PT1587828E - Proteínas defensinas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DEFENSINAS"

Esta invenção refere-se à proteína INSP109, aqui identificada como uma proteína segregada, em particular, como um membro da família defensina de proteínas e à utilização desta proteína e sequências de ácido nucleico do gene que a codifica no diagnóstico, prevenção e tratamento de doença.

Antecedentes 0 processo de descoberta de fármacos está presentemente a sofrer uma revolução fundamental à medida que a era da genómica funcional atinge a maioridade. 0 termo "genómica funcional" aplica-se a uma abordagem que utiliza ferramentas bioinformáticas para imputar funções a sequências de proteína de interesse. Tais ferramentas estão a tornar-se cada vez mais necessárias já que a velocidade de geração de dados de sequências está a ultrapassar rapidamente a capacidade dos laboratórios de investigação para atribuir funções a estas sequências de proteínas. À medida que as ferramentas bioinformáticas aumentam de potência e exactidão, elas estão a substituir rapidamente as técnicas convencionais de caracterização bioquímica. Na realidade, as ferramentas bioinformáticas utilizadas na identificação da presente invenção são agora capazes de produzir resultados nos quais se pode colocar um grau de confiança elevado. 2 Várias instituições e organizações comerciais estão a examinar dados de sequências à medida que estes se tornam disponíveis e estão a ser efectuadas descobertas significativas numa base contínua. No entanto, permanece uma necessidade contínua para identificar e caracterizar mais genes e os polipéptidos que eles codificam, como alvos para investigação e para a descoberta de fármacos.

Introdução

Proteínas Segregadas A capacidade das células para produzir e segregar proteínas extracelulares é nuclear para muitos processos biológicos. Enzimas, factores de crescimento, proteínas da matriz extracelular e moléculas de sinalização são todas segregadas por células. Isto ocorre através da fusão de uma vesícula secretora com a membrana do plasma. Na maioria dos casos, mas não em todos, as proteínas são orientadas para o retículo endoplasmático e para as vesículas secretoras por um péptido sinal. Os péptidos sinal são sequências cis-activas que afectam o transporte de cadeias de polipéptidos do citoplasma para um compartimento ligado à membrana, como uma vesícula secretora. Os polipéptidos que são direccionados para as vesículas secretoras são segregados para a matriz extracelular ou são retidos na membrana do plasma. Os polipéptidos que são retidos na membrana do plasma terão um ou mais domínios transmembranares. Exemplos de proteínas segregadas que desempenham um papel central no funcionamento de uma célula são as citoquinas, hormonas, proteínas da matriz extracelular (moléculas de adesão), proteases e factores de crescimento e diferenciação. Segue- 3 se a descrição de algumas das propriedades destas proteínas.

Defensinas

As defensinas fazem parte do sistema imunitário inato do corpo que actua contra a invasão de agentes patogénicos estranhos. As defensinas de mamíferos estão divididas em três categorias; alfa, beta e teta, com base no padrão de ligações dissulfureto. As INSP108 e INSP109 caem na categoria beta. Estas proteínas são catiónicas e ricas em arginina e partilham uma estrutura terciária típica apesar das diferenças na estrutura primária. Elas consistem de três folhas beta antiparalelas ligadas por ansas, e um gancho beta com propriedades hidrófobas que se projecta ortogonalmente.

Foi demonstrado que estas proteínas têm um espectro de actividade alargado que vai desde as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas até às micobactérias, fungos e até mesmo vírus com envelope. Elas ligam-se às membranas celulares carregadas negativamente ricas em fosfolípidos de micróbios e provocam a sua ruptura, se bem que ainda tenha de ser determinado o seu modo de acção exacto.

Concentrações elevadas são citotóxicas para células de mamíferos, embora tenha sido demonstrado que concentrações menores promovem o crescimento em células epiteliais e fibroblastos, sugerindo assim um papel na cicatrização de feridas. Também foi demonstrado que as defensinas são quimiotácticas para monócitos, leucócitos polimorfonucleares e células T. Foi demonstrado in vitro que as defensinas são activas contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium e Candida albicans. 4 0 conhecimento crescente destas proteínas é por isso de extrema importância para aumentar a compreensão das vias subjacentes que conduzem aos estados patológicos e estados patológicos associados mencionados acima, e para desenvolver terapias génicas e/ou farmacológicas mais eficazes para tratar estes distúrbios.

Foi descoberto um número de proteínas da família das defensinas. A W002/04487 divulga as sequências de 25 genes e polipéptidos de defensinas humanas. Schutte et al. (2002) PNAS 99:2129 divulga cinco aglomerados de genes de defensinas descobertos utilizando uma pesquisa computacional. A WO03/024992 divulga as sequências de 34 genes de defensinas beta no genoma humano e 48 no genoma de rato. Harder et al. (1997) Nature 387: 861 divulga uma outra proteína defensina beta humana.

A INVENÇÃO

Um polipéptido de acordo com o primeiro aspecto da invenção: compreende a sequência de aminoácidos como especificada na SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 16.

Noutra forma de realização deste primeiro aspecto da invenção é proporcionado um polipéptido o qual: (i) consiste da sequência de aminoácidos como especificada na SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 16. O polipéptido com a sequência explicitada na SEQ ID NO: 14 é doravante referido como o "polipéptido INSP109". 5

Embora o Requerente não queira ficar limitado por esta teoria, é postulado que os primeiros 21 aminoácidos do polipéptido INSP109 formam um péptido sinal. A sequência do polipéptido INSP109 completo sem esta sequência sinal postulada é explicitada na SEQ ID NO: 16. 0 polipéptido com a sequência explicitada na SEQ ID NO: 16 é doravante referido como "o polipéptido INSP109 maduro". 0 termo "polipéptidos INSP109" como aqui utilizado inclui polipéptidos compreendendo o polipéptido INSP109 e o polipéptido INSP109 maduro.

Por "funciona como um membro da família de defensinas," nós referimo-nos a polipéptidos que compreendem sequências de aminoácidos ou características estruturais que podem ser identificadas como características conservadas nos polipéptidos da família de defensinas, pelo que a interacção do polipéptido com o receptor ou ligando não é substancialmente afectada de modo prejudicial em comparação com a função do polipéptido natural completo. Em particular, nós referimo-nos à presença de resíduos de cisteína em posições específicas do polipéptido que permitem a formação de ligações dissulfureto intradomínio. A capacidade para funcionar como uma defensina pode ser medida utilizando os ensaios descritos por Nizet et al. (Nature 2001, 414:454-457) e Cole et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 2002, 99(4):1813-1818).

Num segundo aspecto, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico purificada a qual codifica um polipéptido do primeiro aspecto da invenção. 6

Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico purificada compreende a sequência de ácido nucleico como especificada na SEQ ID NO: 13 (que codifica o polipéptido INSP109) e/ou SEQ ID NO: 15 (que codifica o polipéptido INSP109 maduro) ou é um equivalente redundante de qualquer uma destas sequências. A invenção proporciona ainda que a molécula de ácido nucleico purificada consiste da sequência de ácido nucleico como especificada na SEQ ID NO: 13 (que codifica o polipéptido INSP109) e/ou SEQ ID NO: 15 (que codifica o polipéptido INSP109 maduro).

Num terceiro aspecto, a invenção proporciona um vector, como um vector de expressão, que contém uma molécula de ácido nucleico do segundo ou terceiro aspecto da invenção.

Num quarto aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira transformada com um vector do quarto aspecto da invenção.

Num quinto aspecto, a invenção proporciona um ligando o qual se liga especificamente a membros de proteínas da família de defensinas do primeiro aspecto da invenção. Preferencialmente, o ligando inibe a função de um polipéptido do primeiro aspecto da invenção o qual é um membro da família defensina de proteínas. Os ligandos para um polipéptido de acordo com a invenção são anticorpos.

Num sexto aspecto, a invenção proporciona um polipéptido do primeiro aspecto da invenção, ou uma molécula de ácido nucleico do segundo aspecto da invenção, ou um vector do 7 terceiro aspecto da invenção, ou uma célula hospedeira do quarto aspecto da invenção para utilização na terapia de doenças nas quais estão implicados membros da família de defensinas. Tais doenças podem incluir distúrbios proliferativos de células, incluindo neoplasma, melanoma, tumores do pulmão, colorrectal, da mama, do pâncreas, da cabeça e pescoço e outros tumores sólidos; distúrbios mieloproliferativos, como leucemia, linfoma não Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, distúrbio de angiogénese, sarcoma de Kaposis; distúrbios autoimunes/inflamatórios, incluindo alergia, doença inflamatória do intestino, artrite, psoríase e inflamação do aparelho respiratório, asma e rejeição de transplante de órgão; distúrbios cardiovasculares, incluindo hipertensão, edema, angina, aterosclerose, trombose, sepsia, choque, lesão de reperfusão e isquemia; distúrbios neuronais incluindo doença do sistema nervoso central, doença de Alzheimer, lesão cerebral, esclerose lateral amiotrófica e dor; distúrbios do desenvolvimento; distúrbios metabólicos incluindo diabetes mellitus, osteoporose e obesidade, SIDA e doença renal; infecções incluindo infecção virai, infecção bacteriana, infecção fúngica e infecção parasitária e outras condições patológicas. Preferencialmente, a doença é uma na qual está implicada a família defensina de proteínas, como endotoxemia subletal, choque séptico, infecção microbiana da cavidade amniótica, reacção de Jarish-Herxheimer de febre recorrente, doenças infecciosas do sistema nervoso central, pancreatite aguda, colite ulcerosa, empiema, síndrome hemolítica de Gasser, doença meningocóccica, infecção gástrica, tosse convulsa, peritonite, psoríase, artrite reumatóide, sepsia, asma, HIV, SIDA e glomerulonefrite. Estas moléculas também podem ser utilizadas no fabrico de um medicamento para o tratamento de tais doenças.

Num sétimo aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido do primeiro aspecto da invenção, ou uma molécula de ácido nucleico do segundo aspecto da invenção, ou um vector do terceiro aspecto da invenção, ou uma célula hospedeira do quarto aspecto da invenção, conjuntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Abaixo é dado um resumo das técnicas e procedimentos correntes que podem ser empregues para utilizar a invenção. Entender-se-á que esta invenção não se restringe à metodologia, protocolos, linhas de células, vectores e reagentes particulares descritos. Entender-se-á também que a terminologia aqui utilizada é apenas para efeitos de descrever formas de realização particulares e não se pretende que esta terminologia limite o âmbito da presente invenção. 0 âmbito da invenção é limitado apenas pelos termos das reivindicações apensas.

Nesta especificação são utilizadas abreviaturas correntes para nucleótidos e aminoácidos. A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de ADN recombinante e imunologia, as quais estão dentro da perícia dos que trabalham na técnica.

Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura. Exemplos de textos particularmente adequados para consulta 9 incluem os seguintes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D. N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente os volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller e Μ. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer e Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N. Y.); e Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds. 1986).

Como aqui utilizado, o termo "polipéptido" inclui qualquer péptido ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é péptidos isosteres. Este termo refere-se tanto a cadeias curtas (péptidos e oligopéptidos) e a cadeias mais longas (proteínas). 0 polipéptido da presente invenção pode estar na forma de uma proteína madura ou pode ser uma pré-, pro- ou pré-pro-proteína que pode ser activada por dissociação da pré-, pro- ou pré-pro-porção para produzir um polipéptido maduro activo. Nesses polipéptidos, a pré-, pro- ou pré-pro-sequência pode ser uma sequência líder ou secretora ou pode 10 ser uma sequência que é empregue para purificação da sequência de polipéptido maduro. O polipéptido do primeiro aspecto da invenção pode fazer parte de uma proteína de fusão. Por exemplo, é frequentemente vantajoso incluir uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais as quais podem conter sequências secretoras ou líder, pró-sequências, sequências que ajudam na purificação, ou sequências que conferem maior estabilidade à proteína, por exemplo durante produção recombinante. Alternativamente ou adicionalmente, o polipéptido maduro pode ser fundido com outro composto, como um composto para aumentar a semivida do polipéptido (por exemplo, polietileno glicol).

Os polipéptidos podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados pelos genes, modificados por processos naturais, como por processamento pós-tradução ou por técnicas de modificação química as quais são bem conhecidas na técnica. Entre as modificações conhecidas que podem estar geralmente presentes nos polipéptidos da presente invenção estão a glicosilação, ligação de lípidos, sulfatação, gama-carboxilação, por exemplo de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Outras modificações potenciais incluem acetilação, acilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma unidade heme, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de um derivado de lípido, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação cruzada, ciclização, formação de ligação dissulfureto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, formação de âncora GPI, iodação, 11 metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, adição de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferência como arginilação e ubiquitinação.

As modificações podem ocorrer em qualquer parte num polipéptido, incluindo na estrutura peptídica, nas cadeias laterais de aminoácidos e nas extremidades amino ou carboxi-terminais. De facto, o bloqueio das extremidades amino ou carboxi-terminais num polipéptido, ou de ambas, por uma modificação covalente é comum em polipéptidos naturais e sintéticos e tais modificações podem estar presentes nos polipéptidos da presente invenção.

As modificações que ocorrem num polipéptido serão frequentemente uma função do modo como o polipéptido é feito. Para polipéptidos que são feitos de modo recombinante, a natureza e extensão das modificações serão, em grande medida, determinadas pela capacidade de modificação pós-tradução da célula hospedeira particular e pelos sinais de modificação que estão presentes na sequência de aminoácidos do polipéptido em questão. Por exemplo, os padrões de glicosilação variam entre tipos diferentes de células hospedeiras.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser preparados de qualquer modo adequado. Esses polipéptidos incluem polipéptidos naturais isolados (por exemplo purificados de culturas de células), polipéptidos produzidos de modo recombinante (incluindo proteínas de fusão), polipéptidos produzidos sinteticamente ou polipéptidos que são produzidos por uma combinação destes métodos. 12

Dois polipéptidos são referidos como sendo "homólogos", como o termo é aqui utilizado, se a sequência de um dos polipéptidos tem um grau de identidade ou semelhança suficientemente elevado com a sequência do outro polipéptido. "Identidade" indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o residuo de aminoácido é idêntico entre as sequências. "Semelhança" indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o residuo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Os graus de identidade e semelhança podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

Por conseguintes, os polipéptidos homólogos incluem variantes biológicas naturais (por exemplo, variantes alélicas ou variações geográficas dentro da espécie da qual os polipéptidos são derivados) e mutantes (como mutantes contendo substituições, inserções ou supressões de aminoácido) do polipéptido INSP109. Tais mutantes podem incluir polipéptidos nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácido estão substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferencialmente um resíduo de aminoácido conservado) e esse resíduo de aminoácido substituído pode ser ou não codificado pelo código genético. As substituições típicas desse tipo são entre Ala, Vai, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre os resíduos 13 ácidos Asp e Glu; entre Asn e Gin; entre os resíduos básicos Lys e Arg; ou entre os resíduos aromáticos Phe e Tyr. São particularmente preferidas variantes nas quais estão substituídos, suprimidos ou adicionados vários, isto é entre 5 e 10, 1 e 5, 1 e 3, 1 e 2 ou apenas 1, aminoácidos em qualquer combinação. São especialmente preferidas as substituições, adições e supressões silenciosas, as quais não alteram as propriedades e actividades da proteína. A este respeito também são especialmente preferidas as substituições conservadoras. Tais mutantes também incluem polipéptidos nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte.

Como aqui utilizado, o termo "fragmento" refere-se a um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos que é igual a parte, mas não à totalidade, da sequência de aminoácidos do polipéptido INSP 109. Os fragmentos deveriam compreender pelo menos n aminoácidos consecutivos da sequência e, dependendo da sequência particular, n é preferencialmente 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou mais). Os fragmentos pequenos podem formar um determinante antigénico.

Os fragmentos do polipéptido INSP109 completo podem consistir de combinações de 1 ou 2 de sequências exões vizinhas na sequência do polipéptido INSP109, respectivamente. Por exemplo, tais combinações incluem os exões 1 e 2 do polipéptido INSP 108.

Tais fragmentos podem ser "isolados", isto é não fazem parte ou não estão fundidos a outros aminoácidos ou polipéptidos, ou eles podem estar compreendidos num 14 polipéptido maior nos quais eles constituem uma parte ou região. Quando compreendido num polipéptido maior, o fragmento pode formar uma única região continua. Por exemplo, um fragmento possuindo uma região pré- e/ou pro-polipéptido fundida à extremidade amino-terminal do fragmento e/ou uma região adicional fundida à extremidade carboxi-terminal do fragmento. No entanto, vários fragmentos podem ser compreendidos num único polipéptido maior.

Os polipéptidos da presente invenção ou os seus fragmentos imunogénicos (compreendendo pelo menos um determinante antigénico) podem ser utilizados para produzir ligandos, como anticorpos policlonais ou monoclonais, que são imunoespecificos para os polipéptidos. Tais anticorpos podem ser utilizados para isolar ou para identificar clones que expressam os polipéptidos da invenção ou para purificar os polipéptidos por cromatografia de afinidade. Os anticorpos também podem ser utilizados como auxiliares de diagnóstico ou terapêuticos, entre outras aplicações, como será evidente para o leitor especialista. 0 termo "imunoespecifico" significa que os anticorpos têm uma afinidade consideravelmente maior para os polipéptidos da invenção do que a sua afinidade para outros polipéptidos relacionados da técnica antecedente. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas intactas bem como a fragmentos destas, como Fab, F(ab')2 e Fv, os quais são capazes de se ligar ao determinante antigénico em questão. Tais anticorpos ligam-se assim aos polipéptidos do primeiro aspecto da invenção. 15

Por "afinidade consideravelmente maior" nós queremos dizer que existe um aumento mensurável na afinidade para um polipéptido da invenção em comparação com a afinidade para proteínas segregadas conhecidas.

Preferencialmente, a afinidade é pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes, 106 vezes ou maior para um polipéptido da invenção do que para proteínas segregadas conhecidas tais como os membros da família defensina de proteínas.

