CN111979249B

CN111979249B - 一种特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体及其应用

Info

Publication number: CN111979249B
Application number: CN202010736118.6A
Authority: CN
Inventors: 高顺祥; 吴继红; 张圣海; 孙兴怀
Original assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Current assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: CN111979249A

Abstract

本发明涉及眼科学领域，具体是一种特异性结合脂质运载蛋白‑1(LCN 1)的核酸适配体及其应用。本发明通过磁珠SELEX技术筛选，得到了一组与LCN 1特异性结合的高亲和力核酸适配体，并通过截短和构建高稳定的迷你发夹结构等优化策略进一步改善核酸适配体的性能。本发明的核酸适配体具有广阔的应用前景，可用于临床样品中LCN 1的捕获、体内外LCN 1的检测、眼病中LCN 1治疗药物的开发及靶向给药系统的构建等，为LCN 1相关的检测技术的开发、临床诊断方法的发展和核酸药物的研发提供了有效的工具。

Description

一种特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明涉及眼科学领域，具体地说，是一种特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体及其应用。

背景技术

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最严重的微血管并发症之一,现已成为全球工作年龄人群第一位的致盲性眼病。由于DR的发病机制十分复杂，迄今为止临床上尚无有效的根治方法，唯有通过早期的诊断和干预才能有效降低其致盲风险。目前，临床上DR常用的诊断方法主要包括眼底检查、眼底血管造影、光学相干断层扫描和电生理等。尽管这些诊断方法各有优势，但往往需要通过多种技术进行联合诊断，且更倾向于DR的确诊和病情的评估，难以满足临床早期诊断的需求。

脂质运载蛋白-1(lipocalin-1，LCN 1)是DR特异的生物标志物，其在泪液中的浓度与DR的发生发展具有显著的计量依赖关系。据多个研究团队的报导，将泪液来源的LCN 1作为DR的诊断靶点，具有无创、便捷、易获得和特异性高等优势，可为DR的筛查、早期诊断、干预和治疗提供帮助。

目前亟需解决的问题是获得一种与LCN 1特异性结合的高亲和力靶向识别分子。核酸适配体是一种功能类似于抗体的ssDNA或RNA，它是通过体外筛选的SELEX技术从随机核酸文库中获得的寡核苷酸片段。与抗体相比，核酸适配体作为一种新型的靶向识别分子具有显著的优势，例如：可体外筛选获得而不需要免疫动物，不易受pH、温度等环境因素影响而变性，可通过化学合成制备、改造与标记，免疫源性低，组织渗透性强等。在分子识别方面，核酸适配体具有更高的特异性，它能够识别分辨结构类似物之间单个基团的差别，尤其适合于临床疾病标志物的检测应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的核酸适配体。本发明的另一目的是提供该核酸适配体在制备LCN 1检测试剂、试剂盒或传感器中；在制备LCN 1捕获、分离和纯化的制剂中；在制备LCN 1诊断工具、靶向给药系统、中和或阻断药物中等多方面的应用。

本发明通过SELEX技术筛选得到一种特异性结合LCN 1的高亲和力核酸适配体，并通过截短和构建高稳定的迷你发夹结构等优化策略进一步改善核酸适配体的结合亲和力、靶向特异性和结构稳定性等，为临床样品中LCN 1的捕获、体内外LCN 1检测试剂的制备、眼病中LCN 1靶向给药系统的构建及治疗药物的开发提供了一种亲和力高、特异性强、稳定性好、易于制备和修饰的生物识别分子。

为了实现上述目的，本发明的主要技术方案是：(1)通过磁珠SELEX技术筛选得到一种特异性结合LCN 1的核酸适配体；(2)通过截短优化获得该核酸适配体的核心序列；(3)通过构建高稳定的迷你发夹结构进一步改善该核酸适配体的性能。

本发明的第一方面，提供一种特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.8(表1)所示。

表1：核酸适配体序列及其结合亲和力

本发明的第二方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在制备脂质运载蛋白-1(LCN 1)检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。

本发明的第三方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在制备脂质运载蛋白-1(LCN 1)捕获、分离和纯化制剂中的应用。

本发明的第四方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在开发糖尿病视网膜病变早期诊断新方法中的应用。

进一步的，所述的早期诊断新方法是基于上述核酸适配体对脂质运载蛋白-1(LCN1)高亲和力的结合作用，可用于糖尿病视网膜病变的早期快速诊断。

本发明的第五方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在制备糖尿病视网膜病变早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

进一步的，所述的早期诊断试剂或试剂盒通过上述核酸适配体对LCN 1高亲和力的结合作用，检测泪液中的脂质运载蛋白-1(LCN 1)浓度，用于糖尿病视网膜病变的早期快速诊断。

