CN1342713A - 人长寿保障蛋白和编码序列及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类新的人长寿保障蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的人长寿保障蛋白的多核苷酸的用途。
Description
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人长寿保障蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备方法。
人体及哺乳动物细胞的分裂次数是固定的。每分裂一次，其子代细胞分裂次数的潜能减少一次。经一定次数的分裂，细胞不再能分裂而进入老化与凋亡。一般都认为人体除睾丸精原细胞外，很少有例外。但肿瘤细胞有2/3的细胞株，可不受以上机制约束，而具有无限次分裂的潜能，说明了肿瘤细胞持续分裂可能的机制。目前普遍的认识是：正常细胞的分裂次数，与细胞染色体的端粒长度有关，每分裂一次，端粒长度减短一次，一定次数分裂后当端粒缩短到一定长度时，细胞即停止分裂。但肿瘤细胞或生殖系细胞则具有端粒酶(Telomerase)可在每次分裂后修补其端粒，从而保持其长度。所以，目前认为，哺乳动物细胞必须依赖于端粒酶才能保持细胞的永生化。
然而，酵母细胞的永生化则另有它独特的机制。酵母细胞的分裂，作为个别细胞来说，也有恒定的分裂次数，但它的子细胞却仍保持了亲代细胞的分裂次数的潜能。因此，作为一个群体，酵母细胞是永生化的。这种机制并不依赖于端粒的长度(D′mello N.P.and Jazwinski S.M，J.Bacteriol.173：7609-7613，1991)。酵母中存在长寿保障基因Lag1Sc为控制与保证酵母细胞分裂次数传代后仍得以保证恒定有关(D′mello N.P.，Childress D.S.，Franklin S.P et al，J.Biol.Chem，269：15451-15459，1994)。
1998年，Jiang等人从人体细胞基因文库中分离出与酵母Lag1有一定同源的人的相关基因Lag1Hs(Jiang J.C.Kirchman P.A.Zagulski M等，Genome Res.8(12)：1259-1272，1998。GenBank nos，AF 105005-AF 105009).Lag1Hs在功能上可挽救具有Lag1Δ/Lac1Δ双缺陷区酵母细胞株的死亡，恢复其分裂的能力。上述作者发现该基因在人脑、肌组织中表达，认为以上基因可能与人的神经退行病变有关。
因此，为治疗目的研究和开发人长寿保障基因和蛋白有重要意义。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌作用的蛋白及其激动剂/抑制剂。
本发明的目的是提供一类新的长寿保障蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的长寿保障蛋白被命名为LAG1 Hs2蛋白。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的长寿保障蛋白多肽，它包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述的长寿保障蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO：3的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人长寿保障蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达长寿保障蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人长寿保障蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的长寿保障蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的长寿保障蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
在附图中，图1是Lag1Sc、Lag1Ce1、lag1 Hs1、和本发明的长寿保障蛋白Lag1 Hs2四种蛋白的Lag1基序比较图。
图2显示了Lag1 Hs2的表达谱。
图3显示了大肠杆菌T7 S30体外翻译系统表达Lag1 Hs2的凝胶电泳图。其中，泳道1为空白对照；泳道2为PinPointTM对照DNA(编码CAT融合蛋白，约39kDa)；泳道3为pT7X-LAG 1 Hs2(约27kDa)；泳道4为pT7Zza-LAG 1 Hs2(Zza+Sp260融合蛋白，约41kDa)；
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明，本发明的人长寿保障蛋白(LAG1 Hs2)对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的LAG1 Hs2蛋白或多肽”是指LAG1 Hs2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LAG1 Hs2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。LAG1 Hs2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人LAG1 Hs2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人LAG1 Hs2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人LAG1 Hs2多肽”指具有人LAG1 Hs2蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人LAG1 Hs2蛋白相同功能的、SEQ IDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人LAG1 Hs2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人LAG1 Hs2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人LAG1 Hs2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人LAG1 Hs2多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO：3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人LAG1 Hs2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人LAG1 Hs2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人LAG1 Hs2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人LAG1Hs2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人LAG1 