CN115976029A

CN115976029A - 与gdf15特异性结合的适配体及其应用

Info

Publication number: CN115976029A
Application number: CN202211724297.7A
Authority: CN
Inventors: 高顺祥; 李倩; 吴继红; 孙兴怀; 张圣海
Original assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Current assignee: Eye and ENT Hospital of Fudan University
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，与GDF15特异性结合的适配体，其序列通式为：5’‑AGCAGCACAGAGGTCAGATG‑N₄₀‑CCTATGCGTGCTACCGTGAA‑3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量，优选为如SEQ ID NO.1～4任一条所示的序列。本发明的适配体具有广阔的应用前景，可用于体系中的GDF15捕获、体内外的GDF15检测以及相关疾病中的GDF15治疗药物的开发和靶向给药系统的构建等。本发明的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。

Description

与GDF15特异性结合的适配体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及眼科生物医药工程技术领域，具体涉及一种与生长分化因子15(GDF15)特异性结合的适配体及其应用。

背景技术

青光眼是一组以视乳头萎缩及凹陷、视野缺损及视力下降为共同特征的神经退行性疾病。据统计，2020年全球约有8000万青光眼患者，青光眼具有发病隐匿，早期诊断困难，视功能损害不可逆等特性。青光眼的早筛查、早诊断和早干预可以有效阻断或者延缓病情进展，从而能够保护患者免受严重的视力丧失。

目前，青光眼诊断主要通过眼压测量、形态学及功能学检查进行综合评估。但眼内压在患者与患者之间存在巨大差异，而形态学和功能学检查往往是在患者的视觉功能损害达到50％以上才能准确诊断。因此，青光眼的早期诊断一直都是该领域研究的热点和难点。生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15)是一种与青光眼视神经损伤相关的特征性生物标志物。大量研究已证实，眼内液中GDF15的水平与青光眼的发生发展具有显著的剂量依赖关系。通过精准监测GDF15，将会为青光眼的筛查、诊断和干预提供帮助。

目前亟需解决的问题是获得一种特异性识别GDF15的分子工具。适配体作为一种新型的生物识别分子，能够特异识别并高亲和力的结合靶标。它通常是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponentialenrichment,SELEX)，从随机核酸文库中获得的ssDNA或RNA分子。适配体由于可化学合成、易于标记和修饰、免疫原性和毒性低、亲和力高、特异性强等优势，可用于特定靶标的捕获、检测和成像，以及相应的治疗药物的研发和靶向给药系统的构建等，在分析、诊断和医药等多个领域中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供一种与GDF15特异性结合的适配体及其应用。

本发明的目的在于提供多条能够与GDF15高亲和力、强特异性结合的单链DNA适配体。首先筛选得到适配体APT1和APT2，并对该两条适配体与GDF15之间的亲和力进行测试，得到亲和力常数(K_D)值最低的一条适配体APT2。

本发明的第二目的在于以截短的方式对适配体APT2进行优化，提供结合能力更优，但是长度更短的GDF15适配体APT2T。它不但保持对GDF15高的识别特异性，而且结合亲和力由原来的9.2nM增加至1.07nM。

本发明的第三目的在于对适配体APT2T继续进行优化。为了进一步提高适配体的结构稳定性，我们对APT2T进行了定点突变，获得了适配体APT2TM。与APT2T相比，APT2TM不仅折叠成了更高稳定性的G-四聚体结构，而且它保持了对GDF15一致的结合强度和特异性。

本发明的第四目的在于提供适配体的应用，如适配体在制备GDF15分离富集试剂中的应用，在制备GDF15检测试剂、试剂盒或传感器中的应用，在制备诊断、缓解或治疗GDF15介导的疾病药物中的应用，如青光眼的早期筛查和快速诊断以及治疗。

为了实现上述目的，本发明的主要技术方案是：(1)通过磁珠SELEX技术筛选，获得了靶向GDF15的高特异性适配体APT1和APT2；(2)通过截短优化，得到了靶向GDF15的高特异性、高亲和力适配体APT2；(3)通过突变优化，得到了靶向GDF15的高特异性、高亲和力和高稳定性适配体APT2TM。具体技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了与GDF15特异性结合的适配体，该适配体的序列通式为：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N₄₀-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。

通过磁珠-SELEX技术筛选，得到如下代表性序列：

APT1：ACTAGGTCAGGATACTGTTGCGCACGCCCAGAGTTATCTA(SEQ IDNO.1)；

APT2：TGAGGCGAGTAGGATAGGGTATGGGATGGGTTCGTTGCAC(SEQ IDNO.2)。

本发明的第二方面，以截短的方式对适配体APT2进行优化，提供结合能力更优，但是长度更短的适配体APT2T：GGATAGGGTATGGGATGGG(SEQ ID NO.3)。

