种广泛表达的蛋白，在许多细胞中发挥作用。

实施例4 D-HSP70重组表达载体的构建

构建中所用的真核表达载体pcDNA3.1/neo(Invitrogen公司)含CMV启动子、SV40复制起始点、新霉素抗性基因，可进行目的基因的短暂表达和稳定表达。在其外源基因克隆位点的下游，含有myc表位和6个连续组氨酸(6his)编码序列和该读框的终止密码子，因此可根据需要表达C端连有myc表位和6His的融合蛋白，利用6His进行蛋白纯化，利用myc表位检测表达的融合蛋白。此外，外源基因克隆位点的两端分别是含有T7启动子和牛生长激素BGH的polyA信号，可用T7和BGH通用引物对主的外源基因进行直接测序。

(1)构建表达天然D-HSP70的表达载体pcDNA-D-HSP70

以实施例2中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人D-HSP70 DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′端寡核苷酸引物(有义引物)序列为：

5′-gggaattcgctgccgtccctgctgcctc-3′(SEQ ID NO:6)

该引物含有EcoRⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是对应于SEQID NO:1的部分序列；

3′端引物(反义引物)序列为：

5′-gggtacctta aaa att ctt gat ttc tct a-3′(SEQ ID NO.7)，

该引物含有KpnⅠ限制性内切酶的酶切位点和对应于SEQ ID NO:1的部分序列。

所扩增的PCR产物记为D-HSP70-CQ，大小为1590bp；由于编码D-HSP70蛋白的开放读框中含有D-HSP70本身的终止密码子，其下游的myc表位和6His无法翻译，因此所表达的D-HSP70重组蛋白氨基酸序列与天然D-HSP70理论上完全一致，不含myc表位和6His。表达产物用于D-HSP70瞬时表达的研究。

PCR产物经柱纯化后，EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，直接连入同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重组载体记为pcDNA-D-HSP70。其D-HSP70的基因序列经T7和BGH引物测序确证，正确无误。

(2)构建表达载体pD-HSP70-His，用于表达热休克蛋白D-HSP70的C末端与myc/His融合的融合蛋白D-HSP70-His

按类似的方法构建表达载体pD-HSP70-His，不同点在于：所用的反义链引物是5′-gggtaccagatgctatctcaatgt-3′(SEQ ID NO:8)。所扩增的PCR产物记为D-HSP70-BN，预计大小为1560bp，所表达的重组蛋白D-HSP70-His C端含有myc表位和6His，成熟蛋白的理论分子量为59kD。用于D-HSP70稳定表达的研究。

PCR产物经柱纯化后，EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，直接连入同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重组载体记为pD-HSP70-His。基因序列经T7和BGH引物测序确证，正确无误。

实施例5：D-HSP70蛋白和D-HSP70-His融合蛋白的表达、分离和纯化

(1)D-HSP70蛋白和D-HSP70-His融合蛋白的表达

将实施例4中制得的两种重组质粒pcDNA-D-HSP70和pD-HSP70-His的DNA，分别与脂质体按1∶5比例混合，室温作用45分钟；将待转染细胞洗两遍后与DNA混合。在转染后72小时，进行³⁵S代谢标记。在标记后4小时，收集被pcDNA-D-HSP70、pD-HSP70-His和pcDNA3.1质粒(作为空白对照)转染的293细胞，裂解细胞，离心去除细胞碎片后，进行15％SDS-PAGE电泳和放射性自显影分析。

结果表明：用质粒pcDNA-D-HSP70转染的293细胞中，有约55kDa的主条带；用质粒pD-HSP70-His转染的293细胞中，有约59kDa的主条带；而用pcDNA3.1质粒转染的293细胞中，无上述主条带。上述主条带的分子量与预计分子量相近。

(2)D-HSP70-His融合蛋白的分离和纯化

用质粒pD-HSP70-His转染293细胞，在转染后72小时添加G418，扩增后收集细胞。收集的细胞被裂解、离心并上His-Trap亲和层析柱(Pharmacia公司)，获得了分子量约为59kDa的融合蛋白D-HSP70-His(SEQ ID NO:3)。

用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，证实其N端序列与SEQ ID NO:2所示的N端序列相符。

实施例6：抗人D-HSP70蛋白抗体的产生：

将实施例5中获得的重组蛋白D-HSP70-His用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人D-HSP70蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例7：人D-HSP70蛋白-多肽复合物诱导特异性免疫应答

将β-Gal重组表达载体pSV-βGal(Promega)和实施例4中的D-HSP70-His表达载体pD-HSP70-His，共转染入293细胞。转染后24小时后，用金属螯合层析分离出D-HSP-70-多肽复合物。用该复合物免疫小鼠，可以刺激机体产生针对β-Gal的CTL特异性免疫反应。

