ES2352339T3

ES2352339T3 - Proteínas defensinas.

Info

Publication number: ES2352339T3
Application number: ES04701630T
Authority: ES
Inventors: David Inpharmatica Limited MICHALOVICH; Richard Joseph Impharmatica Limited FAGAN; Christine Power; Simon John Inpharmatica Limited WHITE; Melanie Yorke-Smith
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2003-01-13
Filing date: 2004-01-13
Publication date: 2011-02-17
Anticipated expiration: 2024-01-13
Also published as: GB0300718D0; DE602004029331D1; CA2510401A1; WO2004063219A1; US20090324562A1; EP1587828B1; US7563767B2; AU2004203966B2; NO20052956D0; AU2004203966A1; ATE482976T1; NO20052956L; DK1587828T3; IL169367A0; EP1587828A1; JP2007527197A; PT1587828E; US20090042775A1

Abstract

Un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácido citada en la SEQ. ID. nº 14 y/o en la SEQ. ID. nº 16.

Description

Esta invención se refiere a la nueva proteína INSP109, aquí identificada como una proteína segregada, en particular, como un miembro de la familia defensina de las proteínas y al uso de esta proteína y de las secuencias de ácido nucleico del gen codificante en la diagnosis, prevención y tratamiento de una enfermedad.

Antecedentes

El procedimiento de descubrimiento del fármaco está experimentando actualmente una revolución fundamental a medida que la era de los genómicos funcionales alcanza la mayoría de edad. La expresión "genómicos funcionales" aplica a un planteamiento que utiliza herramientas bioinformáticas para atribuir función a las secuencias de proteínas de interés. Tales herramientas están llegando a ser crecientemente necesarias a medida que la velocidad de generación de los datos de secuencia se está dejando atrás rápidamente la capacidad de laboratorios de investigación para asignar funciones a estas secuencias de proteínas.

A medida que las herramientas bioinformáticas crecen en potencia y en seguridad, estas herramientas están reemplazando rápidamente las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. En efecto, las herramientas bioinformáticas avanzadas usadas en identificar la presente invención son ahora capaces de producir resultados en los que puede situarse un alto grado de confianza.

Varias instituciones y organizaciones comerciales están examinando datos de secuencia a medida que llegan a estar disponibles y se están haciendo significativos descubrimientos sobre una base actual. Sin embargo, permanece una necesidad continuada de identificar y caracterizar genes adicionales y los polipéptidos que codifican, como dianas para la investigación y para el descubrimiento de fármacos.

Introducción

Proteínas Segregadas

La capacidad de las células para fabricar y segregar proteínas extracelulares es central para muchos procesos biológicos. Las enzimas, factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelular y moléculas de señalización son todas segregadas por las células. Esto es a través de la fusión de una vesícula secretora con la membrana de plasma. En la mayor parte de los casos, pero no en todos, las proteínas están dirigidas al retículo endoplasmático y al interior de las vesículas secretoras mediante un péptido señal. Péptidos señal son secuencias que actúan en cis que afectan al trasporte de cadenas polipéptidas desde el citoplasma a un compartimento limitado con membrana tal como una vesícula secretora. Polipéptidos que son dirigidos a las vesículas secretoras son también segregados en la matriz extracelular o son retenidos en la membrana de plasma. Los polipéptidos que son retenidos en la membrana de plasma tendrán uno o más dominios transmembrana. Ejemplos de proteínas segregadas juegan un papel central en el funcionamiento de una célula son citocinas, hormonas, proteínas de matriz extracelular (moléculas de adherencia), proteasas y factores de crecimiento y diferenciación. La descripción de algunas de las propiedades de estas proteínas se describe a continuación.

Defensinas

Las defensinas forman parte del sistema innato inmune del cuerpo que actúan frente a la invasión de patógenos externos. Las defensinas de los mamíferos están divididas en tres categorías: alfa, beta y theta, basadas en el patrón de enlaces disulfuro. INSP108 e INSP109 caen en la categoría beta. Estas proteínas son catiónicas y ricas en arginina y comparten una estructura terciaria típica a pesar de las diferencias en la estructura primaria. Consisten en tres hojas beta anti-paralelas conectadas por bucles y una horquilla beta con propiedades hidrófobas sobresale ortogonalmente.

Se ha demostrado que estas proteínas tienen un amplio espectro de actividad que oscila desde bacterias Gram positivas y Gram negativas a micobacterias, hongos e incluso virus envueltos. Enlazan con las membranas plasmáticas de microbios cargadas negativamente ricas en fosfolípidos y causan destrucción, aunque el modo exacto de acción está todavía por determinar. Altas concentraciones son citotóxicas para las células de mamíferos, aunque se ha demostrado que concentraciones menores activan el crecimiento en las células epiteliales y fibroblastos, sugiriendo de ese modo un papel en la cicatrización de heridas. Se ha demostrado también que las defensinas son quimiotácticas para monocitos, leucocitos polimorfonucleares y células T. Se ha demostrado que las defensinas in vitro son activas frente a E. coli, Listeria monocitogenes, Salmonella typhimurium y Candida albicans.

El conocimiento creciente de estas proteínas es, por tanto, de extrema importancia en el crecimiento de la comprensión de los caminos subyacentes que conducen a estados de enfermedad y estados de enfermedad asociados mencionados anteriormente, y en el desarrollo de un gen más eficaz y/o terapias con fármacos para tratar estos trastornos.

Se han descubierto diversas proteínas de la familia de la defensina. El documento WO02/04487 describe las secuencias de 25 genes y polipéptidos de defensina humana. Schutte et al. (2002) PNAS 99: 2129 describe cinco agrupaciones de genes de defensina beta descubiertos usando una búsqueda por ordenador. El documento WO03/024992 describe las secuencias de 34 genes de defensina beta en el genoma humano y 48 en el genoma del ratón. Harder et al. (1997) Nature 387: 861 describe una proteína adicional beta defensina humana.

LA INVENCIÓN

Un polipéptido de acuerdo con un primer aspecto de la invención: comprende la secuencia de aminoácidos citada en SEQ ID Nº: 14 y/o SEQ ID Nº: 16;

En otra realización de este primer aspecto de la invención, se ha proporcionado un polipéptido que:

(i): consiste en la secuencia de aminoácidos citada SEQ ID Nº: 14 y/o SEQ ID Nº: 16;

(ii): el polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID Nº: 14 se denomina en

adelante "polipéptido INSP109": Aunque el Solicitante no desea limitar esta teoría, propone que los primeros 21 aminoácidos del polipéptido INSP109 forman un péptido señal.

Las secuencias de polipéptido INSP109 de longitud completa sin esta secuencia señal propuesta es citada en la SEQ ID Nº: 16.

El polipéptido que tiene la secuencia citada SEQ ID Nº: 16 se denomina en adelante "polipéptido maduro INSP109".

La expresión "polipéptidos INSP109" usada aquí incluye polipéptidos que comprenden el polipéptido INSP109 y el polipéptido maduro INSP109.

Por "funciones como miembro de la familia de la defensina" nos referimos a los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos o características estructurales que pueden ser identificadas como características conservadas dentro de los polipéptidos de la familia de la defensina, tal que la interacción del polipéptido con el receptor o ligando no está sustancialmente aceptada desfavorablemente en comparación con la función del polipéptido natural de longitud completa. En particular, nos referimos a la presencia de restos de cisteína en posiciones específicas dentro del polipéptido que permiten la formación de enlaces disulfuro intradominio. La capacidad de funcionar como una defensina puede medirse usando los ensayos descritos por Nizet et al. (Nature 2001, 414: 454-457) y Cole et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99(4): 1813-1818).

En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico purificada que codifica un polipéptido del primer aspecto de la invención.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico purificada comprende la secuencia de ácido nucleico como se citó anteriormente en la SEQ ID Nº: 13 (que codifica el polipéptido INSP109) y/o la SEQ ID Nº: 15 (que codifica el polipéptido maduro INSP109) o es un equivalente redundante de una cualquiera de estas secuencias.

La invención proporciona además que la molécula de ácido nucleico purificada consista en la secuencia de ácido nucleico citada anteriormente en la SEQ ID Nº: 13 (que codifica el polipéptido INSP109) y/o la SEQ ID Nº: 15 (que codifica el polipéptido maduro INSP109).

En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector, tal como un vector de expresión, que contiene una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula anfitriona transformada con un vector del cuarto aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un ligando que enlaza específicamente con miembros de proteínas de la familia de la defensina del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, el ligando inhibe la función de un polipéptido del primer aspecto de la invención que es un miembro de la familia de la defensina de las proteínas. Ligandos a un polipéptido de acuerdo con la invención son los anticuerpos.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención, o un vector del tercer aspecto de la invención, o una célula anfitriona del cuarto aspecto de la invención para uso en terapia de enfermedades en las que los miembros de la familia de la defensina están implicados. Tales enfermedades pueden incluir trastornos proliferativos celulares, que incluyen neoplasia, melanoma, de pulmón, colorrectal, de mama, de páncreas, de cabeza y cuello y de otros tumores sólidos; trastornos mieloproliferativos, tales como leucemia, linfoma no Hodgkin, leucocitopenia, trombocitopenia, trastorno de angiogénesis, sarcoma de Kaposis; trastornos autoinmune/inflamatorios, que incluyen alergia, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, psoriasis e inflamación del tracto respiratorio, asma y rechazo al trasplante de órganos; trastornos cardiovasculares que incluyen hipertensión, edema, angina, aterosclerosis, trombosis, septicemia, choque, lesión por reperfusión, e isquemia; trastornos neurológicos que incluyen enfermedad del sistema nervioso central, lesión cerebral, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica y dolor; trastornos del desarrollo, trastornos metabólicos que incluyen diabetes sacarina, osteoporosis y obesidad, SIDA y enfermedal renal; infecciones que incluyen infección viral, infección bacteriana, infección por hongos e infección por parásitos y otros estados patológicos. Preferiblemente, la enfermedad es aquella en la que está implicada la familia de la defensina de las proteínas está implicada, tales como endotoxemia subletal, choque septicémico, infección microbiana de la cavidad amniótica, reacción de Jarish-Herxheimer de fiebre recurrente, enfermedades infecciosas del sistema nervioso central, pancreatitis aguda, colitis ulcerosa, empyaema, síndrome urémico hemolítico, enfermedad meningocócica, infección gástrica, tos ferina, peritonitis, psoriasis, artritis reumatoide, sepsis, asma, VIH, SIDA y glomerulonefritis. Estas moléculas también pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tales enfermedades.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de acido nucleico del segundo aspecto de la invención, o un vector del tercer aspecto de la invención, o una célula anfitriona del cuarto aspecto de la invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un resumen de técnicas y procedimientos estandarizados que pueden emplearse para utilizar la invención se da más adelante. Se comprenderá que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, estirpes celulares, vectores y a los reactivos descritos. También debe comprenderse que la terminología usada aquí tiene el propósito de describir sólo realizaciones particulares y no se pretende que esta terminología deba limitar el alcance de la presente invención. La extensión de la invención está limitada sólo por los términos de las reivindicaciones adjuntas.

En esta memoria descriptiva se usan las abreviaturas estandarizadas para nucleótidos y aminoácidos.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de los que trabajan en la técnica.

Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ejemplos de textos particularmente adecuados para consulta incluyen los siguientes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II

(D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & SJ. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells

(J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, Londres); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Segunda Edición (Springer Verlag, N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986).

Como aquí se utiliza, el término "polipéptido" incluye cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir isosteres peptídicos. Este término se refiere tanto a cadenas cortas (péptidos y oligopéptidos) y como a cadenas más largas (proteínas).

El polipéptido de la presente invención puede estar en la forma de una proteína madura o puede ser un pre-, pro- o prepro-proteína que puede activarse por división de la parte pre, pro- o prepro- para producir un polipéptido maduro activo. En tales polipéptidos, la secuencia pre-, pro- o prepro- puede ser una secuencia predominante o secretora o puede ser una secuencia que se emplea para la purificación de la secuencia del polipéptido maduro.

El polipéptido del primer aspecto de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, a menudo es ventajoso incluir una o más secuencias adicionales de aminoácidos que pueden contener secuencias secretoras o predominantes, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación, o secuencias que confieren una estabilidad superior de la proteína, por ejemplo durante la producción recombinante. Alternativamente o adicionalmente, el polipéptido maduro puede fusionarse con otro compuesto, tal como un compuesto que incrementa la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol).

Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados del gen, modificados o por procesos naturales, tal como por un proceso post-traducción o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes normalmente en polipéptidos de la presente invención están la glicosilación, unión lipídica, sulfatación, gamma-carboxilación, por ejemplo de restos de acido glutámico, hidroxilación y ribosilación-ADP. Otras modificaciones potenciales incluyen acetilación, acilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de enlaces transversales, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, formación de anclaje GPI, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesado proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN transferente tales como arginilación y ubitiquitinación.

Las modificaciones pueden aparecer en cualquier parte en un polipéptido, incluida la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los amino o carboxilo terminales. De hecho, la fijación del amino o carboxilo terminales en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente es normal en polipéptidos que aparecen de forma natural y los sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención.

Las modificaciones que tienen sitio en un polipéptido a menudo serán una función de cómo está fabricado el polipéptido. Para polipéptidos que se fabrican de forma recombinante, la naturaleza y extensión de las modificaciones en gran parte se determinará por la capacidad de modificación post-traducción de la particular célula anfitriona y las señales de la modificación que están presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, los modelos de glicosilación varían entre diferentes tipos de la célula anfitrionas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquiera manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que aparecen de forma natural (por ejemplo, purificado de cultivo celular), polipéptidos producidos de forma recombinante (incluidas las proteínas de fusión), polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos que se producen por una combinación de estos métodos.

Dos polipéptidos se dice que son "homólogos", como el término se usa aquí, si la secuencia de uno de los polipéptidos tiene un grado suficientemente alto de identidad o similaridad a la secuencia del otro polipéptido. "Identidad" indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el resto aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similaridad" indica que, en cualquier posición en las secuencias alineadas, el resto aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Grados de identidad y similaridad que pueden ser fácilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

Los polipéptidos homólogos, por tanto, incluyen variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies de las cuales los polipéptidos se derivan) y mutantes (tales como los mutantes que contienen sustituciones de aminoácidos, inserciones o eliminaciones) del polipéptido INSP109. Tales mutantes pueden incluir polipéptido en el que uno o más de los restos aminoácidos están sustituidos con un resto aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente uno resto aminoácido conservado) y tal resto aminoácido sustituido puede ser o puede no ser el codificado por el código genético. Típicas sustituciones de este tipo son Ala, Val, Leu y Ile; Ser y Thr; restos ácidos Asp y Glu; Asn y Gln; restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr. Son variantes particularmente preferidas en las que entre varios aminoácidos, es decir, entre 5 y 10, 1 y 5, 1 y 3, 1 y 2 o sólo un aminoácido, está sustituido, eliminado o añadido en cualquier combinación. Especialmente preferidas son las sustituciones, adiciones y eliminaciones imperceptibles, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína. También especialmente preferidas a este respecto son las sustituciones moderadas. Tales mutantes incluyen también polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoácidos incluye un grupo sustituyente.

Como aquí se utiliza, el término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es igual como parte, pero no el todo, de la secuencia de aminoácido del polipéptido INSP109. Los fragmentos deberían comprender al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia y, dependiendo de la secuencia particular, n es preferiblemente es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Pequeños fragmentos pueden formar un determinante antigénico.

Los fragmentos del polipéptido INSP109 de longitud completa pueden consistir en combinaciones de 1 ó 2 de secuencias exón vecinas en la secuencia de polipéptido INSP109. Por ejemplo, tales combinaciones incluyen exones 1 y 2 del polipéptido INSP108.

Tales fragmentos pueden estar "colocados a voluntad en cualquier sitio", es decir, no formando parte o fusionado con otros aminoácidos o polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del que forman una parte o región. Cuando está comprendido dentro de un polipéptido más grande, el fragmento puede formar una sola región continua. Por ejemplo, un fragmento que tenga una región polipéptido pre- y/o pro- fusionada con el amino terminal del fragmento y/o una región adicional fusionada al carboxilo terminal del fragmento. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un único polipéptido mas grande.