Se foram desejados anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado, como um rato, coelho, cabra ou cavalo, pode ser imunizado com um polipéptido do primeiro aspecto da invenção. O polipéptido utilizado para imunizar o animal pode ser obtido por tecnologia de ADN recombinante ou pode ser sintetizado quimicamente. Se desejado, o polipéptido pode ser conjugado com uma proteína portadora. Os portadores geralmente utilizados aos quais os polipéptidos podem ser quimicamente acoplados incluem albumina de soro bovino, tiroglobulina e hemocianina de lapa de líster. O polipéptido acoplado é depois utilizado para imunizar o animal. O soro do animal imunizado é recolhido e tratado segundo procedimentos conhecidos, por exemplo por imunocromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais para os polipéptidos do primeiro aspecto da invenção também podem ser facilmente produzidos por um especialista na técnica. A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais utilizando tecnologia de hibridoma é bem conhecida (ver, por exemplo, Kohler, G. e Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al. , Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 in 16

Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra os polipéptidos do primeiro aspecto da invenção podem ser rastreados no que se refere a várias propriedades, isto é, quanto ao isotipo, epítopo, afinidade, etc. Os anticorpos monoclonais são particularmente úteis na purificação dos polipéptidos individuais contra os quais eles são diriqidos. Alternativamente, os qenes que codificam os anticorpos monoclonais de interesse podem ser isolados de hibridomas, por exemplo por técnicas de PCR conhecidas na técnica, e clonados e expressados em vectores apropriados.

Também podem ser de utilidade os anticorpos quiméricos, nos quais regiões variáveis não humanas são unidas ou fundidas regiões constantes humanas (ver, por exemplo, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,3439 (1987)). 0 anticorpo pode ser modificado para o tornar menos imunogénico num indivíduo, por exemplo por humanização (ver

Jones et al., r Nature, 321, 522 (1986) ; Verhoeyen et al. Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al . , J. Immunol., 147 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 86 10029 (1989); German et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA, 88 34181 (1991); e Hodgson et ai., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). 0 termo "anticorpo humanizado", como aqui utilizado, refere-se a moléculas de anticorpo nas quais os aminoácidos CDR e outros aminoácidos seleccionados dos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve de um anticorpo doador não humano foram substituídos no lugar dos aminoácidos equivalentes num anticorpo humano. 0 anticorpo 17 humanizado assemelha-se assim de perto a um anticorpo humano mas tem a capacidade de ligação do anticorpo doador.

Numa outra alternativa, o anticorpo pode ser um anticorpo "biespecifico", isto é um anticorpo possuindo dois domínios de ligação de antigénio diferentes, sendo cada domínio dirigido contra um epítopo diferente.

Pode utilizar-se a tecnologia de apresentação de fagos para seleccionar genes que codificam anticorpos com actividades de ligação para os polipéptidos da invenção quer a partir de repertórios de genes V, amplificados por PCR, de linfócitos de humanos rastreados quanto à presença de anticorpos relevantes, quer a partir de bibliotecas naturais (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). A afinidade destes anticorpos também pode ser melhorada por rearranjo da cadeia (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624-628) .

Os anticorpos gerados pelas técnicas anteriores, quer policlonais ou monoclonais, têm utilidade adicional pelo facto de poderem ser utilizados como reagentes em imunoensaios, radioimunoensaios (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Nestas aplicações, os anticorpos podem ser marcados com um reagente analiticamente detectável como um radioisótopo, uma molécula fluorescente ou uma enzima.

As moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam uma sequência de polipéptido como especificada na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16. Estas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas nos 18 métodos e aplicações aqui descritas. As moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem preferencialmente pelo menos n nucleótidos consecutivos das sequências aqui divulgadas onde, dependendo da sequência particular, n é 10 ou mais (por exemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais) .

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem estar na forma de ARN, como ARNm, ou na forma de ADN, incluindo, por exemplo ADNc, ADN sintético ou ADN genómico. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser obtidas por clonagem, por técnicas de síntese química ou por uma combinação destas. As moléculas de ácido nucleico podem ser preparadas, por exemplo, por síntese química utilizando técnicas como síntese química de fosforamidite em fase sólida, de bibliotecas genómicas ou de ADNc ou por separação de um organismo. As moléculas de ARN podem ser geralmente geradas pela transcrição in vitro ou in vivo de sequências de ADN.

As moléculas de ácido nucleico podem ser de cadeia dupla ou cadeia simples. O ADN de cadeia simples pode ser a cadeia codificadora, também conhecida como a cadeia mensageira, ou pode ser de cadeia não codificadora, também referida como a cadeia antimensageira. O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui análogos de ADN e ARN, como aqueles que contêm cadeias estruturais modificadas, e ácidos nucleicos peptídicos (PNA). O termo "PNA", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula antimensageira ou um agente anti-gene o qual compreende um oligonucleótido de pelo menos cinco nucleótidos de comprimento ligado a uma estrutura peptídica de resíduos de 19 aminoácido, a qual termina preferencialmente em lisina. A lisina terminal confere solubilidade à composição. Os PNAs podem ser pegilados para prolongar o seu tempo de vida numa célula, onde eles preferencialmente se ligam de modo complementar a ADN de cadeia simples e ARN e param o alongamento do transcrito (Nielsen, P.E. et al (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

Uma molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipéptido desta invenção pode ser idêntica à sequência de codificação de uma ou mais das moléculas de ácido nucleico aqui divulgadas.

Estas moléculas também podem ter uma sequência diferente a qual, em consequência da degeneração do código genético, codifica um polipéptido como especificado na SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Tais moléculas de ácido nucleico podem incluir, mas não se restringem à sequência de codificação do próprio polipéptido maduro; à sequência de codificação do polipéptido maduro e sequências de codificação adicionais, como as que codificam uma sequência líder ou secretora, como uma sequência de pro-, pré- ou pré-pro-polipéptido; à sequência de codificação do polipéptido maduro, com ou sem as sequências de codificação adicionais supramencionadas, em conjunto com outras sequências não codificadoras adicionais, incluindo sequências não codificadoras 5' e 3', como as sequências transcritas, não traduzidas que desempenham um papel na transcrição (incluindo sinais de terminação), na ligação a ribossomas e na estabilidade de ARNm. As moléculas de ácido nucleico também podem incluir sequências adicionais que codificam aminoácidos adicionais, como aqueles que proporcionam funcionalidades adicionais. 20

Uma tal molécula de ácido nucleico pode ser uma variante natural como uma variante alélica natural, ou a molécula pode ser uma variante que não se sabe que ocorre naturalmente. Estas variantes não naturais da molécula de ácido nucleico podem ser preparadas por técnicas de mutagénese, incluindo as aplicadas a moléculas de ácido nucleico, células ou organismos.

Entre as variantes a este respeito encontram-se as variantes que diferem das moléculas de ácido nucleico supramencionadas por substituições, supressões ou inserções de nucleótidos. As substituições, supressões ou inserções podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas nas regiões de codificação ou não codificação ou ambas. As alterações nas regiões de codificação podem produzir substituições, supressões ou inserções de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras.

As moléculas de ácido nucleico da invenção também podem ser manipuladas, utilizando métodos geralmente conhecidos na técnica, para uma diversidade de razões, incluindo modificação da clonagem, processamento e/ou expressão do produto genético (o polipéptido). O rearranjo de ADN por fragmentação aleatória e reagrupamento por PCR de fragmentos de genes e oligonucleótidos sintéticos estão incluídos como técnicas que podem ser utilizadas para manipular as sequências de nucleótido. A mutagénese específica de um lócus pode ser utilizada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, alterar a preferência de códão, produzir variantes de excisão-união, introduzir mutações, etc. 21

As moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido do primeiro aspecto da invenção podem ser ligadas a uma sequência heteróloga para que a molécula de ácido nucleico combinado codifique uma proteína de fusão. Estas moléculas de ácido nucleico combinado estão incluídas no segundo aspecto da invenção. Por exemplo, para pesquisar bibliotecas de péptidos quanto à presença de inibidores da actividade do polipéptido, pode ser útil expressar, utilizando uma tal molécula de ácido nucleico combinado, uma proteína de fusão que possa ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser manipulada para conter um sítio de dissociação localizado entre a sequência do polipéptido da invenção e a sequência de uma proteína heteróloga para que o polipéptido possa ser dissociado e purificado da proteína heteróloga. São divulgadas moléculas de ácido nucleico antimensageiro que são parcialmente complementares às moléculas de ácido nucleico que codificam os polipéptidos da presente invenção e que por isso hibridizam com as moléculas de ácido nucleico codificadoras (hibridização). Tais moléculas antimensageiras, como os oligonucleótidos, podem ser concebidas para reconhecer, ligar-se especificamente e evitar a transcrição de um ácido nucleico alvo que codifica um polipéptido da invenção, como será conhecido pelo técnico médio na matéria (ver, por exemplo, Cohen, J. S., Trends in Pharm. Sei., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); 0'Connor, J. Neurochem 56,560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6,3073 (1979 ) ; Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991) . 22 0 termo "hibridização" como aqui utilizado refere-se à associação de duas moléculas de ácido nucleico uma à outra por ligações de hidrogénio. Tipicamente, uma molécula estará fixa a um suporte sólido e a outra estará livre em solução. Em seguida, as duas moléculas podem ser colocadas em contacto uma com a outra em condições que favorecem a ligação de hidrogénio. Os factores que afectam esta ligação incluem: o tipo e volume de solvente; temperatura da reacção; tempo de hibridização; agitação; agentes para bloquear a fixação não especifica da molécula na fase liquida ao suporte sólido (reagente de Denhardt ou BLOTTO); a concentração das moléculas; utilização de compostos para aumentar a velocidade de associação de moléculas (sulfato de dextrano ou polietileno glicol); e o rigor das condições de lavagem após hibridização (ver Sambrook et ai. [supra]). A inibição da hibridização de uma molécula completamente complementar à molécula alvo pode ser examinada utilizando um ensaio de hibridização, como conhecido na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al. [supra]). Nessa altura, uma molécula consideravelmente homóloga competirá e inibirá a ligação de uma molécula completamente homóloga à molécula alvo em várias condições de rigor, como ensinado em Wahl, G.M. e S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 399-407) e Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511). "Rigor" refere-se a condições numa reacção de hibridização que favorecem a associação de moléculas muito semelhantes em relação à associação de moléculas que diferem. Condições de hibridização de alto rigor são definidas como incubação dum dia para o outro a 42°C numa solução compreendendo 50% de formamida, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de 23

Denhardts 5x, 10% de sulfato de dextrano e 20 micrograma/mL de ADN de esperma de salmão cortado, desnaturado, seguida de lavagem dos filtros em SSC 0,lx a aproximadamente 65°C.

As condições de baixo rigor envolvem a reacção de hibridização realizada a 35 °C (ver Sambrook et al. [supra]). Preferencialmente, as condições utilizadas para hibridização são as de alto rigor. É divulgado um processo para detectar uma molécula de ácido nucleico da invenção, compreendendo os passos de: (a) contactar uma sonda nucleica de acordo com a invenção com uma amostra biológica em condições de hibridização para formar cadeias duplas; e (b) detectar quaisquer cadeias duplas que se formarem.

Como discutido adicionalmente abaixo em relação aos ensaios, uma molécula de ácido nucleico como descrita acima pode ser utilizada como uma sonda de hibridização para ARN, ADNc ou ADN genómico, para isolar ADNcs completos e clones genómicos que codificam os polipéptidos INSP108 ou INSP109 e para isolar ADNc e clones genómicos de genes homólogos ou ortólogos que têm uma semelhança de sequência elevada com o gene que codifica este polipéptido. A este respeito, podem ser utilizadas as seguintes técnicas, entre outras conhecidas na matéria, as quais são discutidas abaixo para efeitos de ilustração. Os métodos de sequenciação e análise de ADN são bem conhecidos e são geralmente disponíveis na técnica e podem, de facto, ser utilizadas para pôr em prática muitas das formas de realização da invenção aqui discutida. Tais métodos podem empregar enzimas tais como o fragmento Klenow da ADN polimerase I, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland, 24 OH), Taq polimerase (Perkin Elmer), polimerase T7 termoestável (Amersham, Chicago, IL) ou combinações de polimerases e exonucleases de reparação de defeitos como as encontradas no Sistema de Amplificação ELONGASE comercializado pela Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) . Preferencialmente, o processo de sequenciação pode ser automatizado utilizando máquinas como a Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV) , o ciclizador Térmico Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) e o Catalisador ABI e os Sequenciadores de ADN 373 e 377 (Perkin Elmer).

Um método para isolar uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido com uma função equivalente aqui divulgada consiste em examinar uma biblioteca genómica ou de ADNc com uma sonda natural ou artificialmente concebida utilizando procedimentos correntes que são reconhecidos na técnica (ver, por exemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds) . Greene Publishing Association e John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992) . As sondas compreendendo pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 30 e mais preferencialmente pelo menos 50, bases contíguas que correspondem a, ou são complementares a, sequências de ácido nucleico do gene de codificação apropriado (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15), são sondas particularmente úteis. Tais sondas podem ser marcadas com um reagente analiticamente detectável para facilitar a sua identificação. Os reagentes úteis incluem, mas não se limitam a, radioisótopos, corantes fluorescentes e enzimas que são capazes de catalisar a formação de um produto detectável. Utilizando estas sondas, o especialista comum será de capaz de isolar cópias complementares de polinucleótidos de ADN genómico, ADNc ou ARN que codificam proteínas de interesse de fonte humana, mamífera ou de 25 outro animal e de pesquisar tais fontes quanto à presença de sequências relacionadas, por exemplo, para membros adicionais da familia, tipo e/ou subtipo.

Em muitos casos, as sequências de ADNc isoladas serão incompletas, no sentido de que a região que codifica o polipéptido estará demasiado curta, normalmente na extremidade 5' . Estão disponíveis vários métodos para se obter ADNcs completos ou para prolongar ADNcs curtos. Essas sequências podem ser prolongadas utilizando uma sequência de nucleótidos parcial e empregando vários métodos conhecidos na técnica para detectar sequências a montante tais como elementos promotores e reguladores. Por exemplo, um método que pode ser utilizado baseia-se no método de Amplificação Rápida de Extremidades de ADNc (RACE; ver, por exemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Modificações recentes desta técnica, exemplificadas pela tecnologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), por exemplo, simplificaram significativamente a pesquisa de ADNcs mais compridos. UMA técnica ligeiramente diferente, chamada PCR de "sítio de restrição", utiliza iniciadores universais para recuperar sequências de ácido nucleico desconhecidas adjacentes a um lócus conhecido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). Também pode ser utilizada PCR inversa para amplificar ou prolongar sequências utilizando iniciadores divergentes com base numa região conhecida (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186) . Outro método que pode ser utilizado é a PCR de captura a qual envolve amplificação por PCR de fragmentos de ADN adjacentes a sequências conhecidas de ADN cromossómico artificial humano e de levedura (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). Outro método que pode ser utilizado para recuperar sequências 26 desconhecidas é o de Parker, J.D. et al. (1991); Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Adicionalmente, pode utilizar-se PCR, iniciadores internos e bibliotecas PromoterFinder™ para ADN genómico (Clontech, Paio Alto, CA) . Este processo evita a necessidade de pesquisar bibliotecas e é útil para encontrar junções intrão/exão.

Quando se pesquisa ADNcs completos, é preferível utilizar bibliotecas que foram seleccionadas em termos de tamanho para incluir ADNcs maiores. De igual modo, são preferidas bibliotecas iniciadas aleatoriamente, pelo facto de conterem mais sequências que contêm as regiões 5' dos genes. A utilização de uma biblioteca iniciada aleatoriamente pode ser especificamente preferida em situações nas quais uma biblioteca de oligo d(T) não produz um ADNc completo. As bibliotecas genómicas podem ser úteis para prolongamento de sequências em regiões reguladoras não transcritas 5'.

As moléculas de ácido nucleico aqui divulgadas podem ser utilizadas para localização cromossómica. Nesta técnica, uma molécula de ácido nucleico é especificamente direccionada para, e pode hibridizar com, uma localização particular num cromossoma humano individual. O mapeamento das sequências relevantes nos cromossomas de acordo com a presente invenção é um passo importante na correlação confirmatória daquelas sequências com a doença associada ao gene. Uma vez mapeada a sequência a uma localização cromossómica precisa, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com dados do mapa genético. Estes dados podem ser encontrados em, por exemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponível em linha através de Johns Hopkins University 27

Welch Medicai Library). As relações entre os genes e doenças que foram mapeados na mesma região cromossómica são depois identificadas através análise de ligação (co-herança de genes fisicamente adjacentes). Isto proporciona informação valiosa para os investigadores que pesquisam genes patológicos utilizando clonagem posicionai ou outras técnicas de descoberta de genes. Uma vez localizada grosseiramente a doença ou sindrome por ligação genética a uma região genómica particular, quaisquer sequências que mapeiem essa área podem representar genes associados ou reguladores para investigação adicional. A molécula de ácido nucleico também pode ser utilizada para detectar diferenças na localização cromossómica devido a translocação, inversão, etc. entre indivíduos normais, portadores ou afectados.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção também são úteis para localização tecidular. Estas técnicas permitem determinar os padrões de expressão do polipéptido em tecidos por detecção dos ARNms que os codificam. Estas técnicas incluem técnicas de hibridização in situ e técnicas de amplificação de nucleótidos, como a PCR. Os resultados destes estudos proporcionam uma indicação das funções normais do polipéptido no organismo. Além disso, estudos comparativos do padrão de expressão normal de ARNms com o de ARNms codificados por um gene mutante proporcionam conhecimento valioso sobre o papel de polipéptidos mutantes na doença. Essa expressão inapropriada pode ser de natureza temporal, espacial ou quantitativa.

Também podem ser empreendidas abordagens de silenciamento de genes para regular negativamente a expressão endógena de um gene que codifica um polipéptido da invenção. A 28 interferência de ARN (ARNi) (Elbashir, SM et al., Nature 2001, 411, 494-498) é um método de silenciamento de genes pós-transcrição, especifico para a sequência que pode ser utilizado. Oligonucleótidos de ARNds curtos são sintetizados in vitro e introduzidos numa célula. A ligação especifica à sequência destes oligonucleótidos de ARNds desencadeia a degradação de ARNm alvo, reduzindo ou eliminando a expressão da proteína alvo. A eficácia das abordagens de silenciamento de genes referidas acima pode ser avaliada através da medição da expressão do polipéptido expressão (por exemplo, por transferência de Western), e ao nível do ARN utilizando metodologias com base em TaqMan.

Os vectores da presente invenção compreendem moléculas de ácido nucleico da invenção e podem ser vectores de clonagem ou expressão. As células hospedeiras da invenção, as quais podem ser transformadas, transfectadas ou transduzidas com os vectores da invenção podem ser procariotas ou eucariotas.