本发明第六方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在构建眼病靶向给药系统中的应用。

进一步的，所述的靶向给药系统是基于上述核酸适配体对脂质运载蛋白-1(LCN1)强特异性的识别作用，用于药物的靶向运输和定点释放等。

本发明第七方面，提供如上所述的特异性结合脂质运载蛋白-1(LCN 1)的高亲和力核酸适配体在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用。

进一步的，所述的药物通过中和或阻断LCN 1，可以缓解或者治疗LCN 1介导的糖尿病视网膜病变等临床疾病。

本发明优点在于：

1、本发明将LCN 1蛋白固定在磁珠表面，通过磁珠SELEX技术进行核酸适配体的筛选，获得一组特异性结合LCN 1的高亲和力核酸适配体，并通过序列截短和构建迷你发夹结构等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的亲和力、特异性和结构稳定性等性能。

2、本发明的核酸适配体作为特异性识别并结合LCN 1的分子识别工具，具有稳定性好、亲和力高、特异性强、免疫原性低、制备成本低、易修饰和标记等优势。可用于临床样品中LCN 1的捕获、体内外LCN 1的检测、眼病中LCN 1治疗药物的开发及靶向给药系统的构建等，具有广阔的应用前景，为LCN 1相关的检测技术的开发、临床诊断方法的发展和核酸药物的研究提供了有效的工具。本发明的核酸适配体面向实际应用具有巨大的潜力。

附图说明

图1.磁珠SELEX技术筛选示意图。

图2.结合LCN 1的ssDNA回收率。

图3.核酸适配体与LCN 1的结合解离曲线。

图4.核酸适配体二级结构的预测图。

图5.核酸适配体APT12T与LCN 1的结合解离曲线。

图6.核酸适配体APT12TM与LCN 1的结合解离曲线。

图7.核酸适配体APT12TM与生物标志物结合的相对信号图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.LCN 1在磁珠表面的固定

LCN 1蛋白主要通过C端的His标签固定在磁珠表面，其具体过程为：(a)取20μL的Dynabeads^TMHis-Tag Isolation&Pulldown磁珠用200μL的筛选缓冲液(1mM MgCl₂ in1xPBS，pH 7.2)冲洗数次；(b)将5μg的LCN 1蛋白溶解于200μL的筛选缓冲液中，并加入到上述漂洗好的20μL的磁珠中，室温旋转孵育30分钟；(c)孵育结束后，用筛选缓冲液漂洗3次，并重悬于20μL的筛选缓冲液中，4℃保存。

实施例2.ssDNA文库及其引物的构建

随机ssDNA文库：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N₄₀-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′(SEQID No.9)，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N₄₀代表长度为40个核苷酸的随机序列。上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′(SEQ ID No.10)；下游引物：5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ ID No.11)；修饰的下游引物：5′-poly(dA20)-Spacer18-TTCA CGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ ID No.12)。

实施例3.LCN 1核酸适配的筛选

如图1所示，为了获得与LCN 1特异性结合的高亲和力核酸适配体，共进行了8轮筛选。其筛选的协议详见表2，具体筛选过程为：(a)取20μL LCN 1磁珠，加入封闭缓冲液(含0.1mg/ml yeast tRNA,1mg/mL BSA的筛选缓冲液)室温旋转孵育15min后，用筛选缓冲液漂洗2次；(b)将一定量的ssDNA文库，于95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置10min后，加入到已封闭的磁珠中，室温旋转孵育；(c)孵育结束后，用200μL的筛选缓冲液漂洗磁珠数次，磁性分离，去除未结合的ssDNA后，加入100μL的无菌水，95℃水浴10min，回收上清液中的ssDNA，并进行定量，监测筛选的富集情况；(d)将洗脱下来的ssDNA作为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：10μL的

Hot start premix(5x)；2.5μL的上、下游引物(10μM)；5μL的模板；最后加入无菌水，补充体系至50μL，共40管。扩增条件为：94℃，预变性1min；95℃，变性30s；60℃，退火30s；72℃，延伸30s；最后72℃，再延伸2min；共20个循环；(e)向扩增好的PCR文库中加入尿素变性的上样缓冲液，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min后，上样到12％尿素变性的聚丙烯酰氨凝胶孔中，在300V恒定电压下电泳；(f)电泳结束后，通过核酸荧光染料对凝胶进行染色；(e)在荧光灯下，回收下端ssDNA凝胶至2mL的试管中，并加入1.5mL的ddH₂O，沸水煮胶30min，离心回收上清液；(f)通过