Los polipéptidos de la presente invención o sus fragmentos inmunogénicos (que comprenden al menos un determinante antigénico) pueden usarse para generar ligandos, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, que son inmunoespecíficos de los polipéptidos. Tales anticuerpos pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos de la invención o para purificar los polipéptidos por cromatografía de afinidad. Los anticuerpos pueden también ser empleados como ayudas diagnósticas o terapéuticas, entre otras aplicaciones, como será evidente para un lector con experiencia.

El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad por los polipéptidos de la invención que su afinidad por otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas intactas así como a sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de enlazar con el determinante antigénico en cuestión. Tales anticuerpos enlazan de este modo con los polipéptidos del primer aspecto de la invención.

Por "sustancialmente mayor afinidad" se quiere indicar que hay un aumento medible en la afinidad por un polipéptido de la invención comparado con la afinidad por proteínas segregadas conocidas.

Preferiblemente, la afinidad es al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o mayor para un polipéptido de la invención que para proteínas segregadas conocidas tales como miembros de la familia de la defensina de las proteínas.

Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, tal como un ratón, conejo, cabra o caballo, puede ser inmunizado con un polipéptido del primer aspecto de la invención. El polipéptido usado para inmunizar el animal puede ser derivado mediante tecnología de ADN recombinante o puede ser sintetizado químicamente. Si se desea, el polipéptido puede fusionarse con una proteína del portador. Portadores comúnmente usados a los que los polipéptidos pueden estar acoplados químicamente incluyen seroalbúmina bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa en forma de ojo de cerradura. El polipéptido acoplado se usa luego para inmunizar al animal. El suero del animal inmunizado se recoge y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Los anticuerpos monoclonales a los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden también ser producidos fácilmente por un experto en la técnica. La metodología general para fabricar anticuerpos monoclonales usando tecnología hibridoma es bien conocida (véase, por ejemplo, Köhler, G. y Milstein, С, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden ser cirbados para diversas propiedades, es decir, para isotipo, epítopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles en la purificación de los polipéptidos individuales contra los que están dirigidos. Alternativamente, genes que codifican los anticuerpos monoclonales de interés pueden ser aislados a partir de hibridomas, por ejemplo, por técnicas PCR conocidas en la técnica, y clonados y expresados en los vectores apropiados.

También pueden usarse los anticuerpos quiméricos, en los que las REGIÓNes no humanas se unen o fusionan con REGIÓNes constantes humanas (véase, por ejemplo, Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84, 3439 (1987)).

El anticuerpo puede ser modificado para fabricarlo menos inmunogénico en un individuo, por ejemplo, por inmunización (véase, Jones et al, Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al, Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al, J. Immunol, 147, 1709 (1991); Queen et al, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 86, 10029 (1989); Gorman et al, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 88, 34181 (1991); y Hodgson et al. Bio/Technology, 9, 421 (1991)). La expresión "anticuerpo humanizado", como aquí se utiliza, se refiere a moléculas de anticuerpo en las que los aminoácidos CDR y otros aminoácidos seleccionados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo donante no humano han sido sustituidos en el sitio de los aminoácidos equivalentes en un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado, por eso, se parece mucho a un anticuerpo humano pero tiene la capacidad de enlace del anticuerpo donante.

En una alternativa adicional, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico" que es un anticuerpo que tiene dos diferentes dominios de enlace antigen, estando cada dominio dirigido contra un epítopo diferente.

La tecnología de visualización del bacteriófago puede utilizarse para seleccionar genes que codifican anticuerpos con actividades enlazantes hacia los polipéptidos de la invención o desde repertorios de genes en V amplificados con la PCR de linfocitos a partir de humanos cribados por poseer los anticuerpos relevantes, o desde librerías vírgenes (McCafferty, J. et al, (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al, (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede también mejorarse por redistribución de la cadena (Clackson, T. et al, (1991) Nature 352, 624-628).

Los anticuerpos generados por las técnicas anteriores, sean policlonales o monoclonales, tienen utilidad adicional en que pueden ser empleados como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o en ensayos por inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden estar marcados con un reactivo analíticamente detectable tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima.

Moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son las que codifican una secuencia de polipéptido como la citada en la SEQ ID Nº: 14 y la SEQ ID Nº: 16. Estas moléculas de ácido nucleico pueden usarse en los procedimientos y aplicaciones que se describen aquí. Las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden, preferiblemente, al menos n nucleótidos consecutivos de las secuencias descritas en la presente memoria en donde, dependiendo de la secuencia en particular, n es 10 o más (por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 o más).

Moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tal como ARNm o en la forma de ADN, incluido por ejemplo ADNc, ADN sintético o ADN genómico. Tales moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse por clonación, por técnicas de síntesis químicas o por una combinación de las mismas. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden prepararse, por ejemplo, por síntesis química usando técnicas tales como síntesis química fosforamidita en fase sólida, de bibliotecas genómicas o de ADNc o por separación del un organismo. Las moléculas de ARN pueden generarse, generalmente, por la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN.

Las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias. El ADN monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena sentido,

o puede ser la cadena no codificante, también denominada como cadena antisentido.

La expresión "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, tales como los que contienen cadena principal modificada, y ácidos nucleicos del péptido (ANP). El término "ANP", como aquí se utiliza, se refiere a una molécula antisentido o a un agente antigen que comprende un oligonucleótido de al menos cinco nucleótidos de longitud ligado unido a una cadena principal peptídica de restos de aminoácidos, que preferiblemente termina en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. Los ANP pueden estar pegilados para alrgar su longevidad en una célula, en la que están preferentemente unidas a ADN y ARN monocatenarios complementarios y parar el alargamiento del transcrito (Nielsen, P.B. et al (1993) Anticancer Drug Des. 8: 53-63).

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de esta invención puede ser idéntica a la secuencia codificante de una o más de las moléculas de acido nucleico descritas en la presente memoria.

Estas moléculas también pueden tener una secuencia diferente que, como resultado de la degeneración del código genético, codifica un polipéptido como los citados en la SEQ ID Nº: 14 o en la SEQ ID Nº: 16. Tales moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir pero no limitarse a la secuencia codificante del polipéptido maduro por el mismo; la secuencia codificante del polipéptido maduro y de las secuencias codificantes adicionales, tales como las que codifican una secuencia predominante o secretora, tales como una secuencia de polipéptido pro-, pre- o prepro-, la secuencia codificante del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificantes adicionales anteriormente mencionadas, junto con otras secuencias no codificantes adicionales, que incluyen secuencias 5' y 3' no codificantes, tal como las transcritas, las secuencias no traducidas que juegan un papel en la trascripción (que incluyen señales de terminación), ribosoma enlazante y estabilidad del ARNm. Las moléculas de ácido nucleico pueden también incluir secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales.

Una molécula de ácido nucleico de este tipo puede ser una variante que aparece en la naturaleza tal como la variante alélica que aparece en la naturaleza, o la molécula puede ser una variante que no se sabe que aparezca en la naturaleza. Tales variantes de la molécula de ácido nucleico que no aparecen en la naturaleza pueden fabricarse por técnicas de mutagénesis, incluidas las aplicadas a las moléculas de ácido nucleico, células u organismos.

Entre las variantes a este respecto están las variantes que difieren de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas por sustituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótidos. Las sustituciones, eliminaciones o inserciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las REGIÓNes codificantes o no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las REGIÓNes codificantes pueden producir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, eliminaciones o inserciones.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden ser gestionadas usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica, por diversas razones, incluidoa modificar la clonación, el procesado y/o la expresión del producto gen (el polipéptido). La redistribución de ADN por fragmentación al azar y el reensamblado PCR de los fragmentos de gen y de los oligonucleótidos sintéticos están incluidas como técnicas que pueden ser usadas para gestionar las secuencias de nucleótidos. La mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencia de codón, producir variantes por proceso de corte y empalme, introducir mutaciones, etc.

Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido del primer aspecto de la invención pueden pegarse a una secuencia heteróloga de manera que la molécula de acido nucleico combinada codifica una proteína de fusión. Tales moléculas de acido nucleico combinadas están incluidas en el segundo aspecto de la invención. Por ejemplo, para cribar bibliotecas de péptidos de inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil expresar, usando una molécula de ácido nucleico combinada de este tipo, una proteína de fusión que puede ser reconocida por un anticuerpo disponible comercialmente. Una proteína de fusión puede gestionarse también para contener un sitio de división localizado entre la secuencia del polipéptido de la invención y la secuencia de una proteína heteróloga de manera que el polipéptido puede ser escindido y purificado aparte de la proteína heteróloga.

Se describen moléculas de ácido nucleico antisentido que son parcialmente complementarias con las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de la presente invención y que, por tanto, hibridan con las moléculas de acido nucleico codificantes (hibridación). Tales moléculas antisentido, como los oligonucleótidos, pueden estar diseñadas para reconocer, pegarse específicamente con e impedir la transcripción de un ácido nucleico diana que codifica un polipéptido de la invención, como se reconocerá por los habituales expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor,

J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al, Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al, Science 241,456 (1988); Dervan et al, Science 251,1360 (1991).

El término "hibridación" como se utiliza aquí se refiere a la asociación de dos moléculas de ácido nucleico con otra por enlaces de hidrógeno. Típicamente, una molécula estará fijada a un soporte sólido y la otra estará libre en la solución. Después, las dos moléculas pueden ser puestas en contacto entre sí en condiciones que favorezcan el enlace de hidrógeno. Factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y volumen del disolvente; temperatura de reacción; tiempo de hibridación; agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la molécula en fase líquida con el soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las moléculas; uso de compuestos para incrementar la velocidad de asociación de las moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la restricción de las condiciones de lavado después de la hibridación (véase Sambrook et at. [supra]).

La inhibición de la hibridación de una molécula completamente complementaria a una molécula diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación, como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. [supra]). Una molécula sustancialmente homóloga competirá entonces con, e inhibirá el enlace de una molécula completamente homóloga con la molécula diana en varias condiciones de restricción, como se enseña en Wahl, G.M. y SL. Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 399-407) y Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511).

"Restricción" se refiere a condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de moléculas muy similares frente a la asociación de moléculas que se diferencian. Las condiciones de hibridación con alta restricción están definidas como incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de baja restricción implican que la reacción de hibridación se lleva a cabo a 35ºC (véase Sambrook et al. [supra]). Preferiblemente, las condiciones usadas para la hibridación son las de alta restricción.

Se describe un procedimiento para detectar una molécula de ácido nucleico de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la invención con una muestra biológica en condiciones de hibridación para formar duplicidades; y (b) detectar cualquiera de las duplicidades de ese tipo que se forman.

Como se discute adicionalmente más adelante junto con los ensayos, una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente puede usarse como una sonda de hibridación de ARN, ADNc o ADN genómico, para aislar unos ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican los polipéptidos INSP108 o INSP109 y aislar ADNc o clones genómicos de genes homólogos u ortólogos que tienen una mayor similaridad de la secuencia al gen que codifica este polipéptido.

A este respecto, las técnicas siguientes, entre otras conocidas en la técnica, pueden utilizarse y se discuten más adelante con fines ilustrativos. Los procedimientos para secuenciación y análisis de ADN son bien conocidos y están generalmente disponibles en la técnica y pueden, en efecto, usarse para practicar muchas de las realizaciones de la invención discutidas en el presente documento. Tales procedimientos pueden emplear enzimas de este tipo como el fragmento Klenow de ADN polimerasa I, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland, OH), polimerasa Taq (Perkin Elmer), termoestable T7 polymerasa (Amersham, Chicago, IL) o combinaciones de polimerasas y exonucleasas a prueba de lectura tales como las encontradas en el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Preferiblemente, el proceso de secuenciación puede automatizarse usando máquinas tales como la Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), el Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) y la ABI Catalyst y DNA Sequencers 373 y 377 (Perkin Elmer).

Un procedimiento para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una función equivalente descrito aquí es sondar una biblioteca genómica o de ADNc con una sonda natural o diseñada artificialmente usando procedimientos estándar que se admiten en la técnica (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al (eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, Nueva York, 1989, 1992). Son particularmente útiles las sondas que comprenden al menos 15, preferiblemente al menos 30 y más preferiblemente al menos 50, bases contiguas que corresponden a, o son complementarias a, secuencias de ácidos nucleicos a partir del gen codificante apropiado (SEQ ID Nº: 13 y SEQ ID Nº: 15), son particularmente sondas útiles. Tales sondas pueden marcarse con un reactivo analíticamente detectable para facilitar su identificación. Reactivos útiles incluyen, pero no se limitan a radioisótopos, colorantes fluorescentes y enzimas que son capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Usando estas sondas, el experto corriente será capaz de aislar copias complementarias de polinucleótidos de ADN genómico, ADNc o de ARN que codifican proteínas de interés de origen humano, de mamífero o de otro animal y se criban tales orígenes de las secuencias relacionadas, por ejemplo, para miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo.

En muchos casos, las secuencias de ADNc aislado estarán incompletas, porque la región que codifica el polipéptido será cortada corta, normalmente en el extremo 5'. Varios métodos están disponibles para obtener ADNc de longitud completa o para ampliar los ADNc cortos. Tales secuencias pueden ser ampliadas utilizando una secuencia parcial de polinucleótido y empleando varios procedimientos conocidos en la técnica para detectar secuencias aguas arriba tales como elementos activadores y reguladores. Por ejemplo, el procedimiento que puede emplearse se basa en el procedimiento de Amplificación Rápida de Extremos de ADNc (RACE, en inglés; véase, por ejemplo, Frohman et al. PNAS EE.UU. 85, 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de esta técnica, ejemplificada por la tecnología Marathon® (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la investigación para ADNc de mayor longitud. Una técnica ligeramente diferente, denominada PCR "al sitio de restricción", usa cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida de ácido nucleico adyacente al locus conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). La PCR inversa puede usarse también para amplificar o ampliar secuencias que usan cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia, T. et al (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). Otro método que puede usarse es la PCR de captura que implica la amplificación de la PCR de fragmentos de ADN adyacentes a la secuencia conocida en el ADN de cromosoma humano y de levadura artificial (Lagerstrom, M. et al (1991) PCR Methods Applic, 1, 111119). Otro método que puede usarse para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker, JD. et al (1991); Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Además, se puede usar PCR, cebadores anidados y bibliotecas PromoterFinder® para correr ADN genómico (Clontech, Palo Alto, CA). Este proceso evita la necesidad de cribar bibliotecas y es útil para encontrar uniones intrón/exón.

Cuando se criban los ADNc de longitud completa, es preferible usar bibliotecas que hayan sido seleccionadas por tamaño para incluir los ADNc de mayor longitud. También se prefieren las bibliotecas de cebado al azar porque contendrán más secuencias que contengan REGIÓNes 5' de genes. El uso de bibliotecas de cebado al azar pueden ser especialmente preferibles para situaciones en las que una biblioteca oligo d(T) no produzca un ADNc de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para la ampliación de la secuencia en REGIÓNes reguladoras no transcritas 5'.

Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden ser usadas para localización de cromosomas. En esta técnica, una molécula de ácido nucleico es convertida en diana específicamente a, y puede hibridar con, un sitio particular de un cromosoma de un individuo humano. El mapeo de secuencias relevantes para cromosomas de acuerdo con la presente invención es un importante paso en la correlación confirmativa de aquellas secuencias con las enfermedades asociadas a genes. Una vez una secuencia ha sido mapeada a un sitio cromosómico preciso, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede ser correlacionada con datos de mapas genéticos. Tales datos se encuentran en, por ejemplo V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible on-line a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Las relaciones entre genes y enfermedades que han sido mapeados a la misma región cromosómica son luego identificadas a través del análisis de linaje (la coherencia de genes físicamente adyacentes). Esto proporciona información valiosa a los investigadores que buscan genes de enfermedades que usan clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez la enfermedad o el síndrome ha sido localizada de forma tosca por linaje genético con una región genómica particular, cualquiera de las secuencias que mapean ese área pueden representar genes asociados

o reguladores para una investigación adicional. La molécula de ácido nucleico puede también usarse para detectar diferencias en la posición cromosómica debido a translocación, inversión, etc. entre individuos normales, portadores o afectados.

