CN110392691A - Hmgb1突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高迁移率族框1(HMGB1)多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将对应于人HMGB1的氨基酸第Y109位、第Y144位、第Y155位和/或第Y162位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选全部四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2‑氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6‑二氨基‑6‑氧代己酸)的氨基酸残基。本发明进一步涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸、涉及包含所述多核苷酸的载体、且涉及包含所述多肽、所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及与其相关的方法、试剂盒和用途。

Description

HMGB1突变体
本发明涉及高迁移率族框1(HMGB1)多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将在对应于人HMGB1的氨基酸第Y109位、第Y144位、第Y155位和/或第Y162位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选全部四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2-氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6-二氨基-6-氧代己酸)的氨基酸残基。本发明进一步涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸、涉及包含所述多核苷酸的载体、且涉及包含所述多肽、所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及与其相关的方法、试剂盒和用途。
高迁移率族框1(HMGB1)蛋白属于核蛋白的高迁移率族(HMG)家族，其命名归因于其成员在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的不寻常的高迁移率。这些蛋白质是与染色质相关的仅次于组蛋白的最丰富的蛋白质，它们在真核细胞的细胞核中发挥构建作用，这是由于它们弯曲、变形或以其他方式修饰DNA的构象，从而也修饰了转录因子与DNA的结合。HMG蛋白与各种疾病例如几种良性肿瘤和自身免疫疾病的发生有关。此外，大量HMGB1的释放，特别是从NK细胞的释放，对于树突细胞活化(Saidi等人(2008)，PloS one 3，e3601)和趋化性(Yang等人(2007)，Journal of leukocyte biology 81，59-66)是至关重要的。此外，HMGB1表现出了导致细菌的快速杀灭的显著抗微生物活性，(Zetterstrom等人，(2002)，Pediatric research 52，148-154)。
内源性HMGB1也错综复杂地参与了细胞和器官的能量代谢。HMGB1敲除的小鼠不能利用肝细胞中的糖原储存池并由于围产期低血糖症而死亡。葡萄糖暂时拯救了动物，但由于内脏器官、肌肉和脂肪组织的严重萎缩，小鼠在几天后死亡(Calogero等人(1999)，Nature genetics 22，276-280)。鼠肌肉组织与HMGB1的体外孵育导致肌纤维快速耗尽，并且在患有多发性肌炎的患者的肌浆中发现HMGB1浓度升高(Grundtman等人(2010)，TheFASEB journal 24，570-578)。总之，HMGB1的缺乏和过量严重影响细胞能量代谢。
细胞外HMGB1是免疫系统的巨噬细胞和其他细胞的有效细胞因子和强活化因子，从而导致广泛的炎性反应。因此，HMGB1与自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎有关。然而，发现，血液中大量的HMGB1指示严重或危及生命的炎症例如脓毒症。为了拮抗此类HMGB1相关病理，已经描述了HMGB1功能抑制剂例如抑制性抗体或其片段、在框A中包含突变的HMGB1变体、或框A结构域的聚合物缀合物(US 6468533、WO 02/074337、US2003/0144201、WO 2006024547、和WO 2008031612)。另一方面，提出HMGB1作为抗癌剂(US2011/0123483 A1，Gdynia等人(2016)，Nature Communications 7：10764.doi：10.1038/ncomms10764)。
对于HMGB1蛋白，已经描述了几种结构基序：两个DNA结合结构域(框A和框B)、两个核定位序列、和C-末端酸性结构域。HMGB1蛋白可以通过乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、磷酸化或糖基化进行广泛的翻译后修饰。核定位位点的乙酰化是导致HMGB1蛋白从免疫系统的活化细胞中主动分泌的信号。除活性分泌外，HMGB1也从坏死细胞中被动释放。
除了手术切除肿瘤组织之外，癌症治疗基本上依赖于对活跃分裂细胞发挥有害功能的药物和/或治疗的应用。就其性质而言，这种治疗还会损害人体内经历细胞分裂的非肿瘤细胞和组织，这导致化学治疗和放射治疗的大部分众所周知和可怕的副作用，例如恶心、消化变形、疲劳、脱发等等。因此，希望手头具有通过迄今未知的作用途径发挥效用的新治疗剂，从而潜在地使化学治疗和/或放射治疗中的剂量减少、副作用减轻。提供此类使用新的癌细胞杀伤途径的药物也可能有助于癌症干细胞的去除，所述癌症干细胞可以通过进入静止状态而在化学治疗中存活，并且最近发现所述癌症干细胞的存活是所有复发和转移的至少一部分的原因。
近年来，发现NK细胞在癌症治疗中具有潜在用途。NK细胞的主要优点在于它们是先天免疫系统的一部分，不需要抗原特异性激活。基于NK细胞结合和杀死敏感靶细胞的能力，可将它们分成三个主要亚群(游离性NK细胞、结合性NK细胞和杀伤性NK细胞)(Jewett等人(1996)，J Clin Immunol.16(1)：46-54)。非结合性NK细胞、非杀伤性NK细胞是最不成熟的并且可以被激活成为结合性NK细胞、杀伤性NK细胞，并且发现NK细胞分泌TNF-α的能力与NK细胞成熟的功能性阶段相关(Jewett等人，在上述引文中)。
然而，随着基于免疫的癌症疗法变得更强效、更有效、并且更广泛可用，对其潜在毒性的优化管理变得越来越重要(Lee等人(2014)，Blood124(2)：188)。特别是，细胞因子释放综合征(CRS)是一种与细胞因子循环水平升高相关的综合征，是一种可能危及生命的毒性，该毒性在施予天然和双特异性抗体后观察到，并且最近，在用于癌症的T细胞或NK细胞治疗后观察到(Lee等人，在上述引文中)。
因此，需要改进的癌症治疗方法。该问题通过下文公开的手段和方法解决。
因此，本发明涉及高迁移率族框1(HMGB1)多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸第22位、第57位、第68位和第75位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2-氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6-二氨基-6-氧代己酸)的氨基酸残基。
