MX2007010809A

MX2007010809A - Proteina lipocalina.

Info

Publication number: MX2007010809A
Application number: MX2007010809A
Authority: MX
Inventors: Ursula Boschert; Christine Power; Melanie Yorke-Smith
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2007-11-07
Also published as: KR20070118614A; AU2006221859B2; BRPI0609020A2; EA011816B1; US20080254035A1; CN101189257A; NO20075068L; EP1869074A1; AU2006221859A1; EA200701918A1; IL185547A0; CA2599540A1; JP2008536483A; GB0504767D0; JP4933527B2; UA94221C2; WO2006095164A1

Abstract

La invencion esta basada en el descubrimiento de que la proteina humana denominada en la presente como proteina INSP181, es una lipocalina.

Description

PROTEINA LIPOCALINA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una nueva proteina, (denominada INSP181) , y derivados de la misma, identificada de aquí en adelante como una lipocalina, y al uso de esta proteína y a las secuencias de ácido nucleico provenientes del gen de codificación, en el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas aquí son incorporadas totalmente por referencia .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El proceso de descubrimiento de fármacos está sufriendo actualmente una revolución fundamental ya que la era de los genómicos funcionales llega a la mayoría de edad. El término "genómicos funcionales" aplica a un procedimiento que utiliza herramientas bioinformáticas para adscribir funciones a las secuencias proteicas de interés. Tales herramientas se están volviendo cada vez más necesarias ya que la velocidad de generación de datos de secuencias está rebasando rápidamente la habilidad de los laboratorios de investigación para asignar funciones a estas secuencias de proteínas. Ref.: 185681 Conforme se incrementan las herramientas bioinformáticas en potencia y en precisión, estas herramientas están reemplazando rápidamente a las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. Por supuesto, las herramientas bioinformáticas avanzadas utilizadas en la identificación de la presente invención son ahora capaces de producir resultados en los cuales puede ser colocado un alto grado de confianza. Diversas instituciones y organizaciones comerciales están examinando los datos de las secuencia conforme éstas se vuelven disponibles, y están siendo realizados descubrimientos significativos en una base por venir. No obstante, sigue existiendo una necesidad continua para identificar y caracterizar genes adicionales y los polipéptidos que éstos codifican, como objetivos para la investigación y para el descubrimiento de fármacos. Las lipocalinas son proteínas secretadas pequeñas que se cree están involucradas en el transporte de moléculas hidrofóbicas, pequeñas. Las lipocalinas están caracterizadas por una estructura de dominios múltiples que comprende un dominio de enlace al ligando que está típicamente involucrado en el enlace de las moléculas hidrofóbicas pequeñas y un dominio de enlace al receptor de la superficie celular, conservado, que está típicamente involucrado en el enlace de algún receptor putativo de la superficie celular que puede ser común a más de una lipocalina, y el extremo abierto de estructura de plegamiento que forma un complejo macromolecular, que involucra quizás el receptor de la superficie celular. A pesar de la gran diversidad al nivel de secuencia, las lipocalinas son homólogos estructurales: un barril ß antiparalelo de ocho hebras, simple con una hélice a enlazada forma el "andamiaje de la lipocalina" distinto. Un extremo del barril está abierto hacia el solvente y contiene un sitio de enlace al ligando. Un grupo de cuatro rizos que conectan las hebras consecutivas confieren la especificidad para el enlace al ligando. La mayoría de los miembros relacionados de la familia de la lipocalina comparten tres porciones de secuencias características, conservadas. Los miembros de este grupo incluyen: la proteína de enlace al retinol, purpurina; proteína de enlace al ácido retinoico; alfa-2-microglobulina; proteína urinaria mayor; proteína de enlace a la bilina; alfa-crustacianina; proteína 14 del embarazo; beta-lactoglobina; lipocalina neutrófila y proteína del plexo coroides. Las lipocalinas lejanas son clasificadas como tales debido a que éstas tienen 2 o menos porciones de secuencias conservadas y esas proteínas incluyen: proteína de enlace al odorizante, proteína de la glándula de von Ebner, probasina y afrodisina.

La identificación de las lipocalinas es por lo tanto de importancia extrema en el incremento del entendimiento de las vías subyacentes que conducen a ciertos estados de enfermedad y estados de enfermedad asociados, mencionados más adelante, y en el desarrollo de terapias génicas y/o farmacológicas más efectivas para tratar estos trastornos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención está basada en el descubrimiento de que la proteína humana referida en la presente como la proteína INSP 181 es una lipocalina. La invención está basada en el hallazgo de que los polipéptidos de la presente invención suprarregulan la citocinas de células T cooperadoras 2 (Th2), más específicamente la interleucina 10 (IL-10), interleucina 4 (IL-4) e interleucina 5 (IL-5) . El polipéptido INSP181 fue probado por su efecto sobre la secreción de citocina por las Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana (PBMC, por sus siglas en inglés) estimuladas con el mitógeno, concanavalina A (ConA) . Se encontró que este polipéptido estimula la secreción de IL-10, IL-4 e IL-5 a partir de las PBMC humanas estimuladas con ConA, cuando se probaron a una dilución de 1/10 (46.2 µg en el ensayo). No se observó ningún efecto sobre los niveles de IFN-?, TNF-a o IL-2.

Además, se ha encontrado sorprendentemente que los polipéptidos de la presente invención muestran expresión restringida inesperada en muestras de biopsia de piel y particularmente en biopsias de piel con psoriasis. En resumen, los cebadores específicos para INSP181 fueron probados sobre un panel de aproximadamente 100 muestras de tejidos humanoS normales y enfermos, células primarias y líneas celulares además de 44 biopsias de colon e ileon con enfermedad inflamatoria del intestino y 39 biopsias de psoriasis provenientes de una prueba clínica de proteína de enlace a IL-18 (IL18BP). Los resultados son mostrados en las tablas 3 y 4, y representadas gráficamente en las figuras 12 y 13. La expresión de INSP181 fue sorprendentemente únicamente determinada a un bajo nivel en la piel (0.16% de GAPDH) (Tabla 5, figura 12) y en las biopsias de piel provenientes de pacientes con psoriasis (19/39 de muestras positivas) (tabla 4, figura 13) . Un segundo par de cebadores específicos para los exones 4/6 (cebador delantero en el exón 4 y cebador inverso en el exón 6) confirmaron la especificidad en piel. En un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido, cuyo polipéptido: (i) comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 66 ó SEQ ID No.: 70. (ii) es un fragmento del mismo que es una lipocalina o que tiene un determinante antigénico en común con uno o más de los polipéptidos de (i) ; o (iii) es un equivalente funcional de (i) o (ii) . Preferentemente, el polipéptido de acuerdo a este primer aspecto de la presente invención consiste de o comprende la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 18 o la SEQ ID No.: 24, es un fragmento del mismo que funciona como una lipocalina, o tiene un determinante antigénico en común con tal polipéptido; o es un equivalente funcional de tal polipéptido. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 2 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 1 de INSP181". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 4 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 2 de INSP181". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 6 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido del exón 3 de INSP181". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 8 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido del exón 3 de INSP181-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 10 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido del exón 4 de INSP181-SV1" . El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 12 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido del exón 4 de INSP181". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 14 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido del exón 5 de INSP181". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 16 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido del exón 6 de INSP181". La SEQ ID No.: 18 es producida mediante la combinación de las SEQ ID Nos.: 2, 4, 6, 12, 14 y 16. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 18 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido de INSP181". La SEQ ID No.: 24 es producida mediante la combinación de las SEQ ID Nos.: 2, 4, 6, 12, 14 y 16. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 24 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido de INSP181-SV1". La proteína INSP181-SV1 contiene una inserción de 25 aminoácidos en el inicio del exón 4. Un segundo clon INSP181-SV1 polimorfo (polimorfo INSP181-SV1) fue identificado a partir de un combinado que contenía un cADN derivado de glándula salival, glándula adrenal, ojo y la plantilla de ARN de referencia universal Strategene, la cual contenía el cADN de INSP181-SV1. Este clon contiene las sustituciones de nucleótidos A275C y G340A que conducen a las sustituciones de aminoácidos N92T y G114S.

Se postula que éstos son polimorfismos en las secuencias de INSP181. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 36 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido del polimorfo N92T del exón 3 de INSP181" y comprende la sustitución de aminoácido N92T. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 38 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido del polimorfo N92T del exón 3 de INSP181-SV1" y comprende la sustitución de aminoácido N92T. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 40 es denominada de aquí en adelante "el polipéptido polimorfo INSP181N92T" . La SEQ ID No.: 40 es producida mediante la combinación de las SEQ ID Nos.: 2, 4, 36, 12, 14 y 16. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 44 es denominada de aquí en adelante "el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 N92T". La SEQ ID No.: 44 es producida mediante la combinación de las SEQ ID Nos.: 2, 4, 38, 10, 14 y 16. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 56 es denominada de aquí en adelante "el polipéptido polimorfo G114S del exón 4 de INSP181-SV1", y comprende la sustitución de aminoácido G114S. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 58 es denominada de aquí en adelante "el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 G114S". La SEQ ID No.: 58 es producida mediante la combinación de las SEQ ID Nos.: 2, 4, 8, 56, 14 y 16. Aunque el Solicitante no desea estar comprometido por esta teoría, se postula que el polipéptido INSP181, el polipéptido INSP181-SV1, el polipéptido polimorfo N92T de INSP181, el polipéptido polimorfo N92T de INSP181-SV1 y el polipéptido polimorfo G114S de INSP181-SV1 pueden comprender un polipéptido de señal en el extremo N que es de 20 aminoácidos de longitud. El exón 1 del polipéptido INSP181 y el polipéptido INSP181-SV1 sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 20 y es denominada de aquí en adelante como el "polipéptido del exón 1 de INSP181 maduro". La secuencia del polipéptido INSP181 sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 22 y es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido INSP181 maduro". La secuencia del polipéptido INSP181-SV1 sin esta secuencia de señal postulada, es indicada en la SEQ ID No.: 26 y es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido INSP181-SV1 maduro". La secuencia del polipéptido polimorfo INSP181 N92T sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 42 y es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido maduro polimorfo INSP181 N92T". La secuencia del polipéptido polimorfo INSP181-SV1-N92T sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 46 y es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido maduro del polimorfo INSP181-SV1-N92T". La secuencia del polipéptido polimorfo INSP181-SV1-G114S sin esta secuencia de señal postulada es indicada en la SEQ ID No.: 60 y es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido maduro polimorfo INSP181-SV1-N92T". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 66 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido INSP181 del dominio de lipocalina" y comprende el dominio de lipocalina. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 70 es denominada de aquí en adelante como "el polipéptido INSP181-SV1 del dominio de lipocalina" y comprende el dominio de lipocalina de la variante de empalme. Los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden comprender además un marcador o etiqueta de histidina. Preferentemente, el marcador de histidina es encontrado C-terminal del polipéptido. Preferentemente, este marcador de histidina comprende 1-10 residuos de histidina (por ejemplo, residuos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) . Más preferentemente, el marcador de histidina comprende 6 residuos de histidina. Los polipéptidos preferidos son aquellos que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 28, SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 48, SEQ ID No.: 50, SEQ ID No.: 52, SEQ ID No.: 54, SEQ ID No.: 62, SEQ ID No.: 68 y/o SEQ ID No.: 72. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 28 es denominado de aquí en adelante como "el polipéptido INSP181 marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 30 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido INSP181 maduro marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No. : 32 es de aqui en adelante denominado como "el polipéptido INSP181-SV1 marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 34 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido INSP181-SV1 marcado con his, maduro". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 48 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo INSP181 N92T marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 50 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo INSP181 N92T maduro marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 52 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 N92T marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 54 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo maduro INSP181-SV1 N92T marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 62 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 G11S marcado con his". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 64 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 G114S marcado con his, maduro". El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 68 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido marcado con his INSP181 del dominio de lipocalina" y comprende el dominio de lipocalina con un marcador de his. El polipéptido que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 72 es de aquí en adelante denominado como "el polipéptido marcado con his INSP181-SV1 del dominio de lipocalina" y comprende el dominio de lipocalina de la variante de empalme con el marcador his. El término "polipéptidos INSP181" como se utiliza en la presente, incluye los polipéptidos que comprenden el polipéptido del exón 1 maduro de INSP181, el polipéptido INSP181, el polipéptido maduro INSP181, el polipéptido INSP181-SV1, el polipéptido maduro INSP181-SV1, el polipéptido INSP181 marcado con his, el polipéptido INSP181 maduro marcado con his, el polipéptido INSP181-SV1 marcado con his, el polipéptido INSP181-SV1 maduro marcado con his, el polipéptido polimorfo INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1-N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181-SV1-N92T, el polipéptido polimorfo INSP181-N92T marcado con his, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1-N92T maduro marcado con his, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1-N92T marcado con his, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 N92T marcado con his, maduro, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 G114S marcado con his, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 G114S, el polipéptido INSP181 del dominio de lipocalina, y el polipéptido INSP181 del dominio de lipocalina y la versión marcada con his. Los polipéptidos que incluyen los polipéptidos del dominio de lipocalina, incluyendo los polimorfismos N92T y G114S son también incluidos como aspectos de la presente invención. INSP181 e INSP181-SV1 comparten el mismo sitio de glucosilación en el aminoácido 92 (figura 10) que es también la localización del polimorfismo N92T predicho. La sustitución de la asparagina en la posición 92 podría prevenir la N-glucosilación. La presencia o ausencia de porciones de azúcar puede también tener efectos importantes sobre el funcionamiento de los polipéptidos INSP181. Se ha constatado también la presencia de un enlace disulfuro formado entre los aminoácidos cisteína en las posiciones 90 y 181. Los polipéptidos de la invención en los cuales estos residuos de cisteína están enlazados con puente disulfuro, son incluidos como aspectos de la presente invención. El término "lipocalina" se refiere a una molécula que contiene al menos un dominio de lipocalina. Preferentemente, la "lipocalina" puede ser una molécula que contiene un dominio de lipocalina detectado con un valor e menor de 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.0002, 0.00001, 0.000001 ó 0.0000001. Preferentemente, el término "lipocalina" puede ser una molécula que se ajusta a la construcción HMM de la entrada Pfam detectada con un valor e menor de 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.0002, 0.00001, 0.000001 ó 0.0000001. Preferentemente, el polipéptido de acuerdo a cualquiera de los aspectos anteriormente descritos de la invención funciona como una lipocalina. Preferentemente, el dominio de lipocalina es codificado por los residuos 41-189 de la secuencia de aminoácidos de INSP181. La secuencia del dominio de lipocalina es dada en la SEQ ID No.: 66. Polipéptidos adicionales de acuerdo a la invención incluyen fragmentos que incluyen la actividad de lipocalina y son polipéptidos que contienen o que consisten del dominio de lipocalina como se muestra en la figura 14 (por ejemplo, aa 25-174 ó aa 26-180, ó aa 33-166) y la figura 11 (por ejemplo, aa 41-189) así como un fragmento que contiene los residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro (por ejemplo, aa 96-187) . Un polipéptido adicional de acuerdo a la invención es un dominio de lipocalina situado entre los residuos 25 y 181 de la INSP181. Para INSP181, el dominio de lipocalina está situado entre los residuos 25 y 206, y comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 70. Por "funciona como una lipocalina" se refiere a los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos o características estructurales que pueden ser identificadas como características conservadas dentro de los polipéptidos de la familia de proteínas lipocalinas, tal que la interacción del polipéptido con su socio biológico no es sustancialmente afectada de manera dañina en comparación a la función del polipéptido de tipo silvestre, de longitud completa. En particular, se hace referencia a la presencia de residuos de cisteína en posiciones específicas dentro del polipéptido, que permiten la formación de enlace disulfuro. Las lipocalinas son utilizadas como marcadores de diagnóstico y pronóstico en una variedad de estados de enfermedad. El nivel plasmático de AGP es monitorizado dentro del embarazo y en el diagnóstico y pronóstico de condiciones que incluyen quimioterapia contra el cáncer, disfunción renal, infarto del miocardio, artritis y esclerosis múltiple. La proteína de enlace al retinol (RBP) es utilizada clínicamente como un marcador de la reabsorción tubular en el riñon, y apo D es un marcador en una enfermedad de mama quística grande. La proteína de la glándula de Von Ebner's es también conocida como lipocalina lagrimal, prealbúmina lagrimal o VEGP. Similar a otras lipocalinas, VEGP es un portador para el retinol y otros compuestos hidrofóbicos pequeños. VEGP se enlaza al retinol in vi tro, y se cree que tiene una función antimicrobiana en el ojo, parcialmente debido a que se enlaza a ácidos grasos de cadena larga que inhiben la formación de lisozima (Glasgow, 1995 Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233:513-522). La proteína puede también inactivar los virus envueltos, ayudar a la dispersión superficial de la película lipídica en el ojo y/o proteger el epitelio. Otro miembro de la familia de la lipocalina incluye la proteína de enlace al ácido epididimal-retinoico (ERBP) , que tiene una homología estructural terciaria a la proteína de enlace al retinol proveniente del suero humano (Newcomer et al. 1990 J Biol. Chem. 265:12876-12879). Se cree que ERBP juega un papel importante en la maduración del esperma conforme éste pasa a través del epidídimo. Se ha mostrado también que ERBP se enlaza a un amplio espectro de retinoides, que incluyen retinol (vitamina A) , retinal, acetato de retinilo, beta-ionona, cis-retinoides, beta- caroteno, colesterol, terpenoides, beta-lonilidenacetato, esteres de cadena larga del retinol y ácido retinoico (Flower, 1996, Biochem. J. 318:1-14) in vivo y/o in vi tro . Los retinoides han demostrado que juegan papeles importantes en la diferenciación y preparación celular, así como en la visión, en la biología reproductiva, y en la secreción del moco. Para una revisión de los retinoides y su papel en la enfermedad y en el mantenimiento de la homeostasis, ver Goodman, D. , 1984 N. Engl. J. Med. 310:1023-1031. La sintasa de la postaglandina D2 es un miembro de la familia de la lipocalina involucrada en la síntesis de la prostaglandina D2 en el cerebro, al catalizar la prostaglandina H2 a prostaglandina D2. Similar a otras lipocalinas, la sintasa PD2 es un portador para los compuestos hidrofóbicos. La sintasa de PD2 se enlaza al retinol in vi tro y se ha propuesto que es un transportador secretor de retinoides, que hace circular los retinoides en una variedad de fluidos corporales y los transporta hacia sus transportadores intracelulares. Una vez dentro de las células, los retinoides se enlazan a un receptor dimerizado y al final juegan un papel biológico en la regulación de diversos procesos, tales como la morfogénesis, la diferenciación y la mitogénesis (Tanaka et al, 1997, ibid) . Otras actividades asociadas con los miembros de la familia de lipocalina incluyen actividades antimicrobianas, transporte de feromonas, moduladores de la inflamación, olfato y regulación de la respuesta inmune, regulación del desarrollo del sistema nervioso y actividad antibacteriana. Una lipocalina asociada con la modulación inmune es la lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilo (NGAL) . NGAL ha sido localizada hacia los granulos específicos en los neutrófilos, como monómeros y dímeros (Bartsch et al., 1995 FEBS Letters 357:255-259). NGAL es típica de las lipocalinas ya que se enlazan a moléculas hidrofóbicas pequeñas para el transporte a través de los fluidos hidrofílicos. Mientras que el ligando fisiológico para NGAL no ha sido identificado, se ha mostrado que éste se enlaza al factor quimiotáctico bacteriano FMLP, sugiriendo que la molécula se enlaza a los mediadores inflamatorios lipofílicos (Bungaard et al., 1994 Biochem. Biophys. Res. Comm. 202: 1468-1475). La invención está basada en el hallazgo de que los polipéptidos de la presente invención suprarregulan las citocinas Th2, más específicamente la interleucina 10 (IL-10), interleucina 4 (IL-4) e interleucina 5 (IL-5). Además, se ha encontrado sorprendentemente que los polipéptidos de la presente invención muestran expresión restringida inesperada en muestras de biopsia de piel y particularmente en biopsias de piel con psoriasis. Las enfermedades inmunes pueden ser divididas en aquellas caracterizadas por dominancia de la célula T cooperadora 1 (Thl) o la célula T cooperadora 2 (Th2). Los fármacos pueden afectar el balance Thl/Th2 con el objetivo de modificar la enfermedad autoinmune en cuestión. Una enfermedad de Thl es definida en la presente como una enfermedad seleccionada de la enfermedad de Crohn, diabetes tipo 1, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Grave (tiroiditis) , psoriasis, una enfermedad de la piel por Thl tal como psoriasis o dermatosis hiperqueratócica, artritis reumatoide, formas proliferativa y creciente de la glomerulonefritis, esclerosis múltiple, uveítis posterior, sanado de heridas y/o sarcoidosis. Preferentemente, la enfermedad de la piel por Thl es la psoriasis. Preferentemente, la dermatosis hiperqueratócica es seleccionada de psoriasis, pitiriasis rubra y/o poroqueratosis . Una enfermedad por Th2 es definida en la presente como una enfermedad seleccionada de las alergias tales como rinitis alérgica, asma, una enfermedad de la piel por Th2, liquen ruber plano, sinusitis crónica, síndrome de Sezary, cáncer, queratosis actínica, hepatitis C, colitis ulcerativa, glomerulonefritis membranosa y/o infecciones virales. Preferentemente, la enfermedad de la piel por Th2 es seleccionada de dermatitis atópica, dermatitis por contacto, alergia por contacto, por ejemplo, hacia el níquel o el oro, linfoma cutáneo de células T, eczema atópico, eczema agudo y/o eczema crónico. Preferentemente, la dermatitis atópica es una dermatitis atópica ruda. Preferentemente, el cáncer se selecciona del linfoma cutáneo de células T, carcinoma de células escamosas y/o carcinoma de células básales. Sin desear estar comprometido a esta teoría, un polipéptido de la invención, solo o como parte de una proteína de fusión, y/o un fragmento del mismo puede cambiar el destino de la citocina de célula T de Thl a Th2. Como tal, un polipéptido de la invención, solo o como parte de una proteína de fusión, y/o un fragmento del mismo, es útil para el tratamiento de una enfermedad por Thl. Sin desear estar comprometido con esta teoría, un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido de la invención, puede cambiar el destino de la citocina de células de Th2 a Thl. Como tal, un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un polipéptido de la invención, es útil para el tratamiento de una enfermedad por Th2. Por ejemplo, una respuesta inmune hacia Th2 aumentada y la elaboración de las citocinas tales como IL-4, IL-5 e IL-13 contribuyen a la inducción de alergias y el asma (Ngoc et al. Curr Opin Allergy Clin Immunol . 2005 Abrí; 5(2):161-6). Como tal, un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido de la invención es útil para el tratamiento del asma y/o la alergia. Aparte de dirigirse a los mecanismos celulares, los procedimientos en la terapia contra la psoriasis funcionan por medio de la inmunomodulación humoral por influencia del desbalance de citocina dominado por el tipo 1, con niveles elevados de IL-2, -6, -8, TNF-a o IFN-?. Esto puede ser logrado por la administración de citocinas tipo 2 contra reguladoras deficientes, exógenas, tales como IL-4, -10 y -11 para desviar la diferenciación de las células T productoras de citocina tipo 1, potencialmente hacia la producción de citocinas tipo 2, que estimulan la diferenciación endógena de los linfocitos T tipo 2 en la respuesta inmune normal. Sin desear estar comprometido con esta teoría, se piensa que los polipéptidos de la presente invención probablemente funcionan de una manera similar. Los fármacos que modulan la producción de citocina tales como IL-4 ó IL-10 son conocidos y está siendo considerada la administración de las citocinas recombinantes tales como IL-4, IL-10 e IL-11 para el tratamiento de la psoriasis (Schleyer et al. J Eur Acad Dermatol Venereol . 2005 Enero:19(l) :l-20) . Por ejemplo, un estudio de fase inicial Ib con diferentes dosis de IL-4 recombinante mostró efectos anti- psoriáticos impresionantes (Schleyer et al.). Veinte de 22 pacientes asignados a cinco diferentes dosis de inyecciones semanales de IL-4 en un periodo de tratamiento de 6 semanas, terminaron el estudio y un paciente mostró eventos adversos grado II. En 18 pacientes PASI diminuyó en 60-80% dentro de 6 semanas y no ocurrió rebote durante un seguimiento de 6 semanas. El mejoramiento en la psoriasis fue dependiente de la dosis, asociado con una disminución en las células de infiltración de la piel y normalización de la estructura epidérmica. Estos datos tempranos sugieren que éste podría ser un procedimiento muy exitoso para el tratamiento de la psoriasis por desviación inmune, afectando exclusivamente las células T recientemente activadas. En lesiones psoriáticas, existe una deficiencia relativa en la expresión cutánea de IL-10. Esta citocina Th2 es un potente inhibidor de las funciones de APC tal como la proliferación de las células T. Esta también suprime la función de la citocina tipo 1 incluyendo IFN-? o TNF-a, y por lo tanto juega un papel esencial en el control de las respuestas cutáneas inflamatorias. Como las terapias convencionales tales como los derivados del éster fumárico, los análogos de vitamina D3 tópicos y la radiación UV que funcionan, entre otros, vía una suprarregulación de la IL-10 endógena, se pensaba que la administración sistémica de IL-10 era efectiva en el tratamiento de la psoriasis por restauración relativa del balance de la citocina. Los estudios han indicado que las lipocalinas pueden ser útiles para el tratamiento de las siguientes enfermedades: trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, linfoma cutáneo de células T, carcinoma de células escamosas y/o carcinoma de células básales) , infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos), enfisema, enfermedades de la piel (por ejemplo, una enfermedad de la piel por Thl tal como psoriasis o dermatosis hiperqueratócica; enfermedad cutánea por Th2 tal como dermatitis atópica, dermatitis por contacto, alergia por contacto por ejemplo, hacia el níquel o el oro, linfoma cutáneo y de células T, eczema atópico, eczema agudo y/o eczema crónico), trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina) , disfunción renal, infarto del miocardio, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande, regulación del desarrollo del sistema nervioso, diabetes tipo I, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Grave (tiroiditis) , artritis reumatoide, formas proliferativas y crecientes de glumerulonefritis, uveítis posterior, sanado de heridas, y/o sarcoidosis, pitiriasis rubra y/o poroqueratosis, alergias tales como rinitis alérgica, asma, liquen ruber plano, sinusitis crónica, síndrome de Sezary, queratosis actínica, hepatitis C, colitis ulcerativa, glomerulonefritis membranosa y/o infecciones virales. Se postula que INSP181 puede pertenecer a la subfamilia de inmunocalina y comparte las funcionalidades de los miembros de inmunocalina, más particularmente con la glicodelina (ver para una revisión, Logdberg y ester, Biochim Biophys Acta. 2000 14821 ( 1-2) : 284-97 ) . Los miembros de la familia son codificados por un grupo de genes en la región q32-34 del cromosoma 9 en el genoma humano (INSP181) en la región q34) . La glicodelina ha estado implicada en la fertilización, inmunomodulación y diferenciación. Tres isoformas mayores de la glicodelina pueden ser detectadas (GdA, GdS y GdF) , confiriendo funcionalidades específicas y poniendo de manifiesto la importancia de la glucosilación para la actividad biológica en la subfamilia de inmunocalina. El documento O02/053701 describe los ácidos nucleicos y polipéptidos de lipocalina (más particularmente el gen humano EP17) que pueden ser utilizados para generar un modelo de ratón de infertilidad masculina, para selecciones de descubrimiento de fármacos, y para el tratamiento terapéutico de las condiciones relacionadas a la fertilidad. La patente Alemana DE19807389 describe los anticuerpos monoclonales con la glicodelina A, útiles para el tratamiento del cáncer. Preferentemente, la actividad de un polipéptido de la presente invención, solo o como parte de una proteína de fusión, un fragmento de la misma y/o uno antagonista de la misma puede ser confirmada en al menos uno de los siguientes ensayos : a) en modelos de cánceres de piel como es revisado por Odashiro et al. (Drug Discovery Today: Disease Models 2005; en prensa) , o b) en modelos de dermatitis por contacto o el eczema atópico como es revisado por Gutermuth et al. (Drug Discovery Today: Disease Models 2005, in prensa) , o c) en modelos de dermatitis atópica como es revisado por Zheng y Zhu (Curr Allergy Asthma Rep. 2005 Julio; 5(4) :291-7) ; o d) en el modelo de ratón D6 como es descrito por Jamieson et al. (Nat. Immunol. 2005 Abril; 6 (4 ) : 403-11) , o e) en el ensayo que mide la secreción de citocina por PBMC estimuladas con Con A como es descrito en el ejemplo 5. Más específicamente, la actividad de un polipéptido de la presente invención, solo o como parte de una proteína de fusión, un fragmento del mismo y/o un antagonista del mismo puede ser confirmada si al menos son moduladas las siguientes citocinas: IL-4, 11-5 y/o IL-10. Preferentemente, dos (por ejemplo, IL-4 e IL-5; IL-4 e IL-10; ó IL-5 e IL-10) o las tres citocinas son moduladas. Preferentemente, un polipéptido de la presente invención, solo o como parte de una proteína de fusión, y/o un fragmento del mismo, suprarregula uno o más de las citocinas anteriormente mencionadas. Preferentemente, un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido de la invención, subregula una o más de las citocinas anteriormente mencionadas . La actividad de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, INSP181 puede ser evaluada mediante cualquiera de los métodos descritos en la invención o conocidos en la técnica. Los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden comprender además un marcador de histidina. Preferentemente, el marcador de histidina es encontrado en el extremo C del polipéptido. Preferentemente, el marcador de histidina comprende 1-10 residuos de histidina (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos) . Más preferentemente, el marcador de histidina comprende 6 residuos de histidina. Un "determinante antigénico" de la presente invención puede ser parte de un polipéptido de la presente invención, el cual se enlaza a un sitio de combinación con el anticuerpo o a un receptor de célula T (TCR) . AlteARNtivamente, un "determinante antigénico" puede ser un sitio sobre la superficie de un polipéptido de la presente invención al cual se enlaza una molécula de anticuerpo simple. En general, un antígeno tiene varios o muchos diferentes determinantes antigénicos y reacciona con anticuerpos de muchas diferentes especificidades. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido de la invención. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido de la invención, el cual no es parte de una proteína de fusión. Preferentemente, el anticuerpo es inmunoespecífico para INSP181, INSP181-SV o un fragmento del mismo. Los determinantes antigénicos consisten usualmente de agrupamientos superficiales de moléculas, químicamente activas, tales como cadenas de aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Preferentemente, el "determinante antigénico" se refiere a un grupo químico particular sobre un polipéptido de la presente invención que es antigénico, por ejemplo, que promueve una respuesta inmune específica. En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención. El término "molécula de ácido nucleico purificada" se refiere preferentemente a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) ha sido separada de al menos aproximadamente 50 por ciento de las proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales es encontrada naturalmente cuando el ácido nucleico total es aislado de las células fuentes, (2) no está enlazada a toda o una porción de un polinucleótido al cual está enlazada la "molécula de ácido nucleico purificada" en la naturaleza, (3) está operablemente enlazada a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza, o (4) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia de polinucleótido más grande. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente libre de cualesquiera otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que son encontrados en su ambiente natural que podrían interferir con su uso en la producción del polipéptido o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación. En una modalidad preferida, el ADN genómico es específicamente excluido del alcance de la invención. Preferentemente, el ADN genómico mayor de 10 kbp (pares de kilobases) , 50 kbp, 100 kbp, 150 kbp, 200 kbp, 250 kbp ó 300 kbp son específicamente excluidos del alcance de la invención.

