KR20050111346A - 분비 단백질 계통 - Google Patents

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크리스틴 파워
멜라니에 요르케
리차드 조셉 파간
데이비드 미칼로비크
이안 멕켄드릭
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아레스 트레이딩 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 SECFAM1 계통이라고 하는 신규한 계통의 분비 단백질; 125-153개 아미노산 길이와 8개 보존된 시스테인 잔기를 보유하는 외피 성장 인자(EGF) 폴드-보유 도메인을 포함하는 분비 단백질로서 확인된 신규한 단백질 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117을 비롯한 상기 계통의 구성원; 질병의 진단, 예방, 치료에서 이들 단백질 및 인코딩 유전자로부터 유래된 핵산 서열의 용도에 관한다.

Description

분비 단백질 계통{SECRETED PROTEIN FAMILY}
본 발명은 SECFAM1 계통이라고 하는 신규한 계통의 분비 단백질; 125-153개 아미노산 길이와 8개 보존된 시스테인 잔기를 보유하는 외피 성장 인자(EGF) 폴드-보유 도메인을 포함하는 분비 단백질로서 확인된 신규한 단백질 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117을 비롯한 상기 계통의 구성원; 질병의 진단, 예방, 치료에서 이들 단백질 및 인코딩 유전자로부터 유래된 핵산 서열의 용도에 관한다.
본원에 언급되고 있는 모든 공보, 특허 및 출원은 참고문헌으로 첨부된다.
약물 개발 과정은 기능적 유전체학 시대가 도래하여 근본적으로 혁명 과정을 겪고 있다. “기능적 유전체학”이란 관심이 있는 단백질 서열에 기능을 부여하기 위해 생체 정보 도구를 이용하는 접근 방법에 이용된다. 이런 도구는 서열 데이터를 만드는 속도가 단백질 서열에 기능을 부여하기 위한 연구실의 능력을 너무 빨리 앞지르기 때문에 그 필요성이 점차 증가되고 있다.
생체 정보 도구는 능력 및 정확도가 크기 때문에, 생화학적 특징을 가지는 통상의 기술에 신속하게 대체되고 있다. 또한, 본 발명을 확인하는데 이용되는 진보된 생체 정보 도구는 더 높은 신뢰도를 부여할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.
다양한 연구 기관 및 상업 조직에서는 이들이 이용할 수 있는 서열을 검사하고, 진행 단계에서 상당한 발견을 하고 있다. 하지만, 연구 및 약물 개발을 목적으로 유전자 및 이들이 인코딩하는 폴리펩티드를 확인하고 추가 특성화하는 작업이 지속적으로 요구된다.
도입
분비된 단백질
세포가 세포외 단백질을 만들고 분비하는 능력은 많은 생물학적 과정에 중심한다. 효소, 성장 인자, 세포외 매트릭스 단백질, 신호전달 분자는 모두 세포에 의해 분비된다. 이는 혈장 막과의 분비 소포의 융합을 통하여 진행된다. 대부분의 경우에, 단백질은 소포체(endoplasmic reticulum)를 지향하고 단일 펩티드에 의해 분비성 소포로 이동된다. 신호 펩티드는 세포질로부터 분비 소포와 같은 막에 결합된 격실로 폴리펩티드 사슬을 운반하는데 영향을 주는 cis-작용 서열이다. 분비성 소포를 표적으로 하는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로 분비되거나 혈장 막에 유지된다. 혈장 막에 유지되는 폴리펩티드는 하나 이상의 막통과 도메인을 보유한다. 세포의 기능에 중요하는 역할을 하는 분비 단백질의 예로는 사이토킨, 호르몬, 세포외 매트릭스 단백질(흡착 단백질), 프로테아제, 생장 및 분화 인자등이 있다.
EGF 도메인-보유 단백질
상피 성장 인자(EGF)-유사 단백질은 EGF 수용체(EGF-R) 계통의 구성원을 활성화시킴으로써 세포의 분화를 자극한다(Yarden et al., Eur J Cancer. 2001 Sep; 37 Suppl 4:S3-81). EGF는 이황화 결합의 형성에 관여하는 6개 보존된 시스테인의 별개 모티프를 보유하는 짧은 펩티드이다. 실제로, 상기 모티프는 다양한 기능의 여러 상이한 단백질에서 발견된다(Davis et al., New Biol. 1990 May; 2(5): 410-9). 이런 도메인이 명확한 기능적 결론을 도출할 만큼 기능적으로 다양한 유형의 단백질에서 발견될 수 있긴 하지만, 모든 EGF 도메인(프로스타글란딘 G/H 합성효소 제외)은 막-결합 단백질의 세포외 도메인, 또는 세포외 매트릭스로 분비되는 것으로 알려져 있는 단백질 내에서 발견된다. EGF 도메인은 단백질 사이의 상호작용에 관여하기 때문에, 결합되지 않은 단백질의 표면에 노출된 소수성 잔기의 대부분을 보유하는 것으로 알려져 있다. 고도로 보존된 시스테인 패턴을 갖는 상기 도메인은 선충류에서부터 인간까지 폭넓은 스펙트럼의 생물체에서 신호전달과 조절 현상에 중요한 역할을 수행한다. EGF 도메인은 조직 회복과 혈액 인자 응고의 조절에서부터 여러 유형의 인간 종양의 성장과 발생과 관련된 과정에 관여한다. 후자의 경우에, EGF-유사 단백질은 EGF 신호전달 경로의 구성원을 활성화시킴으로써 세포의 분화를 자극한다(Yarden et al., Eur J Cancer, 2001 Sep; 37 Suppl 4: S3-S1). 이런 관찰에 기인하여, 종양 진행에서 이들의 역할은 항암 치료 전략의 수행에서 많은 주목을 받고 있으며, 상기 분야에서 최근의 신규한 치료제는 EGF 신호전달 경로의 간섭에 기초하고 있다(Waksal et al., Cancer Metastasis Rev. 1999; 18(4): 427-36).
이런 이유로, 이들 도메인에 관한 지식은 상기한 질병 상태 및 연관된 질병 상태를 초래하는 기초 경로의 이해를 증진하고, 이들 질환을 치료하는데 더욱 효과적인 유전자 및/또는 약물 치료제를 개발하는데 극히 중요하다.
본원에서는 완전히 신규한 계통의 분비 단백질의 확인을 상술한다. 분비 단백질 리간드의 정의는 특정 세포로부터 분비되고, 동계 수용체와 하류 신호 전달 경로의 활성을 조절함으로써 동일 및/또는 다른 세포에서 표현형적 반응을 유도하는 단백질이다. 이미 공지된 분비 단백질 리간드 계통의 실례는 당단백질 호르몬 계통이다.
난포-자극 호르몬(FSH)은 당단백질 호르몬 계통의 구성원이다. 남성에서, FSH는 뇌하수체의 소뇌전엽 세포에 의해 분비되고 혈류에 들어가며, 이후 고환의 Sertoil 세포에서 동계 수용체와 결합하여 정자형성 과정을 조절한다. 여성에서, FSH는 난소의 난포막 세포, 간질 세포, 과립층 세포에서 수용체에 결합하여 배란을 조절한다. FSH 결핍은 남성과 여성 모두에서 불임 문제를 초래할 수 있다. 단백질 치료제의 형태로 FSH 투여에 의한 FSH 수준의 회복은 FSH-유인된 불임을 극복하는데 이용될 수 있다. FSH는 GONAL-fTM(Serono)으로 구입가능하다.
이런 실례와 유사하게, 신규한 분비 리간드 단백질 계통의 확인은 신규한 리간드-수용체 경로의 서술 및 리간드 결합의 표현형적 결과의 설명을 가능하게 한다. 인간 질환이 신규한 분비 리간드 단백질 계통에서 임의의 구성원의 기능장애에 의해 발생하는 것으로 확인되면, 상기 구성원을 단백질 치료제로서 투여하여 상기 질환을 극복할 수 있다.
도 1: INSP113 폴리펩티드(SEQ ID NO:2), INSP114 폴리펩티드(SEQ ID NO:6), INSP115 폴리펩티드(SEQ ID NO:10), INSP116 폴리펩티드(SEQ ID NO:14), INSP117 폴리펩티드(SEQ ID NO:26) 및 생쥐(AK049880.1, chr6_예측 - SEQ ID NO:31, chr1O_예측 - SEQ ID NO:32, AK078681, BAC41130.1, AAH15306.1), 쥐(chr2_예측 - SEQ ID NO:33, chr4_예측 - SEQ ID NO:34), 짧은꼬리원숭이(BAB60784.1), 가시복(골격_3581 예측 - SEQ ID NO:35)로부터 유래된 이들의 오쏘로그를 비롯한 SECFAM1 계통에서 전체 15개 폴리펩티드 서열의 ClustalW 정렬.
도 2: INSP113(SEQ ID NO:2)에 대한 SignalP 신호 펩티드 예측. 신호 펩티드 확률: 0.994. 최대 절단 부위 확률: 25와 26번 위치 사이에 0.400.
도 3: INSP114(SEQ ID NO:6)에 대한 SignalP 신호 펩티드 예측. 신호 펩티드 확률: 0.969. 최대 절단 부위 확률: 30과 31번 위치 사이에 0.713.
도 4: INSP115(SEQ ID NO:10)에 대한 SignalP 신호 펩티드 예측. 신호 펩티드 확률: 0.931. 최대 절단 부위 확률: 42와 43번 위치 사이에 0.274.
도 5: INSP116(SEQ ID NO:14)에 대한 SignalP 신호 펩티드 예측. 신호 펩티드 확률: 0.908. 최대 절단 부위 확률: 34와 35번 위치 사이에 0.374.
도 6: INSP117(SEQ ID NO:26)에 대한 SignalP 신호 펩티드 예측. 신호 펩티드 확률: 0.989. 최대 절단 부위 확률: 30과 31번 위치 사이에 0.748.
도 7: CAD28501.1(INSP113 폴리펩티드; SEQ ID NO:2)로 조회이후 Genome Threader 출력.
도 8: CAD38865.1(INSP114 폴리펩티드; SEQ ID NO:6)로 조회이후 Genome Threader 출력.
도 9: XP_08726.1(INSP116 폴리펩티드; SEQ ID NO:14)로 조회이후 Genome Threader 출력. I
도 10: INSP117(SEQ ID NO:26)로 조회이후 Genome Threader 출력.
도 11: AAY53016(INSP115; SEQ ID NO:10)을 이용한 계통 데이터베이스에 대한 BLASTP로부터 상위 15개 결과 및 AAY53016(INSP115; SEQ ID NO:10)과 INSP114(SEQ ID NO:6) 사이에 BLASTP에 의해 산출된 정렬.
도 12: INSP113(SEQ ID NO:2)과 상위 적중 구조 1WHE 사이의 Genome Threader 정렬. 4개의 보존된 이황화 결합 형성 시스테인은 쿼리 서열(하위 열)의 96, 101, 107, 118번 위치에서 관찰된다. 시스테인 98과 109는 구조 1WHE에 의해 규정된 바와 같이 보존된 이황화 결합쌍을 나타낸다.
도 13: INSP117(SEQ ID NO:26) 주위에 구축된 SECFAM1 계통 단백질의 프로필.
도 14: INSP117에서 44 내지 129번 아미노산(정렬(도 1)에서 52-138번 아미노산)으로부터 획득된 PROSITE 형식의 계통 공통 서열. 기호표: - = 각 정렬 위치 사이의 스페이서; G=100% 보존된 G 잔기; [VI] = 상기 정렬 위치에서 V 또는 I; P(0,1) = 상기 정렬 위치에서 1회 관찰되거나 전혀 관찰되지 않는 P 잔기.
도 15: INSP113 예측의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 16: 프라이머 INSP113-CP1과 INSP113-CP2를 이용하여 클론된 INSP113 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 17: 프라이머 INSP113-CP1과 INSP113-CP2를 이용하여 클론된 INSP113sv PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 18: pCR4-TOPO-INSP113의 유전자 지도.
도 19: pCR4-TOPO-INSP113sv의 유전자 지도.
도 20: pDONR 221의 유전자 지도.
도 21: 발현 벡터 pEAK12d의 유전자 지도.
도 22: 발현 벡터 pDEST12.2의 유전자 지도.
도 23: pENTR-INSP113-6HIS의 유전자 지도.
도 24: pENTR-INSP113sv-6HIS의 유전자 지도.
도 25: pEAK12d-INSP113-6HIS의 유전자 지도.
도 26: pEAK12d-INSP113sv-6HIS의 유전자 지도.
도 27: pDEST12.2-INSP113-6HIS의 유전자 지도.
도 28: pDEST12.2-INSP113sv-6HIS의 유전자 지도.
도 29: PCR 프라이머의 위치를 보여주는 코딩 서열의 INSP114 서열 및 이의 번역.
도 30: 프라이머 INSP114-CP1과 INSP114-CP2를 이용하여 클론된 INSP114 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 31: pCR4-TOPO-INSP114의 유전자 지도.
도 32: INSP 114 cds의 뉴클레오티드 정렬 및 IMAGE 클론 1616371(종결 코돈 보유)의 상응하는 영역.
도 33: INSP114 cds의 아미노산 정렬 및 IMAGE 클론 1616371의 상응하는 영역.
도 34: RACE 반응에 이용된 프라이머 쌍의 위치를 보여주는 클론된 INSP114-GR1 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 35: pCR4-TOPO-INSP114-GR1의 유전자 지도.
도 36: 프라이머 INSP114-CP3과 INSP114-CP4를 이용하여 클론된 INSP114-SV2 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 37: pCR4-TOPO-INSP114-SV2의 유전자 지도.
도 38: pDONR 221의 유전자 지도.
도 39: 발현 벡터 pEAK12d의 유전자 지도.
도 40: 발현 벡터 pDEST12.2의 유전자 지도.
도 41: pENTR_INSP114-6HIS의 유전자 지도.
도 42: pEAK12d_INSP114-6HIS의 유전자 지도.
도 43: pDEST12.2_INSP114-6HIS의 유전자 지도.
도 44: pENTR_INSP114-SV1-6HIS의 유전자 지도.
도 45: pEAK 12d_INSP114-SV1-6HIS의 유전자 지도.
도 46: pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS의 유전자 지도.
도 47: pENTR_INSP114-SV2-6HIS의 유전자 지도.
도 48: pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS의 유전자 지도.
도 49: pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS의 유전자 지도.
도 50: cds의 INSP115 서열과 이의 번역.
도 51: pDONR 221의 유전자 지도.
도 52: 발현 벡터 pEAK12d의 유전자 지도.
도 53: 발현 벡터 pDEST12.2의 유전자 지도.
도 54: pENTR_INSP115-6HIS의 유전자 지도.
도 55: pEAK 12d_INSP115-6HIS의 유전자 지도.
도 56: pDEST12.2_INSP115-6HIS의 유전자 지도.
도 57: cds의 INSP116 서열 및 이의 번역.
도 58: pDONR 221의 유전자 지도.
도 59: 발현 벡터 pEAK 12d의 유전자 지도.
도 60: 발현 벡터 pDEST12.2의 유전자 지도.
도 61: pENTR_INSP116-6HIS의 유전자 지도.
도 62: pEAK12d_INSP116-6HIS의 유전자 지도.
도 63: pDEST12.2_INSP116-6HIS의 유전자 지도.
도 64: INSP117 예측 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 65: 프라이머 INSP117-CP1과 INSP117-CP2를 이용하여 클론된 INSP117 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 이의 번역.
도 66: pCRII-TOPO-INSP117의 유전자 지도.
도 67: pDONR 221의 유전자 지도.
도 68: 발현 벡터 pEAK12d의 유전자 지도.
도 69: 발현 벡터 pDEST12.2의 유전자 지도.
도 70: pENTR_INSP117-6HIS의 유전자 지도.
도 71: pEAK12d_INSP117-6HIS의 유전자 지도.
도 72: pDEST12.2_1:NSP117-6HIS의 유전자 지도.
본 발명은 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드가 분비단백질, 바람직하게는 EGF-유사 도메인 보유 분비 단백질이 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 발견에 기초한다. 종합하면, INSP113, MSP114, INSP115, INSP116, INSP117은 SECFAM1 계통 단백질로서 확인된 단백질의 일부를 구성한다.
SECFAM1 계통 단백질의 주석
본 발명의 단백질은 공개된 주석이 없고, 신호 펩티드의 형태로 강한 분비 단백질 신호를 보유하며, 다른 동물 종으로부터 오쏘로그(orthologue)에 의해 뒷받침되는 유사 단백질로 집합될 수 있다. 추가적인 검사에서 5가지 인간 유전자(INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117)로 구성되고, 포유동물과 어류 오쏘로그를 비롯한 총 15개의 서열을 포함하는 아직 특성화되지 않은 계통의 단백질이 확인되었다. 이들 서열 모두 가변적인 구성의 강한 신호 펩티드를 보이는데, 서열의 나머지 부분은 높은 수준의 유사성을 보인다. 전체적으로, 인간 서열 내에서 서열 상동성은 보존된 장기의 강한 프로필과 49% 또는 그 이상이다(도 1). 관련된 서열의 이런 클러스터는 이후 “SECFAM1 계통”이라 한다.
본 발명의 제 1 특징에서는 SECFAM1 계통의 구성원을 확인하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 번역된 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열의 데이터베이스를 검색하여 아래의 서열 프로필과 대응(matching)되는 폴리펩티드 서열을 확인하는 단계를 포함한다:
여기서, NCBI(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11, gap extension penalty=1]에 의해 명시된 디폴트 파라미터를 이용하여 상기 프로필을 검색 프로그램 BLAST에 쿼리 서열로서 입력하는 경우에, SECFAM1 계통의 구성원은 1O-2 이하의 E 값을 보유한다.
따라서, “SECFAM1 계통의 구성원”은 상기한 파라미터를 이용한 BLAST에 쿼리 서열로서 이용되는 경우에 1O-2의 최대 임계 E 값으로 상기한 프로필을 충족하는 펩티드 서열로 해석된다. 적절하게는, 폴리펩티드 서열은 1O-5 이하, 1O-10 이하, 1O-50 이하, 가장 바람직하게는 1O-70 이하의 최소 임계 E 값을 보유한다. 가령, 계통 구성원 INSP113은 본 발명의 제 1 특징의 프로필에 비하여, 발생된 E 값이 4e-80이다. E 값은 무작위로 데이터베이스에서 발견되는 더욱 우수하거나 동등한 대응의 기대수를 나타내거나, 또는 대응이 무작위로 발생하는 가능성으로 기술된다. 따라서, 모든 적중(hit)은 E-값에 따라 정렬되고, E 값은 각 서열 위치에서 가용한 후보의 총수(아미노산의 경우 20개), 서열이나 대응 영역의 길이, 검색된 데이터베이스의 크기에 좌우된다. 이런 이유로, SECFAM1 계통의 구성원과 같은 짧은 서열은 2개의 긴 서열에서 비교되는 대응보다 큰 E-값을 보유하게 된다.
상기 프로필은 신포 서열과 EGF-유사 도메인의 존재를 고려한다. 이런 프로필은 EGF-유사 도메인에 비하여 신호 펩티드 영역의 아미노산 서열(아미노산 1-30)에서 더욱 높은 수준의 변이성을 가능하게 한다. 본 명세서에서 “변이성”은 아미노산 서열 사이의 유사성과 동일성의 정도에 관한다. 이는 본 발명에서 확인된 SECFAM1 계통의 15개 구성원에서 발견되는 상황을 반영한다. EGF-유사 도메인에서 15개 구성원에 의해 공유되는 높은 수준의 유사성은 EGF-유사 도메인이 분자의 중요한 기능에 관여한다는 것을 암시한다. 상기 도메인이 별로 중요하지 않다면, 구성원 사이에 보존의 수준이 그다지 높지 않을 것이다.
검색되는 번역 핵산 서열의 데이터베이스에는 cDNA, EST, mRNA, 전체 또는 게놈 데이터베이스로부터 유래된 번역 핵산 서열이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 제 2 특징에서는
i) NCBI(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11, gap extension penalty=1]에 의해 명시된 디폴트 파라미터를 이용하여 하기 프로필을 검색 프로그램 BLAST에 쿼리 서열로서 입력하는 경우에, 1O-2 이하의 E 값을 보유하는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 이런 폴리펩티드 서열로 구성되는 분리된 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 분리된 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 분리된 폴리펩티드를 제시한다.
적절하게는, 상기한 검사에서, 폴리펩티드는 1O-2의 최대 임계 E 값을 제공한다. 적절하게는, 폴리펩티드 서열은 1O-5 이하, 1O-10 이하, 1O-50 이하, 가장 바람직하게는 1O-70 이하의 최소 임계 E 값을 보유한다. 임계값의 저하는 신호 펩티드와 EGF-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 전체 배경 폴리펩티드 서열로부터 분리하기 위한 더욱 엄격한 필터로서 기능한다.
본 발명의 제 2 특징의 세 번째 구체예에서는
(i) 공통 아미노산 서열을 충족하는 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 분리된 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 분리된 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 2 특징의 네 번째 구체예에서는 공통 아미노산 서열을 충족하는 폴리펩티드로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제시한다:
본 발명의 제 2 특징의 다섯 번째 구체예에서는 본 발명의 제 2 특징의 세 번째 구체예의 분리된 폴리펩티드를 제시하는데, 상기 분리된 폴리펩티드는 공통 아미노산 잔기의 아미노산 위치 55, 60, 66, 77에서 1개 이상, 바람직하게는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 세 번째와 네 번째 구체예의 아미노산 서열은 PROSITE(단백질 부위와 패턴) 표시법으로 기록되는데, 여기서 아미노산은 1문자 코드로 표시된다(Bairoch, A., Bucher, P., Hofmann, K.,(1997). The PROSITE Database: Its status in 1997. Nucl. Acids Res. 25, 217-221). 간단히 말하면, 아래의 공식: A(1)-x(i1,j1)-A2-x(i2,j2)-....Ap-1-x(ip-1,jp-1)-Ap을 포함하는 펩티드는 아래의 방식으로 해석된다.
A(k)는 하나의 아미노산, 예를 들면, C, 또는 일단의 아미노산, 예를 들면, [ILVF]를 명시하는 구성 요소이다. 구성요소 A(k)는 하나의 아미노산(가령, C 또는 L)을 명시하는 경우에 동일한 구성 요소, 또는 하나이상의 아미노산(가령, [ILVF] 또는 [FWY])을 명시하는 경우에 불명료 구성요소이다. i(k), j(k)는 모든 k에서 i(k)<=j(k)인 정수이다. 인수 x(ik,jk)는 ik와 jk 무작위 아미노산 사이의 패턴 대응의 와일드카드 영역이다. 와일드카드 영역 x(ik,jk)는 jk가 ik보다 큰 경우(가령, x(2,3))에 ‘융통성’이 있다. 이런 영역의 융통성은 jk-ik.br>이다. 가령, x(2,3)의 융통성은 1이다. 와일드카드 영역은 j(k)가 i(k)와 동일한 경우(가령, x(2,2) 또는 x(2))에 고정된다. 한 패턴에 대한 융통성 산물은 상기 패턴에서 융통성 와일드카드 영역의 융통성 산물이다. 가령, C-x(2)-H는 2가지 구성 요소(C와 H) 및 하나의 고정된 와일드카드 영역을 보유하는 패턴이다. 이는 C; 2개의 무작위 아미노산; H를 순차적으로 보유하는 임의의 서열에 대응된다. 아미노산 서열 ChgHyw와 liChgHlyw는 이런 공식에 포함된다. C-x(2,3)-H는 2가지 구성 요소(C와 H) 및 하나의 융통성 와일드카드 영역을 보유하는 패턴이다. 이는 C; 2개 또는 3개의 무작위 아미노산; H를 순차적으로 보유하는 임의의 서열, 예를 들면, aaChgHywk와 liChgaHlyw에 대응된다. C-x(2,3)-[ILV]는 2가지 구성 요소(C와 [ILV]) 및 하나의 융통성 와일드카드 영역을 보유하는 패턴이다. 이는 C; 2개 또는 3개의 무작위 아미노산; I, L 또는 V를 순차적으로 보유하는 임의의 서열에 대응된다.
본 발명의 상기 구체예에 열거된 서열은 INSP117(SEQ ID NO:26) 아미노산 위치 44-129(정렬의 아미노산 52-138, 도 1)로부터 높은 동일성 영역을 커버한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, 본 발명의 상기한 구체예의 폴리펩티드 모두 신호 펩티드를 포함하는 것으로 가정된다. 따라서, 신호 펩티드가 부재하는 상기한 폴리펩티드의 성숙 형태는 본 발명의 다른 특징을 형성한다.
본 발명의 제 3 특징의 한 구체예에서는
(i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 및/또는 SEQ ID NO:39에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 3 특징의 두 번째 구체예에서는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 및/또는 SEQ ID NO:39에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제시한다.
SEQ ID NO:2(수탁 번호 CAD28501.1)에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP113 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP113 폴리펩티드의 첫 25개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하는 INSP113 전장 폴리펩티드 서열 및 신호 서열을 포함하지 않는 INSP113 전장 폴리펩티드 서열은 각각 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 열거된다. SEQ ID NO:4에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP113 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:37에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 INSP113 폴리펩티드의 절단접합 변이체이며, 이후 “INSP113sv 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP113sv 폴리펩티드의 첫 25개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP113sv 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:39에 열거된다. SEQ ID NO:39에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP113sv 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징의 두 번째 구체예의 항원 결정부위, 단편 또는 기능성 등가물은 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 96, 101, 107, 118에서 4개의 시스테인 잔기 중에서 하나 이상을 포함한다. 더욱 적절하게는, 이들 시스테인 잔기 중에서 하나 이상이 생리 조건하에 이황화 결합 형성에 참여한다. 본 명세서에서, “생리 조건”은 자연형 또는 야생형의 폴리펩티드가 발견되는 자연 환경을 의미한다. 이황화 결합 형성은 단백질의 정확한 형태 및 이의 기능에 필수적이다. 이런 이유로, 이들 시스테인 잔기는 반드시 보존되어야 한다.
본 발명의 제 3 특징의 세 번째 구체예에서는
(i) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:53 및/또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 3 특징의 네 번째 구체예에서는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:53 및/또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제시한다.
SEQ ID NO:6(수탁 번호 CAD38865.1)에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP114 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP114 폴리펩티드의 첫 30개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP114 전장 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:8에 열거된다. SEQ ID NO:8에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP114 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:41에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 INSP114 폴리펩티드의 절단접합 변이체이며, 이후 “INSP114-SV2 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP114-SV2 폴리펩티드의 첫 30개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP114-SV2 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:43에 열거된다. SEQ ID NO:43에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP114-SV2 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:53에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 INSP114 폴리펩티드의 절단접합 변이체이며, 이후 “INSP114-SV1 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP114-SV1 폴리펩티드의 첫 30개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP114-SV1 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:55에 열거된다. SEQ ID NO:55에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP114-SV1 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징의 네 번째 구체예의 항원 결정부위, 단편 또는 기능성 등가물은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:41 또는 SEQ ID NO:53의 아미노산 위치 96, 101, 107, 118에서 4개의 시스테인 잔기 중에서 하나 이상을 포함한다. 더욱 적절하게는, 이들 시스테인 잔기 중에서 하나 이상이 생리 조건하에 이황화 결합 형성에 참여한다. 이황화 결합 형성은 단백질의 정확한 형태 및 이의 기능에 필수적이다. 이런 이유로, 이들 시스테인 잔기는 반드시 보존되어야 한다.
본 발명의 제 3 특징의 다섯 번째 구체예에서는
(i) SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:45 및/또는 SEQ ID NO:47에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 3 특징의 여섯 번째 구체예에서는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:45 및/또는 SEQ ID NO:47에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제시한다.
SEQ ID NO:12(수탁 번호 AAY53016)에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP115 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP115 폴리펩티드의 첫 42개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP115 전장 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:12에 열거된다. SEQ ID NO:12에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP115 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:45에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP115 클론된 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP115 클론된 폴리펩티드의 첫 45개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP115 클론된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:47에 열거된다. SEQ ID NO:47에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP115 클론된 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징의 여섯 번째 구체예의 항원 결정부위, 단편 또는 기능성 등가물은 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:45의 아미노산 위치 97, 102, 108, 119에서 4개의 시스테인 잔기 중에서 하나 이상을 포함한다. 더욱 적절하게는, 이들 시스테인 잔기 중에서 하나 이상이 생리 조건하에 이황화 결합 형성에 참여한다. 이황화 결합 형성은 단백질의 정확한 형태 및 이의 기능에 필수적이다. 이런 이유로, 이들 시스테인 잔기는 반드시 보존되어야 한다.
본 발명의 제 3 특징의 일곱 번째 구체예에서는
(i) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:49 및/또는 SEQ ID NO:51에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 3 특징의 여덟 번째 구체예에서는 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:49 및/또는 SEQ ID NO:51에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제시한다.
SEQ ID NO:14(수탁 번호 XP_087261.1)에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP116 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP116 폴리펩티드의 첫 34개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP116 전장 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:16에 열거된다. SEQ ID NO:16에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP116 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:49에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP116 클론된 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP116 클론된 폴리펩티드의 첫 36개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP116 클론된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:51에 열거된다. SEQ ID NO:51에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP116 클론된 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징의 여덟 번째 구체예의 항원 결정부위, 단편 또는 기능성 등가물은 SEQ ID NO:14 또는 SEQ ID NO:49의 아미노산 위치 105, 110, 116, 127에서 4개의 시스테인 잔기 중에서 하나 이상을 포함한다. 더욱 적절하게는, 이들 시스테인 잔기 중에서 하나 이상이 생리 조건하에 이황화 결합 형성에 참여한다. 이황화 결합 형성은 단백질의 정확한 형태 및 이의 기능에 필수적이다. 이런 이유로, 이들 시스테인 잔기는 반드시 보존되어야 한다.
본 발명의 제 3 특징의 아홉 번째 구체예에서는
(i) SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 및/또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징에 따른 폴리펩티드는
(i) SEQ ID NO:26 및/또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 3 특징의 열 번째 구체예에서는 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 및/또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제시한다.
적절하게는, 본 발명의 제 3 특징의 아홉 번째 구체예의 항원 결정부위, 단편 또는 기능성 등가물은 SEQ ID NO:26의 아미노산 위치 98, 103, 109, 120에서 4개의 시스테인 잔기 중에서 하나 이상을 포함한다. 더욱 적절하게는, 아미노산 위치 98과 109에서 시스테인 잔기가 생리 조건하에 이황화 결합을 형성한다. 이런 이유로, 이들 시스테인 잔기는 반드시 보존되어야 한다. 본 발명의 상기 구체예에서 4개의 시스테인 잔기는 SEQ ID NO:26과 1WHE에 대한 유사 서열을 비교함으로써 확인하였다(도 12).
SEQ ID NO:18에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 엑손 1 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:20에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 엑손 2 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:22에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 엑손 3 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:24에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 엑손 4 폴리펩티드”라고 한다.
SEQ ID NO:26에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 폴리펩티드”라고 한다.
본 발명은 특정 이론에 한정되지 않지만, INSP117 엑손 1 폴리펩티드의 첫 30개 아미노산은 신호 펩티드를 구성하는 것으로 가정된다. 신호 서열을 포함하지 않는 INSP117 엑손 1과 전장 폴리펩티드 서열은 각각 SEQ ID NO:28과 SEQ ID NO:30에 열거된다. SEQ ID NO:28에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 엑손 1 성숙 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:30에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후 “INSP117 성숙 폴리펩티드”라고 한다.
본 명세서에서 “INSP117 엑손 폴리펩티드”는 INSP117 엑손 1 폴리펩티드, INSP117 엑손 2 폴리펩티드, INSP117 엑손 1 성숙 폴리펩티드, INSP117 엑손 3 폴리펩티드, INSP117 엑손 4 폴리펩티드, INSP117 폴리펩티드 또는 INSP117 성숙 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 INSP117 엑손 1 폴리펩티드, INSP117 엑손 2 폴리펩티드, INSP117 엑손 1 성숙 폴리펩티드, INSP117 엑손 3 폴리펩티드, INSP117 엑손 4 폴리펩티드, INSP117 폴리펩티드 또는 INSP117 성숙 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드를 포괄한다.
본 명세서에서 “INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드” 및 “INSP113, INSP114, INSP115, INSP116 또는 INSP117 폴리펩티드”는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 및/또는 SEQ ID NO:55에 열거된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다.
본 발명의 제 1 특징에서 이미 설명한 바와 같이, EGF-유사 도메인을 포함하는 신규한 단백질의 확인은 이런 도메인이 여러 유형의 종양, 특히, 인간 질환과 종양의 성장과 발생을 비롯한 폭넓은 질환에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다는 점에서 유용하다.