Hs2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人长寿保障蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码人长寿保障蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定人长寿保障蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测人长寿保障蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或人长寿保障蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的人长寿保障蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人长寿保障蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人长寿保障蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人长寿保障蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人长寿保障蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗人长寿保障蛋白功能低下或丧失所致的疾病(尤其是用于抑制肿瘤生长)，和用于筛选促进或对抗人长寿保障蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人长寿保障蛋白的功能。用表达的重组人长寿保障蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人长寿保障蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人长寿保障蛋白的药剂的方法。激动剂提高人长寿保障蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人长寿保障蛋白的膜制剂与标记的人长寿保障蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
人长寿保障蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人长寿保障蛋白的拮抗剂可以与人长寿保障蛋白结合并消除其功能，或是抑制人长寿保障蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。人长寿保障蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人长寿保障蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响人长寿保障蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人长寿保障蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人长寿保障蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
人长寿保障蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于人长寿保障蛋白的无表达或异常/无活性的人长寿保障蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的人长寿保障蛋白，以抑制内源性的人长寿保障蛋白活性。例如，一种变异的人长寿保障蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人长寿保障蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗人长寿保障蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将人长寿保障蛋白基因转移至细胞内。构建携带人长寿保障蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人长寿保障蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制人长寿保障蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对人长寿保障蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗人长寿保障蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人长寿保障蛋白。
与人长寿保障蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人长寿保障蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人长寿保障蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人长寿保障蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人长寿保障蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人长寿保障蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
人长寿保障蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人长寿保障蛋白的单链抗体。
能与人长寿保障蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人长寿保障蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人长寿保障蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人长寿保障蛋白水平，可以用作解释人长寿保障蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断人长寿保障蛋白起作用的疾病。
人长寿保障蛋白的多聚核苷酸可用于人长寿保障蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，人长寿保障蛋白的多聚核苷酸可用于检测人长寿保障蛋白的表达与否或在疾病状态下人长寿保障蛋白的异常表达。如人长寿保障蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断人长寿保障蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人长寿保障蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人长寿保障蛋白的转录产物。
检测人长寿保障蛋白基因的突变也可用于诊断人长寿保障蛋白相关的疾病。人长寿保障蛋白突变的形式包括与正常野生型人长寿保障蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：a Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
本发明的人长寿保障蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