Os polipéptidos da invenção podem ser preparados na forma recombinante por expressão das suas moléculas codificadoras de ácido nucleico em vectores contidos numa célula hospedeira. Tais métodos de expressão são bem conhecidos dos especialistas na técnica e muitos são descritos em detalhe em Sambrook et al. (supra) e Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto). 29

Duma maneira geral, pode utilizar-se qualquer sistema ou vector que seja adequado para manter, propagar ou expressar moléculas de ácido nucleico para produzir um polipéptido no hospedeiro necessário. A sequência de nucleótidos apropriada pode ser inserida num sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas de rotina e bem conhecidas, como, por exemplo, as descritas em Sambrook et ai., (supra). Duma maneira geral, o gene de codificação pode ser colocado sob o controlo de um elemento de controlo como um promotor, sitio de ligação a ribossoma (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador, de modo a que a sequência de ADN que codifica o polipéptido desejado seja transcrita em ARN na célula hospedeira transformada.

Exemplos de sistemas de expressão adequados incluem, por exemplo, sistemas cromossómicos, epissomais e derivados de virus, incluindo, por exemplo, vectores derivados de: plasmideos bacterianos, bacteriófagos, transposões, epissomas de leveduras, elementos de inserção, elementos cromossómicos de levedura, virus como baculovirus, papovavirus como o SV40, virus da variola, adenovirus, virus da difteria aviária, virus da pseudo-raiva e retrovirus, ou combinações destes, como os derivados de plasmideos e elementos genéticos de bacteriófagos, incluindo cosmideos e fagemideos. Também podem ser utilizados cromossomas artificiais humanos (HACs) para fornecer fragmentos de ADN maiores do que os que podem ser contidos e expressados num plasmídeo. Os vectores pCR4-TOPO-INSP108 (Figura 9), pDONR-INSPl08-6HIS (Figura 13), pEAK12d-INSP108-6HIS (Figura 14), pDEST12.2-INSP108-6HIS (Figura 15), pCR4- TOPO-INSP109 (Figura 19), pDONR-INSP109-6HIS (Figura 20), pEAK12d-INSP109-6HIS (Figura 21) e 30 pDEST12.2-INSP109-6HIS (Figura 22), sao exemplos preferidos de vectores adequados para expressão.

Os sistemas de expressão particularmente adequados incluem microrganismos como bactérias transformadas com vectores de expressão de ADN recombinante de bacteriófago, plasmideo ou cosmideo; levedura transformada com vectores de expressão de levedura; sistemas de células de insectos infectadas com vectores de expressão de virus (por exemplo, baculovirus); sistemas de células vegetais transformadas com vectores de expressão de virus (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vectores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmideos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. Também podem ser utilizados sistemas de tradução isentos de células para produzir os polipéptidos da invenção. A introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido da presente invenção em células hospedeiras pode ser efectuada por métodos descritos em muitos manuais de laboratório correntes, como Davis et al.r Basic Methods in Molecular Biology (1986) e Sambrook et al., (supra). Os métodos particularmente adequados incluem transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção, microinjecção, transfecção mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução, introdução por raspagem, introdução balística ou infecção (ver Sambrook et al., 1989 [supra]·, Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald, 1998) . Nas células eucariotas, os sistemas de expressão podem ser transitórios (por exemplo, epissomal) ou permanentes (integração cromossómica) de acordo com as necessidades do sistema. 31 A molécula de ácido nucleico codificadora pode ou não incluir uma sequência que codifica uma sequência de controlo, como um péptido sinal ou sequência líder, conforme desejado, por exemplo, para secreção do polipéptido traduzido no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplásmico ou no ambiente extracelular. Estes sinais podem ser endógenos ao polipéptido ou eles podem ser sinais heterólogos. As sequências líder podem ser removidas pelo hospedeiro bacteriano em processamento pós-tradução.

Além das sequências de controlo, pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam regular a expressão do polipéptido relativamente ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão de um gene seja aumentada ou diminuída em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador ou a várias temperaturas ou condições metabólicas. As sequências reguladoras são as regiões não traduzidas do vector, como intensificadores, promotores e regiões 5' e 3' não traduzidas. Estas interactuam com proteínas das células hospedeira para efectuar a transcrição e tradução. Estas sequências reguladoras podem variar quanto à sua potência e especificidade. Dependendo do sistema vector e hospedeiro utilizado, pode usar-se qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis. Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, pode utilizar-se promotores indutíveis como o promotor lacZ híbrido do fagemídeo Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) ou o plasmídeo pSportl™ (Gibco BRL) e semelhantes. 0 promotor poliedrina de baculovírus pode ser utilizado em células de insecto. Os promotores ou intensificadores derivados dos genomas de 32 células vegetais (por exemplo, genes de choque térmico, RUBISCO e proteína de armazenagem) ou de vírus de plantas (por exemplo, promotores virais ou sequências líder) podem ser clonados no vector. Nos sistemas de células de mamíferos são preferidos promotores de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Se for necessário gerar uma linha de células que contém cópias múltiplas da sequência, pode utilizar-se vectores com base em SV40 ou EBV com um marcador seleccionável apropriado.

Um vector de expressão é construído de modo a que a sequência de codificação de ácido nucleico particular esteja localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, sendo o posicionamento e orientação da sequência de codificação em relação às sequências reguladoras de modo a que a sequência de codificação seja transcrita sob o "controlo" das sequências reguladoras, isto é, a ARN polimerase que se liga à molécula de ADN nas sequências de controlo transcreve a sequência de codificação. Nalguns casos pode ser necessário modificar a sequência de modo a que ela possa ser ligada às sequências de controlo com a orientação apropriada; isto é, para manter a grelha de leitura.

As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem estar ligadas à sequência de codificação de ácido nucleico antes da inserção num vector. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contém as sequências de controlo e um sítio de restrição apropriado.

Para a produção a longo prazo e de alto rendimento de um polipéptido recombinante é preferida a expressão estável. 33

Por exemplo, linhas de células que expressam de modo estável o polipéptido de interesse podem ser transformadas utilizando vectores de expressão que podem conter origens de replicação virais e/ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador seleccionável no mesmo vector ou num vector separado. Após a introdução do vector, as células podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido antes de serem trocadas para um meio selectivo. 0 objectivo do marcador seleccionável é conferir resistência à selecção, e a sua presença permite crescer e recuperar as células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Os clones resistentes de células transformadas de modo estável podem ser proliferados utilizando técnicas de cultura de tecido apropriadas ao tipo de célula.

Na técnica são conhecidas linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis de American Type Culture Collection (ATCC) incluindo, mas não se limitando a células de ovário de hamster chinês (CHO), HeLa, rim de hamster bebé (BHK), rim de macaco (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma de Bowes e carcinoma hepatocelular humano (por exemplo Hep G2) e um número de outras linhas de células.

No sistema de baculovírus, os materiais para os sistemas de expressão de baculovírus/célula de insecto estão comercialmente disponíveis na forma de estojos de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (o estojo "MaxBac"). Estas técnicas são geralmente conhecidas dos especialistas na técnica e são descritas integralmente em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 34 (1987). Células hospedeiras particularmente adequadas para serem utilizadas neste sistema incluem células de insecto como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9.

Existem muitos sistemas de expressão genéticos de cultura de células vegetais e de planta inteira conhecidos na técnica. Exemplos de sistemas de expressão genéticos de células vegetais adequados incluem os descritos em US 5,693,506; US 5,659,122; e US 5,608,143. Exemplos adicionais de expressão genética em culturas de células vegetais foram descritos por Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991).

Em particular, podem ser utilizadas todas as plantas das quais podem ser isolados protoplastos e cultivados para dar plantas regeneradas inteiras, de modo a poderem ser recuperadas plantas inteiras que contêm o gene transferido. Praticamente todas as plantas podem ser regeneradas de células ou tecidos cultivados, incluindo mas não se limitam a todas as espécies principais de cana-de-açúcar, beterraba algodão, árvores de frutos e outras, legumes e vegetais.

Exemplos de células hospedeiras bacterianas particularmente preferidas incluem células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis.

Exemplos de células hospedeiras particularmente adequadas para expressão fúngica incluem células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae) e células de Aspergillus.

Na técnica é conhecido um número de sistemas de selecção que podem ser utilizados para recuperar linhas de células transformadas. Os exemplos incluem os genes de timidina- 35 cinase (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-32) e adenina-fosforribosiltransferase (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-23) do vírus simplex do herpes que podem ser utilizados em células tk“ ou aprt*, respectivamente.

Também se pode utilizar a resistência a antimetabolito, antibiótico ou herbicida como a base para selecção; por exemplo, di-hidrofolato-redutase (DHFR) que confere resistência ao metotrexato (Wigler, M. et ai. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 3567-70); npt, que confere resistência aos aminoglicósidos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14) e ais ou pat, que confere resistência ao clorsulfurão e fosfinotricina-acetiltransferase, respectivamente. Foram descritos genes seleccionáveis adicionais, cujos exemplos serão evidentes para os especialistas na técnica.

Embora a presença ou ausência de expressão do gene marcador sugira que o gene de interesse também está presente, a sua presença e expressão pode ter de ser confirmada. Por exemplo, se a sequência relevante for inserida numa sequência do gene marcador, as células transformadas contendo as sequências apropriadas podem ser identificadas pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, pode colocar-se um gene marcador em tandem com uma sequência que codifica um polipéptido da invenção sob o controlo de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou selecção indica também geralmente a expressão do gene tandem.

Alternativamente, as células hospedeiras que contêm uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido da invenção e as quais expressam o referido polipéptido podem 36 ser identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos dos especialistas na técnica. Estes procedimentos incluem, mas não se limitam a, bioensaios de hibridização ADN-ADN ou ADN-ARN e de proteina, por exemplo, classificação de células activada por fluorescência (FACS) ou técnicas de imunoensaio (como o ensaio de imunoabsorção enzimática [ELISA] e radioimunoensaio [RIA]), que incluem tecnologias à base de membrana, solução ou chip para detecção e/ou quantificação de ácido nucleico ou proteina (ver Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) e Maddox, D.E. et al. (1983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216).

Uma grande variedade de etiquetas e técnicas de conjugação são conhecidas pelos especialistas na técnica e podem ser utilizadas em vários ensaios de ácido nucleico e aminoácido. Os meios para produzir hibridização marcada ou sondas de PCR para detectar sequências relacionadas com moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptidos da presente invenção incluem oligomarcação, tradução de corte, marcação de extremidade ou amplificação por PCR utilizando um polinucleótido marcado.

Alternativamente, as sequências que codificam o polipéptido da invenção podem ser clonadas num vector para a produção de uma sonda de ARNm. Estes vectores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro por adição de uma ARN-polimerase apropriada como a T7, T3 ou SP6 e nucleótidos marcados. Estes procedimentos podem ser realizados utilizando uma diversidade de estojos comercialmente disponíveis (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, 37 MI); Promega (Madison WI); e U. S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)).

As moléculas ou etiquetas repórteres adequadas, as quais podem ser utilizadas para facilitar a detecção, incluem radionuclideos, enzimas e agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicos bem como substratos, factores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes.

As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também podem ser utilizadas para criar animais transgénicos, em particular animais roedores. Esses animais transgénicos formam um outro aspecto da presente invenção. Isto pode ser feito localmente por modificação de células somáticas ou por terapia de linhas embrionárias para incorporar modificações transmissíveis. Estes animais transgénicos podem ser particularmente úteis na produção de modelos animais para moléculas farmacológicas eficazes como moduladores dos polipéptidos da presente invenção. 0 polipéptido pode ser recuperado e purificado de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo precipitação de sulfato de amónio ou etanol, extracção ácida, cromatografia de troca aniónica ou catiónica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. A cromatografia de alta eficiência é particularmente útil para purificação. Podem ser utilizadas técnicas bem conhecidas para replissagem de proteínas para regenerar uma conformação activa quando o polipéptido é desnaturado durante isolamento e ou purificação. 38

Também podem ser utilizadas construções de vector especializadas para facilitar a purificação de proteínas, consoante desejado, juntando sequências que codificam os polipéptidos da invenção com uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio de polipéptido que facilitará a purificação de proteínas solúveis. Os exemplos de tais domínios facilitadores de purificação incluem péptidos quelantes de metal como os módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de prolongamento de FLAGS/purificação por afinidade (Immunex Corp., Seattle, WA). Pode utilizar-se a inclusão de sequências de ligação dissociáveis como as específicas para o Factor XA ou enterocinase (Invitrogen, San Diego, CA) entre o domínio de purificação e o polipéptido da invenção para facilitar a purificação. Um vector de expressão desse tipo permite a expressão de uma proteína de fusão contendo o polipéptido da invenção fundido com vários resíduos de histidina a preceder uma tioredoxina ou um sítio de dissociação de enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação por IMAC (cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado como descrito em Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) enquanto a tioredoxina ou o sítio de dissociação de enterocinase proporciona um meio para purificar o polipéptido da proteína de fusão. Uma discussão de vectores que contêm proteínas de fusão é proporcionada em Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453).

Se o polipéptido for expressado para ser utilizado em ensaios de rastreio, é geralmente preferido que ele seja produzido na superfície da célula hospedeira na qual é 39 expressado. Neste caso, as células hospedeiras podem ser colhidas antes da utilização no ensaio de rastreio, por exemplo utilizando técnicas como as técnicas de classificação de células activada por fluorescência (FACS) ou immunoafinidade. Se o polipéptido for segregado para o meio, o meio pode ser recolhido para se recuperar e purificar o polipéptido expressado. Se polipéptido for produzido intracelularmente, as células têm de ser inicialmente submetidas a lise antes de se recuperar o polipéptido. 0 polipéptido da invenção pode ser utilizado para examinar bibliotecas de compostos utilizando qualquer uma de uma diversidade de técnicas de rastreio de fármacos. Tais compostos podem activar (agonista) ou inibir (antagonista) o nível de expressão do gene ou a actividade do polipéptido da invenção e constitui um outro aspecto da presente invenção. Os compostos preferidos são eficazes para alterar a expressão de um gene natural o qual codifica um polipéptido do primeiro aspecto da invenção ou para regular a actividade de um polipéptido do primeiro aspecto da invenção.

Os compostos agonistas ou antagonistas podem ser isolados, por exemplo, de células, preparações isentas de células, bibliotecas químicas ou misturas de produtos naturais. Estes agonistas ou antagonistas podem ser substratos naturais ou modificados, ligandos, enzimas, receptores ou miméticos estruturais ou funcionais. Para uma revisão adequada de tais técnicas de rastreio, ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2):Capítulo 5 (1991). 40

Os compostos que são mais prováveis de serem bons antagonistas são moléculas que se ligam ao polipéptido da invenção sem induzir os efeitos biológicos do polipéptido ao ligarem-se a este. Os antagonistas potenciais incluem moléculas orgânicas pequenas, péptidos, polipéptidos e anticorpos que se ligam ao polipéptido da invenção e desse modo inibem ou eliminam a sua actividade. Deste modo, pode ser inibida a ligação do polipéptido a moléculas normais de ligação celular, pelo que a actividade biológica normal do polipéptido é prevenida. O polipéptido da invenção que é utilizado numa tal técnica de rastreio pode estar livre em solução, afixado a um suporte sólido, suportado numa superfície celular ou localizado intracelularmente. Em geral, estes procedimentos de rastreio podem envolver a utilização de células ou membranas celulares apropriadas que expressam o polipéptido que são postas em contacto com um composto de ensaio para observar a ligação, ou a estimulação ou inibição de uma resposta funcional. A resposta funcional das células postas em contacto com o composto de ensaio é então comparada com as células de controlo que não foram postas em contacto com o composto de ensaio. Um ensaio desse tipo pode avaliar se o composto de ensaio resulta num sinal gerado por activação do polipéptido, utilizando um sistema de detecção apropriado. Os inibidores de activação são geralmente avaliados na presença de um agonista conhecido e é observado o efeito sobre a activação pelo agonista na presença do composto de ensaio.

Um método para identificar um composto agonista ou antagonista de um polipéptido da presente invenção compreende: 41 (a) pôr em contacto uma célula que expressa na sua superfície o polipéptido de acordo com o primeiro aspecto da invenção, estando o polipéptido associado a um segundo componente capaz de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação de um composto ao polipéptido, com um composto a ser examinado em condições que permitem a ligação ao polipéptido; e (b) determinar se o composto se liga e activa ou inibe o polipéptido medindo o nível de um sinal gerado pela interacção do composto com o polipéptido.

Um outro método para identificar um agonista ou antagonista de um polipéptido da invenção compreende: (a) pôr em contacto uma célula que expressa na sua superfície o polipéptido, estando o polipéptido associado a um segundo componente capaz de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação de um composto ao polipéptido, com um composto a ser examinado em condições que permitem a ligação ao polipéptido; e (b) determinar se o composto se liga e activa ou inibe o polipéptido comparando o nível de um sinal gerado pela interacção do composto com o polipéptido com o nível de um sinal na ausência do composto.

Os métodos gerais que são descritos acima podem compreender ainda a identificação do agonista ou antagonista na presença de ligando marcado ou não marcado ou de um receptor do polipéptido.

Outro método para identificar um agonista ou antagonista de um polipéptido da presente invenção compreende: determinar a inibição de ligação de um ligando ou receptor a células que têm um polipéptido da invenção na sua 42 superfície, ou a membranas celulares contendo um tal polipéptido, na presença de um composto candidato em condições que permitem a ligação ao polipéptido, e determinar a quantidade de ligando ou receptor ligado ao polipéptido. Um composto capaz de provocar a redução de ligação de um ligando ou receptor é considerado como sendo um agonista ou antagonista. Preferencialmente, o ligando está marcado. É divulgado um método de rastreio de um composto antagonista ou agonista do polipéptido compreendendo os passos de: (a) incubar um ligando ou receptor marcado com uma célula inteira que expressa um polipéptido de acordo com a invenção na superfície da célula, ou com uma membrana celular contendo um polipéptido da invenção, (b) medir a quantidade de ligando ou receptor marcado ligado à célula inteira ou à membrana celular; (c) adicionar um composto candidato a uma mistura do ligando ou receptor marcado e da célula inteira ou da membrana celular do passo (a) e deixar a mistura atingir o equilíbrio; (d) medir a quantidade de ligando ou receptor marcado ligado à célula inteira ou à membrana celular após o passo (c) ; e (e) comparar a diferença do ligando ou receptor marcado ligado nos passos (b) e (d) , para que o composto que provoca a redução da ligação no passo (d) seja considerado como sendo um agonista ou antagonista.

