CN115109137A - Fgf21多肽及其融合多肽的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了FGF21多肽，FGF21融合蛋白或FGF21多肽与GLP‑1或其功能性变体的双融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。

Description

FGF21多肽及其融合多肽的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及FGF21多肽及其融合多肽的应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种由小肠L细胞分泌的肠促胰素，其可以刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而维持病患体内胰岛素的平衡。GLP-1通过胰岛素间接起作用，仅对二型糖尿病起作用，限制了其应用范围及效果；同时有报道指出GLP-1存在潜在的致甲状腺癌风险。
FGF21属于FGF家族(成纤维细胞生长因子，FGFs)成员之一。FGF21可以促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，增强胰岛素敏感性，同时与胰岛素相比，FGF21不会引起低血糖等副作用，更能有效保护β胰岛细胞，促进胰岛β细胞的再生与修复，而且由于没有促分裂活性，也不会导致潜在的肿瘤风险。FGF21有希望成为治疗1型糖尿病的药物。此外，FGF21也有很好的降脂作用，是一个很有潜力的降脂药。然而，FGF21在成药性方面也面临着巨大的挑战。这一方面是由于FGF21的半衰期很短，在小鼠模型中其半衰期仅为一小时左右(Xu et al.，2009)。另一方面，FGF21在体内的生物学活性也有限。因此，亟需对FGF21进行改造。
中国发明专利申请CN111662373A中公开了FGF21多肽，融合蛋白，以及包含FGF21多肽，Fc结构域，和GLP-1或其功能性变体的融合蛋白；还公开了这些多肽以及融合蛋白在制备用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病的药物中的用途，所述疾病包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎，在实施例中给出了降空腹血糖，降体重，降摄食量，降血脂的实验数据。
NASH(nonalcoholic steatohepatitis)，即非酒精性脂肪性肝炎，也称代谢性脂肪性肝炎，是病理变化与酒精性肝炎相似但无过量饮酒史的临床综合征，其主要特征为肝细胞大泡性脂肪变性伴随肝细胞损伤和炎症，严重者可发展为肝脏纤维化，肝硬化，肝衰竭以及肝脏肿瘤。由于患者在早期不会显露出明显症状，所以被称为“沉默的杀手”。在过去20年里，其前驱疾病非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率已翻倍，成为导致发达国家和地区人们患慢性肝病及肝酶异常的首要原因。据统计，全球约有3-5％的人患有NASH，而且据《自然》杂志2017年的一篇文章，NASH即将成为继慢性丙型肝炎之后美国肝移植的最主要原因。虽然，NASH药物具有巨大的市场前景，也有众多的研究机构或医药公司专注于NASH药物的研发，但是在过去的几十年时间里，由于NASH的发病机制非常复杂，科学家们在开发药物的过程中遭遇了许多挫折和失败，有多款重磅NASH候选药都以失败告终，直至2020年世界上才有了第一款上市的药品。因此，NASH药品的研发任重道远。
发明内容
本申请提供了FGF21多肽或其融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
第一方面，本申请提供了FGF21多肽在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述FGF21多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其变体。优选地，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，在下述位置处包含氨基酸取代：L98、S167和P171。在本申请中，所述L98、S167和P171可分别指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第98位残基L，第167位残基S和第171位残基P。
优选地，所述FGF21多肽还可在选自下组的一个或多个位置处包含氨基酸取代：R175、R19、A180、A31和G43。在本申请中，所述R175、R19、A180、A31和G43可分别指SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的第175位残基R，第19位残基R，第180位残基A，第31位残基A和第43位残基G。
在一些实施方案中，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，其可在选自下组的氨基酸残基处包含氨基酸取代：
(1)L98、S167、P171和R175；
(2)L98、S167、P171、R175和R19；
(3)L98、S167、P171、R175、R19和A180；
(4)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43。
优选地，所述FGF21多肽在L98处的氨基酸取代可为L98R，
优选地，所述FGF21多肽在S167处的氨基酸取代可为S167H，
优选地，所述FGF21多肽在P171处的氨基酸取代可选自P171A和P171G，
优选地，所述FGF21多肽在R175处的氨基酸取代可为R175L，
优选地，所述FGF21多肽在R19处的氨基酸取代可为R19V，
优选地，所述FGF21多肽在A31处的氨基酸取代可为A31C。
在一些实施方案中，所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可包含选自下组的氨基酸取代：(1)L98R、S167H和P171A；(2)L98R、S167H、P171A和R175L；(3)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(5)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E；(7)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C。
在本申请中，所述的FGF21多肽可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:2-7。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的FGF21多肽，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述FGF21多肽可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病可包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
第二方面，本申请提供了FGF21融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
所述FGF21融合蛋白包含FGF21多肽以及Fc结构域，其中所述FGF21多肽如第一方面所述。