在本发明的一个实施例中，从人肝脏cDNA文库中分离出一个与酵母Lag1在氨基酸序列具有44％(83/183)同源的克隆，定名为LAG1 Hs2。与Jiang等报导的人相关基因LAG1 Hs在氨基酸具有46％(89/191)同源，但同样具有人与酵母共有的Lag1P基序。因此，从生物信息学可以判定新发现的LAG1 Hs2是一个新的与酵母LAG1人体同源基因(命名为“人长寿保障基因”)。在功能上，发现LAG1 Hs2可在体外抑制人肝癌细胞生长，并在裸鼠体内同样对癌的生长有一定抑制作用。此外，Northern杂交证明，本发明的LAG1 Hs2基因在人肾、肝组织有mRNA高水平表达；在脑、心、胎盘、肺组织中低水平表达；肌肉、结肠、胸腺、脾、小肠、外周血白细胞中不表达。原位杂交结果还显示，与肝癌组织相比较，正常肝的表达水平高于癌旁肝组织，癌旁肝组织高于肝癌的表达，证明人肝癌中存在该基因的表达下调。
鉴于LAG1 Hs2具有抑制癌细胞生长的作用。因此，它不仅有调控细胞分裂的作用，而且具有对恶性肿瘤治疗与诊断的应用价值。此外，由于本发明的人长寿保障蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：LAG1 Hs2 cDNA克隆的分离及对人肝癌细胞的生长抑制
从GIBC0 BRL公司购得人肝cDNA文库(目录号.10422-012)，第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。结果发现SP260 cDNA克隆有抑制克隆形成的功能(空载体克隆形成数为38、40、42，SP260 cDNA克隆为1，7，17)。
对cDNA克隆SP260采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆进行另一端测序，仍未获得全长cDNA序列，设计引物，再次进行测序，直到获得全长序列。
对SP260 cDNA克隆序列分析后发现基因尚不完整，采用Clontech公司SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(Cat.No.K1811-1)，基因特异引物为5′GGAAGGGGGAAGAGGCCAGAGAAAG 3′和5′TCCCAGTACAGCCCCCACTTTTTG 3′，按说明书进行操作，获得全长克隆，命名为LAG 1 Hs2。
实施例2：LAG1 Hs2 cDNA的序列分析
实施例1获得的cDNA全长为2007核苷酸，含阅读框架690(第415-1105位)个核苷酸，编码一个由230个氨基酸(不包括终止密码子)组成的蛋白。
A：核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：长度：2007bp 1 CTAGAATTCA GCGGCCGCTG AATTCTAGAA GCCGATCTAG AAGACCGAGA51 TGGACGTGTC TACGCCAAAG CCTCAGATCT CTATATCACG CTGCCCCTGG101 CCTTGCTCTT CCTCATCGTT CGATACTTCT TTGAGCTGTA CGTGGCTACA151 CCACTGGCTG CCCTCTTGAA CATAAAGGAG AAAACTCGGC TGCGGGCACC201 TCCCAACGCC ACCTTGGAAC ATTTCTACCT GACCAGTGGC AAGCAGCCCA251 AGCAGGTGGA AGTAGAGCTT TTGTCCCGGC AGAGCGGGCT CTCTGGCCGC301 CAGGTAGAGC GTTGGTTCCG TCGCCGCCGC AACCAGGACC GGCCCAGTCT351 CCTCAAGAAG TTCCGAGAAG CCAGCTGGAG ATTCACATTT TACCTGATTG401 CCTTCATTGC CGGCATGGCC GTCATTGTGG ATAAACCCTG GTTCTATGAC451 ATGAAGAAAG TTTGGGAGGG ATATCCCATA CAGAGCACTA TCCCTTCCCA501 GTATTGGTAC TACATGATTG AACTTTCCTT CTACTGGTCC CTGCTCTTCA551 GCATTGCCTC TGATGTCAAG CGAAAGGATT TCAAGGAACA GATCATCCAC601 CATGTGGCCA CCATCATTCT CATCAGCTTT TCCTGGTTTG CCAATTACAT651 CCGAGCTGGG ACTCTAATCA TGGCTCTGCA TGACTCTTCC GATTACCTGC701 TGGAGTCAGC CAAGATGTTT AACTACGCGG GATGGAAGAA CACCTGCAAC751 AACATCTTCA TCGTCTTCGC CATTGTTTTT ATCATCACCC GACTGGTCAT801 CCTGCCCTTC TGGATCCTGC ATTGCACCCT GGTGTACCCA CTGGAGCTCT851 ATCCTGCCTT CTTTGGCTAT TACTTCTTCA ATTCCATGAT GGGAGTTCTA901 CAGCTGCTGC ATATCTTCTG GGCCTACCTC ATTTTGCGCA TGGCCCACAA951 GTTCATAACT GGAAAGCTGG TAGAAGATGA ACGCAGTGAC CGGGAAGAAA1001 CAGAGAGCTC AGAGGGGGAG GAGGCTGCAG CTGGGGGAGG AGCAAAGAGC1051 CGGCCCCTAG CCAATGGCCA CCCCATCCTC AATAACAACC ATCGTAAGAA1101 TGACTGAACC ATTATTCCAG CTGCCTCCCA GATTAATGCA TAAAGCCAAG1151 GAACTACCCT GCTCCCTGCG CTATAGGGTC ACTTTAAGCT CTGGGGAAAA1201 AGGAGAAAGT GAGAGGAGAG TTCTCTGCAT CCTCCCTCCT TGCTTGTCAC1251 CCAGTTGCCT TTAAACCAAA TTCTAACCAG CCTATCCCCA GGTAGGGGGG1301 ACGTTGGTTA TATTCTGTTA GAGGGGGACG GTCGTATTTT CCTCCCTACC1351 CGCCAAGTCA TCCTTTCTAC TGCTTTTGAG GCCCTCCCTC AGCTCTCTGT1401 GGGTAGGGGT TACAATTCGC ATTCCTTATT CTGAGAATTT GGCCCCAGCT1451 GTTTGCCTTT GACTCCCTGA CCTCCAGAGC CAGGGTTGTG CCTTATTGTC1501 CCATCTGTGG GCCTCATTCT GCCAAAGCTG GACCAAGGCT AACCTTTCTA1551 AGCTCCCTAA CTTGGGCCAG AAACCAAAGC TGAGCTTTTA ACTTTCTCCC1601 TCTATGACAC AAATGAATTG AGGGTAGGAG GAGGGTGCAC ATAACCCTTA1651 CCCTACCTCT GCCAAAAAGT GGGGGCTGTA CTGGGGACTG CTCGGATGAT1701 CTTTCTTAGT GCTACTTCTT TCAGCTGTCC CTGTAGCGAC AGGTCTAAGA1751 TCTGACTGCC TCCTTTCTCT GGCCTCTTCC CCCTTCCCTC TTCTCTTCAG1801 CTAGGCTAGC TGGTTTGGAG TAGAATGGCA ACTAATTCTA ATTTTTATTT1851 ATTAAATATT TGGGGTTTTG GTTTTAAAGC CAGAATTACG GCTAGCACCT1901 AGCATTTCAG CAGAGGGACC ATTTTAGACC AAAATGTACT GTTAATGGGT1951 TTTTTTTTAA AATTAAAAGA TTAAATAAAA AATATTAAAT