적절하게는, 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징에 따른 폴리펩티드는 EGF 도메인 보유 단백질 계통, 바람직하게는 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이며, “응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는”은 폴리펩티드가 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하고, 이런 활성이 CC-케모킨과 유사한 TAFA 계통에 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것을 의미한다(참조: Tang, Y.T. et al., TAFA: A novel secreted family with homology to CC-chemokines', Genbank record AAP92046, http://harvester.embl.de/harvester/Q7Z5/Q7Z5A7.htm; Tang et al., 'TAFA: a novel secreted family with conserved cysteine residues and restricted expression in the brain', Genomics. 2004 Apr; 83(4):727-34). 폴리펩티드가 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 지를 결정하기 위한 검사법은 실시예 17과 18에 제시한다.
본 발명의 제 4 특징에서는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 정제된 핵산 분자를 제시한다.
적절하게는, 정제된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1(INSP 113 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:3(INSP113 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:5(INSP114 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:7(INSP114 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:9(INSP115 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:11(INSP115 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:13(INSP116 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:15(INSP116 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:17(INSP117 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:19(INSP117 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:21(INSP117 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:23(INSP117 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:25(INSP117 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:27(INSP117 성숙 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:29(INSP117 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:36(INSP113sv 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:38(INSP113sv 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:40(INSP114-SV2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:42(INSP114-SV2 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:44(INSP115 클론된 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:46(INSP115 클론된 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:48(INSP116 클론된 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:50(INSP116 클론된 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:52(INSP114-SV1 폴리펩티드를 인코딩) 및/또는 SEQ ID NO:54(INSP114-SV1 성숙 폴리펩티드를 인코딩)에 열거된 핵산 서열을 포함하거나 이들 서열의 잉여 등가물 또는 단편이다.
본 발명은 적절하게는, 정제된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1(INSP 113 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:3(INSP113 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:5(INSP114 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:7(INSP114 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:9(INSP115 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:11(INSP115 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:13(INSP116 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:15(INSP116 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:17(INSP117 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:19(INSP117 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:21(INSP117 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:23(INSP117 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:25(INSP117 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:27(INSP117 성숙 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:29(INSP117 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:36(INSP113sv 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:38(INSP113sv 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:40(INSP114-SV2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:42(INSP114-SV2 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:44(INSP115 클론된 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:46(INSP115 클론된 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:48(INSP116 클론된 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:50(INSP116 클론된 성숙 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:52(INSP114-SV1 폴리펩티드를 인코딩) 및/또는 SEQ ID NO:54(INSP114-SV1 성숙 폴리펩티드를 인코딩)에 열거된 핵산 서열로 구성되거나 이들 서열의 잉여 등가물 또는 단편인 정제된 핵산 분자를 제시한다.
본원에서 SEQ ID NO:52와 SEQ ID NO:54에 열거된 서열은 종결 코돈을 보유하지 않지만, 본 명세서에서 SEQ ID NO:52와 SEQ ID NO:54는 종결 코돈을 보유하는 SEQ ID NO:52와 SEQ ID NO:54에 열거된 서열을 보유하는 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 유사하게, 종결 코돈을 보유하지 않는 본원에 열거된 다른 SEQ ID NO는 종결 코돈을 보유하는 서열을 포괄한다.
본 발명의 이런 특징의 한 구체예에 따라, 정제된 핵산 분자는 INSP117 엑손 1 폴리펩티드의 시작 지점에 위치한 신호 펩티드(SEQ ID NO:18의 아미노산 1 내지 30)를 배제한다. 상기 구체예에 따라, 정제된 핵산 분자는 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 91 내지 115(SEQ ID NO:27, INSP117 엑손 1 성숙 폴리펩티드를 인코딩) 또는 SEQ ID NO:25의 뉴클레오티드 91 내지 402(SEQ ID NO:29, INSP117 성숙 폴리펩티드를 인코딩)를 포함한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 91 내지 115(SEQ ID NO:27, INSP117 엑손 1 성숙 폴리펩티드를 인코딩) 또는 SEQ ID NO:25의 뉴클레오티드 91 내지 402(SEQ ID NO:29, INSP117 성숙 폴리펩티드를 인코딩)로 구성되는 정제된 핵산 분자를 제시한다.
본 발명의 제 5 특징에서는 높은 엄밀도 조건하에 본 발명의 제 4 특징의 핵산 분자와 혼성화되는 정제된 핵산 분자를 제시한다.
본 발명의 제 6 특징에서는 본 발명의 제 4 도는 제 5 특징의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터를 제시한다. 바람직한 벡터는 pCR4-TOPO-INSP113(도 18), pCR4-TOPO-INSP113sv(도 19), pDONR(도 20), pEAK12d(도 21), pDEST12.2(도 22), pENTR-INSP113-6HIS(도 23), pENTR-INSP113sv-6HIS(도 24), pEAK12d-INSP113-6HIS(도 25), pEAK12d-INSP113sv-6HIS(도 26), pDEST12.2-INSP113-6HIS(도 27), pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(도 28), pCR4-TOPO-INSP114(도 31), pCR4-TOPO-INSP114-GR1(도 35), pCR4-TOPO-INSP114-SV2(도 36), pDONR 221(도 38), pEAK12d(도 39), pDEST12.2(도 40), pENTR_INSP114-6HIS(도 41), pEAK12d_INSP114-6HIS(도 42), pDEST12.2_INSP114-6HIS(도 43), pENTR_INSP114-SV1-6HIS(도 44), pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(도 45), pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(도 46), pENTR_INSP114-SV2-6HIS(도 47), pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(도 48), pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(도 49), pDONR 221(도 51), pEAK12d(도 52), pDEST12.2(도 53), pENTR_INSP115-6HIS(도 54), pEAK12d_INSP115-6HIS(도 55), pDEST12.2_INSP115-6HIS(도 56), pDONR 221(도 58), pEAK12d(도 59), pDEST12.2(도 60), pENTR_INSP116-6HIS(도 61), pEAK12d_INSP116-6HIS(도 62), pDEST12.2_INSP116-6HIS(도 63), pCRII-TOPO-INSP117(도 66), pDONR 221(도 67), pEAK12d(도 68), pDEST12.2(도 69), pENTR_INSP117-6HIS(도 70) , pEAK12d_INSP117-6HIS(도 71), pDEST12.2_INSP117-6HIS(도 72) 등이다.
본 발명의 제 7 특징에서는 본 발명의 제 6 특징의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제시한다.
본 발명의 제 8 특징에서는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 EGF 보유 단백질 계통의 구성원에 특이적으로 결합하는 리간드를 제시한다. 적절하게는, 리간드는 EGF 도메인-보유 계통 단백질의 구성원인 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드의 기능을 저해한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 리간드는 자연이나 변형된 기질, 효소, 수용체, 소형 유기 분자를 비롯한 다양한 형태, 예를 들면, 최대 2000Da, 바람직하게는 800Da 이하의 소형 자연이나 합성 유기 분자, 펩티드유사체, 무기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 이들의 구조적 또는 기능적 유사체로 존재한다.
본 발명의 제 9 특징에서는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현을 변형하거나 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드의 활성을 조절하는데 유효한 화합물을 제시한다.
본 발명의 제 9 특징의 화합물은 유전자의 발현 수준 또는 폴리펩티드의 활성 수준을 증가(항진) 또는 감소(길항)한다.
중요하게는, INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 기능 확인은 질병의 치료 및/또는 진단에 유효한 화합물을 확인할 수 있는 스크리닝 방법의 설계를 가능하게 한다. 본 발명의 제 8과 제 9 특징에 따른 리간드와 화합물은 이런 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 이들 방법은 본 발명의 특징에 포함된다.
본 발명의 제 10 특징에서는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이 관여하는 질병의 치료 또는 진단에 이용되는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 4 또는 제 5 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 6 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 7 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 8 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 9 특징의 화합물을 제시한다. 이런 질환에는 불임을 비롯한 생식 질환; 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측색 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병리학적 이상이 포함된다. 적절하게는, 질환은 EGF 도메인 보유 단백질이 관여하는 질환이다. 이들 분자는 이런 질환의 치료를 위한 약물의 제조에도 사용될 수 있다. 이들 분자는 피임, 또는 불임을 비롯한 생식 장애의 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명의 제 11 특징에서는 환자에서 질병을 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이런 환자로부터 얻은 조직에서 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준, 또는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드의 활성 수준을 평가하고, 상기 발현 또는 활성 수준을 대조 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다. 적절하게는, 이런 방법은 시험관내에서 수행된다. 유사한 방법을 이용하여 환자에서 질병의 치료 과정을 모니터할 수 있는데, 시간의 추이에서 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현이나 활성 수준의 대조 수준으로의 변화는 질병의 퇴행을 암시한다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 검출하는데 적합한 방법은 (a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에 본 발명의 제 8 특징의 리간드, 예를 들면, 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고, (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 제 11 특징에 따른 다양한 이런 방법, 예를 들면, 짧은 프로브와의 핵산 혼성화 방법, 점 돌연변이 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 비정상적 단백질 수준을 검출하는 항체를 이용한 방법이 존재한다. 유사한 방법을 이용하여 환자에서 질병의 치료 과정을 단기 또는 장기적으로 모니터할 수 있다. 또한, 본 발명은 질병을 진단하는 이들 방법에 유용한 키트를 제시한다.
본 발명의 제 12 특징에서는 EGF 도메인 보유 단백질로서 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드의 용도를 제시한다. EGF 도메인 보유 단백질로서 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 용도는 세포 성장, 대사 또는 분화의 조절인자로서 용도; 수용체/리간드 쌍의 일부로서 용도; 생리학적 또는 병리학적 상태에 대한 진단 마커로서 용도이다.
본 발명의 제 13 특징에서는 제약학적으로 수용가능한 담체와 공동으로, 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 4 또는 제 5 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 6 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 7 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 8 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 9 특징의 화합물을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.
본 발명의 제 14 특징에서는 질병의 진단 또는 치료를 위한 약물의 제조에 사용되는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 4 또는 제 5 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 6 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 7 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 8 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 9 특징의 화합물을 제시한다.
본 발명의 제 15 특징에서는 환자에서 질병을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 4 또는 제 5 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 6 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 7 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 8 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 9 특징의 화합물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현, 또는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드의 활성이 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준에 비하여 병든 환자에서 저하되는 질환의 경우에, 환자에게 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물은 항진제이다. 역으로, 자연 유전자의 발현, 또는 폴리펩티드의 활성이 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준에 비하여 병든 환자에서 증가되는 질환의 경우에, 환자에게 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물은 길항제이다. 이런 길항제의 실례는 안티센스 핵산 분자, 리보자임, 리간드, 예를 들면, 항체이다.
본 발명을 실시하는데 이용할 수 있는 표준 기술 및 과정은 아래에 요약하였다. 인지하는 바와 같이, 본 발명에서 설명하고 있는 방법, 프로토콜, 세포 주, 벡터 및 시약에 국한되지 않는다. 본 명세서에 이용되는 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
본 명세서에서는 뉴클레오티드 및 핵산에 대하여 표준 약어를 이용한다.
본 발명은 달리 명시하지 않는 경우에, 당분야에 공지된 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학의 통상적인 기술을 이용하여 실시한다.
이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 설명되고 있다. 적절한 참고 문헌에는 Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition(1989); DNA Cloning, Volumes I and 11(D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture(R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); the Methods in Enzymology series(Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes,(1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition(Springer Verlag, N.Y.); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986) 등이 포함된다.
본 명세서에서 “폴리펩티드”는 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합(가령, 펩티드와 올리고펩티드)에 의해 서로 연결된 임의의 펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 폴리펩티드 용어에는 짧은 사슬(펩티드 및 올리고펩티드)과 긴 사슬(단백질)이 모두 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 성숙한 단백질 형태이거나 또는 pre-, pro-, prepro- 부분의 절단으로 활성화되면 활성 성숙 폴리펩티드를 생산할 수 있는 pre-, pro- , prepro- 단백질 형태이다. 이런 폴리펩티드에서, pre-, pro-, prepro- 서열은 리더, 분비 서열이거나 또는 성숙한 폴리펩티드 서열의 정제에 이용되는 서열이다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드는 융합 단백질 형태의 일부를 형성할 수도 있다. 가령, 분비 또는 리더 서열, pro-서열, 정제에 도움이 되는 서열, 또는 예로써 재조합 생산동안 좀더 높은 단백질 안정성을 공여하는 서열을 비롯한 한가지 이상의 추가 아미노산을 포함하는 것이 유리하다. 대안으로, 성숙한 폴리펩티드를 다른 화합물, 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(가령, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합시킬 수도 있다.
폴리펩티드에는 20개 유전자를 인코딩하는 아미노산 이외의 아미노산도 포함될 수 있는데, 이들 아미노산은 자연적인 공정, 예를 들면 번역후 가공 또는 당분야에 공지된 화학적 변형 기에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 통상적으로 존재할 수 있는 이런 공지의 변형에는 글리코실화반응, 지질 부착, 설페이션, 예로써 글루타민산 잔기의 감마-카르복실화반응, 수산화반응, ADP-리보실화반응 등이 포함된다. 다른 가능한 변형에는 아세틸화반응, 아실화반응, 아미데이션, 플라빈의 공유 부착, 헤미(haeme) 잔기의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-연결, 고리화반응, 이황화결합 형성, 디메틸화반응, 공유 교차 연결의 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화반응, GPI 고정기 형성, 요오드화반응, 메틸화반응, 미리스톨화반응, 산화, 단백분해 공정, 포스포릴화반응, 프레닐화반응, 라셈화반응, 세리노일화반응, 아르기닐화와 같은 t-RNA 매개된 아미노산의 단백질에 추가 및 유비퀴닌화반응 등이 포함된다.
폴리펩티드의 모든 위치, 예를 들면 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단에도 변형이 일어날 수 있다. 사실, 폴리펩티드에서 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양 말단 모두의 공유 변형에 의한 차단은 자연 발생 폴리펩티드와 합성 폴리펩티드에서 공통한데, 이런 변형은 본 발명의 폴리펩티드에도 존재한다.
폴리펩티드에서 일어날 수 있는 변형은 폴리펩티드가 어떻게 만들어지는 가에 따라 달라진다. 재조합에 의해 만들어진 폴리펩티드의 경우에, 상당 부분에서 변형의 성질과 정도는 특정 숙주 세포의 번역후 변형 능력 및 목적 폴리펩티드 아미노산 서열에 존재하는 변형 신호에 의해 결정된다. 가령, 상이한 유형의 숙주 세포간에 글리코실화 반응 패턴이 변한다.
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 이런 폴리펩티드에는 자연 발생 폴리펩티드(예를 들면, 세포 배양물로부터 정제된 분리 폴리펩티드), 재조합에 의해 만들어진 폴리펩티드(융합 단백질 포함), 합성에 의해 만들어진 폴리펩티드 또는 이들 방법의 복합으로 만든 폴리펩티드 등이 포함된다.
본 발명의 제 3 특징의 기능적으로 등가인 폴리펩티드는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드에 상동성인 폴리펩티드이다. 폴리펩티드의 한 서열이 다른 폴리펩티드의 서열과 동일하거나 유사성이 충분한 경우에, 이들 두 폴리펩티드는 “상동성”이라고 한다. “동일성”이란 배열된 서열의 임의 지점에서 서열간에 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. “유사성”이란 배열된 서열의 임의 지점에서 아미노산 잔기가 유사한 유형임을 의미한다. 서열의 동일성 및 유사성 정도는 용이하게 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1. Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
따라서, 상동성 폴리펩티드에는 천연 생물학적 변이체(가령, 폴리펩티드가 유도된 종내에 대립형질 변이체 또는 지형적 변이체), INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 돌연변이체(아미노산 치환, 결손 및 삽입을 포함하는 돌연변이체) 등이 포함된다. 이런 돌연변이체에는 보존형 또는 비-보존형 아미노산(바람직하게는 보존형 아미노산)에 의해 하나이상의 아미노산이 치환된 폴리펩티드가 포함되는데, 이런 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되거나 인코딩되지 않는다. 전형적으로 이런 치환은 다음의 군내에서 이루어진다; Ala, Val, Leu, Ile; Ser, Thr; 산성 아미노산 잔기 Asp, Glu; Asn, Gln; 염기성 잔기 Lys, Arg; 또는 방향족 잔기 Phe, Tyr. 5 내지 1O개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개 아미노산이 치환, 결손 또는 임의의 조합으로 부가된 변이체가 바람직하다. 특히, 단백질의 성질 및 활성에 변화를 주지 않는 침묵 치환, 추가 및 결실이 바람직하다. 또한, 보존성 치환이 바람직하다. 이런 돌연변이체에는 한가지 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 보유하는 폴리펩티드가 포함된다.
일반적으로, 2개 폴리펩티드간 30%이상의 상동성은 기능적 등가로 간주된다. 적절하게는, 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 기능적 등가 폴리펩티드는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드, 또는 이의 활성 단편과 80%이상의 서열 상동성을 가진다. 좀더 적절하게는, 폴리펩티드는 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%이상의 상동성을 가진다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 기능적 등가 폴리펩티드는 한가지 이상의 구조적 배열 기술을 이용하여 확인된 폴리펩티드일 수도 있다. 가령, BiopendiumTM 검색 데이터베이스를 만드는데 이용되는 검색 도구의 한 측면을 형성하는 Inpharmatica Genome ThreaderTM(PCT application WO 01/69507) 기술을 이용하여 현재 기능이 알려지지 않고 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드와 비교하여 서열 상동성이 낮으며, INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드 서열과의 현저한 구조적 상동성을 공유함으로써 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원으로 예측된다. “현저한 구조적 상동성”은 Inpharmatica Genome ThreaderTM에 의해 두 단백질의 구조적 상동성이 적어도 10% 및 그 이상의 확실성으로 예측됨을 의미한다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드에는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 단편 및 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 기능적 등가체의 단편이 포함되는데, 여기서 이들 단편은 EGF 보유 단백질 계통의 구성원이거나 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드와 공통되는 항원 결정부위를 갖는다.
본 명세서에서 “단편”은 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 아미노산 서열과 일부분이 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이들의 기능적 등가체를 의미한다. 단편은 서열로부터 유래된 적어도 n개의 연속 아미노산을 포함하고, 특정 서열에 따라 n은 7 또는 그 이상(예, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 그 이상)이다. 소형 단편은 항원 결정부위를 형성할 수 있다.
전장 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 단편은 각각 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, SP117 폴리펩티드 서열에서 이웃한 엑손 서열의 2개, 3개 또는 4개 조합으로 구성된다.
이런 단편은 “프리-스탠딩(free-standing)”, 다시 말하면, 다른 아미노산 또는 폴리펩티드와 융합되거나 일부분으로 남아있지 않을 수 있고, 또는 이런 단편은 좀더 큰 폴리펩티드의 일부분을 구성할 수도 있다. 좀더 큰 폴리펩티드의 일부분을 구성하는 경우에, 본 발명의 단편은 가장 적절하게는 단일 연속 부분을 형성하게 된다. 가령, 바람직한 구체예는 단편의 카르보닐 단부에 융합된 또는 단편의 아미노 단부에 융합된 Pre- 또는 pro-폴리펩티드를 가지는 단편에 관한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편(적어도 한 개의 항원 결정부위 포함)을 이용하여, 폴리펩티드에 면역 특이적인 리간드, 예를 들면 다클론 또는 단클론 항체를 만들 수 있다. 이런 항체를 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 클론을 확인하거나 친화성 크로마토그래피로 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 항체는 치료 또는 진단 목적으로 이용할 수도 있는데, 이는 당업자에게 명백하다.
“단백질”은 효소로서 기능하는 폴리펩티드를 비롯한 한 유형의 폴리펩티드를 의미한다. 적절하게는, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 리간드로서 기능한다. 본 명세서에서 “리간드”는 다른 분자, 예를 들면, 수용체에 결합하는 분자를 의미한다. 리간드는 효소에 대한 보조-인자이다. “면역특이적”은 항체가 선행 기술의 다른 관련된 폴리펩티드보다 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 훨씬 높은 친화성을 보유한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, “항체”는 의심되는 항원 결정부위에 결합할 수 있는 완전 분자 및 이들의 단편, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv를 의미한다. 따라서, 이들 항체는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드에 결합한다.
“실질적으로 높은 친화성”이란 공지된 분비 단백질에 대한 친화성과 비교하여 본 발명의 펩티드에 대한 친화성에서 측정가능한 증가가 존재한다는 것을 의미한다.
적절하게는, 친화성은 공지된 분비 단백질, 예를 들면, EGF 도메인-보유 단백질 계통의 구성원에 비하여 본 발명의 펩티드에 대하여 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 또는 그 이상으로 높다.
다클론 항체가 바람직한 경우에, 생쥐, 토끼, 염소 또는 말과 같은 선택된 동물에 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 면역한다. 동물을 면역하는데 이용되는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용하여 유도하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 필요에 따라서 폴리펩티드에 운반체 단백질을 연결시킬 수 있다. 폴리펩티드에 화학적으로 결합시키는데 흔히 이용되는 운반체는 소혈청 알부민, 티로글로블린, 키홀 림펫 헤모시아닌 등이다. 결합된 폴리펩티드를 이용하여 동물을 면역할 수 있다. 면역주사를 맞은 동물의 혈청을 취하여 공지의 과정, 예를 들면 면역 친화성 크로마토그래피로 처리한다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드에 대한 단클론 항체는 당업자가 용이하게 만들 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여 단클론항체를 만드는 일반적인 방법은 널리 알려져 있다(Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985).
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드에 대한 단클론 항체 패널은 다양한 특성, 예를 들면, 이소타입, 에피토프, 친화력 등으로 선별할 수 있다. 단클론 항체는 이들의 개별 폴리펩티드를 정제하는데 특히 유용하다. 대안으로, 목적 단클론 항체를 인코딩하는 유전자는 당분야에 공지의 기술인 PCR을 이용하여 하이브리도마에서 분리하고 클론하며 적절한 벡터에서 발현시킬 수 있다.
사람이외의 동물로부터 유래된 가변 영역이 사람의 불변 영역에 결합되거나 융합된 키메라 항체를 이용할 수도 있다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439(1987)).
항체는 예로써 인간화(humanisation)반응을 통하여 개체에서 항원성을 적게 나타내도록 변형시킬 수 있다(Jones et al., Nature, 321, 522(1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534(1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709(1991); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029(1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181(1991); Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421(1991)). 본 명세서에서 “인간화 항체”는 사람아닌 공여자 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 선별된 아미노산과 CDR 아미노산을 사람 항체에서 등가의 아미노산 잔기로 대체시킨 항체 분자를 말한다. 따라서, 인간화 항체는 사람의 항체와는 상당히 유사하지만, 공여자 항체의 결합 능력을 가진다.
다른 대안에서, 항체는 “이중-특이성” 항체가 될 수도 있는데, 이는 2가지 상이한 항원 결합 도메인을 보유하는 항체를 말하는데, 각 도메인은 상이한 에피토프에 관련된다.
파아지 디스플레이 기술을 이용하여, 유관한 항체를 보유하는지에 대해 스크리닝되는 사람 림프구의 PCR 증폭된 V-유전자 레퍼토리, 또는 고유 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 가지는 항체를 인코딩하는 유전자를 선별할 수 있다(McCafferty, J. et al.,(1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al.,(1992) Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화력은 체인 셔플링(chain shuffling)에 의해 개선될 수 있다(Clackson, T. et al.,(1991) Nature 352, 624-628).
상기 기술에 의해 만들어지는 단클론 또는 다클론 항체는 면역검사, 방사능면역검사(RIA), 효소-연결된 면역 흡착 검사(ELISA)에서 시약으로 이용되는 추가 용도를 가진다. 이런 분야에서, 항체는 방사능동위원소, 형광 분자 또는 효소와 같은 분석적으로 검출가능한 시약으로 라벨될 수 있다.
본 발명의 제 4와 제 5 특징의 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2O, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3O, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 및/또는 SEQ ID NO:55에 상술된 폴리펩티드 서열 또는 이들의 기능적 등가 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 핵산 분자들은 본 명세서에서 기술된 분야에 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 서열로부터 적어도 n개 연속 뉴클레오티드로 구성되는데, 이때 n은 특정 서열에 따라 10개 또는 그 이상(예, 12개, 14개, 15개, 18개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 그 이상)이 된다.
본 발명의 핵산에는 상기한 핵산에 상보적인 서열(예, 안티센스 또는 프로브 목적)도 포함된다.
본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA, 또는 cDNA, 합성 DNA, 게놈 DNA와 같은 DNA형이 될 수 있다. 클로닝, 화학적 합성 기술, 또는 이의 복합 기술을 이용하여 이런 핵산 분자를 얻을 수 있다. 유기체로부터 분리하거나 또는 게놈이나 cDNA 라이브러리로부터 고체 상 포스포아미디트 화학적 합성과 같은 화학적 합성 방법을 이용하여 핵산 분자를 만들 수 있다. 일반적으로, RNA 분자는 DNA 서열의 in vitro 또는 in vivo 전사에 의해 만들 수 있다.
핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥으로 되어 있다. 단일 가닥 DNA는 센스 가닥으로 알려진 코딩 가닥이거나 안티-센스 가닥으로 알려진 비-코딩 가닥일 수도 있다.
“핵산 분자”에는 DNA와 RNA 유사체, 예를 들면 변형된 골격구조를 포함하는 유사체 및 펩티드 핵산(PNA) 역시 포함된다. 본 명세서에서 “PNA”는 리신으로 종료되는 아미노산 잔기의 펩티드 골격에 연결된 적어도 5개 뉴클레오티드로 구성되는 안티센스 분자 또는 항-유전자 물질을 의미한다. 말단의 리신은 조성물에 안정성을 부여한다. PNA는 세포에서 수명을 연장시키기 위해 페길화(pegylation)되는데, 여기서 이들은 상보적인 단일 가닥의 DNA 및 RNA에 선호적으로 결합하고 전사 연장을 종료시킨다(Nielsen, P.E. et al.(1 993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).
이들 분자는 유전자 축중의 결과로써 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2O, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3O, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 및/또는 SEQ ID NO:55의 폴리펩티드를 인코딩하는 서로 다른 서열을 보유할 수도 있다. 이런 핵산 분자에는 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 자체; 성숙한 폴리펩티드와 추가 코딩 서열, 예를 들면 pro-, pre-, prepro- 폴리펩티드 서열과 같은 리더 또는 분비 서열을 인코딩하는 코딩 서열; 상기한 추가 코딩 서열의 존부하에 전사, 리보솜 결합, mRNA 안정성에 중요한 역할을 수행하는 전사된 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5' & 3' 서열(종료 신호 포함)을 비롯한 다른 비-코딩 서열과 함께 성숙 폴리펩티드의 코딩 서열이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 핵산 분자에는 다른 기능을 제공하는 부가적인 아미노산을 인코딩하는 추가 서열이 포함될 수도 있다.
본 발명의 제 4와 제 5 특징의 핵산 분자는 제 1 특징의 폴리펩티드의 단편 또는 기능적 등가체를 인코딩할 수도 있다. 이런 핵산 분자는 자연-발생 대립형질 변이체와 같은 자연 발생 변이체이거나 자연 상태에서는 발생하지 않은 변이체이다. 이런 비-자연적 핵산 변이체는 핵산 분자, 세포 또는 유기체에 이용될 수 있는 돌연변이유발 기술로 만들 수 있다.
이런 변이체에는 치환, 결손 또는 삽입에 의해 상기 핵산 분자와는 상이한 변이체가 포함된다. 치환, 결손 또는 삽입은 한가지 이상의 뉴클레오티드가 관계한다. 변이체는 코딩이나 비-코딩 또는 둘 모두에서 변화될 수 있다. 코딩 서열에서 변화는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결손 또는 삽입을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 당분야에 공지된 일반적인 방법을 이용하여, 유전자 생성물(폴리펩티드)의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변화시키는 것을 비롯한 다양한 이유로 조작할 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 조작하는데 이용될 수 있는 기술에는 무작위 절단에 의한 DNA 셔플링 및 유전자 단편과 합성 올리고뉴클레오티드의 PCR 재조합 등이 포함된다. 부위-직접 돌연변이유발은 새로운 제한효소 부위를 추가하고 글리코실화 패턴을 변경하며 코돈 선호도를 변화시키고 절단 변이체를 만들고 돌연변이를 도입하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 이형 서열에 결찰시키면 복합된 핵산 분자는 융합 단백질을 인코딩하게 된다. 이런 복합된 핵산 분자 역시 본 발명의 제 4 또는 제 5 특징에 포함된다. 가령, 폴리펩티드 활성 저해물질에 대한 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 복합된 핵산 분자를 이용하여 상업적으로 이용가능한 항체에 의해 인지될 수 있는 융합단백질을 발현하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질에는 본 발명의 폴리펩티드 서열과 이형 단백질의 서열사이에 절단 부위가 위치하도록 조작하여, 폴리펩티드가 이형단백질로부터 절단 및 정제될 수 있도록 한다.
본 발명의 핵산 분자에는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 부분적으로 상보적이고, 따라서 인코딩 핵산 분자에 혼성화되는 안티센스 분자 역시 포함된다. 올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 표적 핵산을 인지하고 특이적으로 결합하여 핵산의 전사를 방해해도록 설계될 수 있다(참조: Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435(1989), Okano, J. Neurochem. 56. 560(1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560(1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073(1979); Cooney et al., Science 241, 456(1988); Dervan et al., Science 251, 1360(1991).
본 명세서에서 “혼성화 반응”은 수소 결합에 의해 2개 핵산의 상호 연합을 의미한다. 일반적으로, 한 분자는 고형 서포트에 고정되고, 다른 분자는 용액에 자유로운 형태로 존재한다. 이후, 수소 결합이 일어나기 좋은 조건하에서 두 분자를 서로 접촉시킨다. 이런 결합에 영향을 주는 인자는 아래와 같다; 용매의 형태와 용적, 반응 온도; 혼성화 반응 시간; 교반; 고형 서포트에 액상 분자의 비-특이적 결합을 차단하는 물질(Denhardt's 시약 또는 BLOTTO); 분자의 농도; 분자의 연합 속도를 증가시키는 화합물의 이용(덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜); 혼성화 반응이후 세척 조건의 엄밀도(Sambrook et al. [supra]).
표적 분자에 완전하게 상보적인 분자의 혼성화 반응 저해는 당분야에 공지된 혼성화 반응 분석법으로 검사할 수 있다(Sambrook et al .,supral). 실질적으로 상동한 분자는 다양한 엄밀도 조건하에 표적 분자에 완전 상동한 분자의 결합을 경쟁하고 저해하게 된다(Wahl, G.M. and S.L. Berger 1987; Methods Enzymol. 152:399-407; Kimmel, A.R. 1987; Methods Enzymol. 152:507-511).
“엄밀도”란 상이한 분자의 연합보다 매우 유사한 분자들의 연합을 유리하게 하는 혼성화 반응 조건을 말한다. 높은 엄밀도 조건은 아래와 같이 정의할 수 있다;
50% 포름아미드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산3나트륨), 5O mM 인산나트륨(pH7.6), 5x Denhardts 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 20 ㎍/㎖ 변성되고 전단된 연어 정자 DNA로 구성된 용액에 42℃에서 하룻밤동안 배양, 이후 65℃에서 0.1X SSC에서 필터를 세척. 낮은 엄밀도 조건은 35℃에서 실행되는 혼성화 반응이다(Sambrook et al. [supra]). 적절하게는, 혼성화 반응에 이용되는 조건은 높은 엄밀도 조건이다.
본 발명의 적절한 구체예는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116 또는 INSP117 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 전체 길이의 적어도 70% 동일한 핵산 분자 및 이런 핵산 분자에 실제적으로 상보적인 핵산 분자가 된다. 적절하게는, 이런 코딩 서열에 전체 길이의 적어도 80% 동일한 핵산 분자 또는 이런 핵산 분자에 실제적으로 상보적인 핵산 분자이다. 이와 관련하여, 전체 길이의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 좀더 바람직하게는 적어도 98%, 99% 또는 그 이상으로 동일한 것이 특히 선호된다. 이와 관련하여 바람직한 구체예는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능이나 활성을 보유하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다;
(a) 이중나선을 형성하는 혼성화 조건하에서 생물학적 시료와 본 발명의 핵산 프로브를 접촉시키고;
(b) 형성된 이중나선을 검출한다.
본 발명에 이용될 수 있는 분석법과 연관하여 아래에 부언된 같이, 상기한 핵산 분자는 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드를 인코딩하는 전장 cDNA와 게놈 클론을 분리하고 이런 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자와 높은 서열 유사성을 가지는 상동성 유전자의 cDNA와 게놈 클론을 분리하기 위한 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 혼성화 반응 프로브로 이용될 수 있다.