所述FGF21多肽经连接子与所述Fc结构域连接构成FGF21融合蛋白，在本申请中也称为单靶FGF21融合蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽的C末端连接。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体。优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域可为人IgG的Fc(参见UniProt KB或Swiss-Prot中登录号为P01861.1的蛋白质)。所述人IgG的Fc可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域也可为人IgG的Fc的功能性变体。例如，所述人IgG的Fc的功能性变体可以为在所述人IgG1或IgG4(优选IgG4)的Fc的氨基酸序列基础上，利用天然或非天然存在的氨基酸在特定的氨基酸残基处进行修饰而获得的多肽或蛋白质。例如，所述修饰可基于在特定位置插入、替换或删除保守或非保守的一个或多个氨基酸来产生，也可包含在特定位置引入非氨基酸结构的修饰。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域的功能性变体为IgG-Fc-PAAK，其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。所述IgG-Fc-PAAK可包含S228P，F234A，L235A和/或R409K的突变，以及K447的删除。也就是，与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比，所述IgG-Fc-PAAK的第228位残基S被残基P取代，第234位残基F被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，且第447位残基K可被删除。
在一些实施方案中，所述FGF21融合蛋白还包含连接子，将FGF21多肽与Fc结构域连接。优选地，所述连接子为肽连接子。优选地，所述连接子的N末端与所述免疫球蛋白Fc结构域的C末端连接，且所述连接子的C末端与所述FGF21多肽的N末端连接。优选地，所述连接子包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
优选地，所述单靶融合FGF21蛋白具有选自如下的任一种氨基酸序列：SEQ ID NO:13-18。
优选地，所述单靶FGF21融合蛋白为选自如下的任一种单靶FGF21融合蛋白：
单靶FGF21融合蛋白1#，其包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；
单靶FGF21融合蛋白2#，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
单靶FGF21融合蛋白4#，其包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
单靶FGF21融合蛋白7#，其包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
单靶FGF21融合蛋白9#，其包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
单靶FGF21融合蛋白12#，其包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述FGF21融合蛋白为二聚体融合蛋白。优选地，从N端至C端分别为两个重链IgG-Fc-PAAK，两条连接子和两个FGF21多肽。
所述单靶FGF21融合蛋白1#、2#、4#、7#、9#、12#，分别包含的氨基酸序列SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:18是单体FGF21多肽以及单个连接子和单个免疫球蛋白Fc结构域的氨基酸序列。
所述单靶FGF21融合蛋白可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的FGF21融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
第三方面，本申请提供了包含FGF21多肽和GLP-1或其功能性变体的双融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
包含FGF21多肽和GLP-1或其功能性变体的融合蛋白在本申请中也称作双靶融合蛋白。
所述融合蛋白包含第一方面所述的FGF21多肽以及GLP-1或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述GLP-1或其功能性变体包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:10-11。
在一些实施方案中，所述GLP-1或其功能性变体为人GLP-1(其在UniProt KB或Swiss-Prot中登录号为P0C6A0.1)。优选地，所述GLP-1为人GLP-1的功能性变体。优选地，所述人GLP-1的功能性变体为GLP-1-GEG，其可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述GLP-1-GEG可包括A8G，G22E和R36G突变。优选地，与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比，所述GLP-1-GEG的第8位残基A可被残基G取代，第22位残基G可被残基E取代，第36位残基R可被残基G取代。
所述融合蛋白还可包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述FGF21多肽与所述GLP-1或其功能性变体之间。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽的N末端连接，并且与所述GLP-1或其功能性变体的C末端连接；或者，所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽的C末端连接，并且与所述GLP-1或其功能性变体的N末端连接。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体。优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域可为人IgG的Fc(参见UniProt KB或Swiss-Prot中登录号为P01861.1的蛋白质)。所述人IgG的Fc可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域也可为人IgG的Fc的功能性变体。例如，所述人IgG的Fc的功能性变体可以为在所述人IgG1或IgG4(优选IgG4)的Fc的氨基酸序列基础上，利用天然或非天然存在的氨基酸在特定的氨基酸残基处进行修饰而获得的多肽或蛋白质。例如，所述修饰可基于在特定位置插入、替换或删除保守或非保守的一个或多个氨基酸来产生，也可包含在特定位置引入非氨基酸结构的修饰。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域的功能性变体为IgG-Fc-PAAK，其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。所述IgG-Fc-PAAK可包含S228P，F234A，L235A和/或R409K的突变，以及K447的删除。也就是，与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比，所述IgG-Fc-PAAK的第228位残基S被残基P取代，第234位残基F被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，且第447位残基K可被删除。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含连接子，将所述FGF21多肽与Fc结构域或其功能性变体连接和/或将GLP-1或其功能性变体与Fc结构域或其功能性变体连接。优选地，所述连接子为肽连接子。
优选地，所述连接子包含第一连接子和第二连接子。优选地，所述第一连接子将GLP-1或其功能性变体与Fc结构域或其功能性变体连接，所述第二连接子将所述FGF21多肽与Fc结构域或其功能性变体连接。
优选地，所述第一连接子的N末端与GLP-1或其功能性变体的C末端连接，所述第一连接子的C末端与所述Fc结构域或其功能性变体的N末端连接；所述第二连接子的C末端与所述FGF21多肽的N末端连接，所述第二连接子的N末端与所述Fc结构域或其功能性变体的C末端连接。
所述双靶融合蛋白从N端至C端分别为所述GLP-1或其功能性变体、所述第一连接子、所述免疫球蛋白Fc结构域、所述第二连接子和所述FGF21多肽。
或者，所述第一连接子的C末端与GLP-1或其功能性变体的N末端连接，所述第一连接子的N末端与所述Fc结构域或其功能性变体的C末端连接；所述第二连接子的N末端与所述FGF21多肽的C末端连接，所述第二连接子的C末端与所述Fc结构域或其功能性变体的N末端连接。