如下所使用的，以非排他的方式使用术语“具有”、“包含”或“包括”。因此，这些术语可以指除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在其他特征以及存在一个或多于一个其他特征的情况。作为示例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以指除了B之外，A中不存在其他要素的情况(即，单独地且排他地由B组成的情况)，并且可以指除了B之外，在实体A中存在一个或多于一个其他要素例如要素C、要素C和D、或甚至其他要素的情况。
此外，如下所述，术语“优选”，“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选特征，并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来进行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表述所引入的特征旨在表示可选特征，对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征相结合的可能性没有任何限制。此外，如果没有另外说明，则术语“约”是指给定值的±20％。
如本文所用，术语“高迁移率族框1多肽”(HMGB1多肽)是指技术人员已知的多肽的高迁移率族成员，其具有权利要求中指定的修饰；包括如下所述的部分序列或其衍生物。因此，优选地，本发明的HMGB1多肽不是天然存在的HMGB1多肽。还优选地，本发明的HMGB1多肽不是人HMGB1，且不是在氨基酸Y109、Y144、Y155和/或Y162处磷酸化的人HMGB1。优选地，本发明的HMGB1多肽具有本文其他地方所述的活性，优选细胞毒活性和/或激活NK细胞的活性，优选如本文实施例中所述的。优选地，HMGB1多肽是人HMGB1多肽的衍生物(GenbankACCNo：NP_002119.1GI：4504425，SEQ ID NO：3)。用于测量前述活性的合适测定法在所附实施例中描述。HMGB1多肽可以从细胞或组织中纯化、或者可以以化学方法合成、或者优选地，可以重组制备。HMGB1多肽可以包含可以用作纯化标签或检测标签的其他氨基酸，和/或HMGB1多肽可以由例如本文其他地方所述的融合多肽所包含。
因此，在本发明多肽或肽的优选实施方案中，多肽或肽还包含可检测标签。术语“可检测标签”是指被添加至或引入到多肽或肽中的氨基酸片段。优选地，标签应在多肽或肽的C-末端或N-末端添加；所述氨基酸片段可以例如允许通过特异性识别标签的抗体来检测多肽或肽，或者其应允许形成功能性构象例如螯合剂，或者其应允许通过荧光标签而可视化。优选的标签是Myc标签、FLAG标签、6-His标签、HA标签、GST标签或GFP标签。这些标签在本领域中都是众所周知的。
HMGB1多肽的优选实施方案是包含HMGB1多肽的B框基序的多肽，优选包含人HMGB1的B框的多肽，更优选包含具有如本文所述突变的SEQ ID NO：1的衍生物的多肽，更优选包含突变的人HMGB1的B框的多肽，优选如下文所述。
在本发明的HMGB1多肽中，已经将在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸第22位、第57位、第68位和第75位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2-氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6-二氨基-6-氧代己酸)的氨基酸残基。如本领域技术人员所理解的，上述氨基酸位置对应于人HMGB1(SEQ ID NO：3)的氨基酸第Y109位、第Y144位、第Y155位和第Y162位。优选地，在所述HMGB1多肽中，已经将在所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸残基。更优选地，在所述HMGB1多肽中，已经将在所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基或替换为谷氨酰胺残基。甚至更优选地，在所述HMGB1多肽中，已经将在所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酰胺残基；因此，优选地，HMGB1多肽优选包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。最优选地，在所述HMGB1多肽中，已经将在所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基；因此，优选地，HMGB1多肽优选包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在一个实施方案中，HMGB1多肽或其衍生物是寡聚磷酸化的HMGB1多肽，即，其中至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选全部四个酪氨酸残基已被替换为谷氨酰胺、天冬酰胺或高谷氨酰胺残基的HMGB1多肽。在更优选的实施方案中，HMGB1多肽或其衍生物是HMGB1多肽的磷酸模拟物，即，其中至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选全部四个酪氨酸残基已被替换为谷氨酸、天冬氨酸或高谷氨酸残基的HMGB1多肽。
优选地，HMGB1多肽或其衍生物是如上文所述的HMGB1多肽；该术语优选地还包括以下的多肽：该多肽具有与HMGB1多肽或与如本文所述的HMGB1多肽的框B至少70％相同的氨基酸序列，且该多肽具有诱导癌症细胞例如SW480细胞中细胞死亡增加的活性。因此，优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，HMGB1多肽具有诱导在培养的SW480细胞中增加细胞死亡的活性。更优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：6组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导在培养的SW480细胞中细胞死亡的增加。还优选地，该术语优选地还包括以下的多肽：该多肽具有与HMGB1多肽或与如本文所述的HMGB1多肽的框B至少70％相同的氨基酸序列，且该多肽具有诱导NK对癌细胞的杀伤增加的活性；更优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，该多肽诱导NK-92CI细胞对培养的SW480细胞的杀伤增加；更优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：6组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，该多肽诱导NK-92 CI细胞对培养的SW480细胞的杀伤增加。还优选地，该术语优选地还包括以下的多肽：该多肽具有与HMGB1多肽或与如本文所述的HMGB1多肽的框B至少70％相同的氨基酸序列，且该多肽具有诱导NK细胞成熟的活性；优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，该多肽增加培养的NK-92CI细胞的肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌。更优选地，与包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的多肽，优选由氨基酸序列SEQ ID NO：6组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽增加培养的NK-92CI细胞的肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌。
