ES2943136T3

ES2943136T3 - Polipéptido de TAFA4 para su uso para reducir la inflamación cutánea

Info

Publication number: ES2943136T3
Application number: ES19773104T
Authority: ES
Inventors: Sophie Ugolini; Guilhaume Debroas; Guillaume Hoeffel; Abdelaziz Moqrich
Original assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: US20220031807A1; EP3856228B1; EP3856228A1; WO2020064907A1

Abstract

La piel es una de las primeras líneas de defensa contra las amenazas externas. Los macrófagos residentes en tejidos tienen funciones fundamentales en la integridad y homeostasis de la barrera tisular. Tras la inflamación de la piel, una diafonía funcional entre el sistema nervioso sensorial y las células inmunitarias residentes en los tejidos puede regular las respuestas inmunitarias cutáneas. Sin embargo, dependiendo del contexto patológico, las neuronas sensoriales muestran propiedades reguladoras proinflamatorias o antiinflamatorias. Aquí, los inventores identifican, en un modelo de daño cutáneo inducido por ultravioleta (UV), un papel regulador para las neuronas sensoriales del mecanorreceptor de umbral bajo (C-LTMR) de tipo C en la dinámica del reemplazo de macrófagos dérmicos por monocitos inflamatorios a través del neuropéptido TAFA4. Los ratones Tafa4-KO presentan una dermis fibrótica no resuelta después de la irradiación UV. El aumento de la puntuación fibrótica se correlaciona con la persistencia aguas arriba de los monocitos inflamatorios y su progenie de macrófagos MHC-II+. La quimera de médula ósea reveló que la diferenciación de monocitos inflamatorios hacia macrófagos dérmicos CD206+ aumenta en el receptor Tafa4KO. Finalmente, la inyección intradérmica de TAFA4 en el sitio de la radiación UV reduce la acumulación de monocitos inflamatorios y la inflamación de la piel en ratones Tafa4-KO. Los resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la dinámica de los macrófagos residentes en los tejidos durante la resolución de la fibrosis cutánea y, por lo tanto, hacen creíble el uso de TAFA4 para el tratamiento de la inflamación de la piel. La inyección intradérmica de TAFA4 en el sitio de la radiación UV reduce la acumulación de monocitos inflamatorios y la inflamación de la piel en ratones Tafa4-KO. Los resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la dinámica de los macrófagos residentes en los tejidos durante la resolución de la fibrosis cutánea y, por lo tanto, hacen creíble el uso de TAFA4 para el tratamiento de la inflamación de la piel. La inyección intradérmica de TAFA4 en el sitio de la radiación UV reduce la acumulación de monocitos inflamatorios y la inflamación de la piel en ratones Tafa4-KO. Los resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la dinámica de los macrófagos residentes en los tejidos durante la resolución de la fibrosis cutánea y, por lo tanto, hacen creíble el uso de TAFA4 para el tratamiento de la inflamación de la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido de TAFA4 para su uso para reducir la inflamación cutánea

Campo

La presente divulgación se encuentra en el campo de la medicina, en particular enfermedades inflamatorias cutáneas.

Antecedentes

La piel funciona como una barrera importante entre el medio interno y el entorno, que impide el contacto con antígenos potencialmente perjudiciales. En el caso de la penetración de antígeno/patógeno, se induce una respuesta inflamatoria para eliminar el antígeno. Esta respuesta conduce a un infiltrado dérmico que consiste predominantemente en células T, células polimorfonucleares y macrófagos Normalmente, esta respuesta inflamatoria, desencadenada por el patógeno, está bajo control estricto y se detendrá tras la eliminación del patógeno. En determinados casos, la respuesta inflamatoria se produce en ausencia del patógeno. Por ejemplo, la radiación UV provoca daño similar a las quemaduras solares caracterizado por la destrucción de la epidermis y la inflamación de la papila dérmica subyacente89. Estos acontecimientos conducen a la rápida activación de mecanismos orquestados por los monocitos infiltrantes y los macrófagos dérmicos residentes para resolver la inflamación y fomentar la reparación tisular10 Sin embargo, una inflamación excesiva puede conducir a daño tisular crónico seguido de una deposición excesiva de colágeno, lo que da como resultado cicatrices fibróticas no resueltas. Las señales específicas de tejido determinan constantemente la identidad funcional de los macrófagos residentes111213 y fomentan su mantenimiento a lo largo de su vida, ya sea mediante autorrenovación local o mediante el reclutamiento de células derivadas de monocitos adicionales. Sin embargo, la naturaleza de estas señales sigue siendo en gran parte desconocida.

TAFA4 es un miembro de la familia TAFA que se compone de cinco genes altamente homólogos que codifican para proteínas secretadas pequeñas. Estas proteínas contienen residuos de cisteína conservados en posiciones fijas, y están lejanamente relacionados con MIP-1alfa, un miembro de la familia de quimiocinas CC. Por tanto, la molécula de TAFA4 es una proteína similar a quimiocinas23 que se sabe que modula la hipersensibilidad al dolor químico y mecánico inducido por lesión en ratones22. Se ha demostrado que TAFA4 recombinante está implicada en la quimiotaxis de macrófagos en seres humanos in vitro24. También se ha descrito que TAFA4 es adecuada para el tratamiento del dolor (documento US20160113996). Sin embargo, aún no se ha investigado su posible papel en el reclutamiento o la activación de células mieloides in vivo y eventualmente en la inflamación cutánea.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido de TAFA4 o a una molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo para su uso para reducir la inflamación cutánea en un sujeto que lo necesita.

En particular, la presente invención se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada

La piel es una de las primeras líneas de defensa contra las amenazas externas. Los macrófagos residentes en tejidos tienen funciones fundamentales en la homeostasis y la integridad de la barrera tisular. Su mantenimiento tras una lesión se basa en señales específicas de tejido que controlan su autorrenovación o su reemplazo por monocitos circulantes reclutados1. Tras una infección o inflamación cutánea, una interferencia funcional entre el sistema nervioso sensorial y las células inmunitarias residentes en tejidos puede regular las respuestas inmunitarias cutáneas2. Sin embargo, dependiendo del contexto patológico, las neuronas sensoriales muestran propiedades reguladoras proinflamatorias o antiinflamatorias3456, lo que sugiere diversidad funcional dentro de subpoblaciones de neuronas sensoriales diferentes7. En este caso, los inventores identifican, en un modelo de daño cutáneo inducido por ultravioleta (UV), un papel regulador de las neuronas sensoriales de mecanorreceptor de bajo umbral de tipo C (C-LTMR) en la dinámica del reemplazo de macrófagos dérmicos por monocitos inflamatorios a través del neuropéptido TAFA4. Los ratones Tafa4-KO presentan una dermis fibrótica no resuelta después de la irradiación UV. Una puntuación fibrótica aumentada se correlaciona con la persistencia aguas arriba de los monocitos inflamatorios y su progenie de macrófagos CMH-II+. Quimeras de médula ósea revelaron que la diferenciación de monocitos inflamatorios en macrófagos dérmicos CD206+ se aumenta en receptores Tafa4-KO. Finalmente, la inyección intradérmica de TAFA4 en el sitio de irradiación UV reduce la acumulación de monocitos inflamatorios y la inflamación cutánea en ratones Tafa4-KO. Los resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la dinámica de macrófagos residentes en tejidos durante la resolución de fibrosis cutánea y, por tanto, acreditan el uso de TAFA4 para el tratamiento de inflamación cutánea.

Por consiguiente, el primer objeto de la presente divulgación se refiere a un método para reducir la inflamación cutánea en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de TAFA4 o una molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo.

Por tanto, el método de la presente divulgación es particularmente adecuado para el tratamiento de enfermedad inflamatoria cutánea.

Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad cutánea inflamatoria” se refiere a enfermedades caracterizadas por la aparición de una lesión cutánea resultante de la infiltración de células inflamatorias tales como células T cooperadoras activadas y monocitos. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias cutáneas incluyen, pero no se limitan a, acné, rosácea, foliculitis, dermatitis peribucal, fotodaño, envejecimiento cutáneo, psoriasis, ictiosis, heridas crónicas, úlceras de decúbito, queratosis piralis, cicatrices, incluyendo cicatrices quirúrgicas y de acné, quistes sebáceos, dermatosis inflamatorias, hiperpigmentación posinflamatoria, xerosis, prurito, liquen plano, prurigo nodular, eccema y miliaria. Las enfermedades inflamatorias cutáneas que pueden tratarse según la divulgación también incluyen, por ejemplo, inflamación cutánea crónica o aguda, fibrosis cutánea, esclerodermia o una enfermedad o un trastorno fibrótico cutáneo.

En particular, el método que se da a conocer en el presente documento es particularmente adecuado para el tratamiento de esclerodermia, dermatitis atópica, dermopatía fibrosante nefrogénica, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, escleromixedema, escleredema, queloide, esclerodactilia o fascitis eosinofílica.

En particular, el método que se describe en el presente documento es particularmente adecuado para el tratamiento de fotodermatitis. Tal como se usa en el presente documento, el término “fotodermatitis” tiene su significado general en la técnica y se refiere a inflamación cutánea en respuesta a radiación/luz UV. Esta respuesta tisular puede incluir dolor, irritación, picazón, afluencia de células inflamatorias y potenciadoras del dolor y lesión tisular.

En particular, el método que se da a conocer en el presente documento es particularmente adecuado para el tratamiento de herida crónica. Tal como se usa en el presente documento, el término “herida crónica” se refiere a aquellas heridas que no cicatrizan en un conjunto ordenado de etapas y en un periodo de tiempo predecible. Normalmente, las heridas que no cicatrizan en el plazo de tres meses se consideran crónicas. Los ejemplos de heridas crónicas incluyen, pero no se limitan a, úlceras por insuficiencia venosa, úlceras diabéticas del pie, y similares. Por ejemplo, para el tratamiento de úlceras por insuficiencia venosa y por diabetes, la matriz se aplica a las heridas para fomentar la formación de tejido de granulación y facilitar la epitelización. Las heridas crónicas también pueden incluir aquellas relacionadas con traumatismo (o traumatismo repetido), lesión térmica (por ejemplo, quemaduras) y daño por radiación. En particular, también queda abarcado el tratamiento de herida crónica en un sujeto que padece anemia drepanocítica. En particular, también queda abarcado el tratamiento de herida crónica en ancianos.