Também se pode determinar que o polipéptido INSP109 modula a proliferação e diferenciação celular do sistema imunitário de um modo dependente da dose nos ensaios acima 43 descritos. Assim, os "equivalentes funcionais" dos polipéptidos INSP108 e INSP109 incluem polipéptidos que exibem qualquer uma das mesmas actividades de regulação do crescimento e diferenciação nos ensaios descritos acima de um modo dependente da dose. Embora o grau de actividade dependente da dose não tenha de ser idêntico ao dos polipéptidos INSP108 ou INSP109, preferencialmente os "equivalentes funcionais" exibirão uma dependência da dose essencialmente semelhante num dado ensaio de actividade em comparação com os polipéptidos INSP108 e INSP109.

Podem ser utilizados ensaios de ligação simples, nos quais a aderência de um composto de ensaio a uma superfície portadora do polipéptido seja detectada por meio de uma etiqueta directa ou indirectamente associada ao composto de ensaio ou num ensaio envolvendo competição com um competidor marcado. Noutra forma de realização podem ser utilizados ensaios de rastreio de fármacos competitivos, nos quais anticorpos neutralizadores que são capazes de se ligar ao polipéptido competem especificamente com um composto de ensaio no que refere à ligação. Deste modo, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer composto de ensaio que possua afinidade de ligação específica para o polipéptido.

Também podem ser concebidos ensaios para detectar o efeito de compostos de ensaio adicionados na produção de ARNm que codifica o polipéptido em células. Por exemplo, pode ser construída um ELISA que mede os níveis de polipéptido segregado ou associado a células utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais por métodos correntes conhecidos na técnica, e este pode ser utilizado para pesquisar compostos que possam inibir ou intensificar a produção do 44 polipéptido de células ou tecido adequadamente manipulados. A formação de complexos de ligação entre o polipéptido e o composto a ser testado pode ser depois medida. Um ensaio antimicrobiano de defensina beta é descrito por Nizet et al. (Nature 2001, 414: 454- 457). Um ensaio antimicrobiano e antiviral de defensina teta é descrito por Cole et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 2002, 99(4):1813-1818).

Outra técnica para rastreio de fármacos que pode ser utilizada permite o rastreio de alto débito de compostos possuindo afinidade de ligação adequada ao polipéptido de interesse (ver Pedido internacional de patente W084/03564). Neste método é sintetizado um grande número de compostos de ensaio pequenos diferentes num substrato sólido, o qual pode ser depois feito reagir com o polipéptido da invenção e lavado. Um modo de imobilizar o polipéptido consiste em utilizar anticorpos não neutralizadores. 0 polipéptido ligado pode ser depois detectado utilizando métodos que são bem conhecidos na técnica. O polipéptido purificado também pode ser aplicado directamente em placas para utilização nas técnicas de rastreio de fármacos supramencionadas. O polipéptido da invenção pode ser utilizado para identificar receptores ligados à membrana ou solúveis, através de técnicas correntes de ligação ao receptor que são conhecidas na técnica, como é o caso dos ensaios de ligação ao ligando e de reticulação nos quais o polipéptido está marcado com um isótopo radioactivo, está quimicamente modificado ou está fundido a uma sequência peptídica que facilita a sua detecção ou purificação, e é incubado com uma fonte do receptor putativo (por exemplo, uma composição de células, membranas celulares, sobrenadantes de células, extractos de tecido ou fluidos corporais). A eficácia de 45 ligação pode ser medida utilizando técnicas biofísicas tais como a ressonância plasmónica superficial e espectroscopia. Os ensaios de ligação podem ser utilizados para a purificação e clonagem do receptor, mas também podem identificar agonistas e antagonistas do polipéptido, que competem com a ligação do polipéptido ao seu receptor. Os métodos correntes para construir ensaios de rastreio são bem compreendidos na técnica. É aqui divulgado um estojo de rastreio útil nos métodos para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, substratos, enzimas, que são descritos acima. São aqui divulgados agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, substratos e enzimas, e outros compostos que modulam a actividade ou antigenicidade do polipéptido da invenção descobertos pelos métodos que são descritos acima. São aqui divulgadas composições farmacêuticas compreendendo um polipéptido, ácido nucleico, ligando ou composto da invenção em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser adequadas como reagentes terapêuticos ou de diagnóstico, como vacinas ou como outras composições imunogénicas, como delineado em detalhe abaixo.

De acordo com a terminologia aqui utilizada, uma composição contendo um polipéptido, ácido nucleico, ligando ou composto [X] está "substancialmente isenta de" impurezas [aqui, Y] quando pelo menos 85% em massa do total X+Y na composição é X. Preferencialmente, X compreende pelo menos cerca de 90% em massa do total de X+Y na composição, mais 46 preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 98% ou até mesmo 99% em massa.

As composições farmacêuticas deveriam preferencialmente compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido, molécula de ácido nucleico, ligando ou composto da invenção. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui utilizado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição alvo, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada em ensaios de cultura de células, por exemplo, de células neoplásicas, ou em modelos animais, geralmente ratos, coelhos, cães ou porcos. 0 modelo animal também pode ser utilizado para determinar a gama de concentração apropriada e a via de administração. Esta informação pode ser utilizada para determinar doses úteis e vias de administração em humanos. A quantidade eficaz exacta para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado patológico, do estado físico geral do indivíduo, idade, peso e género do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, associação (ões) de fármaco(s), sensibilidades reaccionais e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro do julgamento do clínico. Geralmente, uma dose eficaz será de 0,01 mg/kg até 50 mg/kg, preferencialmente 0,05 mg/kg até 10 mg/kg. As composições podem ser administradas individualmente a um doente ou podem ser administradas em associação com outros agentes, fármacos ou hormonas. 47

Uma composição farmacêutica também pode conter um veiculo farmaceuticamente aceitável para administração de um agente terapêutico. Estes veículos incluem anticorpos e outros polipéptidos, genes e outros agentes terapêuticos como os lipossomas, desde que o veículo não induza ele mesmo a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição, e os quais possam ser administrados sem toxicidade indevida. Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como as proteínas, polissacarídeos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas inactivas de vírus.

Podem ser ali utilizados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e os sais de ácidos orgânicos como os acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Uma discussão exaustiva de veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Adicionalmente podem estar presentes nessas composições substâncias auxiliares, como humectantes ou emulsionantes, substâncias tampão de pH e semelhantes. Estes veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão pelo doente. 48

Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais; em particular, podem ser tratados indivíduos humanos.

As composições farmacêuticas utilizadas nesta invenção podem ser administradas por um número qualquer de vias incluindo, mas não se limitando às aplicações oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica ou transcutânea (por exemplo, ver W098/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal ou rectal. Também podem ser utilizadas pistolas genéticas ou seringas hipodérmicas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solubilizar ou suspender em veículos líquidos antes da injecção. A administração directa das composições será geralmente conseguida por injecção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou administração no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas numa lesão. A dosagem de tratamento pode ser um plano de dose única ou um plano de doses múltiplas.

Se a actividade do polipéptido da invenção estiver em excesso num estado patológico particular encontram-se disponíveis várias abordagens. Uma abordagem compreende a administração, a um indivíduo, de um composto inibidor (antagonista) como descrito acima, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável numa quantidade eficaz 49 para inibir a função do polipéptido, tal como por bloqueio da ligação de ligandos, substratos, enzimas, receptores ou por inibição de um segundo sinal, aliviando desse modo a condição anormal. Preferencialmente, estes antagonistas são anticorpos. Muito preferencialmente, estes anticorpos são quiméricos e/ou humanizados para minimizar a sua imunogenicidade, como anteriormente descrito.

Noutra abordagem, podem ser administradas formas solúveis do polipéptido que retêm afinidade de ligação ao ligando, substrato, enzima, receptor em questão. Tipicamente, o polipéptido pode ser administrado na forma de fragmentos que retêm as porções relevantes.

Numa abordagem alternativa, a expressão do gene que codifica o polipéptido pode ser inibida utilizando técnicas de bloqueamento da expressão, como a utilização de moléculas de ácido nucleico antimensageiras (como descrito acima), quer geradas internamente quer administradas separadamente. Podem ser obtidas modificações na expressão do gene concebendo sequências complementares ou moléculas antimensageiras (ADN, ARN ou PNA) para as regiões de controlo, 5' ou reguladoras (sequência sinal, promotores, intensificadores e intrões) do gene que codifica o polipéptido. Analogamente, a inibição pode ser conseguida utilizando metodologia de emparelhamento de base em "hélice tripla." 0 emparelhamento em hélice tripla é útil porque provoca inibição da capacidade da hélice dupla para se abrir suficientemente para ligação de polimerases, factores de transcrição ou moléculas reguladoras. Avanços terapêuticos recentes utilizando ADN de hélice tripla foram descritos na literatura (Gee, J.E. et al. (1994) In: Huber, B.E. e B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, 50

Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY) . A sequência complementar ou molécula antimensageira também pode ser concebida para bloquear a tradução de ARNm impedindo que o trasncripto se ligue aos ribossomas. Estes oligonucleótidos podem ser administrados ou podem ser gerados in situ a partir de expressão in vivo.

Além disso, a expressão do polipéptido da invenção pode ser prevenida utilizando ribozimas especificas para a sua sequência de ARNm de codificação. As ribozimas são ARNs cataliticamente activos que podem ser naturais ou sintéticos (ver por exemplo Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6 (4), 527-33). As ribozimas sintéticas podem ser concebidas para dissociar especificamente ARNms em posições seleccionadas prevenindo desse modo a tradução dos ARNms no polipéptido funcional. As ribozimas podem ser sintetizadas com uma estrutura de fosfato de ribose natural e bases naturais, como normalmente encontradas em moléculas de ARN. Alternativamente, as ribozimas podem ser sintetizadas com estruturas não naturais, por exemplo, 2'-O-metil-ARN, para proporcionar protecção da degradação pela ribonuclease e podem conter bases modificadas.

As moléculas de ARN podem ser modificadas para aumentar a estabilidade intracelular e a semivida. As modificações possíveis incluem, mas não se limitam à adição de sequências de flanqueamento nas extremidades 5' e/ou 3' da molécula ou à utilização de fosforotioato ou 2'-0-metilo em vez das ligações de fosfodiesterase na estrutura da molécula. Este conceito é inerente à produção de PNAs e pode alargar-se em todas estas moléculas pela inclusão de bases não tradicionais como as inosinas, queosinas e butosinas, bem como formas acetil-, metil-, tio- e formas 51 analogamente modificadas de adenina, citidina, guanina, timina e uridina as quais não são tão facilmente reconhecidas por endonucleases endógenas.

Para tratar condições anormais relacionadas com uma sub-expressão do polipéptido da invenção e com a sua actividade também estão disponíveis várias abordagens. Uma abordagem compreende administrar, a um indivíduo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que active o polipéptido, isto é, um agonista como descrito acima, para aliviar a condição anormal. Alternativamente, pode administrar-se uma quantidade terapêutica do polipéptido em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável para restabelecer o equilíbrio biológico relevante do polipéptido.

Pode utilizar-se a terapia de genes para efectuar a produção endógena do polipéptido nas células relevantes do indivíduo. A terapia de genes é utilizada para tratar permanentemente a produção inapropriada do polipéptido substituindo um gene defeituoso por um gene terapêutico corrigido. A terapia de genes da presente invenção pode ocorrer in vivo ou ex vivo. A terapia de genes ex vivo requer o isolamento e purificação de células do doente, a introdução de um gene terapêutico e introdução das células geneticamente alteradas novamente no doente. Ao contrário, a terapia de genes in vivo não requer isolamento e purificação das células do doente. 0 gene terapêutico está tipicamente "empacotado" para administração a um doente. Os veículos de administração de 52 genes podem ser não virais, como lipossomas, ou vectores de vírus deficientes em replicação, como é o caso dos adenovírus como descrito por Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) ou vírus adeno-associados (AAV) como descrito por Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158,97-129 (1992) e Patente U.S. n° 5,252,479. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido da invenção pode ser manipulada para expressão num vector retroviral deficiente em replicação. Esta construção de expressão pode ser depois isolada e introduzida numa célula de empacotamento transduzida com um vector de plasmídeo retroviral contendo ARN que codifica o polipéptido, pelo que a célula de empacotamento produz agora partículas virais infecciosas contendo o gene de interesse. Estas células produtoras podem ser administradas a um indivíduo para manipulação de células in vivo e expressão do polipéptido in vivo (ver Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (e referências ali citadas) em Human Molecular Genetics (1996) , T Strachan e A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Outra abordagem é a administração de "ADN nu" no qual o gene terapêutico é directamente injectado na corrente sanguínea ou tecido muscular.

Em situações em que os polipéptidos ou moléculas de ácido nucleico da invenção são agentes causadores de doença, a invenção permite que eles possam ser utilizados em vacinas para aumentar os anticorpos contra o agente causador da doença. 53

As vacinas de acordo com a invenção podem ser profilácticas (isto é para prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é para tratar a doença após a infecção). Estas vacinas compreendem antigénio(s) imunizante(s), imunogénio(s), polipéptido(s), proteína(s) ou ácido nucleico, geralmente em associação com veículos farmaceuticamente aceitáveis como descritos acima, os quais incluem qualquer veículo que não induza ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. Adicionalmente, estes veículos podem actuar como agentes imunoestimulantes ("adjuvantes"). Além disso, o antigénio ou imunogénio pode ser conjugado a um toxóide bacteriano, como um toxóide de difteria, tétano, cólera, H. pylori e de outros agentes patogénicos.

Uma vez que os polipéptidos podem ser degradados no estômago, são preferencialmente administradas vacinas compreendendo polipéptidos por via parentérica (por exemplo, injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções injectáveis estéreis aquosas e não aquosas as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor, e suspensões aquosas e não aquosas estéreis as quais podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes.

As formulações de vacina da invenção podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas. Por exemplo, ampolas e frascos selados que podem ser conservados numa condição liofilizada requerendo apenas a adição do veículo estéril imediatamente antes da utilização. A dosagem dependerá da actividade específica da 54 vacina e pode ser prontamente determinada por experimentação de rotina.

Também se pode efectuar a administração genética de anticorpos que se ligam aos polipéptidos de acordo com a invenção, por exemplo, como descrito no Pedido internacional de patente W098/55607. A tecnologia referida como injecção compressiva (ver, por exemplo, www.powderject.com) também pode ser útil na formulação de composições para vacina.

Um número de métodos adequados para vacinação e de sistemas de administração de vacinas são descritos no Pedido internacional de patente WOOO/29428. É divulgada a utilização de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção como reagentes de diagnóstico. A detecção de uma forma mutada do gene caracterizado pelas moléculas de ácido nucleico da invenção o qual está associado a uma disfunção proporcionará uma ferramenta de diagnóstico que pode ajudar a, ou definir, um diagnóstico de uma doença, ou da susceptibilidade a uma doença, que resulta da sub-expressão, sobreexpressão ou expressão espacial ou temporal alterada do gene. Os indivíduos portadores de mutações no gene podem ser detectados ao nível do ADN por uma variedade de técnicas.

As moléculas de ácido nucleico para diagnóstico podem ser obtidas das células de um indivíduo, como do sangue, urina, saliva, biopsia de tecido ou material de autópsia. 0 ADN genómico pode ser utilizado directamente para detecção ou pode ser amplificado enzimaticamente utilizando PCR, 55 reacção em cadeia da ligase (LCR), amplificação de substituição de cadeia (SDA) ou outras técnicas de amplificação (ver Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al. , J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes da análise. É divulgado um método de diagnóstico de uma doença num doente, compreendendo a avaliação do nível de expressão de um gene natural que codifica um polipéptido de acordo com a invenção e a comparação do referido nível de expressão com um nível de controlo, em que um nível que é diferente do referido nível de controlo é indicador de doença. O método pode compreender os passos de: a) pôr em contacto uma amostra de tecido do doente com uma sonda de ácido nucleico em condições rigorosas que permitem a formação de um complexo híbrido entre uma molécula de ácido nucleico da invenção e a sonda; b) pôr em contacto uma amostra de controlo com a referida sonda nas mesmas condições utilizadas no passo a); c) e detectar a presença de complexos híbridos nas referidas amostras; em que a detecção de níveis do complexo híbrido na amostra do doente que diferem dos níveis do complexo híbrido na amostra de controlo é indicador de doença.

Também é aqui divulgado um método de diagnóstico compreendendo os passos de: a) obter uma amostra de tecido de um doente a ser testado quanto à doença; b) isolar uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção a partir da referida amostra de tecido; e 56 c) diagnosticar a doença no doente através da detecção da presença de uma mutação na molécula de ácido nucleico a qual está associada à doença.

Para ajudar à detecção de moléculas de ácido nucleico nos métodos descritos acima pode incluir-se um passo de amplificação, por exemplo utilizando PCR.

As supressões e inserções podem ser detectadas por uma alteração no tamanho do produto amplificado em comparação com o genótipo normal. As mutações pontuais podem ser identificadas hibridizando o ADN amplificado com ARN marcado da invenção ou, alternativamente, com sequências de ADN antimensageiro marcadas da invenção. As sequências perfeitamente condizentes podem ser distinguidas de hélices duplas dissonantes por digestão com RNase ou avaliando diferenças nas temperaturas de fusão. A presença ou ausência da mutação no doente pode ser detectada pondo em contacto ADN com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza com o ADN em condições rigorosas para formar uma molécula de cadeia dupla híbrida, possuindo a molécula de cadeia dupla híbrida uma porção não hibridizada da cadeia da sonda de ácido nucleico em qualquer porção correspondente a uma mutação associada à doença; e detectando a presença ou ausência de uma porção não hibridizada da cadeia da sonda como uma indicação da presença ou ausência de uma mutação associada a doença na porção correspondente da cadeia de ADN.

Estes diagnósticos são particularmente úteis para exame pré-natal e até mesmo neonatal. 57

As mutações pontuais e outras diferenças de sequência entre o gene de referência e os genes "mutantes" podem ser identificadas por outras técnicas bem conhecidas, como a sequenciação directa de ADN ou polimorfismo conformacional de cadeia simples, (ver Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)). Por exemplo, pode utilizar-se um iniciador de sequenciação com produtos de PCR de cadeia dupla ou uma molécula molde de cadeia simples gerada por uma PCR modificada. A determinação da sequência é realizada por procedimentos convencionais com nucleótidos marcados radioactivamente ou por procedimentos automáticos de sequenciação com etiquetas fluorescentes. Os segmentos de ADN clonado também podem ser utilizados como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. A sensibilidade deste método é muito aumentada quando combinado com PCR. Além disso, as mutações pontuais e outras variações de sequência, como os polimorfismos, podem ser detectadas como descrito acima, por exemplo, através da utilização de oligonucleótidos específicos de alelos para amplificação por PCR de sequências que diferem em um único nucleótido.