이와 관련하여, 당분야에 공지된 기술 중에서 아래의 기술을 이용하며 하기에 설명 목적으로 제시한다. DNA 서열화와 분석 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 이용할 수 있으며, 본 명세서에 기술된 본 발명의 많은 구체예를 실행하는데 실제로 이용된다. 이런 방법은 DNA 중합효소 I의 클리노우 단편(Klenow fragment), Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq 중합효소(Perkin Elmer), 열안정성 T7 중합효소(Amersham, Chicago, IL), ELONGASE Amplification System(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)에서 볼 수 있는 중합효소와 프루프-리딩(proof-reading) 엑소뉴클레아제를 복합과 같은 효소 등을 이용할 수 있다. 적절하게는, 서열화 공정은 Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA), ABI Catalyst, 373과 377 DNA 서열rs(Perkin Elmer)와 같은 기계를 이용하여 자동화된다.
INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드와 등가의 기능을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 분리하는 한가지 방법은 당분야에서 인정되는 표준 과정을 이용하여 천연 또는 인공-설계된 프로브로 게놈이나 cDNA 라이브러리를 탐색하는 것이다("Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989,1992). 적절한 인코딩 유전자의 핵산 서열(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:5O, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54)에 상응하거나 이들에 상보적인 적어도 15개, 바람하게는 30개, 좀더 바람하게는 적어도 50개 연속 염기로 구성된 프로브가 특히 유용한 프로브이다. 이런 프로브는 확인을 용이하게 하는 분석적으로 검출가능한 물질로 라벨된다. 유용한 반응물에는 방사능동위원소, 형광 염료 및 검출가능한 산물 형성을 촉진할 수 있는 효소 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 프로브를 이용하면 당업자는 사람, 포유류 또는 다른 동물 종으로부터 목적 단백질을 인코딩하는 게놈 DNA, cDNA, RNA 폴리뉴클레오티드의 상보적인 사본을 분리하고, 이런 자원에서 족, 타입, 서브타입의 다른 구성원과 관련된 서열을 추가 스크리닝할 수 있다.
많은 경우에, 분리된 cDNA 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 부분이 보통 5' 말단에서 짧게 절단되기 때문에 불완전하다. 여러 방법을 이용하여 전장 cDNA를 수득하거나 짧은 cDNA를 연장할 수 있다. 이들 서열은 부분 뉴클레오티드 서열을 이용하고 프로모터와 조절 요소와 같은 상류 서열을 검출하는 당분야에 공지된 다양한 방법을 활용하여 연장할 수 있다. 가령, 이용가능한 한가지 방법은 cDNA 말단의 신속 증폭 방법에 기초한다(RACE; Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). MarathonTM 기술(Clontech Laboratories Inc.)로 예시되는 이런 기술의 최근 변형 기술로 좀더 긴 cDNA에 대한 검색이 상당히 단순화되었다. 약간 다른 기술인 “제한-부위” PCR에서는 범용 프라이머를 이용하여 공지된 위치에 인접하는 미지의 핵산 서열을 찾는다(Sarkar, G.(1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). 또한, 역 PCR을 이용하여 공지된 부분에 기초한 다변 프라이머를 이용하여 서열을 연장 또는 증폭할 수 있다(Triglia, T. et al.(1988) 핵산s Res. 16:8186). 이용가능한 다른 방법은 사람과 이스트 인공 염색체 DNA에서 공지 서열에 인접한 DNA 단편의 PCR 증폭을 수반하는 캡쳐 PCR이다(Lagerstrom, M. et al.(1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). 미지 서열을 확인하는데 이용할 수 있는 또 다른 방법은 Parker, J.D. et al.,((1991); 핵산s Res. 19:30553060)의 방법이다. 이에 더하여, PCR, nested 프라이머, 게놈 DNA를 보행하는 PromoterFinderTM 라이브러리를 이용할 수 있다(Clontech, Palo Alto, CA). 이런 공정은 라이브러리 스크리닝이 필요하지 않고, 인트론/엑손 결합 부분을 찾는데 유용하다.
전장 cDNA를 스크리닝하는 경우에, 좀더 큰 cDNA를 포함하도록 크기-선별된 라이브러리를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자의 5' 부분을 포함하는 서열을 좀더 많이 보유하는 무작위-프라임된 라이브러리가 바람직하다. 무작위-프라임된 라이브러리는 올리고 d(T)가 전장 cDNA를 만들지 못하는 경우에 특히 유용하다. 게놈 라이브러리는 서열을 5' 비-전사된 조절 부분으로 연장하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 염색체 위치 확인에 이용할 수 있다. 이런 기술에서, 핵산 분자는 개별 사람 염색체상의 특정 위치로 특이적으로 표적화되고 혼성화할 수 있다. 본 발명에 따른 염색체에 관련된 서열의 매핑은 유전자-연관된 질환과 이들 서열의 상관성을 확인하는데 중요한 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 매핑되면, 염색체상에서 서열의 물리적인 위치는 유전자 지도 자료와 연계될 수 있다. 이런 데이터는 예로써 V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(available on-line through Johns Hopkins University Welch Medical Library)에서 찾아볼 수 있다. 이후, 연관 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동 유전)을 통하여 동일한 염색체 부분에 매핑된 유전자와 질병의 상관관계를 확인한다. 위치 클로닝 또는 다른 유전자 발견 기술을 이용하면 질병 유전자를 조사하는데 귀중한 정보를 얻을 수 있다. 질병 또는 증후군이 특정 게놈 부분에 유전적으로 연관되어 위치하는 경우에, 상기 부분의 매핑 서열은 추가 조사를 위한 연관된 유전자 또는 조절 유전자를 나타낸다. 핵산 분자는 정상 개체, 보균자 또는 병든 개체간에 전위, 역전 등으로 인한 염색체상 위치에서 차이를 검출하는 데에도 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 조직 위치 측정(localisation)에도 유망하다. 이런 기술을 이용하면 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 검출하여 조직에서 폴리펩티드의 발현 패턴을 결정할 수 있다. 이런 기술에는 in situ 혼성화 반응 기술 및 PCR과 같은 뉴클레오티드 증폭 기술 등이 포함된다. 이런 연구 결과로부터 유기체내 폴리펩티드의 정상적인 기능을 제시할 수 있다. 이에 더하여, mRNA의 정상 발현 패턴과 돌연변이 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 패턴을 비교 연구는 질병에서 돌연변이 폴리펩티드의 역할에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이런 부적절한 발현은 일시적이거나, 지엽적이거나 정성적인 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 내생 발현을 하향 조절하기 위한 유전자 침묵 접근 방법을 실시할 수도 있다. RNA 간섭(RNAi)(Elbashir, SM et al.,Nature 2001, 411, 494-498)은 이용될 수 있는 서열 특이적 전사후 유전자 침묵화 방법중 하나이다. 짧은 dsRNA 올리고뉴클레오티드를 in vitro에서 합성하여 세포내로 도입한다. 이들 dsRNA 올리고뉴클레오티드의 서열 특이적인 결합은 표적 mRNA 분해를 자극하여, 표적 단백질 발현을 감소시키거나 발현되지 않도록 한다.
상기에서 평가한 유전자 침묵화 방법의 효과는 폴리펩티드 발현(웨스턴 블랏팅)으로 측정하여 평가하고, RNA 수준에서는 TaqMan-기초한 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산 분자를 포함하며, 클로닝 또는 발현벡터가 될 수 있다. 본 발명의 숙주 세포는 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 진핵 또는 원핵 세포이다.
본 발명의 폴리펩티드는 숙주내에 포함된 벡터에 존재하는 인코딩된 핵산 분자의 발현으로 재조합 형태로 만들어질 수 있다. 이런 발현 방법은 당분야에 공지되어 있다(Sambrook et al(supra); Fernandez & Hoeffler(1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto).
일반적으로, 필요 숙주에서 폴리펩티드를 만들기 위하여 핵산 분자를 유지, 증폭 또는 발현하는데 적절한 임의의 시스템 또는 벡터를 이용한다. 적절한 뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 일반적인 기술, 예를 들면 Sambrook et al.,(supra)에서 기술하는 다양한 기술을 이용하여 발현 시스템내로 도입한다. 일반적으로, 인코딩 유전자는 프로모터, 리보솜 결합 부분(박테리아 발현의 경우), 선택적으로 오퍼레이트와 같은 조절 요소의 통제하에 위치시켜, 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열이 형질도입된 숙주 세포내에서 RNA로 전사되도록 한다.
적절한 발현 시스템에는 크로모좀, 에피솜, 바이러스-유도된 시스템 등이 포함되는데, 예를 들면 세균성 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 이스트 에피좀, 삽입 요소, 이스트 염색체 원소; 배큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 파포바 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스 , 가금류 폭스 바이러스, 가사공수병 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이들의 조합, 예를 들면 플라스미드 및 코스미드와 파게미드를 비롯한 박테리오파지 유전자 요소로부터 유래된 조합 등이 포함된다. 또한, 사람 인공 염색체(HAC)를 이용하여 플라스미드에서 유지되고 발현될 수 있는 것보다 훨씬 큰 DNA 단편을 운반할 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 벡터의 실례는 pCR4-TOPO-INSP113(도 18), pCR4-TOPO-INSP113sv(도 19), pDONR(도 20), pEAK12d(도 21), pDEST12.2(도 22), pENTR-INSP113-6HIS(도 23), pENTR-INSP113sv-6HIS(도 24), pEAK12d-INSP113-6HIS(도 25), pEAK12d-INSP113sv-6HIS(도 26), pDEST12.2-INSP113-6HIS(도 27), pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(도 28), pCR4-TOPO-INSP114(도 31), pCR4-TOPO-INSP114-GR1(도 35), pCR4-TOPO-INSP114-SV2(도 36), pDONR 221(도 38), pEAK12d(도 39), pDEST12.2(도 40), pENTR_INSP114-6HIS(도 41), pEAK12d_INSP114-6HIS(도 42), pDEST12.2_INSP114-6HIS(도 43), pENTR_INSP114-SV1-6HIS(도 44), pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(도 45), pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(도 46), pENTR_INSP114-SV2-6HIS(도 47), pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(도 48), pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(도 49), pDONR 221(도 51), pEAK12d(도 52), pDEST12.2(도 53), pENTR_INSP115-6HIS(도 54), pEAK12d_INSP115-6HIS(도 55), pDEST12.2_INSP115-6HIS(도 56), pDONR 221(도 58), pEAK12d(도 59), pDEST12.2(도 60), pENTR_INSP116-6HIS(도 61), pEAK12d_INSP116-6HIS(도 62), pDEST12.2_INSP116-6HIS(도 63), pCRII-TOPO-INSP117(도 66), pDONR 221(도 67), pEAK12d(도 68), pDEST12.2(도 69), pENTR_INSP117-6HIS(도 70) , pEAK12d_INSP117-6HIS(도 71), pDEST12.2_INSP117-6HIS(도 72)이다.
특히 적절한 발현 시스템에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 이스트 발현벡터에 의해 형질전환된 이스트; 바이러스 발현 벡터(예, 배큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(가령, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(Ti 또는 pBR322 플라스미드)에 의해 형질도입된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함된다. 무-세포 번역 시스템을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 만들 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자의 숙주 세포로의 도입은 많은 실험 매뉴얼에 기술된 방법으로 달성할 수 있다; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986) and Sambrook et al.,(supra). 특히 적절한 방법에는 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 트랜스펙션, 미세주사, 양이온 지질-매개된 트랜스펙션, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩, 발리스틱 도입(ballistic introduction) 또는 감염 등이 포함된다(Sambrook et al., 1989 [supra]; Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald 1998). 진핵 세포에서 발현 시스템은 필요에 따라 달라 일시적(에피솜)이거나 영구적(염색체 통합)일 수 있다.
인코딩 핵산 분자에는 소포체의 내강, 세포질 공간 또는 세포외 환경으로 번역된 폴리펩티드의 분비를 조절 서열, 예를 들면 신호 펩티드 또는 리더 서열을 인코딩하는 서열이 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 이런 신호는 폴리펩티드에 내생이거나 이형 신호일 수 있다. 리더 서열은 번역후 가공에서 세균 숙주에 의해 제거될 수 있다.
조절 서열 이외에, 숙주 세포 성장과 관련된 폴리펩티드의 발현 조절을 가능하게 하는 조절 서열을 추가하는 것도 바람직하다. 조절 서열의 예는 조절 화합물의 존재, 다양한 온도 또는 대사 조건을 비롯한 화학적 또는 물리적인 자극에 반응하여 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 서열이다. 조절 서열은 벡터의 비-번역 부분인데, 예를 들면 인헨서, 프로모터, 5'와 3' 비-번역 부분이다. 이들은 숙수 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 실행한다. 이런 조절 서열은 강도 및 특이성에서 가변적이다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 본질성과 유도성 프로모터를 비롯한 많은 임의의 적절한 전사 및 번역 요소를 이용할 수 있다. 가령, 세균 시스템에 클로닝되는 경우에, Bluescript 파게미드의 하이브리드 lacZ 프로모터(Stratagene, LaJolla, CA), pSportITM 플라스미드(Gibco BRL) 및 이와 유사한 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 곤충 세포에는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 이용할 수 있다. 식물 세포의 게놈(예, 열 쇼크, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스(예, 바이러스성 프로모터 또는 리더 서열)로부터 유래된 프로모터 또는 인헨서는 벡터내로 클론될 수 있다. 포유류 세포 시스템에서는 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터가 적절하다. 서열의 다중 사본을 포함하는 세포주를 만들 필요가 있는 경우에, 적절한 선택성 표식과 함께 SV40 또는 EBV에 기초한 벡터를 이용할 수 있다.
특정 핵산 코딩 서열이 적절한 조절 서열을 가지는 벡터에 위치하도록 발현벡터를 작제하는데, 조절 서열에 대한 코딩 서열의 위치와 방향은 코딩 서열이 조절 서열의 “통제”하에 전사되도록 한다, 다시 말하면 조절 서열에서 DNA 분자에 결합하는 RAN 중합효소가 코딩 서열을 전사한다. 일부 경우에, 리딩 프레임을 유지하는 적절한 방향으로 조절 서열에 부착되도록 서열의 변화가 필요할 수도 있다.
벡터로 코딩 서열을 도입하기에 앞서 조절 서열 및 다른 조절 서열을 핵산 코딩 서열에 결찰시킬 수도 있다. 대안으로, 코딩 서열은 조절 서열 및 적절한 제한 효소 부위를 이미 포함하고 있는 발현벡터에 직접 클론될 수 있다.
재조합 폴리펩티드를 장기간 다량 생산하고자 하는 경우에, 발현을 안정화시키는 것이 바람직하다. 가령, 목적 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 동일 또는 별개의 벡터에 바이러스 복제 원점 또는 선택적 표식 유전자 발현 요소를 포함하는 발현벡터로 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입이후, 세포는 선택성 배지로 옮기기 이전에 풍부한 배지에서 1-2일간 생장시킨다. 선택적 표식의 목적은 선별에 대한 저항성을 부여하고, 이의 존재가 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 생장 및 회수를 가능하도록 하는 것이다. 안정적으로 형질도입된 세포의 저항성 클론은 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다.
발현을 위한 숙주로 이용가능한 포유류 세포주는 당분야에 공지되어 있는데, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa, 아기 햄스터 신장(BHK), 원숭이 신장(COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes 흑색종, 사람 간세포 육종(예, Hep G2) 세포, 다른 다양한 세포주를 포함하나 이에 국한되지 않은 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수가능한 많은 영속화 세포주 등이 포함된다.
배큘로바이러스 시스템의 경우에, 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템의 재료는 키트 형태로 이용가능하다(Invitrogen, San Diego CA(the "MaxBac" kit)). 이런 기술은 당업자에 공지된 것으로, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)에서 상세하게 기술한다. 이런 시스템에 사용하기 적합한 숙주 세포는 초파리(Drosophila) S2와 거염벌레(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포이다.
많은 식물 세포 배양물 및 전체 식물 유전자 발현 시스템이 당분야에 공지되어 있다. 적절한 식물 세포 유전자 발현 시스템의 예로는 US 5,693,506; US 5,659,122; US 5,608,143에 기술된 것 등이 포함된다. 식물 세포 배양물에서 유전자 발현의 다른 예는 Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863(1991)에서 설명한다.
특히, 원형질체를 분리할 수 있고 온전한 재생 식물로 배양할 수 있는 모든 식물을 이용하여 전이된 유전자를 보유하는 식물을 회수할 수 있다. 실질적으로 모든 식물이 사탕수수, 사탕무, 목화, 과일, 다른 나무, 콩과식물, 채소 등을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생될 수 있다.
특히 적절한 세균성 숙주 세포로는 연쇄상구균(streptococci), 포도상구균(staphylococci), 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스 서브틸리스 세포(Bacillus subtilis) 등이 포함된다.
곰팡이 발현을 위한 적절한 숙주 세포로는 효모(S. cerevisiae) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포 등이 포함된다.
당분야에 공지된 선별 시스템을 이용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 전형적으로, tk- 세포 또는 aprt± 세포에서 각각 이용될 수 있는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제 유전자(Wigler, M. et al.,(1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy, 1. et al.(1980) Cell 22:817-23) 유전자이다.
또한, 선별을 위한 기초로써 항-대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 메토트렉세이트에 저항성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)(Wigler, M. et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G418에 저항성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin, F. et al(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 클로로설푸론 및 포스포나트로신 아세틸트란스퍼라제에 각각 저항성을 부여하는 als 또는 pat 등이 포함된다. 부가적인 선별 유전자에 대해서도 설명하고 있는데, 이들의 예는 당업자에게 자명하다.
표식 유전자의 발현 유무가 목적 유전자의 존재를 암시하긴 하지만, 이의 존재와 발현은 확증을 필요로 한다. 가령, 관련 서열이 표식 유전자내로 삽입되는 경우에, 표식 유전자 기능의 부재로 적절한 서열을 포함하는 형질도입된 서열을 확증할 수 있다. 대안으로, 표식 유전자는 단일 프로모터 조절하에 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열과 나란하게 위치시킬 수 있다. 일반적으로, 유도 또는 선별에 대한 반응으로 표식 유전자의 발현은 나란히 위치하는 유전자의 발현을 암시한다.
대안으로, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 이런 과정에는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드반응 및 핵산이나 단백질의 검출 또는 정량화를 위한 막, 용액 또는 칩 기초한 기술을 수반하는 단백질 생물분석, 예를 들면 형광 활성화된 세포 소팅(FACS) 또는 면역검사 기술(효소-결합된 면역흡착 검사[ELISA] 및 방사능면역검사[RIA]) 등이 포함된다(Hampton, R. et al.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN); Maddox, D.E. et al.(I 983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216).
다양한 라벨 및 접합 기술은 당분야에 공지되어 있고, 다양한 핵산 및 아미노산 검정에 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자와 관련된 서열을 검출하기 위한 라벨된 혼성화 또는 PCR 프로브의 생산 수단에는 라벨된 폴리뉴클레오티드를 이용한 올리고라벨링, 니크 번역, 말단-라벨링 또는 PCR 증폭 등이 포함된다.
대안으로, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 mRNA 프로브를 만들기 위해 벡터내로 클론될 수 있다. 이런 벡터는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 가용하며 T7, T3 또는 SP6과 같은 적절한 RNA 중합효소 및 라벨된 뉴클레오티드를 추가하여 in vitro에서 RNA 프로브를 합성하는데 이용할 수 있다. 이런 과정은 사용 키트를 이용하여 실행할 수 있다(Pharmacia & Upjohn,(Kalamazoo, MI); Promega(Madison WI); U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)).
용이한 검출에 이용하는데 적절한 리포터 분자에는 방사능핵종, 효소, 형광, 화학발광이나 발색 물질, 기질, 보조인자, 저해물질, 자성 입자 등이 포함된다.
본 발명에 따른 핵산 분자를 이용하여 유전자도입 동물, 특히 설치류 동물을 만들 수 있다. 이런 유전자도입 동물 역시 본 발명의 특징에 속한다. 체세포를 변형하거나 유전가능한 변형을 통합하는 생식세포 요법을 이용하여 유전자도입 동물을 만들 수 있다. 이런 유전자도입 동물은 특히 본 발명의 폴리펩티드의 조절물질로써 효과적인 약물 분자에 대한 동물 모델을 만드는데 이용될 수 있다.
공지의 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하고 정제할 수 있는데, 이용할 수 있는 방법으로는 암모늄 설페이트이나 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 등이 포함된다. 정제에는 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 특히 유용하다. 단백질을 재폴팅하는데 공지된 기술을 이용하여, 정제 또는 분리 과정동안 폴리펩티드가 변성되는 경우에 활성 형으로 재생할 수 있다.
원하는 경우에 특화된 벡터 작제를 이용하여, 가용성 단백질의 정제를 조장하는 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 결합시켜, 단백질 정제를 촉진할 수 있다. 이런 정제-촉진 도메인에는 고정된 금속에서 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속-킬레이트화 도메인, 고정된 면역글로불린에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인; FLAGS 연장/친화력 정제 시스템에 이용되는 도메인 등이 포함된다(Immunex Corp., Seattle, WA). 정제 도메인과 본 발명의 폴리펩티드 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나아제(Invitrogen, San Diego, CA)와 같은 절단가능 링커 서열을 포함시켜 정제를 촉진할 수 있다. 이런 발현 벡터는 티오레독신 또는 엔테로키나아제 절단 부위를 선행하는 여러 히스티딘 잔기에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 보유하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 IMAC(고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피 Porath, J. et al.(1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)에 의한 정제를 촉진하고, 티오레독신 또는 엔테로키나아제 절단 부위는 융합 단백질로부터 폴리펩티드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 벡터는 Kroll, D.J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12.441-453)에서 설명한다.
스크리닝 검정에 이용되는 폴리펩티드를 발현하는 경우에, 일반적으로 폴리펩티드는 이를 발현하는 숙주 세포의 표면에서 생산되도록 하는 것이 바람직하다. 이런 경우에, 스크리닝 검정에 앞서 형광 활성화된 세포 소트(FACS) 또는 면역친화력 기술 등을 이용하여 숙주 세포를 수득한다. 폴리펩티드가 배지내로 분비되는 경우에, 발현된 폴리펩티드를 회수하고 정제하기 위하여 배지를 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 만들어지는 경우에, 세포를 먼저 용해시키고, 폴리펩티드를 회수한다.
본 발명의 폴리펩티드는 약물 스크리닝 기술을 이용하여 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 이용할 수 있다. 이런 화합물은 본 발명의 유전자의 발현 수준 또는 본 발명의 폴리펩티드의 활성 수준을 증가(항진제) 또는 저해(길항제)할 수 있는데, 이 또한 본 발명의 특징이 된다. 바람직한 화합물은 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현을 변화시키거나 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드 활성을 조절하는데 유효하다.
항진제 또는 길항제 화합물은 세포, 무-세포 침전물, 화학 라이브러리 또는 천연 생성물 혼합물로부터 분리할 수 있다. 이런 항진제 또는 길항제는 천연이나 변형된 기질, 리간드, 효소, 리포터, 구조적 또는 기능적 모방체 등이 될 수 있다. 이런 스크리닝 기술에 대하여 Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)를 참조한다.
길항제로써 유망한 화합물은 결합시에 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않으면서 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 분자이다. 유망한 항진제로는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 활성을 저해 또는 제거할 수 있는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 등이 포함된다. 이런 방식으로, 정상적인 세포 결합 분자에 폴리펩티드의 결합을 방해하여, 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 저해한다.
이런 스크리닝 기술에 이용되는 본 발명의 폴리펩티드는 용액에서 유리된 형태, 고형 서포트에 고착된 형태, 세포 표면에서 생성된 형태 또는 세포내에 위치하는 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이런 스크리닝 과정은 시험 화합물과 접촉하는 폴리펩티드를 발현하는 적절한 세포 또는 세포막을 이용하여 결합, 또는 기능적 반응의 촉진이나 저해를 관찰하는 단계를 수반한다. 시험 화합물과 접촉된 세포의 기능적 반응은 시험 화합물과 접촉하지 않은 대조 세포의 기능적 반응과 비교한다. 이런 검정에서는 적절한 검출 시스템을 이용하여 시험 화합물이 폴리펩티드 활성화에 의해 발생된 신호를 유발하는 지를 평가한다. 일반적으로, 활성화의 저해물질은 공지된 항진제의 존재하에 분석하고, 항진제에 의한 활성화에 대한 효과는 시험 화합물 존재하에 관찰한다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 바람직한 방법은 아래와 같다;
(a) 폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 폴리펩티드를 세포 표면에서 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키고, 이때 폴리펩티드는 폴리펩티드에 화합물의 결합에 반응하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되고,
(b) 폴리펩티드와 화합물의 상호작용으로 발생되는 신호의 수준을 측정함으로써 화합물이 폴리펩티드에 결합하여 이를 활성화시키는지 또는 저해하는지를 결정한다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 다른 바람직한 방법은 아래와 같다;
(a) 폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 세포 표면에서 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키고, 이때 폴리펩티드는 폴리펩티드에 화합물의 결합에 반응하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되고,
(b) 폴리펩티드와 화합물의 상호작용으로 발생되는 신호 수준을 화합물이 없을 경우의 신호 수준과 비교함으로써 화합물이 폴리펩티드에 결합하여 이를 활성화시키는지 또는 저해하는지를 결정한다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기한 일반적인 방법은 폴리펩티드에 대한 라벨되거나 라벨되지 않은 리간드의 존재하에 항진제 또는 길항제를 확인하는 단계가 추가로 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 방법의 또 다른 구체예는 아래와 같다;
폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서 후보 화합물 존재하에 세포 표면에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 이런 폴리펩티드를 포함하는 세포막에 리간드, 예를 들면, 수용체의 결합 저해를 결정하고;
폴리펩티드에 결합된 리간드 양을 결정한다. 리간드 결합을 감소시키는 화합물은 항진제 또는 길항제로 간주된다. 적절하게는, 리간드는 라벨된다.
좀더 구체적으로, 폴리펩티드 길항제 또는 항진제 화합물을 스크리닝하는 방법은 아래와 같은 단계를 포함한다;
(a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 세포 표면에 함께 라벨된 리간드를 배양하고;
(b) 전체 세포 또는 세포막에 결합된 라벨된 리간드의 양을 측정하고;
(c)(a) 단계의 전체 세포 또는 세포막 및 라벨된 리간드의 혼합물에 후보 화합물을 첨가하여 혼합물이 평형에 이르도록 하고;
(d)(c) 단계이후 전체 세포 또는 세포막에 결합된 라벨된 리간드의 양을 측정하고;
(e) (b)와 (d) 단계에서 결합된 라벨된 리간드에서 차이를 비교하고, (d) 단계에서 결합 감소를 유도하는 화합물은 항진제 또는 길항제로서 간주한다.
본 발명의 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드는 세포 성장과 분화를 조절할 수 있다. 따라서, INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 생물학적 활성은 아가로오스 배양액에서 세포 성장과 분화의 연구가 가능한 시스템, 예를 들면, 장기 배양 검사법에서 또는 콜로니 검사 시스템에서 검사할 수 있다. 세포 증식의 자극 또는 저해는 다양한 검사법으로 측정할 수 있다.
가령, 세포 성장 저해를 관찰하기 위하여, 고체 또는 액체 배지를 이용할 수 있다. 고체 배지에서, 성장이 저해되는 세포는 형성된 콜로니의 크기를 비교함으로써 실험 대상 세포군으로부터 쉽게 분리될 수 있다. 액체 배지에서, 성장 저해는 배양 배지 탁도 또는 라벨된 티미딘의 DNA 함입을 측정함으로써 조사할 수 있다. 전형적으로, 새로 합성된 DNA에 뉴클레오시드 유사체의 함입은 세포 개체군에서 증식(즉, 활성 세포 성장)을 측정하는데 이용된다. 가령, 브로모디옥시우리딘(BrdU)은 DNA 라벨링 시약으로서 이용될 수 있고, 항-BrdU 생쥐 단클론 항체는 검출 시약으로서 이용될 수 있다. 상기 항체는 브로모디옥시우리딘을 함입하는 DNA를 포함하는 세포에만 결합된다. 이런 검사법과 공동으로, 다수의 검출 방법, 예를 들면, 면역형광, 면역조직화학, ELISA, 열량측정법을 이용할 수 있다. 브로모디옥시우리딘(BrdU)과 항-BrdU 생쥐 단클론 항체를 포함하는 키트는 Boehringer Mannheim(Indianapolis, IN)으로부터 상업적으로 구입가능하다.
세포 분화에 대한 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 효과는 다양한 양의 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드를 줄기 세포 또는 배아 세포와 접촉시키고, 이들 줄기 세포 또는 배아 세포의 분화에 대한 효과를 관찰함으로써 측정할 수 있다. 결과의 세포는 조직-특이적 항체와 검경을 이용하여 확인할 수 있다.
또한, INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드는 상기한 검사에서 용량-의존성 방식으로 면역 및/또는 신경 줄기 세포 증식과 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 “기능성 등가물”은 상기한 검사에서 용량-의존성 방식으로 동일한 성장과 분화 조절 활성을 보이는 임의의 폴리펩티드를 포괄한다. 이런 용량-의존성 활성의 정도가 INSP113, INSP114, SP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드에서와 동일할 필요는 없지만, “기능성 등가물”은 일정한 활성 검사에서 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드에서와 실질적으로 유사한 용량-의존성을 보인다.
상기한 특정 구체예에서, 간단한 결합 분석법을 이용할 수 있는데, 여기서 폴리펩티드를 보유하는 표면에 시험 화합물의 부착은 시험 화합물과 직접 또는 간접으로 결합된 라벨로 검출하거나 라벨된 경쟁물질과의 경쟁을 수반하는 검사법으로 검출한다. 다른 구체예에서, 경쟁적인 약물 스크리닝 분석법을 이용할 수 있는데, 여기서 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체는 시험 화합물과 결합에 대하여 특이적으로 경쟁한다. 이런 방식으로, 항체는 폴리펩티드에 특이적인 결합 친화성을 보유하는 시험 화합물의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다.
세포에서 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 생산에 대한 첨가된 시험 화합물의 효과를 검출하는 검사 방법을 설계할 수도 있다. 가령, 당분야에 공지된 표준 방법에 의한 단클론 또는 다클론 항체를 이용하여 폴리펩티드의 분비되거나 세포-결합된 수준을 측정하는 ELISA를 실시할 수 있는데, 상기 방법은 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드 생산을 저해하거나 강화하는 화합물을 검색하는 데에도 이용될 수 있다. 이후, 폴리펩티드와 시험 화합물간 복합체 형성을 측정한다.
이용될 수 있는 다른 약물 스크리닝 기술은 목적 폴리펩티드에 적절한 결합 친화성을 가지는 화합물의 초고속 스크리닝을 제공한다(International patent application WO84/03564). 상기 방법에서, 다수의 상이한 작은 시험 화합물을 고형 기질상에 합성되는데, 이들은 이후 본 발명의 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 폴리펩티드를 고정시키는 한가지 방법은 비-중화 항체를 이용하는 것이다. 이후, 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 결합된 폴리펩티드를 검출한다. 정제된 폴리펩티드는 상기한 약물 스크리닝 기술에 이용되는 플레이트에 직접 피복될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 당분야에 공지된 표준 수용체 결합 기술, 예를 들면 폴리펩티드가 방사성 동위원소로 라벨되거나, 화학적으로 변형되거나, 또는 검출 또는 정제를 조장하고 추정 수용체 자원(예, 세포, 세포 막, 세포 현탁액, 조직 추출물, 체액의 조성물)과 함께 배양되는 리간드 결합과 교차 결합 기술을 통하여 막-결합되거나 가용성 수용체를 확인하는데 이용될 수 있다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 및 스펙트로스코피(spectroscopy)와 같은 생체물리학적 기술을 이용하여 결합 효과를 측정할 수 있다. 결합 분석은 수용체의 정제 및 클로닝에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 수용체에 대한 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인할 수도 있다. 스크리닝 검사를 실행하는 표준 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에는 상기한 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소를 확인하는 방법에 유용한 스크리닝 키트 역시 포함된다.
본 발명에는 앞서 기술된 방법에 의해 발견되는 본 발명 폴리펩티드의 활성 또는 항원성을 조절할 수 있는 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소가 포함된다.
또한, 본 발명은 적절한 약학적 운반체와 복합된 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 하기에 상술된 바와 같이 치료 또는 진단 시약, 백신 또는 다른 면역 조성물로써 적합하다.
본 명세서에서 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물[X]를 함유하는 조성물에서 화합물[x]과 불순물[Y]의 총 중량당 적어도 80%가 X인 경우에, “실질적으로 불순물[Y]이 없는” 조성물이라고 할 수 있다. 적절하게는, X는 조성물에서 X+Y의 총 중량당 적어도 90%로 구성되고, 좀더 적절하게는 총 중량의 약 95%, 98%, 99%로 구성된다.
적절하게는, 약학 조성물은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물의 치료요법적 효과량을 함유한다. “치료요법적 효과량”이란 표적하는 질병 또는 질환을 치료, 경감 또는 예방하거나 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 함량을 의미한다. 임의의 화합물에서, 치료요법적 효과량은 예로써 신생물 세포, 또는 동물 모델, 일반적으로 생쥐, 토끼, 개 또는 돼지의 세포 배양 분석으로 최초 측정할 수 있다. 상기 동물 모델은 적절한 농도 범위와 투여 경로를 결정하는 데에도 이용될 수 있다. 이후, 이런 정보를 활용하여 사람에서 유용한 약량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.