En particular, el método que se da a conocer en el presente documento es particularmente adecuado para prevenir la fibrosis cutánea. Tal como se usa en el presente documento, el término “fibrosis cutánea” o “fibrosis dérmica” significa la proliferación excesiva de células epiteliales o tejido conjuntivo fibroso (fibrosis), dando como resultado de ese modo el desarrollo de tejido cicatrizado (fibrótico). El tejido cicatrizado reemplaza al tejido sano mediante el proceso de fibrosis y puede ser el preludio de la esclerodermia sistémica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” o “tratar” se refiere al tratamiento profiláctico o preventivo así como al tratamiento curativo o modificador de enfermedad, incluyendo el tratamiento de pacientes en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que han contraído la enfermedad, así como de pacientes que están enfermos o que se les ha diagnosticado que padecen una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recidiva clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que padece un trastorno médico o que en última instancia puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por “régimen terapéutico” se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión “régimen de inducción” o “periodo de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o a la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un paciente durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un “régimen de carga”, que puede incluir administrar una mayor dosis del fármaco que la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con más frecuencia de la que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La expresión “régimen de mantenimiento” o “periodo de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o a la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, para mantener al paciente en remisión durante largos periodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear terapia continua (por ejemplo, administrar un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, cada semana, cada mes, cada año, etc.) o terapia intermitente (por ejemplo, tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recidiva o tratamiento tras lograr unos criterios predeterminados particulares [por ejemplo, manifestación de la enfermedad, etc.]).

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de TAFA4” designa un polipéptido perteneciente a la familia de proteínas similares a quimiocinas TAFA, que comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (que corresponde a la secuencia de aminoácidos de TAFA4 humana) y cualquier variante natural del mismo (por ejemplo, variantes presentes en otras especies animales o variantes como resultado de polimorfismo o corte y empalme). Dentro del contexto de la presente divulgación, el término “polipéptido de TAFA4” también incluye cualquier polipéptido que comprende una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1.

SEQ IDNO:1>sp|Q96LR4|F19A4_HUMAN Protein FAM19A4 OS=Homo sapiens

OX=9606 GN=FAM19A4 PE=1 SV=1 MRSPRMRVCAKSVLLSHWLFLAYVLMVCCKLMSASSQHLRGHAGHHQIKQGTCEWAVHR CCNKNRIEERSQTVKCSCFPGQVAGTTRAQPSCVEASIVIQKWWCHMNPCLEGEDCKVLP DYSGWSCSSGNKVKTTKVTR

Según la divulgación, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene el 90; el 91; el 92; el 93; el 94; el 95; el 96; el 97; el 98; el 99 o el 100% de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. Con frecuencia, la identidad de secuencia se mide en cuanto a porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. En la técnica se conocen bien métodos de alineación de secuencias para su comparación. Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; y Pearson et al., Met. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994, presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. A modo de ejemplo, pueden usarse las herramientas de alineación ALIGN (Myers y Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) o LFA^sT^a(Pearson y Lipman, 1988) para realizar comparaciones de secuencias (Internet Program® 1996, W. R. Pearson y la Universidad de Virginia, fasta20u63 versión 2.0u63, fecha de lanzamiento: diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias completas unas con respecto a otras, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web del NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, puede emplearse la función de secuencias Blast 2 usando la matriz BLOSUM62 por defecto ajustada a los parámetros por defecto (coste de existencia de hueco de 11 y coste de hueco por residuo de 1). Cuando se alinean péptidos cortos (de menos de aproximadamente 30 aminoácidos), la alineación debe realizarse usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 ajustada a los parámetros por defecto (penalización por hueco abierto de 9, penalización por hueco de extensión de 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, del sitio web del NCBI; véanse también Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish y States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Met. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997.

Los polipéptidos de la divulgación pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica. Con el fin de producir cantidades suficientes de polipéptidos o equivalentes funcionales de los mismos para su uso según la presente divulgación, la expresión puede lograrse de manera conveniente cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el polipéptido de la divulgación. En particular, el polipéptido se produce mediante medios recombinantes, mediante expresión a partir de una molécula de ácido nucleico codificante. Se conocen bien sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes. Cuando se expresa en forma recombinante, el polipéptido se genera en particular mediante expresión a partir de un ácido nucleico codificante en una célula huésped. Puede usarse cualquier célula huésped, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema particular. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster y muchas otras. Las bacterias también son huéspedes preferidos para la producción de proteína recombinante, debido a la facilidad con la que las bacterias pueden manipularse y hacerse crecer. Un huésped bacteriano preferido habitual es E. coli.

En particular, el polipéptido de TAFA4 se fusiona con un dominio constante de inmunoglobulina para constituir una inmunoadhesina. Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunoadhesina” designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una “adhesión”) con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM. Normalmente, pero no necesariamente, la secuencia de inmunoglobulina es un dominio constante de inmunoglobulina (región Fc). Las inmunoadhesinas pueden presentar muchas de las valiosas propiedades químicas y biológicas de los anticuerpos humanos. Dado que las inmunoadhesinas pueden construirse a partir de una secuencia de proteína humana con una especificidad deseada unida a una secuencia de dominio constante y de bisagra (Fc) de inmunoglobulina humana apropiada, la especificidad de unión de interés puede lograrse usando componentes completamente humanos. Tales inmunoadhesinas son mínimamente inmunogénicas para el paciente y son seguras para su uso prolongado o repetido.

Los polipéptidos de la divulgación pueden presentar modificaciones posteriores a la traducción, incluyendo, pero sin limitarse a, glicosilaciones, (por ejemplo, glicosilaciones unidas a N o unidas a O), miristilaciones, palmitilaciones, acetilaciones y fosforilaciones (por ejemplo, serina/treonina o tirosina).

En particular, se contempla que los polipéptidos usados en los métodos terapéuticos de la presente divulgación pueden modificarse con el fin de mejorar su eficacia terapéutica. Tal modificación de compuestos terapéuticos puede usarse para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo circulatorio o modificar la biodistribución. Por ejemplo, la toxicidad de compuestos terapéuticos potencialmente importantes puede disminuirse significativamente mediante la combinación con una variedad de vehículos portadores de fármacos que modifican la biodistribución. En un ejemplo, la adición de dipéptidos puede mejorar la penetración de un agente circulante en el ojo a través de la barrera hematorretiniana usando transportadores endógenos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una molécula de ADN o ARN. Sin embargo, el término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos base conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetiicitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

En particular, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO:2. Según la divulgación, una primera secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad con una segunda secuencia de ácido nucleico significa que la primera secuencia tiene el 70; el 71; el 72; el 73; el 74; el 75; el 76; el 77; el 78; el 79; el 80; el 81; el 82; el 83; el 84; el 85; el 86; el 87; el 88; el 89; el 90; el 91; el 92; el 93; el 94; el 95; el 96; el 97; el 98; el 99 o el 100% de identidad con la segunda secuencia de ácido nucleico.

