CN101812474A

CN101812474A - 骨保护素-热休克蛋白65融合蛋白的制备及其应用

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Publication number: CN101812474A
Application number: CN200910009225A
Authority: CN
Inventors: 李慎涛; 赵文明; 张月
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2010-08-25

Abstract

本发明为“骨保护素-热休克蛋白65融合蛋白的制备及其应用”，属生物医药新技术领域。本发明提供了一种骨保护素-热休克蛋白65(OPG-HSP65)融合的重组蛋白药物。该药物针对类风湿性关节炎(RA)最重要的病理学特征关节滑膜炎伴有软骨和骨的破坏，通过骨保护素(OPG)作为诱饵受体，可与成骨细胞等细胞表达的核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)结合，阻断RANKL与破骨细胞表达的RANK结合，从而抑制破骨细胞参与的骨吸收；利用热休克蛋白(HSP)的保护性多肽片段抑制关节炎症。发明包括编码该重组蛋白的DNA序列；经重组技术产生这种重组蛋白的方法；以及该重组蛋白的生物学活性等。

Description

骨保护素-热休克蛋白65融合蛋白的制备及其应用

技术领域

本发明涉及使用DNA重组技术在大肠杆菌中表达制备重组骨保护素-热休克蛋白65(OPG-HSP65)融合蛋白的方法，含有由该方法制备的OPG-HSP65的药物制剂以及该药物制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎中的药物中的用途。

技术背景

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种T细胞介导的以关节滑膜炎症和骨损伤为主要特征的慢性全身性自身免疫性疾病。由于RA的患病率高、致残率高、病因尚未完全阐明，特别是RA给社会经济、劳动力造成了严重损失，因此，对RA治疗的研究具有重要的医学和社会经济意义。而RA又是一种难治性疾病，虽然现有治疗手段多种多样，但都不甚理想。本发明针对RA发病中骨损伤及慢性炎症反应这两个相关联的RA的关键性病理学问题，研制OPG-HSP65融合蛋白，为RA的治疗开辟了一种新的思路。

近几年，对于破骨细胞(osteoclast，OC)的研究不仅引发了对免疫调节和骨代谢疾病的理论研究，也为骨代谢性疾病的临床诊断和治疗提供了新的依据。从细胞生物学和分子生物学等方面对OC进行的研究，开辟了各种骨相关疾病的药物研发的新领域(N Engl J Med.2005，353(9)：872-75)。由于OC是形成侵蚀性关节炎的必要成分，因此，治疗RA除了采用抗炎和免疫抑制治疗外，抑制破骨细胞的激活和分化已成为目前研究的热点(Clin Calcium，2007，17(4)：586-592)。

OC分化和/或功能变化所导致的骨再建失衡是多种代谢性骨病，如骨质疏松症、骨质硬化症和畸形性骨炎(Paget骨病)等形成的病理基础。已经证明多种激素和局部细胞因子[如活性维生素D3、糖皮质激素、甲状旁腺素(PTH)、前列腺素(PGE2)、IL-6、IL-11、IL-12等]不仅能调节OC生成，还能调节OC的功能。这些因子主要作用于成骨/基质细胞，通过调节骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)的表达，调控OPG、RANKL和NF-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)之间的比例，介导OC生成并维持其功能。因此OPG、RANKL及RANK是OC的最终调节因子。3种分子在OC分化成熟过程中的相互关系及作用机理的阐明，为多种代谢性骨病的防治提供了理论依据(Curr Opin Rheumatol.2003，15(3)：280-7)。

1997年OPG被发现，它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，有单体和由二硫键连接的同源二聚体两种形式，分子量分别为60kD和120kD。单体存在于成骨细胞内，而二聚体可分泌入基质中，是一种分泌型糖蛋白。OPG在进化中高度保守，大鼠和小鼠OPG的同源性为94％，小鼠和人OPG的同源性为89％。OPG前体由401个氨基酸残基组成，在翻译后加工过程中，由21个氨基酸残基组成的信号肽被去除，成为含380个氨基酸的成熟蛋白质。其N端有4个富含半胱氨酸的功能域(D1～D4)与其配体结合，C端与已知的蛋白没有同源性。许多组织器官可以表达OPG mRNA，如肺、心脏、肾脏、肝、胃肠、脑、脊柱、甲状腺等，其主要作用是抑制骨吸收(Cell.1997，89(2)：309-19)。实验表明，去除OPG的C端部分(至194aa)并不影响OPG活性，因此包括TNFR样功能区的OPG N端序列对于抑制OC分化成熟是必需的也是足够的。