将实施例4中的D-HSP70-His表达载体pD-HSP70-His转染小鼠黑色素瘤细胞，分离出D-HSP70-多肽复合物。将此复合物注入C57BL/6小鼠体内，可使小鼠获得抵抗黑色素瘤攻击的能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                           序列表(1)一般信息：(ⅱ)发明名称：新的人热休克蛋白、其编码序列及用途(ⅲ)序列数目：8(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1757bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CTGTTGCTGT  TGGGGGACCC  CCTCATTCCT  GCCGCTGCCG  TCCCTGCTGC  50CTCATGGCGG  CCATCGGAGT  TCACCTGGGC  TGCACCTCAG  CATGTGAGGC  100CGTCTATAAG  GATGGCCGGG  CTGGTGTGGT  TGCAAATGAT  GCCGGTGACC  150GAGTTAGTGC  AGCTGTTGTT  GCTTACTCAG  AAAATGAAGA  GATTGTTGGA  200TTGGCAGCAA  AACAAAGTAG  AATAAGAAAT  ATTTCAAATA  CAGTAATGAA  250AGTAAAGCAG  ATCCTGGGCA  GAAGCTCCAG  TGATCCACAA  GCTCAGAAAT  3O0ACATCGCGGA  AAGTAAATGT  TTAGTCATTG  AAAAAAATGG  GAAATTACGA  350TATGAAATAG  ATACTGGAGA  AGAAACAAAA  TTTGTTAACC  CAGAAGATGT  400TGCCAGACTG  ATATTTAGTA  AAATGAAAGA  AACGGCACAT  TCTGTATTGG  450GCTCAGATGC  AAATGATGTA  GTTATTACTG  TCCCGTTTGA  TTTTGGAGAA  500AAGCAAAAAA  ATGCTCTTGG  AGAAGCAGCT  AGAGCTGCTG  GATTTAATGT  550TTTGCGATTA  ATTCACGAAC  CGTCTGCAGC  TCTTCTTGGT  TATGGAATTG  6O0GACAAGACTC  CGCTACTGGA  AAAAGCAATA  TTTTGGTGTT  TAAGGTTGGA  650GGAACATCCT  TATCTCTCAG  CGTCATGGAA  GTTAACAGTG  GAATATATCG  700GGTTCTTTCA  ACAAACACTG  ATGATAACAT  CGGTGGTGCA  CATTTCACAG  750AAACCTTAGC  ACAGTATCTA  GCTTCTGAGT  TCCAAAGATC  CTTCAAACAT  800GATGTGAGAG  GAAATGCGCG  AGCCATGATG  AAATTAACGA  ACAGTGCTGA  850AGTAGCGAAA  CATTCTTTGT  CAACCTTGGG  AAGTGCCAAC  TGTTTTCTTG  900ACTCATTATA  TGAAGGTCAA  GATTTTGATT  GCAATGTGTC  CAGAGCAAGA  95OTTTGAACTTC  TTTGTTCTCC  ACTTTTTAAT  AAGTGTATAG  AAGCAATCAG  1000AGGACTCTTA  GATCAAAATG  GATTTACAGC  AGATGATATC  AACAAGGTTG  1050TCCTTTGTGG  AGGGTCTTCT  CGAATCCCAA  AGCTACAGCA  ACTGATTAAA  1100GATCTTTTCC  CAGCTGTTGA  GCTTCTCAAT  TCTATCCCTC  CTGATGAAGT  1150GATCCCTATT  GGTGCAGCTA  TAGAAGCAGG  AATTCTTATT  GGGAAAGAAA  1200ACCTGTTGGT  GGAAGACTCT  CTTATGATAG  AGTGTTCAGC  CAGAGATATT  1250TTAGTTAAGG  GTGTGGACGA  ATCAGGAGCC  AGTAGATTCA  CAGTGCTGTT  1300TCCATCAGGG  ACTCCTTTGC  CAGCTCGAAG  ACAACACACA  TTGCAAGCCC  1350CTGGAAGCAT  ATCTTCAGTG  TGCCTTGAAC  TCTATGAGTC  TGATGGGAAG  1400AACTCTGCCA  AAGAGGAAAC  CAAGTTTGCA  CAGGTTGTAC  TCCAGGATTT  1450AGATAAAAAA  GAAAATGGAT  TACGTGATAT  ATTAGCTGTT  CTTACTATGA  1500AAAGGGATGG  ATCTTTACAT  GTGACATGCA  CAGATCAAGA  AACTGGAAAA  1550TGTGAAGCAA  TCTCTATTGA  GATAGCATCT  TAATGTTTTA  GAGAAATCAA  1600GAATTTTTAA  AAACAAGAAT  ATCAACATTT  GGTTTTGTAG  TATAAGTGGT  1650GTTTGTATTA  AAATACTTTT  TCAATGAACT  GTAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  1700AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  1750AAAAAAA                                                     1757(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：509个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2MAAIGVHLGC  TSACEAVYKD  GRAGVVANDA  GDRVTPAVVA  YSENEEIVGL  50AAKQSRIRNI  SNTVMKVKQI  LGRSSSDPQA  QKYIAESKCL  VIEKNGKLRY  100EIDTGEETKF  VNPEDVARLI  FSKMKETAHS  VLGSDANDVV  ITVPFDFGEK  150QKNALGEAAR  AAGFNVLRLI  HEPSAALLAY  GIGQDSPTGK  SNILVFKLGG  200TSLSLSVMEV  NSGIYRVLST  NTDDNIGGAH  FTETLAQYLA  SEFQRSFKHD  