SEQ IDNO:2

1 aatcagcgcg ttccgcggcg ggcccggccc ctcctggtca gcgcgctagc tgggctcggc

61 tccgcactgc tagctgcgcg ccgccctgga cggggcgcac cgactgcgcg cgcggctgcg

121 ggcaaacatc gggagtcctg cctcagctgc cgcttctcca gcagcagctt caggcttctc

181 ccgcaggagc ttcgggcttc tcctggtaga gacgtgggaa cttttcttct cctggcgagg

241 ctgcagaggt gatgggccgc tcccggggct cccgcgggga ggcggcacgg tgagcgtcct

301 cgggctccgg tgcggcgatc agtacctagt tccggacgcg ccggtccgac ttggatgccg

361 gctctagtcg agtcttctga gctacgataa ttttttggaa cggcagaaat gattggttct

421 agcaacagat gggaatttgg agtcactctg aaatatatcc tggaataagt gtgtttgact

481 agaaccacat cttatgaggt ccccaaggat gagagtctgt gctaagtcag tgttgctgtc

541 gcactggctc tttctagcct acgtgttaat ggtgtgctgt aagctgatgt ccgcctcaag

601 ccagcacctc eggggaeatg caggtcacca ccaaatcaag caagggacct gtgaggtggt

661 cgccgtgcac aggtgctgca ataagaaccg catagaagag cggtcacaaa cggtcaagtg

721 ctcttgcttc ccgggacagg tggcgggcac aactcgggct caaccttctt gtgttgaagc

781 ttccattgtg attcagaaat ggtggtgtca catgaatccg tgtttggaag gagaggattg

841 taaagtgctg ccagattact caggttggtc ctgtagcagt ggcaataaag tcaaaactac

901 gaaggtaacg cggtagcgaa gagagaggtg tgcttcaatc ctggaggggc agcaggaggc

961 ggagctcttt tgcttggatt cccatcatgg cccctttgca gaaaattgtc taggatttca

1021 gcaacttcat atttgtatat gtgagctgtg agaggtggca ttcacttaac tggcccagcc

1081 ctctctgctt cgtgatttta tttcattgaa ttataaccac aagccaccac ccatttgaca

1141 tcctctctgg attcccaagg agcatacctc caaaatccga gaagagcaaa tcagagtctt

1201 caaaatggat caccactaag ggcatgttca ttcttcactt tctttctgct tttacaaaag

1261 aacttggatg tatgttccaa agggtcctca ttctgttcct cttttgaact tttccttttg

1321 tccttgtatt aaagtggttt taaaggggtc taaaaagatt ttggcaaaac atatttgcag

1381 atgtagatta gctggtgaag aaaattactg ctagagatca actgattaac tggtaaagaa

1441 cgtttatttt ataacccttg aagaatagaa ggacatagtt ggattattgt gtgtgcattg

1501 tatttttact tctatttttt ttttgctttc cattttccag ttagcagaga taaaatgaga

1561 gcgttttaac ttcaatgtac cattttactg agtgctaagg aagcatatca attccaatat

1621 tttataacca aagctctatc agaacatatt tataaaactt gttggaattt ttacggcttt

1681 tgtgtagtca tgtaggtaaa tcatttaaaa tataaaacaa tctcaattta gatcaagggt

1741 tatttcttag atcaaattta tgccaattat atgaaaagat tttaactccg agacaggagt

1801 ctttcagtgc tgaattttta gactgtaaat gagttcttct taacttagct gtttccctac

1861 ttctgtgact tctgtgttag ccatcttatt tctttaaaat ctgagtcctg attggcttaa

1921 tgattttgca gcagacatgt ctccacatat tctcaaatgc tgtcatgcgg aaacgtatga

1981 aacagatgaa gaatgactga cccagatttt agatgtataa tgttgttaaa gtacatacta

2041 ctgtaaaaat atgggatgaa ttttatatat taagaaatgc caaaaacata gtttctgcac

2101 caagttaatt atccctgtcc tttcacattt atagggggaa aataaatact ttaatgttgt

2161 ttatagccta acagttattt gattttattc ttgcagaggg aatggaaagg aatggaaaga

2221 tttgttggcg taatttttga atatttgtta tgatcatatg aataagtaaa aaaattcatc

2281 ctgctgatgg cata

En particular, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación se incluye en un vector adecuado. Normalmente, el vector es un vector viral, y más particularmente un virus adenoasociado (AAV), un retrovirus, virus del papiloma bovino, un vector de adenovirus, un vector lentiviral, un virus de la vacuna, un virus del polioma o un virus infeccioso. En particular, el vector es un vector de AAV. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector de AAV” significa un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, incluyendo, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y formas mutadas de los mismos. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo natural de AAV delecionado en su totalidad o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero conservan las secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Los retrovirus pueden elegirse como vectores de inserción de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del huésped, transferir una gran cantidad de material genético foráneo, infectar a un amplio espectro de especies y tipos celulares y empaquetarse en líneas celulares especiales. Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica para un gen de interés en el genoma viral en lugar de determinadas secuencias virales para producir un virus que tiene replicación defectuosa. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y/o env pero sin los componentes de LTR y/o de empaquetamiento. Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con las secuencias de LTR y de empaquetamiento retrovirales, en esta línea celular (por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio), la secuencia de empaquetamiento permite el empaquetamiento del transcrito de ARN del plásmido recombinante en partículas virales, que después se secretan a los medios de cultivo. Después se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, se concentran opcionalmente, y se usan para la transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar a una amplia variedad de tipos celulares. Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovirales habituales gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. La mayor complejidad permite al virus modular su ciclo de vida, como en el transcurso de infección latente. Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH 1, VIH 2) y los virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS). Se han generado vectores lentivirales mediante la atenuación múltiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, se delecionan los genes env, vif, vpr, vpu y nef, lo que hace que el vector sea biológicamente seguro. En la técnica se conocen vectores lentivirales, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.013.516 y 5.994.136. En general, los vectores están basados en plásmidos o basados en virus y están configurados para portar las secuencias esenciales para la incorporación de ácido nucleico foráneo, para la selección y para la transferencia del ácido nucleico a una célula huésped. En la técnica también se conocen los genes gag, pol y env de los vectores de interés. Por tanto, se clonan los genes relevantes en el vector seleccionado y después se usan para transformar la célula diana de interés. En la patente estadounidense n.° 5.994.136 se describe un lentivirus recombinante que puede infectar a una célula no en división en la que se transfecta una célula huésped adecuada con dos o más vectores que portan las funciones de empaquetamiento, concretamente gag, pol y env, así como rev y tat. Esta describe un primer vector que puede proporcionar un ácido nucleico que codifica para un gen gag y un gen pol virales y otro vector que puede proporcionar un ácido nucleico que codifica para un gen env viral para producir una célula de empaquetamiento. Introducir un vector que proporciona un gen heterólogo en esa célula de empaquetamiento da lugar a una célula productora que libera partículas virales infecciosas que portan el gen foráneo de interés. El gen env es preferiblemente una proteína de la envoltura anfotrópica que permite la transducción de células de especies humanas y otras especies. Normalmente, la molécula de ácido nucleico o el vector de la presente divulgación incluye “secuencias de control” que se refieren colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma (“IRES”), potenciadores, y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula del receptor. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes mientras la secuencia codificante seleccionada pueda replicarse, transcribirse o traducirse en una célula huésped apropiada. Otra secuencia de ácido nucleico es una secuencia “promotora” que se usa en el presente documento en su sentido habitual para referirse a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se deriva de un gen que puede unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (en el sentido de 3'). Los promotores de transcripción pueden incluir “promotores inducibles” (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótido unida operativamente al promotor se induce por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc.), “promotores reprimibles” (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótido unida operativamente al promotor se induce por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc.) y “promotores constitutivos”.

Por una “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad suficiente del polipéptido o de la molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo para prevenir para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria cutánea en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente divulgación lo decidirá el médico responsable dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel específico de dosis terapéuticamente eficaz para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o de manera simultánea con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, se conoce bien dentro de la habilidad de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta lograr el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede variarse a lo largo de un amplio intervalo de desde 0,01 hasta 1,000 mg por adulto al día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomático de la dosificación para el sujeto que va a tratarse. Un medicamento contiene normalmente de desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del principio activo, preferiblemente de desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del principio activo. Habitualmente se administra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosificación de desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso corporal al día.

Según la divulgación, el polipéptido o la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación se administra al sujeto en forma de una composición farmacéutica. Normalmente, el polipéptido o la molécula de ácido nucleico (insertado o no en un vector) de la presente divulgación puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones farmacéuticas. “Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen ninguna reacción adversa, alérgica u otra no deseada cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, un diluyente, un material de encapsulación o un adyuvante de formulación de cualquier tipo. En las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma de administración unitaria, como mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitarias adecuadas comprenden formas para vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gelatina, polvos, gránulos y suspensiones o disoluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, intradérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal.

En particular, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración tópica. El portador farmacéuticamente aceptable tópico es cualquier portador sustancialmente no tóxico que puede usarse convencionalmente para la administración tópica de productos farmacéuticos en los que el principio activo de la divulgación permanecerá estable y biodisponible cuando se aplique directamente a la piel. Por ejemplo, portadores tales como los conocidos en la técnica eficaces para penetrar la capa de queratina de la piel hasta el estrato córneo pueden ser útiles en la administración del principio activo de la divulgación a la zona de interés. Tales portadores incluyen liposomas. El principio activo de la divulgación puede dispersarse o emulsionarse en un medio de manera convencional para formar una preparación líquida o mezclarse con un portador semisólido (gel) o sólido para formar una pasta, un polvo, una pomada, una crema, una loción, o similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables tópicos adecuados incluyen agua, solución salina tamponada, gelatina de petróleo (vaselina), petrolato, aceite mineral, aceite vegetal, aceite animal, ceras orgánicas e inorgánicas tales como cera microcristalina, de parafina y de ozocerita, polímeros naturales tales como xantanos, gelatina, celulosa, colágeno, almidón, o goma arábiga, polímeros sintéticos, alcoholes, polioles, y similares. El portador puede ser una composición de portador miscible en agua. Tal composición de portador farmacéuticamente aceptable tópico miscible en agua puede incluir las preparadas con uno o más componentes apropiados al inicio de terapia. Dado que las afecciones dermatológicas que van a tratarse pueden ser visibles, el portador tópico también puede ser un portador cosméticamente aceptable tópico. El portador cosméticamente aceptable tópico será cualquier portador sustancialmente no tóxico que puede usarse convencionalmente para la administración tópica de productos cosméticos en los que el principio activo de la divulgación permanecerá estable y biodisponible cuando se aplique directamente a la superficie cutánea. Los expertos en la técnica conocen portadores cosméticamente aceptables adecuados, e incluyen, pero no se limitan a, líquidos, cremas, aceites, lociones, pomadas, geles o sólidos cosméticamente aceptables, tales como cremas cosméticas de noche convencionales, cremas base, lociones de bronceado, protectores solares, lociones de manos, maquillaje y bases de maquillaje, mascarillas, y similares. Los portadores cosméticamente aceptables tópicos pueden tener una naturaleza similar o idéntica a los portadores farmacéuticamente aceptables tópicos anteriormente descritos. Las composiciones pueden contener otros componentes convencionales en productos cosméticos, incluyendo perfumes, estrógeno, vitaminas A, C o E, alfa-hidroxiácidos o alfa-cetoácidos tales como los ácidos pirúvico, láctico o glicólico, lanolina, vaselina, aloe vera, metilparabeno o propilparabeno, pigmentos, y similares.