As diferenças na sequência de ADN também podem ser detectadas por alterações na mobilidade electroforética de fragmentos de ADN em geles, com ou sem agentes desnaturantes, ou por sequenciação directa de ADN (por exemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). As alterações de sequência em localizações específicas também podem ser reveladas por ensaios de protecção de nuclease, como protecção de RNase e SI ou pelo método de dissociação química (ver Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 85: 4397-4401). 58

Além da electroforese de gel convencional e sequenciação de ADN, as mutações como microssupressões, aneuploidias, translocações, inversões, também podem ser detectadas por análise in situ (ver, por exemplo, Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA (1993) ) , isto é, as sequências de ADN ou ARN nas células podem ser analisadas em relação às mutações sem a necessidade do seu isolamento e/ou imobilização numa membrana. A hibridização de fluorescência in situ (FISH) é presentemente o método mais geralmente aplicado e tem surgido um grande número de revisões sobre a FISH (ver, por exemplo, Trachuck et ai., Science, 250, 559-562 (1990), e Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)). É também aqui divulgada uma matriz de sondas de oligonucleótidos compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção que pode ser construída para realizar um rastreio eficiente de variantes genéticas, mutações e polimorfismos. Os métodos de tecnologia de matriz são bem conhecidos e têm aplicação geral e podem ser utilizados para abordar uma diversidade de questões em genética molecular incluindo expressão de genes, ligação genética e variabilidade genética (ver por exemplo: M. Chee et al., Science (1996), Vol 274, p. 610-613).

Numa forma de realização, a matriz é preparada e utilizada de acordo com os métodos descritos no pedido PCT W095/11995 (Chee et al) ; Lockhart, D.J. et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); e Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 10614-10619). Os pares de oligonucleótidos podem variar de dois até mais de um milhão. Os oligómeros são sintetizados em áreas designadas num substrato utilizando um processo químico orientado por luz. O 59 substrato pode ser papel, nylon ou outro tipo de membrana, filtro, chip, lamela de vidro ou qualquer outro suporte sólido adequado. Alternativamente, pode sintetizar-se um oligonucleótido na superfície do substrato utilizando um procedimento de acoplamento químico e um aparelho de aplicação de jacto de tinta, como descrito no pedido PCT W095/25116 (Baldeschweiler et al.). Noutro aspecto, pode utilizar-se uma matriz "quadriculada" análoga a uma transferência de pontos (ou ranhuras) para arranjar e ligar fragmentos de ADNc ou oligonucleótidos à superfície de um substrato utilizando um sistema de vácuo, procedimentos térmicos, de UV, mecânicos ou de ligação química. Uma matriz, como as aqui descritas, pode ser produzida à mão ou utilizando dispositivos (equipamento de transferência de ranhuras ou de transferência de pontos), materiais (qualquer suporte sólido adequado) e máquinas (incluindo instrumentos robóticos) disponíveis, e podem conter 8, 24, 96, 384, 1536 ou 6144 oligonucleót idos, ou qualquer outro número entre dois e mais de um milhão o que conduz por si à utilização eficiente de instrumentação comercialmente disponível.

Além dos métodos discutidos acima, as doenças podem ser diagnosticadas por métodos compreendendo a determinação, a partir de uma amostra derivada de um indivíduo, de um nível anormalmente diminuído ou elevado de polipéptido ou ARNm. A expressão diminuído ou elevado pode ser medida ao nível do ARN utilizando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica para a quantificação de polinucleótidos, como, por exemplo, amplificação de ácido nucleico, por exemplo PCR, RT-PCR, protecção de RNase, transferência de Northern e outros métodos de hibridização. 60

As técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar os niveis de um polipéptido da presente invenção numa amostra derivada de um hospedeiro são bem conhecidas dos especialistas na técnica e são discutidas com algum detalhe acima (incluindo radioimunoensaios, ensaios de ligação competitiva, análise de transferência de Western e ensaios ELISA). É divulgado um método de diagnóstico o qual compreende os passos de: (a) pôr em contacto um ligando como descrito acima com uma amostra biológica em condições adequadas para a formação de um complexo ligando-polipéptido; e (b) detectar o referido complexo.

Os protocolos tais como ELISA (como anteriormente descrito), RIA e FACS para medir niveis de polipéptidos podem proporcionar adicionalmente uma base para diagnosticar niveis alterados ou anormais de expressão do polipéptido. Os valores normais ou correntes para a expressão do polipéptido são estabelecidos combinando fluidos corporais ou extractos celulares retirados de indivíduos mamíferos normais, preferencialmente humanos, com o anticorpo contra o polipéptido em condições adequadas para formação de complexos. A quantidade de formação corrente de complexo pode ser quantificada por vários métodos, como por meios fotométricos.

Pode utilizar-se anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido da invenção para o diagnóstico de condições ou doenças caracterizadas pela expressão do polipéptido, ou em ensaios para monitorizar doentes que estão a ser tratados com os polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, ligandos e outros compostos da invenção. Os anticorpos úteis para efeitos de diagnóstico podem ser preparados do mesmo modo que os descritos acima para efeitos 61 terapêuticos. Os ensaios de diagnóstico em relação ao polipéptido incluem métodos que utilizam o anticorpo e uma etiqueta para detectar o polipéptido em fluidos corporais humanos ou extractos de células ou tecidos. Os anticorpos podem ser utilizados com ou sem modificação, e podem ser marcados juntando-os, covalentemente ou não covalentemente, com uma molécula repórter. Pode utilizar-se uma grande variedade de moléculas repórter conhecidas na técnica, várias das quais são descritas acima.

As quantidades de polipéptido expressadas nas amostras do indivíduo, de controlo e de doença de tecidos submetidos a biópsia são comparadas com os valores padrão. 0 desvio entre os valores correntes e do indivíduo estabelece os parâmetros para diagnosticar a doença. Pode utilizar-se ensaios de diagnóstico para distinguir entre a ausência, presença e excesso de expressão de polipéptido e para seguir a regulação dos níveis de polipéptido durante intervenção terapêutica. Estes ensaios também podem ser utilizados para avaliar a eficácia de um regime de tratamento terapêutico particular em estudos animais, em ensaios clínicos ou do seguimento do tratamento de um doente individual.

Um estojo de diagnóstico pode compreender: (a) uma molécula de ácido nucleico da presente invenção; (b) um polipéptido da presente invenção; ou (c) um ligando da presente invenção.

Um estojo diagnóstico pode compreender um primeiro recipiente contendo uma sonda de ácido nucleico que hibridiza em condições rigorosas com uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção; um segundo recipiente 62 contendo iniciadores úteis para amplificar a molécula de ácido nucleico; e instruções para utilizar a sonda e iniciadores para facilitar o diagnóstico de doença. 0 estojo pode compreender ainda um terceiro recipiente contendo um agente para digerir o ARN não hibridizado.

Numa alternativa, um estojo diagnóstico pode compreender uma matriz de moléculas de ácido nucleico, das quais pelo menos uma pode ser uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

Para detectar o polipéptido de acordo com a invenção, um estojo diagnóstico pode compreender um ou mais anticorpos que se ligam a um polipéptido de acordo com a invenção; e um reagente útil para detecção de uma reacção de ligação entre o anticorpo e o polipéptido.

Estes estojos serão úteis no diagnóstico de uma doença ou da susceptibilidade a uma doença na qual estão implicados membros da família de defensinas. Tais doenças podem incluir distúrbios proliferativos de células, incluindo neoplasma, melanoma, tumores do pulmão, colorrectal, da mama, do pâncreas, da cabeça e pescoço e outros tumores sólidos; distúrbios mieloproliferativos, como leucemia, linfoma não Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, distúrbio de angiogénese, sarcoma de Kaposis; distúrbios autoimunes/inflamatórios, incluindo alergia, doença inflamatória do intestino, artrite, psoríase e inflamação do aparelho respiratório, asma e rejeição de transplante de órgão; distúrbios cardiovasculares, incluindo hipertensão, edema, angina, aterosclerose, trombose, sepsia, choque, lesão de reperfusão e isquemia; distúrbios neuronais incluindo doença do sistema nervoso central, doença de 63

Alzheimer, lesão cerebral, esclerose lateral amiotrófica e dor; distúrbios do desenvolvimento; distúrbios metabólicos incluindo diabetes mellitus, osteoporose e obesidade, SIDA e doença renal; infecções incluindo infecção virai, infecção bacteriana, infecção fúngica e infecção parasitária e outras condições patológicas.

Preferencialmente, as doenças são aquelas em que estão implicados membros da família de defensinas, como a endotoxemia subletal, choque séptico, infecção microbiana da cavidade amniótica, reacção de Jarish-Herxheimer de febre recorrente, doenças infecciosas do sistema nervoso central, pancreatite aguda, colite ulcerosa, empiema, síndrome hemolítica de Gasser, doença meningocóccica, infecção gástrica, tosse convulsa, peritonite, psoríase, artrite reumatóide, sepsia, asma, HIV, SIDA e glomerulonefrite. Vários aspectos e formas de realização da presente invenção serão agora descritos em mais detalhe a título de exemplo, com referência particular aos polipéptidos INSP108 e INSP109.

Entender-se-á que poderão ser feitas modificações de detalhes sem que se saia do âmbito da invenção.

Breve descrição das Figuras

As Figuras que não se relacionam especificamente com a invenção reivindicada são incluídas apenas para informação.

Figura 1: Resultado BLAST contra a base de dados não redundante NCBI utilizando SEQ ID NO: 6 (o polipéptido INSP108) 64

Figura 2: Alinhamento entre a sequência do polipéptido INSP108 (SEQ ID NO: 6) e a defensina beta 123 (Homo sapiens)

Figura 3: Previsão do sítio de dissociação Sig P para o INSP108

Figura 4: Resultado BLAST contra o banco de dados não redundante NCBI utilizando SEQ ID NO: 14 (o polipéptido INSP109)

Figura 5: Alinhamento entre a sequência do polipéptido INSP109 (SEQ ID NO: 14) e a defensina beta 4 (Mus musculus) Figura 6: Previsão do sitio de dissociação Sig P para o INSP109

Figura 7: Sequência prevista de nucleótidos de INSP108 com tradução

Figura 8: Sequência de nucleótidos com tradução do produto de PCR INSP108 clonado utilizando iniciadores INSP108-CP1 e INSP108-CP2

Figura 9: Mapa de pCR4-TOPO-INSP108

Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16

Mapa de pDONR 221

Mapa do vector de expressão pEAK12d Mapa do vector de expressão pDEST12.2 Mapa de pDONR221-INSP108-6HIS Mapa de pEAK12d-INSP108-6HIS Mapa de pDEST12.2-INSP108-6HIS

Sequência prevista de nucleótidos de INSP109 com tradução

Figura 17: Organização do exão de codificação de INSP109 em ADN genómico e posição dos iniciadores de PCR Figura 18: Sequência de nucleótidos e tradução da ORF de INSP 109 clonada

Figura 19: Mapa de pCR4-TOPO-INSP109 Figura 20: Mapa de pDONR-lNSPl09-6HIS 65

Figura 21: Mapa de pEAK12d-INSP109-6HIS Figura 22: Mapa de pDEST12.2-INSP109-6HIS

Os Exemplos que não se relacionam com a invenção reivindicada são incluídos apenas para informação.

Exemplos

Exemplo 1: INSP 108 A sequência de polipéptido INSP108, mostrada na SEQ ID NO: 6, foi utilizada como uma pergunta BLAST contra a base de dados de sequências não redundantes NCBI. O acerto máximo é com um gene de Homo sapiens anotado como uma defensina (Figura 1) . O INSP108 alinha com esta sequência com um valor E significativo (4e“6) (Figura 2), indicando assim um grau de confiança elevado na previsão.

Exemplo 2: Sequência sinal de INSP108 A Figura 3 mostra que é previsto que a INSP108 possua um péptido sinal no início da proteína. Como os dados de SigP na Figura 3 claramente mostram, julga-se que o sítio de dissociação do péptido sinal se situa entre os resíduos 24 e 25 da sequência do polipéptido INSP108 (Nielsen, H. et ai. 1997, Protein Engineering, 10, 1-6; Nielsen, H., e Krogh, A. : Prediction of signal peptides e signal anchors by a hidden Markov model. In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, p. 122-130 (1998)).

Exemplo 3: INSP109 A sequência do polipéptido INSP109, mostrada na SEQ ID NO: 14, foi utilizada como uma pergunta BLAST contra a base de dados de sequências não redundantes NCBI. 0 acerto máximo é com uma previsão de gene de Mus musculus que não estava anotada e o segundo acerto foi com a defensina beta 4 (NP_0627 02.1) de Mus musculus (Figura 4). A Figura 5 mostra o polipéptido INSP109 alinhado com a defensina beta 4 de Mus musculus.

Exemplo 4: Sequência sinal de INSP109 A Figura 6 mostra que se prevê que a INSP109 possua um péptido sinal no inicio da proteína. Como os dados de SigP na Figura 6 claramente mostram, julga-se que o sítio de dissociação do péptido sinal se situa entre os resíduos 21 e 22 da sequência do polipéptido INSP109 (Nielsen, H. et al. 1997, Protein Engineering, 10,1-6; Nielsen, H., e Krogh, A. : Prediction of signal peptides e signal anchors by a hidden Markov model. In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, p. 122-130 (1998)).

Exemplo 5: Clonagem de INSP108 1.1 Preparação de cadeias molde de ADNc humano ADNc da primeira cadeia foi preparado de uma diversidade de amostras de ARN total de tecido humano normal (Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute e preparações feitas no laboratório) utilizando Transcriptase Inversa

Superscript II RNase H~ (Invitrogen) de acordo com o 67 protocolo do fabricante. Iniciador oligo(dl) i5 (1 μύ a 500 μg/mL) (Promega) , 2 μg de ARN total humano, 1 μ]ΐ de mistura de dNTP 10 mM (10 mM de cada um de dATP, dGTP, dCTP e dTTP a pH neutro) e água destilada estéril até um volume final de 12 μΐ; foram combinados num tubo Eppendorf de 1,5 mL, aquecidos até 65 °C durante 5 min e em seguida arrefecidos em gelo. Os conteúdos foram recolhidos por centrifugação breve e foram adicionados 4 μύ de Tampão de Primeira Cadeia 5X, 2 μΐϋ de DTT 0,1 M e 1 μύ de Inibidor de Ribonuclease

Recombinante RnaseOUT (40 unidades^L, Invitrogen) . O conteúdo do tubo foi misturado suavemente e incubado a 42 °C durante 2 min; em seguida foi adicionado 1 μΐ; (200 unidades) de enzima SuperScript II e misturada suavemente pipetando. A mistura foi incubada a 42 °C durante 50 min e em seguida inactivada aquecendo a 70 °C durante 15 min. Para remover ARN complementar ao ADNc, adicionou-se 1 μΐ; (2 unidades) de RNase H de E. coli (Invitrogen) e a mistura reaccional incubada a 37 °C durante 20 min. A mistura reaccional final de 21 μ]Ι foi diluída adicionando 179 μύ de água estéril para dar um volume total de 200 μύ. As amostras de ADNc humano utilizadas como cadeias molde para amplificação de INSP108 foram provenientes de cérebro, rim, fígado, pulmão, placenta, músculo-esquelético, intestino delgado, baço, tiróide, cólon, testículos, pele, pâncreas, glândula pituitária, glândula salivar, glândula supra-renal, olho e uma mistura de amostras de linhas de células de cancro (amostra de ARN de Referência Universal, Stratagene).

1.2 Iniciadores de clonagem específicos do gene para PCR 68

Um par de iniciadores de PCR possuindo um comprimento entre 18 e 25 bases foram concebidos para amplificar a sequência de codificação completa do ADNc virtual utilizando o Software de Concepção de Iniciadores (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EUA). Os iniciadores de PCR foram optimizados para ter uma Tm próxima de 55 ± 10 °C e um teor por GC de 40-60%. Foram seleccionados iniciadores que tinham selectividade elevada para a sequência alvo (INSP108) com pouca ou nenhuma iniciação não especifica. 1.3 Amplificação por PCR de INSP 108 de uma variedade de cadeias molde de ADNc humano

Foram concebidos iniciadores de clonagem específicos do gene (INSP108-CP1 e INSP108-CP2, Figura 7, Figura 8 e Quadro 1) para amplificar um fragmento de ADNc de 245 pb cobrindo a totalidade da sequência de codificação prevista do INSP108 com 231 pb. A análise da literatura científica sugeriu que as proteínas beta-defensinas deveriam ser expressadas em superfície de mucosa e por órgãos secretores. Os iniciadores de clonagem específicos do gene INSP108-CP1 e INSP108-CP2 foram por isso utilizados com as amostras de ADNc humano listadas na Secção 1.1 como as cadeias molde para PCR. As reacções de PCR foram realizadas num volume final de 50 μ]0 contendo tampão de PCR Platinum® Taq High Fidelity IX, MgS04 2mM, dNTPs 200μΜ, 0,2μΜ de cada iniciador de clonagem, 2,5 unidades de ADN-polimerase Platinum® Taq DNA High Fidelity (Invitrogen) e 100 ng de cadeia molde de ADNc humano utilizando um MJ Research ADN Engine, programado do seguinte modo: 94 °C, 2 min; 40 ciclos de 94°C, 30 s, 55 °C, 30 s, 68 °C, 30 s, seguidos de 69 1 ciclo a 68 °C durante 7 min e um ciclo de conservação a 4 °C.

Uma aliquota de 5 μΐ; de cada produto de amplificação foi visualizada num gel de agarose a 0,8% em tampão de TAE IX (Invitrogen) e foi observado um único produto de PCR a migrar aproximadamente à massa molecular prevista na amostra correspondente ao ADNc de testículo. O restante produto de PCR da amplificação do testículo foi submetido a electroforese num segundo gel de agarose a 0,8% e purificado utilizando o Sistema de Purificação de ADN Qiagen MinElute (Qiagen) . O produto de PCR foi eluído em 10 μύ de tampão de EB (Tris.Cl 120 mM, pH 8,5) e subclonado directamente.