在发现OPG的一年后，美国的同一个研究小组又发现了OPG的配体OPGL(Cell.1998，93(2)：165-76)，即RANKL，属TNF超家族成员，存在膜结合型和可溶性两种形式，主要由成骨细胞和骨髓基质细胞表达，可以促进OC分化、刺激其活化并提高OC存活率。这些作用出现于RANKL与其受体RANK结合时，并最后表现为对骨的吸收。RANK表达于破骨细胞的前体细胞表面，与成骨/基质细胞表面的RANKL结合，可启动OC的分化和成熟。OPG作为RANKL的一种可溶性的诱饵受体可与其特异性结合，通过防止RANKL与RANK结合而使后者其失去生物学活性，阻断骨吸收信号的传递，是OC形成的负调节因子。随着对RANKL/RANK/OPG系统的深入研究，应用OPG及抗RANKL抗体阻断RANK通路以防止或逆转骨质丢失为RA的治疗提供了一个新的途径(Nippon Rinsho，2005，63：1647-1653；Cell Biochem，2006，97：226-232)。实验研究表明，OPG缺陷型小鼠出现严重的骨质疏松，并伴有低骨矿物密度和多发性骨折以及严重的动脉硬化，这是由于RANKL和RANK的结合增加，从而导致OC的形成所致。给正常小鼠重组OPG可以提高其胫骨和股骨的骨量，并可以补偿卵巢切除后由于雌激素丧失而引起的骨丢失。用OPG治疗青少年Pegat骨病取得了良好的效果，且没有明显的副反应发生(N Engl J Med.2005，353(9)：918-23)。2005年举行的美国内分泌学会(ENDO)年会上，报告了将重组的OPG应用于40～70岁妇女，可以降低人体对骨的再吸收。这些临床研究进一步说明了OPG在防止骨破坏方面具有良好的应用前景。

RA的关节破坏包括滑膜表面、关节软骨和软骨下骨的侵蚀。近期研究发现OC是RA关节破坏的关键成份，在病灶部位有大量的成熟OC及OC前体，另外活性淋巴细胞、巨噬细胞、成骨细胞和其他细胞表达多种细胞因子，作用于OC生成、分化、活化等各个环节，使OC过度增殖或异常活跃，打破了骨代谢的平衡，骨的破坏占据优势。目前认为活化的T淋巴细胞表达的RANKL是RA中的关键调节因子，可为RA中免疫系统与骨代谢提供联系(Arthritis Rheum.2006，54(6)：1772-7)。RA关节病变部位出现的大量活化的T淋巴细胞能够直接通过膜结合型的RANKL和可溶性RANKL启动破骨细胞的生成，使关节部位形成更多的OC前体和成熟OC，并引起骨丢失。多种T细胞来源的细胞因子可能干扰RANK信号通路，从而影响OC的生成，如IL-12、IL-18、IL-4等。其中IL-4作为抗炎性细胞因子通过STAT-6依赖机制抑制OC的分化，最新研究表明IL-4通过抑制NF-κB和Ca²⁺信号通路直接作用于OC而抑制骨的再吸收(J Immunol.2005，175(2)：917-25)。在佐剂型关节炎动物模型中，炎症活动部位可检测到RANKL的表达，且与OC的增加、活化相一致，从而导致严重骨与关节破坏。给予OPG可阻抑骨关节的破坏，但对免疫炎症反应无改善作用(Nature.1999，402(6759)：304-9)。在胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型中OPG亦能减少或阻止骨破坏，但对滑膜炎症没有作用(Am J Pathol.2002，161(4)：1419-27)。由此表明，OPG并不能解决RA的慢性炎症问题，炎症仍是相当棘手的问题。动物试验发现，T细胞在RA炎症的发生发展中起着重要作用，近年来的研究提示，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)可通过调节T细胞功能抑制RA的炎性反应。热休克蛋白属于分子伴侣蛋白，不仅仅对细胞内一些蛋白质分子构象和稳定性起调节性作用，还对细胞应激、代谢、增殖以及凋亡等生理过程具有重要的调控作用。根据单体分子量的大小，热休克蛋白可分有6个家族：HSP10、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。其中HSP60家族(包括HSP65)通过控制转录因子的表达调节Th1和Th2细胞表型的分化：下调Th1细胞启动转录因子T-bet、NF-κB、细胞内信号分子NFAF的表达；上调Th2细胞启动转录因子GATA3的表达，从而使前炎症细胞因子分泌减少，而增加调节性细胞因子IL-10的分泌。随着对免疫调节机制特别是调节性T细胞的深入研究，HSP的免疫调节作用也逐渐被人们所认识。HSP诱导调节性T细胞的能力是其他细菌保守抗原所不具备的，它可能与参与固有免疫应答细胞的某些HSP受体有关，而这些受体又是连接固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁。哺乳动物和细菌的HSP都可以直接活化APC(巨噬细胞和树突状细胞)，这种作用可能是通过结合到细胞表面受体如CD14、CD40、TLRs、CD36、CD91和LOX1等实现的(Tissue Antigens.2004，64(4)：442-51)。