사람 개체의 정확한 효과량은 질병의 심각성, 개체의 전반적인 건강 상태, 나이, 체중, 성별, 음식, 투여 빈도와 기간, 약물 복합, 반응 감응도, 치료에 대한 내성/감응성에 좌우된다. 통상적인 실험을 통하여 효과량을 결정할 수 있는데, 이는 임상 의사의 판단 범주에 속한다. 일반적으로, 효과량은 0.01 ㎎/kg 내지 50 ㎎/kg, 적절하게는 0.05 ㎎/kg 내지 10 ㎎/kg 범위이다. 조성물을 환자에 개별적으로 투여하거나, 다른 약물, 물질 또는 호르몬과 공동으로 투여할 수도 있다.
약학 조성물은 치료제 투여를 위한 약학적으로 수용가능한 담체를 함유할 수 있다. 이런 담체에는 항체, 다른 폴리펩티드, 유전자, 리포좀과 같은 다른 치료제가 포함되는데, 담체는 조성물을 제공받는 개체에 유해한 항체 생산을 유도하지 않아야 하고, 과도한 독성없이 투여되어야 한다. 적절한 담체는 크고 대사가 느린 거대분자, 예를 들면 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 고분자 및 비활성 바이러스 입자 등이다.
약학적으로 수용가능한 염에는 염화수소, 브롬화수소, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 유기산 염이 포함된다. 약학적으로 이용가능한 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)를 참고한다.
치료 조성물에서 약학적으로 수용가능한 담체에는 물, 염, 글리세롤, 에탄올이 추가로 포함될 수 있다. 이에 더하여, 가습제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질이 조성물에 포함될 수 있다. 이런 담체를 이용하면, 약학 조성물은 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등 환자에게 복용가능 형태로 제제화될 수 있다.
일단 조제되면, 본 발명의 조성물은 환자에게 직간접적으로 투여할 수 있다. 치료 대상은 동물 특히, 사람 개체이다.
본 발명에 이용가능한 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피내 또는 경피하(예, W098/20734), 피하, 복막내, 비강, 장, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장을 비롯한 다양한 루트로 투여될 수 있다. 유전자 총 또는 하이포스프레이(hyposprays)를 이용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수도 있다. 전형적으로, 치료 조성물을 액체 용액 또는 현탁액 형태의 주사액으로 만들 진다; 주사하기 직전에 용액, 현탁액 또는 액체 운반체에 용해하기에 적합한 고형으로 만들어 질 수도 있다.
조성물을 직접 운반하는 방법은 주사, 피하, 복막, 정맥, 근육으로 주사하거나 조직내 간질(間質) 공간으로 운반하는 것이다. 조성물은 병소에 투여할 수도 있다. 약량은 1회 투약 과정 또는 다회 투약 과정으로 제공될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 활성이 특정 질병 상태에서 과도하게 나타나는 경우에 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 한가지 방법은 상기한 바와 같이 저해 화합물(길항제) 및 리간드, 기질, 효소, 수용체의 결합을 차단하거나 제 2 신호를 저해함으로써 폴리펩티드 기능을 저해하는데 효과량의 약학적으로 수용가능한 담체를 개체에 투여하여 비정상 상태를 경감시키는 것이다. 적절하게는, 길항제가 항체이다. 가장 적절하게는, 항체는 앞서 기술한 바와 같이 면역원성을 최소화하는 인간화 또는 키메라 항체이다.
다른 방법으로, 리간드, 기질, 효소, 수용체에 대한 결합 친화력을 보유하는 가용성 형태의 폴리펩티드를 투여할 수도 있다. 전형적으로, 폴리펩티드는 유관한 부분을 보유하는 단편 형태로 투여된다.
또 다른 방법으로, 내부적으로 생성되거나 별도로 투여된 안티센스 핵산 분자의 이용과 같은 발현 저해 기술을 이용하여, 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 발현을 저해할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 통제, 5' 또는 조절 부분(신호 서열, 프로모터, 인헨서, 인트론)에 상보적인 서열 또는 안티센스 분자(DNA, RNA 또는 PNA)를 설계하여 유전자 발현을 변화시킬 수 있다. 유사하게, “삼중 나선” 염기쌍 방법을 이용하여 저해를 달성할 수 있다. 삼중 나선 염기쌍 형성 기술은 삼중 나선이 중합효소, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위하여 이중 나선이 충분히 개방되는 능력을 저해하기 때문에 유용하다. 삼중 나선 DNA를 이용한 최근 치료법의 발전이 기존 문헌에서 보고되고 있다(Gee, J.E. et al.(1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). 상보적인 서열 또는 안티센스 분자를 설계하여 전사체가 리보솜에 결합하는 것을 차단함으로써 mRNA의 전사를 저해할 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 투여되거나 in vivo 발현으로 in situ 생성될 수 있다.
이에 더하여, 인코딩 mRNA 서열에 특이적인 리보자임을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 발현을 차단할 수도 있다. 리보자임은 천연 또는 합성 형태로 촉매 활성을 가진 RNA이다(Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol(1996) 6(4), 527-33). 선택된 위치에서 mRNA를 특이적으로 절단할 수 있는 합성 리보자임을 설계하여, mRNA가 기능적 폴리펩티드로 번역되는 것을 방지할 수 있다. RNA 분자에서 정상적으로 발견되는 천연 리보즈 포스페이트 골격과 천연 염기로 리보자임을 합성할 수 있다. 대안으로, 리보자임은 비-천연 골격, 예를 들면 2'-O-메틸 RNA로 합성하여 리보뉴클레아제 분해되지 않고, 변형된 염기를 보유하도록 할 수도 있다.
RNA 분자를 변형시켜, 세포내 안정성과 반감기를 증가시킬 수 있다. 가능한 변형 방법에는 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 인접 서열을 추가, 분자의 골격내에 포스포디에스테라제 연쇄보다는 포스포로티오에이트 또는 2‘O-메틸의 이용 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 개념은 PNA 생산에 내재하고, 내인성 엔도뉴클레아제에 의해 용이하게 인지되지 않는 비-전통적 염기, 예를 들면 이노신, 큐에오신, 부토신을 비롯하여 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민, 우리딘의 유사하게 변형된 형태의 포함으로 이들 분자 모두에서 확장될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 과소 발현 및 이의 활성과 관련된 비정상 상태의 치료에는 여러 방법이 가능하다. 한가지 방법은 비정상적 상태를 완화시키기 위하여 폴리펩티드를 활성화시키는 화합물, 다시 말하면 상기한 바와 같은 항진제의 효과량을 개체에 투여하는 것이다. 대안으로, 적절한 약학 담체와 공동으로 폴리펩티드의 치료요법적 효과량을 투여하여 폴리펩티드의 적절한 생리학적 균형을 복원한다.
유전자 요법을 이용하여 개체에서 관련 세포에 의한 폴리펩티드의 내적 생산에 달성할 수 있다. 유전자 요법은 결함 유전자를 교정된 치료 유전자로 대체하여 폴리펩티드의 부적절한 생산을 영구적으로 치유하는데 이용된다.
본 발명의 유전자 요법은 in vivo 또는 ex vivo 상태에서 실시될 수 있다. Ex vivo 유전자 요법은 환자 세포의 분리와 정제, 치유 유전자의 도입, 유전적으로 변경된 세포의 환자로의 역도입이 요구된다. 대조적으로, in vivo 유전자 요법은 환자 세포 분리와 정제 과정이 필요하지 않다.
일반적으로, 치료 유전자는 환자에 투여하기 위하여 “포장”된다. 유전자 운반체는 리포좀과 같은 비-바이러스성 물질, 또는 복제-결함 바이러스, 예를 들면 Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66(1992)에서 설명하는 아데노바이러스 또는 Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129(1992)와 U.S. Patent No. 5.252,479에서 설명하는 아데노-연합된 바이러스(AAV) 벡터이다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 복제-결함성 레트로바이러스 벡터에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 이후, 이런 발현 구조체는 분리하고 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스성 플라스미드 벡터로 형질도입된 포장 세포에 도입하여, 포장 세포가 목적 유전자를 포함하는 감염성 바이러스성 입자를 생산할 수 있도록 한다. 이들 생산 세포를 개체에 투여하여, in vivo 상태에서 세포를 조작하고, 폴리펩티드를 발현시킨다(참조: Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, in Human Molecular Genetics(1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).
또 다른 방법은 “나신 DNA”의 투여인데, 여기서 치료 유전자는 혈류 또는 근육 조직에 직접 주사된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 질병-원인 물질인 경우에, 본 발명에서는 이들 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 질병 원인 물질에 대한 항체를 만드는 백신으로 사용될 수 있도록 한다.
본 발명의 백신은 예방(감염 방지) 또는 치료(감염후 질병 치유)를 목적으로 한다. 이런 백신은 통상적으로 상기한 약학적으로 수용가능한 담체(조성물을 제공받은 개체에서 유해한 항체 생산을 유도하지 않은 담체 포함)와 함께 면역용 항원, 면역원, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 분자를 함유한다. 게다가, 이들 담체는 면역자극 물질(“어쥬번트”)로 기능할 수 있다. 더 나아가, 항원 또는 면역원은 디프테리아, 파상풍(테타누스), 콜레라, H. pylori 및 다른 병원균과 같은 세균성 독소에 공액될 수 있다.
폴리펩티드는 위에서 분해되기 때문에, 폴리펩티드를 함유하는 백신은 장관외(가령, 피하, 근육, 정맥, 경피 주사) 투여하는 것이 바람직하다. 장관외 투여에 적합한 조성물에는 항산화제, 완충제, 정균제, 개체의 혈액에서 조성물에 등장성을 부여하는 용매를 함유하는 수용성과 비-수용성 무균 주사 용맥 및 현탁제 또는 농후제를 함유하는 수용성과 비-수용성 무균 현탁액이 포함된다.
본 발명의 백신 조성물은 단위 약형 또는 다중 약형 용기로 제공될 수 있다. 가령, 밀봉된 앰플과 바이알은 냉동 건조 상태에 보관하는데, 이는 사용 직전에 무균 액상 담체만 추가하면 된다. 약량은 백신의 특정 활성에 따라 좌우되는데, 통상적인 실험으로 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 결합하는 항체의 유전자 전달은 국제 특허 출원 WO 98/55607에 기술된 바와 같이 달성할 수도 있다.
제트 주사로 지칭되는 이 기술(참조: www.powderjet.com) 역시 백신 조성물의 조제에 유용하다.
면역화에 적합한 다양한 방법 및 백신 전달 시스템은 국제 특허 출원 WO 00/29428에서 기술한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자의 진단 시약으로의 용도에 관한한다. 기능이상과 연관된 본 발명의 핵산 분자에 의해 특성화되는 유전자의 돌연변이 형태의 검출은 유전자의 과소 발현, 과다 발현, 변형된 공간적 또는 시간적 발현 등으로 인한 질병을 정의하거나 진단하거나 또는 질병에 대한 민감성을 진단하는 진단 도구를 제공한다. 다양한 기술을 이용하여, DNA 수준에서 유전자에 돌연변이를 보유하는 개체를 확인할 수 있다.
진단용 핵산 분자는 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 또는 부검 물질과 같은 개체 세포에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접적으로 이용하거나 분석에 앞서 PCR, 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 다른 증폭 기술을 이용하여 효소적으로 증폭할 수 있다(Saiki et al., Nature, 324, 163-166(1986); BeJ, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334(1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126(1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294(1990)).
한 구체예에서, 본 발명은 환자에서 질병을 진단하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준을 평가하고, 발현 수준을 대조 수준과 비교하는 단계를 포함하는데, 이때 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다;
a) 본 발명의 핵산 분자와 프로브간 하이브리드 복합체 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 환자로부터 얻은 조직 시료와 핵산 프로브를 접촉시키고;
b)(a) 단계에서 이용된 조건하에서 프로브와 대조 시료를 접촉시키고;
c) 시료에서 하이브리드 복합체의 존재를 검출하고,
이때 대조 시료에서 하이브리드 복합체의 수준과 비교하여 환자 시료에서 하이브리드 복합체의 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
본 발명은 아래의 단계를 포함하는 다른 진단 방법을 제공한다;
a) 질병을 검사받는 환자로부터 조직 시료를 얻고;
b) 조직 시료로부터 본 발명의 핵산 분자를 분리하고;
c) 핵산 분자에서 질병과 연관된 돌연변이의 존재를 검출하여 환자에서 질병을 진단한다.
상기한 방법에서 핵산 분자의 검출을 보조하기 위하여, 예로써 PCR을 이용한 증폭 단계가 포함될 수 있다.
정상 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기에서 변화를 이용하여 결손 및 삽입을 확인할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 본 발명의 라벨된 RNA 또는 본 발명의 라벨된 안티센스 DNA 서열에 혼성화시켜 확인할 수 있다. RNase 절단에 의해 또는 용융 온도에서 차이를 확인하여, 미스매치된 이중나선과 완전하게 매치된 서열을 구별할 수 있다. 환자에서 돌연변이 유무는 하이브리드-이중 가닥 분자를 형성하는 엄밀도 조건하에서 DNA에 혼성화되는 핵산 프로브와 DNA를 접촉시키고, 여기서 하이브리드 이중-가닥 분자는 질병과 연관된 돌연변이에 상응하는 임의의 부분에서 핵산 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분을 보유하고; DNA 가닥의 상응하는 부분에 질병-연관된 돌연변이 유무의 지표로써 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분의 유무를 검출함으로써 확인할 수 있다.
이런 진단은 태아 및 신생아 검사에서 특히 유용하다.
참고 유전자와 “돌연변이 유전자”사이에 점 돌연변이 및 다른 서열 차이는 다른 널리 공지된 기술, 예를 들면 직접 DNA 서열화 또는 단일-가닥 형태 다형성으로 확인할 수 있다(참조: Orita et al., Genomics, 5, 874-879(1989)). 가령, 서열화 프라이머는 이중 가닥 PCR 생성물 또는 변형된 PCR에 의해 생성된 단일-가닥 주형 분자와 함께 사용할 수 있다. 서열 결정은 방사능라벨된 뉴클레오티드를 이용한 통상의 과정 또는 형광-태그를 이용한 자동화 서열화 과정으로 실행한다. 클론된 DNA 절편을 프로브로 이용하여 특정 DNA 단편을 검출할 수도 있다. PCR과 병용하는 경우에 상기 방법의 감응성은 현저하게 향상된다. 게다가, 예로써 단일 뉴클레오티드에 의해 구별되는 서열의 PCR 증폭을 위한 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 점 돌연변이 및 다형성과 같은 다른 서열 변이, 예를 들면 다형성을 검출할 수 있다.
또한, 변성제 유무에 관계없이 겔에서 DNA 단편의 전기영동 이동성 변화 또는 직접DNA 서열화로 DNA 서열 차이를 확인할 수 있다(Myers et al., Science(1985) 230:1242). 특정 위치에서 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 검정 또는 화학적 절단 방법으로 알 수 있다(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985) 85: 4397-4401).
통상의 겔 전기영동 및 DNA 서열화 방법 이외에, 마이크로결실(microdeletion), 이수체(aneuploidy), 전치(translocation), 역위(inversion)와 같은 돌연변이는 in situ 분석으로 검출할 수 있다(Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA(1993)), 다시 말하면 세포에서 DNA 또는 RNA 서열은 분리 또는 막에 고정할 필요없이 돌연변이를 분석할 수 있다. 형광 in situ 혼성화 반응(FISH)이 현재 가장 일반적으로 이용된다(Trachuck et al., Science, 250, 559-562(1990); Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154(1991)).
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 어레이를 작제하여 유전자 변이, 돌연변이, 다형성을 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 어레이 기술은 널리 공지되어 있고 보편적으로 이용할 수 있는데, 유전자 발현, 유전적 연쇄, 유전자 변이성을 비롯한 분자 유전학에서 다양한 문제를 해결하고 있다(M. Chee et al., Science(1996), Vol 274, pp 610-613).
한 구체예에서, 어레이는 PCT 출원 W095/11995(Chee et al); Lockhart, D. J. et al.(1996) Nat. Biotech. 14. 1675-1680); Schena, M. et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)에 기술된 방법으로 제조하고 이용한다. 올리고뉴클레오티드 쌍은 2 내지 1만개 범위이다. 올리고머는 광-직접 화학 공정을 이용하여 기질상의 지정된 지역에서 합성한다. 기질은 종이, 나일론 또는 다른 종류의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 다른 적절한 고형 서포트이다. 다른 측면에서, PCT 출원 W095/25116(Baldeschweiler et al)에 기술된 바와 같이 화학 결합 과정 및 잉크젯 적용 장치를 이용하여 기질 표면상에 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 도트(또는 슬롯) 블랏과 유사한 “격자” 어레이를 이용하고, 진공 시스템, 열, UV, 기계적 또는 화학적 결합 공정에 따라 지질 표면상에 cDNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 배열하고 연결할 수 있다. 본 명세서에서 어레이는 수동으로 또는 이용가능한 장치(슬롯 블랏 또는 도트 블랏 장치), 재료(임의의 적절한 고형 서포트), 기계(로봇 장치)를 이용하여 만들 수 있고 8개, 24개, 96개, 384개, 1536개 또는 6144개 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 시판되는 장치를 효과적으로 이용할 수 있는 2 내지 1만개 이상 범위의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
상기한 방법에 더하여, 개체에서 유래된 샘플로부터 폴리펩티드 또는 mRNA의 비정상적인 증가 또는 감소를 결정하여 개체의 질병을 진단할 수 있다. 폴리펩티드를 정량하는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블랏, 다른 하이브리드 방법과 같은 핵산 증폭을 이용하여 RNA 수준에서 발현의 증가 또는 감소를 결정할 수 있다.
숙주로부터 유래된 시료에서 본 발명의 폴리펩티드 수준을 결정하는데 이용되는 검정 기술은 당분야에 공지되어 있고, 이들중 일부(방사능면역검사, 경쟁-결합 검사, 웨스턴 블랏 분석, ELISA 검사)는 앞서 상술한다. 본 발명의 이런 특징은 아래의 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한다;
(a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 생물학적 시료와 상기한 리간드를 접촉시키고;
(b) 상기 복합체를 검출한다.
폴리펩티드 수준을 측정하는 ELISA, RIA, FACS와 같은 프로토콜은 폴리펩티드 발현의 변화되거나 비정상적인 수준에 대한 기초를 추가적으로 제공한다. 폴리펩티드 발현에 대한 정상 또는 표준 값은 복합체 형성에 적합한 조건하에서 폴리펩티드에 대한 항체와 정상적인 포유류 개체, 바람직하게는 사람에서 취한 세포 추출물 또는 체액을 복합시켜 확립한다. 표준 복합체 형성 양은 광도계 수단과 같은 다양한 방법으로 정량할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리펩티드 발현으로 특성화되는 질병 또는 상태의 진단, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드, 다른 화합물로 치료되는 환자를 모니터하는 분석에 이용될 수 있다. 진단 목적에 유용한 항체는 치료요법에서와 동일한 방식으로 만들 수 있다. 폴리펩티드의 진단 분석에는 사람 체액, 또는 세포 또는 조직의 추출물에서 폴리펩티드를 검출하는 라벨과 항체를 이용하는 방법이 포함된다. 항체는 변형하거나 변형하지 않고 이용할 수 있고, 리포터 분자와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시켜 라벨링할 수도 있다. 당분야에 공지된 다양한 리포터 분자를 이용할 수 있으며, 일부는 앞서 기술한다.
개체, 대조 및 생검 조직에서 얻은 질병 시료에서 발현된 폴리펩티드의 양은 표준 수치와 비교한다. 표준과 개체 수치간 편차는 질병 진단을 위한 파라미터를 확립한다. 진단 검사를 이용하여 폴리펩티드 발현의 부재, 존재, 과다 발현을 구별하고, 치료 개입 동안 폴리펩티드 수준의 조절을 모니터할 수 있다. 이런 검사를 이용하여 동물 연구, 임상 시험, 개별 환자의 치료 모니터링에서 특정 치료 섭생의 효과를 평가할 수도 있다.
본 발명의 진단 키트는
(a) 본 발명의 핵산 분자;
(b) 본 발명의 폴리펩티드;
(c) 본 발명의 리간드를 포함한다.
본 발명의 한 특징에서, 진단 키트는 엄밀도 조건하에서 본 발명의 핵산과 혼성화될 수 있는 핵산을 보유하는 제 1 용기; 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머를 보유하는 제 2 용기; 질병 진단을 조장하는 프로브와 프라이머의 사용 설명서를 포함한다. 키트에는 혼성화되지 않은 RNA를 절단하는 약품을 보유하는 제 3 용기가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 특징에서, 진단 키트에는 핵산 분자 어레이가 포함되는데, 이중에서 적어도 하나는 본 발명의 핵산 분자이다.
본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위하여, 진단 키트는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 한가지 이상의 항체 및 항체와 폴리펩티드 사이에 결합 반응을 검출하는데 유용한 시약을 포함한다.
이런 키트는 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이 관여하는 질병 또는 질병에 대한 감수성을 진단하는데 유용하다. 이런 질환에는 불임을 비롯한 생식 질환; 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측색 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병리학적 이상이 포함된다. 적절하게는, 질환은 림프구 항원이 관여하는 질환이다. 이들 키트는 불임을 비롯한 생식 장애의 검출에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다양한 특징 및 구체예는 특히 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드와 관련된 실시예를 통하여 상술한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 상세한 설명의 개변은 본 발명에 범위에 포섭된다.
실시예 1 - SECFAM1 계통 구성원의 선별과 정렬
INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117은 공개된 주석이 없고, 신호 펩티드의 형태로 강한 분비 단백질 신호를 보유하며, 다른 동물 종으로부터 오쏘로그(orthologue)에 의해 뒷받침되는 유사 단백질로 집합될 수 있다.
추가적인 검사에서 5가지 인간 유전자(INSP113-117)로 구성되고, 포유동물과 어류 오쏘로그를 비롯한 총 15개의 서열을 포함하는 아직 특성화되지 않은 계통의 단백질이 확인되었다. 이들 서열은 ClustalW(Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson T.J. Nucelic Acids Res 1994 Nov 11;22(22):4673-80)를 이용하여 정렬하였다(도 1). 상기 정렬로부터, 이들 서열에서 유사성과 차이를 분명하게 확인할 수 있다.
SignalP 프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)을 이용하여 INSP113-117 폴리펩티드에 대한 잠재적 신호 펩티드 영역 및 절단 부위를 확인하였다. INSP113(SEQ ID NO:2)에 대한 SignalP 결과는 절단 부위가 SEQ ID NO:2의 25와 26번 사이에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다(도 2). INSP114(SEQ ID NO:6)에 대한 SignalP 결과는 절단 부위가 SEQ ID NO:6의 30과 31번 사이에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다(도 3). INSP115(SEQ ID NO:10)에 대한 SignalP 결과는 절단 부위가 SEQ ID NO:10의 42와 43번 사이에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다(도 4). INSP116(SEQ ID NO:14)에 대한 SignalP 결과는 절단 부위가 SEQ ID NO:14의 30과 31번 사이에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다(도 5). INSP117(SEQ ID NO:26)에 대한 SignalP 결과는 절단 부위가 SEQ ID NO:26의 30과 31번 사이에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다(도 5).
이런 신호 펩티드 영역은 높은 수준의 유사성을 보이는 폴리펩티드의 나머지 부분에 비하여 더욱 가변적인 것으로 밝혀졌다. 전체적으로, 인간 서열 내에서 상동성은 보존된 장기의 강한 프로필과 49% 또는 그 이상이다(도 1). 관련된 서열의 이런 클러스터는 이후 “SECFAM1 계통”이라 한다.
실시예 2 - INSP115
Genome Threader“라고 하는 생물정보학 프로그램에서 AAY53016(INSP115)을 이용한 쿼리에서 결과가 산출되지 않았다. 하지만, AAY53016(INSP115)의 호모 사피엔스 파라로그(paralogue)가 확인되었는데, 이후 CAD38865.1(INSP114)라고 한다. CAD38865.1(INSP114)의 잔기 42-130은 SECFAM1 계통(도 11)에 대한 INSP115의 BLASTP 쿼리에서 AAY53016(INSP115)의 잔기 43-132와 51% 서열 상동성을 보유하는 것으로 확인되었다. CAD38865.1(INSP114)의 잔기 42-130은 EGF-유사 도메인의 구조를 수용할 것으로 예측된 영역(잔기 67-121)을 보유한다. AAY53016(INSP115)이 EGF-유사 도메인의 구조를 수용할 것으로 예측되는 CAD38865.1(INSP114)과 공유하는 높은 서열 동일성에 기초하여, AAY53016(INSP115) 역시 EGF-유사 도메인을 수용할 것으로 예측된다. Chothia and Lesk, 1986, EMBO Journal vol.5 pp823)에서는 50% 이상의 서열 상동을 보유하는 단백질의 경우에, 구성 잔기의 85%가 동일한 형태를 수용한다는 것을 처음으로 입증하였다. 다른 그룹(Sander, C. and Schneider, R.(1991) Proteins vol.9 pp56; Hubbard, T.J.P. and Blundell, T.L.(1987) Protein Engineering vol.1 pp159; Flores, T.P., Orengo, C.A., Moss, D.M. and Thornton, J.M.(1993) Protein Science vol.2 pp1811; Hilbert, M., Bohm, G. and Jaenicke, R.(1993) Protein vol.17 pp138)은 이들 연구를 더욱 확대하여, 서열 동일성이 30%로 낮아지는 경우에도 폴드(fold)는 동일하게 유지된다는 것을 입증하였다.
실시예 3 - INSP117 유전자 모델에 대한 증거
INSP117 유전자 모델 예측은 EST(BM94096)에 의해 검증하였다. 상기 EST는 100% 상동성에서 INSP117(총 134개)의 잔기 7-120을 커버하는 3개의 절단접합 엑손에 걸쳐있다. 상기 EST는 인간 게놈의 Build31에서 chr1:112149567-112151424(+ 가닥)에 위치하였다. 이에 더하여, 번역된 유전자 모델은 다른 SECFAM1 계통 구성원에 매우 강하게 정렬된다(도 1).
실시예 4 - SECFAM1 단백질 내에서 EGF 도메인의 존재에 대한 증거
분비 펩티드로서 이들의 특성화 이외에, SECFAM1 계통 단백질의 주석은 BLAST, CDD, InterPro 스캔 또는 Inpharmatica Domain Professor와 같은 서열- 또는 도메인 프로필-기초한 방식을 이용하여 배치할 수 없었다. 서열 수준에서 거의 관련이 없는 서열 사이에 구조적 폴드가 유지된다는 점을 고려하여, Inpharmatica Genome Threader 프로그램을 이용하여 공지된 구조에 대한 구조적 관계를 검색하였다.
15개 계통 서열 각각을 이용한 Genome Threader 쿼리로부터 얻은 결과에서 반향 구조에서 한가지 경향이 관찰되었다. 구조 1WHE, 2PF2, 2SPT, 1URK는 SECFAM1 서열 쿼리 사이에서 복수의 경우에 모두 적중되었다. 이에 더하여, 이들은 쿼리 서열(계통 정렬)의 동일한 영역을 보유하는 구조의 동일한 영역에서 폴딩되었다. 데이터 세트에서 임의의 폴드 예측의 신뢰성 비율은 70%대 내지 80%대이고, 이들 엔트리는 일반적으로 가장 유의한 결과를 구성하였다(인간 서열 결과에 대한 도 7-10(INSP115는 임의의 결과를 산출하지 않았다)). 단독으로, 이들 적중의 유의성은 임의의 명확한 결론을 도출하기에는 너무 낮았다. 하지만, 이들 동일한 구조가 서열 전체[이들 서열중 일부는 서열 동일성에서 매우 유의하게 이탈한다(가령, INSP113과 INSP114 사이에 68% ID)]에서 지속적으로 적중된다는 사실은 훨씬 강한 관계를 제공한다. 모든 경우에, 계통 서열이 폴딩된 구조의 영역은 EGF-유사 도메인과 관련되었다.
결과의 정렬로부터, 4개의 지속적으로 보존된 시스테인이 존재하는 것으로 관찰되었다(참조: 도 12). 이들 시스테인 잔기는 SECFAM1 계통 정렬에서 106, 111, 117, 128번 위치에 해당하였다(도 1). 더 나아가, 이들 보존된 잔기는 공지된 구조 내에서 이황화 가교의 형성에 관여한다.
도 8에서는 SECFAM1 계통에 대한 잔기 빈도의 프로필을 도시한다. 상기 프로필은 상기 계통의 독특한 특징을 나타낸다. 상기 프로필은 신규한 서열 INSP117을 주형으로 이용하여 작제하였는데, 상기 주형으로부터 정렬상의 INSP117의 개별 잔기에 의해 점유된 각 위치에서 임의의 아미노산 잔기를 발견할 가능성을 계산하였다. 이후, 이들 계산 결과는 잔기 INSP117에 의해 범위가 한정된 정렬상의 각 위치에서 20개 아미노산 잔기 각각에 대한 확률 스코어의 표로서 제시하였다.
실시예 5 - 조직 분포
2개 이상의 엑손에서 절단접합하는 것으로 확인된 발현된 서열 태그(expressed sequence tag)는 모든 5개 서열을 뒷받침하였다. 각 EST 대응에 대한 정보는 표 1에서 확인할 수 있다. 상기 정보는 중추신경계 조직에서 INSP113-117 유전자 발현의 상향-조절을 암시하였다.
[표 1]
서열 EST 수탁 번호. 조직
INSP113 H23443.1 전뇌(유아)
AW955725.1 결장암
INSP114 AA984082 뇌: 전두엽
AA984097 뇌: 전두엽
H08484 전뇌(유아)
INSP115 BI596893 뇌: 시상하부
BI915401 뇌
BI599742 뇌: 시상하부
INSP116 BI599941 뇌: 시상하부
INSP117 BM694096 눈: 망막
BQ638101 눈: 망막
표 1: 발현 서열 태그(EST)는 수탁 번호를 보이는 5가지 인간 유전자 및 이들이 발현된 조직에 대응된다.
실시예 6 - SECFAM1 계통 프로필
도 13에서는 SECFAM1 계통에 대한 위치-특이적 스코어 매트릭스, 또는 프로필을 도시한다. 상기 프로필은 먼저 서열을 복수 정렬함으로써 획득하였다. 주형 서열, 본원의 경우에 INSP117을 선택하고, 이를 중심으로 프로필을 구성하였다. 가능한 20개 아미노산 유형 각각의 빈도는 주형 서열의 잔기에 의해 점유되는 계통 복수 서열 정렬의 각 칼럼에서 사정하였다. 계통 정렬의 각 위치에서 각 아미노산 잔기 유형의 스코어는 BLOSUM62 위치-독립된 배경 매트릭스에 기초하여, 빈도 스코어 및 이런 잔기 유형 우성 잔기의 치환을 관찰할 가능성에 기초하여 계산하였다(Henikoff & Henikoff, 1992. Proc. Nail. Acad. Sci USA, 89:10915-9). 상기 매트릭스는 아미노산 치환 빈도가 62% 이상의 상동성으로 집합된 정렬에 기초하여 사정된 계통 정렬 블록(BLOcks SUbstitution Matrix)의 대규모 데이터세트에 기초한다. 이런 경우에, 이들 인자는 함께 합쳐, SECFAM1 정렬의 각 위치에서 각 아미노산 유형에 대한 대수-기초한 스코어를 제공하였다. 최대 양성 스코어는 상기 위치에서 발견될 가능성이 가장 높은 아미노산을 나타낸다. 이런 프로필을 이용하여 쿼리 서열의 정렬 스코어를 확인할 수 있다. 각 위치에서, 아미노산에 상응하는 수치를 도출하고, 쿼리 서열의 각 아미노산에 대한 이들 스코어의 총합은 상기 서열에 대한 정렬 스코어를 구성한다. 이것이 특정 역치 이상이면, 쿼리 서열은 계통과 유의하게 관련된다. 이후, 상기 프로필은 계통에 대한 고감도 통계 표준을 구성한다.