本发明的第三方面，对适配体APT2进行突变优化，获得了适配体APT2TM：GGGTAGGGTATGGGATGGG(SEQ ID NO.4)。与APT2T相比，APT2TM不仅折叠成了更高稳定性的G-四聚体结构，而且它保持了对GDF15一致的结合强度和特异性。

优选的，上述适配体APT2TM或APT2T或APT2，可以在其3’端或5’端进行生物素、FITC和巯基等化学修饰。

本发明的第四方面，提供了适配体的应用，选自如下任一种情形：

(1)提供上述适配体在制备GDF15检测试剂、试剂盒或传感器中的应用；

(2)提供上述适配体在制备GDF15捕获、分离和纯化制剂中的应用。

(3)提供上述适配体在开发致盲性眼病诊断新方法中的应用。所述的诊断新方法是基于上述适配体对GDF15的结合作用，可用于青光眼的早期筛查和快速诊断。

(4)提供上述适配体在构建靶向给药系统中的应用。所述的靶向给药系统是基于上述适配体对GDF15的识别作用，可用于药物的靶向运输和定点释放。

(5)还提供了上述适配体在制备核酸药物中的应用。该药物是基于上述适配体对GDF15的中和或阻断作用，可用于缓解或者治疗GDF15所介导的相关疾病。

本发明的第五方面，提供了一种与GDF15特异性结合的适配体的药物组合物，以与GDF15特异性结合的适配体作为活性成份，还包括医学上可接受的药物载体。

优选的，药物组合物为青光眼的早期筛查和快速诊断的制剂。

本发明的药物组合物和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的适配体核心序列的构像完整性，同时还能保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

本发明的有益保障及效果：

1.本发明将GDF15固定在磁珠表面，通过磁珠SELEX技术的筛选，获得了一组高特异性识别GDF15的适配体。该筛选技术具有操作简便、重复性高等特点，大大简化了构建技术路线，生产成本低、纯化周期短。适配体作为一种新型分子识别探针，具有成本低廉、性质稳定和方便修饰等优点，适宜于在生物医药工业化生产中大规模应用。

2.本发明通过截短和突变等方案的优化，进一步改善了适配体的结合亲和力，靶向特异性和结构稳定性等性能。

3.本发明的适配体作为GDF15的分子识别工具，具有亲和力高、特异性强、稳定性好、免疫原性低、制备成本低、易于修饰和标记等优势。可用于体系中GDF15的捕获、体内外GDF15的检测以及相关疾病中GDF15所介导的治疗药物开发和靶向给药系统的构建等。

因此，本发明的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。

附图说明

图1为磁珠SELEX技术筛选示意图。

图2为结合GDF15的ssDNA回收率。

图3为适配体APT1的结合解离曲线。

图4为适配体APT2的结合解离曲线。

图5为适配体二级结构的预测图。

图6为适配体APT2T的结合解离曲线。

图7为适配体APT2TM的结合解离曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.适配体筛选文库及其引物的构建

1.构建长度为80个核苷酸的ssDNA文库

5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N₄₀-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′(SEQ IDNO.5)；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N₄₀代表长度为40个核苷酸的随机序列。

2.引物的构建

上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′(SEQ ID NO.6)；

下游引物1：5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ ID NO.7)；

下游引物2：

5′-poly(dA20)-Spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ ID NO.8)。

实施例2.GDF15适配体的筛选

如图1所示，为了获得与GDF15特异性结合的高亲和力适配体，我们通过EDC/NHS化学耦合的方式将GDF15蛋白固定在磁珠表面后，共进行了10轮筛选。为了提高筛选的效率，从第5轮开始引入空白磁珠进行反向筛选，并在正向体系中逐步加入竞争性的反向靶标，包括BSA、HSA、GTX、ATP、LCN1和BDNF等进行共孵育，以进一步提高筛选的特异性。