HSP60作为免疫显性抗原，可以被机体识别并产生相应的免疫应答。分析HSP60的表位发现，只有那些能够诱导自身HSP交叉反应性T细胞的表位才有保护作用。由于HSP60进化保守区段在微生物与哺乳动物之间产生交叉反应，这些保守肽段诱导产生的自身抗原交叉反应性T淋巴细胞可分泌抑制炎症的细胞因子，从而激活了免疫调节机制，阻止炎性疾病的进程。而且，HSP肽段的保护性作用与致病性作用无关。

研究表明用结核杆菌HSP65肽段免疫动物有较好的防治CIA的效果，关节炎指数明显下降、病理变化较轻、抑制性细胞因子IL-4水平升高，而炎性细胞因子IFN-γ水平和抗CII抗体水平降低，与阳性对照组相比有显著性差异(中国免疫学杂志.2006，22(12)：1092-5)。

鉴于滑膜炎和骨损伤是RA的两个最显著的病理学特征，我们将OPG功能片段和HSP65功能片段组成的OPG-HSP65融合基因(去除两者的与治疗RA无关的或对机体有害的肽段，并有利于制剂的制备)，插入原核表达载体pET-28a。在此基础上，对重组蛋白进行原核表达，并通过分子筛或离子交换层析等方法对重组蛋白进行纯化，采用SDS-PAGE、Western-blot法等对融合蛋白进行理化鉴定。其次，通过体内外生物活性实验对融合蛋白的生物学活性进行分析。该体系蛋白表达量高，可控性强，生产成本相对较低，且具有良好的生物学活性，容易实现大规模生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供用大肠杆菌表达OPG-HSP65融合蛋白并分离纯化制备OPG融合蛋白的生产方法。

本发明还提供一种OPG-HSP65融合蛋白，及其在制备用于预防和治疗类风湿关节炎的药物中的用途。

本发明的另一个目的是提供含有本发明的OPG-HSP65融合蛋白和药学上可接受的载体的药物制剂。

本发明所述的OPG融合蛋白指OPG或其活性变体、片段与HSP或其变体、片段融合而成的蛋白。

本发明提供一种编码OPG与HSP65融合蛋白的核酸序列。但在某些实施方案中，可以根据实际需要对核酸密码子进行突变，选用大肠杆菌偏好密码子，但编码OPG-HSP65融合蛋白的氨基酸序列不变。

本发明所述的OPG-HSP65融合蛋白，其为R1-L-R2形式，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段，R2为HSP蛋白、或其变体或片段，L为接头蛋白。

所述OPG蛋白，或其变体、片段选自：

(a)SEQIDNo.1所示的蛋白序列；

(b)氨基酸序列22-X，其中X为SEQIDNo.1所示的包括位置185-401的任意氨基酸残基。

所述的HSP70蛋白、或其变体或片段选自：

(a)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；

(b)氨基酸序列ITDAVITTPAYFNDA。

所述接头选自：

(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1～4间的整数；

(b)gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(c)gly-pro-gly；

(d)gly-gly-pro-gly-gly；

(e)ser-gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(f)val；

(g)tyr-val；

(h)亚部分(a)-(g)的任何组合。

本发明中所指的大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)等宿主细胞。本发明所使用的表达载体可以选用各种已知的原核表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，利用合适的条件筛选重组子，诱导表达OPG-HSP65融合蛋白。

在本发明的一个优选的实施例中，在合适的条件下发酵培养工程菌的步骤包括：

将酶切鉴定正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于25mL LB培养基(含25mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。次日取50ml过夜培养物转接于1LLB培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃培养至OD₆₀₀至0.5，加入IPTG使之终浓度为0.5mmol/L，30℃继续振荡培养5h后离心收集菌体。