실시예 7 - INSP113의 클로닝
7.1 인간 cDNA 주형의 제조
첫 번째 가닥 cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라, Superscript II RNase H- 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 다양한 정상 인간 조직 전체 RNA 샘플(Clontech, Ambion, 사내 샘플)로부터 준비하였다. 올리고(dT)5 프라이머(500 ㎍/㎖에서 1㎕)(Promega), 2 ㎍ 인간 전체 RNA, 1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물(각각 10 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 중성 pH), 무균 증류수(12 ㎕ 최종 부피)는 1.5 ㎖ Eppendorf 튜브에 합치고 5분동안 65℃로 가열하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 내용물은 짧은 원심분리로 수거하고 4 ㎕의 5X 일차-가닥 완충액, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 저해물질(40 unit/㎕, Invitrogen)을 첨가하였다. 튜브의 내용물은 부드럽게 혼합하고 42℃에서 2분동안 배양하였다; 이후, 1 ㎕(200 unit)의 SuperScript II 효소를 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 부드럽게 혼합하였다. 혼합물은 42℃에서 50분동안 배양하고, 이후 70℃에서 15분동안 가열하여 불활성화시켰다. cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위하여, 1 ㎕(2 unit)의 대장균(E. coli) RNase H(Invitrogen)를 첨가하고, 반응 혼합물은 37℃에서 20분동안 배양하였다. 최종 21 ㎕ 반응 혼합물은 179 ㎕ 무균수를 첨가하여 희석하고 200 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. INSP113의 증폭을 위한 주형으로 이용되는 인간 cDNA 라이브러리 샘플은 결장, 뇌, 신장으로부터 획득하였다.
7.2 cDNA 라이브러리
인간 cDNA 라이브러리(박테리오파지 람다(λ) 벡터)는 Clontech로부터 구입하거나 λ GT10 벡터에 사내 제조하였다. 박테리오파지 λ DNA는 제조업자(Promega, Corporation, Madison WI)의 프로토콜에 따라, Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템을 이용하여 감염된 대장균(E. coli) 숙주 균주의 소규모 배양액으로부터 준비하였다. INSP113의 증폭을 위한 주형으로 이용되는 인간 cDNA 라이브러리 샘플은 성인 뇌 피질, 태아 뇌, 태아 신장으로부터 획득하였다.
7.3 PCR을 위한 유전자 특이적 클로닝 프라이머
18개 내지 25개 염기 길이를 보유하는 한 쌍의 PCR 프라이머는 Primer Designer Software(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)를 이용한 가상 cDNA의 완전 코딩 서열을 증폭하기 위하여 설계되었다. PCR 프라이머는 55 ± 10℃에 근접하는 Tm 및 40-60%의 GC 함량을 보유하도록 최적화되었다. 비-특이적인 프라임 없이 표적 서열(INSP113)에 높은 선택성을 보유하는 프라이머가 선택되었다.
7.4 다양한 인간 cDNA 주형과 파아지 라이브러리 cDNA로부터 INSP113의 PCR 증폭
유전자-특이적 클로닝 프라이머(INSP113-CP1과 INSP113-CP2, 도 15-17과 표 2)는 INSP113 예측의 전체 399 bp 코딩 서열을 커버하는 420 bp의 cDNA 단편을 증폭하기 위하여 설계되었다. INSP113 예측으로 공개 EST 서열 데이터베이스의 검색은 상기 서열이 성인과 태아 뇌, 성인과 태아 신장, 결장 cDNA 주형에서 발현된다는 것을 암시하였다. 이런 이유로, 유전자-특이적 클로닝 프라이머 INSP113-CP1과 INSP113-CP2는 섹션 7.1에 기재된 인간 cDNA 샘플 및 PCR 주형으로서 섹션 7.2에 기재된 파아지 라이브러리 cDNA 샘플과 함께 이용되었다. PCR은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 각각 50 pmole의 클로닝 프라이머, 2.5 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer), 100 ng의 인간 cDNA 주형을 함유하는 50 ㎕ 최종 부피에서 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 1분, 51℃에서 1분, 72℃에서 1분의 40회 주기; 이후, 72℃에서 7분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
50 ㎕의 각 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 시각화시켰다. 성인 뇌의 첫 번째 가닥 cDNA 주형에 상응하는 샘플에서 대략 예측된 분자량으로 이동하는 단일 PCR 산물이 관찰되었다. 태아 뇌의 cDNA 라이브러리 주형에 상응하는 샘플에서 대략 500 bp로 이동하는 두 번째 PCR 산물이 관찰되었다. 이들 2개의 PCR 산물은 Wizard PCR Preps DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔로부터 정제하였다. 각 PCR 산물은 50㎕ 무균수에 용리시키고 직접 서브클론하였다.
[표 2]
INSP113 클로닝과 서열분석 프라이머
밑줄 표시된 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종결 코돈
이탤릭체 서열 = His tag
7.5 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
이들 PCR 산물은 제조업자에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO)에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen)에 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분동안 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초동안 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음에 환원하고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 교반(220 rpm)하면서 배양하였다. 형질전환 혼합물(300 ㎕)은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
7.6 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 20 pmole T7 프라이머, 20 pmole T3 프라이머, 1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 함유하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 1분의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 예상 PCR 산물 크기(복수 클로닝 부위(MCS)에 기인한 420 bp 또는 대략 500 bp cDNA + 105 bp)를 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
7.7 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업자의 지시에 따라 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 100 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Eppendorf BO 광도계 또는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T7 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 2에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서 예상 INSP113 서열에 100% 대응을 보유하는 성인 뇌 DNA로부터 증폭된 클론이 확인되었다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 16에 도시한다. 클론된 PCR 산물(pCR4-TOPO-INSP113)(플라스미드 ID.13887)의 플라스미드 지도는 도 18에 도시한다.
INSP113 예측의 절단접합 변이체를 보유하는 두 번째 클론이 확인되었다. 상기 산물은 태아 뇌 cDNA 라이브러리로부터 증폭되었다. 이는 예상 엑손 1과 2 사이에 추가의 엑손을 보유하는데, 상기 추가의 엑손은 216 bp의 ORF를 결과하는 종결 코돈을 보유하였다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 17에 도시한다. 클론된 PCR 산물(pCR4-TOPO-INSP113sv)(플라스미드 ID13888)의 플라스미드 지도는 도 19에 도시한다.
실시예 8 - HK293/EBNA 세포에서 INSP113과 INSP113sv의 발현을 위한 플라스미드의 작제
DNA 서열분석으로 확인된 INSP113 또는 INSP113sv의 전체 코딩 서열(ORF)을 보유하는 pCR4-TOPO 클론(pCR4-TOPO-INSP113, 플라스미드 ID 13887(도 18), 또는 pCR4-TOPO-INSP113sv, 플라스미드 ID 13888(도 19))은 GatewayTM 클로닝 기술(Invitrogen)로 각 삽입체를 포유동물 세포 발현 벡터 pEAK12d(도 21)와 pDEST12.2(도 22)로 서브클론하는데 이용하였다.
8.1 인-프레임 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환성 INSP113 ORF와 INSP113sv ORF의 산출
Gateway 클로닝 과정의 첫 번째 단계는 5' 말단에서 attB1 재조합 부위와 Kozak 서열과 접하고, 3' 말단에서 인-프레임 6 히스티딘(6HIS) 태그, 종결 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환성 cDNA)를 인코딩하는 서열과 접하는 INSP113 또는 INSP113sv의 ORF를 산출하는 2단계 PCR 반응을 수반한다. 첫 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 1.5 ㎕의 pCR4-TOPO-INSP113(플라스미드 ID 13887) 또는 1.5 ㎕의 pCR4-TOPO-INSP113sv(플라스미드 ID 13888), 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 유전자 특이적 프라이머(100 μM)(INSP113-EX1과 INSP113-EX2, 또는 INSP113sv-EX1과 INSP113sv-EX2), 2.5 ㎕의 10X EnhancerTM 용액(Invitrogen), 1 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. PCR 반응은 95℃에서 2분의 최초 변성 단계; 이후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분 30초의 15회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 증폭 반응물로부터 직접 정제하였다.
두 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 10 ㎕ 정제된 PCR 1 산물, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 Gateway 전환 프라이머(100 μM)(GCP 전방과 GCP 후방), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 1분; 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 68℃에서 3분의 4회 주기; 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 3분의 19회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔 정제하였다.
8.2 게이트웨이 엔트리 벡터 pDONR221 및 발현 벡터 pEAK12d와 pDEST12.2로 Gateway 호환성 INSP113 ORF와 INSP113sv ORF의 서브클로닝.
Gateway 클로닝 과정의 두 번째 단계는 아래와 같이 Gateway 엔트리 벡터 pDONR221(Invitrogen, 도 20)로 Gateway 변형된 PCR 산물의 서브클로닝을 수반한다: PCR2로부터 5 ㎕의 정제된 산물은 실온에서 1시간동안 10 ㎕의 최종 부피로 1 ㎕ pDONR221 벡터(0.15 ㎍/㎕), 2 ㎕ BP 완충액, 1.5 ㎕의 BP 클로나아제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 배양하였다. 반응은 단백분해효소 K 1 ㎕(2 ㎍/㎕)를 첨가하여 중단시키고 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(2 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 30 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕ BP 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 카나마이신(40 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 2에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
이후, 정확한 서열을 보유하는 클론(pENTR-INSP113-6HIS, 플라스미드 ID 14216, 도 23; pENTR-INSP113sv-6HIS, 플라스미드 ID 14223, 도 24) 중에서 하나로부터 유래된 플라스미드 용출액(2 ㎕)은 10 ㎕ 최종 부피로 1.5 ㎕의 pEAK12d 벡터 또는 pDEST12.2 벡터(도 21 & 22)(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ LR 완충액, 1.5 ㎕ LR 클로나아제(Invitrogen)를 함유하는 재조합 반응물에 이용하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하고, 단백분해효소 K(2 ㎍)의 첨가로 중단시키며 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 30 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ LR 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. pEAK12d 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 pEAK12F와 pEAK12R 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. pDEST12.2 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 2에 도시한다.
CsCl 구배 정제된 maxi-prep DNA는 Sambrook J. et al., 1989, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술된 방법을 이용하여, 서열 검증된 클론(pEAK12d-INSP113-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14225(도 25), pEAK12d-INSP113sv-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14227(도 26), pDEST12.2-INSP113-6HIS, 플라스미드 ID 14226(도 27), pDEST12.2-INSP113sv-6HIS, 플라스미드 ID 14260(도 28)) 각각의 500 ㎖ 배양액으로부터 준비하고, 플라스미드 DNA는 무균수에서 1 ㎍/㎕의 농도로 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 9 - INSP114의 클로닝
9.1 인간 cDNA 주형의 제조
첫 번째 가닥 cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라, Superscript II RNase H- 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 다양한 정상 인간 뇌 RNA 샘플(Clontech)로부터 준비하였다. 올리고(dT)5 프라이머(500 ㎍/㎖에서 1㎕)(Promega), 2 ㎍ 인간 뇌 전체 RNA, 1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물(각각 10 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 중성 pH), 무균 증류수(12 ㎕ 최종 부피)는 1.5 ㎖ Eppendorf 튜브에 합치고 5분동안 65℃로 가열하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 내용물은 짧은 원심분리로 수거하고 4 ㎕의 5X 일차-가닥 완충액, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 저해물질(40 unit/㎕, Invitrogen)을 첨가하였다. 튜브의 내용물은 부드럽게 혼합하고 42℃에서 2분동안 배양하였다; 이후, 1 ㎕(200 unit)의 SuperScript II 효소를 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 부드럽게 혼합하였다. 혼합물은 42℃에서 50분동안 배양하고, 이후 70℃에서 15분동안 가열하여 불활성화시켰다. cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위하여, 1 ㎕(2 unit)의 대장균(E. coli) RNase H(Invitrogen)를 첨가하고, 반응 혼합물은 37℃에서 20분동안 배양하였다. 최종 21 ㎕ 반응 혼합물은 179 ㎕ 무균수를 첨가하여 희석하고 200 ㎕의 최종 부피를 제공하였다.
9.2 cDNA 라이브러리
인간 cDNA 라이브러리(박테리오파아지 람다(λ) 벡터)는 Clontech로부터 구입하거나 λ GT10 벡터에 사내 제조하였다. 박테리오파아지 λ DNA는 제조업자(Promega, Corporation, Madison WI)의 프로토콜에 따라, Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템을 이용하여 감염된 대장균(E. coli) 숙주 균주의 소규모 배양액으로부터 준비하였다. INSP114의 증폭을 위한 주형으로 이용되는 인간 cDNA 라이브러리 샘플은 성인과 태아 뇌로부터 획득하였다.
9.3 PCR을 위한 유전자 특이적 클로닝 프라이머
18개 내지 25개 염기 길이를 보유하는 한 쌍의 PCR 프라이머는 Primer Designer Software(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)를 이용한 가상 cDNA의 완전 코딩 서열을 증폭하기 위하여 설계되었다. PCR 프라이머는 55 ± 10℃에 근접하는 Tm 및 40-60%의 GC 함량을 보유하도록 최적화되었다. 비-특이적인 프라임 없이 표적 서열(INSP114)에 높은 선택성을 보유하는 프라이머가 선택되었다.
9.4 다양한 인간 cDNA 주형과 파아지 라이브러리 cDNA로부터 INSP113의 PCR 증폭
유전자-특이적 클로닝 프라이머(INSP114-CP1과 INSP114-CP2, 도 29-30과 표 3)는 INSP114 예측의 전체 393 bp 코딩 서열을 커버하는 439 bp의 cDNA 단편을 증폭하기 위하여 설계되었다. INSP114 예측으로 공개 EST 서열 데이터베이스의 검색은 상기 서열이 뇌 cDNA 주형에서 발현된다는 것을 암시하였다. 이런 이유로, 유전자-특이적 클로닝 프라이머 INSP114-CP1과 INSP114-CP2는 섹션 8.1에 기재된 인간 cDNA 샘플 및 PCR 주형으로서 섹션 8.2에 기재된 파아지 라이브러리 cDNA 샘플과 함께 이용되었다. PCR은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 각각 50 pmole의 클로닝 프라이머, 2.5 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer), 100 ng의 인간 cDNA 주형을 함유하는 50 ㎕ 최종 부피에서, 아래와 같은 예정에 따라 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 40회 주기; 이후, 72℃에서 7분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
[표 3]
INSP114 클로닝과 서열분석 프라이머
밑줄 표시된 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종결 코돈
이탤릭체 서열 = His tag
50 ㎕의 각 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 시각화시켰는데, 뇌의 첫 번째 가닥 cDNA 주형에 상응하는 샘플에서 대략 예측된 분자량으로 이동하는 단일 PCR 산물이 관찰되었다. 상기 PCR 산물은 Qiagen MinElute DNA 정제 시스템(Qiagen)을 이용하여 정제하고 10㎕ EB 완충액(10 mM Tris.Cl, pH 8.5)에 용리시키고 직접 서브클론하였다.
9.5 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
상기 PCR 산물은 제조업자에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO)에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 인간 뇌 cDNA 증폭으로부터 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen)에 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분동안 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초동안 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음에 환원하고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 교반(220 rpm)하면서 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
9.6 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 20 pmole T7 프라이머, 20 pmole T3 프라이머, 1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 함유하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 1분의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 반응 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 예상 PCR 산물 크기(복수 클로닝 부위(MCS)에 기인한 439 bp cDNA + 105 bp)를 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
9.7 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업자의 지시에 따라 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 100 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Eppendorf BO 광도계 또는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T7 프라이머와 T3 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서 예상 INSP114 서열에 100% 대응을 보유하는 클론이 확인되었다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 29에 도시한다. 클론된 PCR 산물(pCR4-TOPO-INSP114)(플라스미드 ID.14213)의 플라스미드 지도는 도 31에 도시한다.
9.8 IMAGE cDNA 클론의 확인과 서열분석
INSP114 예측으로 공개 EST 서열 데이터베이스의 검색에서 INSP114 서열의 일부에 상응하는 다수의 인간 EST가 확인되었다. 이들 EST는 뇌와 고환 주형으로부터 유래되었다. INSP114 코딩 서열의 첫 385 bp에 100% 대응을 보이는 1개의 EST, GenBank Accession AA984082가 확인되었다. 상응하는 클론, IMAGE ID 1616371은 ATCC로부터 구입하였다. 상기 IMAGE 클론의 삽입체는 T7과 T3 서열분석 프라이머 및 증폭 프라이머 INSP114-CP1과 INSP114-CP2를 이용하여 서열분석하였다. IMAGE 클론 삽입체는 INSP114 서열의 첫 3개의 엑손에 정확하게 상응하는 것으로 밝혀졌다. 마지막 엑손은 3개의 아미노산 및 이후의 종결 코돈으로 구성되었다. INSP114 서열에서, 이들 아미노산은 VTH(Val-Thr-His)이었다. IMAGE 클론에서, 이들 3개의 아미노산은 ANV(Ala-Asn-Val)이었고, 종결 코돈이 뒤에 위치하였다. IMAGE 클론 1616371은 INSP114-SV1에 상응하고 플라스미드 ID 14211이다. INSP114 cds 및 IMAGE 클론 1616371의 상응하는 영역의 정렬은 도 32와 33에 도시한다.
9.9 3'RACE(cDNA 말단의 급속 증폭)
IMAGE 클론 1616371이 발현된 서열로부터 상이한 엑손 4를 보유하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 임의의 다른 엑손 4 서열이 존재하는 지를 확인하기 위하여 INSP114 예측으로부터 3' RACE를 수행하였다. INSP114 예측으로 공개 EST 서열 데이터베이스의 검색에서 뇌와 고환 주형으로부터 유래된 다수의 상응하는 인간 EST가 확인되었다. 이런 이유로, 3' RACE 반응을 위한 주형으로 뇌와 고환 cDNA 샘플이 선택되었다.
9.10 3'RACE 증폭 반응
3' RACE는 제조업자의 지시에 따라 GeneRacerTM 시스템(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. RNA 주형을 제외한 모든 반응 성분을 상기 시스템에 공급하였다. 뇌와 고환 RNA(Clontech, Ambion)는 제조업자의 프로토콜에 따라, 공급된 GeneRacerTM 올리고 dT 프라이머(표 3)와 SuperScript II RNase 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 3' RACE-일차 가닥 cDNA로 전환시켰다. 간단히 말하면, 1 ㎕ GeneRacerTM 올리고 dT 프라이머(50 μM), 1 ㎕ dNTP 혼합물(1O mM), 5 ㎍ 전체 RNA 샘플, DEPC-처리된 무균수는 1.5 ㎖ Eppendorf 튜브에서 12 ㎕ 최종 부피로 혼합하고, 65℃에서 5분동안 가열하고 2분동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 내용물은 짧은 원심분리로 수거하고 4 ㎕의 5X 일차-가닥 완충액, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 저해물질(40 unit/㎕, Invitrogen), 1 ㎕ SuperScript II RT(200 U/㎕)을 첨가하였다. 내용물은 부드럽게 혼합하고 짧은 원심분리로 수거하며 42℃에서 50분동안 배양하고, 이후 70℃에서 15분동안 가열하여 불활성화시켰다. 혼합물은 얼음 위에서 2분동안 냉각시키고, 내용물은 짧은 원심분리로 재수거하고, cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위하여 1 ㎕(2 unit)의 대장균(E. coli) RNase H(Invitrogen)를 첨가하였다. 혼합물은 37℃에서 20분동안 배양하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 첫 번째 가닥 cDNA는 RACE 반응에 사용하기에 앞서 -20℃에서 보관하였다.
한 쌍의 유전자 특이적 nested 3'RACE 프라이머(INSP114-GR1-3'과 INSP114-GR1nest-3', 표 3)는 각각 INSP114 서열의 엑손 2와 엑손 3 내에 설계하였다. 이들 프라이머는 각각 GeneRacerTM 3' 프라이머와 GeneRacerTM 3' Nested 프라이머와 공동으로 연속 RACE PCR에 이용되었다. 일차 증폭 반응을 위하여, 1X Platinum® Taq High Fidelity PCR 완충액, 2 mM MgS04, 200 μM dNTP, 0.2 μM의 INSP114-GR1-3' 프라이머, 0.6 μM의 GeneRacerTM 3' 프라이머, 2.5 unit의 Platinum® Taq High Fidelity DNA 중합효소(Invitrogen), 2 ㎕의 3' GeneRacerTM-뇌 일차 가닥 cDNA 또는 3' GeneRacerTM-고환 일차 가닥 cDNA 주형은 50 ㎕ 최종 부피로 합쳤다. 증폭 사이클링은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 72℃에서 3분의 5회 주기; 94℃에서 30초, 70℃에서 3분의 5회 주기; 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 3분의 25회 주기; 이후 68℃에서 10분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
2차 PCR을 위하여, 1 ㎕의 PCR1 산물은 50 ㎕의 최종 부피로 1X Platinum® Taq High Fidelity PCR 완충액, 2 mM MgSO4, 200 μM dNTP, 0.2 μM의 INSP114-GR1nest-3' 프라이머, 0.2 μM의 GeneRacerTM Nested 3' 프라이머, 2.5 unit의 Platinum® Taq High Fidelity DNA 중합효소(Invitrogen)와 합쳤다. 증폭 사이클링은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 3분의 25회 주기; 이후 68℃에서 10분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
50 ㎕의 각 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 시각화시켰다. 여러 밴드가 겔의 각 레인에서 관찰되었다. 1개의 밴드는 뇌 cDNA PCR1로부터 절제되었고, 1개의 밴드는 뇌 cDNA PCR2로부터 절제되었고, 3개의 밴드는 고환 PCR2로부터 절제되었다. 이들 PCR 산물은 Qiagen MinElute DNA 정제 시스템(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 각 산물은 10㎕ EB 완충액(10mM Tris.Cl, pH 8.5)에 용리시키고 직접 서브클론하였다.
9.11 3'RACE PCR 산물의 서브클로닝
각 RACE PCR 산물은 제조업자에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO)에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 인간 뇌 cDNA 증폭으로부터 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen)에 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분동안 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초동안 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음에 환원하고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 교반(220 rpm)하면서 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
9.12 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 20 pmole T7 프라이머, 20 pmole T3 프라이머, 1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 함유하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 1분 30ch 또는 3분(예상 삽입체의 크기에 따라)의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 반응 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 삽입체를 보유하는, 다시 말하면, 복수 클로닝 부위에 기인한 105 bp 이상의 PCR 산물 크기를 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
9.13 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업자의 지시에 따라 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 100 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Eppendorf BO 광도계 또는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T7 프라이머와 T3 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서 pCR4-TOPO-INSP114 클론(플라스미드 ID 14213) 또는 IMAGE 클론 1616371(플라스미드 ID 14211)에서처럼 동일한 엑손 4 서열을 보유하는 여러 클론이 확인되었다. 하지만, 엑손 4의 세 번째 이형을 보유하는 클론은 확인되지 않았다. 상기 경우에, 엑손 4는 단일 아미노산 W(Trp) 및 이후의 종결 코돈으로만 구성되었다. 이는 엑손 3의 인트론 서열로의 연속이 아닌 절단접합된 엑손 4를 나타낸다. 상기 서열은 고환 cDNA 주형으로부터 증폭되었다. RACE 반응 산물의 서열은 도 34에 도시한다. 클론된 산물, pCR4-TOPO-INSP114-GR1의 지도는 도 35에 도시한다. 상기 클론은 플라스미드 ID 15939이다.
9.14 INSP114 예측된 엑손 1-3 및 RACE-확인된 엑손 4를 보유하는 클론의 산출
RACE 증폭과 클로닝 반응에서 새로운 INSP114 엑손 4가 확인되었지만, 이런 새로운 엑손 4 서열을 보유하는 전상 INSP114 서열을 포함하는 클론이 요구되었다. INSP114-SV2라고 하는 이런 이형 서열은 최초 엑손 3을 새로운 이형으로 대체한 한 쌍의 PCR 프라이머를 이용하여 pCR-TOPO-INSP114 클론, 플라스미드 ID 14213으로부터 조작하였다. 이들 프라이머는 엑손 4 서열의 매우 짧은 길이로 인하여 cDNA 주형에서 검사되지 못하고, PCR 프라이머에 의해 엑손 1-3 서열을 보유하는 임의의 cDNA 주형에 부가되었다.
한 쌍의 유전자-특이적 클로닝 프라이머, INSP114-CP3과 INSP114-CP4(표 3)는 INSP114 서열을 증폭하고 이와 동시에 엑손 4 서열을 치환하기 위하여 설계되었다. PCR 반응은 1X Platinum® Taq High Fidelity PCR 완충액, 2 mM MgS04, 200 μM dNTP, 각각 10 pmole의 클로닝 프라이머, 2.5 unit의 Platinum® Taq High Fidelity DNA 중합효소(Invitrogen), 1 ㎕의 플라스미드 ID 14213을 함유하는 50 ㎕ 최종 부피에서 수행하였다. 증폭 사이클링은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초의 30회 주기; 이후, 68℃에서 7분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
50 ㎕의 각 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 시각화시켰는데, 대략 예측된 분자량으로 이동하는 단일 PCR 산물이 관찰되었다. 상기 PCR 산물은 Wizard PCR Preps DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 정제하고, 50㎕ 물에서 용리시키고 직접 서브클론하였다.
9.15 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
상기 PCR 산물은 제조업자에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO)에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 인간 뇌 cDNA 증폭으로부터 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen)에 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분동안 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초동안 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음에 환원하고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 교반(220 rpm)하면서 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
9.16 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 20 pmole T7 프라이머, 20 pmole T3 프라이머, 1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 함유하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 30초의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 반응 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 예상 PCR 산물 크기(복수 클로닝 부위(MCS)에 기인한 390 bp cDNA + 105 bp)를 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
9.17 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업자의 지시에 따라 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 100 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Eppendorf BO 광도계 또는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T7 프라이머와 T3 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서 대체 엑손 4 서열을 보유하는 예상 INSP114-SV2 서열에 100% 대응을 보유하는 클론이 확인되었다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 36에 도시한다. 클론된 PCR 산물(pCR4-TOPO-INSP114-SV2)(플라스미드 ID.14426)의 플라스미드 지도는 도 37에 도시한다.
실시예 10 - INSP114, INSP114-SV1, INSP114-SV2에 대한 포유동물 세포 발현 벡터의 작제
플라스미드 14213, 14211, 14426은 GatewayTM 클로닝 방법(Invitrogen)으로, 각각 INSP114, INSP114-SV1 또는 INSP114-SV2 ORF 서열을 보유하고, 3' 서열이 6HIS 태그를 인코딩하는 pEAK12d(도 42, 45 & 48)와 pDEST12.2(도 43, 46 & 49) 발현 클론을 산출하기 위한 PCR 주형으로 이용하였다.
10.1 인-프레임 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환성 INSP114, INSP114-SV1, INSP114-SV2 ORF의 산출
Gateway 클로닝 과정의 첫 번째 단계는 5' 말단에서 attB1 재조합 부위와 Kozak 서열과 접하고, 3' 말단에서 인-프레임 6 히스티딘(6HIS) 태그, 종결 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환성 cDNA)를 인코딩하는 서열과 접하는 INSP114, INSP114-SV1, INSP114-SV2의 ORF를 산출하는 2단계 PCR 반응을 수반한다. 첫 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 1 ㎕(40 ng)의 플라스미드 14213, 14211 또는 14426, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 10 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 유전자 특이적 프라이머(100 μM)(INSP114의 경우에 INSP114-EX1과 INSP114-EX2, INSP114-SV1의 경우에 INSP114-EX1과 INSP114-EX3, INSP114-SV2의 경우에 INSP114-EX1과 INSP114-EX4), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. PCR 반응은 95℃에서 2분; 이후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 12회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로즈 겔에서 시각화시키고, 예측된 분자량으로 이동하는 산물은 제조업자의 지시에 따라 Wizard PCR Prep DNA 정제 시스템(progema)을 이용하여 겔로부터 정제하고 50 ㎕ 무균수에서 회수하였다.
두 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 10 ㎕ 정제된 PCR 1 산물, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 Gateway 전환 프라이머(100 μM)(GCP 전방과 GCP 후방), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 1분; 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 68℃에서 2분의 4회 주기; 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 25회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔 정제하였다.
10.2 게이트웨이 엔트리 벡터 pDONR221 및 발현 벡터 pEAK12d와 pDEST12.2로 Gateway 호환성 INSP114, INSP114-SV1, INSP114-SV2 ORF의 서브클로닝.
Gateway 클로닝 과정의 두 번째 단계는 아래와 같이 Gateway 엔트리 벡터 pDONR221(Invitrogen, 도 38)로 Gateway 변형된 PCR 산물의 서브클로닝을 수반한다: PCR2로부터 5 ㎕의 정제된 산물은 실온에서 1시간동안 10 ㎕의 최종 부피로 1 ㎕ pDONR221 벡터(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ BP 완충액, 1.5 ㎕의 BP 클로나아제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 배양하였다. 반응은 단백분해효소 K 1 ㎕(2 ㎍/㎕)를 첨가하여 중단시키고 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ BP 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 카나마이신(40 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
이후, 정확한 서열을 보유하는 클론(pENTR-INSP114-6HIS, 플라스미드 ID 14391, 도 41; pENTR-INSP114sv-6HIS, 플라스미드 ID 14392, 도 44, 또는 pENTR-INSP114sv-6HIS, 플라스미드 ID 14689, 도 47) 중에서 하나로부터 유래된 플라스미드 용출액(2 ㎕ 또는 대략 150 ng)은 10 ㎕ 최종 부피로 1.5 ㎕의 pEAK12d 벡터 또는 pDEST12.2 벡터(도 39 & 40)(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ LR 완충액, 1.5 ㎕ LR 클로나아제(Invitrogen)를 함유하는 재조합 반응물에 이용하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하고, 단백분해효소 K(2 ㎍)의 첨가로 중단시키며 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ LR 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 L-액체배지(LB)에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 각 벡터에서 서브클론된 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. pEAK12d 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 pEAK12F와 pEAK12R 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. pDEST12.2 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다.
CsCl 구배 정제된 maxi-prep DNA는 Sambrook J. et al., 1989, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술된 방법을 이용하여, 서열 검증된 클론(pEAK12d-INSP114-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14396(도 42), pEAK12d-INSP114-SV1-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14397(도 45), pEAK12d-INSP114-SV2-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14695(도 48), pDEST12.2-INSP114-6HIS, 플라스미드 ID 14408(도 43), pDEST12.2-INSP114-SV1-6HIS, 플라스미드 ID 14409(도 46), pDEST12.2-INSP114-SV2-6HIS, 플라스미드 ID 14696(도 49)) 각각의 500 ㎖ 배양액으로부터 준비하고, 플라스미드 DNA는 무균수(또는 10 mM Tris-HCl pH 8.5)에서 1 ㎍/㎕의 농도로 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 11 - INSP115의 클로닝
INSP115는 4개의 엑손에서 인코딩된 132개 아미노산 단백질(396 bp)에 대한 예측이다. 전장 cds를 이용한 공개 EST 데이터베이스 검색에서, INSP115 서열에 대응되는 여러 서열이 확인되었다. IMAGE cDNA 클론 5299791에 상응하는 1개의 서열, GenBank Accession BI599742를 선택하고, 상기 클론을 ATCC로부터 구입하였다. 상기 IMAGE 클론의 삽입체 서열은 T7과 T3 서열분석 프라이머를 이용하여 서열분석하였다(표 4). 상기 삽입체 서열은 INSP115 cds를 보유하는 것으로 밝혀졌다. IMAGE 클론 5299791은 플라스미드 데이터베이스 ID 14210이다. IMAGE 클론 삽입체의 전장은 INSP115에 상응하는 영역이 확인된 이후에도 서열분석되지 않았다.
[표 4]
INSP115 클로닝과 서열분석 프라이머
밑줄 표시된 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종결 코돈
이탤릭체 서열 = His 태그
INSP115 예측의 서열은 도 50에 도시한다. IMAGE 클론 5299791의 상응하는 영역은 뉴클레오티드 수준에서 INSP115 cds에 일치하였다.
실시예 12 - INSP115에 대한 포유동물 세포 발현 벡터의 작제
플라스미드 14210은 GatewayTM 클로닝 방법(Invitrogen)으로, INSP115 ORF 서열을 보유하고, 3' 서열이 6HIS 태그를 인코딩하는 pEAK12d(도 55)와 pDEST12.2(도 56) 발현 클론을 산출하기 위한 PCR 주형으로 이용하였다.
12.1 인-프레임 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환성 INSP115 ORF의 산출
Gateway 클로닝 과정의 첫 번째 단계는 5' 말단에서 attB1 재조합 부위와 Kozak 서열과 접하고, 3' 말단에서 인-프레임 6 히스티딘(6HIS) 태그, 종결 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환성 cDNA)를 인코딩하는 서열과 접하는 INSP115의 ORF를 산출하는 2단계 PCR 반응을 수반한다. 첫 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 1 ㎕(40 ng)의 플라스미드 ID 14210, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 10 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 유전자 특이적 프라이머(100 μM)(INSP115-EX1과 INSP115-EX2), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. PCR 반응은 95℃에서 2분의 최초 변성 단계; 이후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 12회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로즈 겔에서 시각화시키고, 예측된 분자량으로 이동하는 산물은 제조업자의 지시에 따라 Wizard PCR Prep DNA 정제 시스템(progema)을 이용하여 겔로부터 정제하고 50 ㎕ 무균수에서 회수하였다.
두 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 10 ㎕ 정제된 PCR 1 산물, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 Gateway 전환 프라이머(100 μM)(GCP 전방과 GCP 후방), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 1분; 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 68℃에서 2분의 4회 주기; 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 25회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔 정제하였다.