Las moléculas de acido nucleico de la presente invención son también valiosas para localización de tejidos. Tales técnicas permiten la determinación de patrones de expresión del polipéptido en tejidos por detección del ARNm que los codifica. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridación in situ y técnicas de amplificación de nucleótidos, tales como la PCR. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos de los modelos de expresión normales de ARNm con el de ARNm codificado por un gen mutante proporcionan ideas valiosas en el papel de los polipéptidos mutantes en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial o cuantitativa.

El gen que silencia el planteamiento puede también comprometerse para regular por disminución la expresión endógena de un gen que codifica un polipéptido de la invención. El ARN interferente (ARNi) (Elbashir, SM et al. Nature 2001, 411, 494-498) es el método de silenciar el gen de secuencia post-transcripcional específico que puede ser empleado.

Los oligonucleótidos de ARN bicatenario (dsRNA en inglés) corto son sintetizados in vitro e introducidos en una célula. El enlace específico de la secuencia de estos oligonucleótidos de ARN bicatenario desencadena la degradación de ARNm diana, reduciendo o cortando la expresión de la proteína diana.

La eficacia evaluada anteriormente del gen que silencia el planteamiento puede ser evaluada a través de la medida de la expresión del polipéptido (por ejemplo, mediante inmunotransferencia Western), y al nivel de ARN que usa metodologías basadas en TaqMan.

Los vectores de la presente invención comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención y pueden ser vectores de clonación o de expresión. Las células anfitrionas de la invención, que pueden se transformadas, transfectadas o transducidas con los vectores de la invención pueden ser procarióticas o eucarióticas.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse en forma recombinante mediante la expresión de sus moléculas de ácido nucleico codificante en vectores contenidos dentro de una célula anfitriona. Tales métodos de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser descritos en detalle por Sambrook et al. (supra) y Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, Londres, Boston, Nueva York, Sydney, Tokio, Toronto).

Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el anfitrión requerido. La secuencia de nucleótido apropiada puede ser insertada en un sistema de expresión por cualquiera de las diversas técnicas conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al, (supra). Generalmente, el gen codificante puede ser situado bajo el control de un elemento de control tal como un activador, un sitio de enlace de ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de manera que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado es transcrita en ARN en la célula anfitriona transformada.

Ejemplos de sistemas de expresión adecuados incluyen, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episódicos y derivados de virus, incluidos, por ejemplo, vectores obtenidos de: plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papova virus tales como SV40, virus de la vacuna, adenovirus, viruela aviar, virus pseudorables y retrovirus, o combinaciones de los mismos, tales como las obtenidas de los elementos genéticos plásmidos y bacteriófagos, que incluyen cósmidos y fásmidos. También pueden emplearse cromosomas artificiales humanos (HAC) para enviar fragmentos de ADN más largos que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. Los vectores pCR4-TOPO-INSP108 (Figura 9), pDONR-INSP108-6HIS (Figura 13), pEAK12d-INSP108-6HIS (Figura 14), pDEST12.2-INSP108-6HIS (Figura 15), pCR4TOPO-INSP109 (Figura 19), pDONR-INSP109-6HIS (Figura 20), pEAK12d-INSP1096HIS (Figura 21) y pDEST12.2-INSP109-6HIS (Figura 22), son ejemplos preferidos de vectores adecuados para expresión.

Sistemas de expresión particularmente adecuados incluyen microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante bacteriófago, de plásmido o de cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmidos de Ti o pBR322); o sistemas celulares animales. También pueden emplearse sistemas de traducción exentos de células para producir los polipéptidos de la invención.

La introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la presente invención en células anfitrionas puede ser efectuada por métodos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al. (supra). Métodos particularmente adecuados incluyen transfección de fosfato cálcico, transfección mediada con DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada con lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga con rascado, introducción balística o infección (véase Sambrook et al, 1989 [supra]; Ausubel et al, 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald, 1998). En células eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser transientes (por ejemplo, episómicos)

o permanentes (integración cromosómica) de acuerdo con las necesidades del sistema.

La molécula de ácido nucleico codificante puede incluir o no una secuencia que codifica a una secuencia control, tal como un péptido señal o una secuencia predominante, si se desea, por ejemplo, para secreción del polipéptido traducido en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Secuencias predominantes pueden ser eliminadas por el anfitrión bacteriano en el procesado post-traducción.

Además de las secuencias de control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido respecto al crecimiento de la célula anfitriona. Ejemplos de secuencias reguladoras son las que causan que la expresión de un gen aumente o disminuya en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador o a varias temperaturas o condiciones metabólicas. Las secuencias reguladoras son aquellas REGIÓNes no traducidas del vector, tal como potenciadores, activadores y REGIÓNes no traducidas 5' y 3'. Estas interaccionan con las proteínas celulares del anfitrión para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales secuencias reguladoras pueden variar en su resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema vector y anfitrión utilizado, puede usarse cualquier número de elementos adecuados de transcripción y traducción, incluyendo activadores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando la clonación es en sistemas bacterianos, pueden usarse activadores inducibles tales como el activador híbrido lacZ del fásmido Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) o el plásmido pSportl® (Gibco BRL) y similares. El activador de polihedrina baculovirus puede ser usado en células de insectos. Los activadores o potenciadores obtenidos de genomas de células vegetales (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO y genes de proteínas de almacenamiento) o de virus vegetales (por ejemplo, activadores víricos o secuencias predominantes) pueden clonarse en el vector. En sistemas de células de mamíferos son preferibles los activadores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una estirpe celular que contenga múltiples copias de la secuencia, pueden usarse los vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

Un vector de expresión es construido de manera que la secuencia particular codificante de ácido nucleico se localiza en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, el posicionamiento y la orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias reguladoras que son tales que la secuencia codificante es transcrita bajo el "control" de las secuencias reguladoras, es decir, el ARN polimerasa que enlaza con la molécula de ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia codificante. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia de manera que puede estar unida a la secuencia de control con la orientación apropiada, es decir, manteniendo el marcvo de lectura.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden estar ligadas a la secuencia codificante de ácido nucleico antes de la inserción en un vector. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser clonada directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

Para la producción a largo plazo y con alto rendimiento de un polipéptido recombinante, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, estirpes de células que expresan de forma estable el polipéptido de interés pueden ser transformadas usando vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector separado. Después de la introducción del vector, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que sean cambiadas al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas de forma estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas al tipo de células.

Las estirpes de células de mamíferos disponibles como anfitrionas para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas estirpes de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) que incluye, pero no se limita a, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, riñón de hámster bebé (BHK), riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma Bowes y carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y un número de otras estirpes de células.

En el sistema baculovirus, los materiales para los sistemas de expresión baculovirus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit a partir de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (el kit "MaxBac"). Estas técnicas son generalmente conocidas por los expertos en la técnica y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987). Las células anfitrionas particularmente adecuadas para uso en este sistema incluyen células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9.

Hay muchos cultivos de células de plantas y sistemas de expresión genética de plantas completas conocidos en la técnica. Ejemplos de adecuados sistemas de expresión génética de células de plantas incluyen los descritos en los documentos US 5.693.506;

US 5.659.122; y US 5.608.143. Ejemplos adicionales de expresión genética en el cultivo de células de plantas se han descrito por Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991).

En particular, pueden utilizarse todas las plantas de las que puedan aislarse y cultivarse protoplastos para dar plantas completas regeneradas, de manera que se recuperen plantas completas que contengan el gen transferido. Prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de células o tejidos cultivados, incluidas pero no limitándose a todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales y otros, y legumbres y hortalizas.

Ejemplos de células anfitrionas bacterianas particularmente preferidas incluyen células streptococci, staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis.

Ejemplos de células anfitrionas particularmente adecuadas para la expresión fúngica incluyen células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) y células de Aspergillus.

Cualquier número de sistemas de selección son conocidos en la técnica que pueden ser usados para recuperar estirpes de células transformadas. Entre los ejemplos se incluyen genes de la quinasa timidina del virus herpes simple (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 22332) y de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23) que pueden ser empleados en células tk-o aprt±, respectivamente.

También, antimetabolito, antibiótico o resistente a herbicidas puede usarse como base para la selección; por ejemplo, dihidrofolato reductadasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, M. et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70); npt, que confiere resistencia a la aminoglicosidos neomicina y G-41S (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y als o pat, que confiere resistencia a clorosulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Se han descrito genes adicionales seleccionables cuyos ejemplos serán evidentes para los expertos en la técnica.

Aunque la presencia o ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y expresión pueden necesitar ser confirmadas. Por ejemplo, si la secuencia relevante es insertada dentro de una secuencia de un gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias apropiadas pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede situarse en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido de la invención bajo el control de un único activador. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica también normalmente la expresión del gen tándem.

Alternativamente, las células anfitrionas que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención y que expresa dicho polipéptido puede ser identificada por diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a hibridaciones de ADN-ADN o de ADN-ARN y bioensayos con proteínas, por ejemplo, clasificación celular activada con fluorescencia (FACS, en inglés) o técnicas de inmunoensayo (tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima [ELISA] y radioinmunoensayo [RIA]), que incluye membrana, solución, o tecnologías basadas en circuito integrado para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína (véase Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) y Maddox, D.E. et al (1983) J. Exp. Med, 158, 12111216).

Una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación son conocidas por los expertos en la técnica y pueden usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y de aminoácidos. Los medios para producir la hibridación con etiqueta o sondas PCR para detectar secuencias relacionadas con las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de la presente invención incluyen oligoetiquetado, traslación de muesca, etiquetado del extremo o amplificación PCR usando un polinucleótido etiquetado.

Alternativamente, las secuencias que codifican el polipéptido de la invención pueden ser clonadas en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica, están comercialmente disponibles, y pueden ser usados para sintetizar sondas de ARN in vitro por adición de un apropiado ARN polimerasa tales como T7, T3 o SP6 y nucleótidos etiquetados. Estos procedimientos pueden ser conducidos usando diversos kits comercialmente disponibles (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI); Promega (Madison WI); y U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)).

Las moléculas indicadoras adecuadas o etiquetas, que pueden ser usadas para una fácil detección, incluyen radionuclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes

o cromogénicos así como también sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención pueden también usarse para crear animales transgénicos, particularmente animales roedores. Tales animales transgénicos forman un aspecto adicional de la presente invención. Esto puede hacerse localmente por modificación de células somáticas, o por terapia de estirpe reproductora para incorporar modificaciones heredables. Tales animales transgénicos pueden ser particularmente útiles en la generación de modelos de animales para moléculas de fármacos eficaces como moduladores de los polipéptidos de la presente invención.

El polipéptido puede ser recuperado y purificado a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen sulfato de amonio o precipitación en etanol, extracción por ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxillapatito y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alto rendimiento es particularmente útil para purificación. Técnicas bien conocidas para replegar proteínas pueden ser empleadas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o purificación.

Construcciones de vectores especializados pueden también usarse para facilitar la purificación de las proteínas, si se desea, uniendo secuencias que codifican los polipéptidos de la invención a una secuencia de nucleótidos que codifican un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Ejemplos de tales dominios que facilitan la purificación incluyen péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación o metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación FLAGS extensión/afinidad (Immunex Corp., Seattle, Washington). La inclusión de secuencias de ligador divisible tales como las específicas para Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la invención pueden usarse para facilitar la purificación. El vector de expresión de este tipo mantiene la expresión de una proteína de fusión que contiene el polipéptido de la invención fusionado con varios restos de histidina que preceden a un sitio de división de una tioredoxina o de una enterocinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado como se describe en Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) mientras que el sitio del desdoblamiento de la tioredoxina o de la enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido a partir de la proteína de fusión. Un debate de vectores que contienen proteínas de fusión es proporcionado en Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).

Si el polipéptido va a ser expresado para uso en ensayos de cribado, generalmente se prefiere que sea producido en la superficie de la célula anfitriona en la que es expresado. En este caso, las células anfitrionas pueden ser recolectadas antes de usar en el ensayo de cribado, por ejemplo usando técnicas como la clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoafinidad. Si el polipéptido es segregado en el medio, el medio puede ser recuperado para recuperar y purificar el polipéptido expresado. Si el polipéptido es producido de forma intracelular, las células deben ser primero lisadas antes de que el polipéptido sea recuperado.

El polipéptido de la invención puede usarse para cribar bibliotecas de compuestos en cualquiera de las diversas técnicas de cribado de fármacos. Tales compuestos pueden activar (hacer agonista) o inhibir (hacer antagonista) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido de la invención y dar forma a un aspecto adicional de la presente invención. Los compuestos preferidos son eficaces para alterar la expresión de un gen natural que modifica un polipéptido del primer aspecto de la invención o regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención.

Compuestos agonistas o antagonistas pueden ser aislados a partir de, por ejemplo, células, preparados sin células, bibliotecas químicas o mezclas de productos naturales. Estos agonistas o antagonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas, receptores o miméticos estructurales o funcionales. Para una revisión adecuada de tales técnicas de cribado, véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991).

Los compuestos que con más probabilidad van a ser buenos antagonistas son las moléculas que enlazan con el polipéptido de la invención sin inducir los efectos biológicos de los polipéptidos después de enlazarse a ello. Antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que enlazan con el polipéptido de la invención y, de ese modo, inhiben o extinguen su actividad. De esta forma, el enlazado del polipéptido con las moléculas de enlace celular normales puede ser inhibido, de manera que se impide la actividad biológica normal del polipéptido.

El polipéptido de la invención que se emplea en una técnica de cribado de este tipo puede estar libre en la solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular

o localizada intracelularmente. En general, tales procedimientos de cribado pueden implicar el uso de células o de membranas celulares apropiadas que expresan el polipéptido que está en contacto con un compuesto de ensayo para observar el enlace, o estimulación o inhibición de una respuesta funcional. La respuesta funcional de las células puestas en contacto con el compuesto de ensayo se compara entonces con las células de control que no estuvieron en contacto con el compuesto de ensayo. Un ensayo de este tipo puede valorar si el compuesto de ensayo da como resultado una señal generada por activación del polipéptido, usando un sistema de detección apropiado. Los inhibidores de activación son generalmente probados en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista en presencia del compuesto de ensayo.

Un método para identificar un compuesto agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención comprende:

(a): poner en contacto una célula que expresa sobre la superficie de la misma el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, estando el polipéptido asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto con el polipéptido, con un compuesto que va a ser cribado en condiciones que permitan enlazar con el polipéptido; y

(b): determinar si el compuesto enlaza con y activa o inhibe el polipéptido midiendo el nivel de una señal generada desde la interacción del compuesto con el polipéptido.

Un método adicional para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención comprende:

(a): poner en contacto una célula que expresa sobre la superficie de la misma el polipéptido, estando el polipéptido asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto con el polipéptido, con un compuesto que va a ser cribado en condiciones que permitan el enlace con el polipéptido; y

(b): determinar si el compuesto enlaza con y activa o inhibe el polipéptido mediante la comparación del nivel de una señal generada desde la interacción del compuesto con el polipéptido con el nivel de una señal en ausencia del compuesto.

Los métodos generales que se describen anteriormente pueden comprender además conducir la identificación del agonista o del antagonista en presencia de ligando o receptor etiquetado o no etiquetado al polipéptido.

Otro método para identificar un agonista o un antagonista de un polipéptido de la presente invención se describe comprendiendo: determinar la inhibición de enlazar un ligando o un receptor a las células que tienen un polipéptido de la invención en la superficie de la misma, o a membranas celulares que contienen tal polipéptido, en presencia de un compuesto candidato en condiciones que permitan enlazar al polipéptido, y determinar la cantidad de ligando o de receptor enlazado al polipéptido. Un compuesto capaz de causar reducción del enlace de un ligando o un receptor se considera que es un agonista o un antagonista. Preferiblemente el ligando es etiquetado.