在本发明的一个优选的实施例中，从发酵产物中纯化分离并复性出OPG-HSP65融合蛋白包括以下要点：

取发酵培养后收集的大肠杆菌菌体，用预冷的20mmol/L Tris-HCL(pH＝7.9)缓冲液洗涤菌体，用预冷的20mmol/LTris-HCL(pH 7.9)缓冲液洗涤菌体。每克湿菌体加10倍体积的细菌细胞蛋白裂解液重悬，加入溶菌酶至1mg/ml，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至lmmol/L，冰上放置30min后，在冰浴中超声裂菌10min，离心收集沉淀的包涵体。再分别用2mol/L、3mol/L尿素包涵体洗涤液各洗两次，然后用4mol/L尿素变性液溶解包涵体，4℃，12000r/min离心45min，取上清经0.22μm的微孔滤膜过滤获得目的重组蛋白的变性液。根据BCA蛋白定量法将纯化的蛋白变性液浓度稀释到0.5mg/mL。按尿素浓度逐步递减(4mol/L-3mol/L-2mol/L-1mol/L-0.5mol/L-0mol/L)的方法配好复性液(4mol/L尿素，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20％(V/V)甘油，5％(W/V)葡萄糖，PBS，pH7.6)，将稀释的蛋白变性液8ml置于透析袋内，于500ml复性液中4℃缓慢搅拌透析。根据透析过程中蛋白是否析出以及析出量的多少确定最佳复性透析条件，约4个小时更换一次尿素浓度逐渐降低的透析液，最后在pH7.6的PBS溶液中透析过夜，其间更换一次PBS溶液，对蛋白变性液进行透析复性。已确证，OPG-Fc融合蛋白在临床应用上是安全有效的，因此，OPG-HSP65融合蛋白可用于药物使用。

OPG-HSP65融合蛋白可以用于预防和治疗类风湿关节炎等疾病，抑制骨破坏作用并发挥抑制炎症作用。

附图说明

图1显示本发明重组质粒的构建示意图

图2显示本发明表达载体的示意图

图3OPG、OPG-HSP65PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

图4OPG-HSP65融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱

图5Western-blotting分析OPG-HSP65融合蛋白

图6纯化复性后的OPG-HSP65融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱

图7OPG-HSP65融合蛋白对破骨细胞的分化抑制

图8OPG-HSP65融合蛋白对3种促炎性细胞因子产生的抑制作用

表1OPG-HSP65融合蛋白对炎症模型小鼠的抑炎作用

具体实施方式

实施例1 OPG-HSP65融合蛋白原核表达载体的构建

依据OPG-HSP65重组片段(OPG P22-194，HSP65P256-270)基因序列和pET-28a表达载体的特征设计3条引物：上游引物P1和下游引物P2、P3，保留了pET-28a自带的His标签，以重组质粒pGEM-TEasy-OPG为模板，将MTB256-270aa基因序列设计到引物中，采用两次PCR的方法连接二者的基因片段，同时在下游引物P2中引入了TCC柔性片段，使OPG-HSP65重组蛋白空间构象得以正确形成。PCR反应条件：95℃变性5min，按下述参数循环30次：94℃变性40s，53℃退火35s，68℃延伸1min，最后72℃延伸7min。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳观察其大小。

实施例2 OPG-HSP65融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将酶切鉴定正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于25mL LB培养基(含25mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。次日取50ml过夜培养物转接于1L LB培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃培养至OD₆₀₀至0.5，加入IPTG使之终浓度为0.5mmol/L，30℃继续振荡培养5h后离心收集菌体。