Puede ser deseable disponer de un sistema de administración que controle la liberación del principio activo de la divulgación a la piel y se adhiera a, o se mantenga por sí mismo en, la herida durante un periodo de tiempo prolongado para aumentar el tiempo de contacto del principio activo de la divulgación en la piel. La liberación sostenida o retardada del principio activo de la divulgación proporciona una administración más eficiente que da como resultado una dosificación menos frecuente y/o disminuida del principio activo de la divulgación y un mejor cumplimiento por parte del paciente. Los ejemplos de portadores adecuados para liberación sostenida o retardada en un entorno húmedo incluyen gelatina, goma arábiga, polímeros de xantano. Los portadores farmacéuticos que pueden liberar el principio activo de la divulgación cuando se exponen a cualquier entorno oleaginoso, graso, ceroso o húmedo en la zona que va a tratarse incluyen elastómero o resina termoendurecible flexible o termoplástica incluyendo resinas termoplásticas tales como poli(haluros de vinilo), poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilideno) y poliolefinas halogenadas, elastómeros tales como Brasiliensis, polidienos y cauchos naturales y sintéticos halogenados, y resinas termoendurecibles flexibles tales como poliuretanos, resinas epoxídicas y similares. Se describen sistemas de administración controlada, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.427.778, que proporciona formulaciones de gel y disoluciones viscosas para la administración del principio activo de la divulgación al sitio cutáneo. Los geles tienen las ventajas de presentar un alto contenido de agua para mantener húmeda la piel, la capacidad de absorber exudado cutáneo, una fácil aplicación y una fácil eliminación por lavado. Preferiblemente, el portador de liberación sostenida o retardada es un gel, un liposoma, una microesponja o una microesfera.

En particular, la administración tópica para tratamiento cutáneo se logra mediante un dispositivo transdérmico o dispositivo “de parche”. El principio activo de las formulaciones de la divulgación para administración transdérmica puede usarse para recubrir las fibras de un apósito de gasa absorbente.

En particular, el polipéptido de TAFA4 se administra en combinación con un tratamiento clásico de inflamación cutánea.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento clásico” se refiere a cualquier agente activo usado para el tratamiento de inflamación cutánea.

En particular, el tratamiento clásico de inflamación cutánea se refiere a un inhibidor de calcineurina tal como tacrolimús y pimecrolimús; dapsona; retinoides; metotrexato; y glucocorticoide.

En particular, el polipéptido de TAFA4 se administra en combinación con otro agente activo tal como un glucocorticoide. Los ejemplos no limitativos específicos de glucocorticoides incluyen dexametasona, acetónido de triamcinolona (AZMACORT®), beclometasona, dipropionato (VANCERIL®), flunisolida (AEROBID®), propionato de fluticasona (FLOVENT®), prednisona, metilprednisolona y furoato de mometasona (ASMANEX®, TWISTHALER®).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento combinado”, “preparación combinada”, “terapia combinada” o “combinación de terapias” se refieren a un tratamiento que usa más de un medicamento. La terapia combinada puede ser terapia doble o biterapia.

Los medicamentos usados en el tratamiento combinado según la divulgación se administran al sujeto de manera simultánea, por separado o de manera secuencial.

Tal como se usa en el presente documento, el término “administración de manera simultánea” se refiere a la administración de 2 principios activos por la misma vía y al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. El término “administración por separado” se refiere a la administración de 2 principios activos al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo por vías diferentes. El término “administración de manera secuencial” se refiere a la administración de 2 principios activos en momentos diferentes, siendo la vía de administración idéntica o diferente.

La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la presente divulgación.

Figuras

Figura 1: (A) Los ratones Tafa4-KO WT (CTL) se trataron con UV y se monitorizó el grosor de oreja a lo largo del tiempo. Los ratones Tafa4-KO se trataron o bien con solución salina (Tafa4-KO) o bien con proteína TAFA4 recombinante (100 nM) (rescate de Tafa4-KO). N=10 ratones por grupo. (B-C) Se evaluó el número absoluto de células mieloides CCR2+ (B) o macrófagos CMH-II+ (C) el día 7 tras el tratamiento con UV. Todos los datos se representan como media /- EEM. (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Ejemplo

Material y métodos

Ratones

Los ratones se mantuvieron en condiciones de alojamiento convencionales libres de patógenos, con acceso libre a pienso y agua y un ciclo de 12 h de luz y oscuridad a una temperatura ambiental de 22°C en la instalación para animales de ClML o CIPHE (CIML, Francia). Los ratones C57/Bl6J se adquirieron de Janvier (https://www.janvier-labs.com) y los ratones TAFA4-KO y GINIP-DTR se criaron en el propio alojamiento para animales. Los ratones TAFA-4-KO y los ratones NaV1.8CRE-GINIP-DTR fueron generados por el grupo de Aziz Moqrich (IBDM, AMU, Francia) y se describieron previamente1722. Los ratones CCR2-KO se describieron previamente31. Se realizó un esfuerzo especial para minimizar el número y el estrés. Todos los protocolos son conformes a las recomendaciones de la Unión Europea para la experimentación con animales. Todos los ratones se usaron entre 8 y 12 semanas, a menos que se especifique.

Generación de quimeras de médula ósea

Los ratones WT o TAFA4-KO de edad y sexo coincidentes se anestesiaron con ketamina/xilazina (10 |il/g, Imalgene500 al 2% y Rompun al 5%). Después se sometieron los ratones a una irradiación letal de 6,5 Gy procedente de un irradiador de rayos X. Se usó una placa de plomo para proteger la piel de la oreja frente al daño inducido por la irradiación. 6 h más tarde, se inyectaron (i.p.) 30 mg/kg de busulfán para agotar los progenitores mieloides restantes en los ratones receptores. 12 h más tarde, se recuperaron estos ratones con 5 10 millones de células de médula ósea procedentes de ratones CD45.1 o CCR2-KO. Después de la irradiación, los ratones se trataron con Bactrim (en el agua de beber) durante dos semanas durante un tiempo de recuperación total de 5 semanas antes de analizar la eficiencia de quimerismos y usarse para los experimentos. Lesión cutánea

Los ratones WT, TAFA4-KO o GINIP-DTR de edad y sexo coincidentes se anestesiaron con ketamina/xilazina (10 |il/g, Imalgene500 al 2% y Rompun al 5%) y después se dejaron sin tratar o se expusieron a UV (longitud de onda: 254 nm; tensión: 8 W; fuente: 30 cm desde el objetivo) durante 30 min tal como se describió previamente42. Se monitorizó el grosor de la oreja cada dos días con un compás calibrador (los ratones estaban bajo anestesia con isofluorano) y se evaluó como grosor de orejas tratadas con UV menos grosor de orejas sin tratar de control. Análisis de histología y anatomía patológica

En diferentes momentos después del tratamiento con UV, a los ratones se les administró anestesia letal de ketamina/xilazina (15 |il/g, Imalgene500 al 20% y Rompun al 5%), después se recogieron 100 ml de sangre con una pipeta Pasteur de vidrio. Después se perfundieron los ratones con 10 ml de PBS. Después se recogieron las orejas y se fijaron con formol (durante al menos 1 h), después se crioconservaron con sacarosa al 30% durante la noche y se incrustaron en parafina. Se tiñeron cortes cutáneos de 5 |im con hematoxilina y eosina o rojo picrosirio. Las puntuaciones histológicas se evaluaron a ciegas por parte de un patólogo siguiendo los criterios descritos en la tabla 2S. Brevemente, se realizó una clasificación de la inflamación, de la cicatrización de heridas y fibrosis con una evaluación semicuantitativa de la cantidad de fibrosis en un corte y del grosor de epidermis. Aislamiento de ganglios de la raíz dorsal (DRG) y corte tisular

Después de la anestesia (mezcla de ketamina/xilazina en i.p.: 15 |il/g de ratones, Rompun al 5% e Imalgene500 al 2% 20%), a los ratones se les inyectó 5 ml de PBS fría y justo después 25 ml de AntigenFix (PFA al 4%) (i.c.). Se disecaron cuidadosamente los DRG de la médula espinal bajo un binocular y se recogieron en AntigenFix (PFA al 4%). Después se fijaron posteriormente los DRG en AntigenFix (PFA al 4%) durante al menos 1 h, después se crioconservaron con sacarosa al 30% (p/v) durante la noche antes de congelarse en OCT y almacenarse a -80°C. Se realizaron cortes de 12 |im de las muestras de DRG usando un crióstato convencional (Leica).

Hibridación in situ e inmunofluorescencia en los DRG

La hibridación in situ se llevó a cabo siguiendo el protocolo del documento 16. Brevemente, se sinterizaron sondas de ARN usando cebadores de PCR específicos de genes y moldes de ADNc de los DRG de ratón.

Los cortes de DRG se trataron con proteinasa K, después con disoluciones de trietanolamina y anhídrido acético. Las sondas marcadas con digoxigenina se hibridaron durante la noche a 55°C después de 2 h de hibridación previa. Los portaobjetos se trataron con baños de SSC 0,2X, después se bloquearon a temperatura ambiente con suero de cabra al 10% y se incubaron con anticuerpo anti-digoxigenina (Roche). La detección final se logró usando el kit Cyanine 3 TSA plus (Perkin Elmer).

Para la inmunofluorescencia, los cortes de DRG se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3% en tampón FACS durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron de la siguiente manera: anticuerpo de conejo anti-ATF3 1:200 (Santa Cruz SC-188), anticuerpo de rata anti-TAFA4 (clon 1D8 1:500; MiMabs) durante la noche a 4°C, anticuerpo de rata anti-Ginip 1:1000 (amable obsequio del Dr. A. Moqrich, IBDMI) durante la noche a 4°C, anticuerpo de cabra anti-CGRP 1:1000 (Abeam Ab36000) durante 2 h a 37°C. Los anticuerpos secundarios correspondientes (Alexa405, 488 ó 594; Jackson ImmunoReasarch, 712-585-153, 712 475-153, 711-545-152, 705-585-147) se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se usaron conjugados de isolectina B4 con el colorante AlexaFluor 647 (Invitrogen) a 1:200, 45 minutos a temperatura ambiente.

Las imágenes se adquirieron en un dispositivo Confocal LSM780 (Zeiss) y se analizaron con los software ZEN e ImageJ.

Aislamiento de células cutáneas

Después del tratamiento con UV, se sacrificaron los ratones. Las orejas se dividieron en capas dorsal y ventral, después se trituraron para dar trozos pequeños y se incubaron durante 1 h a 37°C en medio completo (RPMI+L-glutamina, SVF al 10%) al que se le añadieron 1 mg/ml de ADNasa (Roche), 0,2 mg/ml de dispasa (GIBCO) y 0,2 mg/ml de colagenasa tipo IV (Sigma). Después se disociaron los tejidos usando jeringas de 2,5 ml y agujas de calibre 18G y se filtraron en un filtro celular (100 mm, BD), se lavaron con tampón Facs (PBS-EDTA 2 mM, FCS al 2%, BSA al 0,5%) para obtener una suspensión celular homogénea lista para la tinción.