所述双靶融合蛋白从N端至C端分别为所述FGF21多肽、所述第二连接子、所述免疫球蛋白Fc结构域、所述第一连接子和所述GLP-1或其功能性变体。
优选地，所述第一连接子和/或所述第二连接子包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
优选地，所述双靶融合蛋白从N端至C端可分别为所述FGF21多肽、所述第二连接子、所述免疫球蛋白Fc结构域、所述第一连接子和所述GLP-1或其功能性变体，其中，所述FGF21多肽具有选自下组中任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:2-7；所述免疫球蛋白Fc结构域具有选自下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:8-9；所述GLP-1或其功能性变体具有选自下组中任一项所示的氨基酸序列SEQ ID NO:10-11；所述第一连接子和/或所述第二连接子具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
优选地，所述双靶融合蛋白为选自如下的任一种的双靶融合蛋白：
双靶融合蛋白1#，其包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-1(其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)；
双靶融合蛋白2#，其包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-2(其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列)；
双靶融合蛋白4#，其包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-4(其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)；
双靶融合蛋白7#，其包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-7(其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列)；
双靶融合蛋白9#，其包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-9(其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列)；
双靶融合蛋白12#，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-12(其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列)。
在一些实施方案中，所述双靶融合蛋白为二聚体融合蛋白。优选地，从N端至C端分别为两个GLP-1-GEG，两条第一连接子，两个重链IgG-Fc-PAAK，两条第二连接子和两个FGF21多肽。
所述双靶融合蛋白1#、2#、4#、7#、9#、12#，分别包含的氨基酸序列SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:24是从N端至C端分别为单体GLP-1-GEG，单条第一连接子，单个重链IgG-Fc-PAAK，单条第二连接子和单个FGF21多肽的氨基酸序列。
例如，双靶融合蛋白1#，为二聚体融合蛋白，从N端至C端分别为两个GLP-1-GEG，两条第一连接子，两个重链IgG-Fc-PAAK，两条第二连接子和两个FGF21，其中单个GLP-1-GEG，单条第一连接子，单个重链IgG-Fc-PAAK，单条第二连接子和单个FGF21具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其从N端至C端分别为GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)，第一连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列)，第二连接子(其包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)和FGF21-1(其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述双靶融合蛋白可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病为糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
第四方面，本申请提供给了一种分离的核酸分子在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述分离的核酸分子可编码第一方面所述的FGF21多肽、第二方面所述的FGF21融合蛋白、或第三方面的双融合蛋白。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述双靶融合蛋白可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病为糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
第五方面，本申请提供了一种载体在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述载体包含第四方面的分离的核酸分子。
所述载体可以为质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述双靶融合蛋白可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病为糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
第六方面，本申请提供了一种宿主细胞在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述宿主细胞可包含或表达本申请第一方面所述的FGF21多肽、第二方面所述的FGF21融合蛋白、第三方面所述的双融合蛋白、第四方面所述的分离的核酸分子或第五方面所述的载体。
所述药物还可以是药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述双靶融合蛋白可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。所述FGF21的代谢失调引起的疾病为糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。优选地，所述FGF21多肽可用于治疗与脂肪肝相关的疾病，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化。优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在最近20年，随着肥胖在全世界范围内流行，越来越多既不酗酒也无病毒性肝炎的人群患上了晚期肝脏疾病，NASH才逐渐得到了人们的重视。NASH这种“沉默的疾病”其实很可怕，如果不及时治疗，它会引起肝脏纤维化，最终可能会发展成为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。除了肝移植外，患者们别无他法。2020年以后，NASH将成为美国肝脏移植的最主要原因。然而，全球范围内，获批上市的治疗NASH的药物只有1到2个，究其原因，NASH的发病率非常复杂，有学者提出“二次打击”和“多次打击”等学说，然而到目前为止，尚不知道NASH的具体发病机理。
本申请发现并且证实了本申请的融合蛋白不仅可以发挥持久的降血糖和减重效果，还可以改善血脂和肝功能，具体而言，可以显著降低肝功指标：ALT(谷丙转氨酶)和AST(谷草转氨酶)的水平，降低肝中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的水平。此外本申请的融合蛋白还可以显著降低肝组织脂肪变、炎性浸润、肝脏气球样变以及NAS评分，尤其是，显著降低肝纤维化得分，这些指标显示本申请的融合蛋白可以显著改善NASH的指标，这些显著的效果是基于现有技术公开的内容完全预料不到的。