II试剂盒浓缩和纯化上清液中的ssDNA，并重溶于筛选缓冲液中进行下一轮的筛选。

为了提高筛选的效率，从第5轮开始引入反向磁珠进行负筛选，即将变复性处理好的文库先与50μL的空白磁珠孵育15min，以消除非特异性结合磁珠载体的ssDNA。随后，将回收的上清液与LCN 1磁珠进一步孵育。同时，为了提高筛选的特异性，在正向孵育体系中逐步加入游离的反向靶分子，包括LCN 2，HAS，SEMA3A和sIgA等进行同孵育。根据上面的筛选过程重复进行，至第8轮时，ssDNA的回收率显著增加(如图2)。因此，停止筛选，将富集的文库进行高通量测序，获得了多条如表1所示的核酸适配体。

表2：磁珠SELEX技术筛选的协议

实施例4.生物膜干涉技术测定分子间相互作用

生物膜干涉技术是一种免标记的分子间相互作用的分析方法。其原理是仪器发射白光到传感器表面，光通过传感器的生物膜层后会发生透射与反射，反射光的频率会受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光与入射光会产生相长干涉，而另一些受到了相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到，形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相对位移强度显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度。即当固定在传感器生物膜上的核酸适配体与溶液中的LCN 1结合时，引起生物膜层厚度增加，因而产生相对位移，这个相对位移随着LCN 1结合量的增减而增减，最后达到一个平衡状态并实时给出相应的结合曲线、解离曲线和亲和力常数。具体的实施过程为：(a)将生物素标记的核酸适配体用筛选缓冲液溶解并稀释至1μM，于95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置10min；(b)将筛选缓冲液、核酸适配体、LCN 1蛋白和筛选缓冲液依次分别加入到96孔板中(各200μL)，链霉亲和素包被的生物传感器按照仪器设定的程序依次浸入到各反应孔中，经过平衡1.5min，核酸适配体固化5min，漂洗1.5min；再次平衡1.5min，结合5min和解离5min六个步骤。结果如图3所示，核酸适配体APT12、APT29、APT33、APT55、APT71、APT82与LCN 1结合的亲和力常数分别为48.22、163.7、248.9、197.1、84.61、100.3nM。

实施例5.核酸适配体优化与鉴定

为了能够进一步改善核酸适配体的性能，序列截短和构建高稳定的迷你发夹结构等优化策略分别被引进。如图4所示，基于Mfold在线预测，核酸适配体APT12含有三个茎环结构。茎环1，2或者3分别被截去，仅有APT12T保持一致的结合亲和力(49.9nM，图5)，这可能是由于茎环2和3折叠成靶向结合LCN 1的必须空间结构。因此，通过截短优化策略，我们获得了仅有26个核苷酸组合的核酸适配体的核心序列APT12T。通过定点突变，在茎环2和3处构建了高稳定的迷你发夹结构。如图6和图7所示，核酸适配体APT12TM与LCN 1的结合亲和力被显著增加至21.4nM，且具有高的靶向特异性。这可能是由于核酸适配体APT12TM结构稳定性的增加，使APT12TM与LCN 1结合更加致密，导致了两者的结合亲和力和靶向特异性被显著改善。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

<120> 一种特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体及其应用

<130> /

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

acggtggagc gcacgctatg ccgaattgtc ggcgcaccgg 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gtacccatcc aggtcggcct aacacttgtt ggtggtggac 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ttcatttccc cttgaaagtg gagtcataac taagccatct 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tatcgggtca tgggtatagg agtgcgggag cggctgtgga 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gaggatctgt ctaggttgac cgtttgtccc tgatggagga 40

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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tggttgggct aggggagtac aatttcggtt cggcttggac 40

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

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<210> 9

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(60)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

agcagcacag aggtcagatg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

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<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

ttcacggtag cacgcatagg 20

Claims

1.特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.7-8所示。

2.如权利要求1所述的特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体在制备脂质运载蛋白-1检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。

3.如权利要求1所述的特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体在制备脂质运载蛋白-1捕获、分离和纯化制剂中的应用。

4.如权利要求1所述的特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体在制备糖尿病视网膜病变早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的早期诊断试剂或试剂盒通过所述的核酸适配体对脂质运载蛋白-1的结合作用，检测临床样品中的脂质运载蛋白-1含量，用于糖尿病视网膜病变的早期快速诊断。

6.如权利要求1所述的特异性结合脂质运载蛋白-1的核酸适配体在构建眼病靶向给药系统中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的靶向给药系统是基于所述的核酸适配体对脂质运载蛋白-1的识别作用，用于药物的靶向运输和定点释放。