Anticuerpo

Se sembraron suspensiones de células individuales en placas de fondo en U de 96 pocillos y se tiñeron a 4°C. Se retiraron las células muertas mediante contraselección en el kit de tinción de células muertas Livedead fixable blue UV (L23105; Invitrogen). Anticuerpos usados: CD45-BV785 (30F11; Biolegend), CD45.1-BV605 (A20; Biolegend), CX3CR1-BV421 (SA011F1), CD11b-BV510 (M1/70; BD Biosciences), CD64-BV711 (X54-5/7.1; Biolegend), CD169-BV605 (3D6.112; Biolegend), Ly6C-FITC (AL-21; BD Biosciences), F4-80-PECF594 (T45-2342; BD Biosciences), CD11c-PECy7 (N418; Biolegend), CCR2-PE (475301; R&D System), SiglecF-PE (E50-2440; BD Biosciences), CD206-APC (C068C2; Biolegend), Ly6G-APC-Cy7 (1A8; Biolegend), IA-IE-A700 (M5/114.15.2; Biolegend), CD24-BUV395 (M1/69; BD Biosciences), CD103-biotina (M290; BD Bioscience), MerTK-biotina (policlonal, BAF591 R&D System), Ac contra IL-1b-PE (BD), anticuerpo anti-TNFa-PE (BD), estreptavidina-BUV737 (BD Biosciences).

Citometría de flujo

Las células se incubaron durante 40 min a 4°C en tampón Facs con anticuerpo anticuerpo 2.4G2 para bloquear los receptores de Fc, se lavaron y se fijaron hasta su análisis. Para la tinción de citocinas ex vivo, las suspensiones celulares se permeabilizaron usando el kit fixperm FoxP3 de ebioscience y se tiñeron con anticuerpo anti-IL-1 b y TNF-a. Se realizó un análisis multiparamétrico por FACS usando un sistema LSR X20 (BD). Se obtuvieron los números absolutos para cada población usando perlas Quanti (556296, BD Bioscience). El análisis por FACS se realizó usando el software Flowjo (Tree Star, Inc.).

Generación de macrófagos derivados de médula ósea y tratamiento in vivo

Las células de médula ósea de fémures y tibias se lavaron con PBS estéril, se filtraron (filtro celular, 100 mm, BD) y después se cultivaron en DMEM completo (DMEM, SVF al 10%, P/S, L-Glu al 1%) complementado con medio acondicionado con células L929 al 10%. Después de 7 días en cultivo, se recogieron los BMDM maduros mediante lavado con PBS fría, incubación en hielo durante 15 min y pipeteo exhaustivo. Se sembraron 1 x 106 BMDM/pocillo en placas de 12 pocillos (BD) en medio DMEM completo complementado con 100 ng/ml de M-CSF y se incubaron con estímulos inductores de macrófagos activados alternativamente (10 ng/ml de IL-4, Peprotech) con o sin TAFA-4 10 ó 100 nM (R&D System). Después de 16 horas, los BMDM se lisaron usando medio RLT (Qiagen), después se hicieron pasar a través de una columna QIAShredder (Qiagen) para la homogeneización y se almacenaron a -80°C.

Macrófagos generados con tioglicolato y tratamiento in vitro

Se aislaron macrófagos peritoneales de ratones C57Bl/6J (de 8 a 12 semanas de edad) a partir de un lavado peritoneal tres días después de la inyección i.p. de tioglicolato al 3% (Sigma). Las células se sembraron a 1 x 106 células por pocillo en DMEM completo (D^mEM, FCS al 10%, P/S, L-glu al 1%) y se incubaron con o sin LPS (100 ng/ml, Sigma) en presencia de una concentración creciente de TAFA-4 (R&D System; 0, 1, 10, 100 ó 1000 nM). Después de 8 horas, los macrófagos se lisaron con un medio de lisis (RLT, QlAGEN), después se centrifugaron en una columna QIAShredder para la homogeneización para conservar el ácido nucleico, los cuales se conservaron a -80°C.

Análisis de la expresión génica

El ARN total se aisló a partir de las orejas no tratadas o tratadas con irradiación UV. Las orejas se dislaceraron mediante FastPrep-24 (MpBio) con perlas de matriz A (MpBio). El ARN se aisló usando un minikit RNeasy para tejido fibroso (QIAGEN). La transcripción inversa se realizó usando Superscript RTII (Invitrogen). La amplificación previa se realizó usando una sonda Taqman para el gen diana con una mezcla maestra de amplificación previa (Fluidigm). Los productos previamente amplificados (18 ciclos) se diluyeron cinco veces antes de su análisis con la mezcla maestra de PCR universal y ensayos de expresión génica con Taqman en matrices dinámicas 96.96 en un sistema BioMark (Fluidigm). Los datos se analizaron en el análisis por PCR en tiempo real de BioMark (Fluidigm) y se normalizaron con respecto a un gen de mantenimiento, ^gA^dPH, para el experimento in vitro y HPRT para el experimento in vivo (2A-ACt). Todos los genes Taqman se adquirieron de Applied Biosystems y fueron los recomendados por el proveedor.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como medias /- EEM. El análisis estadístico se realizó usando el software GraphPad Prism para Windows. Se comparó la significación estadística de los datos usando la prueba de la t de Student o la prueba de Mann-Whitney si se comparaban 2 grupos. Si había múltiples grupos, se usaron ANOVA bifactorial o la prueba de la t múltiple con corrección de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas de la siguiente manera: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; y ****p<0,0001.

Resultados y discusión:

La radiación UV provoca daño similar a quemaduras solares caracterizado por la destrucción de la epidermis e inflamación de la papila dérmica subyacente89. Estos acontecimientos conducen a la rápida activación de mecanismos orquestados por los monocitos infiltrantes y los macrófagos dérmicos residentes para resolver la inflamación y fomentar la reparación tisular10. Sin embargo, una inflamación excesiva puede conducir a daño tisular crónico seguido de una deposición excesiva de colágeno, lo que da como resultado cicatrices fibróticas no resueltas. Las señales específicas de tejido determinan constantemente la identidad funcional de los macrófagos residentes111213 y fomentan su mantenimiento a lo largo de su vida, ya sea mediante autorrenovación local o mediante el reclutamiento de células derivadas de monocitos adicionales. Sin embargo, la naturaleza de estas señales sigue siendo en gran parte desconocida. Se planteó la hipótesis de que la red de neuronas sensoriales altamente desarrollada presente dentro de la piel puede proporcionar señales clave requeridas para las funciones de células mieloides en la reparación tisular.

Para entender cómo puede producirse esta posible interferencia neuroinmunitaria después de una lesión cutánea, se expusieron las orejas de ratones de tipo natural (WT) a irradiación UV-C para inducir daño cutáneo en condiciones estériles (datos no mostrados). La piel tiene un sistema nervioso sensorial altamente desarrollado que detecta estímulos externos y lesiones tisulares. Tras la exposición a UV, las zonas con quemaduras solares se caracterizan generalmente por una fase temporal de hipersensibilidad al dolor mediada por la activación de neuronas sensoriales especializadas que inervan la piel14. Se analizó la cinética de activación de las neuronas cutáneas después de la exposición a UV. En primer lugar, se monitorizaron las neuronas sensoriales que inervan las orejas inyectando por vía intradérmica el colorante fluorescente DiI en la oreja y analizando las neuronas de ganglios de la raíz dorsal (DRG) para determinar la presencia del colorante dentro de su cuerpo celular mediante microscopía confocal (datos no mostrados). Se analizaron los DRG C2, C3, C4 y los ganglios trigeminales (TG) y se halló que C2 y C3 eran los DRG que presentaban el mayor nivel de tinción con DiI, lo que demuestra que estos DRG eran los que inervan las orejas. Previamente se demostró que la inducción del factor de transcripción activante 3 (ATF3) en las neuronas de DRG era un marcador celular sensible para revelar las fibras aferentes primarias con las cuales interaccionan diversos estímulos químicos o nocivos15. Se investigó la capacidad de las neuronas que inervan la piel para reaccionar frente a la exposición a UV monitorizando el perfil de expresión de Atf3 mediante qRT-PCR en DRG C2/C3 agrupados a lo largo del transcurso de tiempo de 14 días tras el tratamiento con UV (datos no mostrados). Se observó que, en comparación con los ratones no expuestos, la irradiación UV indujo una expresión significativa de ARNm de ATF3 en los DRG en el plazo de un día. La expresión máxima de Atf3 se alcanzó el día 3 y se mantuvo a un alto nivel al menos hasta el día 7 posterior a la irradiación UV. Todavía se observaba expresión residual del gen Atf3 el día 14 posterior a la exposición a UV. Después se siguió la cinética de la inflamación cutánea en el presente modelo analizando en la piel el perfil de expresión de genes implicados en la activación de células mieloides, la inflamación y la reparación tisular, en diferentes puntos de tiempo posteriores a la irradiación mediante qRT-PCR (datos no mostrados). Este análisis reveló que los genes inflamatorios que codifican para factores tales como IL1 p, TNF-a, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6 y CXCL10 estaban regulados por incremento entre el día 3 y el día 7 posterior a la irradiación UV, destacando la fase inflamatoria inducida por UV. La expresión de estos genes disminuyó lentamente después de eso, mientras que la expresión de genes implicados en la reparación tisular tales como Colla y RETLNa aumentaron únicamente después del día 14 hasta al menos el día 35, destacando la fase de recuperación y la aparición de remodelación tisular. Estos datos sugieren que la cinética de activación de las neuronas sensoriales dentro de los DRG se correlaciona con el grado de inflamación observado dentro de la piel expuesta a UV (datos no mostrados).