定义：
在本申请中，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义下，是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物亚单位组成的化合物。
在本申请中，术语“组合物”通常是两种或更多种物质的组合，例如，活性剂与其它惰性或活性化合物的组合。
在本申请中，术语“治疗有效量”通常指对受试者产生治疗益处所需的活性成分的最小剂量。例如，对于表现出患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代谢综合征的患者或为预防其发病的患者而言，“治疗有效量”是指能够诱导、改进或者造成与上述紊乱相关或因与之对抗所致的病理症状、疾病进展、生理情况改善的剂量。
本申请中，术语“受试者”或“患者”可为人，但也可为非人动物，更具体而言可为伴侣动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、羊、猪、马等)或者实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)等。
在本申请中，术语“连接子”通常是指可通过肽键连接两个或多个多肽的功能性结构。在本申请中，术语“连接子”、“linker”和“接头”可互换使用。当形成本申请的融合蛋白时，可以使用连接子。连接子可由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。本申请的连接子可为任何长度或组成的连接子。在某些实施方案中，连接子可由通过肽键连接的1-20个氨基酸构成。例如，所述氨基酸可选自20种天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，所述氨基酸可选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在某些实施方案中，所述连接子由空间上不受阻碍的多个氨基酸构成。例如，所述空间上不受阻碍的氨基酸可以为甘氨酸和丙氨酸。所述连接子可以为富含G的多肽，例如，其可以选自(G)3-S(即“GGGS”)、(G)4-S(即“GGGGS”)和(G)5-S(即“GGGGGS”)。在一些实施方案中，所述连接子可以为：GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSA。其它合适的连接子可以为：GGGGGSGGGSGGGGS、GGGKGGGG、GGGNGSGG、GGGCGGGG和GPNGG等。本申请中所述的连接子还可以为非肽连接子。例如，可以使用烷基连接子，例如-NH-(CH2)S-C(O)-，其中S＝2-20。这些烷基连接子可被任何无空间位阻的基团进一步取代，所述无空间位阻的基团可包括但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性的非肽连接子还可以为聚乙二醇连接子，其中连接子的分子量可以为100-5000kD，例如100-500kD。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。在本申请中，所述的融合蛋白可包含所述的FGF21多肽。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合蛋白可通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。在本申请中，所述融合蛋白还可包含除所述FGF21多肽以外的结构域。在本申请中，所述的融合蛋白还可以包含连接所述FGF21多肽和所述除FGF21多肽以外的结构域的连接子，和/或其他结构域。
在本申请中，术语“免疫球蛋白Fc结构域”通常是指包含免疫球蛋白(例如，抗体)的CH2和CH3恒定区部分的结构域。例如，所述免疫球蛋白Fc结构域可以为由免疫球蛋白(例如，抗体)的铰链区、CH2和CH3恒定区部分组成的结构域。例如，所述免疫球蛋白可以为人免疫球蛋白。例如，所述免疫球蛋白可以为人IgG1。
在本申请中，术语“功能性变体”通常是指在目标蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫缀合物、所述免疫球蛋白Fc结构域或所述GLP-1)的氨基酸序列的基础上进行取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，然而仍保留至少一个该目标蛋白的生物学特性的蛋白质或多肽。在本申请中，所述“一个或多个”氨基酸替换中的“多个”通常是指大于1个氨基酸的替换。例如，1～30个、1～20个、1～10个、1～5个、如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个氨基酸的替换。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述功能性变体还可以为所述目标蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫缀合物、所述免疫球蛋白Fc结构域或所述GLP-1)的同源物。在本申请中，所述同源物可以为，例如，与所述目标蛋白的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。
本申请所述的“FGF21多肽”，在一些实施例中是野生型FGF21，在一些实施例中是FGF21变体。
本申请所述的“GLP-1”，在一些实施例中是野生型GLP-1，在一些实施例中是GLP-1变体。
本申请所述的“双靶融合蛋白1#FGF21”，既包含双靶融合蛋白1#在体内代谢后游离的FGF21+Fc，又包含未代谢的或完整的双靶融合蛋白1#。
本申请所述的“双靶融合蛋白1#GLP-1”，既包含双靶融合蛋白1#在体内代谢后游离的GLP-1+Fc，又包含未代谢的或完整的双靶融合蛋白1#。
附图说明
图1显示了双靶融合蛋白1#(简称双靶1#)非还原处理SDS-PAGE检测图。
图2显示了双靶融合蛋白1#(简称双靶1#)还原处理SDS-PAGE检测图。
图3显示了双靶融合蛋白1#(简称双靶1#)的质谱检测图。
图4显示了平均血浆药物浓度-时间曲线。
图5显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠随机血糖变化及首次给药后显著降低血糖。
图6显示了药物对高脂饮食诱导C57BL/6小鼠腹腔糖耐量IPGTT的影响。
图7显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠空腹血糖、胰岛素水平及HOMA-IR。
图8显示了药物对高脂饮食诱导C57BL/6小鼠体重变化率及体脂质量的影响。
图9显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠-血清脂质水平。
图10显示高脂饮食诱导C57BL/6小鼠-血清肝功指标ALT/AST水平。
图11显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠-肝绝对重量。
图12显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠-肝匀浆脂质水平。
图13显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠肝脏组织病理学照片(400um)。
图14显示了高脂饮食诱导C57BL/6小鼠肝脏组织病理评分。
图15显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验的随机血糖。
图16显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-体重增长率。
图17显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-血清TC/TG。
图18显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-肝脏湿重和肝脏指数。
图19显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-肝功指标。
图20显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-肝脏脂质。