12.2 게이트웨이 엔트리 벡터 pDONR221 및 발현 벡터 pEAK12d와 pDEST12.2로 Gateway 호환성 INSP115 ORF의 서브클로닝.
Gateway 클로닝 과정의 두 번째 단계는 아래와 같이 Gateway 엔트리 벡터 pDONR221(Invitrogen, 도 51)로 Gateway 변형된 PCR 산물의 서브클로닝을 수반한다: PCR2로부터 5 ㎕의 정제된 산물은 실온에서 1시간동안 10 ㎕의 최종 부피로 1.5 ㎕ pDONR221 벡터(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ BP 완충액, 1.5 ㎕의 BP 클로나아제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 배양하였다. 반응은 단백분해효소 K 1 ㎕(2 ㎍/㎕)를 첨가하여 중단시키고 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ BP 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 카나마이신(40 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 4에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
이후, 정확한 서열을 보유하는 클론(pENTR-INSP115-6HIS, 플라스미드 ID 14393, 도 54) 중에서 하나로부터 유래된 플라스미드 용출액(2 ㎕ 또는 대략 150 ng)은 10 ㎕ 최종 부피로 1.5 ㎕의 pEAK12d 벡터 또는 pDEST12.2 벡터(도 52 & 53)(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ LR 완충액, 1.5 ㎕ LR 클로나아제(Invitrogen)를 함유하는 재조합 반응물에 이용하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하고, 단백분해효소 K(2 ㎍)의 첨가로 중단시키며 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ LR 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 각 벡터에서 서브클론된 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. pEAK12d 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 pEAK12F와 pEAK12R 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. pDEST12.2 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 4에 도시한다.
CsCl 구배 정제된 maxi-prep DNA는 Sambrook J. et al., 1989, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술된 방법을 이용하여, 서열 검증된 클론(pEAK12d-INSP115-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14398(도 55), pDEST12.2-INSP115-6HIS, 플라스미드 ID 14410(도 56)) 각각의 500 ㎖ 배양액으로부터 준비하고, 플라스미드 DNA는 무균수(또는 10 mM Tris-HCl pH 8.5)에서 1 ㎍/㎕의 농도로 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 13 - INSP116의 클로닝
INSP116은 5개의 코딩 엑손에서 인코딩된 140개 아미노산 단백질(420 bp)에 대한 예측이다. 전장 cds를 이용한 공개 EST 데이터베이스 검색에서, INSP116 서열에 대응되는 여러 서열이 확인되었다. IMAGE cDNA 클론 5302753에 상응하는 1개의 서열, GenBank Accession BI599941을 선택하고, 상기 클론을 ATCC로부터 구입하였다. 상기 IMAGE 클론의 삽입체 서열은 T7과 T3 서열분석 프라이머를 이용하여 서열분석하였다(표 5). 상기 삽입체 서열은 INSP116 cds를 보유하는 것으로 밝혀졌다. IMAGE 클론 5302753은 플라스미드 데이터베이스 ID 14206이다. IMAGE 클론 삽입체의 전장은 INSP116에 상응하는 영역이 확인된 이후에도 서열분석되지 않았다.
INSP116 예측의 서열은 도 57에 도시한다. IMAGE 클론 5302753의 상응하는 영역은 뉴클레오티드 수준에서 INSP116 cds에 일치하였다.
[표 5]
INSP116 클로닝과 서열분석 프라이머
밑줄 표시된 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종결 코돈
이탤릭체 서열 = His 태그
실시예 14 - INSP116에 대한 포유동물 세포 발현 벡터의 작제
플라스미드 14206은 GatewayTM 클로닝 방법(Invitrogen)으로, INSP116 ORF 서열을 보유하고, 3' 서열이 6HIS 태그를 인코딩하는 pEAK12d(도 62)와 pDEST12.2(도 63) 발현 클론을 산출하기 위한 PCR 주형으로 이용하였다.
14.1 인-프레임 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환성 INSP116 ORF의 산출
Gateway 클로닝 과정의 첫 번째 단계는 5' 말단에서 attB1 재조합 부위와 Kozak 서열과 접하고, 3' 말단에서 인-프레임 6 히스티딘(6HIS) 태그, 종결 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환성 cDNA)를 인코딩하는 서열과 접하는 INSP116의 ORF를 산출하는 2단계 PCR 반응을 수반한다. 첫 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 1 ㎕(40 ng)의 플라스미드 ID 14206, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 10 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 유전자 특이적 프라이머(100 μM)(INSP116-EX1과 INSP116-EX2), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. PCR 반응은 95℃에서 2분의 최초 변성 단계; 이후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 12회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로즈 겔에서 시각화시키고, 예측된 분자량으로 이동하는 산물은 제조업자의 지시에 따라 Wizard PCR Prep DNA 정제 시스템(progema)을 이용하여 겔로부터 정제하고 50 ㎕ 무균수에서 회수하였다.
두 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 10 ㎕ 정제된 PCR 1 산물, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 Gateway 전환 프라이머(100 μM)(GCP 전방과 GCP 후방), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 1분; 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 68℃에서 2분의 4회 주기; 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 25회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔 정제하였다.
14.2 게이트웨이 엔트리 벡터 pDONR221 및 발현 벡터 pEAK12d와 pDEST12.2로 Gateway 호환성 INSP116 ORF의 서브클로닝.
Gateway 클로닝 과정의 두 번째 단계는 아래와 같이 Gateway 엔트리 벡터 pDONR221(Invitrogen, 도 58)로 Gateway 변형된 PCR 산물의 서브클로닝을 수반한다: PCR2로부터 5 ㎕의 정제된 산물은 실온에서 1시간동안 10 ㎕의 최종 부피로 1.5 ㎕ pDONR221 벡터(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ BP 완충액, 1.5 ㎕의 BP 클로나아제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 배양하였다. 반응은 단백분해효소 K 1 ㎕(2 ㎍/㎕)를 첨가하여 중단시키고 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ BP 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 카나마이신(40 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 5에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
이후, 정확한 서열을 보유하는 클론(pENTR-INSP116-6HIS, 플라스미드 ID 14394, 도 61) 중에서 하나로부터 유래된 플라스미드 용출액(2 ㎕ 또는 대략 150 ng)은 10 ㎕ 최종 부피로 1.5 ㎕의 pEAK12d 벡터 또는 pDEST12.2 벡터(도 59 & 60)(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ LR 완충액, 1.5 ㎕ LR 클로나아제(Invitrogen)를 함유하는 재조합 반응물에 이용하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하고, 단백분해효소 K(2 ㎍)의 첨가로 중단시키며 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ LR 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 각 벡터에서 서브클론된 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. pEAK12d 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 pEAK12F와 pEAK12R 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. pDEST12.2 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 5에 도시한다.
CsCl 구배 정제된 maxi-prep DNA는 Sambrook J. et al., 1989, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술된 방법을 이용하여, 서열 검증된 클론(pEAK12d-INSP116-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14399(도 62), pDEST12.2-INSP116-6HIS, 플라스미드 ID 14411(도 63)) 각각의 500 ㎖ 배양액으로부터 준비하고, 플라스미드 DNA는 무균수(또는 10 mM Tris-HCl pH 8.5)에서 1 ㎍/㎕의 농도로 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 15 - INSP117의 클로닝
15.1 인간 cDNA 주형의 제조
첫 번째 가닥 cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라, Superscript II RNase H- 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 다양한 정상 인간 조직 전체 RNA 샘플(Clontech, Ambion, 사내 샘플)로부터 준비하였다. 올리고(dT)5 프라이머(500 ㎍/㎖에서 1㎕)(Promega), 2 ㎍ 인간 전체 RNA, 1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물(각각 10 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 중성 pH), 무균 증류수(12 ㎕ 최종 부피)는 1.5 ㎖ Eppendorf 튜브에 합치고 5분동안 65℃로 가열하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 내용물은 짧은 원심분리로 수거하고 4 ㎕의 5X 일차-가닥 완충액, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 저해물질(40 unit/㎕, Invitrogen)을 첨가하였다. 튜브의 내용물은 부드럽게 혼합하고 42℃에서 2분동안 배양하였다; 이후, 1 ㎕(200 unit)의 SuperScript II 효소를 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 부드럽게 혼합하였다. 혼합물은 42℃에서 50분동안 배양하고, 이후 70℃에서 15분동안 가열하여 불활성화시켰다. cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위하여, 1 ㎕(2 unit)의 대장균(E. coli) RNase H(Invitrogen)를 첨가하고, 반응 혼합물은 37℃에서 20분동안 배양하였다. 최종 21 ㎕ 반응 혼합물은 179 ㎕ 무균수를 첨가하여 희석하고 200 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. INSP117의 증폭을 위한 주형으로 이용되는 인간 cDNA 라이브러리 샘플은 태반, 눈, 망막으로부터 획득하였다. Universal Reference 세포주 혼합 cDNA 샘플(Stragene) 역시 검사하였다.
15.2 cDNA 라이브러리
인간 cDNA 라이브러리(박테리오파아지 람다(λ) 벡터)는 Clontech로부터 구입하거나 λ GT10 벡터에 사내 제조하였다. 박테리오파아지 λ DNA는 제조업자(Promega, Corporation, Madison WI)의 프로토콜에 따라, Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템을 이용하여 감염된 대장균(E. coli) 숙주 균주의 소규모 배양액으로부터 준비하였다. INSP117의 증폭을 위한 주형으로 이용되는 인간 cDNA 라이브러리 샘플은 태반과 망막으로부터 획득하였다.
15.3 PCR을 위한 유전자 특이적 클로닝 프라이머
18개 내지 25개 염기 길이를 보유하는 한 쌍의 PCR 프라이머는 Primer Designer Software(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)를 이용한 가상 cDNA의 완전 코딩 서열을 증폭하기 위하여 설계되었다. PCR 프라이머는 55 ± 10℃에 근접하는 Tm 및 40-60%의 GC 함량을 보유하도록 최적화되었다. 비-특이적인 프라임 없이 표적 서열(INSP117)에 높은 선택성을 보유하는 프라이머가 선택되었다.
15.4 다양한 인간 cDNA 주형과 파아지 라이브러리 cDNA로부터 INSP117의 PCR 증폭
유전자-특이적 클로닝 프라이머(INSP117-CP1과 INSP117-CP2, 도 64-65와 표 6)는 INSP117 예측의 전체 399 bp 코딩 서열을 커버하는 412 bp의 cDNA 단편을 증폭하기 위하여 설계되었다. INSP117 예측으로 공개 EST 서열 데이터베이스의 검색은 상기 서열이 태반, 눈, 망막 cDNA 주형에서 발현된다는 것을 암시하였다. 이런 이유로, 유전자-특이적 클로닝 프라이머 INSP117-CP1과 INSP117-CP2는 섹션 1.1에 기재된 인간 cDNA 샘플 및 PCR 주형으로서 섹션 1.2에 기재된 파아지 라이브러리 cDNA 샘플과 함께 이용되었다. PCR 반응은 1X Platinum® Taq High Fidelity PCR 완충액, 2 mM MgS04, 200 μM dNTP, 각각 0.2 μM의 클로닝 프라이머, 2.5 unit의 Platinum® Taq High Fidelity DNA 중합효소(Invitrogen), 100 ng의 인간 cDNA 주형, 0X, 1X 또는 2X 최종 농도의 PCRx Enhancer 용액(Invitrogen)을 함유하는 50 ㎕ 최종 부피에서 수행하였다. 증폭 사이클링은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분의 40회 주기; 이후, 68℃에서 7분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
50 ㎕의 각 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 시각화시켰는데, 망막 일차 가닥 cDNA 주형에 상응하는 샘플에서 대략 예측된 분자량으로 이동하는 단일 PCR 산물이 관찰되었다. 상기 PCR 산물은 Qiagen MinElute DNA 정제 시스템(Qiagen)을 이용하여 정제하고, 10㎕의 EB 완충액(10 mM Tris.Cl, pH 8.5)에서 용리시키고 직접 서브클론하였다.
[표 6]
INSP117 클로닝과 서열분석 프라이머
밑줄 표시된 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종결 코돈
이탤릭체 서열 = His tag
15.5 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
이들 PCR 산물은 제조업자에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCRII-TOPO)에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 인간 망막 cDNA 증폭으로부터 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen)에 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분동안 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초동안 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음에 환원하고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 교반(220 rpm)하면서 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
15.6 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여, 1X AmpliTaqTM 완충액, 200 μM dNTP, 20 pmole T7 프라이머, 20 pmole SP6 프라이머, 1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 함유하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 1분의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 반응 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 예상 PCR 산물 크기(복수 클로닝 부위(MCS)에 기인한 412 bp cDNA + 187 bp)를 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
15.7 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업자의 지시에 따라 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 100 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Eppendorf BO 광도계를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T7 프라이머와 SP6 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 6에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서 예상 INSP117 서열에 100% 대응을 보유하는 클론이 확인되었다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 65에 도시한다. 클론된 PCR 산물(pCRII-TOPO-INSP117)(플라스미드 ID.14417)의 플라스미드 지도는 도 66에 도시한다.
실시예 16 - INSP117에 대한 포유동물 세포 발현 벡터의 작제
플라스미드 14417은 GatewayTM 클로닝 방법(Invitrogen)으로, INSP117 ORF 서열을 보유하고, 3' 서열이 6HIS 태그를 인코딩하는 pEAK12d(도 71)와 pDEST12.2(도 72) 발현 클론을 산출하기 위한 PCR 주형으로 이용하였다.
16.1 인-프레임 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환성 INSP117 ORF의 산출
Gateway 클로닝 과정의 첫 번째 단계는 5' 말단에서 attB1 재조합 부위와 Kozak 서열과 접하고, 3' 말단에서 인-프레임 6 히스티딘(6HIS) 태그, 종결 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환성 cDNA)를 인코딩하는 서열과 접하는 INSP117의 ORF를 산출하는 2단계 PCR 반응을 수반한다. 첫 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 1 ㎕(40 ng)의 플라스미드 ID 14417, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 10 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 유전자 특이적 프라이머(100 μM)(INSP117-EX1과 INSP117-EX2), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. PCR 반응은 95℃에서 2분의 최초 변성 단계; 이후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 12회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. 증폭 산물은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로즈 겔에서 시각화시키고, 예측된 분자량으로 이동하는 산물은 제조업자의 지시에 따라 Wizard PCR Prep DNA 정제 시스템(progema)을 이용하여 겔로부터 정제하고 50 ㎕ 무균수에서 회수하였다.
두 번째 PCR 반응물(50 ㎕의 최종 부피)은 10 ㎕ 정제된 PCR 1 산물, 1.5 ㎕ dNTP(10 mM), 5 ㎕의 10X Pfx 중합효소 완충액, 1 ㎕ MgSO4(50 mM), 각각 0.5 ㎕의 Gateway 전환 프라이머(100 μM)(GCP 전방과 GCP 후방), 0.5 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)를 함유한다. 2차 PCR 반응은 95℃에서 1분; 94℃에서 15초, 50℃에서 30초, 68℃에서 2분의 4회 주기; 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 2분의 25회 주기; 4℃의 홀딩 주기를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 제조업자의 지시에 따라, Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 겔 정제하였다.
16.2 게이트웨이 엔트리 벡터 pDONR221 및 발현 벡터 pEAK12d와 pDEST12.2로 Gateway 호환성 INSP117 ORF의 서브클로닝.
Gateway 클로닝 과정의 두 번째 단계는 아래와 같이 Gateway 엔트리 벡터 pDONR221(Invitrogen, 도 67)로 Gateway 변형된 PCR 산물의 서브클로닝을 수반한다: PCR2로부터 5 ㎕의 정제된 산물은 실온에서 1시간동안 10 ㎕의 최종 부피로 1.5 ㎕ pDONR221 벡터(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ BP 완충액, 1.5 ㎕의 BP 클로나아제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 배양하였다. 반응은 단백분해효소 K 1 ㎕(2 ㎍/㎕)를 첨가하여 중단시키고 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ BP 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 카나마이신(40 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업자의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 6에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
이후, 정확한 서열을 보유하는 클론(pENTR-INSP117-6HIS, 플라스미드 ID 14594, 도 70) 중에서 하나로부터 유래된 플라스미드 용출액(2 ㎕ 또는 대략 150 ng)은 10 ㎕ 최종 부피로 1.5 ㎕의 pEAK12d 벡터 또는 pDEST12.2 벡터(도 68 & 69)(0.1 ㎍/㎕), 2 ㎕ LR 완충액, 1.5 ㎕ LR 클로나아제(Invitrogen)를 함유하는 재조합 반응물에 이용하였다. 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하고, 단백분해효소 K(2 ㎍)의 첨가로 중단시키며 37℃에서 추가로 10분동안 배양하였다. 상기 반응물의 분량(1 ㎕)을 이용하여 아래와 같이 일렉트로포레이션(electroporation)으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질전환시켰다: 25 ㎕ 분량의 DH1OB 전기적격(electrocompetent) 세포(Invitrogen)는 얼음 위에서 해동시키고 1 ㎕ LR 반응 혼합물을 첨가하였다. 혼합물은 냉각된 0.1 ㎝ 일렉트로포레이션 큐벳에 이전하고, 세포는 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 BioRad Gene-PulserTM을 이용하여 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션 직후에, 실온으로 미리 데워진 SOC 배지(0.5 ㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 15 ㎖ 스냅-캡(snap-cap) 튜브에 이전하고 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 형질전환 혼합물의 분량(10 ㎕와 50 ㎕)을 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
플라스미드 Mini-prep DNA는 Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하여 각 벡터에서 서브클론된 6개의 생성 콜로니의 5 ㎖ 배양액으로부터 준비하였다. pEAK12d 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 pEAK12F와 pEAK12R 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. pDEST12.2 벡터에서 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 상기한 바와 같이 21M13과 M13Rev 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 6에 도시한다.
CsCl 구배 정제된 maxi-prep DNA는 Sambrook J. et al., 1989, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술된 방법을 이용하여, 서열 검증된 클론(pEAK12d-INSP117-6HIS, 플라스미드 ID 번호 14601(도 71), pDEST12.2-INSP117-6HIS, 플라스미드 ID 14605(도 72)) 각각의 500 ㎖ 배양액으로부터 준비하고, 플라스미드 DNA는 무균수(또는 10 mM Tris-HCl pH 8.5)에서 1 ㎍/㎕의 농도로 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 17: INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117의 발현과 정제
본원에 개시된 뉴클레오티드와 아미노산 서열에 기초하여, 생체내에서 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 조직 분포와 발현 수준을 결정하기 위하여 추가적인 실험을 수행한다.
INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117에 대한 전사체의 존재는 상이한 인간 조직으로부터 유래된 cDNA의 PCR로 조사한다. INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 전사체는 검사 샘플에서 매우 낮은 수준으로 존재한다. 이런 이류로, RNA 제조물에서 소량의 게놈 오염물질이 가양성 결과를 유발하기 때문에 다양한 인간 조직에서 전사체의 존재를 확립하는 실험의 설계에는 극도의 주의가 요구된다. 따라서, 모든 RNA는 역전사에 사용하기에 앞서, DNAse로 처리해야 한다. 이에 더하여, 각 조직에서, 역전사가 수행되지 않는 대조(a-ve RT 대조)를 설정한다.
가령, 각 조직으로부터 1 ㎍의 전체 RNA를 이용하여, Multiscript 역전사효소(ABI)와 무작위 헥사머 프라이머로 cDNA를 산출한다. 각 조직에서, 역전사효소를 제외하고 모든 구성 요소가 첨가된 대조 반응물(-ve RT 대조)을 설정한다. 각 조직에서, 역전사된 RNA 샘플 및 마이너스 RT 대조에서 PCR 반응물을 설정한다. INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117-특이적 프라이머는 본원에 개시된 서열 정보에 기초하여 용이하게 설계할 수 있다. 마이너스 RT 대조에서 산물의 부재와 함께, 역전사된 샘플에서 정확한 분자량 산물의 존재는 상기 조직에서 전사체의 존재에 대한 증거이다. 임의의 적절한 cDNA 라이브러리는 상기한 바와 같이 산출된 전사체뿐만 아니라 INSP113, INSP114, MSP115, INSP116, INSP117 전사체를 선별하는데 이용할 수 있다.
INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 조직 분포 패턴은 이들 폴리펩티드의 기능과 관련하여 유용한 정보를 추가로 제공한다.
이에 더하여, pCR4-TOPO-INSP113(도 18), pCR4-TOPO-INSP113sv(도 19), pDONR(도 20), pEAK12d(도 21), pDEST12.2(도 22), pENTR-INSP113-6HIS(도 23), pENTR-INSP113sv-6HIS(도 24), pEAK12d-INSP113-6HIS(도 25), pEAK12d-INSP113sv-6HIS(도 26), pDEST12.2-INSP113-6HIS(도 27), pDEST12.2-INSP113sv-6HIS(도 28), pCR4-TOPO-INSP114(도 31), pCR4-TOPO-INSP114-GR1(도 35), pCR4-TOPO-INSP114-SV2(도 36), pDONR 221(도 38), pEAK12d(도 39), pDEST12.2(도 40), pENTR_INSP114-6HIS(도 41), pEAK12d_INSP114-6HIS(도 42), pDEST12.2_INSP114-6HIS(도 43), pENTR_INSP114-SV1-6HIS(도 44), pEAK12d_INSP114-SV1-6HIS(도 45), pDEST12.2_INSP114-SV1-6HIS(도 46), pENTR_INSP114-SV2-6HIS(도 47), pEAK12d_INSP114-SV2-6HIS(도 48), pDEST12.2_INSP114-SV2-6HIS(도 49), pDONR 221(도 51), pEAK12d(도 52), pDEST12.2(도 53), pENTR_INSP115-6HIS(도 54), pEAK12d_INSP115-6HIS(도 55), pDEST12.2_INSP115-6HIS(도 56), pDONR 221(도 58), pEAK12d(도 59), pDEST12.2(도 60), pENTR_INSP116-6HIS(도 61), pEAK12d_INSP116-6HIS(도 62), pDEST12.2_INSP116-6HIS(도 63), pCRII-TOPO-INSP117(도 66), pDONR 221(도 67), pEAK12d(도 68), pDEST12.2(도 69), pENTR_INSP117-6HIS(도 70) , pEAK12d_INSP117-6HIS(도 71), pDEST12.2_INSP117-6HIS(도 72) 발현 벡터를 이용하여 추가적인 실험을 수행한다. 이들 벡터로 포유동물 세포주의 트랜스펙션은 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 단백질의 높은 수준 발현을 가능하게 하고, 따라서 INSP113, INSP114, INSP115, INSP116, INSP117 폴리펩티드의 지속적 조사를 가능하게 한다. 아래의 재료와 방법은 이들 실험에 적합한 전형이다.
세포 배양
Epstein-Barr 바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 태아 신장 293 세포(HEK293-EBNA, Invitrogen)는 Ex-cell VPRO 혈청-없는 배지(종균(seed stock), 유지 배지, JRH)에 현탁 상태로 유지시킨다. 트랜스펙션이전 16시 내지 20시(Day-1)에, 세포는 2x T225 플라스크(2x105 세포/㎖ 밀도로 2% FBS 접종 배지(JRH)를 포함하는 DMEM/F 12(1:1)에서 플라스크당 50 ㎖)에 접종한다. 다음날(Day 0), JetPEITM 시약(2 ㎕/㎍의 플라스미드 DNA, PolyPlus-트랜스펙션)을 이용하여 트랜스펙션을 수행한다. 각 플라스크에서, 플라스미드 DNA는 GFP(형광 리포터 유전자) DNA로 동시-트랜스펙션시킨다. 이후, 트랜스펙션 혼합물은 2xT225 플라스크에 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 6일동안 배양한다. 양성 트랜스펙션의 확증은 Day 1과 Day 6에서 정량적 형광 검사로 수행한다(Axiovert 10 Zeiss).
Day 6(수거일)에, 2개의 플라스크로부터 상층액은 모으고 원심분리하며(가령, 4℃, 400g) 독특한 확인물질을 포함하는 용기에 위치시켰다. 6His-태그 단백질(내부 생물가공 QC)의 QC를 위하여 1 분량(500㎕)을 보관한다.
규모 확대 배치(batch)는 폴리에틸렌이민(Polyscience)을 트랜스펙션 작용제로 이용하는 “현탁 세포의 PEI 트랜스펙션”이라고 하는 프로토콜(BP/PEI/HH/02/04)에 따라 수행된다.
정제 과정
C-말단 6His 태그를 보유하는 재조합 단백질을 포함하는 배양 배지 시료는 냉각 완충액 A(50 mM NaH2PO4; 600 mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, pH 7.5)로 희석하였다. 시료는 무균 필터(Millipore)에 통과시켜 여과하고 무균 사각 배지 병(Nalgene)에서 4℃에 유지시켰다.
정제는 자동 시료 적하장치(Labomatic)에 연결된 VISION workstation(Applied Biosystems)에서 4℃에서 수행하였다. 정제 과정은 2단계, Ni 이온으로 충전된 Poros 20 MC(Applied Biosystems) 칼럼(4.6 x 50 mm, 0.83 ㎖)에서 금속 친화성 크로마토그래피, 이후 Sephadex G-25 배지(Amersharn Pharmacia) 칼럼(1.0 x 10 cm)에서 겔 여과로 구성되었다.
제 1 크로마토그래피 단계에서, 금속 친화성 칼럼은 30 칼럼 용적의 EDTA 용액(100 mM EDTA; 1M NaCl; pH 8.0)으로 재생시키고, 15 칼럼 용적의 100 mM NiSO4 용액으로 세척하여 Ni 이온으로 재충전하며, 10 칼럼 용적의 완충액 A와 7 칼럼 용적의 완충액 B(50 mM NaH2PO4; 600 mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, 400 mM; 이미다졸, pH 7.5)로 순차적으로 세척하고, 최종적으로 15 mM 이미다졸을 함유하는 15 칼럼 용적의 완충액 A로 평형시켰다. 시료는 Labomatic 시료 적하장치로 200 ㎖ 시료 루프로 옮기고, 후속으로 분당 10 ㎖ 유속으로 Ni 금속 친화성 칼럼에 충전시켰다. 칼럼은 12 칼럼 용적의 완충액 A, 이후 20 mM 이미다졸을 함유하는 28 칼럼 용적의 완충액 A로 세척하였다. 20 mM 이미다졸 세척 동안, 느슨하게 결합된 오염 단백질이 칼럼으로부터 용리되었다. 최종적으로, 재조합 His-표지된 단백질은 분당 2㎖ 유속으로 10 칼럼 용적의 완충액 B로 용리시키고, 용리된 단백질은 수집하였다.
제 2 크로마토그래피 단계에서, Sephadex G-25 겔-여과 칼럼은 2㎖ 완충액 D(1.137M NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; pH 7.2)로 재생시키고, 후속으로 4 칼럼 용적의 완충액 C(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; 20%(w/v) 글리세롤; pH 7.4)로 평형시켰다. Ni-칼럼으로부터 용리되는 피크 분획물은 VISION에서 통합 시료 적하장치를 통하여 Sephadex G-25 칼럼으로 자동 적하하고, 단백질은 분당 2㎖ 유속으로 완충액 C로 용리하였다. 분획물은 무균 원심분리 필터(Millipore)를 통하여 여과하고 동결시키며 -80℃에서 보관하였다. 시료 1 분량은 SDS-PAGE(4-12% NuPAGE gel; Novex)에서 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다. NuPAGE 겔은 실온에서 1시간동안 0.1% 코마시 블루 R250 염색 용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)으로 염색하고, 후속으로 배경 부분이 투명해지고 단백질 밴드가 선명하게 보일 때까지 20% 메탄올, 7.5% 아세트산에서 탈색시켰다.
전기영동이후, 단백질은 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 전기적으로 이동시켰다. 막은 완충액 E(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; 0.1% Tween 20, pH 7.4)에서 5% 우유 분말로 실온에서 1시간동안 차단하고, 후속으로 완충액 E에 담긴 2가지 토끼 다클론 항-His 항체(G-18과 H-15, 각각 0.2 ㎍/㎖; Santa Cruz)/2.5% 우유 분말의 혼합물과 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 실온에서 1시간동안 추가로 배양한 이후, 막은 완충액 E(3x10 분)로 세척하고, 이후 2.5% 우유 분말을 함유하는 완충액 E에서 1/3000으로 희석된 2차 HRP-공액된 항-토끼 항체(DAKO, HRP 0399)와 함께 실온에서 2시간동안 배양하였다. 완충액 E(3 x 10 분)로 세척한 이후, 막은 ECL 키트(Amersham Pharmacia)로 1분간 전개시켰다. 막은 후속으로 Hyperfilm(Amersham Pharmacia)에 노출시키고, 필름은 현상하고, 웨스턴 블랏 이미지는 시각적으로 분석하였다.
코마시 염색에서 검출가능한 단백질 밴드를 보인 시료에서, 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하는 BCA 단백질 검사 키트(Pierce)를 이용하여 결정하였다.
더 나아가, 세포주에서 폴리펩티드의 과다발현 또는 발현의 녹다운을 이용하여 숙주 세포 게놈의 전사 활성화에 대한 효과를 결정한다. INSP113, INSP114, INSP1l5, INSP116, INSP 117 폴리펩티드의 이합체화 파트너, 보조-활성인자, 보조-억제자는 면역침전과 웨스턴 블랏팅의 조합 및 면역침전과 질량 분광분석의 조합으로 확인할 수 있다.
실시예 18 - 응고 인자 X의 생물 활성과 유사한 생물 활성의 검출법.
1. T 림프구 반응을 표적하는 검사
Fas-리간드-유도된 T 세포 사멸
본 검사에서는 수용체 매개된 세포 사멸의 새로운 조절물질을 확인한다.
상기 검사에서, 재조합 6 히스티딘-표지된 Fas 리간드와 단클론 항 6-his 항체의 조합으로 Jurkat 세포(인간 T 세포주)를 자극함으로써 T 세포 아폽토시스를 유도한다. 사멸은 세포가 사멸하는 동안 배양 배지에 방출되는 세포질 효소인 LDH의 방출로 정량한다. 판독(read out)은 490 nm에서 비색법(colorimetric assay)으로 수행한다. T 세포는 여러 자가면역 질환에서 병원성으로 확인되었는데, 치료 전략은 항원-특이적 T 세포 사멸을 조절하는 것이다(가령, 크론병 환자에서 항-TNFα 치료).
인간-MLR: 증식과 사이토킨 분비
세포-기초한 본 검사에서는 림프구 증식에 대한 신규한 단백질의 효과 및 다른 공여자로부터 PBMC에 의한 자극이후 사이토킨 분비 또는 저해(동종반응성)를 측정한다. 이들 검사에서는 자가면역 질환에서 결정적인 세포 반응인 항원-특이적 T 세포와 항원 제시 세포 기능을 다룬다. 분비된 사이토킨(IL-2, 4, 5, 10, TNF-α, IFN-γ)은 CBA로 정량한다.
주의: 증식과 사이토킨 분비는 독립된 반응이다.
생쥐-MLR: 증식
세포-기초한 본 검사에서는 다른 공여자(생쥐 균주)로부터 얻은 비장 세포에 의한 자극이후 생쥐 비장 세포의 림프구 증식 또는 저해에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다. 상기 검사에서는 T 림프구와 항원 제시 세포 반응에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정하고, h-MLR 검사에서 양성과 적중(hit) 실체의 활성을 확증한다. 상기 검사는 인간 질환의 뮤린 모델에서 검사될 단백질을 선별하는데 이용된다.
초항원(superantigen), TSST로 자극된 인간 PBMC.
초항원은 T 세포에 영향을 주는 면역계의 강력한 조절물질이다. 초항원은 면역학적으로 매개된 질환, 예를 들면, IBD, 염증성 피부 질환(가령, 아토피성 피부염과 건선)에 영향을 준다. 본 세포 검사에서는 특히, 보조-자극 분자와 관련하여 고전적인 항원에 대한 T 세포 반응과 요구 조건이 상이하긴 하지만 TCR을 통한 T 림프구 활성화를 특이적으로 표적한다.
ConA 또는 PHA로 자극된 인간 PBMC
이들 세포-기초한 검사에서는 사이토킨 비드 어레이(CBA) 검사(IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4, IL-10)에 의한 측정으로, 서로 다른 세포에 작용하는 2가지 상이한 자극에 의해 유도된 사이토킨 분비에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
대부분의 사이토킨은 손상, 환경, 세포 표적에 따라, 이중 작용, 친-염증성 또는 항-염증성 작용을 보유할 수 있다. 사이토킨 분비를 조절할 수 있는 능력을 보유하는 임의의 단백질은 치료 잠재력을 보유한다(가령, IFN-γ와 TNF-α의 감소는 Th1-매개된 자가면역 질환에 유효하고, 반면 IL-4, IL-5의 감소는 Th2-매개된 질환에 유효하고, IL-10 증가는 MS와 SLE에 관련된다).