Tras la invasión cutánea con patógenos o exposición a sustancias químicas, la deleción de subconjuntos de neuronas sensoriales cutáneas puede ser o bien protectora o bien perjudicial para la defensa del huésped y se halló que inducía respuestas proinflamatorias o antiinflamatorias3456. La variedad de desenlaces funcionales observados tras las deficiencias de neuronas sensoriales2 pudo explicarse por la complejidad y la diversidad de subtipos de neuronas sensoriales7, pero su papel respectivo en controlar las funciones de células inmunitarias y la base molecular implicada siguen siendo desconocidos.

Para delinear el fenotipo de las neuronas sensoriales activadas por irradiación UV, se realizó tinción por inmunofluorescencia y análisis por microscopía confocal de los DRG C3 de ratones WT expuestos o no a UV. El día 3 posterior a UV, se observó tinción de ATF3 en el núcleo de un subconjunto de neuronas sensoriales que expresan la proteína de interacción con Gai (GINIP) en ratones expuestos pero no en condiciones de control (datos no mostrados). Curiosamente, esta translocación de ATF3 no se observó en neuronas peptidérgicas CGRP+ en ratones expuestos a UV (datos no mostrados). Estos datos sugieren que las neuronas GINIP+ se activaban preferentemente mediante el tratamiento con UV. Como su posible papel en el control de la inflamación cutánea no se había abordado hasta la fecha, se decidió diseccionar su papel específico en la reparación tisular en el contexto de daño cutáneo inducido por irradiación UV. Se usó un modelo genético que permite la ablación inducible y específica de tejido de neuronas que expresan GINIP16. Este modelo se obtuvo cruzando la línea GINIPflx/+ 17 con ratones que expresan la recombinasa CRE del locus Nav1.8 (ratones NaV1.8CRE/Cre)18 El tratamiento con toxina diftérica (DT) en NaV1.8CRE+ GINIPflx/+ (denominados a continuación en el presente documento ratones GINIP-DTR) a las 4 semanas de edad permitió la ablación específica de neuronas sensoriales GINIP+ 16. Los ratones NaV1.8CREl+ GINIP+/+ tratados con DT se usaron como controles de camada en todo momento.

Las orejas de ratones GINIP-DTR y controles de camada se expusieron a irradiación UV 4 semanas después del tratamiento con DT. Se evaluó la inflamación y el daño tisular midiendo el grosor de oreja cada 2-3 días durante 35 días (datos no mostrados). Se observó una fuerte fase inflamatoria en ambos grupos entre el día 5 y el día 10 posterior a la exposición a UV. El grosor de oreja aumentó significativamente en los ratones GINIP-DTR en comparación con los hermanos de camada de control comenzando el día 5 y hasta el día 35 posterior a UV (datos no mostrados). El máximo de inflamación se produjo el día 7 con una variación en el grosor de oreja que alcanzó 95 |im (+/-11 |im) en los ratones de control frente a 160 |im (+/-35 |im) en los ratones GINIP-DTR. La fase de recuperación siguiente duró 20 días más en el grupo de control y más de 30 días en los ratones GINIP-DTR en los que el grosor de oreja se redujo escasamente a lo largo del tiempo (datos no mostrados). Después se realizó un análisis de anatomía patológica los días 14 y 35 posteriores a UV para caracterizar mejor la naturaleza y el grado del daño tisular en los dos grupos de ratones (datos no mostrados). Midiendo el nivel de infiltración de leucocitos (inflamación; datos no mostrados), el engrosamiento de la epidermis (datos no mostrados) y la expansión de fibras de colágeno (fibrosis; datos no mostrados), ambos grupos alcanzaron una puntuación máxima el día 14, lo que sugiere daños tisulares masivos inducidos por irradiación UV en ambos grupos (datos no mostrados). Sin embargo, la infiltración de leucocitos, el grosor epidérmico y la puntuación fibrótica del día 35 fueron mayores en los ratones GINIP-DTR en comparación con los hermanos de camada de control (datos no mostrados). Por consiguiente, la puntuación acumulada disminuyó significativamente entre el día 14 y el día 35 en el grupo de control pero no en el grupo de ratones GINIP-DTR (datos no mostrados), lo que sugiere un defecto en la remodelación tisular en ratones agotados de neuronas GINIP+. Un análisis histológico adicional de las orejas el día 35 (datos no mostrados) mostró claramente una fuerte infiltración de fibras de colágeno por toda la dermis que conduce a la pérdida completa de la estructura cartilaginosa en las orejas de ratones GINIP-DTR (datos no mostrados), mientras que las orejas de los ratones de control mostraban signos de recuperación fibrótica (datos no mostrados).

Como se sabe que los monocitos infiltrantes y los macrófagos residentes en tejidos tienen un papel central en la remodelación tisular y la fibrosis, se analizó la respuesta de estas células en la piel de las orejas expuestas a UV de hermanos de camada de control y GINIP-DTR mediante citometría de flujo. Excluyendo las células dendríticas (CD11c+ CMH-II+), los granulocitos (CD11b+ Ly6G+) y los eosinófilos (CD11b+ Siglec F+ CD24+), el compartimento de monocitos/macrófagos caracterizado por la doble expresión de CD11b y F480 (datos no mostrados) puede separarse adicionalmente en dos subconjuntos basándose en la expresión de CCR2 y CD64 (datos no mostrados). La población CCR2+ se ha relacionado previamente con monocitos que dan lugar a macrófagos derivados de monocitos caracterizados por su alta expresión de CMH-II1920 CD64 se usa habitualmente para identificar las poblaciones de macrófagos residentes en tejidos21. En comparación con los ratones de control, los ratones GINIP-DTR expuestos a irradiación UV presentaban una población más persistente de células CCR2+ el día 14 (datos no mostrados) así como mayores números de macrófagos CMH-II+ entre los días 14 y 35 después de la irradiación UV (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren que, en ausencia de neuronas GINIP+, la piel es más susceptible a la fibrosis inducida por UV y a la infiltración de células derivadas de monocitos.

GINIP se expresa en dos subconjuntos distintos de Ret+, neuronas sensoriales no peptidérgicas que pueden distinguirse a través de su tinción diferencial con isolectina B4 (IB4) y la expresión de TAFA417. Para delinear los mecanismos subyacentes que conducen al fuerte daño cutáneo observado en ratones GINIP-DTR expuestos a irradiación UV, se realizó una investigación mediante microscopía confocal sobre los DRG C3 cuyos subconjuntos de neuronas sensoriales GINIP+ estaban reaccionando a la exposición a UV usando un anticuerpo monoclonal anti-TAFA4 recientemente generado, ATF3 y tinción con IB4. La translocación de ATF3 se observó principalmente en el núcleo del subconjunto IB4- TAFA4+ (datos no mostrados), que representa C-LTMR1722. La molécula de TAFA4, un marcador de este subconjunto, es una proteína similar a quimiocinas23 que se sabe que modula la hipersensibilidad al dolor químico y mecánico inducida por lesión en ratones22. Se ha demostrado que TAFA4 recombinante está implicada en la quimiotaxis de macrófagos humanos in vitro2A. Sin embargo, se desconoce su posible papel en el reclutamiento o la activación in vivo de células mieloides. Por tanto, se investigó si la molécula de TAFA4 puede estar implicada en el fenotipo de GINIP-DTR, repitiendo el protocolo de inflamación cutánea inducida por UV en ratones Tafa4-KO22. La monitorización de los grosores de oreja en hermanos de camada de control y Tafa4-KO mostró una fase inflamatoria que culminaba tanto para ratones de control como para ratones Tafa4-KO entre el día 7 y el día 10 posterior al tratamiento con UV (datos no mostrados). Durante la fase de recuperación siguiente, el grosor de oreja se resolvió progresivamente en el día 35 en los ratones de control. Sin embargo, el grosor de oreja fue significativamente mayor en los ratones Tafa4-KO en comparación con los ratones de control desde los días 18 hasta 35, lo que sugiere un defecto en la resolución de la inflamación cutánea y/o la remodelación tisular en ausencia de TAFA4.

Para caracterizar adicionalmente el fenotipo de ratones Tafa4-KO antes y después del daño cutáneo inducido por UV, se realizó un análisis de anatomía patológica de su piel de oreja (datos no mostrados). En estado estacionario, sin exposición a UV (datos no mostrados), la piel de ratones Tafa4-KO y de control de camada era similar sin ningún signo de inflamación. Después de la irradiación UV, la naturaleza y el grado del daño tisular eran similares en los dos grupos de ratones entre el día 7 y el día 21 posteriores a UV (datos no mostrados). En cambio, el día 35, tal como se observa en ratones GINIP-DTR, las puntuaciones que miden la infiltración de leucocitos (datos no mostrados), el grosor epidérmico (datos no mostrados) y la deposición de colágeno (datos no mostrados) eran mayores en ratones Tafa4-KO que en controles WT de camada, con una puntuación acumulada de 5,7 /- 2,2 en comparación con 8 /- 1,5 para ratones de control y Tafa4-KO respectivamente (datos no mostrados). Por tanto, en este punto de tiempo, los ratones Tafa4-KO presentaban una fibrosis persistente de la dermis en comparación con el grupo de control. En consistencia con esta observación, la tinción con rojo picrosirio y el análisis histológico revelaron una deposición en exceso de colágeno tipo 1 y una persistencia de cicatrices fibróticas no resueltas dentro de la dermis de ratones Tafa4-KO en comparación con controles de camada el día 35 (datos no mostrados). Finalmente, el análisis por citometría de flujo de células cutáneas en las orejas de ratones Tafa4-KO después de UV mostró, tal como se observa en ratones GINIP-DTR, la persistencia de células CCR2+ el día 14 (datos no mostrados) y la presencia de macrófagos CMH-II+ más abundantes el día 35 (datos no mostrados). Por tanto, los ratones Tafa4-KO fenocopian, al menos parcialmente, la patología fibrótica y los cambios en la respuesta de células mieloides observados en ratones GINIP-DTR. En conjunto, estos datos sugieren que el neuropéptido TAFA4 producido por un subconjunto de neuronas GINIP+ regula las respuestas de células mieloides a la lesión cutánea después de la irradiación UV.