1.4 Subclonagem dos Produtos de PCR 0 produto de PCR foi subclonado no vector de clonagem modificado por topoisomerase I (pCR4- TOPO) utilizando o estojo de clonagem TA adquirido da Invitrogen Corporation utilizando as condições especificadas pelo fabricante. Resumidamente, 4 μύ de produto de PCR purificado por gel da amplificação do ADNc de testículo humano foi incubado durante 15 min à temperatura ambiente com 1 μ]1 de vector TOPO e 1 μ]1 de solução salina. A mistura reaccional foi em seguida transformada na estirpe TOP 10 de E. coli (Invitrogen) do seguinte modo: uma aliquota de 50 μ]1 de células One Shot TOP10 foi descongelada em gelo e foram adicionados 2 μ]1 de reacção TOPO. A mistura foi incubada durante 15 min em gelo e em seguida submetida a choque térmico por incubação a 42 °C durante exactamente 30 s. As amostras foram recolocadas em gelo e foram adicionados 250 70 μΐ; de meio SOC morno (temperatura ambiente) . As amostras foram incubadas sob agitação (220 rpm) durante 1 h a 37 °C. A mistura de transformação foi então aplicada em placas de caldo L (LB) contendo ampicilina (100 μρ/ιηΒ) e incubada dum dia para o outro a 37 °C. 1.5 PCR de Colónia

Inoculou-se colónias em 50 μΐ; de água estéril utilizando um palito estéril. Uma aliquota de 10 μΐϋ do inoculo foi então submetida a PCR num volume reaccional total de 30 μΕ contendo tampão AmpliTaq™ IX, dNTPs 200 μΜ, 2 0 pmoles de iniciador T7, 20 pmoles de iniciador T3, 1 unidade de

AmpliTaq™ (Perkin Elmer) utilizando um MJ Research ADN Engine. As condições de ciclização foram as seguintes: 94 °C, 2 min; 30 ciclos de 94 °C, 30 s, 48 °C, 30 s e 72 °C durante 1 min. As amostras foram conservadas a 4°C (ciclo de conservação) antes de mais análise.

Os produtos de reacção de PCR foram analisados em geles de agarose 1% em tampão TAE IX. As colónias que deram o tamanho esperado para o produto de PCR (ADN c com 2 45pb + 105pb devido ao sítio de clonagem múltiplo ou MCS) foram multiplicadas dum dia para o outro a 37 °C em 5 mL de Caldo L (LB) contendo ampicilina (100 \iq/mL) , com agitação a 220 rpm. 1.6 Preparação de ADN de plasmídeo e sequenciação O ADN de plasmídeo Miniprep foi preparado a partir da cultura de 5 mL utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) ou o estojo Wizard Plus SV Minipreps 71 (Promega n° catálogo 1460) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN de plasmídeo foi eluido em 100 μΐ; de água estéril. A concentração de ADN foi medida utilizando um fotómetro Eppendorf BO. O ADN de plasmídeo (200-500 ng) foi submetido a sequenciação de ADN com o iniciador T7 e o iniciador T3 utilizando o sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems n° catálogo 4390246) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências iniciadoras são mostradas no Quadro 1. As reacções de sequenciação foram purificadas utilizando colunas Dye-Ex (Qiagen) ou placas de processamento Montage SEQ 96 (Millipore n° catálogo LSKS09624) em seguida analisadas num sequenciador Applied Biosystems 3700. A análise de sequência identificou um clone que condizia a 100% com a sequência prevista para o INSP108. A sequência do fragmento de ADNc clonado é mostrada na Figura 8. O mapa de plasmídeo do produto de PCR clonado (pCR4-TOPO-INSP108) (plasmídeo ID. 13982) é mostrado na Figura 9. 2. Construção de um plasmídeo para a expressão de INSP108 em células HEK293/EBNA.

Um clone pCR4-TOPO contendo a sequência de codificação completa (ORF) de INSP108 identificada por sequenciação de ADN (pCR4-TOPO-INSPl08, plasmídeo ID. 13982) (figura 9) foi então utilizado para subclonar o inserto nos vectores de expressão de células de mamíferos pEAK12d (figura 11) e pDEST12.2 (figura 12) utilizando a metodologia de clonagem Gateway™ (Invitrogen) . 2.1 Geração de ORF de INSP108 fundida com uma sequência etiqueta de 6HIS em grelha compatível com Gateway. 72 A primeira etapa do processo de clonagem Gateway envolve uma reacção de PCR em dois passos que gera a ORF de INSP108 flanqueada na extremidade 5' com um sitio de recombinação attBl e sequência Kozak, e flanqueada na extremidade 3' com uma sequência que codifica uma etiqueta de 6 histidinas (6HIS) em grelha, um códão de paragem e o sitio de recombinação attB2 (ADNc compatível com Gateway). A primeira reacção de PCR (num volume final de 50 μ]0) contém: 1,5 μ]0 de pCR4-TOPO- INSP108 (plasmídeo ID 13982), 1,5 μ]0 de dNTPs (10 mM) , 5 μ]0 de tampão de polimerase Pfx 10X, 1 μΐ, de MgS04 (50 mM) , 0,5 μι, de cada iniciador específico de gene (100 μΜ) (INSP108-EX1 e INSP0108-EX2) , 2,5 μΐ, de solução Enhancer™ 10X (Invitrogen) e 1 μΕ de ADN-polimerase Platinum Pfx (Invitrogen). A reacção de PCR foi realizada utilizando um passo inicial de desnaturação de 95 °C durante 2 min, seguido de 15 ciclos de 94 °C durante 15 s; 55 °C durante 30 s e 68 °C durante 2 min 30 s; e um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos de amplificação foram purificados directamente da mistura de PCR utilizando o Sistema de Purificação de ADN Wizard PCR Preps (Promega) e recuperados em 50 μ]0 de água estéril de acordo com as instruções do fabricante. A segunda reacção de PCR (num volume final de 50 μΕ) continha 10 μΕ de produto purificado de PCR 1, 1,5 μΕ de dNTPs (10 mM) , 5 μΕ de tampão de polimerase Pfx 10X, 1 μΕ de MgS04 (50 mM) , 0,5 μΕ de cada iniciador de conversão

Gateway (100 μΜ) (GCP directo e GCP inverso) e 0,5 μΕ de ADN-polimerase Platinum Pfx. As condições para a 2a reacção de PCR foram: 95 °C durante 1 min; 4 ciclos de 94 °C, 15 s; 73 50 °C, 30 s e 68 °C durante 2 min 30 s; 19 ciclos de 94 °C, 15 s; 55 °C, 30 s e 68 °C, 2 min 30 s; seguido de um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos de PCR foram purificados em gel utilizando o sistema de purificação de ADN Wizard PCR prep (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. 2.2 Subclonagem de ORF de INSP108 compatível com Gateway no vector de entrada Gateway pDONR221 e nos vectores de expressão pEAK12d e pDESTl2.2 A segunda fase do processo de clonagem Gateway envolve a subclonagem do produto de PCR modificado por Gateway no vector de entrada Gateway pDONR221 (Invitrogen, figura 10) do seguinte modo: 5 μΒ de produto purificado de PCR2 foram incubados com 1 μΒ de vector pDONR221 (0,15 μρ/μΒ), 2 μΒ de tampão PB e 1,5 μΒ de mistura enzimática PB clonase (Invitrogen) num volume final de 10 μΒ à T.A. durante 1 h. A reacção foi parada pela adição de proteinase K (2 μρ) e incubada a 37 °C durante mais 10 min. Uma alíquota desta reacção (2 μΒ) foi utilizada para transformar células DH10B de E. coli por electroporação do seguinte modo: uma alíquota de 30 μΒ de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) foi descongelada em gelo e foram adicionados 2 μΒ da mistura reaccional PB. A mistura foi transferida para uma cuveta de electroporação de 0,1 cm e as células electroporadas utilizando um Gene-Pulser™ BioRad segundo o protocolo recomendado pelo fabricante. Após electroporação foi imediatamente adicionado meio SOC (0,5 mB) que tinha sido pré-aquecido até à temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um tubo de 15 mB com tampa de encaixe e incubada, sob agitação (220 rpm) durante 1 h a 37 °C. 74

Alíquotas da mistura de transformaçao (10 μΕ e 50 μΐΟ foram então aplicadas em Placas de caldo L (LB) contendo canamicina (40 μρ/ΐΓΛ) e incubadas dum dia para o outro a 37 °C. ADN de plasmídeo Mini-prep foi preparado de culturas de 5 mL a partir de 6 das colónias resultantes utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). O ADN de plasmídeo (200-500ng) foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores 21M13 e M13Rev utilizando o sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems n° catálogo 4390246) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências iniciadoras são mostradas no Quadro 1. As reacções de sequenciação foram purificadas utilizando colunas Dye-Ex (Qiagen) ou Placas de processamento Montage SEQ 96 (Millipore n° catálogo LSKS09624) em seguida analisadas num sequenciador Applied Biosystems 3700.

O eluato de plasmídeo (2 μΐι) de um dos clones que continha a sequência correcta (pDONR221-INSP108-6HIS, plasmídeo ID 14224, figura 13) foi então utilizado numa reacção de recombinação contendo 1,5 μΕ de vector pEAK12d ou vector pDEST12.2 (figuras 11 & 12) (0,1 μg/μL), 2 μΕ de tampão LR e 1,5 μΕ de clonase LR (Invitrogen) num volume final de 10 μΕ. A mistura foi incubada à T.A. durante 1 h, parada pela adição de proteinase K (211g) e incubada a 37 °C durante mais 10 min. Uma alíquota desta reacção (1 μΕ) foi utilizada para transformar células DH10B de E. coli por electroporação do seguinte modo: uma alíquota de 30 μΕ de Células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) foi descongelada em gelo e foi adicionado 1 μΕ da mistura 75 reaccional LR. A mistura foi transferida para uma cuveta de electroporação de 0,1 cm congelada e as células electroporadas utilizando um Gene-Pulser™ BioRad de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Após electroporação foi imediatamente adicionado meio SOC (0,5 mL) que tinha sido pré-aquecido até à temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um tubo de 15 mL com tampa de encaixe e incubada, sob agitação (220 rpm) durante lha 37 °C. Aliquotas da mistura de transformação (10 μΑ e 50 μί) foram então aplicadas em placas de caldo L (LB) contendo ampicilina (100 μρ/ιπύ) e incubadas dum dia para o outro a 37 °C. ADN de plasmídeo Mini-prep foi preparado de culturas de 5 mL a partir de 6 das colónias resultantes subclonadas em cada vector utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) . O ADN de plasmídeo (200-500 ng) no vector pEAKl2d foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores pEAK12F e pEAK12R como descrito acima. O ADN de plasmídeo (200-500ng) no vector pDEST12.2 foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores 21M13 e M13Rev como descrito acima. As sequências dos iniciadores são mostradas no Quadro 1. ADN maxi-prep purificado com gradiente de CsCl foi preparado de uma cultura de 500 mL de um de cada um dos clones de sequência verificada (pEAK12d-INSP108-6HIS, número de ID do plasmídeo 14228, figura 14, e pDEST12.2-INSP108-6HIS, plasmídeo ID 14229, figura 15) utilizando o método descrito por Sambrook J. et al., 1989 (in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). O ADN de plasmídeo foi 76 ressuspenso a uma concentração de 1 \iq/\iL em água estéril e conservado a -20 °C.

Quadro 1: Clonagem de INSP108 e iniciadores de sequenciação

Iniciador Sequência (5'-3') INSP108-CP1 ATT GGT ATG GCC ACA AGG AG INSP108-CP2 CAC AAC TAT TTC CCA GTC AGT A INSP108-EX1 AA GCA GGC TTC GCC ACC ATG GCC ACA AGG AGC GTC CT INSP108-EX2 GTG ATG GTG ATG GTG TTC TGC CTC CTG CGT CTT GT GCP Directo GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC GCC ACC GCP Inverso GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG pEAK12F GCC AGC TTG GCA CTT GAT GT pEAK12R GAT GGA GGT GGA CGT GTC AG 21M13 TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13REV CAG GAA ACA GCT ATG ACC T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG G T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG

Sequência sublinhada = sequência Kozak Negrito = códão de paragem

Sequência em Itálico = etiqueta His

Exemplo 6: Clonagem de INSP109 por junção de exão 1.1 Amplificação por PCR de exões que codificam o INSP109 de ADN genómico.

Foram concebidos iniciadores de PCR para amplificar os exões 1 e 2 de INSP109 (Quadro 2). O iniciador inverso para o exão 1 (INSP109-exonlR) tem uma sobreposição de 9 pb com o exão 2 de INSP109 na sua extremidade 5' . O iniciador directo para o exão 2 (INSP109-exon2F) tem uma sobreposição de 9 pb com o exão 1 de INSP 109 na sua extremidade 5'. 77

Para gerar o exão 1 de INSP109, a reacção de PCR foi realizada num volume final de 50 μΡ e continha 1 μΡ de ADN genómico (0,1 μg/μL (Novagen Inc.) , 1,5 μΡ de dNTPs 10 mM (Amersham Pharmacia Biotech), 1 μι de MgS04 (Invitrogen),

1,5 μΐ, de INSP109-exonlF (10 μΜ) , 1,5 μΡ de INSPl09-exonlR (10 μΜ), 10 μΡ de tampão Pfx 10X e 0,5 μΡ de polimerase Pfx

(2,5υ/μΡ) (Invitrogen). As condiçoes de PCR foram 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de 94 °C durante 15 s, 57 °C durante 30 s e 68 °C durante 30 s; um ciclo de alongamento adicional de 68 °C durante 7 min; e um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos reaccionais foram carregados num gel de agarose a 2% (TAE IX) e os produtos de PCR do tamanho correcto (64 pb) foram purificados em gel utilizando um Estojo de Extracção Qiaquick Gel (Qiagen n° catálogo 28704) e eluido em 30 μΡ de tampão de eluição (Qiagen) . O exão 2 de INSP109 foi produzido e purificado utilizando o mesmo excepto que os iniciadores de PCR foram INSP109-exon2F e INSP109-exon2R, e a temperatura de emparelhamento utilizada foi de 63 °C. O produto de PCR do exão 2 de INSP109 tinha 190 pb. 1.2 Junção dos exões 1 e 2 para gerar a ORF de INSP109

Os exões 1 e 2 foram juntos numa reacção de PCR de 50 μΡ contendo 5 μΡ de exão 1 purificado em gel, 5 μΡ de exão 2 purificado em gel, 1 μΡ de dNTPs 10 mM, 2 μΡ de MgS04, 1 μΡ de INSP109-exonlF (10 μΜ) , ΙμΡ de INSP109-exon2R (10 μΜ) , 5μΡ de tampão Platinum Taq HiFi 10X e 0,5 μΡ de ADN-polimerase Platinum Taq HiFi (5υ/μΡ) (Invitrogen). As condições reaccionais foram: 94 °C, 2 min; 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s e 68 °C durante 1 78 min; um ciclo de alongamento adicional de 68 °C durante 7 min; e um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos reaccionais foram analisados num gel de agarose a 2% (TAE IX). Os produtos de PCR do tamanho correcto (236 pb) foram purificados em gel utilizando o sistema de purificação de ADN Qiagen MinElute (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, eluido em 10 μΕ de tampão EB (Tris.Cl 10 mM, pH 8,5) e subclonados directamente.

1.3 Subclonagem de Produtos de PCR O produto de PCR foi subclonado no vector de clonagem modificado por topoisomerase I (pCR4-TOPO) adguirido de Invitrogen Corporation utilizando as condições especificadas pelo fabricante. Resumidamente, 4 μΕ de produto de PCR purificado por gel foi incubado durante 15 min à temperatura ambiente com 1 μΕ de vector TOPO e 1 μΕ de solução salina. A mistura reaccional foi então transformado na estirpe TOP10 de E. coli (Invitrogen) do seguinte modo: uma alíquota de 50 μΕ de células TOPIO One Shot foi descongelada em gelo e foram adicionados 2 μΕ de reacção TOPO. A mistura foi incubada durante 15 min em gelo e em seguida submetida a choque térmico por incubação a 42 °C durante exactamente 30 s. As amostras foram recolocadas em gelo e foram adicionados 250 μΕ de meio SOC morno (temperatura ambiente). As amostras foram incubadas com agitação (220 rpm) durante 1 h a 37 °C. A mistura de transformação foi então aplicada em Placas de caldo L (LB) contendo ampicilina (100 μρ/πΕΟ) e incubada dum dia para o outro a 37 °C. 1.4 PCR de Colónia 79

Inoculou-se colónias resistentes a ampicilina em 50 μ]Ι de água estéril utilizando um palito estéril. Uma aliquota de 10 \1L do inoculo foi então submetida a PCR num volume reaccional total de 20 μΐϋ contendo tampão AmpliTaq™ IX, dNTPs 200 μΜ, 20 pmoles de iniciador T7, 20 pmoles de iniciador T3, 1 unidade de AmpliTaq™ (Perkin Elmer) utilizando um MJ Research ADN Engine. As condições de ciclização foram do seguinte modo: 94 °C, 2 min; 30 ciclos de 94 °C, 30 s, 48 °C, 30 s e 72 °C durante 1 min. As amostras foram mantidas a 4°C (ciclo de conservação) antes de mais análise.

Os produtos reaccionais de PCR foram analisados em geles de agarose a 1% em tampão TAE IX. As colónias que deram o tamanho de produto de PCR esperado (236 pb de ADNc + 103 pb devido ao sitio de clonagem múltiplo ou MCS) foram multiplicadas dum dia para o outro a 37 °C em 5 mL de caldo L (LB) contendo ampicilina (100μg/mL), com agitação a 220 rpm. 1.5 Preparação e sequenciação de ADN de plasmídeo

Preparou-se ADN de plasmídeo Miniprep de culturas de 5 mL utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) ou o estojo Wizard Plus SV Minipreps (Promega n° catálogo 1460) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN de plasmídeo foi eluído em 100 μΤ de água estéril. A concentração de ADN foi medida utilizando um fotómetro Eppendorf BO. 0 ADN de plasmídeo (200-500ng) foi submetido a sequenciação de ADN com o iniciador T7 utilizando o sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems n° catálogo 80 4390246) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências iniciadoras são mostradas no Quadro 2. As reacções de sequenciação foram purificadas utilizando colunas Dye-Ex (Qiagen) ou placas de processamento Montage SEQ 96 (Millipore n° catálogo LSKS09624) em seguida analisadas num sequenciador Applied Biosystems 3700. A análise da sequência identificou um clone que condizia a 100% com a sequência prevista para o INSP109. A sequência do fragmento de ADNc clonado é mostrada na Figura 18. O mapa de plasmideo do produto de PCR clonado (pCR4-TOPO-INSP109) (plasmideo ID. 13984) é mostrado na Figura 19. 3. Construção de um plasmideo para a expressão de INSP109 em células HEK293/EBNA.