图21显示了双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-肝脏病理评分。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达载体质粒-X2的构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成目的基因，所述目的基因编码双靶融合蛋白1#(其包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列)。在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pXC17.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/L)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
实施例2载体转染及在细胞中表达
将CHO宿主细胞用Cellvento CHO-200培养基(Merck)复苏培养后，当细胞密度约4.76×106cells/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×107cell，质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL Cellvento CHO-200培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入L-Methionine sulfoximine(Sigma-aldrich)至终浓度50μM的20mL Cellvento CHO-200培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6×106cell/mL时，对获得的混合克隆株用Cellvento CHO-200培养基进行传代，传代细胞密度约0.2×106cell/mL。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例3融合蛋白纯化及检测
将细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein A Diamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸缓冲液pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用20mM PBS pH7.4缓冲液透析后取部分样品经非还原(参见图1)与还原(参见图2)后通过10％SDS-PAGE电泳检测。同时取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式(参见图3)。
实施例4雄性C57BL/6小鼠单次静脉注射或皮下注射药代动力学
雄性C57BL/6小鼠6只(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，随机平均分为2组，3只/组，按1mg/kg分别静脉注射或皮下注射给予双靶融合蛋白1#。分别于给药后1、5、7、24、48、72、120、168、240、336h采血并分离血浆(EDTA-K2抗凝)，静脉给药组增加0.25h采血。采用3种ECLA法(均基于双抗夹心原理)分析各样本中双靶融合蛋白1#、双靶融合蛋白1#FGF21(Fc+FGF21)和双靶融合蛋白1#GLP-1(GLP-1+Fc)的浓度。根据血浆药物浓度计算药代动力学参数，主要PK参数结果见表1，药时曲线见图4。
C57BL/6小鼠皮下注射双靶融合蛋白1#后，双靶融合蛋白1#、双靶融合蛋白1#FGF21和双靶融合蛋白1#GLP-1平均血浆半衰期分别为7.2、12和38h；平均达峰时间分别为5.7、7.0和6.3h，平均Cmax分别为3.24、3.96和4.45μg/mL，平均AUClast分别为60.7、119和230μg·h/mL，绝对生物利用度分别为75％、77％和95％。
表1.C57BL/6小鼠单次静脉或皮下注射给药后主要药代动力学参数总结(均值)
Figure BDA0003552889520000131
Figure BDA0003552889520000141
*静脉注射过程中可能部分药液误注入皮下组织，导致出现吸收峰。
实施例5双靶融合蛋白1#在高脂诱导的C57BL/6小鼠模型中发挥持久的降低血糖和减重效果
C57BL/6小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)在高脂饲料(D12492,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ)喂养16周后，根据测定的血糖和体重进行随机分组成溶媒组或治疗组。在研究中包括普通饲料对照组(Control)、高脂饲料模型组(Model)给予溶媒PBS、索马鲁肽(Semaglutide)皮下注射一天一次(QD)10nmol/kg、双靶1#每周两次给药(BIW)低剂量为3nmol/kg和高剂量10nmol/kg,每组7只，药物组按照给药频率给予相应药物，连续给药16周，给药期间继续喂予高脂饮食至实验结束。监测小鼠随机血糖、体重及腹腔糖耐量IPGTT。
整个试验阶段监测动物随机血糖，结果(参见图5A)显示与对照组相比，各组血糖升高幅度较小。双靶融合蛋白1#10nmol/kg在给药阶段平均血糖维持在7.04mmol/L左右，相比模型组降低22.4％，处于各组中最低，但动物状态良好，未出现低血糖症状。首次给药后，与模型组相比，阳性药索马鲁肽和双靶融合蛋白1#10nmol/kg均能显著降低血糖AUC0-72h(p<0.05)(参见图5B)。
实验第2(参见图6A)、8(参见图6B)、16(参见图6C)周分别进行IPGTT实验，从图6可以看出，腹腔糖耐量(IPGTT)与对照组相比，模型组动物在给予葡萄糖糖前或后血糖均有显著增加，0-90min血糖曲线下面积增加也明显，即模型组动物糖耐量异常高。与模型组相比，双靶融合蛋白1#和索马鲁肽均能显著降低给糖后30-90min或15-90min时间点血糖及血糖-曲线下面积，双靶融合蛋白1#的降低效应具有良好量效，且等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低更为显著。
试验结束时动物测空腹血糖，同时取血清检测血清胰岛素水平并计算HOMA-IR指数，图7结果显示：与对照组相比，模型组动物空腹血糖(参见图7A)、胰岛素(参见图7B)和HOMA-IR(稳态模型胰岛素抵抗指数)(参见图7C)指数均显著升高，即模型组动物表现为胰岛素抵抗。相比于模型组，双靶融合蛋白1#在低、高剂量下均显著降低空腹血糖水平(P<0.001)，等摩尔剂量下降低空腹血糖效果优于索马鲁肽；双靶融合蛋白1#、阳性对照组索马鲁肽均能显著降低胰岛素水平和HOMA-IR指数(P<0.001)，且双靶融合蛋白1#降低程度量效显著，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#对HOMA-IR降低幅度与索马鲁肽相当。
给药阶段监测动物体重并计算体重变化率，图8结果显示：与对照组相比，模型组动物体重远高于对照组，且体重持续增加。与模型组相比，双靶融合蛋白1#和索马鲁肽均能显著降低动物体重增长率(P<0.001)，且双靶融合蛋白1#减重效应量效显著，10nmol/kg剂量下体重下降幅度达42.4％，而等摩尔剂量下索马鲁肽体重降低幅度为24.3％(参见图8A)。动物解剖时取动物皮下脂肪、附睾脂肪及肾周脂肪，并计算总脂肪质量，表2的结果显示：与对照组相比，模型组体脂质量显著升高，包括皮下脂肪、附睾脂肪、肾周脂肪及总脂肪。与模型组相比，双靶融合蛋白1#、阳性对照组索马鲁肽均能显著降低体脂质量(P<0.001)，且双靶融合蛋白1#降低体脂程度呈明显的量效关系，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低幅度优于索马鲁肽(参见图8B)。
表2.高脂饮食诱导C57BL/6小鼠脂肪质量(平均值±SD，n＝6-7)
Figure BDA0003552889520000151
###P<0.001vs对照组；*,**,***P<0.05,0.01,0.001vs模型组。
实施例6双靶蛋白高脂饮食诱导C57BL/6小鼠模型可显著改善血脂及肝功能作用
