CN109821012A

CN109821012A - 一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂

Info

Publication number: CN109821012A
Application number: CN201910276078.9A
Authority: CN
Inventors: 叶贤龙; 齐剑英; 朱升龙; 吴云舟
Original assignee: Henan Normal University
Current assignee: Henan Normal University
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明公开了一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂，属于生物医药技术领域。本发明的技术方案要点为：用于治疗代谢疾病的药物组合物的活性成分为Leptin和成纤维细胞生长因子21，其中Leptin蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，成纤维细胞生长因子21蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。本发明缓释微球经体外释放试验，其缓释达1周以上，释放符合近似零级模式，可用于治疗糖尿病、肥胖症及相关内分泌疾病的皮下注射制剂。本发明的药物组合物及其缓释微球制剂给糖尿病和肥胖症患者的治疗提供了更加经济和高效的治疗方案。

Description

一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及瘦素（Leptin）和成纤维细胞因子21（FGF21）组合物及其缓释微球制剂在治疗代谢疾病中的用途，还涉及降低瘦素蛋白和成纤维细胞生长因子21蛋白使用成本并提高其安全性和药效的药物组合物及其缓释微球制剂。

背景技术

糖尿病是危及全球的一种严重的代谢疾病，目前我国糖尿病患者已达1亿左右，患病率已由十几年前的1%增长至目前的2.5%，并以每年0.1%的速度递增。糖尿病已经成为继心脑血管疾病和癌症之后威胁人类健康的第三大杀手。目前仍缺少治愈糖尿病的有效方法，临床上对糖尿病以药物控制为主，患者需要终身服药以达到控制血糖水平，减轻糖尿病的症状，延缓并发症的出现的目的。现临床应用的糖尿病药物极易引起一些较严重的副作用，如低血糖、体重增加、心血管毒等副作用。而且由于糖尿病后期多数患者体内胰岛素抵抗现象严重，导致大部分依赖胰岛素通路的药物失效，给糖尿病治疗带来较大困难。因此，探寻更有效且安全的，尤其是可不依赖胰岛素途径独立调节血糖的新型药物一直是糖尿病治疗研究中现实而紧迫的任务。

肥胖是指体内过量脂肪堆积而使体重超过标准体重的20%，若因肥胖而影响正常生活及工作的通常称之为肥胖症。随着人们生活水平的不断提高，居民的饮食结构和生活习惯发生了较大的变化，表现为从膳食中摄入的能量和脂肪日渐增加，体力消耗却日渐减少，导致体内脂肪积累明显增加。肥胖症是以体内脂肪过多为主要特征的、多病因的、能够合并多种疾病的慢性病。肥胖是糖尿病、心血管疾病及高血压等疾病和社会心理障碍的重要危险因素。目前，肥胖症已被世界卫生组织列为与癌症并列的21世纪威胁人类健康的最严重的疾病，故研究肥胖症及其相关疾病的病因及防治措施已成为紧迫的课题。

1994年Zhang等首次成功地克隆了小鼠的肥胖基因（obese gene，ob）ob基因及人类的同源序列。ob基因及表达产物-瘦素（Leptin）的发现使肥胖的研究获得突破性进展，而且近年瘦素与2型糖尿病的研究亦成为热点。Leptin为ob基因的表达产物，由146个氨基酸组成的单链蛋白质。Leptin由脂肪组织分泌后进入血循环与瘦素受体结合，通过下丘脑调节食欲、能量消耗而控制体重。Leptin的作用包括中枢和外周性，Leptin作用除通过中枢神经系统，还可通过脂肪组织的Leptin受体，直接抑制脂肪组织中脂类的合成。Leptin在调节机体摄食和能量代谢中发挥着重要作用，在神经内分泌、血管新生、生殖、免疫调节和创伤修复等方面的作用也渐渐被人们重视，同时Leptin在肥胖、糖尿病、心血管疾病和缺血再灌注损伤等方面的作用也被重视。