术语“TNF-α”或“肿瘤坏死因子α”是本领域技术人员已知的参与全身性炎症，特别参与急性期反应的细胞因子。优选地，TNF-α是人TNF-α。
优选地，HMGB1多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列，和/或包含与SEQ IDNO：3具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列，并且更优选地，具有上述活性的至少一种，更优选至少两种，最优选所有三种。更优选地，HMGB1多肽包含与SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8，优选与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列，并且更优选地，具有上述活性的至少一种，更优选至少两种，最优选所有三种。
如本文所用，术语“提供HMGB1多肽的试剂”涉及能够向生物系统提供或释放如本文所述的HMGB1多肽的任何试剂或组合物。优选地，提供HMGB1多肽的试剂以诱导1nM至5μM，更优选10nM至1μM，最优选50nM至900nM的血浆浓度的剂量使用。优选地，该术语还涉及特异性结合包含HMGB1多肽的肿瘤细胞的试剂。优选地，所述特异性结合肿瘤细胞的试剂是抗体、适配体、凝集素等。还优选地，术语“提供HMGB1多肽的试剂”涉及被诱导分泌HMGB1多肽的HMGB1分泌细胞。可被诱导分泌HMGB1的细胞及其制备方法是本领域已知的，优选为实施例中所示的方法；优选的可被诱导分泌HMGB1的细胞是巨噬细胞和NK细胞。还优选地，术语“提供HMGB1多肽的试剂”涉及编码HMGB1多肽的可表达的多核苷酸。如本领域技术人员所理解的，所述多核苷酸优选包含在载体或宿主细胞中，优选如下文所述。
在本发明化合物的上下文中使用的术语“衍生物”涉及具有与本发明的所述化合物相关的结构的化学分子。优选地，衍生物可以由本发明的化合物通过至多三个，更优选至多两个，最优选至多一个化学衍生化反应制备。优选地，衍生物是在哺乳动物，优选人的体内代谢成本发明化合物的化合物。还优选地，衍生物是可以通过水解获得本发明的化合物的化合物。在化合物是肽或多肽的情况下，衍生物优选是如下文所述的与其衍生自的化合物具有至少一定程度相似性的化合物。如本文所用，如本文所述的高迁移率族框1(HMGB1)多肽的衍生物至少具有如上文所述的抑制癌细胞的活性。
优选地，涉及多肽或肽的术语“衍生物”包括所述多肽或肽的氨基酸序列的变体，所述变体具有与多肽或肽的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且所述变体保留本文所述的多肽或肽的功能。优选地，针对整个氨基酸序列区域计算同一性百分比值。基于各种算法的一系列程序可供技术人员用于比较不同的序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，51989：151-153)或程序Gap和BestFit(Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))将作为GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991))的一部分使用。优选地，使用程序GAP在整个序列区域上确定以百分比(％)表示的上述序列同一性值，其中使用以下设置：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000。
此外，多肽或肽的衍生物还包括可代表特定多肽或肽的直系同源物、旁系同源物或其他同源物的前述特定氨基酸序列的变体。变体优选包含氨基酸序列，其特征在于该序列可以通过至少一个氨基酸置换和/或添加和/或缺失而衍生自上述多肽或肽的前述序列。
术语衍生物还包括化学修饰的多肽，例如含有经修饰的氨基酸的多肽或生物素化的多肽、或与荧光团例如荧光素或Cy3结合的多肽、例如通过二硫键桥接或通过订合而被构象限制的多肽(Walensky 2004，Science 305(5689)：1466-1470)、或与细胞穿透多肽或蛋白转导结构域相连的多肽(Snyder 2004，Pharm Res 21(3)：389-393)。这些修饰可以改善多肽的生物学特性，例如细胞穿透性、结合性、稳定性、或者可以用作检测标记。
优选地，HMGB1多肽作为药物相容性制剂提供。本文使用的术语“药物相容性制剂”和“药物组合物”涉及包含至少一种本发明化合物和任选的一种或多于一种药学上可接受的载剂的组合物。本发明化合物可以配制成药学上可接受的盐。优选的可接受的盐是乙酸盐、甲酯、HCl、硫酸盐、氯化物等。药物组合物优选局部施用，或更优选全身施用。通常用于药物施用的合适施用途径是经口、静脉内或肠胃外施用以及吸入。然而，取决于化合物的性质和作用方式，药物组合物也可以通过其他途径施用。此外，这些化合物可以以普通药物组合物的形式施、或者以本文别处所述的分离的药物组合物的形式与其它药物组合施用，其中所述分离的药物组合物可以以试剂盒套装的形式提供。
该化合物优选以常规剂型施用，该常规剂型通过根据常规方法将药物与标准药物载剂组合来制备。这些方法可以包括混合、制粒和压缩或溶解适合于所需制剂的成分。应当理解的是，药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量。
载剂在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是可接受的。所用的药物载剂可以是例如固体、凝胶或液体。示例性固体载剂是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载剂是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油例如花生油和橄榄油、水、乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载剂或稀释剂可包括本领域公知的延时材料，例如单独使用的或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载剂包括上述那些和本领域熟知的其他载剂，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。
选择稀释剂以便不影响一种或多于一种化合物的生物活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或制剂还可包含其他载剂，佐剂，或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
治疗有效剂量是指用于本发明药物组合物中的化合物的量，其预防、改善或治疗伴随本说明书中提及的疾病或病症的症状。这些化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法测定，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)。治疗效果和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比例LD50/ED50。