Preferentemente, la "molécula purificada de ácido nucleico" consiste de cADN únicamente. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico purificada consiste de o comprende la secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID No.: 1 (que codifica para el polipéptido del exón 1 de INSP181); SEQ ID No.: 3 (que codifica para el polipéptido del exón 2 de INSP181); SEQ ID No.: 5 (que codifica para el polipéptido del exón 3 de INSP181) ; SEQ ID No.: 7 (que codifica para el polipéptido del exón 3 de INSP181-SV1) ; SEQ ID No.: 9 (que codifica para el polipéptido del exón 4 de INSP181-SV1) ; SEQ ID No.: 11 (que codifica para el polipéptido del exón 4 de INSP181); SEQ ID No.: 13 (que codifica para el polipéptido del exón 5 de INSP181) ; SEQ ID No.: 15 (que codifica para el polipéptido del exón 6 de INSP181) ; o SEQ ID No.: 17 (que codifica para el polipéptido de INSP181) , la SEQ ID No.: 19 (que codifica para el polipéptido maduro del exón 1 de INSP181); SEQ ID No.: 21 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP181) ; SEQ ID No.: 23 (que codifica para el polipéptido de INSP181-SV1) ; SEQ ID No.: 22 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP181-SV1) ; SEQ ID No.: 27 (que codifica para el polipéptido de INSP181 marcado con His); SEQ ID No.: 29 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP181 marcado con His); SEQ ID No.: 31 (que codifica para el polipéptido de INSP181-SV1 marcado con His); SEQ ID No.: 33 (que codifica para el polipéptido maduro de INSP181-SV1 marcado con His) ; o SEQ ID No.: 35 (que codifica para el polipéptido polimorfo N92T del exón 3 de INSP181) SEQ ID No.: 37 (que codifica para el polipéptido polimorfo N92T del exón 3 de INSP181-SV1), SEQ ID No.: 39 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-N92T) , SEQ ID No.: 41 (que codifica para el polipéptido polimorfo maduro de INSP181-N92T) , SEQ ID No.: 43 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 N92T) , SEQ ID No.: 45 (que codifica para el polipéptido polimorfo maduro de INSP181-SV1 N92T) , SEQ ID No.: 47 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181 N92T del marcador his), SEQ ID No.: 49 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181 N92T maduro, del marcador his), SEQ ID No.: 51 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 N92T del marcador his), SEQ ID No.: 53 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 N92, maduro del marcador his), SEQ ID No.: 55 (que codifica para el polipéptido polimorfo G114S del exón 4 de INSP181-SV1), SEQ ID No.: 57 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 G114S), SEQ ID No.: 59 (que codifica para el polipéptido polimorfo maduro de INSP181-SV1 G114S) , SEQ ID No. : 61 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 G114S marcado con his), SEQ ID No.: 63 (que codifica para el polipéptido polimorfo de INSP181-SV1 G114S marcado con his, maduro), SEQ ID No.: 65 (el nucleótido del exón 2 alteARNtivo) , SEQ ID No.: 67 (que codifica para el polipéptido de INSP181 de dominio de lipocalina), SEQ ID No.: 69 (que codifica para el polipéptido marcado con his de INSP181 de dominio de lipocalina), SEQ ID No.: 71 (que codifica para el polipéptido de INSP181 de dominio de lipocalina), y/o la SEQ ID No.: 73 (que codifica para el polipéptido marcado con his de INSP181 de dominio de lipocalina) . En un tercer aspecto, la invención proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones de alta exigencia con una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención. Las condiciones de hibridación de alta exigencia son definidas como incubación toda la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, 5XSSC (cloruro de sodio 150 mM, citrato trisódico 15 mM, fosfato de sodio 50 mM (pH 7.5), solución Denhardts 5x, 10% de sulfato de dextrano y 20 microgramo/ml de ADN de esperma de salmón, recortado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0. IX SSC aproximadamente 65°C. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un vector tal como un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención . En un quinto aspecto, la invención proporciona una célula hospedera transformada con un vector del cuarto aspecto de la invención. En un sexto aspecto, la invención proporciona un ligando que se enlaza específicamente a y que inhibe preferentemente la habilidad de un polipéptido del primer aspecto de la invención para transportar moléculas hidrofóbicas pequeñas. Los ligandos para un polipéptido de acuerdo a la invención, pueden venir en diversas formas, incluyendo sustratos naturales o modificados, enzimas, receptoras, moléculas orgánicas pequeñas tales como moléculas orgánicas pequeñas naturales o sintéticas de hasta 2000 Da, preferentemente de 800 Da o menos, peptidomiméticos, moléculas inorgánicas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, miméticos y estructurales o funcionales de los anteriormente mencionados . Tales compuestos pueden ser identificados utilizando los ensayos y métodos de selección descritos en la presente . En un séptimo aspecto, la invención proporciona un compuesto que es efectivo para alterar la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o para regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención. Un compuesto del séptimo aspecto de la invención puede ya sea incrementar (agonizar) o disminuir (antagonizar) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido. De manera importante, la identificación de la función de los polipéptidos INSP181 permite el diseño de métodos de selección capaces de identificar los compuestos que son. Los ligandos y compuestos de acuerdo al sexto y séptimo aspectos de la invención pueden ser identificados utilizando tales métodos. Estos métodos son incluidos como aspectos de la presente invención. Los compuestos identificados como agonistas de los polipéptidos de la invención pueden ser útiles para la transportación de moléculas hidrofóbicas pequeñas ya sea in vi tro o in vivo . Por ejemplo, los compuestos agonistas son útiles como componentes de medios de cultivo celular definidos, para distribuir moléculas hidrofóbicas pequeñas hacia las células y protegerlas de la degradación por enzimas presentes en el suero. Los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) de INSP181, INSP181-SV1, del polimorfo INSP181 N92T, el polimorfo INSP181-SV1 N92T y/o el polimorfo INSP181-G114S pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, más particularmente el cáncer que afecta el cerebro, los ovarios, los testículos, el bazo, el páncreas, el útero, la sangre y/o los pulmones. Preferentemente, los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) de INSP181-SV1, el polimorfo INSP181-SV1 N92T o el polimorfo INSP181-SV1 G114S (derivados de glándulas salivales, glándulas andrenales y cADN ocular) pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, más particularmente cánceres que afectan las glándulas salivales, las glándulas adrenales y/o el ojo. Otro aspecto más de la invención radica en el uso de un gen de INSP181 o el polipéptido como un objetivo para la selección de moduladores de fármacos candidatos, particularmente fármacos candidatos activos contra trastornos relacionados a la lipocalina. Un aspecto adicional de esta invención radica en métodos de selección de los compuestos para terapia de los trastornos relacionados a la lipocalina, que comprenden determinar la habilidad de un compuesto para enlazarse a un gen o polipéptido INSP181 o un fragmento del mismo. Un aspecto adicional de esta invención radica en métodos de selección de compuestos para terapia de trastornos relacionados a la lipocalina, que comprenden la prueba para la modulación de la actividad de un gen o polipéptido de INSP181, o un fragmento del mismo. En un octavo aspecto, la invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, para el uso en terapia o diagnóstico. Las porciones de la invención pueden ser también utilizadas en la fabricación de un medicamento para tratamiento de ciertas enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, linfoma cutáneo de células T, carcinoma de células escamosas y/o carcinoma de células básales), infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos), enfisema, enfermedades de la piel (por ejemplo, una enfermedad de la piel por Thl tal como psoriasis o dermatosis hiperqueratócica; enfermedad cutánea por Th2 tal como dermatitis atópica, dermatitis por contacto, alergia por contacto por ejemplo, hacia el níquel o el oro, linfoma cutáneo y de células T, eczema atópico, eczema agudo y/o eczema crónico), trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina) , disfunción renal, infarto del miocardio, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande, regulación del desarrollo del sistema nervioso, diabetes tipo I, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Grave (tiroiditis) , artritis reumatoide, formas proliferativas y crecientes de glumerulonefritis, uveítis posterior, sanado de heridas, y/o sarcoidosis, pitiriasis rubra y/o poroqueratosis, alergias tales como rinitis alérgica, asma, liquen ruber plano, sinusitis crónica, síndrome de Sezary, queratosis actínica, hepatitis C, colitis ulcerativa, glomerulonefritis membranosa y/o infecciones virales. Los ensayos descritos en los Ejemplos pueden ser también útiles en la identificación de porciones En un noveno aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que comprende evaluar el nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención o la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención en tejido proveniente del paciente, y comparando el nivel de expresión o actividad a un nivel control, en donde un nivel es diferente al nivel control es indicador de enfermedad. Tal método será llevado a cabo preferentemente in vi tro . Pueden ser utilizados métodos similares para monitorizar el tratamiento terapéutico de la enfermedad en un paciente, en donde la alteración del nivel de expresión o actividad de un polipéptido o molécula de ácido nucleico sobre un periodo de tiempo hacia un nivel control es indicador de la regresión de la enfermedad. La expresión más alta de lipocalinas puede ser detectadas en pacientes que sufren de enfermedades de la piel tales como psoriasis, comparados a los pacientes no afectados o cuando los pacientes son expuestos a alérgenos. Por ejemplo, en pacientes expuestos al níquel o al oro (alergia por contacto) ha sido medido un incremento significativo en la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) (Moller et al. Contact Dermatitis, 1999 Abril; 40 (4 ) : 200-4 ; ) . La suprarregulación de los péptidos/polipéptidos tales como NGAL fue también detectada después del sanado de heridas y ofrecen una explicación para la expresión de estos péptidos/polipéptidos en la psoriasis y el sanado de heridas (Sorensen et al. J. Immunol. 2003 Enero 1 : 170 (11) : 5583-9) . Además, fue observada una fuerte inducción de NGAL en la epidermis en una variedad trastornos de la piel caracterizados por diferenciación epitelial desregulada tal como la psoriasis, pitiriasis rubra y carcinoma de células escamosas (Mallbris et al. Exp. Dermatol. 2002 Diciembre; 11 (6) : 584-91) . De este modo, Mallbris et al. concluyen que NGAL es un marcador para la diferenciación desregulada de queratinocitos en piel humana. De este modo, la sobreexpresión de ciertos polipéptidos de la presente invención puede correlacionarse con la progresión y el pronóstico de la enfermedad. Como tales, los polipéptidos de la presente invención son útiles como marcadores para la progresión y/o pronóstico de la enfermedad. Se cree que ciertos tejidos en mamíferos con enfermedad de Thl o enfermedad de Th2 contienen un número significativamente mayor de copias de genes de la proteína INSP181, y expresan niveles significativamente elevados de la proteína INSP181 y el ARNm que codifica para la proteína INSP181 cuando se compara a un mamífero "estándar" correspondiente, por ejemplo, a un mamífero de la misma especie que no tiene la enfermedad Thl o la enfermedad Th2. Los niveles aumentados de la proteína INSP181 serán detectados en ciertos fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, fluido sinovial y espinal) y/o en la piel de mamíferos con la enfermedad Thl o la enfermedad Th2 cuando se comparan a los sueros/piel de mamífero de la misma especie que no tenga la enfermedad Th2 o la enfermedad Th2. De este modo, la invención proporciona un método útil durante el diagnóstico de la enfermedad Thl o la enfermedad Th2, que involucra la evaluación del nivel de expresión del gen que codifica para la proteína INSP181 o el número de copias del gen en las células de mamífero, particularmente en la piel, o el fluido corporal, y comparando el nivel de expresión del gen o el número de copias del gen con un nivel estándar de expresión del gen de la proteína INSP181, o el número de copias del gen, con lo cual un incremento en el nivel de expresión del gen o en el número de copias de gen sobre el estándar, es indicador de ciertas enfermedades de Thl o enfermedades de Th2. Donde un diagnostico de una enfermedad de Thl o enfermedad de Th2 ha sido ya realizado de acuerdo a los métodos convencionales, la presente invención es útil como un indicador de pronóstico. Mediante la "evaluación del nivel de expresión del gen que codifica para la proteína INSP181" se pretende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de la proteína INSP181 o el nivel del ARNm que codifica para la INSP181 en una primera muestra biológica, ya sea directamente (por ejemplo, mediante la determinación o estimación del nivel absoluto de proteína o el nivel absoluto de ARNm) o relativamente (por ejemplo, mediante la comparación al nivel de la proteína INSP181 o al nivel de ARNm en una segunda muestra biológica) . Por "evaluación del número de copias del gen que codifica para la proteína INSP181" se pretende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias del gen en una primera muestra biológica, ya sea directamente (por ejemplo, mediante la determinación o estimación del número de copias absolutas del gen) o relativamente (por ejemplo, en comparación al número de copias del gen de la proteína INSP181 en una segunda muestra biológica). Preferentemente, el nivel de proteína INSP181, el nivel de ARNr o el número de copias del gen en la primera muestra biológica es medido y estimado, o comparado a un nivel de proteína INSP181 estándar, un nivel de ARNm o un número de copias del gen, siendo tomado el estándar de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que tiene la enfermedad de Thl o la enfermedad de Th2. AlteARNtivamente, donde es utilizado el método como un indicador de pronóstico, la primera y la segunda muestras biológicas pueden ser tomadas de individuos que tienen la enfermedad Thl o la enfermedad Th2 y los niveles de expresión relativos o el número de copias serán medidos para determinar el pronóstico. Como se apreciará en la técnica, una vez que un nivel de proteína estándar INSP181, el nivel de ARNm o el número de copias del gen es conocido, éste puede ser utilizado repetidamente como un estándar para comparación. Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo de tejido u otra fuente que contenga la proteína INSP181 o el ARNm, preferentemente proveniente de la piel. Los métodos para obtener las biopsias tisulares y los fluidos corporales de los mamíferos son bien conocidos en la técnica. Donde la muestra biológica va a incluir un ARNm, una biopsia de tejido es la fuente preferida.

La presente invención es útil para detectar la enfermedad Thl o la enfermedad Th2 de mamíferos. En particular, la invención es útil durante el diagnóstico o pronóstico en mamíferos de los tipos de la enfermedad Thl o la enfermedad de Th2 mencionadas en la presente invención. Los mamíferos preferidos incluyen monos, micos, gatos, perros, vacas, cerdos, caballos, conejos y humanos, particularmente preferidos son los humanos. Un posible método para detectar polipéptidos del primer aspecto de la invención comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando, tal como un anticuerpo, del sexto aspecto de la invención con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo. Un número de diferentes métodos tales de acuerdo al noveno aspecto de la invención existe, como estará enterado el lector experto, tales como los métodos de hibridación de ácido nucleico con sondas cortas, análisis de mutación puntual, amplificación con reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y métodos que utilizan anticuerpos para detectar niveles de proteínas aberrantes. Pueden ser utilizados métodos similares en una base a corto o largo plazo para permitir que el tratamiento terapéutico de una enfermedad sea monitorizado en un paciente. La invención también proporciona los kits que son útiles en esos métodos para diagnosticar la enfermedad. En un décimo aspecto, la invención proporciona el uso de un polipéptido del primer aspecto de la invención como una lipocalina. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados para enlazarse a ácidos grasos pequeños, por ejemplo, en sangre o tejidos para modular su función biológica. Los polipéptidos de la invención podrían ser utilizados para transportar retinoides o esteroides hacia los receptores, en particular como parte de la terapia para el cáncer de mama, enfisema y enfermedades de la piel, y juegan un papel importante en la reproducción. Otros usos incluyen la modulación de las respuestas antiinflamatorias, la actividad como un antimicrobiano, ya sea como un aumentador de la función enzimática o como una molécula misma similar a enzima . Los polipéptidos de la invención pueden ser útiles por sus propiedades antimicrobianas. La actividad antimicrobiana puede ser medida in vitro utilizando células cultivadas o in vivo mediante la administración de moléculas de la invención reclamada al modelo animal apropiado. Los ensayos para probar la actividad antimicrobiana son específicos para el microbio y son en general conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, la prueba in vivo para actividad antimicrobiana es utilizada mediante la inoculación de ratones intraperitonealmente con microorganismos patógenos con un caldo apropiado. Poco después de la inoculación, una composición que contiene el polipéptido es administrada y es registrada la muerte durante los 7 días subsiguientes. En general, la administración es intravenosa, subcutánea, intraperitoneal u oral. Ver por ejemplo, Musiek et al, Antimicrobial Agentes Chemother, 3:40, 1973, para discusión de las pruebas de antimicrobianos in vivo e in vitro. La actividad de los polipéptidos de la presente invención puede ser medida utilizando una variedad de ensayos que miden la habilidad para enlazarse a moléculas hidrofóbicas pequeñas. Tales ensayos incluyen, pero no están limitados a ensayos que miden cambios en la intensidad de fluorescencia (Cogan et al., Eur. J. Biochem. 65:71-78, 1976) y la diálisis en equilibrio de compuestos solubles en agua (Hase et al., J. Biochem. 79:373-380, 1976). Otras utilidades de las moléculas de la presente invención incluyen como un sistema de distribución para transportar y/o estabilizar moléculas lipofílicas pequeñas. Por ejemplo, las moléculas de la presente invención pueden ser utilizadas para microencapsular una molécula lipofílica pequeña que forma un agente farmacológico activo, y de este modo protegen al agente del pH extremo en el intestino, la exposición a enzimas digestivas poderosas y la impermeabilidad de la membrana gastrointestinal hacia el ingrediente activo. Otras ventajas como el encapsulamiento del agente farmacológico, pueden incluir la prevención de la activación prematura del agente o la protección contra irritantes gástricos. Recientemente, se utilizó el andamiaje de lipocalina para manipular por ingeniería las proteínas, con especificidad diseñada a la medida para ligandos no naturales. Tales lipocalinas diseñadas pueden ser consideradas como miméticos de anticuerpo y han sido de este modo nombradas • "anticalinas" (para una revisión, ver Skerra, Biochim Biophys Acta. 2000 Octubre 18; 1482 (1-2 ): 337-50) . En consecuencia, los polipéptidos de la invención pueden encontrar utilidad en la síntesis de "anticalinas". En un décimo primer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, en conjunto con un portador farmacéuticamente aceptable. En un décimo segundo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspectos de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención, para el uso en la fabricación de un medicamento para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad incluyendo, pero no limitado a trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos), enfisema, enfermedades de la piel, trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina), disfunción renal, infarto del miocardio, artritis y esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande y regulación del desarrollo del sistema nervioso. En un décimo tercer aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un paciente, que comprende administrarle al paciente un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, o un compuesto del séptimo aspecto de la invención. Los polipéptidos de la invención son útiles por si solos, como componentes de las proteínas de fusión, tales como la fusión Fc y/o en combinación con uno o más agentes que actúan como subreguladores de Thl. Los antagonistas, por ejemplo, un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido de la invención, pueden ser utilizados por si solos o en combinación con uno o más agentes que actúan como subreguladores de Th2. Los agentes que actúan como subreguladores de Thl o Th2 son bien conocidos en la técnica y no deben ser limitados a los agentes anteriormente mencionados. Preferentemente, el agente que actúa como subregulador de Thl es seleccionado de los inmunorreuguladores celulares, inmunomoduladores humanos, el polipéptido T, Mycoba cteri um vaccae, tazaroteno, bexaroteno, troglitazona, liarozol, rambazol, arginina, óxido nítrico, ciclosporina, metotrexato, análogos de vitamina D3, retinoides, corticosteroides, antralina, alquitrán, psoraleno más UVA (PUVA), curcumina, polipodium, leucotomas, glucocorticoides tales como prednisona y/o un balanceador de Thl/Th2 (adaptógenos) tales como isoflavonas de soya, esteróles vegetales, esterolinas, prebióticos y/o pregnenalona . Preferentemente, el inmunomodulador celular se selecciona de DAB389IL-2, mofetil micofenolato, VX-497, leuflnomida, efalizumab, 0KTcdr4a, CTLA4-lg, MEDÍ 507, LFA3TIP, daclizumab, basiliximab, tacrolimus, pimecrolimus y/o sirolimus. Preferentemente, el inmunomodulador humoral se selecciona de IL-4, IL-10, IL-11, infliximab, etanercept, onercept y/o adalimumab. Preferentemente, el agente que actúa como subregulador de Th2 se selecciona de los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) hacia el receptor de quimiocina CCR3 o CCR4, antagonistas de CXCR4 , anti-TARC, inhibidores de la molécula de adhesisón VLA-4, agonistas de PPAR-?, prostaglandinas de ciclopentenona, tiazolodindionas, SB203580, SB239063, RWJ67657, análogos de Vitamina D3, glucocorticoides, microbacterias, anti-IL-5/IL-13/IL-9, IL-4R soluble, inhibidores de CD80/86, ligando ICOS, un agonista (TLR)-9 del receptor similar a Toll tal como el ADN de CpG, CTLA4-Ig, oligonucleótidos de GATA3 antisentido, Mycrobacterium bacillus de Calmette-Guerin (BCG) , Mycobacterium vaccae, anti-IgE, agonistas del receptor beta, corticoesteroides, semilla de perilla, quercetina, luteolina, isoflavonas, glucocorticoides tal como predisona, y/o un balanceador Thl/Th2 (adaptógenos) tales como las isoflavonas de soya, esteróles vegetales, esterolinas, prebióticos y/o pregnenalona. Para enfermedades en las cuales la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o en el cual la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención, es menor en un paciente enfermo cuando se compara el nivel de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o compuesto administrado al paciente debe ser un agonista. De manera contraria, para enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es más alta en un paciente enfermo cuando se compara al nivel de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o el compuesto administrado al paciente debe ser antagonista. Los ejemplos de tales antagonistas incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido, ribozimas y ligandos, tales como anticuerpos. Los polipéptidos de INSP181 son glucoproteínas de superficie celular y de este modo tienen papeles en muchos estados de enfermedad. Los antagonistas de los polipéptidos de INSP181 son de interés particular ya que proporcionan una manera de modular estos estados de enfermedad. En un décimo cuarto aspecto, la invención proporciona animales no humanos transgénicos o suprimidos en un gen, que han sido transformados para expresar niveles más altos, bajos o ausentes de un polipéptido del primer aspecto de la invención. Tales animales transgénicos son modelos muy útiles para el estudio de enfermedades y pueden ser también utilizados en regímenes de selección para la identificación de compuestos que son efectivos en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad. Como se utiliza en la presente, "equivalente funcional" se refiere a una proteína o molécula de ácido nucleico que posee características funcionales o estructurales que son sustancialmente similares a una molécula de polipéptido o de ácido nucleico de la presente invención. Un equivalente funcional de una proteína puede contener modificaciones, dependiendo de la necesidad de tales modificaciones para la realización de una función específica. El término "equivalente funcional" está destinado a incluir los fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos o derivados químicos de una molécula. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra una o más de las actividades funcionales de los polipéptidos de la presente invención. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra actividad sustancialmente similar en comparación con INSP181 o fragmentos en un ensayo adecuado para la medición de la actividad o función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra actividad idéntica o mayor en comparación con INSP181 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de la actividad o función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una molécula de proteína o de ácido nucleico que muestra 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% o más de actividad en comparación con INSP181 o fragmentos del mismo, en un ensayo adecuado para la medición de la actividad o función biológica. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de mostrar una actividad in vivo o in vitro sustancialmente similar a la de los polipéptidos de la invención. Preferentemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de interactuar con otras moléculas celulares o extracelulares, de una manera sustancialmente similar a la manera en la cual la porción correspondiente de los polipéptidos de la invención lo haría. Por ejemplo, un "equivalente funcional" sería capaz, en un inmunoensayo, de disminuir el enlace de un anticuerpo hacia el polipéptido correspondiente (por ejemplo el polipéptido de la secuencia de aminoácidos del cual es modificado para lograr el "equivalente funcional") del polipéptido de la invención, o al polipéptido de la invención misma, donde el anticuerpo fue producido contra el péptido correspondiente del polipéptido de la invención. Una concentración equimolar del equivalente funcional disminuirá el enlace anteriormente mencionado del péptido correspondiente por al menos aproximadamente 5%, preferentemente entre aproximadamente 5% y 10%, más preferentemente entre aproximadamente 10% y 25%, aún más preferentemente entre aproximadamente 25% y 50%, y lo más preferentemente entre aproximadamente 40% y 50%. Por ejemplo, los equivalentes funcionales pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. De este modo, en la presente invención, las variaciones pueden afectar la función, por ejemplo, de las actividades del polipéptido que reflejan su posesión de un dominio del lipocalina. Un sumario de las técnicas y procedimientos estándares que pueden ser empleados con el fin de utilizar la invención se da más adelante. Se entenderá que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares descritos. Se debe entender también que la terminología utilizada en la presente es para fines de describir las modalidades particulares únicamente y no se pretende que esta terminología deba limitar el alcance de la presente invención. La extensión de la invención está limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas. Las abreviaturas estándares para los nucleótidos y aminoácidos son utilizados en esta especificación. La práctica de la presente invención empleada, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biológica molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de aquellos que trabajan en el campo. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Los ejemplos de textos particularmente adecuados para la consulta incluyen los siguientes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) ; ADN Cloning, Volumen I y II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y SJ. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames y SJ. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edición (Springer Verlag, N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986) . Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" incluye cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos uno al otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, por ejemplo, isósteros peptídicos. El término se refiere a cadenas cortas (péptidos y oligopéptidos) y a cadenas más largas (proteínas). El polipéptido de la presente invención puede estar en la forma de una proteína madura o puede ser una pre-, pro-o prepro-proteína que puede ser activada por la escisión de la pre-, pro-, o prepro-porción para producir un polipéptido maduro activo. En tales polipéptidos, la pre-, pro-, o prepro-secuencia puede ser una secuencia guía o secretora, o puede ser una secuencia que es empleada para la purificación de la secuencia oligopeptídica madura. El polipéptido del primer aspecto de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, es a menudo ventajoso incluir una o más secuencias adicionales de aminoácidos que pueden contener secuencias secretoras o guía, pro-secuencias, secuencias, que ayudan a la purificación, o secuencias que confieren más alta estabilidad de las proteínas, por ejemplo, durante la producción recombinante. AlteARNtiva o adicionalmente, el polipéptido maduro puede ser fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol). En particular, la proteína de fusión puede comprender una o más secuencias de aminoácidos y un fragmento de los los polipéptidos de la invención. El fragmento es preferentemente un dominio de lipocalina. Por ejemplo, como se indica en la SEQ ID No.: 66, SEQ ID No.: 70, o los aminoácidos 25-174, aminoácidos 126-180, aminoácidos 33-166, o aminoácidos 41-189 de la SEQ ID No.: 18 o aminoácidos 25-206 de la SEQ ID No. : 24. Preferentemente, el polipéptido de la invención que comprende una secuencia que tiene al menos 85% de homología con un polipéptido INSP181, es una proteína de fusión. Tales proteínas de fusión pueden ser obtenidas mediante la clonación de un polipéptido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia que tiene al menos 85% de homología con un polipéptido de INSP181 intraestructuralmente con la secuencias de codificación para una secuencia de proteína heteróloga. El término "heterólogo o heteróloga", como se utiliza en la presente, está destinado a designar cualquier polipéptido diferente de un polipéptido de INSP181 humano.