2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子21（FGF21）。FGF21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏和脂肪中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽（去除信号肽后的多肽为成熟肽），因此FGF21可以分泌到细胞外。FGF21具有调节血糖、降低血脂和改善胰岛素抵抗等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。但长期的研究及临床实验结果显示，FGF21使用剂量高，与其它蛋白药物一样，稳定性差、体内半衰期短、易产生抗原抗体反应，这直接影响了其在临床上的治疗效果。本发明将Leptin与FGF21联合应用，并将其制备成缓释微球制剂，不但可以提高降低血糖、体重及血脂的效果，而且降低使用剂量，增加安全性，为糖尿病和肥胖症的治疗提供更安全、经济和有效的治疗方案。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂，该药物组合物及其缓释微球制剂有效降低了Leptin和成纤维细胞生长因子21的使用成本，并提高了药物的安全性和使用效果。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种用于治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于：所述用于治疗代谢疾病的药物组合物的活性成分为Leptin和成纤维细胞生长因子21，其中Leptin蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，Leptin蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，成纤维细胞生长因子21蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，成纤维细胞生长因子21蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

优选的，所述用于治疗代谢疾病的药物组合物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了活性组分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。

优选的，所述用于治疗代谢疾病的药物组合物的给药形态为针剂，具体包括粉剂、水剂或油剂。

优选的，所述用于治疗代谢疾病的药物组合物在制备治疗糖尿病、肥胖及相关内分泌疾病药物中的应用，该药物组合物用于降低血糖浓度、降低体重、改善血脂参数、增加胰岛素敏感性及Leptin敏感性，该药物组合物能够达到稳定血糖在正常水平和体重降低的同时减少Leptin的治疗剂量达4倍，并减少FGF21的使用剂量达4倍以上，从而降低糖尿病和肥胖症治疗中Leptin和FGF21的使用成本，同时增加在糖尿病和肥胖症治疗中的脂代谢调节能力，主要包括增加脂解和能量的消耗，避免由于长期单独使用Leptin而引起Leptin抵抗的副作用。

近年来生物可降解的高分子材料广泛应用于蛋白多肽类药物缓释微球的制备，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactide-co-glycolide)，PLGA），由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准为药用高分子材料使用。以PLGA作为微球基质，体内外降解实验证明，在药物释放过程中，整个聚合物骨架呈均匀行降解，随着分子量的下降，骨架材料的亲水性增强，由于水分的不断渗入使蛋白多肽类药物持续释放出来。

本发明所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂，其特征在于：以Leptin和成纤维细胞生长因子21为主药，以PLGA为基质，于室温搅拌反应制得用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

本发明所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖和甘露醇，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，基质浓度为50-300mg/mL，取主药和保护剂溶于水中形成内水相，Leptin和FGF21组合物的总浓度为1-10mg/mL，将内水相加入到油相中，超声乳化形成初乳，将初乳滴加在聚乙烯醇水溶液中，经W/O/W溶剂挥发法制得用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

本发明所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和甘露醇，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂乙腈制成油相，基质浓度为50-300mg/mL，取主药、聚乙二醇和保护剂溶于水中，冷冻干燥后用二氯甲烷洗涤离心去除聚乙二醇得到主药微粉，将主药微粉分散在油相中，经S/O/O溶剂挥发法制备用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

本发明所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和人血清白蛋白，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，将主药和保护剂溶于水中，经喷雾冷冻干燥得到主药微粉，再将主药微粉加入油相中，经喷雾干燥法制备用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

优选的，所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂作为治疗糖尿病、肥胖症及相关内分泌疾病的皮下注射制剂的用途，该缓释微球制剂能够持续释药达1周以上，并达到降低血糖浓度、降低体重、改善血脂参数、增加胰岛素敏感性及Leptin敏感性的效果。

本发明缓释微球经体外释放试验，其缓释达1周以上，释放符合近似零级模式，可用于治疗糖尿病、肥胖症及相关内分泌疾病的皮下注射制剂。本发明的药物组合物及其缓释微球制剂给糖尿病和肥胖症患者的治疗提供了更加经济和高效的治疗方案。

附图说明

图1为Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠血糖水平变化；

图2为Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠体重变化；

图3为Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠糖耐量变化；

图4为Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠甘油三脂水平变化；

图5为Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠空腹胰岛素水平变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Leptin蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，Leptin蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

成纤维细胞生长因子21蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，成纤维细胞生长因子21蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