剂量方案将由主治医师和其他临床因素确定；优选地，根据任何一种上述方法来确定。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监测进展情况。典型的剂量可以是例如1μg至1000μg；然而，设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是在考虑到上述因素的情况下。通常，作为药物组合物的常规施用的方案应当是每天1μg至10mg单位。如果方案是连续输注，则其也应分别是每分钟每千克体重1μg至10mg单位。可以通过定期评估来监测进展情况。本发明化合物的优选剂量和浓度在本文其他地方说明。本文提及的药物组合物和制剂优选至少施用一次，以治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病症。然而，所述药物组合物可以施用多于一次，例如每天施用一次至四次，直至非限定天数。
特定的药物组合物以药学领域中众所周知的方式制备，并且包含至少一种与药学上可接受的载剂或稀释剂混合的或以其他方式结合的上文提及的活性化合物。为了制备这些特定的药物组合物，通常将活性化合物与载剂或稀释剂混合，或将该活性化合物封闭或包封在胶囊、小药囊、扁囊、纸或其他合适的容器或载体中。所得制剂应采用施用方式，即片剂、胶囊剂、栓剂、溶液、混悬剂等形式。剂量建议应在开处方者或用户说明书中说明，以便根据所考虑的接受者预测剂量调整。
有利地，在本发明的基础工作中发现，与野生型HMGB1相比，本发明的突变HMGB1多肽具有增加的活性，其中Glu-HMGB1仍然比Gln-HMGB1更具活性。此外，发现通过使用不同的HMGB1突变体，可以根据需要调节对癌细胞的细胞毒性水平和免疫系统的活化水平。
上述定义经必要修改后适用于以下内容。以下进一步作出的另外的定义和解释也适用于本说明书中描述的所有实施方案，细节上可作出必要的修改。
本发明还涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”涉及包含编码具有如上所述生物活性的多肽的核酸序列的多核苷酸，优选包含编码包含如上所述的氨基酸序列SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：8或其衍生物的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。应当理解的是，由于多于一种多核苷酸的简并遗传密码，可以编码具有如上详述的氨基酸序列的多肽。此外，根据本发明使用的术语“多核苷酸”还涵盖前述特定多核苷酸的变体。所述变体可以代表本发明多核苷酸的直系同源物、旁系同源物或其他同源物。多核苷酸变体优选地包含核酸序列，其特征在于该序列可以通过至少一个核苷酸置换、添加和/或缺失而衍生子前述特定的核酸序列，其中变体核酸序列仍然可以编码具有如上所述的突变和活性的多肽。变体还包括含有能够与上述特定核酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸，优选地在严格杂交条件下与上述特定核酸序列杂交。这些严格条件是技术人员已知的，并且可以在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的优选实例是在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中，然后在50℃至65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次或多于一次洗涤步骤的杂交条件。技术人员知道这些杂交条件根据核酸的类型而不同，以及例如，当存在有机溶剂时与缓冲液的温度和浓度相关。例如，在“标准杂交条件”下，在浓度为0.1×SSC至5×SSC(pH7.2)的水性缓冲液中，温度根据核酸的类型在42℃至58℃之间变化。如果有机溶剂存在于上述缓冲液例如50％甲酰胺中，则标准条件下的温度为约42℃。针对DNA：RNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和20℃至45℃，优选为30℃至45℃。针对DNA：RNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和30℃至55℃，优选为45℃至55℃。例如对于具有约100bp(碱基对)的长度和50％的G+C含量的核酸，在不存在甲酰胺的条件下测定上述杂交温度。技术人员知道如何通过参考教科书例如上述教科书来确定所需的杂交条件。
或者，多核苷酸变体可通过基于PCR的技术获得，例如基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即使用针对本发明多肽的保守结构域的简并引物来获得。可以通过如上所述的多核苷酸的核酸序列或多肽的氨基酸序列的序列比较来鉴定本发明多肽的保守结构域。合适的PCR条件是本领域熟知的。作为模板，可以使用来自AAV的DNA或cDNA。此外，变体包括包含与上面详述的核酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列的多核苷酸。优选地，百分比同一性值如上所述计算。
包含任何上述核酸序列的片段的多核苷酸也包含在本发明的多核苷酸中。该片段应编码仍具有上述生物学活性的多肽。因此，多肽可包含赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域或由赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域组成。本文所指的片段优选包含任何一种前述核酸序列的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续核苷酸或编码包含任何一种前述核酸序列的至少20、至少30、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸的氨基酸序列。
优选地，本发明的多核苷酸应作为分离的多核苷酸(即从其天然环境中分离)提供或以遗传修饰的形式提供。多核苷酸优选是包括cDNA的DNA或RNA。该术语涵盖单链和双链多核苷酸。此外，还包含化学修饰的多核苷酸，其包括天然存在的经修饰的多核苷酸例如糖基化或甲基化的多核苷酸、或人工修饰的多核苷酸例如生物素化的多核苷酸。
本发明的多核苷酸基本上由前述核酸序列组成或包含前述核酸序列。因此，本发明的多核苷酸也可包含其他核酸序列。具体地，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明进一步涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。
术语“载体”优选包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。更优选地，该术语涉及衍生自病毒的载体，优选地所述病毒优先感染肿瘤细胞(肿瘤病毒)或涉及衍生自优先裂解癌细胞的病毒(溶瘤病毒)的载体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合到基因组DNA中。此类靶向构建体优选包含用于同源或异源重组的足够长度的DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于在宿主中繁殖和/或选择的可选择标记。载体可以通过本领域熟知的各种技术并入宿主细胞中。例如，可以将质粒载体引入沉淀物例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物中，或引入具有带电荷脂质的复合物中或引入碳基簇例如富勒烯中。或者，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，可以在应用于宿主细胞之前使用合适的包装细胞系在体外对其进行包装。病毒载体可以具有复制能力或是复制缺陷的。