实施例3 OPG-HSP65融合蛋白在大肠杆菌中的纯化与复性

阳性克隆菌株于0.5mmol/L IPTG，30℃诱导培养5h后，4℃，6000r/min离心15min，收集菌体，用预冷的20mmol/L Tris-HCL(pH＝7.9)缓冲液洗涤菌体，用预冷的20mmol/LTris-HCL(pH 7.9)缓冲液洗涤菌体。每克湿菌体加10倍体积的细菌细胞蛋白裂解液重悬，加入溶菌酶至1mg/ml，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至1mmol/L，冰上放置30min后，在冰浴中超声裂菌10min，离心收集沉淀的包涵体。再分别用2mol/L、3mol/L尿素包涵体洗涤液各洗两次，然后用4mol/L尿素变性液溶解包涵体，4℃，12000r/min离心45min，取上清经0.22μm的微孔滤膜过滤获得目的重组蛋白的变性液。根据BCA蛋白定量法将纯化的蛋白变性液浓度稀释到0.5mg/mL。按尿素浓度逐步递减(4mol/L-3mol/L-2mol/L-1mol/L-0.5mol/L-0mol/L)的方法配好复性液(4mol/L尿素，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20％(V/V)甘油，5％(W/V)葡萄糖，PBS，pH7.6)，将稀释的蛋白变性液8ml置于透析袋内，于500ml复性液中4℃缓慢搅拌透析。根据透析过程中蛋白是否析出以及析出量的多少确定最佳复性透析条件，约4个小时更换一次尿素浓度逐渐降低的透析液，最后在pH7.6的PBS溶液中透析过夜，其间更换一次PBS溶液，对蛋白变性液进行透析复性。

实施例4 活性实验：OPG-HSP65融合蛋白对破骨细胞的分化抑制

于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养小鼠骨髓细胞，加入巨噬细胞集落刺激因子M-CSF至终浓度为25ng/ml后培养24h，次日收集细胞悬液，即为M-CSF依赖性非附着性骨髓单核细胞。1000r/min，常温离心5min，弃上清，PBS洗两遍。用1640培养基(含25ng/mL的M-CSF和40ng/mL的RANKL)重悬细胞，计数并调整细胞浓度为1×10⁶/mL。于24孔板中每孔放置一张玻片，各孔分别加入培养液1640200μl，37℃温育2h后吸出培养液。分OPG-HSP65重组蛋白实验组和PBS对照组，每组10个复孔。实验组加入OPG-HSP65重组蛋白至终浓度为10μg/ml，对照组加入等量的PBS溶液。然后各孔中加入重悬的骨髓细胞悬液1ml，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养。3天后换液，此后每2天换液1次，每次换液50％，培养至第7天时，弃去培养基，PBS洗细胞2次，用4％甲醛溶液固定15min，然后再用PBS洗细胞2次，空气中自然干燥。按照Sigma说明书行TRAP染色，于光学显微镜下计数多核TRAP阳性破骨细胞。胞体较大、多核、染为红色的为破骨细胞，光学显微镜下计算每个玻片上TRAP染色阳性的多核细胞数。

实施例6 活性实验：OPG-HSP65融合蛋白对炎症模型小鼠的抑炎作用

30只小鼠随机分为实验组、阳性对照组和正常对照组，每组10只。小鼠腹部皮肤脱毛，范围约3cm×2cm，用10g/L DNFB溶液40μl均匀涂抹致敏，建立迟发型超敏反应小鼠模型(实验组和阳性对照组)。同时给药，实验组腹腔注射重组蛋白200μl，阳性对照组注射等量的PBS溶液。致敏后第5天，用10g/L DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。24h后，断颈处死小鼠，随后进行下述试验。

实施例6.1 活性实验：小鼠耳肿胀程度检测

用打孔器打下直径为8mm的小鼠左右耳片并称重。采用单因素方差分析比较各组的差异，左右耳片重量之差表示迟发型超敏反应的程度。

实施例6.2 活性实验：实时荧光定量PCR法检测促炎性细胞因子表达

用Trizol Reagent从小鼠脾脏组织提取总RNA。根据MMLV第一链cDNA合成试剂盒说明书操作步骤，以寡聚(dT)为引物合成cDNA第一链。以反转录产物为模板，在TaqDNA聚合酶作用下，用小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-17、β-actin基因序列的Real-time PCR引物(表1)进行PCR。最后以各cDNA为模板进行SYBR GREEN real-time PCR实验：反应体系为25μl，于96孔板按如下成分加入2x SYBR Green PCR Master mix 12μl，15pmol/μl相应的上下游引物F/R 0.3/0.3μl，无菌双蒸水11.4μl，相应的cDNA 1μl。PCR循环设置：50℃2min→95℃10min→(95℃15s→60℃1min)×40个循环→95℃15s→60℃15s→95℃15s。反应结束后，由Real-Time PCR软件分析计算出Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，因为比较的是转录水平的差异，所以通过检测每个样品的管家基因β-Actin将目的基因归一化。计算结果：ΔΔCt＝ΔCt实验组(阳性对照组)-ΔCt正常对照组，ΔCt实验组(阳性对照组)＝Ct(实验组或阳性对照组)目的基因-Ct(实验组或阳性对照组)管家基因，ΔCt正常对照组＝Ct(正常对照组)目的基因-Ct(正常对照组)管家基因，然后取2^-ΔΔCt即代表被检测因子初始mRNA的相对表达浓度。统计学方法采用单因素方差分析及t检验。