Los ejemplos de secuencias heterólogas, que pueden estar comprendidas en las proteínas de fusión ya sea en el extremo N o en el extremo C, incluyen: dominios extracelulares de la proteína enlazada a la membrana, regiones constantes de inmunoglobulina (regiones Fc) , dominios de multimerización, dominios de proteínas extracelulares, secuencias de señal, secuencias de exportación y secuencias que permiten la purificación mediante cromatografía de afinidad. Muchas de estas secuencias heterólogas son comercialmente disponibles en los plásmidos de expresión, ya que estas secuencias son comúnmente incluidas en las proteínas de fusión con el fin de proporcionar propiedades adicionales sin deteriorar significativamente la actividad biológica específica de la proteína fusionada a ellas (Terpe K, 2003, Appl Microbiol Biotechnol, 60:523-33). Los ejemplos de tales propiedades adicionales son una vida media más prolongada en los fluidos corporales, la localización extracelular o un procedimiento de purificación más fácil como es permitido por un tramo de histidinas que forman el denominada "marcador de histidina" (Gentz et al. 1989, Proc Nati Acad Sci Estados Unidos, 86:821-4) o por la etiqueta "HA", un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al. 1994, Cell, 37:767-78). Si es necesario, la secuencia heteróloga puede ser eliminada por una escisión proteolítica, por ejemplo la inserción de un sitio de escisión proteolítica entre la proteína y la secuencia heteróloga, y al exponer la proteína de fusión purificada a la proteasa apropiada. Estas características son de importancia particular para las proteínas de fusión, ya que éstas facilitan su producción y el uso en la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la proteína utilizada en los ejemplos (por ejemplo, el polipéptido INSP181 maduro; SEQ ID No.: 22) fue purificado por medio de un péptido de hexa-histidina funcional en el extremo C del INSP181. Cuando la proteína de fusión comprende una región de inmunoglobulina, la fusión puede ser directa, o vía un péptido ligador corto, el cual puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos de aminoácidos de longitud. El ligador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) , por ejemplo, o una secuencia ligadora de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre la secuencia de las sustancias de la invención y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene propiedades mejoradas, tal como un tiempo de residencia extendido en los fluidos corporales (por ejemplo, una vida media incrementada) actividad específica incrementada, nivel de expresión incrementado o la purificación de la proteína de fusión es facilitada.

En una modalidad preferida, la proteína es fusionada a la región constante de una molécula de Ig. Preferentemente, ésta es fusionada a regiones de cadena pesada, como los dominios CH2 y CH3. Otras isoformas de moléculas de IgG son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de acuerdo a la presente invención, tales como las isoformas IgG2 o IgG , u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero- u homomultiméricas . En una modalidad preferida adicional, el derivado funcional comprende al menos una porción enlazada a uno o más grupos funcionales, que aparecen como una o más cadenas laterales sobre los residuos de aminoácidos, preferentemente, la porción es una porción de polietileno (PEG), la PEGilación puede ser llevada a cabo mediante métodos conocidos, tales como aquellos descritos en el documento W099/55377, por ejemplo . Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por los genes, modificados ya sea por procesos naturales, tales como mediante procesamiento post-traduccional o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar comúnmente presentes en los polipéptidos de la presente invención están la glucosilación, enlace de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación, por ejemplo, de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Otras modificaciones potenciales incluyen acetilación, acilación, amidación, enlace covalente de la flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un derivado lipídico, enlace covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, formación de ancla GPI, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier sitio en un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del extremo amino o carboxilo en un polipéptido o ambos, mediante una modificación covalente es común en los polipéptidos de origen natural y sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención. Las modificaciones que ocurren en un polipéptido, a menudo serán una función de cómo es elaborado el polipéptido. Para los polipéptidos que son elaborados recombinantemente, la naturaleza y el grado de las modificaciones en gran parte serán determinadas por la capacidad de modificación post-traduccional de la célula hospedera particular, y de las señales de modificación que están presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, los patrones de glucosilación varían entre diferentes tipos de células hospederas. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser preparados de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados de origen natural (por ejemplo, purificados de células del cultivo), polipéptidos producidos recombinantemente (incluyendo proteínas de fusión) , polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos que son producidos por una combinación de estos métodos. Los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención pueden ser polipéptidos que son homólogos a los polipéptidos INSP181. Se dice que dos polipéptidos son "homólogos", como el término se utiliza en la presente, si la secuencia de uno de los polipéptidos tienen un grado suficientemente alto de identidad o similitud a la secuencia del otro polipéptido. "Identidad" indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácidos es idéntico entre las secuencias. "Similitud" indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Los grados de identidad y similitud pueden ser fácilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing . Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Los polipéptidos homólogos incluyen por lo tanto variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variantes geográficas dentro de la especie de la cual son derivados los polipéptidos) y mutantes (tales como mutantes que contienen sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos) de los polipéptidos INSP181. Tales mutantes pueden incluir polipéptidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (preferentemente, un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Tales sustituciones típicas están entre Ala, Val, Leu e He; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre los residuos básicos Lys y Arg; o entre los residuos aromáticos Phe y Tyr. Particularmente preferidas son las variantes en las cuales varios, por ejemplo entre 5 y 10, 1 y 5, 1 y 3, 1 y 2 o solo 1 aminoácido están sustituidos, suprimidos o agregados en cualquier combinación. Especialmente preferidas son las sustituciones, adiciones o supresiones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades de la proteína. También, especialmente preferidas a este respecto son las sustituciones conservadoras . Tales mutantes comprenden también polipéptidos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente. De acuerdo con la presente invención, cualquier sustitución puede ser preferentemente una sustitución "conservadora" o "segura" que es comúnmente definida como una sustitución que introduce aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares (por ejemplo, aminoácidos básicos, positivamente cargados deben ser reemplazados por otro aminoácido básico, positivamente cargado) , con el fin de preservar la estructura y la función biológica de la molécula . La literatura proporciona muchos modelos sobre los cuales puede ser realizada la selección de sustituciones conservadoras de aminoácidos con base en los estudios estadísticos y fisicoquímicos sobre la secuencia y/o estructura de las proteínas (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001) . Los experimentos de diseño de proteínas han mostrado que el uso de subgrupos específicos de aminoácidos pueden producir proteínas plegables y activas, ayudando en la clasificación de sustituciones "sinónimas" de aminoácidos que pueden ser más fácilmente acomodadas en la estructura de la proteína, y que pueden ser utilizadas para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales (Murphy LR et al, 2000). Los grupos de aminoácidos sinónimos y los grupos de aminoácidos sinónimos más preferidos son mostrados en la Tabla 1. Las mutaciones no conservadoras, específicas, pueden ser también introducidas en los polipéptidos de la invención con diferentes propósitos. Las mutaciones que reducen la afinidad de la proteína similar a CD24 pueden incrementar su habilidad para ser reutilizadas y recicladas, incrementando potencialmente su potencia terapéutica (Robinson CR, 2002). Los epitopos inmunogénicos eventualmente presentes en los polipéptidos de la invención pueden ser explotados para desarrollar vacunas (Stevanovic S, 2002), o eliminarlos mediante modificación de su secuencia siguiendo métodos conocidos para seleccionar mutaciones para incrementar la estabilidad de las proteínas, y para corregirlas (van den Buró B y Eijsink V. 2002; documentos InteARNcional WO 00/34317, WO 98/52976) . Los grupos sinónimos, alteARNtivos, preferidos, para derivados de aminoácidos incluidos en los miméticos peptídicos son aquellos definidos en la Tabla 2. Una lista no exhaustiva de derivados de aminoácidos también incluyen el ácido amino-isobutírico (Aib), hidroxiprolina (Hyp), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-COOH, ácido indolin-2carboxílico, 4-difluoro-prolina, ácido L-tiazolidin-4-carboxílico, L-homoprolina, 3, 4-deshidro-prolina, 3, 4-dihidroxi-fenilalanina, ciclohexil-glicina y fenilglicina . Por "derivado de aminoácido" se entiende un aminoácido o entidad química similar a aminoácido diferente de uno de los 20 aminoácidos de origen natural codificados genéticamente. En particular, el derivado de aminoácido puede contener porciones alquilo lineales, ramificadas o cíclicas, sustituidas o no sustituidas, y pueden incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos pueden ser elaborados de novo u obtenidos a partir de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem Ag, Suiza; Bachem, Estados Unidos) . Diversas metodologías para incorporar derivados de aminoácidos no naturales en proteínas, utilizando un sistema de traducción in vi tro e in vivo, para sondear y/o mejorar la estructura y función de las proteínas, se describen en la literatura (Dougherty DA, 2000) . Las técnicas para la síntesis y el desarrollo de los miméticos peptídicos, así como los miméticos no peptídicos, son también bien conocidos en la técnica (Golebiowski A et al., 2001; Hruby VJ y Balse PM, 2000; Sawyer TK, en "Structure Based Drug Design", editada por Veerapandian P, Marcel Dekker Inc., pg. 557-663, 1997) . Típicamente, una identidad mayor del 30% entre dos polipéptidos es considerada como una indicación de equivalencia funcional. Preferentemente, los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención, tienen un grado de identidad secuencial con los polipéptidos INSP181, o con fragmentos activos del mismo, de más de70% u 80%. Los polipéptidos más preferidos tienen grados de integridad mayores de 85%, 90%, 95%, 98.5% ó 99.5%, respectivamente . Los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la invención pueden ser también polipéptidos que han sido identificados utilizando una o más técnicas de alineación estructural. Por ejemplo, la tecnología InPharmatica Genome Threader que forma un aspecto de las herramientas de investigación utilizadas para generar la base de datos de investigación BiopendiumMR, puede ser utilizada (ver WO 01/67507) para identificar los polipéptidos de función actualmente desconocida, los cuales, mientras que tienen baja identidad de secuencia en comparación a los polipéptidos del exón de INSP181 o el polipéptido INSP181 (SEQ ID No.: 14 y 18) se predice que son lipocalinas, en virtud de compartir homología estructural significativa con los polipéptidos del exón de INSP181, el polipéptido INSP181, el polipéptido INSP181-SV1. El polipéptido INSP181-SV1, el polipéptido maduro INSP181, polipéptido maduro INSP181-SV1, el polipéptido polimorfo INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1G114S o el polipéptido polimorfo maduro INSP181-SV1 G114S. Por "homología estructural significativa" se entiende que el Inpharmatica Genome TreaderMR predice dos proteínas, o regiones proteicas, que comparten homología estructural con una certeza de al menos 10% más preferentemente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y mayor. El valor de certidumbre de Inpharmatica Genome TreaderMR es calculado como sigue. Un grupo de comparaciones fue inicialmente realizado utilizando el Inpharmatica Genome TreaderMR exclusivamente utilizando secuencias de estructura conocida. Algunas de las comparaciones estuvieron entre las proteínas que se sabía estaban relacionadas (con base en la estructura) . Una red neural fue luego entrenada con base en que ésta necesitaba distinguir mejor entre las relaciones conocidas y las no relaciones conocidas tomadas de la clasificación de la estructura CATH (www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath). Esto dio como resultado una calificación de red neural entre O y 1. No obstante, nuevamente, conforme eran conocidas el número de proteínas que están relacionadas y el número que no están relacionadas, fue posible dividir los resultados de la red neural en paquetes y calcular empíricamente el porcentaje de resultados que eran correctos. De esta manera, cualquier predicción genuina en la búsqueda de datos Biopendium tiene una calificación de red neural vinculada, y el porcentaje de confianza es una reflexión de qué tan exitoso fue Inpharmatica Genome TreaderMR en el grupo de entrenamiento/prueba. Los polipéptidos del primer aspecto de esta invención también incluyen fragmentos de los polipéptidos INSP181 y fragmentos de los equivalentes funcionales de los polipéptidos INSP181, con la condición de que esos fragmentos sean lipocalinas o tengan un determinante antigénico común con el polipéptido INSP181, el polipéptido INSP181 maduro, el polipéptido INSP181-SV1, el polipéptido INSP181-SV1 maduro, el polipéptido polimorfo INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181, el polipéptido polimorfo INSP181-SVl N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1G114S, el polipéptido polimorfo maduro INSP181-SV1 G114S, el dominio de lipocalina de INSP181 o el dominio de lipocalina de INSP181-SV1. Los ejemplos de fragmentos que mantienen la actividad de lipocalina son aquellos que comprenden o consisten del dominio de lipocalina, como es dado en la SEQ ID No.: 66 o las secuencias como se muestran en la figura 12 (por ejemplo, los aminoácidos 25-174, los aminoácidos 26-180 y/o los aminoácidos 33-166 de cualquiera de las secuencias INSP181 de longitud completa, así como un fragmento que contiene los residuos de cisteína que forman el enlace de disulfuro (por ejemplo, los aminoácidos 96-187 de cualquiera de las secuencias INSP181 de longitud completa) . Preferentemente, en enlace disulfuro es formado entre los aminoácidos de cisteína en las posiciones 90 y 181. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que parte de, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos INSP181 o uno de sus equivalentes funcionales. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia y dependiendo de la secuencia particular, n preferentemente es 7 ó más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Fragmentos pequeños pueden formar un determinante antigénico.

Los fragmentos de acuerdo a la invención pueden ser de 1-100 aminoácidos de longitud, preferentemente de 5-50, más preferentemente de 7-20 aminoácidos. Los ácidos nucleicos de acuerdo a la invención son preferentemente de 10-1000 nucleótidos de longitud, preferentemente de 50-800 nucleóitidos, preferentemente de 100-600, preferentemente de 200-550, preferentemente de 300- 500 nucleótidos de longitud. Los polipéptidos de acuerdo a la invención son preferentemente de 5-500 aminoácidos de longitud, preferentemente de 50-400, preferentemente 100-300, preferentemente 150-250 aminoácidos en longitud. Los fragmentos de los polipéptidos INSP181 de longitud completa pueden consistir de combinaciones de 1 ó 2, 3, 4, 5... secuencias de exón vecinas en las secuencias de los polipéptidos INSP181, respectivamente. Estos exones pueden ser combinados con fragmentos maduros adicionales de acuerdo a la invención. Por ejemplo, tales combinaciones incluyen los exones 1 y 2, y así sucesivamente. Tales fragmentos son incluidos en la presente invención. Los fragmentos pueden también consistir de combinaciones de diferentes dominios de la proteína INSP181. Por ejemplo, un fragmento puede consistir de combinaciones de los diferentes dominios de lipocalina de INSP181 como se indicó anteriormente. Tales fragmentos pueden ser de "permanencia libre" por ejemplo, no parte de o fusionado a otros aminoácidos o polipéptidos o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región. Cuando está comprendido dentro de un polipéptido más grande, el fragmento de la invención lo más preferentemente forma una región continua simple. Por ejemplo, ciertas modalidades preferidas se refieren a un fragmento que tiene una región de pre- y/o pro-polipéptido fusionada al extremo amino del fragmento y/o una región adicional fusionada al extremo carboxilo del fragmento. No obstante, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande simple. Los polipéptidos de la presente invención o sus fragmentos inmunogénicos (que comprenden al menos un determinante antigénico) pueden ser utilizados para generar ligandos, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, que son inmunoespecíficos para los polipéptidos. Tales anticuerpos pueden ser empleados para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos de la invención o para purificar los polipéptidos mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos pueden ser también empleados como auxiliares de diagnósticos o terapéuticos, entre otras aplicaciones, como será aparente por aquellos expertos en la técnica. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a las moléculas intactas así como los fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de enlazarse al determinante antigénico en cuestión. Tales anticuerpos se enlazan de este modo a los polipéptidos del primer aspecto de la invención. Por "afinidad sustancialmente mayor" se entiende que existe un incremento mensurable en la afinidad por un polipéptido de la invención en comparación a la afinidad por otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior tales como las lipocalinas conocidas. Preferentemente, la afinidad es al menos de 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 105 veces o mayor para un polipéptido de la invención que para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. Preferentemente, existe un incremento mensurable en la afinidad de un polipéptido de la invención en comparación con las lipocalinas conocidas. Preferentemente, existen un incremento mensurable en la afinidad para un polipéptido de la invención, en comparación con la lipocalina natural.

Si son deseados anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, tal como un ratón, conejo, cabra o caballo puede ser inmunizado con un polipéptido del primer aspecto de la invención. El polipéptido utilizado para inmunizar el animal puede ser derivado mediante tecnología de ADN recombinante o puede ser sintetizado químicamente. Si se desea, el polipéptido puede ser conjugado a una proteína portadora. Los portadores comúnmente utilizados para los cuales pueden ser químicamente acoplados los péptidos, incluyen albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura. El polipéptido acoplado es luego utilizado para inmunizar el animal. El suero proveniente del animal inmunizado es recolectado y tratado de acuerdo a los procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos monoclonales para los polipéptidos del primer aspecto de la invención, pueden ser también fácilmente producidos por una persona experta en la técnica. La metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales utilizando tecnología del hibridoma, es bien conocido (ver por ejemplo, Kohler, G, y Milstein, C, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4:72 (1983); Colé et al., 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985) . Los paneles de anticuerpo monoclonales producidos contra los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden ser seleccionados para diversas propiedades, por ejemplo, el isotipo, epitopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles en la purificación de los polipéptidos individuales contra los cuales están dirigidos. AlteARNtivamente, los genes que codifican para los anticuerpos monoclonales de interés pueden ser aislados de hibridomas, por ejemplo, mediante técnicas de PCR conocidas en la materia, y clonados y expresados en vectores apropiados. Los anticuerpos quiméricos, en los cuales están unidas regiones variables no humanas o fusionados a regiones constantes humanas (ver por ejemplo, Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sic. Estados Unidos, 84, 3439 (1987)), pueden ser también de uso. El anticuerpo puede ser modificado para hacerlo menos inmunogénico en un individuo, por ejemplo, mediante humanización (ver Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol, 147, 1709 (1991), Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 88, 34181 (1991); y Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). El término "anticuerpo humanizado" como se utiliza en la presente, se refiere a las moléculas de anticuerpo en las cuales los aminoácidos de CDR y otros aminoácidos seleccionados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo donador no humano, han sido sustituidas en lugar de los aminoácidos equivalentes en un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado se asemeja de este modo estrechamente a un anticuerpo humano pero tiene la habilidad de enlace del anticuerpo donador. En una modalidad alteARNtiva, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico", que es un anticuerpo que tiene dos diferentes dominios de enlace al antígeno, estando dirigido cada dominio contra un epitopo diferente. La tecnología de visualización de fago puede ser utilizada para seleccionar los genes que codifican para los anticuerpos con actividad de enlace hacia los polipéptidos de la invención, ya sea a partir de repertorios de genes V amplificados por PCR de los linfocitos provenientes de humanos seleccionados por poseer los anticuerpos relevantes, o de bibliotecas intactas (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783) . La afinidad de estos anticuerpos puede ser también mejorada por revoltura de cadena (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624-628). Los anticuerpos generados por las técnicas anteriores, ya sea policlonales o monoclonales, tienen utilidad adicional ya que éstos pueden ser empleados como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RÍA) o ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) . En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden ser marcados con un reactivo analíticamente detectable, tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima. Las moléculas preferidas de ácido nucleico del segundo y tercer aspectos de la invención son aquellas que codifican para una secuencia polipeptídica como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22. SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28, SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 42, SEQ ID No.: 44, SEQ ID No.: 46, SEQ ID No.: 48, SEQ ID No.: 50, SEQ ID No.: 52, SEQ ID No.: 54, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 58, SEQ ID No.: 60, SEQ ID No.: 62, SEQ ID No.: 64, los polipéptidos funcionalmente equivalentes. Estas moléculas de ácido nucleico pueden ser utilizadas en los métodos y aplicaciones descritas en la presente. Las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden preferentemente al menos n nucleótidos consecutivos provenientes de las secuencias descritas en la presente, donde, dependiendo de la secuencia particular, n es 10 o más (por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ó más) .

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen secuencias que son complementarias a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente (por ejemplo, para fines de antisentido o sondeo). Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tales como ARNm, o en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, el cADN, ADN sintético o ADN genómico. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser obtenidas mediante la clonación, por técnicas sintéticas químicas o por combinación de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante síntesis química utilizando técnicas tales como síntesis química de fosforamidita en fase sólida, a partir de bibliotecas genómicas o de cADN o mediante separación a partir de un organismo. Las moléculas de ARN pueden ser en general generadas mediante la trascripción in vi tro o in vivo de las secuencias de ADN. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de doble hebra o de una sola hebra. El ADN de una sola hebra puede ser la hebra de codificación, también conocida como la hebra en sentido, o ésta puede ser la hebra de no codificación, también denominada como la hebra anti-sentido. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los análogos de ADN y de ARN, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El término "PNA" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula antisentido o un agente anti-gen, el cual comprende un oligonucleótido de al menos 5 nucleótidos de longitud enlazado a una cadena principal peptídica de los residuos de aminoácidos, que termina preferentemente en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. Los PNAs pueden ser pegilados para extender su lapso de vida en una célula, donde éstos se enlazan preferentemente al ADN o al ARN de hebra simple, complementario, y detienen el alargamiento del transcrito (Nielsen, P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63). Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de esta invención puede ser idéntica a la secuencia de codificación de una o más moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. Estas moléculas pueden también tener una secuencia diferente la cual, como resultado de la degeneración del código genético, codifica para un polipéptido como se indica en cualquiera de las SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22. SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28, SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 42, SEQ ID No.: 44, SEQ ID No.: 46, SEQ ID No.: 48, SEQ ID No.: 50, SEQ ID No.: 52, SEQ ID No.: 54, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 58, SEQ ID No.: 60, SEQ ID No.: 62 o SEQ ID No.: 64, y polipéptidos funcionalmente equivalentes. Tales moléculas de ácido nucleico pueden incluir, pero no están limitadas a, la secuencia de codificación para el polipéptido maduro por si mismo; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencias de codificación adicionales, tales como aquellas que codifican para una secuencia guía o secretora, tal como una secuencia pro-, pre- o prepro-polipeptídica; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin la secuencia de codificación adicionales anteriormente mencionadas, junto con secuencias de no codificación adicionales, incluyendo la secuencia 5' y 3' de no codificación, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripción (incluyendo señales de terminación), enlace al ribosoma y estabilidad del ARNm. Las moléculas de ácido nucleico pueden también incluir secuencias adicionales que codifican para aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proporcionan funcionalidades adicionales. Las moléculas de ácido nucleico del segundo y tercer aspectos de la invención pueden también codificar para los fragmentos o los equivalentes funcionales de los polipéptidos y fragmentos del primer aspecto de la invención. Tal molécula de ácido nucleico puede ser una variante de origen natural tal como una variante alélica de origen natural, o la molécula puede ser una variante que no se sabe que aparezca de manera natural. Tales variantes de origen no natural de la molécula de ácido nucleico pueden ser elaboradas mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a las moléculas de ácido nucleico, células u organismos. Entre las variantes a este respecto, están las variantes que difieren de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas por sustituciones, supresiones o inserciones de nucléotidos. Las sustituciones, supresiones o inserciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en las regiones de codificación o no codificación o ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras . Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden también ser manipuladas por ingeniería genética, utilizando métodos en general conocidos en la materia, por una variedad de razones, incluyendo la modificación de la clonación, el procesamiento y/o expresión de producto génico (el polipéptido) . La revoltura de ADN mediante f agmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos, son incluidas como técnicas que pueden ser utilizadas para manipular por ingeniería genética las secuencias nucleotídicas. La mutagénesis dirigida al sitio puede ser utilizada para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glucosilación, cambiar preferencia de codón, producir variantes de empalme, introducir mutagénesis y así sucesivamente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido del primer aspecto de la invención pueden ser ligadas a una secuencia heteróloga, de modo que la molécula combinada de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión. Tales moléculas combinadas de ácido nucleico son incluidas dentro del segundo y tercer aspecto de la invención. Por ejemplo, para seleccionar las bibliotecas peptídicas para inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil expresar utilizando tal molécula de ácido nucleico combinada, una proteína de fusión que puede ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible. Una proteína de fusión puede ser también manipulada por ingeniería genética para contener un sitio de escisión localizado entre la secuencia del polipéptido de la invención y la secuencia de una proteína heteróloga, de modo que el polipéptido puede ser escindible y purificado de la proteína heteróloga . Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen las moléculas antisentido que son parcialmente complementarias a las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la presente invención y que por lo tanto se hibridan a las moléculas de ácido nucleico de codificación (hibridación) . Tales moléculas antisentido, tales como los oligonucleótidos, pueden ser diseñadas para reconocer, para enlazarse específicamente a y para prevenir la transcripción de un ácido nucleico objetivo que codifica para un polipéptido de la invención, como será conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo Cohén; J.S.; Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem. 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 256 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991). El término "hibridación" como se utiliza en la presente, se refiere a la asociación de los moléculas de ácido nucleico una con la otra mediante enlace de hidrógeno. Típicamente, una molécula será fijada a un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Luego, las dos moléculas pueden ser colocadas en contacto una con la otra bajo condiciones que favorecen el enlace del hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y volumen del solvente, la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación, la agitación, los agentes para bloquear el enlace no específico de la molécula en fase sólida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO) , la concentración de las moléculas; el uso de los compuestos para incrementar la velocidad de asociación de las moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la exigencia de las condiciones de lavado después de la hibridación (ver Sambrook et al., [supra] ) . La inhibición de la hibridación de una molécula completamente complementaria a una molécula objetivo puede ser examinada utilizando el ensayo de hibridación, como es conocido en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al. [supra] ) . Una molécula sustancialmente homologa competirá entonces por e inhibirá el enlace de una molécula completamente homologa a la molécula objetivo, bajo diversas condiciones de exigencia, tal como se muestra en Wahl, G.M. y S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511). "Exigencia o severidad" se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de moléculas muy similares sobre la asociación de moléculas que difieren. Las condiciones de hibridación de alta exigencia que son definidas como la incubación toda la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, 5XSSC (cloruro de sodio 150 mM; citrato disódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardts 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramo/ml de ADN de esperma de salmón, recortado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0. IX SSC a aproximadamente a 65°C. Las condiciones de baja exigencia involucran la reacción de hibridación que se lleva a cabo a 35°C (ver Sambrook et al. [supra]). Preferentemente, las condiciones utilizadas para la hibridación son aquellas de alta exigencia. Las modalidades preferidas de este aspecto de la invención son las moléculas de ácido nucleico que son al menos 70% idénticas sobre su longitud completa a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido INSP181 (SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22. SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 26, SEQ ID No.: 28, SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 42, SEQ ID No.: 44, SEQ ID No.: 46, SEQ ID No.: 48, SEQ ID No.: 50, SEQ ID No.: 52, SEQ ID No.: 54, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 58, SEQ ID No.: 60, SEQ ID No.: 62 o SEQ ID No.: 64), y las moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias a tales moléculas de ácido nucleico. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico de acuerdo a este aspecto de la invención comprende una región que es al menos 80% idéntica sobre su longitud completa a la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia dada en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 21. SEQ ID No.: 23, SEQ ID No.: 25, SEQ ID No.: 27, SEQ ID No.: 29, SEQ ID No.: 31, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 35, SEQ ID No.: 37, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 41, SEQ ID No.: 43, SEQ ID No.: 45, SEQ ID No.: 47, SEQ ID No.: 49, SEQ ID No.: 51, SEQ ID No.: 53, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 57, SEQ ID No.: 59, SEQ ID No.: 61, SEQ ID No.: 63, SEQ ID No.: 65, SEQ ID No.: 67 o SEQ ID No.: 69, o una molécula de ácido nucleico que es complementaria a éstas. A este respecto, las moléculas de ácido nucleico de al menos 90%, preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 98%, 99% o más idénticas sobre su longitud completa a las mismas, son particularmente preferidas. Las modalidades preferidas en este aspecto, son las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o actividad del polipéptido INSP181, el polipéptido INSP181, el polipéptido maduro INSP181, el polipéptido INSP181-SV1, el polipéptido maduro INSP181-SV1, el polipéptido polimorfo INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1 N92T, el polipéptido polimorfo maduro INSP181 N92T, el polipéptido polimorfo INSP181-SV1G114S, el polipéptido polimorfo maduro INSP181-SV1 G114S, el polipéptido del dominio de lipocalina de INSP181.