AAAAAAAAAA2001 AAAAAAAB：氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：长度：230个氨基酸1 MAVIVDKPWF YDMKKVWEGY PIQSTIPSQY WYYMIELSFY WSLLFSIASD 51 VKRKDFKEQI IHHVATIILI SFSWFANYIR AGTLIMALHD SSDYLLESAK101 MFNYAGWKNT CNNIFIVFAI VFIITRLVIL PFWILHCTLV YPLELYPAFF151 GYYFFNSMMG VLQLLHIFWA YLILRMAHKF ITGKLVEDER SDREETESSE201 GEEAAAGGGA KSRPLANGHP ILNNNHRKNDC克隆名称：LAG 1 Hs 2(SEQ ID NO：3)起始编码子：415 ATG 终止编码子：1107 TGA蛋白质分子量：26912.781 CTA GAA TTC AGC GGC CGC TGA ATT CTA GAA GCC GAT CTA GAA GAC CGA 4849 GAT GGA CGT GTC TAC GCC AAA GCC TCA GAT CTC TAT ATC ACG CTG CCC 9697 CTG GCC TTG CTC TTC CTC ATC GTT CGA TAC TTC TTT GAG CTG TAC GTG 144145 GCT ACA CCA CTG GCT GCC CTC TTG AAC ATA AAG GAG AAA ACT CGG CTG 192193 CGG GCA CCT CCC AAC GCC ACC TTG GAA CAT TTC TAC CTG ACC AGT GGC 240241 AAG CAG CCC AAG CAG GTG GAA GTA GAG CTT TTG TCC CGG CAG AGC GGG 288289 CTC TCT GGC CGC CAG GTA GAG CGT TGG TTC CGT CGC CGC CGC AAC CAG 336337 GAC CGG CCC AGT CTC CTC AAG AAG TTC CGA GAA GCC AGC TGG AGA TTC 384385 ACA TTT TAC CTG ATT GCC TTC ATT GCC GGC ATG GCC GTC ATT GTG GAT 4321 Met Ala Val Ile Val Asp 6433 AAA CCC TGG TTC TAT GAC ATG AAG AAA GTT TGG GAG GGA TAT CCC ATA 4807 Lys Pro Trp Phe Tyr Asp Met Lys Lys Val Trp Glu Gly Tyr Pro Ile 22481 CAG AGC ACT ATC CCT TCC CAG TAT TGG TAC TAC ATG ATT GAA CTT TCC 52823 Gln Ser Thr Ile Pro Ser Gln Tyr Trp Tyr Tyr Met Ile Glu Leu Ser 38529 TTC TAC TGG TCC CTG CTC TTC AGC ATT GCC TCT GAT GTC AAG CGA AAG 57639 Phe Tyr Trp Ser Leu Leu Phe Ser Ile Ala Ser Asp Val Lys Arg Lys 54577 GAT TTC AAG GAA CAG ATC ATC CAC CAT GTG GCC ACC ATC ATT CTC ATC 62455 Asp Phe Lys Glu Gln Ile Ile His His Val Ala Thr Ile Ile Leu Ile 70625 AGC TTT TCC TGG TTT GCC AAT TAC ATC CGA GCT GGG ACT CTA ATC ATG 67271 Ser Phe Ser Trp Phe Ala Asn Tyr Ile Arg Ala Gly Thr Leu Ile Met 86673 GCT CTG CAT GAC TCT TCC GAT TAC CTG CTG GAG TCA GCC AAG ATG TTT 72087 Ala Leu His Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Leu Glu Ser Ala Lys Met Phe 102721 AAC TAC GCG GGA TGG AAG AAC ACC TGC AAC AAC ATC TTC ATC GTC TTC 768103 Asn Tyr Ala Gly Trp Lys Asn Thr Cys Asn Asn Ile Phe Ile Val Phe 118769 GCC ATT GTT TTT ATC ATC ACC CGA CTG GTC ATC CTG CCC TTC TGG ATC 816119 Ala Ile Val Phe Ile Ile Thr Arg Leu Val Ile Leu Pro Phe Trp Ile 134 817 CTG CAT TGC ACC CTG GTG TAC CCA CTG GAG CTC TAT CCT GCC TTC TTT 864135 Leu His Cys Thr Leu Val Tyr Pro Leu Glu Leu Tyr Pro Ala Phe Phe 150865 GGC TAT TAC TTC TTC AAT TCC ATG ATG GGA GTT CTA CAG CTG CTG CAT 912151 Gly Tyr Tyr Phe Phe Asn Ser Met Met Gly Val Leu Gln Leu Leu His 166913 ATC TTC TGG GCC TAC CTC ATT TTG CGC ATG GCC CAC AAG TTC ATA ACT 960167 Ile Phe Trp Ala Tyr Leu Ile Leu Arg Met Ala His Lys Phe Ile Thr 182961 GGA AAG CTG GTA GAA GAT GAA CGC AGT GAC CGG GAA GAA ACA GAG AGC 1008183 Gly Lys Leu Val Glu Asp Glu Arg Ser Asp Arg Glu Glu Thr Glu Ser 1981009 TCA GAG GGG GAG GAG GCT GCA GCT GGG GGA GGA GCA AAG AGC CGG CCC 1056199 Ser Glu Gly Glu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Lys Ser Arg Pro 2141057 CTA GCC AAT GGC CAC CCC ATC CTC AAT AAC AAC CAT CGT AAG AAT GAC 1104215 Leu Ala Asn Gly His Pro Ile Leu Ash Ash Asn His Arg Lys Asn Asp 2301105 TGA ACC ATT ATT CCA GCT GCC TCC CAG ATT AAT GCA TAA AGC CAA GGA 1152231 *** 2311153 ACT ACC CTG CTC CCT GCG CTA TAG GGT CAC TTT AAG CTC TGG GGA AAA 12001201 AGG AGA AAG TGA GAG GAG AGT TCT CTG CAT CCT CCC TCC TTG CTT GTC 12481249 ACC CAG TTG CCT TTA AAC CAA ATT CTA ACC AGC