序列表

<110>李，慎涛

赵，文明

张，月

<120>骨保护素-热休克蛋白65融合蛋白的制备及其应用

<130>OPG-Hsp65

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1206

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1206)

<400>1

atg aac aag ttg ctg tgc tgc gcg ctc gtg ttt ctg gac atc tcc att 48

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1 5 10 15

aag tgg acc acc cag gaa acg ttt cct cca aag tac ctt cat tat gac 96

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

20 25 30

gaa gaa acc tct cat cag ctg ttg tgt gac aaa tgt cct cct ggt acc 144

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

35 40 45

tac cta aaa caa cac tgt aca gca aag tgg aag acc gtg tgc gcc cct 192

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

50 55 60

tgc cct gac cac tac tac aca gac agc tgg cac acc agt gac gag tgt 240

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65 70 75 80

cta tac tgc agc ccc gtg tgc aag gag ctg cag tac gtc aag cag gag 288

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

85 90 95

tgc aat cgc acc cac aac cgc gtg tgc gaa tgc aag gaa ggg cgc tac 336

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

100 105 110

ctt gag ata gag ttc tgc ttg aaa cat agg agc tgc cct cct gga ttt 384

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

115 120 125

gga gtg gtg caa gct gga acc cca gag cga aat aca gtt tgc aaa aga 432

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

130 135 140

tgt cca gat ggg ttc ttc tca aat gag acg tca tct aaa gca ccc tgt 480

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145 150 155 160

aga aaa cac aca aat tgc agt gtc ttt ggt ctc ctg cta act cag aaa 528

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

165 170 175

gga aat gca aca cac gac aac ata tgt tcc gga aac agt gaa tca act 576

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

180 185 190

caa aaa tgt gga ata gat gtt acc ctg tgt gag gag gca ttc ttc agg 624

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

195 200 205

ttt gct gtt cct aca aag ttt acg cct aac tgg ctt agt gtc ttg gta 672

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

210 215 220

gac aat ttg cct ggc acc aaa gta aac gca gag agt gta gag agg ata 720

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225 230 235 240

aaa cgg caa cac agc tca caa gaa cag act ttc cag ctg ctg aag tta 768

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

245 250 255

tgg aaa cat caa aac aaa gcc caa gat ata gtc aag aag atc atc caa 816

Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

260 265 270

gat att gac ctc tgt gaa aac agc gtg cag cgg cac att gga cat gct 864

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

275 280 285

aac ctc acc ttc gag cag ctt cgt agc ttg atg gaa agc tta ccg gga 912

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

290 295 300

aag aaa gtg gga gca gaa gac att gaa aaa aca ata aag gca tgc aaa 960

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305 310 315 320

ccc agt gac cag atc ctg aag ctg ctc agt ttg tgg cga ata aaa aat 1008

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

325 330 335

ggc gac caa gac acc ttg aag ggc cta atg cac gca cta aag cac tca 1056

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

340 345 350

aag acg tac cac ttt ccc aaa act gtc act cag agt cta aag aag acc 1104

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

355 360 365

atc agg ttc ctt cac agc ttc aca atg tac aaa ttg tat cag aag tta 1152

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

ttt tta gaa atg ata ggt aac cag gtc caa tca gta aaa ata agc tgc 1200

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385 390 395 400

tta taa 1206

Leu

<210>2

<211>401

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1 5 10 15

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

20 25 30

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

35 40 45

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

50 55 60

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65 70 75 80

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

85 90 95

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

100 105 110

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

115 120 125

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

130 135 l40

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145 150 155 160

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

165 170 175

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

180 185 190

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

195 200 205

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

210 215 220

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225 230 235 240

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

245 250 255

Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

260 265 270

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

275 280 285

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

290 295 300

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305 310 315 320

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

340 345 350

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

355 360 365

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385 390 395 400

Leu

<210>3

<211>1623

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1623)