为了提高重组Leptin和FGF21的可溶性表达，可以将Leptin核苷酸序列和FGF21核苷酸序列与分子伴侣连接，再将其克隆到表达载体中。

通过实验发现，当采用以下条件进行表达重组Leptin或FGF21时，可显著提高目标蛋白的可溶性表达水平：将菌体OD₆₀₀培养到0.35左右，在温度为30℃、IPTG终浓度为0.25mmol/L、转速为60 r/min条件下诱导5 h。

本发明提供了一种纯化Leptin或FGF21的方法，包括：将表达载体转化宿主细胞；培养并诱导表达Leptin或FGF21，应用中空纤维柱膜过滤技术，对菌体进行富集，对包涵体进行洗涤、变性及复性，经过离子交换层析，即得成熟的Leptin或FGF21。

其中，所述的表达载体为PET系列载体。优选的，所述的表达载体为PET-27b（+），所述的宿主细胞为Rosseta（DE3）。

动物学试验结果表明，本发明中Leptin和FGF21联用能够更加有效的改善模型小鼠体内的血糖和血脂水平，减肥效果也较单独使用更佳。其中，Leptin和FGF21组合物的缓释微球制剂与联合给药方式也表现出相同的效果，但大大减少了给药次数。本发明中Leptin和FGF21联用使用及其缓释微球制剂能够作为药物治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。

实施例1

W/O/W溶剂挥发法制备Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂

将PLGA（RG502H，质量比PLA：PGA=50:50，Mw=34000）100 mg溶于1.0 mL有机溶剂二氯甲烷制成油相，Leptin和FGF21各2 mg溶于0.1 mL的重蒸馏水中（内含3wt%海藻糖和5wt%甘露醇）形成内水相，将其加入上述油相，超声乳化，形成w/o的初乳，将含3wt% PVA溶液30mL（含NaCl 2wt%和F-68 0.5wt%）置于搅拌容器中，将初乳在高速搅拌（1000 rpm）下快速加入外水相中充分匀化，三分钟后，将转速下调至400 rmp同时外水相加入30 mL蒸馏水，在室温下搅拌4小时，微球硬化后离心分离并洗涤，冷冻干燥。密封分装后辐照消毒即可。Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂的包封率为92%，粒径<100 μm。

实施例2

S/O/O溶剂挥发法制备Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂

将PEG（PEG6000）24 mg和Leptin和FGF21各2 mg及保护剂（碳酸锌5 mg）分散于1 mL重蒸馏水中，漩涡混合3分钟左右，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到Leptin和FGF21组合物微粉。将PLGA（RG502H，质量比PLA：PGA=50:50，Mw=34000）200 mg溶于1.0 mL有机溶剂乙腈制成油相，将微粉加入上述油相，超声分散，将其逐滴加入棉子油中充分匀化，搅拌（600 rpm）1小时，再加入适量的石油醚继续搅拌（400 rpm）2小时，可得Leptin和FGF21组合物微球，离心，用石油醚洗涤，收集，冷冻干燥，密封分装后辐照消毒即可。Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂的包封率为90%，粒径<100 μm。

实施例3

喷雾干燥法制备Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂

将Leptin和FGF21各4 mg及保护剂（人血清白蛋白30 mg）溶于10 mL的重蒸馏水中，喷入液氮中，将液氮在低温下挥发，得到Leptin和FGF21组合物微粉。将PLGA（RG502H，质量比PLA：PGA=50:50，Mw=34000）600 mg溶于10 mL有机溶剂二氯甲烷制成油相，将微粉加入油相中超声分散，喷雾干燥，进口温度为40℃、出口温度为30℃、喷雾压力5 Pa，喷嘴直径0.5mm，流速1-2 mL/min。将收集的微球在室温下真空干燥6小时，密封分装后辐照消毒即可。Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂的包封率为80%，粒径<60 μm。

实施例4

实验动物处理

ob/ob小鼠（2型糖尿病肥胖模型小鼠，SPF级，雄性，10-11周龄）：上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK 2014-0002(沪)。选取40只成模的血糖和体重接近均值的模型小鼠，分成5组，每组8只，每天给予实验组（Vehicle组、Leptin（0.25 mg/kg）+FGF21（0.25 mg/kg）组、Leptin（1mg/kg）组和FGF21（1mg/kg）组）相应的受试物或溶剂一次，皮下注射，连续注射14 d后停药，实验组（Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂（PLeptin+FGF21，1.75 mg/kg））每周给药一次，观察14 d内各实验组小鼠的血糖和体重变化情况。给药结束后，检测各实验组小鼠糖耐量改善情况，并采血测定甘油三脂和胰岛素水平，所得实验数据进行统计学分析。