Um clone pCR4-T0P0 contendo a sequência de codificação (ORF) completa de INSP109 identificado por sequenciação de ADN (pCR4-TOPO-INSP109, plasmideo ID. 13984) (figura 19) foi então utilizado para subclonar o inserto nos vectores de expressão de células de mamíferos pEAK12d (figura 11) e pDEST12.2 (figura 12) utilizando a metodologia de clonagem Gateway (Invitrogen). 2.1 Geração de orf de INSP109 compatível com Gateway fundida com uma sequência etiqueta de 6HIS em grelha. A primeira fase do processo de clonagem Gateway envolve uma reacção de PCR de dois passos a qual gera a ORF de INSP109 flanqueada na extremidade 5' com um sítio de recombinação attBl e uma sequência Kozak, e flanqueada na extremidade 3' com uma sequência que codifica uma etiqueta de 6 histidinas 81 (6HIS) em grelha, um códao de paragem e o sítio de recombinação attB2 (ADNc compatível com Gateway). A primeira reacção de PCR (num volume final de 50 μΐΟ contém: 1,5 μτ, de pCR4-TOPO-INSP109 (plasmídeo ID 13984), 1.5 μΐ; de dNTPs (10 mM) , 5 μΐ; de tampão de polimérase Pfx 10X, 1 μΡ de MgS04 (50mM) , 0,5 μΐ, de cada iniciador específico de gene (100 μΜ) (INSP109-EX1 e INSP109-EX2), 2.5 μΕ de solução Enhancer™ 10X (Invitrogen) e 1 μΕ de

ADN-polimerase Platinum Pfx (Invitrogen). A reacção de PCR foi realizada utilizando um passo inicial de desnaturação de 95 °C durante 2 min, seguido de 15 ciclos de 94 °C durante 15 s; 55 °C durante 30s e 68 °C durante 2 min 30 s; e um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos de amplificação foram purificados directamente da mistura de PCR utilizando o Sistema de Purificação de ADN Wizard PCR Preps (Promega) e recuperados em 50 μΐϋ de água estéril de acordo com as instruções do fabricante. A segunda reacção de PCR (num volume final de 50 μΐι) continha 10 μΕ do produto de PCR 1 purificado, 1,5 μΐ; de dNTPs (10 mM) , 5μ]1 de tampão de polimerase Pfx 10X, 1 μΐ; de MgS04 (5 0mM) , 0,5 μ]1 de cada iniciador de conversão Gateway (100 μΜ) (GCP directo e GCP inverso) e 0,5 μΐ; de ADN-polimerase Platinum Pfx. As condições para a 2a reacção de PCR foram: 95 °C durante 1 min ; 4 ciclos de 94 °C, 15 s; 50 °C, 30 s e 68 °C durante 2 min 30 s; 19 ciclos de 94 °C, 15 s; 55 °C, 30 s e 68 °C, 2 min 30 s; seguidos de um ciclo de conservação de 4 °C. Os produtos de PCR foram purificados em gel utilizando o sistema de purificação de 82 ADN Wizard PCR prep (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. 2.2 Subclonagem de ORF de INSP109 compatível com Gateway no vector de entrada Gateway pDONR221 e nos vectores de expressão pEAK12d e pDESTl2.2 A segunda fase do processo de clonagem Gateway envolve a subclonagem do produto de PCR modificado por Gateway no vector de entrada Gateway pDONR221 (Invitrogen, figura 10) do seguinte modo: 5 μΐ^ de produto purificado de PCR2 foram incubados com 1 μΐϋ de vector pDONR221 (0,15 μ^/μΕ), 2 μΐϋ de tampão PB e 1,5 μΕ de mistura enzimática PB clonase (Invitrogen) num volume final de 10 μ]Ι à T.A. durante 1 h. A reacção foi parada pela adição de proteinase K (2 μρ) e incubada a 37 °C durante mais 10 min. Uma alíquota desta reacção (2 μ]Ι) foi utilizada para transformar células DH10B de E. coli por electroporação do seguinte modo: uma alíquota de 30μ]Ι de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) foi descongelada em gelo e foram adicionados 2 μΐ, da mistura reaccional PB. A mistura foi transferida para uma cuveta de electroporação de 0,1 cm congelada e as células electroporadas utilizando um Gene-Pulser BioRad de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Após electroporação foi imediatamente adicionado meio SOC (0,5 mL) que tinha sido pré-aquecido até à temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um tubo de 15 mL com tampa de encaixe e incubada, sob agitação (220 rpm) durante lha 37 °C. Alíquotas da mistura de transformação (10 μΕ e 50 μΕ) foram então aplicadas em placas de caldo L (LB) 83 contendo canamicina (40 μg/mL) e incubadas dum dia para o outro a 37 °C.

Preparou-se ADN de plasmídeo Mini-prep de culturas de 5 mL de 6 das colónias resultantes utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). O ADN de plasmídeo (200-500 ng) foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores 21M13 e M13Rev utilizando o sistema

BigDyeTerminator (Applied Biosystems n° catálogo 4390246) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências iniciadoras são mostradas no Quadro 2. As reacções de sequenciação foram purificadas utilizando colunas Dye-Ex (Qiagen) ou Placas de processamento Montage SEQ 96 (Millipore n° catálogo LSKS09624) em seguida analisadas num sequenciador Applied Biosystems 3700.

O eluato de plasmídeo (2 μΐ^ de um dos clones que continha a sequência correcta (pDONR221-INSP109-6HIS, plasmídeo ID 14230, figura 20) foi então utilizado numa reacção de recombinação contendo 1,5 μ]0 de vector pEAK12d ou vector pDEST12.2 (figuras 11 & 12) (0,1 μg/μL) , 2 μΐ^ de tampão LR e 1,5 μΐ^ de clonase LR (Invitrogen) num volume final de 10 μL. A mistura foi incubada à T.A. durante 1 h, parada pela adição de proteinase K (2 μρ) e incubada a 37 °C durante mais 10 min. Uma alíquota desta reacção (1 μL) foi utilizada para transformar células DH10B de E. coli por electroporação do seguinte modo: uma alíquota de 30μΒ de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) foi descongelada em gelo e foi adicionado 1 μΒ da mistura reaccional LR. A mistura foi transferida para uma cuveta de electroporação de 0,1 cm congelada e as células 84 electroporadas utilizando um Gene-Pulser™ BioRad de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Após electroporação foi imediatamente adicionado meio SOC (0,5 mL) que tinha sido pré-aquecido até à temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um tubo de 15 mL com tampa de encaixe e incubada, sob agitação (220 rpm) durante lha 37 °C. Aliquotas da mistura de transformação (10 μρ e 50 μΡ) foram então aplicadas em placas de caldo L (LB) contendo ampicilina (100 μρ/πΟΟ) e incubadas dum dia para o outro a 37 °C.

Preparou-se ADN de plasmideo Mini-prep de culturas de 5 mL de 6 das colónias resultantes subclonadas em cada vector utilizando um sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). 0 ADN de plasmideo (200-500 ng) no vector pEAK12d foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores pEAK12F e pEAK12R como descrito acima. O ADN de plasmideo (200-500 ng) no vector pDESTl2.2 foi submetido a sequenciação de ADN com iniciadores 21M13 e M13Rev como descrito acima. As sequências dos iniciadores são mostradas no Quadro 2. ADN maxi-prep purificado com gradiente de CsCl foi preparado de uma cultura de 500 mL de um de cada um dos clones de sequência verificada (pEAK12d-INSP109-6HIS, número de ID do plasmideo 14231, figura 21, e pDEST12.2-INSP109-6HIS, plasmideo ID 14350, figura 22) utilizando o método descrito por Sambrook J. et al., 1989 (in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). O ADN de plasmideo foi ressuspenso a uma concentração de 1 μg/μL em água estéril e conservado a -20°C. 85

Quadro 2: Iniciadores para clonagem e sequenciação de INSP109

Iniciador Sequência (5'-3' ) GCP Directo GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC GCC ACC GCP Inverso GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG INSP109-exonlF ATG AAC CTC TGT CTT TCT GCA TTA CTC INSP109-exonlR illliiiliii GTA AGA TCA C INSP109-exon2F GAA AAG '?· V A TGT TTG GGA ATG INSP109-exon2R TAA TGA ACC CAT GGA TCT TTG GCT TGC GG INSP109-EX1 GCA GGC TTC GCC ACC ATG AAC CTC TGT CTT TCT GC INSP109-EX2 GTG ATG GTG ATG GTG ATG AAC CCA TGG ATC TTT GG pEAK12-F GCC AGC TTG GCA CTT GAT GT pEAK12-R GAT GGA GGT GGA CGT GTC AG pENTR-F TCG CGT TAA CGC TAG CAT GGA TCT C pENTR-R GTA ACA TCA GAG ATT TTG AGA CAC T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T3 CTC CCT TTA GTG AGG GTA ATT

Sequência sublinhada = sequência Kozak Negrito = códão de paragem

Sequência em Itálico = etiqueta His lilqu&hdía. lllillilllr sdteeposí-çio caía

Exemplo 7: Expressão e purificação de INSP108 e INSP109

Agora podem ser realizadas outras experiências para determinar a distribuição e níveis de expressão no tecido dos polipéptidos INSP108 e INSP109 in vivo, com base no nucleótido e sequência de aminoácidos aqui divulgados. A presença de transcriptos para INSP108 e INSP109 pode ser investigada por PCR de ADNc de tecidos humanos diferentes. Os transcriptos INSP108 e INSP109 podem estar presentes a níveis muito baixos na amostra testada. Portanto, é necessário um cuidado extremo na concepção de experiências 86 para estabelecer a presença de um transcripto em vários tecidos humanos já que uma pequena quantidade de contaminação genómica na preparação de ARN originará um resultado falso positivo. Assim, todo o ARN deverá ser tratado com DNASe antes da utilização em transcrição inversa. Além disso, para cada tecido pode ser efectuada uma reacção de controlo na qual não seja realizada a transcrição inversa (um controlo RT -vo).

Por exemplo, 1 μρ de ARN total de cada tecido pode ser utilizado para gerar ADNc utilizando transcriptase inversa Multiscript (ABI) e iniciadores hexaméricos aleatórios. Para cada tecido é preparada uma reacção de controlo na qual são adicionados todos os constituintes excepto a transcriptase inversa (controlo RT -vo) . São preparadas reacções de PCR para cada tecido nas amostras de ARN de transcrição inversa e nos controlos RT menos. Os iniciadores específicos de INSP085 podem ser facilmente concebidos com base na informação aqui proporcionada sobre a sequência. A presença de um produto da massa molecular correcta na amostra de transcrição inversa em conjunto com a ausência de um produto no controlo RT menos pode ser tomada como evidência para a presença de um transcripto nesse tecido. Pode utilizar-se quaisquer bibliotecas de ADNc adequadas para rastrear no que se refere a presença de transcriptos de INSP108 e INSP109, e não apenas para aqueles gerados como descrito acima. 0 padrão de distribuição no tecido dos polipéptidos INSP108 e INSP109 proporcionará mais informação útil relativamente à função desses polipéptidos. 87

Além disso, agora podem ser realizadas outras experiências utilizando os vectores de expressão pEAK12d-INSP108-6HIS, pEAK12d-INSP109-6HIS, pDEST12.2-INSP108-6HIS e pDEST12.2-INSP109-6HIS. A transfecção de linhas de células de mamíferos com estes vectores pode permitir a expressão de nível elevado das proteínas INSP108 e INSP109 e permitir assim a investigação contínua das características funcionais dos polipéptidso INSP108 e INSP109. Os materiais e métodos seguintes são um exemplo dos adequados em tais experiências:

Cultura de Células Células Embrionárias de Rim Humano 293 que expressam o Antigénio Nuclear do Vírus Epstein-Barr (HEK293-EBNA, Invitrogen) são mantidas em suspensão em meio Ex-celular isento de soro VPRO (cultura-mãe, meio de conservação, JRH). Dezasseis a 20 horas antes da transfecção (Dia 1), as células são aplicadas em balões 2xT225 (50 mL por balão em DMEM / F12 (1:1) contendo 2% de meio de cultura FBS (JRH) a uma densidade de 2xl05 células/mL). No dia seguinte (dia 0 da transfecção) efectua-se a transfecção utilizando o reagente JetPEITM (2 μ]0/μρ de ADN de plasmídeo, transfecção PoliPlus) . Para cada balão, o ADN de plasmídeo é co-transfectado com ADN de GFP (gene repórter fluorescente). A mistura de transfecção é então adicionada aos balões 2xT225 e incubada a 37 °C (5% de CO2) durante 6 dias. A confirmação de transfecção positiva pode ser realizada por exame de fluorescência qualitativo no dia 1 e no dia 6 (Axiovert 10 Zeiss).

No dia 6 (dia de colheita) , os sobrenadantes dos dois balões são misturados e centrifugados (por exemplo, 4°C, 88 400 g) e colocados num recipiente com um identificador único. Uma alíquota (500 μύ) é mantida para QC da proteína marcada com 6His (QC de bioprocessamento interno).

Podem ser produzidos lotes de aumento de escala seguindo o protocolo chamado "transfecção PEI de células em suspensão," codificado BP/PEI/HH/02/04, com PoliEtilenoImina da Polisciences como agente de transfecção.

Processo de purificação A amostra do meio de cultura contendo a proteína recombinante com uma etiqueta de 6His C-terminal é diluída com tampão A frio (Nat^POí 50 mM; NaCl 600 mM; 8,7 % (m/v) de glicerol, pH 7,5). A amostra é então filtrada através de um filtro estéril (Millipore) e mantida a 4°C num frasco quadrado de meio estéril (Nalgene). A purificação é realizada a 4°C na estação de trabalho VISION (Applied Biosystems) ligada a um amostrador automático (Labomatic). 0 procedimento de purificação é constituído por dois passos sequenciais, cromatografia de afinidade metálica numa coluna Poros 20 MC (Applied Biosystems) carregada com iões Ni (4,6 x 50 mm, 0,83 mL) , seguida de filtração em gel numa coluna de meio Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia) (1,0 x 10 cm).

Para o primeiro passo de cromatografia, a coluna de afinidade metálica é regenerada com 30 volumes da coluna de solução de EDTA (EDTA 100 mM; NaCl 1 M; pH 8,0), recarregada com iões Ni através de lavagem com 15 volumes 89 da coluna de uma solução de NiS04 100 mM, lavada com 10 volumes da coluna de tampão A, seguidos de 7 volumes da coluna de tampão B (NaH2PC>4 50 mM; NaCl 600 mM; 8,7 % (m/v) glicerol, 400 mM; imidazole, pH 7,5) e finalmente eguilibrada com 15 volumes da coluna de tampão A contendo imidazole 15 mM. A amostra é transferida, pelo amostrador automático Labomatic, para dentro de uma espiral de amostra de 200 mL e subseguentemente carregada na coluna de afinidade metálica de Ni a um caudal de 10 mL/min. A coluna é lavada com 12 volumes da coluna de tampão A, seguidos de 28 volumes da coluna de tampão A contendo imidazole 20 mM. Durante a lavagem com imidazole 20 mM, as proteínas contaminantes fracamente ligadas são eluidas da coluna. A proteína marcada com His recombinante é finalmente eluída com 10 volumes da coluna de tampão B a um caudal de 2 mL/min e a proteína eluída é recolhida.

Para o segundo passo de cromatografia, a coluna de filtração de gel Sephadex G-25 é regenerada com 2 mL de tampão D (NaCl 1,137 M; KC1 2,7 mM; KH2P04 1,5 mM; Na2HP04 8 mM; pH 7,2), e subsequentemente equilibrada com 4 volumes da coluna de tampão C (NaCl 137mM; KC1 2,7 mM; KH2P04 1,5 mM; Na2HP04 8mM; 20% (m/v) de glicerol; pH 7,4). A fracção de pico que elui da coluna de Ni é automaticamente carregada na coluna Sephadex G-25 através do amostrador automático integrado no VISION e a proteína é eluída com tampão C a um caudal de 2 mL/min. A fracção foi filtrada através de um filtro de centrifugação estéril (Millipore), congelada e conservada a -80°C. Uma alíquota da amostra é analisada por transferência de Western em SDS-PAGE (4-12% de gel NuPAGE; Novex) com anticorpos anti-His. 0 gel NuPAGE pode ser revelado numa solução de revelação de azul de Coomassie R250 a 0,1 % (30% de metanol, 10% de ácido 90 acético) à temperatura ambiente durante lhe subsequentemente desrevelada em 20% de metanol, 7,5% de ácido acético até o fundo ser transparente e as bandas de proteína claramente visíveis.

Após a electroforese, as proteínas são electrotransferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. A membrana é bloqueada com leite em pó a 5% em tampão E (NaCl 137 mM; KC1 2,7 mM; KH2P04 1,5 mM; Na2HP04 8 mM; 0,1 % de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente, e subsequentemente incubadas com uma mistura de 2 anticorpos policlonais de coelho anti-His (G-18 e H-15, 0,2 μρ/ηϋΐ cada; Santa Cruz) em leite em pó a 2,5% em tampão E dum dia para o outro a 4°C. Após mais 1 hora de incubação à temperatura ambiente, a membrana é lavada com tampão E (3 x 10 min) e em seguida incubada com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP (DAKO, HRP 0399) diluído a 1/3000 em tampão E contendo 2,5% de leite em pó durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem com tampão E (3 x 10 minutos), a membrana é revelada com o estojo ECL (Amersham Pharmacia) durante 1 min. A membrana é subsequentemente exposta a uma Hyperfilm (Amersham Pharmacia), a película é revelada e a imagem de transferência de western analisada visualmente.

Para amostras que exibiram bandas de proteína detectáveis por revelação com Coomassie, a concentração de proteína pode ser determinada utilizando o estojo de doseamento de proteína BCA (Pierce) com albumina de soro bovino como padrão. 91

Além disso, a sobreexpressão ou a anulação da expressão dos polipéptidos em linhas de células pode ser utilizada para determinar o efeito na activação transcricional do genoma da célula hospedeira. Os parceiros de dimerização, co-activadores e co-repressores dos polipéptidos INSP108 e INSP109 podem ser identificados por imunoprecipitação associada a transferência de Western e imunoprecipitação associada a espectrometria de massa.

Exemplo 8: Ensaios para a detecção de actividade defensina

Ensaio com base em Células e Animais para a validação e caracterização dos polipéptidos tipo quimiocina.