2. 단핵구/대식세포 및 과립구 반응을 표적하는 검사
LPS로 자극된 인간 PBMC
세포-기초한 상기 검사에서는 단핵구/대식세포 및 과립구에 작용하는 LPS에 의해 유도된 사이토킨 분비(IFN-γ, TNF-α)에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
IFN-γ와 TNF-α 분비를 조절할 수 있는 능력을 보유하는 임의의 단백질은 Th1-매개된 자가면역 질환에 유효하다.
3. 호중구 반응을 표적하는 검사
호중구는 류머티스 관절염과 같은 염증과 자가면역 질환에 중요하다. IL-8과 같은 백혈구 주화성인자는 세포와 미세-혈관 내피 사이의 일련의 부착성 상호작용을 개시하여, 호중구의 활성화, 부착, 이동을 유도한다. 호중구의 조직 침윤은 이들 세포의 세포 형태에서 특정 변화와 연관된 세포골격 요소의 재편에 좌우된다.
세포-기초한 상기 검사에서는 인간 호중구의 세포골격 재편에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
4. B 림프구 반응을 표적하는 검사
자가항체 및 침윤 B 세포는 다양한 자가면역 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 류머티스 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 중증 근무력증(myasthenia gravis)의 병인에 중요한 것으로 생각된다. 여러 흥미로운 증거는 B 세포 항상성에서 조절장애가 자가반응성 B 세포의 부적절한 생존을 유발하는 면역 관용에 영향을 주어, 병원성 항체 및 지속적인 염증을 발생시킬 수 있음을 암시한다. B 세포 수용체 유인이후 B 세포 증식, 생존, 분화의 조절에서 중요한 역할을 수행하는 새로운 인자의 확인은 신규한 치료제의 개발에서 매우 유의하다.
B 세포 증식
세포-기초한 본 검사에서는 B 세포 생존에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
B 세포 동시-자극
세포-기초한 본 검사에서는 B 세포 동시-자극에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
5. 단핵구와 미세아교(microglial) 반응을 표적하는 검사
THP-1 칼슘 유동
THP1-세포에서 Ca+-유동 검사에서는 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 세포내 칼륨 방출(일반적인 2차 메신저 현상)을 유인하는 능력에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
6. 미세아교 세포 증식(차기 IAC에 제공된다).
미세아교 선조세포의 증식동안, 일부 사이토킨을 비롯한 다수의 콜로니-자극 인자가 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이들 중에서, M-CSF는 대식세포/미세아교 성숙의 최종 단계에서 결정적이며, 임의의 다른 인자에 의해 대체되지 않는다. 이런 생물학적 반응의 평가는 미세아교 활성에 영향을 주는 방법 및 MS에 대한 치료 잠재력을 보유하는 분자를 확인하는 기회를 대표한다.
미세아교 세포주의 M-CSF로의 증식 반응을 측정하는 세포-기초한 검사법이 개발되었다. 실행가능성과 확실성 단계는 최적 결과를 보였다. 상기 검사는 96 웰 평판에 기초한다; 비-방사성 기질이 요구되고, 쉽게 자동화된다.
7. 케모킨-유사 활성을 검출하는 검사
구조-활성 상관관계에 대한 연구에서 케모킨은 아미노-말단 영역을 이용하여 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 영역의 아미노산에 대한 단백분해 절단, 돌연변이유발, 또는 화학적 변형은 길항 활성을 보유하는 화합물을 산출할 수 있다(Loetscher P and Clark-Lewis I, J Leukoc Biol, 69: 881-884, 2001 Lambeir A, et al. J Biol Chem, 276: 29839-29845, 2001, Proost P. et al. Blood, 98(13):3554-3561, 2001). 따라서, 상응하는 케모킨의 아미노-말단 영역 또는 다른 영역에서 하나이상 잔기의 특이적인 변형(결실, 비-보존성 치환)으로 발생된 길항 분자는 염증과 자가면역 질환에 치료 잠재력을 갖는 것으로 간주된다(WO 02/28419; WO 00/27880; WO 99/33989; Schwarz MK and Wells TN, Curr Opin Chem Biol, 3: 407-17, 1999). 이런 이유로, 본원의 다른 목적은 본 발명의 폴리펩티드를 변형시킴으로써 산출된 이런 종류의 길항제에 의해 대표된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 및 관련 반응물의 치료 용도는 동물 세포, 조직, 모델을 이용한 생체내/시험관내 검사(Coleman RA et al., Drug Discov Today, 6: 1116-1126, 2001; Li AP, Drug Discov Today, 6: 357-366, 2001; Methods Mol. Biol vol. 138, "Chemokines Protocols", edited by Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 and 288, Academic Press, 1997), 또는 약물 발견과 전임상 개발동안 케모킨과 다른 생물학적 산물의 검증을 위한 in silico/전산학적 방법(Johnson DE and Wolfgang GH, Drug Discov Today, 5: 445-454, 2000)으로 평가할 수 있다(안전성, 약물동역학, 효능의 관점에서).
본원에서는 세포 증식성 질환, 자가면역/염증 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 발달 장애, 대사 장애, 감염, 다른 병리학적 이상과 같은 질병의 치료 또는 예방용으로 적절하게 조제된 제약학적 조성물에서 활성 성분으로 효과적인 신규한 케모킨-유사 폴리펩티드 및 일련의 관련 반응물을 개시한다. 특히, 케모킨의 공지된 특성에 비추어, 이들 개시된 폴리펩티드와 반응물은 비정상적 또는 결함성 세포 이동을 수반하는 질병을 해결한다. 이런 질병의 무제한적 실례는 관절염, 류머티스 관절염(RA), 건성성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 전신 경화증, 경피증(scleroderma), 다발성근염(polymyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 섬유증, 폐 섬유증과 염증, 알레르기 또는 과민성 질환, 피부염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 폐혈 쇼크, HIV 감염, 이식 거부반응, 상처 치유, 전이(metastasis), 자궁내막증, 간염, 간 섬유증, 암, 무통각, 죽상경화증과 연관된 혈관 염증이다.
케모킨-유사 폴리펩티드의 검증과 특성화를 위한 세포-와 동물-기초한 검사
케모킨의 특이성, 효능, 효력을 검사하기 위하여, 세포 배양액 또는 동물 모델, 예를 들면, in vivo 주화성 검사(Proudfoot A, et al. J Biol Chem 276: 10620-10626, 2001; Lusti-Narasimhan M et al., J Biol Chem, 270: 2716-21, 1995), 또는 생쥐 귀 부종(Garrigue JL et al., Contact Dermatitis, 30: 231-7, 1994)을 이용한 여러 검사법이 개발되었다. 유용한 툴(tool)과 산물(항체, 유전자도입 동물, 방사성표지된 단백질 등)을 산출하기 위한 여러 다른 검사법과 기술은 케모킨과 관련된 간행물에서 기술하며(Methods Mol. Biol vol. 138, "Chemokines Protocols", edited by Proudfoot AI et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 and 288, Academic Press, 1997), 가능한 치료 또는 진단 방법과 용도와 관련하여 본 발명의 케모킨-유사 폴리펩티드와 관련 반응물의 생물학적 활성을 더욱 정확한 방식으로 검증하는데 이용될 수 있다.
사이토킨 발현 조절 검사
1. 도입
아래의 시험관내 세포-기초한 삼중 검사에서는 IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4, IL-10에 대한 사이토킨 비드 어레이(CBA)에 의한 측정에서, 상이한 인간 말초혈 단핵 세포(hPBMC)에 작용하는 콘카나발린 A(Con A)에 의해 유도된 사이토킨 분비에 대한 본 발명에 따른 단백질의 효과를 측정한다.
최적 농도는 96-웰 평판에서 100,000 세포/웰이었고 2% 글리세롤에서 최종 100 ㎕이다.
유사분열원(ConA)의 최적 농도는 5 ng/㎖이다.
상기 검사의 최적 시간은 48시간이다.
판독(read-out) 선택은 CBA이다.
2. 장비와 소프트웨어
- 96 웰 마이크로역가 평판 분광계 EX(Labsystem).
- Graph Pad Prism Software
- Excel 소프트웨어
- 유세포분석기 Becton-Dickinson
- CBA 분석 소프트웨어
- 세포 배양용 후드
- 세포 배양용 인큐베이터
- 원심분리기
- 피펫
3. 재료와 시약
- 연막층(Buffy coat)
- DMEM GIBCO
- 인간 혈청형 AB SIGMA
- L-글루타민 GIBCO
- 페니실린-스트렙토마이신 GIBCO
- Ficoll PHARMACIA
- 세포 배양용 96웰 마이크로역가 평판 COSTAR
- 콘카나발린 A SIGMA
- 인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 키트 Becton-Dickinson
- PBS GIBCO
- FALCON 50 ㎖ 무균 Becton-Dickinson
- BSA SIGMA
- 글리세롤 MERCK
- DMSO SIGMA
- 96 웰 마이크로역가 평판 원뿔 바닥 NUNC
4. 방법
4.1 연막층으로부터 인간 PBMC의 정제
연막층 1 내지 2는 DMEM으로 희석하였다. 이후, 25 ㎖의 희석 혈액을 50 ㎖ Falcon 튜브에 담긴 15 ㎖ 층의 Ficoll에 첨가하고, 튜브는 원심분리하였다(2000 rpm, 20분, 실온에서 브레이크 없음). 간기(고리)는 수집하고, 세포는 25 ㎖ DMEM으로 세척하고, 이후 원심분리(1200 rpm, 5분)하였다. 상기 과정은 3회 반복하였다. 연막층은 대략 600 x 106개의 전체 세포를 제공하였다.
4.2 스크리닝
80 ㎕의 1.25 x 106 세포/㎖는 DMEM+2.5% 인간 혈청+1% L-글루타민+1% 페니실린-스트렙타비딘에 희석하고, 이후 96 웰 마이크로역가 평판에 첨가하였다.
웰당 10 ㎕를 첨가하였다(웰당 동일 조건): 단백질은 PBS+20% 글리세롤에서 희석하였다(단백질의 최종 희석도는 1/10이다).
그 다음, 10 ㎕의 ConA Stimuli를 각 웰에 첨가하였다(웰당 동일 조건): - ConA 50 ㎍/㎖(ConA의 최종 농도는 5 ㎍g/㎖이다)
48시간후, 세포 상층액은 수집하고, 인간 사이토킨은 인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 키트 Becton-Dickinson로 측정하였다.
4.3 CBA 분석
(더욱 상세한 내용은 CBA 키트에 동봉된 소책자를 참조한다)
i) 혼합된 인간 Th1/Th2 포획 비드의 준비
실험에 요구되는 검사 튜브의 총수를 결정하였다.
각 포획 비드 현탁액은 혼합에 앞서 수초동안 활발하게 교반하였다. 각 분석 검사에서, 10 ㎕ 분량의 각 포획 비드를 “혼합된 포획 비드”로 표지된 단일 튜브에 첨가하였다. 비드 혼합물은 완전하게 교반하였다.
ii) 검사 시료의 준비
상층액은 분석 희석액을 이용하여 희석하였다(1:4)(20 ㎕의 상층액 + 60 ㎕의 분석 희석액). 시료 희석액은 혼합하고, 이후 96 웰 마이크로역가 평판 원뿔 바닥(Nunc)으로 시료를 이전하였다.
iii) 인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 검사 절차
50 ㎕의 희석 상층액은 96 웰 마이크로역가 평판 원뿔 바닥(Nunc)에 첨가하였다.
50 ㎕의 혼합된 포획 비드 및 50 ㎕의 인간 Th1/Th2 PE 검출 시약을 순차적으로 첨가하였다. 이후, 평판은 실온에서 3시간동안 배양하고, 광에 대한 직접적인 노출을 피하면서 1500rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 버렸다. 후속 단계에서, 200 ㎕의 세척 완충액을 각 웰에 2회 첨가하고 1500rpm에서 5분동안 원심분리하며 상층액을 조심스럽게 버렸다. 이후, 130 ㎕의 세척 완충액을 각 웰에 첨가하여 비드 펠렛을 재부유시켰다. 시료는 유세포분석기에서 최종적으로 분석하였다. 데이터는 CBA Application Software, Activity Base, Microsoft Excel 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
검사 결과의 판독(read-out)으로부터, 시험관내에서 본 발명의 단백질이 검사된 모든 사이토킨(IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10)에 대한 지속적인 저해 효과를 보유하는 지를 평가할 수 있다.
더 나아가, EC50 수치에 기초하여, 어떤 사이토킨이 가장 효과적으로 저해되는 지를 평가하여, 이런 사이토킨에 연관된 것으로 알려져 있는 특정 자가면역/염증 질환을 도출할 수 있다.
서열:
SEQ ID 1: (INSP113 전체 뉴클레오티드 서열)
1 ATGGCAATGG TCTCTGCGAT GTCCTGGGTC CTGTATTTGT GGATAAGTGC TTGTGCAATG
61 CTACTCTGCC ATGGATCCCT TCAGCACACT TTCCAGCAGC ATCACCTGCA CAGACCAGAA
121 GGAGGGACGT GTGAAGTGAT AGCAGCACAC CGATGTTGCA ACAAGAATCG CATTGAGGAG
181 CGGTCACAAA CAGTAAAGTG TTCCTGTCTA CCTGGAAAAG TGGCTGGAAC AACAAGAAAC
241 CGGCCTTCTT GCGTCGATGC CTCCATAGTG ATTTGGAAAT GGTGGTGTGA GATGGAGCCT
301 TGCCTAGAAG GAGAAGAATG TAAGACACTC CCTGACAATT CTGGATGGAT GTGCGCAACA
361 GGCAACAAAA TTAAGACCAC GAGAATTCAC CCAAGAACCT AA
SEQ ID 2: (INSP113 전체 FASTA 서열; INSP113[인간] CAD28501.1 가상 단백질)
1 MAMVSAMSWV LYLWISACAML LCHGSLQHTFQ QHHLHRPEG GTCEVIAAH RCCNKNRIEE
61 RSQTVKCSCL PGKVAGTTRNR PSCVDASIVIW KWWCEMEPC LEGEECKTL PDNSGWMCAT
121 GNKIKTTRIH PRT
SEQ ID 3: (INSP113 성숙 뉴클레오티드서열)
1 TCCCTTCAGC ACACTTTCCA GCAGCATCAC CTGCACAGAC CAGAAGGAGG GACGTGTGAA
61 GTGATAGCAG CACACCGATG TTGCAACAAG AATCGCATTG AGGAGCGGTC ACAAACAGTA
121 AAGTGTTCCT GTCTACCTGG AAAAGTGGCT GGAACAACAA GAAACCGGCC TTCTTGCGTC
181 GATGCCTCCA TAGTGATTTG GAAATGGTGG TGTGAGATGG AGCCTTGCCT AGAAGGAGAA
241 GAATGTAAGA CACTCCCTGA CAATTCTGGA TGGATGTGCG CAACAGGCAA CAAAATTAAG
301 ACCACGAGAA TTCACCCAAG AACCTAA
SEQ ID 4: (INSP113 성숙 폴리펩티드 서열)
1 SLQHTFQQHH LHRPEGGTCE VIAAHRCCNK NRIEERSQTV KCSCLPGKVA GTTRNRPSCV
61 DASIVIWKWW CEMEPCLEGE ECKTLPDNSG WMCATGNKIK TTRIHPRT
SEQ ID 5: (INSP114 전체 뉴클레오티드 서열)
1 ATGAGTAAGA GATACTTACA GAAAGCAACA AAAGGAAAAC TGCTAATAAT AATATTTATT
61 GTAACCTTGT GGGGGAAAGT TGTATCCAGT GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA
121 ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA
181 CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT
241 GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA
301 TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT
361 GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGGTAACC CATTAA
SEQ ID 6: (INSP114 전체 FASTA 서열; INSP114[인간] CAD38865.1 인간 폴리펩티드)
1 MSKRYLQKAT KGKLLIIIFI VTLWGKVVSS ANHHKAHHVK TGTCEVVALH CCNKNKIEER
61 SQTVKCSCFP GQVAGTTRAA PSCVDASIVE QKWWCHMQPC LEGEECKVLP DRKGWSCSSG
121 NKVKTTRVTH
SEQ ID 7: (INSP114 성숙 뉴클레오티드서열)
1 GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC
61 AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC
121 CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG
181 GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT
241 CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGGTAACC
301 CATTAA
SEQ ID 8: (INSP114 성숙 폴리펩티드 서열)
1 ANHHKAHHVK TGTCEVVALH RCCNKNKIEE RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV
61 EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS GNKVKTTRVT H
SEQ ID 9: (INSP115 전체 뉴클레오티드 서열)
1 ATGGCGCCAT CGCCCAGGAC CGGCAGCCGG CAAGATGCGA CCGCCCTGCC CAGCATGTCC
61 TCAACTTTCT GGGCGTTCAT GATCCTGGCC AGCCTGCTCA TCGCCTACTG CAGTCAGCTG
121 GCCGCCGGCA CCTGTGAGAT TGTGACCTTG GACCGGGACA GCAGCCAGCC TCGGAGGACG
181 ATCGCCCGGC AGACCGCCCG CTGTGCGTGT AGAAAGGGGC AGATCGCCGG CACCACGAGA
241 GCCCGGCCCG CCTGTGTGGA CGCAAGAATC ATCAAGACCA AGCAGTGGTG TGACATGCTT
301 CCGTGTCTGG AGGGGGAAGG CTGCGACTTG TTAATCAACC GGTCAGGCTG GACGTGCACG
361 CAGCCCGGCG GGAGGATAAA GACCACCACG GTCTCCTGA
SEQ ID 10: (INSP115 전체 FASTA 서열 INSP115[인간] AAY53016 인간 분비 단백질 클론)
1 MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRT
61 IARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT
121 QPGGRIKTTT VS
SEQ ID 11: (INSP115 성숙 뉴클레오티드서열)
1 GGCACCTGTG AGATTGTGAC CTTGGACCGG GACAGCAGCC AGCCTCGGAG GACGATCGCC
61 CGGCAGACCG CCCGCTGTGC GTGTAGAAAG GGGCAGATCG CCGGCACCAC GAGAGCCCGG
121 CCCGCCTGTG TGGACGCAAG AATCATCAAG ACCAAGCAGT GGTGTGACAT GCTTCCGTGT
181 CTGGAGGGGG AAGGCTGCGA CTTGTTAATC AACCGGTCAG GCTGGACGTG CACGCAGCCC
241 GGCGGGAGGA TAAAGACCAC CACGGTCTCC TGA
SEQ ID 12: (INSP115 성숙 폴리펩티드 서열)
1 GTCEIVTLDR DSSQPRRTIA RQTARCACRK GQIAGTTRAR PACVDARIIK TKQWCDMLPC
61 LEGEGCDLLI NRSGWTCTQP GGRIKTTTVS
SEQ ID 13: (INSP116 전체 뉴클레오티드 서열)
1 ATGAGGTCCC CAAGGATGAG AGTCTGTGCT AAGTCAGTGT TGCTGTCGCA CTGGCTCTTT
61 CTAGCCTACG TGTTAATGGT GTGCTGTAAG CTGATGTCCG CCTCAAGCCA GCACCTCCGG
121 GGACATGCAG GTCACCACCA AATCAAGCAA GGGACCTGTG AGGTGGTCGC CGTGCACAGG
181 TGCTGCAATA AGAACCGCAT AGAAGAGCGG TCACAAACGG TCAAGTGCTC TTGCTTCCCG
241 GGACAGGTGG CGGGCACAAC TCGGGCTCAA CCTTCTTGTG TTGAAGCTTC CATTGTGATT
301 CAGAAATGGT GGTGTCACAT GAATCCGTGT TTGGAAGGAG AGGATTGTAA AGTGCTGCCA
361 GATTACTCAG GTTGGTCCTG TAGCAGTGGC AATAAAGTCA AAACTACGAA GGTAACGCGG
421 TAG
SEQ ID 14: (INSP116 전체 FASTA 서열; INSP116[인간] XP_087261.1 가상 단백질)
1 MRSPRMRVCA KSVLLSHWLF LAYVLMVCCK LMSASSQHLR GHAGHHQIKQ GTCEVVAVHR
61 CCNKNRIEER SQTVKCSCFP GQVAGTTRAQ PSCVEASIVI QKWWCHMNPC LEGEDCKVLP
121 DYSGWSCSSG NKVKTTKVTR
SEQ ID 15: (INSP116 성숙 뉴클레오티드서열)
1 TCAAGCCAGC ACCTCCGGGG ACATGCAGGT CACCACCAAA TCAAGCAAGG GACCTGTGAG
61 GTGGTCGCCG TGCACAGGTG CTGCAATAAG AACCGCATAG AAGAGCGGTC ACAAACGGTC
121 AAGTGCTCTT GCTTCCCGGG ACAGGTGGCG GGCACAACTC GGGCTCAACC TTCTTGTGTT
181 GAAGCTTCCA TTGTGATTCA GAAATGGTGG TGTCACATGA ATCCGTGTTT GGAAGGAGAG
241 GATTGTAAAG TGCTGCCAGA TTACTCAGGT TGGTCCTGTA GCAGTGGCAA TAAAGTCAAA
301 ACTACGAAGG TAACGCGGTA G
SEQ ID 16: (INSP116 성숙 폴리펩티드 서열)
1 SSQHLRGHAG HHQIKQGTCE VVAVHRCCNK NRIEERSQTV KCSCFPGQVA GTTRAQPSCV
61 EASIVIQKWW CHMNPCLEGE DCKVLPDYSG WSCSSGNKVK TTKVTR
SEQ ID 17: (INSP117 뉴클레오티드 서열: 엑손 1)
1 ATGAGTGAGA GGGTCGAGCG GAACTGGAGC ACGGGCGGCT GGCTGCTGGC ACTGTGCCTG
61 GCCTGGCTGT GGACCCACCT GACCTTGGCT GCCTTGCAGC CTCCCACTGC CACAG
SEQ ID 18: (INSP117 단백질 서열: 엑손 1)
1 MSERVERNWS TGGWLLALCL AWLWTHLTLA ALQPPTATV
SEQ ID 19: (INSP117 뉴클레오티드 서열: 엑손 2)
1 TGCTTGTGCA GCAGGGCACC TGCGAGGTGA TTGCGGCTCA CCGCTGCTGC AACCGGAACC
61 GCATCGAGGA GCGCTCCCAG ACGGTGAAAT GCTCCTGTTT TTCTGGCCAG GTGGCCGGCA
121 CCACGCGGGC AAAGCCCTCC TGCGTGGACG
SEQ ID 20: (INSP117 단백질 서열: 엑손 2)
1 LVQQGTCEVI AAHRCCNRNR IEERSQTVKC SCFSGQVAGT TRAKPSCVDA
SEQ ID 21: (INSP117 뉴클레오티드 서열: 엑손 3)
1 CCTCCATCGT CCTGCAGAGA TGGTGGTGTC AGATGGAGCC CTGCCTGCCG GGGGAGGAGT
61 GTAAGGTGCT CCCGGACCTG TCGGGATGGA GCTGCAGCAG TGGACACAAA GTCAAAACCA
121 CCAAG
SEQ ID 22: (INSP117 단백질 서열: 엑손 3)
1 SIVLQRWWCQ MEPCLPGEEC KVLPDLSGWS CSSGHKVKTT K
SEQ ID 23: (INSP117 뉴클레오티드 서열: 엑손 4)
1 GTCACACGAT AG
SEQ ID 24: (INSP117 단백질 서열: 엑손 4)
1 VTR
SEQ ID 25: (INSP117 완전 CDS)
1 ATGAGTGAGA GGGTCGAGCG GAACTGGAGC ACGGGCGGCT GGCTGCTGGC ACTGTGCCTG
61 GCCTGGCTGT GGACCCACCT GACCTTGGCT GCCTTGCAGC CTCCCACTGC CACAGTGCTT
121 GTGCAGCAGG GCACCTGCGA GGTGATTGCG GCTCACCGCT GCTGCAACCG GAACCGCATC
181 GAGGAGCGCT CCCAGACGGT GAAATGCTCC TGTTTTTCTG GCCAGGTGGC CGGCACCACG
241 CGGGCAAAGC CCTCCTGCGT GGACGCCTCC ATCGTCCTGC AGAGATGGTG GTGTCAGATG
301 GAGCCCTGCC TGCCGGGGGA GGAGTGTAAG GTGCTCCCGG ACCTGTCGGG ATGGAGCTGC
361 AGCAGTGGAC ACAAAGTCAA AACCACCAAG GTCACACGAT AG
SEQ ID 26: (INSP117 완전 단백질 서열)
1 MSERVERNWS TGGWLLALCL AWLWTHLTLA ALQPPTATVL VQQGTCEVIA AHRCCNRNRI
61 EERSQTVKCS CFSGQVAGTT RAKPSCVDAS IVLQRWWCQM EPCLPGEECK VLPDLSGWSC
121 SSGHKVKTTK VTR
SEQ ID 27: (INSP117 성숙 뉴클레오티드서열 엑손 1)
1 GCCTTGCAGC CTCCCACTGC CACAG
SEQ ID 28: (INSP117 성숙 폴리펩티드 서열 엑손 1)
1 ALQPPTATV
SEQ ID 29: (INSP117 성숙 뉴클레오티드서열)
1 GCCTTGCAGC CTCCCACTGC CACAGTGCTT GTGCAGCAGG GCACCTGCGA GGTGATTGCG
61 GCTCACCGCT GCTGCAACCG GAACCGCATC GAGGAGCGCT CCCAGACGGT GAAATGCTCC
121 TGTTTTTCTG GCCAGGTGGC CGGCACCACG CGGGCAAAGC CCTCCTGCGT GGACGCCTCC
181 ATCGTCCTGC AGAGATGGTG GTGTCAGATG GAGCCCTGCC TGCCGGGGGA GGAGTGTAAG
241 GTGCTCCCGG ACCTGTCGGG ATGGAGCTGC AGCAGTGGAC ACAAAGTCAA AACCACCAAG
301 GTCACACGAT AG
SEQ ID 30: (INSP117 성숙 폴리펩티드 서열)
1 ALQPPTATVL VQQGTCEVIA AHRCCNRNRI EERSQTVKCS CFSGQVAGTT RAKPSCVDAS
61 IVLQRWWCQM EPCLPGEECK VLPDLSGWSC SSGHKVKTTK VTR
SEQ ID 31: (크로모좀 6에서 생쥐 오쏘로그에 대한 Inpharmatica 예측)
1 MRVCAKWVLL SRWLVLTYVL MVCCKLMSAS SQHLRGHAGH HLIKPGTCEV VAVHRCCNKN
61 RIEERSQTVK CSCFPGQVAG TTRAQPSCVE AAIVIEKWWC HMNPCLEGED CKVLPDSSGW
121 SCSSGNKVKT TKAS
SEQ ID 32: (크로모좀 10에서 생쥐 오쏘로그에 대한 Inpharmatica 예측)
1 MNKRYLQKAT QGKLLIIIFI VTLWGKAVSS ANHHKAHHVR TGTCEVVALH RCCNKNKIEE
61 RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS
121 GNKVKTTRVT H
SEQ ID 33: (크로모좀 2에서 쥐 오쏘로그에 대한 Inpharmatica 예측)
1 MAERSTSNWS PGSWVLALCL AWLWTRLASA SLQPPTSTVK QGTCEVIAAH RCCNRNRIEE
61 RSQTVKCSCL SGQVAGTTRA KPSCVDASIV LQKWWCQMEP CLLGEECKVL PDLSGWSCSR
121 GHKVKTTKVL RWT
SEQ ID 34: (크로모좀 4에서 쥐 오쏘로그에 대한 Inpharmatica 예측)
1 MTMVSAMSWV LYLWISACAM LLCHGSLQHT FQQHHLHRPE GGTCEVIAAH RCCNKNRIEE
61 RSQTVKCSCL PGKVAGTTRN RPSCVDASIV IGKWWCEMEP CLEGEECKTL PDNSGWMCAT
121 GNKIKTTRVS P
SEQ ID 35: (게놈 DNA 골격_3581에서 가시복 오쏘로그에 대한 Inpharmatica 예측)
1 MNVIRSVRPS HWGLLLLCTA AFCSQLVATG NQSSRGQRGS EQERTGTCEV VAAHRCCNKN
61 KIEERSQTVK CSCFPGQVAG TTRALPSCVD ASIVRQKWWC NMEPCVVGEE CRVLPDLTGW
121 SCISGNKVKT TKVSRGAALV VKKPNRTSLQ CRI
SEQ ID NO:36: (INSP113sv 뉴클레오티드 서열)
1 ATGGCAATGG TCTCTGCGAT GTCCTGGGTC CTGTATTTGT GGATAAGTGC TTGTGCAATG
61 CTACTCTGCC ATGGATCCCT TCAGCACACT TTCCAGCAGC ATCACCTGCA CAGACCAGGT
121 GCAGAGCAAA ACCAGTGTGG CTGGAAAGGA GAAAGAAGGA AAGGGGGCTT CAAGCAAGAT
181 CATGTGCATT GTCAGACTTC AGATCATCCA AGGCCT
SEQ ID NO:37: (INSP113sv 폴리펩티드 서열)
1 MAMVSAMSWV LYLWISACAM LLCHGSLQHT FQQHHLHRPG AEQNQCGWKG ERRKGGFKQD
61 HVHCQTSDHP RP
SEQ ID NO:38: (INSP113sv 성숙 뉴클레오티드서열)
1 TCCCTTCAGC ACACTTTCCA GCAGCATCAC CTGCACAGAC CAGGTGCAGA GCAAAACCAG
61 TGTGGCTGGA AAGGAGAAAG AAGGAAAGGG GGCTTCAAGC AAGATCATGT GCATTGTCAG
121 ACTTCAGATC ATCCAAGGCC T
SEQ ID NO:39: (INSP113sv 성숙 폴리펩티드 서열)
1 SLQHTFQQHH LHRPGAEQNQ CGWKGERRKG GFKQDHVHCQ TSDHPRP
SEQ ID NO:40: (INSP114-SV2 뉴클레오티드 서열)
1 ATGAGTAAGA GATACTTACA GAAAGCAACA AAAGGAAAAC TGCTAATAAT AATATTTATT
61 GTAACCTTGT GGGGGAAAGT TGTATCCAGT GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA
121 ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA
181 CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT
241 GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA
301 TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT
361 GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGTGGTGA
SEQ ID NO:41: (INSP114-SV2 폴리펩티드 서열)
1 MSKRYLQKAT KGKLLIIIFI VTLWGKVVSS ANHHKAHHVK TGTCEVVALH RCCNKNKIEE
61 RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS
121 GNKVKTTRW
SEQ ID NO:42: (INSP114-SV2 성숙 뉴클레오티드서열)
1 GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC
61 AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC
121 CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG
181 GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT
241 CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGTGGTGA
SEQ ID NO:43: (INSP114-SV2 성숙 폴리펩티드 서열)
1 ANHHKAHHVK TGTCEVVALH RCCNKNKIEE RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV
61 EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS GNKVKTTRW
SEQ ID NO:44: (INSP115 클론d 뉴클레오티드 서열)
1 ATGGCGCCAT CGCCCAGGAC CGGCAGCCGG CAAGATGCGA CCGCCCTGCC CAGCATGTCC
61 TCAACTTTCT GGGCGTTCAT GATCCTGGCC AGCCTGCTCA TCGCCTACTG CAGTCAGCTG
121 GCCGCCGGCA CCTGTGAGAT TGTGACCTTG GACCGGGACA GCAGCCAGCC TCGGAGGACG
181 ATCGCCCGGC AGACCGCCCG CTGTGCGTGT AGAAAGGGGC AGATCGCCGG CACCACGAGA
241 GCCCGGCCCG CCTGTGTGGA CGCAAGAATC ATCAAGACCA AGCAGTGGTG TGACATGCTT
301 CCGTGTCTGG AGGGGGAAGG CTGCGACTTG TTAATCAACC GGTCAGGCTG GACGTGCACG
361 CAGCCCGGCG GGAGGATAAA GACCACCACG GTCTCCTGA
SEQ ID NO:45: (INSP115 클론d 폴리펩티드 서열)
1 MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRT
61 IARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT
121 QPGGRIKTTT VS
SEQ ID NO:46: (INSP115 클론d 성숙 뉴클레오티드서열)
1 ACCTGTGAGA TTGTGACCTT GGACCGGGAC AGCAGCCAGC CTCGGAGGAC GATCGCCCGG
61 CAGACCGCCC GCTGTGCGTG TAGAAAGGGG CAGATCGCCG GCACCACGAG AGCCCGGCCC
121 GCCTGTGTGG ACGCAAGAAT CATCAAGACC AAGCAGTGGT GTGACATGCT TCCGTGTCTG
181 GAGGGGGAAG GCTGCGACTT GTTAATCAAC CGGTCAGGCT GGACGTGCAC GCAGCCCGGC
241 GGGAGGATAA AGACCACCAC GGTCTCCTGA
SEQ ID NO:47: (INSP115 클론d 성숙 폴리펩티드 서열)
1 TCEIVTLDRD SSQPRRTIAR QTARCACRKG QIAGTTRARP ACVDARIIKT KQWCDMLPCL
61 EGEGCDLLIN RSGWTCTQPG GRIKTTTVS
SEQ ID NO:48: (INSP116 클론d 뉴클레오티드 서열)
1 ATGAGGTCCC CAAGGATGAG AGTCTGTGCT AAGTCAGTGT TGCTGTCGCA CTGGCTCTTT
61 CTAGCCTACG TGTTAATGGT GTGCTGTAAG CTGATGTCCG CCTCAAGCCA GCACCTCCGG
121 GGACATGCAG GTCACCACCA AATCAAGCAA GGGACCTGTG AGGTGGTCGC CGTGCACAGG
181 TGCTGCAATA AGAACCGCAT AGAAGAGCGG TCACAAACGG TCAAGTGCTC TTGCTTCCCG
241 GGACAGGTGG CGGGCACAAC TCGGGCTCAA CCTTCTTGTG TTGAAGCTTC CATTGTGATT
301 CAGAAATGGT GGTGTCACAT GAATCCGTGT TTGGAAGGAG AGGATTGTAA AGTGCTGCCA
361 GATTACTCAG GTTGGTCCTG TAGCAGTGGC AATAAAGTCA AAACTACGAA GGTAACGCGG
421 TAG
SEQ ID NO:49: (INSP116 클론d 폴리펩티드 서열)
1 MRSPRMRVCA KSVLLSHWLF LAYVLMVCCK LMSASSQHLR GHAGHHQIKQ GTCEVVAVHR
61 CCNKNRIEER SQTVKCSCFP GQVAGTTRAQ PSCVEASIVI QKWWCHMNPC LEGEDCKVLP
121 DYSGWSCSSG NKVKTTKVTR
SEQ ID NO:50: (INSP116 클론d 성숙 뉴클레오티드서열)
1 TCAAGCCAGC ACCTCCGGGG ACATGCAGGT CACCACCAAA TCAAGCAAGG GACCTGTGAG
61 GTGGTCGCCG TGCACAGGTG CTGCAATAAG AACCGCATAG AAGAGCGGTC ACAAACGGTC
121 AAGTGCTCTT GCTTCCCGGG ACAGGTGGCG GGCACAACTC GGGCTCAACC TTCTTGTGTT
181 GAAGCTTCCA TTGTGATTCA GAAATGGTGG TGTCACATGA ATCCGTGTTT GGAAGGAGAG
241 GATTGTAAAG TGCTGCCAGA TTACTCAGGT TGGTCCTGTA GCAGTGGCAA TAAAGTCAAA
301 ACTACGAAGG TAACGCGGTA
SEQ ID NO:51: (INSP116 클론d 성숙 폴리펩티드 서열)
1 SSQHLRGHAG HHQIKQGTCE VVAVHRCCNK NRIEERSQTV KCSCFPGQVA GTTRAQPSCV
61 EASIVIQKWW CHMNPCLEGE DCKVLPDYSG WSCSSGNKVK TTKVTR
SEQ ID NO:52: (INSP114-SV1 뉴클레오티드 서열)
1 ATGAGTAAGA GATACTTACA GAAAGCAACA AAAGGAAAAC TGCTAATAAT AATATTTATT
61 GTAACCTTGT GGGGGAAAGT TGTATCCAGT GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA
121 ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA
181 CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT
241 GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA
301 TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT
361 GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGGCAAAC GTG
SEQ ID NO:53: (INSP114-SV1 폴리펩티드 서열)
1 MSKRYLQKAT KGKLLIIIFI VTLWGKVVSS ANHHKAHHVK TGTCEVVALH RCCNKNKIEE
61 RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS
121 GNKVKTTRAN V
SEQ ID NO:54: (INSP114-SV1 성숙 뉴클레오티드서열)
1 GCAAACCATC ATAAAGCTCA CCATGTTAAA ACGGGAACTT GTGAGGTGGT GGCACTCCAC
61 AGATGCTGTA ATAAGAACAA GATAGAAGAA CGGTCACAAA CAGTCAAGTG CTCCTGCTTC
121 CCTGGGCAGG TGGCAGGCAC CACGCGAGCT GCTCCATCAT GTGTGGATGC TTCAATAGTG
181 GAACAGAAAT GGTGGTGCCA TATGCAGCCA TGTCTAGAGG GAGAAGAATG TAAAGTTCTT
241 CCGGATCGGA AAGGATGGAG CTGTTCCTCT GGGAATAAAG TCAAAACAAC TAGGGCAAAC
301 GTG
SEQ ID NO:55: (INSP114-SV1 성숙 폴리펩티드 서열)
1 ANHHKAHHVK TGTCEVVALH RCCNKNKIEE RSQTVKCSCF PGQVAGTTRA APSCVDASIV
61 EQKWWCHMQP CLEGEECKVL PDRKGWSCSS GNKVKTTRAN V
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15 Ile Ile Phe Ile Val Thr Leu Trp Gly Lys Val Val Ser Ser Ala Asn 20 25 30 His His Lys Ala His His Val Lys Thr Gly Thr Cys Glu Val Val Ala 35 40 45 Leu His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Lys Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr 50 55 60 Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr Arg Ala 65 70 75 80 Ala Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Glu Gln Lys Trp Trp Cys 85 90 95 His Met Gln Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Val Leu Pro Asp 100 105 110 Arg Lys Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly Asn Lys Val Lys Thr Thr Arg 115 120 125 Trp <210> 42 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 gcaaaccatc ataaagctca ccatgttaaa acgggaactt gtgaggtggt ggcactccac 60 agatgctgta ataagaacaa gatagaagaa cggtcacaaa cagtcaagtg ctcctgcttc 120 cctgggcagg tggcaggcac cacgcgagct gctccatcat gtgtggatgc ttcaatagtg 180 gaacagaaat ggtggtgcca tatgcagcca tgtctagagg gagaagaatg taaagttctt 240 ccggatcgga aaggatggag ctgttcctct gggaataaag tcaaaacaac taggtggtga 300 <210> 43 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ala Asn His His Lys Ala His His Val Lys Thr Gly Thr Cys Glu Val 1 5 10 15 Val Ala Leu His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Lys Ile Glu Glu Arg Ser 20 25 30 Gln Thr Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Arg Ala Ala Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Glu Gln Lys Trp 50 55 60 Trp Cys His Met Gln Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Val Leu 65 70 75 80 Pro Asp Arg Lys Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly Asn Lys Val Lys Thr 85 90 95 Thr Arg Trp <210> 44 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 atggcgccat cgcccaggac cggcagccgg caagatgcga ccgccctgcc cagcatgtcc 60 tcaactttct gggcgttcat gatcctggcc agcctgctca tcgcctactg cagtcagctg 120 gccgccggca cctgtgagat tgtgaccttg gaccgggaca gcagccagcc tcggaggacg 180 atcgcccggc agaccgcccg ctgtgcgtgt agaaaggggc agatcgccgg caccacgaga 240 gcccggcccg cctgtgtgga cgcaagaatc atcaagacca agcagtggtg tgacatgctt 300 ccgtgtctgg agggggaagg ctgcgacttg ttaatcaacc ggtcaggctg gacgtgcacg 360 cagcccggcg ggaggataaa gaccaccacg gtctcctga 399 <210> 45 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Ala Pro Ser Pro Arg Thr Gly Ser Arg Gln Asp Ala Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val 35 40 45 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp 85 90 95 Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile 100 105 110 Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr 115 120 125 Thr Thr Val Ser 130 <210> 46 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 acctgtgaga ttgtgacctt ggaccgggac agcagccagc ctcggaggac gatcgcccgg 60 cagaccgccc gctgtgcgtg tagaaagggg cagatcgccg gcaccacgag agcccggccc 120 gcctgtgtgg acgcaagaat catcaagacc aagcagtggt gtgacatgct tccgtgtctg 180 gagggggaag gctgcgactt gttaatcaac cggtcaggct ggacgtgcac gcagcccggc 240 gggaggataa agaccaccac ggtctcctga 270 <210> 47 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Thr Cys Glu Ile Val Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Ile Ala Arg Gln Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile 20 25 30 Ala Gly Thr Thr Arg Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile 35 40 45 Lys Thr Lys Gln Trp Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly 50 55 60 Cys Asp Leu Leu Ile Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly 65 70 75 80 Gly Arg Ile Lys Thr Thr Thr Val Ser 85 <210> 48 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 atgaggtccc caaggatgag agtctgtgct aagtcagtgt tgctgtcgca ctggctcttt 60 ctagcctacg tgttaatggt gtgctgtaag ctgatgtccg cctcaagcca gcacctccgg 120 ggacatgcag gtcaccacca aatcaagcaa gggacctgtg aggtggtcgc cgtgcacagg 180 tgctgcaata agaaccgcat agaagagcgg tcacaaacgg tcaagtgctc ttgcttcccg 240 ggacaggtgg cgggcacaac tcgggctcaa ccttcttgtg ttgaagcttc cattgtgatt 300 cagaaatggt ggtgtcacat gaatccgtgt ttggaaggag aggattgtaa agtgctgcca 360 gattactcag gttggtcctg tagcagtggc aataaagtca aaactacgaa ggtaacgcgg 420 tag 423 <210> 49 