实施例4试验结束时即给药第16周，动物过夜禁食不禁水，称重后眼眶采血，分离血清全自动生化仪检测血清脂质(TG(甘油三酯),TC(总胆固醇))和肝功指标ALT(谷丙转氨酶)/AST(谷草转氨酶)。采用Elisa试剂盒检测血清胰岛素水平，根据公式计算HOMA-IR指数，即HOMA-IR＝空腹血糖第16周IPGTT 0时血糖值)×空腹胰岛素/22.5。动物取血完毕后，解剖取其肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪以及肾周脂肪进行称重。称取约40-60mg肝组织置于匀浆管中，加入1mL无水乙醇进行匀浆，匀浆后取匀浆液，4℃，3,500rpm，离心10min，取上清，用全自动生化检测仪检测上清中TG及TC的浓度，随后根据称取的肝重进行计算，得出TG及TC的含量。
图9显示，与对照组相比，模型组动物总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平均显著升高，属于高血脂动物模型，与模型组相比，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低血清TG，且双靶融合蛋白1#降低效应量效显著，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低TG幅度略优于索马鲁肽；双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低血清TC，且双靶融合蛋白1#降低效应量效显著，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低TC幅度略优于索马鲁肽(参见图9A和9B)。
图10显示，与对照组相比，模型组动物血清肝功ALT和AST水平均显著升高，与模型组相比，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低ALT和AST水平，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低幅度与索马鲁肽相当(参见图10A和10B)。
图11显示，与对照组相比，模型组动物肝绝对重量显著升高，与模型组相比，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低肝绝对重量，且双靶融合蛋白1#降低程度量效显著，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低幅度略大于索马鲁肽(参见图11)。
图12显示，与对照组相比，模型组动物肝匀浆总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平均显著升高，属于高血脂动物模型，与模型组相比，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低肝匀浆TG水平，且双靶融合蛋白1#降低效应量效显著，等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#降低TG幅度略优于索马鲁肽；与对照组相比，模型组肝匀浆TC升高不明显，且除双靶融合蛋白1#-10nmol/kg组与模型组相比TC显著降低之外，其余各组无明显差异(参见图12A和12B)。
实施例7双靶蛋白高脂饮食诱导C57BL/6小鼠模型可显著改善肝脏NASH指标
对实施例5解剖获取的肝脏左大叶浸泡在装有福尔马林的50mL离心管中制备肝病切片，将福尔马林肝组织进行蜡块的制作、切片、HE染色，将HE染色片邮寄到苏州凯斯艾有限公司进行NAS评分；采用天狼星红染色评估纤维化程度，根据纤维化的严重程度进行打分，分值在1-3分。光镜观察肝组织病理学改变并进行NAS/纤维化评分。
图13显示，与对照组相比，模型组动物肝组织发生严重的脂肪样变，肝细胞普遍出现空泡化现象，多处出现炎性病灶，并出现轻至中度纤维化。
图14以及下表3显示，与模型组相比，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低肝组织脂肪变、炎性浸润以及NAS评分；在纤维化改善上，双靶融合蛋白1#和阳性对照组索马鲁肽均能显著降低肝纤维化得分。
表3.高脂饮食诱导C57BL/6小鼠肝组织NAS及纤维化评分(平均值±SD，n＝6-7)
Figure BDA0003552889520000161
##,###P<0.01,0.001vs对照组；*,**,***P<0.05,0.01,0.001vs模型组。
实施例8 ob/ob小鼠模型给药6周降低血糖的效果
采用雄性ob/ob小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)，共70只，体重43-45克左右，饲喂高脂饲料(D12492,Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ)9周以建立非酒精性脂肪肝(NASH)模型，并在开始HFD饲喂3周后测试化合物双靶融合蛋白1#、Fc-FGF21(单靶1#)、度拉糖肽(Dulaglutide)在为期6周给药后的治疗性药效。实验动物在HFD饲养2周后根据体重和血糖随机分成5组，分别为：模型组(组-1,n＝10)，双靶融合蛋白1#-3nmol/kg组(组-2,n＝10)；双靶融合蛋白1#-10nmol/kg组(组-3,n＝10g)；Fc-FGF21-10 nmol/kg组(组-4,n＝10)；度拉糖肽-10nmol/kg(组-5,n＝10)。其中模型组给予PBS，双靶融合蛋白1#、Fc-FGF21、度拉糖肽每周给药2次，共给药6周。开始HFD饲喂后每两天记录动物采食量，采水量及体重，持续到实验终点。至第一次给药开始检测0、2、7、24、48、72小时血糖，随后一周两次检测血糖。实验终点动物禁食检测空腹血糖。
图15显示，从长期给药随机血糖水平来看，受试化合物双靶融合蛋白1#、Fc-FGF21在给药后7h至整个试验周期血糖值均低于模型组动物，且双靶融合蛋白1#呈现出剂量依赖性的降低血糖，低、高剂量的平均降糖率分别为36.9％和47.2％。阳性药物度拉糖肽D5(5天)之后血糖值水平与模型组相比差异较小(P>0.05)；等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#在给药早期降糖幅度大于Fc-FGF21，给药后期降糖大于度拉糖肽。
实施例9双靶融合蛋白1#给药6周能够显著降低ob/ob小鼠体重变化率
模型组动物在给予高脂饮食至实验结束时体重持续上升，体重增长幅度高达20.23％。图16显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠血脂改善，与模型组相比，阳性对照度拉糖肽、双靶融合蛋白1#高剂量组在D1-D43整个给药期体重增长率显著下降，平均减重幅度分别达到8.9％和22.7％(p<0.01或0.001)；双靶融合蛋白1#低剂量在给药前期(D1-D37)(第1天-第37天)动物体重增长率显著下降(p<0.05或0.001)，给药后期仍有下降趋势；Fc-FGF21在给药D5-D21动物体重增长率显著下降(p<0.05～0.001)，后期体重仍增长缓慢。等摩尔剂量下双靶融合蛋白1#体重增长率低于阳性对照度拉糖肽和Fc-FGF21。
实施例10双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠血脂改善
图17显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠血脂改善，与模型组相比，受试化合物双靶融合蛋白1#低、高剂量组及Fc-FGF21组均显著性降低血清TC水平(分别p<0.05,p<0.001,p<0.01)，且双靶融合蛋白1#呈现良好剂量依赖性；阳性对照度拉糖肽组血清TC降低不明显；等摩尔剂量下，双靶融合蛋白1#对TC的降低幅度大于度拉糖肽和Fc-FGF21。受试化合物双靶融合蛋白1#低剂量组、阳性对照度拉糖肽组显著性降低血清TG水平(p<0.01，p<0.001)；双靶融合蛋白1#高剂量组及Fc-FGF21组对血清TG改善不显著。
实施例11双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠肝重及NASH指标的改善
图18-21以及下表4显示了双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠肝重及NASH指标的改善：