CTA TCC CCA GGT AGG 12961297 GGG GAC GTT GGT TAT ATT CTG TTA GAG GGG GAC GGT CGT ATT TTC CTC 13441345 CCT ACC CGC CAA GTC ATC CTT TCT ACT GCT TTT GAG GCC CTC CCT CAG 13921393 CTC TCT GTG GGT AGG GGT TAC AAT TCG CAT TCC TTA TTC TGA GAA TTT 14401441 GGC CCC AGC TGT TTG CCT TTG ACT CCC TGA CCT CCA GAG CCA GGG TTG 14881489 TGC CTT ATT GTC CCA TCT GTG GGC CTC ATT CTG CCA AAG CTG GAC CAA 15361537 GGC TAA CCT TTC TAA GCT CCC TAA CTT GGG CCA GAA ACC AAA GCT GAG 15841585 CTT TTA ACT TTC TCC CTC TAT GAC ACA AAT GAA TTG AGG GTA GGA GGA 16321633 GGG TGC ACA TAA CCC TTA CCC TAC CTC TGC CAA AAA GTG GGG GCT GTA 16801681 CTG GGG ACT GCT CGG ATG ATC TTT CTT AGT GCT ACT TCT TTC AGC TGT 17281729 CCC TGT AGC GAC AGG TCT AAG ATC TGA CTG CCT CCT TTC TCT GGC CTC 17761777 TTC CCC CTT CCC TCT TCT CTT CAG CTA GGC TAG CTG GTT TGG AGT AGA 18241825 ATG GCA ACT AAT TCT AAT TTT TAT TTA TTA AAT ATT TGG GGT TTT GGT 18721873 TTT AAA GCC AGA ATT ACG GCT AGC ACC TAG CAT TTC AGC AGA GGG ACC 19201921 ATT TTA GAC CAA AAT GTA CTG TTA ATG GGT TTT TTT TTA AAA TTA AAA 19681969 GAT TAA ATA AAA AAT ATT AAA TAA AAA AAA AAA AAA AAA 2007
D.同源比较
本发明的LAG1 Hs2 cDNA克隆，含全长cDNA序列。它与酵母的LAG1的氨基酸相同性(Identity)22％(42/185)，相似性(Positiveness)为43％(82/185)。与已报导的人LAG1 Hs I相同性为28％(54/191)，相似性为46％(89/191)。(1)LAG1Hs 2的氨基酸序列与酵母、C.Elegans相关基因的同源性比较Query＝LAG I Hs2 Sbjct＝LAG1Ce-1(C.Elegans)＞LAG1Ce-1 长度＝368分值＝134 bits(334)，预计值＝2e-36相同性＝71/194(36％)，相似性＝104/194(53％)，缺口＝14/194(7％)Query： 3 VIVDKPWFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWYYMIELSFYWSLLFSIASDVKRKDFKEQIIH 62
V+ + W YD+K+ W GYP + +WYYMIE FY+SLL DV+R DF + ++HSbjct：112 VMKNSSWLYDVKQCWIGYPFHPVPDTIWWYYMIETGFYYSLLIGSTFDVRRSDFWQLMVH 171Query： 63 HVATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNY-AGWKNTCNNXXXXXXXX 121
HV TI L+S SW N++R GTLI+ HD SD LE K+ Y A KN NSbjct：172 HVITIFLLSSSWTINFVRVGTLILLSHDVSDVFLEGGKLVRYDAHNKNMTNFMFVLFFSS 231Query：122 XXXTRLVILPFWILHCT------------LVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFW 169
TRL+ PF ++ +++ +L P + +++ +L LHIFWSbjct：232 WVATRLIYYPFIVIRSAVTEAAALIQPDYILWDYQLSPPYAPRLIVFALI-LLFFLHIFW 290Query：170 AYLILRMAHKFITG 183
++ILR+A++ TGSbjct：291 TFIILRIAYRTSTG 304Query＝LAG 1 Hs2 Sbjct＝Lag1Sc(酵母)＞Lag1Sc 长度＝411分值＝60.5 bits(144)，预计值＝5e-14相同性＝42/185(22％)，相似性＝82/185(43％)，缺口＝13/185(7％)Query： 9 WFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWYYMIELSFYWS---LLFSIASDVKRKDFKEQIIHHVA 65
W + K ++ YP+ T P + + + + +W+ + + + RKD+KE + HH+Sbjct：200 WLFKTKPMYRTYPV-ITNPFLFKIFYLGQAAFWAQQACVLVLQLEKPRKDYKELVFHHIV 258Query： 66 TIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNYAGWKNTCNNXXXXXXXXXXXT 125
T++LI S+ ++ + G I D SD+ L +K NY TSbjct：289 TLLLIWSSYVFHFTKMGLAIYITMDVSDFFLSLSKTLNYLNSVFTPFVFGLFVFFWIYLR 318Query：126 RLV-ILPFWIL--------HCTLVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFWAYLILRM 176
+V I W + + L + + Y + ++ LQL++++W +LILR+Sbjct：319 HVVNIRILWSVLTEFRHEGNYVLNFATQQYKCWISLPIVFVLIAALQLVNLYWLFLILRI 378Query：177 AHKFI 181
++I
Sbjct：379 LYRLI 383
(2)与人LAG1Hs的氨基酸序列及核苷酸序列比较
与Lag1Hs氨基酸序列比较：
＞Lag1Hs 长度＝350
分值＝77.3 bits(187)，预计值＝4e-19
相同性＝54/191(28％)，相似性＝89/191(46％)，缺口＝11/191(5％)
Query： 6 DKPWFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWY-YMIELSFYW-SLLFSIASDVKRKDFKEQIIHH 63
D P+F+D V+ + +P Y+++ SFY S+ ++ D RKD ++HH
Sbjct：124 DYPFFHDPPSVFYDWTPGMAVPRDIAAAYLLQGSFYGHSIYATLYMDTWRKDSVVMLLHH 183
Query： 64 VATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNYAGWKNTCNNXXXXXXXXXX 123