优选地，在本发明的载体中，本发明的多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，使得能够在原核或真核细胞或其分离的部分中表达。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选在哺乳动物细胞中表达的调控元件是本领域熟知的。优选地，调控元件包含确保转录起始的调控序列以及任选的确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调控元件可包括转录增强子和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子，和允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子、或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或珠蛋白内含子。此外，诱导型表达控制序列可用于本发明所包含的表达载体中。这种诱导型载体可以优选地包含tet或lac操纵子序列或可由热休克或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域熟知的。除了负责转录起始的元件之外，这些调控元件还可以包含转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在本文中，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(InVitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。衍生自病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送到靶细胞群中。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建重组病毒载体；参见，例如在Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1994)中描述的技术。
此外，本发明涉及包含根据本发明的多肽、多核苷酸和/或载体的宿主细胞。
术语“宿主细胞”优选地涉及与施用于对象相容的细胞。更优选地，所述细胞与对象免疫相容。最优选地，细胞是从所述对象获得的细胞。本发明的宿主细胞优选是具有迁移到癌细胞附近的倾向的细胞，更优选地，宿主细胞是免疫细胞，并且最优选地是特异性识别肿瘤特异性抗原的免疫系统的细胞，例如肿瘤抗原特异性T细胞。
此外，包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞优选是能够产生本发明的HMGB1多肽的细胞，例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
本发明还涉及根据本发明的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞用作药物。
此外，本发明涉及根据本发明的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞用于治疗癌症和/或免疫调节。
如本文所用，术语“癌症”是指动物，优选人的疾病，其特征在于一群体细胞的不适当的和/或不受控制的生长。这种不受控制的生长可伴随着对周围组织的侵入和破坏并且可能将不适当增殖的细胞扩散到体内的其他位置。因此，优选地，根据本发明的多核苷酸、载体和/或宿主细胞用于治疗癌症。
优选地，癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、喉癌、髓母细胞瘤、眼部髓上皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤(NET)/癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦氏巨球蛋白血症、和肾母细胞瘤。
更优选地，癌症是白血病、淋巴瘤、HPV相关癌症、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、脑癌或乳腺癌。优选的结肠直肠癌是结肠癌。甚至更优选地，癌症是白血病，最优选是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
术语“癌症疗法”包括本领域技术人员已知的适用于治疗癌症的所有手段和方法。优选地，该术语涉及批准用于人类癌症治疗的疗法。术语“细胞癌症免疫疗法”优选涉及癌症治疗方法，该方法包括将细胞，优选自体细胞例如优选地，B细胞、T细胞和/或NK细胞、或其前体细胞例如造血干细胞施用于对象。优选地，所述施用的细胞是NK细胞或其前体细胞。更优选地，所述细胞是识别肿瘤的NK细胞或其前体细胞。甚至更优选地，所述细胞是识别肿瘤的NK细胞，最优选是识别自体肿瘤的NK细胞。
优选地，治疗癌症和免疫调节包括细胞癌症免疫疗法。还优选地，治疗癌症和/或免疫调节包括诱导NK细胞分泌TNF-α，优选诱导NK细胞成熟。还优选地，治疗癌症和/或免疫调节包括避免诱导不良事件，更优选包括避免诱导细胞因子释放综合征(CRS)。
本领域技术人员已知术语“自然杀伤细胞”和“NK细胞”涉及细胞毒性淋巴细胞，其是先天免疫系统的一部分并且通过包括NKG2D、NKp44、NKp46、NKp30等的受体来识别通常在肿瘤细胞上表达的各种配体，包括ULBP和MICA。术语“NK细胞成熟”是技术人员所理解的。优选地，NK细胞成熟是在NK细胞总比例中结合和/或杀死肿瘤细胞的NK细胞比例增加。
“不良事件”涉及HMGB1治疗并涉及细胞免疫疗法及其标志物和症状，并且合适的治疗是本领域技术人员已知的(例如，在Tey，S-K(2014)，Clinical and TranslationalImmunology 3，e17；doi：10.1038/cti.2014.11中所综述的)。不良事件优选包括神经毒性(引起例如听力丧失、癫痫或昏迷)、白癜风、结肠炎、升高的肝酶、急性肺浸润、B细胞耗竭、低γ球蛋白血症和细胞因子释放综合征。例如根据Lee等人(在上述引文中)，术语“细胞因子释放综合征”及其症状和标志物是本领域技术人员已知的。优选地，用于阻止或阻碍CRS的标记物是C-反应蛋白、IL-6和/或TNF-α，优选标记物是TNF-α。
此外，本发明涉及用于在对象中治疗癌症和/或诱导免疫调节的方法，其包括：
a)使所述对象与根据实施方案1至18中任一项的多肽、根据实施方案19的多核苷酸、根据实施方案20的载体、和/或根据实施方案21的宿主细胞接触，并且由此
b)在所述对象中治疗癌症和/或诱导免疫调节。
优选地，本发明的方法是体内方法。此外，它们可以包括除了上面明确提到的步骤之外的步骤。例如，用于治疗癌症和/或诱导免疫调节的方法的另一步骤可涉及例如在施用所述药物活性化合物之前或之后用手术除去肿瘤组织。优选地，通过以所示顺序执行的步骤来执行该方法。而且，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。
如本文所用，术语“对象”涉及动物，优选农场动物或宠物，更优选哺乳动物，最优选人。优选地，对象是患有癌症的对象，更优选是如上所述的对象。