<400>3

atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gag 48

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu

1 5 10 15

cgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc 96

Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

20 25 30

aag ggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc 144

Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

35 40 45

acc aac gat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg 192

Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

50 55 60

tac gag aag atc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc 240

Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr

65 70 75 80

gat gac gtc gcc ggt gac ggc acc acg acg gcc acc gtg ctg gcc cag 288

Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

85 90 95

gcg ttg gtt cgc gag ggc ctg cgc aac gtc gcg gcc ggc gcc aac ccg 336

Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

100 105 110

ctc ggt ctc aaa cgc ggc atc gaa aag gcc gtg gag aag gtc acc gag 384

Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

115 120 125

acc ctg ctc aag ggc gcc aag gag gtc gag acc aag gag cag att gcg 432

Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

130 135 140

gcc acc gca gcg att tcg gcg ggt gac cag tcc atc ggt gac ctg atc 480

Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile

145 150 155 160

gcc gag gcg atg gac aag gtg ggc aac gag ggc gtc atc acc gtc gag 528

Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

165 170 175

gag tcc aac acc ttt ggg ctg cag ctc gag ctc acc gag ggt atg cgg 576

Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

180 185 190

ttc gac aag ggc tac atc tcg ggg tac ttc gtg acc gac ccg gag cgt 624

Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

195 200 205

cag gag gcg gtc ctg gag gac ccc tac atc ctg ctg gtc agc tcc aag 672

Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

210 215 220

gtg tcc act gtc aag gat ctg ctg ccg ctg ctc gag aag gtc atc gga 720

Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

225 230 235 240

gcc ggt aag ccg ctg ctg atc atc gcc gag gac gtc gag ggc gag gcg 768

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

245 250 255

ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc acc ttc aag tcg gtg 816

Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

260 265 270

gcg gtc aag gct ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag gcg atg ctg cag 864

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

275 280 285

gat atg gcc att ctc acc ggt ggt cag gtg atc agc gaa gag gtc ggc 912

Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

290 295 300

ctg acg ctg gag aac gcc gac ctg tcg ctg cta ggc aag gcc cgc aag 960

Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys

305 310 315 320

gtc gtg gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag ggc gcc ggt gac 1008

Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

325 330 335

acc gac gcc atc gcc gga cga gtg gcc cag atc cgc cag gag atc gag 1056

Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

340 345 350

aac agc gac tcc gac tac gac cgt gag aag ctg cag gag cgg ctg gcc 1104

Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

355 360 365

aag ctg gcc ggt ggt gtc gcg gtg atc aag gcc ggt gcc gcc acc gag 1152

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu

370 375 380

gtc gaa ctc aag gag cgc aag cac cgc atc gag gat gcg gtt cgc aat 1200

Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn

385 390 395 400

gcc aag gcc gcc gtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg 1248

Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

405 410 415

ctg ttg caa gcg gcc ccg acc ctg gac gag ctg aag ctc gaa ggc gac 1296

Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

420 425 430

gag gcg acc ggc gcc aac atc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg 1344

Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

435 440 445

aag cag atc gcc ttc aac tcc ggg ctg gag ccg ggc gtg gtg gcc gag 1392

Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

450 455 460

aag gtg cgc aac ctg ccg gct ggc cac gga ctg aac gct cag acc ggt 1440

Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

465 470 475 480

gtc tac gag gat ctg ctc gct gcc ggc gtt gct gac ccg gtc aag gtg 1488

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

485 490 495

acc cgt tcg gcg ctg cag aat gcg gcg tcc atc gcg ggg ctg ttc ctg 1536

Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

500 505 510

acc acc gag gcc gtc gtt gcc gac aag ccg gaa aag gag aag gct tcc 1584

Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

515 520 525

gtt ccc ggt ggc ggc gac atg ggt ggc atg gat ttc tga 1623

Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe

530 535 540

<210>4

<211>540

<212>PRT

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>4

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu

l 5 10 15

Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

20 25 30

Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

35 40 45

Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

50 55 60

Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

85 90 95

Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

100 105 110

Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

115 120 125

Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

130 135 140

Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile

145 150 155 160

Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

165 170 175

Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

180 185 190

Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

195 200 205

Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

210 215 220

Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

245 250 255

Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

260 265 270

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

275 280 285

Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

290 295 300

Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys

305 310 315 320

Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

325 330 335

Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

340 345 350

Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

355 360 365

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu

370 375 380

Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn

385 390 395 400

Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

405 410 415

Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

420 425 430

Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

435 440 445

Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

450 455 460

Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

465 470 475 480

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

485 490 495

Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

500 505 510

Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

515 520 525

Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe

530 535 540

<210>5

<211>612

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>OPG-Hsp65融合蛋白编码序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(612)