V T+ILI S+ Y G L++ LHD SD LE K+ Y + +
Sbjct：184 VVTLILIVSSYAFRYHNVGILVLFLHDISDVQLEFTKLNIYFKSRGGSYHRLHALAADLG 243
Query：124 XT---------RLVILPFWILHCTLVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFWAYLIL 174
RL P +L+ T L P Y+FFN+++ +L L++++W I+
Sbjct：244 CLSFGFSWFWFRLYWFPLKVLYATSHCSLRTVPDIPFYFFFNALLLLLTLMNLYWFLYIV 303
Query：175 RMAHKFITGKL 185
A K +TG++
Sbjct：304 AFAAKVLTGQV 314
F：基序分析
如图1所示，本发明的LAG1 Hs2 cDNA序列，在53至104号氨基酸序列中，含与酵母Lag1P基序高度同源的特征性序列(RKDFKEQIIHHVATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNY)，酵母属Lag基因及已报导的LAG1 Hs I即长寿保障基因中的共有保守序列的基序。因此，本发明的LAG1 Hs2蛋白具有Lag1基序，这暗示它具有与酵母长寿保障蛋白相同或相近的功能。
实施例3：LAG1 Hs2对移植性人肝癌裸鼠体内生长抑制
皮下接种人肝癌移植瘤于裸鼠，待瘤长至直径为0.5cm左右(约一周)，随机分组，每组6只，设一组为对照组，即生理盐水组，一组为实验组。LAG1 Hs2基因克隆于真核表达载体pBKCMV中，构建成表达质粒。对照组瘤周注射100μl生理盐水/次/周，实验组瘤周注射100μl溶解于生理盐水中的GE7基因转移系统包裹的0.2μg LAG1 Hs2表达质粒/次/周，共注射四次，最后一次注射后一周，处死裸鼠，取瘤称重，求±SD，进行统计处理。结果如表所示，LAG1 Hs2基因有29.4％抑瘤率。
W±SD 抑制率对照组 4.01±0.53LAG1Hs2 2.83±1.55 29.4％
实施例4：LAG1 Hs2在人组织中mRNA表达谱
用LAG 1 Hs2基因为探针，于多种组织mRNA膜片(Clontech)进行杂交。结果如图2所示，本发明的LAG1 Hs2 cDNA，用Northern杂交，证明该基因在人肾、肝组织有mRNA高水平表达；在脑、心、胎盘、肺组织中低水平表达；肌肉、结肠、胸腺、脾、小肠、外周血白细胞中不表达。
原位杂交结果还显示，与肝癌组织相比较，正常肝的表达水平高于癌旁肝组织，癌旁肝组织高于肝癌的表达，证明人肝癌中存在该基因的表达下调。
实施例5：体外翻译系统表达LAG1 Hs2蛋白
(1)LAG1 Hs2基因克隆于含T7启动子的表达载体
在本实施例中采用非融合和融合表达两种形式。在非融合表达中，设计LAG 1Hs2基因开放阅读框架(ORF)的一对特异引物，5′端引物含有NcoI酶切点，3′端引物含有HindIII酶切点，以LAG 1 Hs2克隆质粒或RT-PCR的扩增产物为模板扩增片段PCR，产物经NcoI和HindIII酶切。非融合表达质粒为含有T7启动子的p22450(该载体为中科院上海生物工程中心构建)，载体也经NcoI和HidnIII酶切，与PCR酶切片段连接，组建非融合表达质粒。
在融合表达中，设计LAG 1 Hs2基因开放阅读框架(ORF)的一对特异引物，5′端引物含有EcoRI酶切点，3′端引物含有HindIII酶切点，以LAG 1 Hs2克隆质粒或RT-PCR的扩增产物为模板扩增PCR片段，产物经EcoRI和HindIII酶切。融合表达所用载体为pT7zza(该载体为上海生物工程中心构建)，载体经EcoRI和HindIII酶切后与PCR酶切片段连接，组建融合表达质粒。
(2)体外翻译表达
用上述构建的两种表达质粒，采用E.coli T7 S30 Exaact System for CircularDNA(Promega，Cat#L1130)，并利用TranscendTM Colorimetric TranslationDetection System(Promema，Cat.#L5070)，体外表达LAG1 Hs2蛋白。
1.建立体外翻译反应体系：
质粒DNA： 1-4μg
完全氨基酸tRNA混合液： 5μl
无氨基酸的S30预混合液： 20μl
TranscendTM tRNA*： 1μl
T7 S30细胞裂解液： 15μl
无核酸酶无菌水加至终浓度： 50μl
*TranscendTM tRNA是e-NH2被生物素标记的Lys-tRNA。
37℃反应1-2小时。
2.体外翻译产物的分析：
SDS-PAGE电泳分析：15％分离胶，4％浓缩胶。
电转移至PVDF：100V，60分钟。
利用Streptavidin-Alkaline Phosphatase(链霉抗生物素-碱性磷酸脂酶)结合含生物素的翻译蛋白，并通过Western Blue Stablized Substrate for AlkalinePhosphatase(碱性磷酸脂酶固定化染色剂)显色。
结果显示正对照样品CAT融合蛋白表达质粒在39KD处有蛋白条带，LAG1 Hs2蛋白表达质粒pT7X-LAG1 Hs2在27KD处有蛋白条带，LAG1 Hs2与ZZ融合蛋白表达质粒pT2Zza-LAG1 Hs2在41KD处有蛋白条带，分子量与预计相符(图3)。这表明用体外表达系统表达了LAG1 Hs2蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息：(i)申请人：上海市肿瘤研究所(ii)发明名称：人长寿保障蛋白和编码序列及其用途(iii)序列数目：3(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征：
(A)长度：2007bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：核苷酸(ix)序列描述：SEQ ID NO.1：CTAGAATTCA GCGGCCGCTG AATTCTAGAA GCCGATCTAG AAGACCGAGA TGGACGTGTC 60TACGCCAAAG CCTCAGATCT CTATATCACG CTGCCCCTGG CCTTGCTCTT CCTCATCGTT 120CGATACTTCT TTGAGCTGTA CGTGGCTACA CCACTGGCTG CCCTCTTGAA CATAAAGGAG 180AAAACTCGGC TGCGGGCACC TCCCAACGCC ACCTTGGAAC ATTTCTACCT GACCAGTGGC 240AAGCAGCCCA AGCAGGTGGA AGTAGAGCTT TTGTCCCGGC AGAGCGGGCT CTCTGGCCGC 300CAGGTAGAGC GTTGGTTCCG TCGCCGCCGC AACCAGGACC GGCCCAGTCT CCTCAAGAAG 360TTCCGAGAAG CCAGCTGGAG ATTCACATTT TACCTGATTG CCTTCATTGC CGGCATGGCC 420GTCATTGTGG ATAAACCCTG GTTCTATGAC ATGAAGAAAG TTTGGGAGGG ATATCCCATA 480CAGAGCACTA TCCCTTCCCA GTATTGGTAC TACATGATTG AACTTTCCTT CTACTGGTCC 540CTGCTCTTCA GCATTGCCTC TGATGTCAAG CGAAAGGATT TCAAGGAACA GATCATCCAC 600CATGTGGCCA CCATCATTCT CATCAGCTTT TCCTGGTTTG CCAATTACAT CCGAGCTGGG 660ACTCTAATCA TGGCTCTGCA TGACTCTTCC