术语“治疗”是指在很大程度上改善本文提及的疾病或病症或伴随它的症状。如本文所用的所述治疗还优选包括就本文提及的疾病或病症而言完全恢复健康。应理解的是，根据本发明使用的治疗可能并非对所有待治疗的对象都有效。然而，该术语应该优选地要求，可以成功治疗统计学显著比例的患有本文提及的疾病或病症的对象。本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具例如确定置信区间、p值确定、t检验、Mann-Whitney检验等，可以毫不费力地确定比例是否具有统计学意义。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，治疗应对给定队列或群体的对象的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％有效。
如本文所用的术语“免疫调节”涉及诱导对象的免疫系统作用于抗原的程度的变化。优选地，免疫调节是激活。优选地，抗原是肿瘤抗原，更优选是肿瘤特异性抗原，即优选地，仅由对象的肿瘤细胞表达和/或呈递的抗原。更优选地，调节对象的免疫应答是诱导NK细胞分泌TNF-α，最优选诱导NK细胞成熟，优选如上所述。
本发明还涉及向对象提供HMGB1治疗以避免诱发不良事件的方法，优选避免诱导细胞因子释放综合征(CRS)的方法，其包括
a)向所述对象施用提供HMGB1的试剂
b)确定患者样品中的不良事件，优选CRS的至少一个参数，
c)继续施用提供HMGB1的试剂与提供HMGB1的替代试剂，
其中在步骤b)中确定的所述参数指示不良事件，优选CRS的概率增加的情况下，所述提供HMGB1的替代试剂提供HMGB1多肽，该HMGB1多肽具有降低的诱导TNF-α分泌的活性和/或降低的诱导NK细胞杀伤细胞的活性；和/或
其中在步骤b)中确定的所述参数指示不良事件，优选CRS的概率降低的情况下，所述提供HMGB1的替代试剂提供HMGB1多肽，该HMGB1多肽具有增加的诱导TNF-α分泌的活性和/或增加的诱导NK细胞杀伤细胞的活性；
d)由此向对象提供HMGB1治疗以避免不良事件，优选避免诱导CRS。
优选地，具有降低的诱导TNF-α分泌的活性和/或降低的诱导NK细胞杀伤细胞的活性的HMGB1多肽是实施方案5的HMGB1多肽，优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多肽。还优选地，具有增加的诱导TNF-α分泌的活性和/或增加的诱导NK细胞杀伤细胞的活性的HMGB1多肽是实施方案4的HMGB1多肽，优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8的多肽。优选地，CRS的参数是TNF-α浓度。
此外，本发明涉及调节对象的免疫应答的方法，其包括：
a)向所述对象施用提供HMGB1多肽的试剂，其中所述HMGB1多肽是根据本发明的多肽，并且由此
b)调节所述对象的免疫应答。
优选地，所述调节对象的免疫应答是诱导NK细胞分泌TNF-α，优选诱导NK细胞成熟，优选如上文所述。
此外，本发明涉及在其内部包含根据本发明的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的试剂盒。
这里使用的术语“试剂盒”是指包括至少上述方法的单独或组合提供的集合，优选在单个容器内提供。容器还优选地包含用于实施本发明方法的说明书。优选地，以“即用”方式提供试剂盒的组分，例如相应地调整浓度等。优选地，还包括自然杀伤细胞(NK细胞)和/或用于其分离的装置。用于分离NK细胞的方法是特异用于分离NK细胞的方法，且特别包括特异性结合NK细胞的抗体。
鉴于以上所述，以下实施方案是优选的：
1.一种高迁移率族框1(HMGB1)多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将对应于SEQID NO：1的氨基酸第22位、第57位、第68位和第75位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2-氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6-二氨基-6-氧代己酸)的氨基酸残基。
2.根据实施方案1所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸残基。
3.根据实施方案1或2所述的HMGB1多肽，在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基或替换为谷氨酰胺残基。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酰胺残基。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽包含与SEQID NO：1具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列，和/或包含与SEQ ID NO：3具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽包含与SEQID NO：5至SEQ ID NO：8，优选与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列；优选包含SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8的核酸序列，优选SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的核酸序列。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽衍生自人HMGB1多肽。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽是非天然存在的。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导培养的SW480细胞中细胞死亡的增加。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导培养的SW480细胞中细胞死亡的增加。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述细胞死亡增加至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导NK-92CI细胞对培养的SW480细胞的杀伤增加。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导NK-92CI细胞对培养的SW480细胞的杀伤增加。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述杀伤增加至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，最优选至少20％。
16.根据实施方案1至15中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽增加培养的NK-92CI细胞的肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽增加培养的NK-92 CI细胞的肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌。
18.根据实施方案1至17中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述TNF-α分泌增加至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，最优选至少增加至少50％。