Un método de cribado de un compuesto antagonista o agonista de polipéptido se describe comprendiendo las etapas de:

(a): incubar un ligando o receptor etiquetado con una célula completa que expresa un polipéptido de acuerdo con la invención en la superficie de la célula, o una membrana de la célula que contiene un polipéptido de la invención;

(b): medir la cantidad de ligando o receptor etiquetado ligado a la célula completa o a la membrana de la célula;

(c): añadir un compuesto candidato a una mezcla de ligando o receptor etiquetado y la célula completa o la membrana de la célula de la etapa (a) y permitir la mezcla para lograr el equilibrio;

(d): medir la cantidad de ligando o receptor etiquetado ligado a la célula completa o a la membrana de la célular después de la etapa (c); y

(e): comparar la diferencia en ligando o receptor etiquetado enlazado en las etapas (b) y (d), de manera que el compuesto que causa la reducción en el enlace en la etapa (d) se considera que es un agonista o antagonista.

También puede encontrarse que el polipéptido INSP109 modula la proliferación y diferenciación de células en sistemas inmunes de una manera que depende de la dosis en los ensayos anteriormente descritos. Por ello, los “equivalentes funcionales” de los polipéptidos INSP108 e INSP109 incluyen polipéptidos que exhiben cualquiera de los mismos crecimiento y diferenciación que regulan las actividades en los ensayos anteriormente descritos de una manera que depende de la dosis. Aunque el grado de actividad que depende de la dosis no necesita ser idéntico al de los polipéptidos INSP108

o INSP109, preferiblemente los "equivalentes funcionales" exhibirán una dependencia de la dosis sustancialmente similar en un ensayo de actividad determinado comparado con los polipéptidos INSP108 e INSP109.

Pueden usarse ensayos de enlace sencillos en los que se detecta la adherencia de un compuesto de ensayo a una superficie que transporta el polipéptido por medio de una etiqueta asociada directa o indirectamente con el compuesto de ensayo o en un ensayo que implica competición con un competidor etiquetado. En otra realización, pueden usarse ensayos de cribado de fármacos competitivos, en los que los anticuerpos neutralizantes que son capaces de ligar el polipéptido compiten específicamente con un compuesto de ensayo por el enlace. De esta manera, los anticuerpos pueden ser usados para detectar la presencia de cualquier compuesto de ensayo que posea afinidad de enlace específico con el polipéptido.

Los ensayos pueden también diseñarse para detectar el efecto de compuestos de ensayo añadidos en la producción de ARNm que codifica el polipéptido en las células. Por ejemplo, puede construirse un ELISA que mida niveles de polipéptido segregados o asociados con las células que usan anticuerpos monoclonales o policlonales mediante métodos estándar conocidos en la técnica, y esto puede ser usado para buscar compuestos que puedan inhibir o potenciar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. La formación de complejos de enlace entre el polipéptido y el compuesto que es ensayado puede entonces ser medida. Un ensayo antimicrobiano de beta defensina es descrito por Nizet et al. (Nature 2001, 414:454-457). Un ensayo antimicrobiano y antivírico theta-defensina se describe por Cole et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99(4):1813-1818).

Otra técnica para cribar fármacos que pueden ser usados mantiene un cribado de alto rendimiento de compuestos con adecuada afinidad de enlace con el polipéptido de interés (véase la solicitud de patente internacional WO84/03564). En este método, grandes números de pequeños compuestos de ensayo diferentes son sintetizados en un sustrato sólido que puede luego hacerse reaccionar con el polipéptido de la invención y lavarse. La manera de inmovilizar el polipéptido es usar anticuerpos no neutralizantes. El polipéptido enlazado puede entonces cribarse usando métodos que son bien conocidos en la técnica. El polipéptido purificado puede, también, revestirse directamente sobre placas para uso en las técnicas de cribado de los fármacos anteriormente mencionados.

El polipéptido de la invención puede usarse para identificar receptores ligados a membrana o solubles, a través de técnicas de enlace de receptores estándar que son conocidos en la técnica, tales como ensayos de enlace y de reticulación de ligando en los que el polipéptido es etiquetado con un isótopo radiactivo, se modifica químicamente, o se fusiona con una secuencia de péptidos que facilita su detección o purificación, y se incuba con una fuente de receptor putativo (por ejemplo, una composición de células, membranas de células, sobrenadantes de células, extractos de tejido, o fluidos corporales). La eficacia del enlace puede medirse usando técnicas biofísicas tales como resonancia de plasmones superficiales y espectroscopía. Los ensayos de enlace pueden usarse para la purificación y clonación del receptor, pero también pueden identificar agonistas y antagonistas del polipéptido, que compiten con el enlace del polipéptido con su receptor. Métodos estándar para conducir ensayos de cribado son bien comprendidos en la técnica.

Aquí se describe un kit de cribado útil en los métodos para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos, enzimas.

Aquí se describen agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas, y otros compuestos que modulan la actividad o antigenicidad del polipéptido de la invención descubierto por los métodos que se describen anteriormente.

Aquí se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, ácido nucleico, ligando o un compuesto de la invención en combinación con un excipiente farmacéutico adecuado. Estas composiciones pueden ser adecuadas como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, como vacunas, o como otras composiciones inmunogénicas, como se subraya con detalle más adelante.

De acuerdo con la terminología usada en el presente documento, una composición que contiene un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto [X] está “sustancialmente libre" de impurezas [aquí, Y] cuando al menos el 85% en peso del X+Y total en la composición es X. Preferiblemente, X comprende al menos aproximadamente el 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferiblemente al menos aproximadamente al 95%, 98% o incluso 99% en peso.

Las composiciones farmacéuticas deberían comprender, preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, molécula de ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” usada aquí se refiere a una cantidad de agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o estado diana o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente

o en ensayos de cultivo celular, por ejemplo de células neoplásicas, o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede ser utilizado para determinar el intervalo de concentración y la ruta de administración apropiados. Tal información puede entonces usarse para determinar dosis y vías útiles para su administración en los seres humanos.

La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, de la salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación o combinaciones de fármacos, sensibilidades a la reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación rutinaria y queda a juicio del médico. Generalmente, una dosis eficaz estará entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferiblemente entre 0,05 mg/kg y 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Una composición farmacéutica puede contener también un excipiente farmacéuticamente aceptable, por la administración de un agente terapéutico. Tales excipientes incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, con tal de que el excipiente no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos al individuo que recibe la composición, y que pueda administrarse sin una toxicidad indebida. Excipientes adecuados pueden ser grandes macromoléculas metabolizadas lentamente tales como las proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos polímeros, aminoácidos copolímeros y partículas víricas inactivas.

Aquí pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión a fondo de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Marck Pub. Co., N.J. 1991).

En tales composiciones pueden estar presentes excipientes farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener además líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampón de pH y similares. Tales excipientes permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, soluciones en suspensión, suspensiones y similares para la ingestión por parte del paciente.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales; en particular, pueden ser tratados sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención pueden ser administradas por cualquier número de vías incluidas pero no limitándose a aplicaciones orales, intravenosas, intramusculares, intraarteriales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), por medios subcutáneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópico, sublingual, intravaginal o rectal. Pistolas de genes o hypospray pueden también usarse para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas como inyectables o como soluciones líquidas o como suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La entrega directa de las composiciones se realizará generalmente por inyección, de forma subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se enviará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden también administrarse en una lesión. El tratamiento de la dosificación puede ser en un programa de una sola dosis o en un programa de dosis múltiple.

Si la actividad del polipéptido de la invención está en exceso en un estado de enfermedad particular, están disponibles varios planteamientos. Un planteamiento comprende administrar a un sujeto un compuesto inhibidor (antagonista) como el descrito anteriormente, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz que inhiba la función del polipéptido, tal como bloqueando el enlace de ligandos, sustratos, enzimas, receptores o inhibiendo una segunda señal y aliviando de ese modo el estado anormal. Preferiblemente, tales antagonistas son anticuerpos. Lo más preferiblemente, tales anticuerpos son quiméricos y/o humanizados para minimizar su inmunogenicidad, como se ha descrito anteriormente.

En otro planteamiento, se pueden administrar formas solubles del polipéptido que mantengan la afinidad enlazante por el ligando, sustrato, enzima, receptor en cuestión. Típicamente, el polipéptido puede ser administrado en forma de fragmentos que mantengan las porciones relevantes.

En un planteamiento alternativo, la expresión del gen que codifica el polipéptido puede ser inhibida usando técnicas bloqueantes de la expresión, tales como el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido (como se ha descrito anteriormente), o generado internamente

o administrado separadamente. Pueden obtenerse modificaciones de la expresión del gen diseñando secuencias complementarias o moléculas antisentido (ADN, ARN o ANP) al control, al 5’ o a las REGIÓNes reguladoras (secuencia señal, activadores, potenciadores e intrones) del gen que codifica el polipéptido. De forma similar, puede lograrse la inhibición usando metodología de emparejamiento de base de “triple hélice”. El emparejamiento de triple hélice se utiliza porque causa la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para el enlace de polimerasas, de factores de transcripción o de moléculas reguladoras. Recientes avances terapéuticos que usan ADN de triple hélice han sido descritos en la documentación (Gee, J.E. et al. (1994). En: Huber,

B.E. y B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, Nueva York). La secuencia complementaria o molécula antisentido puede también ser diseñada para bloquear la traducción de ARNm impidiendo que el transcrito se ligue a ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden ser administrados o pueden ser generados in situ de la expresión in vivo.

Además, la expresión del polipéptido de la invención puede impedirse usando ribozimas específicas para su secuencia de ARNm codificante. Las ribozimas son ARN catalíticamente activos que pueden ser naturales o sintéticos (véase por ejemplo Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Las ribozimas sintéticas pueden diseñarse para dividir específicamente ARNm en posiciones seleccionadas impidiendo de ese modo la traducción del ARNm en el polipéptido funcional. Las ribozimas pueden ser sintetizadas con una cadena principal de ribosa fosfato natural y bases naturales, como las normalmente encontradas en las moléculas de ARN. Alternativamente, las ribozimas pueden ser sintetizadas con cadenas principales no naturales, por ejemplo, ARN 2’-Ometilo, para proporcionar protección de la degradación ribonucleasa y puede contener bases modificadas.

Las moléculas de ARN pueden ser modificadas para incrementar la estabilidad intracelular y la semivida. Posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias adyacentes en los extremos 5’ y/o 3’ de la molécula o el uso de fosforotioato o 2’ O-metilo antes que enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena principal de la molécula. Este concepto es intrínseco a la producción de ANP y puede alargarse en todas estas moléculas por la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, a queosina y butosina, así como acetil, metil, tio y formas modificadas de forma similar de adenina, citidina, guanina, timina y uridina que no son fácilmente reconocidas por las endonucleasas endógenas.

Para el tratamiento de estados anormales relacionados con una expresión insuficiente del polipéptido de la invención y de su actividad, también están disponibles varios planteamientos. El planteamiento comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que activa el polipéptido, es decir, un agonista como el descrito anteriormente, para aliviar el estado anormal. Alternativamente, una cantidad terapéutica del polipéptido en combinación con un excipiente farmacéuticamente adecuado puede administrarse para restaurar el equilibrio fisiológico relevante del polipéptido.

La terapia génica puede emplearse para efectuar la producción endógena del polipéptido mediante células relevantes en el sujeto. La terapia génica se usa para tratar permanentemente la producción inapropiada del polipéptido reemplazando un gen defectuoso con un gen terapéutico corregido.

La terapia génica de la presente invención puede ocurrir in vivo o ex vivo. La terapia génica ex vivo requiere el aislamiento y purificación de células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de las células genéticamente alteradas de nuevo en el paciente. En contraste, la terapia génica in vivo no requiere aislamiento ni purificación de células del paciente.

El gen terapéutico es típicamente “empaquetado” para su administración al paciente. Los vehículos de entrega del gen pueden ser no víricos, tales como liposomas, o virus de deficiente replicación, tales como adenovirus descritos por Berkner, K.L., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) o vectores asociados con adenovirus (AAV) como describe Muzyczka, N., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) y la patente de EE.UU. nº 5.252.479. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención puede ser gestionada para expresión en un vector retrovírico de defectuosa replicación. Esta construcción de expresión puede aislarse e introducirse, entonces, en una célula de empaquetamiento transducida con un vector plásmido retrovírico que contiene ARN que codifica el polipéptido, de manera que la célula de empaquetamiento produce ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden ser administradas a un sujeto por células de gestión in vivo y expresión del polipéptido in vivo (véase el Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (y referencias citadas aquí) en Human Molecular Genetics (1996), T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Otro planteamiento es la administración de “ADN desprotegido*” en el que el gen terapéutico se inyecta directamente en la corriente sanguínea o en el tejido muscular.

En situaciones en las que los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención son agentes que causan enfermedades, la invención proporciona que puedan ser usados en vacunas para producir anticuerpos contra el agente que causa la enfermedad.

Vacunas de acuerdo con la invención pueden ser o profilácticas (es decir, para impedir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección). Tales vacunas comprenden antigen inmunizante o antigenes inmunizantes, inmunogen o inmunogenes, polipéptido o polipéptidos, proteína o proteínas o ácido nucleico normalmente en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables como los descritos anteriormente, que incluyen cualquier excipiente que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Además, estos excipientes pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (“adyuvantes”). Además, el antigen o el inmunogen pueden estar conjugados con un toxoide bacteriano, tales como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori y otros patógenos.

Debido a que los polipéptidos pueden romperse en el estómago, vacunas que comprenden polipéptidos se administran preferiblemente de forma parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyecciones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que producen la formulación isotónica con la sangre del receptor, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes.

Las formulaciones de vacunas de la invención pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis. Por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden ser almacenadas en un estado de secado por congelación que requiera sólo la adición del excipiente líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente por experimentación de rutina.

La entrega genética de anticuerpos que ligan con polipéptidos de acuerdo con la invención puede también efectuarse, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente internacional WO98/55607.

La tecnología denominada inyección de chorro (véase, por ejemplo, www.powderject.com) puede también ser útil en la formulación de composiciones de vacunas.

Un número de métodos adecuados para vacunación y sistemas de entrega de vacunas se describe en la solicitud de patente internacional WO00/29428.

Se describe el uso de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como agentes diagnósticos. Detección de una forma mutada del gen caracterizado por las moléculas de ácido nucleico de la invención que está asociada con una disfunción proporcionará una herramienta diagnóstica que puede añadirse a, o definir, una diagnosis de una enfermedad, o susceptibilidad a una enfermedad, que resulta de la expresión con disminución, sobreexpresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Los individuos que transportan mutaciones en el gen pueden ser detectados a nivel ADN por diversas técnicas.

Moléculas de ácido nucleico para diagnosis pueden obtenerse a partir de células de los sujetos, como de la sangre, orina, saliva, material de la biopsia o autopsia de tejidos. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR, reacción de cadena ligasa (LCR), amplificación del desplazamiento de hélice (SDA), u otras técnicas de amplificación (véase Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes del análisis.

Un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende valorar el nivel de expresión de un gen natural que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención y comparar dicho nivel de expresión con un nivel de control, en el que se describe un nivel en que es diferente a dicho nivel de control es indicativo de enfermedad. El método puede comprender las etapas de:

a) poner en contacto una muestra de tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico en condiciones astringentes que permiten la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de la invención y la sonda;

b) poner en contacto una muestra de control con dicha sonda en las condiciones usadas en la etapa a);

c) y detectar la presencia de complejos híbridos en dichas muestras; en las que la detección de niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difiere de niveles del complejo híbrido de la muestra de control es indicativo de enfermedad.

Aquí se describe también un método diagnóstico que comprende las etapas de: a) obtener una muestra de tejido de un paciente en el que se está ensayando la enfermedad;

b) aislar una molécula de ácido nucleico de dicha muestra de tejido de acuerdo con la invención; y

c) diagnosticar en el paciente la enfermedad detectando la presencia de una mutación en la molécula de ácido nucleico que está asociada con la enfermedad.

Para ayudar en la detección de moléculas de ácido nucleico en los métodos anteriormente descritos, puede incluirse una etapa de amplificación, por ejemplo usando PCR.