<400>5

atg gaa acg ttt cct cca aag tac ctt cat tat gac gaa gaa acc tct 48

Met Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser

l 5 10 15

cat cag ctg ttg tgt gac aaa tgt cct cct ggt acc tac cta aaa caa 96

His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln

20 25 30

cac tgt aca gca aag tgg aag acc gtg tgc gcc cct tgc cct gac cac 144

His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His

35 40 45

tac tac aca gac agc tgg cac acc agt gac gag tgt cta tac tgc agc 192

Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser

50 55 60

ccc gtg tgc aag gag ctg cag tac gtc aag cag gag tgc aat cgc acc 240

Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr

65 70 75 80

cac aac cgc gtg tgc gaa tgc aag gaa ggg cgc tac ctt gag ata gag 288

His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu

85 90 95

ttc tgc ttg aaa cat agg agc tgc cct cct gga ttt gga gtg gtg caa 336

Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln

100 105 110

gct gga acc cca gag cga aat aca gtt tgc aaa aga tgt cca gat ggg 384

Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly

115 120 125

ttc ttc tca aat gag acg tca tct aaa gca ccc tgt aga aaa cac aca 432

Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr

130 135 140

aat tgc agt gtc ttt ggt ctc ctg cta act cag aaa gga aat gca aca 480

Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr

145 150 155 160

cac gac aac ata tgt tcc gga aac agt gaa tca act caa aaa gga gga 528

His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Gly Gly

165 170 175

gga gga gga gga gcg ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc 576

Gly Gly Gly Gly Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly

180 185 190

acc ttc aag ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 612

Thr Phe Lys Leu Glu His His Hi s His His His

195 200

<210>6

<211>203

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>6

Met Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser

1 5 10 15

His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln

20 25 30

His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His

35 40 45

Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser

50 55 60

Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr

65 70 75 80

His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu

85 90 95

Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln

100 105 110

Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly

115 120 125

Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr

130 135 140

Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr

145 150 155 160

His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Gly Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly

180 185 190

Thr Phe Lys Leu Glu His His His His His His

195 200

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>OPG上游引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(29)

<400>7

catgccatgg aaacgtttcc tctccaaag 29

<210>8

<211>62

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>OPG下游引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(62)

<400>8

gttgacgacc agggtggaca gcgctcctcc tcccctcctc ctcctttttg agttgattca 60

ct 62

<210>9

<211>46

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>OPG-Hsp65下游引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(27)

<400>9

ccgctcgagc ttgaaggtgg cggatcttgt tgacgaccag ggtgga 46

Claims

1.一种制备OPG-HSP65融合蛋白的新方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码OPG、其变体或片段的核苷酸序列和编码HSP蛋白、其变体或片段的核苷酸序列可操作地连接于表达载体中，得到OPG-HSP65融合蛋白的重组表达载体；

(b)将步骤(a)中的重组表达载体转化入大肠杆菌中，并筛选获得表达OPG-HSP65融合蛋白的工程菌；

(c)在合适的条件下发酵培养诱导表达融合蛋白；

(d)从步骤(c)中的培养产物中纯化分离所述融合蛋白；其中所述融合蛋白的形式为R1-L-R2形式，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段；R2为HSP蛋白、或其变体或片段；L为接头蛋白。

所述OPG蛋白，或其变体、片段选自：

(1)SEQID No.1所示的蛋白序列；

(2)氨基酸序列22-X，其中X为SEQIDNo.1所示的包括位置185-401的任意氨基酸残基。

所述的HSP65蛋白、或其变体或片段选自：

(1)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；

(2)氨基酸序列ALSTLVVNKIRGTFK。

所述L接头选自：

(1)ala-(ala)n-ala，n可以是1～4间的整数；

(2)gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(3)gly-pro-gly；

(4)gly-gly-pro-gly-gly；

(5)ser-gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(6)val；

(7)tyr-val；

(8)亚部分(1)-(7)的任何组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于25mL LB培养基(含25mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。次日取50ml过夜培养物转接于1L LB培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃培养至OD₆₀₀至0.5，加入IPTG使之终浓度为1mmol/L，30℃继续振荡培养5h后离心收集菌体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括采用包涵体的溶解，稀释复性及分子筛层析纯化，获得目的蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列22-X是第22-194为氨基酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白潜在用于类风湿关节炎的治疗。