Los presentes datos sugieren una correlación entre la fibrosis dérmica no resuelta y la persistencia de células derivadas de monocitos dentro de la piel de ratones Tafa4-KO tras la exposición a UV. Se caracterizó adicionalmente el fenotipo de subconjuntos de macrófagos de la dermis usando análisis por citometría de flujo (datos no mostrados). Como la reparación tisular está asociada con funciones de macrófagos alternativamente activados, se usó el marcador CD206 para su identificación en la dermis. Se observó que la mayoría de los macrófagos CCR2- CD64alto eran positivos para este marcador (datos no mostrados), lo que sugiere que CD206 también destaca los macrófagos residentes en tejidos de la dermis (datos no mostrados). Analizando la piel durante toda la vida de los ratones WT usando esta estrategia de selección, se observó que CD206 ya estaba expresado antes del nacimiento, en E17.5 del desarrollo embrionario (datos no mostrados), lo que sugiere que CD206 marca los macrófagos residentes en tejidos de origen embrionario de larga duración de la dermis25. La población CCR2+ consiste principalmente en monocitos infiltrantes (R1; Ly6C+, CMH-II-), monocitos inflamatorios (R2; Ly6C+ CMH-II+) y macrófagos derivados de monocitos (R3; Ly6C-CMH-II+) tal como se observa en este caso (datos no mostrados) y en informes previos20. De hecho, esta población CCR2+ está ausente en dermis embrionaria y sólo surgió en el plazo de la primera semana después del nacimiento, lo que sugiere su relación con la hematopoyesis de médula ósea (datos no mostrados). Un análisis adicional reveló que la población CD206+ contiene dos subconjuntos de macrófagos basándose en la expresión o no de CMH-II (R4: CMH-II+ y R5: CMH-II-; datos no mostrados). Usando esta estrategia de selección, se analizó durante todo el transcurso de tiempo tras la exposición a UV la dinámica de subconjuntos de monocitos y macrófagos dentro de la piel. El tratamiento con UV indujo un reclutamiento masivo de monocitos circulantes, tanto en ratones Tafa4-KO como en ratones de control de camada, que culminó el día 5 y disminuyó lentamente hasta el día 23 (datos no mostrados). No se observaron diferencias, en cuanto a reclutamiento de monocitos, entre los dos grupos. Ahora está bien aceptado que los monocitos infiltrantes regulan por disminución progresivamente la expresión de Ly6C y regulan por incremento la expresión de CMH-II para convertirse en monocitos inflamatorios (datos no mostrados). Se sabe que estos monocitos inflamatorios producen IL-1p y TNF-a así como iNOS responsables de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y pueden dar lugar a macrófagos derivados de monocitos o células dendríticas productoras de TNF/iNOS (Tip) dependiendo del contexto tisular26. Entre el día 14 y el día 30 tras la irradiación UV, se observó una persistencia prolongada de monocitos inflamatorios dentro de la dermis de ratones Tafa4-KO en comparación con los hermanos de camada de control, lo que sugiere que la ausencia de TAFA4 favorece que la diferenciación de los monocitos infiltrantes hacia un fenotipo inflamatorio (datos no mostrados). La población de macrófagos derivados de monocitos (Ly6C- CMH-II+) también se expandió significativamente más rápido en ratones Tafa4-KO que en ratones de control, al menos hasta el día 25 (datos no mostrados). Los macrófagos dérmicos residentes (R5), que se sabe que surgen antes del nacimiento a partir de precursores embrionarios que se siembran en la piel durante la organogénesis27, son células de larga duración mantenidas continuamente a través de autorrenovación local sin aporte de precursores circulantes de médula ósea28. Sin embargo, varias poblaciones de macrófagos residentes en tejidos, tales como las del intestino, del corazón así como de la dermis, todavía pueden recibir, aunque a una tasa más lenta, cierta contribución a partir de los monocitos circulantes para sostener su agrupación de macrófagos293020. Después del tratamiento con UV, los dos subconjuntos (CMH-II- y CMH-II+) de macrófagos dérmicos CD206+ residentes se expandieron rápidamente hasta al menos el día 25 en ambos grupos de ratones (datos no mostrados). De manera importante, el número de macrófagos dérmicos fue mayor en la piel de ratones Tafa4-KO desde el día 7 hasta el día 25. Combinando las diferentes poblaciones de macrófagos identificadas en la dermis, la agrupación de macrófagos global se expandió fuertemente hasta el día 35 y de manera notablemente más rápida en ratones Tafa4-KO en comparación con los hermanos de camada de control (datos no mostrados). Este conjunto de datos muestra, en primer lugar, que la irradiación UV desencadena el reclutamiento de un gran número de monocitos a partir de la circulación para proporcionar macrófagos adicionales de manera local, lo que probablemente respalda las funciones de agrupaciones residentes en la dermis. Estos datos muestran que TAFA4 es necesario para el control de la respuesta de macrófagos dérmicos desencadenada por la exposición a UV. Además, sugieren en gran medida que la ausencia de TAFA4 conduce a una expansión local excesiva de macrófagos dérmicos posiblemente responsables del fenotipo de fibrosis cutánea no resuelta.

Como los macrófagos residentes y los macrófagos derivados de monocitos pueden tener una función y una contribución al fenotipo observado distintas, se generó una serie de quimeras de médula ósea (BM) en las que la piel de las orejas y sus células residentes están protegidas frente a la radiación mediante una placa de plomo (Ajami et al., 2007; datos no mostrados). La circulación de monocitos desde la médula ósea hasta los tejidos inflamados depende gran medida del eje CCR2/CCL231. Para obtener información sobre la contribución de los monocitos a los diferentes subconjuntos de macrófagos, se siguió la expansión, en número absoluto, de cada población descrita anteriormente, 7 días posteriores a UV, o bien en ratones WT con quimeras de BM (datos no mostrados) o bien en quimeras WT reconstituidas con BM de ratones CCR2-KO (datos no mostrados). En ratones CCR2-KO con quimeras de BM, los monocitos, los monocitos inflamatorios y los macrófagos derivados de monocitos no pudieron alcanzar la dermis inflamada después del tratamiento con UV y no pudieron contribuir a la expansión necesaria de estas poblaciones en la dermis inflamada (datos no mostrados). Sin embargo, tal como se esperaba, la población de macrófagos dérmicos residentes (datos no mostrados) todavía pudo expandirse independientemente de los precursores circulantes aunque con una notable reducción en comparación con los ratones WT con quimeras de BM. Curiosamente, el subconjunto de macrófagos CMH-II+ CD206+ dependía bastante de los precursores circulantes. Esto sugiere que esta población puede representar un subconjunto intermedio que vincula los monocitos circulantes y la población de macrófagos dérmicos residentes auténticos de larga duración (datos no mostrados).

Para investigar adicionalmente cómo afecta el microentorno al destino de los monocitos en ausencia de TAFA4, se recuperaron los ratones irradiados CD45.2 WT o Tafa4-KO con BM CD45.1. En estas condiciones, puede monitorizarse el destino de los monocitos infiltrantes basándose en la expresión de CD45.1, mientras que los macrófagos dérmicos residentes (R5) pueden identificarse a través de la expresión de CD45.2. Los macrófagos residentes se expandieron drásticamente después de la irradiación UV e incluso más rápido en ratones Tafa4-KO en comparación con los hermanos de camada de control (datos no mostrados) tanto en ratones WT como en ratones Tafa4-KO con quimeras no expuesto a UV, cinco semanas después de la recuperación, la contribución de BM CD45.1 WT a la agrupación de macrófagos dérmicos residentes (R5) permaneció por debajo del 25% (datos no mostrados). Tal como se esperaba, la frecuencia de microglía de cerebro CD45.1+, que permanece independiente de los monocitos circulantes, alcanzó menos del 3%, mientras que los granulocitos y los monocitos circulantes alcanzaron el 95% (datos no mostrados). Estos datos sugieren un recambio lento pero constante de macrófagos residentes en la dermis. En cambio, tras la exposición a UV, la contribución de precursores circulantes de BM CD45.1+ a los macrófagos dérmicos alcanzó el 55% (+/- 8%) en ratones receptores WT frente al 74% (+/- 9%) en ratones receptores Tafa4-KO, 14 días después del tratamiento con UV. Dos explicaciones alternativas pueden subyacer a estos datos. Los macrófagos dérmicos residentes pueden ser sensibles a UV, lo que conduce, después de su eliminación por ejemplo a través de mecanismos de necroptosis32, a su reemplazo por monocitos circulantes. Alternativamente, la agrupación de macrófagos dérmicos residentes puede permanecer estable, pero su frecuencia relativa se vería mermada tras una expansión masiva de células derivadas de monocitos que pueden diferenciarse en un subconjunto intermedio CD206+ CMH-II+ tal como se observó anteriormente (datos no mostrados, grupos UV). El análisis de los mismos subconjuntos de células el día 35 posterior al tratamiento con UV respalda la segunda hipótesis ya que el quimerismo de macrófagos dérmicos volvió al 41% /- 12% en receptores WT y al 55% /- 13% en receptores Tafa4-KO (datos no mostrados). Tres meses después de la exposición a UV, el quimerismo de macrófagos dérmicos residentes disminuyó hasta el 34% /- 7% en receptores WT mientras que aumentó hasta el 63% /-12% en ratones receptores Tafa4-KO, respectivamente (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la diferenciación de monocitos en macrófagos dérmicos residentes, observada en ratones receptores WT, es transitoria y que los macrófagos dérmicos auténticos se expanden durante la fase de recuperación para ocupar su nicho inicial. Además, los presentes resultados sugieren que, en ausencia de TAFA4, los macrófagos dérmicos derivados de monocitos permanecen más tiempo en la dermis y posiblemente se convierten en células residentes de larga duración. Por tanto, el origen de los macrófagos dérmicos en los ratones Tafa4-KO frente a los ratones WT es diferente, lo que sugiere una funcionalidad posiblemente diferente.