La invención también proporciona un proceso para detectar una molécula de ácido nucleico de la invención que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de acuerdo a la invención con una muestra biológica bajo condiciones de hibridación para formar dúplex; y (b) detectar cualesquiera de tales dúplex que se forman. Como se discute además más adelante en conexión con los ensayos que pueden ser utilizados de acuerdo a la invención, una molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente, puede ser utilizada como una sonda de hibridación para ARN, cADN o ADN genómico, con el fin de aislar los cADNs de longitud completa y los clones genómicos que codifican para los polipéptidos INSP181 y para aislar el cADN y los clones genómicos de los genes homólogos u ortólogos que tienen una alta similitud secuencial al gen que codifica para estos polipéptidos. A este respecto, las siguientes técnicas, entre otras conocidas en la materia, pueden ser utilizadas y son discutidas más adelante para fines de ilustración. Los métodos para secuenciamiento y análisis de ADN son bien conocidos y son en general disponibles en la técnica y pueden, por supuesto ser utilizados para practicar muchas de las modalidades de la invención discutida en la presente. Tales métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, la secuenasa (US Biochemical Corp, Cleveland, OH). La polimerasa Taq (Perkin Elmer) , la polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, IL) , o combinaciones de polimerasas y exonucleasas de lectura de prueba tales como aquellas encontradas en el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) . Preferentemente, el proceso de secuenciamiento puede ser automatizado utilizando máquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV) , el ciclador térmico Peltier (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) y el catalizador ABI y los secuenciadores de ADN 373 y 377 ( Perkin Elmer) . Un método para el aislamiento de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con una función equivalente a aquella de los polipéptidos INSP181, es sondear una biblioteca genómica o de cADN con una sonda natural o artificialmente diseñada utilizando procedimientos estándares que son reconocidos en la técnica (ver por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds). Greene Publisihing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Las sondas que comprenden, al menos 15, preferentemente al menos 30, y más preferentemente al menos 50 bases contiguas que corresponden a, o son complementarias a las secuencias de ácido nucleico provenientes del gen de codificación apropiada (SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 15 y SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 21. SEQ ID No.: 23, SEQ ID No.: 25, SEQ ID No.: 27, SEQ ID No.: 29, SEQ ID No.: 31, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 35, SEQ ID No.: 37, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 41, SEQ ID No.: 43, SEQ ID No.: 45, SEQ ID No.: 47, SEQ ID No.: 49, SEQ ID No.: 51, SEQ ID No.: 53, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 57, SEQ ID No.: 59, SEQ ID No.: 61, SEQ ID No.: 63, SEQ ID No.: 65, SEQ ID No.: 67 o SEQ ID No.: 69) son sondas particularmente útiles. Tales sondas pueden ser marcadas con un reactivo analítico detectable para facilitar su identificación. Los reactivos útiles incluyen, pero no están limitados a, radioisótopos, colorantes fluorescentes y enzimas que son capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Utilizando estas sondas, la persona de experiencia ordinaria en la técnica será capaz de aislar las copias complementarias de los polinucleótidos de ADN genómico, cADN o ARN que codifican para las proteínas de interés provenientes de humanos, mamíferos u otras fuentes animales, y seleccionando tales fuentes para secuencias relacionadas, por ejemplo, para miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo. En muchos casos, las secuencias aisladas de cADN estarán incompletas, ya que la región que codifica para el polipéptido será recortada, normalmente en el extremo 5' . Son disponibles diversos métodos para obtener cADN de longitud completa, o para extender los cADNs cortos. Tales secuencias pueden ser extendidas utilizando una secuencia nucleotídica parcial, y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar las secuencias corriente arriba (5') tales como los promotores y los elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede ser empleado está basado en el método de la amplificación rápida de los extremos de cADN (RACE; ver por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de esta técnica, ejemplificadas por la tecnología MarathonMR (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda para cADNs más largos. Una técnica ligeramente diferente, denominada PCR del "sitio de restricción", utiliza cebadores universales para recuperar la secuencia de ácido nucleico desconocida a un locus conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). La PCR inversa puede ser también determinada para amplificar o para extender las secuencias utilizando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Otro método más que puede ser utilizado es la PCR de captura que involucra la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en humano y el ADN cromosómico artificial de levadura (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). Otro método más que puede ser utilizado para recuperar secuencias desconocidas es aquel de Parker, J.D. et al. (1991); Nucleic Acides Res. 19:3055-3060). Además, se puede utilizar la PCR, los cebadores anidados, y las bibliotecas PromoterFinderMR para viajar a través del ADN genómico (Clontech, Palo Alto, CA) . Este proceso evita la necesidad para seleccionar bibliotecas y es útil para buscar uniones intrón/exón. Cuando se seleccionan los cADNs de longitud completa, es preferible utilizar bibliotecas que han sido seleccionadas en tamaño para incluir cADNs más grandes. También, las bibliotecas cebadas aleatoriamente son preferibles, ya que éstas contendrán más secuencias que contienen las regiones 5' de los genes. El uso de una biblioteca aleatoriamente cebada, puede ser especialmente preferible para situaciones en las cuales una biblioteca de oligos d(T) no produce un cADN de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de las secuencias hacia las regiones reguladoras 5' no transcritas . En una modalidad de la invención, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizadas para la localización de cromosomas. En esta técnica, una molécula de ácido nucleico está específicamente dirigida a, y puede hibridarse con, un sitio particular sobre un cromosoma humano individual. El mapeo de las secuencias relevantes a los cromosomas de acuerdo a la presente invención es un paso importante en la correlación confirmatoria de esas secuencias con la enfermedad asociada al gen. Una vez que una secuencia ha sido mapeada a un sitio cromosómico preciso, la posición física de las secuencias sobre el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del mapa genético. Tales datos son encontrados en, por ejemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través Johns Hopkins University Welch Medical Library) . Las relaciones entre genes y enfermedades que han sido mapeadas a la misma región cromosómica, son luego identificadas a través de análisis de enlace (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . Esto proporciona información valiosa a los investigadores que buscan genes de enfermedad utilizando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el síndrome han sido crudamente localizados mediante enlace genético a una región genómica particular, cualquier mapeo de secuencias a esa área puede representar genes asociados o regulatorios para la investigación posterior. La molécula de ácido nucleico puede también ser utilizada para detectar diferencias en el sitio o localización cromosómica debido a translocación, inversión, etc., entre individuos normales, portadores o afectados. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son también valiosas para la localización de tejidos. Tales técnicas permiten la determinación de patrones de expresión del polipéptido en tejidos por detección de los ARNms que los codifican. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridación in si tu y técnicas de amplificación de nucleótidos, tales como PCR. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos del patrón de expresión normal de los ARNms con aquel de los ARNms codificados por un gen mutante, proporcionan introspectivas valiosas del papel de los polipéptidos mutantes en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de una naturaleza temporal, espacial o cuantitativa . Los procedimientos de silenciamiento de genes pueden ser también emprendidos para subregular la expresión endógena de un gen que codifica para un polipéptido de la invención. La interferencia del ARN (ARNi) (Elbashir, SM et al., Nature 2001, 411, 494-498) es un método de silenciamiento de gen post-transcripcional, específico de secuencia que puede ser empleado. Los oligonucleótidos de dsARN son sintetizados in vi tro e introducidos dentro de una célula. El enlace específico de secuencia de estos oligonucleótidos de dsARN dispara la degradación del ARNm objetivo, reduciendo o aboliendo la expresión de la proteína objetivo.

La eficacia de los procedimientos de silenciamiento de genes, evaluados anteriormente puede ser evaluada a través de la medición de la expresión del polipéptido (por ejemplo, mediante transferencia de Western) , y al nivel de ARN utilizando metodologías basadas en TaqMan. Los vectores de la presente invención comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención y pueden ser vectores de clonación o de expresión. Las células hospederas de la invención, las cuales pueden ser transformadas, transfectadas o transducidas con los vectores de la invención, pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados en forma recombinante mediante expresión de sus moléculas de ácido nucleico o de codificación en vectores contenidos de una célula hospedera. Tales métodos de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y muchos son descritos con detalle por Sambrook et al. (supra) y FeARNndez y Hoeffler (1998, eds. "Gene expresión systems: Using nature for the art of expresión". Academic Press, San Diego, Londres, Boston, New York, Sydney, Tokio, Toronto) . En general, cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el hospedero requerido, pueden ser utilizadas. La secuencia nucleotídica apropiada puede ser insertada dentro de un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como por ejemplo, aquellas descritas en Sambrook et al. (supra). En general, el gen de codificación puede ser colocado bajo el control de un elemento de control tal como un promotor, sitio de enlace al ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido deseado, es transcrita dentro del ARN en la célula hospedera transformada. Los ejemplos de sistemas de expresión adecuada incluyen por ejemplo, sistemas cromosómicos, episómicos y derivados de virus, incluyendo, por ejemplo, vectores derivados de: plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papova virus tales como SV40, virus de la vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus o combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de los elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, incluyendo cósmidos y fagémidos. Los cromosomas artificiales, humanos (HACs) pueden ser también empleados para distribuir fragmentos grandes de ADN que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. Los vectores pCR4-TOPO-INSP181, pCR4-TOPO-INSP181-SVl, pDONR221_INSP181-6HIS, pDONR221_INSP181SVl-6HIS, pEAK_INSP181-6HIS, pEAK_INSP181SVl-6HIS, pDEST12.2_INSP181-6HIS y pDEST12.2_INSP181SVl-6HIS son ejemplos preferidos de vectores adecuados para el uso de acuerdo con los aspectos de esta invención con relación a INSP181. Los sistemas de expresión particularmente adecuados incluyen microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plásmidos o cósmicos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión virales (por ejemplo, el virus mosaico de la coliflor, CaMV; virus mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, los plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Los sistemas de traducción libres de células pueden ser también empleados para producir los polipéptidos de la invención. La introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención dentro de las células hospederas puede ser efectuada mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., (supra). Particularmente, los métodos adecuados incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspado, introducción, balística o infección (ver Sambrook et al., 1989 [supra]; Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman y Leinwald, 1998). En células eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser ya sea transitorios (por ejemplo, episomales) o permanentes (integración cromosómica) de acuerdo a las necesidades del sistema. La molécula de ácido nucleico de codificación puede o no incluir una secuencia que codifica para una secuencia control, tal como un péptido de señal o secuencia guía, como se desee, por ejemplo, para la secreción del polipéptido traducido hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Las secuencias guía pueden ser removidas por el hospedero bacteriano en el procesamiento post-traduccional . Además de las secuencias de control, puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedera. Los ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión de un gen sea incrementada o disminuida en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador o a diversas condiciones de temperatura o metabólicas. Las secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector, tales como aumentadores, promotores y las regiones 5' y 3' no traducidas. Estas interactúan con las proteínas celulares del hospedero para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales secuencias reguladoras pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del hospedero utilizado, cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles pueden ser utilizados. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, los promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) , el plásmido pSportMR (Gibco BRL) y similares pueden ser utilizados. El promotor de la polihedrina del baculovirus puede ser utilizado en células de insecto. Los promotores o aumentadores derivados de genomas de células vegetales (por ejemplo, genes proteicos de choque térmico, RUBISCO y de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias guías) pueden ser clonados dentro del vector. El sistema celular de mamífero, los promotores provenientes de los genes de mamífero o de los virus de mamífero son preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contenga copias múltiples de la secuencia, pueden ser utilizados los vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado. Un vector de expresión es construido de modo que el ácido nucleico particular que codifica para la secuencia, está localizado en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la colocación y la orientación de la secuencia de codificación con respecto a las secuencias reguladoras que es tal que la secuencia de codificación es transcrita bajo el "control" de las secuencias reguladoras, por ejemplo, la ARN-polimerasa que se enlaza a la molécula de ADN en las secuencias de control, transcribe la secuencia de codificación. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia de modo que ésta pueda ser acoplada a las secuencias de control con la orientación adecuada; por ejemplo, para mantener la estructura de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ser ligadas a ácido nucleico que codifica para la secuencia, antes de la inserción dentro de un vector. AlteARNtivamente, la secuencia de codificación puede ser clonada directamente dentro de un vector de expresión que ya contiene la secuencia de control y un sitio de restricción apropiado. Para la producción de largo plazo de alto rendimiento de un polipéptido recombinante, la expresión estable es preferida. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente el polipéptido de interés pueden ser transformadas utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción al vector, las células se pueden dejar desarrollar por 1-2 días en un medio enriquecido, antes de que éstas sean cambiadas a medios selectivos. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden ser proliferados utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular . Las líneas celulares de mamífero, disponibles como hospederos para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) incluyendo, pero no limitadas a, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células renales de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma de Bowes y de carcinoma hepatocelular humana (por ejemplo, Hep G2) y un número de otras líneas celulares.

En el sistema baculoviral, los materiales para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto son comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (el kit "MaxBac") . Estas técnicas son en general conocidas por aquellos expertos en la materia y son descritas completamente en Summers y Smith, Boletín de la Estación Experimental Agrícola de Texas No. 1555 (1987). Las células hospederas particularmente adecuadas para el uso en este sistema, incluyen células de insecto tales como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9. Existen muchos sistemas de expresión genéticos de cultivo celulares de plantas y de plantas enteras, conocidas en la técnica. Los ejemplos de sistemas de expresión genéticos celulares de plantas, adecuados, incluyen aquellos descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,393,506; 5,659,122 y 5,608,143. Los ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo de células vegetales han sido descritos en Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991) . En particular, todas las plantas a partir de las cuales son aislados y cultivados los protoplastos para dar plantas regeneradas enteras pueden ser utilizados, de modo que las plantas enteras son recuperadas, las cuales contienen el gen transferido. Prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de las células cultivadas o de los tejidos, incluyendo pero no limitadas a todas las especies mayores de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, fruta y otros árboles, legumbres y vegetales. Los ejemplos de células hospederas bacterianas particularmente preferidas incluyen estreptococos, estafilococos, células de E. coli, Streptomyces y Bacill us subtilis . Los ejemplos de células hospederas particularmente adecuadas para la expresión en hongos incluyen células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) y células de Aspergillus . Cualquier número de sistemas de selección son conocidos en la técnica, los cuales pueden ser utilizados para recuperar las líneas celulares transformadas. Los ejemplos incluyen los genes de la timidina-cinasa del virus de herpes simple (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) y de la adenina-fosforribosiltransferasa (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23) que pueden ser empleados en células tk~ o aprt", respectivamente. También, puede ser utilizada la resistencia a antimetabolitos, o antibióticos o a herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa (DHFR) que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglocósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al., (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y ais o pat, que confiere resistencia a clorosulfurón y fosfinotricina-acetiltransferasa, respectivamente. Los genes seleccionables adicionales han sido descritos, los ejemplos de los cuales serán claros para aquellos expertos en la técnica. Aunque la presencia o ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y expresión pueden necesitar ser confirmadas. Por ejemplo, si la secuencia relevante es insertada dentro de una secuencia del gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias apropiadas pueden ser identificadas por la ausencia de la función del gen marcador. AlteARNtivamente, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifica para un polipéptido de la invención bajo el control de un promotor simple. La expresión del gen marcador en respuesta a la introducción o selección usualmente indica también la expresión del gen en tándem. AlteARNtivamente, las células hospederas que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención y que expresan el polipéptido, puede ser identificadas por una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayos de proteínas, por ejemplo clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoensayo (tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas [ELISA] y radioinmunoensayo [RÍA] ) , que incluyen tecnologías basadas en membrana, en solución o en chip, para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o de la proteína (ver Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) , y Maddox, D.E. et al. (1983) J. Exp. Med. 158, 1211-1216) . Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser utilizados en diversos ensayos de aminoácidos y de ácido nucleico. Los medios para producir la hibridación marcado o las sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la presente invención, incluyen la oligomarcación, la pseudotraducción, la marcación en el extremo o la amplificación por PCR utilizando un polinucleótido marcado. AlteARNtivamente, las secuencias que codifican para el polipéptido de la invención pueden ser clonadas dentro de un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica, son comercialmente disponibles, y pueden ser utilizados para sintetizar las sondas de ARN in vi tro por la adición de una ARN-polimerasa apropiada tal como T7, T3 ó SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden ser conducidos utilizando una variedad de kits comercialmente disponibles (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI); Promega (Madison Wl); y U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Las moléculas reporteras y marcadores adecuados, que pueden ser utilizados para facilidad de detección, incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención pueden también ser utilizadas para crear animales transgénicos, particularmente animales roedores. Tales animales transgénicos forman un aspecto adicional de la presente invención. Esto puede ser realizado localmente mediante modificación de las células somáticas, o mediante terapia con línea germinal para incorporar modificaciones heredables. Tales animales transgénicos pueden ser particularmente útiles en la generación de modelos animales para moléculas de fármacos efectivas de moduladores de los polipéptidos de la presente invención. El polipéptido puede ser recuperado y purificado a partir de los cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución es particularmente útil para la purificación. Las técnicas bien conocidas para el replegamiento de las proteínas pueden ser empleadas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación. Las construcciones de vector especializadas pueden se también utilizadas para facilitar la purificación de proteínas, como se desee, al unir las secuencias que codifican para los polipéptidos de la invención a una secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Los ejemplos de tales dominios facilitadotes de la purificación incluyen péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptona que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión-afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seatlle, WA) . La inclusión de las secuencias ligadoras escindibles tales como aquellas específicas para el factor XA o la enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la invención, pueden ser utilizadas para facilitar la purificación. Un vector de expresión tal proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene el polipéptido de la invención, fusionado a los diversos residuos de histidina que preceden una tiorredoxina o un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) mientras que el sitio de escisión de la tiorredoxina o la enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido de la proteína de fusión. Una discusión de los vectores que contienen proteína de fusión es proporcionada en Kroll, D.J., et al. (1993; ADN Cell Biol. 12:441-453). Si el polipéptido que va a ser expresado para el uso en los ensayos de selección, en general, se prefiere que éste sea producido en la superficie de la célula hospedera en el cual se expresa. En este caso, las células hospederas pueden ser cosechadas antes del uso en el ensayo de selección, por ejemplo, utilizando técnicas tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoafinidad. Si el polipéptido es secretado hacia el medio, el medio puede ser recuperado con el fin de recuperar y purificar el polipéptido expresado. Si el polipéptido es producido intracelularmente, las células deben ser primeramente usadas antes de que el polipéptido sea recuperado . Como se indicó anteriormente, la presente invención también proporciona los nuevos objetivos y métodos para la selección de candidatos o guías de fármaco. Estos métodos de selección incluyen ensayos de enlace y/o ensayos funcionales, y pueden ser realizados in vitro, en sistemas celulares o animales . A este respecto, un objetivo particular de esta invención radica en el uso de un polipéptido INSP181 como un objetivo para la selección de fármacos candidatos para tratar o prevenir trastornos relacionados a la lipocalina. Otro objetivo más de esta invención radica en los métodos para seleccionar compuestos biológicamente activos, dichos métodos comprenden poner en contacto un compuesto candidato con un gen o polipéptido de INSP181, y seleccionar los compuestos que se enlacen al gen o al polipéptido. Otro objetivo adicional de esta invención radica en los métodos para seleccionar compuestos biológicamente activos, el método comprende poner en contacto un compuesto candidato con la célula hospedera o recombinante que expresa un polipéptido INSP181 con un compuesto candidato, y seleccionar los compuestos que se enlazan al polipéptido INSP181 en la superficie de dichas células y/o que modulan la actividad del polipéptido INSP181.