图18显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠肝重和肝脏指数的影响，与模型组相比，所有组动物的肝重和肝脏指数均有显著性降低(p<0.001)，且双靶融合蛋白1#呈现良好剂量依赖性；等摩尔剂量下，双靶融合蛋白1#对肝重和肝脏指数的降低幅度大于度拉糖肽和Fc-FGF21；
图19显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠血清ALT/AST/ALP水平的影响，与模型组相比，各给药组血清ALT/AST/ALP水平均显著性降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，且双靶融合蛋白1#呈现良好剂量依赖性；等摩尔剂量下，双靶融合蛋白1#对ALT/AST/ALP的降低幅度大于度拉糖肽和Fc-FGF21；
图20显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠肝脏TG，TC含量的影响，相对于模型组，各给药组的肝脏TG，TC含量均有显著降低(P<0.01～P<0.05)，且双靶融合蛋白1#呈现良好剂量依赖性；等摩尔剂量下，双靶融合蛋白1#对肝组织TG的降低幅度大于度拉糖肽和Fc-FGF21，对肝组织TC的降低幅度大于度拉糖肽，与Fc-FGF21相当；
图21显示双靶融合蛋白1#给药6周对ob/ob小鼠肝脏病理评分的影响，与对照组相比，模型组动物肝组织发生严重的脂肪样变，肝细胞普遍出现空泡化现象，多处出现炎性病灶，并出现轻至中度纤维化。与模型组相比，双靶融合蛋白1#高低剂量组呈现出剂量依赖性地降低肝脏脂肪变、肝脏炎症细胞浸润、肝脏气球样变以及NAS评分，且降低程度大于度拉糖肽和Fc-FGF21；
表4.双靶融合蛋白1#对ob/ob小鼠6周给药实验-肝脏病理评分(平均值±SEM，n＝10)
Figure BDA0003552889520000181
*,**,***p<0.05,0.01,0.001vs.模型组
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 广东东阳光药业有限公司
<120> FGF21多肽及其融合多肽的应用
<130> CP21072YGUC
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
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Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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65 70 75 80
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Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
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Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
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Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
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325 330 335
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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420
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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385 390 395 400
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
305 310 315 320
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
405 410 415
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
465 470
<210> 22
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
35 40 45
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
65 70 75 80
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
85 90 95
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
100 105 110
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys
305 310 315 320
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln
325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
405 410 415
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 23
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
35 40 45
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
65 70 75 80
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
85 90 95
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
100 105 110
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
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325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 24
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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195 200 205
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225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
405 410 415
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
465 470

Claims (26)

1.FGF21多肽在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FGF21多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其变体，优选地，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，在下述位置处包含氨基酸取代：L98、S167和P171。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FGF21多肽还可在选自下组的一个或多个位置处包含氨基酸取代：R175、R19、A180、A31和G43。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，其可在选自下组的氨基酸残基处包含氨基酸取代：