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Arg Ser Pro Arg Met Arg Val Cys Ala Lys Ser Val Leu Leu Ser 1 5 10 15 His Trp Leu Phe Leu Ala Tyr Val Leu Met Val Cys Cys Lys Leu Met 20 25 30 Ser Ala Ser Ser Gln His Leu Arg Gly His Ala Gly His His Gln Ile 35 40 45 Lys Gln Gly Thr Cys Glu Val Val Ala Val His Arg Cys Cys Asn Lys 50 55 60 Asn Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr Arg Ala Gln Pro Ser Cys Val Glu Ala 85 90 95 Ser Ile Val Ile Gln Lys Trp Trp Cys His Met Asn Pro Cys Leu Glu 100 105 110 Gly Glu Asp Cys Lys Val Leu Pro Asp Tyr Ser Gly Trp Ser Cys Ser 115 120 125 Ser Gly Asn Lys Val Lys Thr Thr Lys Val Thr Arg 130 135 140 <210> 50 <211> 320 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 tcaagccagc acctccgggg acatgcaggt caccaccaaa tcaagcaagg gacctgtgag 60 gtggtcgccg tgcacaggtg ctgcaataag aaccgcatag aagagcggtc acaaacggtc 120 aagtgctctt gcttcccggg acaggtggcg ggcacaactc gggctcaacc ttcttgtgtt 180 gaagcttcca ttgtgattca gaaatggtgg tgtcacatga atccgtgttt ggaaggagag 240 gattgtaaag tgctgccaga ttactcaggt tggtcctgta gcagtggcaa taaagtcaaa 300 actacgaagg taacgcggta 320 <210> 51 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser Ser Gln His Leu Arg Gly His Ala Gly His His Gln Ile Lys Gln 1 5 10 15 Gly Thr Cys Glu Val Val Ala Val His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Arg 20 25 30 Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln 35 40 45 Val Ala Gly Thr Thr Arg Ala Gln Pro Ser Cys Val Glu Ala Ser Ile 50 55 60 Val Ile Gln Lys Trp Trp Cys His Met Asn Pro Cys Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Cys Lys Val Leu Pro Asp Tyr Ser Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly 85 90 95 Asn Lys Val Lys Thr Thr Lys Val Thr Arg 100 105 <210> 52 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 atgagtaaga gatacttaca gaaagcaaca aaaggaaaac tgctaataat aatatttatt 60 gtaaccttgt gggggaaagt tgtatccagt gcaaaccatc ataaagctca ccatgttaaa 120 acgggaactt gtgaggtggt ggcactccac agatgctgta ataagaacaa gatagaagaa 180 cggtcacaaa cagtcaagtg ctcctgcttc cctgggcagg tggcaggcac cacgcgagct 240 gctccatcat gtgtggatgc ttcaatagtg gaacagaaat ggtggtgcca tatgcagcca 300 tgtctagagg gagaagaatg taaagttctt ccggatcgga aaggatggag ctgttcctct 360 gggaataaag tcaaaacaac tagggcaaac gtg 393 <210> 53 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Ser Lys Arg Tyr Leu Gln Lys Ala Thr Lys Gly Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ile Phe Ile Val Thr Leu Trp Gly Lys Val Val Ser Ser Ala Asn 20 25 30 His His Lys Ala His His Val Lys Thr Gly Thr Cys Glu Val Val Ala 35 40 45 Leu His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Lys Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr 50 55 60 Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr Arg Ala 65 70 75 80 Ala Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Glu Gln Lys Trp Trp Cys 85 90 95 His Met Gln Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Val Leu Pro Asp 100 105 110 Arg Lys Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly Asn Lys Val Lys Thr Thr Arg 115 120 125 Ala Asn Val 130 <210> 54 <211> 303 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gcaaaccatc ataaagctca 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<223> Xaa is Ala, Val or Leu <220> <222> 9 <223> Xaa is His or Asp <220> <222> 11 <223> Xaa is Cys or Asp <220> <222> 12 <223> Xaa is Cys or Ser <220> <222> 13 <223> Xaa is Asn or Ser <220> <222> 14 <223> Xaa is Lys, Arg or Gln <220> <222> 15 <223> Xaa is Asn or Pro <220> <222> 16 or 25 <223> Xaa is Arg or Lys <220> <222> 17 <223> Xaa is Ile or Arg <220> <222> 18 <223> Xaa is Glu or Thr <220> <222> 19 <223> Xaa is Glu or Ile <220> <222> 20 <223> Xaa is Arg or Ala <220> <222> 21 <223> Xaa is Ser or Arg <220> <222> 24 <223> Xaa is Val or Ala <220> <222> 27 or 42 <223> Xaa is Ser or Ala <220> <222> 29 <223> Xaa is Leu, Phe or Arg <220> <222> 30 <223> Xaa is Pro, Ser or Lys <220> <222> 32 <223> Xaa is Lys or Gln <220> <222> 33 <223> Xaa is Val or Ile <220> <222> 39 <223> Xaa is Asn or Ala <220> <222> 40 <223> Xaa is Arg, Gln, Leu, Ala or Lys <220> <222> 45 <223> Xaa is Asp or Glu <220> <222> 47 <223> Xaa is Ser, Ala or Arg <220> <222> 49 <223> Xaa is Val or Ile <220> <222> 50 <223> Xaa is Ile, Glu, Leu, Lys or Arg <220> <222> 51 <223> Xaa is Trp, Gly, Gln, Glu or Thr <220> <222> 52 <223> Xaa is Lys or Arg <220> <222> 53 <223> Xaa is Trp or Gln <220> <222> 56 <223> Xaa is Glu, His, Asn, Gln or Asp <220> <222> 58 <223> Xaa is Glu, Asn, Gln or Leu <220> <222> 61 <223> Xaa is Leu or Val <220> <222> 62 <223> Xaa is Glu, Val, Leu or Pro <220> <222> 65 <223> Xaa is Asp, Glu or Gly <220> <222> 67 <223> Xaa is Lys, Arg or Asp <220> <222> 68 <223> Xaa is Thr, Val or Leu <220> <222> 70 <223> Xaa is Pro or Ile <220> <222> 71 <223> Xaa is Asp or Asn <220> <222> 72 <223> Xaa is Asn, Tyr, Ser, Leu or Arg <220> <222> 73 <223> Xaa is Ser, Thr or Lys <220> <222> 76 <223> Xaa is Met, Ser or Thr <220> <222> 78 <223> Xaa is Ala, Ser, Ile or Thr <220> <222> 79 <223> Xaa is Thr, Ser, Arg or Gln <220> <222> 82 <223> Xaa is Asn, His or Gly <220> <222> 83 <223> Xaa is Lys or Arg <220> <222> 84 <223> Xaa is Ile or Val <400> 56 Gly Thr Cys Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Thr Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa 20 25 30 Xaa Ala Gly Thr Thr Arg Xaa Xaa Pro Xaa Cys Val Xaa Ala Xaa Ile 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Met Xaa Pro Cys Xaa Xaa Gly Glu 50 55 60 Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Trp Xaa Cys Xaa Xaa Pro 65 70 75 80 Gly Xaa Xaa Xaa Lys Thr Thr 85 <210> 57 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <222> 5 or 6 <223> Xaa is Val or Ile <220> <222> 7 <223> Xaa is Ala or Thr <220> <222> 8 <223> Xaa is Ala, Val or Leu <220> <222> 9 <223> Xaa is His or Asp <220> <222> 11 <223> Xaa is Cys or Asp <220> <222> 12 <223> Xaa is Cys or Ser <220> <222> 13 <223> Xaa is Asn or Ser <220> <222> 14 <223> Xaa is Lys, Arg or Gln <220> <222> 15 <223> Xaa is Asn or Pro <220> <222> 16 or 25 <223> Xaa is Arg or Lys <220> <222> 17 <223> Xaa is Ile or Arg <220> <222> 18 <223> Xaa is Glu or Thr <220> <222> 19 <223> Xaa is Glu or Ile <220> <222> 20 <223> Xaa is Arg or Ala <220> <222> 21 <223> Xaa is Ser or Arg <220> <222> 24 <223> Xaa is Val or Ala <220> <222> 27 or 42 <223> Xaa is Ser or Ala <220> <222> 29 <223> Xaa is Leu, Phe or Arg <220> <222> 30 <223> Xaa is Pro, Ser or Lys <220> <222> 32 <223> Xaa is Lys or Gln <220> <222> 33 <223> Xaa is Val or Ile <220> <222> 39 <223> Xaa is Asn or Ala <220> <222> 40 <223> Xaa is Arg, Gln, Leu, Ala or Lys <220> <222> 45 <223> Xaa is Asp or Glu <220> <222> 47 <223> Xaa is Ser, Ala or Arg <220> <222> 49 <223> Xaa is Val or Ile <220> <222> 50 <223> Xaa is Ile, Glu, Leu, Lys or Arg <220> <222> 51 <223> Xaa is Trp, Gly, Gln, Glu or Thr <220> <222> 52 <223> Xaa is Lys or Arg <220> <222> 53 <223> Xaa is Trp or Gln <220> <222> 56 <223> Xaa is Glu, His, Asn, Gln or Asp <220> <222> 58 <223> Xaa is Glu, Asn, Gln or Leu <220> <222> 61 <223> Xaa is Leu or Val <220> <222> 62 <223> Xaa is Glu, Val, Leu or Pro <220> <222> 65 <223> Xaa is Asp, Glu or Gly <220> <222> 67 <223> Xaa is Lys, Arg or Asp <220> <222> 68 <223> Xaa is Thr, Val or Leu <220> <222> 70 <223> Xaa is Pro or Ile <220> <222> 71 <223> Xaa is Asp or Asn <220> <222> 72 <223> Xaa is Asn, Tyr, Ser, Leu or Arg <220> <222> 73 <223> Xaa is Ser, Thr or Lys <220> <222> 76 <223> Xaa is Met, Ser or Thr <220> <222> 78 <223> Xaa is Ala, Ser, Ile or Thr <220> <222> 79 <223> Xaa is Thr, Ser, Arg or Gln <220> <222> 81 <223> Xaa is Asn, His or Gly <220> <222> 82 <223> Xaa is Lys or Arg <220> <222> 83 <223> Xaa is Ile or Val <400> 57 Gly Thr Cys Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Thr Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa 20 25 30 Xaa Ala Gly Thr Thr Arg Xaa Xaa Pro Xaa Cys Val Xaa Ala Xaa Ile 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Met Xaa Pro Cys Xaa Xaa Gly Glu 50 55 60 Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Trp Xaa Cys Xaa Xaa Gly 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Lys Thr Thr 85 <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 58 Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr 1 5 10 15 Cys Thr Gly <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 59 ccacaaatgc ttctgttagg 20 <210> 60 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 60 aagcaggctt cgccaccatg gcaatggtct ctgcgat 37 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 61 gtgatggtga tggtgggttc ttgggtgaat tctcg 35 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 62 aagcaggctt cgccaccatg gcaatggtct ctgcgat 37 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 63 gtgatggtga tggtgaggcc ttggatgatc tgaag 35 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 64 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 65 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 65 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 66 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 67 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 68 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 69 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 70 taatacgact cactatagg 19 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 71 attaaccctc actaaagg 18 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 72 atttaggtga cactatag 18 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 73 gctgcaggat gagtaagaga 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 74 tcatcagcct tgaggatcac 20 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 75 atgagtaaga gatacttaca gaaagc 26 <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 76 tcaccaccta gttgttttga ctttattc 28 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 77 acgcgagctg ctccatcatg tgt 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 78 tggtgccata tgcagccatg tct 23 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 79 gctgtcaacg atacgctacg taacg 25 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 80 cgctacgtaa cggcatgaca gtg 23 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 81 gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtttt tttttttttt tttt 54 <210> 82 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 82 aagcaggctt cgccaccatg agtaagagat acttaca 37 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 83 gtgatggtga tggtgatggg ttaccctagt tgttt 35 <210> 84 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 84 gtgatggtga tggtgcacgt ttgccctagt tgttt 35 <210> 85 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 85 gtgatggtga tggtgccacc tagttgtttt gactt 35 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 86 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 87 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 87 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 88 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 89 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 90 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 90 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 91 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 91 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 92 taatacgact cactatagg 19 <210> 93 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 93 attaaccctc actaaagg 18 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 94 atttaggtga cactatag 18 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 95 taatacgact cactatagg 19 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 96 attaaccctc actaaagg 18 <210> 97 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 97 aagcaggctt cgccaccatg gcgccatcgc ccaggac 37 <210> 98 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 98 gtgatggtga tggtgggaga ccgtggtggt cttta 35 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 99 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 100 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 100 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 101 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 102 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 103 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 104 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 105 taatacgact cactatagg 19 <210> 106 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 106 attaaccctc actaaagg 18 <210> 107 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 107 aagcaggctt cgccaccatg aggtccccaa ggatgag 37 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 108 gtgatggtga tggtgccgcg ttaccttcgt agttt 35 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 109 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 110 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 110 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 111 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 112 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 113 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 114 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 114 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 115 ttctctccgc aggatgagtg a 21 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 116 tcgtgtgacc ttggtggttt 20 <210> 117 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 117 aagcaggctt cgccaccatg agtgagaggg tcgagcg 37 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 118 gtgatggtga tggtgtcgtg tgaccttggt ggttt 35 <210> 119 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 119 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 120 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 120 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 121 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 122 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 123 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 124 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 124 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 125 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 125 taatacgact cactatagg 19 <210> 126 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 126 atttaggtga cactatag 18

Claims (67)

  1. SECFAM1 계통의 구성원을 확인하는 방법에 있어서, 번역된 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열의 데이터베이스를 검색하여 아래의 서열 프로필과 대응(matching)되는 폴리펩티드 서열을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법:
    여기서, NCBI(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11, gap extension penalty=1]에 의해 명시된 디폴트 파라미터를 이용하여 상기 프로필을 검색 프로그램 BLAST에 쿼리 서열로서 입력하는 경우에, SECFAM1 계통의 구성원은 1O-2 이하의 E 값을 보유한다.
  2. 제 1항에 있어서, E 값은 1O-5 이하, 1O-10 이하, 1O-50 이하, 또는 1O-70 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 번역된 핵산 서열의 데이터베이스는 cDNA, EST, mRNA, 전체 또는 부분 게놈 데이터베이스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 데이터베이스는 EST 데이터베이스인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 데이터베이스는 인간 서열 데이터베이스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. i) NCBI(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11, gap extension penalty=1]에 의해 명시된 디폴트 파라미터를 이용하여 하기 프로필을 검색 프로그램 BLAST에 쿼리 서열로서 입력하는 경우에, 1O-2 이하의 E 값을 보유하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 분리된 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 분리된 폴리펩티드.
  7. 제 6항에 있어서, 이런 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  8. 제 6항 또는 7항에 있어서, 1O-2의 최대 임계 E 값을 보유하고, 적절하게는, 1O-5 이하, 1O-10 이하, 1O-50 이하, 또는 1O-70 이하의 최소 임계 E 값을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  9. (i) 아래의 공통 아미노산 서열을 충족하는 폴리펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 분리된 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 분리된 폴리펩티드.
  10. 제 9항에 있어서, 아래의 공통 아미노산 서열을 충족하는 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드:
  11. (i) SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  12. 제 11항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  13. 제 11항 또는 12항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:30에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  14. (i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 또는 SEQ ID NO:39에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  15. 제 14항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:37 또는 SEQ ID NO:39에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  16. (i) SEQ NO:6, SEQ NO:8, SEQ NO:41, SEQ NO:43, SEQ NO:53 또는 SEQ NO:55에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  17. 제 16항에 있어서,
    (i) SEQ NO:6, SEQ NO:8, SEQ NO:41, SEQ NO:43, SEQ NO:53 또는 SEQ NO:55에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  18. (i) SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:45 또는 SEQ ID NO:47에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  19. 제 18항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:45 또는 SEQ ID NO:47에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  20. (i) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:49 또는 SEQ ID NO:51에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  21. 제 20항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:49 또는 SEQ ID NO:51에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원이거나 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 이의 단편인 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  22. 제 6항 내지 21항중 어느 한 항의 (iii)에 따른 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열에 상동하고 EGF 도메인 보유 단백질 계통의 구성원인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 제 6항 내지 22항중 어느 한 항에 열거된 단편 또는 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  24. 제 6항 내지 23항중 어느 한 항에 열거된 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드와 현저한 구조적 상동성을 보이는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  25. 제 6항 내지 21항 및 23항중 어느 한 항에 열거된 단편인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 또는 SEQ ID NO:55에 열거된 아미노산 서열로부터 7개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 제 6항 내지 21항중 어느 한 항의 (i) 폴리펩티드와 공통 항원 결정부위를 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  26. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자 X와 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  27. 전술한 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 정제된 핵산 분자.
  28. 제 27항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54에 열거된 핵산 서열을 포함하거나 이들의 잉여 등가물 또는 단편인 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  29. 제 27항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54에 열거된 핵산 서열로 구성되거나 이들의 잉여 등가물 또는 단편인 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  30. 높은 엄밀도 조건하에서 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 혼성화되는 정제된 핵산 분자.
  31. 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 열거된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  32. 제 31항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  33. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 EGF 도메인 보유 단백질 계통 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드.
  34. 제 33항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 리간드.
  35. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현이나 활성 수준을 증가 또는 감소시키는 화합물.
  36. 제 35항에 있어서, 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않으면서 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  37. 제 36항에 있어서, 자연이나 변형 기질, 리간드, 효소, 수용체, 또는 구조적 또는 기능적 모방체(mimetic)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  38. 질병의 치료 또는 진단에 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 또는 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물.
  39. 환자에서 질병을 진단하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    상기 환자로부터 얻은 조직에서 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준, 또는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 활성 수준을 평가하고;
    상기 발현 또는 활성 수준을 대조 수준과 비교하고,
    여기서 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다.
  40. 제 39항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 39항 또는 40항에 있어서,
    (a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에 본 발명의 제 33항 또는 34항의 리간드를 생물학적 샘플과 접촉시키고,
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 39항 또는 40항에 있어서,
    a) 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 프로브간 하이브리드 복합체 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 환자로부터 얻은 조직 시료와 핵산 프로브를 접촉시키고;
    b)(a) 단계에서 이용된 조건하에서 프로브와 대조 시료를 접촉시키고;
    c) 시료에서 하이브리드 복합체의 존재를 검출하고,
    여기서, 대조 시료에서 하이브리드 복합체의 수준과 비교하여 환자 시료에서 하이브리드 복합체의 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
  43. 제 39항 또는 40항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 프라이머간 하이브리드 복합체의 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 핵산 프라이머와 환자 조직의 핵산 시료를 접촉시키고;
    b) a) 단계에서와 동일한 조건하에서 대조 시료와 프라이머를 접촉시키고;
    c) 견본으로 조사된 핵산을 증폭하고;
    d) 환자 시료와 대조 시료로부터 증폭된 핵산의 수준을 검출하고;
    여기서, 대조 시료에서 증폭된 핵산 수준과 비교하여 환자 시료에서 증폭된 핵산의 현저하게 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
  44. 제 39항 또는 40항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 질병을 검사받는 환자로부터 조직 시료를 얻고;
    b) 조직 시료로부터 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 분리하고;
    c) 질병의 지표로서 핵산 분자에서 질병과 연관된 돌연변이의 존재를 검출하여 환자에서 질병을 진단한다.
  45. 제 44항에 있어서, 핵산 분자를 증폭시켜 증폭 산물을 만들고, 증폭 산물에서 돌연변이 유무를 검출하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 44항 또는 45항에 있어서, 하이브리드-이중 가닥 분자를 형성하는 엄밀도 조건하에서 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 프로브와 핵산 분자를 접촉시키고, 여기서 하이브리드 이중-가닥 분자는 질병과 연관된 돌연변이에 상응하는 임의의 부분에서 핵산 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분을 보유하고; 질병-연관된 돌연변이 유무의 지표로써 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분의 유무를 검출함으로써 환자에서 돌연변이 유무를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 39항 내지 46항중 어느 한 항에 있어서, 질병은 불임을 비롯한 생식 질환; 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측색 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 39항 내지 46항중 어느 한 항에 있어서, 질병은 림프구 항원이 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. EGF 도메인 보유 단백질로서 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
  50. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 또는 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물을 함유하는 약학 조성물.
  51. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 함유하는 백신 조성물.
  52. 불임을 비롯한 생식 질환; 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측색 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병인성 질환에서 선택되는 질병 치료용 약물의 제조에 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물.
  53. 림프구 항원이 관련된 질병 치료용 약물의 제조에 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물.
  54. 환자에서 질병을 치료하는 방법에 있어서, 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물을 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 건강한 사람에서 발현이나 활성 수준과 비교하여 자연 유전자의 발현 또는 폴리펩티드의 활성이 병든 환자에서 감소하는 질병의 경우에, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 리간드, 화합물 또는 조성물은 항진제인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 54항에 있어서, 건강한 사람에서 발현이나 활성 수준과 비교하여 자연 유전자의 발현 또는 폴리펩티드의 활성이 병든 환자에서 증가하는 질병의 경우에, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 리간드, 화합물 또는 조성물은 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 환자에서 질병 치료를 모니터하는 방법에 있어서, 환자의 조직에서 일정 기간동안 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현이나 활성 수준, 또는 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 발현 수준을 모니터하고, 시간이 경과함에 따라 활성이나 발현 수준이 대조 수치에 근접하는 것은 질병으로부터 회복을 암시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 질병의 진단 또는 치료에 효과적인 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 상기 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 결합 친화성을 갖는 것으로 생각되는 한가지이상의 화합물과 접촉시키고;
    이들 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물을 선별한다.
  59. 질병을 진단하는데 유용한 키트에 있어서,
    엄밀도 조건하에서 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 혼성화되는 핵산 프로브를 보유하는 제 1 용기;
    핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머를 보유하는 제 2 용기;
    질병 진단을 용이하게 하는 프로브와 프라이머의 사용 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  60. 제 59항에 있어서, 혼성화되지 않은 RNA를 절단하는 약품을 보유하는 제 3 용기가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  61. 핵산 분자 어레이를 포함하고, 어레이중 적어도 하나는 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자인 키트.
  62. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 결합하는 한가지이상의항체 및 상기 항체와 상기 폴리펩티드 사이의 결합 반응을 검출하는데 유용한 시약을 포함하는 진단 키트.
  63. 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 더욱 높거나 낮은 수준으로 발현하거나 이런 폴리펩티드를 발현하지 않도록 형질전환된 유전자도입 또는 녹아웃(knockout)된 사람-아닌 동물.
  64. 질병을 치료하는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    제 63항에 따른 사람-아닌 유전자도입 동물과 후보 화합물을 접촉시키고;
    동물에서 질병에 대한 화합물의 효과를 결정한다.
  65. IVF 또는 피임제 용도로 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물.
  66. 피임제의 제조에 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물
  67. 관절염, 류머티스 관절염(RA), 건성성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 전신 경화증, 경피증(scleroderma), 다발성근염(polymyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 섬유증, 폐 섬유증과 염증, 알레르기 또는 과민성 질환, 피부염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 폐혈 쇼크, HIV 감염, 이식 거부반응, 상처 치유, 전이(metastasis), 자궁내막증, 간염, 간 섬유증, 암, 무통각, 죽상경화증과 연관된 혈관 염증, 아토피성 피부염과 건선과 같은 염증성 피부 질환, 쇼그렌 증후군, 중증 근무력증(myasthenia gravis)의 치료를 위한 약물의 제조에 사용되는 제 6항 내지 26항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 27항 내지 30항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 31항에 따른 벡터, 제 32항에 따른 숙주 세포, 제 33항 또는 34항에 따른 리간드, 제 35항 내지 37항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 50항에 따른 약학 조성물.
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