Las detecciones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones de punto pueden identificarse hibridando ADN amplificado frente a ARN etiquetado de la invención

o alternativamente, secuencias de ADN antisentido etiquetado de la invención. Las secuencias perfectamente emparejadas pueden ser distinguidas de duplicidades no emparejadas mediante la digestión de la RNasa o valorando las diferencias en las temperaturas de fusión. La presencia o ausencia de la mutación en el paciente puede detectarse mediante contacto del ADN con una sonda de ácido nucleico que hibrida con el ADN en condiciones astringentes para formar una molécula híbrida de doble hélice, teniendo la molécula híbrida de doble hélice una parte no hibridada de la hélice de la sonda de ácido nucleico en cualquier parte que corresponda a una mutación asociada con la enfermedad; y detectar la presencia o ausencia de una parte no hibridada de la hélice de la sonda como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada con la enfermedad en la parte correspondiente de la hélice de ADN.

Tales diagnósticos son particularmente útiles para pruebas prenatales e incluso neonatales.

Las mutaciones puntuales y otras diferencias en la de secuencia entre el gen de referencia y los genes “mutantes” pueden identificarse mediante otras técnicas bien conocidas tales como secuenciación directa de ADN o polimorfismo conformacional de una sola hélice (véase Orita et al., Genomïcs, 5, 874-879 (1989)). Por ejemplo, un cebador de secuenciación puede usarse con un producto PCR de doble hélice o una molécula plantilla de una sola hélice generada por una PCR modificada. La determinación de secuencia se realiza mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radioetiquetados o mediante procedimientos de secuenciación automática con etiquetas fluorescentes. Los segmentos de ADN clonados pueden también usarse como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método está muy potenciada cuando se combina con la PCR. Además, las mutaciones puntuales y otras variaciones de las secuencias, tales como polimorfismos, pueden detectarse como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, a través del uso de oligonucleótidos específicos de alelos para amplificación de la PCR de secuencias que difieren en los nucleótidos sencillos.

Las diferencias de secuencias de ADN pueden también ser detectadas por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o por la secuenciación directa de ADN (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). Cambios en la secuencia en localizaciones específicas pueden también ser revelados por pruebas de protección de nucleasa, tales como protección RNasa y S1 o método de división química (véase Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos (1985) 85:4397-4001).

Además de la electroforesis en gel y la secuenciación de ADN convencionales, las mutaciones tales como microeliminaciones, aneuploidias, translocaciones, inversiones pueden también ser detectadas mediante análisis in situ (véase, por ejemplo, Keller et al., DNA Probes, 2ª Ed., Stockton Press, Nueva York, N.Y., EE.UU.(1993)), es decir, las secuencias de ADN o ARN en células pueden ser analizadas por las mutaciones sin necesidad de su aislamiento y/o inmovilización en una membrana. La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) es actualmente el método más normalmente aplicado y han aparecido numerosas publicaciones de FISH (véase, por ejemplo, Trachuck et al., Science, 250, 559-562 (1990), y Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)).

También se ha descrito aquí una disposición de sondas de oligonucleótido que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención que puede ser construida para conducir un eficiente cribado de variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Los métodos de la tecnología matriz son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden ser usados para direccionar una variedad de cuestiones en genética molecular que incluye expresión de gen, ligado genético, y variabilidad genética (véase por ejemplo: M. Chee et al., Science (1996), Vol 274, pág.610-613).

En una realización, la matriz se prepara y se usa de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud del PCT WO95/11995 (Chee et al.); Lockhart, D.J. et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); y Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1061410619). Pares de oligonucleótido pueden oscilar desde dos a más de un millón. Los oligómeros se sintetizan en áreas designadas sobre un sustrato que usa un proceso químico dirigido por luz. El sustrato puede ser papel, nilón u otro tipo de membrana, filtro, circuito integrado, portaobjetos de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. Alternativamente, un oligonucleótido puede ser sintetizado en la superficie del sustrato usando un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta, como se describe en la solicitud PCT W095/25116 (Baldeschweiler et al.). En otro aspecto, una matriz “enrejada” análoga a una mancha de punto (o de ranura) puede usarse para disponer y ligar fragmentos de ADNc u oligonucleótidos a la superficie de un sustrato que usa un sistema de vacío, procedimientos térmicos, UV, de enlace mecánico

o químico. Una matriz, como las descritas anteriormente, puede ser producida a mano o usando dispositivos disponibles (aparato de mancha de ranura o mancha de punto), materiales (cualquier soporte sólido adecuado), y máquinas (que incluyen instrumentos robóticos), y pueden contener 8, 24, 96, 384, 1.536 o 6.144 oligonucleótidos, o cualquier otro número entre dos y más de un millón que se presta al uso eficaz de la instrumentación comercialmente disponible.

Además de los métodos discutidos anteriormente, las enfermedades pueden ser diagnosticadas por métodos que comprenden determinar, desde una muestra derivada de un sujeto, un nivel disminuido o aumentado anormalmente de polipéptido o de ARNm. La expresión disminuida o aumentada puede medirse en el nivel de ARN usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tal como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección RNasa, inmunotransferencia Northern y otros métodos de hibridación.

Técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar niveles de un polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un anfitrión son bien conocidas por los expertos en la técnica y se han discutido con mayor detalle anteriormente (incluyendo radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivo, análisis por inmunotransferencia Western y ensayos ELISA). Se describe un método diagnóstico que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un ligando como uno descrito anteriormente con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de un complejo polipéptido-ligando; y (b) detectar dicho complejo.

Protocolos tales como ELISA (descrito anteriormente), RIA y FACS para medir niveles de polipéptidos pueden proporcionar además una base para diagnosticar niveles de expresión de polipéptido alterados o anormales. Los valores normales o estándar para la expresión de un polipéptido se establecen combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de los sujetos mamíferos normales, preferiblemente seres humanos, con el anticuerpo del polipéptido en condiciones adecuadas para la formación del complejo. La cantidad de formación del complejo estándar puede cuantificarse por varios métodos, tales como medios fotométricos.

Anticuerpos que ligan específicamente con un polipéptido de la invención pueden usarse para la diagnosis de estados o enfermedades caracterizados por expresión del polipéptido, o en pruebas para controlar pacientes que son tratados con los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, ligandos u otros compuestos de la invención. Anticuerpos útiles para propósitos de diagnóstico pueden ser preparados en la misma manera que la descrita anteriormente para los terapéuticos. Ensayos diagnósticos para el polipéptido incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una etiqueta para detectar el polipéptido en fluidos corporales humanos o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden ser usados con o sin modificación, y pueden ser etiquetados uniéndolos, de forma covalente o de forma no covalente, con una molécula indicadora. Pueden usarse una amplia variedad de moléculas indicadoras conocidas en la técnica, varias de las cuales se han descrito anteriormente.

Cantidades de polipéptido expresado en el sujeto, control y muestras de la enfermedad de tejidos biopsiados se comparan con los valores estándar. La desviación entre valores estándar y del sujeto establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. Las pruebas diagnósticas pueden usarse para distinguir entre ausencia, presencia y exceso de expresión de polipéptido y para controlar la regulación de niveles de polipéptido durante la intervención terapéutica. Tales ensayos pueden también usarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios en animales, en pruebas clínicas o en el control del tratamiento de un paciente individual.

Un kit de diagnóstico puede comprender:

(a): una molécula de ácido nucleico de la presente invención;

(b): un polipéptido de la presente invención; o

(c): un ligando de la presente invención.

Un kit de diagnóstico puede comprender un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que hibrida en condiciones astringentes con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención; un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para usar la sonda y los cebadores para facilitar la diagnosis de la enfermedad. El kit puede comprender además un tercer recipiente que porta un agente para digerir ARN no hibridado.

En una alternativa, un kit de diagnóstico puede comprender una matriz de moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales puede ser una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Para detectar el polipéptido de acuerdo con la invención, un kit de diagnóstico puede comprender uno o más anticuerpos que ligan con un polipéptido de acuerdo con la invención; y un reactivo útil para la detección de reacción ligante entre el anticuerpo y el polipéptido.

Tales kits serán de uso en diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad en la que están implicados miembros de la familia de la defensina. Tales enfermedades pueden incluir trastornos de proliferación de células, incluidos neoplasia, melanoma, de pulmón, colorrectal, de mama, de páncreas, de cabeza y cuello y otros tumores sólidos; trastornos mieloproliferativos, tales como leucemia, linfoma no-Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, trastornos de angiogénesis, sarcoma de Kaposis; trastornos autoinmunes/inflamatorios, incluidos alergia, enfermedad del intestino inflamado, artritis, psoriasis e inflamación del tracto respiratorio, asma y rechazo a transplante de órganos; trastornos cardiovasculares incluidos hipertensión, edema, angina, arterosclerosis, trombosis, septicemia, síndrome de insuficiencia cardiocirculatoria, daños por reperfusión e isquemia; trastornos neurológicos incluidos la enfermedad del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, daños en el cerebro, esclerosis lateral amiotrófica y dolor; trastornos del desarrollo; trastornos metabólicos incluidos diabetes sacarina, osteoporosis y obesidad, SIDA y enfermedad renal; infecciones que incluyen infección vírica, infección bacteriana, infección fúngica e infección por parásitos y otros estados patológicos. Preferiblemente, las enfermedades son aquellas en las que están implicados los miembros de la familia de la defensina, tales como endotoxemia subletal, choque septicémico, infección microbiana de la cavidad amniótica, reacción de fiebre recurrente de Jarish-Herxheimer, enfermedades infecciosas del sistema nervioso central, pancreatitis aguda, colitis ulcerosa, empyaema, síndrome urémico hemolítico, enfermedad meningocócica, infección gástrica, tos ferina, peritonitis, psoriasis, artritis reumatoide, septicemia, asma, HIV, SIDA y glomerulonefritis.

Varios aspectos y realizaciones de la presente invención serán ahora descritos con más detalle y a modo de ejemplo, con referencia particular a los polipéptidos INSP108 e INSP109.

Se comprenderá que pueden hacerse modificaciones de detalles sin apartarnos del alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

Las figuras que no se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen sólo para información.

Figura 1: Resultado BLAST contra la base de datos no redundante NCBI usando SEQ ID nº 6 (polipéptido INSP108) Figura 2: Alineamiento entre la secuencia de polipéptido INSP108 (SEQ ID nº 6) y la beta defensina 123 (Homo sapiens) Figura 3: Predicción del sitio de división del Sig P para INSP108 Figura 4: Resultado BLAST contra la base de datos no redundante NCBI usando SEQ ID nº14 (polipéptido INSP109) Figura 5: Alineamiento entre la secuencia del polipéptido INSP109 (SEQ ID nº14) y beta defensina 4 (Mus musculus) Figura 6: Predicción del sitio de división del Sig P para INSP109 Figura 7: Secuencia de nucleótido predicho de INSP108 con traducción Figura 8: Secuencia de nucleótido con traducción de producto de PCR INSP108 clonado usando cebadores INSP108-CP1 e ISNP108-CP2 Figura 9: Mapa de pCR4-TOPO-INSP108 Figura 10: Mapa de pDONR 221 Figura 11: Mapa de vector de expresión pEAK12d Figura 12: Mapa de vector de expresión pDEST12.2 Figura 13: Mapa de pDONR221-INSP108-6HIS Figura 14: Mapa de pEAK12d-INSP108-6HIS Figura 15: Mapa de pDEST12.2-INSP108-6HIS Figura 16: Secuencia de nucleótidos predichos de INSP109 con traducción Figura 17: Organización del exón codificante INSP109 en ADN genómico y posición de cebadores de la PCR Figura 18: Secuencia de nucleótidos y traducción de INSP109 ORF clonado Figura 19: Mapa de pCR4-TOPO-INSP109 Figura 20: Mapa de pDONR-INSP109-6HIS Figura 21: Mapa de pEAK12d-INSP109-6HIS Figura 22: Mapa de pDEST12.2-INSP109-6HIS

Los ejemplos que no se refieren a la invención reivindicada se incluyen sólo a modo de información.

Ejemplos

Ejemplo 1: INSP108 La secuencia de polipéptidos del INSP108, mostrada en la SEQ ID nº6, se usó como una duda BLAST frente a la base de datos de secuencias no redundantes de NCBI. La mejor posición es para el gen Homo sapiens anotado comentado como defensina (Figura 1). El INSP108 se alinea con esta secuencia con un valor significativo E (4e-6) (Figura 2), indicando por ello un alto grado de confianza en la predicción.

Ejemplo 2: Secuencia de la señal INSP108 La Figura 3 muestra que con el INSP108 se predice que posee un péptido señal al principio de la proteína. Como los datos del SigP de la Figura 3 muestran claramente, el sitio de división del péptido señal se piensa que está entre los restos 24 y 25 de la secuencia de polipéptidos de INSP108 (Nielsen H. et al. 1997, Protein Engineering, 10, 16; Nielsen, H., y Krogh, A.: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. En Proceedings of the Sixth International Conferencia on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pág 122-130 (1998)).

Ejemplo 3: INSP109 La secuencia de polipéptidos INSP109, mostrada en la SEQ ID nº14, se usó como una duda BLAST frente a la base de datos de la secuencia no redundante NCBI. La mejor posición es para la predicción con gen Mus musculus que no es comentada, y la segunda mejor posición fue beta 4 defensina Mus musculus (NP_062702.1) (Figura 4). La Figura cinco muestra el polipéptido INSP109 alineado con la beta 4 defensina Mus musculus.

Ejemplo 4: Secuencia de señal INSP109 La Figura 6 muestra que con el INSP109 se predice que posee un péptido señal al principio de la proteína. Como los datos de SigP en la Figura 6 muestran claramente, se piensa que el sitio de división del péptido señal está entre los restos 21 y 22 de la secuencia de polipéptidos INSP109 (Nielsen H. et al. 1997, Protein Engineering, 10, 1-6; Nielsen, H., y Krogh, A.: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. En Proceedings of the Sixth International Conferencia on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pág. 122130 (1998)).

Ejemplo 5: Clonación de INSP108

1.1 Preparación de modelos ADNc humano La primera hélice de ADNc se preparó a partir de una variedad de muestras normales de ARN total de tejido humano (Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute y preparados domésticos) usando la transcriptasa inversa RNasa H Superscript II (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cebador oligo (dT)15 (1 µl a 500 µg/ml) (Promega), 2 µg de ARN total humano, 1 µl de mezcla de dNTP 10mM (10 mM cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP a pH neutro) y agua destilada estéril hasta un volumen final de 12 µl se combinaron en un tubo Eppendorf 1,5 ml, se calentaron a 65ºC durante 5 minutos y después se enfriaron sobre hielo. Los contenidos se recogieron con una breve centrifugación y 4µl de tampón 5X First-Strand, 2 µl de DTT 0,1 M y se añadió 1 µl de inhibidor ribonucleasa recombinante RnasaOUT (40 unidades/µl, Invitrogen). Los contenidos del tubo se mezclaron con cuidado y se incubaron a 42°C durante 2 minutos; después se añadió 1 µl (200 unidades) de enzima SuperScript II y se mezclaron con cuidado con una pipeta. La mezcla se incubó a 42°C durante 50 minutos y después se inactivó mediante calentamiento a 70°C durante 15 minutos. Para separar el ARN complementario del ADNc, se añadió 1 µl (2 unidades) de RNasa H (Invitrogen) de E. coli y la mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 20 minutos. La mezcla de reacción final de 21 µl se diluyó añadiendo 179 µl de agua estéril para dar un volumen total de 200 µl.

Las muestras de ADNc humano usadas como plantillas para la amplificación de INSP108 eran procedentes del cerebro, riñón, hígado, pulmón, placenta, músculo esqueletal, intestino delgado, bazo, tiroide, colon, testículos, piel, páncreas, glándula pituitaria, glándula salivar, glándula adrenal, ojo y una mezcla de muestras de estirpes de células tumorales (muestra de ARN de Referencia Universal, Stratagene).