(1)L98、S167、P171和R175；
(2)L98、S167、P171、R175和R19；
(3)L98、S167、P171、R175、R19和A180；
(4)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43；
优选地，所述FGF21多肽在L98处的氨基酸取代可为L98R，
优选地，所述FGF21多肽在S167处的氨基酸取代可为S167H，
优选地，所述FGF21多肽在P171处的氨基酸取代可选自P171A和P171G，
优选地，所述FGF21多肽在R175处的氨基酸取代可为R175L，
优选地，所述FGF21多肽在R19处的氨基酸取代可为R19V，
优选地，所述FGF21多肽在A31处的氨基酸取代可为A31C。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，包含选自下组的氨基酸取代：(1)L98R、S167H和P171A；(2)L98R、S167H、P171A和R175L；(3)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(5)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E；(7)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C；(9)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；和(10)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的FGF21多肽具有下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-7。
7.FGF21融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述FGF21融合蛋白包含FGF21多肽以及Fc结构域，其中所述FGF21多肽如权利要求1-6任一项中所述。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽的N末端连接，
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体，
更优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述FGF21多肽经连接子与所述Fc结构域连接，
优选地，所述连接子为肽连接子，
更优选地，所述连接子的N末端与所述免疫球蛋白Fc结构域的C末端连接，且所述连接子的C末端与所述FGF21多肽的N末端连接，
更优选地，所述连接子包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述FGF21融合蛋白包含选自如下的任一种氨基酸序列：SEQ ID NO:13-18。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述FGF21融合蛋白为二聚体融合蛋白，从N端至C端分别为两个重链IgG-Fc-PAAK，两条连接子和两个FGF21多肽。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述SEQ ID NO:13-18任一项的氨基酸序列是单体FGF21多肽以及单个连接子和单个重链Fc区的氨基酸序列。
13.包含权利要求1-6任一项中所述的FGF21多肽和GLP-1或其功能性变体的双融合蛋白在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述GLP-1或其功能性变体包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述双融合蛋白还可包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性变体。
16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述FGF21多肽与所述GLP-1或其功能性变体之间，
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽的N末端连接，并且与所述GLP-1或其功能性变体的C末端连接；或者，所述免疫球蛋白Fc结构域与所述FGF21多肽C末端连接，并且与所述GLP-1或其功能性变体的N末端连接，
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体，
更优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述双融合蛋白还包含连接子，将所述FGF21多肽与Fc结构域或其功能性变体连接和/或将GLP-1或其功能性变体与Fc结构域或其功能性变体连接，优选地，所述连接子为肽连接子。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述连接子包含第一连接子和第二连接子，所述第一连接子将GLP-1或其功能性变体与Fc结构域或其功能性变体连接，所述第二连接子将所述FGF21多肽与Fc结构域或其功能性变体连接，
优选地，所述第一连接子的N末端与GLP-1或其功能性变体的C末端连接，所述第一连接子的C末端与所述Fc结构域或其功能性变体的N末端连接；所述第二连接子的C末端与所述FGF21多肽的N末端连接，所述第二连接子的N末端与所述Fc结构域或其功能性变体的C末端连接；或者，
所述第一连接子的C末端与GLP-1或其功能性变体的N末端连接，所述第一连接子的N末端与所述Fc结构域或其功能性变体的C末端连接；所述第二连接子的N末端与所述FGF21多肽的C末端连接，所述第二连接子的C末端与所述Fc结构域或其功能性变体的N末端连接，
优选地，所述第一连接子和/或所述第二连接子包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述双融合蛋白包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:19-24。
20.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述双靶融合蛋白为二聚体融合蛋白，优选地，从N端至C端分别为两个GLP-1-GEG，两条第一连接子，两个重链IgG-Fc-PAAK，两条第二连接子和两个FGF21多肽。
21.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述氨基酸序列SEQ ID NO:19-24中的任一项是从N端至C端分别为单体GLP-1-GEG，单条第一连接子，单个重链IgG-Fc-PAAK，单条第二连接子和单个FGF21多肽的氨基酸序列。
22.一种分离的核酸分子在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述分离的核酸分子编码权利要求1-6中任一项所述的FGF21多肽、权利要求7-12中任一项所述的FGF21融合蛋白、或权利要求13-21中任一项所述的双融合蛋白。
23.一种载体在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述载体包含权利要求22中所述的分离的核酸分子。
24.一种宿主细胞在制备用于治疗与脂肪肝相关的疾病的药物中的应用，所述宿主细胞可包含或表达权利要求1-6中任一项所述的FGF21多肽、权利要求7-12中任一项所述的FGF21融合蛋白、权利要求13-21中任一项所述的双融合蛋白、权利要求22中所述的分离的核酸分子或权利要求23中所述的载体。
25.根据权利要求1-24任一项的应用，其特征在于，所述药物为药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。
26.根据权利要求1-25任一项的应用，其特征在于，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化或肝硬化，
优选地，所述与脂肪肝相关的疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
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