Foram desenvolvidos vários ensaios para testar a especificidade, potência e eficácia de quimiocinas utilizando culturas de células ou modelos animais, por exemplo o ensaio de quimiotaxia in vitro (Proudfoot A, et al. J Biol Chem 276: 10620-10626, 2001; Lusti-Narasimhan M et al., J Biol Chem, 270: 2716-21,1995) ou da tumefacção da orelha de rato (Garrigue JL et al., Contact Dermatitis, 30: 231-7, 1994). Muitos outros ensaios e tecnologias para gerar ferramentas e produtos úteis (anticorpos, animais transgénicos, proteínas marcadas radioactivamente, etc.) foram descritos em revisões e livros dedicados às quimiocinas (Methods Mol. Biol vol. 138, "Chemokines Protocols", ditado por Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 e 288, Academic

Press, 1997), e podem ser utilizados para verificar, de um modo mais exacto, as actividades biológicas dos polipéptidos tipo quimiocina da invenção e reagentes afins relacionados com os possíveis métodos e utilizações terapêuticos ou de diagnóstico. 92

Ensaios de modulação da Expressão de Citoquinas

Os ensaios com base em células em triplicado in vitro seguintes medem os efeitos da proteína da invenção na secreção de citoquinas induzida por Concanavalina A (Con A) que actua em células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMC) diferentes como medido por um ensaio de matriz de esferas de citoquina (CBA) para IL-2, IFN-γ, TNF-a, IL-5, IL-4 e IL-10 como o estojo CBA para Citoquinas Thl/Th2 humanas (Becton-Dickinson).

As condições óptimas são 100 000 células/poço em placas de 96 poços e 100 μ]0 finais em glicerol a 2 %. A concentração óptima de mitogénio (ConA) é de 5 ng/mL. O tempo óptimo para o ensaio é de 48 h. A escolha de leitura é a CBA. 1 Purificação de PBMC humanas de uma crosta inflamatória A crosta inflamatória 1 até 2 é diluída com DMEM. Depois foram ali adicionados lentamente 25 mL de sangue diluído numa camada de 15 mL de Ficoll num tubo Falcon de 50 mL, e os tubos são centrifugados (2000 rpm, 20 min, à T.A. sem travar). A interfase (anel) é então recolhida e as células são lavadas com 25 mL de DMEM seguida de um passo de centrifugação (1200 rpm, 5 min). Este procedimento é repetido três vezes. Uma crosta inflamatória dá aproximadamente 600 x 105 células totais. 2 Rastreio 93 80 μ]0 de 1,25 x 106 células/mL são diluídos em DMEM + 2,5% de Soro Humano + 1% de L-Glutamina + 1% de Penicilina-

Estreptomicina e, depois disso, adicionados a uma placa microtítulo de 96 poços. São adicionados 10 μΕ por poço (uma condição por poço): As proteínas foram diluídas em PBS+20% de Glicerol (a diluição final das proteínas é 1/10). São então adicionados 10 μΕ do estimulante ConA (50 μg/mL) por poço (uma condição por poço - a concentração final de ConA é 5μρ/π1Ι1)

Após 48 h, os sobrenadantes celulares são recolhidos e as citoquinas humanas são medidas com o estojo CBA para Citoquinas Thl/Th2 Humanas, Becton-Dickinson.

3 Análise CBA (para mais detalhes, remete-se para as instruções do fabricante no estojo CBA) i) Preparação de Esferas de Captura Thl/Th2 Humanas Mistas

Determina-se o número de tubos de ensaio necessários para cada experiência.

Cada suspensão de esferas de captura é vigorosamente submetida a agitação em vortex durante alguns segundos antes de se misturar. Para cada ensaio a ser analisado são adicionadas alíquotas de 10 μΕ de cada esfera de captura para um único tubo marcado "esferas de captura mistas". A mistura de esferas é submetida a agitação exaustiva em vortex. ii) Preparação de amostras de ensaio 94

Os sobrenadantes são diluídos (1:4) utilizando o Diluente de Ensaio (20 μΐϋ de sobrenadantes + 60 μ]1 de Diluente de Ensaio). A diluição da amostra é então misturada antes de se transferir amostras para uma placa microtítulo de 96 poços de fundo cónico (Nunc). iii) Procedimento de Ensaio CBA para Citoquinas Thl/Th2

Humanas

Adiciona-se 50 μι, dos sobrenadantes diluídos a uma placa microtítulo de 96 poços de fundo cónico (Nunc). Adiciona-se 50 μΐ, de esferas de captura mistas, seguida da adição de 50 μ]ΐ do Reagente de Detecção PE de Thl/Th2 Humanas. A placa é depois incubada durante 3 horas à T.A. e protegida da exposição directa à luz, seguida de centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é então cuidadosamente rejeitado. Num passo seguinte, adiciona-se duas vezes 200 μΐ, de tampão de lavagem a cada poço, centrifuga-se a 1500 rpm durante 5 minutos e rejeita-se cuidadosamente o sobrenadante. Adiciona-se depois 130 μΕ de tampão lavagem a cada poço para ressuspender o sedimento de esferas. As amostras são finalmente analisadas num citómetro de fluxo. Os dados são então analisados utilizando o Software de Aplicação CBA, o software Activity Base e o Microsoft Excel. A partir da leitura do ensaio pode avaliar-se se in vitro, a proteína da invenção tem um efeito inibidor coerente em todas as citoquinas testadas (IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL- 5, IL-10). 95

Além disso, com base no valor de EC50, pode avaliar-se facilmente qual a citoquina que é mais inibida e em seguida deduzir a doença auto-imune/inflamatória especifica, que se sabe estar particularmente ligada a essa citoquina.

Ensaios direccionados para a resposta de linfócitos T

Morte de células T induzida pelo Ligando Fas. Este ensaio revelará novos moduladores da morte celular mediada por receptor.

Neste ensaio, a apoptose de células T é induzida estimulando células Jurkat (uma linha de células T humana) com Ligando Fas marcado com 6 Histidinas recombinante combinado com um anticorpo monoclonal anti-6-his. A morte é quantificada pela libertação de LDH, uma enzima citoplasmática libertada para o meio de cultura quando as células estão a morrer. A leitura é uma leitura de ensaio colorimétrico a 490nm. Foi demonstrado que as células T são patogénicas em muitas doenças autoimunes, pelo que a capacidade de controlar a morte de células T especifica do antigénio é uma estratégia terapêutica (por exemplo, tratamento anti-TNFa num doente com doença de Crohn). MLR Humana: proliferação e secreção de citoquinas. Este ensaio com base em células mede os efeitos de proteínas novas na proliferação de linfócitos e secreção de citoquinas ou inibição após estimulação por PBMC de outro doador (alorreactividade). Este ensaio aborda as funções de células T especificas do antigénio e células apresentadoras de antigénio, as quais são respostas celulares cruciais em qualquer doença auto-imune. As citoquinas segregadas (IL-2, 4, 5, 10, TNF-α e IFN-γ) são quantificadas por CBA. 96

Nota: a proliferação e secreção de citoquinas são respostas independentes. MLR de rato: proliferação. Este ensaio com base em células mede os efeitos de proteínas novas na proliferação de linfócitos ou na inibição de células de baço de rato após estimulação por células de baço de outro doador (raça de rato) . Este ensaio com base em células mede o efeito de proteínas novas nas respostas dos linfócitos T e das células apresentadoras de antigénio e será utilizada para confirmar a actividade de positivos e identificar acertos nos ensaios de h-MLR. Este ensaio será utilizado para seleccionar proteínas que serão testadas em modelos murídeos de doenças humanas. PBMC humanas estimuladas com o superantigénio, TSST.

Os superantigénios são moduladores fortes do sistema imunitário que afectam as células T. Os superantigénios influenciam distúrbios mediados imunologicamente como o IBD, doenças inflamatórias da pele como dermatite atópica e psoríase. Neste ensaio celular, nós estamos a visar especificamente a activação de linfócitos T via a TCR mas com requisitos diferentes da resposta de células T a antigénios clássicos, em particular no que se refere às moléculas co-estimuladoras. PBMC humanas estimuladas com ConA ou PHA. Estes ensaios com base em células medem os efeitos de proteínas novas na secreção de citoquinas induzida por dois estímulos diferentes que actuam em células diferentes como medido por 97 um ensaio de matriz de esferas de citoquinas (CBA) (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4 e IL-10). A maioria das citoquinas pode ter uma acção dupla, pró- ou anti-inflamatória, dependendo da lesão, meio e alvo celular. Qualquer proteína com a capacidade para modular a secreção de citoquinas pode ter um potencial terapêutico (por exemplo, a diminuição de IFN-γ e TNF-α seria benéfica em doenças auto-imunes mediadas por Thl, em contrapartida a diminuição de IL-4, IL-5 poderia ser benéfica em doenças mediadas por Th2, a indução de IL-10 seria interessante em MS e SLE) .

Ensaios direccionados para as respostas de monócitos/macrófagos e granulócitos PBMC humanas estimuladas com LPS. Este ensaio com base em células mede os efeitos de proteínas novas na secreção de citoquinas (IFN-γ, TNF-α) induzida por LPS que actua em monócitos/macrófagos e granulócitos.

Qualquer proteína com a capacidade para modular a secreção de IFN-γ e TNF-cc seria benéfica em doenças auto-imunes mediadas por Thl.

Ensaios que visam as respostas de neutrófilos

Os neutrófilos são importantes na inflamação e doenças autoimunes como a artrite reumatóide. Os quimioatractores de leucócitos como a IL-8 iniciam uma sequência de interacções adesivas entre as células e o endotélio micro-vascular, resultando na activação, adesão e finalmente 98 migração de neutrófilos. A infiltração no tecido de neutrófilos depende da reorganização dos elementos do citosqueleto associados a alterações especificas na morfologia celular destas células.

Este ensaio com base em células mede o efeito de proteínas novas na reorganização do citosqueleto de neutrófilos humanos.

Ensaios que visam as respostas de linfócitos B

Julga-se que os autoanticorpos e as células B infiltrantes sejam importantes na patogénese de várias doenças autoimunes, como o lúpus eritematoso sistémico (SLE), artrite reumatóide (RA), síndrome de Sjogren e miastenia grave. Evidência persuasiva indica que uma desregulação na homeostasia de células B poderia afectar a tolerância imune conduzindo à sobrevivência inapropriada de células B auto-reactivas produzindo anticorpos patogénicos e inflamação prolongada. A identificação de novos factores que desempenhem papéis críticos na regulação da proliferação, sobrevivência e diferenciação de células B após a activação do receptor de células B são de alta relevância no desenvolvimento de novas terapias.

Proliferação de células B. Este ensaio com base em células mede o efeito de proteínas novas na sobrevivência de células B.

Co-estimulação de células B. Este ensaio com base em células mede o efeito de proteínas novas na co-estimulação de células B. 99

Ensaios que visam respostas de monócitos e microgliais

Fluxo de cálcio em THP-1. 0 ensaio de fluxo de Ca+ em células THP1 mede os efeitos de proteínas novas na sua capacidade para desencadear uma libertação de cálcio intracelular (um evento genérico de mensageiro secundário) do retículo endoplasmático.

Proliferação de células de microglia (será apresentado no próximo IAC).

Sabe-se que, durante a proliferação de progenitores microgliais, um número de factores estimuladores de colónias, incluindo algumas citoquinas, desempenham papéis chave. Entre estes, o M-CSF é crucial para o passo final de maturação de macrófagos/microglia e não é substituível por qualquer outro factor. A avaliação desta resposta biológica pode representar uma maneira de influenciar a actividade microglial e, portanto, uma oportunidade para identificar moléculas com potencial terapêutico para MS.

Foi desenvolvido um ensaio com base em células para medir a resposta proliferativa de uma linha de célula de microglia ao M-CSF. As fases de praticabilidade e robustez apresentaram resultados óptimos. Este ensaio é em placas de 96 poços; é necessário um substrato não radioactivo, facilmente automatizado. 100

Lista de sequências de INSP108 e INSP109 (listagem de Sequências): SEQ ID NO: 1 (sequência de nucleótidos do exão 1 de INSP108)

1 ATGGCCACAA GGAGCGTCCT CTTGGCCCTC GTGGTCCTTA ACTTACTCTT 51 CTATGTTCCA CCAG SEQ ID NO: 2 (sequência do exão 1 do polipéptido INSP108)

1 MATRSVLLAL WLNLLFYVP PG SEQ ID NO: 3 (sequência de nucleótidos do exão 2 de INSP108)

1 GTAGAAGTGG ACCCAATGTC TACATACAAA AAATCTTTGC TTCATGTTGG 51 CGACTGCAAG GTACTTGCCG GCCAAAATGT CTAAAAAACG AACAATATCG 101 TATTTTGTGT GATACTATAC ATTTGTGCTG TGTAAACCCA AAATATTTAC 151 CTATACTGAC TGGGAAATAG SEQ ID NO: 4 (sequência do exão 2 do polipéptido INSP108) 1 RSGPNVYIQK IFASCWRLQG TCRPKCLKNE QYRILCDTIH LCCVNPKYLP 51 ILTGK* SEQ ID NO: 5 (sequência de nucleótidos de INSP108)

1 ATGGCCACAA GGAGCGTCCT CTTGGCCCTC GTGGTCCTTA ACTTACTCTT 51 CTATGTTCCA CCAGGTAGAA GTGGACCCAA TGTCTACATA CAAAAAATCT 101 TTGCTTCATG TTGGCGACTG CAAGGTACTT GCCGGCCAAA ATGTCTAAAA 151 AACGAACAAT ATCGTATTTT GTGTGATACT ATACATTTGT GCTGTGTAAA 201 CCCAAAATAT TTACCTATAC TGACTGGGAA ATAG SEQ ID NO: 6 (sequência do polipéptido INSP108) 1 MATRSVLLAL WLNLLFYVP PGRSGPNVYI QKIFASCWRL QGTCRPKCLK 51 NEQYRILCDT IHLCCVNPKY LPILTGK* SEQ ID NO: 7 (sequência de nucleótidos de INSP108 maduro) 101

1 GGACCCAATG TCTACATACA AAAAATCTTT GCTTCATGTT GGCGACTGCA 51 AGGTACTTGC CGGCCAAAAT GTCTAAAAAA CGAACAATAT CGTATTTTGT 101 GTGATACTAT ACATTTGTGC TGTGTAAACC CAAAATATTT ACCTATACTG 151 ACTGGGAAAT AG SEQ ID NO: 8 (sequência do polipéptido INSP108 maduro) 1 GPNVYIQKIF ASCWRLQGTC RPKCLKNEQY RILCDTIHLC CVNPKYLPIL 51 TGK* SEQ ID NO: 9 (sequência de nucleótidos do exão 1 de INSP109)

1 ATGAACCTCT GTCTTTCTGC ATTACTCTTC TTCCTGGTGA TCTTACTGCC 51 TTCAG SEQ ID NO: 10 (sequência do exão 1 do polipéptido INSP109)

1 MNLCLSALLF FLVILLPSG SEQ ID NO: 11 (sequência de nucleótidos do exão 2 de INSP109)

1 GAAAAGGTAT GTTTGGGAAT GATGGAGTCA AAGTTCGCAC CTGCACTAGC 51 CAGAAAGC CG TATGTTTCTT CGGGTGTCCG C CAG GAT AC A GGTGGATTGC 101 GTTCTGCCAC AATATTCTGT CTTGCTGTAA AAATATGACA CGTTTTCAAC 151 CCCCGCAAGC CAAAGATCCA TGGGTTCATT AA SEQ ID NO: 12 (sequência do exão 2 do polipéptido INSP109) 1 KGMFGNDGVK VRTCTSQKAV CFFGCPPGYR WIAFCHNILS CCKNMTRFQP 51 PQAKDPWVH* SEQ ID NO: 13 (sequência de nucleótidos de INSP109)

1 ATGAACCTCT GTCTTTCTGC ATTACTCTTC TTCCTGGTGA TCTTACTGCC 51 TT CAGGAAAA GGTATGTTTG GGAATGATGG AGTCAAAGTT CGCACCTGCA 101 CTAGCCAGAA AGCCGTATGT TTCTTCGGGT GTCCGCCAGG ATACAGGTGG 151 ATTGCGTTCT GCCACAATAT TCTGTCTTGC TGTAAAAATA TGACACGTTT 201 TCAACCCCCG CAAGCCAAAG ATCCATGGGT TCATTAA SEQ ID NO: 14 (sequência do polipéptido INSP109) 102 1 MNLCLSALLF FLVILLPSGK GMFGNDGVKV RTCTSQKAVC FFGCPPGYRW 51 IAFCHNILSC CKNMTRFQPP QAKDPWVH* SEQ ID NO: 15 (sequência de nucleótidos de INSP109 maduro) 1 ATGTTTGGGA ATGATGGAGT CAAAGTTCGC ACCTGCACTA GCCAGAAAGC 51 CGTATGTTTC TTCGGGTGTC CGCCAGGATA CAGGTGGATT GCGTTCTGCC 101 ACAATATTCT GTCTTGCTGT AAAAATATGA CACGTTTTCA ACCCCCGCAA 151 GCCAAAGATC CATGGGTTCA ΤΓΑΑ SEQ ID NO: 16 (sequência do polipéptido INSP109 maduro) 1 MFGNDGVKVR TCTSQKAVCF FGCPPGYRWI AFCHNILSCC KNMTRFQPPQ 51 AKDPWVH*

Lisboa, 30 de Setembro de 2010

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido, o qual compreende a sequência de aminoácidos como especificada na SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 16

2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 o qual consiste da sequência de aminoácidos como especificada na SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 16.

3. Molécula de ácido nucleico purificada a qual codifica um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

4. Molécula de ácido nucleico purificada de acordo com a reivindicação 3, a qual compreende a sequência de ácido nucleico como especificada na SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 15, ou é um equivalente redundante desta.

5. Molécula de ácido nucleico purificada de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 a qual consiste da sequência de ácido nucleico como especificada na SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 15, ou é um equivalente redundante desta.

6. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico como especificada em qualquer uma das reivindicações 3 até 5.

7. Célula hospedeira transformada com um vector de acordo com a reivindicação 6. 2

8. Ligando o qual se liga especificamente ao polipéptido de defensina de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 e o qual é um anticorpo.

9. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 até 5, um vector de acordo com a reivindicação 6 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7, para utilização em terapia.

10. Composição farmacêutica compreendendo um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 até 5, um vector de acordo com a reivindicação 6 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7.

11. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 até 5, um vector de acordo com a reivindicação 6, uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7, ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, para utilização no tratamento de distúrbios proliferativos de células, incluindo o neoplasma da mama. Lisboa, 30 de Setembro de 2010