实施例5

Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠血糖水平变化

结果显示，模型对照组小鼠血糖相对较高，各给药组小鼠血糖变化趋势一致，但单独给药组（Leptin组和FGF21组）小鼠血糖较联合给药组（Leptin+FGF21组）小鼠血糖下降缓慢且回升快，其中联合给药方式和Leptin和FGF21组合物缓释微球制剂（PLeptin+FGF21）的长期降糖效果和停药后控制模型小鼠血糖能力最佳，两者结果相当（如图1所示）。说明Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂在体内有明显的缓释和降血糖作用。

实施例6

Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠体重变化

结果如图2所示，随着时间的变化，模型对照组小鼠体重不断增加，两单独给药组小鼠体重变化无明显差异，有轻微的下降趋势，停药后体重迅速增加至起始水平；而联合给药组和PLeptin+FGF21组小鼠体重变化较大，给药3 d后，体重下降明显，且停药后小鼠体重增加缓慢。以上结果说明了联合给药方式及其缓释微球制剂在控制模型小鼠体重方面的能力较强于单独给药。

实施例7

Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠糖耐量变化

给药14 d后，对各实验组小鼠进行OGTT实验，检测不同给药方式对模型小鼠糖耐量改善情况。结果如图3所示，与模型对照组相比，四种给药方式在控制小鼠机体血糖能力方面都有很大程度的改善，但在整个实验过程中，联合给药组和PLeptin+FGF21组小鼠血糖水平显著低于单独给药组。以上结果表明了联合给药方式及其缓释微球制剂在调节模型小鼠糖耐量方面的能力显著强于单独给药。

实施例8

Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠甘油三脂水平变化

给药14 d后，各实验组小鼠血清甘油三脂水平检测结果如图4所示，相对于生理盐水组，四种给药方式都能显著降低模型小鼠甘油三脂含量。而与单独给药组相比，联合给药方式及其缓释微球制剂在血脂水平控制上表现出更佳的改善效果。

实施例9

Leptin和FGF21组合物及其缓释微球制剂调节ob/ob小鼠空腹胰岛素水平变化

给药14 d后，各实验组小鼠空腹血清胰岛素含量果如图 5所示。与模型对照组相比，四种给药方式都能显著降低实验组小鼠的空腹腹胰岛素浓度；而联合给药组和PLeptin+FGF21组小鼠空腹胰岛素水平较单独给药组低。结果表明了联合给药方式及其缓释微球制剂可明显改善模型小鼠胰岛素抵抗状态，且改善程度显著优于单独给药方式。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都要求落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gttccgatccagaaagttcaggacgacaccaaaaccctgatcaaaaccat 50

cgttacccgtatcaacgacatctctcacacccagtctgtttcttctaaac 100

agaaagttaccggtctggacttcatcccgggtctgcacccgatcctgacc 150

ctgtctaaaatggaccagaccctggctgtttaccagcagatcctgacctc 200

tatgccgtctcgtaacgttatccagatctctaacgacctggaaaacctgc 250

gtgacctgctgcacgttctggctttctctaaatcttgccacctgccgtgg 300

gcttctggtctggaaaccctggactctctgggtggtgttctggaagcttc 350

tggttactctaccgaagttgttgctctgtctcgtctgcagggttctctgc 400

aggacatgctgtggcagctggacctgtctccgggttgctaa 441

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile ValThr Arg 20

Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr GlyLeu Asp 40

Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr LeuAla Val 60

Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser AsnAsp Leu 80

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Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser GlyTyr Ser 120

Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu TrpGln Leu 140

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 146

<210> 3

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

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cctgtacaccgacgacgctcagcagaccgaagctcacctggaaatccgtg 100