19.一种多核苷酸，其编码根据实施方案2至18中任一项所述的多肽。
20.一种载体，其包含根据实施方案19所述的多核苷酸。
21.一种宿主细胞，其包含根据实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸和/或根据实施方案20所述的载体。
22.根据实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸、根据实施方案20所述的载体、和/或根据实施方案21所述的宿主细胞，其用作药物。
23.根据实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸、根据实施方案20所述的载体、和/或根据实施方案21所述的宿主细胞，其用于治疗癌症和/或免疫调节。
24.根据实施方案23的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和免疫调节包括细胞癌症免疫疗法。
25.根据实施方案23的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和/或免疫调节包括诱导NK细胞分泌TNF-α，优选诱导NK细胞成熟。
26.根据实施方案23的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和/或免疫调节包括避免诱导不良事件，优选包括避免诱导细胞因子释放综合征(CRS)。
27.一种用于在对象中治疗癌症和/或诱导免疫调节的方法，其包括：
a)使所述对象与实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸、根据实施方案20所述的载体、和/或根据实施方案21所述的宿主细胞接触，并且由此
b)在所述对象中治疗癌症和/或诱导免疫调节。
28.一种向对象提供HMGB1治疗以避免诱导不良事件，优选避免诱导细胞因子释放综合征(CRS)的方法，其包括
a)向所述对象施用提供HMGB1的试剂
b)确定患者样品中的不良事件，优选CRS的至少一个参数，
c)继续施用提供HMGB1的试剂与提供HMGB1的替代试剂，
其中在步骤b)中确定的所述参数指示不良事件，优选CRS的概率增加的情况下，所述提供HMGB1的替代试剂提供HMGB1多肽，该HMGB1多肽具有降低的诱导TNF-α分泌的活性和/或降低的诱导NK细胞杀伤细胞的活性；和/或
其中在步骤b)中确定的所述参数指示不良事件，优选CRS的概率降低的情况下，所述提供HMGB1的替代试剂提供HMGB1多肽，该HMGB1多肽具有增加的诱导TNF-α分泌的活性和/或增加的诱导NK细胞杀伤细胞的活性；
d)由此向对象提供HMGB1治疗以避免不良事件，优选避免诱导CRS。
29.根据实施方案28所述的方法，其中具有降低的诱导TNF-α分泌的活性和/或降低的诱导NK细胞杀伤细胞的活性的HMGB1多肽是实施方案5的HMGB1多肽。
30.根据实施方案28或29所述的方法，其中具有增加的诱导TNF-α分泌的活性和/或增加的诱导NK细胞杀伤细胞的活性的HMGB1多肽是实施方案4的HMGB1多肽。
31.根据实施方案28至30中任一项所述的方法，其中所述CRS的参数是TNF-α浓度。
32.一种调节对象的免疫应答的方法，其包括
a)向所述对象施用提供HMGB1多肽的试剂，其中所述HMGB1多肽是根据实施方案1至18中任一项所述的多肽，并且由此
b)调节所述对象的免疫应答。
33.根据实施方案32所述的方法，其中所述调节对象的免疫应答是诱导NK细胞分泌TNF-α，优选诱导NK细胞成熟。
34.一种试剂盒，其在内部中包含根据实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸、根据实施方案20所述的载体、和/或根据实施方案21所述的宿主细胞。
35.根据实施方案34所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含自然杀伤细胞(NK细胞)和/或用于其分离的装置。
36.根据实施方案34或35所述的试剂盒，其中所述杀伤细胞是识别肿瘤的NK细胞。
37.根据实施方案1至18中任一项所述的多肽、根据实施方案19所述的多核苷酸、根据实施方案20所述的载体和/或根据实施方案21所述的宿主细胞在制备药物中的用途，优选在制备用于治疗癌症和/或用于免疫调节的药物中的用途。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用并入本文，该引用涉及其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容。
附图说明
图1：Glu-HMGB1有效激活自然杀伤细胞(NK-92CI)(n＝3，p＜0.05)。WT＝HMGB1WT、E-变体＝Glu-HMGB1(SEQ ID NO：8)、Q-变体＝Gln-HMGB1(SEQ ID NO：6)。
以下实施例仅用于说明本发明。它们不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：方法
Cr-51释放试验
将SW480结肠癌细胞在96孔板(20000个细胞/孔)中培养并用51Cr(25μCi/孔)标记2小时。然后用HMGB1和NK细胞处理细胞24小时。除去培养基并计数放射性(cpm1)。将细胞用培养基洗涤4次并用100μl的0.5N NaOH溶解。计数裂解物的放射性(cpm2)。
放射性计数
将样品与10ml UltimaGold混合并在液体闪烁计数器中对样品进行计数。
细胞死亡的计算：
GluHMGB1、GlnHMGB1和野生型HMGB1的产生
将编码所有四个B框结构域酪氨酸残基分别被谷氨酸或谷氨酰胺残基替代的HMGB1多肽的质粒转染到HEK细胞中(无血清悬浮细胞培养物，1000ml(约2.5×106个细胞/ml)，然后补充丙戊酸)。为了产生野生型HMGB1，B框结构域在其酪氨酸残基上未被修饰。将细胞沉淀均质化并通过IMAC和TALON(Clontech)树脂对其进行纯化，并使用咪唑进行洗脱。通过SDS-PAGE(考马斯染色)分析15种洗脱物。在收集阳性洗脱物后，对蛋白质进行凝胶过滤(Superdex)，最后通过SDS-PAGE对其进行分析。在实验中使用800nM的经纯化蛋白。
NK细胞的激活
使用经800nM指定的HMGB1蛋白刺激24小时的400000个NK细胞，通过检测TNF-α向上清液中的释放来测量自然杀伤细胞系NK-92CI的激活。根据制造商的说明，用ELISA试剂盒(Avia Systems Biology，目录号OKAA00027_96W)进行TNF-α的检测。
实施例2：结果和讨论
不同的HMGB1形式显示出对癌细胞的不同的细胞毒性，并且显示出针对癌细胞的自然杀伤细胞毒性增强和NK细胞激活增强的差异
使用用于评估24小时的HMGB1细胞毒性非常短的时间和用于检测细胞死亡的高灵敏度的51Cr(铬51)释放金标准测定，我们揭示了在B框结构域上进行了修饰的不同HMGB1形式的令人惊讶的新细胞毒性谱。与野生型HMGB1相比，Gln-HMGB1显示出43％以上的针对癌细胞的细胞死亡率，而与野生型HMGB1相比，Glu-HMGB1甚至显示出83％以上的细胞死亡率(表1)。