GATTACCTGC TGGAGTCAGC CAAGATGTTT 720AACTACGCGG GATGGAAGAA CACCTGCAAC AACATCTTCA TCGTCTTCGC CATTGTTTTT 780ATCATCACCC GACTGGTCAT CCTGCCCTTC TGGATCCTGC ATTGCACCCT GGTGTACCCA 840CTGGAGCTCT ATCCTGCCTT CTTTGGCTAT TACTTCTTCA ATTCCATGAT GGGAGTTCTA 900CAGCTGCTGC ATATCTTCTG GGCCTACCTC ATTTTGCGCA TGGCCCACAA GTTCATAACT 960GGAAAGCTGG TAGAAGATGA ACGCAGTGAC CGGGAAGAAA CAGAGAGCTC AGAGGGGGAG 1020GAGGCTGCAG CTGGGGGAGG AGCAAAGAGC CGGCCCCTAG CCAATGGCCA CCCCATCCTC 1080AATAACAACC ATCGTAAGAA TGACTGAACC ATTATTCCAG CTGCCTCCCA GATTAATGCA 1140TAAAGCCAAG GAACTACCCT GCTCCCTGCG CTATAGGGTC ACTTTAAGCT CTGGGGAAAA 1200AGGAGAAAGT GAGAGGAGAG TTCTCTGCAT CCTCCCTCCT TGCTTGTCAC CCAGTTGCCT 1260TTAAACCAAA TTCTAACCAG CCTATCCCCA GGTAGGGGGG ACGTTGGTTA TATTCTGTTA 1320GAGGGGGACG GTCGTATTTT CCTCCCTACC CGCCAAGTCA TCCTTTCTAC TGCTTTTGAG 1380GCCCTCCCTC AGCTCTCTGT GGGTAGGGGT TACAATTCGC ATTCCTTATT CTGAGAATTT 1440GGCCCCAGCT GTTTGCCTTT GACTCCCTGA CCTCCAGAGC CAGGGTTGTG CCTTATTGTC 1500CCATCTGTGG GCCTCATTCT GCCAAAGCTG GACCAAGGCT AACCTTTCTA AGCTCCCTAA 1560CTTGGGCCAG AAACCAAAGC TGAGCTTTTA ACTTTCTCCC TCTATGACAC AAATGAATTG 1620AGGGTAGGAG GAGGGTGCAC ATAACCCTTA CCCTACCTCT GCCAAAAAGT GGGGGCTGTA 1680CTGGGGACTG CTCGGATGAT CTTTCTTAGT GCTACTTCTT TCAGCTGTCC CTGTAGCGAC 1740AGGTCTAAGA TCTGACTGCC TCCTTTCTCT GGCCTCTTCC CCCTTCCCTC TTCTCTTCAG 1800CTAGGCTAGC TGGTTTGGAG TAGAATGGCA ACTAATTCTA ATTTTTATTT ATTAAATATT 1860TGGGGTTTTG GTTTTAAAGC CAGAATTACG GCTAGCACCT AGCATTTCAG CAGAGGGACC 1920ATTTTAGACC AAAATGTACT GTTAATGGGT TTTTTTTTAA AATTAAAAGA TTAAATAAAA 1980AATATTAAAT AAAAAAAAAA AAAAAAA 2007(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征：
(A)长度：230氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(ix)序列描述：SEQ ID NO.2MAVIVDKPWF YDMKKVWEGY PIQSTIPSQY WYYMIELSFY WSLLFSIASD 50VKRKDFKEQI IHHVATIILI SFSWFANYIR AGTLIMALHD SSDYLLESAK 100MFNYAGWKNT CNNIFIVFAI VFIITRLVIL PFWILHCTLV YPLELYPAFF 150GYYFFNSMMG VLQLLHIFWA YLILRMAHKF ITGKLVEDER SDREETESSE 200GEEAAAGGGA KSRPLANGHP ILNNNHRKND 230(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征：
(A)长度：2007bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：核苷酸(ix)序列描述：SEQ ID NO.3：1 CTA GAA TTC AGC GGC CGC TGA ATT CTA GAA GCC GAT CTA GAA GAC CGA 4849 GAT GGA CGT GTC TAC GCC AAA GCC TCA GAT CTC TAT ATC ACG CTG CCC 9697 CTG GCC TTG CTC TTC CTC ATC GTT CGA TAC TTC TTT GAG CTG TAC GTG 144145 GCT ACA CCA CTG GCT GCC CTC TTG AAC ATA AAG GAG AAA ACT CGG CTG 192193 CGG GCA CCT CCC AAC GCC ACC TTG GAA CAT TTC TAC CTG ACC AGT GGC 240241 AAG CAG CCC AAG CAG GTG GAA GTA GAG CTT TTG TCC CGG CAG AGC GGG 288289 CTC TCT GGC CGC CAG GTA GAG CGT TGG TTC CGT CGC CGC CGC AAC CAG 336337 GAC CGG CCC AGT CTC CTC AAG AAG TTC CGA GAA GCC AGC TGG AGA TTC 384385 ACA TTT TAC CTG ATT GCC TTC ATT GCC GGC ATG GCC GTC ATT GTG GAT 4321 Met Ala Val Ile Val Asp 6433 AAA CCC TGG TTC TAT GAC ATG AAG AAA GTT TGG GAG GGA TAT CCC ATA 4807 Lys Pro Trp Phe Tyr Asp Met Lys Lys Val Trp Glu Gly Tyr Pro Ile 22481 CAG AGC ACT ATC CCT TCC CAG TAT TGG TAC TAC ATG ATT GAA CTT TCC 52823 Gln Ser Thr Ile Pro Ser Gln Tyr Trp Tyr Tyr Met Ile Glu Leu Ser 38529 TTC TAC TGG TCC CTG CTC TTC AGC ATT GCC TCT GAT GTC AAG CGA AAG 57639 Phe Tyr Trp Ser Leu Leu Phe Ser Ile Ala Ser Asp Val Lys Arg Lys 54577 GAT TTC AAG GAA CAG ATC ATC CAC CAT GTG GCC ACC ATC ATT CTC ATC 62455 Asp Phe Lys Glu Gln Ile Ile His His Val Ala Thr Ile Ile Leu Ile 70625 AGC TTT TCC TGG TTT GCC AAT TAC ATC CGA GCT GGG ACT CTA ATC ATG 67271 Ser Phe Ser Trp