Un compuesto "biológicamente activo" • denota cualquier compuesto que tenga actividad biológica en un sujeto, preferentemente actividad terapéutica, más preferentemente un compuesto que tenga actividad de lipocalina, y además preferentemente un compuesto que pueda ser utilizado para tratar trastornos relacionados a INSP181, o como una guía para desarrollar fármacos para tratar trastornos relacionados a la lipocalina. Un compuesto "biológicamente activo" es preferentemente un compuesto que modula la actividad de INSP181. Los métodos anteriores pueden ser conducidos in vi tro, utilizando diversos dispositivos y condiciones, incluyendo con reactivos inmovilizados, y pueden comprender además un paso adicional de evaluar la actividad de los compuestos seleccionados en un modelo de trastorno relacionado a la lipocalina, tal como un modelo animal. Los compuestos seleccionados preferidos son agonistas de INSP181, por ejemplo, los compuestos que pueden enlazarse a INSP181 e imitar la actividad de un ligando endógeno del mismo. Un objetivo adicional de esta invención radica en un método de seleccionar compuestos biológicamente activos, dicho método comprende poner en poner en contacto in vi tro un compuesto de prueba con un polipéptido INSP181 de acuerdo a la presente invención, y determinar la habilidad de dicho compuesto de prueba para modular la actividad del polipéptido INSP181. Un objetivo adicional de esta invención radica en un método para seleccionar compuestos biológicamente activos, el método comprende poner en contacto in vitro un compuesto de prueba con un gen INSP181 de acuerdo a la presente invención, y determinar la habilidad del compuesto de prueba para modular la expresión del gen INSP181, preferentemente para estimular la expresión del mismo. En otra modalidad más, esta invención se refiere a un método para seleccionar, clasificar o identificar compuestos activos, particularmente compuestos sobre la esclerosis múltiple o trastornos relacionados, el método comprende poner en contacto un compuesto de prueba con una célula hospedera recombinante que comprende una construcción reportera, la construcción reportera comprende un gen reportero bajo el control de un promotor del gen INSP181, y seleccionar los compuestos de prueba que modulan (por ejemplo, estimulan o reducen, preferentemente estimulan) la expresión del gen reportero. El polipéptido de la invención puede ser utilizado para seleccionar bibliotecas de compuestos en cualquiera de una variedad de técnicas de selección de fármacos. Tales compuestos pueden activar (agonizar) o inhibir (antagonizar) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido de la invención, y formar un aspecto adicional de la presente invención. Los compuestos preferidos son efectivos para alterar la expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido del primer aspecto de la invención, o para regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de al invención. Los compuestos agonistas o antagonistas pueden ser aislados de, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, o mezclas de productos naturales. Estos agonistas o antagonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas, receptores o miméticos estructurales o funcionales. Para una revisión adecuada de tales técnicas de selección, ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991) . El enlace a un gen o polipéptido objetivo proporciona una indicación respecto a la habilidad del compuesto para modular la actividad de dicho objetivo, y de este modo para afectar una vía que conduce al trastorno relacionado a la lipocalina en un sujeto. La determinación del enlace puede ser realizada mediante diversas técnicas, tales como mediante marcación del compuesto candidato, por competencia con un ligando de referencia marcado, etc. Para los ensayos de enlace in vi tro, los polipéptidos pueden ser utilizados en forma esencialmente pura, en suspensión, inmovilizados sobre un soporte, o expresados en una membrana (célula intacta, preparación membranal, liposoma, etc.). La modulación de la actividad incluye, sin limitación, la estimulación de la expresión de superficie del receptor de INSP181, la modulación de la multimerización del receptor (por ejemplo, la formación de complejos multiméricos con otras sub-unidades) , etc. Las células utilizadas en los ensayos pueden ser cualquier célula recombinante (por ejemplo, cualquier célula que comprenda un ácido nucleico recombinante que codifique para un polipéptido INSP181) o cualquier célula que exprese un polipéptido INSP181 endógeno. Los ejemplos de tales células incluyen, sin limitación, células procarióticas (tales como bacterias) y células eucarióticas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli , Pichia pastoris , Hansenula polimorpha , levaduras de Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces o Sa ccharomyces , líneas celulares de mamífero (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamífero primarias o establecidas (por ejemplo, producidas a partir de fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los compuestos que van a ser más probablemente buenos antagonistas son moléculas que se enlazan al polipéptido de la invención sin inducir los efectos biológicos del polipéptido después del enlace a éste. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se enlazan al polipéptido de la invención y con esto inhiben o extinguen su actividad. De esta manera, el enlace del polipéptido a las moléculas de enlace celular normales puede ser inhibido, tal que la actividad biológica normal del polipéptido es prevenida . El polipéptido de la invención que es empleado en tal técnica de selección puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, llevado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. En general, tales procedimientos de selección pueden involucrar el uso de células apropiadas o membranas celulares que expresan el polipéptido que se ponen en contacto con un compuesto de prueba para observar el enlace, o la estimulación o inhibición de una respuesta funcional. La respuesta funcional de las células puestas en contacto con el compuesto de prueba es luego comparada con las células control que no fueron puestas en contacto con el compuesto de prueba. Tal ensayo puede evaluar si el compuesto de prueba da o no como resultado una señal generada por activación del polipéptido, utilizando un sistema de detección apropiado. Los inhibidores de la activación son en general evaluados en presencia de un agonista conocido y el efecto de la activación por el agonista en presencia del compuesto de prueba es observado. Un método preferido para la identificación de un compuesto agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención comprende: (a) poner en contacto una célula que exprese (opcionalmente sobre la superficie del mismo) el polipéptido de acuerdo al primer aspecto de la invención, estando asociado el polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto hacia el polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones que permiten el enlace al polipéptido; y (b) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al medir el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido . Los métodos para generar las señales detectables en los tipos de ensayos descritos en la presente serán conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un ejemplo particular es la cotransfección de una construcción que expresa un polipéptido de acuerdo a la invención, o un fragmento tal como el LBD, en fusión con el dominio de enlace al ADN de GAL4, dentro de una célula junto con un plásmido reportero, un ejemplo del cual es pFR-Luc (Stratagene Europe, Ámsterdam, Holanda) . Este plásmido particular contiene un promotor sintético con cinco repeticiones en tándem de los sitios de enlace a GAL4 que controlan la expresión del gen de luciferasa. Cuando un ligando potencial es agregado a las células, éste se enlazará a la fusión GAL4-polipéptido e inducirá transcripción del gen de la luciferasa. El nivel de expresión de luciferasa puede ser monitorizado por su actividad utilizando un lector de luminiscencia (ver, por ejemplo, Lehman et al. JBC 270, 12953, 1995; Pawar et al. JBC, 277, 39243, 2002) . Un método preferido adicional para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención comprende : (a) poner en contacto un compuesto marcado o no marcado con el polipéptido inmovilizado sobre cualquier soporte sólido (por ejemplo, esferas, placas, soporte de matriz, chip) y la detección del compuesto mediante la medición del marcador o la presencia del compuesto mismo; o (b) poner en contacto una célula que expresa sobre la superficie del mismo el polipéptido, por medio del anclaje artificialmente de éste a la membrana celular, o al construir un receptor quimérico que está asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones que permiten el enlace al polipéptido; y (c) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al comparar el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido, con el nivel de una señal en ausencia del compuesto . Por ejemplo, un método tal como la detección por FRET del ligando enlazado al polipéptido en presencia de coactivadores peptídicos (Norris et al., Science 285, 744, 1999) puede ser utilizado. Un método preferido adicional para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención comprende : (a) poner en contacto una célula que exprese (opcionalmente sobre la superficie del mismo) el polipéptido, estando asociado el polipéptido con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que va a ser seleccionado bajo condiciones para permitir el enlace al polipéptido; y (b) determinar si el compuesto se enlaza a y activa o inhibe el polipéptido al comparar el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido con el nivel de una señal en ausencia del compuesto . En modalidades preferidas adicionales, los métodos generales que son descritos anteriormente pueden comprender además la conducción de la identificación del agonista o antagonista en presencia del ligando marcado o no marcado para el polipéptido. En otra modalidad del método para identificar el agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención comprende: determinar la inhibición del enlace de un ligando a las células que expresan un polipéptido de la invención (y que opcionalmente tienen un polipéptido de la invención sobre la superficie del mismo) , o a las membranas celulares que contienen tal polipéptido, en presencia de un compuesto candidato bajo condiciones para permitir el enlace al polipéptido, y determinando la cantidad del ligando enlazado al polipéptido. Un compuesto capaz de provocar la reducción del enlace de un ligando se considera que es un agonista o antagonista. Preferentemente el ligando está marcado. Más particularmente, un método de selección de un compuesto antagonista o agonista del polipéptido, comprende los pasos de: (a) incubar un ligando marcado con una célula completa que expresa un polipéptido de acuerdo a la invención, opcionalmente sobre la superficie celular, o una membrana celular que contiene un polipéptido de la invención, (b) medir la cantidad del ligando marcado enlazado a la célula entera o a la membrana celular; (c) agregar un compuesto candidato a una mezcla del ligando marcado y la célula entera o la membrana celular del paso (a) y permitir que la mezcla alcance el equilibrio; (d) medir la cantidad del ligando marcado enlazado a la célula entera o la membrana celular después del paso (c); y (e) comparar la diferencia en el ligando marcado enlazado en el paso (b) y (d) , tal que el compuesto que provoca la reducción en el enlace en el paso (d) es considerado como un agonista o antagonista. Similarmente, se proporciona un método para seleccionar un antagonista o agonista polipéptido que comprende los pasos de: (a) incubar un ligando marcado con un polipéptido de acuerdo a la invención sobre cualquier soporte sólido o la superficie celular, o una membrana celular que contiene un polipéptido de la invención. (b) medir la cantidad del ligando marcado enlazado al polipéptido sobre el soporte sólido, la célula entera o la membrana celular; (c) agregar un compuesto candidato a una mezcla del ligando marcado y el polipéptido inmovilizado sobre el soporte sólido, la célula entera o la membrana celular del paso (a) y permitir que la mezcla alcance el equilibrio; (d) medir la cantidad del ligando marcado enlazado al polipéptido inmovilizado o la célula entera o la membrana celular después del paso (c) ; y (e) comparar la diferencia en el ligando marcado enlazado en el paso (b) y (d) , tal que el compuesto que provoca la reducción en el enlace en el paso (d) es considerado como un agonista o antagonista. Se puede encontrar también que los polipéptidos INSP181 modulan una variedad de procesos fisiológicos y patológicos de una manera dependiente de la dosis en los ensayos anteriormente descritos. De este modo, los "equivalentes funcionales" de los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que muestran cualquiera de las mismas actividades moduladoras en los ensayos anteriormente descritos, de una manera dependiente de la dosis. Aunque el grado de actividad dependiente de la dosis no necesita ser idéntico a aquel de los polipéptidos de la invención, preferentemente los "equivalentes funcionales" mostrarán dependencia a la dosis sustancialmente similar en un ensayo de actividad dado, en comparación a los polipéptidos de la invención. En algunas de las modalidades descritas anteriormente, pueden ser utilizados ensayos de enlace simple, en los cuales la adherencia de un compuesto de prueba a una superficie que lleva el polipéptido, es detectada por medio de un marcador directa o indirectamente asociado con el compuesto de prueba, o en un ensayo que involucra la competencia con un competidor marcado. En otra modalidad más, pueden ser utilizados ensayos de selección de fármacos competitivos, en los cuales los anticuerpos neutralizadores que son capaces de enlazarse al polipéptido, compiten específicamente con un compuesto de prueba para el enlace. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier compuesto de prueba que posea afinidad de enlace específica para el polipéptido. Pueden ser también diseñados los ensayos para detectar el efecto de los compuestos de prueba agregados sobre la producción del ARNm que codifica para el polipéptido en las células. Por ejemplo, un ELISA puede ser construido el cual mide los niveles secretados o asociados a las células del polipéptido, utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales mediante métodos estándares conocidos en la técnica, y éste puede ser utilizado para buscar los compuestos que pueden inhibir o mejorar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. La formación de los complejos de enlace entre el polipéptido y el compuesto que se prueba puede ser entonces medida.

Pueden ser también diseñados los ensayos para detectar el efecto de los compuestos de prueba agregados sobre la producción de ARNm que codifica para el polipéptido en las células. Por ejemplo, puede ser construida una ELISA que mide los niveles secretados o asociados a las células del polipéptido utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales, mediante métodos estándares conocidos en la técnica, y éste puede ser utilizado para buscar los compuestos que pueden inhibir o aumentar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. Puede ser entonces medida la formación de los complejos de enlace entre el polipéptido y el compuesto que se prueba. Los métodos de ensayo que son también incluidos dentro de los términos de la presente invención son aquellos que involucran el uso de los genes y polipéptidos de la invención en ensayos de sobreexpresión o de ablación. Tales ensayos involucran la manipulación de los niveles de estos genes/polipéptidos en las células y la evaluación del impacto de este evento de manipulación sobre la fisiología de las células manipuladas. Por ejemplo, tales experimentos revelan los detalles de las vías de señalización y metabólicas en las cuales están implicados los genes/polipéptidos particulares, generan información respecto a las identidades de los polipéptidos con los cuales interactúan los polipéptidos estudiados, y proporcionan pistas respecto a los métodos mediante los cuales son regulados los genes y las proteínas relacionados . Otra técnica más para la selección de fármacos que pueden ser utilizados, proporciona la selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen afinidad de enlace adecuada al polipéptido de interés (ver solicitud de patente InteARNcional WO84/03564). En este método, números grandes de compuestos de prueba pequeños, diferentes, son sintetizados sobre un sustrato sólido, el cual puede hacerse luego reaccionar con el polipéptido de la invención y lavado. Una manera de inmovilizar el polipéptido es utilizar anticuerpos no neutralizadores. El polipéptido enlazado puede ser luego detectado utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. El polipéptido purificado puede ser también recubierto directamente sobre placas para el uso en las técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionadas . Los polipéptidosde la invención puede ser utilizado para identificar los receptores enlazados a la membrana o solubles, a través de las técnicas de enlace al receptor, estándares que son conocidas en la materia, tales como el enlace del ligando y los ensayos de reticulación en los cuales el polipéptido está marcado con un isótopo radioactivo, es químicamente modificado, o es fusionado a una secuencia peptídica que facilita su detección o purificación, y es incubado con una fuente de receptor putativo (por ejemplo, una composición de células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos tisulares, o fluidos corporales). La eficacia del enlace puede ser medida utilizando técnicas biofísicas tales la resonancia de plasmón superficial y espectroscopia. Los ensayos de enlace pueden ser utilizados para la purificación y clonación del receptor, pero pueden también identificar los agonistas y antagonistas del polipéptido, que compiten con el enlace del polipéptido a su receptor. Los métodos estándares para conducir los ensayos de selección son bien comprendidos en la técnica. En otra modalidad más, esta invención se refiere al uso de un polipéptido INSP181 o fragmento del mismo, mediante el cual el fragmento es preferentemente un fragmento específico del gen INSP181, para el aislamiento o generación de un agonista o estimulador del polipéptido INSP181 para el tratamiento de un trastorno relacionado al sistema inmune, en donde el agonista o el estimulador se selecciona del grupo que consiste de: 1. un anticuerpo específico o fragmento del mismo que incluye : a) un anticuerpo quimérico, b) un anticuerpo humanizado o c) un anticuerpo completamente humano, así como; 2. un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, 3. una cadena simple (por ejemplo scFv) o 4. un anticuerpo de dominio simple, o 5. un mimético peptídico o no peptídico derivado de los anticuerpos o 6. un mimético de anticuerpo tal como a) una anticalina o b) una molécula de enlace basada en la fibronectina (por ejemplo trinectina o adnectina) . La generación de los miméticos peptídicos o no peptídicos de los anticuerpos, es conocida en la técnica (Saragovi et al., 1991 y Saragovi et al., 1992). Las anticalinas son también conocidas en la técnica (Vogt et al., 2004) . Las moléculas de enlace basadas en la fibronectina se describen en US6818418 y WO200429224. Además, el compuesto de prueba puede ser de diversos orígenes, naturaleza y composición, tal como cualquier molécula pequeña, ácido nucleico, lípido, péptido, polipéptido que incluye un anticuerpo tal como un anticuerpo quimérico, humanizado o completamente humano, o un fragmento de anticuerpo, mimético peptídico o no peptídico derivado de éste, así como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, un anticuerpo de cadena simple (por ejemplo scFv) o de dominio simple, o un mimético de anticuerpo tal como una molécula de enlace basada en anticalina o fibronectina (por ejemplo trinectina o adnectina), etc., en forma aislada o en mezcla o combinaciones. La invención también incluye un kit de selección útil en los métodos para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos, enzimas, que son descritos anteriormente. La invención incluye los agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas, y otros compuestos que modulan la actividad o antigenicidad del polipéptido de la invención, descubierto por los métodos que son descritos anteriormente. Como se mencionó anteriormente, se considera que las diversas porciones de la invención (por ejemplo los polipéptidos del primer aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, un vector del cuarto aspecto de la invención, una célula hospedera del quinto aspecto de la invención, un ligando del sexto aspecto de la invención, un compuesto del séptimo aspecto de la invención) pueden ser útiles en terapia o diagnóstico de enfermedades. Para evaluar la utilidad de las porciones de la invención para tratar o diagnosticar una enfermedad, pueden ser llevados a cabo uno o más de los siguientes ensayos. Nótese que aunque algunos de los siguientes ensayos se refieren al compuesto de prueba como una proteína/polipéptido, una persona experta en la técnica será fácilmente capaz de adaptar los siguientes ensayos, de modo que las otras porciones de la invención pueden ser también utilizadas como el "compuesto de prueba". La invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención en combinación con un portador famacéutico adecuado. Estas composiciones pueden ser adecuadas como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, como vacunas, o como otras composiciones inmunogénicas, como se describe con detalle más adelante. De acuerdo a la terminología utilizada en la presente, una composición que contiene un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto [X] es "sustancialmente libre de" impurezas [en la presente, Y] cuando al menos 85% en peso del total X+Y en la composición es X. Preferentemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferentemente al menos aproximadamente 95%, 98%, 98.5% o incluso 99% en peso. Las composiciones farmacéuticas deben comprender preferentemente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el ligando o el compuesto de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición objetivo, o exhibir un efecto terapéutico preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal puede ser también utilizado para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Tal información puede ser luego utilizada para determinar las dosis y rutas útiles para la administración en humanos. La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones del fármaco, las sensibilidades de la reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del clínico. En general, una dosis efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferentemente 0.05 mg/kg a 10 mg/kg. Las composiciones pueden ser administradas individualmente a un paciente o pueden ser administradas en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Una composición farmacéutica puede también contener un portador farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, con la condición de que el portador por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y el cual puede ser administrado sin toxicidad indebida. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácido polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizadas en la presente, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión completa de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mac, Pub. Co., N.H. 1991). Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para la ingestión por el paciente. Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales; en particular, sujetos humanos pueden ser tratados. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención pueden ser administradas mediante cualquier número de rutas que incluyen, pero no están limitadas a, las aplicaciones oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica o transcutánea (por ejemplo, ver WO98/20734), los medios subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, entéricos, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Pueden ser también utilizadas pistolas de genes o hiporrocíos para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la invención, pueden también ser preparadas . La distribución directa de las composiciones será lograda en general por inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o distribuidas al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden también ser administradas dentro de una lesión. El tratamiento de dosis puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Si la actividad del polipéptido de la invención es en exceso en un estado de enfermedades particular, están disponibles varios procedimientos. Un procedimiento comprende administrarle a un sujeto un compuesto inhibidor (antagonista) como se describe anteriormente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para inhibir la función del polipéptido, tal como mediante el bloqueo del enlace de los ligandos, sustratos, enzimas, receptores, o mediante la inhibición de una segunda señal, y con esto aliviar la condición anormal. Preferentemente, tales antagonistas son anticuerpos. Lo más preferentemente, tales anticuerpos son quiméricos y/o humanizados para reducir al mínimo su inmunogenicidad, como se describió previamente. En otro procedimiento más, las formas solubles del polipéptido que conservan afinidad de enlace para el ligando, sustrato, enzima, receptor, en cuestión, pueden ser administrados. Típicamente, el polipéptido puede ser administrado en la forma de fragmentos que conservan las porciones relevantes. En un procedimiento alteARNtivo, la expresión del gen que codifica para el polipéptido puede ser inhibida utilizando técnicas de bloqueo de la expresión, tales como el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido (como se describe anteriormente), ya sea inteARNmente generadas o separadamente administradas. Las modificaciones de la expresión de los genes pueden ser obtenidas mediante el diseño de secuencias complementarias o moléculas antisentido (ADN, ARN o PNA) al control, 5' o regiones reguladoras (secuencia de señal, promotores, aumentadores e intrones) del gen que codifica para el polipéptido. Similarmente, la inhibición puede ser lograda utilizando la metodología de apareamiento de base de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil debido a que éste provoca la inhibición de la habilidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para el enlace de las polimerasas, factores de la transcripción, o moléculas reguladoras. Avances terapéuticos recientes utilizando ADN triples han sido descritos en la literatura (Gee, J.E. et al. (1994) En: Huber, B.E. y B.I. Carr, Molecualr and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt . Kisco, NY) . La secuencia complementaria o molécula antisentido puede ser también diseñada para bloquear la traducción del ARNm al prevenir que el transcrito se enlace a los ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden ser administrados o pueden ser generados in si tu a partir de la expresión in vivo . 12 Además, la expresión del polipéptido de la invención puede ser prevenida mediante el uso de ribozimas específicas a su secuencia de ARNm de codificación. Las ribozimas son ARNs catalíticamente activas que pueden ser naturales o sintéticos (ver por ejemplo Usman, N., et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Las ribozimas sintéticas pueden ser diseñadas para escindir específicamente ARNms en posiciones seleccionadas, con lo cual se previene la traducción de los ARNms en polipéptido funcional. Las ribozimas pueden ser sintetizadas con una cadena principal de fosfato de ribosa natural, y bases naturales, como son encontradas normalmente en las moléculas de ARN. AlteARNtivamente, las ribozimas pueden ser sintetizadas con cadenas principales no naturales, por ejemplo, 2'-0-metil-ARN, para proporcionar protección a partir de la degradación por ribonucleasa y pueden contener bases modificadas. Las moléculas de ARN pueden ser modificadas para incrementar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2'0-metilo en vez de enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena principal de la molécula. Este concepto es inherente en la producción de PNAs y puede ser extendido en todas estas moléculas por la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y butosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas similarmente modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina, que no son tan fácilmente reconocidas pro las endonucleasas endógenas. Para tratar condiciones anormales relacionadas a una sub-expresión del polipéptido de la invención y su actividad, están disponibles varios procedimientos. Un procedimiento comprende administrarle a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que activa el polipéptido, por ejemplo un agonista como se describe anteriormente, para aliviar la condición anormal. AlteARNtivamente, una cantidad terapéutica del polipéptido en combinación con un portador farmacéutico adecuado puede ser administrada para restaurar el balance del polipéptido. La terapia génica puede ser empleada para efectuar la producción endógena del polipéptido por las células relevantes en el sujeto. La terapia génica es utilizada para tratar permanentemente la producción inapropiada del polipéptido por reemplazo de un gen defectuoso con un gen terapéutico corregido. La terapia génica de la presente invención puede ocurrir in vivo o ex vivo. La terapia génica ex vivo requiere el aislamiento y la purificación de células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de células genéticamente alteradas nuevamente al paciente. En contraste, la terapia génica in vivo no requiere el aislamiento y purificación de las células de un paciente . El gen terapéutico es típicamente "empaquetado" para la administración a un paciente. Los vehículos de distribución de genes pueden ser no virales, tales como liposomas, o virus deficientes en replicación, tales como adenovirus como se describe por Berkner, K.L., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) o vectores virales adeno-asociados (AAV) como se describe por Muzyczka, N., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) y Patente de los Estados Unidos No. 5,252,479. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención puede ser manipulada por ingeniería genética para la expresión en un vector retroviral defectuoso en replicación. Esta construcción de expresión puede ser luego aislada e introducida dentro de una célula de empaquetamiento transducida por un vector plásmido retroviral que contiene el ARN que codifica para el polipéptido, tal que la célula de empaquetamiento produce ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden ser administradas a un sujeto para manipular por ingeniería las células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo (ver Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (y referencias citadas en la presente) en Human Molecular Genetics (1996), T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd) . Otro procedimiento es la administración de "ADN desnudo" en el cual el gen terapéutico es directamente inyectado dentro de la corriente sanguínea o el tejido muscular . En situaciones en las cuales los polipéptidos o las moléculas ácido nucleico de la invención son agentes promotores de enfermedad, la invención proporciona que éstos puedan ser utilizados en vacunas para producir anticuerpos contra el agente promotor de enfermedad. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (por ejemplo para prevenir la infección) o terapéuticas (por ejemplo para tratar la enfermedad después de la infección) . Tales vacunas comprenden la inmunización de uno o varios agentes, uno o varios inmunógenos, uno o varios polipéptidos, una o varias proteínas o ácido nucleico, usualmente en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables como se describen anteriormente, que incluyen cualquier portador que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Además, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el antígeno o el inmunógeno puede ser conjugado a un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de la difteria, tétanos, cólera, H. Pylori y otros patógenos. Ya que los polipéptidos pueden ser desintegrados en el estómago, las vacunas que comprenden los polipéptidos son preferentemente administradas parenteralmente (por ejemplo, subcutáneas, intramusculares, intravenosas o la inyección intradérmica) . Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles, acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del recipiente, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores o agentes espesantes. Las formulaciones de vacuna de la invención pueden ser presentadas en recipientes de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas selladas y frascos y pueden ser almacenados en una condición liofilizada que requiere únicamente la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede ser fácilmente determinada por experimentación rutinaria. La distribución genética de los anticuerpos que se enlazan a los polipéptidos de acuerdo a la invención puede también ser efectuada, como se describe en la solicitud de Patente InteARNcional WO98/55607. La tecnología denominada como inyección de chorro (ver, por ejemplo, www.powderject.com) puede ser también útil en la formulación de composiciones de vacuna. Un número de métodos adecuados para la vacunación y sistemas de distribución de vacunas se describen en la solicitud de Patente InteARNcional WO00/29428. Esta invención también se refiere al uso de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen caracterizada por las moléculas de ácido nucleico de la invención que están asociadas con una disfunción, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede agregarse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, o la susceptibilidad de una enfermedad, que resulta de la sub-expresión, sobre-expresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Los individuos que poseen mutaciones en el gen pueden ser detectados al nivel del ADN por una variedad de técnicas. Las moléculas de ácido nucleico para el diagnóstico pueden ser obtenidas a partir de las células de un sujeto, tal como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejido o material de autopsia. El ADN genómico puede ser utilizado directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente mediante el uso de PCR, reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) , u otras técnicas de amplificación (ver Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej , et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J. , Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes del análisis. En una modalidad, este aspecto de la invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que comprende la evaluación del nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido de acuerdo a la invención, y comparando el nivel de expresión a un nivel control, en donde un nivel que es diferente al nivel control es indicador de la enfermedad. El método puede comprender los pasos de: a) poner en contacto una muestra del tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones estrictas que permiten la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de la invención y la sonda; b) poner en contacto una muestra control con la sonda bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a); c) y detectar la presencia de los complejos híbridos en las muestras; en donde la detección de los niveles del complejo en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra control, es indicador de la enfermedad. Un aspecto adicional de la invención comprende un método de diagnóstico que comprende los pasos de: a) la obtención de una muestra de tejido de un paciente que es probado para la enfermedad; b) el aislamiento de una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención, a partir de la muestra de tejido; y c) el diagnóstico del paciente para la enfermedad por la detección de la presencia de una mutación en la molécula de ácido nucleico que está asociada con la enfermedad. Para ayudar a la detección de las moléculas de ácido nucleico en los métodos anteriormente descritos, puede ser incluido un paso de amplificación, por ejemplo utilizando PCR. Las supresiones e inserciones pueden ser detectadas mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación al genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas mediante hibridación del ADN amplificado al ARN marcado de la invención o alteARNtivamente, secuencias marcadas de ADN antisentido de la invención. Las secuencias de concordancia perfecta pueden ser distinguidas de los dúplex con mala concordancia con digestión con ARNsa o por evaluación de las diferencias en las temperaturas de fusión. La presencia o ausencia de la mutación en el paciente puede ser detectada al poner en contacto el ADN con una sonda de ácido nucleico que se hibrida al ADN bajo condiciones estrictas para formar una molécula híbrida de doble hebra, la molécula híbrida de doble hebra tiene una porción no hibridada de la hebra de la sonda de ácido nucleico en cualquier porción correspondiente a una mutación asociada con la enfermedad; y detectando la presencia o ausencia de una porción no hibridada de la hebra de la sonda, como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada a la enfermedad, en la porción correspondiente de la hebra de ADN. Tales diagnósticos son particularmente útiles para la prueba prenatal e incluso neonatal. Las mutaciones puntuales y otras diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes "mutantes" pueden ser identificadas por otras técnicas bien conocidas, tales como la secuencia de ADN directa o el polimorfismo conformacional de una sola hebra (ver Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)). Por ejemplo, puede ser utilizado un cebador de secuenciamiento con el producto de PCR de doble hebra o una molécula plantilla de una sola hebra, generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia es realizada por procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o procedimientos de secuenciamiento automáticos con marcadores fluorescentes. Los segmentos de ADN clonados pueden ser también utilizados como sondas para detectar los segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método es mejorada en gran medida cuando se combina con la PCR. Además, mutaciones puntuales y otras variaciones de secuencia, tales como polimorfismos, pueden ser detectadas como se describe anteriormente, por ejemplo, a través del uso de oligonucleótidos específicos de alelo para la amplificación por PCR de las secuencias que difieren por nucleótidos simples. Las diferencias en la secuencia de ADN pueden ser también detectadas por alteraciones en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en los geles, con o sin agentes de desnaturalización, o mediante secuenciamiento directo de ADN (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Los cambios secuenciales en sitios específicos pueden también ser revelados por ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNsa y protección SI o el método de escisión química (ver Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 85: 4397-4401) . Además de la electroforesis en gel convencional y el secuenciamiento de ADN, las mutaciones tales como las microsupresiones, aneuploidías, translocaciones, inversiones, pueden ser también detectadas mediante análisis in si tu (ver, por ejemplo, Keller et al., ADN Probes, 2a Ed., Stockton Press, Nueva York, N.Y., EUA (1993)), es decir, las secuencias de ADN o ARN en las células pueden ser analizadas para mutaciones sin la necesidad de su aislamiento y/o inmovilización sobre una membrana. La hibridación de fluorescencia in si tu (FISH por sus siglas en ingles) es actualmente el método más comúnmente aplicado y han aparecido numerosas revisiones de FISH (ver, por ejemplo, Trachuck et al., Science, 250, 559-562 (1990), y Trask et al., Trends, Genet. , 7, 149-154 (1991) ) . En otra modalidad más de la invención, un arreglo de sondas oligonucleotídicas que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención pueden ser construidas para conducir la selección eficiente de variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Métodos de tecnología de arreglos son bien conocidos y tienen en general aplicabilidad que pueden ser utilizados para enfrentar una variedad de cuestiones en la genética molecular, incluyendo la expresión del gen, el enlace genético, y la variabilidad genética (ver por ejemplo: M. Chee et al., Science (1996), Vol. 274, p. 610-613) . En una modalidad, el arreglo es preparado y utilizado de acuerdo a los métodos descritos en la solicitud del PCT W095/11995 (Chee et al.); Lockhart, D.J. et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); y Schena, M. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 10614-10619). Los pares de oligonucleótidos pueden ir de dos a más de un millón. Los oligómeros son sintetizados en áreas designadas sobre un sustrato, utilizando un proceso químico dirigido a la luz. El sustrato puede ser papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En otro aspecto más, un oligonucleótido puede ser sintetizado sobre la superficie del sustrato mediante el uso de un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta, como se describe en la solicitud del PCT W095/25116 (Baldeschweiler et al.). En otro aspecto más, un arreglo en "rejilla" análogo a una transferencia por puntos (o ranura) puede ser utilizado para acomodar y enlazar los fragmentos de cADN o los oligonucleótidos a la superficie de un sustrato utilizando un sistema de vacío, procedimientos de unión térmica, por UV, mecánica o química. Un arreglo, tales como aquellos descritos anteriormente, puede ser producido manualmente o mediante el uso de dispositivos disponibles (aparato de transferencia por ranura o transferencia por puntos), materiales (cualquier soporte sólido adecuado), y máquinas (incluyendo instrumentos robóticos), y puede contener 8, 24, 96, 384, 1536 ó 6144 oligonucleótidos, o cualquier otro número entre dos y más de un millón que se preste al uso eficiente de la instrumentación comercialmente disponible. Además de los métodos discutidos anteriormente, las enfermedades pueden ser diagnosticadas mediante métodos que comprenden la determinación, a partir de una muestra derivada de un sujeto, de un nivel anormalmente disminuido o incrementado de polipéptido o de ARNm. La expresión disminuida o incrementada puede ser medida al nivel del ARN utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en la materia para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección con ARNsa, transferencia de Northern y otros métodos de hibridación. Las técnicas de ensayo que pueden ser utilizadas para determinar los niveles de un polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un hospedero son bien conocidas por aquellos expertos en la materia y son discutidas en cierto detalle anteriormente (incluyendo radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivos, análisis de transferencia de Western y ensayos de ELISA) . Este aspecto de la invención proporciona un método de diagnóstico que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando como se describe anteriormente con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo. Los protocolos tales como ELISA, RÍA y FACS para medir los niveles de polipéptido pueden proporcionar además una base para diagnosticar los niveles alterados o anormales de la expresión del polipéptido. Los valores normales o estándares para la expresión del polipéptido son establecidos por la combinación de los fluidos corporales o los extractos celulares tomados de sujetos mamíferos normales, preferentemente humanos, con anticuerpo para el polipéptido bajo condiciones adecuadas para la formación del complejo. La cantidad de formación estándar del complejo puede ser cuantificada mediante diversos métodos, tales como mediante medios fotométricos . Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención pueden ser utilizados para el diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas por expresión del polipéptido, o en ensayos para monitorizar a los pacientes que son tratados con los polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico, ligandos y otros compuestos de la invención. Los anticuerpos útiles para fines de diagnóstico pueden ser preparados de la misma manera que aquellos descritos anteriormente para fines terapéuticos. Los ensayos de diagnóstico para el polipéptido incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar el polipéptido en fluidos corporales humanos o extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden ser utilizados con o sin modificación, y pueden ser marcados al unirlos, ya sea covalente o no covalentemente, con una molécula reportera. Una amplia variedad de moléculas reporteras conocidas en la técnica pueden ser utilizadas, varias de las cuales se describen anteriormente. Las cantidades del polipéptido expresado en el sujeto, en las muestras control y de la enfermedad provenientes de tejidos de biopsia son comparados con los valores estándares. La desviación entre los valores estándar y del sujeto establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. Los ensayos de diagnóstico pueden ser utilizados para distinguir entre ausencia, presencia y expresión excesiva del polipéptido y para monitorizar la regulación de los niveles de polipéptido durante la invención terapéutica. Tales ensayos pueden también ser utilizados para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios en animales, en pruebas clínicas o en el monitoreo del tratamiento de un paciente individual. Un kit de diagnóstico de la presente invención puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico de la presente invención; (b) un polipéptido de la presente invención; o (c) un ligando de la presente invención. En un aspecto de la invención, un kit de diagnóstico puede comprender un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención; un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para el uso de la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad. El kit puede comprender además un tercer recipiente que mantiene un agente para digerir el ARN no hibridado. En un aspecto alteARNtivo de la invención, un kit de diagnóstico puede comprender un arreglo de moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales puede ser una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención. Para detectar el polipéptido de acuerdo a la invención, un kit de diagnóstico puede comprender uno o más anticuerpos que se enlazan a un polipéptido de acuerdo a la invención; y un reactivo útil para la detección de una reacción de enlace entre el anticuerpo y el polipéptido. Tales kits serán de uso en el diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad particularmente ciertas enfermedades que incluyen pero no están limitadas a trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos), enfisema, enfermedades de la piel, trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina), disfunción renal, infarto del miocardio, artritis y esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande y regulación del desarrollo del sistema nervioso. Diversos aspectos y modalidades de la presente invención serán descritos ahora con más detalle a manera de ejemplo, con referencia particular a los polipéptidos INSP181. Se apreciará que la modificación del detalle puede ser realizada sin apartarse del alcance de la invención . Figura 1: Resultado de BLAST para INSP181 versus la base de datos pública de proteína. Figura 2: Alineación de la mayor calificación blast INSP181. Figura 3: Salida de señal P para INSP181. Figura 4: Alineamiento de secuencia múltiple de INSP181 y secuencias que contienen el dominio de lipocalina relacionada. Figura 5: ADN de INSP181 y secuencia de proteínas. La posición y sentido de cebadores de PCR son indicados por flechas . Figura 6: La alineación de la secuencia nucleotídica de los cADNs clonados utilizando los cebadores INSP181-CP3 e INSP181-CP4 PCR con la predicción de INSP181. Figura 7: La secuencia de aminoácidos de los cADNs clonados utilizando los cebadores de PCR INSP181-CP3 e INSP181-CP4 con la predicción de INSP181. Figura 8: La secuencia nucleotídica con traducción del producto de PCR de INSP181 clonado, utilizando los cebadores INSP181-CP3 e INSP181-CP4. Figura 9: La secuencia nucleotídica con traducción del producto de PCR de INSP181-SV clonado utilizando los cebadores INSP181-CP3 e INSP181-CP4. Figura 10: Resultados de NetNGyc para INSP181. Es indicado un sitio de glucosilación en la posición 92. Figura 11: Traducción y características de la secuencia de INSP181. Figura 12: Expresión de INSP181 en tejidos humanos mayores como son medidos por RT-PCR (TaqMan) . Figura 13: Expresión de INSP181 en biopsias de piel enfermas provenientes de pruebas clínicas con IL18BP como se mide mediante RT-PCR (TaqMan) . Figura 14: La información de Profesor de Dominio que muestra el dominio de lipocalina predicho en INSP181. Figura 15: Información de la Familia/Residuo para el dominio de lipocalina que muestra predicciones estructurales secundarias y la localización del puente disulfuro.