1.2 Cebadores de la clonación específica del gen para PCR

Un par de cebadores PCR con una longitud de entre 18 y 25 bases se diseñó para amplificar la secuencia codificante completa del ADNc virtual que usa Primer Designer Software (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EE.UU.). Los cebadores PCR se optimizaron para tener una Tf cercana a 55 ± 10°C y un contenido de GC de 40-60%. Se seleccionaron cebadores que tenían gran selectividad por la secuencia diana (INSP108) con pequeño o ningún cebado no específico.

1.3 Amplificación de PCR de INSP108 a partir de una variedad de plantillas de ADNc humano

Los cebadores de clonación específica del gen (INSP108-CP1 e INSP108-CP2, Figura 7, Figura 8 y Tabla 1) se diseñaron para amplificar un fragmento de ADNc de 245 bp que cubren toda la secuencia predicha codificante de 231 bp del INSP108. El análisis de la documentación científica sugería que las proteínas beta defensinas deberían ser expresadas en superficies mucosas y por órganos secretores. Los cebadores de clonación del gen específico INSP108-CP1 e INSP108-CP2 se usaron, por tanto, con muestras de ADNc humano listadas en la Sección 1.1 como plantillas de PCR. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 µl que contenían tampón de PCR 1X Platinum® Taq High Fidelity, MgSO4 2 mM, dNTP(s) 200 µM, 0,2 µM de cada cebador de clonación, 2,5 unidades de ADN polimerasa Platinum® Taq ADN High Fidelity (Invitrogen) y 100ng de plantilla de ADNc humano usando un MJ Research DNA Engine, programado como sigue: 94°C, 2 minutos; 40 ciclos de 94°C, 30 segundos, 55°C, 30 segundos, 68°C, 30 segundos, seguido de un ciclo a 68°C durante 7 minutos y un ciclo de mantenimiento a 4°C.

Una alícuota de 5 µl de cada producto de amplificación se visualizó en un gel de agarosa al 0,8% en tampón 1X TAE (Invitrogen) y se vio que un único producto de la PCR migraba a aproximadamente la masa molecular predicha en la muestra que corresponde al ADNc de testículo. El producto de la PCR restante de la amplificación del testículo se sometió a electroforesis en un segundo gel de agarosa 0,8% y se purificó usando el sistema de purificación de ADN Qiagen MinElute (Qiagen). El producto de la PCR se eluyó en 10 µl de tampón EB (Tris. Cl 10 mM, pH 8,5) y se subclonó directamente.

1.4 Subclonación de productos de la PCR

El producto de la PCR se subclonó en el vector de clonación modificado con topoisomerasa I (pCR4-TOPO) usando el kit de clonación TA comprado a Invitrogen Corporation usando las condiciones especificadas por el fabricante. En resumen, 4 µl de producto de la PCR de la amplificación de ADNc de testículo humano, purificado en gel, se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con 1 µl de vector TOPO y 1 µl de solución salina. La mezcla de reacción se transformó después en la variedad de de E. coli TOP10 (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de células One Shot TOP10 se congelaron sobre hielo y se añadieron 2 µl de la reacción de TOPO. La mezcla se incubó durante 15 minutos sobre hielo y después se sometió a un choque térmico por incubación a 42°C durante exactamente 30 segundos. Las muestras se devolvieron al hielo y se añadieron 250 µl de medio SOC templado (temperatura ambiente). Las muestras se incubaron con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación se llevó a placas después sobre placas de caldo L (LB) que contienen ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

1.5 Colonia PCR

Las colonias se inocularon en 50 µl de agua estéril usando un palillo de dientes estéril. Una alícuota de 10 µl de inóculo se sometió luego a PCR en un volumen total de reacción de 20 µl que contenía tampón 1X AmpliTaq® , 200 µm de dNTP(s), 20 pmoles de cebador T7, 20 pmoles de cebador T3, 1 unidad de AmpliTaq® (Perkin Elmer) usando un MJ Research DNA Engine. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 94°C, 2 minutos; 30 ciclos de 94°C, 30 segundos, 48°C, 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. Las muestras se mantuvieron a 4°C (ciclo de mantenimiento) antes de un análisis adicional.

Los productos de reacción de la PCR se realizaron en geles de agarosa al 1% en tampón 1 X TAE. Las colonias que dieron el tamaño de producto esperado de la PCR (245 bp de ADNc + 105 bp debido al sitio de clonación múltiple o MCS(en inglés)) se desarrollaron durante la noche a 37°C en 5 ml de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 µg/ml), con agitación a 220 rpm.

1.6 Preparación y secuenciación de ADN plásmido

El ADN plásmido miniprep se preparó a partir de 5 ml de cultivo usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) o Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega catálogo nº 1460) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido se eluyó en 100µl de agua estéril. La concentración de ADN se midió usando un fotómetro Eppendorf BO. El ADN plásmido (200-500 ng) se sometió a secuenciación de ADN con el cebador T7 y el cebador T3 usando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems catálogo nº 4390246) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias del cebador se muestran en la Tabla 1. Las reacciones de secuenciación se purificaron usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. nº LSKS09624) después se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems 3700.

El análisis de la secuencia identificó un clon que contenía al 100% la misma secuencia INSP108 predicha. La secuencia del fragmento de ADNc clonado se muestra en la Figura

8. El mapa del plásmido del producto de la PCR clonado (pCR4-TOPO-INSP108) (plásmido ID.13982) se muestra en la Figura 9.

2. Construcción de un plásmido para la expresión de células de INSP108 en HEK293/EBNA.

Un clon pCR4-TOPO que contenía la secuencia codificante completa (ORF) de INSP108 identificado por secuenciar ADN (pCR4-TOPO-INSP108, plásmido ID 13982) (figura 9) se usó luego para subclonar el inserto en vectores expresión de células de mamífero pEAK12d (figura 11) y pDEST12.2 (figura 12) usando metodología de clonación Gateway® (Invitrogen).

2.1. Generación de la ORF de INSP108 compatible Gateway condensado con una secuencia de etiqueta en marco 6HIS.

La primera etapa del proceso de clonación Gateway implica una reacción de la PCR en dos etapas que genera la ORF de INSP108 flanqueado en el extremo 5’ por un sitio de recombinación attB1 y una secuencia Kozak, y flanqueado en el extremo 3’ por una secuencia que codifica una etiqueta en marco 6 histidina (6HIS), un codón de terminación y el sitio de recombinación attB2 (ADNc compatible Gateway). La primera reacción de la PCR (en un volumen final de 50 µl) contiene: 1,5 µl de pCR4-TOPO-INSP108 (plásmido ID 13982), 1,5 µl de dNTP(s) (10 mM), 5 µl de tampón polimerasa 10X Pfx, 1 µl de MgSO4 (50 mM), 0,5 µl cada uno de cebadores específicos del gen (100 µM) (INSP108-EX1 e INSP0108-EX2), 2,5 µl de solución 10X EnhancerTM (Invitrogen) y 1 µl ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen). La reacción de la PCR se realizó usando una etapa de desnaturalización inicial de 95°C durante 2 minutos, seguido de 15 ciclos de 94°C durante 15 segundos; 55°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos 30 segundos; y un ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de la amplificación se purificaron directamente a partir de la mezcla de la PCR usando el sistema de purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega) y se recuperó en 50 µl de agua estéril de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La segunda reacción de la PCR (en un volumen final de 50 µl) contenía 10 µl de producto purificado PCR 1, 1,5 µl de dNTPs (10 mM), 5 µl de tampón polimerasa 10 X Pfx, 1 µl de MgSO4 (50 mM), 0,5 µl de cada cebador de transformación Gateway (100 µM) (GCP hacia delante y GCP inverso) y 0,5 µl de ADN polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones para la segunda reacción de la PCR fueron: 95°C durante un minuto; 4 ciclos de 94°C, 15 segundos; 50°C, 30 segundos y 68°C durante 2 minutos 30 segundos; 19 ciclos de 94°C, 15 segundos; 55°C, 30 segundos y 68°C, 2 minutos 30 segundos; seguido de un ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de la PCR fueron purificados en gel usando el sistema de purificación de ADN Wizard PCR prep (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.2 Subclonación de la ORF de INSP108 compatible Gateway en el vector de entrada Gateway pDONR221 y en los vectores de expresión pEAK12d y pDEST12.2

La segunda etapa del proceso de clonación Gateway implica la subclonación del producto de la PCR modificado Gateway en el vector de entrada Gateway pDONR221 (Invitrogen, figura 10) como sigue: 5 µl del producto purificado de la PCR 2 se incubaron con 1 µl del vector pDONR221 (0,15 µg/µl), 2 µl de tampón BP y 1,5 µl de mezcla de enzima clonasa de BP (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se detuvo por adición de proteinasa K (2 µg) y se incubó a 37°C durante unos 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 µl) se usó para transformar células DH10B de E. coli por electroporación como sigue: una alícuota de 30 µl de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) se congelaron sobre hielo y se añadieron 2 µl de la mezcla de reacción BP. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación enfriada de 0,1 cm y las células se electroporaron usando un BioRad Gene-Pulser® de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Medio SOC (0,5 ml) que había sido precalentado a temperatura ambiente se añadió inmediatamente después de la electroporación. La mezcla se transfirió a un tubo de cerrado rápido de 15 ml y se incubó, con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37ºC. Alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) se sometieron en placas después sobre placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina (40 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

ADN plásmido mini-prep se preparó a partir de 5 ml de cultivos de 6 de las colonias resultantes usando un sistema automático Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El ADN plásmido (200-500 ng) se sometió a secuenciación de ADN con cebadores 21M13 y M13Rev usando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems cat. nº 4390246) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias cebadoras se muestran en la Tabla 1. Las reacciones de secuenciación se purificaron usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. nº LSKS09624) después se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems 3700.

El eluato del plásmido (2 µl) de uno de los clones que contenía la secuencia correcta (pDONR221-INSP108-6HIS, plásmido ID 14224, figura 13) se usó después en una reacción de recombinación que contenía 1,5 µl de o vector pEAK12d o vector pDEST12.2 (figuras 11 y 12) (0,1 µg/µl), 2 µl de tampón LR y 1,5 µl de clonasa LR (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, se detuvo por adición de proteinasa K (2 µg) y se incubó a 37°C durante unos 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (1 µl) se usó para transformar células DH10B de E. coli por electroporación como sigue: una alícuota de 30 µl de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) se congeló sobre hielo y se añadió 1 µl de la mezcla de la reacción LR. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,1 cm enfriada y las células se electroporaron usando un BioRad Gene-Pulser® de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El medio SOC (0,5 ml) que había sido precalentado a temperatura ambiente se añadió inmediatamente después de la electroporación. La mezcla se transfirió a un tubo de cierre rápido de 15 ml y se incubó, con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37ºC. Alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) se llevaron después a placas de cultivo L (LB) que contenían ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

ADN plásmido mini-prep se preparó a partir de 5 ml de cultivos de 6 de las colonias resultantes subclonadas en cada vector usando un sistema automático Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pEAK12d se sometió a

5 secuenciación de ADN con cebadores pEAK12d y pEAK12R como se ha descrito anteriormente. El ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pDEST12.2 se sometió a secuenciación de ADN con cebadores 21M13 y M13Rev como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1.

10 El ADN maxi-prep purificado con gradiente CsCl se preparó a partir de un cultivo de 500 ml de uno de cada uno de los clones verificados de la secuencia (pEAK12d-INSP1086HiS, plásmido ID nº 14228, figura 14, y pDEST12.2-INSP108-6HIS, plásmido ID 14229, figura 15) usando el métido descrito por Sambrook J. et al., 1989 (en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). El ADN del plásmido se

15 volvió a someter a suspesión a una concentración de 1 µg/µl en agua estéril y se almacenó a -20ºC.

Tabla 1: Cebadores de clonación y de secuenciación de INSP108

imagen1

20 Secuencia subrayada = secuencia Kozak En negrita = codón de terminación Secuencia en cursiva = etiqueta de histidina

Ejemplo 6: Clonación de INSP109 por montaje exón

1.1 Amplificación de la PCR de exones que codifican INSP109 a partir de ADN genómico.

Cebadores PCR se diseñaron para amplificar exones 1 y 2 de INSP109 (tabla 2). El cebador inverso del exón 1 (INSP109-exón1R) tiene un solapamiento de 9 bp con el exón 2 del INSP109 en su extremo 5’. El cebador hacia delante del exón 2 (INSP109-exón2F) tiene un solapamiento de 9 bp con exón 1 del INSP109 en su extremo 5’.

Para generar un exón 1 de INSP109, la reacción de la PCR se realizó en un volumen final de 50 µl y contenía 1 µl de ADN genómico (0,1 µg/µl (Novagen Inc.), 1,5 µl de dNTP(s) 10 mM (Amersham Pharmacia Biotech), 1 µl de MgSO4 (Invitrogen), 1,5 µl de INSP109exón1F (10 µM), 1,5 µl de INSP109-exón1R (10 µM), 10 µl de tampón 10X Pfx y 0,5 µl de polimerasa Pfx (2,5U/µl) (Invitrogen). Las condiciones de la PCR fueron 94°C durante cinco minutos; 30 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 57°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos; un ciclo de alargamiento adicional a 68°C durante 7 minutos; y un ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de reacción se cargaron en un gel de agarosa del 2% (1X TAE) y los productos de la PCR de tamaño correcto (64 bp) se purificaron en gel usando un kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen cat. nº 28704) y se eluyeron en 30 µl de tampón de elución (Qiagen). Se produjo exón 2 de INSP109 y se purificó usando lo mismo excepto que los cebadores de la PCR eran INSP109-exón2F e INSP109-exón2R, y la temperatura de anillado fue de 63°C. El producto INSP109-exón 2 de la PCR tenía 190 bp.

1.2 Conjunto de exones 1 y 2 para generar la ORF de INSP109

Los exones 1 y 2 fueron ensamblados en 50 µl de la reacción de la PCR que contenía 5 µl de exón 1 purificado en gel, 5 µl de exón 2 purificado en gel, 1 µl de dNTPs 10 mM, 2 µl de MgSO4, 1 µl de INSP109-exón1F (10 µM), 1 µl de INSP109-exón2R (10 µM), 5 µl de tampón 10X Platinum Taq HiFi, y 0,5 µl de ADN polimerasa Platinum Taq HiFi (5 U/µl) (Invitrogen). Las condiciones de reacción fueron: 94°C, 2 minutos; 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto; un ciclo de alargamiento adicional de 68°C durante 7 minutos; y 1 ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa al 2% (1X TAE). Los productos PCR del tamaño correcto (236 bp) se purificaron en gel usando el sistema de purificación de ADN Qiagen MinElute (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se eluyeron en 10 µl de tampón EB (Tris. Cl. 10 mM, pH 8,5) y se subclonaron directamente.

1.3 Subclonación de productos PCR

El producto de PCR se subclonó en un vector de clonación modificado con topoisomerasa I (pCR4-TOPO) comprado a Invitrogen Corporation usando las condiciones especificadas por el fabricante. En resumen, 4 µl de producto PCR purificado en gel se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con 1 µl de vector TOPO y 1 µl de solución salina. La mezcla de reacción se transformó entonces en variedad TOP10 de E. coli (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de células One Shot TOP10 se congeló sobre hielo y se añadieron 2 µl de la reacción TOPO. La mezcla se incubó durante 15 minutos sobre hielo y después se sometió a choque térmico por incubación a 42°C durante exactamente 30 segundos. Las muestras se devolvieron al hielo y se añadieron 250 µl de medio SOC templado (temperatura ambiente). Las muestras se incubaron con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación se sometió después en placas sobre placas de caldo L (LB) que contenían ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

1.4 Colonia PCR

Las colonias resistentes a la ampicilina se inocularon en 50 µl de agua estéril usando un palillo de dientes estéril. Una alícuota de 10 µl del inoculo se sometió después a PCR en un volumen de reacción total de 20 µl que contenía tampón 1X AmpliTaq®, dNTPs 200 µM, 20 pmoles de cebador T7, 20 pmoles de cebador T3, 1 unidad de AmpliTaq® (Perkin Elmer) usando un MJ Research DNA Engine. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 94°C, 2 minutos; 30 ciclos de 94°C, 30 segundos, 48°C, 30 segundos y 72°C durante un minuto. Las muestras se mantuvieron a 4°C (ciclo de mantenimiento) antes de un análisis adicional.