250VRGNARAMMK  LTNSAEVAKH  SLSTLGSANC  FLDSLYEGQD  FDCNVSRARF  300ELLCSPLFNK  CIEAIRGLLD  QNGFTADDIN  KVVLCGGSSR  IPKLQQLIKD  350LFPAVELLNS  IPPDEVIPIG  AAIEAGILIG  KENLLVEDSL  MIECSARDIL  400VKGVDESGAS  RFTVLFPSGT  PLPARRQHTL  QAPGSISSVC  LELYESDGKN  450SAKEETKFAQ  VVLQDLDKKE  NGLRDILAVL  TMKRDGSLHV  TCTDQETGKC  500EAISIEIAS                                                   509(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：540个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:MAAIGVHLGC  TSACEAVYKD   GRAGVVANDA  GDRVTPAVVA  YSENEEIVGL     50AAKQSRIRNI  SNTVMKVKQI   LGRSSSDPQA  QKYIAESKCL  VIEKNGKLRY     100EIDTGEETKF  VNPEDVARLI   FSKMKETAHS  VLGSDANDVV  ITVPFDFGEK     150QKNALGEAAR  AAGFNVLRLI   HEPSAALLAY  GIGQDSPTGK  SNILVFKLGG     200TSLSLSVMEV  NSGIYRVLST   NTDDNIGGAH  FTETLAQYLA  SEFQRSFKHD     250VRGNARAMMK  LTNSAEVAKH   SLSTLGSANC  FLDSLYEGQD  FDCNVSRARF     300ELLCSPLFNK  CIEAIRGLLD   QNGFTADDIN  KVVLCGGSSR  IPKLQQLIKD     350LFPAVELLNS  IPPDEVIPIG   AAIEAGILIG  KENLLVEDSL  MIECSARDIL     400VKGVDESGAS  RFTVLFPSGT   PLPARRQHTL  QAPGSISSVC  LELYESDGKN     450SAKEETKFAQ  VVLQDLDKKE   NGLRDILAVL  TMKRDGSLHV  TCTDQETGKC     500EAISIEIASP  DPSSVPSFLE   QKLISEEDLN  SAVDHHHHHH                 540(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：20碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CTGTTGCTGT TGGGGGACCC                      20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：21碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:ACAGTTCATT GAAAAAGTAT T                  21(2)SEQ ID NO:6的信息

(ⅰ)序列特征

(A)长度：28碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GGGAATTCGC TGCCGTCCCT GCTGCCTC                                 28(2)SEQ ID NO:7的信息

(ⅰ)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：GGGTACCTTA AAAATTCTTG ATTTCTCTA                                29(2)SEQ ID NO：8的信息

(ⅰ)序列特征

(A)长度：19碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:GGGTACCAGA TGCTATCTCA ATGT                                     24

Claims (14)

1．一种分离的人D-HSP70多肽，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2．如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO:2或3氨基酸序列的多肽。

3．一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO:1中54-1583位的序列；

(b)具有SEQ ID NO:1中1-1757位的序列。

6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7．一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8．一种具有人D-HSP70蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人D-HSP70蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人D-HSP70蛋白活性的多肽。

9．一种能与权利要求1所述的人D-HSP70蛋白特异性结合的抗体。

10．一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-1757个核苷酸。

11．一种检测样品中是否存在D-HSP70蛋白的方法，其特征在于，包括：

将样品与权利要求9所述的抗体接触，

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在D-HSP70蛋白。

12．如权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于筛选促进人D-HSP70蛋白活性的激动剂，或者筛选抑制人D-HSP70蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。

13．一种如权利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

14．一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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