TABLA 1 Aminoácidos Grupos Sinónimos Grupos Sinónimos Más Preferidos Ser Gly Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Arg Asn Lys , Gln, Arg, His Arg, Lys, His Leu Phe He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Pro Gly Ala, Ser, Thr, Pro Pro Thr Gly Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser Ala Gly Thr, Pro, Ala, Ser Gly, Ala Val Met Phe, He, Leu, Val Met, He, Val, Leu Gly Ala Thr, Pro, Ser, Gly Gly, Ala He Phe He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Phe Trp Phe, Tyr Tyr, Phe Tyr Trp Phe, Tyr Phe, Tyr Cys Ser Thr, Cys Cys His Asn Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His Gln Glu Asn, Asp, Gln Asn, Gln Asn Glu Asn, Asp, Gln Asn, Gln Lys Asn Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His Asp Glu Asn, Asp, Gln Asp, Glu Glu Glu Asn, Asp, Gln Asp, Glu Met Phe He, Val, Leu, Met He, Val, Leu, Met Trp Trp - Phe, Tyr Trp TABLA II Asn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Lys D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, He, D-Ile, Orn, D-Orn Asp D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Glu D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln Met D-Met, S-Me-Cys, He, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val EJEMPLOS Ejemplo 1: INSP181 La secuencia polipeptídica del INSP181 fue utilizada como una búsqueda BLAST contra la base de datos de secuencias no redundantes NCBI . Las diez concordancias principales de la búsqueda BLAST son mostradas en la Figura 1. La Figura 2 muestra la alineación de la secuencia de búsqueda de INSP181 al acierto principal de BLAST. La clonación del cADN de INSP181 permitirá la expresión de la proteína INSP181 en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos y su purificación y caracterización subsiguientes. Por ejemplo, la INSP181 recombinante puede ser utilizada para generar los anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de INSP181 que pueden ser luego utilizados en la caracterización bioquímica de INSP181. AlteARNtivamente, la INSP181 recombinante puede ser utilizada en una amplia variedad de ensayos de selección, incluyendo aquellos descritos anteriormente, y aquellos descritos en el Ejemplo 5 más adelante.

Ejemplo 2: Clonación de INSP181 e INSP181SV 2. 1 Prepara ción de las plan tillas de cADN humanas El cADN de primera hebra fue preparado a partir de una variedad de muestras de ARN total de tejido humano (Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute y preparaciones doméstricas) utilizando la Transcriptasa Inversa ARNsa H~ Superscript II o SuperScript III (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante. Para SuperScript II: se combinaron el cebador Oligo (dT)?s (1 µl a 500 µg/ml) (Promega), 2 µg de ARN total humano, 1 µl de una mezcla de dNTP 10 mM (10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP a pH neutro) y agua destilada estéril hasta un volumen final de 12 µl se combinaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, calentado a 65°C por 5 minutos y enfriado sobre hielo. Los contenidos fueron recolectados mediante centrifugación breve y se agregaron 4 µl del Amortiguador de Primera Hebra 5X, 2 µl de DTT 0.1 M, y 1 µl del Inhibidor de Ribonucleasa Recombinante ARNseOUTMR (40 unidades/µl, Invitrogen) . Los contenidos del tubo fueron mezclados suavemente e incubados a 42 °C por 2 minutos, luego se agregó 1 µl (200 unidades) de la enzima SuperScript IIMR y se mezclaron suavemente mediante pipeteo. La mezcla se incubó a 42°C por 50 minutos y luego se inactivo por calentamiento a 70°C por 15 minutos. Para eliminar el ARN complementario al cADN, se agregaron 1 µl (2 unidades) de ARNsa H de E . coli (Invitrogen) y la mezcla de reacción se incubó a 37°C por 20 minutos . Para SuperScript III: 1 µl del cebador Oligo (dT)20 (50 µM, Invitrogen), 2 µg de ARN humano total, 1 µl de mezcla de dNTP 10 mM (10 mM cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP a pH neutro) y agua destilada estéril hasta un volumen final de 10 µl, se combinaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, calentado a 65°C por 5 minutos y luego se enfrió sobre hielo. Para cada reacción de RT se preparó una mezcla de síntesis de cADN como sigue: 2 µl de amortiguador 10X RT, 4 µl de cloruro de magnesio 25 mM, 2 µl de DTT 0.1 M, 1 µl de ARNseOUTMR (40 U/µl) y 1 µl de enzima SuperScript IIMR RT se combinaron en un tubo separado y luego 10 µl de esta mezcla se agregaron al tubo que contenía la mezcla de ARN/cebador. Los contenidos del tubo fueron suavemente mezclados, recolectados mediante centrifugación breve, e incubados a 50°C por 50 minutos. La reacción fue terminada al incubar a 80°C por 5 minutos y la mezcla de reacción se enfrió sobre hielo y se recolectó mediante centrifugación breve. Para remover el ARN complementario al cADN, se agregó 1 µl (2 unidades) de ARNasa H de E . coli (Invitrogen) y la mezcla de reacción se incubó a 37°C por 20 minutos. La mezcla de reacción final de 21 µl fue diluida mediante adición de 179 µl de agua estéril para dar un volumen total de 200 µl . Las muestras de ARN fueron mezcladas en combinados tal que cada combinado contenía hasta 5 diferentes muestras de cADN . SE utilizaron 5 µl de cada combinado de cADN como una plantilla para PCR en un volumen de reacción final de 50 µl y éste consistió de 1 µl de cada muestra de cADN en ese combinado. Esto representó aproximadamente 20 ng de cada plantilla de cADN individual. 2. 2 Bibliotecas de cADN Las bibliotecas de cADN humanas (en vectores de bacteriófago lambda (?) ) fueron adquiridas de Stratagene, Clontech o Invitrogen, o preparadas en el Serono Pharmaceutical Research Institute en los vectores ? ZAP, ? GT10, ? GT11 o TriplEx2 de acuerdo al protocolo del fabricante ( (Stratagene y Clontech) . El ADN del bacteriófago ? fue preparado a partir de cultivos a pequeña escala de la cepa hospedera de E . coli infectada utilizando el sistema de purificación de ADN Wizard Lambda Preps de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Promega, Corporation, Madison l) . 2. 3 Cebadores de clonación específicos del gen para PCR Dos pares de cebadores de PCR que tenían una longitud entre 18 y 30 bases fueron diseñados para la amplificación de los cds predichos de INSP181 utilizando el Sopftware Primer Designer (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045 EUA) . Los cebadores de PCR fueron optimizados para tener una Tm cercana a 55 ± 10°C y un contenido de GC de 40 a 60%. Los cebadores fueron seleccionados, los cuales tuvieron alta selectividad para la secuencia objetivo (INSP181) con poco o nada de aprestamiento específico. Los cebadores fueron diseñados para formar dos pares anidados tal que los cebadores INSP181-CP3/INSP181-CP4 fueron colocados inteARNmente a los cebadores INSP181-CP1/INSP181-CP2. 2. 4 Amplifica ción por PCR de INSP181 a partir de plantillas de cADN humanas Los cebadores de clonación específicos del gen, INSP181-CP1 e INSP181-CP2 (Tabla 1, Figura 5) fueron diseñados para amplificar un fragmento de cADN de 540 pares de bases que contiene los cds de INSP181. El par de cebadores fue utilizado con el panel de bibliotecas de cADN y los combinados de muestras de cADN humanas como plantillas de PCR. Esta PCR1 fue realizada en un volumen final de 50 µl que contenía amortiguador IX AmpliTaqMR, dNTPs 200 µM, 50 pMoles de cada cebador de clonación, 2.5 unidades de AmpliTaqMR (Applied Biosystems) y aproximadamente 20 ng de la plantilla de la biblioteca de cADN o 100 ng de la plantilla del combinado de cADN utilizando una Máquina de ADN MJ Research, programada como sigue: 94°C, 2 minutos; 40 ciclos de 94°C, 1 minuto, 55°C, 1 minuto y 72°C, 1 minuto; seguido por 1 ciclo a 72°C por 7 minutos y un tiempo de retención a 4°C. Cada producto de PCR1 fue luego utilizado como la plantilla para la PCR2 utilizando los cebadores de amplificación INSP181-CP3 e INSP181-CP4 (Tabla 1, Figuras 5-9) diseñado para amplificar un fragmento de cADN de 496 pb dentro del producto INSP181-CP1/INSP181-CP2. La PCR2 fue realizada en un volumen final de 50 µl que contenía el amortiguador AmpliTaqMR IX, dNTPs 200 µM, 50 pmoles de cada cebador de clonación, 2.5 unidades de AmpliTaqMR (Applied Biosystems), y 1 µl del producto de PCR1 utilizando una Máquina de ADN MJ Research, programada como sigue: 94 °C, 2 minutos; 40 ciclos de 94°C, 1 minuto, 59°C, 1 minuto y 72°C, 1 minuto; seguido por 1 ciclo a 72°C por 7 minutos y un tiempo de retención a 4°C. 30 µl de cada producto de amplificación de PCR1 y PCR2 fueron visualizados sobre un gel de agarosa al 0.8% en un amortiguador IX TAE (Invitrogen). Los productos de aproximadamente el peso molecular esperado (540 pb para la PCR1, 496 pb para la PCR2) fueron purificados a partir del gel utilizando el Sistema de Purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega), eluido en 50 µl de agua y subclonado directamente . 2. 5 Subclona ción de los Productos de PCR Los productos de PCR fueron subclonados dentro del vector de clonación modificado de la topoisomerasa 1 (pCR4-TOPO) utilizando el kit de clonación de TA adquirido de la corporación Invitrogen utilizando las condiciones especificadas por el fabricante. En resumen, 4 µl del producto de PCR purificado en gel se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente con 1 µl del vector TOPO y 1 µl de solución salina. La mezcla de reacción fue luego transferida a la cepa de E . coli TOP10 (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de células One Shot TOP10 se descongeló sobre hielo y se agregaron 2 µl de reacción TOPO. La mezcla se incubó por 15 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor por incubación a 42 °C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC tibio (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación a 220 rpm por 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación fue luego sembrada sobre placas de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. 2. 6 PCR Colonial Las colonias fueron incubadas en 50 µl de agua estéril utilizando un palillo de dientes estéril. Una alícuota de 10 µl del inoculo fue luego sometida a PCR en un volumen de reacción total de 20 µl que contenía amortiguador AmpliTaqMR IX, dNTPs 200 µM, 20 pmoles de cebador T7, 20 pmoles de cebador T3, 1 unidad de AmpliTaqMR (Applied Biosystems) utilizando una Máquina Secuenciadota de ADN MJ Research. Las condiciones de ciclamiento fueron como sigue: 94°C, 2 minutos; 30 ciclos de 94°C, 30 segundos, 48°C, 30 segundos y 72°C, 1 minuto; las muestras fueron mantenidas a 4°C (ciclo de retención antes del análisis posterior). Los productos de PCR fueron analizados sobre geles de agarosa al 1% en amortiguador IX TAE. Las colonias que dieron productos de PCR de aproximadamente el peso molecular esperado (540 pb o 496 pb + 105 pb debido al sitio de clonación múltiple (MCS)) fueron desarrolladas toda la noche a 37°C en 5 ml de ampicilina que contenía caldo L (LB) (100 µg/ml) , con agitación a 220 rpm. 2. 7 Prepara ción y secuenciamien to del ADN plásmido El ADN plásmido Miniprep fue preparado a partir de los cultivos de 5 ml utilizando un sistema robótico Biorobot 8000 (Qiagen) o el kit Wizard Plus SV Minipreps (Promega Cat. No. 1460) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido fue eluido en 80µl de agua estéril. La concentración de ADN fue medida utilizando un fotómetro Eppendorf BO o un fotómetro Spectramax 190 (Molecular Devices) . 200 a 500 ng del ADN plásmido se sometieron a un secuenciamiento de ADN con los cebadores de secuenciamiento T7 y T3 (Tabla 1) utilizando el sistema Terminador BigDye (Applied Biosystems Cat. No. 4390246) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciamiento fueron purificadas utilizando las columnas Dye-Ex (Qiagen) o las placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore Cat. No. LSKS09624) luego analizadas sobre un secuenciador Applied Biosystems 3700. El análisis de la secuencia identificó un clon, amplificado a partir de un combinado que contenía un cADN derivado de una placa ateroesclerótica y basófilos en PCR2, que contenía la secuencia del producto PCR esperado INSP181-CP3/INSP181-CP4. La secuencia del fragmento de cADN clonado se muestra en la Figura 8. El producto del PCR clonado está en el plásmido pCR4-TOPO-INSP181. Fue identificado un segundo clon, amplificado a partir de un combinado que contenía el cADN derivado de glándula salival, glándula adrenal, ojo y la plantilla de ARN de referencia universal Stratagene en PCR2, que contenía el producto esperado INSP181-CP3/INSP181-CP4 , pero con una inserción de 25 aminoácidos en el inicio del exón 4. Esta inserción condujo a la sustitución de aminoácido F113V. En comparación con la secuencia de ADN genómica, el clon también contenía las sustituciones de aminoácidos N92T y G114S que pueden ser errores inducidos por PCR aunque los polimorfismos no pueden ser excluidos en esta etapa. La secuencia del fragmento de cADN clonado es mostrada en la Figura 9. El producto de PCR clonado es un plásmido pCR4-TOPO-INSP181-SVl .

Tabla 1 Cebador Secuencia (5' -3') INSP181-CP1 CCC TGG AGA AAG GCC CGC TCC TG INSP181-CP2 AGG GTG GGG GAC ATG GGC CAT C INSP181-CP3 GCT GCT GGC CCT TGG CCT GG INSP181-CP4 TAT GTT GAA GAC CGG GGC TTT CTG T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG G T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG Ejemplo 3: Generación de una ORF de INSP181 compatible con Gateway, fusionada a una secuencia marcadora 6HIS infraestructura! INSP181 fue clonado por PCR anidada, y por lo tanto el inserto de cADN en el clon pCR4-TOPO (plásmido pCR4-TOPO- INSP181) fue de 26 pares de bases faltantes en el extremo 5' y 21 pares de bases en el extremo 3' de la secuencia de codificación. La incorporación de los nucleótidos faltantes, el marcador 6HIS y el codón de detención fueron todos logrados por la inclusión de los nucleótidos apropiados en los cebadores utilizados para la amplificación por PCR. Las secuencias de los cebadores de PCR utilizados en la clonación son mostradas en la Tabla 2.

Tabla 2 Cebador Secuencia (5 '-3') INSP181 MAT FP GCC ACC ATG GCC CTG GAG AAA GGC CCG CTC CTG CTG CTG GCC CTT GGC INSP181 MAT RP GTG ATG GTG ATG GTG GGG TGG GGG ACÁ TGG GCC ATC GTT GAA GAC CGG INSP181 ATTB1 FP G GGG ACÁ TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC GCC ACC ATG GCC CTG ATTB1 PCR RP GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG INSP181 SVl (T92N) FP GGG TGT GTA AAG AAA CAA ACÁ TCA CCG TCC ATC CAA C Cebador Secuencia (5'-3') INSP181 SVl (T92N) GTT GGA TGG ACG GTG ATG T TTG TTT CTT RP TAC ACÁ CCC INSP181 SVl (S114G) TGG CAT GGG GGG GTC CAG G GCC TGG GGG FP ACG GAG GAG INSP181 SVl (S114G) CTC CTC CGT CCC CCA GGC C CTG GAC CCC RP CCC ATG CCA 21 M13 FP CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13 RP CAG GAA ACÁ GCT ATG AC pEAK12 FP AGC CTC AGA CAG TGG TTC AA pEAK12 RP GAT GGA GGT GGA CGT GTC AG Secuencia subrayada = secuencia Kozak Negritas = Codón de detención Secuencia en cursivas = marcador His El plásmido pCR4-TOPO-INSP181 fue utilizado como plantilla de PCR para generar la ORF de longitud completa que contenía un marcador 6HIS C-terminal y un codón de detención. La primera etapa de este proceso de clonación Gateway involucró una reacción de PCR de dos pasos que genera la ORF de longitud completa de INSP181 flanqueada en el extremo 5' por un sitio de recombinación attBl y una secuencia Kozak, y flanqueada en el extremo 3' por una secuencia que codifica para un marcador de 6 histidinas (6HIS) intraestructural, un codón de detención y el sitio de recombinación attB2 (cADN compatible con Gateway) . La primera reacción de PCR, PCRl, (en un volumen de 50 µl) contiene respectivamente: 1 µl (25 ng) del plásmido pCR4-TOPO-INSP181, 4.0 µl de dNTPs (10 mM) , 5 µl del amortiguador de polimerasa Pfx 10X, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 1.0 µl de cada cebador específico de gen (para dar una concentración final de 100 pmoles) (INSP181 MAT FP e INSP181 MAT RP) , y 0.5 µl de la ADN-polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen) . La reacción de PCR fue realizada utilizando un paso de desnaturalización inicial de 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 64°C por 30 segundos y 68 °C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 68°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. El producto de amplificación fue directamente purificado utilizando el kit de limpieza Perfectprep Gel (Eppendorf) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se visualizó una alícuota de 2 µl sobre gel de agarosa al 1.6% en amortiguador IX TAE con el fin de verificar que el producto fuera del peso molecular esperado (543 pb + 24 pb = 567 pb) . La segunda reacción de PCR (en un volumen final de 50 µl) contenía 1 µl del producto de PCRl purificado, diluido (hasta una concentración final de 10 ng) , 4.0 µl de dNTPs (10 mM) , 5 µl del amortiguador de polimerasa 10X Pfx, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 1.0 µl de cada cebador de conversión Gateway (para dar una concentración final de 100 pmoles) (INSP181 ATTB1 FP y ATTB1 PCR RP) y 0.5 µl de ADN-polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones para la segunda reacción de PCR fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 68°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 68°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. El producto de PCR fue purificado en gel utilizando el kit de limpieza Perfectprep Gel (Eppendorf) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fue visualizada una alícuota de 2 µl sobre gel de agarosa al 1.6% en amortiguador IX TAE con el fin de verificar que el producto fuera del peso molecular esperado (567 pb + 64 pb = 63 pb) . 3. 1 Subclonación de la ORF de INSP181 -6HIS compa tible con Ga teway dentro del vector de entrada de Ga teway, pDONR221 La segunda etapa del proceso de clonación Gateway involucró la subclonación del producto de PCR modificado por Gateway dentro del vector de entrada de Gateway, PDONR221 (Invitrogen) como sigue: 5 µl del producto extraído en gel proveniente de la PCR2 fueron incubados con 1.5 µl del vector pDONR221 (0.1 µg/µl), 2 µl de amortiguador BP y 1.5 µl de mezcla de enzima clonasa BP (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl a temperatura ambiente por 1 hora. La reacción fue detenida por la adición de 1 µl de la proteinasa K (2 µg/µl) e incubada a 37°C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 µl) se utilizó para transformar la cepa DH5a (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de las células DH5a fue descongelada sobre hielo y se agregaron 2 µl de la mezcla de reacción. La mezcla se incubó por 30 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor por incubación a 42°C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC tibio (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación (250 rpm) por 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación fue luego colocada sobre placas de caldo L (LB) que contenían 40 µg/ml de kanamicina y se incubaron toda la noche a 37°C. Cinco transformantes fueron picados y transferidos en forma de parche sobre placas de agar LB que contenía 40 µg/ml de kanamicina y se incubaron toda la noche a 37 °C. Una cucharada del cultivo desarrollado de la placa sembrada fue resuspendida en 50 µl de agua y calentada a ebullición por 5 minutos para lisar las células. El lisado celular fue centrifugado para eliminar los desechos celulares y el sobrenadante obtenido fue utilizado como una plantilla para la selección de PCR colonial. La mezcla de PCR (en un volumen final de 25 µl) contenía 10 µl del lisado celular centrifugado, 2.0 µl de dNTPs (10 mM) , 2.5 µl del amortiguador de polimerasa Taq, 0.5 µl de los cebadores de selección (para dar una concentración final de 100 picomoles) y 0.5 µl de la ADN-polimerasa Taq. Las condiciones para la reacción de PCR de selección fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 72°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. Los productos de PCR fueron cargados sobre un gel de agarosa al 1.6% para verificar el tamaño del fragmento. Un clon positivo fue seleccionado y el ADN del plásmido mini-prep fue preparado a partir de cultivos de 5 ml utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores 21M13 y M13Rev utilizando el Kit de Inicio Rápido de Secuenciamiento de Ciclo Terminador con Colorante CEQ (Beckman Coulter P/N 608120) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias cebadoras son mostradas en la Tabla 2. Las reacciones de secuenciamiento fueron analizadas sobre un sistema de análisis de ADN CEQ 2000 XL (Beckman Coulter P/N 608450) . Después de la confirmación secuencial o del inserto, pDONR221_INSP181-6HIS se utilizó luego para la creación de los clones de expresión. 3. 2 Subclona ción de la ORF de INSP181 compa tible con Ga teway den tro de los vectores de expresión pEAK12d y pDEST12. 2 El ADN plásmido (2 µl o aproximadamente 150 ng) de pDONR221_INSP181-6HIS se utilizó luego en una reacción de recombinación que contenía 1.5 µl ya sea del vector pEAK12d o el vector pDESTl2.2 (0.1 µg/µl), 2 µl de amortiguador LR y 1.5 µl de clonasa LR (Invitrogen) en un volumen de 10 µl. La reacción fue detenida por la adición de 1 µl de proteinasa K (2 µg/µl) e incubada a 37 °C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 litros) fue utilizada para transformar la cepa DH5a (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de las células DH5aa fue descongelada sobre hielo y se agregaron 2 µl de la mezcla de reacción. La mezcla se incubó por 30 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor por incubación a 42°C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC tibio (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación (250 rpm) por 1 hora a 37 °C. La mezcla de transformación fue luego sembrada sobre placas de caldo LB que contenían ampicilina (100 µg/ml) e incubadas toda la noche a 37 °C. Cinco transformantes fueron picados y transferidos por parches sobre placas de agar LB que contenían ampicilina (100 µg/ml) e incubadas toda la noche a 37°C. Una cucharada del cultivo desarrollado de la placa con parche se resuspendió en 50 µl de agua y se calentó a ebullición por 5 minutos para lisar las células. El lisado celular fue centrifugado para eliminar los desechos celulares y el sobrenadante obtenido fue utilizado como una plantilla para la selección de PCR colonial. La mezcla de PCR (en un volumen final de 25 µl) contenía 10 µl del lisado celular centrifugado, 2.0 µl de dNTPs (10 mM) , 2.5 µl del amortiguador de polimerasa Taq, 0.5 µl de cebadores de selección (para dar una concentración final de 100 picomoles y 0.5 µl de ADN-polimerasa Taq. Los clones de pEAK12d fueron seleccionados utilizando los cebadores pEAK12 FP e INSP181 MAT RP y los clones de pDEST12.2 fueron seleccionados utilizando los cebadores 21M13FP e INSP181 MAT RP. Las condiciones para la reacción de PCR de selección fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 72°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. Los productos de PCR fueron cargados sobre un gel de agarosa al 1.6% para verificar el tamaño del fragmento. Un clon positivo fue seleccionado y el ADN miniprep del plásmido fue preparado a partir de cultivos de 5 ml utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) en el vector pEAK12d fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores de secuenciamiento pEAK12 FP y pEAK12 RP como se describió anteriormente. El ADN plásmido (150-200 ng) en el vector pDEST12.2 fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores de secuenciamiento 21M13 FP y M13Rev RP como se describió anteriormente. Los clones confirmados en secuencia fueron designados como pEAK12d_INSP181-6HIS y pDEST12.2_INSP181-6HIS. El ADN maxi-prep fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia pEAK12d_INSP181-6HIS utilizando un kit de preparación Qiagen Maxi prep de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido fue resuspendido a una concentración de 1 µg/µl en amortiguador TE y almacenado a -20°C. El ADN maxi-prep libre de endotoxina fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia (pDEST12.2_INSP181-6HIS) utilizando el kit EndoFree Plasmid Mega (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido purificado fue resuspendido en amortiguador de TE libre de endotoxina a una concentración final de al menos 3 µg/µl y almacenado a -20°C.