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<210> 4

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr LeuTyr Thr 20

Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr ValGly Gly 40

Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro GlyVal Ile 60

Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly AlaLeu Tyr 80

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu GluAsp Gly 100

Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly AsnLys Ser 120

Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro GlyLeu Pro 140

Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val GlySer Ser 160

Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Thr Ser178

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种用于治疗代谢疾病的药物组合物及其缓释微球制剂

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gttccgatcc agaaagttca ggacgacacc aaaaccctga tcaaaaccat cgttacccgt 60

atcaacgaca tctctcacac ccagtctgtt tcttctaaac agaaagttac cggtctggac 120

ttcatcccgg gtctgcaccc gatcctgacc ctgtctaaaa tggaccagac cctggctgtt 180

taccagcaga tcctgacctc tatgccgtct cgtaacgtta tccagatctc taacgacctg 240

gaaaacctgc gtgacctgct gcacgttctg gctttctcta aatcttgcca cctgccgtgg 300

gcttctggtc tggaaaccct ggactctctg ggtggtgttc tggaagcttc tggttactct 360

accgaagttg ttgctctgtc tcgtctgcag ggttctctgc aggacatgct gtggcagctg 420

gacctgtctc cgggttgcta a 441

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

1 5 10 15

Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro

130 135 140

Gly Cys

145

<210> 3

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tctgactctt ctccgctgct gcagttcggt ggtcaggttc gtcagcgtta cctgtacacc 60

gacgacgctc agcagaccga agctcacctg gaaatccgtg aagacggtac cgttggtggt 120

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<210> 4

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg

1 5 10 15

Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile

20 25 30

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35 40 45

Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly

50 55 60

Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu

85 90 95

Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro

100 105 110

Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg

115 120 125

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130 135 140

Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser

145 150 155 160

Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr

165 170 175

Thr Ser

Claims

1.一种用于治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于：所述用于治疗代谢疾病的药物组合物的活性成分为Leptin和成纤维细胞生长因子21，其中Leptin蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，Leptin蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，成纤维细胞生长因子21蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，成纤维细胞生长因子21蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于：所述用于治疗代谢疾病的药物组合物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。

3.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于：所述用于治疗代谢疾病的药物组合物的给药形态为针剂，具体包括粉剂、水剂或油剂。

4.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于：所述用于治疗代谢疾病的药物组合物在制备治疗糖尿病、肥胖及相关内分泌疾病药物中的应用，该药物组合物用于降低血糖浓度、降低体重、改善血脂参数、增加胰岛素敏感性及Leptin敏感性，该药物组合物能够达到稳定血糖在正常水平和体重降低的同时减少Leptin的治疗剂量达4倍，并减少FGF21的使用剂量达4倍以上，从而降低糖尿病和肥胖症治疗中Leptin和FGF21的使用成本，同时增加在糖尿病和肥胖症治疗中的脂代谢调节能力，主要包括增加脂解和能量的消耗，避免由于长期单独使用Leptin而引起Leptin抵抗的副作用。

5.一种用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂，其特征在于：以Leptin和成纤维细胞生长因子21为主药，以PLGA为基质，于室温搅拌反应制得用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

6.一种权利要求5所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖和甘露醇，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，基质浓度为50-300mg/mL，取主药和保护剂溶于水中形成内水相，Leptin和FGF21组合物的总浓度为1-10mg/mL，将内水相加入到油相中，超声乳化形成初乳，将初乳滴加在聚乙烯醇水溶液中，经W/O/W溶剂挥发法制得用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

7.一种权利要求5所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和甘露醇，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂乙腈制成油相，基质浓度为50-300mg/mL，取主药、聚乙二醇和保护剂溶于水中，冷冻干燥后用二氯甲烷洗涤离心去除聚乙二醇得到主药微粉，将主药微粉分散在油相中，经S/O/O溶剂挥发法制备用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

8.一种权利要求5所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂的制备方法，其特征在于：基质为质量比聚乳酸：羟基乙酸=25:75-75:25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，主药为Leptin和FGF21组合物，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和人血清白蛋白，具体制备过程为：将基质溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，将主药和保护剂溶于水中，经喷雾冷冻干燥得到主药微粉，再将主药微粉加入油相中，经喷雾干燥法制备用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂。

9.权利要求5所述的用于治疗代谢疾病的缓释微球制剂作为治疗糖尿病、肥胖症及相关内分泌疾病的皮下注射制剂的用途，该缓释微球制剂能够持续释药达1周以上，并达到降低血糖浓度、降低体重、改善血脂参数、增加胰岛素敏感性及Leptin敏感性的效果。