具体筛选过程为：(1)取50μL的GDF15磁珠，用筛选缓冲液(含2mM MgCl₂的PBS，pH7.2)漂洗数次后，加入封闭缓冲液(含0.1mg/ml yeast tRNA和1mg/mL BSA的筛选缓冲液)孵育30分钟。(2)将ssDNA文库溶解于筛选缓冲液，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置10min后，加入到已封闭的GDF15磁珠中，室温低速旋转进行孵育。(3)孵育结束后，先用筛选缓冲液漂洗数次，去除未结合的ssDNA，再加入100μL的无酶水，在95℃水浴10min后，回收与GDF15特异性结合的ssDNA。(4)将洗脱下来的ssDNA作为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：10μL的Hot start premix(5x)；2.5μL的上、下游引物(10μM)；5μL的模板；最后加入无菌水，补充体系至50μL，共40管。扩增条件为：94℃，预变性1min；95℃，变性30s；60℃，退火30s；72℃，延伸30s；最后72℃，再延伸2min；共20个循环。(5)向扩增好的PCR文库中加入尿素变性的上样缓冲液，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min后，上样至12％尿素变性的聚丙烯酰氨凝胶孔中，在300V恒定电压下进行电泳。(6)电泳结束后，在干净的平皿中加入20ml ddH₂O和5μL核酸荧光染料，充分混匀后将凝胶放置其中，在水平摇床上轻轻震荡。(7)染色5-10min后，将凝胶放置在荧光成像系统上，切割回收下端ssDNA文库至2mL的试管中，加入1.5mL的ddH2O，沸水煮胶30min后，离心回收上清液。(8)通过

II试剂盒回收纯化上清液中的ssDNA，并重溶于筛选缓冲液中进行下一轮筛选。

根据上面的筛选过程重复进行，至第10轮时，ssDNA回收率显著增加(图2)。因此，停止筛选，将富集的文库进行高通量测序和多序列比对分析，最终获得了适配体APT1和APT2。

实施例3.生物膜干涉技术测定分子间相互作用

生物膜干涉技术是一种实时的分子间相互作用的分析方法。其原理是仪器发射白光到传感器表面，光通过传感器的生物膜层后会发生反射，而反射光的频率会受到生物膜层厚度影响。一些频率的反射光与入射光会产生相长干涉，而另一些受到了相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到，形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相对位移强度显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜厚度的变化。即当固定在传感器生物膜上的适配体与溶液中的GDF15发生相互作用时，引起生物膜层厚度改变，因而产生了相对位移，这个相对位移随着GDF15结合量的增减而增减，最后达到一个平衡状态并实时给出相应的结合曲线、解离曲线和亲和力常数。

具体的实施过程为：(a)将生物素标记的适配体用筛选缓冲液溶解后，于95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置10min，促使其形成稳定的空间结构；(b)将200μL的筛选缓冲液、适配体、GDF15蛋白和筛选缓冲液依次分别加入到96孔板中；(c)链霉亲和素包被的传感器按照仪器设定的程序依次浸入到各反应孔中，经过传感器平衡，适配体固化，漂洗，GDF15(或者HSA，BSA)结合和解离五个步骤。结果如图3和图4所示，适配体APT1和APT2均能够高亲和力、强特异性的结合GDF15，且结合亲和力常数分别为28和9.2nM。

实施例4.适配体优化与鉴定

为了进一步改善适配体的性能，截短和突变等优化策略分别被引入。如图5所示，基于QGRS预测，适配体APT2能够形成G-四聚体结构。通过截断G-四聚体两端冗余的序列，产生了G-四聚体的核心结构序列APT2T。它不但保持对GDF15高的识别特异性，而且结合亲和力增加至1.07nM(图6)。为了进一步提高适配体的结构稳定性，我们对APT2T进行了定点突变，获得了适配体APT2TM。与APT2T相比，APT2TM不仅折叠成了更高稳定性的G-四聚体结构，而且它保持了对GDF15一致的结合强度和特异性(图7)。此外，适配体APT2TM还显示出对大鼠来源的GDF15蛋白的高亲和力，且结合亲和力常数为8.38nM。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于，所述适配体的序列通式为：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N₄₀-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。

2.根据权利要求1所述的与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于：

其中，所述适配体的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中任一条所示。

3.根据权利要求1所述的与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于：

其中，所述适配体的序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4中任一条所示。

4.权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体在制备GDF15捕获、分离、纯化制剂或构建GDF15靶向给药系统中的应用。

5.权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体在制备GDF15检测或诊断试剂、试剂盒或传感器中的应用。

6.权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体在构建GDF15靶向给药系统中的应用。

7.权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体在制备诊断、缓解或者治疗GDF15所介导的相关疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

其中，所述疾病为致盲性眼病，

所述药物是以与GDF15特异性结合的适配体作为唯一活性成份或者是包含与GDF15特异性结合适配体的药物组合物。

9.含有如权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体的药物组合物，以与GDF15特异性结合的适配体作为活性成份，还包括医学上可接受的药物载体。

10.根据权利要求9所述的与GDF15特异性结合的适配体的药物组合物，其特征在于：

其中，所述药物组合物为青光眼的早期筛查和快速诊断的制剂。