Ejemplo 4: Generación de la ORF de INSP181SV1 compatible con Gateway fusionada a una secuencia de marcador 6HIS infraestructura! INSP181SV1 fue clonado mediante PCR anidada y por lo tanto el inserto de cADN en el clon de pCR4-T0P0 (plásmido pCR4-T0P0-INSP181-SVl) estuvo ausente a 26 pares de bases en el extremo 5' y 21 pares de bases en el extremo 3' de la secuencia de codificación. También, dos mutaciones que dan como resultado los cambios de aminoácido (N92T y G114S) fueron detectados en el secuenciamiento, el cual necesitó ser corregido. La incorporación de nucleótidos faltantes, al marcador 6HIS y el codón de detención fueron todos logrados mediante la inclusión de los nucleótidos faltantes en los cebadores utilizados para la amplificación por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio fue llevada a cabo para corregir las dos mutaciones después de que fue creado el clon de entrada INSP181 de longitud completa. El plásmido pCR4-T0P0-INSP181-SVl fue utilizado como la plantilla de PCR para generar la ORF de longitud completa que contenía un marcador de 6HIS C-terminal y un codón de detención. La primera etapa de este proceso de clonación Gateway involucró una reacción de PCR de dos pasos, la cual genera la ORF de longitud completa de INSP181SV1 flanqueado en el extremo 5' por un sitio de recombinación attBl y la secuencia Kozak, y flanqueado en el extremo 3' por una secuencia que codifica para un marcador de 6 histidinas intraestructural (6HIS), un codón de detención y el sitio de recombinación attB2 (cADN compatible con Gateway) . La primera reacción de PCR, PCRl, (en un volumen final de 50 µl) contiene respectivamente: 1 µl (25 ng) del plásmido pCR4-TOPO-INSP181-SV1, 4.0 µl de dNTPs (10 mM) , 5 µl del amortiguador Pfx-polimerasa 10X, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 1.0 µl de cada cebador específico de gen (para dar una concentración final de 100 pmoles) (INSP181 MAT FP e INSP181 MAT RP) , y 0.5 µl de la ADN-polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen). La reacción de PCR fue realizada utilizando un paso de desnaturalización inicial de 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos; 64 °C por 30 segundos y 68°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 68°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. El producto de amplificación fue directamente purificado utilizando el kit de limpieza Perfectprep Gel (Eppendorf) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Una alícuota de 2 µl fue visualizada sobre un gel de agarosa al 1.6% en el amortiguador 1 X TAE con el fin de verificar que el producto era del peso molecular esperado (618 pb + 24 pb = 642 pb) . La segunda reacción de PCR (en un volumen final de 50 µl) contenía 1 µl del producto de PCRl purificado, diluido (hasta una concentración final de 10 ng) , 4.0 µl de dNTPs (10 mM) , 5 µl de amortiguador de Pfx-polimerasa 10X, 1 µl de sulfato de magnesio (50 mM) , 1.0 µl de cada cebador de conversión Gateway (para dar una concentración final de 100 pmoles) (INSP181 ATTB1 FP y ATTBl PCR RP) y 0.5 µl del ADN-polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones para la segunda reacción de PCR fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 68°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 68°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. El producto de PCR fue purificado en gel utilizando el kit de limpieza Perfectprep Gel (Eppendorf) y recuperado en 50 µl de agua estéril de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fue visualizada una alícuota de 2 µl sobre el gel de agarosa al 1.6% en amortiguador 1 X TAE con el fin de verificar que el producto era del peso molecular esperado (642 pb + 64 pb = 706 pb) . 4 . 1 Subclona ción de INSP181SV1 - 6HIS ORF compa tible con Ga teway den tro del vector pDON4221 de en trada a Ga teway La segunda entrada del proceso de clonación Gateway involucró la subclonación del producto de PCR modificado por Gateway dentro del vector de entrada de Gateway pDONR221 (Invitrogen) como sigue: 5 µl del producto extraído del gel de PCR2, se incubaron por 1.5 µl del vector pDONR221 (0.1 µg/µl), 2 µl de amortiguador BP y 1.5 µl de mezcla de enzima clonasa BP (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl a temperatura ambiente por 1 hora. La reacción fue detenida por la adición de 1 µl de proteinasa K (2 µg/µl) y se incubó a 37°C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 µl) fue utilizada para transformar la cepa DH5a (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de las células DH5a fue descongelada sobre hielo y se agregaron 2 µl de la mezcla de reacción. La mezcla se incubó por 30 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor por incubación a 42°C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC tibio (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación (250 rpm) por 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación fue luego colocada sobre placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina (40 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. Cinco transformantes fueron picados y transferidos en forma de parche sobre placas de agar LB que contenía kanamicina (40 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. Una cucharada del cultivo desarrollado a partir de la placa de parche se resuspendió en 50 µl de agua y se calentó a ebullición por 5 minutos para lisar las células. El lisado celular fue centrifugado para eliminar los desechos celulares y el sobrenadante obtenido fue utilizado como una plantilla para la selección de PCR colonial.

La mezcla de PCR (en un volumen final de 25 µl) contenía 10 µl del lisado celular centrifugado, 2.0 µl de dNTPs (10 mM) , 2.5 µl del amortiguador de polimerasa Taq, 0.5 µl de cebadores de selección (para dar una concentración final de 100 pmoles) (21M13 FP y ATTB1 PCR RP) y 0.5 µl de ADN-polimerasa Taq. Las condiciones para la reacción de PCR de selección fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 72°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. Los productos de PCR fueron cargados sobre un gel de agarosa al 1.6% para verificar el tamaño del fragmento. Un clon positivo fue seleccionado y el ADN mini-prep plásmido fue preparado a partir de cultivos de 5 ml utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores 21M13 y M13Rev utilizando el Kit de Inicio Rápido de Secuenciamiento de Ciclo Terminador con Colorante CEQ (Beckman Coulter P/N 608120) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias cebadoras son mostradas en la Tabla 2. Las reacciones de secuenciamiento fueron analizadas sobre el sistema de análisis de ADN CEQ 2000 XL (Beckman Coulter P/N 608450) . Después de la confirmación de la secuencia, se utilizó pDONR221_INSP181SVl (N92T, G114S)-6HIS como una plantilla para la mutagénesis dirigida al sitio, para corregir las dos mutaciones. 4. 2 Mutagénesis dirigida al si tio de INSP181SV1 - 6HIS La secuencia INSP181SV1 clonada por PCR difirió de la INSP181SV1 predicha por sustitución en dos posiciones diferentes (A275C y G340A) que conduce a las mutaciones de aminoácidos N92T y G114S. Se pensó que estas mutaciones resultaban del procedimiento de clonación por PCR ya que éstas no fueron detectadas en el ADN genómico (Celera o Genbank) . Con el fin de crear un clon de pDONR221 que contenía la secuencia de INSP181SV1 correcta, el clon pDONR221_INSP181SVl- (N92T, G114S)-6HIS se utilizó como una plantilla para la mutagénesis dirigida al sitio. 4. 3 Cebadores de clona ción específicos del gen para la mutagénesis dirigida al si tio de INSP181 SV1 Dos pares de cebadores de PCR, INSP181SV1 (T92N) FP, INSP181SV1 (T92N) RP e INSP181SV1 (S114G) FP e INSP181SV1 (S114G) RP (Tabla 2), fueron diseñados tal que los cebadores se recocieron a hebras opuestas de la secuencia pDONR221_INSP181SVl-(N92T, G114S)-6HIS y cada cebador se recoció a 15-25 bases sobre cualquier lado del aminoácido que va a ser mutado. Los cebadores de PCR fueron diseñados siguiendo las instrucciones dadas en el manual de instrucciones para el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange® II XL (Stratagene). 4. 4 Mutagénesis dirigida al si tio de INSP181SV1 La mutagénesis 1 dirigida al sitio, fue llevada a cabo utilizando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange® II XL (Stratagene) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La reacción de control fue realizada en un volumen final de 50 µl que contenía IX de amortiguador de reacción, 10 ng de plásmido control pWhitescript 4.5 kb, 125 ng de cebador de oligonucleótido control #1, 125 ng de cebador de control #2, 1 µl de mezcla de dNTP, y 2.5 unidades de ADN-polimerasa PfuUl tra HF. La reacción de la muestra fue realizada en un volumen final de 50 µl que contenía un amortiguador de reacción IX, 10 ng del ADN plásmido plantilla (pDONR221_INSP181SVl- (N92T, G114S)-6HIS), 125 ng de INSP181SV1 (T92N) FP, 125 ng de INSP181SV1 (T92N) RP, 1 µl de la mezcla de dNTP, 2.5 unidades de la ADN-polimerasa PfuUl tra HF. El ciclo térmico fue realizado utilizando una Máquina de ADN MJ Research, programada como sigue: 95°C, 1 minuto; 18 ciclos de 95°C, 30 segundos, 60°C, 1 minuto, y 68°C, 3 minutos 30 segundos; seguido por una extensión final de 68 °C por 7 minutos y un ciclo de retención a 4°C. Se utilizó digestión con Dpn I para digerir el ADN plantilla progenitor metilado o hemimetilado (plásmido pDONR221_INSP181SVl-6HIS en la reacción de muestra), 1 µl de la enzima de restricción Dpn I (10 U/µl, Stratagene) se agregó a los productos de las reacciones de amplificación control y de muestra. Las reacciones fueron mezcladas suavemente e incubadas a 37 °C por 1 hora. Cada mezcla de reacción fue luego transformada dentro de las células supercompetentes XLl-Blue (Stratagene) como sigue. Una alícuota de 50 µl de las células XLl-Blue fue descongelada sobre hielo y se agregó 1 µl de ADN tratado con Dpn I . La mezcla fue incubada por 30 minutos sobre hielo y luego chocada por calor mediante incubación a 42°C exactamente por 45 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo por 2 minutos y se agregaron 250 µl de medio pre-calentado NZY (42°C) . Las muestras fueron incubadas con agitación (220 rpm) por 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación control (250 µl) fue luego sembrada sobre una placa de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 µg/ml), X-gal (80 µg/ml), e IPTG 20 mM. La mezcla de transformación de muestra (250 µl sobre cada una de 2 placas) se sembró sobre placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina (40 µg/ml). Las placas fueron incubadas toda la noche a 37 °C. 4. 5 Prepara ción y secuenciamien to del ADN plásmido Fue seleccionado un transformante y el ADN mini- prep plásmido fue preparado a partir de un cultivo de 5 ml utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) fue sometido a secuenciamiento de ADN con los cebadores 21M13 y M13Rev utilizando el Kit de Inicio Rápido de Secuenciamiento de Ciclo Terminador con Colorante CEQ (Beckman Coulter P/N 608120) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias cebadoras son mostradas en la Tabla 2. Las reacciones de secuenciamiento fueron analizadas sobre el sistema de análisis de ADN CEQ 2000 XL (Beckman Coulter P/N 608450) . Después de la confirmación de la secuencia del inserto con la mutación correcta, pDONR221_INSP181SVl- (G114S) -6HIS se utilizó entonces como una plantilla para la realización de la segunda corrección (S114G). La mutagénesis 2 dirigida al sitio, fue llevada a cabo utilizando el protocolo y las condiciones mencionadas anteriormente. Los cebadores utilizados para la mutagénesis 2 dirigida al sitio fueron INSP181SV1 (S114G) FP e INSP181SV1 (S114G) RP. El análisis secuencial identificó un clon que contenía la secuencia de inserto esperada INSP181SV1 (pDONR221_INSP181SVl-6HIS) . 4. 6 Subclona ción de la INSP181 SV1 ORF compa tible con Ga teway den tro de los vectores de expresión pEAK12d y pDEST12. 2 El ADN plásmido (2 µl o aproximadamente 150 ng) de pDONR221_INSP181SVl-6HIS fue luego utilizado en una reacción de recombinación que contenía 1.5 µl ya sea del vector pEAK12d o del vector pDEST12.2 (0.1 µg/µl), 2 µl del amortiguador LR y 1.5 µl de clonasa LR (Invitrogen) en un volumen final de 10 µl . La reacción fue detenida por la adición de 1 µl de proteinasa K (2 µg/µl) y se incubó a 37°C por 10 minutos adicionales. Una alícuota de esta reacción (2 µl) fue utilizada para transformar la cepa DH5a (Invitrogen) como sigue: una alícuota de 50 µl de las células DH5a fue descongelada sobre hielo y se agregaron 2 µl de la mezcla de reacción. La mezcla se incubó por 30 minutos sobre hielo y luego se chocó por calor mediante incubación a 42°C exactamente por 30 segundos. Las muestras fueron devueltas al hielo y se agregaron 250 µl del medio SOC tibio (temperatura ambiente) . Las muestras fueron incubadas con agitación (250 rpm) por 1 hora a 37°C. La mezcla de transformación fue luego sembrada sobre placas de caldo (LB) que contenían ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. Cinco transformantes fueron picados y transferidos en forma de parche sobre placas de agar LB que contenía ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron toda la noche a 37°C. Una cucharada del cultivo desarrollado a partir de la placa de parche se resuspendió en 50 µl de agua y se calentó a ebullición por 5 minutos para lisar las células. El lisado celular fue centrifugado para eliminar los desechos celulares y el sobrenadante obtenido fue utilizado como una plantilla para la selección de PCR colonial. La mezcla de PCR (en un volumen final de 25 µl) contenía 10 µl del lisado celular centrifugado, 2.0 µl de dNTPs (10 mM) , 2.5 µl del amortiguador de polimerasa Taq, 0.5 µl de cebadores de selección (para dar una concentración final de 100 pmoles) y 0.5 µl de ADN-polimerasa Taq. Los clones pEAK12d fueron seleccionados utilizando los cebadores pEAK12 FP e INSP181 MAT RP, y los clones de pDEST12.2 fueron seleccionados utilizando los cebadores 21M13FP e INSP181 MAT RP. Las condiciones para la reacción de PCR de selección fueron: 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos; 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto; y un ciclo de extensión final de 72°C por 5 minutos y un ciclo de retención de 4°C. Los productos de PCR fueron cargados sobre un gel de agarosa al 1.6% para verificar el tamaño del fragmento. Un clon positivo fue seleccionado y el ADN miniprep plásmido fue preparado a partir de cultivos de 5 ml utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) . El ADN plásmido (150-200 ng) en el vector pEAK12d se sometió a secuenciamiento de ADN con los cebadores de secuenciamiento pEAK12 FP y pEAK12 RP como se describe anteriormente. El ADN plásmido (150-200 ng) en el vector pDEST12.2 se sometió a secuenciamiento de ADN con los cebadores de secuenciamiento 21M13 FP y M13Rev RP como se describe anteriormente. Los clones confirmados en secuencia fueron designados como pEAK12d_INSP181SVl-6HIS y pDEST12.2_INSP181SVl-6HIS. El ADN maxi-prep fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia pEAKl2d_INSP181-6HIS utilizando un kit Qiagen Maxi prep de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido fue resuspendido a una concentración de 1 µg/µl en el amortiguador TE y almacenado a -20°C. El ADN maxi-prep libre de endotoxina fue preparado a partir de un cultivo de 500 ml del clon verificado en secuencia pDEST12.2_INSP181-6HIS utilizando el kit EndoFree Plasmad Mega (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido purificado fue resuspendido en amortiguador TE libre de endotoxina a una concentración final de al menos 3 µg/µl y almacenado a -20°C.

Ejemplo 5: Ensayos Adecuados par la Exploración de la Relevancia Biológica de la Función de INSP181 Se cree que las porciones de la invención serán particularmente útiles para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades/trastornos del sistema reproductivo y enfermedades/trastornos autoinmunes. Se cree que los siguientes ensayos serán útiles para probar las porciones que tienen efectos biológicos útiles. Nótese que aunque algunos de los ensayos siguientes se refieren al compuesto de prueba como una proteína/polipéptido, una persona experta en la técnica será fácilmente capaz de adaptar los siguientes ensayos, de modo que las otras porciones de la invención pueden ser también utilizadas como el "compuesto de prueba".

A Ensayos de salud reproductiva Ensayo de Implantación de JEG-3: En este ensayo, se utiliza un sistema de 2 cámaras donde las células JEG-3 marcadas fluorescentemente invaden a través de una membrana porosa recubierta con Matrigel desde una cámara superior hacia una cámara inferior, cuando las células Ishikawa o el medio condicionado de Ishikawa son colocados en la cámara inferior. Las células que migran son cuantificadas en un lector de placas. La meta es identificar las proteínas que incrementan la invasión de las células JEG-3 para el uso en ayudar a la implantación in vivo .

Ensayos de esfera de osteopontina (células Ishikawa) En este ensayo, las esferas fluorescentes recubiertas con osteopontina representan el blastocito, y las células Ishikawa son aprestadas para aceptarlas para el enlace tratándolas con estradiol. La meta es identificar las proteínas que incrementan la habilidad de las células Ishikawa para enlazarse a las esferas de osteopontina como un auxiliar para incrementar la receptividad del endometrio uterino al tiempo de la implantación.

Ensayo de HuF6: En este ensayo, la meta es identificar las proteínas que incrementan la producción de PGF2 (un marcador para la decidualización) por las células HuF6 como una manera de aumentar la decidualización durante el embarazo temprano.

Ensayo de endometriosis: TNFa peritoneal juega un papel en la endometriosis al inducir que las células endometriales desprendidas, provenientes del útero, se adhieran a y proliferen sobre las células mesoteliales peritoneales. En este ensayo, las células BEND son tratadas con TNFa, lo cual incrementa su habilidad para enlazarse a las esferas fluorescentes recubiertas con fibronectina, como un ensayo para la adherencia durante la endometriosis. La meta es identificar las proteínas que disminuyen o que inhiben la habilidad de TNFa para estimular la capacidad de enlace a las esferas de las células.

Ensayo de AMP cíclico utilizando células granulosas porcinas JC-410 establemente transfectadas con hLHR En el Síndrome de ovario Poliquístico, LH proveniente de la pituitaria es relativamente alta, e induce salida de andrógenos desde las células fecales de ovario. En este ensayo, se está buscando un inhibidor de la señalización de LH que pudiera ser utilizado para disminuir la acción de LH en el ovario durante PCOS . La línea de células granulosas porcinas JC-410 fue establemente transfectada con el receptor de LH humano. El tratamiento con LH da como resultado la producción de cAMP.

Ensayo de AMP cíclico utilizando células granulosas porcinas JC-410 establemente transfectadas con hFSHR La línea de células granulosas porcinas JC-410 fue establemente transfectada con la FSHR humana. El tratamiento con FSH estimula la producción de cAMP, que es medida en este ensayo. La meta es identificar las proteínas que aumentan la acción de FSH en las células granulosas.

Ensayos de células de pituitaria LbetaT2 (ratón) Las células LbT2 son una línea de célula gonadotróficas de pituitaria murina, inmortalizadas. La estimulación con activina únicamente o con GnRH + Activina, da como resultado la secreción de FSH. Las células pueden ser ya sea tratadas con GnRH + proteínas Bioscreen para enlazar las proteínas que actúan al unísono con GnRH para estimular la producción de FSH, o éstas pueden ser tratadas con las proteínas Bioscreen solas, para encontrar una proteína que puede estimular la secreción de FSH como la activina sola.

Ensayo de expansión de cúmulo Utilizando complejos de cúmulo-oocitos murinos se puede desarrollar un ensayo para identificar las porciones que promueven la expansión.

Ensayo de proliferación de RWPE La hiperplasia prostática benigna está caracterizada por el desarrollo de epitelio prostático y estroma que no es balanceado por apoptosis, dando como resultado el agrandamiento del órgano. RWPE es una línea de células epiteliales prostáticas humanas, regulares, que fue inmortalizada con HPV-18, y se utiliza en lugar de las células epiteliales prostáticas humanas primarias, que no son siempre disponibles.

Ensayo de invasión de fibrosarcoma HT-1080 Células de fibrosarcoma humanas HT-1080 fluorescentemente marcadas, son cultivadas en la cámara superior de un sistema de 2 cámaras, y pueden ser estimuladas para invadir a través de la membrana porosa recubierta con Matrigel hacia la cámara inferior, donde éstas son cuantificadas. La meta podría ser identificar una porción que pudiera inhibir la invasión.

Ensayo de músculo liso uterino humano, primario Una de las marcas notables de la enfermedad fibroide uterina es la deposición de colágeno por las células del músculo liso uterinas que se han vuelto leiomiomas. Las células de músculo liso uterino humanas, son estimuladas para producir colágeno mediante tratamiento con TGFb, que es bloqueado con Rebif. La meta es descubrir las proteínas que inhiben este fenotipo fibrótico.

Ensayo de proliferación de células de leiomioma humano Las células de leiomioma humano pueden ser utilizadas como un modelo para la enfermedad fibroide uterina en un ensayo de proliferación. Las células se desarrollan muy lentamente pero éstas pueden ser estimuladas con estradiol y factores de crecimiento. La meta es identificar las proteínas que inhiben el crecimiento dependiente del estradiol de las células de leiomioma.

Ensayo de migración U937 Las lesiones endometrióticas secretan citocinas que reclutan células inmunes hacia la cavidad peritoneal que son luego mediadoras de los síntomas inflamatorios que son comunes a la endometriosis. Se ha mostrado que RANTES es producido por las células estromales endometrióticas y está presente en el fluido peritoneal. En este ensayo, U937, una línea celular monocítica utilizada como un modelo para los macrófagos activados, puede ser inducida mediante tratamiento del nivel inferior de un sistema de cultivo de 2 cámaras para migrar desde la cámara superior. Si las células son precargadas con el colorante fluorescente, éstas pueden ser cuantificadas en la cámara inferior. La meta será identificar las proteínas que inhiben la migración de las células U937.

Ensayo de trofoblastos humanos JEG3 El trofoblasto del blastocito produce HLA-G, una molécula HLA de la Clase I que se cree es importante en la prevención del rechazo inmunológico del embrión por la madre. Durante la pre-eclampsia, los niveles de HLA-G son bajos o no existentes. La línea de células protoblásticas humanas JEG-3 produce HLA-G y puede ser utilizada para identificar porciones que pueden incrementar la producción de HLA-G.

Ensayo de dispersado de ovario primario de rata La cantidad de producción de estradiol a partir de los cultivos de células provenientes de ovarios enteros, tomados de ratas inmaduras u otros roedores, puede ser medida después del tratamiento con FSH y/o LH. La meta será identificar las proteínas que aumentan la esteroidogénesis estimulada por gonadotropina, o las proteínas que funcionan solas para incrementar la esteroidogénesis por estos cultivos .

Ensayo IVF en ratón En este ensayo, la función espermática, medida por la habilidad para fertilizar los oocitos, será evaluada con la meta de encontrar las proteínas que estimulan el potencial de fertilización del esperma. Tal ensayo puede ser corrido con, por ejemplo, esperma de ratón y oocitos.

Ensayo de proliferación de células estromales de próstata humana, primarias Ha sido desarrollado un ensayo para el componente epitelial de BPH (ver RWPE arriba) . Este ensayo utiliza células estromales de próstata humana, primarias, como un modelo para la proliferación de estas células durante BPH. La meta será identificar las proteínas que inhiben la proliferación de estas células.

Ensayo de proliferación del músculo liso uterino humano, primario Las proteínas y otras porciones pueden ser probadas para identificar con esto las porciones capaces de inhibir la proliferación de las células del músculo liso uterinas, humanas, primarias. La proliferación de las células del músculo liso uterinas es un precursor para el desarrollo de tumores en la enfermedad fibroide uterina.

B. Ensayos autoinmunes Ensayos que se dirigen a las respuestas de linfocitos T • Muerte de células T inducida por el ligando Fas . Este ensayo revelará los nuevos moduladores de la muerte celular mediada por el receptor. En este ensayo, la apoptósis de células T es inducida por la estimulación de las células Jurkat con el ligando Fas marcado con 6 histidinas, recombinante, combinado con un anticuerpo monoclonal anti-6-his. La muerte es cuantificada mediante liberación de LDH, una enzima citoplásmica liberada en el medio de cultivo cuando las células están muriendo. Se ha mostrado que las células T son patógenas en muchas enfermedades autoinmunes, siendo capaces de controlar la muerte de células T específicas del antígeno, lo cual es una estrategia terapéutica.

• MLR Humanas: proliferación y secreción de citocina.

Este ensayo basado en células mide los efectos de las nuevas proteínas sobre la proliferación de linfocitos y la secreción o inhibición de citocina después de la estimulación por PBMC proveniente de otro donador (alorreactividad) .

* PBMC humanas estimuladas con superantígeno , TSST.

En este ensayo celular, la activación de linfocitos T puede ser específicamente dirigida vía la TCR, pero con diferentes requerimientos que la respuesta de células T a antígenos clásicos, en particular con respecto a las moléculas co-estimuladoras .

* PBMC humanas estimuladas ya sea con ConA o PHA. Estos ensayos basados en células miden los efectos de las nuevas proteínas sobre la secreción de citocina inducida por dos diferentes estímulos que actúan sobre diferentes células, como se mide por un ensayo de arreglo de esferas de citocina (CBA) (IL-2, IFN-?, TNF-a, IL-5, IL-4 e IL-10).

Ensayo que se dirige a los monocitos/macrófagos y las respuestas de granulocitos • PBMC humanas estimuladas con LPS. Este ensayo basado en células mide los efectos de las nuevas proteínas sobre la secreción de citocina (IFN-?, TNF-a) inducida por el LPS que actúa sobre monocitos/macrófagos y granulocitos.

Ensayos que se dirigen a las respuestas de neutrófilos La infiltración tisular de los neutrófilos depende de una reorganización de los elementos del citoesqueleto, asociados con los cambios específicos en la morfología celular de estas células. Este ensayo basado en células mide el efecto de las nuevas proteínas sobre la reorganización del citoesqueleto de los neutrófilos humanos.

Ensayos que se dirigen a las respuestas de linfocitos B • Proliferación de células B. Este ensayo basado en células mide el efecto de las nuevas proteínas sobre la supervivencia de células B. • Co-estimulación de células B. Este ensayo basado en células mide el efecto de las nuevas proteínas sobre la co-estimulación de células B.

Ensayos que se dirigen a los monocitos y respuestas microgliales Flujo de calcio de THP-1. El flujo de Ca+ en el ensayo de células THPl mide los efectos de las nuevas proteínas sobre su habilidad para disparar una liberación de calcio intracelular (un evento de segundo mensajero genérico) a partir del retículo endoplásmico.