Los productos de reacción de la PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% en tampón 1X TAE. Las colonias que dieron el tamaño del producto de PCR esperado (236bp de ADNc + 103 bp debido a múltiples sitios de clonación o MCS) se dejaron crecer durante la noche a 37°C en 5 ml de cultivo L (LB) que contenía ampicilina (100 µg/ml), con agitación a 220 rpm.

1.5 Preparación y secuenciación de ADN plásmido

El ADN plásmido miniprep se preparó a partir de cultivos de 5 ml usando un sistema automático Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) o un kit Wizard Plus SV Minipreps (Promega cat. nº 1460) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido se eluyó en 100 µl de agua estéril. La concentración de ADN se midió usando un fotómetro Eppendorf BO. El ADN plásmido (200-500 ng) se sometió a secuenciación de ADN con el cebador T7 usando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems cat. nº 4390246) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias del cebador se muestran en la Tabla 2. Las reacciones de secuenciación se purificaron usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. nº LSKS09624) después se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems 3700.

El análisis de secuencia identificó un clon que contenía al 100% la misma secuencia INSP109 predicha. La secuencia del fragmento de ADNc clonado se muestra en la Figura

18. El mapa plásmido del producto PCR clonado (pCR4-TOPO-INSP109) (plásmido ID.13984) se muestra en la Figura 19.

3. Construcción de un plásmido para la expresión de INSP109 en células HEK293/EBNA.

Un clon pCR4-TOPO que contenía la secuencia codificante completa (ORF) de INSP109 identificado por la secuenciación de ADN (pCR4-TOPO-INSP109, plásmido ID.13984) (figura 19) se usó entonces para subclonar el inserto en los vectores pEAK12d (figura 11) y pDEST12.2 (figura 12) de expresión de células de mamífero usando la metodología de clonación Gateway® (Invitrogen).

2.1. Generación de la ORF de INSP109 ORF compatible de Gateway fusionada con una secuencia de etiqueta en el marco 6HIS.

La primera etapa del proceso de clonación Gateway implica una reacción PCR en dos etapas que genera la ORF de INSP109 flanqueada en el extremo 5’ por un sitio de recombinación attB1 y secuencia Kozak, y flanqueado en el extremo 3’ por una secuencia que codifica una etiqueta en el marco de 6 histidina (6HIS), un codón de terminación y un sitio de recombinación attB2 (cADN compatible Gateway). La primera reacción de la PCR (en un volumen final de 50 µl) contiene: 1,5 µl de pCR4-TOPO-INSP109 (plásmido ID 13984), 1,5 µl de dNTPs (10 mM), 5 µl de tampón polimerasa 10X Pfx, 1 µl de MgSO4 (50 mM), 0,5 µl de cada uno de los cebadores específicos del gen (100 µM) (INSP109EX1 e INSP109-EX2), 2,5 µl de solución 10X Enhancer™ (Invitrogen) y 1 µl de ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen). La reacción de la PCR se realizó usando una etapa de desnaturalización inicial de 95°C durante 2 minutos, seguido de 15 ciclos de 94°C durante 15 segundos; 55°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos 30 segundos; y un ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de amplificación se purificaron directamente a partir de mezcla de PCR usando el sistema de purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega) y se recuperaron en 50 µl de agua estéril de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La segunda reacción de la PCR (en un volumen final de 50 µl) contenía 10 µl del producto de la PCR 1 purificado, 1,5 µl de dNTPs (10 mM), 5 µl de tampón polimerasa de 10X Pfx, 1 µ de MgSO4 (50 mM), 0,5 µl de cada cebador de transformación Gateway (100 µM) (GCP hacia delante y GCP inverso) y 0,5 µl de ADN polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones de la segunda reacción de PCR fueron: 95°C durante 1 minuto; 4 ciclos de 94°C, 15 segundos; 50°C, 30 segundos y 68°C durante 2 minutos 30 segundos; 19 ciclos de 94°C, 15 segundos; 55°C, 30 segundos y 68°C, 2 minutos 30 segundos; seguido de un ciclo de mantenimiento de 4°C. Los productos de la PCR se purificaron en gel usando el sistema de purificación de ADN Wizard PCR prep (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.2 Subclonación de la ORF de INSP109 Gateway compatible en el vector de entrada pDONR221 y en los vectores de expresión pEAK12d y pDEST12.2 de Gateway

La segunda etapa del proceso de clonación Gateway implica la subclonación del producto de PCR modificado Gateway en el vector pDONR221 de entrada Gateway (Invitrogen, figura 10) como sigue: 5 µl de producto purificado a partir de PCR2 se incubaron con 1 µl de vector pDONR221 (0,15 µg/µl), 2 µl de tampón BP y 1,5 µl de mezcla de enzima clonasa BP (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se detuvo por adición de proteinasa K (2 µg) y se incubaron a 37°C durante unos 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 µl) se usó para transformar células DH10B de E. coli por electroporación como sigue: una alícuota de 30 µl de células electrocompetentes DH10B (Invitrogen) se descongelaron sobre hielo y se añadieron 2 µl de la mezcla de reacción BP. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,1 cm enfriada y las células se electroporaron usando un BioRad Gene-Pulser® de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El medio SOC (0,5 ml) que había sido precalentado a temperatura ambiente se añadió inmediatamente después de la electroporación. La mezcla se transfirió a un tubo de cierre rápido de 15 ml y se incubó, con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37°C. Alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) se llevaron a placas después sobre placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina (40 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

El ADN plásmido mini-prep se preparó a partir de cultivos de 5 ml de 6 de las colonias resultantes usando un sistema automático Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El ADN plásmido (200-500 ng) se sometió a secuenciación ADN con cebadores 21M13 y M13Rev usando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems cat. nº 4390246) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias del cebador se muestran en la Tabla

2. Las reacciones de secuenciación se purificaron usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore cat. nº LSKS09624) y después se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems 3700.

El eluato plásmido (2 µl) de uno de los clones que contenía la secuencia correcta (pDONR221-INSP109-6HIS, plásmido ID 14230, figura 20) se usó después en una reacción de recombinación que contenía 1,5 µl de vector pEAK12d o vector pDEST2.2 (figuras 11 y 12) (0,1 µg/µl), 2 µl de tampón LR y 1,5 µl de clonasa LR (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, se detuvo por adición de proteinasa K (2 µg) y se incubó a 37°C durante unos 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (1 µl) se usó para transformar células DH10B de E. coli por electroporación como sigue: una alícuota de 30 µl de células DH10B electrocompetentes (Invitrogen) se descongelaron sobre hielo y se añadió 1 µl de la mezcla de reacción LR. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,1 cm enfriada y las células se electroporaron usando un BioRad Gene-Pulser® de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Un medio SOC (0,5 ml) que había sido calentado previamente a temperatura ambiente se añadió inmediatamente después de la electroporación. La mezcla se transfirió a un tubo de cierre rápido de 15 ml y se incubó, con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37°C. Alícuotas de la mezcla de transformación (10 µl y 50 µl) se sometieron después sobre placas de caldo L (LB) que contenían ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

El ADN plásmido mini-prep se preparó a partir de cultivos de 5 ml de 6 de las colonias resultantes subclonadas de cada vector usando un sistema automático Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pEAK12d se sometió a secuenciación de ADN con cebadores pEAK12F y pEAK12R, como se ha descrito

5 anteriormente. El ADN plásmido (200-500 ng) en el vector pDEST12.2 se sometió a secuenciación de ADN con cebadores 21M13 y M13Rev como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2.

El ADN maxi-prep purificado con gradiente CsCl se preparó a partir de 500 ml de cultivo

10 de uno de cada uno de los clones verificados de la secuencia (pEAK12d-INSP109-6HIS, plásmido ID 14231, figura 21, y pDEST12.2-INSP109-6HIS, plásmido ID 14350, figura 22) usando el método descrito por Sambrook J. et al., 1989 (en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). El ADN plásmido se volvió a someter a suspensión a una concentración de 1 µg/µl en agua estéril y se

15 almacenó a -20ºC.

Tabla 2: Cebadores para la clonación y secuenciación de INSP109

imagen1

Secuencia subrayada = secuencia Kozak En negrita = codón de terminación 5 Secuencia en cursiva = etiqueta de histidina Secuencia resaltada = solapamiento con exón adyacente

Ejemplo 7: Expresión y purificación de INSP108 y de INSP109

10 Experimentos adicionales pueden ahora realizarse para determinar los niveles de distribución y expresión en el tejido de los polipéptidos INSP108 e INSP109 in vivo, sobre la base de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos descritas aquí.

La presencia de los transcritos de INSP108 e INSP109 puede ser investigada por PCR de 15 ADNc a partir de diferentes tejidos humanos. Los transcritos de INSP108 y de INSP109 pueden estar presentes a muy bajos niveles en las muestras ensayadas. Por tanto, se

necesita un extremo cuidado en el diseño de los experimentos para establecer la presencia de un transcrito en varios tejidos humanos ya que una pequeña cantidad de contaminación genómica en la preparación de ARN proporcionará un resultado positivo falso. Por ello, todo el ARN debe ser tratado con DNAsa antes de usar en la transcripción inversa. Además, para cada tejido puede establecerse una reacción de control en la que no se experimente transcripción inversa (a un control a temperatura inferior a la ambiente).

Por ejemplo, puede usarse 1 µg de ARN total de cada tejido para generar ADNc usando transcriptasa inversa Multiscript (ABI) y cebadores hexámeros al azar. Para cada tejido, se establece una reacción de control en la que se añaden todos los constituyentes excepto la transcriptasa inversa (control a temperatura inferior a la ambiente). Las reacciones de PCR se establecen para cada tejido en las muestras de ARN transcritas inversas y los controles a temperatura inferior a la ambiente. Los cebadores específicos de INSP085 pueden diseñarse fácilmente sobre la base de la información de secuencia proporcionada en este documento. La presencia de un producto de peso molecular correcto en la muestra transcrita inversa junto con la ausencia de un producto en el control a una temperatura inferior a la ambiente pueden ser tomados como evidencia de la presencia de un transcrito en ese tejido. Cualquier genoteca adecuada puede usarse para cribar transcritos de INSP108 y de INSP109, no sólo las generadas descritas anteriormente.

El modelo de distribución de tejido de los polipéptidos INSP108 e INSP109 proporcionará una información adicional útil en relación con la función de aquellos polipéptidos.

Además, experimentos adicionales pueden ahora ser realizados usando vectores de expresión pEAK12d-INSP108-6HIS, pEAK12d-INSP109-6HIS, pDEST12.2-INSP108-6HIS y pDEST12.2-INSP109-6HIS. La transfección de estirpes de células de mamíferos con estos vectores puede permitir la expresión a gran nivel de las proteínas INSP108 e INSP109 y permitir por ello la investigación continuaba de las características funcionales de los polipéptidos INSP108 e INSP109. El material y los métodos siguientes son un ejemplo de los adecuados en tales experimentos:

Cultivo celular 293 células embrionarias de riñón humano que expresan el antigen nuclear del virus Epstein-Barr (HEK293-EBNA, Invitrogen) se mantuvieron en suspensión en un medio exento de suero Ex-cell VPRO (provisión de semillas, medio de mantenimiento, JRH). Dieciséis a 20 horas antes de la transfección (día 1), las células se inseminaron en 2 matraces de T225 (50 ml por matraz en DMEM / F12 (1:1) que contenían medio de inseminación FBS al 2% (JRH) a una densidad de 2x105 células/ml). Al día siguiente (día 0 de la transfección) tuvo sitio la transfección usando el reactivo JetPEITM (2 µl/µg de ADN plásmido, PolyPlus-transfection). Para cada matraz, el ADN plásmido es cotransfectado con ADN GFP (gen indicador fluorescente). La mezcla de transfección se añade entonces a dos matraces T225 y se incubó a 37ºC (CO2 al 5%) durante 6 días. La confirmación de transfección positiva puede realizarse mediante examen por fluorescencia cualitativa entre el día 1 y el día 6 (Axiovert 10 Zeiss).

En el día 6 (día de la recolección), los sobrenadantes de los dos matraces se mezclaron y se centrifugaron (por ejemplo, 4ºC, 400 g) y se colocaron en un tarro llevando un único identificador. Una alícuota (500 µl) se mantuvo para el CC de la proteína etiquetada 6HIS (CC del bioprocesado interno).

Lotes de aumentos progresivos pueden ser producidos siguiendo el protocolo denominado “Transfección PEI de células en suspensión”, referenciada BP/PEI/HH/02/04, con polietilenimina a partir de Polysciences como agente de transfección.

Proceso de purificación

La muestra del medio de cultivo que contenía la proteína recombinante con una etiqueta 6His en el C-terminal se diluyó con tampón A en frío (NaH2PO450 mM; NaCl 600 mM; 8,7% (p/v) de glicerol, pH 7,5). La muestra se filtró después a través de un filtro estéril (Millipore) y se mantuvo a 4°C en una botella para medio de forma cuadrada estéril (Nalgene).

La purificación se realizó a 4°C en un puesto de trabajo VISION (Applied Biosystems) conectado a un cargador de muestras automático (Labomatic). El proceso de purificación está compuesto de dos etapas secuenciales, cromatografía por afinidad con metal sobre una columna Poros 20 MC (Applied Biosystems) cargada con iones Ni (4,6 x 50 mm, 0,83 ml), seguida por filtración en gel en una columna de medio Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia) (1,0 x 10 cm).

Para la primera etapa de cromatografía la columna de afinidad de metal se regenera con 30 volúmenes de columna de solución de AEDT (AEDT 100 mM; NaCl 1M; pH 8,0), recargada con iones Ni a través de lavado con 15 volúmenes de columna de una solución de NiSO4 100 mM, se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón A, seguidos por 7 volúmenes de columna de tampón B (NaH2PO4 50 mM; NaCl 600 mM; 8,7% (p/vol) de glicerol; imidazol 400 mM, pH 7,5) y, finalmente, se equilibró con 15 volúmenes de columna de tampón A que contenía imidazol 15 mM. La muestra se transfirió mediante un cargador de muestras Labomatic, en un circuito de muestras de 200 ml y posteriormente se cargó en una columna de afinidad con Ni metal a un caudal de 10 ml/min. La columna se lavó con 12 volúmenes de columna de tampón A, seguido por 28 volúmenes de columna de tampón A que contenía imidazol 20 mM. Durante el lavado con imidazol 20 mM proteínas contaminantes poco unidas se eluyeron de la columna. La proteína recombinante etiquetada His se eluyó finalmente con 10 volúmenes de columna de tampón B a un caudal de 2 ml/min, y se recogió la proteína eluida.

Para la segunda etapa de cromatografía, la columna en gel Sephadex G-25 se regeneró con 2 ml de tampón D (1,137 M NaCl; 2,7 mM KCl; 1,5 mM KH2PO4; 8 Mm NaH2PO4; pH 7,2), y posteriormente se equilibró con 4 volúmenes de columna de tampón C (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,5 mM KH2PO4; 8 mM NaH2PO4; 20% (p/vol) glicerol; pH 7,4). La fracción pico eluida de la columna con níquel se cargó automáticamente en una columna de Sephadex G-25 a través de un cargador de muestras integrado en el VISION y la proteína se eluyó con tampón C a un caudal de 2 ml/min. La fracción se filtró a través de un filtro de centrifugación estéril (Millipore), se congeló y se almacenó a -80ºC. Una alícuota de la muestra se analizó sobre inmunotransferencia Western SDS-PAGE (gel NuPAGE al 4-12%; Novex) con anticuerpos anti-His. El gel NuPAGE puede ser coloreado en una solución manchada con azul Coomassie R250 al 0,1% (30% metanol, 10% ácido acético) a temperatura ambiente durante 1 hora y posteriormente decolorarse en 20% metanol, 7,5% ácido acético hasta que el fondo estaba transparente y las bandas de proteína eran claramente visibles.

Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron desde el gel a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con leche en polvo al 5% en tampón E (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HPO4; 0,1% pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente, y posteriormente se incubaron con una mezcla de 2 anticuerpos anti-His policlonales de conejo (G-18 y H-15, 0,2 µg/ml cada uno; Santa Cruz) en leche en polvo al 2,5% en tampón E durante la noche a 4°C. Después de una incubación de 1 hora adicional a temperatura ambiente, la membrana se lavó con tampón E (3 x 10 min), y después se incubó con un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP secundario (DAKO, HRP 0399) diluido 1/3000 en tampón E, que contenía leche en polvo al 2,5%, durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con tampón E (3 x 10 min), la membrana se desarrolló con el kit ECL (Amersham Pharmacia) durante 1 minuto. La membrana se expuso posteriormente a Hyperfilm (Amersham Pharmacia), el film se desarrolló y se analizó visualmente la imagen de la inmunotransferencia Western.

Para muestras que mostraban bandas de proteína detectables mediante el manchado Coomassie, la concentración de proteína puede determinarse usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce) con seroalbúmina bovina como patrón.

Además, la sobreexpresión o caída de la expresión de los polipéptidos en estirpes de células puede usarse para determinar el efecto sobre la activación transcripcional del genoma de la célula anfitriona. Parejas de dimerización, coactivadores y correpresores del polipéptido INSP108 y del INSP109 pueden ser identificados por inmunoprecipitación combinada con inmunotransferencia Western e inmunoprecipitación combinada con espectroscopia de masas.

Ejemplo 8: Ensayos para la detección de la actividad de la defensina

Ensayos basados en células y animales para la validación y caracterización de los polipéptidos similares a la quimiocina.

Se han desarrollado varios ensayos para probar la especificidad, potencia y eficacia de las quimiocinas usando cultivos celulares o modelos animales, por ejemplo ensayos de quimiotaxis in vitro (Proudfoot A, et al. J Biol Chem 276: 10620-10626, 2001; Lusti-Narasimhan M et al., J Biol Chem, 270: 2716-21, 1995), o hinchamiento de oreja de ratón (Garrigue JL et al., Contact Dermatitis, 30: 231-7, 1994). Muchos otros ensayos y tecnologías para generar herramientas y productos útiles (anticuerpos, animales transgénicos, proteínas radiomarcadas, etc.), han sido descritos en revistas y libros dedicados a las quimiocinas (Methods Mol. Biol vol. 138, “Chemokines Protocols”, editada por Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 y 288, Academic Press, 1997), y puede usarse para verificar de una manera más precisa, las actividades biológicas de los polipéptidos de la invención similares a la quimiocina y los reactivos relacionados junto con posibles métodos y usos terapéuticos o diagnósticos.

Ensayos de modulación de la expresión de la citocina

Los siguientes ensayos tri-réplica basados en células in vitro miden los efectos de la proteína de la invención en la secreción de la citocina inducida por Concanavalin A (Con A) que actúan sobre diferentes células mononucleares de la sangre periférica en el ser humano (hPBMC), células medidas por un ensayo de una matriz de bolitas de citosina (CBA) para IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4 e IL-10 tal como el kit Human Th1/Th2 Cytokine CBA (Becton-Dickinson).

Las condiciones óptimas son 100.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y 100 µl final en glicerol al 2%. La concentración óptima del mitogen (ConA) es de 5 ng/ml. El tiempo óptimo para el ensayo es de 48 horas. La elección de lectura de salida es CBA.

1 Purificación de PBMC humano a partir de una capa leucocitaria

La capa leucocitaria 1 a 2 se diluyó con DMEM. 25 ml de sangre diluida se añadieron lentamente más tarde sobre 15 ml de la capa de Ficoll en un tubo Falcon de 50 ml, y los tubos se centrifugaron (1.200 rpm, 20 minutos a temperatura ambiente sin frenar). La interfase (anillo) se recoge después y las células se lavan con 25 ml de DMEM seguido por una etapa centrífuga (1.200 rpm, 5 minutos). Este procedimiento se repite tres veces. Una capa leucocitaria da aproximadamente 600 x 106 células totales.

2 Cribado

80 µl de 1,25 x 106 células/ml se diluyeron en DMEM+2,5% de suero humano +1% de Lglutamina + 1% de penicilina-estreptomicina y más tarde se añadieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Se añadieron 10 µl por pocillo (una condición por pocillo): las proteínas se diluyeron en PBS+20% de glicerol (la dilución final de las proteínas era de 1/10). 10 µl de Stimulant de Con A (50 µg/ml) se añaden después a cada pocillo (una condición por pocillo – la concentración final de ConA es de 5 µg/ml).

Después de 48 horas, las células sobrenadantes se recogen y las citocinas humanas se miden mediante un kit Human Th1/Th2 Cytokine CBA de Becton-Dickinson.

Análisis CBA (para más detalles, referir a las instrucciones del fabricante en el kit de CBA)

i) Preparación de bolitas de captura Th1/Th2 humanas mezcladas

El número de tubos de ensayo que se requieren para el experimento se determinó. Cada suspensión de bolitas de captura se sometió a una agitación vigorosa con vórtice durante unos pocos segundos antes de mezclar. Para cada ensayo que iba a ser analizado, se añadieron 10 µl de alícuota de cada perla de captura en un solo tubo etiquetado “bolitas de captura mezcladas”. La mezcla de bolitas se sometió vigorosamente a agitación con vórtice.

ii) Preparación de las muestras de ensayo

Los sobrenadantes se diluyeron (1:4) usando el Diluyente de Ensayo (20 µl de sobrenadantes + 60 µl de Diluyente de Ensayo). La dilución de la mezcla se mezcló entonces antes de transferir las muestras a una placa de microtitulación con 96 pocillos de fondo cónico (Nunc).

iii) Procedimiento de ensayo de CBA de citocinas Th1/Th2 humanas

Se añadieron 50 µl de sobrenadante diluidos a una placa de microtitulación con 96 pocillos de fondo cónico (Nunc). 50 µl de las bolitas de captura mezcladas se añadieron después por adición de 50 µl del reactivo de detección de PE Th1/Th2 humana. La placa se incubó entonces durante 3 horas a temperatura ambiente y se protegió de la exposición directa a la luz seguido de centrifugación a 1.500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó luego con cuidado. En una etapa posterior, 200 µl de tampón de lavado se añadieron dos veces a cada pocillo, se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos y se desechó con mucho cuidado el sobrenadante. Más tarde, se añadieron 130 µl de tampón de lavado a cada pocillo para volver a suspender los grupos de bolitas. Las muestras se analizaron finalmente en un citómetro de flujo. Los datos se analizaron después usando el CBA Application Software, Activity Base y Microsoft Excel software.

De la lectura de salida del ensayo puede valorarse si, in vitro, la proteína de la invención tiene un efecto inhibidor consistente sobre todas las citocinas ensayadas (IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10).

Además, basado en el valor EC50, puede evaluarse fácilmente que la citocina se inhibió lo máximo y después deriva la enfermedad autoinmune/inflamatoria específica, que es conocida por estar particularmente ligada a esa citocina.

Ensayos que direccionan a respuestas de linfocito T Muerte de células en T inducida por ligandos Fas. Este ensayo revelará nuevos moduladores de muerte celular mediada por receptor.

En este ensayo, la apoptosis de células T es inducida mediante la estimulación de células Jurkat (una estirpe de células T humanas) con ligando Fas recombinante etiquetado con 6 histidina combinado con un anticuerpo monoclonal anti-6-his. La muerte es cuantificada por la liberación de LDH, una enzima citoplasmática liberada en el medio de cultivo cuando las células están muriéndose. La lectura de salida es la lectura de un ensayo colorimético a 490 nm. Se ha demostrado que las células T son patógenas en muchas enfermedades autoinmunes, siendo capaz de controlar la muerte de células T específicas del antigen es una estrategia terapéutica (p. ej., tratamiento anti-TNFα en paciente con enfermedad de Crohn).

Human-MLR: proliferación y secreción de citocina. Este ensayo basado en células mide los efectos de nuevas proteínas en la proliferación de linfocitos y secreción o inhibición de citocina después de estimulación mediante PBMC de otro donante (aloreactividad). Estos ensayos dirigen la célula T específica de antigen y el antigen que presenta funciones de célula, que son respuestas celulares cruciales en cualquiera de las enfermedades autoinmunes. La citocina segregada (IL2, 4, 5, 10, TNF-α y IFN-γ) se cuantifican por CBA. Nota: la proliferación y secreción de citosina son respuestas independientes.

MLR de Ratón proliferación. Este ensayo basado en células mide los efectos de nuevas proteínas sobre la proliferación o inhibición de linfocitos de las células de bazo de ratón después de estimulación por células del bazo de otro donante (cepa de ratón). Este ensayo basado en células mide el efecto de nuevas proteínas sobre el linfocito T y el antigen que presenta respuestas celulares y se usará para confirmar actividad de positivos y los mejores se identifican en ensayos h-MLR. Este ensayo se usará para seleccionar proteínas que se ensayarán en modelo murino de enfermedades humanas.

PBMC humano estimulado con superantigen TSST.

Los superantigenes son moduladores fuertes del sistema inmune que afectan a las células T. Los superantigenes influyen en los trastornos mediados inmunológicamente tales como IBD, enfermedades inflamatorias de la piel como la dermatitis atópica y la psoriasis. En este ensayo celular los autores de la invención están direccionando específicamente la actividad del linfocito T mediante la TCR pero con diferentes requisitos que la respuesta de la célula T frente a antigenes clásicos, en particular con respecto a moléculas coestimuladoras.

PBMC humano estimulado con ConA o con PHA. Estos ensayos basados en células miden los efectos de nuevas proteínas en la secreción de citocina inducida por dos diferentes estímulos que actúan sobre diferentes células medido por un ensayo (IL-2, IFNγ, TNF-α, IL-5, IL-4 e IL-10) de matriz de bolita de perla citocina (CBA).

La mayor parte de las citocinas pueden tener acciones duales, proinflamatorias o antiinflamatorias, dependiendo del daño, medio y diana celular. Cualquier proteína con la capacidad de modular secreción de citocina puede tener un potencial terapéutico (por ejemplo, disminuyendo IFN-γ y TNF-α sería beneficioso en la enfermedad autoinmune mediada con Th1 al contrario que disminuyendo IL-4, IL-5 que puede ser beneficioso en enfermedades mediadas con Th2, induciendo IL-10 sería interesante en MS y SLE).

Ensayos que direccionan respuestas monocitos/macrófagos y granulocitos

PBMC humano estimulado con LPS. Este ensayo basado en células mide los efectos de nuevas proteínas sobre la secreción de citocina (IFN-γ, TNF-α) inducida por LPS que actúa sobre monocitos/macrófagos y granulocitos.

Cualquier proteína con la capacidad de modular secreción IFN-γ y TNF-α sería beneficiosa en enfermedades autoinmunes mediadas con Th1.

Ensayos que direccionan las respuestas de neutrófilos Los neutrófilos son importantes en enfermedades inflamatorias y autoinmunes tales como Artritis Reumatoide. Los leucocitos quimioatractivos tales como IL-8 inician una secuencia de interacciones adhesivas entre células y el endotelio microvascular, dando como resultado la activación, adherencia y finalmente la migración de neutrófilos. La infiltración de los neutrófilos en el tejido depende de la reorganización de elementos citoesqueléticos asociados con cambios específicos en la morfología celular de estas células.

Este ensayo basado en células mide el efecto de nuevas proteínas en la organización citoesquelética de neutrófilos humanos.

Ensayos que direccionan las respuestas de linfocitos B

Se piensa que los Autoanticuerpos así como las células B de infiltración son importantes en la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), síndrome de Sjogren y miastenia gravis. La evidencia convincente indica que una disregulación en la homeostasis de célula B podría afectar la tolerancia inmune que conduce a la inapropiada superviviencvia de células B autorreactivas que producen anticuerpos patógenos e inflamación sostenida. La identificación de nuevos factores que juegan papeles críticos en la regulación de la proliferación, supervivencia y diferenciación de células B, después de provocar al receptor de células B son de gran relevancia en el desarrollo de nuevas terapias.

Proliferación de las células B. Este ensayo basado en células mide el efecto de nuevas proteínas en la supervivencia de las células B.

Coestimulación de las células B. Este ensayo basado en células mide el efecto de nuevas proteínas en la coestimulación de las células B.

Ensayos que direccionan las respuestas de monocitos y microgliocitos

Flujo de calcio THP-1. El flujo de Ca++ en ensayos de células THP1 mide los efectos de nuevas proteínas en su capacidad para provocar una liberación del calcio intracelular (unos casos genéricos de segundo mensajero) desde el retículo endoplásmático.

Proliferación de células microglía (será presentado en el próximo IAC).

Durante la proliferación de losprogenitores de microglial, se sabe que un número de factores estimulantes de la colonia, incluidas algunas citocinas, juegan papeles clave. Entre ellos, la M-CSF es crucial en la etapa final de maduración de macrófagos/microglía y no es reemplazable por ningún otro factor. La evaluación de esta respuesta biológica

5 puede representar una manera de influir en la actividad microglial y, por tanto, una oportunidad de identificar moléculas con el potencial terapéutico de la MS.

Un ensayo basado en células se desarrolló para medir la respuesta proliferativa de una estirpe de células microglía con M-CSF. Las fases de factibilidad y de robustez mostraron 10 resultados óptimos. Este ensayo es en placas de 96 pocillos; se requiere un sustrato no radiactivo, de fácil automatización.

Lista de secuencias de INSP108 y INSP109 (Lista de Secuencias): SEQ. ID. nº:1 (exón 1 de la secuencia del nucleótido INSP108)

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SEQ. ID. nº:2 (exón 1 de la secuencia del nucleótido INSP108)

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SEQ. ID. nº:3 (exón 2 de la secuencia del nucleótido INSP108)

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15 SEQ. ID. nº:4 (exón 2 de la secuencia del nucleótido INSP108)

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SEQ. ID. nº:5 (secuencia del nucleótido INSP108)

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SEQ. ID. nº:6 (secuencia del nucleótido INSP108) SEQ. ID. nº:7 (secuencia de nucleótido maduro INSP108)

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SEQ. ID. nº:8 (secuencia de nucleótido maduro INSP108)

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SEQ. ID. nº:9 (exón 1 de la secuencia del nucleótido INSP109)

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15 SEQ. ID. nº:10 (exón 1 de la secuencia del polipéptido INSP109)

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SEQ. ID. nº:11 (exón 2 de la secuencia de nucleótido INSP109)

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SEQ. ID. nº:12 (exón 2 de la secuencia de polipéptido INSP109) SEQ. ID. nº:13 (secuencia del nucleótido INSP109)

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SEQ. ID. nº:14 (secuencia del polipéptido ÍNSP109)

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SEQ. ID. nº:15 (secuencia del nucleótido maduro INSP109)

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SEQ. ID. nº:16 (secuencia del polipéptido maduro INSP109)

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Claims

1.: Un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácido citada en la SEQ. ID. nº 14 y/o en la SEQ. ID. nº 16.

2.: Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que consta de una secuencia de aminoácidos como la citada en la SEQ. ID. nº 14 y/o la SEQ. ID. nº !6.

3.: Una molécula de ácido nucleico purificado que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

4.: Una molécula de ácido nucleico purificado de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende las secuencias de ácido nucleico purificado citadas SEQ. ID nº 13 y/o SEQ. ID nº 15, o es un equivalente redundante del mismo.

5.: Una molécula de ácido nucleico purificado de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 que consta de la SEQ. ID. de ácido nucleico citada en la ESQ. ID. nº:13 y/o SEQ. ID nº:15, o es un equivalente redundante del mismo.

6.: Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como la citada en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7.: Una célula anfitriona transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8.: Un ligando que se une específicamente al polipéptido defensina de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y que es un anticuerpo.

9.: Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un vector de acuerdo con la reivindicación 6, o una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso en terapia.

10.: Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un vector de acuerdo con la reivindicación 6, o una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 7.

11. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un vector de acuerdo con la reivindicación 6, una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 7, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en el tratamiento de trastornos proliferativos de las células, incluyendo neoplasma de mama.