Phe Ala Ash Tyr Ile Arg Ala Gly Thr Leu Ile Met 86673 GCT CTG CAT GAC TCT TCC GAT TAC CTG CTG GAG TCA GCC AAG ATG TTT 72087 Ala Leu His Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Leu Glu Ser Ala Lys Met Phe 102721 AAC TAC GCG GGA TGG AAG AAC ACC TGC AAC AAC ATC TTC ATC GTC TTC 768103 Asn Tyr Ala Gly Trp Lys Asn Thr Cys Asn Asn Ile Phe Ile Val Phe 118769 GCC ATT GTT TTT ATC ATC ACC CGA CTG GTC ATC CTG CCC TTC TGG ATC 816119 Ala Ile Val Phe Ile Ile Thr Arg Leu Val Ile Leu Pro Phe Trp Ile 134817 CTG CAT TGC ACC CTG GTG TAC CCA CTG GAG CTC TAT CCT GCC TTC TTT 864135 Leu His Cys Thr Leu Val Tyr Pro Leu Glu Leu Tyr Pro Ala Phe Phe 150865 GGC TAT TAC TTC TTC AAT TCC ATG ATG GGA GTT CTA CAG CTG CTG CAT 912 151 Gly Tyr Tyr Phe Phe Asn Ser Met Met Gly Val Leu Gln Leu Leu His 166913 ATC TTC TGG GCC TAC CTC ATT TTG CGC ATG GCC CAC AAG TTC ATA ACT 960167 Ile Phe Trp Ala Tyr Leu Ile Leu Arg Met Ala His Lys Phe Ile Thr 182961 GGA AAG CTG GTA GAA GAT GAA CGC AGT GAC CGG GAA GAA ACA GAG AGC 1008183 Gly Lys Leu Val Glu Asp Glu Arg Ser Asp Arg Glu Glu Thr Glu Ser 1981009 TCA GAG GGG GAG GAG GCT GCA GCT GGG GGA GGA GCA AAG AGC CGG CCC 1056199 Ser Glu Gly Glu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Lys Ser Arg Pro 2141057 CTA GCC AAT GGC CAC CCC ATC CTC AAT AAC AAC CAT CGT AAG AAT GAC 1104215 Leu Ala Ash Gly His Pro Ile Leu Ash Asn Asn His Arg Lys Asn Asp 2301105 TGA ACC ATT ATT CCA GCT GCC TCC CAG ATT AAT GCA TAA AGC CAA GGA 1152231 *** 2311153 ACT ACC CTG CTC CCT GCG CTA TAG GGT CAC TTT AAG CTC TGG GGA AAA 12001201 AGG AGA AAG TGA GAG GAG AGT TCT CTG CAT CCT CCC TCC TTG CTT GTC 12481249 ACC CAG TTG CCT TTA AAC CAA ATT CTA ACC AGC CTA TCC CCA GGT AGG 12961297 GGG GAC GTT GGT TAT ATT CTG TTA GAG GGG GAC GGT CGT ATT TTC CTC 13441345 CCT ACC CGC CAA GTC ATC CTT TCT ACT GCT TTT GAG GCC CTC CCT CAG 13921393 CTC TCT GTG GGT AGG GGT TAC AAT TCG CAT TCC TTA TTC TGA GAA TTT 14401441 GGC CCC AGC TGT TTG CCT TTG ACT CCC TGA CCT CCA GAG CCA GGG TTG 14881489 TGC CTT ATT GTC CCA TCT GTG GGC CTC ATT CTG CCA AAG CTG GAC CAA 15361537 GGC TAA CCT TTC TAA GCT CCC TAA CTT GGG CCA GAA ACC AAA GCT GAG 15841585 CTT TTA ACT TTC TCC CTC TAT GAC ACA AAT GAA TTG AGG GTA GGA GGA 16321633 GGG TGC ACA TAA CCC TTA CCC TAC CTC TGC CAA AAA GTG GGG GCT GTA 16801681 CTG GGG ACT GCT CGG ATG ATC TTT CTT AGT GCT ACT TCT TTC AGC TGT 17281729 CCC TGT AGC GAC AGG TCT AAG ATC TGA CTG CCT CCT TTC TCT GGC CTC 17761777 TTC CCC CTT CCC TCT TCT CTT CAG CTA GGC TAG CTG GTT TGG AGT AGA 18241825 ATG GCA ACT AAT TCT AAT TTT TAT TTA TTA AAT ATT TGG GGT TTT GGT 18721873 TTT AAA GCC AGA ATT ACG GCT AGC ACC TAG CAT TTC AGC AGA GGG ACC 19201921 ATT TTA GAC CAA AAT GTA CTG TTA ATG GGT TTT TTT TTA AAA TTA AAA 19681969 GAT TAA ATA AAA AAT ATT AAA TAA AAA AAA AAA AAA AAA 2007
Claims (10)
1.一种分离的长寿保障蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO：2的氨基酶序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：
(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有SEQID NO：2的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：
SEQ ID NO：3的编码区序列或全长序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：
(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有长寿保障蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达长寿保障蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出具有长寿保障蛋白活性的多肽。
9.一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
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