Proliferación de células de la microglía. Durante la proliferación de los progenitores microgliales, se sabe que un número de factores estimuladores de colonias, incluyendo algunas citocinas, juegan papeles clave. Entre ellos, M-CSF es crucial para el paso final de maduración de los macrófagos/microglía y no es reemplazable por ningún otro factor. La evaluación de esta respuesta biológica puede representar una manera de influenciar la actividad de la microglía y por lo tanto una oportunidad para identificar las moléculas con potencial terapéutico a partir de MS . La persona experta en la técnica será capaz de desarrollar un ensayo basado en células • que puede medir la respuesta proliferativa de una línea celular de microglía a M-CSF. Otros ensayos que pueden ser útiles incluyen un ensayo de modulación de expresión de citocina. En resumen, se miden los efectos de la proteína de prueba (u otra porción de prueba) sobre la secreción de citocina inducida por Concanavalina A que actúa sobre diferentes células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC) como se miden por un ensayo de arreglo de esferas de citocina (CBA) para IL-2, IFN-?, TNF-a, IL-5, IL-4 e IL-10. Utilizando tal ensayo, puede ser determinada la citocina "mejor inhibida" y las enfermedades co-relacionadas con tal citocina pueden ser encontradas en la literatura.

Ejemplo 5 - Efecto de INSP181 sobre la secreción de citocina por las PBMCs estimuladas con Con A .1 Sumario Se probó INSP181 para su efecto sobre la secreción de citocina por Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana (PMBC), estimuladas con el mitógeno, concanavalina A (ConA) . INSP181-6HIS estimula la secreción de IL-10, IL-4 e IL-5 a partir de las PBMC humanas estimuladas con ConA, cuando se prueba a una dilución 1/10 (46.2 µg en el ensayo) . No se observó ningún efecto sobre los niveles de IFN-?, TNF-a o IL-2.

Materiales y Reactivos Piel de buey DMEM GIBCO Ref: 21331-020 Suero humano tipo AB SIGMA Ref: H1513 L-glutamina GIBCO Ref: 250 030-020 Penicilina-estreptomicina GIBCO Ref: 150-070-063 Ficoll PHARMACIA Ref: 17-1440-03 Placa de microtitulación de 96 pozos para cultivo celular COSTAR Ref: 3596 Concanavalina A SIGMA Ref. C0412 Dexametasona soluble en agua SIGMA Ref: D2915 Kit CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Becton-Dickinson Ref: 550749 PBS GIBCO Ref: 14190-094 FALCON 50 ml estéril Becton-Dickinson Ref: 2070 Glicerol MERCK Ref: 1-04092-2500 Placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico NUNC Ref: 249570 .3 MÉTODO 5.3.1 Purificación de PBMC Humanas provenientes de una piel de buey Se diluye la piel de buey 1 a 2 con DMEM. Se agregan lentamente 25 ml de sangre diluida sobre una capa de 15 ml de Ficoll en un tubo Falcon de 50 ml . Se centrifugan los tubos (2000 rpm, 20 minutos, a TA sin rompimiento) . Se recolecta la interfase (anillo) y se lavan las células con 25 ml de DMEM, seguido por un paso de centrífuga (1200 rpm, 5 minutos). Se repite 3 veces. Una piel de buey podría dar aproximadamente 600 x 106 células totales. .3.2 Prueba de Actividad Se agregan 80 µl de 1.25 x 106 células/ml, diluidas en DMEM + 2.5% de suero humano + 1% de L-glutamina + 1% de penicilina-estreptomicina, a una placa de microtitulación de 96 pozos.

Se agregan 10 µl por pozo (una condición por pozo) : AS902285/1 en PBS + 20% de glicerol. Agregar 10 µl por pozo: ConA 50 µg/ml (la concentración final de ConA es de 5 µg/ml). Después de 48 horas, los sobrenadantes celulares son recolectados y las citocinas humanas medidas mediante el Kit CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Becton-Dickinson. .3.3. Análisis de CBA La mezcla de Esferas de Captura Thl/Th2 Humanas es preparada siguiendo las instrucciones del proveedor (CBA Kit Becton-Dickinson Ref: 550749), brevemente: se determina el número de tubos de ensayo que son requeridos para el experimento. - se agita en torbellino vigorosamente cada suspensión de esferas de captura por unos pocos segundos antes del mezclado, se agrega una alícuota de 10 µl de cada esfera de captura, para cada ensayo que va a ser analizada, dentro de un tubo simple marcado "esferas de captura mixtas", se agita en torbellino la mezcla de Esferas perfectamente . Preparación de las muestras de prueba Se diluyen los sobrenadantes 1:5 utilizando el Diluyente de Ensayo (20 µl de sobrenadantes + 60 µl de Diluyente de Ensayo) . Se mezcla la dilución de muestra antes de transferir las muestras a una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico (Nunc) Procedimiento de Ensayo de CBA de Citocina Thl/Th2 Humana Se agregon 50 µl de los sobrenadantes diluidos a una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo cónico (Nunc) . Agregar 50 µl de las esferas de captura mixtas. Se agrega 50 µl del Reactivo de Detección PE de Thl/Th2 Humano . Se incuba la placa por 3 horas a TA y se protege de la exposición directa a la luz. Se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se desecha cuidadosamente el sobrenadante. Se agregan 200 µl de Amortiguador de Lavado a cada pozo y se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. - Se desecha cuidadosamente el sobrenadante. Se agregan 200 µl de Amortiguador de Lavado a cada pozo y se centrífuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se desecha cuidadosamente el sobrenadante. Se agregan 130 µl de amortiguador de lavado a cada pozo para resuspender el botón de esferas. Analizar las muestras en un citómetro de flujo. Los datos son analizados utilizando el software de Aplicación CBA, el software Activity Base y el software Excel . Los resultados son dados en porcentaje de secreción de citocina en comparación al nivel de citocina alcanzado por la estimulación con ConA (100%) versus las células no estimuladas ( 0% ) . .4 RESULTADOS. La presente invención está basada en el hallazgo de que los polipéptidos de la presente invención suprarregulan las citocinas Th2, más específicamente la interleucina-10 (IL-10), interleucina-5 (IL-4) e interleucina-5 (IL-5). Además, esta suprarregulación es específica para las citocinas Th2, ya que los niveles de citocinas Thl (por ejemplo IFN-?, TNF-a o IL-2) permanecen sin cambio. Este perfil específico de expresión de citocina conduce al uso terapéutico potencial de los polipéptidos de la presente invención en enfermedades de Thl, antagonistas de los mismos que son útiles en las enfermedades de Thl.

Tabla 3. Efecto de INSP181-6HIS sobre la secreción de citocina por PBMCs humanas estimuladas con Con A Ejemplo 6 6.1 Análisis de los niveles de expresión del gen INSP181 mediante PCR en tiempo real (Taqman) El ARN total de cada muestra fue transcrito inversamente utilizando el sistema de síntesis de primera hebra Superscript III para RT-PCR (Invitrogen, Cat. No. 18080-051) en un volumen de reacción final de 20 µl . 2µg del ARN total fueron combinados con 50 ng de los cebadores hexaméricos aleatorios, 10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP, y DTTP y agua tratada con DEPC en un volumen de 10 µl . La mezcla fue incubada a 65°C por 5 minutos y luego enfriada sobre hielo por 1 minuto. La siguiente mezcla de síntesis de 10 µl de cADN fue preparada en un tubo separado: 2 µl de amortiguador RT 10X, 4 µl de cloruro de magnesio 25 mM, 2 µl de DTT 0.1M, 1 µl de ARNseOUTMR (40 unidades/µl), y 1 µl de la enzima SuperScriptMR IIIRT (200 unidades/µl) . La mezcla de síntesis de cADN fue agregada a la mezcla de ARN/cebador, mezcladas suavemente e incubadas a 25°C por 10 minutos y luego a 50°C por 50 minutos. La enzima RT fue luego inactivada mediante incubación a 85°C por 5 minutos. La mezcla fue enfriada sobre hielo y luego se agregó 1 µl de la ARNsa H de E. coli (2 unidades/µl) y la mezcla se incubó a 37°C por 20 minutos. La mezcla se enfrió sobre hielo y luego se diluyó 1/250 con agua estéril. Las diluciones de la reacción de transcriptasa inversa fueron luego sometidas a análisis de PCR en tiempo real sobre un instrumento Taqman (PE Biosystems 7700) . Los cebadores de PCR para la INSP181 humana y el gen control de mantenimiento doméstico de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) fueron diseñados utilizando el software Primer Express (PE Biosystems) . El cebador delantero fue diseñado en el exón 1.

El cebador inverso fue diseñado en el exón 2. Este cebador no distinguirá INSP181 de INSP181SV. Las secuencias de los cebadores son mostradas en la Tabla 4. La especificidad de la concentración óptima del cebador para utilizarse en el análisis TaqMan fueron determinadas mediante la prueba de los cebadores INSP181 sobre una serie de diluciones del plásmido pEAK12d-INSP181-6HIS y pEAK12d-INSP181SV-6HIS. La contaminación por ADN genómico potencial del cADN fue excluida mediante la realización de reacciones de PCR utilizando cebadores específicos para la secuencia intrónica de GAPDH. La ausencia de amplificación específica fue controlada mediante el análisis de los productos de PCR sobre geles de agarosa al 4% para asegurar que una banda simple del peso molecular esperado era producida. Fueron llevadas a cabo reacciones de PCR en tiempo real SYBR Green en un volumen de reacción de 50 µl que contenía 25 µl de mezcla maestra de PCR SYBR Green (PE Biosystems) (a la cual habían sido agregadas previamente 0.5 unidades de la uracilo-N-glucosilasa AmpErase (UNG, PE Biosystems) ) 300 nM de cada cebador de amplificación, y 5 µl del producto de RT-PCR. Los ciclos fueron realizados utilizando el sistema de detección ABI PRISM 7700 (TaqMan) programado como sigue: 1 ciclo de 50°C por 2 minutos; 1 ciclo de 95°C por 10 minutos; 40 ciclos de 95°C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto. Cada reacción fue llevada a cabo por duplicado y los resultados promediados . Las regiones específicas del cebador de las muestras de cADN transcritas inversamente, fueron de este modo amplificadas y sus valores de umbral del ciclo (Ct) fueron determinadas. El valor Ct para cada muestra de cADN fue normalizado a aquel del gen de mantenimiento doméstico de GAPDH como sigue. La diferencia en el nivel de expresión entre el gen de GAPDH y el gen de INSP181 en cada muestra de cADN fue expresada como una diferencia en el valor de Ct, por ejemplo Delta (d) Ct = Ct (GAPDH) - Ct (INSP181) . Los resultados para cada muestra fueron luego expresados como una diferencia proporcional en el número de ciclos requeridos para la expresión detectable del gen INSP181 con relación a aquella para GAPDH, de acuerdo a la fórmula de diferencia proporcional = 2(~ ct). Finalmente, se mostró que el nivel de expresión del gen INSP181 en cada muestra de cADN es relativo al nivel de expresión del gen GAPDH, donde el nivel de expresión de GAPDH = 100%, al dividir 100 entre la diferencia proporcional para INSP181. 6.2 Resultados Los cebadores de INSP181 fueron probados sobre un panel de aproximadamente 100 muestras de tejido humano normales y enfermas, células primarias y líneas celulares además de 44 biopsias de colon e íleon con enfermedad inflamatoria del intestino, y 39 biopsias de psoriasis provenientes de una prueba clínica de IL18BP. Los resultados se muestran en las tablas 5 y 6 y son representados gráficamente en las figuras 12 y 13. La expresión de INSP181 fue sorprendentemente únicamente detectada a un bajo nivel en la piel (0.16% de GAPDH) (tabla 5, figura 12) y en biopsias de piel a partir de pacientes con psoriasis (19/39 muestras positivas) (tabla 6, figura 13) . Un segundo par de cebadores específico para los exones 4/6 (cebador delantero en el exón 4 y cebador inverso en el exón 6) confirmaron la especificidad en piel . Los resultados de la expresión muestran la expresión restringida no esperada de INSP181 en muestras de biopsia de piel y muestras de piel con psoriasis . Este patrón específico de expresión conduce a la conclusión del involucramiento de INSP181 en enfermedades cutáneas. Preferentemente, la enfermedad de la piel es una enfermedad de la piel de Thl o Th2. Preferentemente, la enfermedad de Thl fue la psoriasis. Estas propiedades sorprendentes que caracterizan a los polinucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención los hacen particularmente adecuados para la preparación de un fármaco o una composición farmacéutica. Los polinucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención muestran por lo tanto el hallazgo inesperado de una expresión restringida en tejidos específicos.

Tabla 4. Secuencias del cebador de PCR TaqMan Tabla 5. Expresión de INSP181 en tejidos humanos principales medida mediante RT-PCR (TaqMan) Tabla 6. Expresión de INSP181 en biopsias de piel enferma de pruebas clínicas de IL18BP medida mediante RT-PCR (TaqMan) Ejemplo 7 : estudios de microarreglo Han sido fabricados microarreglos a la medida utilizando el proceso de síntesis in situ sin contacto de Agilent Technologies (Agüen Technologies Inc. Palo Alto, CA) de impresión de sondas oligonucleotídicas de longitud de 60 mer, base por base, a partir de archivos de secuencia digitales. Esto es logrado con un proceso de chorro de tinta que distribuye volúmenes extremadamente pequeños y precisos (picolitros) de los productos químicos que van a ser transferidos. La química estándar de la fosforamidita utilizada en las reacciones permite que sean mantenidas eficiencias de acoplamiento muy altas en cada paso en la síntesis del oligonucleótido de longitud completa. Cantidades precisas son al parecer depositadas "al vuelo". Esta hazaña de ingeniería es lograda sin detenerse para hacer contacto con la superficie del portaobjetos y sin introducir anomalías de la característica de contacto superficial, dando como resultado uniformidad de transferencia consistente y capacidad de rastreo. (Hughes et al. (2001) Nat. Biotech. Apr; 19(4): 342-7. Exprexssion profiling using microarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer) .

Síntesis de la Sonda Se llevaron a cabo las metodologías de acuerdo a las instrucciones de Agilent. Esencialmente, la síntesis del cADN y la amplificación subsecuente de la polimerasa T7 de la sonda de cARN marcada con cianina 3 (5) -CTP se llevó a cabo utilizando el kit de amplificación lineal fluorescente de entrada baja de ARN y Agilent, a partir de una plantilla de 5 µg del ARN de acuerdo al protocolo del kit (versión 2 Agosto 2003, Agilent, Palo Alto, CA) . El cARN es luego fragmentado utilizando el kit de hibridación in situ Agilent e hibridado de acuerdo al protocolo de Agilent (protocolo de procesamiento de microarreglo de 60 mer de Agilent versión 4.1 Abril 2004, Agilent, Palo Alto, CA) .

Diseño del Chip del Microarreglo • 10,536 sondas están en el arreglo • 5557 de las sondas diseñadas específicamente para detectar las secuencias secretadas de interés primario • 1000 sondas diseñadas como controles negativos • 500 sondas diseñadas como controles positivos • el resto de las sondas fueron diseñadas a las secuencias de dominio público, que se sabe son ya sea proteínas extracelulares solubles secretadas o bien proteínas enlazadas a la membrana con un dominio extracelular en contacto con el medio extracelular.

Estudios específicos para INSP181 Se forma INSP181 a partir de los exones de componentes separados. Se pretende perfilar los chips utilizando la sonda sintetizada a partir de 10 tejidos normales, médula ósea, cerebro, pulmón, ovario, PBMCs, placenta, próstata, bazo y testículos. Los reportes de expresión son obtenibles en una base de exón por exón. El promedio se realiza para los datos, utilizando el algoritmo de peso doble de Tukey de un solo paso (Análisis de Datos y Regresión: A Second Course in Statics", Mosteller and Tukey, Addison-Wesley, 1977, pp, 203-209; ver también el algoritmo Affymetrix MAS5.0). El propósito se esto es definir un estimado robusto del valor promedio de un grupo de datos. En este caso los presentes grupos de datos comprenderán múltiples valores de expresión de sonda para un exón único. Este arreglo a la medida es útil para un número de razones. Primeramente, éste sigue la existencia y la secuencia del transcrito que va a ser confirmado. En segundo lugar, la distribución tisular de la secuencia polipeptídica de INSP181 puede ser evaluada y este modo, puede ser aclarado el papel de este polipéptido en la enfermedad. El arreglo puede ser también utilizado como una herramienta de diagnóstico, para diagnosticar la incidencia de la enfermedad en pacientes con condiciones de enfermedad con las cuales este polipéptido está correlacionado. El uso de las sondas específicas del exón permite cualquier variación en la expresión de las variantes de empalme de esta secuencia polipeptídica que va a ser evaluada, en general, en tejidos específicos y estados de enfermedad específicos Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido, caracterizado porque: (i) comprende o consiste la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 66 ó SEQ ID No. : 70; (ii) es un fragmento del mismo que es una lipocalina o que tiene un determinante antigénico y común con uno o más de los polipéptidos de (i); o (iii) es un equivalente funcional de (i) o (ii) .
2. Un polipéptido que es un fragmento de conformidad con la reivindicación l(ii), caracterizado porque el polipéptido comprende o consiste de los aminoácidos 25-174, los aminoácidos 26-180, los aminoácidos 33-166, o los aminoácidos 41-189 de la SEQ ID No.: 18, o los aminoácidos 25-206 de la SEQ ID No.: 24, y es una lipocalina
3. Un polipéptido que es un equivalente funcional de conformidad con la reivindicación l(iii), caracterizado porque es homólogo a la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 66 O SEQ ID No.: 70, y es una lipocalina.
4. El polipéptido que es un fragmento o un equivalente funcional como se indica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque tiene más de 80% de identidad secuencial con las secuencias de aminoácidos indicada en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No . : 8, SEQ ID No . : 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No . : 22, SEQ ID No . : 24 O SEQ ID No.: 66 o con un fragmento activo de las mismas, preferentemente mayor de 85%, 90%, 95%, 98.5%, 99% o 99.5% de identidad secuencial.
5. El polipéptido que es un equivalente funcional como se indica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque muestra homología estructural significativa con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No . : 8, SEQ ID No . : 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No . : 14, SEQ ID No . : 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No . : 22, SEQ ID No . : 24, SEQ ID No. : 66 ó SEQ ID No . : 70.
6. El polipéptido que es un fragmento como se indica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 4, caracterizado porque tiene un determinante antigénico en común con el polipéptido de la parte (i) de conformidad con las reivindicación 1, que consiste de 7 o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.: 66 ó SEQ ID No.: 70.
7. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el polipéptido contiene la sustitución de aminoácido N92T y/o G114S.
8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia es indicada en las SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 42, SEQ ID No.: 44, SEQ ID No.: 46, SEQ ID No.: 56, SEQ ID No.: 58 o SEQ ID No.: 60.
9. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación previa.
10. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polipéptido comprende un marcador de histidina.
11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia es indicada en la SEQ ID No.: 28, SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 34, SEQ ID No.: 48, SEQ ID No.: 50, SEQ ID No.: 52, SEQ ID No.: 54, SEQ ID No.: 62, SEQ ID No.: 64, SEQ ID No. : 68 ó SEQ ID No. : 72.
12. Una molécula purificada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas.
13. Una molécula purificada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende o consiste de la secuencia de ácido nucleico como se indica en las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 21. SEQ ID No.: 23, SEQ ID No.: 25, SEQ ID No.: 27, SEQ ID No.: 29, SEQ ID No.: 31, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 35, SEQ ID No.: 37, SEQ ID No.: 39, SEQ ID No.: 41, SEQ ID No.: 43, SEQ ID No.: 45, SEQ ID No.: 47, SEQ ID No.: 49, SEQ ID No.: 51, SEQ ID No.: 53, SEQ ID No.: 55, SEQ ID No.: 57, SEQ ID No.: 59, SEQ ID No.: 61, SEQ ID No.: 63, SEQ ID No.: 65, SEQ ID No.: 67, SEQ ID No.: 69, SEQ ID No.: 71 o SEQ ID No.: 72 o es un equivalente redundante o fragmento del mismo.
14. La molécula purificada de ácido nucleico, caracterizada porque se hibrida bajo condiciones de alta exigencia con una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13.
15. Un vector, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
16. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 15.
17. Un ligando, caracterizado porque se enlaza específicamente a, y preferentemente modula la actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
18. Un ligando de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque es un anticuerpo.
19. Un compuesto, caracterizado porque incrementa o disminuye el nivel de expresión o actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
20. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque se enlaza a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, sin inducir ninguno de los efectos biológicos del polipéptido.
21. El compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es un sustrato natural o modificado, ligando, enzima, receptor o mimético funcional o estructural.
22. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un vector de conformidad con la reivindicación 15, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, un ligando de conformidad con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, o un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, caracterizado porque es para el uso en terapia o diagnóstico de enfermedades.
23. Un método para diagnosticar una enfermedad en un paciente, caracterizado porque comprende la evaluación del nivel de expresión de un gen natural que codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la evaluación de la actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el tejido proveniente del paciente, y comparando el nivel de expresión o actividad a un nivel control, en donde el nivel que es diferente al nivel control, es indicador de la enfermedad.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es llevado a cabo in vi tro .
25. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ligando de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18 con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar el complejo.
26. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra de tejido del paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones estrictas para permitir la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, y la sonda; b) poner en contacto una muestra control con la sonda bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a) ; y detectar la presencia de complejos híbridos en las muestras; en donde la detección de los niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra control, es indicadora de la enfermedad.
27. El método de conformidad con la reivindicación 24 o la reivindicación 25, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una muestra de ácido nucleico proveniente del tejido del paciente, con un cebador de ácido nucleico bajo condiciones estrictas, que permite la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, y el cebador; b) poner en contacto una muestra control con el cebador bajo las mismas condiciones utilizadas en el paso a); y c) amplificar el ácido nucleico muestreado; y d) detectar el nivel de ácido nucleico amplificado proveniente del paciente y las muestras control; en donde la detección de los niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra del paciente, que difieren significativamente de los niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra control, es indicadora de la enfermedad.
28. El método de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de tejido de un paciente que es probado para enfermedad; b) aislar una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 de la muestra de tejido; y c) diagnosticar al paciente para la enfermedad al detectar la presencia de una mutación que está asociada con la enfermedad en la molécula de ácido nucleico como una indicación de la enfermedad.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además la amplificación de la molécula de ácido nucleico para formar un producto amplificado, y detectando la presencia o ausencia de una mutación en el producto amplificado.
30. El método de conformidad con la reivindicación 28 o la reivindicación 29, caracterizado porque la presencia o ausencia de la mutación en el paciente es detectada al poner en contacto la molécula de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que se hibrida a la molécula de ácido nucleico bajo condiciones estrictas para formar una molécula híbrida de doble hebra, la molécula híbrida de doble hebra tiene una porción no hibridada de la hebra de la sonda de ácido nucleico en cualquier porción correspondiente a una mutación asociada con la enfermedad; y detectando la presencia o ausencia de una porción no hibridada de la hebra de la sonda, como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada a la enfermedad.
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, caracterizado porque la enfermedad incluye, pero no está limitada a trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, linfoma cutáneo de células T, carcinoma de células escamosas y/o carcinoma de células básales) , infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos) , enfisema, enfermedades de la piel (por ejemplo, una enfermedad de la piel por Thl tal como psoriasis o dermatosis hiperqueratócica; enfermedad cutánea por Th2 tal como dermatitis atópica, dermatitis por contacto, alergia por contacto por ejemplo, hacia el níquel o el oro, linfoma cutáneo y de células T, eczema atópico, eczema agudo y/o eczema crónico) , trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina), disfunción renal, infarto del miocardio, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande, regulación del desarrollo del sistema nervioso, diabetes tipo I, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Grave (tiroiditis), artritis reumatoide, formas proliferativas y crecientes de glumerulonefritis, uveítis posterior, sanado de heridas, y/o sarcoidosis, pitiriasis rubra y/o poroqueratosis, alergias tales como rinitis alérgica, asma, liquen ruber plano, sinusitis crónica, síndrome de Sezary, queratosis actínica, hepatitis C, colitis ulcerativa, glomerulonefritis membranosa y/o infecciones virales.
32. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, como una lipocalina .
33. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un vector de conformidad con la reivindicación 15, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, un ligando de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
34. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
35. Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un vector de conformidad con la reivindicación 14, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, un ligando de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque es para el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una cierta enfermedad que incluye, pero no está limitada a trastornos de la visión (por ejemplo, ceguera noctuARN) , trastornos del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), trastornos inflamatorios, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , proctitis, trastornos proliferativos celulares, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, linfoma cutáneo de células T, carcinoma de células escamosas y/o carcinoma de células básales), infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas y por hongos) , enfisema, enfermedades de la piel (por ejemplo, una enfermedad de la piel por Thl tal como psoriasis o dermatosis hiperqueratócica; enfermedad cutánea por Th2 tal como dermatitis atópica, dermatitis por contacto, alergia por contacto por ejemplo, hacia el níquel o el oro, linfoma cutáneo y de células T, eczema atópico, eczema agudo y/o eczema crónico), trastornos reproductivos (por ejemplo, infertilidad, en particular infertilidad masculina) , disfunción renal, infarto del miocardio, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de la mama quística grande, regulación del desarrollo del sistema nervioso, diabetes tipo I, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Grave (tiroiditis) , artritis reumatoide, formas proliferativas y crecientes de glumerulonefritis, uveítis posterior, sanado de heridas, y/o sarcoidosis, pitiriasis rubra y/o poroqueratosis, alergias tales como rinitis alérgica, asma, liquen ruber plano, sinusitis crónica, síndrome de Sezary, queratosis actínica, hepatitis C, colitis ulcerativa, glomerulonefritis membranosa y/o infecciones virales..
36. Un polipéptido caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un vector de conformidad con la reivindicación 14, una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, un ligando de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27.
37. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque las enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es menor en un paciente enfermo, cuando se comparan niveles de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula hospedera, el ligando, el compuesto o la composición administrada al paciente es un agonista.
38. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque las enfermedades en las cuales la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es mayor en un paciente enfermo, cuando se comparan niveles de expresión o actividad en un paciente saludable, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula hospedera, el ligando, el compuesto o la composición administrada al paciente es un antagonista.
39. El método para monitorizar el tratamiento terapéutico de una enfermedad en un paciente, caracterizado porque comprende el monitoreo en un periodo de tiempo del nivel de expresión o actividad de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en el tejido del paciente, en donde la alteración del nivel de expresión o actividad sobre el periodo de tiempo hacia un nivel de control, es indicador de la regresión de la enfermedad.
40. Un método para la identificación de un compuesto que es efectivo en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedad, caracterizado porque comprende poner en contacto un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, con uno o más compuestos sospechosos de poseer actividad de enlace para la molécula de polipéptido o de ácido nucleico, y la selección de un compuesto que se enlaza específicamente a la molécula de ácido nucleico o el polipéptido.
41. Un kit útil para diagnosticar la enfermedad, caracterizado porque comprende un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para utilizar la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad.
42. El kit de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende además un tercer recipiente que mantiene un agente para digerir el ácido ribonucleico (ARN) no hibridado.
43. Un kit, caracterizado porque comprende un arreglo de moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales es una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
44. Un kit, caracterizado porque comprende uno o más anticuerpos que se enlazan a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y un reactivo útil para la detección de una reacción de enlace entre el anticuerpo y el polipéptido.
45. Un animal no humano transgénico o suprimido en un gen, caracterizado porque ha sido transformado para expresar niveles más altos, más bajos o ausentes de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
46. Un método caracterizado porque es para seleccionar un compuesto efectivo para tratar una enfermedad, caracterizado porque se pone en contacto un animal transgénico no humano de conformidad con la reivindicación 45, con un compuesto candidato, y determinando el efecto del compuesto sobre la enfermedad del animal.
47. El uso de un polipéptido INSP181 como un objetivo para seleccionar fármacos candidatos para tratar o prevenir un trastorno relacionado a la lipocalina.
48. Un método para seleccionar compuestos biológicamente activos, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un compuesto candidato con células hospederas recombinantes que expresan un polipéptido INSP181; (b) seleccionar los compuestos que se enlazan al polipéptido INSP181 en la superficie de las células y/o que modulan la actividad del polipéptido INSP181.