Para entender adicionalmente el mecanismo por el cual TAFA4 puede regular la respuesta de células mieloides, se sometió a prueba si TAFA4 recombinante puede modular directamente su función in vitro. A diferencia de un informe previo24, no pudo detectarse ninguna actividad quimiotáctica de TAFA4 sobre los macrófagos de ratón (datos no mostrados). Sin embargo, se halló que el perfil transcriptómico de macrófagos derivados de BM sensibilizados con IL-4 se modificó en presencia de TAFA4. La expresión de genes que codifican para factores de transcripción, tales como IRF5 y IRF8, implicados en la maduración del desarrollo de macrófagos y la polarización3334 estaban regulados por incremento al aumentar la concentración de TAFA4 (datos no mostrados). Además, el gen Nr4a1, necesario para la regulación de la activación y la apoptosis de macrófagos, así como para la diferenciación de monocitos y la supervivencia de monocitos Ly6ClD 35-37, también estaba regulado por incremento mediante TAFA4 (datos no mostrados). El ARNm que codifica para TGF-p también estaba regulado por incremento en respuesta a TAFA4 (datos no mostrados). TGF-p, además de ser un factor central para la resolución de inflamación, se ha implicado recientemente en el mantenimiento de varios macrófagos residentes así como en el reclutamiento y la diferenciación de monocitos3839. Estos datos sugieren que TAFA4 puede actuar directamente sobre los macrófagos y activar rutas reguladoras implicadas en funciones clave de macrófagos y monocitos. Finalmente, los macrófagos inflamatorios inducidos por tioglicolato, tratados in vitro con lipopolisacárido40, regularon por disminución, en respuesta a TAFA4 adicional, la proteína cinasa de interacción con el receptor 3 (RIPK3), un gen implicado en la necroptosis, lo que sugiere que TAFA4 puede proteger a los macrófagos frente a la muerte inducida por una inflamación excesiva41 (datos no mostrados).

Estos datos in vitro sugieren que TAFA4 puede modular directamente la homeostasis de células mieloides. Su ausencia general en ratones Tafa4-KO puede favorecer el reemplazo de macrófagos residentes en tejidos en condiciones inflamatorias. En consistencia con un posible papel de TAFA4 en la inducción de un perfil transcriptómico antiinflamatorio en macrófagos, se hallaron más monocitos inflamatorios Ly6C+ CMH-II+ que producen IL-1 p y TNF-a en ratones Tafa4-KO en comparación con los controles de camada in vivo 7 días después de la exposición a UV (datos no mostrados). Se demostró que la producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias, tal como la producción de TFN-a, I L-1 b, IL-6, CXCL1, CCL4 o CCL2, se prolonga en ratones TAFA4-KO en la piel total después de 7 ó 10 días de irradiación UV (datos no mostrados). La expresión de IL-10 está regulada por incremento en macrófagos purificados en ratones WT después de la irradiación UV, pero no en ratones TAFA4-KO. Se procedió a un análisis ex vivo de la producción de IL-10 en subconjuntos de macrófagos (Tim4+ Mac, DN Mac y CMH-II+ Mac). Se halló que dos subconjuntos de macrófagos dérmicos, Tim4+ Mac y DN mac, regulan por incremento la producción de IL-10 in vivo tras la irradiación UV de la piel en ratones WT pero no en ratones TAFA4-KO (datos no mostrados). Esto sugiere que TAFA4 no sólo puede regular la biología de células residentes, sino que también puede inhibir las funciones inflamatorias de monocitos recién reclutados en los tejidos.

Para confirmar el potencial antiinflamatorio de TAFA4, se realizaron inyecciones intradérmicas de TAFA4 (100 nM, 50 ul) o solución salina en las orejas de ratones Tafa4-KO cada 2 días partiendo del día del tratamiento con UV durante 8 días. El seguimiento del grosor de oreja a lo largo del tiempo reveló una reducción de la fase inflamatoria en los ratones Tafa4-KO tratados con TAFA4 (110 |im /- 11 |im) en comparación con los ratones Tafa4-KO o de control tratados con solución salina (145 |im /- 23 |im y 135 |im /- 27 |im, respectivamente) el día 10 (figura 1A). La reducción del grosor de oreja en los ratones Tafa4-KO tratados con TAFA4 frente a los que se les inyectó solución salina también fue significativa entre el día 14 y el día 19 posteriores a la exposición a UV (figura 1A). Sin embargo, en puntos de tiempo posteriores, el grosor de oreja volvió al nivel observado en el grupo de control Tafa4-KO tratado con solución salina, lo que sugiere que la presencia de TAFA4 es necesaria durante todo el proceso de reparación tisular. Después se analizó si la reducción en el grosor de oreja de ratones Tafa4-KO tratados con la proteína TAFA4 estaba asociada con modificaciones en las respuestas de células mieloides. En consistencia con el fenotipo descrito anteriormente, en ratones a los que se les inyectó solución salina, se observó un claro aumento en el número de macrófagos CCR2+ en las orejas de Tafa4-KO en comparación con los hermanos de camada de control 7 días después de la irradiación UV. En cambio, los ratones Tafa4-KO tratados con TAFA4 mostraron un rescate de este fenotipo con los macrófagos CCR2+ en la piel de la oreja (figura 1B). Además, la inyección local de TAFA4 también redujo el número de macrófagos CMH-II+ en las orejas de ratones Tafa4-KO 7 días después de la irradiación UV (figura 1C). Por tanto, la inyección de TAFA4 en piel lesionada puede restablecer la respuesta alterada observada en ratones Tafa4-KO in vivo, lo que sugiere que tal tratamiento puede tener un posible interés en algunas afecciones patológicas asociadas con enfermedades inflamatorias cutáneas.

En conjunto, estos datos muestran que TAFA4, una molécula expresada por un subconjunto de neuronas sensoriales GINIP+ que inervan la piel, es necesaria para la resolución de inflamación cutánea y fibrosis tras la exposición a irradiación UV. Los presentes resultados también sugieren que el tratamiento con TAFA4 in vitro e in vivo puede fomentar respuestas de células mieloides antiinflamatorias y favorables para la reparación.

Las neuronas sensoriales primarias son heterogéneas por numerosos criterios moleculares7. La variedad de desenlaces funcionales observados tras las deficiencias de neuronas sensoriales puede explicarse por la complejidad y la diversidad de subtipos de neuronas sensoriales. Sin embargo, la importancia funcional de esta notable heterogeneidad apenas está surgiendo. Estudios previos han demostrado que las neuronas sensoriales implicadas en la sensibilidad al dolor pueden modular algunos aspectos de respuestas inmunitarias inflamatorias cutáneas2. Sin embargo, la mayoría de ellos se centran en el papel de subconjuntos peptidérgicos y en particular en el papel del neuropéptido CGRP que se ha descrito que tiene efectos proinflamatorios principalmente34. En este caso se describe que un grupo de neuronas no peptidérgicas que expresan el marcador GINIP son necesarias para regular por disminución procesos inflamatorios y para modular la respuesta de células mieloides. Este control es necesario para fomentar la reparación tisular en el contexto de exposición de la piel a irradiación UV. Se identificó que TAFA4, un factor producido por C-LTMR GINIP+, tiene un factor principal implicado en esta regulación. Sin embargo, el fenotipo inflamatorio cutáneo en ratones Tafa4-KO es menos pronunciado que en ratones GINIP-DTR (datos no mostrados), lo que sugiere que otros mediadores expresados por neuronas GINIP+ pueden tener funciones reguladoras adicionales. Este estudio revela nuevos mecanismos de regulaciones neuroinmunitarias y allana el camino para futuras investigaciones que analicen el papel de esta novedosa ruta reguladora en otras enfermedades inflamatorias cutáneas.

Referencias

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta divulgación.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo para su uso para reducir la inflamación cutánea en un sujeto que lo necesita.

2. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece una enfermedad cutánea inflamatoria.

3. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece una enfermedad cutánea inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en acné, rosácea, foliculitis, dermatitis peribucal, fotodaño, envejecimiento cutáneo, psoriasis, ictiosis, heridas crónicas, úlceras de decúbito, queratosis piralis, cicatrices, incluyendo cicatrices quirúrgicas y de acné, quistes sebáceos, dermatosis inflamatorias, hiperpigmentación posinflamatoria, xerosis, prurito, liquen plano, prurigo nodular, eccema y miliaria.

4. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece una enfermedad cutánea inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en esclerodermia, dermatitis atópica, dermopatía fibrosante nefrogénica, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, escleromixedema, escleredema, queloide, esclerodactilia o fascitis eosinofílica.

5. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece fotodermatitis.

6. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece herida crónica.

7. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece úlceras por insuficiencia venosa o úlceras diabéticas del pie.

8. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1 para su uso para tratar herida crónica en un sujeto que padece anemia drepanocítica o herida crónica en ancianos.

9. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, para su uso para prevenir la fibrosis cutánea.

10. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de TAFA4 comprende una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:1.

11. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de TAFA4 se fusiona con un dominio constante de inmunoglobulina para constituir una inmunoadhesina.

12. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico se incluye en un vector adecuado, tal como un vector viral (por ejemplo, AAV).

13. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de TAFA4 o la molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo se formulan para administración tópica.

14. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 13, en el que la administración tópica para tratamiento cutáneo se logra mediante un dispositivo transdérmico o dispositivo de parche.

15. Polipéptido de TAFA4 o molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de TAFA4 o la molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo el polipéptido de TAFA4 se administra con otro agente activo tal como un glucocorticoide.