接下来，将效应(E)细胞(NK-92 CI，自然杀伤细胞系)与51Cr标记的靶(T)细胞(SW480结肠癌细胞)以各种E∶T比例：5∶1、10∶1和20∶1进行孵育(表1)。与没有刺激的NK细胞裂解活性相比，Gln-HMGB1加NK细胞显示出针对癌细胞的高达55％以上的细胞死亡率，而与没有刺激的NK细胞裂解活性相比，Glu-HMGB1显示出针对癌细胞的高达94％以上的细胞死亡率(E∶T分别为5∶1)(表1)。此外，与经野生型HMGB1刺激后的NK细胞裂解活性相比，Gln-HMGB1加NK细胞显示出针对癌细胞的达到13％以上的细胞死亡率，而与经野生型HMGB1刺激后的NK细胞裂解活性相比，Glu-HMGB1显示出针癌细胞的高达25％以上的细胞死亡率(E∶T分别为5∶1)(表1)。
总之，三种不同的HMGB1同种型显示出不同的细胞毒性谱。在针对癌细胞的细胞毒性方面和针对癌细胞的NK细胞裂解活性的增强方面，Glu-HMGB1优于野生型HMGB1和Gln-HMGB1。在针对癌细胞的细胞毒性方面和针对癌细胞的NK细胞裂解活性的增强方面，Gln-HMGB1优于野生型HMGB1。因此，与Glu-HMGB1和Gln-HMGB1相比，野生型HMGB1显示出最差的细胞毒性谱。Gln-HMGB1仍针对癌细胞发挥强烈的细胞毒性(尽管低于Glu-HMGB1)，其中NK细胞裂解活性中度增强(处于野生型HMGB1(低NK细胞裂解活性)和Glu-HMGB1(高NK细胞裂解活性)之间的活性)。
此外，三种不同的HMGB1同种型在激活NK细胞中显示出不同的活性。我们测量了由HMGB1刺激而激活后NK-92 CI细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。Glu-HMGB1最有效地刺激TNF-α的分泌，因此最有效地激活NK细胞成为结合剂和杀伤剂。
因此，通过应用不同形式的HMGB1、Glu-HMGB1和Gln-HMGB1，在癌症治疗中可以调节(i)针对癌细胞的直接细胞毒性，(ii)针对肿瘤附近的癌细胞的NK细胞细胞毒性，和(iii)循环NK细胞的整体活化(将它们转换成结合剂和杀伤剂)，从而促进NK细胞向肿瘤的聚集。本文显示的结果表明，与野生型HMGB1相比，Glu-HMGB1和Gln-HMGB1本身或与细胞免疫疗法(例如NK细胞)组合的Glu-HMGB1和Gln-HMGB1显示出针对癌细胞的增强的细胞毒性。
对于GluHMGB1和GlnHMGB1，临床医生具备可以在基于HMGB1的癌症治疗期间调节免疫系统的一般激活(例如，分泌不同细胞因子例如TNF-α的NK细胞的激活)的工具。根据所需的激活状态或所需的细胞因子血浆水平(例如TNF-α)，Glu-HMGB1可用于免疫系统的强烈激活和增强的细胞因子释放，而Gln-HMGB1可用于免疫系统的中度激活和中度细胞因子释放(例如来自NK细胞)。与野生型HMGB1相比，通过组合Glu-HMGB1和Gln-HMGB1，可以增强或减少细胞因子的释放，同时总是具有针对癌细胞的增加的直接细胞毒性，和对肿瘤附近的癌细胞的NK细胞细胞毒性。
表1：使用NK-92 CI自然杀伤细胞和SW480结肠癌细胞加HMGB1进行Cr-51释放测定(n＝3，＊p＜0.05)。

Claims (21)

1.一种高迁移率族框1(HMGB1)多肽，其中在HMGB1多肽中，已经将对应于SEQ ID NO：1的氨基酸第22位、第57位、第68位和第75位的位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、高谷氨酸(2-氨基己二酸)和高谷氨酰胺(2，6-二氨基-6-氧代己酸)的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为独立地选自谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基或替换为谷氨酰胺残基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酸残基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的HMGB1多肽，其中在所述HMGB1多肽中，已经将所述位置处的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，最优选所有四个酪氨酸残基替换为谷氨酰胺残基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽包含与SEQ IDNO：1具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列；和/或包含与SEQ ID NO：3具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽包含与SEQ IDNO：5至SEQ ID NO：8中的至少一种，优选SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选95％，最优选至少98％的序列同一性的核酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽衍生自人HMGB1多肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的HMGB1多肽，其中所述HMGB1多肽是非天然存在的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的HMGB1多肽，其中与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，优选由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽相比，在0.8μM的浓度下，所述HMGB1多肽诱导培养的SW480细胞中细胞死亡的增加。
11.一种多核苷酸，其编码根据权利要求2至10中任一项所述的多肽。
12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的多肽、根据权利要求11所述的多核苷酸和/或根据权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽、根据权利要求11所述的多核苷酸、根据权利要求12所述的载体、和/或根据权利要求13所述的宿主细胞，其用作药物。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽、根据权利要求11所述的多核苷酸、根据权利要求12所述的载体、和/或根据权利要求13所述的宿主细胞，其用于治疗癌症和/或免疫调节。
16.根据权利要求15所述的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和免疫调节包括细胞癌症免疫疗法。
17.根据权利要求15或16所述的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和/或免疫调节包括诱导NK细胞分泌TNF-α，优选诱导NK细胞成熟。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，其中所述用于治疗癌症和/或免疫调节包括避免诱导不良事件，优选包括避免诱导细胞因子释放综合征(CRS)。
19.一种试剂盒，其内部包含根据权利要求1至10中任一项所述的多肽、根据权利要求11所述的多核苷酸、根据权利要求12所述的载体、和/或根据权利要求13所述的宿主细胞。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含自然杀伤细胞(NK细胞)和/或用于其分离的装置。
21.根据权利要求19或20所述的试剂盒，其中所述杀伤细胞是识别肿瘤的NK细胞。
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